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Das Ziel dieser Studie war der retrospektive Vergleich zweier fortschrittlicher robotergestützter Angiographie-Systeme in Bezug auf Strahlendosis und Bildqualität bei der Bildgebung im Rahmen der konventionellen transarteriellen Chemoembolisation (cTACE) von bösartigen Lebertumoren.
Dafür haben wir 106 Patienten (insgesamt 57 Frauen und 49 Männer; Durchschnittsalter 60 ± 11 Jahre), welche eine cTACE Therapie an einem der zwei Generationen von Roboter-Angiographieplattformen erhalten hatten, einbezogen. Die Patienten wurden in zwei Gruppen eingeteilt (n=53): Gruppe 1 (Behandlung am Gerät der ersten Generation) und Gruppe 2 (Behandlung am Gerät der zweiten Generation). Die Strahlendosis für die Fluoroskopie und die digitale Subtraktions-Angiographie (DSA) wurde zwischen den Angiographiegeräten der ersten bzw. zweiten Generation verglichen. Zu den besonderen Merkmalen des Systems der zweiten Generation- im Vergleich zum System der ersten Generation - gehörten ein verfeinertes kristallines Detektorsystem, zur verbesserten Rauschunterdrückung und eine fortschrittliche CARE-Filtersoftware, zur Senkung der Strahlendosis. Die Strahlendosis wurde mit einer herkömmlichen im Gerät verbauten Ionisationskammer gemessen. Die Bildqualität wurde von drei unabhängigen Radiologen anhand einer 5-Punkt-Likert-Skala bewertet. Beide Gruppen waren in Bezug auf Anzahl und Lage der Läsionen sowie Körpergewicht, BMI-Werte und anatomische Varianten der versorgenden Leberarterien vergleichbar (alle p > 0,05).
Das Dosisflächenprodukt (DAP) für die Fluoroskopie war in Gruppe 2 signifikant niedriger (1,4 ± 1,1 Gy·cm2) als in Gruppe 1 (2,8 ± 3,4 Gy·cm2; p = 0,001). Für DSA war DAP in Gruppe 2 (2,2 ± 1,2 Gy·cm2) signifikant niedriger (p = 0,003) gegenüber Gruppe 1 (4,7 ± 2,3 Gy·cm2). Die Ergebnisse für die DSA-Bildqualität (IQ) zeigten signifikante Verbesserungen für Gruppe 2 um 30% im Vergleich zu Gruppe 1 (p = 0,004). In der Fluoroskopie waren die Werte für den IQ in Gruppe 2 76% höher als in Gruppe 1 (p = 0,001). Eine gutes bis sehr gutes Inter-rater-agreement mit Kappa- Fleiss-Koeffizienten von κ = 0,75 für Gruppe 1 und κ = 0,74 für Gruppe 2 wurde erreicht.
Zusammenfassend ließ sich feststellen, dass die neueste Generation der robotergestützten Angiographiegeräte im Zusammenhang von cTACE der Leber eine erhebliche Reduzierung der Strahlendosis bei gleichzeitiger Verbesserung der Bildqualität in der Fluoroskopie und DSA-Bildführung ermöglicht.
