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Even one century after Santiago Ramón y Cajal’s groundbreaking contribu- tions to neuroscience, one of the most fundamental questions in the field is still largely open, namely understanding how the shape of a dendrite is adapted to its specific biological function. A systematic investigation of this problem is challenging both technically and conceptually because neurons have diverse genetic, molecular, morphological, connectional and functional properties.
In the light of the preceding, dendritic arborisation (da) neurons of the Drosophila melanogaster larva PNS have proven to be an excellent model system for the study of such growth and patterning processes. Structure and function in these cell classes are intimately intertwined, as class type-specific dendritic arbour differentiation processes are required to satisfy a given phys- iological need. Also, there is a remarkable genetic toolkit that enables one to selectively and reproducibly label, image and manipulate each one of these sensory neuron classes. In this thesis, I address the aforementioned open problem by linking single-cell patterning, information processing and wiring optimisation in sensory da neurons to behaviour in Drosophila larva.
In particular, I study Class I ventral peripherical dendritic arborisation (c1vpda) neurons. These are a class of proprioceptive neurons that relay information on the position of the larva’s body back to the CNS during crawling behaviour to assure proper locomotion. Their stereotypical comb- like shaped dendritic branches spread along the body-wall, and they get noticeably deformed during crawling behaviour. The bending of the den- dritic branches is hypothesised to be a possible mechanism to transduce the mechanosensory inputs arising from cuticle folding. Interestingly, c1vpda neurons do not necessarily satisfy optimal wiring constraints since they are required to pattern into a specific shape to fulfil their function. Therefore, I considered the da system to study how the specific functional requirements may be combined with optimal wiring constraints during development.
Although the molecular machinery of dendrite patterning in c1vpda neurons is well studied, the precise elaboration of the comb-like shaped dendrites of these cells remains elusive. Moreover, even though a lot of work has been put into the description and quantification of growth processes of the nervous system, there are still few solid and standardised models of arbour staging and patterning. Importantly, the defining parameters that determine the dendrite elaboration program that in turn is responsible for creating the final arbour morphology are still unknown. As a result, unraveling possible universal stages of dendrite elaboration shared between different model systems and cell types is challenging.
Thus, in order to understand the development of the fine regulation of branch outgrowth that leads to the observed terminal arbour morphology in the mature cell, I collected in vivo, long-term, non-invasive high temporal res- olution time-lapse recordings of dendritic trees during the differentiation process in the embryo and its maturation phase in the larva. For further analysis, I developed new algorithms that quantified the structural changes in dendrite morphology in the time-lapse videos. My approach provides a framework to analyse such developmental data, or any dataset comprising continuous morphological dynamical processes in an unbiased way. Using these newly developed methods, I examined the development of a sample of c1vpda cells and identified five stages of differentiation in these data: initial stem polarization, extension, pruning, stabilization, and isometric stretching during larval stages.
The beginning of the growth process is marked by the polarisation of the main stem. Subsequently, during the extension phase, branches emerge interstitially from the existing main stem. Later, higher-order branches sprout from pre-existing lateral branches, increasing arbour complexity. This is followed by a pruning stage where developmental intermediate dendritic branches are removed. This step leads to a spatial rearrangement of the dendritic tree. The end of the pruning step is followed by a stabilisation period where arbour morphology remains virtually unaltered in the embryo. After hatching, c1vpda dendrites experience an isometric scaling, with their branching complexity and pattern being invariant across all larval stages.
After dissecting the c1vpda dendrites spatiotemporal differentiation process, I established a link between dendritic shape and behaviour. I measured intra- cellular Ca++ activity in the dendrite branches of l1 larvae during forward locomotion, while simultaneously recording branch deformation using a dual genetic line. I reported that post-embryonic c1vpda dendrites Ca++ responses increased in freely crawling larvae. Furthermore, I showed strong correlations between Ca++ signal and deformation of the comb-like dendritic ranches during body-wall contractions.
Then, using a geometrical model, I provided evidence that the pruning stage could reorganise the dendrite morphology to maximise mechanosensory re- sponses during body wall contraction. I showed that the angle orientation of each side branch correlates with the bending curvature and thus with the me- chanical displacement of the cell membrane during locomotion. During the pruning phase, I observed a preferential reduction of less efficient branches with low bending curvature, influencing the mechanisms of dendritic sig- nal integration of c1vpda sensory neurons. I proceeded to quantify branch dynamics at single tip resolution during pruning, providing evidence that a simple random pruning mechanism is sufficient to remodel the tree structure compatible with the observed way.
I used these time-lapse data to constrain a new computational noisy growth model with random pruning based on optimal wiring principles. This model is able to generate highly realistic synthetic c1vpda morphologies. The model furthermore requires few parameters to generate highly accurate temporal development trajectories and morphologies at single-cell level. Utilising this data and model enabled me to investigate upon the hypothesis that a noisy dendrite growth and random pruning mechanism synergise to achieve den- dritic trees efficient in terms of both wiring and function. My findings show how single neurons can create functionally specialised dendrites while min- imising wiring costs, elucidating how general principles of self-organisation may be involved in the generation of these structures.
