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Heute gewinnen pflanzliche Arzneimittel im Zeichen einer verstärkten Hinwendung zu natürlichen, relativ nebenwirkungsarmen Medikamenten zunehmend an Bedeutung, so auch die über Jahrtausende hinweg traditionell angewandte Ginsengwurzel (Panax ginseng) und der Indische Weihrauch (Boswellia serrata). Neben der Struktur- und Extraktanalytik konzentriert sich die Forschung in zunehmenden Maße darauf, die zahlreichen pharmakologisch untersuchten und klinisch beobachteten Wirkungen dieser beiden Arzneipflanzen einzelnen Inhaltsstoffen zuzuordnen. Bei der Ginsengwurzel gestaltet sich dies jedoch besonders schwierig. Dies ist begründet durch die große Anzahl strukturell ähnlicher Ginsenoside sowie durch deren unterschiedlicher Metabolismus. Zwar ist aus In-vitro-Experimenten bekannt, daß die Degradation über die stufenweise Deglukosylierung stattfindet, allerdings ist bislang nicht geklärt, ob intakte Ginsenoside überhaupt resorbiert werden und welche der vielen in vitro ermittelten Degradationsprodukte tatsächlich den systemischen Kreislauf erreichen. Anders als bei Ginseng, kann die therapeutische Wirkung des Indischen Weihrauches wohl definierten Inhaltsstoffen, AKBA und KBA, zugeschrieben werden. Dennoch mangelt es hier an verlässlichen pharmakokinetischen Daten, da bislang keine validierte bioanalytische Methode zur Verfügung stand. Im Rahmen der Bioanalytik von Ginsenosiden und Boswellliasäuren kamen in der vorliegenden Arbeit die Nano-ESI-MS(n)-Technik sowie die HPLC-Analytik zur Anwendung. Bereits bei der Strukturanalyse von Ginsenosiden erwies sich die Kombination der Nano-ESI-Technik mit MS(n)-Experimenten in einer Quadrupol-Ionenfalle als besonders vorteilhaft. Im Vergleich zu konventionellem ESI bietet Nano-ESI nicht nur den Vorzug, mit kleinsten Substanzmengen lange Messungen durchführen zu können, sondern auch den Vorteil einer effektiveren, weniger diskreminierenden Ionisation. Sowohl die hohe Sensitivität der Nano-Elektrosprayionisierung bei der Analyse von glykosidischen Verbindungen als auch die umfangreichen Strukturinformationen infolge mehrerer aufeinanderfolgender stoßinduzierter Fragmentierungen machen diese Technik zu einer attraktiven und effizienten Methode zur Analyse von Ginsenosiden. In MS(n)-Experimenten äußert sich das charakteristische Fragmentierungsverhalten der Ginsenoside in der sequentiellen Abspaltung der Zuckereinheiten in sukkzessiven Fragmentierungsschritten. Mit dieser Methode konnten die Zuckerketten an verschiedenen Positionen des Protopanaxadiol- bzw. Protopanaxatriolaglykons der Ginsenoside identifiziert, die glykosidischen Verknüpfungen innerhalb der einzelnen Zuckereinheiten durch spezifische Ringfragmente bestimmt und die genaue(n) Verknüpfungsposition(en) enzymatisch eingeführter Galaktose(n) lokalisiert werden. Bisher wurden allerdings Nano-ESI-MS/MS bzw. MS(n)-Untersuchungen primär an wässrigen oder organischen Lösungen von isolierten / aufgereinigten Stoffen oder Stoffgemischen durchgeführt. In dieser Arbeit wurde erstmals diese Technik in der Bioanalytik zur Identifizierung von Ginsenosiden und deren Degradationsprodukte in Humanplasma und -urin angewandt. Obwohl die optimale Analytkonzentration für die Nano-Elektrosprayionisierung im allgemeinen bei 10-5M liegt, ist es gelungen, die Ginsenoside anhand ihrer spezifischen Fragmentionen im MS/MS Modus bis zu einer Konzentration von 2 ng/mL (10-8M) in biologischen Matrices nachzuweisen. Auch wenn die Molekülionenpeaks bei diesen geringen Konzentrationen im Rauschen untergehen, können die Ginsenoside durch selektive Isolierung der gewünschten Vorläuferionen und deren anschließende Fragmentierung in der Quadrupol-Ionenfalle auf der Basis der Detektion spezifischer Fragmente identifiziert werden. Da bei der Fragmentierung der gleichen Vorläuferionenmasse in Leerplasma bzw. Urin keine charakteristischen Fragmentionen gebildet werden, handelt es sich somit um einen spezifischen Nachweis der Ginsenoside in biologischen Matrices. Vor dem Hintergrund dieser vielversprechenden Vorversuche wurde eine Pilotstudie zum qualitativen Screening von Ginsenosiden und deren Metaboliten in Humanplasma und –urin durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, daß