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Neben den Phytocannabinoiden und synthetischen Cannabinoiden exisitieren bei Säugetieren und Menschen endogene Cannabinoide (EC). Diese lipophilen Signalstoffe sind vorwiegend im ZNS und Immunsystem aktiv. Heute werden den EC vermehrt neuroprotektive Eigenschaften zugewiesen. Mit den Cannabinoid (CB)1- und -2-Rezeptoren wurden bisher zwei dem endogenen Cannabinoidsystem (ECS) zugehörige Rezeptoren kloniert. Pharmakologische Untersuchungen an CB1- und -2-Rezeptor defizienten Mäusen weisen jedoch auf noch weitere bisher nicht klonierte Rezeptoren hin. Zu den bekanntesten im ZNS selbst synthetisierten und gezielt freigesetzten Liganden für die CB Rezeptoren zählen Arachidonylethanolamin (AEA), 2-Arachidonylglycerin (2-AG) und Palmitylethanolamin (PEA). Deren Mengen steigen z.B. nach einer traumatischen Schädigung deutlich an. Die postulierte Neuroprotektion der EC erfolgt wahrscheinlich über eine Reduktion der glutamatergen Neurotransmission. Darüber hinaus kommt es auch in Mikrogliazellen und Astrozyten zur Cannabinoid induzierten Aktivierung intrazellulärer Signalkaskaden, wodurch Produktion und Freisetzung von proinflammatorischen Substanzen wie TNF-alpha vermindert werden. Im vorliegenden Projekt sollten die den Phytocannabinoiden (THC) und den EC zugewiesenen neuroprotektiven Eigenschaften am Modellsystem der organotypischen hippokampalen Schnittkultur (OHSC) nach einer exzitotoxischen Läsion vergleichend untersucht werden. Dazu wurden OHSC von 8 Tage alten Ratten hergestellt und durch Applikation von N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) exzitotoxisch geschädigt. Exzitotoxische Läsionen zeichnen sich durch einen massiven Neuronenverlust sowie durch die Aktivierung von Mikrogliazellen und Astrozyten aus. Die Anzahl der zerstörten Körnerzellen im Gyrus dentatus (GD) des Hippokampus wurde als Maß für die Bestimmung des neuronalen Schadens angesehen. Weiterhin wurde die Anzahl der aktivierten Mikrogliazellen im Bereich der Körnerzellschicht quantitativ bestimmt. Dann sollte geprüft werden, ob die eingesetzten Cannabinoide die Anzahl aktivierter Mikrogliazellen reduzieren und ob sich eine Reduktion der Mikrogliazellen positiv auf das Überleben der Neurone auswirkt. Ungeschädigte und NMDA geschädigte OHSC wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von THC, AEA, 2-AG oder PEA behandelt. Durch Zugabe von Propidiumiodid (PI) wurden die degenerierten Neurone markiert (PI+-Neurone). Mit Hilfe von FITC-konjugiertem Griffonia simplicifolia Isolektin B4 (IB4+) wurden die Mikrogliazellen dargestellt und die OHSC abschließend mit einem konfokalen Laserscanning Mikroskop analysiert. Es folgten weitere Versuche, bei denen verschiedene synthetische Agonisten/Antagonisten von CB-Rezeptoren verwendet wurden, um die möglicherweise an neuroprotektiven Prozessen beteiligten CB-Rezeptoren zu identifizieren. Um die mögliche Beteiligung des CB1- und -2-Rezeptors zu beleuchten, kamen die Antagonisten AM251 und AM630 zum Einsatz. Die Beteiligung von bisher nur pharmakologisch identifizierten CB-Rezeptoren, wie dem WIN- oder dem abnormalen (abn) Cannabidiol-Rezeptor, wurde mit Hilfe des Agonisten WIN und des Antagonisten Capsazepin für den WIN-Rezeptor, oder, im Falle des abn Cannabidiol Rezeptors, mit Hilfe der Agonisten abn Cannabidiol und 2-AG sowie der Antagonisten O-1918 und Cannabidiol untersucht. In ungeschädigten OHSC waren in der KZS des GD nahezu keine PI+-Neurone und nur sehr wenige IB4+-, ramifizierte Mikrogliazellen nachweisbar. Nach NMDA-Schädigung stieg die Zahl der PI+-Neurone und der IB4+-, amöboiden Mikrogliazellen massiv an. Die aktivierten Mikrogliazellen akkumulierten vorwiegend an Stellen höchster neuronaler Schädigung. Im Vergleich zu ausschließlich mit NMDA-behandelten OHSC verursachte das Phytocannabinoid THC eine konzentrationsabhängige numerische Reduktion der IB4+-Mikrogliazellen. Die Anzahl der PI+-Neurone wurde hingegen nicht beeinflusst. Alle verwendeten Endocannabinoide (AEA, 2-AG, PEA) reduzierten die Anzahl der IB4+-Mikrogliazellen. Darüber hinaus war die Zahl der PI+-Neurone nach Gabe von 2-AG und PEA im Sinne eines neuroprotektiven Effektes deutlich vermindert, wohingegen AEA keine neuroprotektiven Eigenschaften besaß. Die synthetischen CB-Rezeptor-Agonisten WIN und abn Cannabidiol reduzierten die Anzahl der IB4+-Mikrogliazellen und PI+-Neurone ebenfalls deutlich. Der Einsatz der oben beschriebenen Antagonisten ergab, dass die THC-induzierte Reduktion der IB4+-Mikrogliazellen durch den CB2-Rezeptor Antagonisten AM630 aufgehoben wurde, was auf eine Beteiligung des CB2-Rezeptors hindeutet. Die 2-AG-induzierte Reduktion der IB4+-Mikrogliazellen wurde durch die abn-Cannabidiol-Rezeptor-Antagonisten O-1918 und Cannabidiol gehemmt. Der 2-AG vermittelte neuroprotektive Effekt wurde ebenfalls durch O-1918 und Cannabidiol aufgehoben. Beide Antagonisten hoben auch die abn-Cannabidiol-induzierte Reduktion der IB4+-Mikrogliazellen und die abn-Cannabidiol-induzierte Neuroprotektion auf. Die am Modellsystem der OHSC durchgeführten Versuche zeigen deutlich, dass die verwendeten Cannabinoide nach einer exzitotoxischen Schädigung einen unterschiedlichen Einfluss auf die Anzahl aktivierter Mikrogliazellen und die Zahl degenerierender Neurone ausüben. Sie belegen ferner, dass eine Reduktion der Anzahl aktivierter Mikrogliazellen sich nicht per se neuroprotektiv auszuwirken scheint. Daher ist festzustellen, dass ein Zusammenspiel verschiedenartiger CB-Rezeptortypen auf der einen und unterschiedlicher Zelltypen auf der anderen