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Die klinische Pfade zielten in erster Linie darauf ab, die Aufenthaltsdauer zu verkürzen und unnötige Kosten zu sparen, während die Qualität der Pflege erhalten blieb oder verbessert wurde. Bei der laparoskopischen Cholezystektomie gibt es keine ausreichenden Beweise für einen Einfluss auf postoperative Komplikationen.
In dieser retrospektiven Studie wurde die logistische Regression verwendet, um einen Neigungswert zu berechnen, und nach dem Abgleich werden 296 Patienten in beiden Gruppen im Hinblick auf postoperative Komplikationen unter Verwendung des Clavien-Dindo-Klassifizierungssystems als primäres Ziel analysiert. Darüber hinaus wurden sekundäre Ziele wie Aufenthaltsdauer, Einhaltung und Abweichung vom klinischen Pfad in Bezug auf die Entlassung von Patienten analysiert. Das relative Risiko des primären Ergebnisses wurde berechnet und mit dem E-Wert als Ansatz für Sensitivitätstests verglichen.
Aufgrund des obligatorischen Teil der klinischen Pfad bei den Patienten betrug die Compliance 100 Prozent. In 16% der Fälle trat eine Abweichung vom Pfad in Bezug auf die geplante Entlassung des Patienten am zweiten Tag nach der Operation auf. Nach Anpassung um potenzielle Faktoren beträgt das relative Risiko beim Vergleich der Clavien-Dindo-Komplikationsbewertung 0 versus 1-4 ist 1,64 (95% CI 0,87; 3,11), was nicht signifikant unterschiedlich ist (p = 0,127).
Nach Matching beträgt die Verweildauer 3,69 Tage ohne bzw. 3,26 Tage mit dem klinischen Pfad.
Vergleich zu bereits implementierter strukturierter Standardoperationsverfahren kann ein klinischer Pfad postoperative Komplikationen nicht reduzieren.
Dennoch betrachten wir unseren klinischen Pfad als ein äußerst wertvolles Instrument für die interdisziplinäre Verwaltung des Krankenhausaufenthalts des Patienten unter der Aufsicht eines erfahrenen Chirurgen.
Komplexität und Zufälligkeit
(1978)
Pericytes are capillary-associated mural cells involved in the maintenance and the stability of the vascular network. This thesis aims to investigate the role of pericytes in the heart in the context of ageing and disease. We highlight the malignant effects of the remodelling in the heart and stress the focus on the role of cardiac pericytes in this context. We show that ageing reduces pericyte coverage and that myocardial infarction (MI) causes an activation of these cells. Single-nuclei and single-cell RNA sequencing analysis of murine hearts further revealed that the expression of the Regulator of G-protein signalling 5 (Rgs5) is reduced in cardiac pericytes both in ageing and transiently at day 1 and day 3 after MI. The loss of RGS5 in pericytes drives an entropic state of these mural cells characterized by morphological changes, excessive extracellular deposition and enhanced Gaq mediated GPCR signalling. The deletion of RGS5 in pericytes causes cardiac systolic dysfunction, induces myocardial fibrosis, and drives the activation of cardiac fibroblasts in a TGFb-dependent manner. In conclusion, our results describe the importance of pericytes maintaining cardiac homeostasis, identify RGS5 as a key regulator of this process and propose pericytes as crucial mediators of cardiac fibrosis and possible therapeutic targets to prevent cardiovascular disease.
Die Verwendung von Photoschaltern zur gezielten Kontrolle von Systemen birgt ein hohes Potential hinsichtlich biologischer Fragestellungen, bis hin zu optoelektronischen Anwendungen. Infolge einer Photoanregung kommt es zu Geometrieänderungen, die einen erheblichen Einfluss auf ihr photophysikalisches Verhalten haben. Die Änderungen der photochemischen, wie photophysikalischen Eigenschaften, beruht entweder auf der Isomerisierung von Doppelbindungen oder auf perizyklischen Reaktionen. Durch sorgfältige Modifikationen, wie beispielsweise die Änderung der Konjugation durch unterschiedlich große π-Elektronensysteme, der Molekülgeometrie oder der Veränderung des Dipolmoments, lassen sich intrinsische Funktionen variieren.
