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Enzyme der Cytochrom P450 (CYP) 2C Familie werden extrahepatisch vor allem in Endothelzellen exprimiert und liefern durch Metabolisierung der Arachidonsäure zu Epoxyeicosatriensäuren (EET) einen den Gefäßtonus modulierenden Faktor, den sogenannten endothelialen hyperpolarisierenden Faktor (EDHF), der zur Relaxation des glatten Gefäßmuskels führt. Neben dieser wichtigen Funktion als EDHF-Synthase beeinflussen diese Enzyme (CYP-Epoxygenasen) weitere zentrale Signalwege der Endothelzellen und tragen so zur vaskulären Homöostase bei. So wurde beschrieben, dass EET u.a. antiinflammatorische und fibrinolytische Eigenschaften besitzen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung weiterer Funktionen der CYP Epoxygenasen in Endothelzellen. Zunächst wurden physiologisch und pharmakologisch relevante Einflüsse auf die Expression der endothelialen CYP 2C lsoformen untersucht. Im Gegensatz zu der deutlichen CYP 2C Expression in nativen Endothelzellen, ist die Expression in kultivierten Endothelzellen drastisch reduziert. Es wurde gezeigt, dass kultivierte Endothelzellen, die einer kontinuierlichen, rhythmischen Dehnung (18 Stunden) ausgesetzt waren, eine signifikant höhere CYP 2C Expression verglichen mit unter statischen Bedingungen kultivierten Endothelzellen aufweisen. Ebenso bewirkte zyklische Dehnung (sechs Stunden) von endothelintakten Koronarsegmenten eine Induktion der endothelialen CYP 2C Expression. Diese Befunde zeigen, dass pulsatile Dehnung von Endothelzellen, ein kontinuierlicher hämodynamischer Stimulus in vivo, wesentlich zu dem physiologischen Expressionsniveau von CYP Epoxygenasen beiträgt. Auch eine Reihe kardiovaskulärer Pharmaka beeinflussen die Expression von CYP Epoxygenasen. Inkubation kultivierter Endothelzellen bzw. endothelintakter Gefäßsegmente mit dem lnsulinsensitizer Troglitazon und den Statinen Cerivastatin und Fluvastatin ergab eine deutliche Expressionserhöhung der endothelialen CYP 2C Isoformen. Die physiologische Bedeutung der verstärkten Expression konnte mit der einhergehenden, verbesserten EDHF-vermittelten glattmuskulären Relaxation demonstriert werden. Der Effekt endothelialer CYP 2C9 Expression auf die Proliferation wurde in weiteren Experimenten untersucht. Hierzu wurden kultivierte Endothelzellen eingesetzt, die mit CYP 2C9 Expressionsvektoren (adenovirale Infektion bzw. liposomale Transfektion) transfiziert wurden. In diesen CYP 2C9 überexprimierenden Endothelzellen konnte der proliferative Effekt des Enzyms demonstriert werden, da sie sowohl eine verstärkte DNA-Synthese als auch eine erhöhte Zellzahl im Vergleich zu Kontrollvektor-behandelten Zellen zeigten. Als weiteren Marker einer Proliferation ließ sich eine erhöhte Expression des zellzyklusregulierenden Proteins Cyclin Dl nachweisen. Eine verstärkte Phosphorylierung und Aktivierung des EGF Rezeptors in CYP 2C9 überexprimierenden bzw. EET behandelten Zellen gab einen deutlichen Hinweis auf die Beteiligung des EGF Rezeptor-Signalweges an diesem proliferativen Prozess. Diese Hypothese wurde durch den Befund belegt, dass lnkubation mit dem EGF Rezeptor lnhibitor AG 1478 zur Hemmung der CYP 2C9-induzierten Proliferation führte. Die Aktivierung des EGF Rezeptors bewirkte des weiteren die verstärkte Phosphorylierung der Proteinkinase B/Akt. Neben dem proliferativen Effekt konnte sowohl für CYP 2C9 als auch für EET ein angiogenetischer Effekt demonstriert werden. Im in vitro Angiogenese-Assay führten CYP 2C9-Uberexpression und exogene Stimulation mit 11,12-EET zur Ausbildung kapillarartiger Strukturen, die bei Kontrollzellen nicht zu finden waren. Ebenso bewirkten 11,12-EET in vivo (chick chorioallantoic membrane-assay) eine signifikant verstärkte Gefäßneubildung, die sich, wie die induzierte Endothelzellproliferation, als EGF Rezeptor-vermittelt erwies. In weiteren Experimenten wurde die Rolle des CYP 2C9 als endotheliale Quelle physiologisch relevanter Mengen reaktiver Sauerstoffspezies analysiert. Mit unterschiedlichen Methoden konnte in kultivierten Endothelzellen sowie in endothelintakten Koronarsegmenten gezeigt werden, dass CYP 2C9 nicht nur EET, sondern auch Sauerstoffradikale bildet. Diese Erhöhung des oxidativen Stress führte in Endothelzellen zur Aktivierung des redoxsensitiven Transkriptionsfaktors NF-KB und zur verstärkten Expression des Adhäsionsmoleküls VCAM-1. Zusammengefasst konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die Expression von CYP 2C9 in Endothelzellen relevante, physiologische Funktionen wie Induktion von Proliferation und Angiogenese sowie Modulation der Aktivität von Transkriptionsfaktoren bedingt. Da EET über die Hemmung der NF-KB Aktivierung antiinflammatorische Effekte ausüben, die CYP 2C9-abhängige Bildung von O2- durch Aktivierung von NF-KB jedoch proinflammatorisch wirkt, sind grundsätzlich gegenläufige, CYP 2C9-induzierte Effekte möglich. Unter welchen Bedingungen EET oder Sauerstoffradikale eine funktionelle Dominanz ausüben, müssen weitere Studien klären.