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Die Ausbreitung von HIV stellt ein kontinuierlich wachsendes Problem dar [132]. Durch Einführung der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) konnte die Morbidität und Mortalität der HIV-Infektion deutlich gesenkt werden, jedoch limitieren Resistenzbildungen des Virus und Toxizität der Medikamente den Erfolg. Eine mögliche Therapiealternative bietet die HIV-Gentherapie. Hierbei werden Zellen eines Patienten genetisch modifiziert, so dass sie ein antivirales Genprodukt exprimieren. In der Arbeitsgruppe von Laer (Georg-Speyer-Haus, Frankfurt) wurde der retrovirale Vektor M87o entwickelt, der das antivirale, membranverankerte Peptid maC46 kodiert. Dieses hemmt als Fusionsinhibitor effizient den Viruseintritt von HIV. Als Zielzellen einer HIV-Gentherapie können neben TLymphozyten, den eigentlichen Zielzellen von HIV, auch deren Vorläufer, die hämatopoetischen Stammzellen, verwendet werden. Durch Generierung der gesamten Hämatopoese sollte dies zur Expression des antiviralen Transgens in allen Blutzelllinien führen. Besonders wichtig hierbei ist, dass die Funktion der hämatopoetischen Stammzellen durch die genetische Modifikation möglichst nicht gestört wird. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, toxische Effekte von M87o auf die Repopulierungsfähigkeit hämatopoetischer Stammzellen auszuschließen. Neben den Toxizitätsanalysen sollte auch die Langzeitexpression des retroviralen Vektors nach Transplantation genetisch modifizierter T- und Stammzellen untersucht werden. Eine stabile Expression des Transgens ist vor allem in T-Lymphozyten als Hauptzielzellen von HIV ausschlaggebend für den Erfolg der Gentherapie. Daher war ein weiteres Ziel dieser Arbeit, die Transgenexpression in vivo besonders in T-Lymphozyten im Verlauf zu untersuchen. Hierzu wurden in einem syngenen Mausmodell hämatopoetische Stammzellen mit dem retroviralen Vektor M87o transduziert und in bestrahlte Rag1-defiziente Mäuse transplantiert. Damit mögliche toxische Effekte von M87o auf die Hämatopoese nicht durch den Anteil untransduzierter Zellen im Transplantat maskiert werden, wurde in einer Versuchgruppe der Anteil transduzierter Stammzellen durch MACS-Sortierung auf über 95% angehoben. bAls Kontrollgruppen wurden untransduzierte, aber gleichermaßen kultivierte Stammzellen sowie mit dem Kontrollvektor M87c transduzierte Stammzellen transplantiert. Im folgenden Beobachtungszeitraum von 18-20 Wochen wurde regelmäßig das periphere Blut der Empfängertiere analysiert sowie nach Tötung der Tiere die einzelnen Zellpopulationen der hämatopoetischen Organe Blut, Lymphknoten und Milz charakterisiert. Hierbei konnte keine Toxizität durch M87o nachgewiesen werden. Zwar wurde für M87o-angereicherte Stammzelltransplantate eine verminderte bzw. verzögerte Lymphozytenrepopulierung beobachtet, dies war jedoch wahrscheinlich auf eine eingeschränkte „Fitness“ der Stammzellen durch den Sortierungsprozess und eine geringere Zellzahl im Transplantat zurückzuführen. M87o-transduzierte Stammzellen waren schließlich in der Lage, die komplette Lymphopoese zu generieren. Im Blut, Lymphknoten und Milz der Rezipienten konnten NK-, T- und B-Zellen nachgewiesen werden. Die lymphatische Differenzierung wurde also durch M87o nicht beeinträchtigt. Eine Aussage über die Toxizität von M87o auf die Myelopoese konnte leider nicht getroffen werden. Nach subletaler Bestrahlung der Empfängertiere und damit nur teilweisen Ablation des endogenen Knochenmarks wurden die meisten Zellen der myeloischen Linie durch die Wirts-Stammzellen generiert. Es müssen somit hinsichtlich der Unbedenklichkeit von M87o noch weitere präklinische Untersuchungen erfolgen, bei denen durch letale Bestrahlung der Empfängertiere lediglich die durch Spenderzellen differenzierte Myelopoese analysiert werden kann. Bei den Untersuchungen zur Transgenexpression nach Transplantation genetisch modifizierter Stammzellen konnte eine Langzeitexpression des maC46-Peptids auf allen lymphatischen Zelllinien (T-, B- und NK-Zellen) nachgewiesen werden. Dies zeigt also, dass eine stabile und effiziente Integration des Transgens und somit eine langfristige Expression in vivo möglich ist. Im Verlauf konnten jedoch bei nahezu allen Tieren fallende Anteile M87o-exprimierender Lymphozyten nachgewiesen werden. Dieser beobachtete Expressionsverlust war variabel hinsichtlich des zeitlichen Auftretens sowie zelltypabhängig. Die höchsten Anteile M87o-exprimierender Zellen zeigten sich innerhalb der B-Lymphozyten. Im Rahmen der M87o-Expressionsanalyse nach Transplantation genetisch modifizierter T-Lymphozyten wurden T-Lymphozyten mit unterschiedlicher Transduktionseffizienz in Rag1-defiziente Mäuse transplantiert. Unterschiede in der Langzeitexpression in Abhängigkeit von der ins Genom integrierten Kopienzahl des Vektors konnten hierbei nicht eindeutig gezeigt werden. Bei einigen Tieren konnte eine relativ langfristige in vivo Expression des maC46-Peptids nachgewiesen werden, bei anderen hingegen nachlassende Transgenexpressionen. Insgesamt war die Aussagekraft hier jedoch durch eine nach Transplantation auftretende schwere Kolitis bei den Versuchstieren und somit limitierte Beobachtungszeit stark eingeschränkt.
Die Verfügbarkeit synthetischer Oligonukleotide hat der Entwicklung einer Vielzahl molekularbiologischer, biochemischer und medizinischer Anwendungen den Weg geebnet. Und sind viele diese Anwendungen für sich genommen schon hochinteressant, so eröffnet die Kombination mehrerer Methoden oft noch ganz neue Möglichkeiten. In der vorliegenden Doktorarbeit ist es gelungen, die Technik der photolabilen Schützung auf die Anwendungen von siRNAs und molecular beacons zu übertragen und diesen damit die Option der orts- und zeitaufgelösten Aktivierung zu ermöglichen. Durch die Einführung eines Nukleotids mit 2-(2-nitrophenyl)propyl-geschützter Nukleobase in eine siRNA, konnte der katalytische Schritt der RNA-Interferenz, die mRNA-Spaltung, unterbunden werden. Hierzu wurde das photolabil modifizierte Nukleotid so in der siRNA positioniert, dass es gegenüber der mRNA-Schnittstelle bzw. in unmittelbarerer Nachbarschaft zu dieser lag. Dabei war das modifizierte Nukleotid selbst kein Ribonukleotid sondern ein Desoxynukleotid. Zuvor konnte gezeigt werden, dass die Einführung einzelner Desoxynukleotide in eine siRNA keinerlei Einfluss auf deren Aktivität hat. Als Modellsystem diente der RFP/eGFP-Reportergenassay, wobei die Plasmide mit der siRNA in die verwendeten HeLa-Zellen kotransfiziert wurden. Die verwendete siRNA regulierte dabei die eGFP-mRNA, die gemessene Fluoreszenz wurde auf die RFP-Fluoreszenz normiert. In der Studie gelang es, ein sauberes „An/Aus-Verhalten“ zu erzielen, das heißt, die modifizierte siRNA zeigte zunächst keinerlei Einfluss auf die eGFP-mRNA. Bestrahlte man diese siRNA jedoch für drei Minuten bei 366 nm, erzielte man eine Unterdrückung der eGFP-Expression, die der einer unmodifizierten siRNA entsprach. Dies funktionierte für vor der Transfektion bestrahlte siRNAs ebenso, wie für solche, die erst nach der Transfektion in der Zelle entschützt wurden. Vereinfachte Darstellung der lichtaktivierbaren RNA Interferenz. Links: solange die Photoschutzgruppe (rot) auf dem Führungsstrang sitzt wird das Substrat des RISC nicht geschnitten. Rechts: Bestrahlung mit UV-Licht entfernt die Photoschutzgruppe und aktiviert die RNAi-Maschinerie. Ein bis jetzt ungeklärtes und noch näher zu untersuchendes Phänomen ist die Stabilität der Modifikationen in der Zelle. Aus bisher nicht eindeutig zu benennender Ursache fand nach einer definierten Zeit eine Aktivierung der ausgeschalteten siRNA statt, ohne dass diese bestrahlt wurde. Versuche mit photolabil modifizierten Nukleotiden an anderen Positionen innerhalb der siRNA, sowie eine Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie-Studie mit fluoreszenzmarkierter siRNA und fluoreszenzmarkiertem RISC erlaubten es Rückschlüsse auf den Schritt der RNAi zu ziehen, der durch die Einführung der Basenmodifikation blockiert wird. Offenbar handelt es sich tatsächlich um den katalytischen Schritt der mRNA-Spaltung, ein Einbau der modifizierten siRNA in den RISC findet statt. Zudem zeigte die erfolgreiche Inaktivierung der für die FCS-Studie genutzten anti-TK siRNA, dass der Ansatz, die Modifikation im Bereich der Schnittstelle einzubauen, von der anti-eGFP siRNA auf andere siRNAs übertragbar ist. Im zweiten erfolgreichen Projekt gelang es, molecular beacons durch Einführung zahlreicher photolabiler Basenmodifikationen lichtaktivierbar zu machen. Hierzu wurde ein bereits beschriebener GAPDH-molecular beacon verwendet. Modifiziert man die Schleife dieses molecular beacon mit sieben photolabilen Basenschutzgruppen (NPP und NPE) so gelingt es die Bindung desselben an seine komplementäre Ziel-RNA komplett zu unterbinden, während ein GAPDH-beacon mit drei oder fünf Modifikationen noch in verringertem Maße bindungsfähig ist. Dieses Verhalten wurde sowohl mittels einfachen Auslesens der Fluoreszenzintensität, als auch anhand eines PA-Geles belegt. Eine große Herausforderung bei diesem Projekt stellte die Aufreinigung des hochmodifizierten molecular beacon dar, der neben Fluorophor und Quencher auch zahlreiche Photoschutzgruppen trägt. Diese gelang schließlich durch den Einsatz einer extra densely bond-RP-HPLC-Säule und wiederholter HPL-Chromatographie. Ebenfalls konnte der große Vorteil eines lichtaktivierbaren molecular beacon, die Möglichkeit der präzisen Ortsauflösung der Aktivierung, dargestellt werden. Hierzu wurde modellhaft die Ziel-RNA auf einer Objektträgeroberfläche immobilisiert. Die dann aufgetragene molecular beacon-Lösung zeigte zunächst keine Fluoreszenz. Diese trat erst nach Bestrahlung und auch nur begrenzt auf den wenige Quadratmikrometer großen Bestrahlungsbereich auf.