Die Messung von heteronuklearen 15N-Relaxationszeiten (Longitudinale, transversale sowie heteronukleare NOE) bei verschiedenen Magnetfeldstärken (500, 600 und 800 MHz 1H Larmorfrequenz) ergeben Informationen über interne dynamische Prozesse in Biomolekülen. Diese verschiedenen Relaxationsraten sind voneinander abhängig und über die spektrale Leistungsdichtefunktion miteinander gekoppelt. Die mikrodynamischen Parameter des NH-Peptidrückgratvektors (der Ordnungsparameter S2 und die effektive interne Korrelationszeit te) sowie der Beitrag des konformationellen Austausches zur transversalen Relaxationsrate der Austauschparameter Rex wurden für einige Proteine errechnet und angepaßt. Das Human ILBP gehört zur Familie der intrazellulären Lipidbindungsproteine (LBP), die in der Lage sind, Fett- und Gallensäuren spezifisch zu binden und in Cytosol zu transportieren. Viele verschiedene Typen von LBPs sind bis heute identifiziert worden. Diese Proteine enthalten 127 - 135 Aminosäurereste und werden nach dem Gewebe benannt, aus dem sie isoliert wurden. Human-ILBP enthält 127 Aminosäurereste und besteht haupsächlich aus 10 antiparallelen beta-Faltblattsträngen, die eine beta-Fassstruktur mit einer großen Bindungstasche bilden, und zwei alpha-Helices. ILBP hat die Tendenz, Gallensäuren oder Fettsäuren zu binden. Diese geringe Tendenz zur liganden Spezifität ist entweder in der Struktur oder in seiner Dynamik begründet. Aus diesem Grund kann die Untersuchung der Dynamik des Human ILBP (apo- und holo-Form) in zwei Zeitfenstern zum besseren Verständnis der Funktion führen. Für die nicht-terminalen Peptidrückgratgruppen wurde ein S2-Parameter> 0,8 mit einen Durchschnitt von 0,88 beobachtet, was auf eine niedrige Mobilität im ganzen Protein in einem Nano- zu Picosekunden-Zeitfenster deutet, wobei eine Korrelationszeit von tc = 6.25 ns für ILBP (apo-form) und tc = 6.10 ns für ILBP (holo-Form) beobachtet wurde. Apo- und holo-Form (mit Taurocholat als Ligand) zeigen eine ähnliche Dynamik in diesem Zeitfenster. Überdurchschnittliche S2-Werte der alpha-Helix I deuten eine geringe Flexibilität des Peptidrückgrats an, während alpha-Helix II als Teil der Portalregion eine höhere Beweglichkeit zeigt. Austauschparameter Rex wurden hauptsächlich in den Regionen der Ligandenbindung nachgewiesen. Die hier beschriebenen Eigenschaften unterscheiden sich von denen des H-FABP und des E-FABP. Offensichtlich unterscheiden sich verschiedene Mitglieder der LBP-Familie wie ILBP (Human oder Schwein), H-FABP und E-FABP in der Funktion und Dynamik des Peptidrückgrats. In der vorliegenden Arbeit wurden die transversalen 15N CSA/DD-kreuzkorrelierten Kreuzrelaxationsraten bestimmt. Für die Bestimmung der Anisotropie des chemischen Verschiebungstensors wurde des Verhältnis zwischen den Auto- und Kreuzrelaxationsraten in Abhängigkeit von der magnetischen Feldstärke genutzt, wobei es möglich war, die Orientierung und Größe des CSA-Tensors einzelner Aminosäurereste zu bestimmen. Bei dieser Methode (wie auch in vielen anderen Studien gezeigt) wurde keine Korrelation zwischen der Sekundärstruktur des Proteins und den 15N CSA-Werten festgestellt. Zum Vergleich der CSA-Konstanten der ILBP-Spezies wurden die entsprechenden Parameter der RNaseT1 gemessen. Alle Daten wurden im Hinblick auf strukturelle Details kritisch diskutiert.
This study investigates a historical event that occurred during the Indonesian Revolution as depicted in Indonesian historical films and argues that these films not only attempt to depict the past but also use the past as a means of social commentary, teaching moral insight, and historical reinforcement. The historical films selected are The Long March (Darah dan Do’a) (1950) and Mereka Kembali (1972). Both films deal with the Long March event experienced by the troops of the Siliwangi Division in 1948. These troops were previously assigned to infiltrate Yogyakarta and its surrounding areas. They were instructed to march back to their original base in West Java as a part of the military strategies to confront the Dutch during the Indonesian Revolution, also known as the Indonesian War of Independence. This event became known as the Long March of the Siliwangi Division. This study examines not only the representation of the past or the texts of the films but also the production process, which includes the motivations of the filmmakers and the public reception when the films were screened for the public at the time—in 1950 and 1972, respectively. This approach provides a broader and richer dimension, valuable insights into the behind-the-scenes process of making the selected historical films, and essential information about the public reception of the films. From the production point of view, there are two main reasons for making these historical films: personal reason and social engagement. Further, the military also plays a vital role in these historical film productions. From the historical representation aspect, these two films depict the events of the Long March of the Siliwangi Division as a journey full of various obstacles and difficulties, such as harsh terrain, lack of food, battles against the Dutch, and internal disputes with fellow Indonesians: Darul Islam. From the reception aspect, the audience’s point of view, these films provide several representations that meet their expectations about the Long March of the Siliwangi Division. However, the audience disagrees with some of the other representations. Finally, the study revealed that historical films are potential vehicles for telling, interpreting, entertaining, legitimating and preserving the past. In addition, this study has a vital implication for reopening the tradition of Indonesian film studies and reigniting attention to old films.
