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Institute
The interleukin (IL)-1 family has been described for its numerous involvement in the regulation of inflammatory processes. Certain members are able to induce inflammation, whereas others have the capacity to inhibit inflammation. The newly discovered IL-1 family member IL-38 shows interesting and innovative properties. While most of these cytokines are pro-inflammatory mediators, IL-38 appears to enter the smaller circle of anti-inflammatory mediators. As a pattern, IL-38 appears to suppress IL-17-driven chronic or auto-inflammation by working as receptor antagonist. These properties, as well as its beneficial effects in models of inflammatory and autoimmune diseases suggest the possibility of IL-38-based therapies. Nevertheless, its role in the resolution of acute inflammation, thereby preventing chronic inflammation, remains unclear.
The first part of my thesis elucidated the role of IL-38 in the resolution of inflammation. I found that the complete absence of IL-38 in IL-38 KO mice leads to a delayed resolution of inflammation in the zymosan-induced peritonitis mouse model, compared to WT mice. This was marked by a persistent neutrophilia and a lower production of pro-resolving mediators during the resolution phase, such as TGFβ1 production from macrophages following efferocytosis of apoptotic cells. Reduced TGFβ1 production from macrophages coincided with reduced levels of regulatory T cells (Tregs), which are known to promote the resolution of inflammation. Unexpectedly, the TGFβ1 production capacity of macrophages did not influence the induction of Tregs from naïve T cells. Rather, IL-38 KO mice had an accumulation of Tregs in the thymus compared to WT mice. This was caused by an impairment of CD62L expression at the surface of Tregs, which is required for Tregs migration outside of the thymus. Higher Treg numbers in the thymus correlated with lower level of Tregs in peripheral lymphoid organs. Importantly, CD62L expression at the surface of IL-38 KO Tregs in the thymus was restored by injecting IL-38 i.p. for 24h. These data indicate a potential key function of IL-38 in the regulation of Treg migration, which is triggered in many cases of autoimmunity.
The second part of my thesis was to study the role of IL-38 in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) development, given that EAE is IL-17-dependent. Unexpectedly, IL-38-deficient mice showed strongly reduced clinical scores and histological markers of EAE. This came with reduced inflammatory cell infiltrates, as well as reduced expression of inflammatory markers in the spinal cord. IL-38 mRNA was detected in the spinal cord, mainly by resident and infiltrated phagocytes, but also by other cells, such as ependymal cells. IL-38 was upregulated upon pro-inflammatory stimulation of bone marrow-derived macrophages, and its presence was necessary for a complete activation of inflammatory macrophages. My data suggest an alternative cell-intrinsic role of IL-38 in macrophages to promote inflammation in the central nervous system.
In the last part of my thesis, I initiated a project on the function of IL-38 in B cell physiology and antibody production, given the fact that IL-38 is expressed by B cells. I generated preliminary data showing that the absence of IL-38 in mice decreased antibody production. Furthermore, I showed that IL-38 is particularly expressed by plasma cells in human tonsils. This project remains open and further studies will be conducted to investigate how IL-38 regulates antibody production, both in physiological and autoimmune settings. Understanding the role of IL-38 in autoantibody production could lead to original and innovative therapy for patients suffering from auto-inflammatory disease.
In summary, the different projects of my thesis provide evidence that the pro-resolving function of IL-38 may be indirectly linked to the retention of Tregs in the thymus. Moreover, a possible intracellular role of IL-38 within macrophages was described showing opposite properties in the regulation of inflammation. This function could be causatively involved in EAE development. However, further studies remain to be done to find the mechanism of action by which IL-38 regulates Tregs egression and how it influences the EAE development. Complete understanding of the IL-38 biology and differentiation between its extra- vs potential intracellular functions could make it a promising therapeutic target for chronic inflammatory or autoimmune diseases.
Bacteria constantly attempt to hold up ion gradients across their membranes to maintain their resting potential for routine cell function, while coping with sudden environmental changes. Under abrupt hyperosmotic conditions, as faced when invading a host, most bacteria restore their turgor pressure by taking up potassium ions to prevent death by plasmolysis. Here, the potassium transporter AB, or KtrAB for short, is a key player. KtrAB consists of the membrane-embedded KtrB dimer, which includes two pores organized in tandem, and a cytoplasmic, octameric KtrA ring, which regulates these two pores. The KtrB subunits alone were suggested to function as rather non-selective ion channels translocating potassium and sodium ions. The KtrA subunits confer transport velocity, K+ selectivity as well as Na+ and nucleotide dependency to the Ktr system. The nucleotide regulation by binding to KtrA is rather well characterized. In contrast, the regulatory role of Na+ remains elusive. Controversially discussed is how selective the ion translocation by KtrB is and how KtrA affects it. Although there are several functional and structural data available of KtrAB and its homolog TrkAH, the selectivity of the ion translocation was never thoroughly addressed. The functional characterization of whether KtrAB is a selective ion channel and how selectivity is achieved is in the focus of this thesis. Since selectivity is usually defined by the ion channels’ selectivity filter contained in the pore-forming domain, a particular attention was laid on the ion-translocating subunits KtrB.
KtrB belongs to the superfamily of K+ transporters (SKT). Each KtrB monomer consists of four covalently attached M1-P-M2 motifs, each motif is made of two transmembrane (TM or M) helices that are connected by a pore (P) helix. The four motifs, referred to as domains D1 to D4, are arranged in a pseudo-fourfold symmetry and together form the pore for potassium ion translocation. Each pore contains two structural features thought to be involved in ion selectivity and ion gating. These are the non-canonical selectivity filter and the intramembrane loop. The selectivity filter is localized at the extracellular side of the pore and mostly shaped by the backbone carbonyl groups of the loops connecting the P and M2 helices in each domain. In KtrB, each P-loop contains only one highly conserved glycine residue instead of the classical -TVGYG- signature sequence of a K+ channel. This simple constructed selectivity filter led to the hypothesis that KtrAB would only have low ion selectivity. The intramembrane loop is formed by broken helix D3M2 and is located directly under the selectivity filter. It consists mostly of polar residues and acts as a molecular gate restricting ion fluxes. The intramembrane loop has been shown to be regulated by nucleotide binding to KtrA. Additionally, it could directly or indirectly be affected by Na+ binding. Further, the loop might even be involved in ion selectivity because it presents a physical barrier inside the pore.
To address the ion selectivity of the Ktr system, first, the ion binding specificity of KtrB was investigated. Binding affinities of different cations to KtrB were determined using isothermal titration calorimetry (ITC). For this, KtrB from Vibrio alginolyticus was heterologously produced in and purified from Escherichia coli. 12 L of culture roughly yielded 4 to 8 mg of the functional KtrB dimer in detergent solution. ITC measurements were performed in two different buffers, one choline-Cl-based and one LiCl-based buffer. No differences in the affinity between Na+ (KD = 1.8 mM), K+ (KD = 2.9 mM), Rb+ (KD = 1.9 mM) or Cs+ (KD = 1.6 mM) were detected in the choline-Cl-based buffer; only Li+ did not bind. In contrast, ITC measurements in LiCl-based buffer revealed a significant preference for K+ (KD = 91 µM) over Rb+ (KD = 2.4 mM), Cs+ (KD = 1.7 mM) and particularly Na+ (for which no binding was observed). Similarly, the presence of low millimolar NaCl concentrations in the choline-Cl-based buffer led to a decreased KD value of 260 µM. Hence, small cations, which usually are present in the natural environment, seem to modulate the selectivity filter for a better binding of K+ ions providing K+ selectivity. In fact, the low binding affinities of the other ions could indicate that they do not even bind to the selectivity filter but to the cavity. However, ITC competition experiments showed that all four ions compete for the same or overlapping binding sites, with Rb+ and Cs+ even blocking K+ binding at concentrations 10-fold above their binding affinities. Importantly, at physiological NaCl concentrations of 200 mM, the apparent binding affinity for K+ to KtrB was still 3.5 mM. This suggested that Na+ can also bind to KtrB’s selectivity filter but with a comparably low binding affinity providing an unexpectedly high preference for K+ ions.
...
Connectomic analysis of apical dendrite innervation in pyramidal neurons of mouse cerebral cortex
(2020)
The central goal of this study was to generate synapse-resolution maps of local and long-range innervation on apical dendrites (AD) in mouse cerebral cortex. We used three-dimensional electron microscopy (3D-EM) to first measure the cell-type specific balance in the excitatory and inhibitory input on ADs. Further, we found two inhibitory axon populations with preference for apical dendrites originating from layer 2 and 3/5. Additionally, we used a combination of large-scale volumetric light and electron microscopy to investigate the innervation preference of long-range cortical projections onto ADs. To generate such large-scale 3D-EM datasets, we also developed a software package to automate aberration adjustment.
The balance of excitation and inhibition defines the computational properties of neurons. We, therefore, generated 6 datasets and annotated 26,548 excitatory and inhibitory synapses to map the relative inhibitory strength on the AD of pyramidal neurons in layers 1 and 2 (L1 and 2) of the cortex. We found consistent and cell-type specific patterns of inhibitory strength along the apical dendrite of L2-5 pyramidal neurons in primary somatosensory (S1), secondary visual (V2), posterior parietal (PPC) and anterior cingulate (ACC) cortices. L2 and L5 pyramidal neurons had inhibitory hot-zones at their main bifurcation and distal apical dendrite tuft, respectively. In contrast, L3 neurons had a baseline (~10%) level of inhibition along their apical dendrite. As controls, we quantified the effect of synapse strength (size), dendrite diameter, AD classification and synapse identification methods on the cell-type specific synapse densities. To classify L5 pyramidal subtypes, we performed hierarchical clustering using morphological properties that were described to differentiate slender- and thick-tufted L5 neurons.
We also investigated the distance to soma as a predictor of fractional inhibition around the main bifurcation of apical dendrites. Interestingly, we found a strong exponential relationship that was absent in density of either synapse type. This suggests a distance dependent control mechanism designed specifically for the balance (in synapse numbers) of excitation and inhibition.
Next, we focused on the inhibitory innervation preference for apical dendrite of pyramidal neuron. We, therefore, annotated 5,448 output synapses of AD-targeting inhibitory axons and found two populations specific for either L2 or L3/5 apical dendrites. Together with previous findings on preferential innervation of sub-cellular structures by inhibitory axons, this suggests two distinct inhibitory circuits for control of AD activity in L2 vs. deep-layer pyramidal neurons. This innervation preference was surprisingly consistent across S1, V2, PPC and ACC cortices.
3D-EM data acquisition is a laborious process that is made easier and more popular everyday by technical progress in the laboratory and industrial settings. To make data acquisition robust using our custom-built 3D-EM microscopes, an automatic aberration software was implemented to adjust the objective lens and the stigmators of the electron microscope. This method was used in multiple month-long experiments across 2 microscopes and 10 datasets. The aberration adjustment used the reduction in image details (high-frequency elements) to estimate the level of deviation from optimal focus and stigmator parameters. However, large objects in EM micrographs such as blood vessel and nuclei cross-sections generated anomalous results. We, therefore, added image processing routines based on edge detection combined with morphological operations to exclude such large objects.
Finally, we performed a correlative three-dimensional (3D) light (LM) and electron (EM) microscopy experiment to map the long-range primary visual (V1) and secondary motor (M2) cortical input to ADs in layer 1 of PPC using the “FluoEM” approach. This method allows for identification of the long-range source of projection axons in EM volumes without the need for EM-dense label conversion or heat-induced markings. The long-range source of an axon in EM is identified based on the fluorescent protein that is expressed in its LM counterpart. In comparison to M2 input, Long-range axons from V1 had a higher tendency to target L3 pyramidal neurons in PPC according to our preliminary analysis. In combination with the difference observed in the synapse composition of L2 and L3 apical dendrites, this suggests the need for separate functional and structural analysis of L2 and 3 pyramidal neurons.
This thesis discusses important questions of the beam dynamics in the proton-lead operation in the Large Hadron Collider (LHC) at CERN in Geneva. In two time blocks of several weeks in the years 2013 and 2016, proton-lead collisions have so far been successfully generated in the LHC and used by the experiments at the LHC. One reason for doubts regarding the successful operation in proton-lead configuration was the fact that the beams have to be accelerated with different revolution frequencies. There is long-range repulsion between the beams, since both beams share the beam chamber around the interaction points. Because of the different revolution frequencies, the positions of the interaction between the beams shift each revolution. This can lead to resonant excitation and to an increase in the transverse beam emittance, as was observed in the Relativistic Heavy-Ion Collider (RHIC). In this thesis, simulations for the LHC, RHIC and the High-Luminosity Large Hadron Collider (HL-LHC) are performed with a new model. The results for RHIC show relative growth rates of the emittances of the gold beam in gold-deuteron operation in RHIC from 0.1 %/s to 1.5 %/s. Growth rates of this magnitude were observed experimentally in RHIC. Simulations for the LHC show no significant increase of the emittance of the lead beam for different intensities of the counter-rotating beam. The simulation results confirm the measured stability of the beams in the LHC and the issue of strongly increasing emittances in RHIC is reproduced. Also, no significant increase of the emittance is predicted for the Future Circular Collider (FCC) and the HL-LHC.
Using a frequency-map analysis, this work verifies whether the interaction of the lead beam with the much smaller proton beam in the proton-lead operation of the LHC leads to diffusion within the lead beam. Experiences at HERA at DESY in Hamburg and at SppS at CERN have shown that the lifetime of the larger beam can rapidly decrease under certain circumstances. The results of the simulation show no chaotic dynamics near the beam centre of the lead beam. This result is supported by experimental observation.
A program code has been developed which calculates the beam evolution in the LHC by means of coupled differential equations. This study shows that the growth rates of the lead beam due to intra-beam scattering is overestimated and that particle bunches of the lead beam lose more intensity than assumed in the model. The analysis also shows that bunches colliding in a detector suffer additional losses that increase with decreasing crossing angle at the interaction point.
In this work, 2016 data from beam-loss monitors in combination with the luminosity and the loss rate of the beam intensity are used to determine the cross section of proton-lead collisions at the center-of-mass energy of 8.16 TeV. Beam-loss monitors that mainly detect beam losses that are not caused by the collision process itself are used to determine the total cross section via regression. An analysis of the data recorded in 2016 at the center-of-mass energy of 8.16 TeV resulted in a total cross section of σ=(2.32±0.01(stat.)±0.20(sys.)) b. This corresponds approximately to a hadronic cross section of σ(had)=(2.24±0.01(stat.)±0.21(sys.)) b. This value deviates only by 5.7 % from the theoretical value σ(had)=(2.12±0.01) b.
