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Im Rahmen dieser Arbeit wurde die humane Leukotrien A4-Hydrolase untersucht.
Die hLTA4H ist ein bifunktionelles Enzym, welches neben der Hydrolaseaktivität, welche für die Umwandlung des instabilen LTA4 zu LTB4 verantwortlich ist, auch eine Peptidaseaktivität aufweist. Beide Enzymaktivitäten spielen bei Entzündungsprozessen eine wichtige Rolle, weshalb die LTA4H ein interessantes pharmakologisches Target darstellt. Aufgrund der gegensätzlichen Eigenschaften der beiden Aktivitäten der LTA4H (Produktion des proinflammatorischen LTB4 durch die Hydrolase-Aktivität, sowie der Abbau des PGP-Tripeptids durch die Peptidase-Aktivität) wird deutlich, dass die Entwicklung selektiver Hydrolase-Inhibitoren von Vorteil ist.
Das Protein der humanen LTA4H konnte erfolgreich kloniert werden und in E. coli-Zellen exprimiert werden. Zur Gewinnung des reinen rekombinanten Proteins konnte ein Aufreinigungsprotokoll mittels Nickel-Affinitätschromatographie sowie anschließender Größenausschlusschromatographie etabliert werden. Durch die Testung unterschiedlicher Lysemethoden konnte die Ausbeute deutlich erhöht werden.
Um herauszufinden, ob es durch den potentiellen Inhibitor zu einer Hemmung der Enzymaktivität kommt, muss diese detektiert werden können. Hierfür wurde ein geeignetes fluoreszenzbasiertes Testsystem zur Detektion der Enzymaktivität der hLTA4H entwickelt. Dies lässt auch die Quantifizierung der Wirksamkeit der möglichen Inhibitoren zu. Mit Hilfe eines pharmakophorbasierten Ansatzes wurden 22 Testsubstanzen für die in vitro Testung ausgewählt. Nach der Evaluierung dieser Substanzen wurden weitere 14 Derivate der besten Verbindung ausgewählt und ihre inhibitorischen Eigenschaften an rekombinanter LTA4H getestet. Die Ergebnisse wurden mittels Differential Scanning Fluorimetrie validiert, wofür ein einfaches Protokoll etabliert werden konnte.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden weiterhin 5 bereits bekannte Inhibitoren der LTA4H ausgewählt, um sie hinsichtlich ihres thermodynamischen Profils zu untersuchen. Hierzu wurden die ausgewählten Inhibitoren mittels Isothermer Titrationskalorimetrie vermessen. Die Dissoziationskonstanten der untersuchten Inhibitoren wurden ebenfalls mittels Differential Scanning Fluorimetrie bestimmt, wobei sich zeigte, dass diese Methode nicht zur präzisen Messung von Protein/Ligand Interaktionen herangezogen werden kann. Mittels eines in silico Ansatzes zur Vorhersage von stabilisierten und destabilisierten Wassermolekülen in der Bindetasche konnten die thermodynamischen Daten im strukturellen Kontext interpretiert werden. Durch diese Kombination konnten neue Erkenntnisse zum Design neuer Inhibitoren der LTA4H gewonnen werden.
The mitochondrial cascade hypothesis of dementia assumes mitochondrial dysfunction leading to reduced energy supply, impaired neuroplasticity, and finally cell death as one major pathomechanism underlying the continuum from brain aging over mild cognitive impairment to initial and advanced late onset Alzheimer's disease. Accordingly, improving mitochondrial function has become an important strategy to treat the early stages of this continuum. The metabolic enhancer piracetam has been proposed as possible prototype for those compounds by increasing impaired mitochondrial function and related aspects like mechanisms of neuroplasticity. We here report that piracetam at therapeutically relevant concentrations improves neuritogenesis in the human cell line SH-SY5Y over conditions mirroring the whole spectrum of age-associated cognitive decline. These effects go parallel with improvement of impaired mitochondrial dynamics shifting back fission and fusion balance to the energetically more favorable fusion site. Impaired fission and fusion balance can also be induced by a reduction of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP) function as atractyloside which indicates the mPTP has similar effects on mitochondrial dynamics. These changes are also reduced by piracetam. These findings suggest the mPTP as an important target for the beneficial effects of piracetam on mitochondrial function.
