Refine
Document Type
- Doctoral Thesis (4)
Language
- German (4)
Has Fulltext
- yes (4) (remove)
Is part of the Bibliography
- no (4) (remove)
Keywords
- Struktur-Aktivitäts-Beziehung (4) (remove)
Institute
- Pharmazie (2)
- Biochemie und Chemie (1)
- Biowissenschaften (1)
Der G-Protein-gekoppelte Histamin-H3-Rezeptor (H3R) ist einer von vier bekannten Histamin-Rezeptorsubtypen. Die Verbreitung erstreckt sich hauptsächlich auf das ZNS, wo der Rezeptor maßgeblich an der Regulation des Schlaf-Wach-Rhythmus, der Kognition, der Aufmerksamkeit und dem Ernährungsverhalten beteiligt ist. Als Autorezeptor reguliert er die Darstellung und Freisetzung von Histamin im Gehirn und moduliert darüberhinaus als Heterorezeptor auch die Konzentration anderer wichtiger Neurotransmitter. Ein Ansatz für die Entwicklung neuer Arzneistoffe bei multifaktoriellen Erkrankungen entspringt der Hybridtheorie. In dieser Arbeit wurde der Hybridansatz durch verschiedene Varianten realisiert, bei denen die jeweiligen Pharmakophore durch Überlappung oder Aneinanderkopplung verknüpft wurden. Als Grundstruktur für das H3-Pharmakophor diente das 4-(3-Piperidin-1-ylpropoxy)-phenyl-Element, als andersartige Pharmakophore dienten neben Arzneistoffen aus der Gruppe der Neuroleptika, Antidepressiva und SSRI auch solche Pharmakophore, die das Wirkprofil von H3R-Liganden durch spezifische Eigenschaften (z. B. neuroprotektiv) ergänzen können. Bei der Kopplung der Pharmakophore lag der Fokus auf der Untersuchung von Aminvariationen. Mit Hilfe des Hybridansatzes wurden in dieser Arbeit zahlreiche neue und potente Histamin-H3-Hybridliganden entwickelt. Es wurden hohe Bindungsaffinitäten im nano- bis subnanomolare Bereich erzielt und wichtige Struktur-Wirkungsbeziehungen abgeleitet. In-vitro zeigte sich eine hohe Toleranz des H3R bezüglich der heterogenen Liganden, darunter solche mit sterisch anspruchsvollen, stark basischen und sauren Gruppen.
Synthese und in vitro-pharmakologische Charakterisierung von dualen PPARalpha/gamma-Agonisten
(2005)
Die Behandlung von Hypertriglyceridämien und Insulinresistenz erfolgt heute vor allem durch den Einsatz der Fibrate und Thiazolidindione (TZDs). Eine neue Wirkstoffklasse stellen die vor der Zulassung stehenden Glitazare dar, die als duale PPARalpha/gamma-Agonisten die lipidsenkenden Eigenschaften der Fibrate und die insulinsensitivierenden Eigenschaften der TZDs in einer Molekülklasse vereinen. Peroxisomen Proliferator-aktivierte Rezeptoren (PPARs) gehören zur Klasse der nukleären Rezeptoren, von denen drei Subtypen (PPARalpha, beta und gamma) bekannt sind. PPARalpha fungiert als molekulares Target für die Klasse der Fibrate, welche als Lipidsenker eingesetzt werden, wohingegen die Thiazolidindione (TZDs) bei Typ 2 Diabetes indiziert sind und ihre Wirkung als selektive PPARgamma-Aktivatoren (Insulinsensitizer) entfalten. Duale PPARalpha/gamma-Agonisten wie Muraglitazar und Tesaglitazar stellen eine neue Klasse von Arzneistoffen dar, deren Zulassung beantragt ist und die zukünftig zur Behandlung von Typ 2 Diabetikern mit gestörtem Lipidprofil eingesetzt werden. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde eine Leitstrukturoptimierung am selektiven PPARalpha-Agonist Pirinixinsäure (WY 14643) mit Hilfe subtypspezifischer Reportergenassays durchgeführt. Dabei wurde wurde zunächst eine geeignete Synthesestrategie zur Darstellung von Pirinixinsäurederivaten etabliert, was zur Charakterisierung und Identifizierung einer Serie von potenten dualen PPARalpha/gamma-Agonisten führte. Die Synthesestrategie zur Darstellung von sowohl im Arylamino-Bereich (W) als auch in alpha-Position (R) modifizierten Derivaten der Pirinixinsäure bestand im Allgemeinen in einer vierstufigen Reaktionsfolge. Die PPAR-Modulatoren 18-25, 30, 53-59, 