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluß der Variation des Oxidationspotentials und der Elektronenkonfiguration ( * gegen n *) auf die zur Löschung von angeregten Triplettzuständen durch O2 führenden Prozesse untersucht. Bei ausreichender Triplettenergie werden neben dem Grundzustand des ursprünglich angeregten Sensibilisators in Konkurrenz O2(1 g ) und O2(1 g) Singulettsauerstoff sowie O2(3 g -) Grundzustandssauerstoff gebildet. Frühere Untersuchungen in diesem Arbeitskreis hatten gezeigt, daß es für * Triplettzustände zwei Desaktivierungskanäle gibt, die beide zu O2(1 g ), O2(1 g) und O2(3 g -) führen. Der eine geht von den bei der Löschung zunächst gebildeten 1,3(T1 3 ) Encounter Komplexen ohne Charge Transfer Stabilisierung aus (nCT). Diese befinden sich in einem vollständig eingestellten spinstatistischen Gleichgewicht, aus dem durch innere Konversion in niedrigere Komplexzustände die Desaktivierung erfolgt. Ein gemeinsames Energielückengesetzt f( E) und damit letztlich die Triplettenergie des Sensibilisators bestimmt die Größe der Geschwindigkeitskonstanten der zu O2(1 g ), O2(1 g) und O2(3 g -) führenden Prozesse in diesem nCT Kanal. Für Sensibilisatoren mit hohem Oxidationspotential und vernachlässigbaren Charge Transfer Wechselwirkungen ist dies der einzige Desaktivierungsprozeß. Mit zunehmender Charge Transfer Wechselwirkung, also mit abnehmendem Oxidationspotential und/oder zunehmender Triplettenergie, wird ein zweiter Desaktivierungskanal geöffnet, der über 1,3(T1 3 ) Komplexe mit Charge Transfer Stabilisierung (pCT) also über Exciplexe führt. Die Exciplexbildung ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt im pCT Kanal. Zur Verbreitung der Datenbasis den T1( *) Sensibilisatoren wurde in dieser Arbeit eine Reihe von mit elektronenziehenden bzw. elektronenschiebenden Gruppen substituierten Fluorenen studiert, bei denen im wesentlichen nur das Oxidationspotential variiert, während die Triplettenergien weitgehend konstant bleiben. Die mit den Fluorenen erhaltener Ergebnisse bestätigen das bisher erarbeitet Zweikanal-Desaktivierungsmodell. Insbesondere wird auch das spinstatistische Gewicht von 1:3 für die Bildung von Singulett zu Triplettsauerstoff im Exciplex Kanal gefunden, das nur mit einem relativ langsamen 1(T1 3 ) 3(T1 3 ) isc Gleichgewicht konsistent ist. Dieses Ergebnis widerspricht der früheren Annahme, wonach ein effizientes isc Gleichgewicht nur zwischen 1,3(T1 3 ) Exciplexen, nicht aber zwischen 1,3(T1 3 ) Encounter Komplexen existieren soll. In der vorliegenden Arbeit wird ein Modell für die 1(T1 3 ) 3(T1 3 ) angeregten Komplexe vorgeschlagen, das in einfacher Weise erklärt, warum das isc zwischen Encounter Komplexen von Sensibilisator und O2 schneller ist, als das zwischen den entsprechenden Exciplexen. Die weitere Analyse der Fluoren Daten zeigt, daß neben dem Oxidationspotential und der Triplettenergie des Sensibilisators auch dessen Struktur die Geschwindigkeitskonstanten beeinflussen kann, allerdings weitaus schwächer als die beiden ersten Einflußgrößen. Mit den Messungen der Geschwindigkeitskonstanten kT 1 , kT 1 und für kT 3 der zu O2(1 g ), O2(1 g) und O2(3 g -) führenden Prozesse für die unterschiedlich substituierten Benzophenonderivate wurde erstmals eine quantitative Untersuchung der Löschung von n * angeregten Triplettzuständen durch O2 durchgeführt. Obwohl für die Benzophenone eine stärkere Variation des Oxidationspotentials bei nahezu konstanter Triplettenergie erreicht werden konnte, wurde im Vergleich zu den * Triplettsensibilisatoren eine wesentlich schwächere Variation von kT 1 , kT 1 und für kT 3 beobachtet. Gleichzeitig liegen die Werte von kT 1 , kT 1 und für kT 3 der Benzophenone mit vernachlässigbarer Charge Transfer Wechselwirkung weit von der für * Triplettsensibilisatoren gefundenen Energielückenbeziehung f( E). Offenbar gilt für n * Triplettsensibilisatoren eine andere Energielückenbeziehung f( E), die viel schwächer von E abhängt. Es konnte gezeigt werden, daß die schwächere Überschußenergieabhängigkeit mit der unterschiedlichen Struktur der 1,3(T1.3 ) Komplexe zusammenhängt. Für 1,3(T1(n *) 3 ) ist eine Vierzentren Struktur, bei der die beiden Sauerstoffatome des O2 Moleküls parallel und benachbart zu den beiden Atomen der angeregten Carbonyl Gruppe liegen, sehr wahrscheinlich. Bei der Desaktivierung der Carbonyleinheit ändern sich die Bindungslängen der Vierzentrenstruktur stark, was einem Übergang zwischen versetzten Potentialkurven mit schwacher Energieabhängigkeit der Franck-Condon Faktoren entspricht. Für 1,3(T1( *) 3 ) Komplexe ist eine supra-supra Struktur anzunehmen, bei der die beiden Sauerstoffatome des O2 Moleküls mit gegenüberliegenden Kohlenstoffatomen eines angeregten aromatischen Rings wechselwirken. Bei der Desaktivierung des aromatischen Rings ändern sich die Bindungslängen nur wenig, so daß man von einem Übergang zwischen übereinander liegenden Potentialkurven mit stärkerer Energieabhängigkeit der Franck-Condon Faktoren sprechen kann. Dies ist der eigentliche Grund für die verschiedenen Energielückenbeziehungen f( E) und f( E) bei der Löschung von * und n * Triplettsensibilsatoren durch O2. Die Variation des Oxidationspotentials und damit der Stärke der Charge Transfer Wechselwirkungen in den 1,3(T1 3 ) Komplexen wird durch unterschiedliche Substitution von aromatischen Ringen mit elektronenziehenden oder elektronenschiebenden Gruppen bewirkt. Da die aromatischen Ringe bei den n * Triplettsensibilisatoren im Gegensatz zu den * Triplettsensibilisatoren nicht Bestandteil des elektronisch angeregten Zentrum sind, fallen die Charge Transfer Effekte bei den n * Triplettsensibilisatoren deutlich schwächer aus als bei den * Triplettsensibilisatoren. Damit konnte in der vorliegende Arbeit erstmals eine konsistente Begründung für das unterschiedliche Verhalten von n * und * Triplettsensibilisatoren bei der Löschung durch O2 gegeben werden.