Protopanaxatriol-Ginsenoside sowohl im Magen hydrolysiert als auch intestinal degradiert werden. Schon in den ersten Stunden nach der einmaligen oralen Einnahme von Ginsana G115 Kapseln wurden die Hydrolyseprodukte G-Rh1 und hydratisiertes G-Rh1 in Humanplasma detektiert. Die schnelle Resorption dieser beiden Verbindungen aus dem oberen Gastrointestinaltrakt deutet auf die Hydrolyse des Ginsenosides Rg1 im Magen hin. Das spätere Auftreten eines weiteren monoglukosylierten Protopanaxatriols, des Degradationsproduktes G-F1, liefert den ersten In-Vivo-Hinweis auf einen intestinalen Metabolismus von Protopanaxatriol-Ginsenoside. Im Gegensatz zu den Protopanaxatriolginsenosiden passieren die Protopanaxadiol-Ginsenoside den Magen unverändert, wie aus der Abwesenheit jeglicher Protopanaxadiol-Degradationsprodukte im Plasma und Urin in den ersten Stunden nach der Applikation geschlossen werden kann. Erst im unteren Gastrointestinaltrakt werden Protopanaxadiol-Ginsenoside durch intestinale Bakterien zu „Compound-K“ abgebaut und anschließend resorbiert. Der Nachweis von Ginsenosid Rb1 im Plasma, sowie weiterer Ginsenoside im Urin eines Probanden zeigt, daß auch Ginsenoside in ihrer intakten Form resorbiert werden können. Dennoch sind weitere Studien hierzu notwendig, um zu klären, ob die Resorption intakter Ginsenoside die Regel oder eher eine Ausnahme darstellt. Mit der Identifizierung des Hydrolyseproduktes G-Rh1, der Degradationsprodukte G-F1 sowie „Compound-K“ in Humanplasma und -urin konnte schließlich die Frage geklärt werden, welche der zahlreichen in vitro bestimmten Degradationsprodukte tatsächlich den systemischen Kreislauf erreichen. Damit ist die Basis für eine spätere Quantifizierung dieser Verbindungen nach ihrer Isolierung bzw. Herstellung und Charakterisierung als Referenzsubstanzen geschaffen. Außerdem können diese neuen Erkenntnisse helfen, pharmakologische Ergebnisse aus In-vitro-Versuchen mit In-vivo-Daten besser zu korrelieren, da sie erste Hinweise geben, welche der in vitro getesteten Substanzen für die in vivo beobachteten Effekte verantwortlich sein könnten. Bisher wurde Nano-ESI-MS(n) in der Bioanalytik pflanzlicher Arzneistoffe nicht eingesetzt. In dieser Arbeit wurde diese Technik erstmals zum Screening von Ginsenosiden und deren Degradationsprodukte in Humanplasma und –urin benutzt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß Nano-ESI-MS(n) auch eine empfindliche und sensitive Methode zur Identifizierung und zum Nachweis anderer medizinisch relevanter glykosidischer Verbindungen in biologischen Matrices darstellt, woraus sich neue Perspektiven für den Einsatz dieser Technik in der Metabolitenforschung sowie in der Bioanalytik pflanzlicher Xenobiotika ergeben. In den letzten Jahren rückte auch der Indische Weihrauch immer mehr in den Mittelpunkt des wissenschaftlichen sowie therapeutischen Interesses. Aufgrund der selektiven Hemmung der 5-Lipoxygenase gewinnen AKBA und KBA, als neue entzündungshemmende Verbindungen, zunehmend an Bedeutung. Während die quantitative Analytik der Boswelliasäuren in Extrakten und in verschiedenen Fertigarzneimitteln erhebliche Fortschritte erzielen konnte, fehlten auf dem Gebiet der Bioanalytik bislang validierte analytische Methoden zur Durchführung pharmakokinetischer Studien. Vor diesem Hintergrund wurde eine HPLC-Methode zur Bestimmung von KBA in Humanplasma entwickelt und validiert. Die Methode ist durch eine einfache Probenvorbereitung gekennzeichnet, die sich auf eine Festphasenextraktion der KBA aus der komplex zusammengesetzten biologischen Matrix beschränkt. Im Anschluß an die chromatographische Trennung auf einer RP-C18 Säule erfolgt die Quantifizierung der KBA mittels UV-Detektion bei 250 nm. Um eine adäquate Bestimmung der KBA in Humanplasma zu gewährleisten, wurde eine umfassende Validierung durchgeführt. Alle ermittelten Validierungsparameter, wie Spezifität, Linearität, Präzision, Richtigkeit, Reproduzierbarkeit, untere Quantifizierungsgrenze und Stabilität lagen innerhalb der vorgegebenen Grenzen. Damit erfüllt die entwickelte HPLC-Methode die allgemein gültigen Anforderungen an die Validierung bioanalytischer Methoden. Mit der Erstellung