62, 65, 69, 71, 73 und 74-77 wurden in vitro-pharmakologisch unter Anwendung Subtyp-selektiver Reportergen-Assays (mPPARalpha, hPPARalpha, beta, gamma) charakterisiert. Durch Strukturmodifikationen im Arylamino-Bereich (Substanzen 18-25) der Leitstruktur WY 14643 (EC50 (hPPARalpha) = 39.8 mikroM, EC50 (hPPARgamma) = 53.7 mikroM) konnte im Falle der 4-Halogenaryl-substituierten Liganden 18 (Br) und 20 (Cl) eine signifikante Steigerung der hPPARalpha-Aktivität um den Faktor 4 (18) bzw. den Faktor 3 (20) erzielt werden. Die Inaktivität der Precursorverbindungen 74-77 demonstriert den für PPAR-Aktivität essentiellen terminalen hydrophoben Molekülrest, welcher dem 2,3-Dimethylphenyl-Rest von WY 14643 entspricht. Die alpha-alkylsubstituierten Derivate 53-57 zeigten sowohl am hPPARalpha als auch am hPPARgamma eine mit der aliphatischen Kettenlänge steigende Potenz. Die EC50-Werte (hPPARalpha) der Carbonsäuren 53-57 und 62 liegen zwischen 1.2 und 8.8 mikroM, wobei sich das alpha-Hexyl-Derivat 57 und das alpha-Butyl-Derivat 56 mit EC50-Werten von 1.2 mikroM (57) bzw. 1.3 mikroM (56) entsprechend einer Steigerung der Aktivität gegenüber WY 14643 um Faktor 33 (57) bzw. Faktor 30 (56) als besonders potent erwies. Am hPPARgamma präsentieren ebenso das alpha-butylsubstituierte Derivat 56 und der alpha-hexylsubstituierte Ligand 57 mit EC50-Werten von 3 mikroM (56) bzw. 3.6 mikroM (57) und einer Steigerung der Bindungsaktivität gegenüber WY 14643 von ~Faktor 18 (56) bzw. ~Faktor 15 (57) die Verbindungen mit der höchsten PPARgamma-Aktivität. Im Rahmen dieser Dissertation gelang somit die Auffindung neuartiger Leitstrukturen 56 und 57. Die alpha-butyl- und alpha-hexylsubstituierten Liganden 56 und 57 besitzen dualen hPPARalpha/gamma-Charakter. Die PPARalpha/gamma-agonistischen Eigenschaften der neuentwickelten alpha-alkylsubstituierten Pirinixinsäurederivate werden durch ein von Pirard et al etabliertes Pharmakophor- und Selektivitätsmodell, welches die Ligandenbindungsdomäne (LBD) der PPARs durch fünf Bindungstaschen beschreibt, unterstützt. Die Einführung von alpha-Alkylsubstituenten in das Grundgerüst der Pirinixinsäure führt offensichtlich zum Besetzen der linken proximalen Bindungstasche und somit zu einer im Vergleich zur Leitstruktur WY 14643 stärkeren Bindung an die Ligandenbindungsdomäne des Rezeptors.
Gephyrin ist ein Protein mit strukturellen und enzymatischen Eigenschaften. Ein Aspekt der strukturellen Funktion ist die synaptische Verankerung inhibitorischer Rezeptoren an das Zytoskelett. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, dass ein Interaktionspartner von Gephyrin, Collybistin, die Organistion des Aktin-Zytoskeletts reguliert. Die enzymatische Funktion von Gephyrin besteht in der Synthese eines Kofaktors, welcher für die Aktivität von Molybdoenzymen notwendig ist. Das gezielte Ausschalten des für Gephyrin kodierenden Gens weist im Mausmodell einen letalen Phänotyp auf. Als Ursache hierfür kommen die fehlende synaptische Aggregation von Glyzin- und GABAA-Rezeptoren in neuronalem Gewebe, sowie die fehlende Aktivität von Molybdoenzymen in peripheren Organen in Frage. Da sowohl Molybdän-Kofaktor-Defizienzen beim Menschen, wie auch bestimmte Mutationen von Glyzin- und GABAA-Rezeptoren bei Mäusen letal sind, kann der beobachtete Phänotyp nicht eindeutig zugeordnet werden. Die vorliegende Arbeit verfolgt zwei Ziele. Das erste ist eine Einengung der Binderegion von Collybistin an Gephyrin. Dabei konnte diese durch immunzytochemische und biochemische Methoden auf wenige Aminosäuren genau beschrieben werden. Verschiedene Strukturvorhersageprogramme weisen auf eine helikale Struktur für diesen Sequenzabschnitt hin. Der Austausch der Aminosäuren R107, D108, R111 und E117 mit Alanin führt über den Verlust ionischer Ladungen