Refine
Document Type
- Doctoral Thesis (3)
Has Fulltext
- yes (3)
Is part of the Bibliography
- no (3)
Keywords
- vasculogenesis (3) (remove)
Institute
Die Bildung von Blutgefäßen ist essentiell für die Entwicklung und Homöostase von Wirbeltieren und die Endothelzellspezifikation ist ein wichtiger erster Schritt in diesem Prozess. Das früheste bekannte Ereignis bei der Endothelzellspezifikation im Zebrafisch ist die Expression des bHLH-PAS-Transkriptionsfaktor-Gens npas4l. Ich habe eine transgene V5-Linie zum Nachweis des markierten Npas4l auf Proteinebene und eine Gal4-VP16-Reporterlinie zur Visualisierung und Verfolgung von npas4l exprimierenden Zellen in vivo generiert. Beide Linien können bereits in frühen Entwicklungsstadien nachgewiesen werden und komplementieren auch starke npas4l-Mutanten Allele. Um npas4l Reporter exprimierende Zellen in npas4l Mutanten zu verfolgen, habe ich anschließend eine mutierte Variante der Gal4-Reporterlinie erzeugt. Diese Mutante trägt eine Insertion in der Region, die die DNA-Bindedomäne kodiert. Dadurch stört sie die Npas4l-Funktion, aber nicht die Reporterexpression. Dieses mutierte Reporterallel komplementiert nicht die npas4l-Mutanten und zeigt einen starken Phänotyp, was darauf hindeutet, dass es sich um ein funktionelles Nullallel handelt. Phänotypische Analysen zeigten, dass npas4l-Reporter positive Zellen in npas4l-Mutanten nicht spezifizieren oder zur Mittelachse wandern. Stattdessen tragen sie zu den vom intermediären Mesoderm abgeleiteten pronephrischen Tubuli und dem vom paraxialen Mesoderm abgeleiteten Skelettmuskel bei. Ich habe diese Phänotypen durch Einzelzell-RNAseq an den npas4l-Reporter positiven Zellen in npas4l+/- und npas4l-/- Embryonen bestätigt. Zusammen erklären diese beiden alternativen Zellschicksale den Großteil der beobachteten Veränderungen zwischen den Genotypen. Npas4l ist dafür bekannt die Expression der drei Transkriptionsfaktorgene etsrp, tal1 und lmo2 zu fördern. Ich stellte die Hypothese auf, dass das Fehlen jedes dieser Transkriptionsfaktoren in npas4l-Mutanten verschiedene Aspekte des npas4l-Phänotyps verursacht. Daher habe ich Mutantenlinien für alle drei Gene generiert und sie sowohl in vaskulären Reporterlinien als auch im npas4l-Reporterhintergrund analysiert. Die Daten legen nahe, dass verschiedene Gene unterschiedliche Prozesse während der frühen Endothelentwicklung regulieren. In npas4l-/- und etsrp-/- Embryonen differenzieren npas4l-Reporter exprimierende Zellen nicht zu Endothelzellen und tragen stattdessen zur Skelettmuskelzellpopulation bei. In npas4l-/- und tal1-/- Embryonen können npas4l-Reporter exprimierende Zellen nicht migrieren und tragen stattdessen zu der Bildung der pronephrischen Tubuli bei. Um die Beziehung zwischen diesen Faktoren besser zu verstehen, habe ich getestet, ob die Injektion von etsrp-, tal1- oder lmo2-mRNA verschiedene Aspekte des npas4l-Phänotyps retten würde. npas4l-, etsrp- und tal1-Mutanten zeigen alle schwere vaskuläre Phänotypen. Einige Endothelzellen und vaskuläre Strukturen bleiben jedoch in jeder Mutante erhalten. Der Phänotyp ist am stärksten in npas4l-/- Embryonen, aber selbst in diesen Embryonen können einige fli1a-positive Endothelzellen in der Schwanzregion beobachtet werden. Es war unklar, ob sich diese Population von Endothelzellen unabhängig von der Npas4l-, Tal1- und Etsrp-Funktion entwickelt oder als Folge einer restlichen tal1- oder etsrp-Expression unabhängig von Npas4l. Um diese Frage zu untersuchen, habe ich Doppelmutanten generiert und nach dem Vorhandensein von fli1a-positiven Endothelzellen in diesen Mutanten gesucht. Während fli1a-positive Endothelzellen in npas4l-/- und npas4l-/-;tal1-/- Embryonen deutlich vorhanden sind, können keine solchen Zellen in npas4l-/-;etsrp-/- oder etsrp-/-;tal1-/- Embryonen beobachtet werden. Diese Daten deuten darauf hin, dass sich im Zebrafisch keine Endothelzellen entwickeln können, wenn zugleich npas4l und etsrp oder etsrp und tal1 gestört sind. Während der Verlust von etsrp zu stärkeren Defekten in npas4l-Mutanten führt, gibt es keinen zusätzlichen Phänotyp, der durch den Verlust von tal1verursacht