Im ersten Abschnitt der Doktorarbeit wurden kurze alpha-helikale Modellpeptide mit Oligosacchariden, die Teile der Core-Region der N-Glycane bilden, N-glycosyliert, um den konformationellen Effekt der N-Glycosylierung auf das Peptidrückgrat zu untersuchen. CD- und NMR-Untersuchungen ergaben, daß die Konformation der N-Glycopeptide durch die Größe der angehängten N-Glycanreste und die Wahl der Aminosäurereste nahe der Glycosylierungsstelle beeinflußbar war. Die signifikantesten konformationellen Änderungen ergaben die N-Glycosylierung mit einem Monosaccharid beziehungsweise einem Pentasaccharid. Die Kombination von organischer Synthese mit biologischen Methoden ermöglicht es heute, neben den 20 natürlichen Aminosäuren, auch unnatürliche Aminosäuren ortsspezifisch in Proteine einzubauen. Dabei wird das Codon für die jeweilige Aminosäure durch Oligonucleotid-Mutagenese durch das Nonsense-Codon UAG ersetzt. Für dieses spezielle Codon wird eine Suppressor-tRNA hergestellt und in vitro chemisch mit der gewünschten unnatürlichen Aminosäure aminoacyliert. Mit dem späteren Ziel einer in vitro-N-Glycoproteinsynthese wurde hier die Darstellung von N-glycosylierten Aminosäuren und der Versuch der Anknüpfung an ein Dinukleotid pdCpA beschrieben. Die für die Aminoacylierung des Dinukleotids geeigneten Zuckeraminosäuren trugen Nterminal die photochemisch abspaltbare NVOC-Schutzgruppe, Acetylgruppen an den Zucker-OH-Funktionen und eine Cyanomethylaktivesterfunktion am C-Terminus. Die Aminoacylierungsreaktionen führten nicht zu dem gewünschten N-Glycosylaminoacyldinukleotid. Insbesondere durch die Wahl anderer Zuckerschutzgruppen sollte dennoch die Acylierung des Dinukleotids pdCpA mit einer N-glycosylierten Aminosäure gelingen. Der dritte Teil der Doktorarbeit beinhaltete die Synthese eines Prionen-N-Glycoproteins über chemische Ligation eines Thioesters mit einem Cystein-Peptid. Die Verknüpfung von Peptidfragmenten erlaubt die selektive Isotopen-Markierung, was die Strukturaufklärung mit Hilfe der NMR-Spektroskopie enorm vereinfacht. Die Funktion der Glycosylierung des Prionenproteins scheint in wenigen Aspekten geklärt zu sein. Unklar ist, ob die N-Glycosylierung auch die Konformation des Prionenproteins verändern kann. Ein kurzes Prionen-N-Glycopeptidfragment SHA PrP172-194 aus der Helix B des Prionenproteins wurde der Strukturanalyse unterzogen, wobei ein Effekt der NGlycosylierung auf die Konformation des Peptidrückgrats verzeichnet werden konnte. Motiviert durch diese Ergebnisse wurden in der Doktorarbeit das Prionenproteinfragment SHA PrP12l-178 als N-terminales Thioesterfragment und das Fragment SHA PrP179-231 als C-terminales Cystein-Peptid mit Festphasenpeptidsynthese dargestellt. Mit diesen wasserlöslichen Proteinfragmenten wurde erfolgreich eine chemische Ligation unter denaturierenden Bedingungen durchgeführt. Da man selektiv Isotopen-markierte Proteine herstellen wollte, war man auf die biochemische Expression des N-terminalen Thioesterfragments SHA PrPl2l-178 angewiesen. Dr. S. Becker (Max-Planck-Institut für Biophysikalische Chemie, Göttingen) gelang die Expression eines unmarkierten Prionen-Inteinfusionsproteins, aus dem durch Thiol-vermittelte Inteinspaltung ein Thioester generiert werden konnte. Auch mit diesem biochemischen Ligationsansatz konnte das Fragment SHA PrP121-23l erhalten werden. Ein N-glycosyliertes Prionenfragment SHA PrP179-231 wurde in der vorliegenden Doktorarbeit ebenfalls dargestellt und steht für Intein-vermittelte Ligationsreaktionen zur Verfügung.