Hintergrund. Die Achtung der individuellen Autonomie ist eines von vier medizinethischen Prinzipien, das im Kontext von Medizin und Forschung insbesondere in Bezug auf die informierte Einwilligung einer Person thematisiert wird. Menschen mit Demenz können aufgrund innerer oder äußerer Faktoren in ihrer Einwilligungsfähigkeit beeinträchtigt sein, was zu einer Einschränkung ihres Rechts auf Selbstbestimmung führen kann. Im diesbezüglichen Spannungsfeld zwischen Fürsorge und Autonomie soll Entscheidungsassistenz zur Ermöglichung selbstbestimmter Entscheidungen beitragen.
Zielrichtung der Arbeit. Ziel der vorliegenden Dissertation ist die Definition, Implementierung und Evaluation von Entscheidungsassistenzmaßnahmen für Menschen mit Demenz, um deren Autonomie in Entscheidungsprozessen zu unterstützen. Drei Teilprojekte umfassen die Ermittlung des internationalen Forschungsstands zu Entscheidungsassistenz bei Demenz, die Definition und Pilotierung von Unterstützungstools in der Praxis und die Analyse des individuellen Erlebens der vereinfachten Aufklärungsgespräche durch Menschen mit Demenz.
Methode. Im ersten Teilprojekt wurde eine am PRISMA-Standard orientierte systematische Literaturrecherche in Medline und PsycINFO durchgeführt. Die extrahierten relevanten Informationen wurden inhaltlich systematisiert. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurden im zweiten Teilprojekt konkrete Unterstützungstools definiert und in reale Aufklärungsgespräche (Lumbalpunktion) implementiert. Die Tools wurden in der Pilotierung in der Praxis sowie in einem iterativen Diskussionsprozess mit Experten weiterentwickelt. Im dritten Teilprojekt wurde das individuelle Erleben der Teilnehmer der vereinfachten Aufklärungsgespräche mittels problemzentrierter Interviews untersucht und die Daten einer qualitativen Inhaltsanalyse unterzogen.
Ergebnisse. Die Datenbankrecherche ergab initial 2348 Treffer. Nach Screenings der Titel, Abstracts und Volltexte konnten 11 Artikel eingeschlossen werden. Vier der eingeschlossenen Studien sind Interventionsstudien, die übrigen sieben qualitative Interviewstudien. Die identifizierten Unterstützungsmaßnahmen wurden zunächst den beiden Kategorien Interventionen und Strategien und anschließend unter Zuhilfenahme des Konzepts des Contextual Consents fünf komplexitätssteigernden Dimensionen einer Entscheidungssituation zugeordnet (individuelle, soziale, medizinische, informationelle und Folgendimension). Darauf aufbauend wurden im zweiten Teilprojekt acht Entscheidungsassistenzmaßnahmen abgeleitet: (1) Gesprächsstruktur, (2) Elaborierte klare Sprache, (3) Ambiente / Raumgestaltung, (4) Stichwortlisten, (5) Prioritätenkarten, (6) Visualisierung, (7) Vereinfachte schriftliche Einverständniserklärung sowie (8) Personenzentrierte Haltung des Entscheidungsassistenten (1-7: Tools, 8: Grundeinstellung). Die Tools zielen überwiegend auf eine Komplexitätsreduktion in der informationellen Dimension unter Berücksichtigung der fähigkeitsbezogenen und der bedürfnisbezogenen individuellen Dimension ab. Durch Anpassungen der Informationsdarbietung oder der kommunikativen Interaktion im Gespräch dienen sie mehrheitlich der Förderung des (Informations-) Verständnisses. Die Analyse der qualitativen Daten im dritten Teilprojekt zeigt, dass die Erfahrung der vereinfachten Aufklärungsgespräche durch drei übergreifende Themen gekennzeichnet ist. Die Kategorie Formalität versus Informationsgewinn illustriert die individuelle Bedeutung des Aufklärungsgesprächs für die Teilnehmer und deren Bewertung des Prozesses der informierten Einwilligung. Die Kategorie Wahrnehmung der Unterstützung skizziert die Bewertungen der angewandten Unterstützungstools durch die Teilnehmer. Die Kategorie Der Wahrheit ins Auge sehen müssen stellt dar, dass die erlebte Situation des vereinfachten Aufklärungsgesprächs wesentlich durch die Verdachtsdiagnose Demenz bestimmt ist, die im Rahmen aller Aufklärungsgespräche besprochen wurde.
