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In optogenetischen Anwendungen, welche die Manipulation von zellulären Aktivitäten durch Licht ermöglichen, werden die Eigenschaften von mikrobiellen Rhodopsinen, einer Familie natürlich vorkommender lichtgesteuerter Proteine, ausgenutzt.
In der vorliegenden Arbeit wurden die einwärts transportierende Protonenpumpe NsXeR, sowie die auswärts Natriumionenpumpe KR2 untersucht. Des Weiteren wurden Tandem Proteine betrachtet, die mikrobielle Rhodopsine kombinieren mit dem Chemokinrezeptor CXCR4, der durch SDF1 aktiviert und anschließend in Endosomen internalisiert wird.
Für die Untersuchung des Mechanismus, der die Vektorialität in NsXeR bestimmt, wurde eine umfassende elektrophysiologische Studie durchgeführt. In Patch Clamp Messungen an NsXeR exprimierenden NG108-15 Zellen wurden bei kontinuierlicher 561 nm Beleuchtung aktive Einwärtsströme entgegen eines elektrochemischen Gradienten gemessen. Ein Einfluss des intrazellulären pHs auf die steady-state Ströme und deren Abfallkinetik konnte nicht festgestellt werden. Der Vergleich der exponentiellen Abfallrate k2 mit den Übergängen im NsXeR Photozyklus, lässt den Schluss zu, dass der ratenlimitierende Schritt der MII Zerfall ist.
Die elektrogenen Schritte im NsXeR Photozyklus wurden mit elektrischen Messungen an der black lipid membrane (BLM) an NsXeR Proteoliposomen bestimmt. Die Belichtung mit 20 ns Lichtpulsen bei 556 nm rufen Spannungssignale hervor, die exponentiell gefittet wurden, wobei drei elektrogene Schritte identifiziert werden konnten. Bei pH 7.4 betrugen die ermittelten Zeitkonstanten etwa 220 µs, 1 ms und 15 ms, denen 42%, 10% und 48% an der Gesamtladungsverschiebung zugeordnet wurden. Die elektrogenen Schritte konnten den Übergängen im Photozyklus zugeordnet werden, wobei der erste Schritt mit t1 dem MI Aufbau (Deprotonierung Schiff’sche Base, Protonenabgabe zur intrazellulären Seite) zugeschrieben wurde. t2 wurde dem MI→MII Übergang (Switch, Zugänglichkeitsänderung vom Intra- zum Extrazellulären) zugeordnet und t3 korreliert mit dem MII Zerfall (Reprotonierung Schiff’sche Base, Protonenaufnahme von der extrazellulären Seite).
Die Kinetik und der Ladungstransportanteil des zweiten elektrogenen Schritts haben keine starke pH Abhängigkeit, was sich dadurch erklären lässt, dass t2 durch eine Konformationsänderung bestimmt wird. t1 und t3 werden bei höheren pH Werten beschleunigt, was sich bei t1 mit einer erleichterten intrazellulären Protonenabgabe erklären lässt. Für t3 wurde eine Reprotonierung durch eine Donor Gruppe Asp76 vorgeschlagen. Die pH-sensitive Änderung der relativen Ladungstransferanteile des ersten und dritten elektrogenen Schrittes (∆ΨI und ∆ΨIII) wurden durch eine mögliche Verzögerung der frühen Protonenabgabe bei niedrigen pH Werten erklärt.
Der mutmaßliche Protonenakzeptor Asp220 wurde gegen Asn und Glu ausgetauscht und in Patch Clamp sowie UV-Vis Spektroskopie Messungen untersucht. Für D220N wurden keine Pumpströme und kein Einfluss auf die maximale Absorptionswellenlänge λmax festgestellt. D220E dagegen führte zu einer Erniedrigung des pKa-Werts der Schiff’schen Base und zu einer Verminderung der Iss-Abfallsrate k2 in Patch Clamp Dauerbelichtungsmessungen (D220E k2 = 27.1 ± 1.8 Hz, Wildtyp k2 = 83.1 ± 2.6 Hz). Daraus konnte geschlossen werden, dass Asp220 wesentlich für den Protonentransport ist und nicht als Gegenion für die protonierte Schiff’sche Base dient.
In Patch Clamp Experimenten bei 561 nm Dauerbelichtung und zusätzlicher gepulster Belichtung bei 355 nm wurde der Blaulichteffekt an NsXeR untersucht, bei dem Proteine im M Intermediat ein Photon absorbieren und unter Reprotonierung der Schiff’schen Base in den Grundzustand zurückkehren.
Für NsXeR konnte eine Potentialabhängigkeit für die Richtung der transienten Ströme, die durch die
355 nm Belichtung hervorgerufen wurden, festgestellt werden. Beim NsXeR Blaulichteffekt scheint eine
Reprotonierung der Schiff’schen Base von beiden Seiten möglich zu sein, was auf die unterschiedlichen Zugänglichkeiten in den beiden M Zuständen MI und MII zurückgeführt wurde. Es wurde ein Modell vorgeschlagen, welches auf einem potentialabhängigen Gleichgewicht zwischen MI und MII basiert.
In Patch Clamp Messungen an KR2 exprimierenden NG108-15 Zellen wurden die Pumpströme untersucht, die durch den auswärts Transport von Na+ und H+ hervorgerufen wurden. Die Na+-Konzentrationen der intra- und extrazellulären Lösungen wurden symmetrisch variiert und die steady-state Ströme Iss bei 532 nm Dauerbelichtung betrachtet. Mit steigender Na+-Konzentration zeigte sich ein Übergang von einer linearen Potentialabhängigkeit der Iss, zu einem sättigungsähnlichen Verhalten bis hin zu einer fast glockenförmigen Form. Da die exponentielle Abfallrate der steady-state Ströme k2 in ihrer Potentialabhängigkeit mit den Iss korrelierte, konnte geschlossen werden, dass die Ströme überwiegend kinetisch limitiert sind. Die Erhöhung der Rate k2 mit steigender Na+-Konzentration zwischen -120 mV und -60 mV deutet darauf hin, dass die Na+-Aufnahme von der intrazellulären Seite bei diesen Bedingungen die Limitierung für die Pumpe darstellt.
