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The post-transcriptional modification of the canonical nucleoside uridine into its rotational isomer pseudouridine occurs in non-coding as well as coding RNA and is the most abundant post-transcriptional modification in all kingdoms of life. While the occurrence of pseudouridine has been linked to the enhancement of stability and the codon-anticodon interaction in tRNAs, enhancement of the translation efficiency in rRNAs, regulatory functions in spliceosomal snRNA and nonsense codon suppression in mRNA, its exact role in many RNAs is still ambiguous. The uridine to pseudouridine isomerization can either be catalyzed by one of various standalone pseudouridylases or it can be performed in an RNA-guided manner by H/ACA ribonucleoproteins. In eukaryotes, the guide RNA always adapts a conserved bipartite, double-hairpin conformation. Each hairpin contains an internal RNA-loop motif, which can recruit a specific substrate RNA via base pairing. The catalytically active RNP is formed by the interactions of the guide RNA with four proteins. While Cbf5 forms the catalytically active center, Nop10 and Nhp2 perform auxiliary functions and Gar1 is involved in substrate turnover. Up until now, most structural knowledge about H/ACA RNPs has been derived from archaeal complexes, while the exact structure-function-relationships between RNA and proteins in eukaryotic RNPs is still ambiguous. While archaeal H/ACA RNPs share many similarities with eukaryotic RNPs and act as good model system, there are also many differences between them like eukaryotic specific protein domains as well as the overall bipartite complex structure, dictated by the snoRNA. Investigating pseudouridylation by eukaryotic H/ACA RNPs opens up a broad area of research and helps to gain a better understanding of this enzyme class – especially since malfunction of H/ACA RNPs has been linked to the genetic disease Dyskeratosis congenita as well as several types of cancer.
The main goal of this thesis was to gain new insights into the RNA/protein interactions in the eukaryotic snR81 H/ACA snoRNP from Saccharomyces cerevisiae on a structural as well as dynamical level. In the first part of this thesis, the main goal was to in vitro prepare a functionally active snR81 H/ACA RNP. The guiding snoRNA was prepared by in vitro transcription and purification, while the Saccharomyces cerevisiae proteins were recombinantly expressed from Escherichia coli. Apart from the full length, bipartite snR81 snoRNP, several sub-complexes of the RNP were reconstituted. Therefore, snoRNA constructs were designed and prepared, which only contained a single hairpin motif of the complex. Furthermore, snoRNA constructs in which the apical hairpin stem was replaced by a stable tetraloop were prepared, to investigate the influence of the apical stem on protein binding and activity. Also, for the eukaryotic proteins, a shortened version of Gar1 (Gar1Δ) was utilized, which lacks the eukaryotic specific RGG domains, that have been characterized as accessory RNA binding motifs. Reconstituted snoRNPs were utilized in catalytic activity assays, monitoring the turnover rate of uridine to pseudouridine. For this purpose, radioactively labeled substrate RNAs were prepared by phosphorylation and splinted ligation of oligonucleotides and were objected to reconstituted H/ACA RNPs under single as well as multiple turnover conditions. In the second part of this thesis, the RNA/protein interactions were dissected via single molecule FRET spectroscopy. Therefore, the snoRNA was labeled with an acceptor fluorophore via NHS ester/amine-reaction. Furthermore, the snoRNA contained a biotin-handle, allowing immobilization of the complex during the experimental time-window of the spectroscopic analysis. Eukaryotic specific protein Nhp2 was labeled with a donor fluorophore via “click” chemistry, which included the chemical synthesis and incorporation by genetic code expansion of non-canonical amino acids. The interactions of Nhp2 with the different snoRNA constructs (standalone-hairpins “H5” and “H3”, as well as hairpins lacking the apical binding motif “H5Δ” and “H3Δ”) were monitored on a single molecule level.
In summary, it was possible to gain new insights into the complex structure and the dynamical behavior of the still sparsely characterized eukaryotic H/ACA RNPs. Especially, new knowledge could be obtained about the hairpin specific behavior on the bipartite RNA complex structure, including the rather ambiguous role of the protein Nhp2 and the contribution of the eukaryotic specific features of Gar1 in their interaction with the guide/substrate RNA.
Carotinoide sind Pigmente, die in Pflanzen, Algen, einigen Pilzen und Bakterien vorkommen. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Photosynthese durch Absorption von Licht und beim Lichtschutz. Sie sind verantwortlich für die braunen, roten, orangen und gelben Farben von Obst, Gemüse, Herbstblättern und die Farbe einiger Blumen und Algen. Tiere können keine Carotinoide synthetisieren, daher ist ihre Anwesenheit auf die Nahrungsaufnahme zurückzuführen. Carotinoide sind Tetraterpenoide (40C), die aus Isoprenoidmolekülen (5C) synthetisiert werden. Der Methylerythritol-phosphatweg ist der Carotinoid-Vorläuferweg, der die Isoprenoideinheiten bildet. Carotinoide haben aufgrund ihrer gesundheitlichen Vorteile das Interesse der Nutrazeutika-Industrie geweckt.
Fucoxanthin ist ein Carotinoid, das nur in Kieselalgen, Braunalgen, Haptophyten und einigen Dinoflagellaten vorkommt. Aufgrund seiner Vorteile zur Vorbeugung von Krebs, kognitiven Erkrankungen und Fettleibigkeit sowie seiner antioxidativen Eigenschaften ist Fucoxanthin ein sehr interessantes Molekül fur die Nutrazeutikabranche.
Fucoxanthin hat eine komplexe chemische Struktur mit einer Allenbindung und einer Epoxyketogruppe. Daher wäre seine chemische Synthese kompliziert, da es auch eine stereokontrollierte Synthese erfordert86. Aus diesem Grund ist die Extraktion aus Makroalgen oder Mikroalgen die Methode der Wahl für die kommerzielle Herstellung von Fucoxanthin.
In dieser Arbeit bestand das Ziel darin, die Fucoxanthin-Produktivität in Kieselalgen mit gentechnischen Methoden zu steigern, damit die Zellen mehr Fucoxanthin produzieren. Zu diesem Zweck wurde der Effekt der Insertion zusätzlicher Kopien von Genen in das Genom untersucht, die für geschwindigkeitsbestimmende oder Schlüsselenzyme im Carotinoid- und MEP-Weg kodieren.
Zu Beginn wurden diese Effekte bei einzelnen Mutanten beobachtet. Letztendlich ist es jedoch das Ziel, eine Mutante zu erzeugen, die mehrere geschwindigkeitsbestimmende Enzyme überexprimiert, um auf diese Weise Engpässe zu vermeiden. In früheren Studien erreichten Eilers et al.54 durch die einmalige Überexpression der psy- und dxs-Gene in der Kieselalge P. tricornutum einen 2.4- und 1.8-fachen Anstieg der Fucoxanthin-Spiegel.
In dieser Arbeit führte die Insertion zusätzlicher Kopien der Gene idi und pds2 nicht dazu, dass die Zellen mehr Fucoxanthin produzieren. Im Gegensatz dazu erreichten die Mutanten mit zusätzlichen Kopien der Gen ggpps und mit zusätzlichen Kopien sowohl von psy als auch von dxs seine um 28% bzw. 10% höhere Fucoxanthin-Produktivität pro Million Zellen. Bei diesen Mutanten ist die Gesamtproduktivität jedoch geringer als beim Wildtyp, da ihr Wachstum langsamer als beim Wildtyp ist.
Unter Berücksichtigung der besten Zielgene wurden Mutanten erzeugt, die gleichzeitig zusätzliche Kopien von psy, dxs und ggpps enthielten. Die Mutanten hatten unter sehr niedriegen Lichtbedingungen eine um bis zu 61% höhere Produktivität pro Million Zellen als der Wildtyp. Ausnahmsweise wurden diese Mutanten bei sehr schwachem Licht (10 µE m-2 s-1) gezüchtet, da sie sehr gestresst waren und als Zellklumpen wuchsen. Obwohl die Gesamt-Fucoxanthin-Spiegel in diesen Mutanten unter diesen Bedingungen höher sind als im Wildtyp, sind sie daher niedriger als die Fucoxanthin-Spiegel bei den in anderen Experimenten verwendeten Lichtbedingungen (50 µE m-2 s-1). Als Ergebnis dieser Experimente kann gesagt werden, dass die Belastung der Zellen nach den genetischen Veränderungen untersucht werden muss, da dies zu einer Abnahme der Biomasse und folglich zu einer Abnahme der Fucoxanthinproduktion führt. Alternativ könnte auch eine 2-Stufen-Kultur etabliert werden, in der in einem ersten Schritt eine hohe Biomasse erreicht wird und im zweiten Schritt die Expression der interessierenden Gene induziert wird.
Aufgrund der antioxidativen Eigenschaften von Carotinoiden besteht eine übliche Strategie zur Akkumulation von Carotinoiden darin, die Zellen unter oxidative Stressbedingungen zu setzen. Diese Strategie ist jedoch nicht wirksam für die Anreicherung von Fucoxanthin unter hohen Salzkonzentrationen oder hohen Lichtbedingungen. Bessere Versuchspläne könnten jedoch eine 2-Stufen-Kultur oder adaptive Laborbedingungen gewesen sein.
Eine andere mögliche Strategie zur Erhöhung des Fucoxanthinspiegels wäre die Durchführung einer zufälligen Mutagenese der Zellen. Auf diese Weise sind keine Vorkenntnisse über den Carotinoidsyntheseweg und seine Regulation erforderlich und es kann zu Veränderungen in Genen führen, die keine offensichtlichen Ziele sind.
Experimente mit zufälliger Mutagenese erfordern ein Hochdurchsatz-Screeningsystem, da Hunderte oder sogar Tausende von Mutanten erhalten werden. Eine mögliche Strategie, um die Kultivierung der hohen Anzahl von Mutanten zu vereinfachen, ist die Einkapselung dieser Mutanten in Alginatkügelchen. Auf diese Weise können alle Mutanten in demselben Gefäß kultiviert werden. Die eingekapselten Zellen können dann beispielsweise mit einem Durchflusszytometer auf große Partikel durch Fluoreszenz- oder Absorptionsmessungen gescreent werden.
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Im Mittelpunkt der Studie steht die Überprüfung der Wirksamkeit der Fortbildungs¬reihe zum förder- und kompetenzorientierten Unterrichten, die von der Verfasserin konzipiert und hessenweit für Lehrpersonen aller Schulformen angeboten wurde. Bislang sind kohärente Konzepte zum förder- und kompetenzorientierten Unterrichten oder zur individuellen Förderung zumindest nicht weit verbreitet. Das Erkenntnisinteresse der vorliegenden Studie war daher auf die Frage gerichtet, ob sich durch eine dieser Art konzipierten Fortbildungsreihe tatsächlich die Nutzung ausgewählter Prinzipien, Instrumente und Verfahren sowie die Selbstwirksamkeitserwartungen bezüglich der Steuerung und Unterstützung von Lernprozessen verändern und beeinflussen lassen. Diese Fragestellung kann aufgrund der empirischen Daten bejaht werden.
Als wichtige Voraussetzung für den Erfolg der Fortbildungsreihe zum förder- und kompetenzorientierten Unterrichten kann die in den formativen Evaluationen ermittelte Akzeptanz der Fortbildung und der Fortbildungsinhalte angesehen werden. Sie bildet die Grundlage für Veränderungsprozesse, die sich messbar insbesondere in der Follow-Up-Erhebung in der Zunahme der Nutzung von Prinzipien, Instrumente und Verfahren und in den Selbstwirksamkeitserwartungen der Lehrpersonen niederschlagen. Dieser Veränderungsprozess kann als bemerkenswert bezeichnet werden, da in den formativen Evaluationen die Frage nach der Nutzung und Umsetzbarkeit im eigenen Unterricht stets durch niedrigere Zustimmungswerte gekennzeichnet war und damit das Zutrauen und die Überzeugung in den persönlichen Veränderungsprozess zurückhaltend war im Vergleich zu den Zustimmungswerten zu den Inhalten der Fortbildungsreihe sowie zu deren Sinnhaftigkeit.
Akzeptanz, Zustimmung und die Einsicht in die Sinnhaftigkeit sowie die Überzeugung der Umsetzbarkeit im eigenen Unterricht können als Schlüsselelemente für die Veränderung der Handlungskompetenz von Lehrpersonen gesehen werden und stehen in Übereinstimmung mit entsprechenden Befunden der Conceptual-Change-Forschung. Damit konnte ein wesentliches Element erfolgreicher, da wirksamer Fortbildung insbesondere durch die Follow-Up-Erhebung empirisch belegt. Diese sollte nach ca. einem halben Jahr nach dem Ende der Fortbildungsreihe Aufschluss über die Nachhaltigkeit der Wirkung der Fortbildungsinhalte erbringen. Einschränkend soll hier jedoch auf die Reduktion der Stichprobe hingewiesen werden: Waren es zum 1.MZP 422 Lehrpersonen (270 FG, 152 KG), die an der Erhebung teilgenommen haben, waren es zum 2.MZP noch 347 Lehrpersonen (229 FG, 118 KG) und zum 3. Messzeitpunkt nur 172 Lehrpersonen (101 FG, 71 KG).
Insbesondere die durch die Fortbildungsreihe erzielten positiven Veränderungen der Selbstwirksamkeitserwartungen unterstreichen den Forschungsstand zu deren Bedeutung für nachhaltige Veränderung des Unterrichtshandelns von Lehrpersonen aller Schulformen. Von besonderem Interesse für die Konzeptualisierung von Lehrerfortbildungen erscheint der Zusammenhang zwischen der Vermittlung von Wissen und den Selbstwirksamkeitserwartungen. Aufgrund von Forschungsbefunden kann angenommen werden, dass ohne die Überzeugung und die Zuversicht, das erworbene Wissen erfolgreich im eigenen Unterricht umsetzen und in Handlungskompetenz überleiten zu können, keine Veränderungsprozesse und Lernen ausgelöst und ermöglicht werden. Dieser Zusammenhang sollte stärker in weiteren Studien überprüft werden, um Lehrpersonen künftig gezielter für und auf Veränderungen im Unterrichtshandeln vorbereiten und unterstützen zu können. Desweiteren gilt es, die Anleitung der Lehrpersonen zur Reflexion ihres Unter¬richtshandelns genauer in den Blick zu nehmen. Nach dem kompetenztheoretischen Ansatz von Baumert und Kunter (2006) und entsprechenden Forschungsbefunden kann die Selbstreflexion als ein wesentlicher Faktor für Veränderungsprozesse und vor allem für die Selbstwirksamkeitserwartungen angenommen werden. In der Fortbildungsreihe zum förder- und kompetenzorientierten Unterrichten wurden die Lehrpersonen jeweils zu Beginn jeder Veranstaltung zur Reflexion angeleitet über die umgesetzten Fortbildungsinhalte sowie deren Wirkung auf die Schülerinnen und Schüler. Hierzu sind weitergehende Forschungen wünschenswert, um auf der Grundlage entsprechender Befunde wirksame Fortbildungsangebote gestalten zu können.
Weiterer Klärungsbedarf besteht hinsichtlich der Implementation von Fortbil¬dungsinhalten in die Unterrichtspraxis. In der vorliegenden empirischen Studie konnte insbesondere durch die Follow-Up-Erhebung gezeigt werden, dass die Umsetzung und Implementation der Fortbildungsinhalte gelungen zu sein scheint und die Verbesserung der Nutzung von Prinzipien, Instrumenten und Verfahren zum förder- und kompetenzorientierten Unterrichten sowie die Steigerung der Selbstwirksamkeitserwartungen erkennbar sind. Dabei gilt als einschränkend zu bedenken, dass es sich bei den erhobenen Werten um Selbstauskünfte der Teilnehmer/-innen handelt. Gleichwohl kann insbesondere der signifikante Zuwachs in den Selbstwirksamkeitserwartungen als bedeutsam eingeschätzt werden, nachdem durch Forschungsbefunde nachdrücklich darauf verwiesen wird, dass gerade Überzeugungen von Lehrpersonen schwer zugänglich und veränderbar sind.
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Für ausgewählten Patienten mit Aortenklappeninsuffizienz (AI) bietet die Aortenklappenrekonstruktion eine sehr attraktive Alternative zum Klappenersatz, wodurch mögliche prothesenbezogene Komplikationen vermieden werden können.
Die begrenzte Zahl der Langzeitstudien sowie das Fehlen von standardisierten Verfahren machen die klappenerhaltende Aortenklappenchirurgie technisch anspruchsvoll.
Ziel dieser Arbeit ist es, die Langzeitergebnisse nach Aortenklappenrekonstruktion zu erfassen und die Haltbarkeit sowie die klappenbezogenen Komplikationen nach klappenerhaltender Aortenklappenchirurgie zu untersuchen.
Hierzu analysierten wir die klinischen Daten von 560 Patienten, die eine operative Versorgung mittels Aortenklappenrekonstruktion erhielten. Dabei wurden sowohl Segelpathologien (bikuspid sowie trikuspid) als auch Aortenwurzelpathologien berücksichtigt. Bei 56% der Patienten (n=313) wurde eine Reimplantation nach David durchgeführt. Bei 247 Patienten wurde bei isolierter Segelpathologie ohne Aortenwurzelbeteiligung eine Segelrekonstruktion durchgeführt. Pathologien der Aortenwurzel konnten mit subkommissuralen Nähten (bei 62 Patienten) oder mit Rekonstruktion des sinotubulären Übergangs (bei 60 Patienten) behoben werden. Begleitende Aorteneingriffe bei Aneurysma oder Dissektion der thorakalen Aorta wurden ebenfalls durchgeführt. So wurden bei 78 Patienten ein partieller Aortenbogenersatz, bei 12 Patienten ein kompletter Aortenbogenersatz und bei 14 Patienten ein Bogenersatz mit „Elephant Trunk“ Technik durchgeführt.
Die Nachuntersuchungen erfolgten anhand eines standardisierten Fragebogens 5 sowie durch transthorakal echokardiographische Verlaufskontrollen. Die durchschnittliche Nachuntersuchungszeit betrug 6.3 ± 4.6 Jahre, 97% der Patienten konnten dabei erfasst werden.
Die 30-Tage-Mortalität betrug 1,4%. Im Langzeitverlauf wurden 132 Verstorbene beobachtet, wobei 13 Patienten aufgrund eines kardiovaskulären Ereignisses verstarben. Das 10-Jahres-Überleben betrug 70%. Eine Reoperation war bei 39 Patienten notwendig, in 25 Fällen aufgrund von signifikanter Restinsuffizienz der Aortenklappe, in 5 Fällen aufgrund eines kombinierten Aortenklappenvitium. Endokarditis führte in 9 Fällen zur Reoperation (0,2% pro Patientenjahr). Die Freiheit von Reoperation betrug 88% nach 10 Jahren. Die klappenbezogenen Komplikationen ergaben eine kumulative linearisierte Inzidenz von 2% pro Patientenjahr.
Schlussfolgernd kann man sagen, dass die Aortenklappenrekonstruktion für ausgewählte Patienten eine gute Alternative zum Aortenklappenersatz darstellt. Die Haltbarkeit der Klappenfunktion erwies sich in der Langzeitbeobachtung als gut. Die adäquate Wahl der Operationstechnik bezogen auf die Pathologie führen zu guten Ergebnissen der Aortenklappenrekonstruktion mit akzeptabler Mortalität und Morbidität im Langzeitverlauf.
Schwerverletzte Patienten folgen einem biphasischen Mortalitätsmuster, mit einem ersten frühen Mortalitätsgipfel aufgrund von schweren Verletzungen des zentralen Nervensystems oder durch massiven Blutverlust. Der zweite, später auftretende Traumatod ist mit einer immunologischen Dysregulierung verbunden, welche durch eine ausgeprägte Inflammation häufig im (Multi)-Organversagen endet. Insbesonders thorakale Verletzungen sowie das Erleiden eines hämorrhagischen Schocks prädisponieren den Organismus für die Entwicklung von pulmonalen Komplikationen im klinischen Folgevelauf. Alkohol spielt hierbei eine wichtige Rolle. In den vergangenen 15 Jahren hat sich zwar die Anzahl der „Alkoholunfälle“ mit Personenschaden reduziert, dennoch tritt Alkohol als eine der häufigsten Unfallursachen bei 18-34jährigen auf. Zudem hat Alkohol durch seine immunmodulatorischen Eigenschaften einen signifikanten Einfluss auf die Entwicklung und Prognose von (infektiösen) Komplikationen im klinischen Folgeverlauf. Verunfallte Patienten mit einer akuten Alkoholintoxikation zeigen im Vergleich zu chronisch Alkoholisierten eine verringerte 24-Stunden-Letalität nach Trauma. Die Studienlage zu den Hintergründen ist äußerst kontrovers, und stellt den Kern der vorliegenden Arbeit dar. Eine zentrale Rolle in der Genese der post-traumatisch inflammatorischen Immunantwort nehmen die Monozyten, sowie die Alveolarmakrophagen (AM) in der Lunge, aber auch zirkulierende polymorphonukleäre Leukozyten (PMNL) insbesondere neutrophile Granulozyten ein. Die Monozyten aktivieren bspw. über die Inflammasomassemblierung Caspase-1 (Pyroptose), die das inaktive Interleukin (IL)-1β in seine aktive Form prozessiert, aktiviert und seine Sezernierung induziert. Neutrophile Granulozyten, die ebenfalls durch inflammatorische und chemotaktische Reize aktiviert werden, infiltieren durch Modifikationen ihrer Oberflächenrezeptoren wie CD11b, CD62L und CD31 entzündetes Gewebe. Am Ort der „Schädigung“ weisen sie eine prolongierte Lebensspanne auf, und tragen durch ihre verstärkte Akkumulation so zu einem hyper-inflammatorischen Zustand bei. Folglich wird das eigene Gewebe geschädigt, was im Verlust der Zell- und Organintegrität enden kann. Die zugrundeliegenden Pathomechanismen wurden in diversen Studien mit der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB assoziiert. Interessanterweise konnte die anti-inflammatorische Wirkung einer akuten Alkoholexposition mit der Hemmung des NF-κB, aber auch mit einer reduzierten Inflammasomassemblierung in vitro assoziiert werden.
Für die Untersuchung der akuten Alkoholwirkung wurde ein klinisch relevantes double hit Modell bestehend aus stumpfen Thoraxtrauma und hämorrhagischem Schock mit anschließender Flüssigkeitstherapie (TxT+H/R) genutzt. Um den Einfluss von Alkohol auf die posttraumatische Immunantwort mit Fokus auf die Rolle der zirkulierenden neutrophilen Granulozyten und Monozyten in der Genese pulmonaler Schädigungen zu untersuchen, erfolgte im vorliegenden Modell eine akute Gabe von Ethanol (5 g/kg, 30%, EtOH) zwei Stunden vor Hämorrhagie und Reperfusion. Zwei Stunden nach Reperfusion wurden die inflammatorischen Prozesse und das Outcome der Tiere untersucht.
Die Ergebnisse zeigen, dass TxT+H/R zu diffusen histopathologischen Lungenschäden führt, welche mit einer erhöhten Proteinkonzentration in der bronchoalveolären Lavage (BAL), verstärkten Infiltration des Lungengewebes mit PMNL sowie einer systemischen Aktivierung von neutrophilen Granulozyten und Monozyten verbunden war. Neutrophile Granulozyten zeigten eine signifikante Reduktion der Oberflächenexpression von CD62L und einen signifikanten Anstieg von CD11b und CD31; in zirkulierenden Monozyten konnte eine Inflammasomaktivierung durch direkten Nachweis der aktiven Caspase-1 gezeigt werden. Die Analyse der aktiven Effektorcaspasen der Apoptose Caspase-3 und -7 zeigte eine reduzierte Apoptose in zirkulierenden neutrophilen Granulozyten. Orale Gavage EtOH reduzierte signifikant die lokale Inflammation in der Lunge, welche mit einer verminderten PMNL Infiltration, verminderten IL-6 Genexpression und reduziertem BAL Proteingehalt einherging. Während die reduzierte Proteinkonzentration in der BAL durchaus für einen verminderten Lungenschaden spricht, war dieser histopathologisch nicht festellbar. Systemisch modulierte die akute EtOH-Gabe Oberflächenrezeptorexpression auf zirkulierenden neutrophilen Granulozyten, was deren reduzierte Aktivierung bestätigt. Die verminderte inflammatorische Aktivierung von zirkulierenden Monozyten und Granulozyten zeigte sich ebenfalls in der reduzierten Inflammasomaktivität.
Wir konnten wichtige Erkenntnisse für das Verständnis der Genese von pulmonalen Komplikationen nach TxT und HS, sowie die immunmodulatorischen Eigenschaften von Alkohol auf das angeborene Immunsystem darstellen. Die akute Alkoholexposition reduzierte die systemische Immunantwort, welcher in diesem klinisch relevanten Kombinationstrauma vermutlich eine reduzierte lokale Inflammationsantwort folgte. In weiterführenden Studien sollten die zugrundeliegenden Signalwege, Einfluss der Traumachwere sowie der Schwere der Alkoholintoxikation untersucht werden.
Autophagy, together with the ubiquitin-proteasome system, is the main quality control pathway responsible for maintaining cell homeostasis. There are several types of autophagy distinguished by cargo selectivity and means of induction. This thesis focuses on macroautophagy, hereafter autophagy, where a double-layered membrane is formed originating from the endoplasmatic reticulum (ER) engulfing cargo selectively or unselectively. Subsequently, a vesicle forms around the cargo, an autophagosome, and eventually fuses with the lysosome leading to degradation of the vesicle content and release of the cargo “building blocks”. Basal autophagy continuously occurs, unselectively engulfing a portion of the cytoplasm. However, autophagy can also be induced by stress such as starvation, protein aggregation, damaged organelles, intracellular pathogens etc. In this case, the cargo is selectively targeted, and the fate of the autophagosome is the same as in basal autophagy. In recent years, interest in identifying mechanisms of autophagy regulation has risen due to its importance in neurodegenerative diseases and cancer. Given the complexity of the process, its execution is tightly regulated from initiation, autophagosome formation, expansion, closure, and finally fusion with the lysosome. Each of the steps involves different protein complexes, whose timely activity is orchestrated by post-translational modifications. One of them is ubiquitination. Ubiquitin is a small, 76-amino acid protein conjugated in a 3-step reaction to other proteins, in a reversible manner, meaning undone by deubiquitinases. Originally described as a degradation signal targeting proteins to the proteasome, today it is known it has various additional non-proteolytic functions, such as regulating a protein’s activity, localization, or interaction partners. The role of ubiquitin in autophagy has already been shown. However, given the reversibility and fine-tuning of the ubiquitin signal, many expected regulators remain unidentified. This work aimed to identify novel deubiquitinating enzymes that regulate autophagy. We identified ubiquitin-specific protease 11 (USP11) as a novel, negative regulator of autophagy. Loss of USP11 leads to an increase in autophagic flux, whereas overexpression of USP11 attenuates it. Moreover, this observation was reproducible in model organism Caenorhabditis elegans, emphasizing the importance of USP11 in autophagy regulation. To identify the mechanism of USP11-dependent autophagy regulation, we performed a USP11 interactome screen after 4 hour Torin1 treatment and identified a plethora of autophagy-related proteins. Following the most prominent hits, we have investigated versatile ways in which USP11 regulates autophagy. USP11 interacts with the PI3KC3 complex, the role of which is phosphorylating lipids of the ER, thereby initiating the formation of the autophagosomal membrane. Phosphorylated lipids serve as a recruitment signal for downstream effector proteins necessary for the membrane expansion. The core components of the complex are VPS34, the lipid kinase, ATG14, the protein responsible for targeting the complex to the ER, VPS15, a pseudokinase with a scaffolding role, Beclin1, a regulatory subunit, and NRBF2, the dimer-inducing subunit. We have found USP11 interacts with the complex and, based on its activity, USP11 influences post-translational status of all the aforementioned subunits, except for ATG14. Moreover, we have found that loss of USP11 leads to an increase in NRBF2 levels, whereas it does not change the levels of the other proteins. Given that the dimerization of the complex leads to an increase in complex activity, we investigated if the complex is more tightly formed in the absence of USP11, and if it is more active. We have found both to be the case. Although the exact mechanism of USP11-dependent PI3KC3 complex regulation remains to be identified, we found that loss of USP11 stimulates the complex formation and activity, likely contributing to the general effect of USP11 on autophagy flux. Additionally, we found that USP11 modulates levels of mTOR, the most upstream kinase in autophagy initiation steps and general multifaceted metabolism regulator. Loss of USP11 led to downregulation of mTOR levels, suggesting USP11 may rescue mTOR from proteasome-mediated degradation. Furthermore, we found mTOR to be differentially modified depending on the activity of USP11. However, it remains to be shown if USP11-dependent mTOR regulation contributes to the observed autophagy phenotype. Taken together, USP11 is a novel, versatile, negative regulator of autophagy, and an important addition to our knowledge on the regulation of autophagy by the ubiquitin system.
In vitro release testing as an alternative to establishing bioequivalence of drug products in vivo
(2020)
Generische Arzneimittel werden als Arzneimittel definiert, die im Vergleich zu einem Referenzarzneimittel hinsichtlich der meisten pharmazeutischen Aspekte identisch sind.
Um die therapeutische Äquivalenz zum Referenzprodukt sicherzustellen, sind Bioverfügbarkeitsstudien erforderlich. Für Arzneimittel, die als feste, perorale, schnell freisetzende Darreichungsformen formuliert sind, kann auf den Nachweis der Bioäquivalenz in vivo zugunsten eines vergleichenden Freisetzungstests in vitro im Rahmen eines sogenannten Biopharmaceutics Classification System (BCS) basierten Biowaivers verzichtet werden.
Der BCS-basierte Biowaiver ist ein vielversprechendes Instrument, welches Kosteneinsparungen sowie eine Verringerung des regulatorischen Aufwands im Zuge der behördlichen Zulassung von Generika ermöglicht und dazu beitragen kann, die Zugänglichkeit unentbehrlicher Arzneimittel zu verbessern. Dabei gibt es jedoch auch Hürden, welche die weitläufige Anwendung des Verfahrens verhindern: Unklare Löslichkeits- und Permeabilitätsklassifizierungen von Wirkstoffen, Arzneimittel, welche die in vitro Freisetzungskriterien nicht erfüllen, sowie Zweifel an der Eignung der regulatorischen Spezifikationen, Freisetzungsunterschiede in vitro erfassen zu können, die für das Verhalten in vivo relevant sind.
In der vorliegenden Dissertation werden diese Probleme thematisiert, indem eine umfassende Bewertung der Anwendbarkeit und Einschränkungen des BCS-basierten Biowaivers in seinem aktuell regulatorisch vorgeschriebenen Ablauf vorgenommen wird. Mögliche Anpassungen des Verfahrens wurden auf der Grundlage experimenteller in vitro Daten untersucht, bewertet und mithilfe von in silico Simulationsmodellen auf die Situation in vivo extrapoliert.
Ziel dieser klinischen Studie war es, die Ergebnisse der operativen Behandlung eines idiopathischen Makulaforamens durch Vitrektomie, ggf. in Kombination mit einer Phakoemulsifikation, ILM-Peeling und einer Tamponade entweder mit Luft oder mit 20%-igem SF6-Gas zu vergleichen. Primärer Endpunkt war die Verschlussrate nach einer Vitrektomie und die Reoperationsrate bei primär nicht geschlossenen Makulaforamina. Sekundärer Endpunkt war die Visusentwicklung in der ersten postoperativen Woche und nach 3 Monaten.
In der vorliegenden Arbeit wurden hierzu retrospektiv 117 Augen von 117 konsekutiven Patienten analysiert. Es wurden die Ergebnisse von 2 Patientengruppen verglichen. In der ersten Gruppe wurden 66 Augen (m=27, w=39, Altersmedian 70 Jahre), bei denen am Ende der Vitrektomie eine Tamponade mit Luft erfolgte, untersucht. In der zweiten Gruppe wurden die Ergebnisse von 51 Augen (m=20, w=31, Altersmedian 71 Jahre), bei denen 20%-SF6-Gas als Tamponade verwendet wurde, ausgewertet. Bei etwa 70 % der Augen beider Gruppen erfolgte eine simultane Phakoemulsifikation. Der Verschluss des Makulaforamens wurde bereits in den ersten postoperativen Tagen mit einem modifizierten Fourier Domain-OCT untersucht. Sobald der Verschluss des Makulaforamens im OCT gesichert werden konnte, wurde die postoperative „Gesicht nach unten“-Lagerung („Bauchlage“) beendet. Die mediane Lagerungszeit betrug 1 Tag (Spanne 1-6 Tage). Der Zeitraum der Nachbeobachtung betrug 3 Monate (Median).
Die Verschlussrate nach einer Vitrektomie aller Makulaforamina betrug 87,2% (102/117 Augen). Die primäre Verschlussrate der Luft-Gruppe und der SF6-Gas-Gruppe betrug 83,3% (55/66 Augen) bzw. 92,2% (47/51 Augen). Bei Augen mit einem persistierenden Foramen erfolgte eine frühe Reoperation. Die Verschlussrate nach 3 Monaten lag insgesamt bei 99,1% (116/117 Augen), in der Luft-Gruppe bei 98,5% (65/66 Augen) und in der SF6-Gas-Gruppe bei 100% (51/51 Augen). Es zeigte sich kein statistisch signifikanter Unterschied der Verschlussrate bzw. der anatomischen Ergebnisse zwischen den beiden Endotamponade-Gruppen.
Es konnte jedoch ein statistisch signifikanter Unterschied des Fernvisus bei der Entlassung zwischen beiden Endotamponadegruppen nachgewiesen werden. Der logMAR-Visus bei Entlassung lag in der Luft-Gruppe mit 1,3 (Median) deutlich unter dem Visus der SF6-Gas-Gruppe mit 1,9 (Median). Die Anwendung von Luft führte somit im Vergleich zu SF6 zu einem schnelleren postoperativen Visusanstieg. In beiden Gruppen zeigte sich nach 3 Monaten eine signifikante Visusbesserung. Es ließ sich kein signifikanter Unterschied des Fernvisus zwischen den beiden Gruppen mehr nachweisen.
Die Makulaforamenchirurgie mit pars plana Vitrektomie und Peeling der ILM erzielte sowohl mit einer Luft- als auch mit einer 20%-SF6-Gas-Tamponade guten anatomischen und funktionellen Ergebnissen. Mit einer kurz wirksamen Endotamponade erscheint eine postoperative Lagerung essenziell, dürfte aber in den meisten Fällen nur wenige Tage erforderlich sein, um den Verschluss eines durchgreifenden Makulaforamens zu erreichen. Die Reoperations-Rate nach einer Lufttamponade war bei sehr großen Foramina (> 600 µm) signifikant höher als bei Foramina mit einem Durchmesser kleiner 600 µm. Daher scheint die Anwendung von Gasen, die länger als Luft wirken, nur bei sehr großen Foramina erforderlich zu sein. Vorteil einer kurz wirkenden Lufttamponade ist die postoperativ um einige Tage schneller einsetzende visuelle Rehabilitation, so dass die Patienten früher in ihren Alltag zurückkehren können. Eine frühe postoperative Untersuchung der Makula unter Einsatz der optischen Kohärenztomographie ist Voraussetzung für eine individualisierte Steuerung der Lagerung und für eine möglichst frühe Erkennung und Reoperation von nicht geschlossenen Makulalöchern.
Throughout their life cells of eukaryotic organisms can be confronted with a variety of proteotoxic stresses and in order to survive, corresponding resistance mechanisms had to evolve. Proteotoxic stresses can cause misfolding of proteins and accumulation of toxic protein aggregates. Failure to remove aggregates of misfolded proteins compromises cellular function and can ultimately cause cell death and disease. To deal with this challenge, cells utilize a complex network of protein quality control pathways, including chaperones, the ubiquitin-proteasome system and the autophagy system.
Another mechanism to cope with proteotoxic stresses is the stalling of translation initiation in order to save valuable resources and prevent faulty translation. Upon stress, intrinsically disordered RNA-binding proteins such as TIA-1 or G3BP1/2 are recruited to stalled preinitiation complexes and a network of multivalent interactions between RNAs and proteins is formed. These mRNP networks can merge with each other and phase separate into membraneless liquid-like structures called stress granules (SGs). Once stress is released, SGs are quickly resolved and translation continues. Yet, chronic stress or mutations of SG-associated proteins can cause persistent SGs, which can sequester misfolded proteins and have been linked to neurodegenerative diseases such as amyotrophic lateral sclerosis or frontotemporal dementia.
In mammalian cells, three isoforms of the small ubiquitin-related modifier (SUMO), SUMO1, SUMO2 and SUMO3 are covalently attached to lysine residues of target proteins. SUMO conjugation is catalyzed via an enzymatic cascade of an heteromeric E1 activating enzyme, the E2 conjugating enzyme Ubc9 and in some cases one of a limited number of E3 SUMO ligases. SUMOylation is a dynamic modification and can be reversed by SUMO isopeptidases, the best characterized of which belong to the SENP family. Cellular stresses such as heat or oxidative stress strongly induce SUMOylation resulting in increased numbers of poly-SUMOylation (formation of SUMO2/3 chains) on nuclear proteins.
The SUMO-targeted ubiquitin ligase (STUbL) RNF4 harbors four SUMO interaction motifs in its N-terminal domain. This feature allows RNF4 to specifically bind poly-SUMOylated proteins and catalyze their proteolytic or non-proteolytic ubiquitylation.
A variety of substrate proteins have been shown to undergo SUMO-primed ubiquitylation by RNF4 in response to stress or DNA damage. RNF4-mediated ubiquitylation is often a signal for proteolytic degradation of these substrates.
In this work we aimed by identify novel RNF4 targets, in heat-stressed cells in order to gain a wider understanding of the nuclear proteotoxic stress response. Analysis by mass spectrometry revealed that a large fraction of RNF4-interacting proteins in heatstressed cells are nuclear RNA-binding proteins, many of which shuttle outside the nucleus and associate with SGs upon stress. We validated, that nuclear RNA-binding proteins, such as TDP-43 and hnRNP M are indeed heat-induced targets of SUMOprimed ubiquitylation by RNF4.
These initial results led us to further investigate the links between the SUMO/RNF4-mediated, nuclear protein quality control and the dynamics of cytosolic heat- or arsenite-induced SGs. SUMO2/3 and RNF4 are mainly nuclear proteins and we confirmed that they do not associate with SGs. Yet, we could demonstrate that depletion of SUMO2/3, the E3 SUMO ligase PML or RNF4 as well as chemical inhibition of SUMOylation strongly delayed SG clearance upon stress release, indicating that a functional STUbL pathway is essential for the timely clearance of SGs.
Next, we investigated how stress-induced poly-SUMOylation is regulated. Our data shows that SENP levels and activities are reduced in response to heat and arsenite stress, which allows the buildup of poly-SUMO chains on nuclear proteins. Limitation of poly-SUMOylation by overexpression of the SUMO chain-specific isopeptidases SENP6 and SENP7 induced SG formation. In contrast, poly-SUMO-priming by chemical depletion of SENP6 with the drug hinokiflavone drastically limited SG formation upon stress treatment. These results indicate a clear role of chain-specific SENPs in the regulation of stress-induced poly-SUMOylation and SG dynamics.
Last, we investigated whether the STUbL pathway could affect the phase separation of FUSP525 (an ALS-linked mutant of the SG-associated protein FUS) and observed that perturbations of the STUbL pathway lead to an increased phase separation of FUSP525L.
Thus, our work connects the SUMO/RNF4 protein quality control mechanism to the dynamics of SGs supporting the hypothesis that release of proteotoxic stress in the nucleus facilitates the clearance of cytosolic SGs. Thereby, we discovered a previously unknown link between the nuclear and cytosolic axis of proteotoxic stress response.
In the past decade, tissue-resident innate lymphoid cells (ILC) have become a central field of immunological research. ILC are a family of innate immune cells comprising cytotoxic Natural Killer (NK) cells and the non-cytotoxic helper like ILC1, ILC2 and ILC3. They mirror the functions and phenotypes of T cells, but do not require rearranged antigen-specific receptors for their rapid response to signals from injured or infected tissue. As potent cytokine producers being enriched in mucosal tissue, ILC play an essential role in tissue maintenance and regulating immunity to chronic inflammation and infection (Vivier et al., 2018). Although heterogeneity and plasticity of ILC complicates their classification, the pathophysiology of a broad variety of autoimmune and chronic inflammatory diseases have been associated with dysregulations in ILC subset distribution and functions (Dzopalic et al., 2019). This highlights their importance in human health and disease and accounts for the need for markers unambiguously describing the different ILC subtypes. This work introduces NKp65, a C-type lectin-like receptor (CTLR) encoded in the natural killer gene complex by the KLRF2 gene, as an exclusive marker for human ILC3. NKp65 expression especially discerns ILC3-like NK cell precursor from mature NK cells which express the NKp65-relative NKp80. Moreover, flow cytometric analysis of NKp65 expression aids in the demarcation of natural cytotoxicity receptor (NCR) expressing ILC3, from the closely related but functionally distinct RORt+ LTi cells and NCR- ILC3. This work further provides insights into NK cell development by in vitro differentiation studies in which NKp65 expressing cells are generated in presence of OP9 feeder cells and cytokines to support development. In such cultures, NKp65 expressing in vitro ILC (ivILC) acquire NKp80 expression in a Notch-dependent manner indicating their differentiation into mature NK cells. Acquisition of NK cell phenotypic markers is accompanied by NKp65 downregulation which leads to the mutually exclusive expression of NKp80 on NK cells and NKp65 on ILC3-like cells. Further insights are provided into the functional consequences of NKp65 engagement by its cognate high affinity ligand ‘keratinocyte-associated C-type lectin’ (KACL) which is selectively expressed on human keratinocytes (Bauer et al., 2015; Spreu et al., 2010). Expressed on ivILC, NKp65 mediates killing of KACL expressing target cells, suggesting that NKp65-KACL interaction promotes cellular cytotoxicity. In this context, the observed metalloproteinase dependent shedding of NKp65 might play a role in the termination of the cellular interaction. The findings on the regulation of NKp65 expression demonstrate the presence of a functional STAT5 response element in the KLRF2 promoter endowing a transcriptional control of NKp65 expression by IL-7 signaling. This provides an interesting link between the dependency of ILC3 on IL-7 signaling for their maintenance and the specific expression of NKp65 on these cells.
In summary, this study provides new insights into the physiologic expression of the CTLR NKp65 on human ILC3. The dependency of NKp65 surface expression on sustained STAT5 signaling provided by IL-7 underlines the connection of NKp65 expression and an ILC3 phenotype which might contribute to promote future research in discerning the interspersed pathways of ILC3 and NK cell development. The tissue and cell specific expression of NKp65 on ILC3 and its ligand KACL on keratinocytes of the human skin further suggests an important role of this genetically coupled receptor-ligand pair in tissue specific immunosurveillance.
Die Frage der Frauenrechte in Afghanistan diente nach dem Sturz des Taliban-Regimes als Legitimation für das militärische und entwicklungspolitische Engagement der internationalen Gemeinschaft. Jedoch existieren bis heute nur wenige empirische Arbeiten, die Aufschluss über Lebenslagen afghanischer Frauen geben und Interventionen lokaler Akteur*innen untersuchen, die diese adressieren. Die vorliegende Dissertation, die in der feministischen Ethnologie und in der Ethnologie der Menschenrechte verortet ist, trägt dazu bei, diese Forschungslücken zu schließen.
Die Daten wurden in mehrmonatigen teilnehmenden Beobachtungen in zwei afghanischen Frauenrechts-NGOs und einem Frauenrechtsnetzwerk erhoben, ergänzt von 38 Interviews. Vier Interventionsformen gegen Gewalt an Frauen werden analysiert: Neben Frauenselbsthilfegruppen und Frauenhäusern sind dies Interaktionen mit religiösen und anderen Machtakteuren. Nach Merry (2006) werden die Interventionen als Aushandlungs- und Übersetzungsprozesse divergierender Vorstellungen über Geschlechternormen und soziale Praktiken innerhalb des afghanischen Normenpluralismus konzeptualisiert.
Die Studie liefert Ergebnisse auf mehreren Ebenen. Erstens werden sowohl spezifische Bedingungen für die Wirksamkeit der untersuchten Interventionsformen herausgearbeitet als auch ihre jeweiligen Begrenzungen, welche in den vorherrschenden Machtdynamiken begründet sind. Deutlich wird zweitens der Nutzen der universalen Menschenrechte als Bezugs- und Legitimationsrahmen für die Aktivist*innen, wobei sich gleichermaßen zeigt, wo sich der Bezug auf Menschenrechte als problematisch erweist. Um Rückschlüsse für zukünftige Interventionen von Frauenrechts-NGOs auch über den afghanischen Kontext hinaus ziehen zu können, wird drittens eine Erweiterung des Theorie-Praxis-Modells nach Merry (2006) vorgeschlagen, welche die Kontextualisierung in Machtverhältnisse miteinbezieht, sowie Begrenzungen als Indikatoren für Aushandlungsspielräume postuliert.
Hintergrund: Die Einnahme vieler Antidepressiva und Antipsychotika in der frühen Schwangerschaft kann nach aktuellem Forschungsstand als sicher bezüglich des Risikos für Fehlbildungen erachtet werden. Daten hinsichtlich der Sicherheit einer Psychopharmakotherapie während der Stillperiode sind hingegen rar. Die meisten Betroffenen würden einerseits gerne ihre Kinder stillen, andererseits wollen sie aber auch sicher sein, dass sie ihrem Nachwuchs dadurch nicht schaden.