The simulation code for determining the beam evolution is also used to estimate the integrated luminosity of a future one-month run with proton-lead collisions. The result of the study shows that in the future the luminosity in the ATLAS and CMS experiments will increase from 15/nb per day in 2016 to 30/nb per day, which is a significant increase in terms of the performance. This operation, however, requires the use of the TCL collimators to protect the dispersion suppressors at ATLAS and CMS from collision fragments.
This work also gives an outlook on the expected luminosity production in proton-nucleus operation using ion species lighter than lead ions. For example, a change from proton-lead to proton-argon collisions would increase the integrated luminosity from monthly 0.8/nb to 9.4/nb in ATLAS and CMS. This is an increase of one order of magnitude and approximately a doubling of the integrated nucleon-nucleon luminosity. There may be a test operation with proton-oxygen collisions in 2023, which will last only a few days and will be operated with a low luminosity. The LHCf experiment (LHCb experiment) would achieve the desired integrated luminosity of 1.5/nb (2/nb) within 70h (35h) beam time.
Astrozyten erfüllen verschiedene Funktionen im Zentralnervensystem, welche sich in die Bereiche Entwicklung, Durchblutung, Metabolismus, Strukturerhalt und Gliotransmission unterteilen lassen. Astrozyten sind an der synaptischen Informationsverarbeitung beteiligt und wirken an zahlreichen höheren Hirnfunktionen mit. Durch Regulation der synaptischen Transmission und Plastizität sind Astrozyten am Lernverhalten und Erinnerungsvermögen, sowie an der Verhaltensmodulation und Verarbeitung emotionaler Reize involviert. Im Zuge dieser zahlreichen Funktionen können Astrozyten auf externe Stimuli mit der gezielten Freisetzung von Gliotransmittern reagieren.
In kultivierten Astrozyten konnte Keil143 das TGN, bestehend aus Zisternen und Vesikeln, darstellen und mit anti-Rab6 identifizieren. Rab6 mit seinen Subtypen A und B gehört der Superfamilie der monomeren Ras-GTPasen an, die den intrazellulären Membran- und Vesikelverkehr regulieren. Rab6 spielt in HeLa-Zellen beim Transport vesikulärer Organellen vom TGN zur Zellmembran eine wichtige Rolle. Assoziationsanalysen von Rab6A mit vesikulären Glutamattransportern, Serinracemase und Markern der regulierten Exozytose in kultivierten Astrozyten143 deuten darauf hin, dass dieses Rab6A-Organellsystem die ultrastrukturelle Grundlage für die Freisetzung von Gliotransmittern wie D-Serin und Glutamat bildet.
Zur Untersuchung, ob Rab6A tatsächlich ein System der Glia-Neuron-Kommunikation im Gehirn darstellt, war es zunächst unabdingbar das Vorkommen von Rab6A in situ zu untersuchen. Die durchgeführten immunzytochemischen Färbungen an Hirnschnitten der Maus zeigen das gleichmäßige und ubiquitäre Vorkommen von Rab6A in allen untersuchten Hirnregionen. Durch verblindet durchgeführte Kolokalisationsanalysen von Rab6A mit den etablierten astrozytären Markern Glutaminsynthetase (GS), Glial fibrillary acidic protein (GFAP), Aldh1L1 und Sox9 konnte eine Lokalisation von Rab6A in allen Astrozyten gezeigt werden. Weitere Analysen schließen die Lokalisation von Rab6A in Mikroglia (Iba1), NG2-Zellen (NG2) und Oligodendrozyten (CNPase) aus. Die Astrozyten unterscheiden sich in Größe und subzellulärem Verteilungsmuster der Rab6A+ Strukturen, wonach eine Kategorisierung in vier Typen vorgenommen wurde. Anhand der Einteilung kann vermutet werden, dass größere Rab6A+ TGN-Zisternen bis weit in die Zellperipherie transportiert werden und kleine Rab6A+ Vesikel erst dort ausknospen und der Exozytose zugeführt werden. Zur Frage der möglichen astrozytären Subpopulationen konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten Astrozyten GS+, Aldh1L1+, Sox9+ und Rab6A+ sind, jedoch nicht GFAP+.
Um die prinzipielle Übertragbarkeit der gewonnenen Befunde auf den Menschen zu überprüfen, wurde reseziertes Cortex-Gewebe von drei Patienten mit unterschiedlicher pathologischer Genese untersucht. Rab6A ist im massiven Ausmaß in humanen Astrozyten lokalisiert, was nahelegt, dass die zuvor an der Maus gewonnenen Ergebnisse auf den Menschen übertragbar sind.
Die mögliche funktionelle Bedeutung von astrozytärem Rab6A im Gehirn wurde an HFS-Schnitten untersucht. Die Untersuchung zeigt einen signifikanten Anstieg der Rab6A+ Intensität in der gesamten Molekularschicht der Fascia dentata der stimulierten im Vergleich zur unstimulierten Seite. Da die HFS ein etabliertes LTP-Modell darstellt, könnte es infolge dieser zu einer strukturellen, intrazellulären Veränderung der Astrozyten mit erhöhter Freisetzung von D-Serin oder Glutamat aus Rab6A+ Vesikeln kommen, was das Lernverhalten beeinflussen könnte. Die dargestellten Ergebnisse legen eine Auswirkung der HFS auf Rab6A nahe.
Zur Bestätigung der immunzytochemischen Untersuchungen wurde die mRNA-Expression von Rab6A in Astrozyten bereits publizierter Transkriptomanalysen untersucht. Die in den Publikationen verwendeten Genom-Chips treffen allenfalls indirekt eine Aussage zu Rab6A, da Rab6 allgemein und nur Rab6B spezifisch untersucht wurde, jedoch keine spezifische Rab6A Sonde erwähnt wird.
Zusammenfassend kann Rab6A als spezifisches und selektiv in Astrozyten vorkommendes Protein dargestellt und als neuer astrozytärer Marker etabliert werden, der auch Astrozyten des humanen Gewebes markiert. Durch die gewonnenen Befunde kann in nachfolgenden Studien die mögliche Bedeutung von Rab6A in neuropathologischen und neurophysiologischen Prozessen untersucht werden.
Die vorliegende Studie befasst sich mit dem Einfluss minimalinvasiver Zugangswege zur Mitralklappe auf den Herzrhythmus, den Erfolg einer perioperativ durchgeführten Ablation und die postoperative Notwendigkeit eines Herzschrittmachers.
Mitralklappenvitien und deren herzchirurgische Versorgung sind in vielen Fällen mit präoperativ bestehendem oder postoperativ neu auftretendem Vorhofflimmern assoziiert. In den vergangenen Jahrzehnten haben sich neben der medikamentösen Therapie des Vorhofflimmerns und der durch die Mitralklappeninsuffizienz induzierten Herzinsuffizienz verschiedene minimalinvasive chirurgische Zugangswege zur Mitralklappe sowie Ablationsverfahren etabliert und einen kurativen Therapieansatz gebildet.
Die Ablation im Zuge einer Mitralklappenchirurgie ist zu einem alltäglich durchgeführten Verfahren geworden.
Neu auftretendes Vorhofflimmern im Rahmen der Mitralklappenchirurgie kann perioperativ begrenzt sein und konvertiert häufig innerhalb der ersten 6 Wochen spontan in den Sinusrhythmus. Es geht aber mit einer erhöhten Mortalität und Hospitalisierungszeit einher. Das neu auftretende Vorhofflimmern kann jedoch auch persistieren oder erst im Langzeitverlauf entstehen. Auch die Notwendigkeit eines Herzschrittmachers kann durch Mitralklappeneingriffe insbesondere mit additiver Ablation aufgrund der anatomischen Gegebenheiten erhöht sein.
In unserer Arbeit ist von Interesse, ob sich die unten genannten Zugangswege im Hinblick auf das Neuauftreten von Vorhofflimmern im Langzeitverlauf, die Vorhofflimmerrezidivrate nach Ablation und die Schrittmacherrate mit und ohne durchgeführte Ablation unterscheiden.
Die vorliegende Studie umfasst alle Mitralklappenoperationen, die zwischen 1998 und 2015 in der Klinik für Thorax-, Herz- und thorakale Gefäßchirurgie der Universitätsklinik Frankfurt am Main über die folgenden drei minimalinvasiven Zugangswege, durchgeführt wurden: Gruppe A bildeten 300 Patienten, die im genannten Zeitraum über eine anterolaterale Minithorakotomie mittels Chitwood-Klemme operiert wurden. Gruppe B bestand aus 687 Patienten, die über eine partielle obere Sternotomie mit superiorem transseptalem Zugang operiert wurden. Die 219 Patienten, bei denen eine partielle obere Sternotomie mit transcavalem Zugang angewandt wurde, bildeten Gruppe C.
Die Auswertung erfolgte anhand von Patientenakten, internen und externen Untersuchungsbefunden und eines standardisierten Fragebogens im Follow-up. Es erfolgte eine zweite Auswertung nach Propensity Matching, um präoperative signifikante Unterschiede der Gruppen zu egalisieren.
Im Ergebnis konnte in unserer Studie gezeigt werden, dass die atriale Inzision einen entscheidenden Einfluss auf den Ablationserfolg sowie auf die Schrittmacherinzidenz hat. Bekannt war dabei ein höheres Risiko für postoperatives Vorhofflimmern und Schrittmacherimplantationen aufgrund der anatomischen Gegebenheiten bei Gruppe B. Dass jedoch Gruppe C ein signifikant noch höheres Risiko für Schrittmacherimplantationen mit sich bringt, war überraschend und ist derzeit nicht in der Literatur beschrieben.
In der multivariaten Analyse nach Matching waren Gruppe C, eine additive Ablation und das Alter signifikante unabhängige Prädiktoren für Schrittmacherimplantationen. In der logistischen Regression war Gruppe A ein unabhängiger Prädiktor für den Ablationserfolg zum Zeitpunkt der Entlassung. In der Langzeitbeobachtung trat Gruppe C an Stelle von Gruppe A, möglicherweise aufgrund der bei Gruppe A vorliegenden längsten Follow-up-Zeit. Wie schon in der vorliegenden Literatur diskutiert waren auch in unserer Auswertung hohes Alter und eine präoperative linksatriale Vergrößerung unabhängige Prädiktoren für den langfristigen Ablationserfolg.
Es bedarf weiterer vergleichender Studien mit einheitlichen Follow-up-Zeiten, um die hier gezeigten Ergebnisse zu überprüfen. Insbesondere der transcavale Zugang, der sich im negativen Sinne auf die Zahl der Schrittmacherimplantationen auszuwirken scheint, gibt Anlass für weitere Untersuchungen.
Historic amphibian settlements in the northwestern Nile delta - a geoarchaeological perspective
(2020)
No concise picture of the archaeological and palaeoecological evolution can be drawn for the northwestern Nile delta, and archaeological records show significant population dynamics that still need explanation and spur the need for further palaeoenvironmental research. This study delivers a set of new methods especially in the fields of remote sensing and data analytics that can be regarded as important milestones and foundations for further palaeoenvironmental research in the area. Additionally, it shows new insights for individual time slices.
This geoarchaeological project is a cooperation with the archaeological excavations of the German Archaeological Institute (DAI) in Buto and Kom el’Gir. It expands the work of Wunderlich (1989) which laid important foundations in understanding the origin of the initial landscape that was later colonized in different cultural stages showing different dynamics, settlement intensities and even long phases of abandonment or breaks in between. This forms the starting point for relating the population dynamics of the different cultural phases reaching from Predynastic (prior to 3150 before Christ) up to the Greco-Roman era (~anno Domini 650) to the environmental history and events that occurred in the area. It is very likely that environmental changes such as the shifting of major water routes, inundation or paludification of larger areas or other environmental events affected settlements and human life in the area.
In the fields of remote sensing new methods are presented to complete information on the location of ancient settlements, and complex workflows are developed that allow the tracing of subsurface structures via indirect analysis of vegetation growth in larger time series data. It was verified that a relationship exists between vegetation performance, the appearance of archaeologic material in the topsoil, and the location of former Nile river branches.
Together with a new high resolution digital elevation model (DEM) based on TanDEM-X data, new interpretations with a high spatial significance are possible. For individual time slices, namely the Late Dynastic and Greco-Roman era, this work delivers a detailed landscape description suggesting a finely ramified subdelta, with all settlements placed on alluvial levees. This explains the massive increase in settlements in the Ptolemaic, Roman and in particular late Roman periods (4th century before Christ – anno Domini 7th century).
We sampled the Nile delta clays together with the channels and the material of the archaeologic excavations in vibracores and profile walls. This geologic inspection of the subsurface together with geochemical results from a handheld portable X-ray fluorescence device (pXRF) allowed new interpretations of the landscape and environmental history. For example, we used geochemical data to distinguish between artificial and natural channels as a measure for the anthropogenic influence, a proxy for past environmental characteristics and lastly as a basis for a new dating method. Many of the channels, for instance, were dated by our own 14C datings, comparisons with the previous work ofWunderlich (1989) and application of new dating approach based on machine learning with artificial neural networks. Additionally, we run a full methodological approach, and examine the applicability of pXRF methods in general, and test the quality of the data to detect distinct geochemical differences between the main settlement phases with advanced methods in data analytics. The dating is based, for example, on the training of artificial neural networks with pXRF data from archaeological material of well-dated context to date test data of cultural layers within the vibracores. With this method the homogeneous Nile alluvium, cultural layers and channels can be dated roughly and, as a result, fundamental changes in the landscape can be linked with the settlement history of Buto and neighboring tells.
Alzheimer’s disease (AD) is the major cause of dementia. It is characterized by the accumulation of abnormal proteins (amyloid-β plaque and neurofibrillary tangles) leading to loss of synapses, dendrites, neurons, memory and cognition. Sporadic late-onset AD is the major type of AD characterized by unclear etiology and a lack of disease-modifying therapy. To understand this disease, an alternative AD hypothesis has been proposed: AD may resemble diabetes in the brain or “diabetes type 3”. This hypothesis is supported by the fact that (1) brain glucose hypometabolism precedes AD clinical symptoms and (2) diabetes increases the risk of AD. To test this hypothesis, wild-type rats receiving intracerebroventricular administration of streptozotocin (icv-STZ) were used as a model. Streptozotocin (STZ) is a glucosamine-nitrosourea compound commonly used to induce experimental diabetes by peripheral administration. A similar pathological mechanism to peripheral STZ is then proposed to explain icv-STZ toxicity: insulin receptor signaling impairment results in glucose hypometabolism leading to cognitive deficits.