Unter Na+-“freien” Bedingungen wurde der Einfluss des intrazellulären pHs untersucht. Für die Rate k2 wurde eine Erhöhung bei niedrigen pH Werten festgestellt und die Potentiale E0 (Iss = 0 pA) verschoben bei niedrigem intrazellulärem pH zu hyperpolarisierenden Potentialen. Daraus lässt sich schließen, dass die steady-state Ströme durch den Transport von Protonen hervorgerufen wurden.
In Messungen mit gepulster 530 nm Belichtung wurden die transienten Pumpströme gemessen und durch exponentielles Fitten des Stromabfalls drei elektrogene Schritte identifiziert. Eine Abhängigkeit vom Potential und der Na+-Konzentration konnte nur für den dritten Schritt mit der Rate 1/τ3 festgestellt werden, wobei 1/τ3 mit der Na+-Konzentration und bei positiveren Potentialen steigt. Unter Na+-“freien” Bedingungen steigt 1/τ3 auch mit niedrigeren intrazellulären pH Werten. Die elektrogenen Schritte wurden dem KR2 Photozyklus zugeordnet, wobei ein Modell angewendet wurde, das einen M1→M2 Übergang einführt. Diesem wurde der zweite elektrogene Schritt zugeordnet. Die relativen Ladungstransportanteile Q2 und Q3 des zweiten und dritten elektrogenen Schrittes sind sowohl potential- als auch Na+-abhängig. Um dieses Verhalten zu erklären, wurde ein Modell vorgeschlagen, bei dem ein Ausgleichsladungstransfer in Form von einer Protonenabgabe und -wiederaufnahme während des Photozyklus eingeführt wurde.
In Patch Clamp Messungen wurde die erhaltene Funktionalität der ChR2 Mutante ChR2(L132C) mit erhöhter Ca2+-Permeabilität im Tandem Protein tCXCR4/CatCh nachgewiesen. Auch die Internalisierung von tCXCR4/CatCh konnte anhand der zeitabhängigen Abnahme des CatCh-Signals nach der CXCR4-Aktivierung durch SDF1 in Strommessungen beobachtet werden. Für tCXCR4/Arch, ein Tandem Protein mit einer Protonenpumpe, wurde die SDF1-induzierte Internalisierung mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie betrachtet und eine Kolokalisierung der Fluoreszenz des im Tandem exprimierten YFP und der eines gelabelten CXCR4-spezifischen Antikörpers in intrazellulären Vesikeln beobachtet. Bei Behandlung mit dem CXCR4 Antagonisten AMD3100 wurde die Kolokalisierung hauptsächlich in der Zellmembran festgestellt, da die Internalisierung blockiert war. Die Tandem Protein könnten als in intrazellulären Organellen wirkende optogenetische Werkzeuge eingesetzt werden für z.B. die Manipulation der intrazellulären Ca2+-Konzentration.
Over the last decade, cryo-EM has developed exponentially due to improvements in both hardware (“machine”-based) and software (“algorithm”-based). These improvements have pushed the best achievable resolutions closer to atomic level, bridging “gaps” not covered by other biophysical techniques, and allowing more difficult biological questions to be addressed. Thus, this PhD project was designed and constructed to apply cryo-EM to answer biological questions, while allowing simultaneous cryo-EM method development.
The biological focus of this research is pentameric ligand-gated ion channels (pLGICs), specifically the serotonin receptor type-3 receptor (5HT3R), which also belongs to the Cys-loop receptor family. 5HT3R plays an important role in fast synaptic signal transduction in response to agonist and antagonist binding. Binding to its native ligand results in opening of the channel at the transmembrane domain, allowing cations to pass through, resulting in membrane depolarization and conversion of the chemical signal into an electrical one.
This work consisted mainly of two specific aims. One was focused on conformational investigation of 5HT3R in its ligand-bound open conformation, using cryo-electron microscopy (cryo-SPA), in order to understand the gating mechanism upon ligand activation. The other one was to combine SPA with cryo-ET and STA to push the resolution limitation of conventional cryo-ET and STA workflows.
In the end, three different cryo-EM conformations of membrane-embedded 5HT3R were resolved using cryo-SPA, two structures in resting closed forms, one C5-symmetric and one C1-asymmetric, and one serotonin-bound open form. These three structures presented a number of novel features related to the transition of the receptor to its ion-conductive state. Specifically, the serotonin-bound receptor shows asymmetric opening, which was speculated to occur via an intermediate asymmetric Apo state. In addition to the cryo-SPA work, application of cryo-ET and STA to the study of 5HT3R in native vesicles is described in this thesis. Additional work on methods development, focused on combining SPA and STA techniques, along with preliminary results on tobacco mosaic virus are also detailed and discussed.
Moreover, previously unreported asymmetric arrangements of the subunits of the homopentameric 5HT3R around the pore axis were revealed. The asymmetric open state is stabilized by phospholipids inserted at the interface between subunits, at a site well-documented for the binding of allosteric pLGIC modulators. These results not only give structural support to a large body of functional data on the effects of lipids on the function of this receptor family, but also provide structural guidance for future studies in this field. Meanwhile, the SPA-STA combined methods developed during the course of this work have the potential to help resolve higher resolution tomography-based structures, which would benefit researchers seeking to do in-situ-based structural studies.
In dieser Studie haben wir die Modulation von Arachidonsäure (AA)-Stoffwechselwegen während einer Wurminfektionen mit dem Fadenwurm Heligmosomoides polygyrus bakeri (Hpb) als angeborene regulatorische Strategie zur Modulation der Typ-2-Entzündung untersucht. Wir zeigten, dass Hpb in frühen Stadien der Infektion (Tag 7) die Produktion von regulatorischen Prostaglandinen (PGE2 und 6-keto PGF1-α, ein Abbauprodukt von PGI2) und COX-Metaboliten (12-HHT und TXB2) fördert, jedoch die Sekretion von entzündungsfördernden Mediatoren PGD2 und LTs (LTB4, cysLTs) unterdrückt. Die Hpb-gesteuerte Regulierung des AA-Stoffwechsels könnte eine Strategie zur Immunsuppression/ Immunevasion dieses Parasiten darstellen, die darauf abzielt, die vom Wirt ausgelösten Immunantworten des Typs-2 zu unterbinden und sowohl die Infiltration und Rekrutierung von Granulozyten als auch die Schleimproduktion zu begrenzen und auf diese Weise das Abtöten bzw. Ausscheiden der Larven zu verhindern.