einer Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve im Rahmen einer ersten Pilotstudie konnte diese Methode zudem ihre praktische Anwendbarkeit unter Beweis stellen. Somit steht für zukünftige pharmakokinetische Studien eine validierte HPLC-Analytik zur Bestimmung von KBA, einer der Hauptwirkstoffe des Indischen Weihrauches, zur Verfügung, die sich durch hohe Spezifität, Reproduzierbarkeit und Präzision auszeichnet. Verlässliche Daten zur Pharmakokinetik am Menschen sind heute von besonderer Bedeutung, da sie helfen, die Dosierung zu optimieren, die biopharmazeutischen Eigenschaften von Präparaten zu verbessern und die Sicherheit bei der Anwendung zu erhöhen. Insbesondere im Hinblick auf bereits festgestellte Interaktionen von pflanzlichen Arzneimitteln mit Medikamenten reicht es nicht mehr aus, wenn sich pflanzliche Arzneimittel, wie beispielsweise Ginseng und Indischer Weihrauch, nur auf ihre langjährigen tradierten Anwendungserfahrungen berufen. So wird auch bei Phytopharmaka in verstärktem Maße eine wissenschaftliche Absicherung durch bioanalytische Forschung erwartet. Mit der Identifizierung der Ginsenoside und deren Degradationsprodukte im Menschen, der erstmaligen Anwendung von Nano-ESI-MS(n) in der Metabolitenforschung und der Entwicklung einer validierten bioanalytischen Methode zur Bestimmung der 11-Keto-Beta-Boswelliasäure in Humanplasma wurde diesen Erfordernissen Rechnung getragen.
Im Rahmen dieser Arbeit werden die Synthese, Eigenschaften und Anwendungsmöglichkeiten von Arylalkyl-Rückgrat modifizierten DNA-Oligonucleotiden untersucht. Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit war, lipophile, arylalkylmodifizierte Oligonucleotide zu synthetisieren und die Auswirkungen der absoluten Konfiguration der Modifikationen auf die Eigenschaften der resultierenden Duplexe zu untersuchen. Als zweites sollten die Modifikationen in Antisense-Oligonucleotide eingebaut werden um diese auf ihre Anwendbarkeit für die lnhibierung der HCV Genexpression zu testen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 18 unterschiedliche Rückgrat-Modifikationen synthetisiert. Dabei wurde die Alkylkettenlänge wie auch die Größe des aromatischen Systems variiert. Zudem wurde untersucht, welchen Einfluss Ringsubstituenten auf die Eigenschaften der resultierenden Oligonucleotide ausüben. Die Rückgratmodifikationen wurden über die Festphasensynthese nach der Phosphoramiditmethode in Oligonucleotide eingebaut. Als Ausgangsverbindungen für die modifizierten Phosphoramidite dienten die Arylalkylhalogide. Diese wurden in einer dreistufigen in situ Reaktion - über das Grignard-Reagenz zu der entsprechenden cadmiumorganischen Verbindung und deren weitere Reaktion mit Phosphortrichlorid - zu den Arylalkyldichlorphosphanen umgesetzt. Die als Phosphorylierungsreagenzien fungierenden (Arylalkyl)(diisopropylamin)-chlorphosphane konnten durch Umsetzung mit N,N-Diisopropylamin erhalten werden. Die folgende Reaktion mit den 5'-hydroxyl- und aminogeschützten, natürlichen Nucleosiden führte zu den modifizierten Phosphoramidit-Bausteinen. Diese wurden mittels der OligonucleotidFestphasensynthese selektiv, an verschiedenen Positionen in sehr guten Ausbeuten in ModellOligonucleotide eingebaut und die erhaltenen Diastereoisomeren mittels RP-HPLC getrennt. Die einfach modifizierten, diastereoisomerenreinen Oligonucleotide zeigten eine signifikant erhöhte Lipophilie im Vergleich zu den unmodifizierten Strängen. Die Lipophilie nahm bei der Verlängerung der Alkylkettenlänge und der Vergrößerung des aromatischen Ringsystems pro (CH2)-Gruppe sowie pro weiterem Sechsring in konstanten Schritten zu, wodurch die Lipophilie gezielt gesteuert werden kann. Um den Einfluss der Modifikationen im Doppelstrang zu untersuchen wurden die Tm-Werte der Duplexe bestimmt und diese zudem CD- und Fluoreszenzspektroskopisch untersucht. Die erhaltenen Tm-Werte variierten sehr stark in Abhängigkeit der Alkylkettenlänge, der Ringgröße und der absoluten Konfiguration. Mit den Rp-konfigurierten benzyl- (B), (naphth-1-yl)methyl- (I) und 2,4-difluorbenzylmodifizierten (M) Oligonucleotid-Duplexen konnte eine Schmelzpunktserhöhung erzielt werden. Auch konnte mit den 3-(Anthracen-9-yl)propylphosphonaten K eine signifikante Tm-Wert Steigerung