Mit Hilfe der direkten Nachweismethode von Singulettsauerstoff über die 1O2-Phosphoreszenzemission bei 1270 nm wurden zeitabhängige Messungen durchgeführt, mit denen größtenteils die jeweiligen Reaktionsmechanismen der Perhydrolyse von Nitrilen, Chlorameisensäureestern und Acetamid sowie von Natriumcyanat und teilweise von Benzoylsäurechloriden ermittelt werden konnten. Über den Mechanismus der erstmals von Radziszewski durchgeführten Reaktion von Wasserstoffperoxid mit Nitrilen (Radziszewski 1885) bestand bis heute noch keine endgültige Gewißheit. Es konnte nun gezeigt werden, daß im Gegensatz zu dem bisher allgemein akzeptierten Mechanismus von Wiberg (Wiberg 1953) der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in wäßriger alkalischer Lösung der heterolytische Zerfall der intermediär gebildeten Peroxoiminosäure ist. Diese Zerfallsreaktion läuft nach einer Reaktion zweiter Ordnung ab und ist stark vorn pN-Wert abhängig. Durch die ph-Abhängigkeit konnten erstmals sowohl die pKs-Werte sowie auch die heterolytischen Zerfallskonstanten kZ, der untersuchten Peroxoiminosäuren abgeschätzt werden. In Gegenwart eines Ketons wird diese Reaktion bei Verwendung von Acetonitril stark beschleunigt. Verwendet man reaktivere Ketone wie zum Beispiel Fluoraceton wird das Zeitgesetz so komplex, daß eine quantitative Auswertung allein anhand der Singulettsauerstoffbildung nicht mehr möglich ist. Im Rahmen der Untersuchung der Nitrile wurde auch die Perhydrolyse des anorganischen Natriumcyanats in alkalischer Pufferlösung untersucht. Der hierbei gefundene Mechanismus unterscheidet sich allerdings von dem der Nitrile. In der ersten Reaktion pseudo-erster Ordnung wird die bisher unbekannte Peroxocarbaminsäure (H2N-C(O)OOH) gebildet, die dann unter Bildung von Ammoniak und dem instabilen Kohlenstoffperoxid (C03) zerfällt. Kohlenstoffperoxid (C03) wird als die Verbindung angesehen, deren Zerfall zur Bildung von Kohlenstoffdioxid und Singulettsauerstoff führt. Bei der Perhydrolyse des Acetamids im basischen Bereich konnten nur bei einem großen Überschuß an Wasserstoffperoxid auswertbare 1O2-Phosphoreszenz-Zeit-Kurven gefunden werden. Weiterhin wurde in THF die Perhydrolyse einiger Chlorameisensäureester in Abwesenheit und Gegenwart von Pyridin studiert. Die Perhydrolyse der Ester führte in Abwesenheit von Pyridin überwiegend zur Ausbildung eines konstanten 1O2-Phosphoreszenzsignal, dem Soge nannten "Chloridsignal", das eindeutig auf die in saurer Lösung durch Chloridionen katalysierte Zerfallsreaktion von Wasserstoffperoxid zurückzuführen ist. Die Induktionszeit, das heißt die Zeit nach der ein Singulettsauerstoffsignal beobachtet wird, korreliert mit der Stärke der elektronenziehenden Estergruppe. Wird die Perhydrolyse der genannten Ester in Gegenwart von Pyridin untersucht, wird die Reaktion bei dem Chlorameisensäuremethylester (CAME), dem Chlorameisensäureethylester (CAEE), dem Chlorameisensäurebenzylester (CABE) und dem Chlorameisensäure-4-nitrobenzylester (CANBE) durch Pyridin sehr stark beschleunigt. Nach Zugabe von Pyridin wird ohne lnduktionsperiode ein intensives 1O2-Phosphoreszenzsignal beobachtet, das nach einer Reaktion pseudo-erster Ordnung abklingt. Vermutlich wird bei den genannten Estern intermediär das N-Peroxocarboxylpvridiniumkation gebildet, welches auf Grund des in alpha-Stellung zur Peroxocarhoxylgruppe stehenden positiv geladenen Stickstoffatoms ein starkes Oxidationsmittel ist. Ferner wurde die Umsetzung von Säurechloriden mit Wasserstoffperoxid untersucht, bei der ebenfalls intermediär eine Peroxosäure gebildet wird, Jedoch war es nicht möglich, den Reaktionsmechanismus tatsächlich aufzuklären.
Das Photosystem II (PSII) und die F1Fo-ATP-Synthase, zwei Membranproteinkomplexen der Energieumwandlung, wurden im Rahmen dieser Dissertation bearbeitet. Mittels zweidimensionaler (2D) Kristallisation und elektronenkristallographischen Methoden sollte die dreidimensionale (3D) Struktur aufgeklärt werden. PSII katalysiert den ersten Schritt der Lichtreaktion der Photosynthese. Es ist für das Einfangen von Lichtquanten, die Anregung von Elektronen, die Freisetzung von Sauerstoff aus Wasser verantwortlich. Über 25 Untereinheiten sind an diesem Prozess in den Thylakoidmembranen der Chloroplasten beteiligt. Ziel des ersten Projekts war die Verbesserung der 8 Å-Struktur des CP47-RC-Subkomplexes durch neue oder bessere 2D-Kristalle. Die Aufreinigung aus Spinat lieferte reproduzierbar eine gute Ausbeute an aktivem PSII. Das solubilisierte PSII enthielt genug endogenes Lipid, um es ohne den Zusatz von weiterem Lipid direkt durch Mikrodialyse zu rekonstituieren. Während der Rekonstitution verlor der PSII-Komplex CP43 und andere Untereinheiten, wahrscheinlich durch das Detergenz begünstigt, und ergab hoch geordnete Membranen aus CP47-RC. Die besten vesikulären 2D-Kristalle hatten eine tubuläre Morphologie und waren bis zu 1 µm breit und 3 µm lang. Elektronenmikroskopische Bilder unter Cryo-Bedingungen von ihnen aufgenommen zeigten nach der Bildverarbeitung Daten bis 6 Å. Durch Erhöhung der Zinkazetatkonzentration im Dialysepuffer konnten dünne 3D-Kristalle gezüchtet werden, die aus 2D-Kristallstapeln bestanden. Obwohl Elektronenbeugungsmuster Reflexe bis 4,5 Å aufwiesen, konnte auf Grund der unbekannten und veränderlichen Anzahl von Schichten keine 3D-Struktur erstellt werden. Weitere Versuche die Qualität der 2D-Kristalle von CP47-RC zu verbessern waren nicht erfolgreich. Durch die kürzliche Veröffentlichung der Röntgenkristallstruktur des dimeren PSII-Komplexes aus Synechococcus elongatus wurden weitere Untersuchungen eingestellt. Im letzten Schritt der Energieumwandlungskette bildet die F1Fo-ATP-Synthase unter Ausnutzung eines elektrochemischen Gradienten schließlich ATP, die universelle Energieeinheit der Zelle. Die Struktur und Funktion des löslichen, katalytischen F1-Teils sind seit einigen Jahren im Detail bekannt. Im Gegensatz zeichnet sich die Struktur des