Objective: Icv-STZ model seems promising as a toxin-induced, non-transgenic AD model with the possibility to connect AD and diabetes mellitus (DM), one of the risk factors for AD. However, the mechanisms of how icv-STZ induced AD-like symptoms are unclear. Therefore, using microdialysis as the main technique, we tested 2 AD hypotheses in this model: (1) the glucose hypometabolism as an alternative AD hypothesis and (2) the cholinergic deficit as an important characteristic of AD pathology. Hippocampus was chosen because cholinergic function in this region is severely affected in AD. In comparison, the striatum was chosen because it contains cholinergic interneurons and is less affected in AD.
Methods: In this study, we used male Wistar rats of 190-220 g body weight (5 weeks of age). The rats were injected intracerebrally with STZ at a dose of 3 mg/kg (2x1.5 mg/kg; „high dose“) and 0.6 mg/kg („low dose“) with saline as control. After 21 days, samples were collected to investigate cholinergic and metabolic changes using histology, biochemistry, and neurochemistry. Brain injury was confirmed using GFAP staining and Fluoro jade staining in the hippocampus. Mitochondrial toxicity was investigated by measurement of mitochondrial
respiratory function in both hippocampus and striatum. Cholinergic markers such as acetylcholinesterase (AChE) activity, choline acetyltransferase (ChAT) activity, and choline transporter (CHT-1) activity, commonly known as high-affinity choline uptake (HACU), were measured in both hippocampus and striatum using a spectrophotometer and a scintillator.
Microdialysis is the main technique in our study. It was done in awake animals under behavioral or pharmacological stimulation. We used a self-built probe with a semi-permeable membrane (pore size of 30 kDa) that was implanted in either hippocampus or striatum. The probes were then perfused with artificial cerebrospinal fluid (aCSF) supplemented with 0.1 μM neostigmine for extracellular acetylcholine level measurement. During the perfusion, small hydrophilic compounds from brain extracellular space diffuse into the dialysates. Dialysates of 15 minutes intervals were collected for 90 minutes and used for analysis. After collection of dialysates for the first 90 minutes (basal data), rats were moved to an open field box (35x32x20 cm) for behavioral stimulation. After collection of the second 90 minute dialysates, the rats were transferred back to the microdialysis cage and dialysates were collected for another 90 minutes. On day 2, after collection of dialysates under basal conditions, 1 μM scopolamine was added to the perfusion solution for stimulation of acetylcholine release. The dialysates were also collected for 90 min followed by another 90 min of dialysis without scopolamine. The microdialysate samples were then analyzed as follows. ACh level was measured by HPLC-ECD. Glucose metabolites (glucose, lactate, pyruvate) were measured by a CMA-600 microanalyzer. An alternative energy metabolite (beta-hydroxybutyrate/BHB) was measured by GC-MS. Choline and glycerol as membrane breakdown markers were also measured by HPLC-ECD and CMA-600 microanalyzer, respectively. Markers of oxidative stress (isoprostanes) were measured using a commercially available ELISA kit.
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This PhD thesis is dedicated to the extension of the portfolio of nuclear magnetic resonance (NMR) methods to characterize ribonucleic acids (RNAs). Only within the last few decades it has been realized that the cellular role of RNA goes well beyond the central dogma of molecular biology. In fact, RNA takes part in numerous cellular processes, executes numerous functions and acts either as a single player or in larger complexes, mostly RNA-protein complexes (RNPs) such as the ribosome or the spliceosome. This versatility in RNA function is coupled to a structural variety and the ability to adopt multiple long-lived and intricate conformations. Due to this high molecular complexity special demands are placed on the methods that are required for RNA structural characterization. With the ability to capture dynamics at atomic resolution and to measure under close to native conditions, NMR spectroscopy is undoubtedly a prime method for this purpose.
A general introduction to the current state of research, selected achievements as well as challenges in the field of NMR spectroscopy on RNA is given in Chapter I. This thesis is further composed of three independent chapters covering the three separate projects, which form the main body of work within the course of this thesis.
The imino group found in two of the four RNA nucleobases is generally considered to be the most powerful reporter group in the process of the NMR spectroscopic characterization of RNA. Its resonance assignment provides key information for a rapid determination of the RNA’s secondary structure. This is possible, since the imino proton can only be detected, if it is protected from rapid solvent exchange through hydrogen bonding interactions or, in rare cases, steric shielding. Consequently, information on flexible regions of RNA that are not protected against solvent exchange cannot be derived using this NMR spy. It is a key finding of the thesis that nucleobase interactions can also be mapped through the amino groups, as they similarly take part in base pairing or RNA-ligand interactions. Notably, solvent exchange of the amino protons is always slower compared to the imino proton. Thus, 1H,15N resonances of the amino group can be detected even for dynamic regions of RNA. Moreover, focusing on characterizing amino groups of RNA nucleobases increases the number of available reporters as amino groups are present in three out of four RNA nucleobases.
However, there is a reason that up to work conducted in this thesis, amino groups have not been used for monitoring RNA nucleobases: the rate of the C-NH2 bond rotation is most often close to the chemical shift differences of the two non-identical amino proton resonances, in particular for guanosines and adenosines, amino resonances regularly remain elusive in NMR spectra. Therefore, we developed experiments that excite double quantum (DQ) coherences of the two amino group protons and that further utilize 13C-detection. Results on these experiments are discussed in Chapter II and show that the rotational exchange can be avoided by evolving double quantum instead of single quantum (SQ) coherence in the indirect dimension of a 13C-detected C(N)H-HDQC experiment. The new experiment enables the detection of a full set of sharp amino resonances. The advantages of this experiment are immediately apparent when comparing the number of observable imino resonances in a classic 1H,15N-HSQC spectrum with the number of amino resonances obtained in the 13C-detected C(N)H-HDQC spectrum of the same RNA.
Furthermore, based on the newly available resonance assignment of amino groups, we developed a 13C-detected “amino”-NOESY experiment to obtain precious additional structural restraints. The 13C-detected “amino”-NOESY experiment enables the observation of NOE contacts that are not accessible using other 1H-detected NOESY experiment. Among these new NOE contacts are valuable, inter-residual correlations, which are otherwise scarce in RNA due to the proton deficiency of its nucleobases. We showed that the newly obtained NOE contacts are especially important in the structure determination of RNAs with only few NOE restraints. Under such circumstances, the inclusion of the newly obtained amino NOE contacts lead to a significant improvement in the root-mean-square deviation (RMSD) of the three-dimensional structure of the 34 nts GTP class II aptamer. Together the novel 13C-detected NMR experiments developed within this PhD project provide a valuable alternative for the imino-based characterization of nucleobase interactions.
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Hintergrund: Die LCPUFA der Zellmembran sind Ausgangspunkt für die Synthese von Lipidmediatoren und können je nach freigesetzter Fettsäure von der Zelle in pro- oder antientzündliche Mediatoren verstoffwechselt werden. LCPUFA können das Reaktionsprofil von Zellen beeinflussen, indem sie selbst oder die aus ihnen entstandenen Lipidmediatorderivate an Rezeptoren binden oder auf Genebene ihre Wirkung entfalten. Sowohl das antientzündliche Potenzial der Einzelfettsäuren EPA, DHA, GLA und SDA als auch die Wirkung des n-6/n-3-Verhältnisses wurden bereits in zahlreichen Studien gezeigt. Jedoch wurde noch nicht ausführlich auf den Einfluss einer Kombination verschiedener LCPUFA eingegangen, die sich im Hinblick auf die Verstoffwechselung von n-3- und n-6-Fettsäuren durch gleiche Enzyme wechselseitig beeinflussen können.
Zielsetzung: Ziel dieser Arbeit war es deshalb, den Einfluss von mehrfach ungesättigten Fettsäuren allein und in Kombination auf die COX-2-abhängige Inflammation in A549-Lungenepithelzellen zu untersuchen. Die Inkubation der Zellen mit den Einzelfettsäuren EPA, DHA, GLA und SDA wurde einem LCPUFA-Mix aus diesen vier Fettsäuren gegenübergestellt. Es wurde die IL-6-Produktion und die COX-2-Expression in CM1-stimulierten A549-Zellen als Marker einer Entzündung mittels CBA bzw. Durchflusszytometrie gemessen.
Ergebnisse: Durch die Oberflächencharakterisierung der A549-Zellen mittels Durchflusszytometrie konnte ihre Funktion im Immunsystem hervorgehoben werden. Die Inkubation mit den LCPUFA führte zur Aufnahme in die Zellmembran und zur weiteren Verstoffwechselung der Fettsäuren, wie sich gaschromatographisch nachweisen ließ. Der LCPUFA-Mix (0,02 pmol/Zelle) konnte die CM1 induzierte COX-2-Expression nur tendenziell erniedrigen. Im Gegensatz dazu ließ sich die COX-2-Expression durch eine gleiche Menge an EPA (0,02 pmol/Zelle) sehr signifikant (von 26,81% ± 2,78 auf 16,43% ± 1,45, p < 0,01) reduzieren. Die CM1-induzierte IL-6-Produktion wurde weder durch eine Einzellfettsäure EPA, DHA, GLA oder SDA noch den LCPUFA-Mix signifikant gesenkt.
Diskussion: In Übereinstimmung mit Corbière et al. wurden phänotypische Oberflächenmarker auf den A549-Zellen mittels Durchflusszytometrie gemessen, die sie zur Antigenpräsentation gegenüber T-Lymphozyten befähigen und zeigen, dass sie Teil des Immunsystems sind.[76] Im Gegensatz zum LCPUFA-Mix inhibierte EPA die COX-2-Expression. Zwar ist EPA die Hauptkomponente des LCPUFA-Mixes, dieser enthält aber zusätzlich DHA, GLA und SDA. Eine der vorgenannten drei Fettsäuren könnte den hemmenden Effekt des EPAs auf die COX-2 gemindert haben. Es ist aber auch denkbar, dass eine Interaktion der verschiedenen Fettsäuren zu einer geringeren Hemmung geführt hat. Auch andere Forschungsergebnisse bestätigen, dass die Stärke des Effektes von Fettsäuren abhängig von ihrer Kombination und Konzentration ist. Es stellt sich ein Wirkmaximum auf die Genexpression ein, das durch weitere Erhöhung der Fettsäuren nicht gesteigert werden kann und eventuell sogar ins Gegenteil umschlagen könnte. Gleissman et al. stellten erhöhte Spiegel an AA und COX-2 sowie einen geringeren Anteil an EPA und DHA in Tumorgeweben fest.[37] Für die A549-Zellen zeigten sich in der gaschromatographischen Messung ebenfalls im Vergleich zum AA-Anteil (5,72% ± 0,09) ein geringerer EPA- (0,95% ± 0,37) und DHA-Anteil (0,60% ± 0,07). Für COX-2-Inhibitoren konnten bereits antineoplastische Eigenschaften nachgewiesen werden.[94] Dies könnte ein Grund für die eingeschränkte Zellviabilität im XTT-Test bei höheren Fettsäure-Konzentrationen sein.
Fazit: Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass im Gegensatz zu DHA, GLA, SDA und dem LCPUFA-Mix nur EPA eine signifikante antiinflammatorische Wirkung auf die COX-2 ausübte. Jedoch konnte kein signifikanter antiinflammatorischer Effekt hinsichtlich der Produktion des proinflammatorischen Cytokins IL-6 festgestellt werden. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass weder einer alleinigen Fettsäure noch dem LCPUFA-Mix eine überlegene antiinflammatorische Wirkung auf alle hier untersuchten Parameter zugeordnet werden konnte.
Autophagy, together with the ubiquitin-proteasome system, is the main quality control pathway responsible for maintaining cell homeostasis. There are several types of autophagy distinguished by cargo selectivity and means of induction. This thesis focuses on macroautophagy, hereafter autophagy, where a double-layered membrane is formed originating from the endoplasmatic reticulum (ER) engulfing cargo selectively or unselectively. Subsequently, a vesicle forms around the cargo, an autophagosome, and eventually fuses with the lysosome leading to degradation of the vesicle content and release of the cargo “building blocks”. Basal autophagy continuously occurs, unselectively engulfing a portion of the cytoplasm. However, autophagy can also be induced by stress such as starvation, protein aggregation, damaged organelles, intracellular pathogens etc. In this case, the cargo is selectively targeted, and the fate of the autophagosome is the same as in basal autophagy. In recent years, interest in identifying mechanisms of autophagy regulation has risen due to its importance in neurodegenerative diseases and cancer. Given the complexity of the process, its execution is tightly regulated from initiation, autophagosome formation, expansion, closure, and finally fusion with the lysosome. Each of the steps involves different protein complexes, whose timely activity is orchestrated by post-translational modifications. One of them is ubiquitination. Ubiquitin is a small, 76-amino acid protein conjugated in a 3-step reaction to other proteins, in a reversible manner, meaning undone by deubiquitinases. Originally described as a degradation signal targeting proteins to the proteasome, today it is known it has various additional non-proteolytic functions, such as regulating a protein’s activity, localization, or interaction partners. The role of ubiquitin in autophagy has already been shown. However, given the reversibility and fine-tuning of the ubiquitin signal, many expected regulators remain unidentified. This work aimed to identify novel deubiquitinating enzymes that regulate autophagy. We identified ubiquitin-specific protease 11 (USP11) as a novel, negative regulator of autophagy. Loss of USP11 leads to an increase in autophagic flux, whereas overexpression of USP11 attenuates it. Moreover, this observation was reproducible in model organism Caenorhabditis elegans, emphasizing the importance of USP11 in autophagy regulation. To identify the mechanism of USP11-dependent autophagy regulation, we performed a USP11 interactome screen after 4 hour Torin1 treatment and identified a plethora of autophagy-related proteins. Following the most prominent hits, we have investigated versatile ways in which USP11 regulates autophagy. USP11 interacts with the PI3KC3 complex, the role of which is phosphorylating lipids of the ER, thereby initiating the formation of the autophagosomal membrane. Phosphorylated lipids serve as a recruitment signal for downstream effector proteins necessary for the membrane expansion. The core components of the complex are VPS34, the lipid kinase, ATG14, the protein responsible for targeting the complex to the ER, VPS15, a pseudokinase with a scaffolding role, Beclin1, a regulatory subunit, and NRBF2, the dimer-inducing subunit. We have found USP11 interacts with the complex and, based on its activity, USP11 influences post-translational status of all the aforementioned subunits, except for ATG14. Moreover, we have found that loss of USP11 leads to an increase in NRBF2 levels, whereas it does not change the levels of the other proteins. Given that the dimerization of the complex leads to an increase in complex activity, we investigated if the complex is more tightly formed in the absence of USP11, and if it is more active. We have found both to be the case. Although the exact mechanism of USP11-dependent PI3KC3 complex regulation remains to be identified, we found that loss of USP11 stimulates the complex formation and activity, likely contributing to the general effect of USP11 on autophagy flux. Additionally, we found that USP11 modulates levels of mTOR, the most upstream kinase in autophagy initiation steps and general multifaceted metabolism regulator. Loss of USP11 led to downregulation of mTOR levels, suggesting USP11 may rescue mTOR from proteasome-mediated degradation. Furthermore, we found mTOR to be differentially modified depending on the activity of USP11. However, it remains to be shown if USP11-dependent mTOR regulation contributes to the observed autophagy phenotype. Taken together, USP11 is a novel, versatile, negative regulator of autophagy, and an important addition to our knowledge on the regulation of autophagy by the ubiquitin system.