Als Schwerpunkt der Arbeit, konnten wir ebenso zeigen, dass ein Larvenextrakt aus Heligmosomoides polygyrus bakeri (HpbE) den AA Stoffwechsel in myeloiden Zellen wie Makrophagen und Granulozyten moduliert, indem die Synthese von 5-LOX in Richtung COX-Metaboliten verschoben wird. Die Behandlung von murinen und humanen Makrophagen mit HpbE induzierte die Synthese von regulatorischen Prostaglandinen (PGE2) und Prostaglandinen, die an der Wundheilung und Blutgerinnung beteiligt sind (12-HHT, TXB2), wohingegen die Produktion von entzündungsfördernden Lipidmediatoren (LTs, PGD2) unterdrückt wurde. Weiter induzierte HpbE in humanen und murinen Makrophagen die Synthese der Typ-2 hemmenden Mediatoren IL-10 und IL-1β und modulierte die Produktion von Zytokinen, die an der Regulierung von M2-Polarisierung und der Typ-2-Entzündung (IL-12, IL-28, IL-27 und TNF-α) in humanen Makrophagen beteiligt sind. Ähnlich zu der HpbE-vermittelten Eicosanoid-Umprogrammierung in Makrophagen, veränderte HpbE den AA-Stoffwechsel humaner Granulozyten und zeigt eine Verschiebung von LOX- in Richtung COX-Metabolismus. Außerdem kann HpbE direkt auf humane Granulozyten wirken und die Chemotaxis von Granulozyten effizienter hemmen als zur Asthmabehandlung verwendete Standardarzneimittel, indem es die Expression von LT synthetisierenden Enzymen (LTA4H und LTC4S) verringert und die Expression von chemotaktischen Rezeptoren (CCR3 und CRTH2) herunterreguliert.
Darüber hinaus, konnten wir die Mechanismen identifizieren, die der HpbE-gesteuerten Eicosanoid-Umprogrammierung in Makrophagen zugrunde liegen. Hpb Produkte induzierten die Aktivierung von p38 MAPK, welche COX und die Transkriptionsfaktoren HIF-1α und NFκβ aktiviert und die Produktion von Prostaglandinen (PGE2 and TXB2) sowie der Typ-2 unterdrückenden Zytokine IL-10 and IL-1β fördert. Der der Induktion des COX-Signalwegs zugrunde liegende Upstream-Mechanismus umfasste mehrere PPRs (TLR2, Dectin-1/2). Diese Rezeptoren waren allerdings nicht an der HpbE-gesteuerten Induktion von IL-10 beteiligt. Die Mechanismen der Modulation des 5-LOX-Signalweges muss noch in zukünftigen Studien weiter erforscht werden.
Das therapeutische Potential von HpbE oder HpbE-behandelten Makrophagen wurde in einem Maus Model mit HDM-induzierter allergischer Atemwegsentzündung in vivo gezeigt. Eine intranasale Behandlung mit HpbE vor HDM-Sensibilisierung und -Provokation führte zu einer Umprogrammierung des AA-Stoffwechsels und verhinderte die Allergie-induzierte Eosinophilie, Zellinfiltration, Atemwegsentzündung und Schleimproduktion. Die Modulation der Typ-2-Entzündung durch HpbE wurde vor allem durch COX-2-Metabolite vermittelt, die von HpbE-stimulierten Makrophagen freigesetzt wurden. Dies zeigte sich insbesondere darin, dass der Transfer von HpbE-stimulierten Wildtyp- aber nicht COX-2-defizienten Makrophagen vor Provokation die Granulozyten Rekrutierung und Typ-2-Entzündung während der HDM-induzierten Allergie in vivo abschwächte.
Mittels eines Maus Models für die allergische Atemwegsentzündung in unterschiedlichen Altersstufen (Neugeboren, Jungtier und Erwachsen) zeigte dieses Forschungsprojekt, dass das Alter der Sensibilisierung eine Schlüsselrolle bei der Produktion von LTs, der Expression von LT-Synthese Enzymen sowie von Faktoren, die zu strukturellen Veränderungen in den Atemwegen führen, spielt. Hier haben wir auch festgestellt, dass der Mechanismus hinter der LT-Produktion und dem Atemwegs-Remodeling im Epithel von ausgewachsenen sensibilisierten Mäusen die Aktivierung der Faktoren sPLA2X, TGM2 und Wnt5a beinhaltet.
Des Weiteren zeigte unsere Studie, dass eine Wechselwirkung zwischen entzündetem Atemwegsepithel und Alveolar-ähnlichen Makrophagen die Synthese von LTs fördern kann. Der vorgeschlagene Mechanismus startet mit der Sekretion von Wnt5a durch das entzündete Atemwegsepithel, welches die Expression von TGM2 in Makrophagen aktiviert und die Produktion von entzündungsfördernden LTs induziert, wodurch die Rolle der Makrophagen in entzündeten Atemwegen bei Erwachsenen weiter unterstützt wird. Die Relevanz der entdeckten Kaskade konnte auch in Geweben von Patienten mit chronischer Rhinosinusitis und Nasenpolypen (CRSwNP) bestätigt werden. Hohe Konzentrationen von LT Enzymen (5-LO, LTC4S LTA4H), sPLA2-X, TGM2 und Wnt5a wurden in humanen Nasenpolyp Geweben beobachtet, und hohe Konzentrationen von CysLTs wurden in Nasenpolyp Sekreten dieser Patienten gemessen. Dies lässt vermuten, dass die Expression von Atemwegs Remodeling-Faktoren, LT-Synthese Enzymen und die LT Synthese steroidresistent sind. Daher könnte diese entzündliche Kaskade ein alternatives therapeutisches Ziel für die Behandlung von Asthma darstellen, speziell bei Patienten mit steroidresistenten Formen von Atemwegsentzündungen.