Fazit. Bislang gibt es wenig empirische Forschung zu Entscheidungsassistenz für Menschen mit Demenz und Unterstützungsmaßnahmen werden überwiegend unsystematisch entwickelt und angewendet. Die Wirksamkeit einzelner Unterstützungsmaßnahmen kann aufgrund fehlender Interventionsstudien selten beurteilt werden. Unterstützungsmaßnahmen zielen überwiegend auf eine Komplexitätsreduktion in der Informationsdarbietung und im kommunikativen Interaktionsprozess ab, wobei sie kognitive Beeinträchtigungen und Interaktions-/ Entscheidungsbedürfnisse von Menschen mit Demenz berücksichtigen. Die definierten Tools können als erste konkret handhabbare Werkzeuge verstanden werden, die das strukturierte Leisten von Entscheidungsassistenz für Menschen mit Demenz erleichtern sollen. Sie sind übertragbar auf verschiedene Entscheidungssituationen. Eine Bewertung der Wirksamkeit der definierten Tools sollte in weiteren Entscheidungssituationen und mit größeren Stichproben weiteruntersucht werden. Die Ergebnisse der Evaluation liefern jedoch erste Hinweise darauf, dass einige Teilnehmer sich von einzelnen Tools unterstützt gefühlt haben und die anvisierte Komplexitätsreduktion in der informationellen Dimension in einigen Fällen erfolgreich war. Eine wesentliche Komplexitätssteigerung in der untersuchten Entscheidungssituation entstand durch die negative Emotionen auslösende Vermittlung einer potentiellen Demenzdiagnose (Folgendimension). Dieses Ergebnis impliziert, dass die definierte „verständnisfördernde Toolbox“ um Unterstützungsmaßnahmen zur emotionalen Entlastung von Menschen mit Demenz erweitert werden muss, da davon ausgegangen werden kann, dass vielfältige Entscheidungssituationen für Menschen mit Demenz emotional hoch belastend sind.
Hintergrund
Obwohl Feedback ein wichtiges und gut untersuchtes Element der medizinischen Ausbildung darstellt, wird es trotz eines großen Bedarfs der Studierenden sowohl im Unterricht als auch in Prüfungssituationen nur selten angewendet. Die Frankfurter Medizinstudierenden beklagen besonders, dass sie zu ihren Objective Structured Clinical Examinations (OSCEs) als Abschlussprüfung im Fach Chirurgie bisher kein detailliertes Feedback erhalten. Auch die Prüfenden beklagen häufig, dass sie die Studierenden weder für herausragende Leistungen loben noch über auftretende Fehler informieren können.
Ziel dieser Arbeit ist deshalb die Erstellung und Implementierung eines strukturierten schriftlichen Feedbacks in eine bestehende OSCE-Prüfung im Fach Chirurgie, das an den Bedürfnissen sowohl der Studierenden als auch der Prüfenden orientiert ist.
Material und Methoden
Das Studiendesign war prospektiv. Im ersten Schritt wurde eine Befragung erfahrener OSCE-Prüfender durchgeführt, um zu erheben, welches Feedback sie gerne an Studierende weitergeben würden. Basierend hierauf wurde ein erster Feedbackbogen erstellt. Dieser umfasste neben vorformulierten Aussagen auch die Möglichkeit Freitextkommentare zu geben und wurde von den Prüfenden für jeden Studierenden in der Wechselzeit zwischen den OSCE-Stationen ausgefüllt. Die Feedbackbögen wurden anschließend eingescannt und per E- Mail an die Studierenden geschickt. Im Anschluss hieran erfolgte eine webbasierte Befragung der Studierenden und der OSCE-Prüfenden, sowie eine tiefergehende Befragung der Studierenden in Form von Fokusgruppen- Interviews.
Basierend auf den Ergebnissen der Umfragen und der Fokusgruppen wurden die Feedbackbögen nochmals grundlegend überarbeitet und im folgenden OSCE erneut angewendet. Die Zufriedenheit der Prüfenden und Studierenden wurde analog zur ersten Befragung erhoben.
Ergebnisse
Insgesamt nahmen 351 Studierende und 51 Prüfende in beiden OSCEs an der Studie teil. In der abschließenden Online-Evaluation gaben 87,5% der Studierenden und 91,6% der Prüfenden an, dass sie zustimmen oder eher zustimmen, dass das schriftliche Feedback in zukünftigen OSCE-Prüfungen weiterhin angewendet werden soll. Mehr als 50% der Studierenden gaben jedoch an, dass das Feedback noch nicht konkret genug sei.
Mehr als ein Viertel der Prüfenden gab an, dass das Ausfüllen der Feedbackbögen zeitlich herausfordernd sei. In allen Fokusgruppen wurde das schriftliche Feedback durch die Studierenden befürwortet.
Schlussfolgerung
Die Implementierung eines strukturierten schriftlichen Feedbacks in einen OSCE ist problemlos möglich. Das schriftliche Feedback wird sowohl von den Prüfenden als auch von den Studierenden als nützlich empfunden.