1. In dieser Arbeit konnten durch chemische Mutagenese drei Pigmentmutanten erzeugt werden, die entsprechend ihrer Pigmentierung in drei Kategorien eingeteilt wurden:hellorange (OC-Mutante), gelb (YC-Mutante) und weiß (WH-Mutante). 2. Durch MS- und NMR-Analysen konnte die Struktur des von H. halophilus produzierten Carotinoids als Methylglykosyl-3,4-dehydro-apo-8’-lycopenoat aufgeklärt werden. Zusätzlich wurden auch die von der OC-Mutante produzierten Carotinoide als Hydroxy-3,4-dehydro-apo-8’-lycopin und Methylhydroxy-3,4-dehydro-apo-8’- lycopinoat identifiziert. Bei allen Pigmenten handelt sich um 8’-Apoderivate mit einer asymmetrischen Anordnung der Methylgruppen. Diese Art von Carotinoiden konnte zuvor nur in dem marinen Isolat P. maritimus gefunden werden (Shindo et al., 2008) 3. Auf Basis der genetischen und biochemischen Daten hinsichtlich der Carotinoide in H. halophilus konnte ein neuartiger Biosyntheseweg postuliert werden. Dabei beginnt die Synthese des C30-Carotinoids nicht wie bei allen bekannten Pigmenten dieser Art mit der Kondensation von zwei C15-Körpern, sondern durch die Kondensation von einem C10- mit einem C20-Molekül. Durch anschließende Desaturierungen, Hydroxylierungen, Methylierungen und Glykosylierungen entsteht das in H. halophilus identifizierte Carotinoid Methylglykosyl-3,4-dehydro-apo-8’-lycopenoat. Dieser Biosyntheseweg ist bisher einzigartig. 4. Die Carotinoide in H. halophilus sind essentiell für den Schutz der Zellen vor oxidativen Schäden. Während das Wachstum des pigmentierten Wildtyps nur wenig durch die Zugabe von bis zu 150 μM Duroquinon beeinträchtigt wurde, wurde das Wachstum der farblosen Pigmentmutante WH schon ab einer Duroquinonkonzentration von 120 μM vollständig gehemmt. Auch durch in vitro-Versuche konnte die antioxidative Eigenschaft von Methylglykosyl-3,4-dehydro-apo-8’-lycopenoat und der Derivate Hydroxy-,4-dehydro-apo-8’-lycopin und Methylhydroxy-3,4-dehydro-apo-8’-lycopinoat bestätigt werden. Dabei war die Wirksamkeit des Carotinoids aus H. halophilus sogar besser als die der biotechnologisch genutzten Pigmente ß-Carotin und Astaxanthin. 5. Durch Wachstumsexperimente konnte gezeigt werden, dass die Carotinoide auch eine Rolle in der Salzadaptation des Bakteriums spielen. Bei niedrigen Salinitäten zeigten der Wildtyp und die farblose Pigmentmutante keine Unterschiede im Wachstum. Eine hohe NaCl-Konzentration von 3,0 M NaCl führte jedoch zu einem verlangsamten Wachstum der Carotinoidmutante WH. 6. Im Genom von H. halophilus konnten anhand von Sequenzvergleichen mit bereits bekannten Kompetenzproteinen aus B. subtilis eine Reihe von putativen Genen identifiziert werden, die dem Bakterium theoretisch die Fähigkeit zur Ausbildung einer natürlichen Kompetenz verleihen. 7. Um die Fähigkeit von H. halophilus zur natürlichen DNA-Aufnahme zu testen, wurde eine Methode entwickelt, durch die es möglich war, viele unterschiedliche Bedingungen zu analysieren. Als Donor-DNA wurde die chromosomale DNA einer Erythromycin-resistenten Mutante von H. halophilus eingesetzt, die innerhalb dieser Arbeit erzeugt wurde. Insgesamt konnten so über 3000 Ansätze getestet werden. Jedoch konnte bei keiner dieser Bedingungen eine natürliche Kompetenz von H. halophilus festgestellt werden. 8. Innerhalb dieser Arbeit ist es gelungen eine Methode zur effizienten Transformation von H. halophilus zu etablieren. Dabei erfolgte die DNA-Aufnahme durch eine PEGvermittelte Protoplastenfusion. Mit dieser Methode konnten für H. halophilus Transformationseffizienzen von 2-102 Transformanden/μg DNA erreicht werden. 9. Durch die Möglichkeit H. halophilus transformieren zu können, ist es in dieser Arbeit erstmalig gelungen, ein System zur markerlosen Deletion von Genen in H. halophilus zu etablieren. Dabei wurde in einem ersten Schritt ein nicht-replizierendes Plasmid, das den gewünschten mutierten Locus enthält, durch Protoplastenfusion in H. halophilus transformiert. Durch einfach homologe Rekombination konnte das Plasmid in das Genom integrieren. Die so erhaltenen Integranten wurden im zweiten Schritt unter nicht-selektiven Bedingungen für etwa 90 Generationen kultiviert. Hierbei kam es zu einer zweiten homologen Rekombination, wodurch das Plasmid wieder aus dem Genom geschnitten wurde (Segregation). Dies resultierte entweder in den Wildtyp-Locus oder in den gewünschten mutierten Locus. Potentielle Integranten wurden auf einen CmS-Phänotyp getestet und mit Hilfe von Southern-Blot-Analysen verifiziert. 10. Mit Hilfe des in dieser Arbeit etablierten Systems zur markerlosen Mutagenese von H. halophilus wurde eine pro-Mutante generiert, deren proHJA-Operon deletiert war. 11. Überraschenderweise konnte die Mutante immer noch Prolin synthetisieren und war demnach nicht prolinauxotroph. Jedoch war H. halophilus pro nicht mehr in der Lage, Prolin als ein kompatibles Solut zu synthetisieren. Trotzdem zeigte das Wachstum der Mutante unter Hochsalzbedingungen keine Beeinträchtigung. Dies konnte auf eine gesteigerte Akkumulation von Glutamat, Glutamin und Ectoin zurückgeführt werden, wodurch der Verlust von Prolin als Osmolyt kompensiert wurde. 12. Die Expression der Gene glnA2, gltA und ectA, die für Biosyntheseenzyme von Glutamin, Glutamat und Ectoin kodieren, ist in H. halophilus pro induziert. Dabei hatte die Salinität einen stärkeren Einfluss auf die relativen RNA-Mengen von glnA2 und ectA in der pro-Mutante als im Wildtyp. gltA zeigte keine salzabhängige Expression im Wildtyp, der mRNA-Level des Gens stieg jedoch in H. halophilus pro bei hohen Salinitäten um das Doppelte im Vergleich zu Niedrigsalzbedingungen an. 13. Für die Glutaminsynthetase, dem Enzym der Glutaminsynthese, konnte eine gesteigerte spezifische Aktivität nachgewiesen werden. Dabei erhöhte sich die Aktivität mit steigender Salinität, sie war jedoch immer 30 bis 50% höher als im Wildtyp. 14. In dieser Arbeit wurde ein möglicher Biosyntheseweg zur salzunabhängigen Prolinsynthese aufgestellt. Hierbei dient Ornithin als Ausgangsmolekül, das entweder durch eine Ornithin-Aminotransferase (RocD) und eine Pyrrolin-5-Carboxylat-Reduktase (ProC und ComER) oder direkt durch eine Ornithin-Cyclodeaminase (ArcB) zu Prolin umgesetzt wird. Für alle Enzyme konnten die entsprechenden Gene im Genom von H. halophilus identifiziert werden. 