Eine Einschränkung des Hörvermögens durch Schäden der Sinnesrezeptoren im Innenohr gilt beim Menschen sowie bei allen anderen Säugetieren als irreversibel. Die Hörforschung ist an der Frage interessiert, ob durch Plastizität in zentralen Teilen des auditorischen Systems Kompensationsmechanismen die Folgen mildern können. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Frage, ob und in welchem Umfang nach peripheren Hörschäden durch zentrale Kompensationsmechanismen eine Erholung des Hörvermögens auftritt auf der Basis von plastischen Änderungen der neuronalen Verarbeitung der Eingangssignale aus dem geschädigten Hörorgan. Schäden des Sinnesepithels im Innenohr, z.B. durch überlaute Beschallung oder ototoxische Substanzen, betreffen in der Regel zunächst die äußeren Haarzellen und führen zu einem Verlust der Empfindlichkeit und Frequenzspezifität des Hörvermögens. Eine primäre selektive Schädigung der inneren Haarzellen (IHZ) tritt im Tiermodell, aus unbekannten Gründen nur bei einer Spezies auf, dem Chinchilla (Chinchilla laniger) und zwar nach Gabe des antineoplastischen Medikament Carboplatin. Das gute Tieffrequenzhören der Chinchillas (0.1-20 kHz) ermöglicht außerdem Aussagen zur akustischen Signalverarbeitung in einem für das menschliche Gehör relevanten Frequenzbereich (0.02-16 kHz). Dieses Tiermodell bietet somit die Gelegenheit, die Veränderungen in zentralen Teilen des auditorischen Systems nach einer definierten sensorischen Schädigung zu untersuchen. Hierfür kommt u.a. das auditorische Mittelhirn, der Colliculus Inferior (IC) in Frage. Der IC wird als Hauptintegrationszentrum der Hörbahn angesehen weil er Eingänge von fast allen vor ihm liegenden auditorischen Kernen (z.B. Nucleus cochlearis, Nucleus olivaris und Leminscus lateralis) bekommt. Ein weiterer Grund für die Wahl des IC als Untersuchungsgebiet der vorliegenden Arbeit ist, die Frage zu beantworten, ob die auf der Ebene des auditorischen Kortex bereits nachgewiesene funktionelle Plastizität auch auf der Ebene des IC schon realisiert oder vorbereitet wird. Die vorliegende Arbeit untersucht das Antwortverhalten der Neurone im ICc an wachen Tieren vor und nach einem selektiven Teilverlust der IHZ bei Erhalt der äußeren Haarzellen. Die Arbeitshypothese ist, dass es nach einem abgeschwächten sensorischen Eingang zu Veränderungen der exzitatorischen und inhibitorischen Antwortfelder kommt, die als funktionelle Plastizität bzw. als Kompensation verstanden werden können. Anhand elektrophysiologischer Ableitungen im ICc von wachen, chronisch implantierten Tieren wurden die exzitatorischen und die inhibitorischen Antwortfelder der Neurone durch Einton- und Zweiton- Stimulation getrennt gemessen und bestimmt. Die Resultate zeigen, dass die exzitatorischen und inhibitorischen Antworteigenschaften im IC bei wachen und narkotisierten Tieren unterschiedlich sind. In wachen Tieren weist die Inhibition generell höhere Variation auf als in narkotisierten Tieren und ist unabhängiger von der Art der Exzitation. Eine Carboplatinbehandlung führte bei allen Tieren nach 3-7 Tagen zu einer Abnahme der Amplituden und einer Erhöhung der Schwellen der akustisch evozierten Hirnstammpotentiale (ABRs). Die histologische Untersuchung des Innenohres (10 Wochen nach Carboplatinbehandlung), zeigte bei allen Tieren Verluste der IHZ (zwischen 20 und 60%) entlang der gesamten Basilarmembran. Es wurden aber keine Verluste von ÄHZ festgestellt. Die Gehirn-Schnitte zeigten, dass die Registrierungen aus dem zentralen Teil des Colliculus Inferior stammen. Die physiologische Untersuchung der Antworteigenschaften der Neurone im IC 4-6 Wochen nach der carboplatinbedingten Schädigung der IHZ zeigte eine Reduktion der Inhibition, die u.a. deutlich an dem Verlauf der Intensitätskennlinien zu beobachten war. Nach dem Teilverlust der IHZ wurden viel weniger nichtmonotone Kennlinien gefunden als vor der Innenohrschädigung. Darüber hinaus beobachteten wir eine Reduzierung der inhibitorischen Regionen und eine signifikante Ausweitung der exzitatorischen Antwortfelder nach dem Teilverlust der IHZ. Die Resultate der vorliegenden Arbeit führen zu der Schlussfolgerung, dass nach einer Teilschädigung der inneren Haarzellen, unter Erhalt der ÄHZ nur ein geringer Sensitivitätsverlust in der zentralen Hörbahn auftritt. Der Verlust von 20-60% der IHZ und der damit einhergehende reduzierte afferente Informationsfluss führt zu physiologischen Veränderungen in der Hörbahn, die im IC von wachen Tieren vor allem durch eine Reduktion der Inhibition hervortritt. Dies deutet daraufhin, dass zentrale Kompensationsmechanismen bei peripheren Hörschäden nicht, wie bisher vermutet, erst in kortikalen sondern zum Teil bereits in subkortikalen Arealen (im Mittelhirn) stattfinden.
