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Der amerikanische Filmregisseur John Ford (1894-1972) gilt als einer der bedeutendsten Künstler des Mediums. In seiner langen, über 5 Jahrzehnte währenden Karriere in Hollywood schuf er Meisterweke wie "The Searchers", "Stagecoach", "Young Mr. Lincoln" "They Were Expendable", "The Quiet Man" oder "The Man Who Shot Liberty Valance". Er gewann sechs Regie-Oscars, und machte John Wayne zum grössten Kinostar seiner Zeit. Einem breitem Publikum bekannt ist der Regisseur durch seine Westernfilme, speziell durch diejenigen, die die US-Kavallerie thematisieren. Die Kavallerie, die Ford liebte, symbolisiert für ihn menschliche und kulturelle Werte, die er in allen seinen Filmen ständig thematisierte und variierte. Von seinem ersten Film mit Kavallerie, "Stagecoach" von 1939 bis zu seinem letzten Western, "Cheyenne Autumn" aus dem Jahr 1964, blieb er seinen bevorzugten Motiven von Familie und Gemeinschaft, Heldentum, Opferbereitschaft, dem Idealbild des Militärs als Familienersatz sowie der Gegensätzlichkeit von wilder Natur und Zivilisation treu. Aber:die Wertigkeit dieser thematischen Motive seiner Filme ist, wie der herrschende Zeitgeist, einem Wandel unterlaufen. Anhand dieses Wandels, stellvertretend dargestellt duch die sich verändernde Darstellung der Kavallerie in den Filmen Fords, will die Arbeit dem sich verändernden Zeitgeist, aber auch den neuen Produktionsstrukturen Hollywoods, nachgehen. Thematisiert wird das Festhalten des Regisseurs Ford an seinen persönlichen künstlerischen Prinzipien und gesellschaftlichen Idealen, sowie der daraus entstehende Bruch zwischen Künstler und Publikum. Die Arbeit versteht sich thematisch als eine Verbindung zwischen Filmwissenschaft, Filmgeschichte, US-amerikanischer Geschichte sowie US-amerikanischer Ideen- und Sozialgeschichte.
Optimierte Labordiagnostik zum Nachweis einer Heparin-induzierten Thrombozytopenie (HIT) Typ II
(2002)
Es ist bekannt, dass nicht alle Patienten, die sich unter einer Heparintherapie nachweislich gegen Heparin/PF4-Komplex immunisieren, das klinische Bild einer Heparin-induzierten Thrombozytopenie (HIT) Typ II entwickeln, wenngleich Heparin/PF4-Antikörper ursächlich für diese schwerwiegende Nebenwirkung angeschuldigt werden. Es ist davon auszugehen, dass in Abhängigkeit von der Grunderkrankung der Anteil der Patienten mit Heparin/PF4-Antikörpern, der keine Klinik entwickelt, relativ groß ist. Da die bisher entwickelten Testsysteme auf dem Nachweis von Heparin/PF4-Antikörpern beruhen, wirkt sich dieses Phänomen nachteilig auf die Testspezifität aus. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, welche der Immunglobulinklassen der HITspezifischen Antikörper für die Auslösung einer HIT Typ II von Bedeutung sind, und inwieweit die isolierte Bestimmung einer der Immunglobulinklassen IgG, IgM und IgA in der Lage ist, die Aussagekraft eines immunologischen Testsystems zu verbessern. Hierzu wurden Patienten, bei denen Heparin/PF4-Antikörper nachweisbar waren, nach klinischen Kriterien in drei verschiedene Gruppen unterteilt und bezüglich der Immunglobulinklassen verglichen. In Gruppe I wurden Patienten zusammengefasst, bei denen sich der klinische Verdacht einer HIT Typ II labordiagnostisch durch Heparin/PF4-Antikörpernachweis bestätigte, und die als besonderes Kriterium thromboembolische Komplikationen entwickelten. Patienten mit einer isolierten Heparin-induzierten Thrombozytopenie und positivem Antikörpernachweis aber ohne thromboembolische Komplikationen wurden als Gruppe II unterschieden. Durch die getrennte Beobachtung dieser beiden Patientengruppen sollte der prädiktive Wert der Immunglobulinklassen für die Entwicklung von Thrombosen unter HIT Typ II untersucht werden. Verglichen wurden diese beiden Gruppen mit einer dritten Gruppe von selektierten Patienten aus einer prospektiven Studie. Die eingeschlossenen gefäßchirurgischen Patienten aus dieser Studie mussten die Kriterien "positiver Heparin/PF4-Antikörpernachweis während Heparintherapie" und "keine klinischen Zeichen einer Heparin-induzierten Thrombozytopenie Typ II" erfüllen. In dieser Arbeit wurde weiter untersucht, welche der Immunglobulinklasse IgG, IgM und IgA am besten zwischen Patienten mit positiven Heparin/PF4-Antikörpern mit und ohne typischer "HIT-Klinik" unterscheiden kann. Die Bestimmung der Immunglobulinklassen erfolgte zum Zeitpunkt des akuten thrombozytopenischen Geschehens, bzw. bei den asymptomatischen Patienten in einem Zeitfenster von 5 bis 20 Tagen nach Therapiebeginn mit einer ELISA-Methode nach Amiral et al. (1991). Parallel zu den immunologischen Untersuchungen wurde ein etablierter, funktioneller Test, der Heparin-induzierte Plättchenaktivierungstest (HIPA) von Greinacher et al. (1991) bei allen Patienten angewandt. Es kam zu folgenden Ergebnissen im Vergleich der Gruppen: Die Patienten mit einer HIT Typ II mit thromboembolischen Komplikationen ließen sich durch keine der untersuchten Immunglobulinklasse oder den Heparin-induzierten Plättchenaktivierungstest (HIPA-Test) signifikant von den Patienten mit HIT ohne thromboembolische Ereignisse unterscheiden. Die asymptomatischen Patienten mit positivem Heparin/PF4-Antikörpernachweis waren signifikant (p < 0,05) von den Patienten mit einer klinisch wahrscheinlichen und laborchemisch nachgewiesenen HIT Typ II zu unterscheiden durch die Immunglobulinklasse IgG und den Heparin-induzierten Plättchenaktivierungstest (HIPA-Test), nicht aber durch die Immunglobulinklassen IgM und IgA. Dementsprechend zeigte IgG in der Diskriminanzanalyse zwischen Patienten mit klinisch eindeutigem HIT Typ II und asymptomatischen Patienten mit positivem Heparin/PF4- Antikörpernachweis mit 20 % eine um 9 % niedrigere Fehlklassifikationsrate als die Mischung aus IgG, IgM und IgA. Der durch die Diskriminanzanalyse optimierte Cut-Off konnte zwar für die Mischung aus IgG, IgM und IgA eine Spezifitätssteigerung von 0 auf 66,6 % erzielen, dies verursachte jedoch einen Verlust an Sensitivität von 91 % auf 76 %. Der Verlust an Sensitivität ist bei der Immunglobulinklasse IgG mit 2 % deutlich günstiger, während die Spezifität zusätzlich durch die Cut-Off Optimierung von 62,5 auf 70,8 % gesteigert werden konnte. Damit ist der Heparin/PF4-Antikörper-EIA mit der isolierten Bestimmung der Immunglobulinklasse IgG bei vergleichbarer Sensitivität spezifischer als der funktionelle HIPA-Test. Aus diesen Ergebnissen lässt sich bestätigen, dass die Immunglobulinklasse IgG eine zentrale Rolle in der Pathogenese spielt, während die Klassen IgM und IgA keinen Einfluß auf die Klinik der HIT Typ II zu haben scheinen. Da nicht alle Patienten mit Heparin/PF4-Antikörpern der Klasse IgG eine HIT Typ II entwickeln, müssen weitere Faktoren am Zustandekommen der klinischen Symptomatik beteiligt sein. Weiter lässt sich schlussfolgern, dass der Heparin/PF4-Antikörper-EIA (HPIA), sofern man nur die relevante Immunglobulinklasse IgG misst, ein brauchbares Instrument zur Diagnostik der HIT Typ II darstellt, und daher von weniger spezialisierten Labors wegen seiner besseren Praktikabilität einem funktionellen Test wie dem HIPA-Test vorgezogen werden sollte. Zwischen Immunglobulinklassen und dem Risiko, ein thromboembolisches Ereignis während einer HIT Typ II zu entwickeln, konnte kein Zusammenhang festgestellt werden. Es ist zu vermuten, dass der überwiegende Teil der Patienten mit initial isolierter Thrombozytopenie bei fortlaufender Therapiedauer auch Thrombosen entwickelt hätte und sich die beiden Patientengruppen I und II nur hinsichtlich der Dauer der Heparintherapie unterscheiden.
Mit unserer Studie sollte der Einfluß von körperlicher Belastung auf Lymphozytenpopulationen bei Patienten mit variablem Immundefektsysndrom CVID untersucht werden. Um eine Verbindung zu alltäglichen Situationen zu schaffen, wählten wir eine moderate Belastung, in Form einer Laufstrecke von 3.5 km. Es wurden vielfach signifikante Unterschiede der Zellverteilung zwischen der Patienten- und Kontrollgruppe deutlich bei der CD8 T-Zellpopulation, bei den CD4 Helferzellen sowie bei den CD45RO - und CD95 - positiven CD4 Helferzellen und bei den Natürlichen Killerzellen. Wir konnten sehen, daß bei den Patienten in der CD8 T-Zellpopulation bereits vor der Belastung eine höhere Zellzahl vorlag als bei den Kontrollpersonen. Die körperliche Belastung hatte bei dieser Zellgruppe dann zur Folge, daß direkt im Anschluß, durch einen Zellzahlanstieg bei den Patienten, ein signifikanter Unterschied der Zellzahl vorlag. Bei den T4-Helferzellen war bereits zum Ausgangszeitpunkt eine signifikant erniedrigte CD4-Zellzahl bei der Patientengruppe zu erkennen (p = 0.02; Median 616 Zellen/µl; Range 450 - 677 Zellen/µl ). Unter Belastung kam es hierbei zu einem signifikanten Zellzahlanstieg (p < 0.01), wohingegen sich bei der Kontrollgruppe keine signifikante Reaktion zeigte (p > 0.05). Bei der näheren Betrachtung der CD4-Untergruppen ergab sich, daß sich die Zellzahlerhöhung in erster Linie in der Population der CD45RO positiven Memory-Zellen abspielte. Desweiteren war ein Anstieg in der Gruppe der CD95 exprimierenden CD4-Zellen zu sehen. In der Kontrollgruppe war hierbei, wie zu erwarten, keine auffällige Entwicklung in der Zellzahl zu erheben. Bei den Natürlichen Killerzellen, die, wie in der Literatur beschrieben, sehr sensibel auf körperliche Belastung reagieren, zeigte sich ein ähnlicher Verlauf in den beiden Gruppen. Erst zu den Meßpunkten 90 Minuten und 120 Minuten nach Belastung war dann bei den Patienten eine grenzwertig (p=0.053) signifikante Zellzahlerniedrigung auffällig. Inwieweit diese Abweichungen nun als pathologische Erscheinungen bzw. als Kompensationsmechanismen zu werten sind, ist anhand der bislang vorliegenden Daten schwer zu beurteilen. Weiterführende Studien sollten zusätzlich Bezug auf die Zellaktivität, bzw. die Zytotoxizität nehmen. Andererseits wäre eine Langzeitbetrachtung der Patienten unter körperlicher Leistung wünschenswert, um Entwicklungen erkennen und eventuell nützen zu können, im Sinne eines gezielten "immununterstützenden" Trainings.
