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Die Arachidonsäurekaskade spielt bei Entzündungsprozessen und der Schmerzentstehung eine wichtige Rolle. Deren primäre Produkte, die Leukotriene und die Prostaglandine, sind entzündungsfördernde Mediatoren und nehmen Einfluss auf den Entzündungs-auflösendenprozess und sind bei einer Dysregulation für diverse Erkrankungen wie z.B. Asthma bronchiale und allergische Rhinitis mitverantwortlich. Die Kaskade gliedert sich mit ihren beiden Hauptenzymen, Cyclooxygenase und 5-Lipoxygenase (5-LO), in zwei Wege auf. Beide Enzyme sind außerdem in der Lage entzündungsauflösenden Mediatoren zu bilden. Die Mediatoren wie z.B. Lipoxin können im Zellstoffwechsel einerseits über die Lipoxygenase-Route, oder andererseits wie „aspirin-triggered“-Lipoxin von der durch geeignete Wirkstoffe acetylierten Cyclooxygenase-2 (COX-2) katalysiert werden. Diese Mediatoren werden benötigt, um (chronische) Entzündungen und beschädigtes Gewebe zurück zur Homöostase zu führen.
Die Pharmakotherapie chronisch entzündlicher Erkrankungen mit guter Wirksamkeit und verträglichem Profil bei Langzeiteinnahme stellt jedoch eine Herausforderung dar. Die Therapie verzögern oft, z. B bei Einnahme von nicht-steroidalen Antirheumatika (NSAR), die Entzündungsauflösung, da die Bildung von entzündungshemmenden und entzündungs-auflösenden Lipidmediatoren gehemmt werden. Die gezielte Modulation und Einflussnahme auf die Arachidonsäurekaskade an einem der beiden Enzyme, stellt daher einen guten Ansatz für eine verbesserte Therapiemöglichkeit von (chronischen) entzündlichen Krankheiten dar. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese von Modulatoren und Inhibitoren der Arachidonsäurekaskade. Zum einen befasst sie sich mit der Entwicklung von irreversiblen COX-2-acetylierenden Substanzen als neues anti-entzündliches und entzündungsauflösendes Prinzip. Zum anderen mit der Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehung (SAR) von 2-Aminothiazolen als direkte 5-LO-Inhibitoren ausgehend von SKI-II, welches zuvor als Leitstruktur zur Entwicklung von 5-LO-Inhibitoren entdeckt wurde.
Als Leitstrukturen für die irreversiblen COX-2-acetylierenden Substanzen wurden bekannte COX-2 selektive Substanzen ausgewählt sowie vereinzelte nicht-selektive NSAR. Es wurden an der COX-2 Kristallstruktur Docking-Studien durchgeführt, um die geeignetsten Positionen für die Einführung einer (labilen) Acetylgruppe zu identifizieren. Aufgrund dieser Studien wurden drei Positionen ausgewählt zur Derivatisierung. Es wurden daraufhin zahlreiche Derivate synthetisiert von Celecoxib, Valdecoxib, Rofecoxib, Etericoxib, als Vertreter der (COX-2) selektive Inhibitoren, sowie von Acetylsalicylsäure, Diclofenac und Nimesulid-Analoga als Vertreter der nicht-selektiven NSARs. Zusätzlich wurden Derivate synthetisiert mit Michael-Akzeptoren als kovalente bindende Komponente. Alle synthetisierten Substanzen wurden sukzessiv auf ihre COX inhibitorischen Eigenschaften hin untersucht und auf COX-2 Selektivitäten überprüft. Weiterhin wurden von allen Derivaten Auswaschungs-Studien durchgeführt als Vorversuche welche Derivate eine irreversible COX-2-Inhibition hervorrufen. In den Vorversuchen zeigte die Verbindung ST-1650 am deutlichsten eine COX-2-Selektivität sowie eine starke irreversible Inhibition der COX-2. Die Verbindung ST-1650 wurde weiterhin auf indirekte Hinweise zur Entstehung von heilungsfördernden Mediatoren untersucht anhand von: M1-Macrophagen Polarisation und einem Schmerzmodell, dem Zymosan-Überempfindlichkeit Pfotenmodell. Im Makrophagen-Modell konnte ST-1650 keine Phänotypverschiebung hinzu entzündungsauflösenden M2-Makrophagen bewirken, sowie in den Schmerzmodellen leider keine schnellere Schmerzauflösung als die Kontrollgruppe. Ob diese Effekte durch mangelnde oder zu geringer Entstehung von entzündungshemmenden Mediatoren zurückzuführen ist, ist noch unklar.