Basierend auf den möglichen therapeutischen Anwendungen von HpbE haben wir begonnen, an der Charakterisierung der im HpbE vorhandenen immunmodulatorischen Wirkstoffe zu arbeiten. Glutamatdehydrogenase (GDH) und Ferritin wurden als potenzielle immunmodulatorische Komponenten von HpbE identifiziert. Es ist jedoch weitere Arbeit erforderlich, um diese in HpbE vorhandenen Proteine rekombinant herzustellen und den Wirkungsmechanismus im Bezug auf die Typ-2-Entzündung weiter aufzuklären.
Schätzungen zufolge sind weltweit etwa 71 Millionen Menschen chronisch mit dem Hepatitis-C-Virus (HCV) infiziert. Im Jahre 2016 sind rund 400.000 Menschen an einer HCV-bedingten Lebererkrankung gestorben, insbesondere aufgrund der Entwicklung von Leberzirrhose und Lebertumoren. Trotz der großen Unterschiede in den Prävalenzschätzungen und der Qualität der epidemiologischen Daten zeigt die jüngste weltweite Bewertung, dass die virämische Ausbreitung der HCV-Infektion (Prävalenz der HCV-RNA) in den meisten Industrieländern, einschließlich der USA, weniger als 1,0% beträgt (www .cdc.gov / Hepatitis / HCV). In einigen osteuropäischen Ländern wie Lettland (2,2%) oder Russland (3,3%) und bestimmten Ländern in Afrika, Ägypten (6,3%) und Gabun (7,0%) oder im Nahen Osten Syriens (3,0%) ist die Prävalenz bemerkenswert höher. In den USA und den am weitesten entwickelten Ländern gilt die gemeinsame Nutzung von Werkzeugezur Herstellung von Arzneimitteln und zur Injektion von Medikamenten (Nadeln) als die häufigste derzeitige Übertragungsart. Die vorherrschende Übertragungsart in Ländern, in denen die Ausbreitung von HCV-Infektionen im Vergleich zu den Industrieländern höher ist, beruht jedoch auf schlechten Methoden zur Infektionskontrolle und unsicherer Handhabung von Injektionsnadeln.
Wenn die chronische Infektion unbehandelt bleibt, kann sich im fortschreitenden Verlauf eine Zirrhose oder ein hepatozelluläres Karzinom bilden (Alter H. J. und Seef L. B. 2000). Die Doppeltherapie, bei der es sich um eine Kombination aus pegyliertem Interferon-α (PEG IFNα) und Ribavirin (riba) handelt, war in einigen Ländern der Dritten Welt bis vor kurzem der goldene Standard für die Behandlung von Patienten mit chronischer Hepatitis C und hat eine anhaltende virologische Reaktion erzielt. Mit nur 50% der mit HCV-Genotyp 1 infizierten Patienten (der häufigere) im Vergleich zu 80% mit Genotyp 2 oder 3, obwohl sie kostspielig und langwierig sind (z. B. 24-48 Wochen) und zahlreiche harte Nebenwirkungen aufweisen, die schwer zu bekämpfen sind tolerieren (Erklärung der National Institutes of Health Consensus Development Conference: Management von Hepatitis C: 2002 - 10.-12. Juni 2002 2002). Die Identifizierung des JFH1 (japanische fulminante Hepatitis Typ 1) -Isolats wurde in einigen in vitro-Studien zu HCV als wichtiger Durchbruch bei der HCV-Behandlung angesehen. Die Verwendung dieses Isolats führte nachfolgend zu einem besseren Verständnis des HCV-Lebenszyklus und der 3D-Strukturen der viralen Proteine. Basierend auf dieser Erkenntnis konnten die ersten direkt wirkenden antiviralen Mittel (DAAs) entwickelt werden, die spezifisch virale Proteine beeinflussen. Die beiden Proteasehemmer (PI) Telaprevir und Boceprevir hemmen die virale NS3-4A-Protease und wurden 2011 als Kombinationstherapie mit PEG IFNα und Ribavirin zugelassen, was die anhaltende virologische Reaktion auf 67-75% erhöhte (Pawlotsky et al. 2015).
Die Optimierung der gegenwärtigen Arzneimittelregime, die Einschränkung des Problems der Mutationsresistenz, die Gestaltung einer individualisierten Therapie, der Zugang zu diesen therapeutischen antiviralen Arzneimitteln und ihr hoher Preis bleiben weiterhin eine Herausforderung (Pawlotsky 2016; Pawlotsky et al. 2015; Sarrazin 2016). Die Entwicklung eines Impfstoffs wird jedoch als größte Herausforderung für die weltweite Kontrolle von HCV angesehen (Bukh 2016). Aus diesem Grund ist es wichtig, weiterhin mehr über den HCV-Lebenszyklus und die Faktoren zu erfahren, die sich auf die Replikation und den gesamten Lebenszyklus auswirken können, um effiziente, qualitativ hochwertige und vor allem leicht zugängliche Behandlungen für alle Menschen weltweit zu entwickeln.
Der Lipidstoffwechsel und insbesondere das Cholesteringleichgewicht werden durch die HCV-Infektion beeinflusst. Die Korrelation zwischen Lipidstoffwechsel und HCV wurde klinisch seit langem beobachtet. In den Leberbiopsien von mit HCV infizierten Patienten wurde ein Anstieg der in den Lipidtröpfchen im Cytosol akkumulierten neutralen Lipide festgestellt (Dienes et al. 1982). Das Hepatitis-C-Virus wurde auch von Hypobetalipoproteinämie, Hypocholesterinämie und Lebersteatose begleitet (Schaefer und Chung 2013). Die Leber ist der primäre Ort für die Synthese, Speicherung und Oxidation von Lipiden und anderen Makromolekülen. Daher ist der Fettstoffwechsel in der Leber für die Aufrechterhaltung der systemischen Nährstoffhomöostase von wesentlicher Bedeutung. Eine Dysregulation des Leberlipidstoffwechsels ist ein Kennzeichen mehrerer Krankheiten wie Diabetes, alkoholische und nichtalkoholische Fettlebererkrankungen sowie parasitäre und virale Infektionen, einschließlich einer HCV-Infektion. (Erklärung der National Institutes of Health Consensus Development Conference: Management von Hepatitis C: 2002 - 10.-12. Juni 2002 2002; Fon Tacer und Rozman 2011; Chen et al. 2013; Reddy und Rao 2006; Visser et al. 2013; Wu und Parhofer 2014)
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Human protein kinases play essential roles in cellular signaling pathways and - if deregulated - are linked to a large diversity of diseases such as cancer and inflammation or to metabolic diseases. Because of their key role in disease development or progression, kinases have developed into major drug targets resulting in the approval of 52 kinase inhibitors by the Food and Drug Administration (FDA) so far.