Diese Arbeit beschreibt die Identifizierung, Klonierung und Charakterisierung von zwei neuen humanen S1P-Rezeptoren. Damit wird die Familie der S1P-Rezeptoren um einen hochaffinen und einen niedrig affinen Rezeptor erweitert. Die Untersuchungen der Expressionsprofile aller humanen S1P/LPA-Rezeptoren sowohl in Herz-Kreislauf-relevanten Geweben als auch in Endothelzellen und glatten Muskelzellen erfolgten bisher nicht im Sinne der hier dargestellten familienübergreifenden Betrachtung. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit erstmalig auch der hS1P5-Rezeptor mit eingeschlossen. Wir konnten zeigen, dass zur Beurteilung der S1P- und LPA-Effekte in den untersuchten Gewebe- und Zellarten neben den bisher bekannten sieben Rezeptoren auch der hS1P5-Rezeptor betrachtet werden muss. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da in bisherigen Untersuchungen insbesondere bei der Interpretation der S1P-Wirkungen nur die Rezeptoren S1P1-3 berücksichtigt wurden. In dieser Arbeit wurde außerdem zum ersten Mal eine große Anzahl potentieller Lipidliganden an den S1P-Rezeptoren S1P1-3 und 5 sowie am hGPR63 getestet. Auch wenn hierbei keine neuen Liganden identifiziert werden konnten, grenzen unsere Untersuchungen die Zahl potentieller zusätzlicher Liganden ein. Außerdem konnten wir zeigen, dass Suramin nicht - wie bisher vermutet - ein spezifischer Antagonist des S1P3-Rezeptors ist, sondern auch S1P5-Rezeptor-vermittelte Effekte blockieren kann. Hierdurch kann eine Fehlinterpretation von durch Suramin-hemmbaren Effekten verhindert werden. Ein wichtiger Befund dieser Arbeit, insbesondere für die pharmazeutische Industrie, ist die speziespezifische Expression des S1P5-Rezeptors. Während in der Ratte hauptsächlich eine Verteilung des Rezeptors im ZNS zu beobachten ist, findet sich das humane Homologe hauptsächlich in peripheren und hier insbesondere Herz-Kreislauf-relevanten Geweben. Der Einsatz von Tiermodellen, bei denen es sich in der Regel um Nager handelt, zur Untersuchung der S1P-Effekte muss daher kritisch überdacht werden, da in diesem Fall ein im Menschen potentiell relevanter Rezeptor nicht in den peripheren Geweben der Ratte vorhanden und somit nicht an den S1P-Wirkungen beteiligt ist. Zudem konnten wir auch funktionelle Unterschiede zwischen den beiden Rezeptoren unterschiedlicher Spezies beobachten, was zusätzlich gegen die Verwendung von Tiermodellen zumindest bei Untersuchungen des S1P5-Rezeptors spricht. Neben der erstmaligen Charakterisierung der Signaltransduktionswege des S1P5-Rezeptors konnte im Laufe dieser Arbeiten eine weitere neue Eigenschaft des S1P5-Rezeptors festgestellt werden: Dieser ist in der Lage, ligand-unabhängige Effekte hervorzurufen. Dies ist von Bedeutung, da häufig Rezeptoren, die aufgrund von Mutationen konstitutiv aktiv sind, für die Ausbildung von Krankheiten verantwortlich sind. Wir konnten darüberhinaus zeigen, dass der zweite in dieser Arbeit identifizierte S1P-Rezeptor, der orphan-hGPR63, von relativ hohen Konzentrationen an S1P sowie von doPA angeschaltet wird. Wenngleich die Affinität des hGPR63 zu doPA niedrig ist, ist dies jedoch der erste Rezeptor, der auf dieses Lipid reagiert. Welche physiologische Bedeutung diesem Rezeptor zukommt, ist noch völlig offen, die primäre Expression im Hirn weist jedoch auf eine zumindest partielle zentrale Wirkung hin. Zusätzlich zu den molekularbiologischen Befunden können aus dieser Arbeit wichtige Informationen für das Screenen von GPCRs und hier insbesondere von Lipid-GPCRs abgeleitet werden. Allgemein gilt, dass der Auswahl des richtigen Versuchssytems im Hinblick auf die Fragestellung und das zu untersuchende Protein eine entscheidende Bedeutung zukommt. Während bei Rezeptoren mit einer restriktiven Gewebeverteilung die Suche nach einem geeigneten Zellsystem keine Schwierigkeiten bereitet, stellt dies das Hauptproblem in der Lipidforschung dar. Da es keine Säugerzellen gibt, die nicht auf S1P reagieren, muss jedes Versuchssystem erneut auf Eignung und optimale Zellart untersucht werden. So konnten in transient transfizierten CHO-K1-Zellen hintergrundfreie S1P-Signale im FLIPR-Versuch gemessen werden, während in den MAP-Kinase-Versuchen in CHO-K1-Zellen der hohe endogene Hintergrund das Versuchsfenster auf ein Minimum reduzierte. Während die Messung von LPA-Effekten in CHO-K1-Zellen mit der FLIPR-Technologie aufgrund der endogenen Signale nicht möglich ist, können LPA-Effekte in McARH7777-Zellen ohne störenden Hintergrund gemessen werden. In diesem Zellsystem ist wiederum die Messung von S1P nicht oder nur begrenzt möglich. Auch wenn diese Beispiele spezifisch für Lipidrezeptoren sind, lässt sich doch aus dieser Arbeit die Notwendigkeit ableiten, neben der richtigen Substanz-Bibliothek besonders bei der Suche nach Liganden für orphan-GPCRs das richtige zelluläre System einzusetzen.