Classical Hodgkin lymphoma (cHL) is one of the most common malignant lymphomas in Western Europe. The nodular sclerosing subtype of cHL (NS cHL) is characterised by a proliferation of fibroblasts in the tumour microenvironment, leading to fibrotic bands surrounding the lymphoma infiltrate. Several studies have described a crosstalk between the tumour cells of cHL, the Hodgkin- and Reed-Sternberg (HRS) cells, and cancerassociated fibroblasts (CAF). However, to date a deep molecular understanding of these fibroblasts is lacking. Aim of the present study therefore was a comprehensive
characterisation of these fibroblasts. Moreover, only a few studies describe the interplay of HRS cells and CAF. The paracrine communication and direct interaction of these two
cellular fractions have been investigated within this study. Finally, the influence of a few HRS cells within a lymph node orchestrate the mere alteration of its architecture and
morphology. Gene expression and methylation profiles of fibroblasts isolated from primary lymph node suspensions revealed persistent differences between fibroblasts obtained from NS cHL and lymphadenitis. NS cHL derived fibroblasts exhibit a myofibroblastic - inflammatory phenotype characterised by MYOCD, CNN1 and IL-6 expression. TIMP3, an inhibitor of matrix metalloproteinases, was strongly upregulated in NS cHL fibroblasts, likely contributing to the accumulation of collagen in sclerotic bands of NS cHL. Treatment by luteolin could reverse this fibroblast phenotype and decrease TIMP3 secretion. NS cHL fibroblasts showed enhanced proliferation when they were exposed to soluble factors released from HRS cells. For HRS cells, soluble
factors from fibroblasts were not sufficient to protect them from Brentuximab-Vedotin(BV) induced cell death. However, HRS cells adherent to fibroblasts were protected from BV-induced injury. The cHL specific interaction of both cell fractions reveals an initiation of inflammatory key regulators such as IL13 and IL4. Among important adhesion molecules known from literature the blocking of integrin beta 1 solely interrupted the adhesion of HRS cells to CAF. In summary, this study proves the stable reprograming of CAF phenotype and expression derived from NS cHL. It presents a suitable in vitro model for studying the interaction of HRS cells and CAF by paracrine factors and adherence. Most importantly the observations confirm the importance of fibroblasts for HRS cells´ inflammatory niche and cell survival associated with TIMP3 which probably acts as a major factor to the typical accumulation of fibrosis observed in NS cHL.
Zentrales Forschungsanliegen der vorliegenden Abhandlung ist die Erörterung der Probleme, welche sich für die Corporate Governance einer Aktiengesellschaft ergeben, wenn abweichend vom gesetzlichen Optimalbild eine Divergenz zwischen dem Stimmrecht des Aktionärs und dessen wirtschaftlicher Betroffenheit vorliegt. Der von seinen Entscheidungen nicht proportional betroffene Aktionär soll als Corporate Governance Akteur in den Blick genommen werden.
Wieso aber lohnt sich eine erneute Befassung mit einem Problem, welches Easterbrook und Fischel bereits 1983 als ein solches identifiziert haben? Zum einen ist die internationale und deutsche Corporate Governance Debatte erheblich vorangeschritten. Steckte diese zum Zeitpunkt des Aufsatzes „Voting in Corporate Law“ noch in den Kinderschuhen, hat sie sich heute zu einem eigenen Forschungsfeld entwickelt, welches Juristen und Ökonomen in aller Welt beschäftigt. Der nicht proportional betroffene Aktionär wird in das durch diese Forschungsströmung entwickelte moderne Corporate Governance System eingeordnet. Zum anderen sind vor allem durch die Entwicklung vielfältiger Finanzderivate im Rahmen der sogenannten „derivatives revolution“ die Möglichkeiten durch schuldrechtliche Vereinbarungen eine entsprechende Disproportionalität zu erzeugen erheblich gestiegen. Während Easterbrook und Fischel noch feststellten „[…] it is not possible to seperate the voting right from the equity interest“, gestatten moderne Finanzprodukte es Aktionären, ihre wirtschaftliche Betroffenheit und zugleich deren Verhältnis zu ihrer Stimmrechtsmacht fast beliebig auszugestalten.
Die Zusammenschau aus einer erheblich diffizileren Corporate Governance Debatte in Verbindung mit einer neuen Vielzahl an Möglichkeiten eine Disproportionalität zwischen Stimmrecht und wirtschaftlicher Betroffenheit zu erzeugen, gibt der Thematik die notwendige Aktualität, die eine vertiefte Befassung anzeigt.
In Abgrenzung zu den bislang in diesem Themenkreis erschienenen Arbeiten, welche sich vor allem isoliert mit den Folgen für das Stimmrecht bzw. den einzelnen Anteilseigner befassen, thematisiert die vorliegende Abhandlung vor allem die Auswirkungen, welche die Trennung von Stimmrecht und wirtschaftlicher Betroffenheit für die Corporate Governance Struktur der Aktiengesellschaft nach sich ziehen kann. Auf diese Weise wird die Problematik der Ausübung disproportionaler Stimmrechte in die Erkenntnisse der Corporate Governance Theorie eingeordnet und insbesondere auch die ökonomischen Folgen selbiger herausgearbeitet. Die so gewonnenen Ergebnisse verdeutlichen den gesetzgeberischen Handlungsbedarf.
We study continuous dually epi-translation invariant valuations on certain cones of convex functions containing the space of finite-valued convex functions. Using the homogeneous decomposition of this space, we associate a certain distribution to any homogeneous valuation similar to the Goodey-Weil embedding for translation invariant valuations on convex bodies. The support of these distributions induces a corresponding notion of support for the underlying valuations, which imposes certain restrictions on these functionals, and we study the relation between the support of a valuation and its domain. This gives a partial answer to the question which dually epi-translation invariant valuations on finite-valued convex functions can be extended to larger cones of convex functions.
We also study topological properties of spaces of valuations with support contained in a fixed compact set. As an application of these results, we introduce the class of smooth valuations on convex functions and show that the subspace of smooth dually epi-translation invariant valuations is dense in the space of continuous dually epi-translation invariant valuation on finite-valued convex functions. These smooth valuations are given by integrating certain smooth differential forms over the graph of the differential of a convex function. We use this construction to give a characterization of a dense subspace of all continuous valuations on finite-valued convex functions that are rotation invariant as well as dually epi-translation invariant.
Using results from Alesker's theory of smooth valuations on convex bodies, we also show that any smooth valuation can be written as a convergent sum of mixed Hessian valuations. In particular, mixed Hessian valuations span a dense subspace, which is a version of McMullen’s conjecture for valuations on convex functions.
Seit der Entdeckung des HI-Virus in 1983, wurden diverse Beobachtungen zu neurologischen Komplikationen bei infizierten Patienten publiziert. Dabei standen initial lebensbedrohliche Komplikationen wie opportunistische Infektionen oder cerebrale Lymphome im Vordergrund. In Zeiten der antiretroviralen Therapie rücken jedoch vermehrt andere, chronisch verlaufende Folgen der Erkrankung in den Fokus. Neurokognitive Störungen bei HIV-infizierten wurden bereits erstmals im Jahre 1986 beschrieben. Seitdem wurden neben der manifesten HIV-assoziierten Demenz auch mildere Einbußen im kongitiven Bereich - sogenannte HIV-assoziierte neurokognitive Störungen (HAND) - klassifiziert, deren Diagnostik mittels diverser neuropsychologischer Testungen erfolgen kann. Hierfür sind geeignete Screening-Tools notwendig, die entsprechenden Anforderungen entsprechen sollten. Einheitliche Empfehlungen für einen bestimmten Test finden sich jedoch in aktuellen Leitlinien und Publikationen nicht. Die vorliegende Arbeit wurde zur Evaluation des MoCA-Tests (Montreal Cognitive Assessment) zur Detektion HIV-1-assoziierter neurokognitiver Störungen angefertigt.
Hierfür wurde der MoCA-Test an 89 HIV-infizierten Männern und Frauen zwischen 21 und 64 Jahren des HIV-Centers Frankfurt am Main durchgeführt und die Ergebnisse mit der gut validierten HIV-Demenz-Skala verglichen. Zudem wurde der Einfluss verschiedener Faktoren wie Geschlecht, Alter, CDC-Stadium, antiretrovirale Therapie, Dauer der HIV-Infektion, CD4-Zellzahl, Viruslast, HCV-Koinfektion, Bildung, Risikogruppenzugehörigkeit, Alkoholkonsum und CPE-Score untersucht.
Der Vergleich zwischen den absoluten Ergebnissen der HDS und des MoCA ergab einen hochsignifikanten statistischen Zusammenhang. Ein statistischer Zusammenhang konnte auch für die Parameter Alter, medikamentöse HIV-Therapie, Dauer der HIV-Infektion zum Untersuchungszeitpunkt sowie Bildung errechnet werden. Die relativen MoCA-Testergebnisse wurden sowohl mit einem Cut-off-Wert von 10 als auch einem Cut-off-Wert von 14 der HDS verglichen.
In Zusammenschau der Ergebnisse korreliert der MoCA-Test auf Grundlage der erhobenen Daten mit der HDS, wobei die Sensitivität in Bezug auf mildere kognitive Störungen niedriger als wünschenswert ist. Eine manifeste HIV-Demenz kann zuverlässig diagnostiziert werden, bei der Diagnostik von milderen Funktionseinschränkungen bestehen jedoch Limitationen. Auf Grund der einfachen Durchführung stellt er ein akzeptables alternatives Screening-Tool dar, wobei Personen mit auffälligen Testergebnissen einer weiteren neuropsychologischen Testung zugeführt werden sollten.
Für Patienten mit lebensbedrohlichen Herzkrankheiten ist die Extracorporeal-Life-Support-Behandlung (ECLS) eine sinnvolle Therapiemöglichkeit. Sie bietet für Patienten im kardiogenen Schock ein Zeitfenster, um eine myokardiale Erholung zu erreichen. Hierbei kann in Abhängigkeit vom Krankheitsbild die zusätzliche Anwendung von IABP die Heilungschancen begünstigen. In der durchgeführten retrospektiven Studie wurden 118 Patienten betrachtet, die in der Klinik für Thorax-, Herz- und thorakale Gefäßchirurgie der Universität Frankfurt am Main im Zeitraum von Dezember 2001 bis Ende 2013 eine ECLS-Therapie erhalten haben. Bei 59 Patienten wurde die ECLS-Unterstützung in Kombination mit IABP durchgeführt. Die beiden Patientenkollektive - mit und
ohne IABP- sind hinsichtlich ihrer Risikofaktoren vergleichbar. Ausgehend von der Zielsetzung dieser Arbeit wurde analysiert, ob der gleichzeitige Einsatz der IABP bei ECLS – Therapie von Vor- oder sogar von Nachteil ist. Hierfür wurden für die beiden Therapiegruppen Überlebenszeitanalysen nach Kaplan-Meier durchgeführt. Der statistische Vergleich der Überlebensraten und des Weaningerfolgs erfolgte mit Hilfe des Log-Rank-Tests.
Die Auswertung der erhobenen Daten hat ergeben, dass kein signifikanter Unterschied bei der 30-Tages-Überlebensrate und dem Weaningerfolg für die beiden Patientenkollektive mit und ohne zusätzliche IABP-Anwendung vorhanden ist. Risikofaktoren wie ein hohes Lebensalter oder eine bereits vor Einlieferung stattgefundene Intubation verringern außerdem die Überlebenschancen nach ECLS - Therapie. Ein fortgeschrittenes NYHA-Stadium konnte nicht als negativer prädiktiver Faktor identifiziert werden.
In der Literatur kommt man bezüglich der Mortalität unter alleiniger ECLS-Therapie oder dem zusätzlichen Einsatz einer IABP zu unterschiedlichen Ergebnissen. Diese besagen teilweise, dass ECLS und IABP einander ergänzende Methoden sind, die sich durchaus synergistisch auf den Behandlungserfolg auswirken können und dass die Mortalität beim zusätzlichen Einsatz einer IABP signifikant niedriger ist. Die Durchführung weiterer prospektiver Studien mit vergleichbaren Patientenkollektiven zur Untersuchung des Outcomes bei den unterschiedlichen Behandlungsmethoden ist jedoch erforderlich, um ein aussagekräftiges Fazit ziehen zu können.
Während meiner Promotion habe ich zwei Projekte unter der Aufsicht von Dr. Misha Kudryashev durchgeführt. Im ersten Projekt habe ich die Strukturen des Ryanodinrezeptors 1 (RyR1) in Apo- und Ryanodin-Bindungszuständen in der nativen Membran durch Tomographie und Subtomogramm-Mittelung bei 12,6 bzw. 17,5 Å bestimmt. Im Vergleich zur Struktur von gereinigtem RyR1 unter Verwendung der Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) können zusätzliche Dichten in der cytoplasmatischen Domäne und der sarkoplasmatischen Retikulum (SR)-Membran bzw. im SR-Lumen beobachtet werden. Die Auflösung der Struktur von RyR1 im Apo-Zustand wurde von den Kollegen in meinem Labor mithilfe der Hybridmethode auf 9,5 Å verbessert. Diese Arbeit hat unser Verständnis für die Mechanismen von RyR1 in nativen Membranen erweitert. Im zweiten Projekt habe ich die Struktur des Proteins SdeC der SidE-Familie durch Einzelpartikel-Kryo-EM bei 4,6 Å bestimmt. Die Kristallstruktur des C-Terminus von SdeA wurde von meinem Forschungspartner Dr. Mohit Misra gelöst. Durch Überlagerung einer gemeinsamen Helix dieser beiden Strukturen konnten wir ein kombiniertes Modell erstellen und ein allgemeines Verständnis der Proteine der SidE-Familie erhalten.
Einleitung: OTSC Proctology ist ein Verfahren in der Analfistelchirurgie dessen Erfolgsaussichten auch 9 Jahre nach der ersten klinischen Anwendung nicht abschließend beurteilt werden können. Die wenigen bisher publizierten Studien zeigen sehr divergente Ergebnisse mit Heilungsraten von 10 bis 90%.