membranintegrierten, Ionen-translozierenden Fo-Teiles aus den Untereinheiten ab2cx erst langsam ab. Der c-Ring besteht in Hefe aus 10 und in Spinatchloroplasten aus 14 Untereinheiten. Ziel des zweiten Projekts war die Aufklärung der 3D-Struktur des sehr stabilen, undecameren c-Rings aus dem Bakterium Ilyobacter tartaricus, welches Na als Kopplungsion nutzt. Große, tubuläre 2D-Kristalle mit einer Einheitszelle von 89,7 x 91,7 Å und p1-Symmetrie bildeten sich nach der Rekonstitution von gereinigten c-Ringen mit dem Lipid Palmitoyl-Oleoyl-Phosphatidylcholin, nachdem das Detergenz durch Mikrodialyse entzogen wurde. Bilder von in Trehalose eingebetteten 2D-Kristallen wurden im Elektronenmikroskop JEOL 3000 SFF bei 4 K aufgenommen. Ein 3D-Datensatz, bestehend aus 58 Bilder bis zu einem Kippwinkel von 45°, ermöglichte die Berechnung einer 3D-Dichtekarte mit einer Auflösung von 4 Å in der Membranebene und 15 Å senkrecht dazu. Die elffach symmetrisierte Karte eines c-Rings zeigt einen taillierten Zylinder mit einer Höhe von 70 Å und einem äußeren Durchmesser von 50 Å, der aus zwei konzentrischen Ringen von transmembranen (-Helices besteht. Ein C-(-Modell der c-Untereinheit, die eine helikale "hair pin" bildet, konnte in die Dichte eingepaßt werden. Die inneren Helices sind nur 6,5 Å (Zentrum-zu-Zentrum-Abstand) von einander entfernt um eine zentrale Öffnung von 17 Å Durchmesser angeordnet. Die dichte Helixpackung wird durch ein konserviertes Motiv aus vier Glycinresten ermöglicht. Jede innere Helix ist mit einer äußeren, C-terminalen Helix über einen kurzen, wohl geordneten Loop auf der cytoplasmatischen Seite verbunden. Die äußere Helix weist in der Nähe der Ionenbindungsstelle einen Knick auf, der gleichzeitig in der Mitte der Membran liegt, wo sich die äußeren und inneren Helices am nächsten kommen. Dadurch wird es möglich, dass die Ionenbindungsstelle aus den Resten von zwei äußeren (Glu65, Ser66) und einer inneren Helix (Pro28) geformt wird. Zur Unterstützung der Ein-Kanal-Modell der Ionentranslokation konnte ein Zugang von der Ionenbindungsstelle zum Cytoplasma durch polare Reste in der c-Untereinheit vorgeschlagen werden. Des Weiteren kann spekuliert werden, dass drei Ionenbrücken zwischen den c-Untereinheiten für die hohe Temperaturstabilität des Oligomers von I. tartaricus verantwortlich sind. Die Vorstellung dieses 3D-Modells des c-Rings ist ein erster Schritt hin zum Verständnis der Kopplung der Ionentranslokation an die Rotation der F1Fo-ATP-Synthase. Wenn die Struktur der a-Untereinheit gelöst worden ist, wird hoffentlich auch der Mechanismus des kleinsten, biologischen Rotationsmotors entschlüsselt werden.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit unterschiedlichen Aspekten der Faltung von Tendamistat, einem aus 74 Aminosäuren bestehenden a-Amylase lnhibitor aus Streptomyces tendae. Bei der oxidativen Rückfaltung des Tendamistats konnten bisher drei kinetische Phasen (t1, t2 und t3) identifiziert werden. Die mittlere (t2) bzw. langsame (ti) kinetische Phase, resultiert als Folge einer cis/trans lsomerisierung um eine der drei Xaa-Pro Bindungen im Tendamistat. Wie im ersten Teil dieser Arbeit gezeigt werden konnte, entsteht die prolinabhängige lsomerisierungsreaktion während der Rückfaltung (t3) als Folge einer trans -> cis Umlagerung um die A1a49-Pro50 Amidbindung nach Entfaltung des Proteins. Der Nachweis einer solchen lsomerisierung gelang auf rekombinantem Weg, durch gezielten Austausch der einzelnen Proline. Im Gegensatz dazu resultiert die mittlere kinetischen Phase (t2) als Folge einer Prolin-unabhängigen cis/trans-lsomerisierungsreaktion um mindestens eine vorhandenen nicht-Prolinbindungen im Protein. Diese Schlußfolgerung konnte durch Vergleich mit zahlreichen Literaturdaten und Experimenten weiter gestützt werden. Tendamistat ist damit das erste Protein in der Literatur, bei dem es gelang, eine solche Prolin-unabhängige lsomerisierungsreaktion experimentell nachzuweisen. Wie mit Hilfe von weiteren Substitutionsexperimenten im zweiten Teil der Arbeit gezeigt werden konnte, tragen hydrophobe Oberflächencluster entscheidend zur Stabilisierung des lnhibitors bei. Die dabei gemessenen Stabilisierungsbeiträge stehen in einem linearen Verhältnis zum Seitenkettenvolumen der eingeführten Aminosäurereste (Alanin << Valin << Isoleucin). Hierdurch ließ sich zeigen, daß der stabilisierende Einfluß solcher Cluster im Wesentlichen auf das Vorhandensein von hydrophoben Wechselwirkungen zurückzuführen ist. Für die Faltung von Proteinen, die wie das Tendamistat ausschließlich aus ß-Faltblättern bestehen, spielt die Bildung von ß-Hairpinstrukturen eine entscheidende Rolle Die in dieser Arbeit untersuchten ß-Hairpinmutanten L14A bzw. N25A zeigen im Vergleich zum Wildtyp eine extreme Destabilisierung der ß-Faltblattstruktur. Durch Vergleich der Aktivierungsenergien (DeltadeltaGD-TS) mit den freien Enthalpien (DeltadeltaG0N-D) konnte die strukturelle Entwicklung des ß-Hairpins im Übergangszustand an den beiden Positionen 14 bzw. 25 mitverfolgt werden (~-Wert Analyse). Entgegen den Erwartungen zeigen diese Untersuchungen, daß beide Positionen im Übergangszustand noch weitestgehend solvatisiert vorliegen. Damit scheint die nativ-ähnliche Zusammenlagerung des ersten ß-Hairpins erst nach Erreichen des Übergangszustands stattzufinden. Alle in dieser Arbeit vorgelegten Daten über die Faltung des alpha-Amylase lnhibitors sind konsistent mit dem Nukleations-Kondensations Modell. Analog der Tröpfchenbildung bei unterkühlten Gasen kommt es nach dem kollabieren der Proteinkette als Reaktion auf die veränderten Lösungsmittelbedingungen zur intramolekularen Suche nach Nukleationsstellen. Der Übergangszustand wird erreicht, wenn sich eine kritische Zahl stabilisierender Kontakte (unspezifische Nukleation) ausbilden konnte. Ob an einem solchen Nukleationskern stets bestimmte Seitenketten beteiligt sind (spezifische Nukleation), bleibt an dieser Stelle noch offen.