Interleukin-11 signaling is a global molecular switch between regeneration and scarring in zebrafish
(2022)
The two diametrically opposing outcomes after tissue damage are regeneration and fibrotic scarring. After injury, adult mammals predominantly induce fibrotic scarring, which most often leads to patient lethality. Fibrotic scarring is the deposition of excessive extracellular matrix that matures and hinders tissue function. The scarring response is mainly orchestrated by myofibroblasts, which arise only upon tissue damage, from various cellular origins, including tissue resident fibroblasts, endothelial cells and circulating blood cells. On the contrary, species like zebrafish, possess the remarkable capacity to regenerate their damaged tissues. After injury, instead of inducing a myofibroblast-mediated fibrogenic gene program, cells in these species undergo regenerative reprogramming at the transcriptional level to activate vital cellular processes needed for regeneration, including proliferation, dedifferentiation, and migration. Several pro-regenerative mechanisms have been identified to date. Most of them, if not all, are also important for tissue homeostasis and hence, are not injury specific. Therefore, the central aim of this study is to identify injury-specific mechanisms that not only induce regeneration, but also limit fibrotic scarring.
To test the notion that fibrotic scarring limits regeneration, I first compared the scarring response in the regenerative zebrafish heart after cryoinjury with what is known in the non-regenerative adult mouse heart. I found that zebrafish display ~10-fold less myofibroblast differentiation compared to adult mouse after cardiac injury. With these findings, I hypothesized that zebrafish employ mechanisms to actively suppress scarring response. Using a novel comparative transcriptomic approach coupled with genetic loss-of-function analyses, I identified that Interleukin-6 (Il-6) cytokine family-mediated Stat3 is one such pro-regenerative pathway in zebrafish.
Il-6 cytokine family consists of Il-6, Interleukin-11 (Il-11), Ciliary neurotrophic factor, Leukemia inhibitory factor, Oncostatin M, and Cardiotrophin-like cytokine factor 1. Il-6 family ligands signal through their specific receptors and a common receptor subunit (Il6st or Gp130). Using gene expression analyses after adult heart and adult caudal fin injuries in zebrafish, I identified that both the Il-11 cytokine encoding paralogous genes (il11a and il11b) are the highest expressed and induced among the Il-6 family cytokines. Hence, I chose Il-11 signaling as a candidate pathway for further analysis. To investigate the role of Il-11 signaling, I generated genetic loss-of-function mutants for both the ligand (il11a and il11b) and the receptor (il11ra) encoding genes. Using various tissue regeneration models across developmental stages in these mutants, I identified that Il-11/Stat3 signaling is indispensable for global tissue regeneration in zebrafish.
To investigate the cellular and molecular mechanisms by which Il-11 signaling promotes regeneration, I performed transcriptomics comparing the non-regenerative il11ra mutant hearts and fins with that of the wild types, respectively. I identified that Il-11 signaling orchestrates both global and tissue-specific aspects of regenerative reprogramming at the transcriptional level. In addition, I also found that impaired regenerative reprogramming in the il11ra mutant hearts and fins resulted in defective cardiomyocyte and osteoblast repopulation of the injured area, respectively.