Analyse der Genauigkeit des neurochirurgischen Operationsroboters Robotic Surgery Assistant (ROSA)
(2020)
In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob der Roboter ROSA bei der Durchführung von intrakraniellen Biopsien oder Elektrodenimplantationen eine Alternative zur klassischen, rahmenbasierten Stereotaxie darstellt. Dazu sollte die mechanische und die Anwendungsgenauigkeit des Systems ermittelt werden. Zur Bestimmung der mechanischen Genauigkeit wurde eine experimentelle Phantomstudie durchgeführt. Hier wurden durch den Roboter wiederholt zehn Trajektorien an einem Stereotaxiephantom angefahren. Der Abstand der robotischen Nadel zum Zielpunkt im Phantom wurde anhand von Röntgenbildern bestimmt. Die Wiederholung des Versuchsaufbaus unter Variation der Planungsbildgebung erlaubte den Vergleich verschiedener Schichtdicken sowie zwischen low-dose und normal-dose Verfahren. Die Anwendungsgenauigkeit sollte durch die Analyse operativer Ergebnisse der ROSA erfasst werden. Dazu wurde anhand von postoperativen Bildern die Genauigkeit anhand des Abstands zwischen geplanter und tatsächlicher Lage von Stereoelektroenzephalographie-Elektroden ermittelt. Es wurden verschiedene Referenzierungstechniken, die der Orientierung des Roboters dienen und bei denen eine präoperative Planungsbildgebung (CT oder MRT) mit einem Abbild des OP-Gebietes (durch Oberflächenerkennung oder durch einen Stereotaxierahmen) referenziert wird, verglichen, nämlich CT-Laser; CT-Leksell-Rahmen und MRT-Laser. Die Ergebnisse wurden einer statistischen Analyse unterzogen. Dabei zeigte sich, dass der ROSA-Roboter eine sehr hohe mechanische Genauigkeit im Submillimeterbereich erreicht. Genauigkeitseinbußen bei einer größeren Schichtdicke der zur Planung verwendeten Computertomographie sind messbar, aber gering. Ein signifikanter Einfluss bei der Verwendung eines low-dose-Protokolls konnte nicht festgestellt werden. Dennoch zeigte sich, dass der entscheidende Teil der Ungenauigkeiten in der klinischen Anwendung entsteht und dabei insbesondere durch die Referenzierungstechnik bestimmt wird. Referenzierungen, die auf einer Computertomographie basierten, erwiesen sich als zufriedenstellend genau und als konkurrenzfähig zur konventionellen Methode. Der Unterschied zwischen dem rahmenbasierten und dem auf Oberflächenerkennung basierenden Verfahren war dabei so gering, dass letzteres sich angesichts seiner Vorteile in der Anwendung als besonders günstiges Verfahren hervortut. Im Gegensatz dazu stand das MRT-Laser-Verfahren, welches bei relativ hohen Abweichungen nur eingeschränkt anwendbar scheint und sich damit eher für Anwendungsbereiche mit geringeren Genauigkeitsanforderungen eignet, wie bspw. Biopsien. Weiterhin kann der Verlauf der Trajektorie an den höheren Sicherheitsabstand angepassten werden. Bei der Einordnung der ermittelten Genauigkeiten ist zu beachten, dass es viele weitere, von der Referenzierungs- und Bildgebungsmethode unabhängige Einflussfaktoren gibt. In dieser Arbeit war der Einfluss der erfassten externen Paramter zwar limitiert, bei anderen Autoren zeigte sich jedoch ein signifikanter Effekt. Dennoch deckt sich die Gesamtgenauigkeit mit den Ergebnissen anderer Arbeiten.
In Zusammenschau der Ergebnisse weist die vom ROSA-Assistenzsystem assistierte Stereotaxie eine verbesserte Prozessqualität auf, unter anderem durch die erhebliche Zeitersparnis, ggf. der Wegfall des Transports des narkotisierten Patienten, die Adaptionsmöglichkeiten der Prozessteilschritte an den Patienten, sowie eine hohe Nutzerfreundlichkeit. Entscheidend ist jedoch, dass es sich um ein sehr sicheres Verfahren handelt: Durch die hohe Genauigkeit wird das Operationsrisiko minimiert, gleichzeitig erlauben Laser-gestützte Registrierungsverfahren eine Reduktion der Strahlenexposition. Zur Konsolidierung der in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse sind weitere klinische Daten notwendig.
Computational estimation is an important skill in everyday life as well as in educational contexts. In the last decades, research has found that children use several strategies in computational estimation and that children’s strategy use depends on different parameters. Still, little is known about the underlying cognitive processes. In the present work, we addressed this issue by investigating (1) the influence of individual differences in children’s executive functions on their strategy use and (2) the influence of varying specific task and problem characteristics that are discussed to involve different cognitive processes.
In four studies, we asked third and fourth graders to solve computational estimation tasks by rounding the summands. Study 1 addressed the influence of working memory updating. The study found that efficient updating contributed to children’s strategy use and moderated relations with problem characteristics. A deliberate feature of Study 1 was to restrict participants’ strategy choice to the rounding-down and rounding-up strategies. Study 2 in turn investigated children’s strategy use when mixed-rounding was allowed. Results indicated that children did not consider unit digits of both operands jointly. Also, no influence of executive functions could be found. Consequently, in Study 3, children’s strategy selection when they could choose between three versus only two strategies was contrasted and the role of working memory updating was investigated. Indeed, children chose the best available strategy more often when three strategies were available. Importantly, relative strategy selection performance differed with children’s updating capacities.