15. Vor dieser Arbeit konnte bereits gezeigt werden, dass Prolin das dominante kompatible Solut unter Hochsalzbedingungen ist. Dabei war die Expression des pro-Operons sowohl von der Salzkonzentration als auch vom Anion Chlorid abhängig. Es zeigte sich, dass auch die zelluläre Konzentration von ProJ salzabhängig war, mit einem Maximum bei 2,0 – 3,0 M NaCl. Zudem war der ProJ-Gehalt wachstumsphasenabhängig. Während das Enzym besonders in frühexponentiellen Zellen detektiert werden konnte, sank die zelluläre ProJ-Konzentration kontinuierlich in stationären Zellen. Nach einem Salzschock von 0,8 auf 2,0 M NaCl stieg die ProJMenge nach 2 h leicht an und sank nach 4 h wieder kontinuierlich. Der ProJ-Level war in Gegenwart von NaCl maximal, sank aber nur leicht um 25%, wenn die Zellen mit 2 M Na-Glutamat oder Na-Nitrat inkubiert wurden. Die Prolinbiosynthese in H. halophilus wird demnach auch auf Ebene der Translation und/oder der Proteinstabilität reguliert. 16. Die Aminosäure Prolin wird nicht nur als kompatibles Solut in H. halophilus synthetisiert, sondern kann auch als C- und Energiequelle und als Stickstoffquelle genutzt werden. 17. Liegt Prolin als alleinige C- und Energiequelle im Medium vor, erfolgt eine salzabhängige Akkumulation des Osmolyts in H. halophilus, während der zelluläre mRNA-Level der pro-Gene stark reduziert ist. Prolin wird demnach nicht nur als Cund Energiequelle aufgenommen, sondern auch als kompatibles Solut. 18. Im Genom von H. halophilus konnten zwei Gene, die für die potentiellen Na+/Prolin- Symporter 3541 und 1381 kodieren, identifiziert werden, deren mRNA-Level bei Wachstum auf Prolin induziert war. 19. Durch Aminosäuresequenzvergleiche konnten in dieser Arbeit im Genom von H. halophilus jeweils zwei Isogene gefunden werden, die für potentielle Prolindehydrogenasen (prodh1/prodh2) und Pyrrolin-5-Carboxylat-Dehydrogenasen (p5cdh1/p5cdh2) kodieren. Mittels reverser Transkription von mRNA und anschließender PCR-Analysen konnte gezeigt werden, dass prodh2 und p5cdh2 ein Operon bilden (put-Operon). Eine Quantifizierung der Transkriptmengen der Abbaugene prodh1/p5cdh1 und prodh2/p5cdh2 mittels quantitativer PCR in Zellen, die in Gegenwart von Prolin als alleiniger C- und Energiequelle oder Stickstoffquelle gezogen wurden, zeigten deutlich, dass unter diesen Bedingungen nur die Expression von prodh2/p5cdh2 induziert wurde. Wurden die Zellen in Gegenwart von Glukose als C- und Energiequelle gezogen, stieg die mRNA-Menge von prodh2/p5cdh2 unter Hochsalzbedingungen um den Faktor 10 – 20 im Vergleich zu Zellen, die bei niedrigen Salinitäten kultiviert wurden, an. Die mRNA-Menge des put- Operons war in Glukose-gewachsenen Zellen wachstumsphasenabhängig mit einem Maximum in der stationären Wachstumsphase. In Gegenwart von 1,0 M NaCl stieg die mRNA-Menge um das 20-Fache, in Gegenwart von 3,0 M NaCl um das Doppelte. 20. Mit Hilfe des Systems zur markerlosen Mutagenese in H. halophilus konnte eine glnA2-Mutante generiert und verfiziert werden. H. halophilus glnA2 zeigte keinen Wachstumsphänotyp bei Anzucht in Gegenwart von unterschiedlichen NaCl-Konzentrationen. Die Deletion von glnA2 führte zu einer Inhibierung der salzabhängigen Prolinbiosynthese, während der Glutamat- und Glutaminpool bei allen getesteten Salinitäten im Vergleich zum Wildtyp nicht verändert war. Der Verlust von Prolin als kompatibles Solut konnte teilweise durch einen Anstieg des Ectoinlevels kompensiert werden. Die zelluläre Transkriptmenge von glnA1 und ectA war in H. halophilus glnA2 stärker von der Salinität beeinflusst als im Wildtyp, während die salzabhängige Regulation der proH-Expression aufgehoben wurde. Im Gegensatz zum Wildtyp wurde die spezifische Aktivität der Glutaminsynthetase in H. halophilus glnA2 durch steigende NaCl-Konzentrationen inhibiert.
Quasi-zweidimensionale organischen Ladungstransfersalze weisen gewisse Analogien zu den Hochtemperatur-Kupratsupraleitern (HTSL) auf. Zu nennen ist einerseits der ähnliche schichtartige Aufbau, wobei sich leitfähige und isolierende Ebenen abwechseln. Zum anderen liegt der antiferromagnetische Grundzustand in direkter Nachbarschaft zur Supraleitung und bei höheren Temperaturen wird ebenfalls die Entstehung einer Pseudo-Energielücke diskutiert. Im Gegensatz zu den HTSL können die elektronischen Eigenschaften der organischen Ladungstransfersalze jedoch leicht durch äußere Parameter wie hydrostatischen bzw. chemischen Druck - die Verwendung verschiedener Anionen X läßt sich in einem verallgemeinerten Phasendiagramm ebenfalls auf die Achse W/U abbilden, siehe Abschn. 4.2 - oder moderate Temperaturen beeinflußt werden. In den quasi-zweidimensionalen K-(BEDT-TTF)2X-Salzen ist bspw. ein moderater Druck p ~ 250 bar ausreichend, um das antiferromagnetisch-isolierende System (X=Cu[N(CN)2]Cl) auf die metallische Seite des Phasendiagramms zu verschieben, wobei dann im Grundzustand Supraleitung auftritt (Tc ~ 12,8 K). Eine Dotierung wie bei den HTSL und die damit einhergehende unerwünschte Unordnung ist nicht notwendig um einen Isolator-Metall-übergang zu induzieren. Demnach sind die experimentellen Anforderungen im Vergleich zu anderen stark korrelierten Elektronensystemen auf relativ einfache Weise zu realisieren. Auch das macht die organischen Ladungstransfersalze zu idealen Modellsystemen, um fundamentale Konzepte der theoretischen Festkörperphysik zu studieren, wovon einige bislang lediglich von akademischem Interesse waren. Erstmalig wird in dieser Arbeit die Fluktuationsspektroskopie als experimentelle Methode angewendet, um die Dynamik des TT-Elektronensystems in den quasi-zweidimensionalen organischen Ladungstransfersalzen K-(BEDT-TTF)2X bei niedrigen Frequenzen zu studieren. Ziel ist es, Informationen über die Temperatur-, Druck- und Magnetfeld-Abhängigkeit der spektralen Leistungsdichte des Widerstandsrauschens und damit über die Dynamik der Ladungsfluktuationen zu gewinnen. Insbesondere in der Nähe korrelationsgetriebener Ordnungsphänomene spielt die Dynamik der Ladungsträger eine entscheidende Rolle. Auch die Kopplung des elektronischen Systems an bestimmte strukturelle Anregungen hat Einfluß auf das Widerstandsrauschen. Zu Beginn wird eine kurze Einführung in die Signalanalyse gegeben und daran anschließend werden verschiedene Arten des Rauschens in Festkörpern dargestellt (Kap. 1). Einige der für diese Arbeit relevanten Ordnungsphänomene werden in Kap. 2 in knapper Form eingeführt, wobei auf die dynamischen Eigenschaften in der Nähe eines Glasübergangs etwas ausführlicher eingegangen wird. Nach der Vorstellung der eingesetzten Meßmethoden, des Versuchsaufbaus und der Probenkontaktierung (Kap. 3) werden die experimentellen Ergebnisse an den K-(BEDT-TTF)2X-Salzen in Kap. 4 ausführlich diskutiert.