Ziele: Unser Ziel war es herauszufinden ob eine Korrelation zwischen der Tagesdosis der Psychopharmaka und der Medikamentenkonzentration im Serum sowie in der Muttermilch (MM) besteht. Weiterhin untersuchten wir, ob es eine allgemeingültige Regeln gibt, wie sich Muttermilchmedikamentenkonzentrationen im Tagesverlauf verhalten. Außerdem wollten wir herausfinden ob die Medikamentenexposition in der Schwangerschaft und/oder Stillperiode einen Einfluss auf die Entwicklung des Kindes in den ersten zwölf Lebensmonaten hat.
Methoden: Wir untersuchten therapeutische Medikamentenspiegel parallel in Serum und MM zu verschiedenen Zeitpunkten um herauszufinden wann die höchsten/niedrigsten Konzentrationen ermittelt werden konnten. Neben dem Talspiegel, nach 12 h oder 24 h (T1), sammelten wir Proben 4 h (T5) und 8 h (T6) nach der Medikamenteneinnahme sowie direkt nach der Medikamenteneinnahme (T2), 1 h nach T2 (T3) und direkt beim nächsten Stillen (T4). Die Messungen wurden im TDM Labor im Zentrum für psychsiche Gesundheit, Universitätsklinikum Würzburg mittels isokratischer reversed-phase high performance liquid Chromatographie durchgeführt. Wir rekrutierten 25 Patientinnen, die in der ambulanten Spezialsprechstunde für psychiatrische Erkrankungen in Schwangerschaft und Stillzeit behandelt wurden. 68% der Patientinnen nahmen in der Schwangerschaft schon ein Psychopharmakon ein. Die Patientinnen litten an unipolaren Depressionen (n = 15), bipolaren Störungen (n = 2), schizoaffektiven Störungen (n = 2) sowie Angst- (n = 4) und Zwangsstörungen (n = 2). Das Spektrum von Antidepressiva und Antipsychotika erstreckte sich von Amitriptylin/Nortriptylin, Clomipramin/N-Desmethyl-Clomipramin, Mirtazapin, Escitalopram, Citalopram, Sertralin, Venlafaxin/ O-Desmethyl-Venlafaxin bis hin zu Lamotrigin und Quetiapin. Weiterhin erfassten wir ob es postnatale Auffälligkeiten sowie im Verlauf Entwicklungsauffälligkeiten bei den exponierten Kinder gab (Daten aus den routinemäßigen U-Untersuchungen der ersten 12 Lebensmonate). Um mehr Daten zur Kindesentwicklung zu sammeln, interviewten wir in einem retrospektiven Unterprojekt 14 weitere Patientinnen, die in der Vergangenheit von der Thematik betroffen waren.
Ergebnisse: Die parallel bestimmten Talspiegel in Serum und MM korrelierten nicht signifikant bei der Analyse aller Medikamente zusammen oder bei der Analyse der einzelnen Medikamente (Spearman Rho Korrelation, p > 0,05). Die Talspiegel im Serum korrelierten weder signifikant mit den Muttermilchkonzentration nach 4 h (T5), noch mit denen nach 8 h (T6) (Spearman Rho Korrelation, p = 0,46; p = 0,08). Die Tagesdosis korrelierte signifikant mit dem Talspiegel im Serum (p = 0,001), jedoch nicht mit den gleichzeitig bestimmten Muttermilchkonzentrationen (p = 0,88). Die Konzentrationen von Venlafaxin in der MM fielen relativ hoch aus. Es zeigte sich eine große interindividuelle Variation der Konzentrationen der unterschiedlichen Medikamente zu verschiedenen Zeitpunkten. Clomipramin und Quetiapin konnten gar nicht oder nur in sehr niedrigen Konzentrationen in der MM gemessen werden (n = 2, n = 4) wie auch Sertralin (ohne Ausreißer-Werte) und Escitalopram. Auch konnte Quetiapin nicht im Serum eines gestillten Kindes nachgewiesen werden, bei dem wir Blutproben gewinnen konnten (n = 1). Keines der gestillten Kinder zeigte negative Auswirkungen aufgrund der Medikation. Die höchste „concentration-bydose-ratio“ (C/D) in der MM wurden für Venlafaxin (n = 4, C/D MM = 5,11) und Lamotrigin (n = 1, C/D MM = 10,0) errechnet, während Clomipramin (n = 2, C/D MM = 0,0), Quetiapin (n = 4, C/D MM = 0,02) und Sertralin (n = 3, C/D MM = 0,03) die niedrigsten Quotienten zeigten. Wir kalkulierten die höchste „milk-to-plasma-ratio“ (M/P) für Mirtazapin (n = 3, M/P = 3,92) und Venlafaxin (n = 2, M/P = 2,4) sowie die niedrigsten für Clomipramin (n = 2, M/P = 0), Quetiapin (n = 3, M/P = 0,03) und Sertralin (n = 3, M/P = 0,08), was für ein niedriges Eindringungsvermögen vom Serum in die MM spricht.
Den photoaktivierbaren Schutzgruppen PPGs wurde als wichtige Werkzeuge, um z. B. biologische Prozesse zu untersuchen, in den letzten Jahren eine beachtliche Aufmerksamkeit zuteil. Der Einsatz von PPGs weist gegenüber chemischen Schutzgruppen wertvolle Vorteile auf, was deren Einsatz für biologische Konzepte attraktiv macht. Insbesondere, da keine weiteren Reagenzien außer Licht als Mittel für die Photolyse benötigt werden. Darüber hinaus ist es möglich, durch Einsatz moderner Lasertechnik, eine homogene Bestrahlung des Reaktionsvolumens mit einer hohen Lichtdosis auf einer, im Vergleich zu klassischen Lichtquellen, kürzeren Zeitskala zu gewährleisten.
Die Diversität der einsetzbaren photosensitiven Schutzgruppen, kommt einerseits der Vielfalt der anwachsenden biochemischen Fragestellungen insofern zugute, als dass die ausgewählten PPGs auf verschiedenste Anforderungen der zu untersuchenden Systeme zugeschnitten werden können. Anderseits kann die, durch einige Problemstellungen, erforderte chromatische Orthogonalität der eingesetzten Schutzgruppen, gewährleistet
werden, deren Umsetzung sich in den letzten Jahren in zahlreichen Studien als erfolgsversprechend erwies. Beide Aspekte sind unter anderem Gegenstand der vorliegenden Arbeit.
Zum einen sollte das Photocaged Puromycin als photolabiles Antibiotikum Derivat, mithilfe der Cumarinylmethyl-Schutzgruppe (DEACM-Puromycin) optimiert werden und mit dem vorherigen Nitrobenzyl-geschützten NVOC-Puromycin mittels spektroskopischer und biochemischer Methoden verglichen werden. Zum anderen sollte eine neue Strategie etabliert werden, mit deren Hilfe das photolytisch entschützte Puromycin erneut deaktiviert werden kann.
DEACM-Puromycin konnte mithilfe eines fünfstufigen Syntheseweges hergestellt werden. Ausgehend von 7-Amino-4-methylcumarin, dessen allylische Methylgruppe durch die Riley-Reaktion mit Selendioxid Se2O zum entsprechenden DEACM-Aldehyd oxidiert wurde und anschließende Reduzierung in Anwesenheit von NaBH4 zum Cumarinalkohol DEACM-OH. Eine nicht toxische Variante, bei welcher Selendioxid umgangen wurde, zeichnete sich ebenso als zielführend aus. DEACM-OH und Puromycin konnten im Anschluss über ein Carbonat-Intermediat miteinander als Carbamat verknüpft und mithilfe von HPLC aufgetrennt werden.
Die Vorrangigkeit des neuen photolabilen Puromycin Derivates (DEACM-Puromycin), wurde zuerst mithilfe der Laser-NMR-Spektroskopie sowie HPLC Verfahren erfasst. Spektroskopische Analysen im Rahmen einer Kollaboration mit dem AK von Professor Wachtveitl bestätigten, dass DEACM-Puromycin für biologische Anwendungen geeignetere photolytische Eigenschaften, wie z. B. einen höheren Extinktionskoeffizienten, eine bathochrome Verschiebung des Absorptionsmaximums, sowie eine höhere Quantenausbeute und Uncaging Effizienz der Photolyse, aufwies. Basierend auf einer vergleichbaren HOMO-LUMO Differenz beider Verbindungen (DEACM-OH und DEACM-Puromycin), konnte die Spaltung der Schutzgruppe mithilfe der Differenz der Fluoreszenzslebensdauern mit einer Rate von 0,71*108 s-1 charakterisiert werden. Dies war im Vergleich zum vorherigen NVOC-Puromycin um eine Größenordnung höher. Weitere durchgeführte spektroskopische Methoden wurden mittels quantenchemischer Rechnungen unterstützt, um wichtige Erkenntnisse der kinetischen und dynamischen Abläufe der Photolyse des geschützten Puromycins anzueignen, z. B.:
• Der zur Photolyse von DEACM-Puromycin konkurrierende Fluoreszenzprozess, kann durch protische Medien unterdrückt werden. Dies und die somit ermöglichten Wasserstoffbrückenbindungen, welche die entstehenden ionischen Intermediate während der Photolyse stabilisieren, könnten sich für die Erhöhung der Quantenausbeute der photolytischen Abspaltung von DEACM-Puromycin zu Nutze gemacht werden.
• Anhand von Experimenten auf der ultrakurzen Zeitskala wurde die Population eines angeregten S1-ICT-Zustandes detektiert. Bei diesem findet, in Anwesenheit von polarem Lösungsmittel, einen Ladungstransfer der Diethylaminoreste auf den Cumarinring statt.
• Polare Lösungsmittel bewirken ebenfalls den Übergang zu einem TICT Zustand, welcher als nichtstrahlende Relaxation die Fluoreszenz des DEACM-Puromycins reduziert. Die Auswahl von Substituenten sowie polaren und protischen Lösungsmitteln zur Begünstigung der ICT- sowie TICT- Zustände, könnte zukünftig zur Optimierung der Photolyse Effizienz herangezogen werden.
Die gelungene Optimierung des geschützten Puromycins als ein photosensitives Antibiotikum, durch die DEACM-Schutzgruppe, konnte mittels eines XTT-Zellviabilität-Experimentes mit sf9-Insektenzellen nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte die lichtkontrollierte Puromycylierung zur Visualisierung neu synthetisierter Proteine als weitere Funktion des optimierten photoaktivierbaren Puromycins in Zusammenarbeit mit dem AK. Schumann (MPI für
Hirnforschung, Frankfurt am Main) nachgeprüft werden. Obwohl beide photocaged Verbindungen, DEACM- sowie das vorherige NVOC-Puromycin, eine vergleichbare Zellpermeabilität zu den präparierten Neurozellen aufwiesen, zeigte DEACM-Puromycin unter gleichen Bedingungen nach der Belichtung ein signifikant intensiveres Puromycylierungsignal als NVOC-Puromycin. Unter der Annahme, dass sich mehr NVOC- als DEACM-Puromycin in
den Zellen befand, bestätigt diese Beobachtung die Vorrangigkeit des DEACM-Derivates, aufgrund seiner bereits optimierten photochemischen Eigenschaften. Durch den Einsatz eines Zwei-Photonen-Lasers, konnte die Eignung von DEACM-Puromycin für die raumselektive Steuerung der Detektion von neu exprimierten Proteinen, mit größerer Auflösung auf subzellularem Level, nachgewiesen werden.
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Die vorliegende Arbeit beschreibt die Erzeugung und Charakterisierung verschiedenartiger piezoresistiver Dünnschichten für die Druck- und Dehnungssensorik bei hohen Temperaturen, die mittels Sputterdeposition abgeschieden werden:
- metallische Schichten aus Chrom mit Verunreinigungen aus Sauerstoff, Stickstoff oder Platin,
- granulare Keramik-Metall-Schichten (Cermets), mit Platin oder Nickel als Metallkomponente und Aluminiumoxid (Al2O3) oder Bornitrid (BN) als Keramikkomponente.
Beide Schichttypen können mit geeigneten Beschichtungsparametern erhebliche piezoresistive Effekte aufweisen, also einen Widerstands-Dehnungs-Effekt, der den von typischen Metallschichten um ein Mehrfaches übersteigt. Der Effekt wird quantifiziert durch den k-Faktor, der die relative Änderung des Widerstands R auf die relative Änderung der Länge l, d.h. die Dehnung ε=Δl/l, bezieht: k=ΔR/(R ε).
In Beschichtungsreihen werden die Schichtzusammensetzung und die Depositionsbedingungen variiert und die Auswirkungen auf den elektrischen Widerstand, dessen Temperaturkoeffizienten (TKR), sowie den k-Faktor untersucht. Die k-Faktoren der chrombasierten Schichten liegen bei 10 bis 20 mit um null einstellbarem TKR. Die Cermet-Schichten erreichen je nach Material k-Faktoren von 7 bis über 70 mit meist stark negativen TKR von mehreren -0,1 %/K.
Die Chrom- und Chrom-Stickstoff-Schichten erweisen sich als geeignete Sensorschichten für Membran-Drucksensoren. Daher wird eine Reihe von Sensoren mit Wheatstone-Messbrücken erzeugt und charakterisiert. Sie zeigen den hohen k-Faktoren entsprechende hohe Signalspannen. Die guten Sensoreigenschaften bleiben auch bei hohen Temperaturen bis 230 °C erhalten.
Nach den ersten Untersuchungen bei Dehnungen bis maximal 0,1 % wird zusätzlich das Verhalten der Schichten bei höheren Dehnungen bis 1,4 % untersucht. Es zeigt sich vorwiegend ein lineares Widerstands-Dehnungs-Verhalten. Die Leiterbahnen der spröden chrombasierten Schichten werden bei Dehnungen um 0,7 % jedoch durch Risse zerstört, die sich von den Rändern der Schicht her ausbreiten.
Die Platin-Aluminiumoxid-Schicht zeigt einen enorm großen, nichtlinearen Widerstands-Dehnungs-Effekt, der auf Risse zurückgeführt werden kann, die sich nach einigen Belastungszyklen reproduzierbar öffnen und schließen.
Tieftemperaturmessungen von 2 bis 300 K zeigen Widerstandsminima der Chrom-Stickstoff-Schichten; Magnetwiderstandsmessungen deuten jedoch nicht auf den Kondo-Effekt hin.
Die Cermet-Schichten zeigen thermisch aktivierte Leitfähigkeit.
Ausgewählte Schichten werden bei Temperaturen bis 420 °C (693 K) charakterisiert. Die chrombasierten Schichten haben bei hohen Temperaturen stabile Widerstände, zeigen jedoch stark nichtlineare Temperaturverläufe von Widerstand und k-Faktor. Oberhalb einer gewissen Temperatur verschwindet der piezoresistive Effekt, kehrt jedoch beim Abkühlen zurück. Die Verläufe lassen sich durch die Schichtzusammensetzung und auch durch Temperaturbehandlungen modifizieren.
Die Platin-Aluminiumoxid-Schicht ist ebenfalls temperaturstabil und zeigt geringe Änderungen des k-Faktors im Temperaturverlauf. Platin-Bornitrid zeigt große, reversible Widerstandsänderungen bei höheren Temperaturen, die auf mögliche Gaseinlagerungen hindeuten.
Aus den experimentellen Ergebnissen lassen sich die Ursachen der Piezoresistivität ableiten: Die chrombasierten Schichten bilden, wie in der Literatur vielfach beschrieben, unterhalb einer Ordnungstemperatur einen Spindichtewellen-Antiferromagnetismus aus. Dieser Zustand führt zu einem zusätzlichen Widerstandsbeitrag, der die beschriebenen Nichtlinearitäten der Widerstands-Temperatur-Verläufe verursacht und zudem empfindlich auf mechanische Dehnung reagiert und so zu erhöhten k-Faktoren führt.
Die Piezoresistivität der Cermet-Schichten resultiert aus der granularen Struktur, in der Ladungsträger zwischen Metallpartikeln tunneln. Mit exponentiell vom Partikelabstand abhängigen Widerständen der Tunnelübergänge resultieren hohe k-Faktoren. Mithilfe von Modellbetrachtungen, in denen Gleichungen für Tunnelwiderstände auf granulare Systeme angewendet werden, werden die experimentellen Ergebnisse diskutiert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich die Eigenschaften der Keramik vorrangig auf den Betrag der k-Faktoren auswirken und die Eigenschaften des Metalls vor allem den TKR beeinflussen.
This PhD thesis is dedicated to the extension of the portfolio of nuclear magnetic resonance (NMR) methods to characterize ribonucleic acids (RNAs). Only within the last few decades it has been realized that the cellular role of RNA goes well beyond the central dogma of molecular biology. In fact, RNA takes part in numerous cellular processes, executes numerous functions and acts either as a single player or in larger complexes, mostly RNA-protein complexes (RNPs) such as the ribosome or the spliceosome. This versatility in RNA function is coupled to a structural variety and the ability to adopt multiple long-lived and intricate conformations. Due to this high molecular complexity special demands are placed on the methods that are required for RNA structural characterization. With the ability to capture dynamics at atomic resolution and to measure under close to native conditions, NMR spectroscopy is undoubtedly a prime method for this purpose.
A general introduction to the current state of research, selected achievements as well as challenges in the field of NMR spectroscopy on RNA is given in Chapter I. This thesis is further composed of three independent chapters covering the three separate projects, which form the main body of work within the course of this thesis.
The imino group found in two of the four RNA nucleobases is generally considered to be the most powerful reporter group in the process of the NMR spectroscopic characterization of RNA. Its resonance assignment provides key information for a rapid determination of the RNA’s secondary structure. This is possible, since the imino proton can only be detected, if it is protected from rapid solvent exchange through hydrogen bonding interactions or, in rare cases, steric shielding. Consequently, information on flexible regions of RNA that are not protected against solvent exchange cannot be derived using this NMR spy. It is a key finding of the thesis that nucleobase interactions can also be mapped through the amino groups, as they similarly take part in base pairing or RNA-ligand interactions. Notably, solvent exchange of the amino protons is always slower compared to the imino proton. Thus, 1H,15N resonances of the amino group can be detected even for dynamic regions of RNA. Moreover, focusing on characterizing amino groups of RNA nucleobases increases the number of available reporters as amino groups are present in three out of four RNA nucleobases.
However, there is a reason that up to work conducted in this thesis, amino groups have not been used for monitoring RNA nucleobases: the rate of the C-NH2 bond rotation is most often close to the chemical shift differences of the two non-identical amino proton resonances, in particular for guanosines and adenosines, amino resonances regularly remain elusive in NMR spectra. Therefore, we developed experiments that excite double quantum (DQ) coherences of the two amino group protons and that further utilize 13C-detection. Results on these experiments are discussed in Chapter II and show that the rotational exchange can be avoided by evolving double quantum instead of single quantum (SQ) coherence in the indirect dimension of a 13C-detected C(N)H-HDQC experiment. The new experiment enables the detection of a full set of sharp amino resonances. The advantages of this experiment are immediately apparent when comparing the number of observable imino resonances in a classic 1H,15N-HSQC spectrum with the number of amino resonances obtained in the 13C-detected C(N)H-HDQC spectrum of the same RNA.
Furthermore, based on the newly available resonance assignment of amino groups, we developed a 13C-detected “amino”-NOESY experiment to obtain precious additional structural restraints. The 13C-detected “amino”-NOESY experiment enables the observation of NOE contacts that are not accessible using other 1H-detected NOESY experiment. Among these new NOE contacts are valuable, inter-residual correlations, which are otherwise scarce in RNA due to the proton deficiency of its nucleobases. We showed that the newly obtained NOE contacts are especially important in the structure determination of RNAs with only few NOE restraints. Under such circumstances, the inclusion of the newly obtained amino NOE contacts lead to a significant improvement in the root-mean-square deviation (RMSD) of the three-dimensional structure of the 34 nts GTP class II aptamer. Together the novel 13C-detected NMR experiments developed within this PhD project provide a valuable alternative for the imino-based characterization of nucleobase interactions.
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Die Extrakorporale Membranoxygenierung (ECMO) ist ein extrakorporales Organersatzverfahren, welches heutzutage insbesondere als Lungenersatzverfahren oder als kreislaufunterstützendes Verfahren zum Einsatz kommt. Seit dem ersten Einsatz 1971 im Rahmen eines posttraumatischen „Acute Respiratory Distress Syndrom“ (ARDS) ist die Zahl der ECMO-Behandlungen im kardiopulmonalen Bereich massiv gestiegen. Dennoch wird der Nutzen der ECMO kontrovers diskutiert. Die aktuellste randomisiert kontrollierte Studie aus dem Jahre 2018 konnte keinen signifikanten Nachweis erbringen, dass die Therapie des ARDS mittels einer ECMO einen Überlebensvorteil bringt. Randomisiert kontrollierte Studien bei Patienten mit kardiogenem Schock liegen zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht vor und für den Einsatz bei septischem Schock ist die Datenlage und Evidenz schwach. Angesichts der ungeklärten Evidenz und weil die ECMO ein komplexes, kostenintensives und mit Risiken verbundenes Verfahren ist, scheint eine sorgfältige Indikationsstellung unverzichtbar zu sein. Das Ziel unserer Studie war daher die Analyse der Mortalität bei Patienten mit Lungenversagen, kardiogenem Schock und septischem Schock. Darüber hinaus sollten mit der Mortalität assoziierte prognostische Variablen identifiziert werden. Des Weiteren sollte untersucht werden, ob sich mit steigender Fallzahl eine Lernkurve beobachten lässt.
Zu diesem Zwecke führten wir eine retrospektive Kohortenstudie an 131 Patienten durch, die zwischen April 2011 und Juli 2016 in der Asklepios Klinik Langen mit einer ECMO behandelt wurden. Die Patienten wurden hierbei in die drei oben genannten Gruppen kategorisiert. Mithilfe logistischer Regression erfolgte die Identifizierung prognostischer Variablen. Eine Lernkurve wurde anhand des „non-risk-adjusted cumulative observed minus expected failure graph“-Verfahrens erstellt.
Die Analyse der Daten ergab eine Gesamtmortalität von 56%. Die Mortalität bei Patienten mit Lungenversagen, kardiogenem Schock und septischem Schock betrug 54%, 59% bzw. 58%. Bei Patienten mit Lungenversagen waren das Alter, das Jahr und weniger als 20 Fälle pro Jahr signifikant mit der Mortalität assoziiert. Bei Patienten mit kardiogenem Schock waren mit der Mortalität assoziierte Variablen das Alter, der SAPS II-Score, der pH-Wert, der Serumlaktatwert prä-ECMO, der Basenüberschuss prä-ECMO sowie eine Hyperlipidämie. Bei Patienten mit septischem Schock konnten keine mit der Mortalität assoziierten Variablen identifiziert werden. In der multivariaten Regressionsanalyse nach Modellabbau zeigten sich in der gesamten Kohorte das Alter, das prä-ECMO Serumlaktat sowie weniger als 20 Fälle pro Jahr als signifikant mit der Mortalität assoziierte Variablen. Patienten, die vor 2014 behandelt wurden, also in einem Zeitraum mit weniger als 20 ECMO-Fällen pro Jahr, hatten eine signifikant höhere Mortalität als Patienten die im Intervall 2014-2016 behandelt wurden. Mit steigender Fallzahl konnte eine Lernkurve nachgewiesen werden, die einen Wendepunkt im Jahr 2014 zeigte. Der im Jahr 2014 beginnende Abwärtstrend signalisierte eine geringere Sterblichkeitsrate als erwartet.
Zusammenfassend ist die Mortalität in allen Indikationen weiter hoch. Die Fallzahl und damit auch die Erfahrung scheint eine wichtige Rolle in Bezug auf die Mortalität zu spielen. Des Weiteren unterstützen unsere Ergebnisse frühere Studien, die einen Einfluss des Alters und des prä-ECMO Laktat-Wertes auf die Mortalität zeigen konnten.
Flat Panel CT Pooled Blood Volume-Mappen vor mechanischer Rekanalisation beim akuten Schlaganfall
(2020)
In der Akutdiagnostik des Schlaganfalles sind die Multislice Computertomographie (MSCT) sowie gegebenenfalls die Kernspintomographie die radiologischen Methoden der Wahl zunächst zur Differenzierung eines ischämischen oder hämorrhagischen Geschehens sowie im Falle einer Ischämie zur Darstellung des Gefäßverschlusses und der Perfusionssituation. Mit Hilfe von Flat Panel Detektoren (flat panel detector computed tomography (FDCT)) in Angiographie-Einheiten konnten zunächst Schnittbilder des Kopfes ähnlich denen einer konventionellen MSCT angefertigt werden, womit ein Blutungsausschluss möglich ist. Des Weiteren wurden sogenannte „Pooled Blood Volume“ (PBV)-Karten entwickelt, welche konzipiert wurden, um das Areal mit vermindertem zerebralem Blutvolumen (cerebral blood volume = CBV) und somit annäherungsweise den Infarktkern darzustellen.
Innerhalb der letzten 10 Jahre hat sich die mechanische Rekanalisation als Therapie des akuten Verschlusses proximaler zerebraler Arterien durchgesetzt. Häufig müssen Patienten für die Intervention aus peripheren Krankenhäusern in Schlaganfall-Zentren verlegt werden, sodass eine Aktualisierung der zerebralen Perfusionsparameter zur Darstellung der Progression der Ischämie und zur Prognose-Abschätzung erstrebenswert ist. Gäbe es die Möglichkeit einer solchen Bildgebung innerhalb der Angiographie- und Interventions-Einheit, so könnte wertvolle Zeit, welche sonst für den innerklinischen Transport, Umlagerung des Patienten etc. benötigt wird, eingespart werden. Auch bei schwer betroffenen Patienten, welche direkt in das jeweilige Schlaganfall-Zentrum eingeliefert werden, könnte somit die Zeit zwischen Ankunft in der Klinik bis zur Gefäß-Rekanalisation bedeutsam verkürzt werden.
In der vorliegenden Studie wurde die Zuverlässigkeit der PBV-Karten hinsichtlich der Abschätzung des späteren Infarktareales untersucht. Hierfür wurden bei 29 aufeinanderfolgenden Patienten mit akuten intrakraniellen Verschlüssen der Arteria carotis interna oder Arteria cerebri media das präinterventionelle Volumen der in den Quellbildern der PBV-Karten dargestellten Minderperfusion mit dem finalen Infarktvolumen, wie es sich in den postinterventionellen konventionellen MSCT-Kontrollen darstellte, verglichen. Außerdem wurde durch Bestimmung der Hounsfield-Einheiten die Stärke der Minderperfusion in dem Areal der PBV-Veränderung gemessen und mit der gesunden Gegenseite verglichen. Die mechanische Rekanalisation war bei 26 der Patienten erfolgreich.
Insgesamt war das mediane präinterventionelle PBV-Defizit 9-mal größer als das mediane finale Infarktvolumen (86,4 ml (10,3; 111,6) versus 9,6 ml (3,6; 36,8)). Dieses Ergebnis basierte insbesondere auf der Subgruppe der erfolgreich rekanalisierten Patienten (PBV Defizit: 87,5 ml (10,6; 115,1), finales Infarktvolumen: 8,7 ml (3,6; 29)). Im Falle einer frustranen Intervention wurde das finale Infarktvolumen eher unterschätzt (PBV Defizit: 86,4 ml (5,9; -), finales Infarktvolumen: 116,4 ml (3,5; -)). Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen der HU Ratio im Bereich des später infarzierten Gewebes (0,45 (0,29; 0,51)) und der umgebenden minderperfundierten „Penumbra“ (0,4 (0,33; 0,5)) (p=0,679). Die HU Ratio zeigte eine signifikante negative Korrelation mit dem Volumen der PBV-Läsion (r= -0,448, p= 0,008).
Zusammenfassend wurde aus den Ergebnissen dieser Studie geschlossen, dass die FDCT PBV-Karten nicht zuverlässig das finale Infarktvolumen prognostizieren und daher keinen Einfluss auf die akute Therapieentscheidung haben sollten. Ursächlich sind technische und methodische Limitationen sowie die Art des untersuchten Perfusionsparameters.
As fossil resources are diminishing, environmental concerns arise and chemical synthesis often involves expensive catalysts or extensive extraction procedures, the demand for production of industrially relevant compounds from renewable resources increases. In this context, engineering microorganisms for production of specialty chemicals, such as 3-alkylphenols, presents an attractive, environmental-friendly approach. 3-alkylphenols have various applications: due to their antiseptic and stabilizing properties many 3-alkylphenols, including 3-methylphenol (3-MP), are utilized as additives in disinfectant reagents and biological products, while they can be also implemented as platform chemicals for production of lubricating oil additives or flavors. Some 3-akylphenols have potential for transmission control of the disease sleeping sickness that is transmitted by tsetse flies in sub-saharan Africa, since 3-ethylphenol (3-EP) and 3-propylphenol (3-PP) and to a lesser degree 3-MP were found to attract tsetse flies and improved catch rates in impregnated tsetse fly traps. Microbial fermentation of 3-alkylphenols would provide a simple and inexpensive way for local communities in Africa to produce these compounds and prepare their own tsetse fly traps.
Some molds synthesize 3-MP as an intermediate during biosynthesis of the mycotoxin patulin. However, the heterologous host Saccharomyces cerevisiae has advantageous traits for industrial application, since it is well characterized, robust, simple to handle and easily genetically accessible. In this thesis, genetical engineering approaches were utilized to establish the yeast S. cerevisiae for biotechnological production of 3-alkylphenols. As a proof of concept, the iterative polyketide synthase from Penicillium patulum, 6-methylsalicylic acid synthase (MSAS), and 6-methylsalicylic acid (6-MSA) decarboxylase PatG from Aspergillus clavatus were heterologously expressed in S. cerevisiae resulting in the first reported de novo biosynthesis of 3-MP via 6-MSA in yeast from sugars (Hitschler & Boles, 2019). It was shown that codon-optimization and genomic integration of heterologous genes, high initial cell densities and a balanced expression of PatG were beneficial for heterologous production of up to 589 mg/L 3-MP in S. cerevisiae. However, toxicity of 3-MP limited higher product accumulation.
Different in vivo detoxification strategies were implemented to face this bottleneck. Growth tests revealed that 3-methylanisole (3-MA) is less toxic to the yeast cells than 3-MP. Expression of an orcinol-O-methyltransferase from chinese rose hybrids (OOMT2) was combined with in situ extraction converting the toxic 3-MP product into the volatile 3-MA and accumulating up to 211 mg/L 3-MA in the dodecane phase. Alternatively, up to 533 mg/L 3-MP glucoside were synthesized by expression of a UDP-glycosyltransferase (UGT72B27) from Vitis vinifera in the 3-MP producing strain, revealing saccharose as beneficial carbon source and ethanol growth phase as essential for high 3-MP production, although 3-MP conversions were not yet complete. Both detoxification strategies allowed circumvention of the toxicity imposed limited product accumulation. This was demonstrated when both detoxification strategies were combined with redirection of the carbon flux through deletion of phosphoglucose isomerase gene PGI1 and feeding a mixture of fructose and glucose leading to majorly improved product formation, with up to 899 mg/L 3-MA/3-MP and 873 mg/L 3-MP/3-MP glucoside, compared to less than 313 mg/L product titers in the wild type controls (Hitschler & Boles, 2020).
For provision of the tsetse fly attractants 3-EP from propionyl-CoA and 3-PP from butyryl-CoA, the substrate promiscuities of MSAS and PatG were exploited. However, slower formation rates with the alternative substrates propionyl-CoA and butyryl-CoA suggested that competing formation of 6-MSA from the preferred priming unit acetyl-CoA was dominating in vivo. Indeed, 3-EP or 3-PP formation was not observed in 3-MP producing yeast strains. Assuming that intracellular levels of propionyl-CoA and butyryl-CoA were limiting 3-EP and 3-PP formation, different strategies were implemented to raise the supply of these alternative priming units and successfully compete with acetyl-CoA for MSAS priming.
Supplementation of propionate increased propionyl-CoA levels by endogenous pathways sufficiently to enable 3-EP formation in yeast mediated by MSAS and PatG. Deletion of the 2-methylcitrate synthases CIT2 and CIT3 revealed that degradation of propionyl-CoA was not limiting 3-EP formation at this stage. In order to raise propionyl-CoA levels further, a heterologous propionyl-CoA synthase (PrpE) was expressed in the 3-MP producing yeast strain leading to up to 12.5 mg/L 3-EP with propionate feeding and blockage of degradation. Moreover, PrpE enabled also 3-EP formation without propionate supplementation suggesting that an endogenous supply of propionate existed that was reactivated by PrpE. As threonine or 2-ketobutyrate feeding increased 3-EP titers in combination with PrpE, this indicated that threonine degradation via 2-ketobutyrate was responsible for the endogenous propionate supply. Moreover, expression of branched-chain ketoacid dehydrogenase complex from Pseudomonas putida combined with PrpE provided propionyl-CoA from endogenous 2-ketobutyrate and raised 3-EP titers up to 5.9 mg/L compared to 2.8 mg/L with only PrpE indicating a potential route for optimization of 3-EP titers independent of propionate or threonine feeding.
For 3-PP production from butyryl-CoA, a heterologous ‘reverse ß-oxidation’ pathway was introduced in the 3-MP producing yeast strain providing sufficient butyryl-CoA for biosynthesis of up to 2 mg/L 3-PP. Degradation of the precursor via ß-oxidation was slightly limiting, since deletion of fatty acyl-CoA oxidase POX1 increased 3-PP titers slightly to 2.6 mg/L.
As the concentrations of 3-alkylphenols are close to the concentrations implemented in tsetse fly traps, the engineered yeast strains have the potential for simple and inexpensive on-site production of 3-alkylphenols as tsetse fly attractants by local rural communities in Africa. In spite of this success, 3-MP remained the main product in the developed yeast strains. Since 3-EP and 3-PP are more efficient tsetse fly attractants, a shift in substrate specificities of MSAS and PatG is desirable for a more favorable 3-EP/3-MP and 3-PP/3-MP product ratio regarding tsetse fly attraction. During rational engineering of MSAS, the MSASQ625A/I752V mutant showed a beneficial shift of product ratios with up to 11 mg/L 3-EP/63 mg/L 3-MP and 4.5 mg/L 3-PP/116 mg/L 3-MP, compared to a higher proportion of 3-MP with up to 343 mg/L, 11 mg/L 3-EP and 1.5 mg/L 3-PP in the wild type controls. Further engineering of MSAS and PatG might majorly improve production of 3-EP and 3-PP.
In summary, this thesis successfully established the yeast S. cerevisiae as cell factory for production of different 3-alkylphenols optimizing expression of the heterologous production pathway, elucidating means to detoxify products and establishing different approaches to increase intracellular levels of acyl-CoA precursors. The engineered yeast strains can be potentially implemented for simple and inexpensive fermentation of tsetse fly attractants in Africa.
Diese Arbeit behandelt die Rolle der Proteinkinasen IKKe und TBK1 in der Progression von humanen malignene Melanomen und die Rolle von alpha-Synuclein in der Schmerzwahrnehmung von Mäusen.
Für die vorliegende Arbeit wurden zur Analyse des Auger-Zerfalls kleiner Moleküle nach Photoionisation die aus der Zerfallsreaktion resultierenden Impuls- und Energiespektren von Photo- und Auger-Elektronen in Koinzidenz mit denen der ionischen Fragmente aufgenommen. Dies ermöglichte eine getrennte Betrachtung der während des Ionisationsschrittes und des Zerfallsschrittes dieses Prozesses besetzten Molekülzustände. Um weitere Einsicht in die Dynamik des Zerfalls zu erhalten, wurden vorhandene theoretische Modelle, welche insbesondere die Interaktion der durch die Reaktion produzierten geladenen Teilchen (Post Collision Interaction) einbeziehen, an die gemessenen Energiespektren angepasst. Dies ermöglichte die separate Betrachtung der im Ionisationsschritt besetzten Molekülzustände. So konnten die Emissionswinkelverteilungen der Photoelektronen im molekülfesten Koordinatensystem für jeden besetzten Anfangszustand einzeln betrachtet werden. Die Trennung der Endzustände des Zerfalls erfolgte über die Analyse des Spektrums der Ionen-Aufbruchsenergie (Kinetic Energy Release) und den Vergleich mit berechneten Potentialkurven der beitragenden Endzustände.
Durch die nach den Anfangszuständen separierte Betrachtung des Auger-Zerfalls wurde es auch möglich, die Auswirkungen dieser Zustände auf die Zerfallsdynamik zu analysieren. Dafür lieferte die Anpassung der Modellprofile die Lebensdauer des jeweiligen 1s-Lochzustandes in dem entsprechenden Zerfallskanal. Diese jeweiligen Lebensdauern eines jeden Zustandes wurden abhängig von verschiedenen Parametern mit einer Genauigkeit im Attosekunden-Bereich aus den Energiespektren der Photoelektronen ermittelt.
We study continuous dually epi-translation invariant valuations on certain cones of convex functions containing the space of finite-valued convex functions. Using the homogeneous decomposition of this space, we associate a certain distribution to any homogeneous valuation similar to the Goodey-Weil embedding for translation invariant valuations on convex bodies. The support of these distributions induces a corresponding notion of support for the underlying valuations, which imposes certain restrictions on these functionals, and we study the relation between the support of a valuation and its domain. This gives a partial answer to the question which dually epi-translation invariant valuations on finite-valued convex functions can be extended to larger cones of convex functions.
We also study topological properties of spaces of valuations with support contained in a fixed compact set. As an application of these results, we introduce the class of smooth valuations on convex functions and show that the subspace of smooth dually epi-translation invariant valuations is dense in the space of continuous dually epi-translation invariant valuation on finite-valued convex functions. These smooth valuations are given by integrating certain smooth differential forms over the graph of the differential of a convex function. We use this construction to give a characterization of a dense subspace of all continuous valuations on finite-valued convex functions that are rotation invariant as well as dually epi-translation invariant.
Using results from Alesker's theory of smooth valuations on convex bodies, we also show that any smooth valuation can be written as a convergent sum of mixed Hessian valuations. In particular, mixed Hessian valuations span a dense subspace, which is a version of McMullen’s conjecture for valuations on convex functions.
In the last two decades, new unpredicted charmonium-like states with extraordinary characteristics have been observed experimentally. These states also known as the XYZ states, e.g., the Y(4260) or the X(3872), are mostly interpreted as QCD allowed exotic hadrons. One of the leading hadron physics experiments in the world, the Beijing Electron Spectrometer III (BESIII) at the Beijing Electron-Positron Collider II (BEPCII) is aiming towards revealing the internal structure of these states. It has brought numerous breakthrough discoveries including the discovery of the charged Zc(3900). In order to understand the nature of the Y(4260) state and its decay patterns, an inclusive analysis is performed for different recoil systems (π+π−,K+K− and K±π∓) using the BESIII data samples for center of mass energies above 4 GeV collected between 2013 and 2019. The aim of this analysis is twofold: on one hand, we search for new unobserved charmonium-like decay channels using the missing mass technique and on the other hand, it provides an accurate inclusive cross section measurement for e+e−→X π+π−, with the X being the J/ψ, hc and ψ(2S), respectively. Two resonant structures, the Y(4220) and the Y(4390), are observed in the inclusive energy dependent Born cross section of e+e−→hc π+π−, which is consistent with the BESIII exclusive measurements. Moreover, the energy dependent cross section of e+e−→J/ψ π+π− is investigated, in which two resonances have consistently been observed with the previous BESIII exclusive studies, namely, the Y(4220) and the Y(4320). In the (K±π±) recoil system, possible Y(4260) open charm decay channels are investigated. Two enhancements are observed in the inclusive energy dependent cross section of e+e−→DD above 4.13GeV, which could possibly be the ψ(4160)and the ψ(4415).
Classical Hodgkin lymphoma (cHL) is one of the most common malignant lymphomas in Western Europe. The nodular sclerosing subtype of cHL (NS cHL) is characterised by a proliferation of fibroblasts in the tumour microenvironment, leading to fibrotic bands surrounding the lymphoma infiltrate. Several studies have described a crosstalk between the tumour cells of cHL, the Hodgkin- and Reed-Sternberg (HRS) cells, and cancerassociated fibroblasts (CAF). However, to date a deep molecular understanding of these fibroblasts is lacking. Aim of the present study therefore was a comprehensive
characterisation of these fibroblasts. Moreover, only a few studies describe the interplay of HRS cells and CAF. The paracrine communication and direct interaction of these two
cellular fractions have been investigated within this study. Finally, the influence of a few HRS cells within a lymph node orchestrate the mere alteration of its architecture and
morphology. Gene expression and methylation profiles of fibroblasts isolated from primary lymph node suspensions revealed persistent differences between fibroblasts obtained from NS cHL and lymphadenitis. NS cHL derived fibroblasts exhibit a myofibroblastic - inflammatory phenotype characterised by MYOCD, CNN1 and IL-6 expression. TIMP3, an inhibitor of matrix metalloproteinases, was strongly upregulated in NS cHL fibroblasts, likely contributing to the accumulation of collagen in sclerotic bands of NS cHL. Treatment by luteolin could reverse this fibroblast phenotype and decrease TIMP3 secretion. NS cHL fibroblasts showed enhanced proliferation when they were exposed to soluble factors released from HRS cells. For HRS cells, soluble
factors from fibroblasts were not sufficient to protect them from Brentuximab-Vedotin(BV) induced cell death. However, HRS cells adherent to fibroblasts were protected from BV-induced injury. The cHL specific interaction of both cell fractions reveals an initiation of inflammatory key regulators such as IL13 and IL4. Among important adhesion molecules known from literature the blocking of integrin beta 1 solely interrupted the adhesion of HRS cells to CAF. In summary, this study proves the stable reprograming of CAF phenotype and expression derived from NS cHL. It presents a suitable in vitro model for studying the interaction of HRS cells and CAF by paracrine factors and adherence. Most importantly the observations confirm the importance of fibroblasts for HRS cells´ inflammatory niche and cell survival associated with TIMP3 which probably acts as a major factor to the typical accumulation of fibrosis observed in NS cHL.
In der vorgelegten kumulativen Arbeit wurden strukturelle und funktionale Untersuchungen an Nukleinsäuren durchgeführt, hauptsächlich, aber nicht ausschließlich unter Verwendung von NMR-Spektroskopie (Kernspin Resonanzspektroskopie) als Analysemethode. Die untersuchten Biomoleküle umfassten kleinere und größere biologisch relevante RNAs sowie einen artifiziellen DNA G-Quadruplex. Hierbei konnten Ergebnisse im Bereich der Bestimmung der molekularen Struktur, der Aufklärung der biologischen Funktion und der Wirkstoffentwicklung gewonnen werden, die in sechs verschiedenen Publikationen dargelegt sind, an deren Erstellung der Autor maßgeblich oder hauptverantwortlich beteiligt war. Des Weiteren wird in einem mehrgliedrigen Einleitungssegment auf den Stand der aktuellen Forschung in den jeweiligen Teilgebieten eingegangen.
This manuscript-based thesis is divided into four chapters. Chapter one is an introduction to lichens and the Antarctic. It introduces the goal of the thesis and the problems related with lichen systematics and the lack of knowledge about Antarctic lichens. The Antarctic is one of the last wildernesses, isolated from the other continents by the Antarctic Circumpolar Current, the Subantarctic Front, the Antarctic Polar Front, and the Drake Passage. Terrestrial life in Antarctica is restricted to widely separated and small ice-free areas that cover only 0.3% of the continent. Colonization of the Antarctic is a challenge for many taxa and is related to their ability for long-range dispersal and their adaptation to the harsh climate. Antarctic terrestrial ecosystems are significantly threatened by climate change, invasive species, and their interactions. Glacial retreat caused by higher than average temperatures exposes new habitats that can be easily colonized from local biota, but non-native species can also be favored by the new climatic conditions. In addition, propagule movement mediated by humans can introduce new species or change the population structure of many taxa. The terrestrial biota is comprised almost exclusively by “lower organisms” (invertebrates, bryophytes, algae, lichenized fungi, and microorganisms). Lichens are the dominant component, and the most important primary producers. Lichens are symbiotic associations consisting of a fungus (mycobiont) and one or more photosynthetic (photobiont) partners. They can disperse sexually or vegetatively. There are several problems related to the symbiotic nature of lichens that do not facilitate easy identification; although molecular data offers additional evidence, species delimitation in lichens is still not straightforward. The true number of species is underestimated due to the presence of cryptic species and species pairs. Recommended universal fungal barcode sequences (e. g. ITS) sometimes fail to delimit species pairs. Thus, it is necessary to identify fast-evolving markers that allow for the delimitation of closely related species before proceeding with the analysis of lichen populations. The goal of this thesis is to elucidate the so far unknown genetic structure among Antarctic lichen populations because of the immediate consequences for conservation strategies. The thesis focuses not only on patterns of differentiation and gene flow, but also investigates the question of human-mediated propagule transfer into Antarctica and among Antarctic sites. This project provides data on the genetic structure of Antarctic lichens that is urgently needed to develop conservation strategies in the face of global warming and increased human activities in the region. Due to the fact that it is not possible to apply all of the unspecific fingerprinting methods to lichens, microsatellites or simple sequence repeats (SSRs) are one of the best tools to investigate the genetic structure of lichen populations. SSRs offer the possibility to discriminate the lichen partners, but species-specific microsatellites have been developed for only a few species. Regarding the Antarctic, only one species has been studied with SSRs.
The second chapter describes new methods and tools to delimit closely related species of lichens and provides fast evolving markers to characterize their genetic structure. The chapter introduces the lichen species analysed in this thesis and the problems related to their correct identification by morphological methods and molecular data. Chapter two explains the sampling methods for lichen populations and the localities from small areas in which the species pairs occur together. Then the methods used to generate and validate fungal specific microsatellites that cross-amplify species pairs are described. This chapter focuses on the species pair Usnea antarctica and U. aurantiacoatra because they are the most common lichens in the Maritime Antarctic. An internal transcribed spacer (ITS) marker do not discriminate between these species, and some authors have suggested to synonymize them. Unpublished results from another Antarctic species pair, Placopsis antarctica and P. contortuplicata, are included to confirm the capability of SSRs to discriminate closely related lichen species. This thesis is the first study to generate SSRs that cross amplify species pairs, using BLAST to compare one genome against the other to obtain markers with the same length in flanking regions. The de novo developed SSRs are able to discriminate the two closely related species, and can detect variability at the population level. In the end of the chapter, ITS sequences, microsatellites, and SNPs are used to delimit the species of Usnea antarctica and U. aurantiacoatra. The chapter exposes the importance of a correct species delimitation and the ability of SSRs and SNPs to delimit the Antarctic Usnea species pair compared with the recommended universal fungal barcode sequence ITS. ...