One of the most species-rich ant-plant mutualisms worldwide is the palaeotropical Crematogaster-Macaranga system. The pioneer-tree genus Macaranga (Euphorbiaceae) is mainly inhabited by at least nine specific species of Crematogaster (Myrmicinae), of which eight belong to the subgenus Decacrema, as well as several species of Camponotus (Formicinae). Ant species are not randomly distributed among the Macaranga host plants but distinct patterns of associations have been found (Fiala et al., 1999 and references cited therein). The specificity of the associations is maintained in spite of common sympatric distribution of several host-plant species. Associations are, however, usually not species-specific and especially the Decacrema ants, that are the focus of this study, usually colonize several host plant species each. In this study I used a combined approach of ecological data as well as phylogenetic data based on mitochondrial DNA sequences in order to elucidate the factors determining the patterns found in the associations and the evolution of this mutualistic system between the specific Decacrema ant partners and their Macaranga host plants. Life history traits of seven different morphospecies found on the most common Macaranga host plants were compared and colony development was followed from colony founding on saplings to adult trees. Temporal variability of the associations between Decacrema ants and their respective host plants was also examined. Associations between Crematogaster ants of the subgenus Decacrema and their Macaranga host plants were found to be stable over periods of time, long enough to enable reproduction of the ant colony and (in most cases) the host plants, too. Life-expectancy of the ant colony seems to be shorter than that of the host plant in general. All adult trees still provide nesting space as well as food for the ants. Colonies from different morphospecies differed in longevity, the onset of alate production, queen number and mode of colony founding. The examined Decacrema species could be placed into two groups according to their life-history traits as well as on morphological grounds: The decamera-group and the captiosa-group, each named after one species that could be synonymized with one morphospecies included in the group. Members of the captiosa-group have larger colonies, presumably with a longer life-span, and a later onset of reproduction compared to the decamera-group. Additionally, queens of the captiosa-group found colonies on saplings as well as in the crown region of bigger trees, whereas queens of the decamera-group found colonies on saplings and small treelets only. Queens belonging to the captiosa-group are brown with relatively large eyes (= 1/3 of the head length), whereas queens from the decamera-group are smaller in size, are dark brown to black in colour and have smaller eyes (< 1/3 of the head length). On some of the host plants examined in this study lifespan of the host plant and their specific ant partners seemed to be well matched whereas on others an ontogenetic succession of specific Decacrema partner ants was found, when host plants were abandoned due to the death of comparatively short-lived ant colonies, usually from species belonging to the decamera-group. Ant-partners of saplings or young plants often differed from specific partner ants found on bigger trees. Only species belonging to the captiosa-group were found to re-colonize the crown region of adult trees, thus facilitating a change of ant species, when longlived host plant species were colonized by relatively short-lived species from the decamera-group first. When long -lived host plants were colonized by long-lived species from the captiosa-group associations were stabler: I did not find any temporal variation in ant-inhabitants then. Life-span of the ant colony as well colony founding behaviour of the different partner ant species therefore play an important role for these ontogenetic changes and the specificity of the associations over time. For the host plant the ontogenetic changes have a strong impact as uninhabited host plants that are not patrolled by workers of specific ant partners suffer higher herbivore damage. Uninhabited host plants may also be colonized by unspecific arboreal ants that only make use of the nesting space and/ or food offered by the plant but do not confer protection against herbivores. Stable associations with a specific ant partner are therefore most beneficial for the host plants. Usually ant colonies are monogynous, but changes in the colony structure were found locally in two Decacrema species. I found colonies that turned secondarily polygynous, possibly after the death of the original founding queen. Secondary polygyny therefore can prolong the life-span of the antcolony on its host plant, leading