Das Ziel dieser Studie ist es, die Möglichkeiten und Grenzen von hochauflösenden Klimaprojektionen in orographisch beeinflussten Gebieten an den Beispielen der europäischen Alpen und des Himalajas zu prüfen. Insbesondere wird die Fragestellung untersucht, ob beobachtete regionale Muster in den höher aufgelösten Daten besser wiedergegeben werden als in den antreibenden großskaligen Daten. Dazu werden regionale Klimasimulationen des COSMO-CLM Modells und Daten von zwei statistischen Regionalisierungsmethoden mit ERA40 Reanalysen sowie Daten des globalen Atmosphäre-Ozean Modells ECHAM5/MPIOM für verschiedene Parameter des Klimasystems verglichen. Ein Vergleich mit den Reanalysen anhand täglicher Niederschlagsstatistiken ergibt, dass die COSMO-CLM Niederschlagsdaten auf der 0.5° Skala vergleichbar sind mit ERA40 Niederschlägen und mit statistisch regionalisierten ERA40 Niederschlägen. Eine zusätzliche Fehlerkorrektur der COSMO-CLM Niederschläge liefert gute Ergebnisse. Dabei sind jedoch etwa 500 Regentage notwendig, um eine robuste Fehlerabschätzung zu gewährleisten. Für das südasiatische Gebiet ist eine realistische Wiedergabe des indischen Sommermonsuns (ISM) in den Modellen von hoher Relevanz. Betrachtet man nur die Mittelwerte und zeitlichen Variabilitäten von verschiedenen Indizes des ISM, so liefert das COSMO-CLM keinen Mehrwert im Vergleich zu den antreibenden Daten. Allerdings werden die räumlichen Strukturen von Niederschlag und vertikaler Windscherung, sowie die zeitliche Korrelation der modellierten Indizes gegenüber dem ECHAM5/MPIOM Modell verbessert. Die durchgeführten COSMO-CLM Projektionen für die Jahre 1960 bis 2100 zeigen negative Trends des ISM für die SRES Szenarien A2, A1B und B1. Die negativsten Trends sind dabei im Szenario A2 zu finden, gefolgt von A1B und B1. Fast keine Trends zeigen sich im commitment Szenario. Trotz großen zeitlichen Variabilitäten sind die Abnahmen in Niederschlagsmengen, ausgehender langwelliger Strahlung und Windscherung statistisch signifikant in großen Regionen des Simulationsgebietes. Für Nordwest-Indien weisen die Projektionen teilweise einen Rückgang der Monsunniederschläge von über 70% in 100 Jahren auf. Der Rückgang der Windscherung ist hauptsächlich auf Veränderungen in der oberen Troposphäre bei 200 hPa zurück zu führen. Während in den COSMO-CLM Projektionen alle Indizes des ISM synchrone Negativtrends aufweisen, sind die Trends für den Monsunregen über Indien im globalen ECHAM5/MPIOM Model positiv. Gemäß den Definitionen der verschiedenen Indizes, sind jedoch synchrone Trends wahrscheinlicher und das COSMO-CLM liefert zu den globalen ISM Projektionen ebenfalls einen Mehrwert. Insgesamt zeigen die Ergebnisse dieser Studie, dass das COSMO-CLM wertvolle regionale Zusatzinformationen zu den globalen Modellen in den beiden untersuchten Regionen liefert. Für die Einzugsgebiete der oberen Donau und des oberen Brahmaputra liefern die COSMO-CLM Projektionen einen signifikanten Anstieg der Temperatur für alle Jahreszeiten der Jahre 1960 bis 2100. Die Werte sind generell höher im Brahmaputragebiet, mit den größten Trends in der Region des tibetanischen Plateaus. Im Niederschlag zeigen die saisonalen Anteile ebenfalls klare Trends, beispielsweise eine Zunahme des Frühjahrsniederschlags im Einzugsgebiet der oberen Donau. Die größten Trends werden wiederum in der Region des tibetanischen Plateaus projiziert mit einem Anstieg von bis zu 50% in der Länge der Trockenperioden zwischen Juni und September und einem gleichzeitigen Anstieg von etwa 10% für die maximale Niederschlagsmenge an fünf aufeinander folgenden Tagen. Für die Region Assam in Indien, zeigen die Projektionen zudem eine Zunahme von 25% in der Anzahl der aufeinander folgenden trockenen Tage während der Monsunzeit
"Protein Associated with Myc" (PAM) hat aufgrund seiner enormen Größe von 510 kD und der Vielzahl an Proteinbindungsstellen das Potential viele regulatorische und physiologische Prozesse zu regulieren. Mit der Funktion als E3-Ubiquitinligase und davon unabhängigen Proteininteraktionen reguliert es beispielsweise Prozesse der Synaptogenese und der spinalen Schmerzverarbeitung, wie auch die Regulation des Pteridin Stoffwechsels und des cAMP-Signalweges. Im Gegensatz zur spinalen Schmerzverarbeitung war eine Beteiligung von PAM an der peripheren Nozizeption bisher unbekannt und sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden. Dazu wurden konditionale PAM-Knockout Mäuse generiert und charakterisiert. Zum einen wurde PAM in Vorläuferzellen von Neuronen und Gliazellen und zum anderen in allen nozizeptiven und thermorezeptiven Neuronen der Dorsalganglia und der Ganglia trigeminale deletiert. Der Knockout in Neuronen und Gliazellen führte zu einer pränatalen Letalität und unterstreicht so die Bedeutung von PAM während der Neuronenentwicklung. Mit Hilfe des spezifischen Knockouts in nozizeptiven Neuronen konnte eine Rolle von PAM bei der Regulation der thermischen Hyperalgesie gezeigt werden. Keinen Einfluss hatte die Deletion von PAM auf basale thermische und mechanische Schmerzschwellen, sowie auf Formalin-induzierte akute Schmerzen. Als potentieller Mechanismus wurde der mTOR- und der p38 MAPK-Signalweg untersucht. Dabei konnte eine Vermittlung der S1P-induzierten mTOR-Aktivierung durch PAM nachgewiesen werden und Rheb als eine Komponente dieser Aktivierung ermittelt werden. Der p38 MAPK Signalweg war in Abwesenheit von PAM konstitutiv aktiviert und einige Proteine des Rezeptortraffickings waren verstärkt exprimiert. Als ursächlich für die beobachtete verlängerte Hyperalgesie in PAM-defizienten Mäusen konnte die Unterbindung der Internalisierung des TRPV1-Rezeptors nachgewiesen werden. Dieser Effekt ist spezifisch für TRPV1, da der verwandte Ionenkanal TRPA1 durch die PAM-Deletion nicht beeinträchtigt wurde. In der vorliegenden Arbeit konnte so zum ersten Mal gezeigt werden, dass PAM in peripheren nozizeptiven Neuronen über die p38 MAPK-vermittelte Internalisierung von TRPV1 die Dauer der thermischen Hyperalgesie reguliert.