aufgrund eines "Dangling-End-Effektes" beobachtet werden. Die erhaltenen Tm-Werte korrelierten hervorragend mit den erhaltenen CD- und Fluoreszenz-Daten. Für die Zuordnung der absoluten Konfiguration der Modifikation wurden drei 3-Phenylpropylphosphonat-Dimere E synthetisiert. Die Zuordnung erfolgte mittels der 2D-ROESY-NMR-Spektren und den berechneten Protonenabständen der diastereoisomerenreinen Dimere sowie über empirische Regeln die von den Methylphosphonaten S abgeleitet wurden. Diese Ergebnisse lassen sich auf längere Oligonucleotide übertragen. Neben den Untersuchungen der Charakteristika der Arylalkyl-Rückgrat modifizierten Oligonucleotide wurden während dieser Arbeit einige Modifikationen gezielt auf ihre Einsetzbarkeit für den Antisense-Einsatz getestet. Als RNA-Zielsequenz wurden die Nucleotide 326-342 der 5'-nicht codierenden Region des Hepatitis C Virus gewählt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden fünf unterschiedlich modifizierte Antisense-Oligonucleotide synthetisiert. Die arylalkylmodifizierten Oligonucleotide zeigten gute Hybridisierungseigenschaften gegenüber der sense-DNA bzw. sense-RNA und eine deutlich erhöhte Stabilität gegenüber der Nuclease Pl. Ferner konnte die Lipophilie der Oligonucleotide signifikant gesteigert werden. Die 2-Phenylethylphosphonate (D) und 2,4-Difluorbenzylphosphonate (M) sind zudem in der Lage die RNase H zu aktivieren. Alle dargestellten Antisense-Oligonucleotide wurden in einem zellfreien in vitro- sowie in einem in vitro-Zellkultur-Translations-Assay auf ihr lnhibierungspotential gegen die Hepatitis C Virus Genexpression getestet. Dabei zeigten die Benzylphosphonate (B), Phosphorthioate (Ps) und die 2-Phenylethylphosphonate (D) im zellfreien in vitro Testsystem hohe, spezifische Inhibierungsraten (>87%), bei einer Oligonucleotid-Konzentration von 5 µM. Auch erwiesen sich die arylalkylmodifizierten Antisense-Oligonucleotide, mit Ausnahme der 4-Phenylbutylphosphonate F, als sehr gute lnhibitoren der HCV-Genexpression in CCI13- und HepG2-Zellen.
MHC Klasse I Moleküle liegen im Endoplasmatischen Reticulum (ER) als Dimer bestehend aus einer schweren Kette mit Transmembrandomäne und einem 12 kDa-Protein, dem ß2-Mikroglobulin vor. Nach der Beladung des MHC-Klasse I-Moleküls mit einem antigenen Peptid, welche vorwiegend im Cytosol durch proteasomalen Abbau generiert und durch den Transportkomplex TAP ins ER transloziert werden, findet der Transport des MHC-Peptid-Komplexes zur Zelloberfläche statt. Dort wird das Antigen cytotoxischen T-Zellen präsentiert. An der Assemblierung und Reifung von MHC-Klasse I-Molekülen sind verschiedene Chaperone beteiligt. Eine wichtige Rolle beim Peptidbeladungsprozess von MHC-Klasse I-Molekülen spielt Tapasin. Dabei handelt es sich um ein 48 kDa, MHC-codiertes Typ I Transmembran-Glycoprotein aus der Immunglobulinsuperfamilie. Es verbrückt den TAP-Komplex mit MHC-Klasse I-Molekülen, hält unbeladene MHC-Klasse I-Moleküle im ER zurück und führt eine Qualitätskontrolle des gebundenen Peptids durch. Bei dieser Peptideditierung werden Peptide wieder selektiv aus der MHC-Bindungstasche entfernt, wenn sie mit einer niedrigen Affinität gebunden sind. Dadurch wird sichergestellt, dass keine leeren oder suboptimal beladenen MHC-Peptid-Komplexe an die Zelloberfläche gelangen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein System etabliert, mit dem der Einfluss von Tapasin auf die Peptidbeladung von MHC-Klasse I-Molekülen in vitro untersucht werden kann. Dazu wurde ein Verfahren zur heterologen Expression und Reinigung von funktionalem, löslichem Tapasin aus E. coli-Zellen aufgestellt. Weiterhin wurden ß2m und die schwere Kette von HLA-B*2705 heterolog in E. coli-Zellen exprimiert, isoliert und zusammen mit einem Reporterpeptid zum funktionalen HLA-B*2705 renaturiert. Bei Untersuchungen der Wechselwirkung zwischen Tapasin und HLA-B*2705-Molekülen konnte mittels der Oberflächen-Plasmonen-Resonanz-Spektroskopie eine direkte Interaktion zwischen Tapasin und unbeladenem HLA-B*2705 gezeigt werden. Detailliertere Untersuchungen zur Rolle von Tapasin bei der Peptidbeladung wurden mittels einer Gelfiltration gekoppelt mit der Fluoreszenzdetektion des Reporterpeptids durchgeführt. Dabei