Die Kombination dieser Eigenschaften stellt eine komplexe Herausforderung dar, da diese Änderungen einen direkten Einfluss auf wichtige Charakteristika wie die Adressierbarkeit, die Effizienz und die Stabilität der Moleküle haben. Darüber hinaus spielt die thermische Stabilität eine erhebliche Rolle im Hinblick auf die Speicherung von Energie oder Informationen für Anwendungsbereiche in der Energiegewinnung und Datenverarbeitung.
Für die Anwendung solcher photochromen Moleküle ist hinsichtlich der oben genannten Eigenschaften auch das Wissen über den photoinduzierten Reaktionsmechanismus unabdingbar.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss auf die Isomerisierungsdynamik organischer Photoschalter durch unterschiedliche Modifikationen mittels stationärer und zeitaufgelöster Spektroskopie untersucht. Im Bereich der Merocyanine konnte ein Derivat vorgestellt werden, das ausschließlich zwischen zwei MC-Formen (trans/cis) isomerisiert. Die interne Methylierung am Phenolatsauerstoff der Chromeneinheit verhindert die Ringschlussreaktion zum SP und somit seinen zwitterionischen Charakter. Die stabilen Grundzustandsisomere TTT und CCT weisen durch den Methylsubstituenten eine hypsochrome Verschiebung ihrer Absorptionsmaxima auf, während TTT das thermodynamisch stabilste Isomer darstellt. Das MeMC wies eine erstaunlich hohe Effizienz seiner Schaltamplituden, insbesondere der TTT → CCT Photoisomerisierung auf, sowie eine überaus hohe Quantenausbeute.
Das MeMC wies zudem eine signifikante Lösungsmittelabhängigkeit auf, die sich insbesondere in der Photostabilität bemerkbar macht. Während das MeMC in MeCN und EtOH photodegradiert, konnte in EtOH/H2O eine konstante Reliabilität festgestellt werden. Diese Zuverlässigkeit impliziert nicht nur eine Stabilisierung durch das Wasser, sondern auch eine Resistenz gegenüber Hydrolysereaktionen. Darüber hinaus konnten kinetische Studien eine hohe thermische Rückkonversion von CCT zu TTT bei Raumtemperatur nachweisen, womit auf schädliche UV-Bestrahlung verzichtet werden könnte.
Die Untersuchung der Kurzzeitdynamiken beider Grundzustandsisomere gab Aufschluss über die Beteiligung anderer möglicher MC-Intermediate und den Einfluss der Methylgruppe auf das System. Mittels quantenchemischer Berechnungen konnte eine erste Initiierung um die zentrale Doppelbindung beider Isomere bestimmt werden, die jeweils zu einem heißen Grundzustandsintermediat führt, bis nach einer zweiten Isomerisierung der endgültige Grundzustand der Photoprodukte populiert wird. Dies bedeutet, dass die trans/cis-Isomerisierung über TTT-TCT-CCT und die Rückkonversion über CCT-CTT-TTT erfolgt.