Die vorgelegte Arbeit beschäftigte sich zunächst mit der Synthese von neuen 3'- und basenmodifizierten Nukleotiden und deren Markierung mit Fluoresceinisithiocyanat. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Überprüfung der synthetisierten Verbindungen auf ihre Eignung als Terminatoren für die enzymatische DNA-Sequenzierung. Die Synthese des neuen Thioamidtriphosphats 3'- [[6-Amino- 1 -thioxohexyl) amino] -3'-konnte in 10 Schritten ausgehend vom Thymidin erfolgreich durchgeführt werden. Zunächst erfolgte die Umsetzung zum 3'-Amino-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-3'-desoxythymidin, an dessen 3'-Aminofunktion ein Aminocapronsäurelinker angekuppelt wurde. Der Schlüsselschritt der Synthese war die Beschwefelung der so generierten 3'-Amidfunktion mittels Lawesson's Reagenz. Dabei konnte durch Optimierung der Synthesebedingungen die Ausbeute der Beschwefelungsreaktion um 30 % gesteigert werden. Das Thioamid 3' -Desoxy-5 '-0- (4,4'-dimethoxytrityl) -3'- {{6-{[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)-carbonyl] -amino}-1-thioxohexyl}amino}thymidin wurde zum Triphosphat umgesetzt und anschliessend FITC markiert. Für die Synthese des N2-modifizierten 2-Pentylamin-2',3'-didesoxyguanosin-5'-triphosphats 43 wurden Synthesewege beschritten. Schliesslich führte der Trick des Ausnutzens von Desmethylwyosin als Schutzgruppe zum Erfolg. Ausgehend vom 2'-Desoxyguanosin konnte die Synthese der unmarkierte Verbindung 2-Valeriansäurenitril-2'3'-didesoxyguanosin-5'-triphosphat 41 in 8 Schritten und die des Triphosphats 2-Pentylamin-2'3'-didesoxyguanosin-5'-triphosphat 43 und dessen FITCMarkierung in 12 Schritten erfolgreich durchgeführt werden. Die 5'-entschützte Verbindung 2-Valeriansäurenitril-2'3'-didesoxyguanosin wurde erfolgreich zum Triphosphat umgesetzt. Die Verbindung 5'-0- (tert-Butyldimethylsilyl)-2-Valeriansäurenitril-2'3'-didesoxyguanosin wurde Azid überführt. Das anschliessend synthetisierte Triphosphat 2-Pentylazid-2',3-didesoxyguanosin-5'-triphosphat 42 wurde reduziert und über die entstandene freie Aminofunktion mit FITC markiert. Alle neuen Triphosphate konnten durch optimierte Aufreinigungsbedingungen in hochreinem, salzreien Zustand isoliert werden. Vor dem Einsatz als Terminatoren für die DNA-Sequenzierung wurden alle Triphosphate als Na-Salze gefällt. Die synthetisierten Thioamidtriphosphate sind im Laufe dieser Arbeit als neue Verbindungen synthetisiert und veröffentlicht worden. Die hergestellten N2 - modifizierten Didesoxyguanosintriphosphate sind bisher nicht beschrieben und neue Vertreter ihrer Verbindungsklasse. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die neuen, modifizierten Triphosphate 39, 40, 41, 43 und 44 auf ihre Eignung als Terminatoren für die Sanger-DANN-Sequenzierung getestet. Dabei wurden fünf verschiedene Polymerasen eingesetzt: Die thermostabilen Polymerasen AmpliTaq, Taq(exo-), Vent(exo-), Bst und die nicht thermostabile T7 Polymerase. Die besten Ergebnisse konnten mit der T7 Polymerase erreicht werden. Alle getesteten Terminatoren wurden als Terminatoren von der T7 Polymerase akzeptiert. Die entsprechenden Sanger-Abbruchfragmente konnten mittels des Cy5-markierten Primers detektiert werden. Die Verbindung 39 wurde auch von der AmpliTaq und der Taq(exo-) Polymerase akzeptiert. Die Terminatoren 41 und 43 wurden von der Taq(exo-) Polymerase eingebaut. Entsprechende Abbruchfragmente konnten in schwacher Konzentration detektiert werden. Mit der Bst- und der Vent(exo-)-Polymerase konnten keine positiven Ergebnisse erzielt werden. Mit Sicherheit können alle getesteten Triphosphate als Substrate zumindest für die positiv getesteten Polymerasen T7, AmpliTaq und Taq(exo-) bezeichnet werden. In Zukunft sollten mit beiden FITC-markierten Nukleotiden Sequenzierversuche mit einem geeigneten Laser durchgeführt werden, um Klarheit darüber zu bekommen, ob der Farbstoff nach dem enzymatischen Einbau am Terminator verbleibt und zur Dye-TerminatorSequenzierung eingesetzt werden kann. Ausserdem ist mit der Synthese des N2 -modifizierten ddG's die Grundlage für ein Sequenziersystem mit den bereits existierenden modifizierten ddA- und ddC-Terminatoren geschaffen.