Für die SAR der 2-Aminothiazole als direkte 5-LO-Inhibitoren wurden über 60 Verbindungen synthetisiert und untersucht. Zu Beginn erfolgte eine Optimierung der Grundstruktur als 5-LO-Inhibitor. Es wurden die Einflüsse der Substituenten des Thiazolsrings und des Aminolinkers auf die 5-LO-Aktivität ermittelt, um die SAR initialer Arbeiten zu vertiefen. Nach der SAR-Untersuchung im intakten Zellsystem konnten durch Kombination bevorzugter Strukturelemente die zwei Verbindungen ST-1853 und ST-1906, als neue potente 5-LO-Inhibitoren entwickelt werden, die sich als nicht-toxisch herausstellten. Diese beiden 5-LO-Inhibitoren wirken um einen Faktor 10 potenter und sind weniger toxisch verglichen mit der Leitstruktur SKI-II. ST-1853 wurde innerhalb der Arachidonsäurekaskade auch auf Off-targets getestet, deren Aktivitäten sie erst bei 100-fach höherer Konzentration beeinflusst, sowie in humanem Vollblut, wo sie sich ihre 10-fach bessere Wirksamkeit im Vergleich zu SKI-II bestätigte. Darüber hinaus erwies sich ST-1853 bei den ersten Überprüfungen seiner Stabilität unter physiologischen Bedingungen wie bei der in vitro Metabolisierung durch Rattenlebermikrosomen als ausreichend stabil und daher zur weiteren Charakterisierung gut geeignet.
In dieser Arbeit werden Projekte beschrieben, in denen das Adsorptionsverhalten von Proteinen und Bakterien an verschiedene Materialoberflächen manipuliert wird.
Durch die Reaktion verschiedener oxidischer Oberflächen mit Glycidol konnten biorepulsive Polyglycerolschichten erzeugt werden. Für die Herstellung dieser Polyglycerolschichten wurden zwei unterschiedliche Verfahren entwickelt und untersucht. Die erste Methode beruht auf der Bildung einer aminoterminierten Monolage auf Silicium-Oberflächen, an der in einem zweiten Schritt die Polymerisation von Glycidol durchgeführt wird. Die Dicke der angebundenen Polyglycerolschicht ist abhängig von der Beschichtungsdauer, wobei die dicksten Schichten bis zu 98% der Bakterienadhäsion unterdrücken können. Das zweite Verfahren ist die direkte Anbindung von stabilen Polyglycerol-Beschichtungen an Silicium-, Aluminium- oder Stahl-Oberflächen. Je größer die abgeschiedene Polyglycerolmenge ist, desto höher ist die Biorepulsivität der Schicht, was durch Adsorptionstests mit Proteinen und ermittelt wurde.
Polyglycerolschichten eignen sich besonders gut für die nachträgliche Modifizierung. So konnten beispielsweise mittels Elektronenstrahlen laterale Strukturierungen der Polyglycerol-beschichteten Oberflächen erfolgreich durchgeführt werden. Sensorisch aktive Moleküle wie Ethylendiamintetraessigsäure oder Biotin konnten im Rahmen dieser Arbeit nachträglich an Polyglycerolschichten angebunden werden. Die Aktivität der Bindungsstellen nach der Anbindung an die Oberfläche konnte dabei durch spezifische Erkennungsereignisse nachgewiesen werden.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden selbstanordnende Monoschichten mit Oligoethylenglycol (OEG)-Kopfgruppen und Thiolat-Ankergruppen verwendet, um lateral strukturierbare, biorepulsive Schichten auf Gold zu erzeugen. Es wurde untersucht, ob derartige OEG-Monolagen kontrolliert durch langwelliges UV-Licht (390 nm) abgebaut werden können, um proteinbindende und proteinrepulsive Bereiche auf einer Substrat-Oberfläche zu generieren. Die Bestrahlung mit UV-Licht bewirkte die Oxidation und Abspaltung der Ethylenglycol-Einheiten, wodurch die unspezifische Adsorption von Proteinen erfolgen kann. Zusätzlich konnten Photooxidations-Reaktionen an der Thiolat-Ankergruppe nachgewiesen werden, welche die Ablösung des SAM-Bausteins zur Folge haben.
Für den Einsatz von Lithographie-Techniken in mikrofluidischen Anlagen wurde das Abbauverhalten der biorepulsiven Monolage bei der Bestrahlung unter Wasser untersucht. In Abwesenheit von molekularem Sauerstoff kommt es hier lediglich zur Spaltung der Etherbindung zwischen den Ethylenglycol-Einheiten. Die Beobachtung, dass die An- bzw. Abwesenheit von molekularem Sauerstoff zu zwei unterschiedlichen Abbaumechanismen führt, kann für die Feinabstimmung der Oberflächenbeschaffenheit und somit der Proteinanlagerung genutzt werden.