Im Bereich der Hydrazon-Photoschalter konnten unterschiedlich substituierte Derivate mittels statischer und zeitaufgelösten UV/Vis-Studien untersucht werden. Da ESIPT Prozesse eine wichtige Funktion bei der Kontrolle von biologischen Systemen spielen, wurden verschiedene Hydrazonderivate hinsichtlich ihrer Reaktionsmechanismen untersucht. Als Rotoreinheit diente zum einen eine Benzothiazolkomponente, die die interne H-Bindung des angeregten Z-Hydrazons schwächen sollte und zum anderen wurde ein Chinolinsubstituent eingesetzt, der als Elektronenakzeptor diente und den H-Transfer begünstigt. Der Einsatz der Benzothiazolkomponente bewirkte die gewünschte Vergrößerung der bathochromen Verschiebung des E-Isomers, sowie eine deutliche Erhöhung der thermischen Stabilität des metastabilen
Zustands. Dies bestätigten die zeitaufgelösten Studien der Z zu E Isomerisierung, bei denen die Isomere im Vergleich zum Chinolinhydrazonderivat, in beiden ausgewählten Lösungsmitteln metastabile Z-Intermediate zeigten und eine Lebenszeit bis in den µs-Zeitbereich aufwiesen. Die Rückreaktion beider Derivate (HCN) und (HBN) hingegen zeigte eine barrierelose Umwandlung in die beteiligten Photoprodukte. Trotz der Verwendung des Chinolinsubstituenten zusammen mit Naphthalin als Rotoreinheit (HCN), konnte kein ESIPT Prozess beobachtet werden. HCB mit einer Kombination aus einem Chinolinrotor und eines Benzothiazolsubstituenten, wies eine Hydrazon-Azobenzol-Tautomerie auf, die ein prototropes Gleichgewicht zwischen dem E-Hydrazon und der E-Azobenzolform (E-AB) ausbildete. Die Reaktionsdynamiken des Z-Hydrazons zum E-AB wiesen eine ultraschnelle Bildung des Photoproduktes auf, während die Rückreaktion über einen ESIPT im sub-ps-Bereich erfolgte. Dieser H-Transfer hat die Bildung des angeregten E-Hydrazons zur Folge. Interessanterweise wurde kein Rückprotonentransfer nachgewiesen, sondern die mögliche Formation eines Z-AB gefunden. Damit unterscheidet sich dieser Reaktionsmechanismus erheblich von den typischen ESIPT Prozessen, die normalerweise zu ihrem Ausgangsmolekül zurückrelaxieren. Des Weiteren konnte ein Pyridinoxid und Benzoylpyridin-substituiertes Hydrazon charakterisiert werden, bei denen die stationären Studien kein Schaltverhalten, sondern Photodegradation aufwiesen. Die zeitaufgelösten Daten ergaben ebenfalls keine Photoproduktbildung, was die These der Photozersetzung unterstützt. Die Verwendung von zusätzlich substituierten Rotoreinheiten, wie beispielsweise Pyridinoxid und Benzoylpyridin, die aufgrund fehlender Protonenakzeptormöglichkeit keine interne H-Bindung ausbilden, erlaubt keine Bildung des Z-Hydrazon Isomers.
Die Ergebnisse der Studie und die Diversität der Datenbanken ist groß.
Für 12 Datenbanken wurde ein Punktesystem mit elf Items entworfen, um die Qualität der einzelnen Datenbanken zu objektivieren. Keine Datenbank konnte alle Bewertungskriterien erfüllen. Der insgesamt schlechte Punktedurchschnitt ist ein Indikator für die Mängel der aktuell verfügbaren Datenbanken. Außerdem konnten wir einen Qualitätsunterschied zwischen kostenpflichtigen und kostenfreien Datenbanken beweisen und mussten im Zuge dieser Ergebnisse die Frage stellen, ob kostenfreie Datenbanken überhaupt nützlich sind. Zwischen den kostenpflichtigen Datenbanken fallen die Qualitätsunterschiede weniger gravierend aus, wenngleich Stärken und Schwächen sich deutlich unterscheiden. Die häufigsten Wechselwirkungen wurden in allen Datenbanken mit großem Abstand zwischen rein psychiatrischen Interaktionspaaren erfasst. Dieses zeigt, wie wechselwirkungsreich Psychopharmaka sind und dass psychiatrische Patienten besonders vulnerabel sind. Die Nutzung digitaler Hilfsmittel scheint bei Betrachtung der hohen Anzahl ausgegebener Warnmeldungen unabdingbar zu sein, dennoch existiert große Uneinheitlichkeit bei der Bewertung der einzelnen Interaktionen. Die Vorstellung, dass zwei Kliniker bei Nutzung zweier unterschiedlicher Datenbanken zu völlig unterschiedlichen Empfehlungen kommen, fällt nicht schwer. Gleichzeitig könnte die Kooperation von Heilberuflern, die unterschiedliche Datenbanken verwenden, die Chance auf zusätzlichen Informationsgewinn und Austausch erhöhen, was im Umkehrschluss in einer erhöhten Arzneimitteltherapiesicherheit resultiert. In Studien konnte der positive Effekt interdisziplinärer Zusammenarbeit bereits bewiesen werden.