On the other hand, by deep phenotyping the scarring response in il11ra mutant hearts and fins, I identified that Il-11 signaling limits myofibroblast differentiation. Furthermore, I found that cardiac endothelial cells and fibroblasts are one of the major responders to injury-induced Il-11 signaling. Using lineage tracing, I found that both the endothelial and fibroblast lineages in the non-regenerative il11ra mutants commit to a myofibroblast fate, spearheading the scarring response. In addition, using cell type specific manipulations, I showed that Il-11 signaling in cardiac endothelial cells allows cardiomyocyte repopulation of the injured area. Finally, using human endothelial cells in culture, I uncovered a novel feedback mechanism by which Il-11 signaling limits fibrogenic gene expression by inhibiting its parent activator and a master regulator of tissue fibrosis, TGF-β signaling.
Overall, I identified Interleukin-11/Stat3 signaling as the first global regulator of regeneration in zebrafish. Briefly, I showed that Interleukin-11 signaling promotes regeneration by regulating two crucial cellular aspects in response to injury – (1) it promotes regenerative reprogramming, thereby allowing cell repopulation of the injured area and (2) it limits mammalian-like fibrotic scarring by inhibiting myofibroblast differentiation and TGF-β signaling. Altogether, these zebrafish data, together with the contradicting mammalian data strongly indicate that the secrets of tissue regeneration lie downstream of IL-11 signaling, in the differences between regenerative and non-regenerative species. Furthermore, I establish the non-regenerative il11ra mutant as an invaluable zebrafish model to study mammalian tissue fibrosis.
Einleitung: Analysen kinematischer und elektromyographischer Daten verwenden häufig zeit-diskrete Werte. Bewegungen und EMGs sind jedoch zeitkontinuierliche Größen. Ziel der Arbeit ist eine verlaufsorien-tierte Analyse von Kinematik und EMG mit der Fragestellung, ob Unter-schiede innerhalb und zwischen den gesunden und operierten Proban-den bestehen. Methodik: Untersucht wurden 21 Patienten nach Hüft-TEP-Operation (43-71 Jahre) und 12 vergleichbare gesunde Probanden (KG). Dazu wurden beim Gehen auf dem Laufband bei frei wählbarer Geschwindigkeit die kinematischen Merkmale der Beckenbewegung und bilateral die EMGs des M. gluteus medius registriert. Mittels ortho-gonaler Referenzfunktionen wurden die Merkmalszeitverläufe einzelner Schritte auf Matrizen abgebildet und anschließend mit Hilfe eines Ähn-lichkeitsmaßes und einer Clusteranalyse untersucht. Ergebnisse: Indi-viduelle Gangmuster konnten in der vorliegenden Arbeit sowohl durch Analyse der kinematischen Daten als auch der EMGs erkannt werden. Es wurden jedoch keine einheitlichen Muster in der Patientengruppe festgestellt, obgleich verschiedene Gruppierungen zu finden waren, die jedoch anhand der erhobenen Patientendaten und Fragebogenscores nur eingeschränkt nachvollzogen werden konnten. Schlussfolgerung: Mit der verwendeten verlaufsorientierten multivariaten Analysemethode konnten intraindividuelle Ähnlichkeiten deutlich besser aufgefunden werden als interindividuelle Ähnlichkeiten, falls durch einen krankheits-spezifischen Anpassungsprozess vorhanden. Die Individualität ist somit dominierend.
Nikotinische Acetylcholin Rezeptoren (nAChR) sind ligandengesteuerte Ionenkanäle der pentameren Cys-Loop Familie, welche nach Bindung des Neurotransmitters Acetylcholin exzitatorische Signale in Muskeln und Neuronen vermitteln. Während die Funktion der Rezeptoren an der synaptischen Membran relativ gut untersucht wurde, gibt es bis heute kaum Erkenntnisse über die intrazellulären Prozesse und Proteine, die der selektiven Assemblierung von homologen Untereinheiten zu funktionalen Rezeptorpentameren zugrundeliegen.