wird, was darauf hindeutet, dass die Expression von etsrp, aber nicht die von tal1, unabhängig von Npas4l auftreten kann. Diese Idee wird durch die Beobachtung unterstützt, dass etsrp, aber nicht tal1-Expression in den meisten fli1a-exprimierenden Zellen in npas4l-/- Embryonen beobachtet wird. Dennoch wird der Großteil -Expression durch Npas4l reguliert. tal1-mRNA-Injektionen reichten aus, um eine Wildtyp-ähnliche vaskuläre Musterbildung im Bauchbereich der npas4l-/- Embryonen wiederherzustellen, einschließlich der Rettung sowohl der Zellmigration als auch der Differenzierung. Da Npas4l mehrere unterschiedliche transkriptionelle Effektoren hat, war eine so starke Rettung durch nur einen dieser Effektoren unerwartet. In den geretteten Mutanten wurde die bilaterale Population von npas4l-Reporter-positiven pronephrischen Tubuluszellen nicht entdeckt, aber die Anzahl der ektopischen npas4l-Reporter exprimierenden Muskelzellen war im Vergleich zu nicht injizierten npas4l-Mutanten gleichbleibend.
...
Vasculogenesis as well as angiogenesis are important for postnatal development of blood vessels. Peripheral blood or bone marrow-derived endothelial precursor cells are used in clinical trials for therapeutic enhancement of postnatal neovascularization in patients suffering from coronary artery diseases. The vasculogenic potential of the precursor cell population depends on the appropriate retention of the infused cells to the ischemic tissue. However, cell-autonomous mechanisms regulating the attraction and retention of circulating cells in inflammatory tissue are not well understood. Caspases belong to a family of pro-apoptotic enzymes. Beyond cell death signals, caspase proteases additionally regulate non-apoptotic processes like cell morphology and migration in many cell types. The isoform Caspase-8 is essential for embryonal vasculogenesis in conditional knockout mice. In this study, we identified a novel apoptosis-unrelated role of Caspase-8 in circulating and bone marrow-derived cells for vascular repair. Caspase-8-specific inhibition abrogated the ex vivo formation of EPC from human peripheral blood. Moreover, Caspase-8 inhibition disables EPC migration and adhesion to different matrices and decreases the cell surface expression of the fibronectin receptor subunit integrin alpha 5 and the chemokine receptor CXCR4. In vitro and in vivo studies using bone marrow mononuclear cells derived from inducible Caspase-8- deficient mice revealed an essential role of Caspase-8 for EPC formation and neovascularization enhancing capacities of progenitor cells. Caspase-8 activity appears to be required for maintaining responses to matrix interaction and chemoattractants of EPC. Additional studies showed that the E3 ubiquitin ligase Cbl-b, a negative regulator of cell adhesion molecules including integrin alpha 5, is present in EPC at low protein levels under basal conditions, but markedly increases upon Caspase-8 inhibition. In vitro assays and overexpression studies in intact cells confirmed Caspase-8-dependent degradation of Cbl-b, providing a potential requirement for Caspase-8-regulated adhesion. Indeed, neovascularization of matrigel plugs was enhanced in mice lacking Cbl-b. Moreover, Cbl-b degradation in the presence of active Caspase-8 prevents the down-regulation of integrin alpha 5 and is associated with an enhanced vasculogenic activity of progenitor cells in hind limb ischemia. The identified upstream regulation of caspase-8 by cytokine IL-6 is only one possibility for fine-tuning the non-apoptotic enzymatic activity. In summary, this study shows a novel essential role of Caspase-8 for proper EPC adhesion-related signaling. Caspase-8 is involved in the function of adhesion molecules by regulation the E3 ubiquitin ligase Cbl-b. Strategies to improve survival of therapeutic injected progenitor cells by using caspase inhibitors should be addressed with caution. Because of the broad spectrum of activity of caspase-8, downstream targets of this caspase isoform and Cbl-b should be in more focus for therapeutic pretreatment to improve neovascularization of myocardial and ischemic tissue.