Freshwater is one of the most fundamental resources for life and is the habitat for a wide diversity of species. One of the most diverse aquatic insect taxa is Trichoptera Kirby, 1813, caddisflies. These semi-aquatic insects have aquatic larvae and terrestrial adults and are found all around the globe in freshwater habitats. Water is also one of the most important natural resources for the human population, but alarmingly, freshwaters are among the most threatened natural habitats. Thus, the monitoring and preservation of the quality of freshwater habitats should have a high priority. In order to track changes in the biota a baseline reference is necessary, but freshwater biodiversity is under-studied in many parts of the Earth such as the biodiversity hotspots of the Himalaya and the Hengduan Mountains. This thesis treats the trichopteran genus Himalopsyche Banks, 1940 (Rhyacophilidae) which has its diversity center in the Himalayas and the Hengduan Mountains. Himalopsyche larvae are large and conspicuous and only occur in clean, unpolluted streams. This makes Himalopsyche potentially suited as indicator organisms for freshwater quality monitoring, but taxonomic knowledge is yet insufficient. Based on samples from a field survey in the Hengduan Mountains targeting both larvae and adults I uncovered three new Himalopsyche species which are described in this thesis (Chapter II), and with the aid of molecular data I associated larvae of Himalopsyche to adult species (Chapter I). The molecular association enabled the first comparative morphological study of Himalopsyche species in the larval stage, and the morphological study in Chapter II revealed that there are four distinct larval types of Himalopsyche. However, no diagnostic characters to identify Himalopsyche larvae to species level were found. To understand Himalopsyche larval morphology from an evolutionary perspective, I reconstructed the first molecular phylogeny of the genus (Chapter III). This demonstrated that each larval type corresponds to a deep phylogenetic split, indicating that larval types evolved early in Himalopsyche evolution and remained constant since. Based on the phylogenetic results as well as larval and adult morphology, I re-defined five species groups of Himalopsyche: H. kuldschensis Group, H. lepcha Group, H. navasi Group, H. phryganea Group, and H. tibetana Group. The species groups differ with respect to their diversity centers. The monotypic H. lepcha Group resides in the Himalayas, and the monotypic H. phryganea Group inhabits Western Nearctic. The H. kuldschensis and H. tibetana Groups are geographically overlapping with distributions in the Himalayas, but the distribution of H. kuldschensis Group stretches more to the west to include the Tian Shan, and the H. tibetana Group is more concentrated around the eastern Himalayas and the Hengduan Mountains. The H. navasi Group has a more eastern distribution than most Himalopsyche including isolated areas such as Japan and Indonesia. The earliest split in Himalopsyche divides the H. navasi Group from remaining Himalopsyche, suggesting a more eastern area of origin of Himalopsyche than its current diversity center, with subsequent radiations in the Himalayas and Hengduan Mountains. In addition to the three chapters, in this thesis I discuss further aspects of Himalopsyche biology including genital evolution, species complexes, and Himalopsyche ecology.
Xenorhabdus and Photorhabdus are bacterial genera that live in symbiosis with entomopathogenic nematodes of the genera Steinernema and Heterorhabditis, respectively. These nematodes infect insect larvae through the trachea and then enter the hemocoel. Once inside the hemocoel, the nematodes release the bacteria through their intestine. Thereafter, the bacteria become active and kill the larvae within 48 h. During this process, the immune system of the insect host is compromised by molecules produced and secreted by the bacteria. This illustrates that the bacteria possess not only a large arsenal of biological weaponry such as antibiotics and fungicides but also lipases, proteases, etc. Therefore, they are not only able to kill the insect but also protect the cadaver from other food competitors.
During the past decades, a large number of natural products have been identified from Xenorhabdus and Photorhabdus. However, the targets and functions for many of these biological molecules are still unknown. Therefore, the goal of the doctoral thesis is to elucidate the modes of action of these natural products from Xenorhabdus and Photorhabdus with the main focus on non-ribosomal peptides (NRPs). The work can be divided into two parts. Initially, it starts with the synthesis of natural compounds and various chemically modified derivatives. Besides that, a number of peptides were synthesized for other projects to either verify their structures or quantify the amount produced by the bacteria. Then, secondary analysis methods are applied and provide additional insight into the modes of action of these compounds.
During the thesis, I carried out peptide synthesis either manually or with an automatic synthesizer system from Biotage. Here, the Fmoc-protecting group strategy was preferred in most cases. Natural products, such as silathride, xenoautoxin, phenylethylamide, tryptamide, rhabdopeptide, 3-hydroxyoctanoic acid, and PAX, were produced during this process. Furthermore, new peptide derivatives derived from synthetic NRPS approaches using the XU concept or SYNZIP were generated as standards.
Most of these natural compounds were experimentally verified by MIC tests (broth microdilution, plate diffusion) to be biologically active. For example, silathride, phenylethylamide, and tryptamide showed quorum quenching effects when tested against Chromobacterium violaceum. Initial results from collaborators (PD Dr. Nadja Hellmann/Mainz) showed that tryptamide and phenylethylamide interact with membrane or membrane proteins.
(R)-3-hydroxyoctanoic acid was synthesized to verify the molecule structure of phototemtide A, a cyclic lipopeptide with antiprotozoal activity. The rhabdopeptides are another class, which showed remarkable antiprotozoal effects. However, their mode of action was unknown. These compounds are relatively short peptide sequences, which contain hydrophobic residues, such as valine, leucine, or phenylalanine. Moreover, they possess N methylation, resulting in a rod-shaped highly hydrophobic structure. In this work, I synthesized eight new derivatives of rhabdopeptides for photo-affinity labeling (PAL). These molecules should react covalently under UV-light irradiation with the biological target of the peptides. In addition, these derivatives can be enriched in a pull-down assay using click chemistry. Afterward, analytic methods such as mass detection (proteome analysis) can be applied to elucidate the protein targets.
The PAX peptides derivatives are well-known to have anti-microbial activities and believed to be secreted into the environment by the producing bacteria. However, I found that the majority of these peptides are located in the cell pellet fraction and not in the supernatant. This has been shown through quantification using HPLC MS. New PAX derivatives were synthesized, which carry a moiety suitable for covalent modification using click-chemistry, therefore being functionalizable with a fluorescence dye. In collaboration with Dr. Christoph Spahn (Prof. Dr. Mike Heilemann group), we used confocal, as well as super-resolution microscopy, in particular, single-molecule localization microscopy (SMLM) to investigate the spatial distribution of clickable PAX molecules and revealed that they localize at the bacterial membrane. Furthermore, bioactivity assays revealed that the promotor exchanged X. doucetiae PAX mutants, which do not produce PAX molecules without chemical induction (hereby termed as pax-), were more susceptible to several insect AMPs tested. Based on these findings, a new dual mechanism of action for PAX was proposed. Besides the previously shown antimicrobial activity, these molecules with a positive net charge of +5 (pH = 7) would bind to the negatively charged bacterial surface. Hereby, the surface charge (typically negative) would be inversed resulting in a protective effect for Xenorhabdus against other positively charged AMPs. Furthermore, PAX was investigated as AMP against E. coli to study its antimicrobial mechanism of action. Here, the results show that PAX can disrupt the E. coli membrane at higher concentrations (> 30 µg/ml), enter the cytosol, and lead to reorganization of subcellular structures, such as the nucleoid during this process.
Another aspect of secondary analysis is the application of proteomic analysis. Therefore, I induced X. nematophila, X. szentirmaii, and P. luminescens with insect lysate. These samples were analyzed using HPLC-MS/MS (Q Exactive) together with a database approach (Maxquant/Andromeda). The results showed that in all strains the lipid degradation and the glyoxylate pathway were induced. This is in line with the given insect lysate diet, which mostly contained lipids. Moreover, several interesting unknown peptides and proteins were also upregulated and might get into the focus of future research.
H/ACA-RNPs are involved in RNA guided pseudouridylation of rRNAs and snRNAs. In this thesis I reconstituted active and labeled archaeal as well as eukaryotic H/ACA-RNPs and studied the structural dynamics of complex assembly and pseudouridine formation. Single molecule FRET spectroscopy was used as method of analysis to study structure, assembly and dynamics of these important complexes.
The genus Giraffa likely evolved around seven million years ago in Indo-Asia and spread over the Arabian-African land bridge into Eastern Africa. The oldest fossil of the African lineage was found in Kenya and dated to 7-5.4 Mya. Beside modern giraffe, four additional African species have likely existed (G. gracilis, G. pygmaea, G. stillei, and G. jumae). Based on their morphological similarities, G. gracilis is often considered to be the closest relative of the modern giraffe. Nevertheless, the phylogeny within the genus Giraffa is largely unresolved.
Modern giraffe (Giraffa sp.) have been neglected by the scientific community for a long time and still very little is known about their biology. Traditionally, present-day giraffe have been considered a single species (G. camelopardalis) which is divided into six to eleven subspecies, with nine subspecies being the most accepted classification. This classification was based on morphological differences and geographic ranges. However, recent genetic analyses found hidden diversity within Giraffa and proposed four genetically distinct giraffe species (G. camelopardalis, G. reticulata, G. tippelskirchi, G. giraffa) with presumably little gene flow among them.
Gene flow on a population level is the exchange of genetic information among populations facilitated by the migration of individuals between populations. Additionally, it is an important criterion to delineate species, because many species concepts, especially the Biological Species Concept, rely on the concept of reproductive isolation. Yet, new genetic methods are identifying an increasing number of species that show signs of introgressive hybridization or gene flow among them. Therefore, strict reproductive isolation cannot always be applied to delineate species, especially in young, probably still diverging, species such as giraffe.
Therefore, giraffe are ideal study organisms to investigate the level of gene flow in recently diverged species with adjacent or potentially overlapping ranges. Furthermore, their recent classification as “Vulnerable” by the IUCN and their unreliable distribution maps require the genetic evaluation of their population structure, distribution and conservation status.
In Publication 1 (Winter et al. (2018a), Ecological Genetics and Genomics, 7–8, 1–5), I studied the distribution and matrilineal population structure of Angolan giraffe (G. giraffa angolensis) using sequences from the cytochrome b gene (1,140 bp) and the mitochondrial control region for individuals from across their known range and beyond, and additionally including individuals from all known giraffe species and subspecies. The reconstruction of a phylogenetic tree and a mitochondrial haplotype network allowed to identify the most easterly known natural population of Angolan giraffe, a population that was previously assigned to their sister-subspecies South African giraffe (G. giraffa giraffa), indicating the limit of classification by morphology and geography. Furthermore, the analyses show that Namibia’s iconic desert-dwelling giraffe population is genetically distinct, even from the nearest population at Etosha National Park, suggesting very limited, if any, natural exchange of matrilines. Yet, no geographic barriers are known for this region that would prevent genetic exchange. Therefore, the two populations are likely on different evolutionary trajectories. Limited individuals with an Etosha haplotype further suggest that translocation of Etosha giraffe into the desert population had only a minor impact on the local population. Two separate haplogroups within Etosha National Park suggest an “out of Etosha” radiation of Angolan giraffe to the East followed by a later back-migration.
In Publication 2 (Winter et al. (2018b), Ecology and Evolution, 8(20), 10156–10165), I investigated the genetic population structure of giraffe across their range (n = 137) with focus on the amount of gene flow among the proposed giraffe species with a 3-fold increased set of nuclear introns (n = 21). Limited gene flow of less than one effective migrant per generation, even between the closely related northern (G. camelopardalis) and reticulated giraffe (G. reticulata) further supports the existence of four giraffe species by a different methodology, gene flow. This is significant because most species concepts build on reproductive isolation. Furthermore, this result is corroborated by four distinct major clades in a phylogenetic tree analysis, and distinct clusters in Principal Component Analysis and STRUCTURE analysis. All these analyses suggest a low level of genetic exchange among the four giraffe species and, therefore, a high degree of reproductive isolation in accordance with the Biological Species Concept (BSC). In Addition, only a single individual in 137 was identified as being potential of natural hybrid origin, which promotes the four-species concept further. ...
Es gibt zwei Leitmotive, die sich konsequent in der Rhetorik der Forschungsliteratur zu Anselm Kiefer beobachten lassen: zum einen die Auseinandersetzung des Künstlers mit dem Nationalsozialismus und in der Folge mit der nordisch-germanischen Mythologie und zum anderen die Beschäftigung mit dem Judentum und der jüdischen Mystik. Innerhalb des Gesamtoeuvres sind jedoch diejenigen Arbeiten, die sich augenscheinlich und sehr offensichtlich mit dem Nationalsozialismus beschäftigen nur eine sehr kleine Gruppe. In seiner 50 Jahre umfassenden künstlerischen Laufbahn hat er lediglich in den ersten Jahren eine offensive Auseinandersetzung mit der NS-Vergangenheit Deutschlands gesucht. Sie bildet gleichsam den Startpunkt seiner künstlerischen Karriere. Mittlerweile ist der Künstler Anselm Kiefer mit der Aufarbeitung des Nationalsozialismus und den Begrifflichkeiten Vergangenheitsbewältigung, Erinnerungsarbeit und Trauerarbeit kanonisiert. Doch je länger der Schaffensprozess von Kiefer andauert und je weiter man auf sein produktives Œuvre zurückblicken kann, umso deutlicher erkennt man nachweisbar zwei ganz andere bildimmanente Leitkategorien in diversen Facetten und Nuancen, die in ihrer Überordnung eine völlig neue Dimension einschlagen: die Dimension von Zeit und Raum respektive Zeitlichkeit und Räumlichkeit in Kiefers gesamtem Werkkomplex.
Insistent beschäftigt sich Kiefer mit allgemeingültigen Themen der Vergangenheit, Gegenwart und Zukunft oder diskutiert zeitlose und damit verbunden auch schwer zugängliche Inhalte. Zeitlos meint in diesem Fall, dass er sich nicht mehr mit den ihm vorher typischen Referenzen der Historie und Geschichte (wie eben dem Nationalsozialismus) beschäftigt, sondern vielmehr auch mit zeitlichen Dimensionen wie der kosmologischen, geologischen oder Lebens-Zeit. Zunehmens treten ab Mitte der achtziger Jahre Raumbezogene Kosmos- und Genesisthemen aus dem Alten Testament oder der Kabbala in den Mittelpunkt. Raum und Zeit als zwei Leitkategorien breiten sich wie eine Art Dach über Kiefers gesamtes Œuvre und über die üblichen ikonografischen Interpretationsmodelle aus. Sie werden von mir als alternative Lesart der Forschung empfohlen.
Jedes Bildwerk besitzt neben seiner räumlichen Gestalt und seinem kompositorischen Bildaufbau auch eine implizite Bildzeit. Beide Determinanten bedingen als Ordnungsraster nicht nur die jeweilige formale Bildgestalt, sondern auch den strukturellen Bildgehalt in Form eines zeitlich-räumlichen Ausdrucks. Raum und Zeit sind als normativ zu verstehen, im Sinne eines Standards, gleichsam als eine Regel, die grundsätzlich für die Annäherung und Interpretation der Kieferschen Arbeiten angewendet werden kann. Die Wahrnehmung von Raum und Zeit bei Kiefer kann gleichsam übergreifend in die folgenden drei Kategorien eingeteilt werden: 1.) die thematische Referenz auf die beiden Dimensionen, 2.) der tatsächlich motivische Bezug oder 3.) die faktische Umsetzung anhand der Dimension des Bildträgers oder der Entstehungszeit des Werkes. Raum und Zeit liegen zudem ganz grundsätzlich dem kosmologischen Weltentwurf zugrunde, da Alles in Zeit und Raum ist. Die beiden Dimensionen sind dem Kieferschen Sternenbild qua seiner Existenz daher schon anhaftig.
Kiefer hat in den Jahren 1995 bis 2010 eine beachtliche Anzahl an Sternenbildern geschaffen. Er fertigt die Bilder vor allem seriell an, so dass diese Fülle auf Basis diverser formaler Bildanlagen von mir in zwei Gruppen unterteilt wurde.
Die erste Gruppe folgt einer traditionellen Bildform, indem sie grundsätzlich den Bildträger kompositorisch in eine irdische und eine stellare räumliche Zone unterteilen. Der nächtliche Sternenhimmel breitet sich darin geschlossen über einer Landschaft oder einem Innenraum aus. Der Betrachter wird gleichsam von seinem irdischen Standpunkt aus auf den Blick gen Sternenhimmel gelenkt. Die Sternenbilder aus irdischer Perspektive versammeln philosophisches und literarisches Gedankengut der historischen Personen Immanuel Kant, Ingeborg Bachmann und Pierre Corneille. Die zweite Gruppe umfasst jene Arbeiten, die den irdischen Standpunkt verlassen und keine Horizontlinie mehr aufweisen. Bei diesen Arbeiten begreift Kiefer den Bildträger in seiner kompletten Dimensionalität als rein stellaren Bildraum. In den Werken wird als Konsequenz eine für Kiefers Sternenbilder neue bildräumliche Perspektive obligat.
Die Sternenbilder Kiefers fokussieren grundsätzlich kosmologische Fragestellungen, seien sie philosophisch, literaturwissenschaftlich, naturphilosophisch, naturwissenschaftlich oder religiös konnotiert. Damit folgen sie der Tradition vorangegangener Künstlergenerationen. In einem Einführungskapitel, welches für die Verortung Kiefers in die Tradition des Sternenbildes wichtig ist, wird aufgezeigt, dass das Bild der Sterne stets in enger Verbindung mit den eben genannten Disziplinen steht, durch diese maßgeblich beeinflusst wurde und weiterhin wird. Den Künstlern ist die Tatsache gemein, dass sie mit ihrer Darstellung des Sternenhimmels der Frage nach einer räumlichen und zeitlichen Ordnung der Welt, gleichsam als Kosmos verstanden, sowie ihrer Entstehungsursache und des „Bauplans“ nachgehen. Den Sternenbildern scheint gemein zu sein, dass sie realiter durch Beobachtungen, Erkenntnisse und Ergebnisse Wissensräume sichtbar machen, determinieren und das jeweilige Wissen transportieren.
Kiefers kosmologischer Diskurs verläuft in dem großen Bereich des Nicht-Wissens, mit dem Versuch einen ontologischen Sinn herzustellen. Die Arbeiten, die auf Kant referenzieren, auf Bachmann und auf Corneille zeugen von Kiefers kosmologischer Auseinandersetzung, seiner Frage nach Gott, seiner Verortung im Kosmos, seiner Beschäftigung mit dem Darstellbaren und Un-Darstellbaren und einer damit verbundenen Sinnsuche.
The $p$-adic section conjecture predicts that for a smooth, proper, hyperbolic curve $X$ over a $p$-adic field $k$, every section of the map of étale fundamental groups $\pi_1(X) \to G_k$ is induced by a unique $k$-rational point of $X$. While this conjecture is still open, the birational variant in which $X$ is replaced by its generic point is known due to Koenigsmann. Generalising an alternative proof of Pop, we extend this result to certain localisations of $X$ at a set of closed points $S$, an intermediate version in between the full section conjecture and its birational variant. As one application, we prove the section conjecture for $X_S$ whenever $S$ is a countable set of closed points.
Inhibitoren der Apoptose (IAP, inhibitor of apoptosis) Proteine spielen eine wichtige Rolle in Bezug auf Zelltodregulation und es ist anzunehmen, dass eine Dysregulation dieser Proteine zu einer Tumorentwicklung und Tumorprogression beiträgt. Erhöhte Expressionslevel von IAP Proteinen verhindern die Aktivierbarkeit des Zelltodprogrammes von Tumorzellen und eine Reihe von Studien konnte bereits erhöhte IAP Level in Tumorzelllinien sowie in primären Tumorproben nachweisen. Des Weiteren korrelieren erhöhte Expressionslevel von IAPs in Tumoren mit Behandlungsresistenzen und schlechten Prognosen für die Patienten.
Das diffuse großzellige B-Zell Lymphom (DLBCL, diffuse large B-cell lymphoma) zählt zu den häufigsten Subtypen der Non-Hodgkin Lymphome (NHL) mit 40 % aller neu diagnostizierten NHL Fälle. DLBCL ist eine sehr heterogene Erkrankung die in drei verschiedene Gruppen klassifiziert wurde: aktivierter B-Zell Typ (ABC, activated B-cell), Keimzentrum B-Zell Typ (GCB, germinal center B-Cell) und Mediastinaler großzelliger B-Zell Typ (PMBL, primary mediastinal B-cell lymphoma). Erhöhte Expressionslevel von zellulärem IAP1 (cIAP, cellular IAP) und cIAP2 wurden ebenfalls in primären Tumorproben von DLBCL Patienten nachgewiesen. Smac mimetics wurden entwickelt, um IAPs zu antagonisieren und stellen damit eine Behandlungsstrategie für DLBCL Patienten dar, denn ca. 40 % aller DLBCL Patienten entwickeln ein Rezidiv oder erreichen gar keine Remission unter Standardtherapie. Jedoch ist der Effekt von Smac mimetics in einer Einzelbehandlung limitiert, weswegen Kombinationstherapien mit Smac mimetics eine vielversprechende Strategie für ihren klinischen Einsatz darstellen. Aus diesem Grund haben wir in dieser Arbeit den Effekt von Smac mimetic in Kombination mit Proteasom-Inhibitoren analysiert und einen speziellen Fokus auf den molekularen Mechanismus des ausgelösten Zelltodsignalweges gelegt.
Die Kombination verschiedener Konzentrationen des Smac mimetics BV6 mit dem Proteasom-Inhibitor carfilzomib (CFZ) löst in allen drei getesteten DLBCL Subtypen (ABC, GCB und PMBL) Zelltod aus. Die Kalkulation des Kombinationsindexes (CI, combination index) sowie des Bliss Scores, zwei quantitative Parameter zur Bestimmung eines Synergismus, zeigen, dass fast alle getesteten Kombinationen einen Synergismus aufweisen. Dies verdeutlicht, dass eine Co-Behandlung von BV6 und CFZ eine wirksame Kombination ist um Zelltod in DLBCL Zelllinien auszulösen. Außerdem zeigt eine Kombination von BV6 mit anderen Proteasom-Inhibitoren wie ixazomib (IXA) oder oprozomib (OPR), ebenfalls eine synergistische Reduktion der Zellviabilität. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der detektierte Effekt nicht auf eine Substanz limitiert ist, sondern, dass ein genereller Effekt von Smac mimetic und Proteasom-Inhibitoren vorliegt, um Zellviabilität in DLBCL zu reduzieren. BV6 und CFZ induzieren einen apoptotischen Zelltod, da sie die Spaltung und Aktivierung von Initiator- und Effektorcaspasen (Caspasen-3, -7, -8 und -9) initiieren und sich der induzierte Zelltod mit Hilfe des Caspasen-Inhibitors zVAD.fmk verhindern lässt. Die Behandlung mit BV6 und CFZ führt zu einer Akkumulation von NIK, ein Protein welches zur Aktivierung des non-kanonischen NF-kB Signalweges benötigt wird. Weitere Untersuchungen zeigen jedoch, dass NIK nicht an der Zelltodinduktion beteiligt ist, da eine siRNA-basierte Herunterregulierung des NIK Proteins keinen Einfluss auf die Zelltodinduktion nimmt. Ebenfalls ist der Zelltod unabhängig von dem TNFa Signalweg, da weder eine Behandlung mit dem TNFa Inhibitor Enbrel den Zelltod verringern kann noch eine zusätzliche Gabe von TNFa den Zelltod erhöht. Weitere mechanistische Studien zeigen eine kritische Rolle der mitochondrialen Apoptose für den BV6/CFZ-vermittelten Zelltod. Unter Behandlung mit BV6/CFZ wurde eine Aktivierung von BAX und BAK nachgewiesen, welche beide mit verantwortlich für die Porenbildung in der mitochondrialen Membran sind. Eine Herunterregulation dieser beiden Proteine mittels siRNA reduziert signifikant den durch BV6/CFZ-induzierten Zelltod auf ein Minimum. Gleichzeitig löst eine Co-Behandlung mit BV6/CFZ einen Verlust des mitochondrialen Membranpotentials (LOMMP, loss of mitochondrial membrane potential) aus. In Übereinstimmung mit den vorherigen Experimenten, zeigen wir eine Akkumulation von mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS; reactive oxygen species), sowie einen generellen Anstieg des allgemeinen ROS Levels. Eine Behandlung mit BV6/CFZ zeigt eine deutliche Akkumulation des pro-apoptotischen Proteins NOXA. Um dessen funktionelle Relevanz zu überprüfen, wurde die Proteinmenge von NOXA mittels siRNA stark reduziert. Eine Behandlung mit der Kombination aus BV6 und CFZ zeigt daraufhin eine signifikant reduzierte Zelltodinduktion, was die funktionelle Relevanz von NOXA für den BV6/CFZ-vermittelten Zelltod unterstreicht. Immunopräzipitationsstudien zeigen, dass in RIVA und U2932 Zellen NOXA konstitutiv an seinen anti-apoptotischen Bindungspartner MCL-1 gebunden ist, was die Zellen bereits darauf vorbereitet Apoptose zu durchlaufen. Dieses sogenannte „primen“ für Apoptose wird durch die Behandlung mit BV6 und CFZ weiter verstärkt, da es die Bindung zwischen NOXA und MCL-1 weiter erhöht. Dadurch wird die Balance zwischen pro- und anti-apoptotischen Proteinen zu Gunsten der pro-apoptotischen Proteine verschoben und die Induktion von Apoptose begünstigt.
Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass DLBCL Zelllinien sensitiv auf eine Behandlung mit Smac mimetic und Proteasom-Inhibitor reagieren und damit eine mögliche neue Behandlungsstrategie für diese heterogene Tumorerkrankung darstellt.
Alzheimer’s disease (AD) is the major cause of dementia. It is characterized by the accumulation of abnormal proteins (amyloid-β plaque and neurofibrillary tangles) leading to loss of synapses, dendrites, neurons, memory and cognition. Sporadic late-onset AD is the major type of AD characterized by unclear etiology and a lack of disease-modifying therapy. To understand this disease, an alternative AD hypothesis has been proposed: AD may resemble diabetes in the brain or “diabetes type 3”. This hypothesis is supported by the fact that (1) brain glucose hypometabolism precedes AD clinical symptoms and (2) diabetes increases the risk of AD. To test this hypothesis, wild-type rats receiving intracerebroventricular administration of streptozotocin (icv-STZ) were used as a model. Streptozotocin (STZ) is a glucosamine-nitrosourea compound commonly used to induce experimental diabetes by peripheral administration. A similar pathological mechanism to peripheral STZ is then proposed to explain icv-STZ toxicity: insulin receptor signaling impairment results in glucose hypometabolism leading to cognitive deficits.
Objective: Icv-STZ model seems promising as a toxin-induced, non-transgenic AD model with the possibility to connect AD and diabetes mellitus (DM), one of the risk factors for AD. However, the mechanisms of how icv-STZ induced AD-like symptoms are unclear. Therefore, using microdialysis as the main technique, we tested 2 AD hypotheses in this model: (1) the glucose hypometabolism as an alternative AD hypothesis and (2) the cholinergic deficit as an important characteristic of AD pathology. Hippocampus was chosen because cholinergic function in this region is severely affected in AD. In comparison, the striatum was chosen because it contains cholinergic interneurons and is less affected in AD.
Methods: In this study, we used male Wistar rats of 190-220 g body weight (5 weeks of age). The rats were injected intracerebrally with STZ at a dose of 3 mg/kg (2x1.5 mg/kg; „high dose“) and 0.6 mg/kg („low dose“) with saline as control. After 21 days, samples were collected to investigate cholinergic and metabolic changes using histology, biochemistry, and neurochemistry. Brain injury was confirmed using GFAP staining and Fluoro jade staining in the hippocampus. Mitochondrial toxicity was investigated by measurement of mitochondrial
respiratory function in both hippocampus and striatum. Cholinergic markers such as acetylcholinesterase (AChE) activity, choline acetyltransferase (ChAT) activity, and choline transporter (CHT-1) activity, commonly known as high-affinity choline uptake (HACU), were measured in both hippocampus and striatum using a spectrophotometer and a scintillator.
Microdialysis is the main technique in our study. It was done in awake animals under behavioral or pharmacological stimulation. We used a self-built probe with a semi-permeable membrane (pore size of 30 kDa) that was implanted in either hippocampus or striatum. The probes were then perfused with artificial cerebrospinal fluid (aCSF) supplemented with 0.1 μM neostigmine for extracellular acetylcholine level measurement. During the perfusion, small hydrophilic compounds from brain extracellular space diffuse into the dialysates. Dialysates of 15 minutes intervals were collected for 90 minutes and used for analysis. After collection of dialysates for the first 90 minutes (basal data), rats were moved to an open field box (35x32x20 cm) for behavioral stimulation. After collection of the second 90 minute dialysates, the rats were transferred back to the microdialysis cage and dialysates were collected for another 90 minutes. On day 2, after collection of dialysates under basal conditions, 1 μM scopolamine was added to the perfusion solution for stimulation of acetylcholine release. The dialysates were also collected for 90 min followed by another 90 min of dialysis without scopolamine. The microdialysate samples were then analyzed as follows. ACh level was measured by HPLC-ECD. Glucose metabolites (glucose, lactate, pyruvate) were measured by a CMA-600 microanalyzer. An alternative energy metabolite (beta-hydroxybutyrate/BHB) was measured by GC-MS. Choline and glycerol as membrane breakdown markers were also measured by HPLC-ECD and CMA-600 microanalyzer, respectively. Markers of oxidative stress (isoprostanes) were measured using a commercially available ELISA kit.
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A novel role for mutant mRNA degradation in triggering transcriptional adaptation to mutations
(2020)
Robustness to mutations promotes organisms’ well-being and fitness. The increasing number of mutants in various model organisms, and humans, showing no obvious phenotype (Bouche and Bouchez, 2001; Chen et al., 2016b; Giaever et al., 2002; Kok et al., 2015) has renewed interest into how organisms adapt to gene loss. In the presence of deleterious mutations, genetic compensation by transcriptional upregulation of related gene(s) (also known as transcriptional adaptation) has been reported in numerous systems (El-Brolosy and Stainier, 2017; Rossi et al., 2015; Tondeleir et al., 2012); however, the molecular mechanisms underlying this response remained unclear. To investigate this phenomenon, I develop and study multiple models of transcriptional adaptation in zebrafish and mouse cell lines. I first show that transcriptional adaptation is not caused by loss of protein function, indicating that the trigger lies upstream, and find that the response involves enhanced transcription of the related gene(s). Furthermore, I observe a correlation between levels of mutant mRNA degradation and upregulation of related genes. To investigate the role of mutant mRNA degradation in triggering the response, I generate mutant alleles that do not transcribe the mutated gene and find that they fail to induce a transcriptional response and display stronger phenotypes. Transcriptome analysis of alleles displaying mutant mRNA degradation revealed upregulation of a significant proportion of genes displaying sequence similarity with the mutated gene’s mRNA, suggesting a model whereby mRNA degradation intermediates induce transcriptional adaptation via sequence similarity. Further mechanistic analyses suggested RNA-decay factors-dependent chromatin remodeling, and repression of antisense RNAs to be implicated in the response. These results identify a novel role for mutant mRNA degradation in buffering against mutations. Besides, they hold huge implications on understanding disease-causing mutations and shall help in designing mutations that lead to minimal transcriptional adaptation-induced compensation, facilitating studying gene function in model organisms.
An overexpression of the E3 ubiquitin ligase TRIM25 is implicated in several human cancers and frequently correlates with a poor prognosis and occurrence of therapy resistance in patients. Previous studies of our group have identified the mRNA encoding the pro-apoptotic caspase-2 as a direct target of the ubiquitous RNA binding protein human antigen R (HuR). The constitutive HuR binding observed in colon carcinoma cells negatively interferes with the translation of caspase-2 mainly through binding to the 5' untranslated region (UTR) of caspase-2 and thereby confers an increased survival of tumor cells. The main objective of this thesis was to unravel novel regulatory proteins critically involved in the control of caspase-2 translation and their impact on therapeutic drug resistance of human colon carcinoma cells. By employing RNA affinity chromatography in combination with mass-spectrometry, among several putative caspase-2 mRNA binding proteins, we have identified the tripartite motif-containing protein 25 (TRIM25) as novel caspase-2 translation regulatory protein in colon carcinoma cells. The constitutive TRIM25 binding to caspase-2 mRNA in two different human colorectal carcinoma cell lines was validated by ribonucleoprotein (RNP)-immunoprecipitation (RIP)-RT-PCR assay and by means of biotin-labeled RNA-pull-down assay. Since caspase-2 is a caspase which is particularly involved in the DNA-damage-induced apoptosis, I tested the functional relevance of negative caspase-2 regulation by TRIM25 for chemotherapeutic drug-induced cell death of different adenocarcinoma cells by RNA interference (RNAi)- mediated loss-of-function and gain-of-function approaches. In the first part of the thesis, I could demonstrate that transient silencing of TRIM25 caused a significant increase in caspase-2 protein levels without affecting the amount of corresponding mRNAs. Mechanistically, the TRIM25 silencing-triggered increase in caspase-2 was totally impaired by cycloheximide, indicating that the stimulatory effects on caspase-2 levels depend on protein synthesis. This finding was corroborated by RNP/polysomal fractionation, which revealed that the transient knockdown of TRIM25 caused a significant redistribution of caspase-2 transcripts from the fraction of RNP particles to that from translationally active polyribosomes.
The second part of my thesis aimed at the elucidation of the functional consequences of the negative caspase-2 regulation by TRIM25 for enhanced tumor cell survival. Thereby, I found that the siRNA-mediated knockdown of TRIM25 caused a significant increase in the chemotherapeutic drug-induced cleavage of caspase-3 and to elevations in cytoplasmic cytochrome c levels implicating that TRIM25 depletion did mainly affect the intrinsic apoptotic pathway. Concordantly, the ectopic expression of TRIM25 caused a reduction in caspase-2 protein levels, concomitant with an attenuated sensitivity of tumor cells to doxorubicin.
To test the functional impact of caspase-2 in the TRIM25 depletion-dependent sensitization to drug-induced apoptosis, I employed a siRNA-mediated knockdown of caspase-2. Interestingly, the strong induction of caspase-3 and -7 cleavage after doxorubicin treatment was fully impaired after the additional knockdown of caspase-2, indicating the sensitizing effects by TRIM25 knockdown depend on caspase-2.
Data from this thesis identified the TRIM25 as a novel RNA-binding protein of caspase-2 mRNA, which negatively interferes with the translation of caspase-2 and which functionally contributes to chemotherapeutic drug resistance of colon carcinoma cells. Interfering with the negative TRIM25-caspase-2 axis may represent a promising therapeutic avenue for sensitizing colorectal cancers to conventional anti-tumor therapies.
Bipolar disorder (BD) and major depressive disorder (MDD) are severe mood disorders that belong to the most debilitating diseases worldwide. Differentiating both mood disorders often poses a major clinical challenge, leading to frequent misdiagnoses. Objective biomarkers able to differentiate individuals with BD and MDD therefore represent a psychiatric research field of utmost importance. Recent studies have applied resting-state fMRI paradigms and found promising results differentiating both disorders based on the acquired data. However, most of these studies have focused their efforts on acutely depressed patients. Thus, it remains unclear whether the aberrations remain in a symptomless disease state.
The here presented study addresses these issues by evaluating the ability to differentiate both disorders from one another by conducting a between-group comparison of functional brain network connectivity (FNC) obtained from resting-state fMRI data. Data were collected from 20 BD, 15 MDD patients and 30 age- and gender-matched healthy controls (HC). Graph theoretical analyses were applied to detect differences in functional network organization between the groups on a global and regional network level.
Network analysis detected frontal, temporal and subcortical nodes in emotion regulation areas such as the limbic system and associated regions exhibiting significant differences in network integration and segregation in BD compared to MDD patients and HC. Participants with MDD and HC only differed in frontal and insular network centrality.
These results indicate that a significantly altered brain network topology in the limbic system might be a trait marker specific to BD. Brain network analysis in these regions may therefore be used to differentiate euthymic BD not only from HC but also from patients with MDD.
Dopaminerge Neurone sind vor allem im Mittelhirn lokalisiert und modulieren die Funktion der Basalganglien, welche eine wichtige Rolle bei motorischem, kognitivem und emotionalem Verhalten spielen. Eine Dysregulation dopaminerger Neurotransmission, speziell die veränderte Belohnungsverarbeitung, spielt eine zentrale Rolle in der Ätiopathogenese der Aufmerksamkeitsdefizit- und Hyperaktivitätsstörung (ADHS), die im Erwachsenenalter häufig durch Komorbiditäten wie affektive Störungen, Angststörungen, Substanzgebrauch-Störungen, Persönlichkeitsstörungen oder Adipositas geprägt ist. Im Rahmen einer Teilstudie eines multizentrischen europäischen Projekts, CoCA (englisch: Comorbid Conditions in ADHD) genannt, soll die Modulation des dopaminergen Belohnungssystems bei gesunden Probanden durch einen pharmakologischen Provokationstest geprüft werden. Die funktionelle Magnetresonanztomographie (MRT) stellt hierbei ein nützliches bildgebendes Verfahren dar, das nicht-invasiv und bei hoher örtlicher Auflösung Veränderungen des sogenannten BOLD-Signals (englisch: blood oxygen level dependent) misst.
Die vorliegende Arbeit untersucht, inwiefern das dopaminerge Belohnungssystem durch einen pharmakologischen Provokationstest mit einem Dopaminagonisten sowie einem Dopaminantagonisten im Vergleich zu Placebo zu modulieren ist. Dazu wurde die BOLD-Antwort mittels funktionellem MRT während eines Gewinnspiels (Monetary Incentive Delay Tasks) mit inbegriffener Antizipations- und Feedback-Phase erforscht. Es wurde zuvor postuliert, dass sich die Aktivität belohnungsabhängiger Strukturen (wie ventrales Striatum, Putamen, Caudatus, anteriore Insula und medialer präfrontaler Kortex) während des Monetary Incentive Delay Tasks in einem pharmakologisch neutralen Haupteffekt reproduzieren lässt. Außerdem wurde ein Unterschied im Aktivitätsniveau des Belohnungssystems unter Pharmaka-Administration versus Placebo erwartet, sodass unter Amisulprid eine Dämpfung, und unter Levodopa eine Aktivitätssteigerung dessen darstellbar werden sollte.
Ein kontrolliert randomisiertes, doppelblindes Cross-over-Studiendesign, umfasste 45 gesunde Probanden, die durchschnittlich circa 23 Jahre alt (SD = 2,71 Jahre) waren. Die Studienteilnehmer absolvierten einen pharmakologischen Provokationstest mit Levodopa (100mg/ 25mg Carbidopa), Amisulprid (200mg) und Placebo sowie anschließender fMRT-Messung in einem 3 Tesla Scanner in randomisierter Reihenfolge. Die Analyse der fMRT-Daten erfolgte anhand von zwei primär definierten Kontrasten: Antizipation Gewinnbedingung > Feedback Gewinnbedingung und Antizipation Gewinnbedingung > Antizipation Kontrollbedingung zur Untersuchung von Belohnungserwartung und Feedback mittels der gemessenen BOLD-Antworten. Das verwendete GewinnspielParadigma, Monetary Incentive Delay Task genannt, erlaubt hierbei eine Beobachtung verschiedener Anteile der Belohnungsverarbeitung.
Im Haupteffekt der beiden Kontraste konnte eine signifikante BOLD-Aktivität in belohnungsabhängigen Gehirnregionen wie Putamen, anteriore Insula und Thalamus dargestellt werden. Unter Amisulprid-Administration konnte ein signifikanter dämpfender Effekt im Vergleich zu Placebo gezeigt werden. Für Levodopa ergab sich wider Erwarten jedoch kein signifikanter Unterschied im Aktivitätsniveau des Belohnungssystems.
Die vorhandenen Ergebnisse der durchgeführten Studie bieten eine Basis, die veränderte Regulation dopaminerger Neurotransmission im Rahmen psychiatrischer Erkrankungen besser zu beurteilen und weiter zu erforschen. Um ADHS mit seinen Komorbiditäten umfänglicher zu erfassen, ist es unvermeidbar, den Pathomechanismus der Dysregulation dopaminerger Neurotransmission, mit der daraus folgenden veränderten Belohnungsverarbeitung, in zukünftigen Studien genauer zu untersuchen.
Investigating the inhibition of anti-apoptotic BCL-2 family proteins in pediatric cancer cells
(2020)
Cancer is amongst the leading causes of death in childhood. Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most frequently occurring soft tissue sarcoma in children and adolescents. It presumably arises from mesenchymal progenitors of skeletal muscle cells and presents with different subtypes that differ both histologically and genetically. Osteosarcoma (OS) and Ewing sarcoma (ES) are the most frequently diagnosed pediatric bone tumors. Even though the prognosis of these cancer entities improved significantly during recent decades, the survival rates are currently stagnating. Especially, dismal prognosis of relapsed and metastasizing cases of these malignancies urgently call for novel treatment options. BCL-2 proteins are vital guardians that control intrinsic apoptosis. Furthermore, it was shown that BCL-2 proteins critically regulate apoptosis in pediatric solid tumors. BH3 mimetics are small molecules that bind and inhibit anti-apoptotic BCL-2 proteins. They have already been investigated as cancer therapeutics for several years and show first encouraging clinical results. Therefore, we hypothesized that targeting BCL-2, MCL-1 and BCL-XL might be a promising approach to treat RMS, OS and ES.
In this study, we aimed to comprehensively evaluate the potential of anti-apoptotic BCL-2 family proteins as therapeutic targets for pediatric solid tumors such as RMS, OS and ES.
Notably, RMS, OS and ES cells largely expressed the most relevant BCL-2 family protein members. However, cells were widely insensitive to single pharmacological inhibition of either BCL-XL, BCL-2 or MCL-1 by A-1331852, ABT-199 and S63845, respectively. This finding was independent of their BCL-2 family protein expression levels. Significantly, co-administration of A-1331852 and S63845 induced cell death in RMS, OS and ES cell lines in a highly synergistic manner. Transient silencing of MCL-1 and/or BCL-XL verified the co-dependency of RMS cells on these proteins for survival. Importantly, A-1331852/S63845 co-treatment was more efficient in causing cell death in RMS, OS and ES cells than either inhibitor combined with ABT-199. Efficacy of A-1331852/S63845 co-treatment could be additionally demonstrated in a primary sample of pediatric malignant epithelioid mesothelioma.
Mechanistically, concomitant A-1331852/S63845 treatment mediated rapid intrinsic apoptosis involving swift loss of the mitochondrial outer membrane potential as well as activation of caspases-3, -8 and -9. An observed caspase dependent loss of MCL-1 might further amplify the A-1331852/S63845 triggered pro-death signaling. Furthermore, we identified BAX and BAK as key mediators of apoptosis caused by dual inhibition of MCL-1 and BCL-XL. A-1331852/S63845 induced cell death was relying on BAX and/or BAK in a cell line dependent manner. Interestingly, treatment with A-1331852 and S63845 liberated BAK from its interaction with MCL-1 and BCL-XL. Moreover, BAX and BAK were activated and interacted with each other to form a pore in the outer mitochondrial membrane. Further, in RD cells BIM and NOXA partially contributed to A-1331852/S63845 mediated cell death. Consistently, in this cell line BIM and NOXA were disrupted from their binding to BCL-XL and MCL-1 by A-1331852 and S63845, respectively. However, BH3 only proteins were not involved in A-1331852/S63845 induced cell death in Kym-1 cells. Therefore, we concluded that BH3 only proteins played only a marginal and cell line dependent role in mediating cell death caused by MCL-1 and BCL-XL co-repression.
Notably, A-1331852/S63845 co-treatment spared non-malignant fibroblasts, myoblasts and peripheral blood mononuclear cells, which suggests a therapeutic window for its application in vivo. Besides, we could demonstrate that sequential BH3 mimetic treatment still significantly induced cell death, albeit to minor extents compared to its dual administration. Importantly, we successfully evaluated concomitant treatment with A-1331852 and S63845 in multicellular RMS spheroids and in an in vivo embryonic chicken model of RMS. These findings stress the high transcriptional relevance of A-1331852/S63845 as an emerging novel cancer regimen.
Collectively, the thesis at hand explored the great potential of co-treatment with A-1331852 and S63845 in pediatric solid tumors and unveiled the underlying molecular mechanisms of cell death in RMS. Together, the current investigations support further preclinical and clinical studies to evaluate the effect of dual MCL-1 and BCL-XL targeting in pediatric solid tumors.
The small photoreceptor Photoactive Yellow Protein (PYP) enters a reversible photocycle after excitation with blue light. The intermediate states are formed on timescales ranging from femtoseconds to seconds including chromophore isomerization and protonation as well as large structural rearrangements. To obtain local dynamic information the vibrational label thiocyanate (SCN) can be inserted site-specifically at any desired position in the protein by cysteine mutation and cyanylation. The label's CN stretch vibration is highly sensitive to polarity, hydrogen bonding interactions and electric fields and is spectrally well separated from the overlapping protein absorptions. During the course of this thesis it was impressively demonstrated that the successful incorporation of the SCN label at selected positions in PYP provides a powerful tool to study structure changes and dynamics during the photocycle and enhance the local information that are obtained by infrared (IR) spectroscopic methods. Hence the SCN-labeled protein mutants were studied under equilibrium (steady-state) and non-equilibrium conditions.