Zusammenfassend konnten umfangreiche Differenzen zwischen allen untersuchten Datenbanken aufgezeigt werden. Um den Anforderungen des klinischen Alltags zu genügen, müssen digitale Unterstützungssysteme weiterentwickelt werden.
Die „ideale Datenbank“ gibt es bisher nicht – das lässt sich durch unser Punktesystem beweisen. Um im klinischen Alltag Patientensicherheit zu gewährleisten ist die Nutzung einer einzelnen Datenbank bisher nicht ausreichend.
Die Gewährung der Patientensicherheit sollte unser oberstes Ziel sein und um dieses zu erreichen, bedarf es vieler Komponenten. Neben der Nutzung und vor allem Weiterentwicklung digitaler Unterstützungssysteme sollte auch der zwischenmenschliche Austausch weiter gefördert werden. Interdisziplinäre Zusammenarbeit im Sinne pharmazeutischer Dienstleistungen zur Medikationsanalyse könnten ein zusätzliches Instrument zur Vermeidung arzneimittelbezogener Probleme werden.
Zukünftig werden unsere Patienten am meisten von optimaler Nutzung weiterentwickelter Technologien, sowie wachsendem zwischenmenschlichem Austausch profitieren.
Das Heidelberger Ionenstrahl-Therapiezentrum (HIT) stellt Protonen-, Helium- und Kohlenstoff-Ionenstrahlen unterschiedlicher Energie und Intensität für die Krebsbehandlung und Sauerstoff-Ionenstrahlen für Experimente zur Verfügung. Der hierfür verwendete Beschleuniger ist darüber hinaus in der Lage auch Ionenstrahlintensitäten unterhalb der für Therapien verwendeten bereitzustellen. Allerdings ist das derzeit installierte Strahldiagnosesystems nicht in der Lage, das Strahlprofil bei solchen geringen Intensitäten (< 10^5 Ionen/s) zu messen. Dabei existieren mögliche medizinische Anwendung für diese niederintensiven Ionen-strahlen, wie beispielsweise eine neuartige und potentiell klinisch vorteilhafte Bildgebung: die Ionenradiographie. Eine essentielle Voraussetzung für diese und andere Anwendungen ist ein System zur Überwachung von Ionenstrahlen niedriger Intensität. Ein solches System wurde im Rahmen dieser Arbeit konzipiert, realisiert, getestet und optimiert.
Das Funktionsprinzip basiert auf szintillierenden Fasern, insbesondere solchen mit erhöhter Strahlungshärte für die Möglichkeit einer dauerhaften Platzierung im Therapiestrahl. Ein diese Fasern durchlaufendes Ion regt den darin enthaltenen Szintillator durch Stoßprozesse kurzzeitig an. Die dabei deponierte Energie wird anschließend in Form von Photonen wieder emittiert. Silizium-Photomultiplier sind an den Enden der Fasern montiert und wandeln die Photonensignale in verstärkte elektrische Impulse um. Diese Impulse werden von einer neuartigen und dedizierten Ausleseelektronik aufgezeichnet und verarbeitet. Ein Prototypaufbau, bestehend aus den genannten Teilen, wurde im Strahl getestet und kann das transversale Strahlprofil erfolgreich im Intensitätsbereich von 10^7 Ionen/s bis hinunter zu 10^2 Ionen/s aufzeichnen. Darüber hinaus konnte, durch die erfolgreiche Ankunftszeitmessung von einzelnen Ionen bis zu Intensitäten von 5*10^4 Ionen/s, ein Machbarkeitsnachweis für die Messung der Spur von einzelnen Teilchen erbracht werden.