to a parallel life-history and stable association as it was the case in Macaranga bancana-Crematogaster captiosa. However, in the other association (Macaranga hypoleuca-Crematogaster cf. decamera) life-expectancy of the ant-colony is still much shorter than that of its host plant species, leading to a change in the specific ant partner at a later stage. Pleometrotic foundress associations that directly led to polygynous colonies in one species were also found locally, a phenomenon hardly ever reported from ants in general. Foundress associations were found to be more successful in establishing colonies than single queens. I found indications that this change in colony founding behaviour might be due to interspecific competition for the same host plant species with another Decacrema species specific to Macaranga. For the phylogenetic analysis partial mitochondrial cytochrome oxidase I and II were sequenced and Neighbor-Joining, Maximum Parsimony, Maximum Likelihood as well as Bayesian analyses were performed. The four different analyses yielded phenetic as well as phylogenetic trees that all had a similar topology. Ants of the subgenus Decacrema formed a monophyletic clade, indicating a single colonization event at the beginning of the Macaranga-Decacrema symbiotic system. In the phylogenetic analysis the decamera-group as well as the captiosa-group were confirmed and clearly separated from each other. However, two species that would have been placed into the decamera-group, due to morphological as well as life-history traits, formed a third separate clade within the Decacrema. These two species (msp. 7- group) as well as the decamera-group came out as the basal groups in the phylogenetic analysis. Thus, life -history traits of these two groups (relatively small colonies, early onset of alate production, colony founding in ground region only) would be the ancestral state for Macarangaassociated ants of the subgenus Decacrema. Changes in colony structure, like secondary polygyny, were found in the captiosa- as well as the decamera-group and are therefore independent of the affiliation within the phylogeny. I did not find evidence for strict cocladogenesis between the subgenus Decacrema and their Macaranga host-plants, although ecological interactions between the two partner groups are close and associations can be rather specific. The phylogenies presented here, along with the known association patterns indicate that host-shifting of the ants is common in some of the species, opening the possibility of sympatric speciation as a result of increased host usage. Additionally, the considerable geographic substructuring found in the phylogenetic trees suggests that allopatric speciation has played a major role in diversification of the Decacrema ants.
Erstes Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines Anzuchtsystems, mit dem ein reproduzierbarer Trockenstreß induziert werden konnte. Mittels dieses Systems erfolgte die Selektion von zwei unterschiedlich trockentoleranten Sorghum bicolor-Kultivaren, die im weiteren Verlauf dieser Arbeit näher charakterisiert wurden. Dabei wurden zunächst Photosynthese, stomatärer Widerstand, Chlorophyll- und Carotinoidgehalt, Fv/Fm-Verhältnis, Blattdruckpotential und Blattschädigungen an allen Blättern von Kontrollpflanzen und gestreßten Pflanzen untersucht. Das jüngste, voll entwickelte Blatt wies die größten Unterschiede zwischen beiden Kultivaren auf, weshalb die weiterführende Untersuchungen nur noch an diesem Blatt durchgeführt wurden. Im Rahmen dieser Untersuchungen erfolgten Gaswechsel- und Chlorophyllfluoreszenz-Messungen unter unterschiedlicher CO2-Versorgung, sowie Messungen der blattflächenbezogenen Aktivität der C4-Enzyme (PEPCase, MDH, NADP-ME, PPDK) und zweier Enzyme des Calvin-Zyklus (Rubisco, FBPase). Darüber hinaus wurde der Gehalt der C4-Metabolite bestimmt und mittels Pigmentanalyse die Kinetik der Xanthophyll-Deepoxidation in Abhängigkeit vom Trockenstreß untersucht. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: Das verwendete Modelsystem erlaubt eine reproduzierbare Induktion des Trockenstresses. Aufgrund der relativ schnellen Änderung des Wasserpotentials des Bodens während der Versuchsdauer muß das Blattdruckpotential als Standard für die Trockenstreßbelastung gemessen werden. Es konnten zwei Sorghum-Kultivare mit unterschiedlicher Trockenstreßresistenz selektiert werden. Die äthiopische Landrasse E 36 zeigt dabei trotz größerer Blattschädigung, insbesondere der älteren Blätter, unter vergleichbarem Blattdruckpotential jeweils höhere Photosyntheseraten der ungeschädigten Bereiche als die amerikanische Zuchtsorte B 35. Trotz hoher Korrelation zwischen Photosyntheserate und stomatärem Widerstand scheint die Photosynthese unter Trockenstreß nicht durch verringerte CO2-Konzentrationen