Sexuelle Funktionsstörungen gehören zu den häufigsten Störungen unserer Zeit und stellen oftmals eine starke Beeinträchtigung der Lebensqualität für den Patienten und seine Partnerschaft dar. Dem Zusammenhang zwischen sexueller Gesundheit und Lebensqualität wurde erst in den letzten Jahren vermehrt Aufmerksamkeit gewidmet, wobei Studien immer wieder den wichtigen Zusammenhang von Sexualität und Lebenszufriedenheit bzw. Lebensqualität belegen. Da bei sexuellen Dysfunktionen organische und psychische Faktoren meistens ineinander greifen, ist die Gruppe derer, die unter diesen Störungen leiden können, sehr breit gefächert. Aufgrund des demografischen Wandels sowie der Zunahme chronischer Erkrankungen ist davon auszugehen, dass die (sekundären) sexuellen Dysfunktionen weiter ansteigen werden. Der Kenntnisstand der Forschung und die Datenlage bezogen auf Epidemiologie, Therapieverfahren und Therapiewirksamkeit sexueller Funktionsstörungen ist in den letzten 60 Jahren seit Kinsey zwar erheblich besser geworden, aber im Vergleich zu anderen medizinischen und psychologischen Störungsbildern nach wie vor unbefriedigend. Auch die Versorgungslage der Patienten im Bereich sexueller Dysfunktionen ist von einer deutlich unzureichenden Anzahl sexualtherapeutisch ausgebildeter Ärzte und Psychologen geprägt. Die vorliegende Arbeit soll einen Beitrag zur Entwicklung und Erforschung des Verständnisses sexueller Funktionsstörungen liefern, mit dem Ziel, die bisher bestehenden therapeutischen Konzepte zu erweitern und somit eine bessere Versorgung von Patienten mit sexuellen Funktionsstörungen zu gewährleisten.
Eine effektive Zusammenarbeit in interdisziplinären Projektteams ist nur möglich, wenn die involvierten Personen miteinander kommunizieren und zudem ein intersubjektives, d. h. ein gemeinsames und einheitliches, Verständnis der Anforderungen, Aufgaben, Arbeitsschritte und der zur Verfügung stehenden Ressourcen besitzen. Der Aufbau eines intersubjektiven Verständnisses kann nur durch Sprache gelingen, indem zwei oder mehrere Personen mit den von ihnen verwendeten sprachlichen Zeichen die gleichen Gegenstände der Realwelt assoziieren und im umgekehrten Fall den Gegenständen die gleichen Zeichen zuordnen. Ist das intersubjektive Verständnis dieser Personen hergestellt, verwenden sie eine gemeinsame Sprache (im engeren Sinne) und bilden eine sogenannte Sprachgemeinschaft. Diese Arbeit widmet sich dem Konzept der Sprachgemeinschaft. Nach der theoretischen Fundierung wird im Rahmen einer explorativen Fallstudie untersucht, wie sich sprachliche Gemeinsamkeiten und Unterschiede auf den Erfolg eines IS-Projekts auswirken können. Die Erkenntnisse dieser Studie motivieren das Ziel dieser Arbeit, Sprachgemeinschaften empirisch nachzuweisen. Der Nachweis gelingt mit Hilfe von zwei sprachwissenschaftlichen Experimenten und dem Einsatz der Latent Semantischen Analyse, mit der sich die semantische Ähnlichkeit von Textdokumenten auf Basis von Worthäufigkeiten bestimmen lässt. Die beiden Experimente werden ferner dazu benutzt, Sprachgemeinschaften einer Effizienzanalyse zu unterziehen. Hierbei wird untersucht, ob die Mitglieder im Vergleich zu Nichtmitgliedern einer Sprachgemeinschaft mit einem geringeren sprachlichen Aufwand kommunizieren.
Die Wirkungen von Acrylamid beschäftigen seit Jahrzehnten Mediziner, Toxikologen, Biologen und Analytiker. Zwar konnte eine kanzerogene Wirkung beim Tier eindeutig nachgewiesen werden, der Nachweis dieser Wirkung beim Menschen ist aber bis heute nicht erbracht. Bis 2000 wurde angenommen, dass Acrylamid ausschließlich technisch erzeugt vorkommt und der Mensch Acrylamid nur aus dieser Quelle aufnimmt. Hierauf beruhen Grenz- und Richtwerte auf nationaler und internationaler Ebene, sowohl am Arbeitsplatz als auch für Trinkwasser und Verpackungsmaterialien. Neben dem Acrylamidgehalt in technischen Produkten, Wasser und Luft gelang der Nachweis der aufgenommenen Acrylamidmenge über Acrylamid-Hämoglobin-Addukte im Blut erst 1995, nachdem der Acrylamid-Metabolismus aufgeklärt worden war und die analytischen Methoden verfeinert waren. Die Annahme, dass Acrylamid ausschließlich in technischen Prozessen gebildet wird, war jedoch nicht vereinbar mit Erkenntnissen, dass auch Probanden einen erhöhten Acrylamidspiegel im Blut aufzeigten, die nicht mit Acrylamid am Arbeitsplatz in Kontakt gekommen waren. Im Jahr 2002 gelang es eindeutig nachzuweisen, dass Acrylamid in vielen, meist alltäglich verzehrten Lebensmitteln abhängig von der Zubereitungsart zu finden ist. Mit Hilfe einer verbesserten Analytik konnten schließlich hohe Acrylamidmengen in zahlreichen, vor allem frittierten Lebensmitteln, belegt werden, die die Belastung aus technischen Quellen oft weit überschritten. Die Tatsache, dass die Nahrung der allgemeinen Bevölkerung deutlich Acrylamid-belastet ist, hat die Bewertung der Acrylamid-Toxizität und die Maßnahmen zum Gesundheitsschutz nachhaltig verändert. Durch den späten Nachweis der Acrylamid-Aufnahme mit Lebensmitteln sind viele frühere Annahmen für die Gesundheitsbewertung irrig, die hieraus gezogenen Schlußfolgerungen nicht haltbar. Seit 2002 ist die Reduktion der Lebensmittelbelastung in den Mittelpunkt gerückt, die Arbeitsplatzbelastung hat - mit Ausnahme der Schleimhautreizung - keine weitere Berücksichtigung erhalten. Die hohe Belastung von Lebensmitteln stellt bisherige Richtlinien und Expositionsauflagen in Frage, der fehlende bisherige epidemiologische Nachweis, der aus Tierversuchen eindeutig nachweisbaren Karzinogenität stellt für Acrylamid auch die bisherigen Modell-Annahmen der Krebsentstehung durch Umweltschadstoffe in der „one hit-Hypothese“ in Frage.
This work investigated the applicability of global pairwise sequence alignment to the detection of functional analogues in virtual screening. This variant of sequence comparison was developed for the identification of homologue proteins based on amino acid or nucleotide sequences. Because of the significant differences between biopolymers and small molecules several aspects of this approach for sequence comparison had to be adapted. All proposed concepts were implemented as the ‘Pharmacophore Alignment Search Tool’ (PhAST) and evaluated in retrospective experiments on the COBRA dataset in version 6.1. The aim to identify functional analogues raised the necessity for identification and classification of functional properties in molecular structures. This was realized by fragment-based atom-typing, where one out of nine functional properties was assigned to each non-hydrogen atom in a structure. These properties were pre-assigned to atoms in the fragments. Whenever a fragment matched a substructure in a molecule, the assigned properties were transferred from fragment atoms to structure atoms. Each functional property was represented by exactly one symbol. Unlike amino acid or nucleotide sequences, small drug-like molecules contain branches and cycles. This was a major obstacle in the application of sequence alignment to virtual screening, since this technique can only be applied to linear sequences of symbols. The best linearization technique was shown to be Minimum Volume Embedding. To the best of knowledge, this work represents the first application of dimensionality reduction to graph linearization. Sequence alignment relies on a scoring system that rates symbol equivalences (matches) and differences (mismatches) based on functional properties that correspond to rated symbols. Existing scoring schemes are applicable only to amino acids and nucleotides. In this work, scoring schemes for functional properties in drug-like molecules were developed based on property frequencies and isofunctionality judged from chemical experience, pairwise sequence alignments, pairwise kernel-based assignments and stochastic optimization. The scoring system based on property frequencies and isofunctionality proved to be the most powerful (measured in enrichment capability). All developed scoring systems performed superior compared to simple scoring approaches that rate matches and mismatches uniformly. The frameworks proposed for score calculations can be used to guide modifications to the atom-typing in promising directions. The scoring system was further modified to allow for emphasis on particular symbols in a sequence. It was proven that the application of weights to symbols that correspond to key interaction points important to receptor-ligand-interaction significantly improves screening capabilities of PhAST. It was demonstrated that the systematic application of weights to all sequence positions in retrospective experiments can be used for pharmacophore elucidation. A scoring system based on structural instead of functional similarity was investigated and found to be suitable for similarity searches in shape-constrained datasets. Three methods for similarity assessment based on alignments were evaluated: Sequence identity, alignment score and significance. PhAST achieved significantly higher enrichment with alignment scores compared to sequence identity. p-values as significance estimates were calculated in a combination of Marcov Chain Monte Carlo Simulation and Importance Sampling. p-values were adapted to library size in a Bonferroni correction, yielding E-values. A significance threshold of an E-value of 1*10-5 was proposed for the application in prospective screenings. PhAST was compared to state-of-the-art methods for virtual screening. The unweighted version was shown to exhibit comparable enrichment capabilities. Compound rankings obtained with PhAST were proven to be complementary to those of other methods. The application to three-dimensional instead of two-dimensional molecular representations resulted in altered compound rankings without increased enrichment. PhAST was employed in two prospective applications. A screening for non-nucleoside analogue inhibitors of bacterial thymidin kinase yielded a hit with a distinct structural framework but only weak activity. The search for drugs not member of the NSAID (non-steroidal anti-inflammatory drug) class as modulators of gamma-secretase resulted in a potent modulator with clear structural distiction from the reference compound. The calculation of significance estimates, emphasizing on key interactions, the pharmacophore elucidation capabilities and the unique compound rannkings set PhAST apart from other screening techniques.