Optimierung der Synthese eines neuen photolabil geschützten Nitroxid-Spin-Labels für RNA und DNA
(2023)
Im Rahmen dieser Arbeit konnte, ausgehend von den günstigen Ausgangsverbindungen Desoxyadenosin und Phthalsäureanhydrid, ein neues photolabil geschütztes Nukleotid 1 und sein Dummypartner 2 synthetisiert werden. Positiv zu bemerken ist, dass einige Schritte im Vergleich zu ähnlichen literaturbekannten Reaktionen in Einfachheit, Reinheit oder Ausbeute verbessert wurden. So konnte die Ausbeute der wichtigen Umwandlung des Amins 46 zum Iodid 47 durch den Ersatz des vorherigen DCM/DIM Gemisches durch reines DIM von 15 % auf akzeptable 50 % erhöht werden, was nicht nur Zeit, sondern auch zukünftige Chemikalienmengen einspart. Nicht nur hierbei, sondern auch bei der Nitrierung zu 61 oder auch der Oxidierung zu 63 war es von äußerster Wichtigkeit eine korrekte Temperaturkontrolle durchzuführen, da es sonst zu hohen Ausbeuteverlusten durch ungewollte Nebenreaktionen kommen konnte. Eine sehr interessante Beobachtung war die Kontrolle der Suzuki Miyaura-Kreuzkupplung durch die Anwendung verschieden starker Basen. Während schwache Basen wie KOAc nur zur Miyaura-Borilierung führten, begünstigten starke Basen wie K3PO4 die Suzuki Miyaura-Kreuzkupplung. Die Zusammenführung des Zucker Bausteins 36 und des Isoindolin-Bausteins 37 funktionierte sehr gut, sodass das Nukleotid 1 durch die Schützung der exozyklischen Amingruppe und Phosphorylierung des 3´-OH dargestellt werden konnte.
Die Synthese der 14mer DNA bzw. RNA Sequenzen mit den neuen Nukleotiden 1 und 2 funktionierten mit zufriedenstellenden Ausbeuten, nur die Abspaltung der Pac-Gruppe benötigte etwas harschere Bedingungen von 50 °C in 32 % Ammoniak über Nacht. Die photolabile Schutzgruppe in Strang (V) mDNA-Tetramethyl konnte nun abgespalten und das Nitroxid an Luft reoxidiert werden. Anhand von EPR-Spektren und einer HPLC Analyse ergab sich jedoch eine Abspalteffizienz von nur 70 %. Dies bedeutet, dass für künftige PELDOR Messungen eine Aufreinigung des Spaltgemisches zur Isolierung des Radikal-Strangs von Nöten ist.
Anhand des Schmelzpunkts der verschiedenen Duplexe wurde anschließend die mögliche Anwendung des Nukleotids weiter analysiert. Hierbei stellte sich heraus, dass der Benzolring sowohl in 2 als auch in 1 eine erhebliche Destabilisierung des Duplex erzeugte. Somit ist das neue photolabil geschützte Nukleotid als EPR Sonde in der Mitte von Sequenzen nur bedingt geeignet. Zukünftige Experimente könnten das neue Spin Label nicht in der Mitte, sondern an den Enden der Sequenzen ähnlich anderer Arbeiten[92,94,164] einbauen, wo die Destabilisierung eine geringere Auswirkung hat, oder die Sequenz für eine bessere Stabilisierung verlängern.[164] Bei ausreichenden Duplexstabilitäten könnten hiermit dann PELDOR Messungen durchgeführt werden. Ähnlich starre, sterisch anspruchsvolle Nukleotide zeigten auch ähnliche Schmelzpunkte für ihre Duplexe[120], dennoch wurden sie für weitere Markierungsexperimente verwendet. Hierbei handelte es sich jedoch nicht um EPR Sonden, sondern um Fluoreszenzmarker. Da auch das neue Spin-Label 1 ein großes π-System besitzt, könnte eine komplett neue Herangehensweise die Anwendung als Fluoreszenzmarker sein. Genaue Absorptionsmessungen müssten noch durchgeführt werden, jedoch zeigte das Spin Label sehr stark fluoreszierende Eigenschaften unter der UV-Lampe während der Säulenchromatographie. Hierbei würde die Synthese um einiges kürzer ausfallen, da das EPR-aktive Nitroxid nicht mehr benötigt wird und geschützt werden muss, was Zeit und Chemikalien spart.