Die Kombination aus proteolytischer Spaltung, massenspektrometrischer Analyse und Datenbanksuche ist eine etablierte Methode zur Identifizierung von Proteinen. Ist die Identität eines Proteins geklärt, dann stellt sich im Anschluß daran häufig die Frage nach den posttranslationalen Modifikationen des Proteins. Auch hierfür ist die Massenspektrometrie eine prädestinierte und häufig angewandte Methode. Eine der wichtigsten posttranslationalen Modifikationen eukaryotischer Proteine ist die Phosphorylierung an Ser-, Thr- und Tyr-Resten. In der vorliegenden Arbeit ist die Weiterentwicklung und Anwendung zweier massenspektrornetrischer Methoden zur Analyse der Proteinphosphorylierung beschrieben: i) der Neutralverlust-Scan zur selektiven Detektion von Ser/Thr-phosphorylierten Peptiden, und ii) die Metallaffinitätschromatographie zur selektiven Anreicherung von Phosphopeptiden. Bei der Optimierung der Analytik der Proteinphosphorylierung mittels Neutralverlust-Scan hatte sich am Beispiel der katalytischen Untereinheit der Proteinkinase A gezeigt, dass die Verwendung einer Protease mit geringer Spaltungsspezifität (Elastase) wesentliche Vorteile gegenüber einer Protease mit hoher Spaltungsspezifität (Trypsin) besitzt. Die kleineren Elastase-generierten Phosphopeptide zeigen im Vergleich zu den Trypsin-generierten Phosphopeptiden eine effektivere Phosphorsäure-Abspaltung und lassen sich im Neutralverlust-Scan mit deutlich besserer Empfindlichkeit detektieren. in weiterer Vorteil der Elastase ist in ihrer Eigenschaft partiell überlappende Peptide zu generieren begründet. Die Metallaffinitätschrornatographie wurde eingesetzt, um die Elastase-generierten Phosphopeptide selektiv anzureichern. Es konnte gezeigt werden, dass die Metallaffinitätschromatographie eine geeignete Methode ist, um die Komplexität des Elastase-generierten Peptidgemischs drastisch zu reduzieren, so dass eine automatische Fragmentionen-Analyse aller angereicherten Peptide mittels nanoESl möglich ist. Die Leistungsfähigkeit der Kombination aus Elastase-Verdau, Metallaffinitätschromatographie und Q-TOF- Tandem-MS wurde am Beispiel des Transkriptionsinitiationsfaktors IA unter Beweis gestellt, wo mit Hilfe dieser Analysen-Strategie drei bislang unbekannte in-vivo-Phosphorylierungsstellen nachgewiesen werden konnten. Neben der Proteinphosphorylierung wurden in dieser Arbeit auch eine Reihe anderer kovalenter Modifikationen untersucht. Bei der Analyse der katalytischen Untereinheit der Proteinkinase A konnten neben einer bislang unbekannten fünften Phosphorylierungsstelle an Ser259 auch die Modifikation von Cys343 durch Glutathion und die N-terminale Modifikation durch Gluconsäure nachgewiesen werden. Mittels Q-TOF-Tandem-MS wurde die in-vivo-Myristoylierung des humanen Proteins GAPR 1 nachgewiesen. Mittels der sog Top-Down-Analyse wurde am Beispiel des Proteins Dynamin A gezeigt, wie mittels dieser Strategie eine vollständige Charakterisierung aller kovalenten Modifikationen eines Proteins erreicht werden kann. Im Falle von Dynamin A konnte die Acetylierung des N-terminalen Methionins nachgewiesen werden. Andere kovalente Modifikationen konnten ausgeschlossen werden. Im letzten Kapitel der vorliegenden Arbeit wird am Beispiel von Dynamin A gezeigt, wie sich die Kombination aus partieller proteolytischer Spaltung, Tandem-MS und Datenbanksuche effektiv zur Charakterisierung der Domänenstruktur von Proteinen einsetzen lässt.
Das Ziel von Gentherapie ist die Behandlung bzw. Heilung einer Erkrankung durch das Einbringen eines oder mehrerer Gene. Dazu werden Gentransfervektoren benötigt, die effizient therapeutische Gene in die zu behandelnden Zellen einbringen. Für eine systemische Applikation müssen Gentransfervektoren die Eigenschaft besitzen, ausschließlich die erkrankten Zellen zu transduzieren. Der Tropismus retroviraler Vektoren wird durch das Envelopeprotein (Env) festgelegt. Maus Leukämie Virus (MLV) basierende Kapsidpartikel können mit dem Envelopeprotein des humanen Immundefizienzvirus Typ-1 (HIV-1) pseudotypisiert werden. Diese MLV/HIV-1 Pseudotypvektoren besitzen einen Tropismus für humane CD4 positive T-Helferzellen. Diese Vektoren sind geeigneten Kandidaten für die gen-therapeutische Behandlung der HIV-lnfektion und von kutanen T-Zell Lymphomen, einer lymphproliferativen Erkrankung von CD4 Zellen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden MLV/HIV Pseudotypvektoren exprimierende Verpackungszelllinien mit Hüllproteinen verschiedener Subtypen etabliert und charakterisiert. Die verwendeten Subtypen waren das T-trophe HIV-1 Isolat BH10, das T-trophe HIV-2 Isolat ISY und das dualotrophe SHIV Isolat 89.6P. Dabei zeigte sich eine Abhängigkeit der Vektortiter vom Subtyp. Die höchsten Titer wurden mit der MLV/HIV-1 Pseudotypvektoren exprimierenden Verpackungszelllinie FLY-HIV-87 erhalten und lagen in Abhängigkeit vom retroviralen Vektor zwischen 1 x 10 hoch 5 und 1 x 10 hoch 6 IU/ml. Die Transduktionsspezifität entsprach dem Korezeptorgebrauch des HIV-Subtyps. Da für die geplanten in vivo Experimente höhere Titer notwendig waren, wurden verschiedene Methoden zur Anreicherung MLV/HIV-1 pseudotypisierter Vektoren zunächst getestet, sowie die Beste dieser Methoden für die Konzentrierung der Partikel optimiert. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde an zwei Mausmodellen die in vivo Applikation MLV/HIV-1 pseudotypisierter Vektoren untersucht. An transgenen hCD4 Mäusen wurde der Gentransfer nach systemischer Applikation von MLV/HIV-1 LacZ Pseudotypvektoren untersucht. In den transduzierten Mäusen konnte Gentransfer in Lymphknoten und Thymus beobachtet werden. Durch subkutane Implantation der humanen kutanen T-Zell Lymphomzellen MyLa in Nacktmäuse wurde ein Tiermodell Modell für humane kutane T-Zell Lymphome etabliert. Die intratumorale Applikation von MLV/HIV-1 Partikeln, deren Vektorgenom für das grüne Fluoreszenzprotein (EGFP) kodiert ergab, daß es zum effektiven und spezifischen Gentransfer in die CD4 positiven MyLa Zellen kam. In dem anschließend durchgeführte Therapieversuch mit Herpes Simplex Virus Thymidinkinase kodierenden Vektoren und darauf folgender systemischer Ganciclovir Behandlung konnte eine Verlangsamung des Tumorwachstums erzielt werden Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit haben gezeigt, daß MLV/HIV-1 Pseudotypvektoren für den spezifischen und effizienten Transfer von Genen in primäre humane CD4 T-Helferzellen geeignet sind und daß sowohl die systemische als auch die intratumorale Applikation dieser Vektoren möglich ist.