Das C. elegans Genom kodiert für mehr als 29 nAChR Untereinheiten-Gene und besitzt damit die größte Anzahl bekannter Homologe innerhalb der untersuchten Arten. An der neuromuskulären Synapse (NMJ) des Nematoden sind zwei Typen von nAChR bekannt: der heteromere Levamisolrezeptor (L-AChR) und der homomere Nikotinrezeptor (N-AChR). Innerhalb dieser Arbeit wurde der funktionale Zusammenhang zwischen den nikotinischen Rezeptoren der NMJ von C. elegans und einem neuen rezeptorassoziierten ER-Proteinkomplex der Proteine NRA-2 und NRA-4 untersucht. Ihre vertebraten Homologe Nicalin und Nomo wurden zuerst im ER vom Zebrafisch im Zusammenhang mit dem TGF-β Signalweg beschrieben. Mutation der Proteine hat einen Agonist-spezifischen Einfluss auf die Aktivität von L-AChR und N-AChR. Die subzellulären Lokalisationsstudien demonstrierten, dass die beiden Proteine im ER von Muskelzellen wirken und dort mit Rezeptoruntereinheiten co-lokalisieren. Weiterhin ließ sich nachweisen, dass die relative Menge einzelner L-AChR-Untereinheiten an der synaptischen Oberfläche reduziert bzw. erhöht ist. Da die Rezeptoraktivität in Zusammenhang mit der Untereinheiten Komposition steht, wurde die Rolle von zusätzlichen Untereinheiten wie ACR-8 untersucht. Dies zeigte, dass die zusätzliche Mutation der Untereinheit acr-8 in nra-2 Mutanten den Einfluss der nra-2 Einzelmutation auf die Aktivität des L-AChR revertiert. Basierend auf diesen Ergebnissen lässt sich die Hypothese formulieren, dass der NRA-2/NRA-4 Komplex im ER von C. elegans als Kontrollinstanz fungiert welche dafür sorgt, dass nur die jeweils „korrekten“ Untereinheiten in funktionale Rezeptoren eingebaut bzw. andere vom Einbau in das Pentamer abgehalten werden. Durch Fehlen des aktiven Komplexes in Mutanten können nicht vorgesehene -Untereinheiten (z. B. ACR-8) in funktionale Pentamere mit veränderter Funktionalität eingebaut werden.
Im Rahmen der Arbeit wird empirisch untersucht, welche Reaktionen die Veröffentlichung von Periodenergebnissen als Teil der Unternehmenspublizität am deutschen Kapitalmarkt auslöst, welches die Bestimmungsfaktoren für das Ausmaß der Kapitalmarktreaktionen sind und ob Unternehmen in der Lage sind, durch ihre Publizitätsentscheidungen die Kapitalmarktreaktionen auf die Veröffentlichung von Periodenergebnissen zu beeinflussen. Kapitalmarktreaktionen auf die Veröffentlichung von Periodenergebnissen werden im Rahmen dieser Arbeit anhand von Aktienkursen und Handelsvolumen (Informationsgehalt) sowie anhand von Geld-Brief-Spannen (Informationsasymmetrie) gemessen. Als Ergebnis kann ein erhöhtes Ausmaß an abnormalen Renditen und Handelsvolumen am Tag der Ergebnisankündigung festgestellt werden, was darauf hinweist, dass Ergebnisankündigungen Informationsgehalt besitzen. Weiterhin kann festgestellt werden, dass durch Ergebnisankündigungen anhand von Geld-Brief-Spannen gemessene Informationsasymmetrien sinken. Weiterhin zeigt sich, dass die Kapitalmarktreaktion umso stärker ist, je mehr zusätzliche Informationen zusammen mit dem Periodenergebnis veröffentlicht werden. In diesem Zusammenhang kann auch gezeigt werden, dass sowohl Aktienkurs- und Handelsvolumenreaktionen als auch Geld-Brief-Spannen bei Anwendung international anerkannter Rechnungslegungsgrundsätze größer sind als bei Anwendung handelsrechtlicher Grundsätze. Dabei zeigt sich, dass Aktienkursreaktionen und Geld-Brief-Spannen über den Untersuchungszeitraum, der als Gewöhnungsphase an international anerkannte Rechnungslegungsgrundsätze angesehen werden kann, sinken und das Handelsvolumen steigt. Darüber hinaus kann gezeigt werden, dass die Kapitalmarktreaktion umso geringer ausfällt, je mehr oder je qualitativ hochwertiger die Unternehmenspublizität vor der Ergebnisankündigung ausfällt.