konnte festgestellt werden, dass unbeladene MHC-Klasse I-Moleküle in Anwesenheit von Tapasin stabilisiert werden und in einer Konformation gehalten werden, die eine Assoziation mit Peptid fördert. Weiterhin wurde gezeigt, dass durch Tapasin die Assoziationsrate für die Peptidbindung erhöht ist. Somit kann in Anwesenheit von Tapasin eine größere Anzahl an Peptiden auf eine stabile und hochaffine Bindung an MHC-Klasse I-Moleküle überprüft werden. In Experimenten mit bereits beladenen MHC-Klasse I-Molekülen konnte gezeigt werden, dass der neugebildetete Komplex auch nach erfolgter Peptidassoziation durch Tapasin stabilisiert wird. Dies ist vermutlich auf eine Erniedrigung der Dissoziationsrate für das Peptid zurückzuführen. Mit dem in dieser Arbeit etablierten Untersuchungssystem ist die Grundlage zu detaillierten Studien der Rolle von Tapasin bei der Peptidbeladung von MHC-Klasse I-Molekülen geschaffen.
Bei der Expression einer Phospholipase A2 aus Soja in Aspergillus oryzae (Probe PL-1007), Trichoderma viride (Probe PL-1008) und Pichia pastoris (Probe PL-1035) wurde neben der erwarteten Phospholipaseaktivität auch eine deutliche Lysophospholipaseaktivität beobachtet. Eine Trennung dieser Aktivitäten war nur mittels einer Free-Flow-Elektrophorese kurzzeitig möglich, bevor sich in jeder Fraktion wieder das ursprüngliche Aktivitätsverhältnis zwischen Phospholipase und Lysophospholipase einstellte. Zur näheren Untersuchung und Charakterisierung dieser Enzymsysteme wurden für einen gaschromatischen Aktivitätstest hochspezifisch substituierte Substrate eingesetzt, die eine parallele Bestimmung der Phospholipase- und Lysophospholipaseaktivitäten ermöglichten. So konnte gezeigt werden, dass nicht in allen Organismen eine Phospholipase A2 exprimiert wird, sondern es in Pichia pastoris (Probe PL-1035) zur Expression einer Phospholipase A1 kommt. Im Falle der Probe PL-1007 konnte die beobachtete Lysophospholipaseaktivität durch Versuche mit veränderten Substratverhältnissen zwischen Lysophospholipase- und Phospholipasesubstrat einem separaten aktiven Zentrum zugeschrieben werden. Durch elektrophoretische Trennungsversuche konnte gezeigt werden, dass es sich nicht nur um separate aktive Zentren, sondern um verschiedene Enzyme handelt. Die Tatsache, dass sich das Aktivitätsverhältnis nach der Trennung selbständig wieder einstellt, lässt das Vorliegen von Faltungsisomeren vermuten. Bezüglich ihrer katalytischen Eigenschaften weisen alle drei Enzymsysteme eine große Ähnlichkeit auf. Sowohl die Phospholipase- wie auch die Lysophospholipaseaktivitäten sind erst ab einer Reaktionstemperatur von über 70°C nicht mehr nachweisbar. Das Aktivitätsmaximum wurde in allen drei Fallen zwischen 45°C und 55°C beobachtet. Auch die pH-Bereiche in denen eine maximale enzymatische Aktivität zu beobachten ist, liegen mit pH 3,6 (PL-1007) bis pH 4,3 (PL-1035) für die Phospholipaseaktivitäten und pH 4,3 (PL-1007 / PL-1008) und pH 4,6 (PL-1035) in ähnlichen Bereichen. Die Aktivität der untersuchten Enzymsysteme zeigt jedoch im beobachteten pH-Bereich von pH 3 bis pH 5 nur eine geringe pH-Abhängigkeit. Deutlichere Unterschiede konnten jedoch für die Substratspezifitäten nachgewiesen werden. Die Phospholipasen A2 zeigen tendenziell höhere Umsätze bei Substraten mit C 12:0 bis C 16:0 Fettsäureresten, während die Phospholipase A1 aus Probe PL-1035 maximale Umsätze bei C 18:0 Fettsäureresten aufweist. Bei allen Enzymproben jedoch bleiben die Umsatzraten der ein- bis mehrfach ungesättigten Fettsäurereste hinter denen der gesättigten zurück. Lediglich bei der Probe PL-1007 sind die Aktivitätsunterschiede zwischen gesättigten und ungesättigten Substraten nicht signifikant. Neben der Untersuchung der katalytischen Eigenschaften konnte im Rahmen dieser Arbeit die in der Literatur mehrfach aufgestellte These der Hemmung der Phospholipaseaktivität in Gegenwart von Uteroglobin bestätigt werden. Ein Hemmungsmechanismus aufgrund direkter Wechselwirkung der Enzyme konnte ausgeschlossen werden. Vielmehr konnte zweifelsfrei bewiesen werden, dass der Hemmungsmechanismus bei den hier eingesetzten Enzymsystemen auf einer Bindung des für die Phospholipasereaktion essentiellen Ca2+ durch das Uteroglobin zurückzuführen ist.