Seite beim Mechanismus der Neuroprotektion stattfindet. In unseren Untersuchungen erwiesen sich THC und AEA als nicht neuroprotektiv, obwohl für beide Substanzen in der Literatur solche Effekte unter In-vivo-Bedingungen beschrieben wurden. Die Diskrepanz zwischen 2-AG und PEA auf der einen Seite und AEA und THC auf der anderen Seite in unserem Modellsystem ließe sich eventuell dadurch erklären, dass in der OHSC keine immunkompetenten Blutzellen vorhanden sind, die möglicherweise ein wichtiges Element im Zusammenspiel verschiedener Zelltypen bei der Neuroprotektion unter In- vivo-Bedingungen darstellen. Um diese Hypothese zu überprüfen, haben wir OHSC mit isolierten Milzmakrophagen inkubiert, um so aus der Blutbahn einwandernde immunkompetente Zellen zu simulieren. Die Ergebnisse dieser Experimente belegen, dass Milzmakrophagen tatsächlich zum Ort höchster neuronaler Schädigung in der OHSC migrieren und bei Anwesenheit dieser Milzkakrophagen sowohl AEA als auch THC neuroprotektiv sind. Schließlich wurde mit primären Kulturen von Mikroglialzellen und Astrozyten untersucht, ob Cannabinoide die Lipopolysaccharid (LPS) induzierte Freisetzung von proinflammatorischen Substanzen beeinflussen. Diesbezüglich wurde die Konzentrationen des Zytokins TNF-alpha im Kulturüberstand mittels ELISA bestimmt. Es zeigte sich, dass die eingesetzten Cannabinoide die Freisetzung von TNF-alpha äußerst differenziert regulieren. Zusammenfassend ist festzustellen, dass in der vorliegenden Arbeit interessante und neue Befunde zur neuroprotektiven Wirkung von Cannabinoiden erhoben wurden. Diese Daten werden sicherlich eine breite Ausgangsbasis für zukünftige Untersuchungen bieten, in denen die weitere Analyse des komplexen Zusammenspiels zwischen verschiedenen CB-Rezeptoren und unterschiedlichen Zelltypen des ZNS bei der Cannabinoid-vermittelten Neuroprotektion erfolgen wird.
The rate of species extinctions due to anthropogenic activities has dramatically increased within the past few centuries (Dirzo & Raven, 2003; Novacek & Cleland, 2001). Although the mechanisms and ultimate causes leading to the extinction of species remain largely unclear (Frankham et al., 2002), five threats to global biodiversity have frequently been referred to as the most important: habitat destruction and fragmentation, global climate change, hunting and overuse of food resources, biological invasions and environmental pollution (Dudgeon et al., 2006; Lewis, 2006; Novacek & Cleland, 2001). Different research fields, as conservation biology, ecology and ecotoxicology, investigate the effects of these factors on organisms and found strong evidence for their negative impact on regional and global biodiversity.
In most cases, natural populations will be impacted not only by one threat, but rather a combination of them (Buckley & Roughgarden, 2004; Kappelle et al., 1999). Multiple environmental stress factors can have cumulative negative effects on the survival of populations (Sih et al., 2004). To understand, how natural populations respond to combinations of different stress factors is thus of crucial importance in order to understand our present and future impact on all scales of biodiversity (Warren et al., 2001).
The effects of anthropogenically introduced chemicals on organisms and ecosystems are investigated in the field of ecotoxicology. Research in this area has led to a large body of information concerning the impact of chemical stress on the fitness of model species in the laboratory. In contrast to this, there is an obvious lack of knowledge on the effects of contaminants on natural populations and communities (Bickham et al., 2000; Bourdeau et al., 1990). For instance, ecotoxicologists have just started to investigate the impact of environmental pollution on the genetic variability of natural populations (Bickham et al., 2000; Whitehead et al., 2003). Genetic variation provides the raw material for populations in order to adapt to changing environmental conditions and is thus the substrate for evolution and long-term survival of populations and species (Frankham, 2005). The amount of genetic variation in populations is positively correlated with the effective population size (Frankham, 1996). Habitat destruction and fragmentation has divided the ranges of many species into small and isolated refuges. Without migration from adjacent habitats, isolated populations will decrease in their level of genetic diversity through random loss of alleles (Hedrick, 2000). Frankham (1995) for instance, showed that 32 of the 37 endangered species (which occur in small populations per definition) of different animals and plant taxa display reduced levels of heterozygosity compared to closely related and more frequent species.
In strongly human impacted landscapes, both factors, environmental pollution and habitat destruction, can be expected to occur frequently together. It is thus of crucial importance to investigate the impact of reduced genetic diversity and inbreeding on the response to chemical stress. In addition, chemical exposure has frequently been discussed to have an impact on the extent of genetic variability in exposed populations (Guttman, 1994; Staton et al., 2001; van Straalen & Timmermans, 2002). However, evidence for this 'genetic erosion hypothesis' remained scarce to date, most likely because of the difficulty to single out the impact of pollution stress from a background of multiple factors which influence patterns of genetic variability in natural populations (Belfiore, 2001; Staton et al., 2001; van Straalen & Timmermans, 2002).