Biorepulsive OEG-Monolagen können auch dazu verwendet werden, um gezielt bestimmte Biomoleküle anzulagern. Dazu können die Monolagen mit Erkennungsstellen ausgestattet werden, welche die spezifische Anbindung einer Biomolekül-Spezies ermöglichen. Gerade bei der Detektion von großen Biomolekülen oder Mikroorganismen spielt jedoch nicht nur die chemische Zusammensetzung, sondern auch die Ausrichtung der Bindungsstelle eine entscheidende Rolle. Für die Untersuchung des Orientierungseinflusses wurden Moleküle verwendet, die neben einer Mannose-Einheit als Bindungsstelle für Bakterien auch eine Azobenzol-Gruppe, welche die strahlungsinduzierte reversible Schaltung der Konformation ermöglicht, tragen. Bakterien-Adhäsionstests zeigten, dass sich die Orientierung der Mannose-Einheit auf die Anbindung der Bakterien auswirkt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden neuartige Methoden zur Herstellung, Charakterisierung und Strukturierung biorepulsiver und biosensorischer Schichten entwickelt. Die dadurch gewonnenen Erkenntnisse sind von bedeutender wissenschaftlicher Relevanz und ermöglichen die potentielle industrielle Anwendung der entwickelten Methoden im Kontext der Material- und Biotechnologie sowie der Nanofabrikation.
Die 5-Lipoxygenase (5-LOX) stellt den Startpunkt des Leukotrienstoffwechsels dar, da sie Arachidonsäure (AA) über die 5(S)-Hydroperoxy-6-trans-8,11,14-cis-eicosatetraensäure (5-HpETE) in Leukotrien A4 (LTA4) umwandelt. 5-HpETE kann zum korrespondierenden Alkohol 5(S)-Hydroxy-6-trans-8,11,14-cis-eicosatetraensäure (5-HETE) reduziert werden. LTA4 dient als Zwischenprodukt für die Synthese von LTB4 und den Cysteinyl-gebundenden LTs LTC4, LTD4 und LTE4. LTs nehmen eine wichtige Funktion in der Immunabwehr ein, sind jedoch auch an einer Vielzahl von Krankheitsgeschehen wie z. B. Asthma bronchiale, Atherosklerose und einiger Tumorarten beteiligt. Die 5-LOX teilt sich in zwei Domänen auf: der reglatorischen, N-terminalen Domäne und der katalytischen, C-terminalen Domäne. Ihre Aktivität unterliegt einer komplexen allosterischen Regulation und kinetischen Besonderheiten wie einer Substratinhibition. In vielen Fällen ist die regulatorische PLAT-(Polycystin-1, Lipoxygenase, alpha-Toxin)-Domäne involviert. Sie ist essentiell an der Bindung von Calcium, Membranen und weiterer Faktoren wie dem Coactosin-like protein (CLP) und Dicer beteiligt. Auch eine zweite Bindungsstelle für das Substrat oder einen seiner Metaboliten wird dort vermutet. Letztlich bleibt jedoch die Regulation der 5-LOX-Aktivität durch die PLAT-Domäne unzureichend geklärt. Diese Tatsache und die fortwährende Suche nach neuen Ansatzpunkten für die 5-LOX-Inhibition bilden den Hintergrund, vor dem diese Arbeit angefertigt wurde.
Das Ziel lag in der Entwicklung einer stabilen, isolierten PLAT-Domäne und deren Charakterisierung. Es stellte sich jedoch heraus, dass sich die isolierte Domäne durch eine hohe thermische Instabilität und starke Aggregationsneigung auszeichnet. Mittels Mutationsstudien auf Basis der 5-LOX AS 1-115, verbunden mit Gelfiltrationsläufen zur Analyse der Proteinaggregation, wurde schließlich ein Konstrukt entwickelt, das in Konzentrationen < 0,5 mg/ml als Monomer vorlag: die sogenannte PLAT1-115 W75G. Ein Austausch des W75 in Glycin erhöhte ebenfalls die thermische Stabilität, so dass Versuche bei 20°C durchgeführt werden konnten. Zunächst wurden jedoch die grundlegenden Eigenschaften der Mutante untersucht. Dies umfasste die Beantwortung der Frage, ob auch die PLAT1-115 W75G Calcium bindet, sowie die Aufnahme eines Circulardichroismus-(CD)-Spektrums. Der erste Aspekt konnte mit mehreren Methoden bestätigt werden. Eine Calciumzugabe zum Laufpuffer 20 mM MOPS, 50 mM KCl pH 7,4 erhöhte konzentrationsabhängig das Elutionsvolumen der PLAT1-115 W75G auf der analytischen Gelfiltrationssäule – vermutlich durch den bekannten Einfluss von Calcium auf die Hydrophobizität der PLAT-Domäne. Zusätzlich wurde die Interaktion durch differential scanning fluorimetry (DSF) und Oberflächen-Plasmonen-Resonanz-Spektroskopie (SPR) nachgewiesen. Allerdings gelang aus verschiedenen Gründen keine Quantifizierung der Bindungsaffinität. Das CD-Spektrum bestätigte die Struktur der PLAT-Domäne als sogenanntes all-beta_protein und ermöglichte die Einordnung der PLAT1-115 W75G in die Gruppe der betaII-Proteine.