Examination of the SCN absorption by FTIR spectroscopy showed the influence of various local environments on the label for different locations in the dark state. The response of the label under illumination with blue light reveals information about structural changes in the signaling state. Additional information for both states were obtained by the vibrational lifetime of the CN vibration measured via ultrafast IR-pump-IR-probe experiments. This observable is particularly sensitive for solvent exposure of the label. Time-resolved IR spectroscopy proved to be an excellent method to follow the protein dynamics throughout most part of the photocycle on a hundreds of femtoseconds to milliseconds timescale. By close inspection of protein and chromophore dynamics in wildtype-PYP over nine decades in time, new insights into the changes leading to the proposed photocycle intermediates were obtained. The investigation of the SCN label allowed to follow the different transient structure changes with high local resolution. Depending on its position within the protein the response of the label provided additional information on the photocycle transitions.
The insights that are obtained by the different observables in the steady-state and by the reaction of the SCN label to formation of the different intermediate states during the photocycle contribute to an improved understanding of local, light-induced structure changes in the photoreceptor PYP. This comprehensive study demonstrated the potential provided by the application of SCN as IR label for investigation of protein dynamics.
Hofstadter-Hubbard physics
(2020)
The Hofstadter model, besides the Haldane and Kane-Mele models, is the most common tight-binding model which hosts topologically nontrivial states of matter. In its time-reversal-symmetric formulation the model can even describe topological insulators. Experimentally, the Hofstadter model was realized with ultracold quantum gases in optical lattices which is a wellcontrolled way to engineer quantum states of tight-binding Hamiltonians. Another established control parameter in ultracold quantum gases are twoparticle, on-site interactions, also known as Hubbard interactions. This work aims at introducing the reader to the concepts of topological states of matter, a collection of corresponding tight-binding models, and the methodology to treat interacting topological states with dynamical mean-field theory.We present recent results for inhomogeneous, interacting systems, spinimbalanced magnetic systems, propose experimental detection methods, and extensions to three-dimensional topological states.
In der vorliegenden Untersuchung wurde das bovine, Hydroxylapatit-basierte, Knochenersatzmaterial Hypro-Oss® zunächst ex vivo überprüft, anschließend subkutan in den interskapulären Bereich von 12 weiblichen Wistar-Ratten (Testgruppe) eingebracht; bei 12 weiteren Tieren erfolgte eine Sham-Operation ohne Einbringung von Biomaterial (Kontrollgruppe). Anschließend wurde die Gewebereaktion über 30 Tage beobachtet und die Explantate jeweils nach Tag 3, 15 und 30 histologisch und histomorphometrisch untersucht.
Die histologische Analyse zeigte innerhalb des Beobachtungszeitraums von 30 Tagen eine störungsfreie Eingliederung der Hypro-Oss®-Granula in das umliegende Gewebe. Bereits 3 Tage nach Einbringung des Biomaterials waren mononukleäre Zellen erkennbar, die bis Tag 30 weiter zunahmen. Ab diesem Zeitpunkt zeigten sich auch TRAP-positive, CD-68-negative Multinukleäre Zellen, die das Ergebnis einer Fusion von Makrophagen sind und eine Fremdkörperreaktion indizierten. Nach 30 Tagen zeigten sich die Granula histologisch stabil integriert ohne Anzeichen einer immunologischen Abstoßungsreaktion.
Die CD-68-Expression der aufgefundenen Makrophagen und mehrkernigen Riesenzellen bildete ein Kriterium zur Unterscheidung der MNGCs von Osteoklasten, die ebenfalls mehrkernig sind, aber dieses Cluster of Differentiation nicht tragen. Dies charakterisiert die vorgefundenen MNGCs als Fremdkörper-Riesenzellen, da sie ebenso wie die pathologischen Riesenzellen vom Typ Langerhans CD-68 exprimieren.
Dieses Bild bestätigte sich für die Hypro-Oss®-Gruppe in der histomorphometrischen Betrachtung über eine kontinuierliche Zunahme von überwiegend CD-68-positiven Makrophagen bis zum Tag 30, während sie für die Kontrollgruppe über die gesamte Zeit rückläufig waren. Die Multinukleären Zellen erreichten dagegen bereits an Tag 15 ihren Höhepunkt, während in der Kontrollgruppe über den gesamten Beobachtungszeitraum erwartungsgemäß keine MNGCs gefunden wurden.
Der hoch signifikante Anstieg der MNGC-Zahl der Testgruppe bis Tag 15 korreliert positiv mit den Vaskularisationsdaten, was darauf hindeutet, dass die Multinukleären Zellen durch die Einbringung des Biomaterials induziert wurden und über die Sekretion des Signalmoleküls VEGF einen wesentlichen Faktor für die Blutgefäßbildung bilden.
Eine Auffälligkeit hat sich jedoch in Bezug auf das Alleinstellungsmerkmal von Hypro-Oss® gezeigt, welches bei der Aufreinigung nicht erhitzt wird. Diverse Studien haben einen Zusammenhang der Höhe der Sintertemperatur mit der Bildung von MNGCs nachgewiesen, wonach für Hypro-Oss® eine geringe Induzierung von MNGCs zu erwarten gewesen wäre als für vergleichbare, höher erhitzte bovine Knochenersatzmaterialien. Dagegen zeigten die Vaskularisationsdaten unserer Untersuchung für Hypro-Oss® im Vergleich zu 2 anderen bovinen Knochenersatzmaterialien (Bio-Oss® und BEGO OSS®) jedoch signifikant höhere Werte für die Blutgefäßbildung als dies aus der Korrelation von Sintertemperatur mit der Anzahl Multinukleärer Riesenzellen zu erwarten gewesen wäre.
Aufgrund der relativ kurzen Dauer der Beobachtung lassen sich keine belastbaren Ergebnisse in Bezug auf den zu erwartenden Materialabbau und die ossäre Integration von Hypro-Oss® feststellen, welche einer längerfristigen Analyse bedürften als es in dieser Untersuchung möglich war. Es gibt aber klinische Erfahrungsberichte23 hinsichtlich Handling, Heilungsverlauf und Materialintegration von Hypro-Oss® bei Sinusbodenelevation und Guided Bone Regeneration, die auch in der Langfristbetrachtung positive Ergebnisse zeigten. Offen bleibt, ob nicht eine physiologische Wundheilung nur mittels Makrophagen einer pathologischen Wundheilung unter Mitwirkung Multinukleärer Riesenzellen überlegen ist: zumindest robustere Knochenersatzmaterialien wie z.B. das hier untersuchte Hypro-Oss® scheinen dabei weniger sensibel auf Multinukleäre Riesenzellen zu reagieren.
Acute lymphoblastic leukemia (ALL), a neoplastic disorder of blood cells of the lymphoid lineage, is the most frequent childhood cancer. In spite of increasing survival rates, the outcome for adults, infants or relapsed patients is still less favorable, highlighting the need for novel treatment options. Reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules that are involved in a variety of cellular pathways. As high ROS levels lead to oxidative stress and irreversible oxidation of cellular macromolecules, the production and elimination of ROS is tightly controlled. Therefore, cells express several antioxidant molecules and enzymes, including glutathione, catalase and the thioredoxin (Trx) system, to balance ROS levels. As cancer cells were found to have increased ROS levels that could contribute to tumor progression and metastasis, they rely strongly on these antioxidant systems to prevent oxidative damage, making cancer cells especially vulnerable to ROS-inducing treatments. ROS and oxidative stress have been shown to induce programmed cell death via different pathways, however the exact mechanisms that couples oxidative signaling and cell death is not completely understood.
As a disturbance of the cellular redox homeostasis was reported during leukemia development and progression, we wanted to determine the potential of Trx inhibitors for ALL therapy. Additionally, we aimed to further understand the role of ROS and subsequent protein oxidation in the induction and execution of programmed cell death.
First, we demonstrated that the Trx1 inhibitor PX-12 induced cell death in three ALL cell lines. Further analysis of the events leading to PX-12-induced cell death in FADD-deficient (FD) Jurkat cells revealed an increase in ROS levels and oxidation-mediated dimer formation of peroxiredoxin 3 (PRDX3). Interestingly cell death was inhibited by the thiol-containing antioxidant N-acetylcysteine (NAC), but not by non-thiol-containing ROS scavengers. PX-12 treatment further induced cleavage of caspase-9 and -3 and activation of the pro-apoptotic BCL-2 protein BAK, leading us to the conclusion that mitochondria-dependent apoptosis was induced. Interestingly, we could demonstrate an important role for the BH3-only protein NOXA in the mediation of PX-12-induced apoptosis as knock-down of NOXA prevented cell death induction and BAK activation. Our findings give novel insights into the mechanism of PX-12-induced cell death in ALL cell lines and underscores the potential of PX-12 for the treatment of ALL.
To further understand the processes leading to cell death upon inhibition of the Trx system, we analyzed global protein oxidation in Jurkat FD cells upon treatment with the Trx reductase inhibitor Auranofin. In line with previous results, Auranofin induced intrinsic apoptosis that was dependent on BAK and accompanied by increased ROS levels. Using a BIAM Switch Assay followed by mass spectrometry, we demonstrated that Auranofin treatment induced oxidation of over 200 proteins. We identified several proteins whose oxidation upon Auranofin treatment was expected, like Trx1, Trx2 and several peroxiredoxins. Additionally, we verified oxidation of APAF1-interacting protein (APIP) and protein arginine N-methyltransferase (PRMT1) that are both implicated in the regulation of apoptosis. With this analysis we were able to demonstrate that Auranofin treatment leads to changes in global protein oxidation. Whether oxidation of the determined proteins changes their functionality and contributes to apoptosis induction remains to be elucidated.
As we identified BAK as an important player in PX-12- and Auranofin-induced cell death in the previous parts of this study, we wanted to further understand its involvement in ROS-mediated cell death. First analyses in wild-type (WT) and BAK-/- murine embryonic fibroblasts (MEFs) revealed that BAK was essential for Auranofin-induced cell death and that this cell death was caspase-independent in MEFs. Interestingly, BAK oxidation was induced upon treatment with Auranofin, but not upon stimulation with the apoptosis-inducing compound Etoposide. Expression of mutated BAK, with either one or both oxidation-sensitive cysteines mutated to oxidation-insensitive serines, revealed that mutating already one cysteine protected cells from Auranofin , but not Etoposide-induced cell death. Of note, mutation of the BAK BH3 domain rescued MEFs from both, Auranofin- and Etoposide-mediated cell death. The presence of cysteine residues also altered BAK interactions as observed by a mass spectrometric analysis of Auranofin-treated MEFs expressing either WT or cysteine-less BAK. We identified interactions of WT BAK with proteins involved in mitochondrial fission and vesicle transport upon Auranofin treatment. Of note, interaction with proteins involved in apoptosis, like BAX or BCL-XL, was not changed between WT and cysteine-less BAK. Our results demonstrate a critical role for BAK oxidation in Auranofin-induced cell death. Furthermore, we identified novel oxidation-dependent BAK interaction partners.
To conclude, this study highlights the potential of ROS-inducing treatments for ALL therapy and provides novel insights into the redox regulation of programmed cell death.
Aufgrund der starken Heterogenität und Komplexität der akuten myeloischen Leukämie ist diese bis heute nicht zufriedenstellend zu behandeln. Die bestmögliche Therapie wird mittlerweile zunehmend auf die Erkrankung des Einzelnen angepasst. Vermehrt gewinnen Tyrosinkinase-Inhibitoren in der Therapie an Bedeutung. Diese Inhibitoren hemmen Proteine auf zellulärer Ebene.
Bei etwa 30% der AML-Patienten lassen sich Mutationen des FLT3-Gens nachweisen. Das Gen kodiert für die fms like tyrosine kinase 3, eine Rezeptor-Tyrosinkinase an der Zelloberfläche von unreifen Blutzellen des Knochenmarks. Durch Mutationen des FLT3 Gens erhalten diese Zellen einen Proliferationsvorteil gegenüber den physiologischen Blutzellen.
Am häufigsten kommt es zu in frame-Insertionen des FLT3-Gens, vor allem im Bereich der juxtamembranen Domäne: sogenannte interne Tandemduplikationen (ITD). Weiterhin kommen zu einem geringeren Teil Punktmutationen einzelner Codons, zum Beispiel im Bereich des activation loops oder im Bereich des gatekeepers vor. Durch das Auftreten der Punktmutationen, die entweder bereits zum Zeitpunkt der Diagnose vorliegen oder erst während einer Therapie mit einem Tyrosinkinase-Inhibitor entstehen können, verändert sich das Bindungsverhalten vieler solcher gegen FLT3 gerichteten Inhibitoren. Durch Letzteres kann ein mögliches Therapieversagen beispielsweise während der Behandlung mit AC220 (Quizartinib) erklärt werden (Smith et al.).
In der vorliegenden Dissertationsschrift sind Unterschiede der Signalwege zwischen FLT3-ITD und FLT3-ITD mit der zusätzlichen gatekeeper-Punktmutation F691L herausgearbeitet. Dafür wurden die beiden FLT3-Mutationen in den Vektor pMy-IRES-GFP eingebracht und retroviral in Ba/F3-Zellen transduziert. Nach Überprüfung der Expression von FLT3 ITD und dem Wachstumsverhalten unter Zugabe von AC220 (Quizartinib), wurden verschiedene Signalkaskaden von FLT3 mittels Western Blot untersucht. Hierbei zeigten sich sowohl Unterschiede für die Expression von phosphoryliertem ERK als auch von phosphoryliertem STAT5.
Durch verschieden starke Expressionen der FLT3130kDa- und FLT3160kDA-Varianten wurde eine unterschiedliche Lokalisation von FLT3-ITD in Zellen mit und ohne die Mutation F691L postuliert. Allerdings ließ sich diese experimentell mittels Immunfluoreszenz nicht belegen, da die Methode für die verwendeten Suspensionszellen nicht ausreichend geeignet war.
In den durchgeführten Versuchen zum Wachstumsverhalten der Zellen bei der Verwendung von Kinaseinhibitoren konnte bei der Verwendung des SYK-Inhibitors R406 eine dosisabhängige Proliferationshemmung der FLT3-ITD-mutierten Ba/F3- und 32D-Zellen beobachtet werden. Die Hemmung von FLT3 durch R406 wurde in der Literatur bereits beschrieben (Braselmann et al.).
Die abschließenden Experimente der Massenspektrometrie mit SILAC Markierung lassen mit der Detektion von mehreren hundert signifikant regulierten phosphorylierten Proteinen in den beiden FLT3-ITD-exprimierenden Populationen auf die Aktivierung unterschiedlicher Signalwege schließen. Durch das Vergleichen einzelner Teilexperimente ergaben sich Proteine, deren Phosphorylierung mehrfach in die gleiche Richtung reguliert war. Für Zellen, die zusätzlich zur ITD-Mutation die Mutation F691L besaßen, konnten insgesamt sieben hoch-regulierte, phosphorylierte Proteine ermittelt werden, bei denen ein zellulärer Effekt durch die Phosphorylierung der entsprechenden Aminosäurereste in der Literatur beschrieben ist.
Das im Western Blot nachgewiesene, in Zellen mit der Mutation F691L stärker phosphorylierte STAT5 ist aller Voraussicht nach Ursache der nachgewiesenen verstärkten Phosphorylierung von RPS6 im Experiment der globalen Phosphorylierung. Die PIM-Kinasen als Substrate einer STAT5-induzierten Transkription phosphorylieren RPS6 an Serin 235. Dies führt seinerseits zu einer verstärkten Translation von mRNA weiterer Gene. Die genauen Zusammenhänge der hier ermittelten Unterschiede müssen jedoch weiter untersucht werden.
In Zukunft könnte zudem die Untersuchung der beiden Proteine SHP 1 oder HSP90 weitere Aufschlüsse über die unterschiedlichen Signalwege geben. Für beide Proteine wurden Phosphorylierungen detektiert, die in den untersuchten Zellen mit FLT3-ITD bzw. der zusätzlichen Punktmutation F691L unterschiedlich reguliert sind.
Even one century after Santiago Ramón y Cajal’s groundbreaking contribu- tions to neuroscience, one of the most fundamental questions in the field is still largely open, namely understanding how the shape of a dendrite is adapted to its specific biological function. A systematic investigation of this problem is challenging both technically and conceptually because neurons have diverse genetic, molecular, morphological, connectional and functional properties.
In the light of the preceding, dendritic arborisation (da) neurons of the Drosophila melanogaster larva PNS have proven to be an excellent model system for the study of such growth and patterning processes. Structure and function in these cell classes are intimately intertwined, as class type-specific dendritic arbour differentiation processes are required to satisfy a given phys- iological need. Also, there is a remarkable genetic toolkit that enables one to selectively and reproducibly label, image and manipulate each one of these sensory neuron classes. In this thesis, I address the aforementioned open problem by linking single-cell patterning, information processing and wiring optimisation in sensory da neurons to behaviour in Drosophila larva.
In particular, I study Class I ventral peripherical dendritic arborisation (c1vpda) neurons. These are a class of proprioceptive neurons that relay information on the position of the larva’s body back to the CNS during crawling behaviour to assure proper locomotion. Their stereotypical comb- like shaped dendritic branches spread along the body-wall, and they get noticeably deformed during crawling behaviour. The bending of the den- dritic branches is hypothesised to be a possible mechanism to transduce the mechanosensory inputs arising from cuticle folding. Interestingly, c1vpda neurons do not necessarily satisfy optimal wiring constraints since they are required to pattern into a specific shape to fulfil their function. Therefore, I considered the da system to study how the specific functional requirements may be combined with optimal wiring constraints during development.
Although the molecular machinery of dendrite patterning in c1vpda neurons is well studied, the precise elaboration of the comb-like shaped dendrites of these cells remains elusive. Moreover, even though a lot of work has been put into the description and quantification of growth processes of the nervous system, there are still few solid and standardised models of arbour staging and patterning. Importantly, the defining parameters that determine the dendrite elaboration program that in turn is responsible for creating the final arbour morphology are still unknown. As a result, unraveling possible universal stages of dendrite elaboration shared between different model systems and cell types is challenging.
Thus, in order to understand the development of the fine regulation of branch outgrowth that leads to the observed terminal arbour morphology in the mature cell, I collected in vivo, long-term, non-invasive high temporal res- olution time-lapse recordings of dendritic trees during the differentiation process in the embryo and its maturation phase in the larva. For further analysis, I developed new algorithms that quantified the structural changes in dendrite morphology in the time-lapse videos. My approach provides a framework to analyse such developmental data, or any dataset comprising continuous morphological dynamical processes in an unbiased way. Using these newly developed methods, I examined the development of a sample of c1vpda cells and identified five stages of differentiation in these data: initial stem polarization, extension, pruning, stabilization, and isometric stretching during larval stages.
The beginning of the growth process is marked by the polarisation of the main stem. Subsequently, during the extension phase, branches emerge interstitially from the existing main stem. Later, higher-order branches sprout from pre-existing lateral branches, increasing arbour complexity. This is followed by a pruning stage where developmental intermediate dendritic branches are removed. This step leads to a spatial rearrangement of the dendritic tree. The end of the pruning step is followed by a stabilisation period where arbour morphology remains virtually unaltered in the embryo. After hatching, c1vpda dendrites experience an isometric scaling, with their branching complexity and pattern being invariant across all larval stages.
After dissecting the c1vpda dendrites spatiotemporal differentiation process, I established a link between dendritic shape and behaviour. I measured intra- cellular Ca++ activity in the dendrite branches of l1 larvae during forward locomotion, while simultaneously recording branch deformation using a dual genetic line. I reported that post-embryonic c1vpda dendrites Ca++ responses increased in freely crawling larvae. Furthermore, I showed strong correlations between Ca++ signal and deformation of the comb-like dendritic ranches during body-wall contractions.
Then, using a geometrical model, I provided evidence that the pruning stage could reorganise the dendrite morphology to maximise mechanosensory re- sponses during body wall contraction. I showed that the angle orientation of each side branch correlates with the bending curvature and thus with the me- chanical displacement of the cell membrane during locomotion. During the pruning phase, I observed a preferential reduction of less efficient branches with low bending curvature, influencing the mechanisms of dendritic sig- nal integration of c1vpda sensory neurons. I proceeded to quantify branch dynamics at single tip resolution during pruning, providing evidence that a simple random pruning mechanism is sufficient to remodel the tree structure compatible with the observed way.
I used these time-lapse data to constrain a new computational noisy growth model with random pruning based on optimal wiring principles. This model is able to generate highly realistic synthetic c1vpda morphologies. The model furthermore requires few parameters to generate highly accurate temporal development trajectories and morphologies at single-cell level. Utilising this data and model enabled me to investigate upon the hypothesis that a noisy dendrite growth and random pruning mechanism synergise to achieve den- dritic trees efficient in terms of both wiring and function. My findings show how single neurons can create functionally specialised dendrites while min- imising wiring costs, elucidating how general principles of self-organisation may be involved in the generation of these structures.
Hintergrund. Die Achtung der individuellen Autonomie ist eines von vier medizinethischen Prinzipien, das im Kontext von Medizin und Forschung insbesondere in Bezug auf die informierte Einwilligung einer Person thematisiert wird. Menschen mit Demenz können aufgrund innerer oder äußerer Faktoren in ihrer Einwilligungsfähigkeit beeinträchtigt sein, was zu einer Einschränkung ihres Rechts auf Selbstbestimmung führen kann. Im diesbezüglichen Spannungsfeld zwischen Fürsorge und Autonomie soll Entscheidungsassistenz zur Ermöglichung selbstbestimmter Entscheidungen beitragen.
Zielrichtung der Arbeit. Ziel der vorliegenden Dissertation ist die Definition, Implementierung und Evaluation von Entscheidungsassistenzmaßnahmen für Menschen mit Demenz, um deren Autonomie in Entscheidungsprozessen zu unterstützen. Drei Teilprojekte umfassen die Ermittlung des internationalen Forschungsstands zu Entscheidungsassistenz bei Demenz, die Definition und Pilotierung von Unterstützungstools in der Praxis und die Analyse des individuellen Erlebens der vereinfachten Aufklärungsgespräche durch Menschen mit Demenz.
Methode. Im ersten Teilprojekt wurde eine am PRISMA-Standard orientierte systematische Literaturrecherche in Medline und PsycINFO durchgeführt. Die extrahierten relevanten Informationen wurden inhaltlich systematisiert. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurden im zweiten Teilprojekt konkrete Unterstützungstools definiert und in reale Aufklärungsgespräche (Lumbalpunktion) implementiert. Die Tools wurden in der Pilotierung in der Praxis sowie in einem iterativen Diskussionsprozess mit Experten weiterentwickelt. Im dritten Teilprojekt wurde das individuelle Erleben der Teilnehmer der vereinfachten Aufklärungsgespräche mittels problemzentrierter Interviews untersucht und die Daten einer qualitativen Inhaltsanalyse unterzogen.
Ergebnisse. Die Datenbankrecherche ergab initial 2348 Treffer. Nach Screenings der Titel, Abstracts und Volltexte konnten 11 Artikel eingeschlossen werden. Vier der eingeschlossenen Studien sind Interventionsstudien, die übrigen sieben qualitative Interviewstudien. Die identifizierten Unterstützungsmaßnahmen wurden zunächst den beiden Kategorien Interventionen und Strategien und anschließend unter Zuhilfenahme des Konzepts des Contextual Consents fünf komplexitätssteigernden Dimensionen einer Entscheidungssituation zugeordnet (individuelle, soziale, medizinische, informationelle und Folgendimension). Darauf aufbauend wurden im zweiten Teilprojekt acht Entscheidungsassistenzmaßnahmen abgeleitet: (1) Gesprächsstruktur, (2) Elaborierte klare Sprache, (3) Ambiente / Raumgestaltung, (4) Stichwortlisten, (5) Prioritätenkarten, (6) Visualisierung, (7) Vereinfachte schriftliche Einverständniserklärung sowie (8) Personenzentrierte Haltung des Entscheidungsassistenten (1-7: Tools, 8: Grundeinstellung). Die Tools zielen überwiegend auf eine Komplexitätsreduktion in der informationellen Dimension unter Berücksichtigung der fähigkeitsbezogenen und der bedürfnisbezogenen individuellen Dimension ab. Durch Anpassungen der Informationsdarbietung oder der kommunikativen Interaktion im Gespräch dienen sie mehrheitlich der Förderung des (Informations-) Verständnisses. Die Analyse der qualitativen Daten im dritten Teilprojekt zeigt, dass die Erfahrung der vereinfachten Aufklärungsgespräche durch drei übergreifende Themen gekennzeichnet ist. Die Kategorie Formalität versus Informationsgewinn illustriert die individuelle Bedeutung des Aufklärungsgesprächs für die Teilnehmer und deren Bewertung des Prozesses der informierten Einwilligung. Die Kategorie Wahrnehmung der Unterstützung skizziert die Bewertungen der angewandten Unterstützungstools durch die Teilnehmer. Die Kategorie Der Wahrheit ins Auge sehen müssen stellt dar, dass die erlebte Situation des vereinfachten Aufklärungsgesprächs wesentlich durch die Verdachtsdiagnose Demenz bestimmt ist, die im Rahmen aller Aufklärungsgespräche besprochen wurde.
Fazit. Bislang gibt es wenig empirische Forschung zu Entscheidungsassistenz für Menschen mit Demenz und Unterstützungsmaßnahmen werden überwiegend unsystematisch entwickelt und angewendet. Die Wirksamkeit einzelner Unterstützungsmaßnahmen kann aufgrund fehlender Interventionsstudien selten beurteilt werden. Unterstützungsmaßnahmen zielen überwiegend auf eine Komplexitätsreduktion in der Informationsdarbietung und im kommunikativen Interaktionsprozess ab, wobei sie kognitive Beeinträchtigungen und Interaktions-/ Entscheidungsbedürfnisse von Menschen mit Demenz berücksichtigen. Die definierten Tools können als erste konkret handhabbare Werkzeuge verstanden werden, die das strukturierte Leisten von Entscheidungsassistenz für Menschen mit Demenz erleichtern sollen. Sie sind übertragbar auf verschiedene Entscheidungssituationen. Eine Bewertung der Wirksamkeit der definierten Tools sollte in weiteren Entscheidungssituationen und mit größeren Stichproben weiteruntersucht werden. Die Ergebnisse der Evaluation liefern jedoch erste Hinweise darauf, dass einige Teilnehmer sich von einzelnen Tools unterstützt gefühlt haben und die anvisierte Komplexitätsreduktion in der informationellen Dimension in einigen Fällen erfolgreich war. Eine wesentliche Komplexitätssteigerung in der untersuchten Entscheidungssituation entstand durch die negative Emotionen auslösende Vermittlung einer potentiellen Demenzdiagnose (Folgendimension). Dieses Ergebnis impliziert, dass die definierte „verständnisfördernde Toolbox“ um Unterstützungsmaßnahmen zur emotionalen Entlastung von Menschen mit Demenz erweitert werden muss, da davon ausgegangen werden kann, dass vielfältige Entscheidungssituationen für Menschen mit Demenz emotional hoch belastend sind.
Hintergrund
Obwohl Feedback ein wichtiges und gut untersuchtes Element der medizinischen Ausbildung darstellt, wird es trotz eines großen Bedarfs der Studierenden sowohl im Unterricht als auch in Prüfungssituationen nur selten angewendet. Die Frankfurter Medizinstudierenden beklagen besonders, dass sie zu ihren Objective Structured Clinical Examinations (OSCEs) als Abschlussprüfung im Fach Chirurgie bisher kein detailliertes Feedback erhalten. Auch die Prüfenden beklagen häufig, dass sie die Studierenden weder für herausragende Leistungen loben noch über auftretende Fehler informieren können.
Ziel dieser Arbeit ist deshalb die Erstellung und Implementierung eines strukturierten schriftlichen Feedbacks in eine bestehende OSCE-Prüfung im Fach Chirurgie, das an den Bedürfnissen sowohl der Studierenden als auch der Prüfenden orientiert ist.
Material und Methoden
Das Studiendesign war prospektiv. Im ersten Schritt wurde eine Befragung erfahrener OSCE-Prüfender durchgeführt, um zu erheben, welches Feedback sie gerne an Studierende weitergeben würden. Basierend hierauf wurde ein erster Feedbackbogen erstellt. Dieser umfasste neben vorformulierten Aussagen auch die Möglichkeit Freitextkommentare zu geben und wurde von den Prüfenden für jeden Studierenden in der Wechselzeit zwischen den OSCE-Stationen ausgefüllt. Die Feedbackbögen wurden anschließend eingescannt und per E- Mail an die Studierenden geschickt. Im Anschluss hieran erfolgte eine webbasierte Befragung der Studierenden und der OSCE-Prüfenden, sowie eine tiefergehende Befragung der Studierenden in Form von Fokusgruppen- Interviews.
Basierend auf den Ergebnissen der Umfragen und der Fokusgruppen wurden die Feedbackbögen nochmals grundlegend überarbeitet und im folgenden OSCE erneut angewendet. Die Zufriedenheit der Prüfenden und Studierenden wurde analog zur ersten Befragung erhoben.
Ergebnisse
Insgesamt nahmen 351 Studierende und 51 Prüfende in beiden OSCEs an der Studie teil. In der abschließenden Online-Evaluation gaben 87,5% der Studierenden und 91,6% der Prüfenden an, dass sie zustimmen oder eher zustimmen, dass das schriftliche Feedback in zukünftigen OSCE-Prüfungen weiterhin angewendet werden soll. Mehr als 50% der Studierenden gaben jedoch an, dass das Feedback noch nicht konkret genug sei.
Mehr als ein Viertel der Prüfenden gab an, dass das Ausfüllen der Feedbackbögen zeitlich herausfordernd sei. In allen Fokusgruppen wurde das schriftliche Feedback durch die Studierenden befürwortet.
Schlussfolgerung
Die Implementierung eines strukturierten schriftlichen Feedbacks in einen OSCE ist problemlos möglich. Das schriftliche Feedback wird sowohl von den Prüfenden als auch von den Studierenden als nützlich empfunden.
Analyse der Genauigkeit des neurochirurgischen Operationsroboters Robotic Surgery Assistant (ROSA)
(2020)
In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob der Roboter ROSA bei der Durchführung von intrakraniellen Biopsien oder Elektrodenimplantationen eine Alternative zur klassischen, rahmenbasierten Stereotaxie darstellt. Dazu sollte die mechanische und die Anwendungsgenauigkeit des Systems ermittelt werden. Zur Bestimmung der mechanischen Genauigkeit wurde eine experimentelle Phantomstudie durchgeführt. Hier wurden durch den Roboter wiederholt zehn Trajektorien an einem Stereotaxiephantom angefahren. Der Abstand der robotischen Nadel zum Zielpunkt im Phantom wurde anhand von Röntgenbildern bestimmt. Die Wiederholung des Versuchsaufbaus unter Variation der Planungsbildgebung erlaubte den Vergleich verschiedener Schichtdicken sowie zwischen low-dose und normal-dose Verfahren. Die Anwendungsgenauigkeit sollte durch die Analyse operativer Ergebnisse der ROSA erfasst werden. Dazu wurde anhand von postoperativen Bildern die Genauigkeit anhand des Abstands zwischen geplanter und tatsächlicher Lage von Stereoelektroenzephalographie-Elektroden ermittelt. Es wurden verschiedene Referenzierungstechniken, die der Orientierung des Roboters dienen und bei denen eine präoperative Planungsbildgebung (CT oder MRT) mit einem Abbild des OP-Gebietes (durch Oberflächenerkennung oder durch einen Stereotaxierahmen) referenziert wird, verglichen, nämlich CT-Laser; CT-Leksell-Rahmen und MRT-Laser. Die Ergebnisse wurden einer statistischen Analyse unterzogen. Dabei zeigte sich, dass der ROSA-Roboter eine sehr hohe mechanische Genauigkeit im Submillimeterbereich erreicht. Genauigkeitseinbußen bei einer größeren Schichtdicke der zur Planung verwendeten Computertomographie sind messbar, aber gering. Ein signifikanter Einfluss bei der Verwendung eines low-dose-Protokolls konnte nicht festgestellt werden. Dennoch zeigte sich, dass der entscheidende Teil der Ungenauigkeiten in der klinischen Anwendung entsteht und dabei insbesondere durch die Referenzierungstechnik bestimmt wird. Referenzierungen, die auf einer Computertomographie basierten, erwiesen sich als zufriedenstellend genau und als konkurrenzfähig zur konventionellen Methode. Der Unterschied zwischen dem rahmenbasierten und dem auf Oberflächenerkennung basierenden Verfahren war dabei so gering, dass letzteres sich angesichts seiner Vorteile in der Anwendung als besonders günstiges Verfahren hervortut. Im Gegensatz dazu stand das MRT-Laser-Verfahren, welches bei relativ hohen Abweichungen nur eingeschränkt anwendbar scheint und sich damit eher für Anwendungsbereiche mit geringeren Genauigkeitsanforderungen eignet, wie bspw. Biopsien. Weiterhin kann der Verlauf der Trajektorie an den höheren Sicherheitsabstand angepassten werden. Bei der Einordnung der ermittelten Genauigkeiten ist zu beachten, dass es viele weitere, von der Referenzierungs- und Bildgebungsmethode unabhängige Einflussfaktoren gibt. In dieser Arbeit war der Einfluss der erfassten externen Paramter zwar limitiert, bei anderen Autoren zeigte sich jedoch ein signifikanter Effekt. Dennoch deckt sich die Gesamtgenauigkeit mit den Ergebnissen anderer Arbeiten.
In Zusammenschau der Ergebnisse weist die vom ROSA-Assistenzsystem assistierte Stereotaxie eine verbesserte Prozessqualität auf, unter anderem durch die erhebliche Zeitersparnis, ggf. der Wegfall des Transports des narkotisierten Patienten, die Adaptionsmöglichkeiten der Prozessteilschritte an den Patienten, sowie eine hohe Nutzerfreundlichkeit. Entscheidend ist jedoch, dass es sich um ein sehr sicheres Verfahren handelt: Durch die hohe Genauigkeit wird das Operationsrisiko minimiert, gleichzeitig erlauben Laser-gestützte Registrierungsverfahren eine Reduktion der Strahlenexposition. Zur Konsolidierung der in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse sind weitere klinische Daten notwendig.
Computational estimation is an important skill in everyday life as well as in educational contexts. In the last decades, research has found that children use several strategies in computational estimation and that children’s strategy use depends on different parameters. Still, little is known about the underlying cognitive processes. In the present work, we addressed this issue by investigating (1) the influence of individual differences in children’s executive functions on their strategy use and (2) the influence of varying specific task and problem characteristics that are discussed to involve different cognitive processes.
In four studies, we asked third and fourth graders to solve computational estimation tasks by rounding the summands. Study 1 addressed the influence of working memory updating. The study found that efficient updating contributed to children’s strategy use and moderated relations with problem characteristics. A deliberate feature of Study 1 was to restrict participants’ strategy choice to the rounding-down and rounding-up strategies. Study 2 in turn investigated children’s strategy use when mixed-rounding was allowed. Results indicated that children did not consider unit digits of both operands jointly. Also, no influence of executive functions could be found. Consequently, in Study 3, children’s strategy selection when they could choose between three versus only two strategies was contrasted and the role of working memory updating was investigated. Indeed, children chose the best available strategy more often when three strategies were available. Importantly, relative strategy selection performance differed with children’s updating capacities.
Finally, Study 4 addressed another task variation that is important in everyday life and educational contexts. That is, presentation duration and modality were varied. Data showed that a permanent, written format was most beneficial for children’s strategy use and that children’s updating moderated presentation effects.
In sum, the results of the present work could shed some light onto cognitive processes in children’s strategy use in computational estimation. Specifically working memory updating
seems to contribute to third and fourth graders strategy use. Interpreting interactions with different task variations, updating most likely influences associative processes, long term memory consolidation and retrieval as well as encoding and calculation processes.
The growing number of infections with multi-resistant bacteria or the current COVID-19 pandemic put compounds with therapeutic properties into the public focus. Non-ribosomal peptides (NRPs) are natural products that are already marketed as antibiotics, cytotoxic agents or immunosuppressants. Their biological activities rely on the structural diversity including non-proteinogenic amino acids (AAs), heterocycles or modifications like methylation or acylation.
The biosynthesis of NRPs is carried out by non-ribosomal peptide synthetases (NRPSs). These multifunctional megaenzymes show a modular architecture like in an assembly-line. Each module is thereby responsible for the incorporation and modification of one AA and therefore contains different catalytic domains. The adenylation (A) domain recognizes and activates its specific substrate in an ATP-dependent manner which is transferred to a 4’-phosphopantetheine cofactor post-translationally attached to the thiolation (T) domain. Peptide bond formation between two T domain bound substrates catalysed by the condensation (C) domain transfers the growing peptide chain to the following module. Such a C-A-T module can be extended with optional domains to integrate structural diversity and a terminal thioesterase (TE) domain usually releases the peptide via hydrolysis or intramolecular attack of nucleophiles. Inspired by the modular architecture, NRPS engineering deals with the modification of NRPs in order to increase biological activities, circumvent bacterial resistances or create de novo peptides. This can be achieved by mutasynthesis or modification of the substrate binding pocket as well as single and multiple domain substitution. However, the few successful approaches led to impaired enzymes and did not establish a general applicable guideline. In the first publication as part of this work, the development of such a guideline comprising three rules is addressed. First, the A-T-C tridomain named exchange unit (XU) is seen as a catalytic unit instead of a module. When using them as building blocks, the C domain’s specificity for the AA of the following XU has to be considered as second rule. Third, a conserved WNATE motif within the C-A linker depicts the fusion point of the XUs. Upon heterologous expression of the cloned plasmids in E. coli and high performance liquid chromatography coupled mass spectrometry-based analysis of the extracts, the ambactin-producing NRPS from Xenorhabdus was reprogrammed with one and two XUs. This only leads to a moderate loss of production titre or an even higher one when the AA configuration was changed by introducing a dual condensation/epimerization (C/E) domain. The pentamodular GameXPeptide-producing NRPS was reconstructed using up to five XUs of four different NRPSs and even completely de novo synthetases were created. The second publication describes the exchange unit condensation domain (XUC) concept and relies on a fusion point between the two subdomains (N-terminal CDsub and C-terminal CAsub) of the C domain’s V-shaped pseudodimeric structure which generates A-T didomains with flanking CAsub and CDsub. These hybrid C domain-forming building blocks depict an improvement to the XU concept by avoiding the drawback of C domain specificity. This allows a more flexible NRPS engineering that can e.g. enable peptide library design. Furthermore, beside a combination of both concepts within one NRPS and a transfer to Bacillus NRPSs, the use of XUC with relaxed A domain specificity allowed further peptide modifications by introducing non-natural AAs. The third publication deals with aldehyde and alcohol-generating reductase (R) domains which depict an alternative for peptide release in NRPSs. A promoter exchange in X. indica identified a pyrazine-producing NRPS with a minimal architecture of an A, T and R domain and was therefore termed ATRed. R domains were additionally used in engineered NRPSs to produce pyrazinones and derivatives thereof by XU substitution although most constructs failed to show production. Beyond that, an R domain has been shown to replace a TE domain in wild type synthetases leading to slightly modified NRPs and the postulated biosynthesis was incidentally revised. Furthermore, an NRPS with terminal R domain was engineered to produce a free peptide aldehyde, which are known to be potent proteasome inhibitors. For the above mentioned ATReds, the presence of up to three coding regions was further identified in 20 different Xenorhabdus strains but only six of them were verified to produce pyrazines. All ATReds share variable sequence similarities among each other and were subsequently divided into three subtypes. One subtype is supposed to perform the pyrazine biosynthesis via a non-canonical catalytic triad.
Astrozyten erfüllen verschiedene Funktionen im Zentralnervensystem, welche sich in die Bereiche Entwicklung, Durchblutung, Metabolismus, Strukturerhalt und Gliotransmission unterteilen lassen. Astrozyten sind an der synaptischen Informationsverarbeitung beteiligt und wirken an zahlreichen höheren Hirnfunktionen mit. Durch Regulation der synaptischen Transmission und Plastizität sind Astrozyten am Lernverhalten und Erinnerungsvermögen, sowie an der Verhaltensmodulation und Verarbeitung emotionaler Reize involviert. Im Zuge dieser zahlreichen Funktionen können Astrozyten auf externe Stimuli mit der gezielten Freisetzung von Gliotransmittern reagieren.
In kultivierten Astrozyten konnte Keil143 das TGN, bestehend aus Zisternen und Vesikeln, darstellen und mit anti-Rab6 identifizieren. Rab6 mit seinen Subtypen A und B gehört der Superfamilie der monomeren Ras-GTPasen an, die den intrazellulären Membran- und Vesikelverkehr regulieren. Rab6 spielt in HeLa-Zellen beim Transport vesikulärer Organellen vom TGN zur Zellmembran eine wichtige Rolle. Assoziationsanalysen von Rab6A mit vesikulären Glutamattransportern, Serinracemase und Markern der regulierten Exozytose in kultivierten Astrozyten143 deuten darauf hin, dass dieses Rab6A-Organellsystem die ultrastrukturelle Grundlage für die Freisetzung von Gliotransmittern wie D-Serin und Glutamat bildet.
Zur Untersuchung, ob Rab6A tatsächlich ein System der Glia-Neuron-Kommunikation im Gehirn darstellt, war es zunächst unabdingbar das Vorkommen von Rab6A in situ zu untersuchen. Die durchgeführten immunzytochemischen Färbungen an Hirnschnitten der Maus zeigen das gleichmäßige und ubiquitäre Vorkommen von Rab6A in allen untersuchten Hirnregionen. Durch verblindet durchgeführte Kolokalisationsanalysen von Rab6A mit den etablierten astrozytären Markern Glutaminsynthetase (GS), Glial fibrillary acidic protein (GFAP), Aldh1L1 und Sox9 konnte eine Lokalisation von Rab6A in allen Astrozyten gezeigt werden. Weitere Analysen schließen die Lokalisation von Rab6A in Mikroglia (Iba1), NG2-Zellen (NG2) und Oligodendrozyten (CNPase) aus. Die Astrozyten unterscheiden sich in Größe und subzellulärem Verteilungsmuster der Rab6A+ Strukturen, wonach eine Kategorisierung in vier Typen vorgenommen wurde. Anhand der Einteilung kann vermutet werden, dass größere Rab6A+ TGN-Zisternen bis weit in die Zellperipherie transportiert werden und kleine Rab6A+ Vesikel erst dort ausknospen und der Exozytose zugeführt werden. Zur Frage der möglichen astrozytären Subpopulationen konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten Astrozyten GS+, Aldh1L1+, Sox9+ und Rab6A+ sind, jedoch nicht GFAP+.
Um die prinzipielle Übertragbarkeit der gewonnenen Befunde auf den Menschen zu überprüfen, wurde reseziertes Cortex-Gewebe von drei Patienten mit unterschiedlicher pathologischer Genese untersucht. Rab6A ist im massiven Ausmaß in humanen Astrozyten lokalisiert, was nahelegt, dass die zuvor an der Maus gewonnenen Ergebnisse auf den Menschen übertragbar sind.
Die mögliche funktionelle Bedeutung von astrozytärem Rab6A im Gehirn wurde an HFS-Schnitten untersucht. Die Untersuchung zeigt einen signifikanten Anstieg der Rab6A+ Intensität in der gesamten Molekularschicht der Fascia dentata der stimulierten im Vergleich zur unstimulierten Seite. Da die HFS ein etabliertes LTP-Modell darstellt, könnte es infolge dieser zu einer strukturellen, intrazellulären Veränderung der Astrozyten mit erhöhter Freisetzung von D-Serin oder Glutamat aus Rab6A+ Vesikeln kommen, was das Lernverhalten beeinflussen könnte. Die dargestellten Ergebnisse legen eine Auswirkung der HFS auf Rab6A nahe.
Zur Bestätigung der immunzytochemischen Untersuchungen wurde die mRNA-Expression von Rab6A in Astrozyten bereits publizierter Transkriptomanalysen untersucht. Die in den Publikationen verwendeten Genom-Chips treffen allenfalls indirekt eine Aussage zu Rab6A, da Rab6 allgemein und nur Rab6B spezifisch untersucht wurde, jedoch keine spezifische Rab6A Sonde erwähnt wird.
Zusammenfassend kann Rab6A als spezifisches und selektiv in Astrozyten vorkommendes Protein dargestellt und als neuer astrozytärer Marker etabliert werden, der auch Astrozyten des humanen Gewebes markiert. Durch die gewonnenen Befunde kann in nachfolgenden Studien die mögliche Bedeutung von Rab6A in neuropathologischen und neurophysiologischen Prozessen untersucht werden.
Understanding the hadron spectrum is one of the primary goals of non-perturbative QCD. Many predictions have experimentally been confirmed, others still remain under experimental investigation. Of particular interest is how gluonic excitations give rise to states with constituent glue. One class of such states are hybrid mesons that are predicted by theoretical models and Lattice QCD calculations. Searching for and understanding the nature of these states is a primary physics goal of the GlueX experiment at the CEBAF accelerator at Jefferson Lab. A search for a JPC = 1−− hybrid meson candidate, the Y(2175), in φ(1020)π+π+ and φ(1020)f0(980) channels in photoproduction on a proton target has been conducted. A first measurement of non-resonant φ(1020)π+π+ and φ(1020)f0(980) total cross sections in photoproduction has been performed. An upper limit on the resonance production cross section for the Y (2175) → φ(1020)π+π+ and Y (2175) → φ(1020)f0(980) channels are estimated. Since the analysis essentially depends on the quality of the charged kaon identification, also an optimization of particle identification through an improvement of the energy loss estimation in the central drift chamber by a truncated mean method has been investigated.
