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In der vorliegenden Arbeit wurde die mögliche Regulation verschiedener Ionenkanalgene bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen mit Hilfe von Northern Blots, der semiquantitativen RT-PCR- Technik und zum Teil durch elektrophysiologische Untersuchungen analysiert. Ziel war es, solche Gene zu identifizieren, deren mRNA-Spiegel hochreguliert oder herunterreguliert waren, da diese möglicherweise eine wichtige Rolle bei den kardiovaskulären Erkrankungen spielen könnten. Diese Untersuchungen sollten zu einem besseren Verständnis der renalen und kardialen Funktion dieser Ionenkanäle und der Pathogenese der untersuchten Krankheiten beitragen, aber auch helfen, neue Kandidatengene für diese Krankheiten zu identifizieren. Es wurden insgesamt fünf Tiermodelle mit Hypertonie, kardialer Hypertrophie, Herzinsuffizienz, Niereninsuffizienz und Vorhofflimmern untersucht. Ein Schwerpunkt dieser Untersuchungen waren die CLC-Chloridkanäle, deren kardiovaskuläre Funktionen noch wenig untersucht sind. Die Genprofile der Chloridkanäle CLC-2, CLC-3, CLC-4, CLC-5, CLC-6 und CLC-7 sowie CLC-K1 und CLC-K2 wurden in den Herzen und Nieren der folgenden Tiermodelle analysiert: (1) In spontan hypertensiven Ratten (SHR) und (2) in SH-stroke-prone-Ratten, die eine genetisch bedingte Hypertonie und Herzhypertrophie entwickeln. (3) In salz-sensitiven Dahl-Ratten, die Hypertonie und Herzhypertrophie erst nach einer salzhaltigen Diät, und (4) in Aortic-Banding-Ratten, die nach einem operativen Eingriff Bluthochdruck und kardiale Hypertrophie entwickeln. (5) Schließlich wurde noch ein Rattenmodell untersucht, in dem durch die Ligatur der Koronararterie ein Herzinfarkt induziert wurde, der letztlich zur Herzinsuffizienz führte. In keinem dieser Tiermodelle wurde jedoch eine auffällige Veränderung in der mRNA-Expression der acht untersuchten CLC-Chloridkanäle in den erkrankten Tieren im Vergleich zu den Kontrolltieren beobachtet. Die CLC-Chloridkanäle wurden ferner in einem Niereninsuffizienz-Modell untersucht, bei dem in Ratten durch Abklemmen der renalen Arterien und Venen ein akutes Nierenversagen und letztlich eine Niereninsuffizienz hervorgerufen wurde. In diesem Tiermodell war bereits eine Herunterregulation vieler anderer Ionenkanäle und Transporter beschrieben worden. In zwei unabhängigen Tierstudien wurde eine unterschiedlich starke Abnahme der mRNA-Expression für die einzelnen CLC-Chloridkanäle beobachtet. In einer weiteren Studie konnte die Behandlung von niereninsuffizienten Ratten mit einem bei Niereninsuffizienz wirksamen Inhibitor des NHE-3-Transports das Ausmaß der Reduktion einzelner CLC-Gene abschwächen. Weitere Studien mit höheren Dosen oder potenteren Substanzen sind notwendig, um diese vorläufigen Befunde zu bestätigen. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung der kardialen Ionenkanaldichten bei einem neuen Kaninchenmodell für Vorhofflimmern, die in Zusammenarbeit mit der Universitätsklinik Tübingen durchgeführt wurde. Das Vorhofflimmern ist eine sehr häufige Herzerkrankung bei älteren Menschen, und anhand dieses Tiermodells sollten vor allem frühe Prozesse des elektrischen Remodelings, das für das Auftreten und die Aufrechterhaltung des Vorhofflimmerns von Bedeutung ist, untersucht werden. Mit Hilfe der semiquantitativen RT-PCR-Analyse konnte in diesem Tiermodell erstmals eine Reduktion der mRNA für die Kaliumkanalgene Kv1.4, Kv4.3 und Kv1.5 sowie für die Kalziumkanalgene alpha1, CaB2a, CaB2b und CaB3 im frühem Stadium des Vorhofflimmerns nachgewiesen werden. Diese Befunde konnten die Resultate von Patch-Clamp-Messungen erklären, die gleichzeitig an der Universität Tübingen an isolierten Vorhofzellen durchgeführt wurden. In diesen Studien wurde in Übereinstimmung mit den erzielten mRNA-Daten eine Abnahme des Ito-Kaliumstromes und des ICa,L-Kalziumstromes nachgewiesen. Mit diesen Untersuchungen konnten frühere Resultate, die auch an Patienten mit chronischem Vorhofflimmern erhoben wurden, bestätigt werden. Die gefundene Regulation zeigt, dass diese Ionenkanalgene eine wichtige Rolle bei dem frühen elektrischen Remodeling spielen und dass das Rapid-Pacing- Kaninchenmodell ein geeignetes Tiermodell für das Vorhofflimmern beim Menschen ist.