Ein weiterer Fokus dieser Arbeit lag auf der vermuteten allosterischen Fettsäurebindungsstelle in der PLAT-Domäne. Es wurde versucht, die Interaktion mittels SPR nachzuweisen. Zur Vorbereitung wurde im 5-LOX-Aktivitätstest und im DSF an der isolierten Domäne ein Detergens bestimmt, das einen möglichst geringen Einfluss auf das Protein ausübt. Dabei zeigte Octyl-beta-D-glucopyranosid (beta-OG) das vorteilhafteste Profil. Auf dieser Basis wurde die kritische Mizellbildungs-Konzentration (CMC) der AA und einiger HETEs in beta-OG-haltigen Puffern bestimmt. Die SPR-Studien ergaben jedoch keine reproduzierbaren Ergebnisse. In einem weiteren Schritt wurden die Substrathemmung des Gesamtproteins 5-LOX und der Einfluss von Calcium charakterisiert. Sowohl in Gegenwart von ~ 1 mM freiem Calcium als auch von 1 mM EDTA lag mit 20 µM AA die höchste Produktbildung nach 10-minütiger Reaktion vor. Das Detergens Tween20 (T20) hob in einer Konzentration unter seiner CMC (0,001 % m/V) in Anwesenheit von Calcium die Inhibition auf. Ohne Calcium zeigte sich auch in Gegenwart von T20 die bekannte Substratinhibition der 5-LOX einschließlich ihrer Maximalaktivität bei 20 µM AA. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Calcium eine Bindung der 5-LOX an eventuell vorhandene, negativ geladene Vesikel aus AA und Detergens vermitteln und dadurch die Substratinhibition aufheben kann. In Fällen, in denen die Substratinhibition vor dem Erreichen der AA-CMC auftritt, hat Calcium folglich keinen Einfluss.
Zuletzt wurde die Interaktion der PLAT1–115 W75G mit CLP und einem C-terminalen Fragment von Dicer untersucht. Im Crosslinking ließ sich nicht auf eine Interaktion der isolierten PLAT-Domäne mit CLP schließen. Dagegen ergaben Diamid-Crosslinking-Studien, dass die isolierte PLAT-Domäne in der Lage ist, das Dicer-Fragment zu binden. Dieses Ergebnis wurde im SPR bestätigt.
Habituation ist eine der einfachsten Formen des Gedächtnisses. Hierbei handelt es sich um die erlerne Gewöhnung an einen harmlosen Reiz. Dies bedeutet, dass nach mehrfacher wiederholter Repräsentation eines harmlosen Reizes die Reaktion darauf stetig abnimmt, bis sie völlig zum erliegen kommt. Je nach Trainingsprotokoll kann diese Gewöhnung bis zu mehren Tagen andauern. Habituation ist hoch konserviert und ein Verhaltensmuster, dass auch bei sehr einfachen vielzelligen Organismen zu finden ist und untersucht werden kann. Zur Untersuchung des Zusammenspiels innerhalb eines neuronalen Netzwerkes, welches für die Habituation des Rückzugsreflexes (Ausweichreaktion nach Berührung) verantwortlich ist wurde hier der Fadenwurm Caenohabditis elegans (C. elegans) als Modell Organismus verwendet. Aufgrund seines einfachen, nur 302 Zellen umfassenden, Nervensystems eignet sich C. elegans sehr gut für Grundlagenforschung in diesem Bereich. Das neuronale Netzwerk, das verantwortlich ist für den Rückzugsreflex ist in drei Ebenen organisiert. Wahrgenommen wird der Reiz von sensorischen Neuronen (ASH, ALM, AVM, PLM, PVM). Die Weiterleitung erfolgt über verschiedene Interneuronen (AVA, AVB, AD, AVE, PVC) hin zu den Motorneuronen, welche die Muskeln enervieren und somit die Reaktion auf den in erster Ebenen wahrgenommen Reiz auslösen.
Mit Hilfe von optogenetischen Werkzeugen wurde hier Untersucht welche Rolle einzelne Zellen innerhalb dieses Netzwerkes innehaben und an welcher Stelle innerhalb des Netzwerkes die kurzzeitige Habituation des Reizes, nach einem Einfachen Lernprotokoll stattfindet. Zuerst musste eine Möglichkeit gefunden werden die zur Verfügung stehenden optogenetischen Werkzeuge zellspezifisch zu exprimieren. In dieser Arbeit wurden hierfür Rekombinasesysteme verwendet, die es ermöglichten zur Expression eine Kombination aus 2 verschiedenen Promotoren zu verwenden. Beide Promotoren dürfen hierbei nur in einer Zelle, der Zielzelle, überlappen. Es konnte zellspezifische Expression des Kationenkanals Chanelrhodopsin 2 (ChR2) in den beiden Zellparen AVAL/R und ASHL/R (nimmt aversive Reize wahr) erreicht werden.