Apoptotic cell (AC)-derived factors alter the physiology of macrophages (M Phi s) towards a regulatory phenotype that is characterized by enhanced production of anti-inflammatory mediators, an attenuated pro-inflammatory cytokine profile and reduced nitric oxide (NO) formation. Impaired NO production in response to ACs or AC-conditioned medium (CM) is facilitated by arginase II (ARG II) expression, which competes with inducible NO synthase for L-arginine. In this study, I investigated the signaling pathway that allowed CM to upregulate ARG II in M Phi s. A sphingolipid, further identified as sphingosine-1-phosphate (S1P), was required but authentic S1P alone only produced small effects. S1P acted synergistically with a so far unidentified factor to elicit high ARG II expression. S1P signaled through S1P receptor 2 (S1P2), since the S1P2-antagonist JTE013 and siRNA knock-down of S1P2 prevented ARG II upregulation. Further, inhibition and knock-down of extracellular signal-regulated kinase 5 (ERK5) attenuated CM-mediated ARG II protein induction. Exploring ERK5-dependent transcriptional regulation, promoter deletion and luciferase reporter analysis of the murine ARG II promoter (mpARG II) suggested the involvement of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) responsive element binding protein (CREB). This was confirmed by EMSA analysis and decoyoligonucleotides scavenging CREB, thereby preventing it from activating target genes and thus, blocking ARG II expression. I concluded that AC-derived S1P binds to S1P2 and acts synergistically with other factors to activate ERK5 and concomitantly CREB. This signaling cascade shapes an anti-inflammatory M Phi phenotype by ARG II induction. Further investigations of ERK5-dependent CREB activation suggested an indirect mechanism implying that ERK5 inhibited phosphodiesterase 4 (PDE4) and thus, prevented hydrolysis of cAMP. Since S1P-dependent ERK5 activation presumably inhibited PDE4, subsequent cAMP accumulation led to enhanced PKA activity and CREB-mediated transcription. The unidentified factor(s) besides S1P probably provoked the required elevation of cAMP production in M Phi s. Indeed, pharmacological inhibition of cAMP-producing adenylyl cyclase with SQ22536 as well as cAMP-dependent protein kinase A (PKA) with KT5720 suggested cAMP to be involved in CM-mediated ARG II up-regulation. Furthermore, forskolin-dependent activation of adenyly cyclase and simultaneous rolipram-mediated inhibition of PDE4 mimicked CM-induced ARG II expression. Considering these findings, I propose that one or several unidentified factors in CM provoke cAMP production in M Phi s. In parallel, AC-derived S1P activates ERK5, which inhibits PDE4-dependent cAMP hydrolysis, further raising intracellular cAMP levels. Thus, unrestricted continuous cAMP signaling via PKA/CREB, results in a time-dependent and sustained ARG II induction.
In the adult mammalian central nervous system, two defined neurogenic regions retain the capacity to generate new neurons throughout adulthood, namely the subependymal zone (SEZ) at the lateral ventricles and the subgranular layer of the hippocampus (SGL). Adult neurogenesis consists of a whole set of events including proliferation, fate specification, migration, survival and finally synaptic integration of newly born neurons. Each of these events is controlled by the interplay of numerous factors. In this study two signalling systems were analysed with regard to their functional role in adult neurogenesis in vivo, namely the purinergic system and the growth factor EGF. Neither short- nor long-term application of the P2Y receptor agonists UTP and ADPβS and the P2Y receptor antagonist suramin into the lateral ventricle of adult mice altered cell responses as compared to vehicle controls in vivo. In contrast, analysis of the expansion rates of cultured neural stem cells (NSCs) from knockout mice revealed a strong increase in the number of NSCs from NTPDase2-/- mice, whereas cell numbers of NSCs from P2Y1-/- and P2Y2-/- mice were significantly reduced in comparison to wildtype levels. Notably, in vivo proliferation rates were potently elevated in the SGL and the SEZ of NTPDase2-deficient mice. However, in vivo proliferation in both neurogenic niches of the single receptor knockout mice P2Y1-/- and P2Y2-/- and P2Y1-/- P2Y2-/-double-knockout mice did not differ significantly from the wildtype. In mice lacking the P2Y2 receptor the survival of newly born neurons in the hippocampal granule cell layer was significantly increased. These data provide the first line of evidence that purinergic signalling is involved in the control of neural stem cells behaviour not only in vitro but also in vivo. In order to further characterise the role of epidermal growth factor (EGF) in adult neurogenesis, transit amplifying precursors (TAPs) and type B astrocytes were identified as EGF-responsive cell populations following ventricular EGF injection, whereas ependymal cells, neuroblasts and NG2-positive cells did not or only to a minor extent respond to EGF injection. These EGF-responsive cell populations were found on both, the septal as well as striatal lateral ventricle walls. Long-term ventricular EGF infusion for 6d, 1. increased cell proliferation of both ventricle walls revealing a gradient along the rostro-caudal axis, 2. altered the balance between neuronal and macroglial cell fates to generate oligodendrocyte precursors and 3. lead to an entire remodelling of the classical architecture of the SEZ.
Proliferation and apoptosis are fundamental cellular processes that are important for the development and homeostasis of multi-cellular organisms. Deregulation of these processes plays an important role in tumor formation. Often, genes that control homeostasis by regulating proliferation and apoptosis are mutated or improperly expressed in tumors. In this project, the physiological and pathological functions of FUSE Binding Protein 1 (FBP1) were studied to elucidate the involvement of this gene in the context of embryonic development and tumorigenesis. Two reasons led to the hypothesis that FBP1 might be relevant in this context. FBP1 was isolated in the group of PD Dr. Martin Zörnig using a functional yeast survival screen for the identification of anti-apoptotic genes involved in tumorigenesis, and the anti-apoptotic function of FBP1 was confirmed in the human colon carcinoma cell line RKO. In addition, FBP1 had been published to function as a transcriptional regulator that activates expression of the proto-oncogene c-myc. This gene stimulates cell proliferation and is overexpressed in many tumors. Analysis of FBP1 expression by immunhistochemistry in normal and tumor tissue samples revealed frequent and significant overexpression of FBP1 in Hepatocellular Carcinoma (HCC). To study the functional relevance of FBP1 activity for this tumor type, apoptosis and proliferation of the HCC cell line Hep3B were studied in dependence of FBP1 expression. Downregulation of FBP1 by lentiviral expression of FBP1-specific short hairpin RNA (shRNA) reduced proliferation and increased sensitivity to apoptosis. Subcutaneous injection of FBP1-deficient Hep3B cells into immunodeficient NOD/SCID mice demonstrated that tumor growth was strongly decreased in comparison to control cells. mRNA expression studies by quantitative real time PCR showed reduced mRNA levels of the pro-apoptotic genes Bik, Noxa, TRAIL and TNF-􀀁 in the absence of FBP1. In addition, the cell cycle inhibitors p21 and p15 were repressed by FBP1 while Cyclin D2 expression was decreased in the absence of FBP1. Surprisingly, expression of c-myc was not altered by FBP1 downregulation, indicating a different mechanism of c-myc regulation in HCC cells. These results demonstrate that overexpression of FBP1 inhibits apoptosis and stimulates proliferation in HCC cells by regulating the transcription of relevant target genes. Therefore, FBP1 might represent a promising therapeutic target for the treatment of HCC. For analysis of the physiological function of FBP1, a gene trap mouse model was established. In these mice, the gene trap vector pT1􀀂geo is inserted in intron 19 of the FBP1 locus, leading to the expression of a fusion protein consisting of a truncated FBP1 (lacking the last 62 amino acids), 􀀁-Galactosidase and Neomycin Phosphotransferase. Luciferase reporter assays demonstrated that the fusion protein was not capable of activating the c-myc promoter and even showed a dominant negative effect. Thus, this gene trap mouse serves as a functional FBP1 knockout model. Phenotyping of the FBP1 gene trap mice showed that homozygous mutation of FBP1 resulted in embryonic lethality at late stages of embryonic development (E15.5-E16.5). Heterozygous mice were viable, but born at lower frequencies, indicating a gene dosage- or a dominant negative effect of the FBP1 fusion protein. The cellular effects of FBP1 inactivation were tested in mouse embryonic fibroblasts isolated from FBP1 gene trap mice. While proliferation was reduced in the absence of wildtype FBP1, apoptosis was not affected. Expression analysis showed that in homozygous MEFs p15 and p21 transcripts were upregulated, while decreased cmyc mRNA levels were measured. Closer inspection of homozygous gene trap embryos revealed an anemic phenotype that appeared most pronounced around embryonic day 15.5. Analysis of fetal livers, the main site of hematopoiesis at this stage of development, showed a strongly reduced total cell number in homozygous embryos. Evaluation of the different hematopoietic cell lineages did not reveal significant changes in particular differentiated cell types. Instead, all cell lineages seemed to be affected equally by FBP1 inactivation. In contrast, analysis of hematopoietic progenitor cell populations showed an increased percentage of multipotent progenitor cells (MPPs) and a strongly reduced number of long-term hematopoietic stem cells (LT-HSCs). Functional analysis of MPPs by in vitro colony formation assays demonstrated that the FBP1-mutant cells possess a normal colony formation potential while their expansion capacity was reduced. Competitive transplantation of lineage negative fetal liver cells into irradiated recipient mice resulted in reduced engraftment of liverderived progenitor cells from homozygous FBP1 gene trap mice. However, stable engraftment was observed over a period of 12 weeks, demonstrating that the FBP1-deficient LT-HSCs are in principle capable of long-term repopulation. These results demonstrate that FBP1 exerts an essential function during definitive hematopoiesis. It can be speculated that FBP1 influences proliferation, apoptosis and possibly also stem cell self-renewal through the regulation of specific target genes within the hematopoietic progenitor cells. Alternatively, extrinsic effects caused by the absence of FBP1 activity could impair the function of the progenitor cells.