Endogene Retroviren des Schweines (PERV), die vertikal auf die Nachkommen vererbt werden, stellen ein potentielles Infektionsrisiko bei der Transplantation porziner Zellen, Gewebe oder solider Organe auf den Menschen (Xenotransplantation) dar. Bislang sind zwei PERV- Klassen des C-Typs bekannt, die in-vitro humane Zellen produktiv infizieren können. Voraussetzung einer produktiven Infektion ist neben dem Rezeptor-vermittelten Eindringen des Virus in die Wirtszellen die transkriptionelle Aktivität des retroviralen Promotors (LTR), welcher die zweite Determinante des Wirtstropismus darstellt. Mittels eines Luciferase Reportergen Assays wurde die Aktivität verschiedener PERV LTRs in humanen und anderen Säugerzellen im Vergleich zu bekanntermaßen starken Promotoren untersucht. Dabei zeigten LTRs, welche in der die Transkription regulierenden Region U3 eine aus 39-bp Repeats bestehende Repeatbox trugen, in nahezu allen getesteten Zellinien eine außerordentlich starke Promotoraktiviät. Diese wurde insbesondere durch die Repeatbox vermittelt und korrelierte direkt mit der Anzahl der 39-bp Repeats. Wie weiterführende Untersuchungen zeigten, konnte die Aktivität heterologer und Repeat-loser homologer Promotoren durch eine 4-fach 39-bp Repeatbox unabhängig von deren Lage und Orientierung über weite Distanzen hinweg signifikant erhöht werden. Die Repeatbox stellt damit einen klassischen Enhancer dar. Als die Transkription regulierende zelluläre Komponente konnte der ubiquitäre, in der Evolution konservierte Transkriptionsfaktors NF-Y identifiziert werden, dessen Bindung an Sequenzabschnitte des 39-bp Repeats nachgewiesen wurde. Weitere cis-aktive Elemente konnten in der U3 Region stromaufwärts der Repeatbox sowie in der R Region lokalisiert werden. Im Verlauf einer seriellen Passagierung in infizierten humanen Zellen erfolgte eine rasche Adaptation der Repeatzahl und damit der transkriptionellen Aktivität an den neuen Wirt. Wie die Ergebnisse einer neu etablierten quantitativen Real- Time PCR zeigten, korrelierte die Anzahl der von einer infizierten Zelle freigesetzten Viruspartikel direkt mit der Aktivität der LTR. Durch Adaptation der LTR Aktivität kann somit eine maximale, für die Wirtszelle verträgliche Virusproduktion erfolgen. Ausgehend von den beschriebenen Eigenschaften der PERV LTR ergeben sich für die Xenotransplantation spezifische Risiken, die Infektion des möglichen Transplantatempfängers vorausgesetzt. Diese betreffen durch mögliche Aktivierung von Protoonkogen oder Disruption zellulärer Gene den Empfänger selbst, durch die mögliche Rekombination von PERV mit humanen endogenen Sequenzen oder anderen exogenen Erregern und der Ausbildung potentiell hochpathogener Formen aber auch sein soziales Umfeld. Wie in-vitro Studien mit zwei routinemäßig in der Transplantationsmedizin eingesetzten Immunsuppressiva belegen, werden diese Risiken durch deren unvermeidlichen Einsatz im Falle einer Xenotransplantation nicht potenziert. Ausgehend von der starken transkriptionellen Aktivität Repeat-tragenden LTRs könnten diese geeignete Werkzeuge für molekularbiologische Anwendungen darstellen, bei denen, wie im Falle des Gentransfers oder der Gentherapie, starke Promotoren benötigt werden. In einem zweiten Projekt der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob die Expression des humanen endogenen Retrovirus HERV-K in einem transgenen Mausmodell Auswirkungen auf den Phänotyp der Tiere hat. HERV-K kodiert im Gegensatz zu den meisten anderen HERV-Familien für komplette virale Proteine, deren Bedeutung für den menschlichen Organismus jedoch weitgehend unbekannt sind. Zur Etablierung transgener Tiere waren zwei verschiedene Transgen-Konstrukte verwendet worden, von denen eines die komplette provirale Sequenz exklusive der LTRs beinhaltete, das andere lediglich das env-Gen. Für beide Konstrukte war die Etablierung homozygot transgener Tiere gelungen, der Nachweis der RNA Expression konnte jedoch nur bei jenen Linien erfolgen, die das komplette virale Genom trugen. Immuno Blot-Analysen und indirekte Immunfluoreszenz belegten die Expression viraler Proteine in verschiedenen Organen juveniler und adulter Tiere dieser Linien. Die transgenen Mäuse zeigten einen normalen Phänotyp und einen normalen Lebenszyklus mit einer unveränderten Reproduktionsrate. Eine auftretende Tumorgenese konnte stets auf das hohe Alter der betroffenen Tiere zurückgeführt werden, histologische oder anatomische Auffälligkeiten traten nicht auf. Ausgehend von diesen Beobachtungen in einem Tiermodell kann der Schluß gezogen werden, daß die HERV-K Expression im humanen Organismus keine große Bedeutung hat.