Im hymnologischen Bereich sind die Entstehung und jahrhundertelange Tradierung deutscher evangelischer Kirchenlieder von großer Bedeutung. Sie übten in zahlreichen Ländern großen Einfluss aus. Im 19. Jahrhundert beispielsweise wurden sie in das Englische übersetzt und in Ländern dieses Sprachraums gesungen. Bei der Missionierung Koreas wurden westliche – darunter auch einige deutsche – Kirchenlieder eingeführt. Es fällt aber auf, dass im Übertragungsprozess inhaltliche und sprachliche Unterschiede zwischen deutschen und koreanischen Fassungungen auftreten konnten. Auf dieses Geschehen hat die Verfasserin der vorliegenden Studie bei ihrer Tätigkeit als Kirchenmusikerin in Deutschland das Augenmerk gerichtet und es zum Ausgangspunkt ihrer Dissertation gewählt.
Ende des 19. Jahrhunderts wurde Korea von anderen Ländern gezwungen, sich zu öffnen. Daraufhin kamen viele Ausländer – unter ihnen auch christliche Missionare – ins Land, die je eine eigene Gesangbuchliteratur mitbrachten. Insbesondere die amerikanische Mission fasste Fuß. Das erste koreanische Gesangbuch Chanmiga wurde im Jahr 1892 veröffentlicht; ihm folgten weitere Ausgaben. In der ersten Hälfte des 20. Jahrhunderts waren amerikanische Missionare Mitherausgeber dieser Gesangbücher. Folgerichtig dominierte westliches Liedgut.
Die vorliegende Arbeit untersucht jene deutschen Kirchenlieder, die vor 1945 in das Koreanische Gesangbuch aufgenommen wurden. Sie fragt danach, auf welche Weise sie übernommen wurden und sich Änderungen bei ihrer Übermittlung vollzogen haben. Methodisch werden Quellen miteinander verglichen, die zum Zeitpunkt der Aufnahme relevant waren. Dank der älteren deutschen, englischen und amerikanischen Gesangbücher, die online und in deutschen Bibliotheken (Online-Archive) freigeschaltet sowie im Gesangbucharchiv Mainz vorhanden sind, ist diese umfangreiche Forschung möglich geworden.
Die Bedeutung des Singens ist für die koreanische Christenheit während der Annexion durch Japan (1910-1945) groß gewesen. Sie sang als Unabhängigkeitsbewegung Kirchenlieder, unter denen besonders Martin Luthers Choral Ein feste Burg ist unser Gott unverzichtbar wurde. Aussagen zeitgenössischer Christen belegen seine damalige Beliebtheit. Ein Grund dafür liegt darin, dass in ihm zahlreiche Analogien zur Situation der unterdrückten Koreaner erkennbar waren. Das Lied vermittelte ihnen Trost, Mut und einen festen Gottesglauben. Seine besondere Bedeutung erkannte auch das japanische Regime und verbot es während der gesamten Besatzungszeit.
Auch nach 1945 wurden deutsche Kirchenlieder in koreanische Gesangbücher aufgenommen. Ihre Anzahl sank jedoch gegen Ende des 20. Jahrhunderts; das aktuelle Gesangbuch, 21st Century Hymnal, von 2006 enthält nur noch 21. Es ist schließlich festzuhalten, dass Ein feste Burg nicht nur im Gottesdienst, sondern auch im Theater zu hören ist – paradigmatisch in der Oper Son Yang Won, eine Komposition des Kirchenmusikers Chae Hoon Park (*1922) aus dem Jahr 2011. Die Oper trägt den Namen des Märtyrers Yang Won Son (1902-1950) und thematisiert geschichtliche Ereignisse von nationaler Bedeutung: die Problematik der Anarchie, beginnend mit der Landesteilung durch die Sowjetunion und USA in zwei Besatzungszonen 1945 sowie die Yeosu-Sucheon-Rebellion von 1948, organisiert von wenigen kommunistischen Soldaten gegen die südkoreanische Regierung. Die vorliegende Studie untersucht, welche Bedeutung das Lied Ein feste Burg in der Oper einnimmt und wie Chae Hoon Park es bearbeitet hat.
Die Dissertation beschränkt ihre hymnologische Forschung nicht auf die Übernahme und Rezeption deutscher Kirchenlieder in Korea; sie blickt umgekehrt auch auf die Rezeption koreanischer Gesänge in Deutschland. Durch Begegnungen von deutschen mit koreanischen Christen entstanden bzw. entstehen neue Gesänge und Kompositionen und werden durch ökumenische Gottesdienste und Veranstaltungen verbreitet. Die ökumenische Bewegung bewirkte nach dem Zweiten Weltkrieg Änderungen im Liedrepertoire. Gesänge, nicht nur aus England, Europa und Nordamerika, sondern auch aus Afrika, Asien und Südamerika, wurden überall aufgenommen und gesungen. Die aktuellen deutschen und koreanischen Gesangbuchinhalte belegen dies.
Die Ausführungen der Studie halten fest, dass religiöse Bewegungen – Missions- und ökumenische Bewegung – bei der Übermittlung althergebrachter und der Entstehung neuer Lieder eine große Rolle spielten. Dies ist anhand der Entwicklung des Koreanischen Gesangbuchs erkennbar. Früher wurden westliche Kirchenlieder von amerikanischen Missionaren nach Korea transferiert; die einheimischen Christen vernachlässigten wiederum ihre eigene Kultur und Musik. Deshalb dominierte für geraume Zeit westlich geprägtes Liedgut. Die Koreanisierung der Kirchenlieder bzw. Gesangbücher wird nun seit einigen Jahrzehnten forciert. Die wachsende kirchenmusikalische Qualifikation koreanischer Musiker, das zunehmend selbstbewusst werdende einheimische Christentum und die ökumenische Öffnung der Kirchen leisten hier wertvolle Beiträge.
Two main types of methods are used in gene therapy: integrating vectors and nuclease-based genome engineering. Nucleases are site-specific and are efficient for knock-outs, but inefficient at inserting long DNA sequences. Integrating vectors perform this task with high efficiency, but their insertion occurs at random genomic positions. This can result in transformation of target cells, which leads to severe adverse events in a gene therapy context. Thus, it is of great interest to develop novel genome engineering tools that combine the advantages of both technologies. The main focus of this thesis is on generating such a targetable integrating vector.
The integrating vector used in this project is the Sleeping Beauty (SB) transposon, a DNA transposon characterized by high activity across a wide range of cells. The SB transposase was combined with an RNA-guided Cas9 nuclease domain. This nuclease component was meant to direct transposase integration to specific targets defined by RNAs. The SB transposase was fused to cleavage-inactivated Cas9 (dCas9) to tether it to the target sites. In addition, adapter proteins consisting of dCas9 and domains non-covalently interacting with SB transposase or the SB transposon were generated. All constituent domains of these fusion proteins were tested in enzymatic assays and almost all enzymatic activities could be verified.
Combining the fusion protein dCas9-SB100X with a gRNA binding a sequence from the AluY repetitive element resulted in a weak, but statistically significant enrichment around sites bound by the gRNA. This enrichment was ca. 2-fold and occurred within a 300 bp window downstream of target sites, or within the AluY element.
Targeting with adapter proteins and targeting of other targets (L1 elements or single-copy targets) did not result in statistically significant effects. Single-copy targets tested included the HPRT gene and three specifically selected GSH targets that were known to be receptive to SB insertions. The combination with a more sequence-specific transposase mutant also failed to increase specificity to a level allowing targeting of single-copy loci. Genome-wide analysis of insertions however demonstrated, that dCas9-SB100X has a different insertion profile than SB100X, regardless of the gRNA used.
As low efficiency of retargeting is likely a consequence of the high background activity of the SB100X transposase in the fusion constructs, a SB mutant with reduced DNA affinity, SB(C42), was generated. For this mutant, transposition activity was partly dependent on a dCas9 domain being supplied with a multi-copy target gRNA, specifically a 2-fold increase in the presence of a AluY-directed gRNA. Whether using this mutant results in improved targeting remains to be determined.
In a side project, an attempt was made to direct SB insertions to ribosomal DNA by fusing the transposase to a nucleolar protein. This fusion transposase partially localized to nucleoli and insertions catalyzed by this transposase were found to be enriched in nucleolus organizer regions (NORs) and nucleolus-associated domains (NADs).
The aim of a second side project was increasing the ratio between homology-directed repair (HDR) and non-homologous end-joining (NHEJ) at Cas9-mediated double-strand breaks (DSBs). To achieve this, Cas9 was fused to DNA-interacting domains and corresponding binding sequences were fused to the homology donors. While an increased HDR/NHEJ ration could be observed for the fusion proteins, it was not dependent on the presence on the binding sequences in the donor molecules.
A Large Ion Collider Experiment (ALICE) is one of the four large experiments at the Large Hadron Collider (LHC) at the European Organization for Particle Physics (CERN). ALICE focuses on the physics of the strong interaction and in particular on the Quark-Gluon Plasma. This is a state of matter in which quarks are de-confined. It is believed that it existed in the earliest moments of the evolution of the universe. The ALICE detector studies the products of the collisions between heavy-nuclei, between protons, and between protons and heavy-nuclei. The sub-detector closest to the interaction point is the Inner Tracking System (ITS), which is used to measure the momentum and trajectory of the particles generated by the collisions and allows reconstructing primary and secondary interaction vertices. The ITS needs to have an accurate spatial resolution, together with a low material budget to limit the effect of multiple scattering on low-energetic particles to precisely reconstruct their trajectory. During the Long Shutdown 2 (2019-2020) of the LHC, the current ITS will be replaced by a completely redesigned sub-detector, which will improve readout rate and particle tracking performance especially at low-momentum.
The ALice PIxel DEtector (ALPIDE) chip was designed to meet the requirements of the upgraded ITS in terms of resolution, material budget, radiation hardness, and readout rate. The ALPIDE chip is a Monolithic Active Pixel Sensor (MAPS) realised in Complementary Metal-Oxide Semiconductor (CMOS) technology. Sensing element, analogue front-end, and its digital readout are integrated into the same silicon die. The readout architecture of the new ITS foresees that data is transmitted via a high-speed serial link directly from the ALPIDE to the off-detector electronics. The data is transmitted off-chip by a so-called Data Transmission Unit (DTU) which needs to be tolerant to Single-Event Effects induced by radiation, in order to guarantee reliable operation. The ALPIDE chip will operate in a radiation field with a High-Energy Hadron peak flux of 7.7·10^5 cm^-2s^-1.
The data are sent by the ALPIDE on copper cables to the readout system, which aggregates them and re-transmits them via optical fibres to the counting room. The position where the readout electronics will be placed is constrained by the maximum transmission distance reasonably achievable by the ALPIDE Data Transmission Unit and mechanical constraints of the ALICE experiment. The radiation field at that location is not negligible for its effects on electronics: the high-energy hadrons flux can reach 10^3 cm^-2s^-1. Static RAM (SRAM)-based Field Programmable Gate Arrays (FPGAs) are favoured over Application Specific Integrated Circuits (ASICs) or Radiation Hard by Design (RHBD) commercial devices because of cost effectiveness. Moreover, SRAM-based FPGAs are re-configurable and provide the data throughput required by the ITS. The main issue with SRAM-based FPGAs, for the intended application, is the susceptibility of their Configuration RAM (CRAM) to Single-Event Upsets: the number of CRAM bits is indeed much higher than the logic they configure. Total Ionizing Dose (TID) at the readout designed position is indeed still acceptable for Component Off The Shelf (COTS), provided that proper verification is carried out.
This dissertation focuses on two parts of the design of the readout system: the Data Transmission Unit of the ALPIDE chip and the design of fundamental modules for the SRAM-based FPGA of the readout electronics. In the first part, a module of the Data Transmission Unit is designed, optimising the trade-off between power consumption, radiation tolerance, and jitter performance. The design was tested and thoroughly characterised, including tests while under irradiation with a 30 MeV protons. Furthermore the Data Transmission Unit performance was validated after the integration into the first prototypes of ITS modules. In the second part, the problem of developing a radiation-tolerant SRAM-based FPGA design is investigated and a solution is provided. First, a general methodology for designing radiation-tolerant Finite State Machines in SRAM-based FPGAs is analysed, implemented, and verified. Later, the radiation-tolerant FPGA design for the ITS readout is described together with the radiation effects mitigation techniques that were selectively applied to the different modules. The design was tested with multiple irradiation tests and the results are stated below.
Proteine sind die Maschinen der Zellen. Um die Funktionalität von zahlreichen zellulären Prozessen zu gewährleisten, müssen Kommunikationssignale innerhalb von Proteinen weitergeleitet werden. Die Weiterleitung einer Störung an einem Ort im Protein zu einer entfernten Stelle, an welcher sie strukturelle und/oder dynamische Änderungen auslöst, wird Allosterie genannt. Zunächst wurde Allosterie hauptsächlich mit großräumigen Konformationsänderungen in Verbindung gebracht, aber später entwickelte sich ein dynamischerer Blickwinkel auf Allosterie in Abwesenheit dieser großräumigen Konformationsänderungen. Die Idee eines allosterischen Pfades bestehend aus konservierten und energetisch gekoppelten Aminosäuren, welche die Signalweiterleitung zwischen entfernten Stellen im Protein vermitteln, entstand. Diese allosterischen Pfade wurden durch zahlreiche theoretische Studien in Zusammenhang mit Pfaden effizienten anisotropen Energieflusses gebracht. Der Energiefluss entlang dieser Netzwerke verknüpft allosterische Signalübertragung mit Schwingungsenergietransfer (VET - vibrational energy transfer). Die Großzahl der Forschungsarbeiten über dynamische Allosterie basiert auf theoretischen Methoden, weil nur wenige geeignete experimentelle Verfahren existieren. Um diesen essentiellen biologischen Prozess der Informationsübertragung besser verstehen zu können, ist die Entwicklung neuer und leistungsstarker experimenteller Instrumente und Techniken daher dringend erforderlich. Die vorliegende Dissertation setzt sich dies zum Ziel.
VET in Proteinen ist aufgrund der Proteingeometrie inhärent anisotrop. Alle globulären Proteine besitzen Kanäle effizienten Energieflusses, von denen vermutet wird, dass sie wichtig für Proteinfunktionen, wie die schnelle Ableitung von überschüssiger Wärme, Ligandenbindung und allosterische Signalweiterleitung, sind. VET kann mit zeitaufgelöster Infrarot (IR) Spektroskopie untersucht werden, bei welcher ein Femtosekunden Anregepuls eines Lasers Schwingungsenergie in ein molekulares System an einer bestimmten Stelle injiziert und ein, nach einem veränderbarem Zeitintervall folgender, IR Abfragepuls die Ausbreitung dieser Schwingungsenergie detektiert. Ein protein-kompatibler und universell einsetzbarer Chromophor, der die Energie eines sichtbaren Photons in Schwingungsenergie konvertiert, wird als Heizelement benötigt um langreichweitige VET Pfade in Proteinen kartieren zu können. Der Azulen (Azu) Chromophor eignet sich dafür, weil er nach Photoanregung des ersten elektronischen Zustandes durch ultraschnelle interne Konversion fast die gesamte injizierte Energie innerhalb von einer Picosekunde in Schwingungsenergie umwandelt. Eingebettet in die nicht-kanonische Aminosäure (ncAA - non-canonical amino acid) ß-(1-Azulenyl)-L-Alanine (AzAla), kann der Azu Rest in Proteine eingebaut werden. Die Ankunft der injizierten Schwingungsenergie an einer bestimmten Stelle im Protein kann mithilfe eines IR Sensors detektiert werden. Die Kombination aus Azu als VET Heizelement und Azidohomoalanine (Aha) als VET Sensor mit transienter IR (TRIR) Spektroskopie wurde schon erfolgreich an kleinen Peptiden in der Dissertation von H. M. Müller-Werkmeister getestet, die der vorliegenden Dissertation in den Laboren der Bredenbeck Gruppe vorausging.
Die Schwingungsfrequenz chemischer Bindungen ist hochempfindlich auf selbst kleine Änderungen der Konformation und Dynamik in der unmittelbaren Umgebung und kann mit IR Spektroskopie gemessen werden, z. B. mit Fourier Transform IR (FTIR) Spektroskopie. IR Spektroskopie bietet eine außergewöhnlich gute Zeitauflösung, die es ermöglicht, dynamische Prozesse in Molekülen auf einer Zeitskala von wenigen Picosekunden zu beobachten, wie z. B. die ultraschnelle Weiterleitung von Schwingungsenergie. Mit zweidimensionaler (2D)-IR Spektroskopie können die Relaxation von schwingungsangeregten Zuständen und strukturelle Fluktuationen um die schwingende Bindung untersucht werden. Allerdings geht die herausragende Zeitauflösung mit limitierter spektraler Auflösung einher. In größeren Molekülen mit zahlreichen Bindungen überlagern sich die Schwingungsbanden und die Ortsauflösung geht verloren. Um diese Limitierung zu überwinden, können IR Marker benutzt werden, chemische Gruppen, die in einer spektral durchsichtigen Region des Protein/Wasser Spektrums (1800 bis 2500 cm-1) absorbieren. Als ncAA können sie kotranslational in Proteine an einer gewünschten Stelle eingebaut werden und so ortsspezifische Informationen aus dem Proteininneren liefern. Aufgrund ihrer geringen Größe, eines relativ großen Extinktionskoeffizientens (350-400 M-1cm-1) und einer hohen Empfindlichkeit auf Änderungen in der lokalen Umgebung sind organische Azide (N3) wie zum Beispiel Aha besonders geeignete IR Marker. Aha kann als Methionin Analogon ins Protein eingebaut werden.
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Photorhabdus and Xenorhabdus bacteria live in a highly specific symbiosis with nematodes that belong to the genus of Heterorhabditis and Steinernema, respectively. These cruiser type nematodes actively search for soil-dwelling insects and infect them via natural openings. Inside of the insect, the bacteria are released into the hemocoel where they start producing an array of secondary metabolites to bypass the insect immune system and kill the prey within 48 hours. Many of those natural products possess bioactivities against other bacteria, fungi, protozoa or insects, which makes them interesting candidates for pharmaceutical applications. Even though advanced molecular biological methods in combination with bioinformatics tools can now be used to predict biosynthetic gene clusters (BGCs) and their products, there are still many BGCs with unknown products. Even for the plethora of natural products that were successfully identified in the last couple of years, the exact ecological function often remains elusive, as laboratory conditions can vary considerably from the natural environment of the bacteria. Knowledge about the natural conditions that stimulate, or repress production of certain natural products and their underlying regulatory mechanisms yield new approaches for natural product research and enables possibilities for selective manipulations of the regulatory cascades.
The overarching goal of this work was to examine the regulatory networks in Photorhabdus and Xenorhabdus strains. The first part of this work focused on the Hfq-dependent regulation of specialized metabolite production. In those genera, the RNA chaperone, Hfq, represses expression of hexA, which encodes for a global transcriptional regulator that acts as the master repressor for SM production. Multiple global approaches were used to identify the sRNA ArcZ, which targets a specific region in the 5’-untranslated region of the hexA mRNA and ultimately guides Hfq in order to repress its expression. It was shown that a deletion of arcZ led to a drastic reduction of SM production in Photorhabdus and Xenorhabdus, consistent with the phenotype of their respective hfq deletion mutants. Transcriptomic profiling revealed far-reaching effects on the transcriptome, with up to 735 coding sequences significantly affected in the arcZ deletion strain. Finally, it was shown that the resulting chemical background, devoid of SMs, in combination with targeted promotor exchange can be used to exclusively overproduce a desired natural product, representing an alternative route of genetic manipulation.
The second part of this work focused on the influence and identification of insect related compounds that affect SM production in P. laumondii, X. szentirmaii and X. nematophila. Insect homogenate was generated from G. mellonella larvae, a model host for these bacteria. Supplementation of the cultivation medium with homogenate induced considerable shifts in the SM profiles of those bacteria. A global effect on the transcriptional output was determined by transcriptomic profiling. The core response to the simulation of an insect environment consisted of ten CDS, eight of which are involved in the degradation of fatty acids or the import of maltose and maltodextrin into the cells. Two abundant components in the insect homogenate, trehalose and putrescin, were added to the cultivation medium of those strains and subsequent HPLC-MS analysis revealed a direct correlation of their concentration in the medium and the production titres of certain SMs. These results indicated that the bacteria sense the insect environment via different insect specific components in order to initiate a metabolic adjustment, which is probably required for adaptation to the insect host.
The last part of this work examined the influence of other, so far not directly related genes on SM production, based on the isolation of P. laumondii transposon-insertion mutants with clear phenotypic alterations. Re-sequencing and SM profiling of the mutant strains revealed that a transposon-insertion in the gene encoding for a putative DNA-adenine methyltransferase affected SM production. The phenotype was confirmed by deleting this gene. Based on Single-Molecule Real-Time sequencing, the complete methylome of the WT, deletion- and complementation mutant were analysed (experimental work performed by Sacha J. Pidot, Melbourne, Australia). No obvious alterations were detected in the methylation patterns of the strains, indicating that the dam gene product does not methylate the adenine in GATC-motifs, as it was described in literature for E. coli. This data raises the question what the function of the putative DNA-adenine methyltransferase is in P. laumondii and how it can influence the secondary metabolism. Even though there is currently no clear evidence, the potential role of epigenetic gene regulation mechanisms should be considered in further work.
Die Aufdeckung krankheitsbedingter Unterschiede und die Identifizierung neuer Biomarker sind essenziell für Diagnose und Behandlung verschiedener Erkrankungen. Unterschiede zwischen Erkrankungen können u.a. durch Analyse des Lipidprofils aufgedeckt werden, da dieses eng mit dem Phänotyp verknüpft ist. Ein unvoreingenommenes Screening gewährt einen umfassenderen Einblick in den metabolischen Zustand als eine gezielte Untersuchung weniger Analyten und kann neue Hypothesen generieren. Deshalb wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Screening-Methode zur untargeted Untersuchung des Lipidoms in biologischen Proben entwickelt. Durch die Kombination aus Umkehrphasenchromatographie und hochauflösender Massenspektrometrie mit datenabhängiger Aufnahme von MS/MS-Spektren konnten in Humanplasma 440 Lipide aus mehr als 15 Lipidklassen identifiziert werden. Die mehrstufige Identifizierung der Analyten, basierend auf der exakten Masse ±5 ppm, der Isotopenverteilung, der MS/MS-Fragmentierungsmuster in beiden Ionisationsmodi sowie der chromatographischen Auftrennung von Isomeren und Isobaren, erfolgte mit hoher Selektivität. Mit der vorgestellten Methode können sowohl Lipidklassen als auch einzelne Lipide relativ zu den internen Standards quantifiziert werden.
Der Probendurchsatz wurde erhöht, um den Einsatz der Methode im Rahmen größerer klinischer Studien zu ermöglichen und vorhandene Ressourcen effizient einzusetzen. Dabei wurden die Inkubationszeiten während der Flüssig-Flüssig-Extraktion mit MTBE:Methanol deutlich reduziert und die Handhabung vereinfacht bei gleichbleibend hoher Wiederfindung. Der hohe Probendurchsatz wird weiter unterstützt durch die kurze chromatographische Laufzeit von 17 min pro Ionisationsmodus. Die Auswertung der Ergebnisse ist der heikelste und zeitintensivste Schritt bei der Entwicklung und Anwendung von Screening-Methoden, deshalb wurde der Arbeitsablauf zur univariaten Analyse durch Entwicklung von R Skripten vereinfacht und beschleunigt.
Die Qualität und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse sind essenziell. Aus diesem Grund wurde die Qualität der entwickelten Methode, angelehnt an den strikten Vorgaben der FDA und EMA zur Validierung von quantitativen Methoden, sichergestellt, obwohl eine Methodenüberprüfung im Bereich von untargeted Methoden nicht verbreitet ist. Die Reproduzierbarkeit der relativen Lipidkonzentrationen konnte z.B. durch die Messung von Kontrollplasmaproben über einen Zeitraum von 10 Monaten gezeigt werden. Außerdem wurde die Linearität der Verdünnung von Plasmaproben bestätigt und eine Verschleppung in darauffolgende Proben ausgeschlossen. Die Stabilität der Proben muss in jeder Messphase inklusive der Präanalytik durch geeignete Untersuchungen und Maßnahmen sichergestellt werden. Anhand einer Studie zur präanalytischen Stabilität humaner Blutproben konnte ein Protokoll zur Probennahme und -vorbereitung für weitere klinische Studien erarbeitet werden. Die Stabilität des Lipidoms in Vollblut und Plasma konnte durch den Einsatz von Natriumfluorid/Citrat als Antikoagulans verbessert werden. Auch die Stabilität der Proben während der Lipidextraktion und Messung konnte gezeigt werden. Es wurden 16 verschiedene Probenarten analysiert, darunter Plasmaproben, verschiedene Mausgewebe und Zellpellets.
Mit der entwickelten Methode wurden die Unterschiede im Lipidprofil im Plasma und Gewebe von Mäusen mit einer akuten Entzündung durch LPS bzw. Zymosan-Injektion aufgedeckt. Dabei wurden die Ether-Phosphatidylcholine als potenzielle Entzündungsmarker identifiziert. Die entwickelte Methode wurde außerdem erfolgreich im Rahmen anderer Arbeiten für die Untersuchung verschiedener Erkrankungen angewendet.
In der vorliegenden Arbeit wird demnach eine schnelle, reproduzierbare und vor allem selektive LC-MS-Screening-Methode vorgestellt, die Veränderungen des Lipidstoffwechsels aufdecken und potenzielle Biomarker identifizieren kann.
Die Arbeit gibt einen Einblick in die Rolle, die Wochenschau und Wahlwerbung während der 1920er Jahre im Zuge der politischen Propagandaarbeit in der ersten deutschen Demokratie einnahmen. Zu diesem Zweck werden nicht nur politische Filme analysiert, sondern es wird auch ein Blick auf die Verbindungen der Weimarer Politik in die Filmbranche und die vorherrschende Zensurpraxis geworfen.
Der Plexus tympanicus ist ein komplex aufgebautes Nervengeflecht in der Mukosa des Mittelohrs. Aus anatomischen Studien ist bekannt, dass zuführende und wegführende Verbindungen unterschiedlichen Hirnnerven und sympathischen Bahnen angehören. Insbesondere werden parasympathische und sympathische Innervationssysteme beschrieben und damit stellt der Plexus tympanicus einen Plexus des vegetativen Nervensystems dar.
Bisher fehlen detaillierte Analysen über die Chemoarchitektur dieses Plexus. In der vorliegenden Studie soll das Vorhandensein unterschiedlicher Neurotransmitter und -peptide untersucht werden, um Vorstellungen über die Funktion dieses komplexen Geflechts zu entwickeln.
Es wurden immuncytochemische Färbungen an sechs Parallelserien von Kryostatschnitten durchgeführt. Dabei wurden Primärantikörper benutzt, die gegen Cholinacetyltransferase (ChAT), Dopamin-β-Hydroxylase (DBH), Substanz P (SP), Vasoaktives intestinales Peptid (VIP) und Neuropeptid Y (NPY) gerichtet waren. Dadurch konnten sympathische Nervenfasern durch den Nachweis von DBH als Leitenzym für die Noradrenalinsynthese analysiert werden; parasympathische Strukturen konnten durch Anti-ChAT-AK, das Leitenzym für die Acetylcholinsynthese, differenziert werden.
Alle genannten Neurotransmitter und -peptide konnten in den Mittelohrschnitten nachgewiesen werden. Dabei wurden sie in folgenden Lokalisationen gefunden: VIP wurde vor allem in perikapillären Boutons und Gefäßwänden im gesamten Ohrbereich sowie basal im Drüsenbereich des Meatus acusticus externus nachgewiesen. In der Mittelohrschleimhaut war VIP weit verbreitet und gerade im Bereich des Promotoriums waren einzelne Zellen intensiv angefärbt, die Zeichen sekretorischer Aktivität trugen. SP wurde vor allem in netzartigen um Gefäße gelagerten Fasern und in beaded Nervenfasern in der Mittelohrschleimhaut gefunden. Auch im Bereich der Drüsen, vor allem an Talgdrüsen des äußeren Gehörgangs, wurde SP nachgewiesen. NPY-IR zeigte sich in Geflechten um große Gefäße, an motorischen Endplatten der benachbarten Muskulatur, in der Mittelohrschleimhaut, in Nervenstämmen, Ganglien des Mittelohrbereichs und weniger dicht an Drüsen. ChAT-ir Strukturen sind direkt auf dem Knochen aufliegend in der Mittelohrschleimhaut, gefäßbegleitend an motorischen Endplatten und basal an Drüsenzellen vorhanden. ChAT-ir Nervenzellperikaryen wurden in großer Zahl in Ganglien gefunden, außerdem waren die Nerven allgemein leicht positiv. DBH-ir Strukturen wurden zwischen den Drüsen, in den Gefäßwänden der Arterien im Mittelohrbereich und in Nervenstämmen nachgewiesen. Einige DBH-ir Nervenzellperikaryen befanden sich in den Ganglien innerhalb des Mittelohrbereichs und der zuführenden Hirnnerven. Auch in der Mittelohrschleimhaut wurden Perikaryen, teilweise ganglienartig organisiert, gefunden. In verschiedenen Strukturen im Innenohrbereich konnten alle Neurotransmitter und -peptide in unterschiedlich starker Tingierung nachgewiesen werden.
Anhand des Verteilungsmuster lassen sich Kolokalisationen der Neuropeptide mit noradrenergen und cholinergen Neuronen vermuten, die bereits in anderen Studien für verschiedene Komponenten des vegetativen Nervensystems beschrieben wurden. Anhand der vorliegenden Analysen wurden Lokalisationsübereinstimmungen von ChAT und VIP, ChAT und SP und DBH und NPY gefunden.
Diese Studie soll als Grundlage für weitere Untersuchungen dienen. Insbesondere für das Verständnis von Funktionen und Pathologien des Nervengeflechts bedarf es weiterer Forschung. Die vorliegende Arbeit weist eindeutig nach, dass der Plexus tympanicus ein integratives System darstellt, das im Gegensatz zu früheren Vorstellungen einer reinen Durchgangsorganisation alle Voraussetzungen für ein Kontrollsystem erfüllt.
In optogenetischen Anwendungen, welche die Manipulation von zellulären Aktivitäten durch Licht ermöglichen, werden die Eigenschaften von mikrobiellen Rhodopsinen, einer Familie natürlich vorkommender lichtgesteuerter Proteine, ausgenutzt.
In der vorliegenden Arbeit wurden die einwärts transportierende Protonenpumpe NsXeR, sowie die auswärts Natriumionenpumpe KR2 untersucht. Des Weiteren wurden Tandem Proteine betrachtet, die mikrobielle Rhodopsine kombinieren mit dem Chemokinrezeptor CXCR4, der durch SDF1 aktiviert und anschließend in Endosomen internalisiert wird.
Für die Untersuchung des Mechanismus, der die Vektorialität in NsXeR bestimmt, wurde eine umfassende elektrophysiologische Studie durchgeführt. In Patch Clamp Messungen an NsXeR exprimierenden NG108-15 Zellen wurden bei kontinuierlicher 561 nm Beleuchtung aktive Einwärtsströme entgegen eines elektrochemischen Gradienten gemessen. Ein Einfluss des intrazellulären pHs auf die steady-state Ströme und deren Abfallkinetik konnte nicht festgestellt werden. Der Vergleich der exponentiellen Abfallrate k2 mit den Übergängen im NsXeR Photozyklus, lässt den Schluss zu, dass der ratenlimitierende Schritt der MII Zerfall ist.
Die elektrogenen Schritte im NsXeR Photozyklus wurden mit elektrischen Messungen an der black lipid membrane (BLM) an NsXeR Proteoliposomen bestimmt. Die Belichtung mit 20 ns Lichtpulsen bei 556 nm rufen Spannungssignale hervor, die exponentiell gefittet wurden, wobei drei elektrogene Schritte identifiziert werden konnten. Bei pH 7.4 betrugen die ermittelten Zeitkonstanten etwa 220 µs, 1 ms und 15 ms, denen 42%, 10% und 48% an der Gesamtladungsverschiebung zugeordnet wurden. Die elektrogenen Schritte konnten den Übergängen im Photozyklus zugeordnet werden, wobei der erste Schritt mit t1 dem MI Aufbau (Deprotonierung Schiff’sche Base, Protonenabgabe zur intrazellulären Seite) zugeschrieben wurde. t2 wurde dem MI→MII Übergang (Switch, Zugänglichkeitsänderung vom Intra- zum Extrazellulären) zugeordnet und t3 korreliert mit dem MII Zerfall (Reprotonierung Schiff’sche Base, Protonenaufnahme von der extrazellulären Seite).
Die Kinetik und der Ladungstransportanteil des zweiten elektrogenen Schritts haben keine starke pH Abhängigkeit, was sich dadurch erklären lässt, dass t2 durch eine Konformationsänderung bestimmt wird. t1 und t3 werden bei höheren pH Werten beschleunigt, was sich bei t1 mit einer erleichterten intrazellulären Protonenabgabe erklären lässt. Für t3 wurde eine Reprotonierung durch eine Donor Gruppe Asp76 vorgeschlagen. Die pH-sensitive Änderung der relativen Ladungstransferanteile des ersten und dritten elektrogenen Schrittes (∆ΨI und ∆ΨIII) wurden durch eine mögliche Verzögerung der frühen Protonenabgabe bei niedrigen pH Werten erklärt.
Der mutmaßliche Protonenakzeptor Asp220 wurde gegen Asn und Glu ausgetauscht und in Patch Clamp sowie UV-Vis Spektroskopie Messungen untersucht. Für D220N wurden keine Pumpströme und kein Einfluss auf die maximale Absorptionswellenlänge λmax festgestellt. D220E dagegen führte zu einer Erniedrigung des pKa-Werts der Schiff’schen Base und zu einer Verminderung der Iss-Abfallsrate k2 in Patch Clamp Dauerbelichtungsmessungen (D220E k2 = 27.1 ± 1.8 Hz, Wildtyp k2 = 83.1 ± 2.6 Hz). Daraus konnte geschlossen werden, dass Asp220 wesentlich für den Protonentransport ist und nicht als Gegenion für die protonierte Schiff’sche Base dient.
In Patch Clamp Experimenten bei 561 nm Dauerbelichtung und zusätzlicher gepulster Belichtung bei 355 nm wurde der Blaulichteffekt an NsXeR untersucht, bei dem Proteine im M Intermediat ein Photon absorbieren und unter Reprotonierung der Schiff’schen Base in den Grundzustand zurückkehren.
Für NsXeR konnte eine Potentialabhängigkeit für die Richtung der transienten Ströme, die durch die
355 nm Belichtung hervorgerufen wurden, festgestellt werden. Beim NsXeR Blaulichteffekt scheint eine
Reprotonierung der Schiff’schen Base von beiden Seiten möglich zu sein, was auf die unterschiedlichen Zugänglichkeiten in den beiden M Zuständen MI und MII zurückgeführt wurde. Es wurde ein Modell vorgeschlagen, welches auf einem potentialabhängigen Gleichgewicht zwischen MI und MII basiert.
In Patch Clamp Messungen an KR2 exprimierenden NG108-15 Zellen wurden die Pumpströme untersucht, die durch den auswärts Transport von Na+ und H+ hervorgerufen wurden. Die Na+-Konzentrationen der intra- und extrazellulären Lösungen wurden symmetrisch variiert und die steady-state Ströme Iss bei 532 nm Dauerbelichtung betrachtet. Mit steigender Na+-Konzentration zeigte sich ein Übergang von einer linearen Potentialabhängigkeit der Iss, zu einem sättigungsähnlichen Verhalten bis hin zu einer fast glockenförmigen Form. Da die exponentielle Abfallrate der steady-state Ströme k2 in ihrer Potentialabhängigkeit mit den Iss korrelierte, konnte geschlossen werden, dass die Ströme überwiegend kinetisch limitiert sind. Die Erhöhung der Rate k2 mit steigender Na+-Konzentration zwischen -120 mV und -60 mV deutet darauf hin, dass die Na+-Aufnahme von der intrazellulären Seite bei diesen Bedingungen die Limitierung für die Pumpe darstellt.
Unter Na+-“freien” Bedingungen wurde der Einfluss des intrazellulären pHs untersucht. Für die Rate k2 wurde eine Erhöhung bei niedrigen pH Werten festgestellt und die Potentiale E0 (Iss = 0 pA) verschoben bei niedrigem intrazellulärem pH zu hyperpolarisierenden Potentialen. Daraus lässt sich schließen, dass die steady-state Ströme durch den Transport von Protonen hervorgerufen wurden.
In Messungen mit gepulster 530 nm Belichtung wurden die transienten Pumpströme gemessen und durch exponentielles Fitten des Stromabfalls drei elektrogene Schritte identifiziert. Eine Abhängigkeit vom Potential und der Na+-Konzentration konnte nur für den dritten Schritt mit der Rate 1/τ3 festgestellt werden, wobei 1/τ3 mit der Na+-Konzentration und bei positiveren Potentialen steigt. Unter Na+-“freien” Bedingungen steigt 1/τ3 auch mit niedrigeren intrazellulären pH Werten. Die elektrogenen Schritte wurden dem KR2 Photozyklus zugeordnet, wobei ein Modell angewendet wurde, das einen M1→M2 Übergang einführt. Diesem wurde der zweite elektrogene Schritt zugeordnet. Die relativen Ladungstransportanteile Q2 und Q3 des zweiten und dritten elektrogenen Schrittes sind sowohl potential- als auch Na+-abhängig. Um dieses Verhalten zu erklären, wurde ein Modell vorgeschlagen, bei dem ein Ausgleichsladungstransfer in Form von einer Protonenabgabe und -wiederaufnahme während des Photozyklus eingeführt wurde.
In Patch Clamp Messungen wurde die erhaltene Funktionalität der ChR2 Mutante ChR2(L132C) mit erhöhter Ca2+-Permeabilität im Tandem Protein tCXCR4/CatCh nachgewiesen. Auch die Internalisierung von tCXCR4/CatCh konnte anhand der zeitabhängigen Abnahme des CatCh-Signals nach der CXCR4-Aktivierung durch SDF1 in Strommessungen beobachtet werden. Für tCXCR4/Arch, ein Tandem Protein mit einer Protonenpumpe, wurde die SDF1-induzierte Internalisierung mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie betrachtet und eine Kolokalisierung der Fluoreszenz des im Tandem exprimierten YFP und der eines gelabelten CXCR4-spezifischen Antikörpers in intrazellulären Vesikeln beobachtet. Bei Behandlung mit dem CXCR4 Antagonisten AMD3100 wurde die Kolokalisierung hauptsächlich in der Zellmembran festgestellt, da die Internalisierung blockiert war. Die Tandem Protein könnten als in intrazellulären Organellen wirkende optogenetische Werkzeuge eingesetzt werden für z.B. die Manipulation der intrazellulären Ca2+-Konzentration.
Over the last decade, cryo-EM has developed exponentially due to improvements in both hardware (“machine”-based) and software (“algorithm”-based). These improvements have pushed the best achievable resolutions closer to atomic level, bridging “gaps” not covered by other biophysical techniques, and allowing more difficult biological questions to be addressed. Thus, this PhD project was designed and constructed to apply cryo-EM to answer biological questions, while allowing simultaneous cryo-EM method development.
The biological focus of this research is pentameric ligand-gated ion channels (pLGICs), specifically the serotonin receptor type-3 receptor (5HT3R), which also belongs to the Cys-loop receptor family. 5HT3R plays an important role in fast synaptic signal transduction in response to agonist and antagonist binding. Binding to its native ligand results in opening of the channel at the transmembrane domain, allowing cations to pass through, resulting in membrane depolarization and conversion of the chemical signal into an electrical one.
This work consisted mainly of two specific aims. One was focused on conformational investigation of 5HT3R in its ligand-bound open conformation, using cryo-electron microscopy (cryo-SPA), in order to understand the gating mechanism upon ligand activation. The other one was to combine SPA with cryo-ET and STA to push the resolution limitation of conventional cryo-ET and STA workflows.
In the end, three different cryo-EM conformations of membrane-embedded 5HT3R were resolved using cryo-SPA, two structures in resting closed forms, one C5-symmetric and one C1-asymmetric, and one serotonin-bound open form. These three structures presented a number of novel features related to the transition of the receptor to its ion-conductive state. Specifically, the serotonin-bound receptor shows asymmetric opening, which was speculated to occur via an intermediate asymmetric Apo state. In addition to the cryo-SPA work, application of cryo-ET and STA to the study of 5HT3R in native vesicles is described in this thesis. Additional work on methods development, focused on combining SPA and STA techniques, along with preliminary results on tobacco mosaic virus are also detailed and discussed.
Moreover, previously unreported asymmetric arrangements of the subunits of the homopentameric 5HT3R around the pore axis were revealed. The asymmetric open state is stabilized by phospholipids inserted at the interface between subunits, at a site well-documented for the binding of allosteric pLGIC modulators. These results not only give structural support to a large body of functional data on the effects of lipids on the function of this receptor family, but also provide structural guidance for future studies in this field. Meanwhile, the SPA-STA combined methods developed during the course of this work have the potential to help resolve higher resolution tomography-based structures, which would benefit researchers seeking to do in-situ-based structural studies.
This Dissertation deals with the development of FAIR-relevant X-ray diagnostics based on the interaction of lasers and particle beams with matter. The associated experimental methods are supposed to be employed in the HIHEX-experiments in the HHT-cave of the GSI Helmholtz Center for Heavy-Ion Research GmbH (GSI) in Phase-0 and in the APPA-cave at the Facility for Antiproton and Ion Research in Darmstadt, Germany.
Diagnostic of high aerial density targets that will be used in FAIR experiments demands intense and highly penetrating X-ray sources. Laser generated well-directe relativistic electron beams that interact with high Z materials is an excellent tool for generation of short-pulse high luminous sources of MeV-gammas.
In pilot experiments carried out at the PHELIX laser system, GSI Darmstadt, relativistic electrons were produced in a long scale plasma of near critical electron density (NCD) by the mechanism of the direct laser acceleration (DLA). Low density polymer foam layers preionised by a well-defined nanosecond laser pulse were used as NCD targets. The analysis of the measured electron spectra showed up to 10- fold increase of the electron "temperature" from T_Hot = 1–2 MeV, measured for the case of the interaction of 1–2 ×10^19 Wcm^(−2) ps-laser pulse with a planar foil, up to 14 MeV for the case when the relativistic laser pulse propagates through the by a ns-pulse preionised foam layer. In this case, up to 80–90 MeV electron energy was registered. An increase of the electron energy was accompanied by a strong increase of the number of relativistic electrons and well-defined directionality of the relativistic electron beam measured to be (12 ±1)° (FWHM). This directionality increases the gamma flux on target by far compared to the soft X-ray sources.
Additionally to laser based active diagnostics, passive techniques involving inherent X-ray fluorescence radiation of projectile and target emitted during heavy-ion target interaction can be used to measure the ion beam distribution on shot. This information is of great importance, since the target size is chosen to be smaller than the beam focus in order to ensure homogeneous heating of the HIHEX-target by the ion beam. High amounts of parasitic radiation and activation of experimental equipment is expected for experiments at the APPA-cave. For this reason, all electronic devices must be placed at a safe distance to the target chamber. In order to transport the signal over a large distance, the X-ray image of the target irradiated by heavy-ions has to be converted into an optical one.
For these purposes, the X-ray Conversion to Optical radiation and Transport (XCOT)-system was developed in the frame of a BMBF-project and commissioned in two beamtimes at the UNILAC, GSI during this work.
In experiments, we observed intense radiation of target atoms (K-shell transitions in Cu at 8–8.3 keV and L-shell transition in Ta) ionised in collisions with heavy ions as well as Doppler-shifted L-shell transitions of Au-projectiles passing through targets. This radiation can be used for monochromatic (dispersive elements like bent crystals) or polychromatic (pinhole) 2D X-ray mapping of the ion beam intensity distribution in the interaction region during the beam-target interaction. We measured the efficiency of the X-ray photon production depending on the target thickness and the number of ions passing through the target. The spatial resolution of the XCOT-system based on the multi-pinhole camera was measured to be (91±17) μm for the image magnification factor M = 2. It was considerably improved by application of a toroidally bent quartz crystal and reached 30 μm at M = 6. This resolution is optimal to image the distribution of a 1mm in diameter ion beam. As next step, the XCOT-system will be tested during the SIS18 beam-time at the HHT-experimental area.
In dieser Studie haben wir die Modulation von Arachidonsäure (AA)-Stoffwechselwegen während einer Wurminfektionen mit dem Fadenwurm Heligmosomoides polygyrus bakeri (Hpb) als angeborene regulatorische Strategie zur Modulation der Typ-2-Entzündung untersucht. Wir zeigten, dass Hpb in frühen Stadien der Infektion (Tag 7) die Produktion von regulatorischen Prostaglandinen (PGE2 und 6-keto PGF1-α, ein Abbauprodukt von PGI2) und COX-Metaboliten (12-HHT und TXB2) fördert, jedoch die Sekretion von entzündungsfördernden Mediatoren PGD2 und LTs (LTB4, cysLTs) unterdrückt. Die Hpb-gesteuerte Regulierung des AA-Stoffwechsels könnte eine Strategie zur Immunsuppression/ Immunevasion dieses Parasiten darstellen, die darauf abzielt, die vom Wirt ausgelösten Immunantworten des Typs-2 zu unterbinden und sowohl die Infiltration und Rekrutierung von Granulozyten als auch die Schleimproduktion zu begrenzen und auf diese Weise das Abtöten bzw. Ausscheiden der Larven zu verhindern.