Material und Methoden: Wir führten eine retrospektive Auswertung der Behandlungsergebnisse aller konsekutiven Patienten, die in dem Zeitraum vom 01.03.2014 bis 31.03.2017 in der koloproktologischen Abteilung der DKD Helios Klinik Wiesbaden mittels OTSC-Verfahren wegen Analfisteln operiert wurden, durch. Erfasst wurden Alter, Geschlecht, OP- und Aufenthaltsdauer, Operateur, Fistelart und –lokalisation, Vorhandensein von Stoma und CED, plastischer Fistelverschluss (PFV) in der Anamnese, Clipverbleib nach der OP, Dauer des Follow-ups, Komplikationen sowie postoperative Schmerzsituation. Die Datenauswertung erfolgte mittels deskriptiver Statistik bei Subgruppenanalyse unter Verwendung der Statistiksoftware SPSS 20.
Ergebnisse: Es wurden insgesamt 68 Fälle eingeschlossen, davon 37% weiblich und 63% männlich. Das durchschnittliche Alter betrug 52 Jahre (25 – 81). 19 (28%) Patienten litten an CED, 11 (16%) Patienten hatten ein Stoma. 34 (50%) der Patienten hatten plastischen Fistelverschluss in der Anamnese. Die Verteilung nach Fisteltyp war wie folgt: 58 (85%) transsphinktär, 4 (6%) suprasphinktär, 3 (4%) intersphinktär, 1 (1,5%) rektovaginal, 1 (1,5%) rektourethral und 1 (1,5%) Pouchfistel. Die häufigsten Fistelokalisationen waren bei 6 h (N = 26, 38%), 12 h (N = 14, 21%), 7 h (N = 7, 10%) und 3h (N = 5, 7%) SSL. Die durchschnittlichen OP-Dauer und stationärer Aufenthalt betrugen 25 min (6 – 90) und 7 Tage (1 – 14 Tage) entsprechend. Die durchschnittliche Dauer des Follow-ups betrug 29 Monate (10 – 36).
Die Fistelheilung im Gesamtkollektiv lag bei 48,5%, 1 (1,5%) Patient war lost-tofollow-up. In der weiblichen (N = 25) und männlichen (N = 43) Kohorte fand die Heilung in 40% und 53% der Fälle entsprechend statt. Die Heilungsraten bei intersphinktären (N = 3), transsphinktären (N = 58) und suprasphinktären (N = 4) Fisteln lagen bei 100%, 46,5% und 50% entsprechend, eine rektovaginale und eine rektourethrale Fistel sind nicht geheilt. Eine Pouchfistel ist geheilt.
Die Heilungsraten bei 6h und 12h SSL lagen bei 58% und 14% entsprechend mit deutlichem Vorteil bei posteriorer Fistellage. Dieser Vorteil blieb nach der Aufteilung der Fisteln in anteriore (N = 30) und posteriore (N = 38), mit
Heilungsraten von 33% und 60,5% entsprechend, bestehen. In den Subgruppen ohne CED (N = 49) und mit CED (N = 19) lagen die Heilungsraten bei 53% und 35% entsprechend. In den Subgruppen ohne PFV (N = 34) und mit PFV (N = 34) lagen die Heilungsraten bei 59% und 38% entsprechend. In der Subgruppe ohne Stoma (N = 57) wurde eine Heilung in 47% der Fälle, in der Subgruppe mit Stoma (N = 11) in 55% beobachtet. In der Subgruppe mit den kryploglandulären Fisteln (N = 47) war die Heilung in 55,3% zu sehen und in der Subgruppe mit
kryptoglandulären Fisteln ohne PFV (N = 27) bei 63%.
In 48 (70,6%) Fällen wurde der Clip aktiv entfernt, in 11 (16,2%) Fällen kam es zum Spontanverlust und in 8 (11,8%) Fällen blieb der Clip in situ. Die durchschnittliche Zeit bis zur Klammerentfernung betrug 4 Monate. Die Heilungsraten bei Clipentfernung, Clipverbleib und Clipspontanabgang lagen bei 42%, 100% und 45% entsprechend.
Der maximale Schmerz nach NRS 0 – 2 bei 61% der Patienten, NRS 3 – 4 bei 28% und NRS 5 – 7 nur bei 11%. Bei 50% der Fälle war kein Opiat erforderlich und bei 39% der Fälle erfolgte die Opiateinnahme nicht länger als 2 Tage.
Die Komplikationen waren sehr selten: eine Nachblutung mit Clipdislokation (1,5%), ein Analabszess (1,5%), 2 Fälle (3%) der neuaufgetretenen Stuhlschmieren und 1 (1,5%) Wundheilungsstörung intraanal, die spontan abheilte. In 4 (6%) Fällen kam es zur Klammerdislokation vom inneren
Fistelostium mit konsekutiver Fistelpersistenz.
Fazit: OTSC ist ein komplikationsarmes und schmerzarmes Verfahren mit kurzer OP-Zeit und könnte einen festen Platz in der Analfistelchirurgie einnehmen. Die bestmöglichen Ergebnisse lassen sich bei dorsal gelegenen Analfisteln in
nichtvoroperierten Patienten ohne CED erzielen.
Diese Arbeit beschäftigt sich mit linearen inversen Problemen, wie sie in einer Vielzahl an Anwendungen auftreten. Diese Probleme zeichnen sich dadurch aus, dass sie typischerweise schlecht gestellt sind, was in erster Linie die Stabilität betrifft. Selbst kleinste Messfehler haben enorme Konsequenzen für die Rekonstruktion der zu bestimmenden Größe.
Um eine robuste Rekonstruktion zu ermöglichen, muss das Problem regularisiert, dass heißt durch eine ganze Familie abgeänderter, stabiler Approximationen ersetzt werden. Die konkrete Wahl aus der Familie, die sogenannte Parameterwahlstrategie, stützt sich dann auf zusätzliche ad hoc Annahmen über den Messfehler. Typischerweise ist dies im deterministischen Fall die Kenntnis einer oberen Schranke an die Norm des Datenfehlers, oder im stochastischen Fall, die Kenntnis der Verteilung des Fehlers, beziehungsweise die Einschränkung auf eine bestimmte Klasse von Verteilungen, zumeist Gaußsche. In der vorliegenden Arbeit wird untersucht, wie sich diese Informationen unter der Annahme der Wiederholbarkeit der Messung gewinnen lassen. Die Daten werden dabei aus mehreren Messungen gemittelt, welche einer beliebigen, unbekannten Verteilung folgen, wobei die zur Lösung des Problems unweigerlich notwendige Fehlerschranke geschätzt wird. Auf Mittelwert und Schätzer wird dann ein klassisches Regularisierungsverfahren angewandt. Als Regularisierungen werden größtenteils Filter-basierte Verfahren behandelt, die sich auf die Spektralzerlegung des Problems stützen. Als Parameterwahlstrategien werden sowohl einfache a priori-Wahlen betrachtet, als auch das Diskrepanzprinzip als adaptives Verfahren. Es wird Konvergenz für unbekannte beliebige Fehlerverteilungen mit endlicher Varianz sowie für Weißes Rauschen (bezüglich allgemeiner Diskretisierungen) nachgewiesen. Schließlich wird noch die Konvergenz des Diskrepanzprinzips für ein stochastisches Gradientenverfahren gezeigt, als erste rigorose Analyse einer adaptiven Stoppregel für ein solches nicht Filter-basiertes Regularisierungsverfahren.
Reliable and efficient recording of the error-related negativity with a speeded Eriksen Flanker task
(2020)
There is accumulating evidence that the error-related negativity (ERN), an event-related potential elicited after erroneous actions, is altered in different psychiatric disorders and may help to guide treatment options. Thus, the ERN is a promising candidate as a psychiatric biomarker. Basic methodological requirements for a biomarker are standardized and reliable measurements. Additional psychiatry specific requirements are time efficiency and patient-friendliness.
The aim of the present study is to establish ERN acquisition in a reliable, time-efficient and patient-friendly way for use in clinical practice.
Healthy subjects (N=27) performed a modified Eriksen Flanker Task with adaptive reaction time window and only incongruent stimuli that maximizes the number of errors. All participants were tested for mental health by the Mini International Neuropsychiatric Interview (M.I.N.I.). The first N=12 subjects were part of a pilot study and further N=14 subjects were included for analysis (one subject was excluded due to technical problems). In a test-retest design with two sessions separated by 28 days the reliability of the ERN has been assessed. To ensure external validity, we aimed to replicate previously reported correlation patterns of ERN amplitude with (1) number of errors and (2) negative affect. State affect of each subject was measured by the Positive and Negative Affect Schedule. In order to optimize the clinical use of the task, we determined to which extent the task can be shortened while keeping reliability >0.80.
We found excellent reliability of the ERN (intraclass correlation coefficient =0.806-0.947) and replicated specific correlation patterns (ERN amplitude with relative number of errors: r=0.394; p=0.082; ERN amplitude with negative affect: r=-0.583, p=0.014). The task can be shortened to a patient-friendly and clinically feasible length of only 8 minutes keeping reliability >0.80.
To conclude, the present modified task provides reliable and efficient recording of the ERN, facilitating its use as a psychiatric biomarker.
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Erzeugung und Charakterisierung verschiedenartiger piezoresistiver Dünnschichten für die Druck- und Dehnungssensorik bei hohen Temperaturen, die mittels Sputterdeposition abgeschieden werden:
- metallische Schichten aus Chrom mit Verunreinigungen aus Sauerstoff, Stickstoff oder Platin,
- granulare Keramik-Metall-Schichten (Cermets), mit Platin oder Nickel als Metallkomponente und Aluminiumoxid (Al2O3) oder Bornitrid (BN) als Keramikkomponente.
Beide Schichttypen können mit geeigneten Beschichtungsparametern erhebliche piezoresistive Effekte aufweisen, also einen Widerstands-Dehnungs-Effekt, der den von typischen Metallschichten um ein Mehrfaches übersteigt. Der Effekt wird quantifiziert durch den k-Faktor, der die relative Änderung des Widerstands R auf die relative Änderung der Länge l, d.h. die Dehnung ε=Δl/l, bezieht: k=ΔR/(R ε).
In Beschichtungsreihen werden die Schichtzusammensetzung und die Depositionsbedingungen variiert und die Auswirkungen auf den elektrischen Widerstand, dessen Temperaturkoeffizienten (TKR), sowie den k-Faktor untersucht. Die k-Faktoren der chrombasierten Schichten liegen bei 10 bis 20 mit um null einstellbarem TKR. Die Cermet-Schichten erreichen je nach Material k-Faktoren von 7 bis über 70 mit meist stark negativen TKR von mehreren -0,1 %/K.
Die Chrom- und Chrom-Stickstoff-Schichten erweisen sich als geeignete Sensorschichten für Membran-Drucksensoren. Daher wird eine Reihe von Sensoren mit Wheatstone-Messbrücken erzeugt und charakterisiert. Sie zeigen den hohen k-Faktoren entsprechende hohe Signalspannen. Die guten Sensoreigenschaften bleiben auch bei hohen Temperaturen bis 230 °C erhalten.
Nach den ersten Untersuchungen bei Dehnungen bis maximal 0,1 % wird zusätzlich das Verhalten der Schichten bei höheren Dehnungen bis 1,4 % untersucht. Es zeigt sich vorwiegend ein lineares Widerstands-Dehnungs-Verhalten. Die Leiterbahnen der spröden chrombasierten Schichten werden bei Dehnungen um 0,7 % jedoch durch Risse zerstört, die sich von den Rändern der Schicht her ausbreiten.
Die Platin-Aluminiumoxid-Schicht zeigt einen enorm großen, nichtlinearen Widerstands-Dehnungs-Effekt, der auf Risse zurückgeführt werden kann, die sich nach einigen Belastungszyklen reproduzierbar öffnen und schließen.
Tieftemperaturmessungen von 2 bis 300 K zeigen Widerstandsminima der Chrom-Stickstoff-Schichten; Magnetwiderstandsmessungen deuten jedoch nicht auf den Kondo-Effekt hin.
Die Cermet-Schichten zeigen thermisch aktivierte Leitfähigkeit.
Ausgewählte Schichten werden bei Temperaturen bis 420 °C (693 K) charakterisiert. Die chrombasierten Schichten haben bei hohen Temperaturen stabile Widerstände, zeigen jedoch stark nichtlineare Temperaturverläufe von Widerstand und k-Faktor. Oberhalb einer gewissen Temperatur verschwindet der piezoresistive Effekt, kehrt jedoch beim Abkühlen zurück. Die Verläufe lassen sich durch die Schichtzusammensetzung und auch durch Temperaturbehandlungen modifizieren.
Die Platin-Aluminiumoxid-Schicht ist ebenfalls temperaturstabil und zeigt geringe Änderungen des k-Faktors im Temperaturverlauf. Platin-Bornitrid zeigt große, reversible Widerstandsänderungen bei höheren Temperaturen, die auf mögliche Gaseinlagerungen hindeuten.
Aus den experimentellen Ergebnissen lassen sich die Ursachen der Piezoresistivität ableiten: Die chrombasierten Schichten bilden, wie in der Literatur vielfach beschrieben, unterhalb einer Ordnungstemperatur einen Spindichtewellen-Antiferromagnetismus aus. Dieser Zustand führt zu einem zusätzlichen Widerstandsbeitrag, der die beschriebenen Nichtlinearitäten der Widerstands-Temperatur-Verläufe verursacht und zudem empfindlich auf mechanische Dehnung reagiert und so zu erhöhten k-Faktoren führt.
Die Piezoresistivität der Cermet-Schichten resultiert aus der granularen Struktur, in der Ladungsträger zwischen Metallpartikeln tunneln. Mit exponentiell vom Partikelabstand abhängigen Widerständen der Tunnelübergänge resultieren hohe k-Faktoren. Mithilfe von Modellbetrachtungen, in denen Gleichungen für Tunnelwiderstände auf granulare Systeme angewendet werden, werden die experimentellen Ergebnisse diskutiert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich die Eigenschaften der Keramik vorrangig auf den Betrag der k-Faktoren auswirken und die Eigenschaften des Metalls vor allem den TKR beeinflussen.