Präklinische Untersuchungen zur Gentherapie der HIV-Infektion mit dem retroviralen Vektor M87o
(2007)
Mit der Einführung der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) 1995 wandelte sich die HIV-Infektion in den Industrieländern von einer akut lebensbedrohlichen zu einer chronisch verlaufenden und scheinbar gut kontrollierten Erkrankung. Das Virus wird allerdings nie vollständig aus dem Körper eliminiert, sodass die Betroffenen zeitlebens Medikamente einnehmen müssen. Die Langzeit-Medikation wird häufig von schweren Nebenwirkungen begleitet, führt zur Selektion resistenter Viren und muss häufig umgestellt werden. Gentherapeutische Verfahren, die die CD4+ Zielzellen durch die Expression antiviraler Gene vor der Infektion durch HIV schützen („intrazelluläre Immunisierung“), stellen viel versprechende Therapiealternativen dar. Der in der Arbeitsgruppe von Laer entwickelte retrovirale Vektor M87o (EGELHOFER et al. 2004, EGELHOFER 2004) exprimiert das 46 Aminosäuren lange membran-verankerte Peptid C46, das in der Lage ist, die gp41-vermittelte Fusion von Virus- und Zellmembran zu inhibieren. In Zelllinien und primären Lymphozyten konnte gezeigt werden, dass M87o die Infektion durch unterschiedliche HIV-Isolate sehr effektiv verhindert. Im Rahmen vorklinischer Untersuchungen konnte in vitro gezeigt werden, dass die retrovirale Transduktion mit M87o das Transformationsrisiko und damit das Risiko der Entstehung von Neoplasien nicht steigert. An primären peripheren T-Zellen konnte zeigt werden, dass M87o die Zielzellen weder phänotypische noch funktionelle verändert. Für die Untersuchung der retroviralen Gentherapie im Rhesusaffenmodell wurde zunächst ein Gentransferprotokoll für periphere Affenlymphozyten entwickelt, mit dem in Vorversuchen Gentransferraten von ca. 50% erreicht werden konnten. Das Transduktionsprotokoll wurde anschließend im Rahmen einer präklinischen Studie zur Toxizität und Immunogenität der M87o-Gentherapie, bei der Herstellung zweier Studientransplantate angewandt. Beide Zellpräparate wurden den Versuchstieren transplantiert. Während des Eingriffs traten keine akuttoxischen Reaktionen auf. M87o+-Zellen konnten bis 140 Tage nach der Transplantation mittels PCR nachgewiesen werden. Immunologische Untersuchungen (Cytokinfärbung, Proliferationsassay, ELISPOT) ergaben keine Hinweise auf zelluläre oder humorale Immunreaktionen. M87o-spezifische Antikörper waren im Serum nicht nachweisbar. Für die Durchführung einer klinischen Studie zur Toxizität und Wirksamkeit (Phase I/II) an HIV-infizierten Probanden wurde ein Protokoll zur Produktion M87o-modifizierter T-Zellen (mindestens 5 × 108 M87o+ CD4-T-Zellen pro Spender) entwickelt. In die klinische Prüfung wurden Patienten aufgenommen, die nach multiplem Therapieversagen durch das Auftreten multiresistenter HIV eine CD4-Zellzahl von 50 bis 200 µl-1 Blut, sowie eine Viruslast von >5.000 Kopien ml-1 Blut aufwiesen. Im Versuchsmaßstab konnte ein Transduktionsprotokoll erarbeitet werden, mit dem im Mittel 46% der CD4+ T-Zellen mit M87o transduziert werden konnten. Innerhalb von 10 Tagen expandierte die Zellzahl im Mittel um den Faktor 153, wobei die HIV-Replikation vollständig inhibiert wurde. Das Protokoll wurde erfolgreich vom Versuchsmaßstab in den klinisch relevanten Produktionsmaßstab übersetzt. In drei Versuchsläufen wurde im Mittel eine Transduktionsrate von 29% erreicht und die Zellzahl um den Faktor 44 vermehrt. Der Anteil an CD3+/CD4+ Zellen an der Gesamtpopulation lag im Mittel bei 91%. Insgesamt konnten mit dem etablierten Protokoll durchschnittlich 2,3 × 109 CD3+/CD4+/M87o+ Zellen, bei gleichzeitig vollständiger Inhibition der HIV-Replikation, generiert werden. Im Rahmen einer klinischen Studie zur Toxizität und Wirksamkeit der M87o-Gentherapie wurden 10 Studientransplantate gemäß dem im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Protokoll hergestellt. Alle Transplantate wurden am Universitäts-Krankenhaus Eppendorf in Hamburg transfundiert und von den Patienten sehr gut vertragen.