Zusammenfassend wurde über eine 22-stufige Synthese ein neues photolabil geschütztes Spin-Label synthetisiert, in ein 14mer integriert, erfolgreich entschützt und mittels EPR-Spektroskopie vermessen. Schmelzpunktmessungen zeigten jedoch eine große Destabilisierung und deuten darauf hin, dass 1 und Nukleotide mit ähnlich Benzolringen nur eingeschränkt als EPR-aktive Nukleotide geeignet sind.
Diese Arbeit hatte das Ziel, die Größe einer DVT-Aufnahme (FOV) mit der Größe der durch die Indikationsstellung definierten Region (ROI) zu vergleichen. Durch eine speziell dafür entwickelte Software sollten Messungen in den Datensätzen ermöglicht werden. Die dazu verwendeten 332 Datensätze wurden zufallsverteilt aus den mit einem Orthophos SL-3D DVT-Gerät der Firma Dentsply Sirona in der Poliklinik für zahnärztliche Chirurgie und Implantologie des ZZMK (Carolinum) in Frankfurt angefertigten Röntgenaufnahmen selektiert.
Es wurde die Auswertungssoftware ExRoi entwickelt, mit der die Werte des axialen Durchmessers, die Höhe (vertikale Dimension) sowie die Distanz der Mittelpunkte von FOV und ROI direkt in den Datensätzen bestimmt werden konnten. Zusätzlich wurde festgehalten, welche rechtfertigenden Indikationen gestellt und welche Auflösungsmodi verwendet wurden.
Die Stichprobe bestand aus Aufnahmen mit einem axialen Durchmesser von 8 cm [VOL 1] (n= 76, entsprechend 46,39%), 5 cm Durchmesser [VOL 2] (n = 102, entsprechend 30,72%) und 11 cm Durchmesser [VOL 3] (n= 154, entsprechend 22,89%). 95,18% der Aufnahmen wurden im HD-Modus mit laut Herstellerangaben vier Mal so vielen Aufnahmen im Vergleich zum SD-Modus angefertigt. Hauptindikationen waren Implantat Planung (45,1%) und Planungen komplizierter Zahn-Extraktionen (25,5%).
Die Messungen zum Vergleich des axialen Durchmessers zeigten, dass bei Verwendung des VOL 2 die ROI im Mittel den größten Anteil der FOV nutzt (78,52 %), den kleinsten Anteil nutzt durchschnittlich VOL 1 (56,04 %). Dazwischen liegt VOL 3 (69,12 %). In der Vertikalen nutzt die ROI von VOL 3 mittelwertig den größten Anteil der FOV (81,87 %), den kleinsten Mittelwert hat VOL 1 (58,76 %). VOL 2 liegt zwischen diesen Werten (64,47 %).
In allen Fällen war das FOV größer als die ROI und die ROI lag im Bereich des gewählten FOV.
Die Mittelpunkte von FOV und ROI lagen im Mittel in der axialen Ebene in Abhängigkeit vom gewählten Volumen um rund 9-13 mm auseinander, in der coronalen und sagittalen Ebene um rund 5-6mm.