Cancer cells, including leukemic cells, can react to therapeutic treatment by altering their metabolic phenotype (“metabolic reprogramming”) to keep their accelerated proliferative state, eventually becoming resistant to the treatment. There is an increasing amount of evidence indicating that metabolic reprogramming is one of the key mechanisms of acquisition of drug resistance by cancer cells. In agreement, several metabolic studies targeting leukaemia and specifically acute myeloid leukaemia (AML) and chronic myeloid leukaemia (CML), have been conducted over the last decades. However, there is still a lack of understanding the metabolic features of both AML and CML leukaemia specially in the acquisition of drug resistance, that is needed for unveiling novel and effective treatments for resistant and non-resistant patients. Therefore, the main objective of this thesis was to investigate the rewiring of cell metabolism occurring in the process of acquisition of resistance to conventional therapeutic treatments in AML and CML malignancies. Next, by revealing this metabolic rewiring, we intended to highlight potential metabolic and non-metabolic targets that could be exploited to overcome resistance to treatments. To this end, we have performed a comprehensive and comparative multi-OMIC study to analyse the links between the metabolic reprogramming and the resistance acquisition of THP-1 and HL-60 AML cell models sensitive or resistant to cytarabine (AraC) and doxorubicin (Dox), and of KU812 CML cell model sensitive or resistant to imatinib, all under normoxic (21% O2) and hypoxic (1% O2) conditions. The results of this thesis are divided into two chapters. On the one hand, in Chapter 1, the multi-OMIC study performed in AML parental and resistant cells unveiled that the acquisition of AraC resistance causes the reprogramming of the glucose metabolism of THP-1 and HL-60 cells by increasing the glycolytic flux whereas it is not associated with an alteration in the mitochondrial respiration. Moreover, our results also exhibited a possible disfunction of ETC complex I as well as alterations in glutamine and serine-glycine-1C metabolism in AML cells that display a more active mitochondrial metabolism. Moreover, we have also identified that the acquisition of Dox resistance causes alterations in the glucose and amino acid metabolism. Importantly, we have observed an important loss of mitochondrial respiration capacity of AML cells resistant to Dox chemotherapeutic drug, which constitutes a potential metabolic vulnerability that can be exploited for the treatment of AML patients resistant to Dox. On the other hand, in Chapter 2 is shown that the acquisition of imatinib resistance causes the reprogramming of glucose metabolism by enhancing the glycolytic flux, PPP, and glycogen metabolism, thus highlighting these metabolic pathways as potential metabolic weaknesses of KU812 cells resistant to imatinib. Moreover, we have observed a high metabolic plasticity of KU812 cells resistant to imatinib which includes the orchestration of many metabolic routes associated with the amino acid metabolism. Importantly, the CML multi-OMIC study has also unveiled an enhanced mitochondrial respiration capacity, which constitutes another potential vulnerability that can be exploited to overcome imatinib resistance. Finally, both AML and CML multi-OMIC studies have allowed us to propose and/or validate different metabolic and non-metabolic targets. In this regard, in this thesis we have identified and validated a battery of single-hit inhibitions that were able to reduce the cell viability of both parental and resistant AML and CML cells. Finally, we have confirmed that the repurposing of Dox chemotherapeutic drug counteracts the imatinib resistance in the KU812 cells resistant to imatinib.
Investigation of co-translational protein folding using cryo-EM and solid-state NMR enhanced by DNP
(2020)
Die zelluläre Proteinbiosynthese findet am Peptidyltransferase-Zentrum innerhalb der großen ribosomalen Untereinheit statt. Die neu synthetisierte Polypeptidkette passiert den ribosomalen Exit-Tunnel, der 80-100 Å lang und 10-20 Å breit ist. Proteinfaltung findet kotranslational statt, während die Peptidkette durch den ribosomalen Tunnel geschleust wird. Zu welchem Ausmaß die Proteine ihre native Struktur noch am Ribosom gebunden annehmen, steht im Fokus aktueller Studien. Verschiedene Methoden, die naszierende Proteinkette am Ribosom zu arretieren und die Faltung des Proteins untersuchen zu können, wurden entwickelt. Zur Herstellung von Ribosom naszierenden Proteinkomplexen (RNCs) in vivo werden Arrestierungspeptide (APs) verwendet. Ein oft genutztes AP ist die 17 Aminosäuren lange SecM Sequenz des E. coli Sekretionsmonitors, das C-Terminal an das zu untersuchende Protein kloniert werden kann und dadurch die Peptidkette am Ribosom behält. RNCs wurden mittels verschiedener Methoden untersucht, einschließlich Proteolyse-Experimenten, enzymatischen Aktivitätsmessungen, FRET, Cryo-EM und NMR-Spektroskopie. Alle Methoden zeigten auf, dass sich die Proteine kotranslational falten und auch am Ribosom eine funktionale Struktur annehmen können. Außerdem konnte eine Peptidkette eine α-Helix innerhalb des Ribosoms ausbilden. Ebenso wurden nicht-native kompakte Strukturen innerhalb der Vestibule detektiert.
Die Translation ist ein nicht-uniformer Prozess und der genetische Code degeneriert mit bis zu sechs Codons, die eine einzelne Aminosäure kodieren. Die Verteilung dieser synonymen Codons ist nicht zufällig und sie werden mit verschiedenen Frequenzen innerhalb eines ORFs verwendet. Codons mit einer höheren tRNA Häufigkeit werden schneller eingebaut als Codons, die seltener verwendet werden. Diese seltenen Codons sind häufig zwischen Proteindomänen oder Sekundärstrukturelementen platziert und könnten daher zur Separierung von Faltungsevents dienen. Dass der Austausch von synonymen Codons nicht ohne Folgen ist, zeigten verschiedene Studien. Buhr et al. (2016) zeigte, dass der synonyme Austausch die Translationsgeschwindigkeit, aber auch die Proteinkonformation des bovinen Augenlinsenproteins γB crystallin (GBC) beeinflusst. Während die unmodifizierte Gensequenz aus B. taurus in E. coli langsamer translatiert wurde und zu einem vollständig reduzierten GBC Protein (U) führte, wurde die harmonisierte Genvariante, die der Codon-Verwendung in E. coli angepasst war, schneller exprimiert und resultierte in einem teilweise oxidierten GBC Protein (H). Dieser Befund war der Ausgangspunkt für diese Doktorarbeit.
Die gemessenen Oxidationsunterschiede basieren auf der unterschiedlichen Translationsgeschwindigkeit der beiden Gensequenzen. Die N-terminale Domäne (NTD) des Zweidomänen-Proteins GBC enthält sechs der insgesamt sieben Cysteinreste. Nur in dieser Domäne wurde Oxidation detektiert und die drei Cysteine Cys18, Cys22 und Cys78 bilden eine Ansammlung mit einem Abstand von 5.4-6.4 Å. Um zu untersuchen, ob die Unterschiede bereits nach der Translation der NTD ausgebildet werden, wurde ein Ein-Domänen-Konstrukt hergestellt. Dieses Konstrukt beinhaltete die Aminosäuren 1-82, aber nicht den Peptidlinker, der beide Domänen verbindet. Allerdings wurden bei der Translation der ersten 70 Aminosäuren die meisten Translationspausen detektiert. Das 2D 1H-15N HSQC wies anhand der unterschiedlichen chemischen Verschiebung der Signale auf eine gefaltete Proteinstruktur hin. Daher konnte sich die NTD ohne Beteiligung der CTD eigenständig falten. Zugabe von DTT zu beiden Proteinvarianten U und H führte zu keinem messbaren Effekt. Im Gegensatz zu dem Volllängen-Protein, in dem die Variante H teilweise oxidiert war, war die NTD der Variante H vollständig reduziert.
Zusätzlich sollte geklärt werden, ob auch mögliche Disulfidbrücken im Inneren des Ribosoms ausgebildet werden können. Dann könnte in beiden Genvarianten eine anfängliche Disulfidbrücke ausgebildet werden und durch die unterschiedliche Translationsgeschwindigkeit die Disulfidbrücke in der langsamen Genvariante im E. coli Zytosol reduziert werden, während diese in der schneller translatierten Variante von der CTD geschützt wird. Um zu untersuchen, ob in der Tat Disulfidbrücken im ribosomalen Tunnel ausgebildet werden können, wurden GBC-Fragmente mittels der SecM Sequenz an das Ribosom arretiert und diese RNCs mittels theoretischer Simulation, Festkörper-NMR, Massenspektrometrie und Cryo-EM gemessen.
Theoretische Simulation mittels flexible-mecanno zeigten, dass der ribosomale Tunnel groß genug für die Ausbildung verschiedenster Disulfidbrücken ist. In einem U32SecM Konstrukt, das vier Cysteine und die SecM Sequenz beinhaltet, konnten alle theoretisch möglichen Disulfidbrücken gebildet werden.
...
Fokus meiner Doktorarbeit ist die Anwendung und Entwicklung NMR-spektroskopischer Methoden zur Charakterisierung zeitabhängiger Strukturänderungen von Biomolekülen – von lokalen dynamischen Veränderungen bis zur vollständigen Rückfaltung von Proteinen – und fasst die Ergebnisse meiner drei wichtigsten PhD-Projekte zusammen.
In meinem ersten Projekt habe ich die Leistung eines Temperatursprung-Probenkopfs – mit dem Proben mit hoher Salzkonzentration schnell erwärmt werden können – mithilfe einer Hochfrequenzspule technisch optimiert. Die optimierten Radiofrequenz-Bestrahlungsparameter, Lösungsmittel-bedingungen und der reduzierte Arbeitszyklus führten zu einem Temperatursprung von 20 °C in 400 ms. Ich habe eine Cystein-freie Mutante von Barstar hergestellt, die nach Zugabe von Harnstoff bei 0 °C kalt denaturiert werden kann, während sie ihren gefalteten Zustand bei 30 °C hält. Dadurch wurde auch ermöglicht, dass der Rückfaltungsprozess hunderte Male ohne Abbau oder Aggregation wiederholt werden kann. Die Kombination von reversibler Rückfaltung und rascher Temperaturänderung des kalt denaturierten Barstars ermöglichte die Entwicklung eines neuen kinetischen Experiments, bei dem der Rückfaltungsprozess von Barstar mit einem zweidimensionalen Echtzeit-NMR in hoher Zeitauflösung untersucht wird. Die vollständige Rückgratresonanzzuweisung wurde sowohl für den gefalteten als auch für den kalt denaturierten Zustand von Barstar durchgeführt und ergab, dass in der denaturierten Form beide Prolin-Reste einen gemischten Konformationszustand aufweisen. Dabei befindet sich die Tyr47-Pro48-Amidbindung im ungefalteten Zustand hauptsächlich in trans-, während im gefalteten Zustand in der seltenen cis-Konformation. Das neue hochauflösende kinetische Experiment zeigte, dass die Rückfaltung von Barstar durch die trans-cis-Isomerisierung der Tyr47-Pro48-Amidbindung verlangsamt wird, was sowohl die Sekundärstruktur als auch die Bildung der Tertiärstruktur beeinflusst. Basierend auf diesen Ergebnissen konnte ich einen plausiblen Faltungsmechanismus für den langsamen Faltungsweg von kalt denaturiertem Barstar skizzieren. Durch Änderung der Zeitparameter des Heizungszyklus wurde erreicht, dass die Tyr47-Pro48-Amidbindung im ungefalteten Zustand in der cis-Konformation bleibt und daher der schnelle Faltungsweg dominant wird. Das Starten des Magnetisierungstransfers vor der Temperaturänderung ermöglichte die Aufzeichnung eines Spektrums, das den entfalteten Zustand mit dem gefalteten Zustand korreliert. Dieses Spektrum ermöglichte quantitative Analysen des schnellen Faltungsweges und lieferte sogar indirekte Hinweise auf einen Zwischenzustand. Diese Methode aus Kombination von schnellem Temperatursprung und Kaltdenaturierung zeigt ein hohes Potenzial, Proteinfaltung auf atomarer Ebene experimentell zu untersuchen und ein tieferes Verständnis verschiedener Faltungswege zu erlangen.
In meinem zweiten Projekt – das Teil einer interdisziplinären Forschung war – konzentrierte ich mich auf die NMR-spektroskopische Charakterisierung von Nukleinsäuren, die mit einer photolabilen Schutzgruppe modifiziert wurden. Zuerst wurde mithilfe homonuklearer Korrelationsexperimente eine vollständige Protonresonanzzuweisung erreicht. Danach wurde die relative Konfiguration der photolabilen Schutzgruppen bestimmt basierend auf einer dreidimensionalen Modellstruktur und spezifischer NOE-Korrelationen. Des Weiteren wurde ein Strukturmodell unter Verwendung von NOE-Einschränkungen berechnet. Dieses Strukturmodell zeigte eine eingeschränkte Rotation um die CN-Bindung zwischen dem Käfig und der Nukleobase. Das Modell zeigte auch, dass der Käfig in der Hauptrille positioniert ist und nicht in das Lösungsmittel herausklappt. Im Vergleich zu einem zuvor charakterisierten NPE-Käfig führte die erhöhte Größe zu einer weiteren Senkung des Schmelzpunkts, zeigte jedoch einen geringeren Schmelzpunktunterschied zwischen der S- und der R-Konfiguration des Käfigs, wobei die S-Konfiguration zu einer größeren Reduktion des Schmelzpunktes führt. Dieser Trend wurde weiter untersucht und durch ein Screening unterstützt. Durch selektive Wasserinversions-Rückgewinnungsexperimente konnte ich auch zeigen, dass der Käfig die lokale Stabilität nur bis zu einer Entfernung von zwei benachbarten Basenpaaren von der Modifikationsstelle verringert. Die NOE-Daten dienten auch als guter Bezugspunkt, um die Qualität molekulardynamischer Simulationen zu testen, mit denen zusätzliche Käfigdesigns untersucht wurden. Die Kombination aus Synthese, NMR-Spektroskopie und MD-Simulationen ermöglichte bis jetzt die detaillierteste Untersuchung des Effekts vom Einbau eines einzelnen Käfigs zur Destabilisierung der DNA-Sekundärstruktur. Dabei wurden Einschränkungen des möglichen Designs aufgedeckt, aber auch die Entwicklung einer neuen, effizienteren Struktur ermöglicht.
Mein drittes Projekt konzentrierte sich auf die Charakterisierung eines RNA-Modellsystems. NMR-spektroskopische Daten von kleinen RNA-Modellsystemen – wie NOE, skalare Kopplungen, kreuzkorrelierte Relaxationsraten und RDC – sind eine unschätzbare Referenz für MD-Simulationen, obwohl die Menge der verfügbaren Literaturdaten – bis jetzt – sehr begrenzt ist. ...