Leukotrienes (LTs) are inflammatory mediators that play a pivotal role in many diseases like asthma bronchiale, atherosclerosis and in various types of cancer. The key enzyme for generation of LTs is the 5-lipoxygenase (5-LO). Here, we present a novel putative protein isoform of human 5-LO that lacks exon 4, termed 5-LOΔ4, identified in cells of lymphoid origin, namely the Burkitt lymphoma cell lines Raji and BL41 as well as primary B and T cells. Deletion of exon 4 does not shift the reading frame and therefore the mRNA is not subjected to non-mediated mRNA decay (NMD). By eliminating exon 4, the amino acids Trp144 until Ala184 are omitted in the corresponding protein. Transfection of HEK293T cells with a 5-LOΔ4 expression plasmid led to expression of the corresponding protein which suggests that the 5-LOΔ4 isoform is a stable protein in eukaryotic cells. We were also able to obtain soluble protein after expression in E. coli and purification. The isoform itself lacks canonical enzymatic activity as it misses the non-heme iron but it still retains ATP-binding affinity. Differential scanning fluorimetric analysis shows two transitions, corresponding to the two domains of 5-LO. Whilst the catalytic domain of 5-LO WT is destabilized by calcium, addition of calcium has no influence on the catalytic domain of 5-LOΔ4. Furthermore, we investigated the influence of 5-LOΔ4 on the activity of 5-LO WT and proved that it stimulates 5-LO product formation at low protein concentrations. Therefore regulation of 5-LO by its isoform 5-LOΔ4 might represent a novel mechanism of controlling the biosynthesis of lipid mediators.
Die eukaryotische RNA-Polymerase II (RNAPII) ist der zentrale Faktor für die Umsetzung des genetischen Codes in funktionelle Proteine. Durch die Transkription wird die statische Information der DNA in ein transient nutzbares RNA-Molekül umgewandelt. Bei diesem fundamentalen Prozess der Genexpression wird ein spezifischer DNA-Abschnitt des Genoms abgelesen und in die komplementäre RNA transkribiert, die entweder direkt regulatorische bzw. funktionelle Aufgaben in der Zelle übernimmt oder als Matrize für die Proteinbiosynthese dient. Zur Erhaltung der Funktionalität eines Organismus und zur schnellen und gezielten Reaktion auf exogene Reize ist eine strikte Regulation der Transkription und der zahlreichen beteiligten Faktoren notwendig. Aufgrund der zentralen Rolle in der Genexpression ist diese Regulation äußerst vielschichtig und erfordert eine feinabgestimmte Maschinerie an Enzymen und Transkriptionsfaktoren, deren genaue Wirkungsweise und Abhängigkeit noch nicht vollständig verstanden sind. Fehler in der Transkriptionsregulation werden mit einer Reihe von schwerwiegenden metabolischen Störungen und der möglichen malignen Transformation der betroffenen Zelle in Verbindung gebracht.
Während einige Regulationsmechanismen der RNAPII bereits seit längerer Zeit beschrieben sind, ist eine besondere Form der RNAPII-abhängigen Regulation erst in den letzten Jahren Gegenstand genauerer Untersuchungen geworden. So erfährt die RNAPII bei einer Vielzahl von Genen unmittelbar nach der Transkriptionsinitiation einen Arrest, der das Enzym nicht weiter über die DNA prozessieren lässt und somit die produktive Elongation des Gens blockiert. Die Aufhebung dieses promotornahen Arrests wird durch den positiven Transkriptions-Elongationsfaktor b (P-TEFb) dominiert, der durch distinkte post-translationale Modifikationen der C-terminalen Domäne der RNAPII und assoziierter Faktoren den Übergang in die produktive Transkriptionselongation ermöglicht. P-TEFb selbst unterliegt dabei einer strengen Regulation durch die Inkorporation in inhibierende Speicherkomplexe (7SK snRNPs), bestehend aus der 7SK snRNA und mehrerer assoziierter Proteine. Abseits des 7SK snRNP wurde P-TEFb als Bestandteil großer Multiproteinkomplexe identifiziert, die einen positiven Einfluss auf die Transkriptionselongation besitzen. Die Transition von P-TEFb aus dem 7SK snRNP in diese sogenannten Superelongationskomplexe (SECs) stellt einen der zentralen Regulationsmechanismen der eukaryotischen Transkription dar, ist jedoch noch nicht ausreichend verstanden.
