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Highlights
• This current review covers studies that have identified long non-coding RNAs in aortic aneurysm development and progression.
• We separately discuss transcripts and mechanisms of importance to thoracic as well as abdominal aortic aneurysms.
• Functional data on lncRNAs being identified are highlighted.
• Some have been studied in human as well as experimental models of the disease pathology.
Abstract
Aortic aneurysm (AA) is a complex and dangerous vascular disease, featuring progressive and irreversible vessel dilatation. AA is typically detected either by screening, or identified incidentally through imaging studies. To date, no effective pharmacological therapies have been identified for clinical AA management, and either endovascular repair or open surgery remains the only option capable of preventing aneurysm rupture. In recent years, multiple research groups have endeavored to both identify noncoding RNAs and to clarify their function in vascular diseases, including aneurysmal pathologies. Notably, the molecular roles of noncoding RNAs in AA development appear to vary significantly between thoracic aortic aneurysms (TAAs) and abdominal aortic aneurysms (AAAs). Some microRNAs (miRNA - a non-coding RNA subspecies) appear to contribute to AA pathophysiology, with some showing major potential for use as biomarkers or as therapeutic targets. Studies of long noncoding RNAs (lncRNAs) are more limited, and their specific contributions to disease development and progression largely remain unexplored. This review aims to summarize and discuss the most current data on lncRNAs and their mediation of AA pathophysiology.
Haloferax volcanii is a well-established model species for haloarchaea. Small scale RNomics and bioinformatics predictions were used to identify small non-coding RNAs (sRNAs), and deletion mutants revealed that sRNAs have important regulatory functions. A recent dRNA-Seq study was used to characterize the primary transcriptome. Unexpectedly, it was revealed that, under optimal conditions, H. volcanii contains more non-coding sRNAs than protein-encoding mRNAs. However, the dRNA-Seq approach did not contain any length information. Therefore, a mixed RNA-Seq approach was used to determine transcript length and to identify additional transcripts, which are not present under optimal conditions. In total, 50 million paired end reads of 150 nt length were obtained. 1861 protein-coding RNAs (cdRNAs) were detected, which encoded 3092 proteins. This nearly doubled the coverage of cdRNAs, compared to the previous dRNA-Seq study. About 2/3 of the cdRNAs were monocistronic, and 1/3 covered more than one gene. In addition, 1635 non-coding sRNAs were identified. The highest fraction of non-coding RNAs were cis antisense RNAs (asRNAs). Analysis of the length distribution revealed that sRNAs have a median length of about 150 nt. Based on the RNA-Seq and dRNA-Seq results, genes were chosen to exemplify characteristics of the H. volcanii transcriptome by Northern blot analyses, e.g. 1) the transcript patterns of gene clusters can be straightforward, but also very complex, 2) many transcripts differ in expression level under the four analyzed conditions, 3) some genes are transcribed into RNA isoforms of different length, which can be differentially regulated, 4) transcripts with very long 5’-UTRs and with very long 3’-UTRs exist, and 5) about 30% of all cdRNAs have overlapping 3’-ends, which indicates, together with the asRNAs, that H. volcanii makes ample use of sense-antisense interactions. Taken together, this RNA-Seq study, together with a previous dRNA-Seq study, enabled an unprecedented view on the H. volcanii transcriptome.
Aims: Long non-coding RNAs (lncRNAs) have been shown to regulate numerous processes in the human genome, but the function of these transcripts in vascular aging is largely unknown. We aim to characterize the expression of lncRNAs in endothelial aging and analyse the function of the highly conserved lncRNA H19.
Methods and results: H19 was downregulated in endothelium of aged mice. In human, atherosclerotic plaques H19 was mainly expressed by endothelial cells and H19 was significantly reduced in comparison to healthy carotid artery biopsies. Loss of H19 led to an upregulation of p16 and p21, reduced proliferation and increased senescence in vitro. Depletion of H19 in aortic rings of young mice inhibited sprouting capacity. We generated endothelial-specific inducible H19 deficient mice (H19iEC-KO), resulting in increased systolic blood pressure compared with control littermates (Ctrl). These H19iEC-KO and Ctrl mice were subjected to hindlimb ischaemia, which showed reduced capillary density in H19iEC-KO mice. Mechanistically, exon array analysis revealed an involvement of H19 in IL-6 signalling. Accordingly, intercellular adhesion molecule 1 and vascular cell adhesion molecule 1 were upregulated upon H19 depletion. A luciferase reporter screen for differential transcription factor activity revealed STAT3 as being induced upon H19 depletion and repressed after H19 overexpression. Furthermore, depletion of H19 increased the phosphorylation of STAT3 at TYR705 and pharmacological inhibition of STAT3 activation abolished the effects of H19 silencing on p21 and vascular cell adhesion molecule 1 expression as well as proliferation.