Proteostasis stressors that destabilize the cellular proteome, like heat shock, trigger transcription and translational reactions leading to the accumulation of heat shock proteins, also called molecular chaperones. During stress, induction of stress response genes is prioritized so that molecular chaperones and other stress response proteins are synthesized to cope with proteome misfolding and aggregation. In order to promote the selective translation of stress-specific genes, translation of others genes that are nonessential for cell survival has to stop. Nonessential protein-coding mRNAs accumulate in the cytosol with the associated proteins to form granular structures called stress granules (SG). These membrane-less organelles are thought to be involved in cell survival, mRNA stabilization and mRNA triage. They were proposed to form via the liquid-liquid phase separation which can be triggered by the high local concentration of RNA-binding proteins. mRNAs were long thought to simply play a scaffolding role by bringing RNA-binding proteins together and allowing their concentration and local aggregation. Recently, the active role of mRNAs in the SG assembly became apparent, too. For example, the spontaneous assembly of total yeast RNA into granules was observed, and these RNA granules showed a large overlap with SG transcriptome. Furthermore, cytosolic mRNAs can be released from polyribosomes under stress and be exposed to the cytosolic contents as free mRNAs. It has been suggested that this massive increase of free mRNA in the cytosol might overload the capacities of RNA-stabilizing proteins. The remaining free mRNA molecules would then become exposed to misfolded and aggregation-prone proteins and trigger granulation.
We investigated the role of free mRNAs in different stress conditions during the early and chronic phases of stress response and explored their involvement in SGs assembly and amlyoidogenesis. We identified and studied the interactome of a free mRNA probe incubated with heat shocked cell lysate by means of quantitative mass spectrometry. Proteomics analysis allowed us to identify 79 interactors of free mRNA. Among these interactors, we focused on the translation initiation factor eIF2α and on the RNA methyltransferase TRMT6/61A. Both interactions were verified biochemically, which confirmed that the association is enhanced in heat shocked lysate. In vitro reconstitution showed that free mRNA and TRMT6 interact directly. Ex vivo pulldowns revealed that eIF2α and TRMT6/61A interact under stress conditions and that this interaction is RNA-dependent.
TRMT6/61A is a tRNA methytransferase responsible for the methylation of the adenosine 58 at the position 1 producing m1A. However, also mRNAs have been recently found to be methylated by TRMT6/61A. Our bioinformatics analyses revealed that significantly more mRNAs enriched in SG contain the motif for methylation than SG-depleted mRNAs. We hypothesized that m1A methylation of mRNAs could constitute a tag for the mRNAs targeting to SGs. TRMT61A knock-down (KD) cell lines were generated using the CRISPR-Cas9 technique. In TRMT61A KD cells, m1A was significantly reduced on mRNAs, which correlated with an increased sensitivity of the cells to proteostasis stress. KD cells also showed defects in SG assembly. In heat shocked cells, an m1A motif-containing mRNA recovered better after returning to normal temperature than a control mRNA with mutated motif. In addition, we could isolate SGs and analyze their m1A and m6A content by mass spectrometry. While m6A content in SG mRNAs was very similar to cytosolic mRNAs, m1A was almost 8 times enriched in SGs. Thus, we could confirm experimentally the results of the bioinformatics analysis and directly support the hypothesis that m1A is a tag to direct mRNAs for sequestration. Finally, we compared amyloidogenesis in wild-type and TRMT61A KD cell lines. Cells with reduced levels of TRMT61A demonstrated an increased accumulation of transfected Aβ and an impaired aggregate clearance. Various assays led us to conclude that the lack of m1A deposition on mRNAs enhanced RNA co-aggregation with amyloids.
Based on our results, we propose a model explaining the fate of free mRNA during proteostasis stress. Upon polysome disassembly, free mRNA is released and becomes free to interact with other proteins, including the methyltransferase TRMT6/61A. TRMT6/61A methylates the freed mRNAs containing the cognate motif. The m1A tag then targets mRNAs to SGs promoting sequestration. Upon stress release, SGs disassemble, thus releasing rescued mRNAs which could now reenter translation and support cell recovery. On the other hand, non-sequestered mRNAs increasingly co-aggregate with aggregating proteins. Thus, deficiency of the N1-adenine methylation of mRNAs due to the lack of TRMT6/61A increases the amount of unpacked mRNAs. The deposition of m1A on mRNAs could then be a way to protect them during exposure to stress, to limit their co-aggregation with misfolded proteins and to allow a faster recovery upon stress release.