Die Erhaltung des Muskeltonus, der die Grundlage für die aufrechte Körperstellung und die Feinabstimmung von Bewegungsabläufen bildet, erfordert ein Gleichgewicht der inhibitorischen und exzitatorischen Impulse, die in den neuronalen Regelkreisen des Rückenmarks verarbeitet werden. Im Rückenmark und Stammhirn von Wirbeltieren wird die synaptische Inhibition vom Strychnin-sensitiven Glyzinrezeptor (GlyR) vermittelt. Dieser liganden-gesteuerte Ionenkanal ist ein pentamerer Proteinkomplex aus drei a- und zwei ßUntereinheiten, der durch ein peripheres Membranprotein, das Gephyrin, in der neuronalen Membran verankert ist. Für die ligandenbindende a-Untereinheit konnten eine Vielzahl von Varianten isoliert werden, die für die Bildung verschiedener GlyR-Isoformen verantwortlich sind. Mutationen, die die Gene für die GlyR-Untereinheiten betreffen, sind stets mit chronischen Bewegungsstömngen assoziiert. So sind Punktmutationen im Gen für die GlyR al-Untereinheit für die Hyperekplexie (Startle Disease) verantwortlich, eine humane Erbkrankheit, die durch ausgeprägte Schreckreaktionen und episodische Muskelsteifheit charakterisiert ist. Die spontanen Mausmutanten spastic (spa), spasmodic (spd) und oscillator (ot), die vergleichbare Bewegungsstömngen manifestieren, tragen ebenfalls Mutationen in den Genen für die GlyR-Untereinheiten. Bei der Mausmutante spa führt eine Transposoninsertion, die im Gen für die GlyR ß-Untereinheit lokalisiert ist, zu einer Störung der GlyR ßExpression. Bei den Mausmutanten spd und ot wurden, wie bei Hyperekplexiepatienten, Mutationen im Gen für die a 1-Untereinheit identifiziert. Diese Mutation führt bei der spasmodischen Maus zu veränderten Rezeptoreigenschaften und bei oscillator zum völligen Verlust der al-Untereinheit. Die Analogie der murinen und humanen Erbkrankheiten ermöglicht die Verwendung der Mausmutanten bei der Entwicklung von in vivo Tiermodellen, die zur Erforschung der molekularen Grundlagen der Glyzinrezeptorfunktion und zur Untersuchung von GlyR-Defekten des Menschen geeignet sind. Für die Entwicklung solcher Tiermodelle wurde in der vorliegenden Arbeit versucht, die hereditären Bewegungsstörungen der Mausmutanten spa, spd und ot durch therapeutischen Gentransfer zu komplementieren. Hierbei sollten die in den Mausmutanten defekten Rezeptorstmkturgene durch solche fremder Spezies ersetzt werden.
Für die genetische Rettung der spastischen Mausmutante wurden transgene Mäuse entwickelt, die die ß-Untereinheit der Ratte in ihrem Nervensystem überexprirnieren. Durch Einbringen der Transgenallele in den genetischen Hintergrund der spastischen Maus konnte deren Menge an funktionellen GlyR ß-Transkripten vergrößert werden. Hierdurch konnte eine Zunahme an funktionellen GlyR-Molekülen erreicht und die Manifestierung ihres mutanten Phänotyps verhindert werden. Dies liefe11e zum einen den formalen Beweis für den Zusammenhang von identifiziertem Gendefekt und mutantem Phänotyp und zeigte, daß GlyR-Untereinheiten über Speziesbarrieren hinweg wirksam sind. Zum anderen wurde deutlich, daß das Erscheinen der adulten GlyR-Isoform (GlyRA) an der Membranoberfläche in vivo direkt von der Verfügbarkeit funktioneller ß-Untereinheiten abhängig ist. Darüber hinaus konnte zum ersten Mal gezeigt werden, daß die normale Funktion des glyzinergen Systems bereits dann gewährleistet ist, wenn nur 25% an funktionsfähigen ß-Transkripten gebildet werden bzw. wenn nur ca. die Hälfte der im Wildtyp vorhandenen GlyRA-Moleküle die neuronale Membranoberfläche erreichen.