Die vorliegende Arbeit fasst folgende experimentellen Arbeiten zusammen: • Synthese von amorphem, schwarzem, basischem Silicium Si am,schw,ox und amorphem, schwarzem, nicht basischem Silicium Siam,schw durch Reduktionsreaktion von Siliciumtetrachlorid mit Natrium. • Reaktivität des amorphen Siliciums Si am gegenüber verschiedenen Gasen: Cl2, HCl, CH3Cl • Reaktivität von Si am gegenüber Alkoholen bei Raumtemperatur. • Reaktivität von Si am gegenüber Alkoholen und Essigsäure in einem geschlossenen System, nicht katalysiert/katalysiert durch Cu(I)Cl und Cu(I)O. • Reaktivität von Si am,schw,ox und Si am,schw gegenüber Alkoholen und Essigsäure in einem offenen System (Ofen, „slurry phase“-Reaktor), nicht katalysiert/katalysiert durch Cu(I)Cl und Cu(I)O. • Thermische und katalytische Disproportionierungsreaktionen von Methylmethoxysilanen, katalysiert durch Alkalimetalle (Na), salzartige Verbindungen (Ca(OH)2, MgSO4/C, Na2SO4/C und (NH4)2SO4/C) und Lewis-Säuren (AlCl3). • Komproportionierung zwischen Trimethylmethoxysilan und Methyltrimethoxysilan Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag in Untersuchung der chemischen Reaktivität von amorphem Silicium Si am, synthetisiert durch Na-Reduktion von Siliciumtetrachlorid, gegenüber verschiedenen Gasen, wie z. B. Chlorgas, Chlorwasserstoff und Methylchlorid, gegenüber Alkoholen, wie z. B. Methanol, Ethanol und Phenol und gegenüber Essigsaure unter unterschiedlichen Reaktionsbedingungen. Die Reaktion zwischen amorphem Silicium Si am und Cl2-Gas führt bei 240-250°C zu Tetrachlorsilan SiCl4 als einziges Produkt. Die Reaktion mit HCl-Gas liefert im Temperaturbereich zwischen 360-370°C zwei Produkte: 15% Dichlorsilan, H2SiCl2 und 85% Trichlorsilan, HSiCl3. Im Temperaturbereich zwischen 370-420°C entstehen drei Produkte: 36,4% Dichlorsilan H2SiCl2, 58,5% Trichlorsilan HSiCl3 und 5,1% Tetrachlorsilan SiCl4. Über eine Temperaturführung kann die Produktbildung wesentlich beeinflusst und damit auch gesteuert werden. Durch eine Reaktion mit Methylchlorid bei 560°C entstehen zwei Produkte: 79% Methyltrichlorsilan CH3SiCl3 und 21% Dimetyldichlorsilan (CH3)2SiCl2. Basisches Silicium Siam,schw,ox liefert in den Reaktionen mit Alkoholen und Essigsäure unter Rückfluss-Bedingungen (Temperaturen zwischen 20 und 420°C; offene Reaktionssysteme) jeweils ein einziges Produkt und führt mit den korrespondierenden Partnern selektiv zu Tetramethoxy-, Tetraethoxy-, Tetraphenoxy- und Tetraacetoxysilan. Diese Reaktionen werden durch die im eingesetzten Siam/NaCl-Gemisch vorhandene Base (NaOH, Na2Ox; x = 1, 2) katalysiert. Gemischte Alkylalkoxysilane oder Siloxane entstehen unter den vorgegebenen Bedingungen nicht. Silicium setzt sich dabei in den Reaktionen mit Methanol und Ethanol vollständig um. Werden die Bedingungen modifiziert und die Reaktionen in geschlossenen Systemen (Reaktionsampullen) bei 150°C, katalysiert durch 5 Gew. % Cu(I)Cl im Mol-Verhältnis Si am,schw,ox/CH3OH 1:3 und 1:4 durchgeführt, wird Trimethoxysilan in 91% und 84% Ausbeute gewonnen. Der Produktbildungsweg führt offensichtlich über die Katalyse eines Komplexes Na+[Cu(OH)Cl]-, der in situ aus Cu(I)Cl und NaOH gebildet wird. Nicht basisches Silicium, Siam,schw, reagiert mit Methanol bei Raumtemperatur zu Trimethoxysilan HSi(OCH3)3 (16-18%) und zu Tetramethoxysilan Si(OCH3)4 (84-82%). Die Produktbildung kann durch Änderungen Reaktionsbedingungen in Richtung von Trimethoxysilan verschoben werden. So entsteht Trimethoxysilan in einer geschlossenen Ampulle zu 95% als Hauptprodukt der Reaktion zwischen amorphem Silicium und Methanol im Mol-Verhältnis 1:3 in Anwesenheit von NH4HF2 als Aktivator. 84,5% Trimethoxysilan entstehen in einer Ampulle bei 200°C nach 5 Stunden Reaktionszeit, dann wenn Methanol im stöchiometrischen Verhältnis 8:1 eingesetzt wird. Der Umsatz an Silicium ist praktisch vollständig (100%). Wird die Reaktion zwischen Siam,schw und Methanol in einem „slurry phase“-Reaktor durchgeführt, resultiert eine Abhängigkeit der Produktausbeute vor allem vom Lösungsmittel, dann aber auch von den weiteren Bedingungen. In Dodecylbenzol entsteht das Trimethoxysilan bei 230°C und mit Cu(I)O als Katalysator zu 72% in einer 8-stündigen Reaktion. Unter vergleichbaren Bedingungen, aber in Isoparaffinöl bildet sich Trimethoxysilan zu 61%. In einem modifizierten „slurry phase“-Reaktor, in dem die Produkte mit überschüssigem Methanol sofort aus der Reaktion abgeführt werden, entsteht das Trimethoxysilan nicht. Allerdings bilden sich in diesem Fall methylierte Methoxysilane. Der Umsatz an Silicium hängt auch von der Temperatur des Methanol-Dampfes ab. Wird die Temperatur zwischen 150-200°C gehalten, werden 49% des Siliciums umgesetzt. Ansonsten beträgt die Umsatzrate des Siliciums 20-25%. Amorphes, schwarzes, basenfreies Silicium, Si am,schw, reagiert bei 150°C mit Ethanol im Mol-Verhältnis 1:3 zu 91% und bei 200°C (Mol-Verhältnis Si : EtOH 1:8) zu 86% Triethoxysilan, HSi(OEt)3. Die Reaktion zwischen nicht basischem Silicium Si am,schw und Essigsäure liefert in der Siedehitze kein Tetraacethoxasilan, sondern nur Polyacethoxysilane