Within the drug discovery process, the affinity of the inhibitors is the parameter that is used most often to predict the later efficacy in humans. However, the kinetics of binding have recently emerged as an important but largely neglected factor of kinase inhibitor efficacy. To efficiently suppress a signaling pathway, the targeted kinase needs to be continuously inhibited. Thus, it has been hypothesized that fast binding on-rates and slow off-rates would be the preferred property of an efficacious inhibitor. Despite optimizing the potency of kinase inhibitors, in the past decade optimization of kinetic selectivity has therefore gained interest as a molecule cannot be active unless it is bound, as Paul Ehrlich once stated. There is increasing evidence of correlations between prolonged drug-target residence time and increased drug efficacy, and that inhibitor selectivity in cellular contexts can be modulated by altered residence times. In order to contribute to the understanding of the effect of long residence times on cellular targets we initiated two projects.
The first of these projects is related to the STE20 kinase Serine/threonine kinase 10 (STK10) and its close relative STE20 like kinase (SLK) which have been reported to be frequent off-targets for kinase inhibitors used in the clinics. Also, an inhibition of STK10 and SLK has been linked to a common side-effect of severe skin rash developed upon treatment with the EGFR inhibitor erlotinib, but not gefitinib and the severity of this rash correlated with the treatment outcome, which fits the known biology of STK10 and SLK to be regulators of lymphocyte migration and PLK kinases. However, there are yet no explanations why these two proteins show such high hit-rates across the kinome among the kinase inhibitors. Using structural analysis, we identified the flexibility of STK10 to be the main reason for this hit-rate. The observed strong in vitro potencies did however not translate to the cellular system which is why we investigated the inhibitors residence time on STK10. We found the same flexibility to be the main reason for slow residence times among several inhibitors. We observed large rearrangements in the hydrophobic backpocket of STK10 including the αC, the P-loop enclosing the inhibitor like a lid and strong π-π-stackings to be the main reasons for prolonged residence times on STK10. Interestingly, we observed an increased residence time for erlotinib, which showed skin-related side-effects, giving rise whether the binding kinetics should be investigated for weak cellular off-target effects in future drug discovery efforts.
In the second project we initiated, we illuminate a structural mechanism that allows kinetic selection between two closely related kinases, focal adhesion kinase (FAK) and proline-rich tyrosine kinase 2 (PYK2). Using an inhibitor series designed to probe the mechanism, residence times measured in vitro and in cells showed a strong correlation. Crystal structures and mutagenesis identified hydrophobic interactions with L567, adjacent to the DFG-motif, as being crucial to kinetic selectivity of FAK over PYK2. This specific interaction was observed only when the DFG-motif was stabilized into a helical conformation upon ligand binding to FAK. The interplay between the protein structural mobility and ligand-induced effect was found to be the key regulator of kinetic inhibitor selectivity for FAK over PYK2.
These two projects showed that the parameter residence time should be considered for different problems among the drug discovery process. First, in an open in vivo system not only the potency of a drug alone, but as well its residence time might be of importance. Here we showed that the weak cellular potency translated to prolonged residence times for several inhibitors in cells and established a link between the phenotypic outcome of skin rash after erlotinib treatment and the residence time of this inhibitor on STK10 in cells. On the other hand, medicinal chemistry efforts should consider structure kinetic relationships (SKR) in the optimization process and aim to understand the molecular basis for prolonged target residence times. Here, we showed that a hydrophobic interaction that is enforced upon inhibitor binding is crucial for an unusual helical DFG conformation which arrests the inhibitor and prolongs its residence time providing the molecular basis for understanding the kinetic selectivity of two closely related protein kinases. Establishing the SKRs will help medicinal chemists to kinetically optimize their drug candidates to select a suitable molecule to proceed into further optimization programs. Hence, the projects showed that the target residence time parameter needs to be considered both as a molecular optimization parameter to improve compound potency and binding behavior as well as a parameter to be understood for proceeding to the open system of in vivo models to later modulate the in vivo efficacy of protein kinase targeting drugs.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten neue Synthesemethoden für den schnellen und effizienten Aufbau von molekularer Komplexität ausgehend von Enamiden als zentrale Synthesebausteine entwickelt werden. Dabei konnten insgesamt fünf unterschiedliche Reaktionen entwickelt werden, die die Synthesen nützlicher Bausteine, wie z.B. β-Amidosulfone 127 oder 1,3-Diamide 128, und neuartiger Heterocyclen ermöglichen. Insgesamt konnte so in einem diversität-orientierten Ansatz, die selektive Bildung von bis zu fünf stereogenen Einheiten ausgehend von einfachen, acyclischen Startmaterialen ermöglicht werden.