Seit der TIMSS- und PISA-Studie sind sie wieder einmal Thema der bildungspolitischen Diskussion: die naturwissenschaftlichen Fächer in unseren Schulen. Deutschen Schülerinnen und Schülern wird bescheinigt: Sie haben nur mangelnde Kenntnisse, verstehen zu wenig, sind nicht recht in der Lage, Fragestellungen methodisch anzugehen, und denken zu wenig darüber nach, wie sie naturwissenschaftliche Probleme lösen könnten. Aber auch viele Erwachsene geben offen zu, besonders von den »harten« Naturwissenschaften wie Chemie wenig zu verstehen und sich nie besonders dafür interessiert zu haben. Wie kommt es, dass eine Wissenschaft, die wesentlich zum Verständnis unserer stofflichen Umwelt beiträgt und deren praktische Anwendung unser tägliches Leben in hohem Maße beeinflusst, auf ein so geringes Interesse stößt?
Ziel dieser Arbeit war es, mit den Methoden der NMR-Spektroskopie die elektrostatischen Eigenschaften der Xylanase aus Bacillus agaradhaerens in Abhängigkeit vom pH-Wert zu charakterisieren. Für die vorliegende Arbeit wurde das Strukturgen der Xylanase in verschiedene Expressionsvektoren des pET-Systems kloniert, wobei das Enzym auf 207 Aminosäuren verkürzt wurde. Diese Länge entspricht der publizierten Kristallstrukur von Sabini et al. (1999). Die Expression in pET3a und die Aufreinigung des Genproduktes mit Ionenaustauschchromatographie wurde optimiert, sodass homogenes Protein mit guten Ausbeuten erhalten werden konnte. Die Xylanase wurde mit den Isotopen 15N und 13C markiert und heteronukleare, mehrdimensionale NMR-Spektren wurden für die Zuordnung der Resonanzen des Proteins aufgenommen. Die chemischen Verschiebungswerte des Proteinrückgrats und die der aliphatischen Seitenketten wurden vollständig zugeordnet. Als eine weitere Voraussetzung für eine pH-Titration wurden sequenzspezifisch die Resonanzen der Histidin- bzw. Carboxylatgruppen bestimmt. Die Lösungsstruktur der Xylanase wurde anhand mehrerer automatisierter Prozeduren errechnet, um die Zuordnung der Resonanzen zu validieren. Alle Strukturelemente, die bereits aus der Kristallstruktur bekannt sind, wurden korrekt wiedergegeben. Da die Lösungsstruktur mit einem backbone RMSD-Wert von 2.44 ± 0.29 Å hoch 2 als vorläufig zu betrachten war, wurde im Folgenden ausschließlich die Kristallstruktur zur Bewertung der Distanzbeziehungen verwendet. In Abwesenheit des Substrats wurden die pH-abhängigen Resonanzen der Histidin- und Carboxylatgruppen sowie der Amide des Proteinrückgrats gemessen. Die Auswertung ergab 220 Titrationsprofile der 15N- and 13C-Resonanzen in einem pH-Bereich von 3.2 bis 8.7. Durch nichtlineare Regression der gemessenen Werte an eine modifizierte Henderson-Hasselbalch Gleichung wurden die pK S-Werte der Seitenketten von Aspartat und Glutamat, sowie für das C-terminale Carboxylat und für die Histidingruppen bestimmt. Die Titrationskurven der katalytischen Dyade zeigten eine ausgeprägte gegenseitige Wechselwirkung. Die korrespondierenden pK S-Werte stimmen gut mit dem vorhergesagten enzymatischen Mechanismus überein (Sabini et al., 1999) und belegen, dass das Nukleophil Glu94 bei einem neutralem pH-Wert deprotoniert ist, während die Bronsted Säure/Base GIu184 zu ca. 30% protoniert ist. Um die Untersuchungen zur katalytischen Aktivität zu vervollständigen, wurden alle pH-abhängigen [15N]-Resonanzen der Amide des Proteinrückgrats wie auch die der lndolstickstoffe in der Substratbindungsspalte analysiert. Die Wendepunkte konnten dem Titrationsverhalten der benachbarten sauren Aminosäure-Seitenketten zugeordnet werden. Aber es erscheint sehr wahrscheinlich, dass ein wesentlich komplexerer Ablauf stattfindet. Die asymmetrische Wechselwirkung von Trptophan-Seitenketten bezüglich der katalytischen Dyade wie auch das wechselnde Monotonieverhalten der Titrationskurven deuten auf eine simultane Reorganisation der Seitenkettenkonformere bei pH ungefähr gleich 6 und/oder auf eine Änderung des Wasserstoffbrückennetzwerkes innerhalb der Bindungsspalte.