mit einem Polymerisationsgrad von n = 2, 3, in einer Ampulle bildet sich jedoch ein Gemisch aus Tetraacetoxysilan und verschiedenen Acethoxypolysilanen. Die Polysilanbildung verstärkt sich mit zunehmender Reaktionstemperatur und –dauer. Die Reaktion zwischen Si am,schw und Essigsäure in einem offenen System (Ofen) liefert bei 300°C außer Tetraacetoxysilan ein Gemisch von Acethoxypolysilanen mit n=2-6. Versuche zur Bildung von Phenoxsilanen aus Si am,schw. und Phenol schlugen bei Temperaturen zwischen 150-300°C fehl. Das MALDI-TOF-MS-Spektrum einer bei 225-230°C im Vakuum siedenden Fraktion, die aus Reaktion von Si am,schw mit Phenol bei 420°C im Ofen entstanden ist, zeigt Spuren von Tetraphenoxysilan und organische Polymere mit dem Molekulargewichht bis zu 960 Dalton. Während Umsetzungen von amorphem Silicium mit Methanol in geschlossenen Reaktionsampullen Trimethoxysilan und Tetramethoxysilan als Hauptprodukte liefern, bilden sich in einem offenen System methylierte Methoxysilane MenSi(OMe)4-n (n=1, 2) in unterschiedlichen Ausbeuten. Dimethyldimethoxysilan entsteht aus basischem Silicium Siam,schw,ox nicht; selbst durch Katalysatorzusatz entsteht das gewünschte Produkt nur in Spuren. Die Monomethylierung verläuft dagegen erfolgreicher. Die höchste Ausbeute an Methyltrimethoxysilan (33,7%) wird bei 320°C mit 20 Gew. % Cu(I)Cl als Katalysator erzielt. Völlig anders verhält sich nicht basisches Silicium Si am,schw , denn es reagiert mit Methanol in einem offenen System bei 350°C zu 13% Dimethyldimethoxysilan (CH3)2Si(OCH3)2, und 37% Methyltrimethoxysilan CH3Si(OCH3)3. In Reaktionen mit größeren Silicium-Mengen (Si-Gehalt: 39-60 mmol) entstehen in einem nicht gerührten Reaktionsreaktor nach 20’ Minuten Reaktionszeit bei 300°C 26% Dimethyldimethoxysilan (CH3)2Si(OCH3)2 und nach 45’ Minuten Reaktionszeit 49,5% Methyltrimethoxysilan CH3Si(OCH3)3. In einem nicht gerührten Reaktionsrohr entstehen nach 3 Stunden Reaktionszeit 25-30% Dimethyldimethoxysilan bei 300°C und mit 20 Gew. % Kupfer(I)Chlorid als Katalysator. In einem gerührten Reaktionsrohr bilden sich bei 350°C und mit 20 Gew. % Cu(I)Cl nach 3-stündiger Reaktion 23,5% (CH3)2Si(OCH3)2 und 53,3% CH3Si(OCH3)3. Das Vorhandensein des Katalysators erhöht die Ausbeute an methylierten Methoxysilanen in den Reaktionen zwischen nicht basischem Silicium und Methanol. Aus dem Verlauf der Reaktion im Ofen lässt sich schließen, dass die größte Menge des Dimethyldimethoxysilans, (CH3)2Si(OCH3)2, während der ersten 20-40 Minuten entsteht. Danach sinkt der Anteil mit zunehmender Reaktionszeit, es bilden sich verstärkt die festen Dimethyloligosiloxane. Die Ausbeute an Tetramethoxysilan, Si(OCH3)4, wächst mit der Reaktionszeit kontinuierlich. Dagegen bleibt die Ausbeute an Methyltrimethoxysilan, CH3Si(OCH3)3, während 3-stündiger Reaktion relativ konstant. Die Bildung aller drei Produkte wurde zwischen 300° und 350°C detailliert verfolgt. Nur ca. 20% des Siliciums setzen sich zu den flüchtigen Produkten um, rund 80% Silicium bleiben in fester Form als nicht abreagiertes Silicium und als feste Oligodimethylsiloxane erhalten. Eine nicht katalysierte Reaktion zwischen Si am,schw und Ethanol liefert nach 3h Reaktionszeit in einem nicht rührenden Reaktor etwa 23% HSi(OCH3)3 und etwa 72% Si(OEt)4. Etylenethoxysilane oder -siloxsane bilden sich nicht. Zum Weiteren ist es gelungen, Dimethyldimethoxysilan durch Disproportionierungsreaktion aus Methyltrimethoxysilan und Tetramethoxysilan über metallischem Natrium im Mol-Verhältnis 1:1 in einer Ampulle bei 250°C herzustellen. Aus Disproportionierung von Methyltrimethoxysilan sind 12% Dimethyldimethoxysilan zu erhalten. Die Disproportionierung von Tetramethoxysilan führt zu 27% Dimethyldimethoxysilan, (CH3)2Si(OCH3)2, 34% Methyltrimethoxysilan, CH3Si(OCH3)3, und 11% Trimethylmethoxysilan, (CH3)3SiOCH3. Die Menge des eingesetzten Natriums muss in weiteren Arbeiten noch optimiert werden. Eine Komproportionierungsreaktion zwischen Trimethylmethoxysilan, (CH3)3SiOCH3, und Methyltrimethoxysilan, CH3Si(OCH3)3, zu Dimethyldimethoxysilan, (CH3)2Si(OCH3)2, fand unter den in dieser Arbeit beschriebenen Bedingungen nicht statt. Diese Ergebnisse sind ein im Labormaßstab chlorfreies Verfahren zur Herstellung von methylierten Methoxysilanen. Unter der Voranstellung der Aufskalierbarkeit wird damit eine neue Route eines möglicherweise technisches Prozesses (das Q-Verfahren) zu Darstellung von Siliconen zugänglich; diese führt wie folgt aus: Siliciumtetrachlorid → amorphes Silicium → Tetramethoxysilan/Tetraethoxysilan/Tetraacetoxysilan → Methylmethoxysilane → Silicone. Es gilt nun, die Synthesebedingungen nach erfolgreicher Optimierung in den Pilotmaßstab zu überführen. Die Synthese von Trimethoxysilan, HSi(OCH3)3, erscheint bereits jetzt schon den Bedingungen des technisch durchführenden Cromptonprozesses überlegt zu sein. Diese bietet jedoch den Vorteil, von technisch verfügbarem Silicium anzugehen. Eine exakte und vergleichende Prozess-Analyse wird darüber Aufschluss geben, ob die in dieser Arbeit erworbenen Ergebnisse zu einer technischen Umsetzung führen.