Finally, Study 4 addressed another task variation that is important in everyday life and educational contexts. That is, presentation duration and modality were varied. Data showed that a permanent, written format was most beneficial for children’s strategy use and that children’s updating moderated presentation effects.
In sum, the results of the present work could shed some light onto cognitive processes in children’s strategy use in computational estimation. Specifically working memory updating
seems to contribute to third and fourth graders strategy use. Interpreting interactions with different task variations, updating most likely influences associative processes, long term memory consolidation and retrieval as well as encoding and calculation processes.
The growing number of infections with multi-resistant bacteria or the current COVID-19 pandemic put compounds with therapeutic properties into the public focus. Non-ribosomal peptides (NRPs) are natural products that are already marketed as antibiotics, cytotoxic agents or immunosuppressants. Their biological activities rely on the structural diversity including non-proteinogenic amino acids (AAs), heterocycles or modifications like methylation or acylation.
The biosynthesis of NRPs is carried out by non-ribosomal peptide synthetases (NRPSs). These multifunctional megaenzymes show a modular architecture like in an assembly-line. Each module is thereby responsible for the incorporation and modification of one AA and therefore contains different catalytic domains. The adenylation (A) domain recognizes and activates its specific substrate in an ATP-dependent manner which is transferred to a 4’-phosphopantetheine cofactor post-translationally attached to the thiolation (T) domain. Peptide bond formation between two T domain bound substrates catalysed by the condensation (C) domain transfers the growing peptide chain to the following module. Such a C-A-T module can be extended with optional domains to integrate structural diversity and a terminal thioesterase (TE) domain usually releases the peptide via hydrolysis or intramolecular attack of nucleophiles. Inspired by the modular architecture, NRPS engineering deals with the modification of NRPs in order to increase biological activities, circumvent bacterial resistances or create de novo peptides. This can be achieved by mutasynthesis or modification of the substrate binding pocket as well as single and multiple domain substitution. However, the few successful approaches led to impaired enzymes and did not establish a general applicable guideline. In the first publication as part of this work, the development of such a guideline comprising three rules is addressed. First, the A-T-C tridomain named exchange unit (XU) is seen as a catalytic unit instead of a module. When using them as building blocks, the C domain’s specificity for the AA of the following XU has to be considered as second rule. Third, a conserved WNATE motif within the C-A linker depicts the fusion point of the XUs. Upon heterologous expression of the cloned plasmids in E. coli and high performance liquid chromatography coupled mass spectrometry-based analysis of the extracts, the ambactin-producing NRPS from Xenorhabdus was reprogrammed with one and two XUs. This only leads to a moderate loss of production titre or an even higher one when the AA configuration was changed by introducing a dual condensation/epimerization (C/E) domain. The pentamodular GameXPeptide-producing NRPS was reconstructed using up to five XUs of four different NRPSs and even completely de novo synthetases were created. The second publication describes the exchange unit condensation domain (XUC) concept and relies on a fusion point between the two subdomains (N-terminal CDsub and C-terminal CAsub) of the C domain’s V-shaped pseudodimeric structure which generates A-T didomains with flanking CAsub and CDsub. These hybrid C domain-forming building blocks depict an improvement to the XU concept by avoiding the drawback of C domain specificity. This allows a more flexible NRPS engineering that can e.g. enable peptide library design. Furthermore, beside a combination of both concepts within one NRPS and a transfer to Bacillus NRPSs, the use of XUC with relaxed A domain specificity allowed further peptide modifications by introducing non-natural AAs. The third publication deals with aldehyde and alcohol-generating reductase (R) domains which depict an alternative for peptide release in NRPSs. A promoter exchange in X. indica identified a pyrazine-producing NRPS with a minimal architecture of an A, T and R domain and was therefore termed ATRed. R domains were additionally used in engineered NRPSs to produce pyrazinones and derivatives thereof by XU substitution although most constructs failed to show production. Beyond that, an R domain has been shown to replace a TE domain in wild type synthetases leading to slightly modified NRPs and the postulated biosynthesis was incidentally revised. Furthermore, an NRPS with terminal R domain was engineered to produce a free peptide aldehyde, which are known to be potent proteasome inhibitors. For the above mentioned ATReds, the presence of up to three coding regions was further identified in 20 different Xenorhabdus strains but only six of them were verified to produce pyrazines. All ATReds share variable sequence similarities among each other and were subsequently divided into three subtypes. One subtype is supposed to perform the pyrazine biosynthesis via a non-canonical catalytic triad.