Die postnatale Neovaskularisierung ist eine wichtige Vorraussetzung um Gewebe vor kritischer Ischämie zu schützen. Eine der Grundlagen dieses Prozesses bilden die Angiogenese, bei der neue Kapillaren durch Proliferation und Migration von Endothelzellen aus bereits vorhandenen Blutgefäßen entstehen. Ein zweiter Eckpfeiler ist die Vaskulogenese, die unter anderem durch zirkulierende endotheliale Vorläuferzellen (EPC) vermittelt wird. Homeobox-Gene der Klasse 1 (Hox) sind Transkriptionsfaktoren, die während der Embryonalentwicklung an der Organogenese und der Entwicklung des kardiovaskulären Systems beteiligt sind. Verschiedene Studien weisen darauf hin, dass Homeobox-Proteine auch im adulten Organismus bei der transkriptionellen Regulation von Genen der Angio- und Vaskulogenese eine wichtige Rolle spielen. Die in dieser Arbeit vorliegenden Ergebnisse zeigen eine essentielle Rolle von HoxA9 für die postnatale Neovaskularisierung sowie für die funktionelle Integrität von Endothelzellen und endothelialen Progenitorzellen. HoxA9-defiziente Mäuse hatten einen signifikant verringerten Blutfluss nach einer Hinterlauflauf-Ischämie. Für die reduzierte Neovaskularisierung des ischämischen Gewebes, genügte der Verlust eines einzigen HoxA9-Wildtypallels. Außerdem zeigen HoxA9-defiziente Endothelzellen in vitro eine stark gehemmte Migration sowie eine verringerte Gefäßstrukturbildung. Zusätzlich war auch deren Interaktion mit EPC im Matrigel verschlechtert. Eine Bestätigung dieser Beobachtung zeigten Untersuchungen an endothelialen Vorläuferzellen, die ebenfalls einen Verlust angiogener Funktionen bei verminderter HoxA9-Expression aufwiesen. Neben der postnatalen Neovaskularisierung konnten erste Untersuchungen embryonaler Allantois zeigen, das HoxA9 vermutlich auch in der embryonalen Gefäßbildung beteiligt ist. Diese Theorie wird durch eine nicht-Mendelsche Verteilung der postnatalen Genotypen nach Kreuzung heterozygoter HoxA9-Mäuse unterstützt. Als molekulare Ursachen der Hemmung angiogener Funktionen bei Endothelzellen, konnte die Regulation verschiedener Gene nachgewiesen werden. So ist HoxA9 für die Expression der endothelialen Stickstoffmonoxidsynthase (eNOS), des VEGF-Rezeptors 2 (VEGF-R2), der Adhäsionsmoleküle VE-Cadherin und Integrin v3 sowie des EphB4-Rezeptors von essentieller Bedeutung. Diese von HoxA9 regulierten Gene spielen für die Angio- und Vaskulogenese alle eine entscheidende Rolle. Der EphB4-Rezeptor, die eNOS und der VEGF-R2 werden durch eine direkte Bindung von HoxA9 an den jeweiligen Promotor auf transkriptioneller Ebene reguliert. Bei den Genen Integrin v3 und VE-Cadherin erfolgt die Regulation durch HoxA9 indirekt über andere Gene oder posttranskriptionell. Zusätzlich zum Nachweis der Kontrolle der Genexpression, konnte für den EphB4-Rezeptor nachgewiesen werden, dass dieser von großer Bedeutung für die HoxA9-regulierte Migration ist. Außerdem besitzt der EphB4-Promotor eine für die Regulation der EphB4-Expression durch HoxA9 wichtige Bindungsstelle. In weiteren Versuchen konnte gezeigt werden, dass HoxA9 Schubspannungs-abhängig reguliert wird und dabei auch in die Regulation der Schubspannungs-induzierten Migration und die Schubspannungs-abhängige Expression der untersuchten Zielgene von HoxA9 eingreift. Zusammenfassend zeigen die hier vorgestellten Daten, dass HoxA9 endotheliale Gene vielfältig reguliert, eine entscheidende Rolle bei der Modulation verschiedener endothelialer Funktionen spielt und essentiell für die postnatale Neovaskularisierung ist.