Die Dissertationsarbeit mit dem Titel "Aufhebung der peripheren Immuntoleranz durch Kopplung eines Melanomantigens mit immunogenen Fremdproteinen" befasst sich mit der Weiterentwicklung einer effektiven Melanomvakzine im tierexperimentellen Modell im Hinblick auf die spätere klinische Anwendung im Patienten. Als Antigen wurde das in Melanomzellen und in Melanozyten natürlicherweise exprimierte Protein TRP2 verwendet. Dieses Antigen kann bei Mäusen und Menschen von zellulären Komponenten des Immunsystems erkannt werden. Durch die Fusion des wenig immunogenen Selbstantigens mTRP2 mit dem immunogenen Fusionspartner EGFP gelang es bei C57BL/6 Mäusen, die körpereigene Toleranz gegen Selbstantigene zu umgehen und so eine antigenspezifische Immunantwort zu induzieren. In den mit der cDNA von EGFPmTRP2aa30-519 immunisierten Mäusen konnte eine vitiligoartige Felldepigmentierung nachgewiesen werden, die nach Immunisierung mit der cDNA von mTRP2 nicht beobachtet wurde. In diesen Tieren ließen sich auch im Elispot TRP2-spezifische T-Zellen nachweisen. Tiere, die mit Ad-EGFPmTRP2aa30-519 immunisiert wurden waren gegen das Wachstum von transplantierten Melanomzellen geschützt. Eine Immunantwort und ein Tumorschutz konnte jedoch nur induziert werden, wenn eine direkte Fusion zwischen dem Selbstantigen TRP2 und dem immunogenen Fusionspartner EGFP besteht. In Versuchen mit knockout Mäusen und Depletionsexperimenten konnte gezeigt werden, das CD4+ T-Zellen eine entscheidende Rolle in der Primingphase CD8+T-Zellen von die Induktion von antigenspezifischen CD8+T-Zellen spielen. In weiteren Experimenten nach Immunisierung mit dem Fusionskonstrukten EGFPmTRP2aa30-188, EGFPmTRP2aa30-179 und EGFPmTRP2aa180-188 konnte gezeigt werden, dass das Peptidepitop mTRP2 aa180-188 für die Induktion einer Felldepigmentierung und für eine effektive Abwehr von transplantierten Melanomzellen vorhanden sein muss. Um den Einfluss von kompetitiven MHC-Klasse I bindenden Peptidepitopen auf die Induktion einer Immunantwort zu untersuchen wurden Mäuse mit dem Fusionskonstrukt ß-Galaktosidase-mTRP2aa180-188 immunisiert. In diesen Mäusen konnte eine vtiligoartige Felldepigmentierung der beschossenen Bauchhaut und im Elispot-Test gleichzeitig TRP2 und ß-gal spezifische T-Zellen nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu Arbeiten anderer Arbeitsgruppen scheint in diesem System keine kompetitive Hemmung zwischen dem ß-gal und dem TRP2 Peptid zu bestehen. Um den Einfluss der Kopplung auf die intrazelluläre Lokalisation zu charakterisieren wurden Fusionskonstrukte bestehend aus EGFP und mTRP2 mit unterschiedlichen Lokalisationssequenzen generiert, DCEK-Zellen stabil transfiziert und die intrazelluläre Lokalisation mit konfokaler Mikroskopie bestimmt. Nach Immunsisierung von Mäusen mit diesen Fusionskonstrukten konnte gezeigt werde, das die intrazelluläre Lokalisation keinen Einfluss auf die Entstehung einer Immunantwort hat. Für die spätere Anwendung der Kopplung in klinischen Studien wurde ein Fusionskonstrukt bestehend aus mTRP2 und dem gut charakterisiertem Antigen des humanen Cytomegalovirus pp65 generiert. Nach Gene-Gun Immunisierung von C57BL/6 Mäusen mit pp65mTRP2 zeigte sich ähnlich wie bei EGFPmTRP2 eine vitiligoartige Felldepigmentierung. Im Elispot-Test ließen sich TRP2 spezifische T-Zellen nachweisen. Das Ergebnis bestätigt die Annahme, dass auch pp65 zur Verstärkung einer antigenspezifischen Immunantwort gegen ein wenig immunogenes Selbstantigen in der Lage ist.