Metall-vermittelte Sulfonierungen von Enamiden mittels Sulfinatsalzen:
Im ersten Abschnitt sollten Enamide für die Synthese von Sulfonen eingesetzt werden. Dabei konnte, abhängig vom Katalysatorsystem, sowohl eine C-(sp2)-H Sulfonylierung (Schema 5-1-a.)) als auch eine Oxysulfonylierung (Schema 5-1-b.)) entwickelt werden. Durch die Verwendung von Mn(OAc)3.2 H2O wurden selektiv (E)-konfigurierteβ-Amidovinylsulfone 126 erhalten. Die Reaktion ist unempfindlich gegenüber Luft und Wasser, was sie besonders einfach in der Durchführung macht. Zudem besitzt sie eine große Substratbreite und bietet durch die Kombination mit klassischer Organometallchemie mit einem Isomerisierung-Sulfonierungs-Protokoll eine interessante Alternative zur C-H Sulfonylierung von Enamiden. Auf Grundlage dieser Reaktion sollte, durch zusätzliches Abfangen eines intermediär gebildeten Acylimins durch einen Alkohol, auch eine Oxysulfonierung entwickelt werden. In der Tat konnte durch die Verwendung von Fe(NO3)3∙9 H2O eine entsprechende 3-Komponentenreaktion zu β-Amidosulfonen 127 mit zwei stereogenen Zentren etabliert werden.
Diese Verbindungen versprechen vor allem durch ihr hohes Vorkommen als Schlüsselmotiv in biologisch aktiven Substanzen ein hohes Anwendungspotential. Die Reaktion verfügt über eine breite Substratbreite und ist analog zur Mangan-vermittelten Variante einfach in der Durchführung. Die erhaltenen sulfonierten N,O-Acetale 127 können zudem in die entsprechende Imine überführt und mit einem geeigneten Nukleophil abgefangen werden. So lässt sich z.B. das Methylfuran-Derivat 177a darstellen, welches durch eine oxidative Spaltung in die geschützte Aminosäure 178 überführt werden kann.
Addition von Enamiden und Enimiden an N-Acylimine:
Aufbauend auf der zweistufigen Reaktionssequenz zum Aufbau von 1,3-Diamiden 128 über die Addition von Enamiden 29 an N-Acylimine 131 und anschließender Umsetzung mit einem Nukleophil, konnte die Synthese zu einer Eintopf-Reaktion weiterentwickelt werden (siehe Schema 5-3-c.).
Als Katalysator für beide Reaktionsschritte zeigte Bi(OTf)3 als luft- und wasserstabiler Katalysator die besten Ausbeuten und Selektivitäten. Dabei werden selektiv 1,2-anti-2,3- anti-konfigurierte 1,3-Diamide 128 mit drei fortlaufenden Stereozentren erhalten. Vorteile dieser Methode sind, neben einer einfachen Durchführbarkeit, die simple Skalierbarkeit sowie die Toleranz einer Vielzahl unterschiedlicher funktioneller Gruppen in der Reaktion. So konnten durch Variation aller drei Komponenten über 30 Beispiele der gewünschten 1,2-anti-2,3-anti-konfigurierten 1,3-Diamide 128 dargestellt werden. Die hier entwickelte Eintopf-Reaktion stellt somit eine wichtige Erweiterung zu bestehenden 1,3-Diamidsynthesen dar. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass ausgehend von Phthaloyl-basierten Enimiden 125 die nur schlecht darstellbare Substanzklasse der Dihydropyrimido[2,1-a]isoindol-6(2H)-one 129 hergestellt werden kann (siehe Schema 5-3-d.). Dieses neuartige heterocyclische Motiv wurde bisher kaum auf seine biologische Aktivität hin untersucht und verspricht daher ein interessantes Anwendungsfeld. Insgesamt weisen die erhaltenen Verbindungen drei fortlaufende Stereozentren auf, wobei sie in guten bis sehr guten Ausbeuten diastereomerenrein erhalten werden konnten. Dabei lässt sich der hohe Grad an Stereoselektivität durch eine [4+2] Cycloaddition zwischen dem in situ erzeugten N-Acylimin 131 und einem Enimid 125 zu einem Oxazin 132, gefolgt von einer Säure-vermittelten Umlagerung, erklären. Durch Variation der Enimid- und Acyliminkomponente konnten insgesamt 27 neuartige Dihydropyrimido[2,1-a]isoindol-6(2H)-one 129 synthetisiert werden.
Addition von Enamiden an Aldehyde – Stereoselektive Synthese
pentasubstituierter Tetrahydropyrane:
Im letzten Teil der Arbeit sollte, analog zur stereodivergenten Synthese von 1,3- Diaminen, durch Addition von Enamiden an Aldehyde, die jeweiligen 1,3-Aminoalkohole dargestellt werden. Interessanterweise wurde in dieser Transformation die selektive Bildung eines pentasubstituierten Tetrahydropyrans beobachtet. Dabei werden in einem Schritt drei neue σ-Bindungen und fünf fortlaufende Stereozentren aufgebaut. Bemerkenswert ist zudem der außerordentlich hohe Grad an Stereoselektivität, da von 16 möglichen Diastereomeren nur eines gebildet wird. Durch Variation der Aldehyd- und Enamidkomponente ließen sich insgesamt 23 verschiedene Tetrahydropyrane in guten bis sehr guten Ausbeuten und exzellenter Diastereoselektivitäten darstellen. Der Einsatz (Z)-konfigurierter Enamide erlaubte zudem die Synthese eines weiteren Diastereomers 262b, welches sich in der relativen Konfiguration an C5 von 262a unterscheidet.
Insgesamt zeigen die in dieser Arbeit entwickelten Reaktionen die enorme Anwendungsbreite von Enamiden in der stereoselektiven Synthese. So konnten in einfach durchführbaren Transformationen aus simplen Startmaterialien bis zu fünf benachbarte stereogene Einheiten aufgebaut werden. Dabei zeigt die Vielfalt der erhaltenen Verbindungen gleichsam die unterschiedlichen Reaktionsmodi der Enamideinheit 29 (siehe Kapitel 1.2). Daher werden, besonders bei der Entwicklung neuer Synthesemethoden für acyclische, stickstoffhaltige Verbindungen mit mehreren fortlaufenden Stereozentren, Enamide auch in Zukunft noch ein interessantes Forschungsfeld bleiben.
Hintergrund: Die Komplexität einer medikamentösen Behandlung steigt mit der Anzahl der Medikamente, der Einzeldosen und der Darreichungsformen und bedroht dadurch die Adhärenz der Patienten. Patienten mit Multimorbidität benötigen oft flexible, individualisierte Behandlungsschemata. Häufige Medikationsänderungen im Verlauf der Behandlung können jedoch die Komplexität einer Therapie weiter erhöhen.
