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In dieser Arbeit wurden zwei Systeme der biologischen Energiewandlung mit verschiedenen spektroskopischen Methoden untersucht und es wurden neue Erkenntnisse über die Funktion und Aktivierung der Proteine Proteorhodopsin und RuBisCO gewonnen. Zusätzlich konnte eine neue methodische Herangehensweise zur Untersuchung von Carboxylierungsreaktionen etabliert werden. Dieser Ansatz bietet in Zukunft breite Anwendungsmöglichkeiten zur Studie dieser biologisch so bedeutenden Reaktionsklasse. Mit Hilfe der Infrarotspektroskopie und vor allem durch den Einsatz von Tieftemperaturmessungen konnte der bisher kontrovers diskutierte Photozyklus von Proteorhodopsin (PR) eingehend charakterisiert werden. Jenseits des gut verstandenen aktiven Transports bei pH 9,0 wurde vor allem der pH 5,1 Photozyklus untersucht. Erstmals konnte auch in Infrarotspektren das M-Intermediat bei pH 5,1 nachgewiesen werden. Dieses Intermediat ist von entscheidender Bedeutung für den aktiven Transport über die Zellmembran und seine Existenz wurde bisher vielfach angezweifelt. Zudem konnte Glu-108 als ein möglicher Protonenakzeptor des Photozyklus bei pH 5,1 identifiziert werden. Durch einen pH-Indikator ließ sich der Nachweis erbringen, dass auch im sauren pH-Bereich Protonen freigesetzt werden. Damit steht fest, dass ein aktiver Protonentransport bei pH 5,1 möglich ist. Zusammen mit Informationen zu protonierbaren Aminosäureseitenketten (vornehmlich Asp und Glu) lässt sich zudem mit Einschränkungen die These unterstützen, dass PR ober- und unterhalb des pKa-Werts von Asp-97 in verschiedene Richtungen Protonen pumpt. Damit ergibt sich ein differenziertes Bild für den pH-abhängigen Photozyklus von PR mit drei pH-Bereichen (pH 9,0, 8,5 bis 5,5 und 5,1) in denen PR unterschiedliche Protonentransportwege zeigt. Als weiteres biologischen System wurde RuBisCO genauer untersucht. Im Fokus der Arbeit war dabei die Aktivierung durch die Bildung eines Lysin-Carbamats im aktiven Zentrum. Obwohl RuBisCO das am häufigsten vorkommende Enzym unseres Planeten ist, in der Kohlenstofffixierung eine bedeutende Rolle spielt und obwohl mehrere Dutzend Kristallstrukturen existieren, gibt es noch immer genügend offene Fragen zur Aktivierung. Mit Hilfe eines Käfig-CO2 konnte die Carbamatbildung im Enzym direkt verfolgt und der Einfluss von Magnesiumionen auf die Aktivierung beobachtet werden. Damit ließ sich ganz klar ausschließen, dass Magnesium bereits für die Carbamatbildung erforderlich ist. Die Koordination von Mg2+ ist erst für die Endiol-Bildung im weiteren Reaktionszyklus essentiell. Zusätzlich wurde gezeigt, dass Azid eine Inhibierung des Enzyms durch die Konkurrenz mit CO2 um die Bindungsstelle auslöst, allerdings verdrängt CO2 das Azidion im Laufe der Zeit. Mit den Ergebnissen für RuBisCO konnte klar gezeigt werden, dass die Kombination aus Käfig-CO2 und Rapid-Scan IR-Spektroskopie ein völlig neues Feld für die Untersuchung von Carboxylierungsreaktionen eröffnet. Gerade die offenen Fragen zu Biotin bindenden Carboxylasen bieten ein breites Anwendungsgebiet für diese Methodik.