Zur Untersuchung der Habituation wurde zusätzlich noch ein Wurmstamm verwendet, welcher ChR2 unter dem mec-4 Promotor exprimiert. ChR2 ist hier in den Mechanorezeptorneuronen (MRN) ALM, AVM, PLM und PVM exprimiert. Die hier durchgeführten Experimente deuten darauf hin das den MRNs die Größte Rolle bei der Ausbildung einer Habituation zukommt. Es gibt jedoch auch Hinweise darauf, dass AVA zusätzlich eine Rolle spielt.
Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde die Rolle von AVA genauer untersucht. AVA gilt als der Hauptsignalgeber für eine Rückwärtsbewegung (spontan und nach Reizempfang). Es konnte gezeigt werden dass eine Unterbrechung der ’Gap Junktionen’ zwischen AVA und PVC eine stärkere Reaktion zur Folge haben. AVA scheint also durch PVC inhibiert zu werden. Ebenfalls mit AVA direkt interagierende Neuronen sind AVD und AVE. Mit den hier zur Verfügung stehenden Mitteln konnte die genaue Modulation von AVA durch diese Zellen jedoch nicht gezeigt werden.
In dieser Arbeit konnte der Grundstein für eine funktionale Aufklärung des Nervensystems von C. elegans gelegt werden. Vor allem durch die Möglichkeit der zellspezifischen Expression kann es zukünftig gelingen das Zusammenspiel der einzelnen Nervenzellen und ihren Anteil an einem bestimmtem Verhalten zu Untersuchen.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein Flugzeitmassenspektrometer (TOF-MS) für die Messung von halogenierten Spurengasen charakterisiert und das verwendete analytische System optimiert. Ein TOF-MS hat den Vorteil, dass es die volle Masseninformation aufzeichnet. Dadurch ist es möglich, auch im Nachhinein Substanzen zu identifizieren und retrospektiv auszuwerten. Eine retrospektive Auswertung kann helfen, Auswirkungen auf die Atmosphäre besser abschätzen zu können. Aus diesem Grund wurde mit Hilfe des TOF-MS ein digitales Datenarchiv durch regelmäßige Messungen von Luftproben, die am Taunus Observatorium auf dem Kleinen Feldberg genommen wurden, initialisiert. Durch die Wahl des Taunus Observatoriums werden in unmittelbarer Nähe des industriellen Ballungsraums Rhein-Main auf der Nordhemisphäre Luftproben genommen, wodurch die Wahrscheinlichkeit erhöht wird, unbekannte Substanzen in erhöhter Konzentration zu messen.
Bevor das TOF-MS jedoch für die Initialisierung des Datenarchivs verwendet werden konnte, wurde es charakterisiert und mit einem, für die Analyse von halogenierten Kohlenwasserstoffen etablierten QP-MS verglichen. Um beide Detektoren vergleichen zu können, erfolgte die Probenaufgabe, Probenaufkonzentrierung und die Separation der Probe im Gaschromatographen innerhalb eines gemeinsamen Systems. Nach der Separation im GC teilt sich der Trägergasfluss auf. Die Charakterisierung des TOF-MS und der Vergleich mit dem QP-MS umfasst die Auswertung der Daten, die Messpräzision, die Linearität, die Sensitivität der Detektoren, die Massenauflösung und die Massenachsenbestimmungsgenauigkeit.
Hinsichtlich der Messpräzision liegen beide Massenspektrometer, wie ermittelt auf dem selben Niveau, wodurch sie auch sehr geringe Variabilitäten in den Mischungsverhältnissen von halogenierten Kohlenwasserstoffen aufzeichnen können.
Die Linearität der Detektoren ist substanzspezifisch. Während das QP-MS in Übereinstimmung mit bereits literaturbekannter Eigenschaft, einen sehr großen linearen Bereich aufweist, zeigt das hier verwendete TOF-MS für 2/3 aller ausgewerteter Substanzen starke substanz- und fragmentabhängig Nichtlinearitäten. Das nichtlineare Verhalten des Detektors des TOF-MS zeigt sich auch bei den Messvergleichen, wobei jedoch nur signifikante Abweichungen bei sehr hohen und sehr niedrig gemessenen Mischungsverhältnissen beobachtet wurden. Diese starke Nichtlinearität stellt eine große Einschränkung für eine retrospektive Auswertung unbekannter Substanzen dar, da deren Verlauf nur qualitativ nicht aber quantitativ dargestellt werden kann.