im Interzellularraum limitiert zu werden, worauf auch die Daten der Fluoreszenz- und Gaswechselmessungen unter erhöhtem CO2-Gehalt hinweisen. Gaswechselmessungen unter vermindertem CO2-Gehalt bei gestreßten Pflanzen lassen auf eine geringere Aktivität der CO2-Fixierung durch die PEPCase schließen. Unter optimalen Bedingungen ist keine der in vitro gemessenen Umsatzraten der C4-Enzyme limitierend für die Photosynthese. In vivo könnte die Aktivität der PEPCase jedoch durch einen niedrigeren pH-Wert des Cytosols und Malathemmung zum geschwindigkeitsbestimmenden Schritt werden und die Photosyntheserate limitieren. Die starke Übereinstimmung von PPDK-Aktivität und Photosynthese in den Kontrollpflanzen weist auf eine mögliche Limitierung der Photosynthese durch die PPDK unter Kontrollbedingungen hin. Die starken Veränderungen der C4-Metabolit Gehalte deuten auf eine grundlegende Veränderung des C4- Stoffwechsels unter Trockenstreß hin. Höhere Malat Konzentrationen der Sorte B 35 könnten dabei zu einer frühen Inhibierung der PEPCase in den trockengestreßten Pflanzen als in E 36 führen, wodurch die Photosynthese limitiert wird.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde der Großteil aller nuklearen Proteine annotiert und klassifiziert. Aus Literatur, Proteinsequenz- und Domänendatenbanken wurden bekannte nukleare Domänen ermittelt, ihre Grenzen unter Zuhilfenahme von Tertiärstrukturen oder Sekundärstrukturvorhersagen bestimmt und multiple Sequenzalignments erstellt. Die handgerfertigten Aligments wurden zur Anfertigung von Hidden Markov Models herangezogen und in das Domänenvorhersageprogramm Simple Modular Architecture Research Tool (Schultz et al. 1998, Schultz et al. 2000) (http://smart.embl-heidelberg.de/) implementiert. Hier sind umfassend Informationen über Literatur, phylogentische Verteilung, Anzahl beteiligter Proteine und Funktion für 164 Domänen (118 entstammen dieser Arbeit) mehr als 35000 Proteine abdeckend zusammengefasst. Aufbauend auf der vollständigen Kollektion nuklearer Proteine wurden ausgewählte nukleare und nicht-nukleare Proteine auf der Grundlage homologiebasierender Sequenzanalyseverfahren untersucht. Die Arbeit führte zur Entdeckung von vier biologisch relevanten neuen Domänen: - L27, eine neue Hetero-Dimer bildende Domäne in den Rezeptor-Targeting-Proteins Lin-2 and Lin-7 (Doerks et al. 2000) - GRAM, eine neue Domäne in Glucosyltransferasen, Myotubularinen und anderen Membran-assoziierten Proteinen (Doerks et al. 2000) - DDT, eine neue DNA-bindende Domäne in unterschiedlichen Transkriptionsfaktoren, Chromosom-assoziierten und anderen nuklearen Proteinen (Doerks et al. 2001) - BSD, eine neue putativ DNA-bindende Domäne in Transkriptionsfaktoren, Synapsen-assozierten und anderen hypothetischen Proteinen (Doerks et al. submitted) Abschliessend erfolgte die automatische Analyse von 24000 nuklearen Proteinen, aus denen 550 hypothetisch neue Domänen hervorgingen. Die intensive Aufarbeitung dieser 550 konservierten Sequenzbereiche erbrachte die Entdeckung von 28 neuen nuklearen oder teilweise nuklearen Domänen unterschiedlicher Speziesverbreitung, Funktion und biologischer Relevanz (Doerks et al. accepted).
Der STAR Level-3 Trigger
(2002)
Schwerionen-Collider-Experimente, wie das STAR-Experiment am RHIC (BNL) oder das geplante ALICE-Experiment am LHC (CERN) untersuchen Schwerionenkollisionen bei Schwerpunktsenergien von Wurzel aus SNN = 200 GeV (RHIC), bzw. Wurzel aus sNN = 5, 5 TeV (ALICE). In diesen Kollisionen werden mehrere tausend geladene Teilchen produziert, die in STAR und ALICE in großvolumigen TPCs gemessen werden. Das Datenvolumen erreicht dabei bis zu 10 MB (STAR) und 60 MB (ALICE) pro Ereignis. Aufgrund der hohen Luminosität der Collider könnten die Experimente zentrale Schwerionenkollisionen mit einer Rate bis zu 100 Hz bzw. 200 Hz (ALICE) untersuchen. Die dabei entstehenden Datenraten im Bereich mehrerer GB/s sind mit heutiger Technologie jedoch nicht mehr einfach zu speichern. Deshalb kann nur ein Bruchteil der zur Verfügung stehenden Ereignisse aufgezeichnet werden. Aufgrund der exponentiellen Entwicklung der CPU-Leistung wird es jedoch möglich, die Rekonstruktion von Ereignissen während der Datennahme in Echtzeit durchzuführen. Basierend auf den rekonstruierten Spuren in den Detektoren kann die Entscheidung getroffen werden, ob ein Ereignis gespeichert werden soll. Dies bedeutet, dass die begrenzte Speicherbandbreite gezielt mit Ereignissen, die eine interessierende physikalische Observable beinhalten, angereichert werden kann. Ein solches System zur Ereignisselektion wird als Level-3-Trigger oder allgemeiner als High Level Trigger bezeichnet. Am STAR-Experiment wurde erstmals in einem Schwerionenexperiment solch ein Level-3-Triggersystem aufgebaut. Es besteht aus 432 i960-CPUs, auf speziell gefertigten Receiver Boards für die paralelle Clusterrekonstruktion in der STARTPC. 