Astrozyten erfüllen verschiedene Funktionen im Zentralnervensystem, welche sich in die Bereiche Entwicklung, Durchblutung, Metabolismus, Strukturerhalt und Gliotransmission unterteilen lassen. Astrozyten sind an der synaptischen Informationsverarbeitung beteiligt und wirken an zahlreichen höheren Hirnfunktionen mit. Durch Regulation der synaptischen Transmission und Plastizität sind Astrozyten am Lernverhalten und Erinnerungsvermögen, sowie an der Verhaltensmodulation und Verarbeitung emotionaler Reize involviert. Im Zuge dieser zahlreichen Funktionen können Astrozyten auf externe Stimuli mit der gezielten Freisetzung von Gliotransmittern reagieren.
In kultivierten Astrozyten konnte Keil143 das TGN, bestehend aus Zisternen und Vesikeln, darstellen und mit anti-Rab6 identifizieren. Rab6 mit seinen Subtypen A und B gehört der Superfamilie der monomeren Ras-GTPasen an, die den intrazellulären Membran- und Vesikelverkehr regulieren. Rab6 spielt in HeLa-Zellen beim Transport vesikulärer Organellen vom TGN zur Zellmembran eine wichtige Rolle. Assoziationsanalysen von Rab6A mit vesikulären Glutamattransportern, Serinracemase und Markern der regulierten Exozytose in kultivierten Astrozyten143 deuten darauf hin, dass dieses Rab6A-Organellsystem die ultrastrukturelle Grundlage für die Freisetzung von Gliotransmittern wie D-Serin und Glutamat bildet.
Zur Untersuchung, ob Rab6A tatsächlich ein System der Glia-Neuron-Kommunikation im Gehirn darstellt, war es zunächst unabdingbar das Vorkommen von Rab6A in situ zu untersuchen. Die durchgeführten immunzytochemischen Färbungen an Hirnschnitten der Maus zeigen das gleichmäßige und ubiquitäre Vorkommen von Rab6A in allen untersuchten Hirnregionen. Durch verblindet durchgeführte Kolokalisationsanalysen von Rab6A mit den etablierten astrozytären Markern Glutaminsynthetase (GS), Glial fibrillary acidic protein (GFAP), Aldh1L1 und Sox9 konnte eine Lokalisation von Rab6A in allen Astrozyten gezeigt werden. Weitere Analysen schließen die Lokalisation von Rab6A in Mikroglia (Iba1), NG2-Zellen (NG2) und Oligodendrozyten (CNPase) aus. Die Astrozyten unterscheiden sich in Größe und subzellulärem Verteilungsmuster der Rab6A+ Strukturen, wonach eine Kategorisierung in vier Typen vorgenommen wurde. Anhand der Einteilung kann vermutet werden, dass größere Rab6A+ TGN-Zisternen bis weit in die Zellperipherie transportiert werden und kleine Rab6A+ Vesikel erst dort ausknospen und der Exozytose zugeführt werden. Zur Frage der möglichen astrozytären Subpopulationen konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten Astrozyten GS+, Aldh1L1+, Sox9+ und Rab6A+ sind, jedoch nicht GFAP+.
Um die prinzipielle Übertragbarkeit der gewonnenen Befunde auf den Menschen zu überprüfen, wurde reseziertes Cortex-Gewebe von drei Patienten mit unterschiedlicher pathologischer Genese untersucht. Rab6A ist im massiven Ausmaß in humanen Astrozyten lokalisiert, was nahelegt, dass die zuvor an der Maus gewonnenen Ergebnisse auf den Menschen übertragbar sind.
Die mögliche funktionelle Bedeutung von astrozytärem Rab6A im Gehirn wurde an HFS-Schnitten untersucht. Die Untersuchung zeigt einen signifikanten Anstieg der Rab6A+ Intensität in der gesamten Molekularschicht der Fascia dentata der stimulierten im Vergleich zur unstimulierten Seite. Da die HFS ein etabliertes LTP-Modell darstellt, könnte es infolge dieser zu einer strukturellen, intrazellulären Veränderung der Astrozyten mit erhöhter Freisetzung von D-Serin oder Glutamat aus Rab6A+ Vesikeln kommen, was das Lernverhalten beeinflussen könnte. Die dargestellten Ergebnisse legen eine Auswirkung der HFS auf Rab6A nahe.
Zur Bestätigung der immunzytochemischen Untersuchungen wurde die mRNA-Expression von Rab6A in Astrozyten bereits publizierter Transkriptomanalysen untersucht. Die in den Publikationen verwendeten Genom-Chips treffen allenfalls indirekt eine Aussage zu Rab6A, da Rab6 allgemein und nur Rab6B spezifisch untersucht wurde, jedoch keine spezifische Rab6A Sonde erwähnt wird.
Zusammenfassend kann Rab6A als spezifisches und selektiv in Astrozyten vorkommendes Protein dargestellt und als neuer astrozytärer Marker etabliert werden, der auch Astrozyten des humanen Gewebes markiert. Durch die gewonnenen Befunde kann in nachfolgenden Studien die mögliche Bedeutung von Rab6A in neuropathologischen und neurophysiologischen Prozessen untersucht werden.