Über lange Zeit wurden in der EPR-Spektroskopie hauptsächlich cw-Experimente bei einer Mikrowellenfrequenz von 9 GHz durchgeführt. In den letzten 10 bis 15 Jahren aber haben zwei verschiedene Entwicklungen immer stärkere Verbreitung gefunden. Dies sind zum einen die Verwendung von immer höheren Magnetfeldern und damit Mikrowellenfrequenzen, und zum anderen die Anwendung von Puls-Experimenten. Hochfeld-EPR bietet zwei wesentliche Vorteile gegenüber den klassisch verwendeten Magnetfeldstärken. Dies ist einerseits die erhöhte spektrale Auflösung bei Systemen mit anisotropen g-Tensoren, andererseits die höhere absolute Empfindlichkeit in Verbindung mit einem geringeren Probenvolumen. Puls-Experimente andererseits bieten die Möglichkeit, Informationen zu gewinnen, die mit cw-EPR Spektroskopie nicht oder nur sehr schwer zu erhalten sind. Die Kombination dieser beiden Weiterentwicklungen der EPR-Spektroskopie eröffnet die Möglichkeit, mittels mehrdimensionaler Spektroskopie detaillierte orientierungsabhängige Informationen zu erhalten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Puls EPR-Spektrometer aufgebaut, welches bei einer Mikrowellenfrequenz von 180 GHz und einem statischen Magnetfeld von 6,4 T arbeitet. 180 GHz ist derzeit weltweit die höchste Mikrowellenfrequenz, bei der routinemäßig ein zylindrischer Hohlraumresonator verwendet wird und bei der Puls EPR-Experimente durchgeführt werden. Da bei solchen Mikrowellenfrequenzen einige benötigte Bauteile nicht mehr in konventioneller Bauweise erhältlich sind, wurden quasioptische Elemente verwendet, um einen Zirkulator aufzubauen. Der Transport der Mikrowellenstrahlung von der Quelle zur Probe und von dort zurück zur Detektion geschieht mittels überdimensionierter Hohlleiter, um die Verluste zu minimieren. Ein zylindrischer Hohlraumresonator wird in einer fundamentalen Mode betrieben, um am Probenort die für Puls-Experimente notwendige Mikrowellenleistung zu erzeugen. Mit der erreichten Mikrowellenleistung und der Ankopplung des Resonators werden Pulslängen von ca. 60 bis 80 ns für Systeme mit S=1/2 erzielt. Die Eigenschaften des aufgebauten Spektrometers wie die Empfindlichkeit oder die Totzeit im Pulsbetrieb werden ausführlich dargestellt und diskutiert. Ebenso werden die Eigenschaften der implementierten Spektrometersteuerung, insbesondere im Hinblick auf das Zeitverhalten bei Puls-Experimenten, dargestellt und diskutiert. Im letzten Teil der Arbeit wird ein ausführliches Anwendungsbeispiel für Hochefeld-EPR diskutiert. Das Ras-Protein spielt eine wichtige Rolle in der intrazellulären Signalweiterleitung und reguliert solche Prozesse wie Zellwachstum, Differentiation und Apoptose. In ca. 30 % aller menschlicher Tumore werden Mutationen dieses Proteins gefunden, was die wichtige Rolle dieses Proteins demonstriert. Trotz dieser wichtigen Funktion ist der genaue Mechanismus des Aktivierungszykluses noch nicht im Detail aufgeklärt worden. Mittels cw-EPR Spektroskopie wurden die GDP-gebundenen inaktiven Proteinkomplexe verschiedener Mutanten untersucht. Durch Messungen in H217O-angereichertem Wasser konnte gezeigt werden, dass bei Raumtemperatur beim Wildtyp ein Wasserligand weniger am aktiven Zentrum der Proteinkomplexe vorliegt als bei einer onkogenen Mutante. Dieses Ergebnis widerspricht den bisher durch verschiedene Röntgenstrukturuntersuchungen gewonnen Erkenntnissen. Es wird ausführlich darüber diskutiert, dass diese unterschiedlichen Ergebnisse vermutlich auf Kristallbildungseffekte zurückzuführen sind.
Chemiker stehen in ihrer Mentalität Architekten nahe: Sie planen und bauen Moleküle. Schon lange, bevor der atomare Aufbau der Materie experimentell bewiesen war, entwickelten sie genaue Vorstellungen über die Raumstruktur von Molekülen. Erst zu Beginn des 20.Jahrhunderts wurden diese "Arbeitshypothesen" – zum Beispiel das von Jacobus van’t Hoff postulierte Tetraedermodell für den vierbindigen Kohlenstoff – von den Physikern glänzend bestätigt. Zwar ist es mittlerweile möglich, die Struktur von unbekannten Molekülen zuverlässig vorherzusagen; doch nach wie vor sind genaue experimentelle Strukturbestimmungen ein unverzichtbarer Bestandteil vieler Forschungsprojekte.