Cancer is the major cause of death besides cardiovascular disease. Leukaemia represents the most prevalent malignancy in children with a frequency of 30 % and is one of the ten leading types of cancer in adults. Philadelphia Chromosome-positive B-ALL (Ph+ B-ALL) is driven by the cytogenetic aberration of the reciprocal chromosomal translocation t(9;22)(q34;q11) leading to the formation of the Philadelphia chromosome with a BCR-ABL1 fusion gene. This fusion gene encodes a BCR-ABL1 oncoprotein which is characterized by a constitutively enhanced tyrosine kinase activity promoting amplified proliferation, differentiation arrest and resistance to cell death. Ph+ B-ALL is considered the most aggressive ALL subtype with a long-term survival rate in the range of only 30 % despite intensive standard of care including chemotherapy in combination with a tyrosine kinase inhibitor (TKI) followed by allogeneic stem cell transplantation after remission for clinically fit patients.
The efficacy of chemotherapy has long been mainly attributed to tumour cell toxicity while immune modulating effects have been overlooked, especially in light of known immunosuppressive properties. Accumulative evidence, however, emphasizes the ability of chemotherapeutic agents, including TKIs, to normalise or re-educate a dysfunctional tumour microenvironment (TME) resulting in enhanced anti-tumour immunity. One of the underlying mechanisms of immune modulation is the induction of immunogenic cell death (ICD). ICD is an anti-tumour agent-induced cell death modality determined by the capacity to convert cancer cells into anti-cancer vaccines. The induction of ICD relies on the release of damage-associated molecular patterns (DAMPs) from dying tumour cells succumbing to ICD. Translocation of CALR to the cell surface, extracellular secretion of ATP and release of HMGB1 from the nucleus are key hallmarks of ICD that mediate anti-tumour immunity upon binding to antigen presenting cells resulting in a tumour antigen-specific immune response. Besides these molecular determinants, ICD is functionally defined by the inhibition of tumour growth in a vaccination assay in which mice are injected with tumour cells exposed to the potential ICD inducer in-vitro and then re-challenged with live tumour cells of the same cancer type. Both molecular and functional criteria determine the gold standard approach to assess ICD. By increasing the immunogenicity of cancer cells, ICD contributes to the restoration of immunosurveillance as an essential feature of tumour rejection, which is clinically reflected by improved therapeutic efficacy and disease outcome in patients. Therefore, identifying novel ICD inducers is an objective of interest in the context of cancer therapy.
In respect of these considerations, the aim addressed in the present work is the examination of the second-generation TKI Nilotinib for the ability to induce ICD. The thesis is set in the context of the group's research on the role of Gas6/TAM signalling within the TME regarding the pathogenesis of acute leukaemia. In in-vivo experiments of our research group it has been consistently observed that the use of Nilotinib enhances the anti-leukaemic immunity mediated by a deletion of Gas6. Against the background of increasing importance of chemotherapeutic agents as potent modulators of a dysregulated TME, it was hypothesized that Nilotinib may synergize with a Gas6-deficient environment by inducing ICD in Ph+ B-ALL cells.
In growth inhibition and Annexin V/Propidium iodide cell death assays Nilotinib was shown to induce cell death in concentration-dependent manner that occurs bimodally in terms of cell death modality ranging between apoptosis and necrosis. By ICD marker analysis, comprising flow-cytometric detection of CALR exposure, chemoluminescence-based ATP measurement and immunoblotting for HMGB1, it was found that Nilotinib-induced cell death is not accompanied by CALR exposure and ATP secretion, but is associated with the release of HMGB1. In macrophages co-culture experiments with Nilotinib-treated leukaemic cells, no relevant shift in terms of macrophages activation and polarisation was observed in either a juxtacrine or paracrine setup. In consistency with the results obtained in the in-vitro experiments, Nilotinib was not potent to elicit a protective immune response in mice within a vaccination assay.
Conclusively, Nilotinib was identified to not qualify as bona fide ICD inducer. The role of Nilotinib-induced cell death and HMGB1 release are proposed as objective for further investigation concerning the synergistic interplay between Nilotinib and a Gas6-deficient environment. Efforts addressing exploration and optimisation of the immunological potential of chemotherapeutic agents are a promising approach aimed at providing cancer patients with the best possible treatment in future.
This thesis reports three experiments on structural choices during grammatical encoding in monolingual adult speakers of German. Conceptual accessibility, one of the most central notions in language production research, as well as the phenomena of structural and perceptual priming are investigated.
In the first two experiments, a manipulation in terms of inherent conceptual accessibility which has shown universal influences on language production - the factor animacy - is combined with a manipulation making the non-canonical passive structure itself more accessible via structural priming.
Results show that, in addition to a preference for animate entities preceding inanimate entities, speakers can be structurally primed. Structural priming of passive structures led to significantly more passive responses compared to (intransitive) baseline structures.
This holds for monologue settings (Experiment 1) as well as dialogue settings (Experiment 2).
The structural priming effect was stronger in the dialogue setting compared to the monologue setting.
The third experiment combines contexts manipulating the derived conceptual accessibility of one of two entities to be described with a visual cueing manipulation increasing the perceptual accessibility of one of the referents.
Whereas a comprehensive literature review as well as the experimental work conducted within this thesis suggest that animacy and topicalization may exert universal influences on structural choices during language production, perceptual accessibility does not seem to have this potential.
In line with previous cross-linguistic work, perceptual priming in form of an implicit visual cueing manipulation did not show significant effects on speakers' structural choices in German.
These findings contrast with findings obtained for English, suggesting that language-specific characteristics in terms of word order flexibility may influence effcts on grammatical encoding during language production.
Increasing the derived accessibility of one of two referents, however, once again showed significant influences on speakers' structural choices with the topicalization of a patient referent leading to an enhanced production of passive responses.
Human protein kinases play essential roles in cellular signaling pathways and - if deregulated - are linked to a large diversity of diseases such as cancer and inflammation or to metabolic diseases. Because of their key role in disease development or progression, kinases have developed into major drug targets resulting in the approval of 52 kinase inhibitors by the Food and Drug Administration (FDA) so far.
Within the drug discovery process, the affinity of the inhibitors is the parameter that is used most often to predict the later efficacy in humans. However, the kinetics of binding have recently emerged as an important but largely neglected factor of kinase inhibitor efficacy. To efficiently suppress a signaling pathway, the targeted kinase needs to be continuously inhibited. Thus, it has been hypothesized that fast binding on-rates and slow off-rates would be the preferred property of an efficacious inhibitor. Despite optimizing the potency of kinase inhibitors, in the past decade optimization of kinetic selectivity has therefore gained interest as a molecule cannot be active unless it is bound, as Paul Ehrlich once stated. There is increasing evidence of correlations between prolonged drug-target residence time and increased drug efficacy, and that inhibitor selectivity in cellular contexts can be modulated by altered residence times. In order to contribute to the understanding of the effect of long residence times on cellular targets we initiated two projects.
The first of these projects is related to the STE20 kinase Serine/threonine kinase 10 (STK10) and its close relative STE20 like kinase (SLK) which have been reported to be frequent off-targets for kinase inhibitors used in the clinics. Also, an inhibition of STK10 and SLK has been linked to a common side-effect of severe skin rash developed upon treatment with the EGFR inhibitor erlotinib, but not gefitinib and the severity of this rash correlated with the treatment outcome, which fits the known biology of STK10 and SLK to be regulators of lymphocyte migration and PLK kinases. However, there are yet no explanations why these two proteins show such high hit-rates across the kinome among the kinase inhibitors. Using structural analysis, we identified the flexibility of STK10 to be the main reason for this hit-rate. The observed strong in vitro potencies did however not translate to the cellular system which is why we investigated the inhibitors residence time on STK10. We found the same flexibility to be the main reason for slow residence times among several inhibitors. We observed large rearrangements in the hydrophobic backpocket of STK10 including the αC, the P-loop enclosing the inhibitor like a lid and strong π-π-stackings to be the main reasons for prolonged residence times on STK10. Interestingly, we observed an increased residence time for erlotinib, which showed skin-related side-effects, giving rise whether the binding kinetics should be investigated for weak cellular off-target effects in future drug discovery efforts.
In the second project we initiated, we illuminate a structural mechanism that allows kinetic selection between two closely related kinases, focal adhesion kinase (FAK) and proline-rich tyrosine kinase 2 (PYK2). Using an inhibitor series designed to probe the mechanism, residence times measured in vitro and in cells showed a strong correlation. Crystal structures and mutagenesis identified hydrophobic interactions with L567, adjacent to the DFG-motif, as being crucial to kinetic selectivity of FAK over PYK2. This specific interaction was observed only when the DFG-motif was stabilized into a helical conformation upon ligand binding to FAK. The interplay between the protein structural mobility and ligand-induced effect was found to be the key regulator of kinetic inhibitor selectivity for FAK over PYK2.
These two projects showed that the parameter residence time should be considered for different problems among the drug discovery process. First, in an open in vivo system not only the potency of a drug alone, but as well its residence time might be of importance. Here we showed that the weak cellular potency translated to prolonged residence times for several inhibitors in cells and established a link between the phenotypic outcome of skin rash after erlotinib treatment and the residence time of this inhibitor on STK10 in cells. On the other hand, medicinal chemistry efforts should consider structure kinetic relationships (SKR) in the optimization process and aim to understand the molecular basis for prolonged target residence times. Here, we showed that a hydrophobic interaction that is enforced upon inhibitor binding is crucial for an unusual helical DFG conformation which arrests the inhibitor and prolongs its residence time providing the molecular basis for understanding the kinetic selectivity of two closely related protein kinases. Establishing the SKRs will help medicinal chemists to kinetically optimize their drug candidates to select a suitable molecule to proceed into further optimization programs. Hence, the projects showed that the target residence time parameter needs to be considered both as a molecular optimization parameter to improve compound potency and binding behavior as well as a parameter to be understood for proceeding to the open system of in vivo models to later modulate the in vivo efficacy of protein kinase targeting drugs.
Monoterpenes and their monoterpenoid derivatives form a subclass of terpene(oid)s. They are widely used in medicines/pharmaceuticals, as flavor and fragrance compounds, or in agriculture and are also considered as future biofuels. However, for many of these substances, the extraction from natural sources poses challenges such as occurring at low concentrations in their raw material or because the natural sources are diminishing. Furthermore, many of the structurally more complex terpenoids cannot be chemically synthesized in an economic way. Therefore, microbial production provides an attractive alternative, taking advantage of the often distinct regio- and stereoselectivity of enzymatic reactions. However, monoterpenes and monoterpenoids are challenging products for industrial biotechnology processes due to their pronounced cytotoxicity, which complicates the production in microorganisms compared to longer-chain terpenes (sesquiterpenes, diterpenes, etc.).
The aim of this thesis was to generate a biotechnological complement to fossil-resources-based chemical processes for industrial monoterpenoid production. Therefore, a starting point for the further development of a microbial cell factory based on the microbe Pseudomonas putida KT2440 was aimed to be created. This production organism should be able to conduct a whole- cell biocatalysis to selectively oxyfunctionalize monoterpene hydrocarbons using renewable industrial by-products and waste streams as raw material for monoterpenoid production (Figure 1). As a model substance, the production of (-)-menthol should be addressed due to its industrial significance. (-)-Menthol is one of the world’s most widely-used flavor and fragrance compounds by volume as well as a medical component, having an annual production volume of over 30,000 tons. An approach for (-)-menthol production from renewable resources could be a biotechnological(-chemical) two-step conversion (Figure 1), starting from (+)-limonene, a by-product of the citrus fruit processing industry.
The thesis project was divided into three parts. In the first part, enzymes (limonene-3- hydroxylases) were to be identified that can convert (+)-limonene into the precursor of (-)-menthol, (+)-trans-isopiperitenol. To counteract product toxicity, in the second part, the tolerance of the intended production organism P. putida KT2440 towards monoterpenes and their monoterpenoid derivatives should be increased. Finally, in the third part, the identified hydroxylase enzymes would be expressed in the improved P. putida KT2440 strain to create a whole-cell biocatalyst for the first reaction step of a two-step (-)-menthol production, starting from (+)-limonene.
To achieve these objectives, different genetic/molecular biology and analytical methods were applied. In this way, two cytochrome P450 monooxygenase enzymes from the fungi Aureobasidium pullulans and Hormonema carpetanum could be identified and functionally expressed in Pichia pastoris, which can catalyze the intended hydroxylation reaction on (+) limonene with high stereo- and regioselectivity. A further characterization of the enzyme from A. pullulans showed that apart from (+) limonene the protein can also hydroxylate ( ) limonene, - and -pinene, as well as 3-carene.
Furthermore, within this thesis, mechanisms of microbial monoterpenoid resistance of P. putida could be identified. It was shown that the different monoterpenes and monoterpenoids tested have very different toxicity levels and that mainly the Ttg efflux pumps of P. putida GS1 are responsible for the tolerance to many of these compounds. Based on these results, a P. putida KT2440 strain with increased resistance to various monoterpenoids, including isopiperitenol, could then be generated, which can be used as a host organism for the further development of monoterpenoid-producing cell factories.
While within the scope of this work the heterologous expression of the fungal gene in prokaryotic cells in a functional form could not be realized despite different approaches, the identified enzymes, the monoterpenoid-tolerant P. putida strain and a plasmid developed for heterologous gene expression in P. putida provide a starting point for the further design of a microbial cell factory for biotechnological monoterpenoid production.
The blood-brain barrier (BBB) protects the brain microenvironment from external damage. It is formed by endothelial cells (ECs) lining the brain vessels, expressing tight junctions and having reduced transcytosis, resulting in a very low paracellular and transcellular passage of substances, respectively (low permeability). The specific BBB phenotype is maintained by Wnt molecules secreted by astrocytes (ACs) that bind to receptors in ECs, and start a molecular cascade that leads to β-catenin translocating to the nucleus and activating the transcription of BBB genes.
An increasing number of studies report BBB dysfunction in Alzheimer’s disease (AD), although the topic is currently under debate. AD is a neurodegenerative condition characterized by brain depositions of Aβ aggregates and Tau neurofibrillary tangles. The aetiology of AD is unknown, although round 5% of all AD cases have a genetic origin. Mutations in APP or PSEN1/2 can lead to Aβ over-production and accumulation, causing familiar AD. There is no cure for AD, as all clinical trials failed during the past years. Consequently, I studied the role of the BBB in AD, aiming to investigate if a BBB dysfunction occurs in AD, and to identify by transcriptomic analysis novel gene regulations happening at the BBB in AD. The final objective was to evaluate the potential of identified BBB genes as therapeutical target.
I used transgenic mice expressing the human APP mutations Swiss, Dutch and Iowa under the control of the neuronal promoter Thy1 (Thy1-APPSwDI) as AD model. In this AD mouse model, I could detect Aβ deposits and memory loss by immunofluorescence (IF) and behavioural tests. Importantly, I identified an increase of BBB permeability to 3-4 kDa dextrans in 6 months, 9-12 months, and 18 months or older AD mice compared to age-matched control wild types (WT), indicating BBB dysfunction in AD mice.