Chloridkanäle und -transporter sind an wichtigen physiologischen Prozessen beteiligt [Jentsch et al., 2002; Zifarelli & Pusch, 2007; Jentsch, 2008] und mutationsbedingte Funktionsdefekte können mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht werden [Planells-Cases & Jentsch, 2009]. Trotz der großen physiologischen Relevanz bilden diese Proteine eine unterrepräsentierte Klasse in der pharmakologischen Wirkstoffsuche [Verkman & Galietta, 2009], auch aufgrund fehlender adäquat robuster und Durchsatz-starker Testsysteme. Vor allem die Vertreter der intrazellulären CLC-Proteine, von denen bereits zwei eindeutig relevanten Krankheiten zugeordnet werden konnten (ClC-5 – Dent´sche Krankheit; ClC-7 – Osteopetrose), entziehen sich aufgrund ihrer vesikulären Lokalisation den klassischen elektrophysiologischen Methoden. Aus diesem Grund kam in dieser Arbeit die SSM-Technik [Schulz et al., 2008] zur Charakterisierung des lysosomalen Cl-/H+-Antiporters ClC-7 zum Einsatz. Bei geeigneter Membranpräparation können mit dieser Methode auch vesikuläre Transportprozesse elektrophysiologisch untersucht werden. Neben der grundlegenden biophysikalischen Untersuchung von ClC-7 war es mit Hilfe der SSM-Technik möglich, die Protonen-gekoppelte Antiportaktivität dieses vesikulären CLC-Vertreters nachzuweisen. Außerdem wurde ein robuster Assay etabliert, der auch die pharmakologische Untersuchung von ClC-7 erlaubt. Mit diesem konnte gezeigt werden, dass ClC-7 spezifisch durch die Chloridkanalblocker DIDS und NPPB mit relativ hoher Affinität (DIDS: IC50= 39 µM, NPPB: IC50= 156 µM) zu inhibieren ist. Da ClC-7 auch als potentielles Target in der Osteoporose-Therapie diskutiert wird [Schaller et al., 2005], bietet die SSM-Technik somit eine Plattform für pharmakologische Untersuchungen an diesem Transporter. Neben dem Wildtyp Protein wurde weiterhin die Funktionalität einer physiologisch wichtigen, der Osteopetrose zuzuordnenden Mutante (G215R), untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Mutante noch immer eine signifikante Transportaktivität besitzt, jedoch einen schweren Lokalisationsdefekt aufweist und nicht mehr korrekt in die Lysosomen transportiert wird. Durch Koexpression der funktionalen beta-Untereinheit Ostm1 [Lange et al., 2006] war es möglich, die lysosomale Lokalisation teilweise, jedoch nicht vollständig wiederherzustellen. Dieser Effekt könnte somit ein Grund für den relativ milden Krankheitsverlauf der mit dieser Mutation verbundenen autosomal dominanten Osteopetrose (ADOII, Alberts-Schönberg Krankheit) sein. Da die SSM-Technik bisher ausschließlich zur Untersuchung primär und sekundär aktiver Transporter zum Einsatz kam [Schulz et al., 2008; Ganea & Fendler, 2009], wurde weiterhin die Eignung der Methode zur Charakterisierung passiver Ionenkanäle anhand des ligandengesteuerten P2X2 Rezeptors überprüft. Ein Vergleich der gewonnenen elektrophysiologischen und pharmakologischen Daten lieferte gute Übereinstimmungen mit den Ergebnissen konventioneller elektrophysiologischer Untersuchungen. So konnte gezeigt werden, dass sich die SSM-Technik auch zur Charakterisierung von Ionenkanälen eignet. Da Ströme über Ionenkanäle bei den klassischen Methoden über eine extern angelegte Spannung gesteuert werden, solch eine Kontrolle bei der SSM-Technik jedoch nicht möglich ist, wurde schließlich in dieser Arbeit versucht, mit Hilfe der lichtgesteuerten Protonenpumpe Bakteriorhodopsin (bR) eine Spannungskontrolle zu etablieren. Anhand eines Fusions-basierten Modellsystems [Perozo & Hubbell, 1993] konnte gezeigt werden, dass lichtgesteuerte Ionenpumpen prinzipiell zur Kontrolle von Ionenkanälen an der SSM genutzt werden können. Allerdings eignet sich bR aufgrund seiner geringen Plasmamembranexpression in CHO Zellen nicht zur direkten Koexpression und Steuerung von Vertebraten-Proteinen. Der Einsatz eukaryotischer Ionenpumpen, kombiniert mit Anionendiffusionspotentialen [Perozo & Hubbell, 1993], könnte sich allerdings als erfolgsversprechend erweisen und die SSM-Technik auch für die Charakterisierung von stark spannungsabhängigen Ionenkanälen öffnen.