Ziel: Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, Medikationsveränderungen bei älteren Patienten mit Multimorbidität und Multimedikation in der hausärztlichen Praxis zu beschreiben und deren Abhängigkeit von soziodemographischen und weiteren Merkmalen zu untersuchen. Zudem sollten die Medikationsveränderungen in den Daten der cluster-randomisierten kontrollierten PRIMUM-Studie (Priorisierung der MUltimedication in Multimorbidity) analysiert werden, um Effekte der komplexen PRIMUM-Intervention zu untersuchen und damit einen Beitrag zur Prozessevaluation zu leisten.
Methoden: In der vorliegenden Arbeit wurden Daten der PRIMUM-Studie, die in 72 Allgemeinpraxen durchgeführt wurde, retrospektiv analysiert. Dazu wurde ein Algorithmus entwickelt, der die Wirkstoffe, die Wirkstärke, die Dosierung und die Darreichungsform zur Beurteilung von Änderungen an der von Ärzten berichteten Medikationsdaten während zweier Intervalle (Basiswert bis sechs Monate: Δ1; sechs bis neun Monate: Δ2) untersucht. Diese Veränderungen wurden auf Verordnungs- und Patientenebene deskriptiv sowie auf die Assoziation zu soziodemographischen und Versorgungsmerkmalen uni- und multivariat analysiert und auf Interventionswirkungen überprüft.
Ergebnisse: Von 502 Patienten (im Durchschnitt 72 Jahre, 52% weiblich) beendeten 464 die Studie. Medikationsveränderungen traten bei 98,6% der Patienten auf. Die maximale Anzahl an Medikationsänderungen pro Patient betrug 21 in Δ1 und 20 in Δ2. Die Gesamtzahl der Medikamente pro Patient blieb dabei weitgehend konstant und betrug im Median zu allen drei Messzeitpunkten 8 (IQR an T0 und IQR an T1: 6-9 und IQR an T2: 6-10). Änderungen bezogen auf den Wirkstoff während Δ1 und Δ2 traten bei 414 (82,5%) und 338 (67,3%) Patienten auf, Dosierungsänderungen bei 372 (74,1%) und 296 (59,2%) und in der Wirkstärke bei 158 (31,5%) bzw. 138 (27,5%). Die Darreichungsform wurde bei 79 (16%) der Patienten sowohl in Δ1 als auch in Δ2 geändert. Simvastatin, Ramipril, Metformin und Aspirin waren am häufigsten von Veränderungen betroffen. Am häufigsten verordnet waren ASS, Metoprolol und Bisoprolol sowie Simvastatin. Medikationsänderungen traten häufiger nach vorhergehenden Aufenthalten im Krankenhaus auf und Dosisreduktion war bei männlichen Patienten häufiger zu verzeichnen. In der Interventionsgruppe waren Medikationsänderungen um 19% wahrscheinlicher. Insbesondere waren Dosisreduktionen und das Ansetzen von neuen Medikamenten in der Interventionsgruppe signifikant häufiger.
Schlussfolgerungen: Bei älteren Patienten mit Multimedikation und Multimorbidität wurden die Therapiepläne häufig geändert. Auf Verordnungsebene ist dies hauptsächlich auf Absetzen und Dosisanpassungen zurückzuführen, gefolgt von Ansetzen und Wiederansetzen von Medikamenten. Dies kann die (longitudinale) Komplexität der Medikation für Patienten erhöhen und ggf. nachteilige Folgen für Therapieadhärenz und Arzneimitteltherapiesicherheit haben. Zudem wird deutlich, dass die medikamentöse Verordnungsqualität in querschnittlichen Erhebungen nicht zuverlässig beurteilt werden kann. In der PRIMUM-Studie wurden häufiger Änderungen in der Interventions- gegenüber der Kontrollgruppe vorgenommen - hauptsächlich das Ansetzen neuer Medikamente und Dosisreduktion. Damit konnten Effekte der komplexen Intervention gezeigt werden, die im Einklang mit den Zielen der Intervention zur Optimierung von Multimedikation steht.
Natural science is only just beginning to understand the complex processes surrounding transcription. Epitranscriptional regulation is in large parts conveyed by transcription factors (TFs) and two recently discovered small RNA (smRNA) species: microRNAs (miRNAs) and transfer RNA fragments (tRFs). As opposed to the fairly well-characterised function of TFs in shaping the phenotype of the cell, the effects and mechanism of action of smRNA species is less well understood. In particular, the multi-levelled combinatorial interaction (many-to-many) of smRNAs presents new challenges to molecular biology. This dissertation contributes to the study of smRNA dynamics in mammalian cells in several ways, which are presented in three main chapters.
I) The exhaustive analysis of the many-to-many network of smRNA regulation is reliant on bioinformatic support. Here, I describe the development of an integrative database capable of fast and efficient computation of complex multi-levelled transcriptional interactions, named miRNeo. This infrastructure is then applied to two use cases. II) To elucidate smRNA dynamics of cholinergic systems and their relevance to psychiatric disease, an integrative transcriptomics analysis is performed on patient brain sample data, single-cell sequencing data, and two closely related in vitro human cholinergic cellular models reflecting male and female phenotypes. III) The dynamics between small and large RNA transcripts in the blood of stroke victims are analysed via a combination of sequencing, analysis of sorted blood cell populations, and bioinformatic methods based on the miRNeo infrastructure. Particularly, importance and practicality of smRNA:TF:gene feedforward loops are assessed.
In both analytic scenarios, I identify the most pertinent regulators of disease-relevant processes and biological pathways implicated in either pathogenesis or responses to the disease. While the examples described in chapters three and four of this dissertation are disease-specific applications of miRNeo, the database and methods described have been developed to be applicable to the whole genome and all known smRNAs.