zum Verlust der Bindungseigenschaft. Das zweite verfolgte Ziel ist die Einführung eines transgenen Konstrukts, welches nur die Molybdän-Kofaktor-Synthesefunktion wiederherstellen soll, in den genetischen Hintergrund der Gephyrin-„knock-out“ Maus. Ziel dieser Analyse ist die Herstellung eines Phänotyps, bei dem die inhibitorische Transmission in einer Weise gestört ist, welche Symptome der Molybdän-Kofaktor-Insufizienz ausschließt. So sollte die Ursache für die Letalität der Gephyrin-Mutation zugeordnet werden können. Dazu wurde das pflanzliche Gephyrin-Homolog Cnx1 in ein Expressionskonstrukt kloniert, und nach biochemischer, immunzytochemischer und funktioneller Analyse in heterologen Zellen in eine Wildtyp-Mauslinie injiziert. Diese wurde mit Geph-/--Mäusen gekreuzt und die daraus resultierenden homozygoten, transgenen Tiere analysiert. Diese Tiere sterben ebenso wie die Geph-/--Mäuse am Tag der Geburt. mRNA des Transgens konnte in Hirn und Leber nachgewiesen werden, das Protein allerdings nur in Hirnextrakten. Dementsprechend lag die Aktivität des für die Lebensfähigkeit von Säugetieren wichtigsten Molybdoenzyms, der Sulfitoxidase, in Leberextrakten nur bei 30%. Eine morphologische Untersuchung von Gehirnschnitten ergab keine Auffälligkeiten. Eine Immunhistochemische Analyse von Rückenmarkschnitten zeigte in Übereinstimmung mit Beobachtungen an Gephyrin-„knock out“-Mäusen diffus verteilte Glyzin-Rezeptoren. Somit wurde eine Maus mit beeinträchtigter inhibitorischer synaptischer Transmission und partiell wiederhergestellter Molybdän-Kofaktor Biosynthese hergestellt. Aufgrund der großen Schwankungsbreite der Aktivität der Sulfitoxidase in Leberextrakten verschiedener Geph-/- + cnx Tiere wäre ein Unterschied in der Lebenserwartung verschiedener Tiere zu erwarten gewesen, wenn die Defizienz dieses Molybdoenzyms die Ursache für den letalen Phänoyp gewesen wäre. Da die transgenen Tiere aber wie die Geph-/- Mäuse wenige Stunden nach der Geburt sterben, ist davon auszugehen, dass der beschriebene Phänotyp auf das Fehlen der strukturellen Eigenschaften von Gephyrin zurückzuführen ist, und nicht von einer durch Beeinträchtigung des Schwefelstoffwechsels hervorgerufene progressive Schädigung des ZNS.
Der Lichtsammelkomplex II (LHCII) dient als Lichtantenne für das photosynthetische Reaktionszentrum II der höheren Pflanzen. Seine Trimere stellen das häufigste Protein in der Thylakoidmembran dar. Ungefähr die Hälfte des Chlorophylls der Pflanze befindet sich in diesem Komplex. Der LHCII ist ein integrales Membranprotein und bindet neben Chlorophyll a und b auch verschiedene Carotinoide. Seine Pigmente absorbieren Licht und geben die dadurch aufgenommene Energie an die photosynthetischen Reaktionszentren weiter, wo sie ausgehend von einer Ladungstrennung chemisch konserviert wird. Die Weiterleitung der Anregungsenergie im LHCII geschieht über spezifische Pfade und mit ultraschneller Kinetik im Femtosekundenbereich. Der LHCII ist das einzige Antennenprotein der höheren Pflanzen, dessen dreidimensionale Struktur bei einer fast atomaren Auflösung von 3.4Å gelöst wurde. Bei dieser Auflösung war es jedoch nicht möglich, den Unterschied zwischen Chlorophyll a und b zu bestimmen, außerdem waren nur zwei der insgesamt drei bis vier gebundenen Carotinoide sichtbar. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die einzelnen Pigmente, deren Positionen aus der Struktur bekannt waren, nach ihrer chemischen Natur zuzuordnen. Hierzu wurden mutierte Komplexe untersucht, bei denen jeweils ein bestimmtes Chlorophyllmolekül fehlte. Dies wurde durch Punktmutationen im Polypeptid erreicht, bei denen diejenige Aminosäure ausgetauscht war, an die ein bestimmtes Chlorophyllmolekül über das zentrale Mg 2 Atom gebunden war. Die veränderten Proteine wurden durch ortsgerichtete Mutagenese und Überexpression des Polypeptids in E. coli hergestellt, wo sie ohne die Pigmente aggregiert in Einschlusskörpern vorlagen. Die Rückfaltung in Gegenwart von Pigmenten und Detergenzien erfolgte auf einer NickelAffinitätssäule, an die das LHC Protein mittels einer HexaHistidinmarkierung gebunden war. So konnte in einem biochemischen Schritt das Protein gefaltet, die Pigmente inkorporiert und die native, trimere Form gebildet werden. Die Rückfaltung von histidinmarkierten Proteinen auf Metallaffinitätssäulen kann als generelle Methode auch für andere, schwierig zu faltende, lösliche und Membranproteine angewandt werden. Der native Zustand des rückgefalteten LHCII wurde folgendermaßen bewiesen: Der Pigmentgehalt, der durch HPLC Analyse bestimmt worden war, war identisch zum nativ isolierten Protein. Auch ein Absorptionsspektrum zeigte bei 4K die charakteristische Aufspaltung in mehrere Chlorophyllmaxima. Es konnte gezeigt werden, dass in einem Fluoreszenzexperiment die Anregungsenergie, die bei kurzwelligem Chlorophyll b eingestrahlt wurde, im Komplex komplett auf das langwelligste Chlorophyll a übertragen wurde. Schließlich wurden aus dem rekombinanten Protein zweidimensionale Kristalle erzeugt, deren elektronenmikroskopische Projektionsbilder identisch zu denen des Nativproteins waren. Der Austausch der Chlorophylle an einigen Bindungsstellen durch Chlorophyllderivate, die entweder im Zentralatom oder in der Porphyrinringstruktur verändert waren, zeigte, dass das Zentralatom den entscheidenden Faktor zur Stabilisierung der Chlorophyllbindung darstellt. Es wurden neun Mutanten erzeugt, bei denen jeweils derjenige Aminosäurerest ausgetauscht war, von dem aus der Struktur bekannt war, dass er den fünften Liganden für das zentrale Mg 2 Atom eines bestimmten Chlorophylls darstellt. Die HPLC Analyse ihrer Pigmente zeigte, dass die Mutanten tatsächlich jeweils ungefähr ein Chlorophyllmolekül verloren hatten; dies diente dazu, die jeweilige Bindungstasche zu Chl a oder Chl b zuzuordnen. Nur sechs Mutanten bildeten Trimere, ihre biochemischen Daten zeigten, dass die in der Struktur vorgenommene Zuordnung bis auf das Chl b3 korrekt war. Einige Chlorophyllmutanten waren auch in ihrem Gehalt an Neoxanthin reduziert, daraus konnte die ungefähre Lage des Neoxanthins in der Nähe der Helix C abgeleitet werden. Die mutierten Proteine lieferten nicht nur die Zuordnung einer Bindungstasche zu einem bestimmten Chlorophylltyp, sondern es konnte aus den Differenzspektren im Vergleich zum Wildtyp auch die Wellenlänge eines bestimmten Chlorophylls abgeleitet werden. Um eine höhere spektrale Auflösung zu erzielen, wurden die Spektren bei 4K aufgenommen. Die Zuordnung einzelner spektraler Banden zu bestimmten Chlorophyllen zeigte, dass in einer bestimmten Bindungstasche nur entweder Chlorophyll a oder Chlorophyll b gebunden war, da sich nur eine einzige Differenzbande im Spektrum ergab. Weiterhin implizieren die gefundenen Einzelbanden, dass die Pigmente keiner starken excitonischen Kopplung unterliegen, wie dies zum Beispiel im B850 Ring des bakteriellen Lichtsammelkomplexes der Fall ist. Bei LHCII Komplexen, die nur mit Chlorophyll b rückgefaltet worden waren, zeigte sich eine ungewöhnlich langwellige Fluoreszenz bei 77K. Dies könnte auf eine räumlich limitierte Kopplung eines einzelnen Chlorpohyllpaars hinweisen. Bei der Mutante der Chl a2 Bindungsstelle zeigte sich, dass dies das langwelligste der untersuchten Pigmente war. Der zugehörige Koomplex war auch der einzige, bei dem die Fluoreszenz ins Kürzerwellige verschoben war. Die Lage des Chlorophylls a2 an der Außenseite des Proteins ist prädestiniert für die Energieübertragung zum photosynthetischen Reaktionszentrum oder zu benachbarten LHC Komplexen.