Aus diesen Ergebnissen kann für das verwendete Gerät eine gute Trefferquote für die ROI abgeleitet werden. Höhe und Durchmesser des FOV hätten in den meisten Fällen kleiner gewählt werden können, liegen aber angesichts der vorhandenen Auswahl-Optionen des Röntgengeräts zur Dimensionierung der Volumina in einem akzeptablen Bereich.
How the brain evolved remains a mystery. The goal of this thesis is to understand the fundamental processes that are behind the evolutionary history of the brain. Amniotes appeared 320 million years ago with the transition from water to land. This early group bifurcated into sauropsids (reptiles and birds) and synapsids (mammals). Amniote brains evolved separately and display obvious structural and functional differences. Although those differences reflect brain diversification, all amniote brains share a common ancestor and their brains show multiple derived similarities: equivalent structures, networks, circuits and cell types have been preserved during millions of years. Finding these differences and similarities will help us understand brain historical evolution and function. Studying brain evolution can be approached from various levels, including brain structure, circuits, cell types, and genes. We propose a focus on cell types for a more comprehensive understanding of brain evolution. Neurons are the basic building blocks and the most diverse cell types in the brain. Their evolution reflects changes in the developmental processes that produce them, which in turn may shape the neural circuits they belong to. However, there is currently a lack of a unified criteria for studying the homology of connectivity and development between neurons. A neuron’s transcriptome is a molecular representation of its identity, connectivity, and developmental/evolutionary history. Hence the comparison of neuronal transcriptomes within and across species is a new and transformative development in the study of brain evolution. As an alternative, comparing neuronal transcriptomes across different species can provide insights into the evolution of the brain. We propose that comparing transcriptomes can be a way to fill this gap and unify these criteria. In previous studies, published in Science (Tosches et al., 2018) and Nature (Norimoto et al., 2020), we leveraged scRNAseq in reptiles to re-evaluate the origins and evolution of the mammalian cerebral cortex and claustrum. Motivated by the success of this approach, in this thesis we have now expanded single-cell profiling to the entire brain of a lizard species, the Australian dragon Pogona vitticeps, with a special focus in thalamus and prethalamus of. This approach allowed us to study the evolution of neuron types in amniotes. Therefore, we aimed to build a multilevel atlas of the lizard brain based on histology and transcriptomic and compare it to an equal mouse dataset (Zeisel et al., 2018).
Our atlas reveals a general structure that is consistent with that for other amniote brains, allowing us to make a direct comparison between lizard and mouse, despite their evolutionary divergence 320 million years ago. Through our analysis of the transcriptomes present in various neuron types, we have uncovered a core of conserved classes and discovered a fascinating dichotomy of new and conserved neuron types throughout the brain. This research challenges the traditional notion that certain brain regions are more conserved than others.
Our research also has uncovered the evolutionary history of the lizard thalamus and prethalamus by comparing them to homologous brain regions of the mouse. This pioneering research sheds new light on our understanding of the evolutionary history of the lizard brain. We propose a new classification of the lizard thalamic nuclei based on
transcriptomics. Our research revealed that the thalamic neuron types in lizards can be grouped into two large, conserved categories from the medial to lateral thalamus. These categories are encoded by a common set of effector genes, linking theories based on connectivity and molecular studies of these areas. In our data we have seen that there is a conservation of the medial-lateral transcriptomic axis in mouse and lizard, this conservation was most likely already present in the common ancestor. Although there is a shared medial-lateral axis, a deeper study of the thalamic cell types has allowed us to see the existence of a partial diversification of the thalamic population, specifically in the sensory-related lateral thalamus; in opposition, the medial thalamic nuclei neuron-types have been preserved.
On the other hand, the comparison with the mammalian prethalamus allowed us to confirm that the lizard ventromedial thalamic neuron types are homologous to mouse reticular thalamic neuron types (Díaz et al., 1994), even if they do not express the classical Reticular thalamic nucleus (RTn) marker PV/pvalb. We also discovered that there has been a simplification in the mammalian prethalamic neuron types in favor of an increase in the number of Interneurons (IN) types within their thalamus. We suggest that the loss of GABAergic neuronal types in the mammalian prethalamus is linked to the need for a more efficient control of the thalamo-pallial communication in mammals, while in lizards, where thalamo-pallial communication is probably simpler, the diversity prethalamus presents a higher diversity.