Zur genetischen Rettung der Mausmutanten spasmodic und oscillator wurden, in analogen Versuchsansätzen, transgene Mauslinien etabliert, die die GlyR al-Untereinheit des Menschen in ihrem Nervensystem überexprimieren. Nach Einbringen der Transgenallele in den genetischen Hintergrund der ot Maus konnte deren Phänotyp partiell komplementiert werden. Eine vollständige Rettung dieser Mausmutante bzw. eine Komplementation des spasmodischen Phänotyps konnte, vermutlich aufgrund zu niedriger Transgenexpressionsrate, nicht erreicht werden. Dennoch zeigte das Ergebnis, daß die humane al-Untereinheit in der Maus Funktion übernehmen kann, eine Grundvoraussetzung für die Entwicklung von Mausmodellen, die zur Untersuchung des Pathomechanismus mutierter GlyR-Untereinheiten des Menschen geeignet sind.
Zweites Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von transgenen Mäusen, die die rekombinante GlyR-Untereinheit "Chl" in ihrem Nervensystem exprimieren, für die in vitro gezeigt wurde, daß sie eine dominant negative Wirkung auf die GlyR-Aktivität entfaltet. Durch den Einsatz dieser Untereinheit sollte die GlyR-Aktivität in vivo gezielt reduziert werden und damit der Pathomechanismus der al-Untereinheit in Hyperekplexiepatienten, die ebenfalls als dominant negative GlyR-Untereinheit wirkt, simuliert werden. Die molekularbiologischen Analysen der etablierten Chl-transgen Linien zeigten, daß die transgene Untereinheit, anders als erwartet, die Expression der ligandenbindende al-Untereinheit beeinflußt. Diese Erkenntnis steht im Gegensatz zu den Ergebnissen aus entsprechenden Experimenten mit in vitro Systemen und macht deutlich, daß in vitro Modelle die in vivo Situation nicht unbedingt repräsentieren müssen. Dies unterstreicht die Bedeutung von Tiermodellen bei der Untersuchung der molekularen Grundlagen der glyzinergen Nervenübertragung und bei der Erforschung von humanen Glyzinrezeptordefekten.
Eine Lavage mit exogenem Surfactant, Perfluorcarbonen alleine oder in Kombination mit der partiellen Flüssigkeitsbeatmung, jeweils mit HFOV, verbessert den pulmonalen Gasaustausch im Modell des MAS bei Ferkeln. In unserem Betrachtungszeitraum von vier Stunden erwies sich die Surfactant Lavage bezüglich des Gasaustausches als die beste Therapie. Eine Perfluorcarbonlavage alleine oder in Kombination mit der PLV erreicht nicht die PaO2-Werte einer Surfactantlavage. Der negative Einfluss einer Mekoniumaspiration auf die Hämodynamik der Versuchstiere der Kontrollgruppe konnte klar dargestellt werden. Innerhalb der Therapiegruppen gibt es während einer Betrachtung von vier Stunden keine wesentlichen Unterschiede in der hämodynamischen Entwicklung der Tiere. Arbeiten, die sich mit den Langzeitveränderungen der systemischen Hämodynamik bei der Therapie des MAS mit Surfactant, PFC, und PLV beschäftigen, müssen folgen. Es konnte in allen Therapiegruppen eine über den Betrachtungsverlauf stabile Hämodynamik (z.B. MABP, Puls, Cardiac Index) und ein stetiger Anstieg des PaO2 ermittelt werden. Zudem war das HZVi zum Zeitpunkt t=240 in allen Therapiegruppen signifikant höher als in der Kontrollgruppe. Die PFC-Lavage Gruppe zeigte nach vier Stunden das signifikant größte ITBVi und schützt vermutlich in Form einer Pufferfunktion in den Alveolen vor „air-trapping“, Pneumothorax und weiteren Lungenschäden beim MAS. Vor allem in Kenntnis der Pathophysiologie des MAS ist dies ein nicht zu unterschätzender Faktor. Wirkliche Langzeiterfahrungen am menschlichen Neonaten stehen leider noch nicht zur Verfügung. Es zeigten sich bei den untersuchten Therapiestrategien keine negativen Auswirkungen auf die protokollierten hämodynamischen Parameter. Früher publizierte Arbeiten, welche den Indikator GEDVi als Vorlastparameter zur Volumensteuerung empfehlen, konnten wir nicht bestätigen. Der positive Einfluss der untersuchten Therapieformen auf das pulmonale Gefäßbett konnte durch den Verlauf des PBV/EVLW Verhältnisses, welches ein Maß für die pulmonalvaskuläre Permeabilität darstellt, nachgewiesen werden.