Auf dem Weg zur multikulturellen Gesellschaft besteht Bedarf, die psychologischen Komponenten verschiedener Migrantengruppen zu erfassen. In Deutschland sind 83.598 Mitmenschen mit chinesischer Staatsbürgerschaft verzeichnet (StatBA, 2009). Werden die Eingebürgerten Übersee-Chinesen mit einbezogen, beläuft sich die Zahl an gesamtchinesischen Mitmenschen auf 135.000 (OCAC, 2009). Als einzige Anhaltspunkte über im Ausland lebende Chinesen dienen Studien aus dem angloamerikanischen Sprachraum. Menschen chinesischen Ursprungs mit westlichem Intellekt erhalten dort die Bezeichnung „Banane“, welche eine gelbe Hülle mit einem weißen Inneren illustriert. Die vorliegende Studie beschäftigt sich erstmalig mit den psychologischen Komponenten der in Deutschland lebenden chinesischen Mitbürger. Welchen Einfluss nimmt die Anpassung an das europäische Umfeld gekoppelt mit der chinesischen Internalisierung auf erinnertes elterliches Erziehungsverhalten, Persönlichkeitsstruktur, Erleben von Emotionen und Körpererleben? 154 chinesisch-stämmige Studierende aus ganz Deutschland wurden für verschiedene standardisierte psychometrische Testverfahren rekrutiert. Ein eigens konzipierter Fragebogen diente zur Messung der asiatischen und europäischen Identität. Wie vorherige Studien (Chao & Aque, 2009) aussagten, zeigten sich in der vorliegenden Stichprobe Züge des autoritativen Erziehungsstils. Im FEE (Fragebogen zum erinnertenelterlichen Erziehungsverhalten) (Schumacher, Eisemann, & Brähler, 1999) erhielten die Übersee-chinesischen Probanden neben einer höheren mütterlichen Strenge auch höhere Werte in der elterlichen Kontrolle und Überbehütung als die deutsche Normstichprobe. Je mehr mütterliche „Ablehnung und Strafe“ und elterliche „Kontrolle und Überbehütung“ die Probanden perzipierten, desto chinesischer sieht der heutige Lebensstil aus. Kongruent mit den Ergebnissen von McCrae et al. (1998) schnitten Übersee-Chinesen im NEO-FFI (Borkenau & Ostendorf, 1993) mit niedrigeren Werten in der Offenheit und höheren Werten in der Verträglichkeit ab. Anders als bei Eap et al. (2008) zeigten Chinesen in Deutschland höhere Werte in der Gewissenhaftigkeit und Extraversion. Diese hingegen korrelierten positiv mit der europäischen Identität. In der MSWS (Multidimensionale Selbstwertskala) (Schütz & Sellin, 2006) erzielten die Übersee-Chinesen einen niedrigeren allgemeinen Selbstwert als die deutsche Normgruppe. Außerdem empfanden die Übersee-Chinesen weniger eigene Selbstwertschätzung im sozialen Kontakt zu anderen, im Umgang mit Kritik und im leistungsbezogenen Bereich. Überraschenderweise erhielten die Probanden einen höheren Selbstwert in der Sportlichkeit. Die SEE (Skalen zu Erleben von Emotionen) (Behr & Becker, 2004) zeigten, dass die körperliche Symbolisierung von Gefühlen bei der chinesischen Stichprobe niedriger war als bei der deutschen Norm. Dies hing mit der Ausprägung der europäischen Identität zusammen. Negativ korrelierte die europäische Identität auch mit der Regulation von Emotionen. Im FBeK (Fragebogen zur Beurteilung des eigenen Körpers) (Strauß & Richter-Appelt,1995) ging das Körpererleben der Übersee-Chinesen mit weniger Selbstbewusstsein für die eigene Attraktivität einher. Je mehr die Lebensart zum Asiatischen tendierte, desto weniger äußerte sich die Akzentuierung des äußeren Erscheinungsbildes und desto höher erschien die Unsicherheit. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse darauf hin, dass die Auslebung einer bikulturellen Identität Folgen für die psychologische Entwicklung eines Individuums mit sich bringen, welche beispielsweise für die Arbeit bei Patienten im psychotherapeutischen Prozess mit berücksichtigt werden sollten.
Die mikroskopische Anatomie sowie die pathologische Anatomie bilden einen wichtigen Baustein der Ausbildung von Medizin- und Zahnmedizinstudenten. Da die zeitlichen und personellen Kapazitäten in den Instituten für Pathologie bzw. Anatomie keine vierundzwanzigstündige Betreuung erlauben, bestand der Wunsch, ein zeit- und ortsunabhängiges webbasiertes und interaktives multimediales Lernprogramm zu entwickeln. Es sollte den Studierenden beim Erlernen der Histologie und Histopathologie helfen und die Präsenzveranstaltungen am Mikroskop und Vorlesungen Ergänzen. Das Lernprogramm wurde mit zahlreichen hochauflösenden Bildern aller histologischen Präparate, die Bestandteil der Histologie- und Histopathologiekurse sind, in verschiedenen Vergrößerungen ausgestattet und in die Kurse des Frankfurter Curriculum für Medizin- und Zahnmedizin integriert. Darüber hinaus wurden alle histologischen Webseiten mit den entsprechenden histopathologischen Seiten verlinkt und umgekehrt. Ein Autorensystem zur Aktualisierung, Korrektur und Erweiterung der Programme wurde entwickelt. Mit der Hilfe der Evaluation durch die Studierenden wurde das System im Verlauf stark verbessert. Die hohe Zahl der Zugriffe auf die Website über das Internet (500.000 – 800.000 im Monat) weist auf die hohe Akzeptanz und Beliebtheit des Programms hin. Im wesentlichen zeigt die vorliegende Arbeit, dass internet-basierte Multimedia-Projekte von Studierenden verwendet werden und ihnen helfen, komplexe Sachverhalte der Histologie und Histopathologie zu erlernen. Die enge Verzahnung zwischen histologischen und histopathologischen Themen und Präparaten ermöglicht Studierenden der vorklinischen Fächer, über krankheitsbedingte Veränderungen zu erfahren, Studierende der klinischen Fächer hingegen können das histologische Basiswissen rekapitulieren. Das Autorensystem kann zur Entwicklung weiterer webbasierter Anwendungen, wie z. B. Virtuelle Mikroskopie oder Wissensprüfungsprogramme für die Histologie/Histopathologie, verwendet werden.