Die Massenauflösung liegt beim TOF-MS bei 1000 mit einer Massenachsenbestimmungsgenauigkeit zwischen 50-170~ppm, wodurch es dem QP-MS, welches nur Einheitsauflösung vorweist, weit überlegen ist. Mit dieser Auflösung und Massenachsenbestimmungsgenauigkeit ist das TOF-MS in der Lage einen halogenierten von einem nichthalogenierten Kohlenwasserstoff quantitativ zu trennen.
Zum Vergleich der Sensitivität der beiden Massenspektrometer wurde das QP-MS in drei verschiedenen Modi betrieben: Zum einen dem SCAN-Modus, dem operationalen SIM-Modus, welcher im regulärem Messbetrieb verwendet wird und mehrere Ionen pro Zeitfenster misst, und dem optimierten SIM-Modus, welcher nur ein Ion der jeweiligen Substanz misst. Das TOF-MS hat die gleiche Sensitivität wie das QP-MS im optimierten SIM-Modus. Das TOF-MS hat eine um den Faktor 3 höhere Sensitivität als das QP-MS im operationalen SIM-Modus und eine um den Faktor 12 höhere Sensitivität als das QP-MS im SCAN-Modus bei den betrachteten Substanzen.
Die Initialisierung des digitalen Datenarchivs wurde im Oktober 2013 mit der Probennahme am Taunus Observatorium begonnen, wobei in der vorliegenden Arbeit der Zeitraum von einem Jahr betrachtet wurde. Es wurden Identifizierungen aus regulären Proben der Taunus Observatoriums-Zeitreihe durchgeführt und so die Substanzen HFC-32, HFC-245fa,HCFC-133a und HFO-1234yf gefunden. Zusätzlich stellte Martin Vollmer (Eidgenössische Material und Prüfgesellschaft) zwei Gasmischungen zu Verfügung für die Identifikation von noch nicht am System vermessenen Substanzen. Somit konnte die Vielfalt an diesem System vermessener Substanzen von 40 auf insgesamt 64 Substanzen erweitert werden.
Von den neu identifizierten Substanzen wurden HFC-227ea, HFC-236fa, HFC-32, HCFO-1233zd, HFO-1234zd, HFO-1234yf, HFC-245fa, HCFC-31, HFC-133a, Isofluran und HFC-112 in der Taunus Observatoriums-Zeitreihe gefunden und rückwirkend aufgearbeitet.
Durch die retrospektive Auswertung ist das TOF-MS für seine charakterisierte Anwendung zum Einsatz gekommen.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde einerseits der Einsatz lichtaktivierbarer Oligonukleotide zur Kontrolle der Leitfähigkeit entlang von DNA untersucht sowie neue photoaktivierbare Verbindungen für die Peptidchemie und für eine neu entwickelte Variante des SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponetial enrichment) Verfahrens synthetisiert.
DNA vermittelte Ladungsübertragung verläuft entlang des gestapelten π-Systems der heteroaromatischen Nukleobasen. Die Leitfähigkeit von Oligonukleotiden reagiert daher empfindlich auf Störungen in der Watson-Crick-Basenpaarung. Die in der Arbeitsgruppe Heckel etablierte Technik, Nukleobasen an für die Basenpaarung relevanten Positionen mit photolabilen Schutzgruppen zu modifizieren, sollte daher mit Systemen der Ladungsübertragung in DNA kombiniert werden. Im Verlauf dieses Projekts wurden zwei literaturbekannte Varianten, in denen Ladungstransport über einen lichtinduzierten Redoxprozess zwischen Metallkomplexen ablaufen und über eine dabei unterdrückte Fluoreszenz optisch verfolgt werden sollte, als ungeeignete Systeme identifiziert. Durch den Wechsel zu elektrodengestützter Leitfähigkeitsmessung konnte der prinzipielle Effekt von Leitfähigkeit in perfekt gepaarter DNA und deutlich reduziertem Stromfluss in Oligonukleotiden mit Fehlpaarungen gezeigt werden. Beim Einsatz photolabil geschützter Oligonukleotide konnte jedoch auch in diesem System noch nicht der gewünschte Effekt gefunden werden.