52 Standard-Computer mit ALPHA- bzw. Pentium-CPUs rekonstruieren die Spuren geladener Teilchen und tre.en eine Triggerentscheidung. Dieses System ermöglicht die Echtzeit-Rekonstruktion zentraler Au-plus-Au-Kollisionen mit anschliessender Analyse durch einen Trigger-Algorithmus mit einer Rate von 40-50 Hz. Die Qualität, die mit dieser schnellen Analyse erreicht wird, kann mit der Qualität der STAR-Offline-Rekonstruktion verglichen werden. Der Level-3-Clusterfinder erreicht in Bezug auf Ortsauflösung und Rekonstruktionseffizienz dieselbe Qualität wie der Offline-Clusterfinder. Der Level-3-Trackfinder erreicht bei Rekonstruktionseffizienz und Impulsauflösung 10-20% schlechtere Werte als der Offline- Trackfinder. Die Anwendung eines Level-3-Triggers besteht in der Messung von seltenen Observablen ("rare Probes"), die ohne eine Anreicherung nicht, oder nur schwer, meßbar wären. In den Jahren 2000 und 2001 wurden erste Triggeranwendungen für das STARLevel- 3-System erprobt. In ultraperipheren Au-plus-Au-Kollisionen wurden po-Kandidaten schon im Jahr 2000 selektiert. Während der Strahlzeit des Jahres 2001 wurde das Level-3-System erstmals zum Triggern in zentralen Au-plus-Au-Kollisionen eingesetzt. Die Triggeralgorithmen beinhalteten einen Õ-Trigger, einen 3He-Trigger und einen Algorithmus zur Anreicherung von Spuren hohen Impulses in der Akzeptanz des RICH-Detektors. Das STAR Level-3-System ist in der Lage zehnmal mehr Ereignisse zu analysieren, als gespeichert werden können. Aufgrund der begrenzten Luminosität des RHIC-Beschleunigers, konnten die Level-3 Trigger erst zum Ende der Strahlzeit eingesetzt werden. Den genannten Algorithmen standen zusätzlich zu den 3 · 10 hoch 6 gespeicherten zentralen Ereignissen, 6 · 10 hoch 5 zentrale Ereignisse zur Analyse zur Verfügung. Mit diesem begrenzten Anreicherungsfaktor von 20% blieb das System hinter seinen Möglichkeiten zurück. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass das STAR Level-3-System in der erwarteten Qualität und Stabilität funktioniert.
Der Ein-Elektron Transporter Adrenodoxin spielt in der Steroidhormonbiosynthese eine entscheidende Rolle. Bislang konnte der Elektronentransportmechanismus zwischen der Adrenodoxin-Reduktase und dem Cytochrom P450 mittels Adrenodoxin nicht eindeutig nachgewiesen werden. Um die molekularen Wechselwirkungen besser verstehen zu können wurden in der vorliegenden Arbeit strukturelle Untersuchungen am Rinderadrenodoxin durchgeführt. Nachdem es bereits 1998 gelang die Struktur des oxidierten Zustands des Adrenodoxins aufzuklären [Müller et al. 1998], sollte die Struktur des reduzierten Zustands Aufschluss über mögliche redoxbedingte konformationelle Änderungen geben. Die Strukturaufklärung mittels NMR erfordert hohe Expressionsausbeuten und effektive Aufreinigungsstrategien des rekombinant hergestellten Proteins. Deshalb wurde zunächst eine Steigerung der Expression von löslichem Adrenodoxin in E.coli angestrebt. In Minimalmedium lieferte die Expression unter Zusatz von 2,5g Glycerin und 1g Glucose optimale Ergebnisse. So konnte nach Optimierung der Aufreinigungsabfolge aus einem Liter M9-Medium bis zu 50 mg homogenes Protein isoliert werden. Nach Optimierung der Expressionsbedingungen und der Aufreinigungsstrategie konnte das Adrenodoxin mit den NMR aktiven Isotopen 15N sowie 13C angereichert werden. Die Reduktion des Adrenodoxins erfolgte durch Zusatz von Natriumdithionit unter strikt anaeroben Bedingungen. Die strukturelle Untersuchung mittels NMR setzt eine Zuordnung der Proteinresonanzen voraus. Diese erfolgte unter Verwendung verschiedener Tripleresonanzexperimente. Eine Zuordnung war aufgrund des stark ausgeprägten Paramagnetismus nur für solche Reste möglich, die sich mindestens 8 Å vom [2Fe-2S]-Cluster des Adrenodoxins entfernt befinden. Trotzdem konnten wichtige Regionen, die sich außerhalb des Einflussbereichs des [2Fe-2S]- Clusters befinden, zugeordnet und mit dem oxidierten Zustand verglichen werden. Aus den 15N-NOESY-HSQC und 13C-NOESY-HSQC-Spektren wurden für den reduzierten Zustand unter Zuhilfenahme des Programms NMR2st 1300 effektiv abstandsbeschränkende NOESignale eindeutig zugeordnet. Nach Minimierung der Zielfunktion wurden im letzten Schritt 50 Strukturen mit dem Strukturkalkulationsprogramm DYANA berechnet. Die 20 Strukturen mit den besten Targetfunkionen wurden als Strukturensemble dargestellt. Für das Proteinrückrat beträgt der RMSD 2,34 Å. Anhand der chemischen Verschiebungsänderungen konnten erste Unterschiede zwischen oxidierten und reduzierten Zustand des Adrenodoxins festgestellt werden. Besonders markant sind diese Veränderungen im Bereich des C-Terminus und des Loops 80-86. Änderungen konnten auch im "Chemical Shift Index" und beim Vergleich der NOE-Konnektivitäten