Physical soil properties feature high spatial variabilities which are known to affect geophysical measurements. However, these variations are not considered in most cases. The challenging task is to quantify the influence of soil heterogeneities on geophysical data. This question is analysed for DC resistivity and GPR measurements which are frequently used for near-surface explorations. To determine the pattern of electric soil properties in situ with the required high spatial resolution, geophysical measuring techniques are methodically enhanced. High-resolution dipole-dipole resistivity measurements are used to determine the electric conductivity distribution of the topsoil. Due to the small electrode separations, the actual electrode geometry has to be considered and an analytic expression for geometric factors is derived instead of assuming point electrodes. Two methods are used to determine soil permittivity with GPR:(i) the coefficient of reflection at the interface air-soil is measured with an air-launched horn antenna, (ii) the velocity of the groundwave is measured with a new setup using two receiver antennas enhancing the lateral resolution from in the best case 0.5 m for standard techniques to approximately 0.1 m with the new technique. With the optimised measuring techniques, the electric properties of sandy soils are determined in the field. Conductivity and permittivity show high spatial variability with correlation lengths of a few decimetres. Geostatistical simulation techniques are used to generate synthetic random media featuring the same statistical properties as in the field. FD calculations are carried out with this media to provide realistic synthetic data of resistivity and GPR measurements. Conductivity variations as determined in the field generate significant variations of simulated Schlumberger sounding curves resulting in uncertainties of the inverted models. Even in pedologically homogeneous sandy soil, moisture pattern and resulting permittivity variations cause strong GPR diffractions as demonstated by FD calculations. This influences the detectability of small objects such as e.g. landmines or of large reflectors as e.g. the groundwater table. Conductivity variations as typical for soils showed to have a minor effect on GPR measurements than variations of permittivity. In summary, geostatistical analysis and simulation provide a powerful tool to simulate geophysical measurements under field conditions including soil heterogeneity which can be used to quantify the uncertainty of field measurements by geologic noise.
Shaped by some of the most dramatic tectonic events of the Cenozoic, the parts of southern and eastern Asia that have become known as the Oriental faunal region comprise vast areas of great geological complexity and ecological diversity. One of the four major groups of terrestrial elapid snakes in this region is the genus Bungarus. These nocturnal and predominantly ophiophagous snakes are widely known as kraits and are an important cause of snakebite mortality throughout their wide range that extends from Afghanistan to Vietnam and eastern China, and south to the Indonesian islands of Java and Bali. Although present on Borneo, kraits have not been found on any island of the Philippines, nor on Lesser Sunda Islands east of Bali. Despite their medical significance and the great importance of Bungarus toxins as tools in neuropharmacology, krait systematics and taxonomy have remained largely unstudied. Twelve species of Bungarus were recognized at the beginning of the present study. Many of these are rare in collections, and most aspects of their biology are unknown. While some species are highly distinct, most kraits are conservative morphologically, rendering molecular methods invaluable for the study of their diversity and biogeography. This study is the first to address the relationships within Bungarus and the historical biogeography of kraits based on molecular evidence. I inferred phylogeographic relationships based on analyses of new nucleotide sequences of the entire mitochondrial cytochrome b gene of 51 kraits and partial NADH dehydrogenase subunit 4 sequences of 40 kraits which I analyzed together with a representative sample of 32 published elapid and non-elapid outgroup taxa using Bayesian, maximum-likelihood, maximum-parsimony and neighbor-joining methods. I then used the recovered phylogeny to investigate the evolution of selected morphological characters and, together with collections-based geographical distribution information, in dispersal-vicariance analyses with models of variable taxonomic and biogeographic complexity. The phylogenetic analyses demonstrate that the current taxonomy of kraits does not adequately represent either the relationships or the genetic diversity in this genus. In contrast, I identified monophyletic groups that are congruent with recognized biogeographic units as well as extensive ecomorph evolution and morphologically cryptic speciation. The following additional conclusions are collectively supported by the mitochondrial phylogeny and morphological as well as biochemical synapomorphies: (1) Kraits are monophyletic with respect to the remaining taxa of the Elapidae; (2) Bungarus flaviceps and Bungarus bungaroides form the monophyletic sister clade of a clade formed by B. fasciatus, black-and-white-banded, and uniformly black taxa; (3) the remaining taxa are divisible into two sister clades, the South Asian species (Bungarus sindanus (Bungarus caeruleus, Bungarus ceylonicus)) vs. Himalayan, Burmese, Southeast and East Asian taxa; (4) within the latter, Burmese taxa form the sister clade to Southeast and East Asian taxa; (5) the widespread and medically significant species Bungarus candidus and Bungarus multicinctus are paraphyletic. The results of this study highlight the importance of vicariant geological events and sea level fluctuations for the cladogenesis of kraits. Events of particular importance in the evolution of kraits include the uplift of the Indo-Burman ranges (Arakan-Naga Hills) which separated black-and-white banded kraits in India and Southeast Asia, and the uplift of mountain ranges in Yunnan, China (e.g., the Gaoligong Shan), which coincided with lineage separation in two distantly related clades of kraits. Alternating dispersal and vicariance events due to Pleistocene climatic and sea level changes have caused complex phylogeographic patterns in kraits in Southeast Asia. Zones of contact between closely related evolutionary lineages of the B. candidus complex are identified in Thailand, Vietnam, and southern China (Hainan). Within this complex, two main clades