Conclusion: These data reveal a pivotal role for the lncRNA H19 in controlling endothelial cell aging.
Untersuchung der Konformation und Dynamik von RNA mit Hilfe fluoreszierender Farbstoffmoleküle
(2010)
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung der konformationellen und elektronischen Eigenschaften sowie der Dynamik verschiedener RNA-Systeme. Zur Durchführung dieser Experimente wurde zusätzlich zu bereits vorhandenen statischen und zeitaufgelösten Absorptionsspektrometern im Rahmen dieser Arbeit eine Apparatur zur Messung von Fluoreszenzlebensdauern entwickelt, die durch die integrative Verwendung zweier verschiedener, etablierter Technologien (TCSPC und Aufkonvertierung) über einen weiten Zeitbereich von 9 Größenordnungen (100 fs - 0,1 ms) operiert. Mit diesem Aufbau konnten neben den RNA-Studien wichtige Beiträge zum Verständnis der Isomerisierung eines Retinalproteins, des Transportprozess des Membrantransportproteins TbSMR und der im Infraroten liegenden Fluoreszenz des Radikalkations von Astaxanthin gewonnen werden. Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit liegt auf der Untersuchung verschiedener RNA-Systeme: So werden die optischen Eigenschaften einer 1-Ethinylpyren-modifzierten RNA-Adeninbase allein und in RNA-Strängen eingebunden untersucht. Statische Fluoreszenzmessungen zeigen einen ausgeprägten Ladungstransfercharakter des Chromophors und eine generell große Wechselwirkung zwischen Ethinylpyren und Adenin, die in einer substanziellen Änderung der optischen Eigenschaften des Pyrens resultiert. Die Untersuchung der schnellen Photodynamik von Pyrenadenin zeigt zudem eine Verringerung der Lebensdauer von Pyren um etwa 2 Größenordnungen. Pyrenadenin zeigt sowohl Fluoreszenz eines neutralen (100-200 ps), als auch eines energetisch tiefer liegenden Ladungstransferzustands (1-2 ns). Die Formationszeit des Ladungstransferzustandes fällt mit steigender Polarität des Lösemittels. Eingebunden in Modell-RNA-Stränge ist Fluoreszenzquantenausbeute des Chromophors ein deutlicher Indikator für seine Interkalation. Nur in der stabileren Umgebung von GC-Basenpaaren ist das Pyren in der Lage, sich dauerhaft innerhalb des Duplex aufzuhalten, während in einer flexibleren AU-Umgebung eine Position außerhalb des RNA-Duplex präferiert wird. Transiente Absorptionsmessungen zeigen, dass die Photophysik des in RNA eingebundenen Pyrenadenins nur kleine Variationen im Vergleich zur Photophysik des Labels allein aufweist. Die deutliche Abnahme der Quantenausbeute des interkalierten Chromophors geht hauptsächlich auf Kosten der langlebigeren Ladungstransferfluoreszenz, so dass interkaliertes Pyren insgesamt schneller in den Grundzustand zurückkehrt als nicht interkaliertes. Mit Hilfe eines doppelt modifizierten Duplex, bei dem sich jeweils ein Farbstoff an einem der beiden Stränge befindet, kann nachgewiesen werden, dass aufgrund von Exzimerwechselwirkungen eine Verschiebung des Fluoreszenzmaximums von 35 nm auftritt. Kurzzeitspektroskopische Messungen zeigen Signale, die als Superposition von Monomeren und Exzimeren interpretiert werden können, wobei die Lebensdauer des letzteren mit 18,5 ns die der Monomerkomponente um ein Vielfaches übertrifft. Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit einer Studie zur Bindung des fluoreszenten Liganden Tetrazyklin an das Tetrazyklin bindende Aptamer. Hier wird auf Basis verschiedener Mutanten mit Hilfe des TCSPC eine Analyse der Stabilität der Bindetasche sowie mit der Stopped-Flow-Methode eine Beobachtung des Bindungsprozesses durchgeführt. Insgesamt folgt die Bindung des Tetrazyklins an das Aptamer einer zweistufigen Kinetik, deren zweiter Schritt irreversibel ist. Die Bindung läuft, verglichen mit anderen Aptameren, sehr schnell ab. Während die Mutationen von A13 und A50,die direkte Kontakte zum Substrat bilden, nur einen leichten Einfluss auf beide Bindungsschritte ausüben, führt eine Mutation der für die Präformation verantwortlichen Base A9 zu einer Verlangsamung des Bindungsprozesses um mehr als einen Faktor 20 durch eine immens gesteigerten Rückreaktionsrate des ersten Bindungsschritts. Hieraus lässt sich schließen, dass bei fehlender Präformation des Aptamers nur wenige Tetrazyklinmoleküle ein für vollständige Bindung geeignetes Aptamer vorfinden. Die Bindung an A13 