Als Schwerpunkt der Arbeit, konnten wir ebenso zeigen, dass ein Larvenextrakt aus Heligmosomoides polygyrus bakeri (HpbE) den AA Stoffwechsel in myeloiden Zellen wie Makrophagen und Granulozyten moduliert, indem die Synthese von 5-LOX in Richtung COX-Metaboliten verschoben wird. Die Behandlung von murinen und humanen Makrophagen mit HpbE induzierte die Synthese von regulatorischen Prostaglandinen (PGE2) und Prostaglandinen, die an der Wundheilung und Blutgerinnung beteiligt sind (12-HHT, TXB2), wohingegen die Produktion von entzündungsfördernden Lipidmediatoren (LTs, PGD2) unterdrückt wurde. Weiter induzierte HpbE in humanen und murinen Makrophagen die Synthese der Typ-2 hemmenden Mediatoren IL-10 und IL-1β und modulierte die Produktion von Zytokinen, die an der Regulierung von M2-Polarisierung und der Typ-2-Entzündung (IL-12, IL-28, IL-27 und TNF-α) in humanen Makrophagen beteiligt sind. Ähnlich zu der HpbE-vermittelten Eicosanoid-Umprogrammierung in Makrophagen, veränderte HpbE den AA-Stoffwechsel humaner Granulozyten und zeigt eine Verschiebung von LOX- in Richtung COX-Metabolismus. Außerdem kann HpbE direkt auf humane Granulozyten wirken und die Chemotaxis von Granulozyten effizienter hemmen als zur Asthmabehandlung verwendete Standardarzneimittel, indem es die Expression von LT synthetisierenden Enzymen (LTA4H und LTC4S) verringert und die Expression von chemotaktischen Rezeptoren (CCR3 und CRTH2) herunterreguliert.
Darüber hinaus, konnten wir die Mechanismen identifizieren, die der HpbE-gesteuerten Eicosanoid-Umprogrammierung in Makrophagen zugrunde liegen. Hpb Produkte induzierten die Aktivierung von p38 MAPK, welche COX und die Transkriptionsfaktoren HIF-1α und NFκβ aktiviert und die Produktion von Prostaglandinen (PGE2 and TXB2) sowie der Typ-2 unterdrückenden Zytokine IL-10 and IL-1β fördert. Der der Induktion des COX-Signalwegs zugrunde liegende Upstream-Mechanismus umfasste mehrere PPRs (TLR2, Dectin-1/2). Diese Rezeptoren waren allerdings nicht an der HpbE-gesteuerten Induktion von IL-10 beteiligt. Die Mechanismen der Modulation des 5-LOX-Signalweges muss noch in zukünftigen Studien weiter erforscht werden.
Das therapeutische Potential von HpbE oder HpbE-behandelten Makrophagen wurde in einem Maus Model mit HDM-induzierter allergischer Atemwegsentzündung in vivo gezeigt. Eine intranasale Behandlung mit HpbE vor HDM-Sensibilisierung und -Provokation führte zu einer Umprogrammierung des AA-Stoffwechsels und verhinderte die Allergie-induzierte Eosinophilie, Zellinfiltration, Atemwegsentzündung und Schleimproduktion. Die Modulation der Typ-2-Entzündung durch HpbE wurde vor allem durch COX-2-Metabolite vermittelt, die von HpbE-stimulierten Makrophagen freigesetzt wurden. Dies zeigte sich insbesondere darin, dass der Transfer von HpbE-stimulierten Wildtyp- aber nicht COX-2-defizienten Makrophagen vor Provokation die Granulozyten Rekrutierung und Typ-2-Entzündung während der HDM-induzierten Allergie in vivo abschwächte.
Mittels eines Maus Models für die allergische Atemwegsentzündung in unterschiedlichen Altersstufen (Neugeboren, Jungtier und Erwachsen) zeigte dieses Forschungsprojekt, dass das Alter der Sensibilisierung eine Schlüsselrolle bei der Produktion von LTs, der Expression von LT-Synthese Enzymen sowie von Faktoren, die zu strukturellen Veränderungen in den Atemwegen führen, spielt. Hier haben wir auch festgestellt, dass der Mechanismus hinter der LT-Produktion und dem Atemwegs-Remodeling im Epithel von ausgewachsenen sensibilisierten Mäusen die Aktivierung der Faktoren sPLA2X, TGM2 und Wnt5a beinhaltet.
Des Weiteren zeigte unsere Studie, dass eine Wechselwirkung zwischen entzündetem Atemwegsepithel und Alveolar-ähnlichen Makrophagen die Synthese von LTs fördern kann. Der vorgeschlagene Mechanismus startet mit der Sekretion von Wnt5a durch das entzündete Atemwegsepithel, welches die Expression von TGM2 in Makrophagen aktiviert und die Produktion von entzündungsfördernden LTs induziert, wodurch die Rolle der Makrophagen in entzündeten Atemwegen bei Erwachsenen weiter unterstützt wird. Die Relevanz der entdeckten Kaskade konnte auch in Geweben von Patienten mit chronischer Rhinosinusitis und Nasenpolypen (CRSwNP) bestätigt werden. Hohe Konzentrationen von LT Enzymen (5-LO, LTC4S LTA4H), sPLA2-X, TGM2 und Wnt5a wurden in humanen Nasenpolyp Geweben beobachtet, und hohe Konzentrationen von CysLTs wurden in Nasenpolyp Sekreten dieser Patienten gemessen. Dies lässt vermuten, dass die Expression von Atemwegs Remodeling-Faktoren, LT-Synthese Enzymen und die LT Synthese steroidresistent sind. Daher könnte diese entzündliche Kaskade ein alternatives therapeutisches Ziel für die Behandlung von Asthma darstellen, speziell bei Patienten mit steroidresistenten Formen von Atemwegsentzündungen.
Basierend auf den möglichen therapeutischen Anwendungen von HpbE haben wir begonnen, an der Charakterisierung der im HpbE vorhandenen immunmodulatorischen Wirkstoffe zu arbeiten. Glutamatdehydrogenase (GDH) und Ferritin wurden als potenzielle immunmodulatorische Komponenten von HpbE identifiziert. Es ist jedoch weitere Arbeit erforderlich, um diese in HpbE vorhandenen Proteine rekombinant herzustellen und den Wirkungsmechanismus im Bezug auf die Typ-2-Entzündung weiter aufzuklären.
Einleitung: Die akute Tonsillitis gehört zu den Infektionen der oberen Atemwege und ist eine sehr häufige Erkrankung in einer Kinder- und Jugendarztpraxis. Ziel unserer Untersuchung war es, das virale und bakterielle Erregerspektrum der akuten Tonsillitis, ihre saisonale Verteilung, ihre Altersverteilung, die klinische Symptomatik und den Einfluss einer Rauchexposition zu untersuchen. Gleichzeitig sollte erneut die Sensitivität und Spezifität des angewandten StrepA ST überprüft werden.
Methoden: In drei Kinder- und Jugendarztpraxen im Rhein-Main Gebiet wurden zwischen April 2009 und Mai 2010 insgesamt 1720 Patienten mit akuten Halsschmerzen untersucht. Mit einem Anamnesebogen wurden Alter, klinische Symptomatik und die Rauchexposition erfasst. Bei allen Patienten wurde ein StrepA ST durchgeführt. In einer Praxis (Praxis 1) wurden bei 306 Patienten zusätzlich ein Abstrich für eine bakterielle Kultur und für eine Multiplex PCR auf Viren durchgeführt.
Resultate: In 84% der Fälle tritt die GAS Tonsillitis im Alter zwischen 2 und 12 Jahren auf. Es konnte keine saisonale Häufung der GAS nachgewiesen werden. Mit 64 (42%) StrepA ST positiven Patienten von 152 Raucher-Familien und 74 (37%) von 200 Nichtraucher-Raucher-Familien zeigt sich kein signifikant erhöhtes Risiko an einer GAS Tonsillitis zu erkranken, wenn mindestens ein Elternteil raucht. Bei 306 Rachenabstrichen konnten 145 (47,5%) mal Streptokokken nachgewiesen werden. Davon waren mit 133 vorwiegend GAS (92%). Die anderen Streptokokken der Gruppen C (4,8%), G (2,1%) und B (1,4%) kommen deutlich seltener vor und spielen eine untergeordnete Rolle. Die Sensitivität und Spezifität des StrepA ST war mit 89,9% und 94,1% ausgezeichnet. Bei 306 Tonsillitiden gelang bei 110 Patienten (35,8%) ein Virusnachweis. Wie erwartet fanden sich doppelt so viele Virusnachweise (46%) bei Patienten ohne GAS Nachweis als Ko-Infektionen bei einer GAS (24%). Der Anteil der Entero-/Rhinoviren unter den nachgewiesenen Viren war mit 54% am höchsten. Adenoviren waren mit 15% und Influenza- 9% die nächst häufigen Viren, Para- und Coronaviren bildeten kleinere Gruppen. Während Entero-/Rhinoviren ganzjährig vorkommen sind Influenzaviren eher in der kalten Jahreszeit für akute Tonsillitiden verantwortlich. Die Rolle der Ko-Infektion in der Entstehung und im Verlauf der akuten Tonsillitis muss in weiteren Untersuchungen erforscht werden.
Schätzungen zufolge sind weltweit etwa 71 Millionen Menschen chronisch mit dem Hepatitis-C-Virus (HCV) infiziert. Im Jahre 2016 sind rund 400.000 Menschen an einer HCV-bedingten Lebererkrankung gestorben, insbesondere aufgrund der Entwicklung von Leberzirrhose und Lebertumoren. Trotz der großen Unterschiede in den Prävalenzschätzungen und der Qualität der epidemiologischen Daten zeigt die jüngste weltweite Bewertung, dass die virämische Ausbreitung der HCV-Infektion (Prävalenz der HCV-RNA) in den meisten Industrieländern, einschließlich der USA, weniger als 1,0% beträgt (www .cdc.gov / Hepatitis / HCV). In einigen osteuropäischen Ländern wie Lettland (2,2%) oder Russland (3,3%) und bestimmten Ländern in Afrika, Ägypten (6,3%) und Gabun (7,0%) oder im Nahen Osten Syriens (3,0%) ist die Prävalenz bemerkenswert höher. In den USA und den am weitesten entwickelten Ländern gilt die gemeinsame Nutzung von Werkzeugezur Herstellung von Arzneimitteln und zur Injektion von Medikamenten (Nadeln) als die häufigste derzeitige Übertragungsart. Die vorherrschende Übertragungsart in Ländern, in denen die Ausbreitung von HCV-Infektionen im Vergleich zu den Industrieländern höher ist, beruht jedoch auf schlechten Methoden zur Infektionskontrolle und unsicherer Handhabung von Injektionsnadeln.
Wenn die chronische Infektion unbehandelt bleibt, kann sich im fortschreitenden Verlauf eine Zirrhose oder ein hepatozelluläres Karzinom bilden (Alter H. J. und Seef L. B. 2000). Die Doppeltherapie, bei der es sich um eine Kombination aus pegyliertem Interferon-α (PEG IFNα) und Ribavirin (riba) handelt, war in einigen Ländern der Dritten Welt bis vor kurzem der goldene Standard für die Behandlung von Patienten mit chronischer Hepatitis C und hat eine anhaltende virologische Reaktion erzielt. Mit nur 50% der mit HCV-Genotyp 1 infizierten Patienten (der häufigere) im Vergleich zu 80% mit Genotyp 2 oder 3, obwohl sie kostspielig und langwierig sind (z. B. 24-48 Wochen) und zahlreiche harte Nebenwirkungen aufweisen, die schwer zu bekämpfen sind tolerieren (Erklärung der National Institutes of Health Consensus Development Conference: Management von Hepatitis C: 2002 - 10.-12. Juni 2002 2002). Die Identifizierung des JFH1 (japanische fulminante Hepatitis Typ 1) -Isolats wurde in einigen in vitro-Studien zu HCV als wichtiger Durchbruch bei der HCV-Behandlung angesehen. Die Verwendung dieses Isolats führte nachfolgend zu einem besseren Verständnis des HCV-Lebenszyklus und der 3D-Strukturen der viralen Proteine. Basierend auf dieser Erkenntnis konnten die ersten direkt wirkenden antiviralen Mittel (DAAs) entwickelt werden, die spezifisch virale Proteine beeinflussen. Die beiden Proteasehemmer (PI) Telaprevir und Boceprevir hemmen die virale NS3-4A-Protease und wurden 2011 als Kombinationstherapie mit PEG IFNα und Ribavirin zugelassen, was die anhaltende virologische Reaktion auf 67-75% erhöhte (Pawlotsky et al. 2015).
Die Optimierung der gegenwärtigen Arzneimittelregime, die Einschränkung des Problems der Mutationsresistenz, die Gestaltung einer individualisierten Therapie, der Zugang zu diesen therapeutischen antiviralen Arzneimitteln und ihr hoher Preis bleiben weiterhin eine Herausforderung (Pawlotsky 2016; Pawlotsky et al. 2015; Sarrazin 2016). Die Entwicklung eines Impfstoffs wird jedoch als größte Herausforderung für die weltweite Kontrolle von HCV angesehen (Bukh 2016). Aus diesem Grund ist es wichtig, weiterhin mehr über den HCV-Lebenszyklus und die Faktoren zu erfahren, die sich auf die Replikation und den gesamten Lebenszyklus auswirken können, um effiziente, qualitativ hochwertige und vor allem leicht zugängliche Behandlungen für alle Menschen weltweit zu entwickeln.
Der Lipidstoffwechsel und insbesondere das Cholesteringleichgewicht werden durch die HCV-Infektion beeinflusst. Die Korrelation zwischen Lipidstoffwechsel und HCV wurde klinisch seit langem beobachtet. In den Leberbiopsien von mit HCV infizierten Patienten wurde ein Anstieg der in den Lipidtröpfchen im Cytosol akkumulierten neutralen Lipide festgestellt (Dienes et al. 1982). Das Hepatitis-C-Virus wurde auch von Hypobetalipoproteinämie, Hypocholesterinämie und Lebersteatose begleitet (Schaefer und Chung 2013). Die Leber ist der primäre Ort für die Synthese, Speicherung und Oxidation von Lipiden und anderen Makromolekülen. Daher ist der Fettstoffwechsel in der Leber für die Aufrechterhaltung der systemischen Nährstoffhomöostase von wesentlicher Bedeutung. Eine Dysregulation des Leberlipidstoffwechsels ist ein Kennzeichen mehrerer Krankheiten wie Diabetes, alkoholische und nichtalkoholische Fettlebererkrankungen sowie parasitäre und virale Infektionen, einschließlich einer HCV-Infektion. (Erklärung der National Institutes of Health Consensus Development Conference: Management von Hepatitis C: 2002 - 10.-12. Juni 2002 2002; Fon Tacer und Rozman 2011; Chen et al. 2013; Reddy und Rao 2006; Visser et al. 2013; Wu und Parhofer 2014)
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Human protein kinases play essential roles in cellular signaling pathways and - if deregulated - are linked to a large diversity of diseases such as cancer and inflammation or to metabolic diseases. Because of their key role in disease development or progression, kinases have developed into major drug targets resulting in the approval of 52 kinase inhibitors by the Food and Drug Administration (FDA) so far.
Within the drug discovery process, the affinity of the inhibitors is the parameter that is used most often to predict the later efficacy in humans. However, the kinetics of binding have recently emerged as an important but largely neglected factor of kinase inhibitor efficacy. To efficiently suppress a signaling pathway, the targeted kinase needs to be continuously inhibited. Thus, it has been hypothesized that fast binding on-rates and slow off-rates would be the preferred property of an efficacious inhibitor. Despite optimizing the potency of kinase inhibitors, in the past decade optimization of kinetic selectivity has therefore gained interest as a molecule cannot be active unless it is bound, as Paul Ehrlich once stated. There is increasing evidence of correlations between prolonged drug-target residence time and increased drug efficacy, and that inhibitor selectivity in cellular contexts can be modulated by altered residence times. In order to contribute to the understanding of the effect of long residence times on cellular targets we initiated two projects.
The first of these projects is related to the STE20 kinase Serine/threonine kinase 10 (STK10) and its close relative STE20 like kinase (SLK) which have been reported to be frequent off-targets for kinase inhibitors used in the clinics. Also, an inhibition of STK10 and SLK has been linked to a common side-effect of severe skin rash developed upon treatment with the EGFR inhibitor erlotinib, but not gefitinib and the severity of this rash correlated with the treatment outcome, which fits the known biology of STK10 and SLK to be regulators of lymphocyte migration and PLK kinases. However, there are yet no explanations why these two proteins show such high hit-rates across the kinome among the kinase inhibitors. Using structural analysis, we identified the flexibility of STK10 to be the main reason for this hit-rate. The observed strong in vitro potencies did however not translate to the cellular system which is why we investigated the inhibitors residence time on STK10. We found the same flexibility to be the main reason for slow residence times among several inhibitors. We observed large rearrangements in the hydrophobic backpocket of STK10 including the αC, the P-loop enclosing the inhibitor like a lid and strong π-π-stackings to be the main reasons for prolonged residence times on STK10. Interestingly, we observed an increased residence time for erlotinib, which showed skin-related side-effects, giving rise whether the binding kinetics should be investigated for weak cellular off-target effects in future drug discovery efforts.
In the second project we initiated, we illuminate a structural mechanism that allows kinetic selection between two closely related kinases, focal adhesion kinase (FAK) and proline-rich tyrosine kinase 2 (PYK2). Using an inhibitor series designed to probe the mechanism, residence times measured in vitro and in cells showed a strong correlation. Crystal structures and mutagenesis identified hydrophobic interactions with L567, adjacent to the DFG-motif, as being crucial to kinetic selectivity of FAK over PYK2. This specific interaction was observed only when the DFG-motif was stabilized into a helical conformation upon ligand binding to FAK. The interplay between the protein structural mobility and ligand-induced effect was found to be the key regulator of kinetic inhibitor selectivity for FAK over PYK2.
These two projects showed that the parameter residence time should be considered for different problems among the drug discovery process. First, in an open in vivo system not only the potency of a drug alone, but as well its residence time might be of importance. Here we showed that the weak cellular potency translated to prolonged residence times for several inhibitors in cells and established a link between the phenotypic outcome of skin rash after erlotinib treatment and the residence time of this inhibitor on STK10 in cells. On the other hand, medicinal chemistry efforts should consider structure kinetic relationships (SKR) in the optimization process and aim to understand the molecular basis for prolonged target residence times. Here, we showed that a hydrophobic interaction that is enforced upon inhibitor binding is crucial for an unusual helical DFG conformation which arrests the inhibitor and prolongs its residence time providing the molecular basis for understanding the kinetic selectivity of two closely related protein kinases. Establishing the SKRs will help medicinal chemists to kinetically optimize their drug candidates to select a suitable molecule to proceed into further optimization programs. Hence, the projects showed that the target residence time parameter needs to be considered both as a molecular optimization parameter to improve compound potency and binding behavior as well as a parameter to be understood for proceeding to the open system of in vivo models to later modulate the in vivo efficacy of protein kinase targeting drugs.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten neue Synthesemethoden für den schnellen und effizienten Aufbau von molekularer Komplexität ausgehend von Enamiden als zentrale Synthesebausteine entwickelt werden. Dabei konnten insgesamt fünf unterschiedliche Reaktionen entwickelt werden, die die Synthesen nützlicher Bausteine, wie z.B. β-Amidosulfone 127 oder 1,3-Diamide 128, und neuartiger Heterocyclen ermöglichen. Insgesamt konnte so in einem diversität-orientierten Ansatz, die selektive Bildung von bis zu fünf stereogenen Einheiten ausgehend von einfachen, acyclischen Startmaterialen ermöglicht werden.
Metall-vermittelte Sulfonierungen von Enamiden mittels Sulfinatsalzen:
Im ersten Abschnitt sollten Enamide für die Synthese von Sulfonen eingesetzt werden. Dabei konnte, abhängig vom Katalysatorsystem, sowohl eine C-(sp2)-H Sulfonylierung (Schema 5-1-a.)) als auch eine Oxysulfonylierung (Schema 5-1-b.)) entwickelt werden. Durch die Verwendung von Mn(OAc)3.2 H2O wurden selektiv (E)-konfigurierteβ-Amidovinylsulfone 126 erhalten. Die Reaktion ist unempfindlich gegenüber Luft und Wasser, was sie besonders einfach in der Durchführung macht. Zudem besitzt sie eine große Substratbreite und bietet durch die Kombination mit klassischer Organometallchemie mit einem Isomerisierung-Sulfonierungs-Protokoll eine interessante Alternative zur C-H Sulfonylierung von Enamiden. Auf Grundlage dieser Reaktion sollte, durch zusätzliches Abfangen eines intermediär gebildeten Acylimins durch einen Alkohol, auch eine Oxysulfonierung entwickelt werden. In der Tat konnte durch die Verwendung von Fe(NO3)3∙9 H2O eine entsprechende 3-Komponentenreaktion zu β-Amidosulfonen 127 mit zwei stereogenen Zentren etabliert werden.
Diese Verbindungen versprechen vor allem durch ihr hohes Vorkommen als Schlüsselmotiv in biologisch aktiven Substanzen ein hohes Anwendungspotential. Die Reaktion verfügt über eine breite Substratbreite und ist analog zur Mangan-vermittelten Variante einfach in der Durchführung. Die erhaltenen sulfonierten N,O-Acetale 127 können zudem in die entsprechende Imine überführt und mit einem geeigneten Nukleophil abgefangen werden. So lässt sich z.B. das Methylfuran-Derivat 177a darstellen, welches durch eine oxidative Spaltung in die geschützte Aminosäure 178 überführt werden kann.
Addition von Enamiden und Enimiden an N-Acylimine:
Aufbauend auf der zweistufigen Reaktionssequenz zum Aufbau von 1,3-Diamiden 128 über die Addition von Enamiden 29 an N-Acylimine 131 und anschließender Umsetzung mit einem Nukleophil, konnte die Synthese zu einer Eintopf-Reaktion weiterentwickelt werden (siehe Schema 5-3-c.).
Als Katalysator für beide Reaktionsschritte zeigte Bi(OTf)3 als luft- und wasserstabiler Katalysator die besten Ausbeuten und Selektivitäten. Dabei werden selektiv 1,2-anti-2,3- anti-konfigurierte 1,3-Diamide 128 mit drei fortlaufenden Stereozentren erhalten. Vorteile dieser Methode sind, neben einer einfachen Durchführbarkeit, die simple Skalierbarkeit sowie die Toleranz einer Vielzahl unterschiedlicher funktioneller Gruppen in der Reaktion. So konnten durch Variation aller drei Komponenten über 30 Beispiele der gewünschten 1,2-anti-2,3-anti-konfigurierten 1,3-Diamide 128 dargestellt werden. Die hier entwickelte Eintopf-Reaktion stellt somit eine wichtige Erweiterung zu bestehenden 1,3-Diamidsynthesen dar. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass ausgehend von Phthaloyl-basierten Enimiden 125 die nur schlecht darstellbare Substanzklasse der Dihydropyrimido[2,1-a]isoindol-6(2H)-one 129 hergestellt werden kann (siehe Schema 5-3-d.). Dieses neuartige heterocyclische Motiv wurde bisher kaum auf seine biologische Aktivität hin untersucht und verspricht daher ein interessantes Anwendungsfeld. Insgesamt weisen die erhaltenen Verbindungen drei fortlaufende Stereozentren auf, wobei sie in guten bis sehr guten Ausbeuten diastereomerenrein erhalten werden konnten. Dabei lässt sich der hohe Grad an Stereoselektivität durch eine [4+2] Cycloaddition zwischen dem in situ erzeugten N-Acylimin 131 und einem Enimid 125 zu einem Oxazin 132, gefolgt von einer Säure-vermittelten Umlagerung, erklären. Durch Variation der Enimid- und Acyliminkomponente konnten insgesamt 27 neuartige Dihydropyrimido[2,1-a]isoindol-6(2H)-one 129 synthetisiert werden.
Addition von Enamiden an Aldehyde – Stereoselektive Synthese
pentasubstituierter Tetrahydropyrane:
Im letzten Teil der Arbeit sollte, analog zur stereodivergenten Synthese von 1,3- Diaminen, durch Addition von Enamiden an Aldehyde, die jeweiligen 1,3-Aminoalkohole dargestellt werden. Interessanterweise wurde in dieser Transformation die selektive Bildung eines pentasubstituierten Tetrahydropyrans beobachtet. Dabei werden in einem Schritt drei neue σ-Bindungen und fünf fortlaufende Stereozentren aufgebaut. Bemerkenswert ist zudem der außerordentlich hohe Grad an Stereoselektivität, da von 16 möglichen Diastereomeren nur eines gebildet wird. Durch Variation der Aldehyd- und Enamidkomponente ließen sich insgesamt 23 verschiedene Tetrahydropyrane in guten bis sehr guten Ausbeuten und exzellenter Diastereoselektivitäten darstellen. Der Einsatz (Z)-konfigurierter Enamide erlaubte zudem die Synthese eines weiteren Diastereomers 262b, welches sich in der relativen Konfiguration an C5 von 262a unterscheidet.
Insgesamt zeigen die in dieser Arbeit entwickelten Reaktionen die enorme Anwendungsbreite von Enamiden in der stereoselektiven Synthese. So konnten in einfach durchführbaren Transformationen aus simplen Startmaterialien bis zu fünf benachbarte stereogene Einheiten aufgebaut werden. Dabei zeigt die Vielfalt der erhaltenen Verbindungen gleichsam die unterschiedlichen Reaktionsmodi der Enamideinheit 29 (siehe Kapitel 1.2). Daher werden, besonders bei der Entwicklung neuer Synthesemethoden für acyclische, stickstoffhaltige Verbindungen mit mehreren fortlaufenden Stereozentren, Enamide auch in Zukunft noch ein interessantes Forschungsfeld bleiben.
Hypertonie stellt in der westlichen Welt die Haupttodesursache dar, obwohl sie im Hinblick auf die pharmakologischen Therapieoptionen gut behandelbar ist. Hauptursächlich ist hierfür eine, vor allem durch eine Non-Adhärenz (u.a. bedingt durch den asymptomatischen Charakter) und in selteneren Fällen eine aufgrund einer therapieresistente Hypertonie (TRH) verursachte, unzureichende Blutdruckkontrolle. Eine Möglichkeit zur Überprüfung der Therapietreue in der antihypertensiven Therapie ist der qualitative Nachweis der Arzneistoffe im Blut oder Urin. Unklar ist, inwiefern die Substanzen in einer biologischen Probe innerhalb des Dosierungsintervalls oder darüber hinaus nachweisbar sind und es zu einer Falschbeurteilung kommen kann.
Daher wurde eine quantitative chromatographisch-tandem-massenspektrometrische Methode für das Therapeutische Drug Monitoring von blutdrucksenkenden Arzneistoffen entwickelt und analytisch vollständig validiert. Bei 38 Patienten mit überwachter Medikamenteneinnahme wurde die Aussagekraft der Methode hinsichtlich der Bestätigung einer Adhärenz zunächst mittels zweier Wirkstoffkonzentrationen im Serum (Tal- und Spitzenspiegel) überprüft. Zur Bewertung der Konzentrationen wurden zwei Konzepte evaluiert. Einerseits wurde die untere Grenze des therapeutischen Referenzbereiches (TRR, Literaturdaten) und andererseits die mittels Rechenmodell (Daten pharmakokinetischer Studien) individuell ermittelte, dosisbezogene Arzneimittelkonzentration (DRC) evaluiert. In einem zweiten Studienansatz wurde diese neue quantitative Methode an einem Kollektiv von 36 ambulanten Patienten (ohne überwachte Medikamenteneinnahme) angewendet und zur Überprüfung der Aussagekraft mit Ergebnissen des etablierten Urinscreenings verglichen.
Die gemessenen Wirkstoffkonzentrationen von Atenolol (64 bis 564 ng/ml), Bisoprolol (2,5 bis 53 ng/ml), Metoprolol (5,8 bis 110 ng/ml), Nebivolol (0,32 bis 3,4 ng/ml), Hydrochlorothiazid (15 bis 606 ng/ml), Furosemid (22 ng/ml), Torasemid (17 bis 1829 ng/ml), Canrenon (25 bis 221 ng/ml), Amlodipin (2,4 bis 35 ng/ml), Lercanidipin (0,24 bis 21 ng/ml), Candesartan (6,0 bis 268 ng/ml), Telmisartan (22 bis 375 ng/ml) und Valsartan (115 bis 7962 ng/ml) haben gezeigt, dass die quantitative Analyse von Antihypertensiva in Serumproben und deren Auswertung auf Basis der individuell berechneten unteren DRC in der Beurteilung einer Adhärenz vielversprechend ist.
Die Auswertung auf Basis der unteren Grenze des TRR signalisierte bei den stationären Patienten (überwachte Einnahme) innerhalb der Substanzklasse der Diuretika (ohne Torasemid) bei 16,7 %, der β-Blocker bei 29,4 %, der Calciumkanal-Blocker bei 14,8 % und der AT1-Antagonisten bei 25 % fälschlicherweise eine Non-Adhärenz.
Die rein qualitative Urinanalyse zeigte im Falle der β-Blocker Atenolol, Bisoprolol und des Diuretikums HCT aufgrund einer hohen Bioverfügbarkeit, einer langen Halbwertszeit oder einer überwiegend renalen Ausscheidung der Muttersubstanz ein Nachweisfenster über das Dosierungsintervall hinaus, was bedingt, dass einige Patienten fälschlicherweise als adhärent gewertet wurden. Ein anderes Problem zeigte sich bei einigen Patienten, die mit dem AT1-Antagonist Candesartan oder dem Calciumkanal-Blocker Lercanidipin behandelt wurden und die als non-adhärent eingestuft wurden. Eine geringe Bioverfügbarkeit, eine hohe Metabolisierungsrate oder geringe renale Ausscheidung der unveränderten Arzneistoffe lies auf eine mangelhafte Nachweisbarkeit innerhalb des Dosierungsintervalls und damit auf eine eingeschränkte Beurteilbarkeit schließen.
Aus den Untersuchungen ergibt sich, dass es bei Anwendung qualitativer Nachweismethoden aufgrund besonderer Pharmakokinetiken einzelner antihypertensiver Wirkstoffe zur Fehleinschätzung der Adhärenz kommen kann. Die neu entwickelte Methodik in Form einer quantitativen Serumanalyse ist unter Verwendung patientenindividueller Bewertungskriterien bei dieser Fragestellung überlegen.
This thesis investigates the acquisition pace and the typical developmental path in eL2 acquisition of selected phenomena of German morphosyntax and semantics and compared them to monolingual acquisition. In addition, the influence of ‘Age of Onset’ and of external factors on eL2 acquisition is examined.
To date, the most studies on eL2 acquisition focused on language production. Based on mostly longitudinal spontaneous speech data of only small number of children, they indicate that eL2 learners acquire sentence structure and subject-verb-agreement faster than monolingual children, whereas the acquisition of case marking causes them more difficulties. Moreover, similar developmental paths to those of monolingual children are claimed. Only several studies examined comprehension abilities in eL2 learners, however overwhelmingly in cross-sectional design. The findings from comprehension studies on telic and atelic verbs, and on wh-questions indicate that eL2 children acquire their target-like interpretation faster than monolingual children. The same acquisition stages towards target-like interpretation like in monolingual acquisition are assumed as well. Taking together, to date, no study exists, that examines comprehension and production abilities in a large group of eL2 learners of German in a longitudinal design.
This thesis extends the previous results by investigating pace of acquisition, impact of factors, and individual developmental paths in a longitudinal design with large groups of participants. Language data of 29 eL2 learners of German (age at T1: 3;7 years, LoE: 10 months) and 45 monolingual German-speaking children (age at T1: 3;7) are examined. The eL2 learners were tested in six test rounds (age at T6: 6;9 years). The monolingual children were tested in five test rounds (are at T5: 5;7). The standardized test LiSe-DaZ (Schulz & Tracy, 2011) was employed to examine children’s language skills.
eL2 learners show a significantly greater rate of change, thus faster acquisition pace, than monolingual children in the following scales: comprehension of telicity, comprehension of wh-questions, production of prepositions, and production of conjunctions. These phenomena are acquired early in monolingual children. No differences regarding acquisition pace between eL2 children and monolingual children are found for comprehension of negation, production of case marking, and production of focus particles. These phenomena are acquired late in monolingual development and involve semantic and pragmatic knowledge. The findings of faster acquisition pace of several phenomena are in line with several studies that reported that eL2 children develop faster than monolingual children.
Independent on whether a phenomenon is acquired early or late, no effects of external factors on eL2 children’s performance are found. These findings indicate that acquisition of core, rule-based phenomena is not sensitive to external factors if the first exposure to L2 takes place around the age of three.
Moreover, eL2 children show the same developmental stages and error types in comprehension of telicity, comprehension of negation, production of matrix and subordinate clauses. This is also independent on how fast they acquire a structure under consideration. Thus, these findings provide a further support for similar developmental paths of eL2 and monolingual children towards target-like comprehension and production.
Space optimizations in deterministic and concurrent call-by-need functional programming languages
(2020)
In this thesis the space consumption and runtime of lazy-evaluating functional programming languages are analyzed.
The typed and extended lambda-calculi LRP and CHF* as core languages for Haskell and Concurrent Haskell are used. For each LRP and CHF* compatible abstract machines are introduced.
Too lower the distortion of space measurement a classical implementable garbage collector is applied after each LRP reduction step. Die size of expressions and the space measure spmax as maximal size of all garbage-free expressions during an LRP-evaluation, are defined.
Program-Transformations are considered as code-to-code transformations. The notions Space Improvement and Space Equivalence as properties of transformations are defined. A Space Improvement does neither change the semantics nor it increases the needed space consumption, for a space equivalence the space consumption is required to remain the same. Several transformations are shown as Space Improvements and Equivalences.
An abstract machine for space measurements is introduced. An implementation of this machine is used for more complex space- and runtime-analyses.
Total Garbage Collection replaces subexpressions by a non-terminating constant with size zero, if the overall termination is not affected. Thereby the notion of improvement is more independent from the used garbage collector.
Analogous to Space Improvements and Equivalences the notions Total Space Improvement and Total Space Equivalence are defined, which use Total Garbage Collection during the space measurement. Several Total Space Improvements and Equivalences are shown.
Space measures for CHF* are defined, that are compatible to the space measure of LRP. An algorithm with sort-complexity is developed, that calculates the required space of independent processes that all start and end together. If a constant amount of synchronization restrictions is added and a constant number of processors is used, the runtime is polynomial, if arbitrary synchronizations are used, then the problem is NP-complete.
Abstract machines for space- and time-analyses in CHF* are developed and implementations of these are used for space and runtime analyses.
Die CXCR4/CXCL12-Achse ist von entscheidender Bedeutung für die Entstehung und Aufrechterhaltung einer gesunden, reifen Hämatopoese. Erstmals beschrieben wurde der später als CXCR4 bezeichnete Rezeptor 1996 allerdings als Co-Rezeptor für den Eintritt humaner HI-Viren in Lymphozyten. Ein großes Interesse bestand daraufhin darin, sowohl natürliche Inhibitoren des G-Protein gekoppelten Rezeptors zu identifizieren, als auch synthetische herzustellen, um einen Eintritt des Virus in den menschlichen Organismus zu verhindern bzw. seine Ausbreitung zu unterbinden. Ein natürlich vorkommender CXCR4-Ligand, der 2015 von Zirafi und Kollegen erstmals beschrieben wurde, fand sich im Hämofiltrat von Dialysepatienten. Der im weiteren Verlauf als EPI-X4 bezeichnete CXCR4-Antagonist wurde als Spaltprodukt von Albumin identifiziert, welches über viele Spezies hochkonserviert ist. Diese Eigenschaft interpretieren wir als Hinweis auf eine relevante physiologische Funktion des Peptids. Da die Halbwertszeit von natürlich vorkommendem EPI-X4 beim Menschen vermutlich sehr kurz ist, sind in vivo- und darauffolgende in vitro-Analysen schwierig durchzuführen. In-vitro-Spike-Analysen von synthetischem EPI-X4 in humanem Plasma ergaben eine Halbwertszeit von nur 17 Minuten. Die geringen auftretenden Konzentrationen erschweren die Problematik zusätzlich. In dieser Arbeit sollen deshalb im Mausmodell in vivo-Analysen durchgeführt werden, um die Effekte von potentiell entstehendem EPI-X4 in verschiedenen experimentellen Ansätzen aufzudecken. Ein probates, hier verwendetes Mittel, ist die Analyse einer Knock-out (KO)-Maus. Die für die Bindung an CXCR4 entscheidende Aminosäure von EPI-X4, das am N-Terminus gelegene Leucin, wurde durch Alanin ersetzt, welches die Entstehung von EPI-X4 unterbindet und zusätzlich dessen Bindung an CXCR4 verhindert. Mit Hilfe zweier Mausmodelle können nun Analysen im EPI-X4-defizienten Modell durchgeführt werden, die im Umkehrschluss Informationen über die organismische Wirkung von EPI-X4 beinhalten. Zunächst wurde in beiden Modellen die physiologisch normale reife und unreife Hämatopoese charakterisiert. Hierbei zeigte sich kein signifikanter systematischer Einfluss von EPI-X4 auf reife Leukozyten (WBC), lediglich eine leichte Lymphozytose in der HR-Ala-Variante. Im weiteren Verlauf der homöostatischen Analyse der Hämatopoese der Ala-EPI-X4-Mäuse zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zu wildtypischen Mäusen. Sowohl reife als auch unreife Zellen zeigten, außer in der T- und B-Zelllinie, keine zahlenmäßigen oder funktionalen Auffälligkeiten, weder im Blut, noch in der Milz oder im Knochenmark. Analysen der Zellzyklusaktivität unterschiedlicher Unreifestufen wiesen ebenfalls keine Auffälligkeiten auf. Diese Daten einer normalen, von einer C57Bl/6-Maus zu erwartenden Ergebnisse dienten als Grundlage zur Bewertung und Analyse von durchgeführten hämatopoetischen Stressmodellen. Hierfür wurden
zunächst hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) mobilisiert. In den angewandten Mobilisierungsmodellen fanden sich lediglich unter G-CSF-Behandlung im Knochenmark eine größere Anzahl Granulozyten, was auf einen Einfluss von EPI-X4 auf HSPC schließen lässt. Um potentielle Auswirkungen von EPI-X4 im Knochenmark weiter zu untersuchen, wurde ein weiteres Stressmodell gewählt, welches ebenfalls mutmaßlich die Bedingungen zur EPI-X4-Generierung schafft: Subletale Bestrahlung der Mäuse sorgt für Schäden an allen Zellarten im Knochenmark, es wird ein steriles entzündliches Milieu kreiert. Unter diesen Umständen wurde die Regeneration von Blutzellen analysiert. Es zeigten sich keine nennenswerten Unterschiede sowohl in der akuten Phase des Schadens als auch in regelmäßigen Blutentnahmen während der Regenerierung.
Die Beschreibung von natürlich vorkommendem EPI-X4 in Vaginal- und Rektalschleimhaut zeigt seine Entstehung an Schleimhautbarrieren auf. Ala-EPI-X4-Muse werden deshalb auf deren Durchlässigkeit untersucht: LPS-Konzentrationen als Marker für eindringende pathogene Bakterien wurden im Plasma untersucht. Hierbei zeigten sich keine Unterschiede zwischen den Gruppen, eine Störung scheint hier nicht vorzuliegen. Zusätzlich wurde die Zusammensetzung des Mikrobioms im Darm untersucht, da beschrieben wurde, dass sich Mikrobiom und die Integrität der Darmschleimhaut gegenseitig beeinflussen. Im Falle der EPI-X4-defizienten Mäuse liegt zwar keine offensichtliche pathologische Veränderung vor, dennoch konnte in männlichen HR-Ala-Mäusen die Abwesenheit des Proteobakteriums Parasutterella nachgewiesen werden. Um eine mögliche Defizienz der Barrierefunktion weiter zu testen, wurden zwei Stressmodelle gewählt: Zunächst wurde den Mäusen eine akute, sterile Peritonitis zugefügt, woraufhin die Anzahl und Zusammensetzung der ins Peritoneum einströmenden Leukozyten analysiert wird. Die Reaktion auf diesen Entzündungsprozess war nicht verändert. Ähnliche Ergebnisse zeigten sich auch in einem akuten Colitis-Stressmodell.
Insgesamt konnte in dieser Arbeit mithilfe zweier KO-Mausmodelle die Rolle von EPI-X4 in der Hämatopoese und der Immunologie von Mäusen beginnend charakterisiert werden. Die homöostatische Hämatopoese scheint kaum von EPI-X4 abhängig zu sein, lediglich die Zahl der B- und T-Zellen, insbesondere der regulatorischen T-Zellen, scheint beeinflusst. Damit einhergehend konnten Veränderungen in Zytokinlevels bei inflammatorischen Ereignissen gezeigt werden. Experimente zur beeinflussten, eventuell gestörten Barrierefunktion von Ala-EPI-X4-Mäusen zeigten vielversprechende Ansätze und sollten in Zukunft weiter analysiert werden.
Natural science is only just beginning to understand the complex processes surrounding transcription. Epitranscriptional regulation is in large parts conveyed by transcription factors (TFs) and two recently discovered small RNA (smRNA) species: microRNAs (miRNAs) and transfer RNA fragments (tRFs). As opposed to the fairly well-characterised function of TFs in shaping the phenotype of the cell, the effects and mechanism of action of smRNA species is less well understood. In particular, the multi-levelled combinatorial interaction (many-to-many) of smRNAs presents new challenges to molecular biology. This dissertation contributes to the study of smRNA dynamics in mammalian cells in several ways, which are presented in three main chapters.
I) The exhaustive analysis of the many-to-many network of smRNA regulation is reliant on bioinformatic support. Here, I describe the development of an integrative database capable of fast and efficient computation of complex multi-levelled transcriptional interactions, named miRNeo. This infrastructure is then applied to two use cases. II) To elucidate smRNA dynamics of cholinergic systems and their relevance to psychiatric disease, an integrative transcriptomics analysis is performed on patient brain sample data, single-cell sequencing data, and two closely related in vitro human cholinergic cellular models reflecting male and female phenotypes. III) The dynamics between small and large RNA transcripts in the blood of stroke victims are analysed via a combination of sequencing, analysis of sorted blood cell populations, and bioinformatic methods based on the miRNeo infrastructure. Particularly, importance and practicality of smRNA:TF:gene feedforward loops are assessed.
In both analytic scenarios, I identify the most pertinent regulators of disease-relevant processes and biological pathways implicated in either pathogenesis or responses to the disease. While the examples described in chapters three and four of this dissertation are disease-specific applications of miRNeo, the database and methods described have been developed to be applicable to the whole genome and all known smRNAs.
Die CT-Diagnostik gewinnt auch über 100 Jahre nach der Entdeckung der Röntgenstrahlung noch immer weiter an Bedeutung im klinischen Alltag. Insbesondere im Bereich des Stagings und der onkologischen Follow-Up-Untersuchungen zählt die Ganzkörper-CT derzeit vielerorts als diagnostischer Goldstandard. Dabei muss jedoch in Kauf genommen werden, dass es zur Applikation nicht unerheblicher Dosiswerte kommt. Das Risiko von Folgeschäden ist dabei nicht von der Hand zu weisen, wobei das Folgemalignom als besonders gefürchtete Komplikation gilt. Die Optimierung der Computertomographie und die Minimierung möglicher Folgeschäden ist daher Gegenstand konstanter klinischer Forschung. Dennoch muss eine Reduktion der Strahlendosis nur äußerst feinfühlig erfolgen, da sie auf technischer Ebene eng mit der realisierbaren Bildqualität korreliert.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Nutzen eines 150 kV + Sn Zinnfilter- Protokolls am Gerät Siemens Somatom Force zu untersuchen. Hierbei sollte vor allem darauf eingegangen werden, wie viel Strahlendosis durch die Implementierung eines solchen Protokolls eingespart werden kann, wie sich das Protokoll auf die subjektive und objektive Bildqualität auswirkt, sowie welcher weitere klinische Nutzen zu erwarten ist. Bisher konnten sich ähnliche Protokolle bereits im Rahmen anderer Fragestellungen als nützlich beweisen.
Insgesamt 40 Patienten mit Ganzkörper-Staging im Rahmen eines Multiplen Myeloms wurden in die Studie inkludiert (28 Frauen, 12 Männer). Diese wurden im vereinbarten Untersuchungszeitraum mit dem durch die Ethikkomission genehmigten Studienprotokoll (150 kV + Sn Force) untersucht und waren jeweils retrospektiv auch Teil der anderen Gruppen gewesen (120 KV Definition AS, 120 KV Flash, 120 kV Force).
Auch wenn der intraindividuelle Vergleich inhärent mit einer höheren statistischen Power einhergeht, wurden sicherheitshalber an vordefinierten Stellen Querdurchmesser der Patienten erhoben, um biometrische Gleichheit zu beweisen.
Hier ließen sich keine signifikanten Unterschiede messen. Die Bilddaten der Patienten wurden randomisiert und doppelt verblindet von zwei dem Projekt fremden und berufserfahrenen Radiologen hinsichtlich der subjektiven Bildqualität ausgewertet. Ein Bezug zu den technischen Hintergrundinformationen der Aufnahme war zu keinem Zeitpunkt möglich.
Anschließend erfolgte die statistische Auswertung objektiver Daten. Zum Vergleich der Bildqualität wurden jeweils gemittelte Schwächungswerte aus Muskeln aus artefaktfreien und aus von Artefakten beladenen Arealen erhoben. Aufgrund des homogenen Charakters der Muskeln wurde die ebenso jeweils gemittelte Standardabweichung dieser Strukturen als Hintergrundrauschen definiert. Hieraus wurde eine SNR errechnet.