are revealed. One includes populations from the Southeast Asian mainland and is in contact with B. multicinctus in southern China. The other consists of populations from Thailand, southern Vietnam, Java, and Bali. The phylogeny as well as genetic distances suggest a scenario in which a Pleistocene southward dispersal of B. candidus to Sumatra, Java, and Bali during times of low sea levels was temporarily interrupted by vicariant events (rising sea levels, especially flooding of the Malacca Strait between Sumatra and the Malay Peninsula, and of the Bali Strait between Java and Bali). In this context, the close phylogenetic relationship between haplotypes from southern Vietnam and those from Java and Bali suggests that "southern" B. candidus dispersed directly via colonization of the widely receded South Chinese Sea, and not by taking a detour via the Malay Peninsula and Thailand, which were already inhabited by other populations of B. candidus. Using these phylogenetic estimates as the framework for a study on the diversity and evolution of krait venom components, I applied biochemical and molecular genetic approaches to identify and quantify polypeptide and protein toxins in krait venom, focusing on the distribution and molecular evolution of alpha-bungarotoxin, an irreversible competitive antagonist of nicotinic acetylcholine receptors with an exceptionally high applied significance as a receptor probe. I was specifically interested in the medically relevant question of intraspecific and interspecific variability in toxin diversity, and whether receptor-binding postsynaptic toxins evolve at rates different from those of presynaptic neurotoxins like beta-bungarotoxin, which act by destroying the nerve terminal and are believed to exhibit hypervariable functional diversification due to an accelerated mode of molecular evolution. In the context of this question, I isolated and purified the major lethal neurotoxins from B. candidus venoms by sequential steps of liquid chromatography for structural and functional characterization studies. Cloning and sequence analysis of toxin-coding genomic DNAs showed that the gene encoding the alpha-bungarotoxin alanine-31 variant, originally isolated from B. multicinctus venom, is widely present and highly conserved in multiple populations of B. candidus and is expressed as the principal postsynaptic neurotoxin at least in Javan B. candidus. In addition to the widespread presence of genomic DNAs encoding the alpha-bungarotoxin alanine-31 variant, the present study also revealed the partial genes of three novel alpha-bungarotoxin isoforms in addition to the previously known alanine-31 and valine-31 variants, all of which share an invariant exon 3 coding region. While alpha-bungarotoxin is the principal postsynaptic neurotoxin of Taiwanese B. multicinctus and Javan B. candidus, the main postsynaptic neurotoxin of Thai B. candidus both by quantity and lethality was a novel polypeptide of similar toxicity with a mass of 8030 Da and 73 amino acid residues, whose characterization at the genetic and protein levels revealed a novel subgroup of krait neurotoxins, here named alpha-delta-bungarotoxins and represented by four sequences from Bungarus caeruleus and B. candidus. alpha-delta-Bungarotoxins share high sequence homology with alpha-bungarotoxins but the purified, 8030 Da alpha-delta-bungarotoxin-1 exhibits only reversible, low affinity binding to nicotinic receptors and high site-selectivity for the acetylcholine binding site at the alpha-delta-subunit interface of the receptor. These properties render alpha-delta-bungarotoxin not only the first snake long-chain neurotoxin with reversible binding and binding-site selectivity, but also an exciting natural tool with which to address structure-function relationships at the subunit interfaces of the human receptor. The results of comparisons of the number of non-synonymous nucleotide substitutions per nonsynonymous site (dN) to the number of synonymous nucleotide substitutions per synonymous site (dS) strongly suggest that positive selection is acting on exon 2 of the alpha-bungarotoxin and probably also of the alpha-delta-bungarotoxin genes. In addition, the numbers of nucleotide substitutions per site of intron (dI) compared to the dS value of the toxin-coding exon regions provide strong evidence for accelerated molecular evolution in exon 2 of alpha-delta-bungarotoxins —whose value of dI is only one-eighth of the value of dS—whereas the hypothesis of accelerated evolution is rejected for 13 unique genomic DNAs encoding five alpha-bungarotoxin isoforms from B. candidus and B. multicinctus....
Die Flusssäure stellt in der modernen zahnärztlichen Adhäsivtherapie eine wichtige Substanz dar. Nur sie allein vermag außerhalb der Mundhöhle ein gleichmäßiges Relief in die defektzugewandte Fläche einer vollkeramischen Einlagefüllung (Inlay) zu ätzen, das es ermöglicht, eine mikro-mechanische Verzahnung mit einem Befestigungszement auf Komposit-Basis einzugehen. Ein Silanisierungsvorgang soll zudem die chemische Bindung zwischen Keramik und Zement ermöglichen und die Haftung optimieren. Kommt es trotz sorgfältigster Handhabung der Restauration und Befolgung sämtlicher Präparationsregeln zu Frakturen, stellt sich die Frage nach der Reparaturfähigkeit solcher Defekte in situ. Grundvoraussetzung hierfür bleibt jedoch die Konditionierung der keramischen Verbundflächen mittels Flusssäure. Die Auswirkungen der als höchst ätzend eingestuften Flusssäure bei Hautkontakt sind weitestgehend bekannt: Neben den auftretenden starken Schmerzen kann es zur Überschwemmung des gesamten Körpers mit Fluoriden kommen. Die Vitalfunktionen des menschlichen Körpers sind durch das Ausfällen des Kalziums durch das Fluorid im höchsten Maße bedroht. Infolge dessen kann es zum Herzstillstand kommen. Aus diesen Gründen war die Untersuchung der Auswirkungen der Flusssäure unerlässlich. Ein von SCHMALZ 1988 beschriebenes Verfahren der Agar-Overlay-Methode in Verbindung mit einem von HEIDEMANN 1982 und 1985 erprobten Modell der Primärzellkultur mit humanen Gingivafibroblasten bildete die Grundlage für eigene Untersuchungen. Dentinscheiben 9 verschiedener Stärken von 100 bis 500 μm wurden mit Flusssäure behandelt und mit 10 ml Ringer-Lösung gespült oder ungespült auf den Zellrasen, der mit Agar überschichtet war, zurückgelegt. Das gleiche Verfahren wendete man bei der Prüfung der Zytotoxizität eines Gemisches aus Fluss- und Phosphorsäure an. In den Versuchsreihen wurde das Verhalten der einlagigen Zellpopulation phasenkontrastmikroskopisch hinsichtlich zytotoxischer Erscheinungen beobachtet und fotographisch dokumentiert....