und A50 geschieht bereits im ersten Schritt des Bindungsprozesses. Ferner konnte anhand von Lebensdauermessungen gezeigt werden, dass nach dem Wildtyp die Mutante A9G die stabilste Bindetasche aufwies. Das Fehlen eines direkten Kontaktes wirkt sich deutlich stärker aus. Insbesondere führt die Abwesenheit der Fixierung des Gegenions durch A50 zu der instabilsten Bindetasche. Wie in dieser Arbeit gezeigt wird, ist die zeitaufgelöste optische Spektroskopie insbesondere in Verbindung mit fluoreszierenden Molekülen ein ausgezeichnetes Mittel zur Beobachtung von Struktur und Dynamik von RNA. Die Empfindlichkeit von Fluoreszenz auf die Veränderung der Umgebung des Chromophors erlaubt es, Konformationsdynamik und elektronische Konfigurationen in Echtzeit zu beobachten.
Highlights
• Endothelial ageing contributes significantly to atherosclerosis.
• Non-coding RNAs are gaining interest as regulators of vascular biology.
• Several microRNAs regulate endothelial cell ageing.
• Multiple lncRNAs play a role in endothelial cell ageing.
Abstract
Atherosclerosis and numerous other cardiovascular diseases develop in an age-dependent manner. The endothelial cells that line the vessel walls play an important role in the development of atherosclerosis. Non-coding RNA like microRNAs and long non-coding RNAs are known to play an important role in endothelial function and are implicated in the disease progression. Here, we summarize several microRNAs and long non-coding RNAs that are known to have an altered expression with endothelial aging and discuss their role in endothelial cell function and senescence. These processes contribute to aging-induced atherosclerosis development and by targeting the non-coding RNAs controlling endothelial cell function and senescence, atherosclerosis can potentially be attenuated.
Background: Differential RNA-Seq (dRNA-Seq) is a recently developed method of performing primary transcriptome analyses that allows for the genome-wide mapping of transcriptional start sites (TSSs) and the identification of novel transcripts. Although the transcriptomes of diverse bacterial species have been characterized by dRNA-Seq, the transcriptome analysis of archaeal species is still rather limited. Therefore, we used dRNA-Seq to characterize the primary transcriptome of the model archaeon Haloferax volcanii.
Results: Three independent cultures of Hfx. volcanii grown under optimal conditions to the mid-exponential growth phase were used to determine the primary transcriptome and map the 5′-ends of the transcripts. In total, 4749 potential TSSs were detected. A position weight matrix (PWM) was derived for the promoter predictions, and the results showed that 64 % of the TSSs were preceded by stringent or relaxed basal promoters. Of the identified TSSs, 1851 belonged to protein-coding genes. Thus, fewer than half (46 %) of the 4040 protein-coding genes were expressed under optimal growth conditions. Seventy-two percent of all protein-coding transcripts were leaderless, which emphasized that this pathway is the major pathway for translation initiation in haloarchaea. A total of 2898 of the TSSs belonged to potential non-coding RNAs, which accounted for an unexpectedly high fraction (61 %) of all transcripts. Most of the non-coding TSSs had not been previously described (2792) and represented novel sequences (59 % of all TSSs). A large fraction of the potential novel non-coding transcripts were cis-antisense RNAs (1244 aTSSs). A strong negative correlation between the levels of antisense transcripts and cognate sense mRNAs was found, which suggested that the negative regulation of gene expression via antisense RNAs may play an important role in haloarchaea. The other types of novel non-coding transcripts corresponded to internal transcripts overlapping with mRNAs (1153 iTSSs) and intergenic small RNA (sRNA) candidates (395 TSSs).
Conclusion: This study provides a comprehensive map of the primary transcriptome of Hfx. volcanii grown under optimal conditions. Fewer than half of all protein-coding genes have been transcribed under these conditions. Unexpectedly, more than half of the detected TSSs belonged to several classes of non-coding RNAs. Thus, RNA-based regulation appears to play a more important role in haloarchaea than previously anticipated.