Der Vergleich von Dosiswerten erfolgte über die aus dem Patientenprotokoll entnehmbaren Angaben, insbesondere des CTDI. Gemeinsam mit den erhobenen Querdurchmessern wurde hieraus eine SSDE gebildet.
Bei allen subjektiven Vergleichen der Studiengruppe (150 kV + Sn Force) wurde bei jeweils starker Korrelation nach Spearman und starker bis sehr starker Übereinstimmung nach Cohen eine gute bis sehr gute Bildqualität attestiert. Damit stellt das Untersuchungsprotokoll Bilder durchweg besser als das Referenzprotokoll auf den Geräten Somatom Definition AS und Somatom Definition Flash dar. Im Direktvergleich zum Referenzprotokoll auf dem Somatom Force ist das Studienprotokoll jeweils mindestens gleichwertig.
Im objektiven Vergleich der Bildqualität zeigte sich als Gütekriterium zunächst, dass Muskeln artefaktfreier Areale in allen vier Gruppen gleich gut dargestellt werden. Bereits bei der Betrachtung der Schwächungswerte artefaktbeladener Muskeln wurde deutlich, dass die anderen Protokolle mit signifikant höherem Signalverlust zu kämpfen haben. Auch das Bildpunktrauschen war in der Studiengruppe (150 kV + Sn Force) überwiegend signifikant niedriger, als das der anderen Gruppen. Lediglich in Artefaktarealen des Untersuchungsabschnitts cCT/HWS konnte die Gruppe 120 kV Force vergleichbar niedrige Rauschwerte aufweisen (p = 1), der Vergleich der SNR wiederholte dieses Ergebnis.
CTDI und SSDE der Gruppe
150 kV Force zeigten im Untersuchungsabschnitt cCT/HWS insbesondere der Gruppe 120 kV Force gegenüber signifikante Dosiseinsparungen von ca. 42 %, im Abschnitt Tho-Knie sogar 64%.
Zusammenfassend zeigte sich durch die Implementierung des Studienprotokolls also mehrheitlich eine Verbesserung sowohl der subjektiven, als auch der objektiven Bildqualität. Bei einer durchschnittlichen Reduktion der applizierten Strahlendosis von ca. 40-60 % (gegenüber dem Referenzprotokoll am Somatom Force) ist der Einsatz des Studienprotokolls für die hier untersuchte Fragestellung im klinischen Alltag also uneingeschränkt zu empfehlen.
The p38α mitogen-activated protein kinase (MAPK) is activated through stress stimuli such as heat shock or hypoxia. In the nucleus, p38α modulates the activity of other kinases and transcription factors, a process that regulates the expression of specific target genes, most importantly pro-inflammatory cytokines. Dysregulation of p38α therefore plays a major role in the development of inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis. Despite many years of intensive research, no p38 small-molecule inhibitors have been approved yet. Several inhibitor design strategies have been reported, leading to >100-fold selective compounds for α/β over the γ and δ isoforms. Achieving such a selectivity among the two structurally most related α and β isoforms, however, remains a challenging task. Targeting an inactive DFG-out conformation offers another strategy for the development of potent kinase inhibitors (type-II), exemplified by the BCR/ABL-inhibitor Imatinib. Achieving selectivity with type-II binders is challenging, because many kinases can adopt an inactive DFG-out conformation. This is exemplified by the p38 type-II inhibitor BIRB-796, which exhibits picomolar on-target affinity but only a poor kinome-wide selectivity. A potent and selective type-II chemical probe for p38α/β was still lacking at the start of this thesis.
The promising hit VPC-00628, was chosen for a combinatorial synthetic approach to develop a type-II chemical probe. The studies covered the optimization of the hinge-binding head group, the hydrophobic region I and the DFG-out deep pocket of the lead compound VPC-00628. Selectivity for the p38α and p38β isoforms was monitored during the optimization process, which identified several inhibitors with favorable isoform selectivity, providing valuable insights into the potential of isoform-selective inhibitor design for p38. A potent and highly selective p38 MAPK probe (SR-318) was discovered, which showed IC50 values in the low nanomolar range in HEK293T cells. An unusual P-loop conformation induced upon binding of SR-318 to p38α contributed most likely to the impressive selectivity profile within the kinome that surpassed both the parent compound and BIRB-796. A negative control compound, SR-321, was developed, to distinguish between on-target effects and non-specific effects due to cross-reactivity with other cellular proteins. Studies of the metabolic stability in human liver microsomes revealed a high stability of the compounds, with only a small amount of metabolites formed over several hours. Compound SR-318 also exhibited a good in vitro efficacy, quantitatively reducing the LPS-stimulated TNF-α release in whole blood. Taken together, SR-318 is a highly potent and selective type-II p38α/β chemical probe, which will help to gain a better understanding of the catalytic and non-catalytic functions of these key signaling kinases in physiology and pathology.
The next studies focused on the exploration of the highly dynamic allosteric back pocket of p38 MAPK, and allosteric BIRB-796 derived compounds for targeting the αC- and DFG-out pockets were synthesized. Kinase activities of allosteric pyrazole-urea fragments were analyzed against a comprehensive set of 47 diverse kinases by differential scanning fluorimetry (DSF), revealing that BIRB-796 off-targets remain a problem when targeting this back-pocket binding motif. Revisiting the recently published compound MCP-081, which combines the allosteric part of BIRB-796 with the active-site directed part of VPC-00628, showed that it displays a clean selectivity profile in our kinase panel. Because the potency of MCP-081 was slightly reduced compared with VPC-00628 and the allosteric tert-butyl pyrazole moiety seemed suboptimal, a set of VPC-00628 derivatives for targeting the αC-out pocket region was synthesized. Through structure-guided extension of the terminal amide of VPC-00628 toward this allosteric site, the potent and selective compound SR-43 was developed, which showed excellent cellular activity on p38 MAPK in NanoBRETTM assays (IC50 [p38α/β] = 14.0 ± 0.1/ 16.8 ± 0.1 nM). SR-43 showed a dose-dependent inhibition of activating phosphorylation of p38 in HCT-15 cells as well as inhibition of phosphorylation of p38 downstream substrates MK2 and Hsp27. In addition, SR-43 induced an anti-inflammatory response by blocking TNF-α release in whole blood and displayed a high metabolic stability. Selectivity profiling of SR-43 revealed a narrow selectivity for additional targets such as the discoidin domain receptor kinases (DDR1/2). DDR kinases play a central role in fibrotic disorders, such as renal and pulmonale fibrosis, atherosclerosis and different forms of cancer. Since selective and potent inhibitors for these important therapeutic targets are largely lacking and the existing inhibitors are of low scaffold diversity, the next study focused on the optimization of SR-43 toward DDR1/2 kinase inhibition. The synthetic work covered the optimization of the hinge-binding head group and the allosteric part of SR-43 toward DDR1/2 kinase inhibition. These studies provided novel insights into the P-loop folding process of p38 MAPK and how targeting of non-conserved amino acids affects inhibitor selectivity. Importantly, they led to the development of a selective dual DDR/p38 inhibitor probe, SR-302, with picomolar affinity for DDR2. SR-302 was efficient in vitro and showed a destabilizing effect on the surface adhesion protein E-cadherin in epithelial cells. In summary, SR-302 and its negative control SR-301 provide a valuable tool set for studying the phenotypic effects of DDR1/2 signaling, e.g., in cancer cell lines.
Während meiner Promotion habe ich zwei Projekte unter der Aufsicht von Dr. Misha Kudryashev durchgeführt. Im ersten Projekt habe ich die Strukturen des Ryanodinrezeptors 1 (RyR1) in Apo- und Ryanodin-Bindungszuständen in der nativen Membran durch Tomographie und Subtomogramm-Mittelung bei 12,6 bzw. 17,5 Å bestimmt. Im Vergleich zur Struktur von gereinigtem RyR1 unter Verwendung der Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) können zusätzliche Dichten in der cytoplasmatischen Domäne und der sarkoplasmatischen Retikulum (SR)-Membran bzw. im SR-Lumen beobachtet werden. Die Auflösung der Struktur von RyR1 im Apo-Zustand wurde von den Kollegen in meinem Labor mithilfe der Hybridmethode auf 9,5 Å verbessert. Diese Arbeit hat unser Verständnis für die Mechanismen von RyR1 in nativen Membranen erweitert. Im zweiten Projekt habe ich die Struktur des Proteins SdeC der SidE-Familie durch Einzelpartikel-Kryo-EM bei 4,6 Å bestimmt. Die Kristallstruktur des C-Terminus von SdeA wurde von meinem Forschungspartner Dr. Mohit Misra gelöst. Durch Überlagerung einer gemeinsamen Helix dieser beiden Strukturen konnten wir ein kombiniertes Modell erstellen und ein allgemeines Verständnis der Proteine der SidE-Familie erhalten.
Chronische pulmonale Infektionen mit Pseudomonas aeruginosa (PA) betreffen die überwiegende Mehrheit der erwachsenen Mukoviszidose (Cystische Fibrose, CF) Patienten.
Diese Infektionen führen gesichert zu einer Abnahme der Lungenfunktion und Zunahme der Mortalität der Patienten. Atemwegsviren stehen im Verdacht pulmonale Exazerbationen bei CF-Patienten auszulösen. Unklar ist jedoch, welchen Einfluss eine chronische Infektion mit PA auf die Anfälligkeit und Reaktion des Atemwegsepithels auf virale Infektionen hat.
Das Ziel dieser Arbeit war es daher, die Interaktionen zwischen PA, humanen Rhinoviren (HRV) und primären bronchialen Epithelzellen zu untersuchen. Hierfür wurden Zellen von jeweils drei Patienten mit CF und mit Lungenemphysem aus Lungenexplantaten isoliert und in einem speziellen Air- Liquid-Interface Zellkulturmodell zu einem mukoziliär differenzierten mehrreihigen Flimmerepithel kultiviert. Chronische Infektionen wurden mit klinischen PA Isolaten für einen Gesamtzeitraum von 16 Tagen durchgeführt. Anschließend wurden die Zellen mit HRV infiziert. Schlüsselzytokine, Interferone und virale RNA wurden mittels Cytometric bead array, ELISA und qPCR bestimmt.
Rein virale Infektionen mit HRV führten zu einem Anstieg von IL-1, -6, -8, TNF- α, IP10 und IFN-b, IFN-l1 sowie ISGs und in ähnlichem Ausmaß konnte dies auch bei Coinfektionen mit einem mukoiden PA-Isolat beobachtet werden. Coinfektionen mit einem nicht-mukoiden PA-Isolat führten im Vergleich zu rein viralen Infektionen zu vermehrter Expression von IL-1β und IL-6 mRNA. Während es unter diesen Bedingungen auch auf Proteinebene zu einem Anstieg der IL-1β Konzentration kam, lag die Konzentration von freiem IL-6 Protein in nahezu allen Proben unter der Nachweisgrenze. Zellkulturmedium aus Coinfektionen mit diesem nicht-mukoiden PA-Isolat führten zudem zu einem Abbau oder einer Bindung von extern zugegebenen rekombinantem IL-6.
IL-8, IP-10, TNF-α Protein und mRNA von IFN-β, -λ1 und ISGs, sowie die Viruslast waren vergleichbar zwischen rein viralen Infektionen und bakteriell- viralen Coinfektionen. Ebenfalls keine Unterschiede wurden zwischen Zellen von Emphysem und CF-Spendern gefunden. Insgesamt zeigen diese Daten, dass eine PA-Infektion die Antwort differenzierter bronchialer Epithelzellen auf eine Virusinfektion verändern kann. Die hierdurch veränderte Immunantwort und möglicherweise eingeschränkten epithelialen Reparaturmechanismen könnten eine Ursache aggravierter viraler Infektionen in P. aeruginosa-infizierten Atemwegen darstellen.
Ein besseres Verständnis der Interaktionen zwischen chronisch-bakteriellen und viralen Atemwegsinfektionen könnte potenziell die Behandlung virus-induzierter Exazerbationen bei PA-infizierten CF-Patienten verbessern.
Currently, due to the misuse of antibiotics, we are facing a major public health problem. The resistance to antibiotics of certain bacterial strains makes the treatment of infections very complex.
In this context, the present thesis project concerns the study of a bacterial efflux complex capable of transporting antibiotics from the cytoplasm to the outside of the cell. This complex is composed of an inner-membrane Major Facilitator Superfamily (MFS) transporter (EmrB, E. coli multidrug resistance), a channel of the outer membrane TolC (Tolerance to Colicin E1) and a periplasmic adapter (EmrA, E. coli multidrug resistance). Unlike RND-type efflux systems (such as AcrAB-TolC), little is known about the MFS-type EmrAB-TolC system. It is therefore important to study the entire complex on a structural and functional level, to analyse the marked differences between these two types of transport systems. The goal of my thesis project was to study at least one EmrAB-TolC complex from a structural point of view. For my studies the aim was to isolate the complex directly from bacteria overexpressing the three protein partners. In a first step, 15 homologous EmrAB-TolC systems were identified and their corresponding genes amplified from genomic DNA of different Gram-negative bacteria. Among the genes of the 15 systems, the genes coding for the E. coli and V. cholerae systems were further studied. The expression vectors encoded fluorescent markers for the monitoring of the expression levels of different proteins and for studying the formation of complexes. In a first step, the different protein expression levels (EmrB-mRFP1 and EmrA-sfGFP) were studied for several expression strains of E. coli by measuring the red and green fluorescence levels and by Western blot (anti-His, Myc, and Strep for EmrB, EmrA, and TolC). The E. coli strain C41(DE3) was best suited for co-expression of EmrAB-TolC. In a second step, the FSEC (Fluorescence detection Size Exclusion Chromatography) methodology was used to identify a complex suitable for structural study. Thus this method enabled the observation that the EmrAB-TolC complex of E. coli was produced in higher amount than that of V. cholerae. The final co-purification protocol consists in perfoming a gentle lysis of the bacteria using lysozyme, then after solubilization with DDM, the purification is started by a Ni2+-NTA affinity chromatography step followed by a size exclusion chromatography step. Finally, the fractions containing the three protein partners are used for the detergent-exchange by amphipol A8-35 before the structural study by electron microscopy. Negative stain EM-micrographs displayed elongated objects with a length of 33 nm in side view. An average image of EmrAB-TolC shows similarities to that of the AcrAB-TolC complex observed under similar conditions. Similarities included the characteristic densities of TolC. Whereas differences were found in the lower part of EmrAB which is thinner than the lower part of AcrAB. The densities visible above the amphipol-ring correspond to EmrA, which displays a channel-like structure as in AcrA. The channel however seems to extend further towards the amphipol belt. Since EmrB does not have an extended periplasmic domain as the RND proteins have, these densities are therefore solely assigned to EmrA. EmrA, on the other side, contacts TolC akin to the interaction of AcrA/MexA to their cognate outer membrane channels (TolC/OprM) in a ‘tip-to-tip’ fashion.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Reaktionsmikroskop (REMI) nach dem Messprinzip COLTRIMS (Cold Target Recoil Ion Momentum Spectrometry) neu konstruiert und aufgebaut. Die Leistungsfähigkeit des Experimentaufbaus konnte sowohl in diversen Testreihen als auch anschließend unter realen Messbedingungen an der Synchrotronstrahlungsanlage SOLEIL und am endgültigen Bestimmungsort SQS-Instrument (Small Quantum Systems) des Freie-Elektronen-Lasers European XFEL (X-ray free-electron laser) eindrucksvoll unter Beweis gestellt werden.
Mit der Experimentiertechnik COLTRIMS ist es möglich, alle geladenen Fragmente einer Wechselwirkung eines Projektilteilchens mit einem Targetteilchen mittels zweier orts- und zeitauflösender Detektoren nachzuweisen. In einem Vakuumrezipienten wird die als Molekularstrahl präparierte Targetsubstanz inmitten der Hauptkammer zentral mit einem Projektilstrahl (z.B. des XFEL) zum Überlapp gebracht, sodass dort eine Wechselwirkung stattfinden kann. Bei den entstehenden Fragmenten handelt es sich um positiv geladene Ionen sowie negative geladene Elektronen. Elektrische Felder, erzeugt durch eine Spektrometer-Einheit, sowie durch Helmholtz-Spulen erzeugte magnetische Felder ermöglichen es, die geladenen Fragmente in Richtung der Detektoren zu lenken. Die Orts- und Zeitmessung eines einzelnen Teilchens (z.B. eines Ions) findet in Koinzidenz mit den anderen Teilchen (z.B. weiteren Ionen bzw. Elektronen) statt. Mit dieser Messmethode können die Impulsvektoren und Ladungszustände aller geladenen Fragmente in Koinzidenz gemessen werden. Da hierbei die geometrische Anordnung der einzelnen Komponenten für die Leistungsfähigkeit des Experiments eine entscheidende Rolle spielt, mussten bei der Neukonstruktion des COLTRIMS-Apparates für den Einsatz an einem Freie-Elektronen-Laser (FEL) einige Rahmenbedingungen erfüllt werden. Besonders wurden die hohen Vakuumvoraussetzungen an den Experimentaufbau aufgrund der enormen Lichtintensität eines FEL beachtet. Das Zusammenspiel der vielen Einzelkomponenten konnte zunächst in mehreren Testreihen überprüft werden. Unter anderem durch Variation der Vakuumbauteile in Material und Beschaffenheit konnten die zuvor ermittelten Vorgaben schließlich erreicht werden. Das neu konstruierte Target-Präparationssystem zur Erzeugung molekularer Gasstrahlen erlaubt nun den Einsatz von bis zu vier unterschiedlich dimensionierten, differentiell gepumpten Stufen. Zudem wurden hochpräzise Piezo-Aktuatoren verbaut, welche die Bewegung von Blenden im Vakuum erlauben, wodurch eine variable Einstellung des lokalen Targetdrucks ermöglicht wird. Die Anpassung der elektrischen Felder des Spektrometers für ein jeweiliges Experiment wurde mittels Simulationen der Teilchentrajektorien, Teilchenflugzeiten sowie der Detektorauflösung durchgeführt.
Da die in dieser Arbeit besprochenen Messungen und Ergebnisse die Wechselwirkungsprozesse von Röntgenstrahlung bzw. Synchrotronstrahlung mit Materie thematisieren, wird die Erzeugung von Synchrotronstrahlung sowohl in Kreisbeschleunigern als auch in den modernen Freie-Elektronen-Lasern (FEL) erklärt und hergeleitet. Der im Röntgenbereich arbeitende Freie-Elektronen-Laser European XFEL, welcher u.A. als Strahlungsquelle für die hier gezeigten Experimente diente, ist eine von derzeit noch wenigen Anlagen ihrer Art weltweit. Seine Lichtintensität in diesem Wellenlängenbereich liegt bis zu acht Größenordnungen über den bisher verwendeten Anlagen für Synchrotronstrahlung.
Beim ersten Einsatz der neuen Apparatur an der Synchrotronstrahlungsanlage SOLEIL wurde der ultraschnelle Dissoziationsprozess von Chlormethan (CH3Cl) untersucht. Während des Zerfallsprozesses nach Anregung durch Röntgenstrahlung werden hochenergetische Auger-Elektronen emittiert, welche in Koinzidenz mit verschiedenen Molekülfragmenten nachgewiesen wurden. Durch den Zerfallsmechanismus der ultraschnellen Dissoziation wird die Auger-Elektronenemission nach resonanter Molekülanregung während der Dissoziation des Moleküls beschrieben. Die kinetische Energie des Auger-Elektrons ist dabei abhängig von seinem Emissionszeitpunkt. Somit können die gemessenen Auger-Elektronen ein „Standbild“ der zeitlichen Abfolge des Dissoziationsprozesses liefern.
Es wird eine detaillierte Beschreibung der Datenanalyse vorgenommen, welche aus Kalibrationsmessungen und einer Interpretation der Messdaten besteht. Die abschließende Betrachtung besteht in der Darstellung der Elektronenemissionswinkelverteilungen im molekülfesten Koordinatensystem. Die Winkelverteilung der Auger-Elektronen wird am Anfang der Dissoziation vom umgebenden Molekül- potential beeinflusst und zeigt deutliche Strukturen entlang der Bindungsachse. Entfernen sich die Bindungspartner voneinander und das Auger-Elektron wird währenddessen emittiert, so verschwinden diese Strukturen zunehmend und eine Vorzugsemissionsrichtung senkrecht zur Molekülachse wird sichtbar.
Die Analyse der Messdaten zur Untersuchung von Multiphotonen-Ionisation an Sauerstoff-Molekülen am Freie-Elektronen-Laser European XFEL ermöglichte unter anderem die Beobachtung „hohler Moleküle“, also Systemen mit Doppelinnerschalen- Vakanzen. Solche Zustände können vor allem durch die sequentielle Absorption zweier Photonen entstehen, wobei die hierbei nötige Photonendichte nur von FEL- Anlagen bereit gestellt werden kann. Hier konnte das Ziel erreicht werden, erstmalig die Emissionswinkelverteilungen der Photoelektronen von mehrfach ionisierten Sauerstoff-Molekülen (O+/O3+-Aufbruchskanal) als Folge der ablaufenden Mechanismen femtosekundengenau zu beobachten. Hierzu wurde ein vereinfachtes Schema der verschiedenen Zerfallsschritte erstellt und schließlich ermittelt, dass der Zerfall durch eine PAPA-Sequenz beschrieben werden kann. Bei dieser handelt es sich um die zweimalige Abfolge von Photoionisation und Auger-Zerfall. Somit werden vier positive Ladungen im Molekül erzeugt. Das zweite Photon des XFEL wird dabei während der Dissoziation der sich Coulomb-abstoßenden Fragmente absorbiert, weshalb es sich um einen zweistufigen Prozess aus Anrege- und Abfrage- Schritt (Pump-Probe) handelt. Schlussendlich gelang zudem der Nachweis von Doppelinnerschalen-Vakanzen im Sauerstoff-Molekül nach Selektion des O2+/O2+- Aufbruchkanals. Hierfür konnten die beiden Möglichkeiten einer zweiseitigen oder einseitigen Doppelinnerschalen-Vakanz getrennt betrachtet werden und ebenfalls erstmalig das Verhalten der Elektronenemission dieser beiden Zustände verglichen werden.
Stellenwert der Teststreifen-basierten Analyse der INR für die Behandlung von Blutungskomplikationen
(2020)
Das Ziel der hier vorliegenden Studie war es einen Zusammenhang zwischen den Ergebnissen von konventioneller versus Teststreifen-basierter INR-Messung zu untersuchen und die Analysedauern der beiden Methoden zu vergleichen. Wir haben in dieser prospektiven Mono-Center Studie 24 hämorrhagische Patienten und Patientinnen inkludiert und aus infrastrukturellen Gesichtspunkten in zwei Gruppenkollektive aufgeteilt. Das eine Studienkollektiv bildeten 12 hämorrhagische Patientinnen der Klinik für Gynäkologie und Geburtshilfe des Universitätsklinikums Frankfurt. Die Blutproben dieser Patientinnen wurden mittels einem personengebundenen Transportdienst in das Zentrallabor der Universitätsklinik geliefert. Das zweite Gruppenkollektiv bildeten 12 Patienten aus dem Schockraum der zentralen Notaufnahme. Die Blutproben dieses Kollektivs wurden mittels Rohrpost direkt in das Zentrallabor übermittelt. Wir untersuchten mittels konventioneller Gerinnungsdiagnostik und mittels Teststreifen-basierter POC-Diagnostik (CoaguChek II Pro®, PT Test, Roche Diagnostics AG) die INR eines jeden Patienten. Zudem erfolgte die Erfassung von Transport- und Analysedauer. Für die Auswertung der Daten errechneten wir die Spearman-Korrelationskoeffizienten sowohl auf Gruppenebene als auch für das Gesamtkollektiv und führten eine Bland-Altman Analyse zum direkten Methodenvergleich durch.
Es zeigte sich, dass die mittels POCT ermittelte INR im Gesamtkollektiv signifikant mit den im Zentrallabor gemessenen Werten korreliert (r=0,79). Auch auf Gruppenebene zeigte sich in Gruppe 1 (Schockraum) r=0,91 und in Gruppe 2 (Kreißsaal) r=0,83 eine signifikante Korrelation. Die Bland-Altmann Analyse ergab, dass die Ergebnisse der Teststreifen-basierten POC-Methode um 0,082 (SD±0,19) niedriger waren als die Ergebnisse der konventionellen Gerinnungstests. Die Untersuchung der Analyse- und Transportzeiten brachte hervor, dass die Bereitstellungsdauer der POC-Messmethode signifikant kürzer war (2 (1,04/2,85) Minuten) als die Dauer bis zur elektronischen Ergebnisbereitstellung nach laboranalytischen Untersuchungen (58,2 (38,28/88) Minuten). Es ergab sich zudem, dass die Transportdauer mittels Rohrpost mit 8 (3,25/10,1) Minuten signifikant kürzer war als die des personengebundenen Transportdienstes 18,5 (14,5/33) Minuten (p<0,001).Die in der Studie ermittelten konsistenten Ergebnisse lassen vermuten, dass Teststreifen-basierte Systeme als Methoden zur Notfalldiagnostik hämorrhagischer Patienten geeignet sein können, weil ihre Messergebnisse verglichen mit der klassischen Gerinnungsdiagnostik im Zentrallabor deutlich schneller und mit vergleichbarer Ergebnisqualität vorliegen. Die Teststreifen-basierten Methoden können als diagnostische Elemente in Hämotherapie-Algorithmen eingesetzt werden und dazu beitragen, eine zeitnahe und zielgerichtete Hämotherapie umzusetzen, die sich positiv auf das klinische Ergebnis der Patienten auswirken kann.
Das Gehirn weist in mehreren Bereichen anatomische Asymmetrien zwischen beiden Hemisphären auf, so auch in Bereichen der Hörrinde. Zudem ist bereits langjährig bekannt, dass menschliche Sprache vorrangig in der linken Gehirnhälfte, d.h. linksseitig lateralisiert, verarbeitet wird. Daraus folgend stellt sich die Frage, ob dies eine besondere Spezialisierung ist, oder ob es noch weitere lateralisierte Hirnfunktionen gibt. Viele akustische Signale haben dabei frequenzmodulierte (FM) Komponenten, die im Hörsystem für die Erkennung nach Parametern wie Richtung und Dauer der Modulation analysiert werden müssen. Ob die Analyse von FM-Komponenten oder einzelner Reizparameter im Gehirn lateralisiert stattfindet, wurde in der Literatur meist mit bildgebenden Verfahren untersucht.
Für das Erkennen und Unterscheiden der Modulationsrichtung weist eine Vielzahl von Studien auf eine erhöhte Aktivität in der rechten Hörrinde hin. Für die Analyse von Stimulusdauern ist es bisher allerdings noch unklar bzw. umstritten, ob diese lateralisiert erfolgt. Für die Untersuchung der Lateralisierung einfacher Sprachkomponenten werden häufig Konsonant-Vokal-Silben (CV-Silben) verwendet. In einer Vielzahl von Studien konnte eine linkslastige Lateralisierung, wie bei der Spracherkennung, gezeigt werden.
In der vorliegenden Arbeit wurde nun untersucht, ob ein eindeutigeres Muster von Lateralisierung zu finden ist, wenn diese in Wahrnehmungsexperimenten, untersucht wird. Dabei wurde ein zu untersuchender Teststimulus (FM-/CV-Stimulus) auf einem Ohr mit einem kontralateralen breitbandigen Rauschen auf dem anderen Ohr gleichzeitig präsentiert. Durch die Struktur der Hörbahn kann dabei davon ausgegangen werden, dass in einer Hemisphäre des Vorderhirns vorrangig Informationen aus dem kontralateralen Ohr verarbeitet und Informationen aus dem ipsilateralen Ohr unterdrückt werden und sich somit Rückschlüsse auf die Funktion/Beteiligung einer Hemishpäre ziehen lassen. Das Rauschen diente dabei zur unspezifischen Aktivierung der gegenüberliegenden Hemisphäre.
Die Lateralisierung wurde systematisch für unterschiedlich komplexe Reize untersucht. Dazu wurden in zwei Versuchsreihen Unterscheidungsexperimente durchgeführt, die sich in mehrere Messungen (mit mehreren Durchläufen) mit unterschiedlichen Parametereinstellungen gliederten. Pro Durchlauf musste sich die Versuchsperson immer zwischen zwei Antwortmöglichkeiten entscheiden (2-AFC-Verfahren). Der Schalldruckpegel des Rauschens war dabei für alle Messungen konstant. Der Schalldruckpegel der Teststimuli blieb zwar während einer Messung konstant, wurde jedoch innerhalb eines Experimentes von Messung zu Messung reduziert.
In einer gemeinsamen Analyse wurden jeweils die Fehlerraten und Reaktionszeiten beider Ohren, getrennt nach Seite und FM-/ CV-Stimulus, miteinander verglichen, um so auf eine mögliche Lateralisierung schließen zu können. Damit die Daten der Versuchspersonen bei vergleichbarer Schwierigkeit analysiert werden konnten, wurde als Vergleichswert zwischen allen Versuchspersonen der Schalldruckpegel der ersten Messung mit einer Fehlerrate von mindestens 15,0 % gewählt (15 %-Kriterium). Um auszuschließen, dass das Hörvermögen der Versuchspersonen Unterschiede zwischen beiden Ohren aufweist, wurde vor jeder Messung der „Punkt subjektiver Gleichheit“ für die Lautstärke-wahrnehmung zwischen linkem und rechten Ohr bestimmt.
In der ersten Versuchsreihe wurde dabei die Verarbeitung der Modulationsrichtung und der Stimulusdauer von FM-Stimuli untersucht. Es zeigte sich für beide Experimente, dass ein sinkender Schalldruckpegel des FM-Stimulus zu einer steigenden Fehlerrate führte. Unter Anwendung des 15 %-Kriteriums waren die Fehlerraten für die Unterscheidung der Modulationsrichtung signifikant geringer, wenn der FM-Stimulus auf dem linken Ohr präsentiert wurde. Dies ist ein deutlicher Hinweis für eine rechtslastige Lateralisierung.
Für die Unterscheidung der Stimulusdauer gab es dagegen keinen signifikanten Unterschied zwischen den Fehlerraten beider Ohren. Somit muss davon ausgegangen werden, dass beide Hemisphären für diese Aufgabe benötigt werden und eine bilaterale Verarbeitung stattfindet. In den Reaktionszeiten konnten in beiden Experimente keine signifikanten Unterschiede gezeigt werden. Die Unterscheidung der Modulationsrichtung wurde dabei von allen Versuchspersonen als einfacher eingestuft als die Unterscheidung der Stimulusdauer, was sich auch in niedrigeren Antwortschnelligkeit und Fehlerraten bei vergleichbaren Schalldruckpegeln zeigte.
In der zweiten Versuchsreihe wurde als Referenzmessung nochmals die Unterscheidung der Modulationsrichtungen von FM-Stimuli durchgeführt. Anschließend wurde die Unterscheidung von „da“ und „ga“ untersucht. Diese CV-Silben differieren ausschließlich in der FM-Komponente. Die Untercheidung von CV-Silben ohne Unterschied in der FM-Komponente wurde mittels „ta“ und „ka“ getestet. Für alle drei Experimente zeigte sich, dass ein geringerer Schalldruckpegel des FM- oder CV-Stimulus zu einer steigenden Fehlerrate führte. Unter Anwendung des 15 %-Kriteriums zeigte sich für die Unterscheidung der Modulationsrichtung ein Trend zu niedrigeren Fehlerraten bei der Präsentation des FM-Stimulus auf dem linken im Vergleich mit dem rechten Ohr. In den Reaktionszeiten konnten keine signifikanten Unterschiede gezeigt werden.
Für die Unterscheidung von „da“ und „ga“ ließ sich unter Anwendung des 15 %-Kriteriums in den Fehlerraten und Reaktionszeiten kein Vorteil eines Ohres nachweisen. Dagegen zeigten sich klare Unterschiede bei einzelnen Versuchspersonen. So waren die Fehlerraten für Versuchspersonen, die vorwiegend „da“ erkannt bzw. gehört hatten signifikant höher, wenn der CV-Stimulus auf dem rechten Ohr präsentiert wurde, für „ga“-Hörer war das Gegenteil der Fall. In den Reaktionszeiten konnte kein signifikanter Zusammenhang nachgewiesen werden. Somit ließ sich zeigen, dass je nach Strategie der Versuchsperson bzw. deren individueller Wahrnehmung der CV-Silben, Unterschiede in der Lateralisierung erreicht werden können.
Für die Unterscheidung von „ta“ und „ka“ zeigten sich unter Anwendung des 15 %-Kriteriums signifikant niedrigere Fehlerraten und Reaktionszeiten, wenn der CV-Stimulus auf dem linken Ohr präsentiert wurde. Dies weist deutlich auf eine rechtslastige Lateralisierung hin. Vergleicht man alle drei Experimente ließ sich zudem zeigen, dass die Unterscheidung der Modulationsrichtung einfacher war als die Unterscheidung verschiedener CV-Stimuli. Dabei war die Unterscheidung von „da“ und „ga“ für die Versuchspersonen schwieriger als die Unterscheidung von „ta“ und „ka“. Allerdings konnte in den Lateralisierungsdaten kein direkter Zusammenhang zwischen den FM- und „da“-/„ga“-Stimuli gezeigt werden.
Zusammenfassend konnte in allen fünf Experimenten eine verschieden stark lateralisierte Verarbeitung von akustischen Stimuli bei gleichzeitigem kontralateralen Rauschen gezeigt werden. Der Vorteil eines Ohres (bzw. einer Hemisphäre) war sowohl von der Aufgabe als auch vom Stimulustyp abhängig. Dabei gab es zum Teil starke Unterschiede in der Effektstärke und dem Grad der Lateralisierung zwischen den einzelnen Versuchspersonen. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass sich die hier angewendete psychophysische Methode gut eignet, um Ergebnisse zur Lateralisierung von akustischen Stimuli zu gewinnen und somit die Verhaltensrelevanz von Ergebnissen aus Studien mit bildgebenden Verfahren zu überprüfen.
The application of natural products (NPs) as drugs and lead compounds has greatly improved human health over the past few decades. Despite their success, we still need to find new NPs that can be used as drugs to combat increasing drug resistance via new modes of action and to develop safer treatments with less side effects.
Entomopathogenic bacteria of Xenorhabdus and Photorhabdus that live in mutualistic symbiosis with nematodes are considered as promising producers of NPs, since more than 6.5% of their genomes are assigned to biosynthetic gene clusters (BGCs) responsible for production of secondary metabolites. The investigation on NPs from Xenorhabdus and Photorhabdus can not only provide new compounds for drug discovery but also help to understand the biochemical basis involved in mutualistic and pathogenic symbiosis of bacteria, nematode host and insect prey.
Nonribosomal peptides (NRPs) are a large class of NPs that are mainly found in bacteria and fungi. They are biosynthesized by nonribosomal peptide synthetases (NRPSs) and display diverse functions, representing more than 20 clinically used drugs. Although a large number of NRPs have been identified in Xenorhabdus and Photorhabdus, the advanced genome sequencing and bioinformatic analysis indicate that these bacteria still have many unknown NRPS-encoding gene clusters for NRP production that are worth to explore. Therefore, this thesis focuses on the discovery, biosynthesis, structure identification, and biological functions of new NRPs from Xenorhabdus and Photorhabdus.
The first publication describes the isolation and structure elucidation of seven new rhabdopeptide/xenortide-like peptides (RXPs) from X. innexi, incorporating putrescine or ammonia as the C-terminal amines. Bioactivity testing of these RXPs revealed potent antiprotozoal activity against the causative agents of sleeping sickness (Trypanosoma brucei rhodesiense) and malaria (Plasmodium falciparum), making them the most active RXP derivatives known to date. Biosynthetically, the initial NRPS module InxA might act iteratively with a flexible methyltransferase activity to catalyze the incorporation of the first five or six N-methylvaline/valine to these peptides.
The second publication focuses on the structure elucidation of seven unusual methionine-containing RXPs that were found as minor products in E. coli carrying the BGC kj12ABC from Xenorhabdus KJ12.1. To confirm the proposed structures from detailed HPLC-MS analysis, a solid-phase peptide synthesis (SPPS) method was developed for the synthesis of these partially methylated RXPs. These RXPs also exhibited good effects against T. brucei rhodesiense and P. falciparum, suggesting RXPs might play a role in protecting insect cadaver from soil-living protozoa to support the symbiosis with nematodes.
The third publication presents the identification of a new peptide library, named photohexapeptide library, which occurred after the biosynthetic gene phpS was activated in P. asymbiotica PB68.1 via promoter exchange. The chemical diversity of the photohexapeptides results from unusual promiscuous specificity of five out of six adenylation (A) domains being an excellent example of how to create compound libraries in nature. Furthermore, photohexapeptides enrich the family of the rare linear D-/L-peptide NPs.
The fourth publication concentrates on the structure elucidation of a new cyclohexapeptide, termed photoditritide, which was produced by P. temperata Meg1 after the biosynthetic gene pdtS was activated via promoter exchange. Photoditritide so far is the only example of a peptide from entomopathogenic bacteria that contains the uncommon amino acid homoarginine. The potent antimicrobial activity of photoditritide against Micrococcus luteus implies that photoditritide can protect the insect cadaver from food competitor bacteria in the complex life cycle of nematode and bacteria.
The last publication reports a new family of cyclic lipopeptides (CLPs), named phototemtides, which were obtained after the BGC pttABC from P. temperata Meg1 was heterologously expressed in E. coli. The gene pttA encodes an MbtH protein that was required for the biosynthesis of phototemtides in E. coli. To determine the absolute configurations of the hydroxy fatty acids, a total synthesis of the major compound phototemtide A was performed. Although the antimalarial activity of phototemtide A is only weak, it might be a starting point towards a selective P. falciparum compound, as it shows no activity against any other tested organisms.
Diese Arbeit etabliert eine nicht-invasive, volloptische Methode zur in-vivo Beobachtung des Membranpotentials in erregbaren Zellen des Fadenwurms C. elegans, die als Ersatz oder komplementär zu invasiven, elektrophysiologischen Methoden verwendet werden kann.
In this thesis different descriptions for the non-Abelian Landau-Pomeranchuk-Migdal (LPM) effect are studied within the partonic transport approach BAMPS (Boltzmann Approach to Multi-Parton Scatterings), which numerically solves the 3+1-dimensional Boltzmann equation for massless partons based on elastic and radiative interactions calculated in perturbative quantum chromodynamics.
The LPM effect is a coherence effect originating from the finite formation time of gluon emissions leading to characteristic dependencies of the radiative energy loss of energetic partonic projectiles, as e.g. jets in ultra-relativistic heavy-ion collisions.
Due to this non-locality of interactions, such coherence effects are difficult to describe rigorously in transport theory.
Therefore we compare in this work three different implementations for the LPM effect: i) a parametric LPM suppression based on a theta function in the radiative matrix elements, ii) a stochastic LPM approach, which explicitly simulates the elastic interactions of gluons during their formation time, and iii) the thermal gluon emission rate from the AMY formalism, which is a hard-thermal-loop calculation exactly considering the non-Abelian LPM effect by resumming ladder diagrams in the large medium limit.
After discussing the numerical implementation of the three approaches, we investigate their consequences in different jet-energy loss scenarios: first the academic scenarios of eikonal and non-eikonal jets flying through a static brick of thermal quark-gluon plasma and then jets traversing the expanding medium of ultra-relativistic heavy-ion collisions at LHC energies.
We can demonstrate that although the different LPM approaches show similarities in the radiative energy loss there are differences in the underlying gluon emission spectra, which originate from the specific treatment of divergences in the matrix elements within BAMPS.
Furthermore, based on the different LPM approaches we present simulation results for recent jet quenching observables from the LHC experiments and discuss properties of the underlying heavy-ion medium.
Bei der Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätsstörung (ADHS) handelt es sich um eine hochprävalente Erkrankung, die bisher insbesondere im Erwachsenenalter nur unzureichend berücksichtigt wurde. Neben den Kernsymptomen bestehend aus Einschränkungen in der Aufmerksamkeit sowie einem erhöhten Maß an Hyperaktivität und Impulsivität gilt es, Komorbiditäten und Beeinträchtigungen zu berücksichtigen, die mit dieser Erkrankung einhergehen. In früheren Studien konnte bereits nachgewiesen werden, dass sowohl Kinder als auch Erwachsene mit einer ADHS vermehrte Unfälle und infolgedessen eine erhöhte Rate an stationären Behandlungen aufweisen. Zusätzlich besteht bei ADHS-Betroffenen ein höheres Risiko, frühzeitig zu versterben, wobei Unfälle als unnatürliche Todesursache den häufigsten Grund darstellen. Bisher existieren auf internationaler Ebene einige Studien, die sich mit den Zusammenhängen von adulter ADHS und Unfallraten beschäftigten. Eine differenzierte Betrachtung, die eine deutsche Population einschließt und den Einfluss des Geschlechts auf das Unfallgeschehen bei ADHS-Betroffenen untersucht, wurde bisher nicht realisiert. Aus diesen Gründen führten wir eine Querschnittsstudie auf unfallchirurgischen Stationen an zwei Kliniken in Frankfurt am Main durch. Im Rahmen der Studie sollte die Prävalenz von adulter ADHS bei stationär betreuten Unfallopfern ermittelt und mögliche unfallcharakteristische Unterschiede zwischen den Geschlechtern der ADHS-Positivkohorte erfasst werden.
Mithilfe der etablierten Adult ADHD Self-Report Scale (ASRS v1.1) der WHO wurden alle Unfallopfer, die den Einschlusskriterien entsprachen, auf adulte ADHS gescreent. Bei der Auswertung des ASRS verwendeten wir zwei unterschiedliche Methoden, die bereits in früheren Studien zur Anwendung kamen. Durch einen eigens erstellten Unfallfragebogen konnten Unfallcharakteristika sowie psychische Komorbiditäten der ADHSPositivkohorte erfasst werden. Zusätzlich erhoben wir zum Vergleich die Unfallcharakteristika bei einer nicht von ADHS betroffenen Kontrollgruppe. Bei einem Teil der positiv gescreenten Patienten wurde eine ausführliche Testung in der ADHS Spezialambulanz des Universitätsklinikums Frankfurt am Main vorgenommen. Mittels diagnostischer Interviews und weiteren Selbstauskunftsfragebögen (DIVA, HASE) konnte eine definitive ADHS-Diagnose gestellt und das positive Screeningergebnis verifiziert werden.
Wir stellten fest, dass die Prävalenz adulter ADHS unter Unfallopfern mit 6,89 % bzw. 8,68 % in Abhängigkeit der ASRS Auswertungskriterien im Vergleich zu der Prävalenz der adulten ADHS in der Allgemeinbevölkerung erhöht war. Des Weiteren gab es mehr Männer mit einem positiven ADHS-Screeningergebnis und einem Unfallgeschehen. Es konnten keine signifikanten geschlechtsspezifischen Unterschiede in den Unfallcharakteristika und Unfallorten in der ADHS Positivkohorte festgestellt werden. Auch in dem Vorhandensein psychischer Komorbiditäten unterschieden sich die beiden Geschlechtergruppen der ADHS-Positivkohorte nicht. Unabhängig der Geschlechterzugehörigkeit wurden die meisten Unfälle der ADHS-Positivkohorte im Straßenverkehr verzeichnet und als selbstverschuldet eingestuft. Es konnten signifikant mehr Unfälle außerhalb des Straßenverkehrs in der nicht von ADHS betroffenen Kontrollgruppe im Vergleich zu der ADHS Positivkohorte nachgewiesen werden. Insgesamt war nur bei 14 % aller positiv gescreenten Patienten eine ADHS-Erkrankung bereits bekannt und diagnostiziert worden.
Auf Grundlage der Ergebnisse dieser Studie lässt sich schlussfolgern, dass Menschen mit einer ADHS-Symptomatik vermehrt auf unfallchirurgischen Stationen anzutreffen sind und im Einklang mit früheren Forschungsergebnissen ein erhöhtes Unfall- und Verletzungsrisiko aufweisen. Darüber hinaus folgern wir aus unseren Ergebnissen, dass sich Männer und Frauen mit einer ADHS-Erkrankung hinsichtlich Symptomatik, Komorbidität und spezifischer Unfallcharakteristika ähnlicher sein könnten, als dass sie sich in diesen Bereichen unterscheiden. Im Hinblick auf die geringen vorbestehenden ADHS-Diagnosen in der Positivkohorte erscheint eine Etablierung eines Screeningsystems bei Patienten sinnvoll, die im Rahmen von Unfallgeschehen gehäuft stationär betreut werden müssen. Da ADHS-Betroffene ein erhöhtes Risiko für multiple Unfälle zu haben scheinen, könnte unter diesen Voraussetzungen eine adulte ADHS-Symptomatik früher erkannt und negative Folgen wie eine erhöhte Unfallrate reduziert werden. Methodologische Limitierungen bestanden in unserer Erhebung durch eine geringe Anzahl an ausführlichen Testungen zur Verifizierung der ADHS-Diagnose sowie dem Informationsgewinn auf der Basis einer Selbstauskunft. Um Ergebnisse aussagekräftiger zu gestalten und auch kleinere Unfälle zu erfassen, erscheint eine Ausweitung der Testung in Ambulanzen sinnvoll.
Chronic inflammation is considered to be a cause of the autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, Alzheimer’s disease, multiple sclerosis, etc. The search for effective compounds with anti-inflammatory properties to combat these diseases is still ongoing. Natural compound narciclasine, derived from plants of Narcissus species, demonstrated its anti-inflammatory activity in in vivo arthritis models. Further investigation of narciclasine’s anti-inflammatory activity together with its impact on the interaction between leukocytes and endothelial cells was the main focus of this PhD thesis.