Im zweiten Projekt dieser Arbeit wurden neue photolabile Verbindungen hergestellt, die Peptide nach ihrem Einbau in das Peptidrückgrat durch Zwei-Photonen-Anregung mit IR-Licht spalten sollen. Drei entsprechende Nitrodibenzofuran-Verbindungen und ein Cumarin-Baustein konnten erfolgreich synthetisiert werden. Die neuen Moleküle zeigten im Rahmen der Peptid-Festphasensynthese Stabilitätsprobleme. Diese Schwierigkeiten konnten durch Peptid-Kopplungen in Lösung umgangen werden. Mit Hilfe eines der hergestellten Bausteine wurden zwei Tripeptide hergestellt, die jeweils mit dem Farbstoff ATTO565 markiert und hinsichtlich ihrer photochemischen Eigenschaften charakterisiert wurden. Der neue Baustein zeigte neben den Eigenschaften als photospaltbare Gruppe, dass er gleichzeitig ein Quencher für den Farbstoff ATTO565 darstellt. Nach Belichtung stieg die Fluoreszenz um den Faktor 81 an. Die Aktivierung gelang wie erwartet mit Ein- und Zwei-Photonen-Anregung. In Kollaboration mit der Arbeitsgruppe von Prof. Heilemann konnten Antiköper mit einem der Tripeptide modifiziert werden und die Kompatibilität der Verbindung mit hochaufgelöster Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie demonstriert werden.
Im letzten in dieser Arbeit thematisierten Projekt wurden neue lichtspaltbare Verbindungen für eine Variante des SELEX-Prozesses hergestellt. Diese Verbindungen erlauben die temporäre Einführung einer Indol Modifikation an Alkin-modifizierte Oligonukleotide über die sogenannte Click-Chemie. Neue chemische Modifikationen wie die hier verwendeten Indole erhöhen die chemische Vielfalt der Oligonukleotide. Eine größere Vielfalt führt zu neuen potentiellen Wechselwirkungen gegenüber Verbindungen, gegen die mit Hilfe herkömmlicher SELEX-Verfahren keine Aptamere erzeugt werden konnten. Da die chemische Modifikation über eine photolabile Gruppe an die Oligonukleotide gebunden wird, kann sie photochemisch von der DNA gespalten werden, wodurch eine Interferenz der Modifikation mit den enzymatisch katalysierten Schritten innerhalb der SELEX ausgeschlossen werden kann.
Zur Untersuchung der Eigenschaften organischer Halbleiter sollte die Ultrareinigung organischer Materialien durch Zonenschmelzen ermöglicht werden und anschließend dieses Verfahren auf einen neuen molekularen n-Halbleiter, Perfluoranthracen, angewendet werden. Ein Großteil der vorliegenden Arbeit beschäftigte sich daher mit der Konstruktion einer Zonenschmelze. Diese sollte in der Lage sein, laborübliche Mengen organischer Materialien zu reinigen (ca. 0,5-5 g). Ein Eigenbau wurde in Angriff genommen, um eine optimale Anpassung an die zu erwartenden Aufgabenstellungen zu erreichen. Daher wurde das System in einer modularen Bauweise konzipiert, sodass einzelne oder mehrere Heizzonen verwendet werden können und die Apparatur auch später beliebig erweitert werden kann. Zunächst mussten Erfahrungen mit der Wärmezufuhr und Kühlung gesammelt werden und ein verlässlicher Zugmechanismus entwickelt werden, der die Probe in kontrollierter, langsamer Weise durch die Apparatur bewegt. Ein grosses Problem stellte das Bersten der gläsernen Probenbehältnisse beim Zonenschmelzen einiger Substanzen dar. Nach dem erfolgreichen Einsatz verschiedener Puffermaterialien wurde schliesslich ein apparativer Aufbau entwickelt, der auf eine aktive Kühlung verzichtete. Hierdurch konnte die unkontrollierte Sublimation unterbunden werden und das Bersten der Probenbehältnisse wurde unterdrückt. Gleichzeitig musste jedoch sichergestellt werden, dass die Effektivität des Zonenschmelzen auch ohne den Einsatz grosser Temperaturgradienten gegeben war. Die Reinigung verschiedener kommerziell verfügbarer Substanzen wurde getestet und gleichzeitig die Analytik der organischen Verunreinigungen mittels Gaschromatographie im Arbeitskreis etabliert. Das Zonenschmelzen ermöglichte schließlich die Reinigung von Anthracen bis auf 99,97%. In Dibenzothiophen konnten der Anteil der Nebenkomponenten unter die Nachweisgrenze verringert werden. Nach der Herstellung von Perfluoranthracen wurden unterschiedliche Methoden zur Reinigung getestet und schließlich das Zonenschmelzen angewendet. Es war möglich, kleinere Mengen an Perfluoranthracen in einer Reinheit von bis zu 99,11% zu isolieren, was durch reguläre Reinigungsverfahren wie Umkristallisation oder Sublimation nicht erreicht werden konnte. Dennoch limitierte die thermische Instabilität des Materials die Effektivität des Zonenschmelzens.