The p38α mitogen-activated protein kinase (MAPK) is activated through stress stimuli such as heat shock or hypoxia. In the nucleus, p38α modulates the activity of other kinases and transcription factors, a process that regulates the expression of specific target genes, most importantly pro-inflammatory cytokines. Dysregulation of p38α therefore plays a major role in the development of inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis. Despite many years of intensive research, no p38 small-molecule inhibitors have been approved yet. Several inhibitor design strategies have been reported, leading to >100-fold selective compounds for α/β over the γ and δ isoforms. Achieving such a selectivity among the two structurally most related α and β isoforms, however, remains a challenging task. Targeting an inactive DFG-out conformation offers another strategy for the development of potent kinase inhibitors (type-II), exemplified by the BCR/ABL-inhibitor Imatinib. Achieving selectivity with type-II binders is challenging, because many kinases can adopt an inactive DFG-out conformation. This is exemplified by the p38 type-II inhibitor BIRB-796, which exhibits picomolar on-target affinity but only a poor kinome-wide selectivity. A potent and selective type-II chemical probe for p38α/β was still lacking at the start of this thesis.
The promising hit VPC-00628, was chosen for a combinatorial synthetic approach to develop a type-II chemical probe. The studies covered the optimization of the hinge-binding head group, the hydrophobic region I and the DFG-out deep pocket of the lead compound VPC-00628. Selectivity for the p38α and p38β isoforms was monitored during the optimization process, which identified several inhibitors with favorable isoform selectivity, providing valuable insights into the potential of isoform-selective inhibitor design for p38. A potent and highly selective p38 MAPK probe (SR-318) was discovered, which showed IC50 values in the low nanomolar range in HEK293T cells. An unusual P-loop conformation induced upon binding of SR-318 to p38α contributed most likely to the impressive selectivity profile within the kinome that surpassed both the parent compound and BIRB-796. A negative control compound, SR-321, was developed, to distinguish between on-target effects and non-specific effects due to cross-reactivity with other cellular proteins. Studies of the metabolic stability in human liver microsomes revealed a high stability of the compounds, with only a small amount of metabolites formed over several hours. Compound SR-318 also exhibited a good in vitro efficacy, quantitatively reducing the LPS-stimulated TNF-α release in whole blood. Taken together, SR-318 is a highly potent and selective type-II p38α/β chemical probe, which will help to gain a better understanding of the catalytic and non-catalytic functions of these key signaling kinases in physiology and pathology.
The next studies focused on the exploration of the highly dynamic allosteric back pocket of p38 MAPK, and allosteric BIRB-796 derived compounds for targeting the αC- and DFG-out pockets were synthesized. Kinase activities of allosteric pyrazole-urea fragments were analyzed against a comprehensive set of 47 diverse kinases by differential scanning fluorimetry (DSF), revealing that BIRB-796 off-targets remain a problem when targeting this back-pocket binding motif. Revisiting the recently published compound MCP-081, which combines the allosteric part of BIRB-796 with the active-site directed part of VPC-00628, showed that it displays a clean selectivity profile in our kinase panel. Because the potency of MCP-081 was slightly reduced compared with VPC-00628 and the allosteric tert-butyl pyrazole moiety seemed suboptimal, a set of VPC-00628 derivatives for targeting the αC-out pocket region was synthesized. Through structure-guided extension of the terminal amide of VPC-00628 toward this allosteric site, the potent and selective compound SR-43 was developed, which showed excellent cellular activity on p38 MAPK in NanoBRETTM assays (IC50 [p38α/β] = 14.0 ± 0.1/ 16.8 ± 0.1 nM). SR-43 showed a dose-dependent inhibition of activating phosphorylation of p38 in HCT-15 cells as well as inhibition of phosphorylation of p38 downstream substrates MK2 and Hsp27. In addition, SR-43 induced an anti-inflammatory response by blocking TNF-α release in whole blood and displayed a high metabolic stability. Selectivity profiling of SR-43 revealed a narrow selectivity for additional targets such as the discoidin domain receptor kinases (DDR1/2). DDR kinases play a central role in fibrotic disorders, such as renal and pulmonale fibrosis, atherosclerosis and different forms of cancer. Since selective and potent inhibitors for these important therapeutic targets are largely lacking and the existing inhibitors are of low scaffold diversity, the next study focused on the optimization of SR-43 toward DDR1/2 kinase inhibition. The synthetic work covered the optimization of the hinge-binding head group and the allosteric part of SR-43 toward DDR1/2 kinase inhibition. These studies provided novel insights into the P-loop folding process of p38 MAPK and how targeting of non-conserved amino acids affects inhibitor selectivity. Importantly, they led to the development of a selective dual DDR/p38 inhibitor probe, SR-302, with picomolar affinity for DDR2. SR-302 was efficient in vitro and showed a destabilizing effect on the surface adhesion protein E-cadherin in epithelial cells. In summary, SR-302 and its negative control SR-301 provide a valuable tool set for studying the phenotypic effects of DDR1/2 signaling, e.g., in cancer cell lines.
Während meiner Promotion habe ich zwei Projekte unter der Aufsicht von Dr. Misha Kudryashev durchgeführt. Im ersten Projekt habe ich die Strukturen des Ryanodinrezeptors 1 (RyR1) in Apo- und Ryanodin-Bindungszuständen in der nativen Membran durch Tomographie und Subtomogramm-Mittelung bei 12,6 bzw. 17,5 Å bestimmt. Im Vergleich zur Struktur von gereinigtem RyR1 unter Verwendung der Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) können zusätzliche Dichten in der cytoplasmatischen Domäne und der sarkoplasmatischen Retikulum (SR)-Membran bzw. im SR-Lumen beobachtet werden. Die Auflösung der Struktur von RyR1 im Apo-Zustand wurde von den Kollegen in meinem Labor mithilfe der Hybridmethode auf 9,5 Å verbessert. Diese Arbeit hat unser Verständnis für die Mechanismen von RyR1 in nativen Membranen erweitert. Im zweiten Projekt habe ich die Struktur des Proteins SdeC der SidE-Familie durch Einzelpartikel-Kryo-EM bei 4,6 Å bestimmt. Die Kristallstruktur des C-Terminus von SdeA wurde von meinem Forschungspartner Dr. Mohit Misra gelöst. Durch Überlagerung einer gemeinsamen Helix dieser beiden Strukturen konnten wir ein kombiniertes Modell erstellen und ein allgemeines Verständnis der Proteine der SidE-Familie erhalten.