Understanding the hadron spectrum is one of the primary goals of non-perturbative QCD. Many predictions have experimentally been confirmed, others still remain under experimental investigation. Of particular interest is how gluonic excitations give rise to states with constituent glue. One class of such states are hybrid mesons that are predicted by theoretical models and Lattice QCD calculations. Searching for and understanding the nature of these states is a primary physics goal of the GlueX experiment at the CEBAF accelerator at Jefferson Lab. A search for a JPC = 1−− hybrid meson candidate, the Y(2175), in φ(1020)π+π+ and φ(1020)f0(980) channels in photoproduction on a proton target has been conducted. A first measurement of non-resonant φ(1020)π+π+ and φ(1020)f0(980) total cross sections in photoproduction has been performed. An upper limit on the resonance production cross section for the Y (2175) → φ(1020)π+π+ and Y (2175) → φ(1020)f0(980) channels are estimated. Since the analysis essentially depends on the quality of the charged kaon identification, also an optimization of particle identification through an improvement of the energy loss estimation in the central drift chamber by a truncated mean method has been investigated.
Im hymnologischen Bereich sind die Entstehung und jahrhundertelange Tradierung deutscher evangelischer Kirchenlieder von großer Bedeutung. Sie übten in zahlreichen Ländern großen Einfluss aus. Im 19. Jahrhundert beispielsweise wurden sie in das Englische übersetzt und in Ländern dieses Sprachraums gesungen. Bei der Missionierung Koreas wurden westliche – darunter auch einige deutsche – Kirchenlieder eingeführt. Es fällt aber auf, dass im Übertragungsprozess inhaltliche und sprachliche Unterschiede zwischen deutschen und koreanischen Fassungungen auftreten konnten. Auf dieses Geschehen hat die Verfasserin der vorliegenden Studie bei ihrer Tätigkeit als Kirchenmusikerin in Deutschland das Augenmerk gerichtet und es zum Ausgangspunkt ihrer Dissertation gewählt.
Ende des 19. Jahrhunderts wurde Korea von anderen Ländern gezwungen, sich zu öffnen. Daraufhin kamen viele Ausländer – unter ihnen auch christliche Missionare – ins Land, die je eine eigene Gesangbuchliteratur mitbrachten. Insbesondere die amerikanische Mission fasste Fuß. Das erste koreanische Gesangbuch Chanmiga wurde im Jahr 1892 veröffentlicht; ihm folgten weitere Ausgaben. In der ersten Hälfte des 20. Jahrhunderts waren amerikanische Missionare Mitherausgeber dieser Gesangbücher. Folgerichtig dominierte westliches Liedgut.
Die vorliegende Arbeit untersucht jene deutschen Kirchenlieder, die vor 1945 in das Koreanische Gesangbuch aufgenommen wurden. Sie fragt danach, auf welche Weise sie übernommen wurden und sich Änderungen bei ihrer Übermittlung vollzogen haben. Methodisch werden Quellen miteinander verglichen, die zum Zeitpunkt der Aufnahme relevant waren. Dank der älteren deutschen, englischen und amerikanischen Gesangbücher, die online und in deutschen Bibliotheken (Online-Archive) freigeschaltet sowie im Gesangbucharchiv Mainz vorhanden sind, ist diese umfangreiche Forschung möglich geworden.
Die Bedeutung des Singens ist für die koreanische Christenheit während der Annexion durch Japan (1910-1945) groß gewesen. Sie sang als Unabhängigkeitsbewegung Kirchenlieder, unter denen besonders Martin Luthers Choral Ein feste Burg ist unser Gott unverzichtbar wurde. Aussagen zeitgenössischer Christen belegen seine damalige Beliebtheit. Ein Grund dafür liegt darin, dass in ihm zahlreiche Analogien zur Situation der unterdrückten Koreaner erkennbar waren. Das Lied vermittelte ihnen Trost, Mut und einen festen Gottesglauben. Seine besondere Bedeutung erkannte auch das japanische Regime und verbot es während der gesamten Besatzungszeit.
Auch nach 1945 wurden deutsche Kirchenlieder in koreanische Gesangbücher aufgenommen. Ihre Anzahl sank jedoch gegen Ende des 20. Jahrhunderts; das aktuelle Gesangbuch, 21st Century Hymnal, von 2006 enthält nur noch 21. Es ist schließlich festzuhalten, dass Ein feste Burg nicht nur im Gottesdienst, sondern auch im Theater zu hören ist – paradigmatisch in der Oper Son Yang Won, eine Komposition des Kirchenmusikers Chae Hoon Park (*1922) aus dem Jahr 2011. Die Oper trägt den Namen des Märtyrers Yang Won Son (1902-1950) und thematisiert geschichtliche Ereignisse von nationaler Bedeutung: die Problematik der Anarchie, beginnend mit der Landesteilung durch die Sowjetunion und USA in zwei Besatzungszonen 1945 sowie die Yeosu-Sucheon-Rebellion von 1948, organisiert von wenigen kommunistischen Soldaten gegen die südkoreanische Regierung. Die vorliegende Studie untersucht, welche Bedeutung das Lied Ein feste Burg in der Oper einnimmt und wie Chae Hoon Park es bearbeitet hat.