Ziel dieser Arbeit war es, zentrale Wirkungen von Statinen näher zu untersuchen. Hierbei sollten zum einen die Statin-Effekte auf die zerebrale und membranäre Cholesterinhomöostase näher untersucht werden, zum anderen sollten Effekte von Statinen auf die APP-Prozessierung sowie auf apoptotische Regulatoren im Gehirn in vivo analysiert werden. Einfluss unterschiedlicher Applikationsformen auf zentrale Statin-Effekte Bislang ist noch nicht vollständig aufgeklärt, ob und inwieweit Statine die zerebrale Cholesterin- oder Isoprenoidsynthese beeinflussen. Statine werden in tierexperimentellen in vivo-Studien bei oraler Wirkstoffapplikation über unterschiedliche Applikationsformen verabreicht wie Schlundsondierung, über das Trinkwasser oder das Futter – der Einfluss der unterschiedlichen Applikationsformen auf die zentralen Statineffekte ist allerdings nicht bekannt. Die zerebralen Statinkonzentrationen wurden bislang nur nach Applikation per Schlundsonde im Tiermodell bestimmt. Für alle anderen oralen Applikationsformen liegen keine Konzentrations-Zeit-Profile der zerebralen Statinspiegel vor. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten über einen direkten Vergleich der Applikation von Lovastatin und Pravastatin über das Futter und per Schlundsonde zeigen, dass zentrale Statin-Effekte insbesondere auf membranärer Ebene entscheidend durch die Wahl der Applikationsform beeinflusst werden. Effekte von Simvastatin auf die zerebrale Cholesterinhomöostase – Vergleich Maus – Meerschweinchen In der vorliegenden Arbeit wurden die Effekte von Simvastatin auf die zentrale und periphere Cholesterinhomöostase in zwei verschiedenen in vivo-Modellen, Mäusen und Meerschweinchen, untersucht. Sowohl Mäuse wie auch Meerschweinchen stellen etablierte Tiermodelle für Untersuchungen des Cholesterin- und Lipoprotein-Metabolismus dar. Allerdings weisen Meerschweinchen eine grössere Ähnlichkeit zum Menschen im Bezug auf den Lipidstoffwechsel auf als die Maus. Die auffälligste Übereinstimmung zwischen Mensch und Meerschweinchen ist, dass auch bei Meerschweinchen die Mehrheit des Cholesterins in LDL transportiert wird. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass insgesamt eine subchronische Simvastatin-Behandlung in Mäusen und Meerschweinchen nicht die gleichen Effekte auf die periphere und zentrale Cholesterinhomöostase hat. Allerdings belegen die Ergebnisse an beiden Tiermodellen, dass generell eine subchronische Simvastatin-Gabe die zerebrale Cholesterinhomöostase nicht negativ beeinflusst. Allerdings werden insbesondere die Serumcholesterinspiegel, die Cholesterinkonzentration in synaptosomalen Plasmamembranen und die DPH-Anisotropie in den beiden Tiermodellen vermutlich aufgrund von Speziesunterschieden im Lipidstoffwechsel in unterschiedlichem Ausmaß beeinflusst, so dass Speziesunterschiede bei der Interpretation tierexperimentellen Statin-Studien immer beachtet werden sollten. Effekte von Simvastatin auf die APP-Prozessierung in vivo Es ist bekannt, dass Statine einen unmittelbaren Einfluss auf die membranäre Cholesterinhomöostase ausüben und dabei vermutlich über eine Veränderung von Raft-Strukturen die APP-Prozessierung modulieren. In der vorliegenden Arbeit wurde der Effekt einer subchronischen Simvastatin-Gabe auf die APP-Prozessierung in einem transgenen AD-Mausmodell (APP751SL-Mäuse) untersucht. Durch die Simvastatin-Behandlung wird eine Umverteilung des Cholesterins aus dem cytofacialen Membranblatt ins exofaciale Membranblatt in synaptosomalen Plasmamembranen induziert und die Proteinexpression des Raft-Markers Flotillin wird signifikant reduziert. Diese Veränderungen innerhalb der synaptosomalen Plasmamembranen sind mit einer Zunahme der Spiegel von unlöslichem Abeta im Gehirn der APP751SL-Mäuse assoziiert. Vermutlich war die Cholesterinsenkung in der Membran nicht stark genug, um die an der APP-Prozessierung beteiligten Sekretasen per se zu inaktivieren. Es scheint vielmehr zu einer Dislokalisation der Rafts zu kommen, die über eine räumliche Annäherung von APP und β-Sekretase/γ-Sekretase letztendlich zu einer erhöhten APP-Prozessierung führt. Darüberhinaus ist in unserer Studie eine Abnahme der Konzentration an löslichem Abeta1-40 im Gehirn der Simvastatin behandelten APP751SL-Mäuse nachweisbar sowie eine gleichzeitige Erhöhung der Konzentration an löslichem Abeta1-40 im Plasma. Dieser Befund deutet darauf hin, dass die Clearance von zerebralem löslichem Abeta1-40 ins Blut durch Simvastatin erhöht wurde. Neuroprotektive Effekte von Simvastatin Es gibt vermehrt Hinweise darauf, dass Statine neben ihrer cholesterinsenkenden Wirkung zentrale protektive Effekte im Rahmen neurologischer Erkrankungen wie Alzheimer Demenz (AD) oder ischämischem Schlaganfall vermitteln. In einer vorangehenden Studie an Mäusen konnten wir zeigen, dass eine subchronische Simvastatin-Gabe eine erhöhte Genexpression des antiapoptotischen Proteins Bcl-2 induziert. In der vorliegenden Arbeit kann dieser Befund im Gehirn von Meerschweinchen bestätigt werden und darüberhinaus kann nachgewiesen werden, dass Simvastatin eine Reduktion der Proteinexpression des proapoptotischen Proteins Bax im Gehirn der behandelten Meerschweinchen induziert. An dissoziierten Hirnzellen wurde anschließend untersucht, ob die signifikante Reduktion der Ratio Bax/Bcl-2 durch Simvastatin-Gabe im Gehirn von Meerschweinchen auf mitochondrialer Ebene protektiv wirkt gegen oxidativen und nitrosativen Stress sowie gegen den Bcl-2 Antagonisten HA 14-1. An dissoziierten Hirnzellen der behandelten Meerschweinchen wirkt Simvastatin über eine Senkung der Ratio Bax/Bcl-2, nachfolgende Hemmung der Caspase-Aktivierung und eine Stabilisierung des mitochondrialen Membranpotentials protektiv. Diese protektiven Wirkungen von Simvastatin sind im Rahmen neurologischer Erkrankungen wie der AD und dem ischämischem Schlaganfall von großer Bedeutung, da bei diesen Erkrankungen Apoptose und mitochondriale Dysfunktion eine Schlüsselrolle in neurodegenerativen Prozessen spielt.