Weiterhin wurden die optische und elektrochemische Bandlücke von Perfluoranthracen untersucht, um Aussagen über die mögliche Anwendung als n-Halbleiter treffen zu können. Es wurde eine optische Bandlücke von 3,08 eV und eine elektrochemische Bandlücke von 2,82 eV ermittelt. Im Vergleich zu Anthracen wurden niedriger liegende Grenzorbitale bestimmt, was ein Einbringen von Elektronen in das energetisch niedrigste unbesetzte Molekülorbital (LUMO) und somit n-Halbleitung vereinfachen könnte. Schließlich wurde untersucht, ob sich durch die äquimolare Mischung von Anthracen und Perfluoranthracen Mischkristalle herstellen lassen, die Charge-Transfer-Eigenschaften (CT) und eine hohe elektrische Leitfähigkeit aufweisen würden. Hierzu mussten zunächst ausreichend grosse Einkristalle gezüchtet werden, von denen anschliessend die Röntgenkristallstruktur bestimmt wurde. Das einkristalline Material zeigte eine gemischt gestapelte Anordnung (siehe Abbildung 0.2), wie sie für andere Systeme, beispielsweise Benzol/Hexafluorbenzol, bekannt ist. In feldstärkenabhängigen und temperaturabhängigen Messungen wurden danach die elektrischen Eigenschaften des Materials charakterisiert. Es konnten keine Hinweise für CT-Eigenschaften gefunden werden. Dennoch besitzt der Mischkristall im Vergleich zu Anthracen eine etwa 10 12 -fach höhere Leitfähigkeit und erreicht Werte guter anorganischer Halbleiter. Das temperaturabhängige Verhalten selbst zeigt aber keine typisch halbleitenden Charakteristiken, da für die thermisch angeregte Zunahme der Ladungsträgerkonzentration im untersuchten Mischkristall kein lineares Verhalten im Arrhenius-Plot gefunden wurde. Die genauen Leitungsmechanismen bedürfen weiterer Untersuchungen. In nachfolgenden Experimenten könnte die mögliche Anwendbarkeit in elektronischen Anwendungen geklärt werden.
Die Biosynthese der Fettsäuren (FS) ist in Eukaryoten und Bakterien ein hochkonserviert zentraler Stoffwechselweg, der in zwei strukturell verschiedenen Systemen ausgeführt wird. Die meisten Bakterien, Parasiten, Pflanzen und Mitochondrien nutzen ein Fettsäuresesynthase Typ-II (FAS-II) System. Bei FAS II Systemen sind alle katalytischen Domänen separate lösliche Proteine. In Eukaryoten wie auch den Bakterien Corynebakteria, Mycobakteria, Nocardia (Klasse der CMN Bakterien) liegen die katalytischen Domänen fusioniert auf einer Polypeptidkette vor, die zu einem Multienzymkomplex der Fettsäuresynthase Typ I (FAS-I) assemblieren. Die Architektur der FAS-I zeigt große Unterschiede; die X förmige Säuger-FAS-I (Maier et al., 2006), sowie die fassartigen Enzyme der Pilz FAS-I (Jenni et al., 2007; Leibundgut et al., 2007; Lomakin et al., 2007; Johansson et al., 2008) und der bakteriellen FAS-I (Boehringer et al., 2013; Ciccarelli et al., 2013). Zwischen Pilz- und bakterieller FAS-I gibt es trotz des ähnlichen Aufbaus bedeutende Unterschiede. Mycobakterium tuberculosis, der Auslöser von Tuberkulose (TB), an der jährlich über eine Million Menschen weltweit sterben (WHO, 2014), synthetisiert durch eine Symbiose von FAS-I, FAS-II und der Polyketidsynthase-13 Mykolsäuren. Durch die Mykolsäuren ist M. tuberculosis resistent gegen äußere Einflüsse. FAS-I ist in die Synthese der Vorstufen der Mykolsäuren involviert. Sie stellt im Kampf gegen TB ein potentielles Inhibierungstarget dar.
Strukturell war die bakterielle FAS-I beim Beginn der vorliegenden Arbeit, nur durch negative-stain-Elektronenmikroskopie (EM) Aufnahmen aus dem Jahr 1982 charakterisiert (Morishima et al., 1982). In dieser Arbeit konnte die bakteriellen FAS I aus M. tuberculosis (MtFAS), sowie Corynebacterium ammoniagenes (CaFAS) und Corynebacterium efficiens (CeFAS) strukturell untersucht werden. Dies geschah mit den Methoden negative-stain-EM, Einzelmolekül-Cryo-EM (Cryo-EM), Cryo EM Tomographie (CET) und Röntgenkristallographie.
Anhand von CeFAS-Kristallen konnte erstmals durch Röntgenkristallographie die Struktur einer bakteriellen FAS-I bestimmt werden. Zudem wurde die hohe konformationelle Flexibilität der bakteriellen FAS-I mit mehreren Methoden gezeigt. Für die CaFAS konnte mit Cryo-EM initiale Prozesse der Proteinkristallbildung abgebildet werden.