Die Dissertation beschränkt ihre hymnologische Forschung nicht auf die Übernahme und Rezeption deutscher Kirchenlieder in Korea; sie blickt umgekehrt auch auf die Rezeption koreanischer Gesänge in Deutschland. Durch Begegnungen von deutschen mit koreanischen Christen entstanden bzw. entstehen neue Gesänge und Kompositionen und werden durch ökumenische Gottesdienste und Veranstaltungen verbreitet. Die ökumenische Bewegung bewirkte nach dem Zweiten Weltkrieg Änderungen im Liedrepertoire. Gesänge, nicht nur aus England, Europa und Nordamerika, sondern auch aus Afrika, Asien und Südamerika, wurden überall aufgenommen und gesungen. Die aktuellen deutschen und koreanischen Gesangbuchinhalte belegen dies.
Die Ausführungen der Studie halten fest, dass religiöse Bewegungen – Missions- und ökumenische Bewegung – bei der Übermittlung althergebrachter und der Entstehung neuer Lieder eine große Rolle spielten. Dies ist anhand der Entwicklung des Koreanischen Gesangbuchs erkennbar. Früher wurden westliche Kirchenlieder von amerikanischen Missionaren nach Korea transferiert; die einheimischen Christen vernachlässigten wiederum ihre eigene Kultur und Musik. Deshalb dominierte für geraume Zeit westlich geprägtes Liedgut. Die Koreanisierung der Kirchenlieder bzw. Gesangbücher wird nun seit einigen Jahrzehnten forciert. Die wachsende kirchenmusikalische Qualifikation koreanischer Musiker, das zunehmend selbstbewusst werdende einheimische Christentum und die ökumenische Öffnung der Kirchen leisten hier wertvolle Beiträge.
Two main types of methods are used in gene therapy: integrating vectors and nuclease-based genome engineering. Nucleases are site-specific and are efficient for knock-outs, but inefficient at inserting long DNA sequences. Integrating vectors perform this task with high efficiency, but their insertion occurs at random genomic positions. This can result in transformation of target cells, which leads to severe adverse events in a gene therapy context. Thus, it is of great interest to develop novel genome engineering tools that combine the advantages of both technologies. The main focus of this thesis is on generating such a targetable integrating vector.
The integrating vector used in this project is the Sleeping Beauty (SB) transposon, a DNA transposon characterized by high activity across a wide range of cells. The SB transposase was combined with an RNA-guided Cas9 nuclease domain. This nuclease component was meant to direct transposase integration to specific targets defined by RNAs. The SB transposase was fused to cleavage-inactivated Cas9 (dCas9) to tether it to the target sites. In addition, adapter proteins consisting of dCas9 and domains non-covalently interacting with SB transposase or the SB transposon were generated. All constituent domains of these fusion proteins were tested in enzymatic assays and almost all enzymatic activities could be verified.
Combining the fusion protein dCas9-SB100X with a gRNA binding a sequence from the AluY repetitive element resulted in a weak, but statistically significant enrichment around sites bound by the gRNA. This enrichment was ca. 2-fold and occurred within a 300 bp window downstream of target sites, or within the AluY element.
Targeting with adapter proteins and targeting of other targets (L1 elements or single-copy targets) did not result in statistically significant effects. Single-copy targets tested included the HPRT gene and three specifically selected GSH targets that were known to be receptive to SB insertions. The combination with a more sequence-specific transposase mutant also failed to increase specificity to a level allowing targeting of single-copy loci. Genome-wide analysis of insertions however demonstrated, that dCas9-SB100X has a different insertion profile than SB100X, regardless of the gRNA used.
As low efficiency of retargeting is likely a consequence of the high background activity of the SB100X transposase in the fusion constructs, a SB mutant with reduced DNA affinity, SB(C42), was generated. For this mutant, transposition activity was partly dependent on a dCas9 domain being supplied with a multi-copy target gRNA, specifically a 2-fold increase in the presence of a AluY-directed gRNA. Whether using this mutant results in improved targeting remains to be determined.
In a side project, an attempt was made to direct SB insertions to ribosomal DNA by fusing the transposase to a nucleolar protein. This fusion transposase partially localized to nucleoli and insertions catalyzed by this transposase were found to be enriched in nucleolus organizer regions (NORs) and nucleolus-associated domains (NADs).
The aim of a second side project was increasing the ratio between homology-directed repair (HDR) and non-homologous end-joining (NHEJ) at Cas9-mediated double-strand breaks (DSBs). To achieve this, Cas9 was fused to DNA-interacting domains and corresponding binding sequences were fused to the homology donors. While an increased HDR/NHEJ ration could be observed for the fusion proteins, it was not dependent on the presence on the binding sequences in the donor molecules.