Narciclasine reduced the infiltration of monocytes and neutrophils to the abdomen and the concentration of the pro-inflammatory cytokines TNF, IL-6 and IL-1β. Together with this, it reduced acute visceral pain caused by zymosan injection. Narciclasine interfered with leukocyte-endothelial cell interaction in both in vivo and in vitro models. In vivo microscopy revealed that the compound reduced rolling, adhesion and transmigration of leukocytes in the vessels of an injured murine cremaster muscle. This observation was confirmed in the in vitro models for adhesion and transmigration where narciclasine reduced the level of leukocyte’s interaction with HUVECs. Narciclasine demonstrated profound anti-inflammatory properties based on its interference with leukocyte-endothelium interaction by downregulation of endothelial cell adhesion molecules expression (ICAM-1, VCAM-1, E-selectin, CX3CL1) and shutdown of NF-κB pathway. All these effects were a result of the TNF receptor 1 protein translation blocking by narciclasine.
In this work the ability of the compound to reduce visceral pain, downregulate the expression of the endothelial cell adhesion molecules and to interfere with the interaction between leukocytes and endothelial cells was demonstrated for narciclasine for the first time. Obtained results open a promising insight into the understanding of narciclasine’s anti-inflammatory properties and justify further investigation of its potential for treatment of inflammatory diseases.
In der durchgeführten Studie erfolgte die Untersuchung des visuellen Arbeits-gedächtnisses von bipolaren Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen. Es erfolgten bereits viele Untersuchungen an Patienten mit bipolarer Störung. Wird das Hauptaugenmerk auf die kognitiven Funktionen der Patienten gelegt, so konnte bereits in einigen Studien gezeigt werden, dass nicht nur in depressi-ver oder manischer, sondern auch in euthymer Stimmungslage kognitive Defizi-te vorliegen. Zur näheren Untersuchung der Funktionen des visuellen Arbeits-gedächtnisses der Patienten mit bipolarer Störung wurde daher eine fMRT-Untersuchung durchgeführt. Hier wurden Patienten, die an bipolarer Störung erkrankt sind, mit gesunden Kontrollen verglichen. Dabei wurden die bipolaren Patienten in euthymer Stimmungslage untersucht. Weder in Antwortrichtigkeit noch Reaktionsgeschwindigkeit konnte ein signifikanter Gruppenunterschied nachgewiesen werden. Außerdem wurde in der Untersuchung eine Differenzie-rung zwischen den einzelnen Phasen gemacht, die eine Gedächtnisinformation durchläuft. Bei diesen Phasen handelt es sich um Enkodierungs-, Halte- und Abrufphase. Hierbei konnten veränderte Aktivierungsmuster an diversen Hirn-strukturen der bipolaren Patienten dargestellt werden. Diese Veränderungen ziehen sich durch alle drei Phasen der Gedächtniskonsolidierung und können vor allem im präfrontalen Kortex nachgewiesen werden. Es handelt sich dabei vor allem um eine schwächere Aktivierung des präfrontalen Kortex (PFC) der bipolaren Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen. Unter anderem ist das Arbeitsgedächtnis im PFC lokalisiert. Diese Ergebnisse scheinen ein Hin-weis dafür zu sein, dass bei den bipolaren Patienten neuronale Defizite im visu-ellen Arbeitsgedächtnis vorliegen.
Light is one of the most important abiotic factors for plant physiological processes. In addition to light intensity, the spectral quality of light can also influence the plant morphology and the content of secondary metabolites. In the horticultural industry, artificial light is used in to enable year-round production of herbs, ornamental plants and vegetables in winter terms.
Until today, discharge lamps like high-pressure sodium (HPS) lamps, emitting predominantly orange and red light and high amounts of infrared radiation, are the most common lamp systems in greenhouses. In the last decades, light-emitting diodes (LEDs) emerged as an efficient alternative light source. LEDs have the advantage of distinct adjustments to the light spectrum. For a usage in horticultural industry LEDs are often too expensive. Furthermore, reduced plant growth can occur due to incorrectly adjusted light spectra and lower leaf temperatures caused by the lack of infrared radiation.
In a research project (LOEWE, funding no. 487/15-29) funded by the Hessen State Ministry of Higher Education, Research and Arts, Microwave plasma lamps (MPL) were tested as new light sources for horticultural industry and plant research. The electrodeless lamp systems emit light in similar properties like sun light. The aim of the study was to determine the influence of artificial sunlight of the MPL on the accumulation of secondary metabolites, plant architecture and plant physiology of three different species (coleus, basil and potted roses). The MPL was compared with other light systems such as commercial HPS lamps, LEDs or ceramic metal halide lamps (CDM). In addition to morphological parameters such as plant height, internode length or fresh and dry weight, the phenolic content of leaves grown under the respective light sources were examined.
Overall an increased far-red light content in the emission spectra of the MPL showed high influence on the plant architecture which was observed in all three plant species. Artificial sunlight from MPL induced stem elongation in coleus and basil plants, compared to the other tested light sources. In potted roses a reduced branching degree was observed under MPL light compared to HPS grown plants.
In addition to the impact of far-red light also the blue light content of the emission spectra was found to be a strong influencing factor for plant physiological processes. A positive correlation between blue light content and leaf thickness was determined in coleus cultivated under MPL, LED, HPS and CDM lamps. Low blue light content in HPS emission spectra resulted in shade-adapted leaves with low photosynthetic capacity and susceptibility to high irradiances. Blue light was assumed to increase phenolic metabolites in basil and rose leaves. Furthermore, the different light treatments resulted in an alteration of the composition of essential oils of basil.
Experiments with coleus plants demonstrated that besides light color also the infrared radiation, had an influence on secondary metabolites by causing different leaf temperatures. Coleus plants grown with MPL showed the lowest content of phenolic compounds such as rosmarinic acid per dry weight. Infrared radiation resulted in a faster plant development indicated by increased biomass production and higher leaf formation rate as observed in coleus and basil plants.
The results obtained in this study show that the influence of leaf temperature should always be considered when comparing different lamp systems. Especially when LEDs are compared to discharge lamps an overestimation of light color can be a consequence since also infrared radiation influences the content of phenolic compounds and plant growth.
The early-diverging oomycetes contain a large number of holocarpic obligate parasites of diatoms, algae, aquatic phycomycetes, and invertebrate animals. These organisms are diverse and widespread. However, taxonomic placement most of the early-diverging oomycetes remains provisional and unresolved, since many have not been sequenced and studied for molecular phylogeny. Here, we report the taxonomy and phylogeny of several holocarpic oomycetes that we have rediscovered and newly classified, including several new species combinations. Phylogenetic reconstructions revealed that the type species of genus Ectrogella (E. bacillariacearum) is a member of the early-diverging Saprolegniales, while the type species of Olpidiopsis (O. saprolegniae) and Pontisma (P. lagenidioides) grouped within the early-diverging lineage of oomycetes forming distinct clades. Since the monophyletic red-algae parasitoids are unrelated to the Olpidiopsis, these were reclassified to the genus Pontisma, while genus Diatomophthora was introduced to accommodate all the diatom parasitoids that were previously assigned to Olpidiopsis. In addition, four new oomycete parasitoids, Miracula helgolandica, Miracula moenusica, Diatomophthora drebesii and Olpidiopsis parthenogenetica and a single rediscovered species, Diatomophthora gillii, are also classified here, including eight new species combinations of red-algae parasites (Pontisma bostrychiae, P. heterosiphoniae, P. muelleri, P. palmariae, P. porphyrae, P. pyropiae) and diatom parasitoids (Diatomophthora drebesii, D. gillii). The results obtained in this study have further improved the resolution and expanded the knowledge on the phylogeny of the earlydiverging oomycetes, leading to the establishment of three new orders (Miraculales, Diatomophthorales, Pontismatales) and one order (Anisolpidiales) being reintroduced.
Mit der COLTRIMS-Technik können immer kompliziertere Reaktionen untersucht werden, dabei steigt aber die Zahl der zu detektierenden Reaktionsfragmente. Der Nachweis von Ionen ist üblicherweise gut möglich, da die entsprechenden Flugzeiten groß sind im Vergleich zur Totzeit der benutzten Detektoren. Elektronen hingegen sind sehr leicht und erreichen den Detektor innerhalb von wenigen 10 ns. Aktuelle Detektoren erlauben aber nur den Nachweis weniger Elektronen und es werden somit neue Detektoren benötigt, um alle Teilchen nachzuweisen. Ziel dieser Arbeit war es also, einen Detektor zu entwickeln, der dies erreicht.
Zu Beginn dieser Monografie wird die COLTRIMS-Technik vorgestellt. Die Experimente mit dieser Messmethode finden hauptsächlich mit einer Laufzeitanode statt. Diese stößt aber bei dem Nachweis von mehreren Teilchen an ihre Grenzen und manche Experimente können nur unvollständig analysiert werden.
Damit ein neuer Detektor entwickelt werden kann, muss erst verstanden werden, wie die zu detektierenden Teilchen/Signale entstehen und wie ihre Eigenschaften sind. Aus diesem Grund wird das Sekundärteilchen-erzeugende MCP ausführlich vorgestellt.
Weiterhin gibt diese Arbeit einen umfassenden Überblick über bereits realisierte Anoden. Verschiedene Repräsentanten der fünf Anodenarten (Flächen-, Streifen-/Pixel-, Laufzeit-, Kamera-, sowie Halbleiter-Anode) werden vorgestellt und bewertet.
Mit diesem Wissen konnten drei Ansätze für neue Anoden entwickelt, designt, produziert, getestet und bewertet werden. Alle neu entwickelten Anoden benutzen Leiterplatinen als Basis und werden in derselben Vakuumkammer getestet. Auch wenn die Detektionsprinzipien der drei getesteten Detektoren unterschiedlich sind, so verläuft die Auskopplung, Verarbeitung und Digitalisierung der Signale nach dem gleichen Schema. Außerdem wurden im Rahmen dieser Arbeit diverse Algorithmen entwickelt und programmiert, mit deren Hilfe die Signalauswertung und Positionsbestimmung erfolgt.
Das dritte Kapitel beschreibt die neu entwickelte Draht-Harfen-Anode. Dieser Detektor besteht aus vielen kurzen Drähten die parallel auf Rahmen aus Leiterplatinen gespannt werden. Aus dieser Anode ließ sich im Rahmen dieser Arbeit aber kein funktionsfähiger Detektor entwickeln und es wird empfohlen, diesen Ansatz nicht weiterzuverfolgen.
Im Kapitel über die Pixel-Anode mit Streifenauslese wird ein Ansatz vorgestellt, bei dem die Elektronenwolke von einem Muster aus leitenden Rauten absorbiert wird. Es wurde ein funktionsfähiger Detektor mit MAMA-Verschaltung realisiert. Die aktive Fläche ist mit einem Durchmesser von 50 mm aber zu klein. Eine große Variante der Anode ist in der realisierten Form aber nicht als Detektor geeignet.
Als dritter neuer Detektor wird die Streifen-Laufzeit-Anode beschrieben. Diese besteht aus einem rechteckigen Muster von Pixeln, die in einer Richtung über eine Zeitverzögerung ausgelesen werden. Dieser Ansatz ist sehr vielversprechend und es ließen sich nicht nur einzelne Teilchen nachweisen, sondern auch beim Aufbruch eines D2+-Moleküls konnten beide Fragmente gemessen werden.
Das letzte Kapitel befasst sich mit weiteren Konzepten, die als Detektor realisiert werden könnten.
Historic amphibian settlements in the northwestern Nile delta - a geoarchaeological perspective
(2020)
No concise picture of the archaeological and palaeoecological evolution can be drawn for the northwestern Nile delta, and archaeological records show significant population dynamics that still need explanation and spur the need for further palaeoenvironmental research. This study delivers a set of new methods especially in the fields of remote sensing and data analytics that can be regarded as important milestones and foundations for further palaeoenvironmental research in the area. Additionally, it shows new insights for individual time slices.
This geoarchaeological project is a cooperation with the archaeological excavations of the German Archaeological Institute (DAI) in Buto and Kom el’Gir. It expands the work of Wunderlich (1989) which laid important foundations in understanding the origin of the initial landscape that was later colonized in different cultural stages showing different dynamics, settlement intensities and even long phases of abandonment or breaks in between. This forms the starting point for relating the population dynamics of the different cultural phases reaching from Predynastic (prior to 3150 before Christ) up to the Greco-Roman era (~anno Domini 650) to the environmental history and events that occurred in the area. It is very likely that environmental changes such as the shifting of major water routes, inundation or paludification of larger areas or other environmental events affected settlements and human life in the area.
In the fields of remote sensing new methods are presented to complete information on the location of ancient settlements, and complex workflows are developed that allow the tracing of subsurface structures via indirect analysis of vegetation growth in larger time series data. It was verified that a relationship exists between vegetation performance, the appearance of archaeologic material in the topsoil, and the location of former Nile river branches.
Together with a new high resolution digital elevation model (DEM) based on TanDEM-X data, new interpretations with a high spatial significance are possible. For individual time slices, namely the Late Dynastic and Greco-Roman era, this work delivers a detailed landscape description suggesting a finely ramified subdelta, with all settlements placed on alluvial levees. This explains the massive increase in settlements in the Ptolemaic, Roman and in particular late Roman periods (4th century before Christ – anno Domini 7th century).
We sampled the Nile delta clays together with the channels and the material of the archaeologic excavations in vibracores and profile walls. This geologic inspection of the subsurface together with geochemical results from a handheld portable X-ray fluorescence device (pXRF) allowed new interpretations of the landscape and environmental history. For example, we used geochemical data to distinguish between artificial and natural channels as a measure for the anthropogenic influence, a proxy for past environmental characteristics and lastly as a basis for a new dating method. Many of the channels, for instance, were dated by our own 14C datings, comparisons with the previous work ofWunderlich (1989) and application of new dating approach based on machine learning with artificial neural networks. Additionally, we run a full methodological approach, and examine the applicability of pXRF methods in general, and test the quality of the data to detect distinct geochemical differences between the main settlement phases with advanced methods in data analytics. The dating is based, for example, on the training of artificial neural networks with pXRF data from archaeological material of well-dated context to date test data of cultural layers within the vibracores. With this method the homogeneous Nile alluvium, cultural layers and channels can be dated roughly and, as a result, fundamental changes in the landscape can be linked with the settlement history of Buto and neighboring tells.
This thesis discusses important questions of the beam dynamics in the proton-lead operation in the Large Hadron Collider (LHC) at CERN in Geneva. In two time blocks of several weeks in the years 2013 and 2016, proton-lead collisions have so far been successfully generated in the LHC and used by the experiments at the LHC. One reason for doubts regarding the successful operation in proton-lead configuration was the fact that the beams have to be accelerated with different revolution frequencies. There is long-range repulsion between the beams, since both beams share the beam chamber around the interaction points. Because of the different revolution frequencies, the positions of the interaction between the beams shift each revolution. This can lead to resonant excitation and to an increase in the transverse beam emittance, as was observed in the Relativistic Heavy-Ion Collider (RHIC). In this thesis, simulations for the LHC, RHIC and the High-Luminosity Large Hadron Collider (HL-LHC) are performed with a new model. The results for RHIC show relative growth rates of the emittances of the gold beam in gold-deuteron operation in RHIC from 0.1 %/s to 1.5 %/s. Growth rates of this magnitude were observed experimentally in RHIC. Simulations for the LHC show no significant increase of the emittance of the lead beam for different intensities of the counter-rotating beam. The simulation results confirm the measured stability of the beams in the LHC and the issue of strongly increasing emittances in RHIC is reproduced. Also, no significant increase of the emittance is predicted for the Future Circular Collider (FCC) and the HL-LHC.
Using a frequency-map analysis, this work verifies whether the interaction of the lead beam with the much smaller proton beam in the proton-lead operation of the LHC leads to diffusion within the lead beam. Experiences at HERA at DESY in Hamburg and at SppS at CERN have shown that the lifetime of the larger beam can rapidly decrease under certain circumstances. The results of the simulation show no chaotic dynamics near the beam centre of the lead beam. This result is supported by experimental observation.
A program code has been developed which calculates the beam evolution in the LHC by means of coupled differential equations. This study shows that the growth rates of the lead beam due to intra-beam scattering is overestimated and that particle bunches of the lead beam lose more intensity than assumed in the model. The analysis also shows that bunches colliding in a detector suffer additional losses that increase with decreasing crossing angle at the interaction point.
In this work, 2016 data from beam-loss monitors in combination with the luminosity and the loss rate of the beam intensity are used to determine the cross section of proton-lead collisions at the center-of-mass energy of 8.16 TeV. Beam-loss monitors that mainly detect beam losses that are not caused by the collision process itself are used to determine the total cross section via regression. An analysis of the data recorded in 2016 at the center-of-mass energy of 8.16 TeV resulted in a total cross section of σ=(2.32±0.01(stat.)±0.20(sys.)) b. This corresponds approximately to a hadronic cross section of σ(had)=(2.24±0.01(stat.)±0.21(sys.)) b. This value deviates only by 5.7 % from the theoretical value σ(had)=(2.12±0.01) b.
The simulation code for determining the beam evolution is also used to estimate the integrated luminosity of a future one-month run with proton-lead collisions. The result of the study shows that in the future the luminosity in the ATLAS and CMS experiments will increase from 15/nb per day in 2016 to 30/nb per day, which is a significant increase in terms of the performance. This operation, however, requires the use of the TCL collimators to protect the dispersion suppressors at ATLAS and CMS from collision fragments.
This work also gives an outlook on the expected luminosity production in proton-nucleus operation using ion species lighter than lead ions. For example, a change from proton-lead to proton-argon collisions would increase the integrated luminosity from monthly 0.8/nb to 9.4/nb in ATLAS and CMS. This is an increase of one order of magnitude and approximately a doubling of the integrated nucleon-nucleon luminosity. There may be a test operation with proton-oxygen collisions in 2023, which will last only a few days and will be operated with a low luminosity. The LHCf experiment (LHCb experiment) would achieve the desired integrated luminosity of 1.5/nb (2/nb) within 70h (35h) beam time.
The innate immune system is the first line of host defense that senses invading pathogens by various surveillance mechanisms, involving pattern recognition receptors (PRRs) such as Toll-like receptors (TLRs). Furthermore, in response to stress, tissue injury or ischemia, cells release endogenous danger-associated molecular patterns (DAMPs) which activate PRRs in order to prompt an effective immune response. Activation of PRRs by DAMPs initiates signaling transduction pathways which drive sterile inflammation by the production of pro-inflammatory effector molecules. Biglycan, a class I small leucine-rich proteoglycan (SLRP), is proteolytically released from the extracellular matrix (ECM) in response to tissue stress and injury or de novo synthesized by activated macrophages. In its soluble form, biglycan operates as an ECM-derived DAMP and triggers a potent inflammatory response by engaging TLR2 and TLR4 on immune cells. By selective utilization of TLR2/4 and the TLR adaptor molecules adaptor molecule myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88) or TIR domain-containing adaptor-inducing interferon-β (TRIF) biglycan differentially regulates the production of TLR downstream mediators or inflammatory molecules. In this way, biglycan triggers the activation of mitogen-activated protein kinase (MAPK) p38, extracellular signal-regulated kinase (Erk) and nuclear factor kappa-light-chain enhancer of activated B cells (NF-κB) in a primarily MyD88-dependent manner. In contrast, biglycan induces the expression of (C–C motif) ligand (CCL)5 and chemokine (C-X-C motif) ligand (CXCL)10 over TLR4/TRIF, heat shock protein 70 (HSP70) production over TLR2 and the synthesis of tumor necrosis factor (TNF)-α, CCL2 and CCL20 by utilizing TLR2/4/MyD88. As a consequence, biglycan promotes the recruitment of immune cells such as neutrophils, T cells, B cells and macrophages into the inflamed tissue. Research over the past years showed that biglycan-induced inflammation is involved in the pathogenesis of various inflammatory diseases such as lupus nephritis (LN), sepsis and renal ischemia/reperfusion injury (IRI), whereby genetic deletion of biglycan or TLR2/4 alleviated disease outcome. Unfortunately, the selective interaction of biglycan to TLRs and TLR adaptors complicates the identification of an efficient pharmacological target in biglycan-mediated inflammation. Yet, the necessity of possible co-receptors in biglycan signaling such as cluster of differentiation 14 (CD14) which was found in a high molecular complex with biglycan was not addressed so far.
In the first part of the present study, by utilizing primary peritoneal murine macrophages we demonstrated that the biglycan-induced expression and synthesis of TNF-α and CCL2 via TLR2/4/MyD88, CCL5 through TLR4/TRIF and HSP70 over TLR2 is blunted in CD14 deficient mice, proving that CD14 is essential in TLR2- and TLR4-mediated biglycan signaling. Pre-incubation of macrophages with an anti-CD14 antibody significantly reduced the protein levels of TNF-α, CCL2, CCL5 and HSP70. In line with these data, pharmacological inhibition of CD14 alleviated the transcriptional activation of NF-κB by biglycan in HEK-Blue cells expressing hTLR2/CD14 as well as hTLR4/CD14/MD2 supporting CD14-dependency for biglycan/TLR2/4 signaling. Western blot analysis of phosphorylated p38, p44/42 and NF-κB in WT and CD14 deficient mice revealed that activation of biglycan-mediated TLR downstream signaling is CD14-dependent. Accordingly, biglycan-induced activation and nuclear translocation of p38, p44/42 and NF-κB was blocked in Cd14-/- mice as analyzed by confocal microscopy. Co-immunoprecipitation studies combined with microscale thermophoresis analysis showed that biglycan is in complex with CD14 in macrophages and in vitro binds directly with high affinity to CD14, thereby sustaining the concept that CD14 is a novel co-receptor in biglycan-mediated inflammation. Additionally, we provided proof-of-principle of our concept in an in vivo mouse model of renal IRI. Transient overexpression of biglycan in WT mice exacerbated the expression and production of TNF-α, CCL2, CCL5 and HSP70 in a CD14-dependent manner. Interestingly, pLIVE or pLIVE-hBGN-injected Cd14-/- mice displayed lower chemo- and cytokine levels in reperfused kidneys as compared to respective WT controls during renal IRI (30 h), indicating a renoprotective effect by CD14 deficiency. Flow cytometry analysis of kidney homogenates underlined the pivotal effect of CD14 in biglycan signaling as biglycan-mediated infiltration of CD11b- and F4/80-positive renal macrophages was abolished in Cd14-/- mice. Additionally, pLIVE or pLIVE-hBGN-injected CD14 deficient mice displayed lower numbers of renal CD11b- and F4/80-positive cells during renal IRI compared to WT mice. Analysis of F4/80- and CD38-positive cells isolated from mononuclear cell extracts from kidney homogenates of pLIVE or pLIVE-hBGN-injected WT and Cd14-/- mice revealed that biglycan triggers the polarization of pro-inflammatory M1 macrophages in a CD14-dependent manner. In line with this, Cd14-/- mice, either injected with pLIVE or pLIVE-hBGN, showed less F4/80- and CD38-positive cells during renal IRI than the respective WT control. As a corroboration of our data PAS-stained renal sections of pLIVE- or pLIVE-hBGN-injected WT or Cd14-/- mice uncovered that biglycan worsens tubular damage in IRI-subjected mice via CD14. At the same time, tubular damage was significantly reduced in IRI-subjected Cd14-/- mice as compared to WT mice. In correlation with these data, serum creatine levels were increased in pLIVE-hBGN-injected WT mice during renal IRI. In contrast, serum creatine levels were significantly less increased in pLIVE- or pLIVE-hBGN-injected Cd14-/- mice than in WT littermate controls. In conclusion we demonstrated that CD14 is a new high affinity ligand for biglycan-mediated pro-inflammatory signaling over TLR2 and TLR4 in macrophages. In vivo, soluble biglycan triggers the expression of various inflammatory mediators by utilizing the co-receptor CD14. Ablation of CD14 abolishes biglycan-induced renal macrophage infiltration and M1 macrophage polarization as well as overall kidney function by reduced tubular damage and serum creatinine levels. Therefore, this study identifies CD14 as a promising therapeutic target to ameliorate biglycan-induced inflammation.
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Chiralität ist in der belebten Natur ein omnipräsentes Phänomen und beschreibt die Symmetrieeigenschaft eines Objektes, dass dieses von seinem Spiegelbild unterscheidbar ist. Die bisherigen Untersuchungen der Wechselwirkung zwischen chiralen Molekülen und Licht fokussieren sich auf das Regime der Ein- und Multiphoton-Ionisation und wird mit dieser Arbeit um Untersuchungen im Starkfeldregime erweitert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Experimente an einzelnen chiralen Molekülen in starken Laserfeldern vorbereitet, durchgeführt, analysiert und alle geladenen Fragmente in Koinzidenz untersucht.
Die Präsentation der Ergebnisse orientierte sich an der Reihenfolge, in der auch die Datenauswertung von Vielteilchenaufbrüchen vonstattengeht: Zunächst wurde der Dichroismus in den Photoionen (PICD) auf chirale Signale in integraler differentieller Form untersucht, dann wurde die Asymmetrien in den Elektronenverteilungen vorgestellt und abschließend die Zusammenhänge zwischen den Ionen- und Elektronenverteilungen aufgezeigt.
Kapitel 6 untersuchte die (differentielle) Ionisations- und Fragmentationswahrscheinlichkeit von verschiedenen chiralen Molekülen. Die in Kapitel 6.1 präsentierten Daten verknüpften erstmals den bereits in der Literatur diskutierten Zirkulardichroismus in den Zählraten von Photoionen (PICD) mit dem signalstärkeren differentiellen PICD in der Einfachionisation von Methyloxiran. Dissoziiert das Molekül nach der Ionisation rasch genug, gewährt der Impulsvektor des geladenen Fragments Zugang zu einer Fragmentationsachse. Durch die Auflösung nach einer Molekülachse ist der beobachtete PICD fast eine Größenordnung stärker, als der über alle Raumrichtungen integrierte.
In steigender Komplexität wurde in Kapitel 6.2 eine Fragmentation in vier Teilchen von Molekülen aus einem racemischen Gemisch von CHBrClF untersucht. Über die Auswertung eines Spatproduktes aus den Impulsvektoren konnte für jedes Molekül dessen Händigkeit bestimmt und der vollständig differentielle PICD untersucht werden. Durch das Festhalten einer Fragmentationsachse (analog zu Kapitel 6.1) konnten um einen Faktor vier stärkere PICD-Signale und durch das Auflösen nach der vollständigen Molekülorientierung die Signalstärke des PICD um einen Faktor von etwa 16 in den Bereich einiger Prozente gebracht werden. Leider übersteigt die theoretische Beschreibung dieses Prozesses den aktuellen Stand der Forschung weit. Daher kann nicht ausgeschlossen werden, dass nicht ein Beitrag zur PICD-Signalverstärkung auch aus der Dynamik der sequentiellen vielfachen Ionisation stammt.
Die untersuchte Reaktion in Kapitel 6.3 war der Fünf-Teilchenaufbruch der achiralen Ameisensäure. In der Messung aller ionischen Fragmente konnten analog zu dem vorherigen Kapitel die internen Koordinaten sowie die Orientierung des Moleküls ermittelt werden. Tatsächlich wurde von einer chiralen Fragmentation der achiralen Ameisensäure berichtet. Welches Enantiomer in der Fragmentation beobachtet wird, hängt maßgeblich von der Molekülorientierung relativ zum ionisierenden Laserpuls ab. Diese Erkenntnis könnte zu neuen Ansätzen für Laserkatalysierte enantioselektive Reaktionen führen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die beobachtete Händigkeit des Moleküls nicht nur von seiner Orientierung, sondern auch von der Helizität des ionisierenden Laserpulses abhängt. Dieser differentielle PICD an der Ameisensäure zeigte sich neben einer sehr großen Signalstärke von über 20 % auch als sensitive Probe für die molekulare Struktur.
In Kapitel 7 wurden die Untersuchungen an den 3-dimensionalen Impulsverteilungen der Photoelektronen vorgestellt. Zunächst wird hierzu auf die allgemeine Form des Dichroismus in den Photoelektronen (PECD) im Starkfeldregime eingegangen und die vorherrschenden Symmetrien des Ionisationsregimes herausgearbeitet (Kapitel 7.1). Mit leicht steigender Komplexität konnte eine klare Verbindung zwischen der Asymmetrie in der Elektronenverteilung und dem Schicksal des zurückbleibenden molekularen Ions anhand der Einfachionisation von Methyloxiran herausgearbeitet werden (Kapitel 7.2). Dies hat eine wichtige Auswirkung auf die Nutzbarkeit des PECD im Starkfeldregime als Analysemethode für Chemie und Pharmazie: Der über alle Fragmentationskanäle integrierte PECD ist sensitiv auf die Gewichtung der Fragmente und damit auch auf beispielsweise die maximale Laserintensität. Die Daten legen nahe, dass die Abhängigkeit des PECD von dem Fragmentationskanal auf die unterschiedliche Auswahl von Subensembles molekularer Orientierungen zurückzuführen ist.
Bei Verwendung von elliptisch polarisiertem Licht treten gegenüber der zirkularen Polarisation eine Reihe neuer Effekte auf (Kapitel 7.3). Zunächst zeigt der PECD auch im Starkfeldregime eine nicht lineare Sensitivität auf den Polarisationszustand, welche sich auch als Funktion des Elektronentransversalimpulses und dem Fragmentationskanal ändert. Somit ist die Verwendung von elliptisch polarisiertem Licht bestens für die chirale Erkennung geeignet, wie inzwischen auch in der Literatur bestätigt wurde. Darüber hinaus führt die gebrochene Rotationssymmetrie bei elliptisch polarisiertem Licht zu einer Elektronenimpulsverteilung, welche selbst chiral ist: Der PECD variiert je nach Winkel φ in der Polarisationsebene, wobei die Extrema des PECD nicht mit den Maxima der Zählraten übereinstimmen. Als neue chirale Beobachtungsgröße konnten wir eine enantiosensitive und vorwärts-/rückwärtsasymmetrische Rotation der Zählratenmaxima einführen. Als abgeleitete Größe aus derselben drei-dimensionalen Elektronenverteilung ist diese Beobachtungsgröße jedoch untrennbar verknüpft mit dem ϕ-abhängigen PECD.
Kapitel 8 verknüpfte das (partielle) Wissen um die molekulare Orientierung und den PICD mit den Asymmetrien der Elektronenverteilung für die Messung der fünffach-Ionisation von Ameisensäure (Kapitel 8.1), der vierfach-Ionisation von CHBrClF (Kapitel 8.2) und der Einfachionisation von Methyloxiran (Kapitel 8.3). Im Datensatz der Ameisensäure und dem des CHBrClF zeigte die molekulare Orientierung einen größeren Einfluss auf die Asymmetrie in der Elektronenverteilung als das Enantiomer oder die Helizität des Lichtes. Diese Verknüpfung zwischen Molekülorientierung und Elektronenasymmetrie überträgt die Asymmetrien des PICD auf die Elektronenverteilung. Die Messung an Methyloxiran relativiert diesen Zusammenhang jedoch in dem dieser in dieser Stärke nur bei manchen Fragmentationskanälen auftritt. Offenbar ist die Übertragung der Asymmetrie der differentiellen Ionisationswahrscheinlichkeit nur einer der Mechanismen, welcher zu Elektronasymmetrien im Starkfeldregime führt.
Die Hippocampusformation ist eine wichtige Hirnstruktur für die Gedächtnisakquisition und -konsolidierung, insbesondere beim räumlichen Lernen spielt sie eine essentielle Rolle. Langzeitpotenzierung (LTP) gilt als das elektrophysiologische Korrelat der synaptischen Plastizität, dem langfristigen Umbau synaptischer Verbindungen, der letztlich zur Ausbildung stabiler, langanhaltender Erinnerungen führt. Signalübertragung über den cAMP/PKA/MAPK/CREB-Weg stellt den wichtigsten molekularen Mechanismus der Langzeitpotenzierung dar, CREB gilt als die zentrale Komponente und Schnittstelle dieser Übertragung. Neuronale Plastizität ist abhängig von de-novo-Pro-teinbiosynthese, an deren Regulation Veränderungen der Chromatinstruktur durch Histonmodifikationen beteiligt ist, in die der genannte Signalweg mündet.
Circadiane Rhythmen sind in den meisten Spezies in vielen verschiedenen Organen und Geweben nachgewiesen und manifestieren sich als Einflüsse auf zahlreiche Parameter des Verhaltens, so auch auf die Leistung beim Erlernen neuer Information. Ihr zentraler Taktgeber ist der Nucleus suprachiasmaticus (SCN). Melatonin ist ein wichtiges Effektorsignal des circadianen Systems und hat gleichzeitig Rückkopplungsfunktion. Seine unmittelbare Wirkung übt es über die beiden G-Protein-gekoppelten Melatonin-rezeptoren MT1 und MT2 aus. Es hat direkten Einfluss auf das Lernen und stellt damit einen Schnittpunkt zwischen Signalwegen der synaptischen Plastizität und des circadianen Systems dar.
Der Lernerfolg vieler Tierarten ist bekanntermaßen während deren subjektivem Tag höher als während der Nacht. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass beim räumlichen Lernen bereits ein einmaliger Stimulus ausreicht, um im Hippocampus der verwendeten C3H-Mäuse eine stabile Induktion der Phosphorylierung von CREB sowie der transkriptionsaktivierenden Histonmodifikationen H3K9ac und H3K14ac zu erzeugen. Ein einmaliger Stimulus hat also verstärkte Signaltransduktion und Protein-syntheseaktivität als Zeichen synaptischer Plastizität zur Folge. Dies geschieht nur tagsüber, nachts zeigt sich kein Effekt. Somit spiegelt sich der Phänotyp in diesen molekularen Markern wider. Anhand eines Mausmodells mit genetischem Knockout der beiden membrangebundenen Melatoninrezeptoren MT1 und MT2 (MT1/2−/−) wurde der Einfluss von Melatonin auf die molekularen Prozesse des hippocampalen Lernens näher beleuchtet. Über MT1/2−/−-Mäuse ist bekannt, dass ihr Lernerfolg in den benutzten Verhaltensversuchen zu jeder Tageszeit auf dem Niveau der C3H-Mäuse während der Nacht liegt. Zunächst zeigt sich, dass in MT1/2−/−-Mäusen die Grundrhythmen der meisten untersuchten Proteine und Histonmodifikationen verändert, teilweise phasenverschoben und abgeflacht sind. Eine Induktion von pCREB und H3K9ac und H3K14ac ist in diesen Tieren nicht mehr erreichbar und somit nach einem einmaligen Lernstimulus keine vermehrte Signalübertragung oder synaptischer Umbau nachweisbar. Auch hier besteht eine gute Korrelation mit dem Lernphänotyp. Weiterhin wurden Unterschiede im Aktivitätsmuster der beiden Mäusestämme gezeigt, MT1/2−/−-Mäuse sind abhängig von der Situation weniger oder gleich aktiv wie C3H-Tiere. Im Angstverhalten als möglichem Störfaktor besteht kein Unterschied zwischen beiden Tierstämmen.
Melatoninrezeptoren wirken über inhibitorische G-Proteine auf die Adenylatcyclase und hemmen den cAMP/CREB-Signalübertragung, was die schlechtere Lernperformance während der Nacht erklärt, wenn der Melatoninspiegel seinen natürlichen Höhepunkt erreicht. Durch Melatonin lassen sich auch tagsüber bei Mäusen und Zebrafischen LTP und räumliches Lernen unterdrücken. Jedoch lässt sich durch diese akute Wirkung von Melatonin nur ein Teil der Ergebnisse erklären, so zum Beispiel die veränderte Aktivität von PKA und PKC. Um das scheinbar paradoxe verschlechterte Lernverhalten der MT1/2−/−-Mäuse und die fehlende Induzierbarkeit von pCREB und Chromatinremodelling zu erklären, muss ein längerfristiger Effekt von Melatonin bestehen, der über dessen maximale Konzentration hinaus anhält und in seiner Abwesenheit zu verbesserter Signalübertragung führt. Hierfür ist eine Sensibilisierung der Adenylatcyclase durch prolongierte Melatoninexposition, wie sie beispielsweise in Zellen der Pars tuberalis nachgewiesen wurde, beschrieben worden. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Melatonin vielfältigen Einfluss auf das hippocampale Lernen hat und dieses mit der inneren Uhr verbindet.
Esta investigación, titulada “La colonialidad de las metáforas: Las representaciones del VIH/sida y de los sujetos vinculados con la ‘enfermedad’, en los discursos periodístico y médico costarricenses (1983-1990) y en la narrativa nacional (1989-1999)”, consta de cuatro capítulos. En el primero, se presenta el tema de estudio y sus interrogantes, las aproximaciones teóricas, los aspectos metodológicos y la estructura del texto. En relación con los enfoques teóricos, se consideran las contribuciones de Paul Ricœur, Hans Blumenberg y Michel Foucault. Así, primero hay una reflexión sobre la metáfora, la narración y el pensamiento (Ricœur y Blumenberg). Segundo, se estudian los símbolos primarios del mal: la mancilla, el pecado y culpabilidad (Ricœur). Tercero, se analiza el concepto de biopolítica y el papel social de la medicina (Foucault). En la metodología, se parte de algunos principios de la Sociocrítica (relacionados con las nociones de texto, contexto y representación) y se propone, nuevamente con Foucault, un análisis del discurso en términos históricos. Asimismo, se introducen unas explicaciones de Philipp Sarasin, con el fin de resaltar la importancia de estudiar las metáforas, los símbolos, las tramas, etc. Para el caso específico de los textos literarios, se toman en cuenta otras posibilidades de análisis semiótico (aunque los textos literarios también son asumidos como parte de un corpus discursivo amplio, con un común denominador: el VIH/sida).
Los siguientes capítulos (II, III y IV) corresponden con el desarrollo de la investigación. Así, en los capítulos II y III, se reflexiona sobre las representaciones que los discursos periodístico y médico movilizaron durante la primera (1983-1986) y la segunda (1987-1990) mitades de la década de los años ochenta. Los discursos periodístico y médico son trabajados en conjunto, ya que las interacciones que se dieron entre estos campos fueron constantes. En total, se recabaron 490 noticias, artículos de opinión, reportajes, etc., publicados en el periódico La Nación. Además, se consideraron los múltiples aportes hechos por los médicos y especialistas, tanto en dicho diario como en diferentes trabajos académicos y en publicaciones institucionales (son alrededor de 38 textos más, entre libros, ensayos, informes, etc.). En el capítulo IV, se analizan los textos literarios sobre el VIH/sida que surgieron, entre los años ochenta y los noventa, en Costa Rica: el libro Tiempos del SIDA: Relatos de la vida real (1989), de Myriam Francis; la novela Paisaje con tumbas pintadas en rosa (1998), de José Ricardo Chaves; y los cuentos de Alfonso Chase, “Antes y ahora” y “Carpe Diem”, publicados en el libro Cara de santo, uñas de gato (1999).
Die kulturanthropologische Studie beschäftigt sich mit der pädagogischen Nutzung von Wäldern. Sie betrachtet dieses Phänomen vor dem Hintergrund zweier Entwicklungen: Zum einen wird die Zunahme von gesellschaftlichen Bedürfnissen an den Wald betrachtet etwa aus den Bereichen Freizeit, Sport, Gesundheit oder Bildung. Zum anderen wird die Zuspitzung des Nutzungskonflikts zwischen Forst- und Naturschutzakteuren im Wald in den Blick genommen. Im Zentrum der Arbeit stehen daher sowohl der Prozess der pädagogischen Inwertsetzung des Waldes als auch die Frage, wie sich der Nutzungskonflikt in der pädagogischen Praxis widerspiegelt. Eine empirisch-ethnografische Feldforschung im Nationalpark Kellerwald-Edersee und im Jugendwaldheim des Forstbetriebs des Landes Hessen im Jahr 2014 bilden das Fundament der Studie.
Die Ergebnisse machen den Prozess der pädagogischen Inwertsetzung transparent: Sie verweisen auf einzelne Praktiken, auf beteiligte Akteure und stellen dar, wie das Bild vom Wald als pädagogisch wertvoller Raum gesellschaftlich Fuß fasst. Sie zeigen darüber hinaus, dass Naturschutz- und Forstakteure die Bildungspraktiken nutzen, um ihre jeweiligen Vorstellungen zur Nutzung des Waldes gesellschaftlich durchzusetzen. Vor allem machen die Ergebnisse deutlich, dass durch die pädagogischen Inwertsetzung einerseits und die Instrumentalisierung der Bildung andererseits Diskussionen über die Funktion und den Stellenwert der pädagogischen Nutzung von Wäldern ausgelöst werden. Die Studie zeigt, dass im Rahmen dieser Debatten die gesellschaftlichen Wünsche gegenüber den bislang dominierenden forstwirtschaftlichen und naturschutzfachlichen Aspekten an Relevanz gewinnen.
Downy mildew of common sage (Salvia officinalis), caused by Peronospora salviae-officinalis, has become a serious problem in sage production worldwide. The causal agent of the disease belongs to the Pe. belbahrii species complex and was described as a species of its own in 2009. Nevertheless, very little is known about its infection biology and epidemiology. The aims of the current study were therefore to unravel the life cycle of this downy mildew and gain deeper insights into the epidemiology of the disease, as well as to clarify the species boundaries in the Pe. belbahrii species complex.
Infection studies showed that temperatures between 15 and 20 °C were most favourable for infection and disease progress. At 5 °C Pe. salviae-officinalis is still able to infect sage plants, but sporulation was only observed at higher temperatures. Furthermore, Pe. salviae-officinalis needs two events of leaf wetness or high humidity, a first one of at least three hours for conidial germination and penetration of the host, and a second one for sporulation. Additionally, contamination of sage seeds by Pe. salviae-officinalis was proven by seed washing and by PCR and DNA sequence comparisons, suggesting that infested seeds might play a major role in the fast spread of sage downy mildew, which is an important finding for phytosanitary or quarantine measures.
A protocol for fluorescence staining and confocal laser scanning microscopy was established and the whole life cycle of Pe. salviae-officinalis was tracked including oospore formation. The method was also used to examine samples of Pe. lamii on Lamium purpureum and Pe. belbahrii on Ocimum basilicum demonstrating the usefulness of this method for studying the infection process of downy mildews in general.
Peronospora species parasitizing S. sclarea, S. pratensis, O. basilicum, and Plectranthus scutellarioides were studied using light microscopy and molecular phylogenetic analyses based on six loci (ITS rDNA, cox1, cox2, ef1a, hsp90 and β-tubulin). The downy mildew on S. pratensis was shown to be distinct from Pe. salviae-officinalis and closely related to Pe. glechomae, and is herein described as a new taxon, Peronospora salviae-pratensis. The downy mildew on S. sclarea was found to be caused by Peronospora salviae-officinalis. The multi-gene phylogeny revealed that the causal agent of downy mildew on coleus is distinct from Pe. belbahrii on basil, and is herein described as a new taxon, Pe. choii.
Einleitung- 12,5% aller operierten Patienten sind für mehr als 80% aller Todesfälle verantwortlich. Über die Identifizierung dieser Risikopatienten ist wenig bekannt.6. Währenddessen sind hepatobiliäre Operationen nach wie vor mit einem relativ hohen Mortalitätsrisiko von etwa 5% assoziiert.15.
Ziel- Die Evaluierung der „Cumulative Illness Rating Scale(CIRS)“ zur Prädiktion von Komplikationen und Mortalität in der hepatobiliären Chirurgie.
Material und Methoden- Alle Patienten, die sich vom 01.01.2011 bis zum 06.05.2016 einer hepatobiliären unterzogen, wurden retrospektiv anhand der elektronischen Patientenakte(NICE) gemäß der modifizierten CIRS46 bewertet. Abhängig von der Gesamtsumme der ermittelten CIRS-Werte wurden die Patienten in 4 Risikoklassen (1-4) unterteilt. Anschließend wurden die 14 CIRS-Kategorien und die Risikoklassen auf ein vermehrtes Auftreten von Komplikationen ≥IIIb50 gemäß der Dindo-Klassifikation sowie der 90-Tages-Mortalität49 untersucht.
Ergebnisse- 576 Patienten mit einem durchschnittlichen Alter von 60,7 ± 13,7 Jahren wurden in die Studie aufgenommen. 18,6% der Patienten wiesen Komplikationen ≥IIIb anhand der Dindo-Klassifikation auf. 6,8% verstarben innerhalb des Überwachungszeitraumes von 90 Tagen. Für die Risikoklassen 3+4 (OR=1,674; p=0,027; 95%CI=1,060-2,645) sowie für Erkrankungen der Schweregrade 3+4 in der Kategorie „Leber“ (OR=2,583; p=0,015; 95%CI=1,205-5,538) konnten signifikant erhöhte Wahrscheinlichkeiten für die Entstehung von Komplikationen festgestellt werden. Gleiches wurde im Bezug auf Mortalität für Erkrankungen der Schweregrade 3+4 in den Kategorien „Hypertonie“ (OR=2,249; p=0,019; 95%CI=1,141-4,434) und „Leber“ (OR=8,891; p=0,033; 95%CI=1,189-66,492) nachgewiesen. Im Gegensatz dazu führten Erkrankungen der Schweregrade 3+4 in der Kategorie „Unterer Gastrointestinaltrakt“ zu einer deutlichen Reduzierung des Risikos für die Entwicklung von Komplikationen (OR=0,385; p<0,000; 95%CI=0,228-0,649) und Mortalität (OR=0,419; p=0,047; 95%CI=0,178-0987). Die im Rahmen der binär logistischen Regression erstellten Regressionsgleichungen ermöglichten keine verbesserte Klassifizierung der Patienten.
Zusammenfassung- Die Ergebnisse zeigen, dass signifikante Zusammenhänge zwischen der Entstehung von Komplikationen ≥IIIb anhand der Dindo-Klassifikation und der 90-Tages-Mortalität mittels CIRS nachweisbar sind. Dennoch geht hervor, dass der prädiktive Wert der modifizierten CIRS für die hepatobiliäre Chirurgie gering ist.