Biological membranes serve as physical barriers in cells and organelles, enabling the maintenance of chemical or ionic gradients that are essential for triggering various integral, peripheral, or lipid-anchored membrane proteins, necessary for their life-essential functions. The study of membrane proteins has unique challenges due to their hydrophobic nature, limited expression levels, and inherent flexibility. Single-particle analysis (SPA) enables the determination of high-resolution three-dimensional structures using minimal amounts of specimen without the need for crystallization. Additionally, cryogenic electron tomography (cryo-ET) and subtomogram averaging (StA) offer the ability to study membrane protein complexes, cellular architecture, and molecular interactions while preserving close-to-life conditions. With ongoing improvements in cryo-EM technologies, obtaining high-resolution structures of membrane proteins in vitro can allow people to understand their mechanisms and functions, and to facilitate the design and optimization of new therapeutic agents. Furthermore, there has been significant growth in the structural characterization of membrane proteins in situ, as studying biomolecules within their physiological context is an ultimate goal in structural biology for a comprehensive understanding of molecular networks in cells.
Due to the amphipathic nature of membrane proteins, their production, purification, and isolation pose significant challenges compared to soluble proteins. To maintain the membrane protein fold in an aqueous buffer after disrupting lipid membranes, the use of detergents, amphipols, lipid nanodiscs, saposin-lipoprotein (salipro), styrene-maleic acid co-polymer lipid particles (SMALPS) is common and often essential. A limitation of the membrane-mimetic systems is the absence of an actual lipid bilayer environment. To address this issue, membrane proteins can be reconstituted into liposomes, and this closed membrane environment closely mimics the physiological conditions of the proteins. The use of liposomes for structure determination is expected to significantly expand in the in vitro study of membrane proteins and membrane-associated proteins, particularly for capturing transient complexes in specific functional states.
Resolving the structures of membrane proteins in their native cellular context is considered the ideal approach for understanding their functions and associated molecular networks. While single-particle cryo-EM can achieve higher resolution than subtomogram averaging, it often requires at least partial purification of the target molecules from their native environment inside cells and tissues. By combining averaging tools on subvolumes obtained through cryo-ET, structures can currently be determined at resolutions of 10-30 Å. With ongoing advancements and refinements in cryo-ET methodologies, routine high-resolution structure determination in situ is poised to become a valuable tool for both structural and cell biologists in the long run, and the field holds great promise for further expanding our understanding of cellular structures and processes at the molecular level.
The main aim of this thesis is to further our knowledge of the structure and function of a small prokaryotic voltage-gated sodium ion channel, NaChBac in liposomes, and a large knob complex found on the surface of Plasmodium falciparum-infected human erythrocyte by cryo-ET and StA.
Chapter 2 presents the first StA map of the 120-kDa NaChBac embedded in liposomes under a resting membrane potential at a modest resolution of 16 Å. The approach presented in this study, which can be widely applied to cryo-EM analysis of membrane proteins, with a specific focus on membrane proteins with small soluble domains, lays the foundation for cryo-ET and StA of integral or peripheral membrane proteins whose functions are affected by transmembrane electrochemical gradients and/or membrane curvatures. Chapter 3 shows the first cryo-EM structure of the supramolecular knob complex in P. falciparum-infected human erythrocyte. While a previous study provided an overall architectural view of knobs using negative stain tomography, the in situ structure bridges this gap, guiding future investigations into the molecular composition and the role of these native knobs in Plasmodium infection and immunity.
This thesis opens up several promising lines for future studies of membrane proteins in vitro and in situ, where other membrane proteins can be studied in physiologically relevant environments. Already with the present generation of cryo-EM hardware and software, this thesis represents pioneering research in the field of membrane protein structural biology.