Ein zentrales Element aller SECs bilden die Mitglieder der AF4/FMR2-Proteinfamilie, darunter das AF4 Protein, dem neben der Erhaltung der strukturellen Integrität mittlerweile auch eine Funktion in der Rekrutierung von P-TEFb zugeschrieben wird. Dabei scheint AF4 jedoch auf die Hilfe bislang noch nicht charakterisierter Faktoren angewiesen zu sein. AF4 ist über diese Rolle hinaus als Bestandteil des Fusionsproteins AF4-MLL eng mit der onkogenen Zelltransformation im Falle einer durch die Translokation t(4;11)(q21;q23) bedingten, akuten lymphoblastischen Leukämie assoziiert.
Das zentrale Thema dieser Arbeit stellen Untersuchungen zum Transfer von P-TEFb aus dem 7SK snRNP zum AF4-Protein dar. Dabei konnte zunächst die DEAD-Box RNA-Helikase DDX6 als Integraler Bestandteil der AF4-SECs identifiziert werden, der bereits eine Funktion in der Kontrolle des microRNA- wie auch des mRNA-Metabolismus zugeschrieben werden konnte. Aus diesem Grund wurde von uns eine mögliche Beteiligung von DDX6 an der Rekrutierung von P-TEFb zum AF4-SEC durch Modulationen der 7SK snRNA postuliert. Des Weiteren konnte eine Bindefähigkeit von DDX6 gegenüber der 7SK snRNA sowie eine direkte Korrelation zwischen des zellulären DDX6-Proteinlevel und der Akkumulation von P-TEFb im AF4-SEC nachgewiesen werden. Sowohl die Überexpression von DDX6 als auch die von AF4 resultierten in einer gesteigerten mRNA-Produktion, wobei die Ergebnisse auf einen kooperativen Mechanismus zwischen den beiden Proteinen in der Aktivierung der Transkription hindeuteten. Außerdem konnte die These einer DDX6-vermittelten Aktivierung von P-TEFb anhand von Expressionsanalysen des bekannten P-TEFb Zielgens HEXIM1, dessen Expression im Zusammenhang eines negativen Rückkopplungsmechanismus gesteigert wird, bestätigt werden. Damit konnte der DEAD-Box RNA-Helikase DDX6 in dieser Arbeit das erste Mal eine entscheidende Funktion in der Rekrutierung von P-TEFb aus dem 7SK snRNP in den AF4-SEC, und somit an der Kontrolle der eukaryotischen Transkription, zugeschrieben werden.
Цель: Оценить влияние локализации точки разрыва в геномной ДНК гена MLL на прогноз острых лейкозов (ОЛ) у детей первого года жизни.
Методы: В исследование было включено 68 детей первого года жизни (29 мальчиков и 39 девочек с медианой возраста 4,8 мес.) с MLL-позитивными острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) (n = 46), острым миелоидным лейкозом (ОМЛ) (n = 20) и ОЛ смешанной линейности (n = 2).
Результаты: 5-летняя бессобытийная выживаемость (БСВ) детей первого года жизни с ОЛЛ, включенных в исследование MLL-Baby, с точкой разрыва в интроне 11 ДНК гена MLL (n = 29) была статистически значимо ниже, чем у пациентов c локализацией точек разрыва, начиная с интрона 7 по экзон 11 (n = 17; 0,16 ± 0,07 и 0,38 ± 0,14; p = 0,039), а кумулятивная вероятность развития рецидива была значительно выше в группе с точкой разрыва в интроне 11 (0,74 ± 0,09 и 0,52 ± 0,17; p = 0,045). В то же время многофакторный анализ показал, что единственным значимым фактором, связанным с неблагоприятным прогнозом, остается сохранение минимальной остаточной болезни (МОБ) в точке наблюдения 4 протокола MLL-Baby (отношение опасности 5,994; 95%-й доверительный интервал 2,209–16,263; p < 0,001). У 22 пациентов с ОМЛ связи между прогнозом и локализацией точки разрыва в ДНК гена MLL не выявлено.
Заключение: Наличие точки разрыва в интроне 11 гена MLL у детей первого года жизни с ОЛЛ, получавших лечение по протоколу MLL-Baby, вело к статистически значимо более низким показателям БСВ и более высокой кумулятивной вероятности развития рецидива. Однако в многофакторной модели риска это нивелировалось сохранением МОБ в точке наблюдения 4. У детей первого года жизни с ОМЛ взаимосвязи между локализацией точки разрыва в ДНК гена MLL и прогнозом не выявлено.
MLL-r Leukemia
(2016)