In order to study the BBB transcriptional changes in AD, I sequenced the RNA from 6 and 18 months old AD and WT mouse brain microvessels (MBMVs), as well as of FACS-sorted ECs, mural cells (MuCs), ACs, and microglia (MG) in collaboration with GenXPro, a company specialized in 3’ RNA sequencing. Currently, no transcriptomic datasets of ECs and MuCs are publicly available, suggesting that this is the first study sequencing those cell types in the context of AD.
The analysis of sequencing data from MBMVs and ECs revealed a Wnt/β-catenin repression, and an increase of inflammatory genes like Ccl3 in ECs, that could explain the BBB dysfunction observed in AD mice. Furthermore, the sequencing data from MuCs identified a set of 11 genes strongly regulated in both 6 and 18 month AD groups. Three of those 11 genes are known to be involved in inflammatory processes, demonstrating that inflammation affects and plays an important role in MuCs and ECs during AD.
Thanks to published sequencing data, some up-regulated MG genes in AD are well known and recognized, such as Trem2 and Apoe. Those genes were found in the FACS-sorted MG data as well, validating the AD model and with it, the other novel sequenced datasets. Importantly, one of the most strongly AD-regulated genes in MBMV and MG samples was Dkk2, a member of the Dickkopf family of secreted proteins known to be involved in Wnt signalling modulation. Importantly, a dual luciferase reporter assay proved that Dkk2 is a Wnt inhibitor. A preliminary immunohistochemistry examination of DKK2 in human brain autopsy tissue from an AD patient and age-matched control revealed a stronger DKK2 immunoreactivity in the AD brain.
In order to answer the question whether a rescue of BBB function would ameliorate AD symptoms, I made use of a tamoxifen-inducible transgenic mouse line to activate the Wnt/β-catenin pathway specifically in ECs, leading to a gain of function (GOF) condition (Cdh5-CreERT2+/–/Ctnnb1(Ex3)fl/fl). This mouse line was then crossed with the AD line, creating AD/GOF and AD/control groups.
AD/GOF mice performed better in a Y-Maze memory test than AD/controls when the Wnt/β-catenin pathway was induced before AD onset, indicating a protective effect. Moreover, the finding implies that shielding BBB functioning in AD further protects the brain from AD toxic effects, suggesting an important role of brain vasculature in AD and its potential as therapeutic target.
Synaptic plasticity is the activity dependent alteration of the composition, form and strength of synapses and believed to be the underlying mechanism of learning and memory formation. While initial changes in synaptic transmission are caused by second messenger signaling pathways and rapid modifications in the cytoskeleton, to achieve stable and persistent changes at individual synapses, the expression of new mRNAs and proteins is required. The central dogma postulated that the cell body is the only source of newly synthesized proteins. For neurons, with their unique morphology, this meant that proteins would need be transported long distances, often hundreds of microns, to reach their destined locations in dendrites and at spines. To overcome this limitation, neurons have developed a strategy to regulate protein synthesis locally by distributing thousands of mRNAs into neuronal processes and use them for local protein synthesis. Ample research has demonstrated the importance of local protein synthesis to many forms of long-term synaptic plasticity. One potential regulator of mRNA localization and local translation in neurons are non-coding RNAs. Intensive work over the past decades has highlighted the importance of non-coding RNAs in many aspects of brain function. The aim of this thesis is to obtain a better understanding of the role of non-coding RNAs in synaptic function and plasticity in the murine hippocampus. For this, we focused our studies on two classes of non-coding RNAs.
In the first part of my thesis, I describe our efforts on characterizing circular RNAs, a novel and peculiar family of non-coding RNAs, in the murine hippocampus by combining high throughput RNA-Sequencing with fluorescence in situ hybridization. Furthermore, we investigated the mechanisms of circular RNA biogenesis in hippocampal neurons by temporarily inhibiting spliceosome activity and analyzing the differentially regulated circular RNAs.
The compound class of the fabclavines was described as secondary or specialized metabolites (SM) for Xenorhabdus budapestensis and X. szentirmaii. Their corresponding structure was elucidated by NMR and further derivatives could be identified in both strains. Biochemically, fabclavines are hybrid SMs derived from two non-ribosomal-peptide-synthetases (NRPS), one type I polyketide-synthase (PKS) and polyunsaturated fatty acid (PUFA) synthases. In detail, a hexapeptide is connected via partially reduced polyketide units to an unsual polyamine. Structurally, they are related to the (pre-)zeamines, described for Serratia plymuthica and Dickeya zeae. Fabclavines exhibit a broad-spectrum bioactivity against a variety of different organisms like Grampositive and Gram-negative bacteria, fungi, protozoa but also against eukaryotic celllines.
In this work, the fabclavine biosynthesis was elucidated and assigned to two independently working assembly lines. The NRPS-PKS-pathway is initiated by the first NRPS FclI via generation of a tetrapeptide, which is elongated by the second NRPS FclJ, leading to a hexapeptide. Alternatively, FclJ can also act as direct start of the biosynthesis, resulting in the final formation of shortened fabclavine derivatives with a diinstead of a hexapeptide. In both cases, the peptide moiety is transferred to the iterative type I PKS FclK, leading to an elongation with partially reduced polyketide units. The resulting NRPS-PKS-intermediate is still enzyme-bound. The PUFA-homologues FclC, FclD and FclE in combination with FclF, FclG and FclH belong to the polyamine-forming pathway. Briefly, repeating decarboxylative Claisen thioester condensation reactions of acyl-coenzym A building blocks lead to the generation of an acyl chain in a PKS- or fatty acid biosynthesis-like manner. The corresponding β-keto-groups are either completely reduced or transaminated in a specific and repetitive way, resulting in the concatenation of so-called amine-units. The final β-keto-group is reduced to a hydroxy-group and the intermediate is reductively released by the thioester reductase FclG. A subsequent transamination step leads to the final polyamine. The NRPS-PKS- as well as the polyamine-pathway are connected by FclL. This condensation domain-like protein catalyzes the condensation of the polyamine with the NRPS-PKS-part, which results in the release of the final fabclavine. The results are described in detail in the first publication (first author).
Fabclavine biosynthesis gene cluster (BGC) are widely spread among the genus Xenorhabdus and Photorhabdus. In Xenorhabdus strains a high degree of conservation regarding the BGC synteny as well as the identity of single proteins can be observed. However, Photorhabdus strains harbor only the PUFA-homologues. While in Photorhabdus no product could be detected, our analysis revealed that the Xenorhabdus strains produce a large chemical diversity of different derivatives. Briefly, the general backbone of the fabclavines is conserved and only four chemical moieties are variable: The second and last amino acids of the NRPS-part, the number of incorporated polyketide units as well as the number of amine units in the polyamine. In combination with the elucidated biosynthesis, these variables could be assigned to single biosynthesis components as diversity mechanisms. Together with the 10 already described derivatives, a total of 32 derivatives could be detected. Interestingly, except for taxonomic closely related strains, all analyzed strains produce their own set of derivatives. Finally, we could confirm that the fabclavines are the major bioactive compound class in the analyzed strains under laboratory conditions. The results are described in detail in the second publication (first author).
Together with our collaboration partner Prof. Selcuk Hazir a potent bioactivity against Enterococcus faecalis, which is associated with endodontic infections, could be contributed to X. cabanillasii. Here, we could confirm that this bioactivity can be assigned to the fabclavines. The results are described in detail in the third publication(co-author).
Among the genus Xenorhabdus, X. bovienii represents an exception as its NRPS and PKS genes of the fabclavine BGC are missing or truncated, resulting in the exclusive production of polyamines. Furthermore, its PUFA-homologue FclC harbors an additional dehydratase (DH) domain. Upon extensive analysis a yet unknown deoxy-polyamine was identified and assigned to this additional domain. Finally, the DH domain was transferred into other polyamine pathways. Regardless of an in cis or in trans integration, the chimeric pathways produced deoxy-derivatives of its naturally occurring polyamines, suggesting that this represents another diversification mechanism. The results are described in detail in the attached manuscript (first author).
Für ausgewählten Patienten mit Aortenklappeninsuffizienz (AI) bietet die Aortenklappenrekonstruktion eine sehr attraktive Alternative zum Klappenersatz, wodurch mögliche prothesenbezogene Komplikationen vermieden werden können.
Die begrenzte Zahl der Langzeitstudien sowie das Fehlen von standardisierten Verfahren machen die klappenerhaltende Aortenklappenchirurgie technisch anspruchsvoll.
Ziel dieser Arbeit ist es, die Langzeitergebnisse nach Aortenklappenrekonstruktion zu erfassen und die Haltbarkeit sowie die klappenbezogenen Komplikationen nach klappenerhaltender Aortenklappenchirurgie zu untersuchen.
Hierzu analysierten wir die klinischen Daten von 560 Patienten, die eine operative Versorgung mittels Aortenklappenrekonstruktion erhielten. Dabei wurden sowohl Segelpathologien (bikuspid sowie trikuspid) als auch Aortenwurzelpathologien berücksichtigt. Bei 56% der Patienten (n=313) wurde eine Reimplantation nach David durchgeführt. Bei 247 Patienten wurde bei isolierter Segelpathologie ohne Aortenwurzelbeteiligung eine Segelrekonstruktion durchgeführt. Pathologien der Aortenwurzel konnten mit subkommissuralen Nähten (bei 62 Patienten) oder mit Rekonstruktion des sinotubulären Übergangs (bei 60 Patienten) behoben werden. Begleitende Aorteneingriffe bei Aneurysma oder Dissektion der thorakalen Aorta wurden ebenfalls durchgeführt. So wurden bei 78 Patienten ein partieller Aortenbogenersatz, bei 12 Patienten ein kompletter Aortenbogenersatz und bei 14 Patienten ein Bogenersatz mit „Elephant Trunk“ Technik durchgeführt.
Die Nachuntersuchungen erfolgten anhand eines standardisierten Fragebogens 5 sowie durch transthorakal echokardiographische Verlaufskontrollen. Die durchschnittliche Nachuntersuchungszeit betrug 6.3 ± 4.6 Jahre, 97% der Patienten konnten dabei erfasst werden.
Die 30-Tage-Mortalität betrug 1,4%. Im Langzeitverlauf wurden 132 Verstorbene beobachtet, wobei 13 Patienten aufgrund eines kardiovaskulären Ereignisses verstarben. Das 10-Jahres-Überleben betrug 70%. Eine Reoperation war bei 39 Patienten notwendig, in 25 Fällen aufgrund von signifikanter Restinsuffizienz der Aortenklappe, in 5 Fällen aufgrund eines kombinierten Aortenklappenvitium. Endokarditis führte in 9 Fällen zur Reoperation (0,2% pro Patientenjahr). Die Freiheit von Reoperation betrug 88% nach 10 Jahren. Die klappenbezogenen Komplikationen ergaben eine kumulative linearisierte Inzidenz von 2% pro Patientenjahr.
Schlussfolgernd kann man sagen, dass die Aortenklappenrekonstruktion für ausgewählte Patienten eine gute Alternative zum Aortenklappenersatz darstellt. Die Haltbarkeit der Klappenfunktion erwies sich in der Langzeitbeobachtung als gut. Die adäquate Wahl der Operationstechnik bezogen auf die Pathologie führen zu guten Ergebnissen der Aortenklappenrekonstruktion mit akzeptabler Mortalität und Morbidität im Langzeitverlauf.
Ziel dieser Untersuchung ist es, die Legitimität der Kriminalisierung des Glücksspiels in Brasilien zu hinterfragen. Dies geschieht mit besonderem Augenmerk auf das spezifische brasilianische Glücksspiel, das „Spiel der Tiere“ (Jogo do bicho), das Ende des 19. Jahrhunderts in der Stadt Rio de Janeiro, der Hauptstadt des damaligen kaiserlichen Brasiliens, entstand. Es handelt sich um eine Form des Glücksspiels, die sich in ganz Brasilien verbreitet hat und bereits Gegenstand mehrerer akademischer Studien in den Bereichen Anthropologie und Soziologie war. Das Verbot dieser Art von Glücksspiel, seine Kriminalisierung, seine große Beliebtheit und seine gesellschaftliche Toleranz sind jedoch Gründe dafür, dass das Spiel der Tiere im Besonderen und das Glücksspiel im Allgemeinen auch im juristischen Bereich, insbesondere im Strafrecht, ein bisher vernachlässigter Forschungsgegenstand von großem Interesse ist.
Das Hauptaugenmerk dieser Arbeit liegt auf der Analyse der Kriminalisierung des Glücksspiels, das in Brasilien seit über einem Jahrhundert unter freiem Himmel praktiziert wird. Bei dieser Analyse werden die Gründe für die Kriminalisierung und die Legitimität des Verbots in Frage gestellt. Zu diesem Zweck ist der Text, abgesehen von der Einleitung und der Schlussfolgerung, in sechs Kapitel unterteilt.
Kapitel 1 beschreibt die Geschichte des brasilianischen Tierspiels, die Ursprünge seines Verbots und seiner Kriminalisierung. In Kapitel 2 wird über die Wirklichkeit der Strafverfolgung in diesem „Kriminalitätsbereich“ berichtet. Kapitel 3 stellt den ent-sprechenden Straftatbestand des brasilianischen „Código Penal“ im Kontext der Systematik des brasilianischen Strafgesetzbuches vor. Kapitel 4 widmet sich zunächst den verfassungsrechtlichen Grenzen der Kriminalisierung, und danach einem Überblick über das deutsche Glücksspielverbot und die Glücksspielregulierung. Ergänzt wird diese Suche in Kapitel 5, in dem die Forschung das strafrechtliche Glücksspielverbot in den Kontext der Debatte über die Abgrenzung zwischen und den Zusammenhang von Recht und Moral. Im abschließenden Kapitel 6 wird das (strafrechtlich sanktionierte) Glücksspielverbot mit den klassischen Legitimations-anforderungen konfrontiert.
Was in der strafrechtlichen Literatur der ersten Hälfte des 20. Jahrhunderts zur Rechtfertigung des Verbots zu lesen ist, deutet auf einen großen Einfluss moralischer Argumente hin. Diese Argumente haben bis heute an Gewicht nicht verloren, auch wenn die Befürworter der Beibehaltung der Kriminalisierung versuchen, ihre letztlich moralistische Ideologie gegen das Glücksspiel mit Argumenten wie der Begleitkriminalität des Glückspiels zu verschleiern, die eher eine Folge als eine Ursache der Kriminalisierung ist.