beider Redoxzustände beobachtet werden. Gerade für die Aminosäurereste Asp76 und Asp79, die für die Wechselwirkung zu den Redoxpartnern essentiell sind, konnten Veränderungen im Aufspaltungsmuster der "NOE-Pattern" nachgewiesen werden, was auf konformationelle Änderungen im Bereich der Wechselwirkungsdomäne hindeutet. Der Vergleich der beiden Tertiärstrukturen lieferte weitere Indizien dafür, dass der C-Terminus redoxbedingte konformationelle Änderungen erfährt. Während des Erstellens dieser Arbeit konnte eine US-amerikanische Gruppe durch Zufall die Existenz eines Adrenodoxin (oxidiert) Dimers bei physiologisch relevanten Konzentrationen nachweisen [Pikuleva et al. 2000]. Bei der Dimerisierung spielt der C-Terminus eine entscheidende Rolle. Zwei intermolekulare Wasserstoffbrücken bilden sich zwischen CTerminus und Protein des jeweils anderen Partners aus. Redoxbedingte konformationelle Änderungen im Bereich des C-Terminus sollten die Auflösung des Dimers begünstigen. Um diese Vermutung zu bestätigen wurden Cross-Linking Experimente mit dem reduzierten und oxidierten Zustand des Adrenodoxins durchgeführt. Die Ergebnisse bestätigten die Annahme, dass sich das Adrenodoxin Dimer nach Reduktion auflöst. Außerdem konnte anhand der voll funktionsfähigen C-terminal verkürzten Mutante Adx(4-108) die tragende Rolle des CTerminus bei der Dimerbildung bewiesen werden. Aus den experimentell erhaltenen Daten wurde ein neuer Elektronentransportmechanismus postuliert, der sowohl Adrenodoxin Dimere als auch Adrenodoxin Monomere als Elektronentransporter annimmt [Beilke et al. 2002]. Die streng kontrollierte Steroidhormonbiosynthese wird durch den Einsatz von Adrenodoxin Dimeren beschleunigt und durch die redoxbedingte Auflösung der Dimere optimert. Die redoxbedingte Auflösung eines Dimers ist in der Biochemie einzigartig und kann zum Verständnis molekularer Wechselwirkungen beitragen. Für die gesamte Gruppe der vertebraten Ferredoxine sind aufgrund der Struktur- und Sequenzhomologie ähnliche Ergebnisse zu erwarten. Im zweiten Teil der Arbeit sollte die Ferredoxin-NADP -Reduktase (FNR) für strukturelle Untersuchungen mittels NMR zugänglich gemacht werden. Durch Verwendung von bakteriellen Expressionssystemen, insbesondere dem pQE30-Expressionssystem, konnte der Anteil an löslichem Protein im Vergleich zum Ursprungssystem um den Faktor 12 erhöht werden. Dabei führten möglichst niedrige Expressionstemperaturen und IPTG Konzentrationen zu den höchsten Proteinausbeuten. Ein verbessertes Isolationsverfahren wurde etabliert und ermöglicht die Darstellung von bis zu 90 mg FNR aus einem Liter LB-Medium. Eine Verlängerung der Expressionsdauer, hervorgerufen durch das Wachstum in M9-Medium und in D2O, verringerte den Anteil an vollständig intaktem Protein, weshalb auf eine kostspielige Proteinpräparation in dreifach angereicherten Minimalmedium verzichtet wurde.
Rezeptortyrosinkinasen der Familie der epidermalen Wachstumsfaktorrezeptoren (EGFR) sind in vielen Krebsarten dereguliert und ursächlich an der malignen Transformation beteiligt. Da die Aktivierung vom Rezeptor ausgehender Signaltransduktionskaskaden auf spezifischen Protein-Protein-Interaktionen basiert, kann durch gezielte Interferenz mit diesen Interaktionen das proliferative Signal ausgeschaltet und das Tumorwachstum angehalten werden. Für diese gezielte Interferenz wurde in der vorliegenden Arbeit das Peptid-Aptamer-System eingesetzt, mittels dem Peptide, die in ein Gerüstprotein inseriert sind, aufgrund ihrer Affinität zu einem Zielprotein selektiert werden können. Drei Peptid-Aptamere (KDI1, KDI3, KDI4), die spezifisch mit dem EGF-Rezeptor interagieren, konnten isoliert werden. lntrazelluläre Expression von Peptid-Aptamer KDI1 oder Einbringung des bakteriell exprimierten Peptid-Aptamers KDI1 mittels einer Proteintransduktionsdomäne führte zu reduzierter EGF-abhängiger Proliferation und Transformation. Durch Interferenz des Aptamers mit dem EGF-Rezeptor war die EGF-induzierte Phosphorylierung von Tyrosin 845, 1068 und 1148, sowie die Aktivierung von p46 Shc und STAT3 reduziert. Daher wurde gefolgert, dass das Peptid-Aptamer die EGF-abhängige Rekrutierung der zytoplasmatischen Kinase c-Src an den Rezeptor inhibiert. Durch Fusion einer zusätzlichen Domäne wie der SOCS-Box-Domäne konnte den Peptid-Aptameren eine zusätzliche inhibitorische Funktion gegeben werden. Hierbei handelt es sich um eine Domäne, die spezifisch Kontakt mit E3-Ubiquitin-Ligasen aufbauen kann. Es konnte gezeigt werden, dass durch Transduktion eines solchen Peptid-Aptamers der Rezeptor spezifisch ubiquitinyliert und damit degradiert wird. Das Peptid-Aptamer-System eignet sich somit dazu, Inhibitoren für vorgegebene Zielmoleküle zu isolieren, die sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der Tumortherapie Anwendung finden können.