Survivin wird in einer Vielzahl von Tumoren überexprimiert, während es in normalem Gewebe bis auf einige Ausnahmen kaum detektierbar ist. In den Krebszellen vermittelt Survivin eine erhöhte Resistenz gegenüber der Apoptose-Induktion, was eine Therapie jedoch meist bezweckt. Durch sein differenzielles Expressionsprofil wird Survivin mittlerweile als ein interessanter Angriffspunkt in der Entwicklung einer neuen, zielgerichteten Behandlung von Krebs betrachtet. Aus diesem Grund wurde zu Beginn der vorliegenden Arbeit die Eignung des anti-apoptotischen und Zellzyklus-regulierenden Proteins Survivin als Zielstruktur für eine Krebstherapie im Vergleich zu den veröffentlichten Publikationen verifiziert. Die Analyse der Survivin-Expression in unterschiedlichen Zelllinien ergab, dass sich in Tumorzellen eine charakteristische Überexpression des Survivin-Proteins zeigte im Vergleich zu gesunden, nicht-transformierten Zelllinien. Eine Inhibition der Survivin-Proteinexpression wurde mittels der Methode der RNA-Interferenz erzielt, bei der die Zielzellen mit shRNA-kodierenden Lentiviren infiziert wurden, welche eine gegen die Survivin-mRNA gerichtete Sequenz beinhalteten. Während Survivin-positive Tumorzelllinien und gesunde Endothelzellen eine starke Reduktion in der Lebend-Zellzahl in vitro aufwiesen, waren die Survivin-negativen Kontrollzelllinien von einem Verlust der Survivin-Expression nicht beeinträchtigt. Anschließend erfolgten eine Analyse der Survivin-Abhängigkeit etablierter Tumorzelllinien und die Untersuchung eines Survivin-Verlusts auf die murine Brustdrüsenentwicklung in vivo. Bei einer Inhibition der Survivin-Expression in Krebszellen in einem Transplanationsmodell konnte ein deutlich verzögertes Tumorwachstum beobachtet werden. Dagegen hatte Survivin in der Entwicklung der murinen Brustdrüse keinen Einfluss auf die Rekonstitution des Gewebes und die Proliferation bzw. Differenzierung der Brustepithelzellen. Um einen direkten protein-basierenden Inhibitor des Survivin-Proteins zu entwickeln und das Repertoire an allgemeinen Survivin-Interventionsstrategien zu erweitern, wurde im zweiten Teil der Arbeit mittels des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems ein neues Survivin-bindendes Protein isoliert. Nach dem Optimierungsprozess bestehend aus einer Fusion mit einem Trägerprotein zur erleichterten Proteinexpression, der Mutagenese eines Cysteins gegen Serin und der Fusion mit einer Proteintransduktionsdomäne konnte das Protein rekombinant in Bakterien hergestellt und durch Affinitätschromatographie in monomerer Form aufgereinigt werden. Anschließend wurde der Einfluss des artifiziellen, rekombinanten Survivin-inhibierenden Proteins (rSip) auf die Funktionen von Survivin bestimmt. rSip zeigte eine Stabilität von bis zu 14 Stunden im Zellkulturmedium und konnte durch seine C-terminale Proteintransduktionsdomäne in das Zytoplasma der Zielzellen aufgenommen werden. In einer Co-Immunpäzipitation konnte die Bindung von rSip an endogenes Survivin bestätigt werden. In Brustkrebszellen führte rSip in einer Konzentration von 1,5 µM zu einem schnellen Verlust des Survivin-Proteins, was möglicherweise auf eine proteosomale Degradation von Survivin zurückzuführen war. Die Analyse der Konsequenzen einer rSip-Behandlung auf die Funktionen von Survivin in der Apoptose-Inhibition und der Zellzyklus-Progression wurde im letzten Abschnitt der Arbeit durchgeführt. Eine viertägige Inkubation mit 1,5 µM rSip bewirkte eine deutliche Reduktion der Lebend-Zellzahl von bis zu 50% im Falle der Survivin-abhängigen Krebszelllinien. Bei den Survivin-negativen Zelllinien trat dagegen kein veränderter Phänotyp auf. Durch einen TUNEL-Test in Brustkrebszellen konnte gezeigt werden, dass die Ursache für die Abnahme der Zellzahl die Apoptose-Induktion durch rSip ist. In den Zellzyklus-Profilen von rSip-behandelten Krebszellen konnte ebenfalls ein starker Anstieg in der apoptotischen Zell-Population beobachtet werden. Abschließend lässt sich sagen, dass in der vorliegenden Arbeit neben der Methode der lentiviralen Applikation von Survivin-spezifischen shRNA-Sequenzen eine neue Möglichkeit der Interferenz mit der Survivin-Funktion in Krebszellen vorgestellt wurde. Die Entwicklung des Survivin-inhibierenden Proteins rSip steht zugegebenermaßen erst am Anfang. Die ersten hier präsentierten Ergebnisse zeigen jedoch klar ein Potential dieses vielversprechenden direkten Survivin-Inhibitors als ergänzende Wirkstoffklasse auf dem Gebiet der therapeutischen Proteine zu den bereits existierenden niedermolekularen Substanzen bzw. antisense-Oligonukleotiden, die auf Ebene der Transkription bzw. der Translation von Survivin wirken.
Die Applikation von Medikamenten zur konservativen Behandlung von Patientinnen mit ektopen Schwangerschaften ist weltweit seit vielen Jahren im klinischen Alltag erfolgreich eingesetzt worden. Am erfolgreichsten zeigte sich über die Jahre, die medikamentöse Methotrexatgabe. Dies wurde eindrucksvoll in in-vivo und in in-vitro Studien bewiesen. Ausgangsbedingungen für die vorliegende Untersuchung sind die zahlreichen experimentellen Untersuchungen zur Wirkung von Prostaglandinen auf den mütterlichen Organismus (speziell glatte Muskelzellen der Blutgefäße, des Uterus und Tubenmuskulatur sowie das Corpus luteum) und die zahlreichen klinischen Fallberichte und Studien zur Anwendung von Prostaglandinen zur Behandlung der EUG. In vitro Studien zu der Wirkweise von Prostaglandinen auf ektopes Schwangerschaftsgewebe gibt es nur in geringer Zahl. Da Prostaglandin E2 in der Geburtshilfe einen festen Platz in der Geburtsinduktion und Zervixreifung hat, haben wir Prostaglandin E2 in vitro auf seine Wirkung auf ektopes Trophoblastengewebe untersucht. In der hier vorgelegten Arbeit sollte die Fragestellung überprüft werden, inwieweit eine medikamentöse Wirkung von Prostaglandin E2 Dinoproston auf Trophoblastengewebe aus extrauterinen Schwangerschaften in einem standardisierten Gewebekultursystem besteht. Aus operativ gewonnenen Extrauteringraviditäten des ersten Trimenons wurde Choriongewebe extrahiert, und in unterschiedlichen Konzentrationen der Wirkstoff Prostaglandin E2 Dinoproston 12 Stunden nach Kulturansatz den Gewebekulturen zugesetzt. Eine weitere Choriongewebekulturzellreihe wurde erst am 6. Tag mit Prostaglandin E2 behandelt. Das durch die Throphoblastenzellen sezernierte Humane Chorion Gonadotropin (HCG) wurde den Kulturen alle zwei Tage entnommen und gemessen. Alle Kulturen zeigten Sekretion von HCG innerhalb der ersten 16 Tage. Das Ergebnis dieser Versuchsreihen zeigte, dass weder die unterschiedlichen Prostaglandin E2-Konzentrationen, noch der Zeitpunkt der Zugabe, eine signifikante Auswirkung auf die HCG Sekretion von ektopen Schwangerschaften hat. Die Kontrollgruppe mit intrauterinem Trophoblastenmaterial bestätigt die fehlende Wirkung auf Throphoblastengewebe in der Zellkultur.
The power to dissociate : molecular function of the twin-ATPase ABCE1 in archaeal ribosome recycling
(2010)
Es ist die Hypothese der hier vorgelegten Arbeit, dass bei Asthmatikern oxidativer Stress in der Lunge durch die nichtinvasive Methode der Atemkondensatsammlung und Messung der [H2O2] im EBC erfasst werden kann. Basierend auf dieser Hypothese sollte geprüft werden, inwieweit bei stabilen Patienten mit intermittierendem allergischem Asthma (Grad I, WHO) eine erhöhte [H2O2] im EBC nachweisbar ist und ob es zu einem differenten Anstieg der [H2O2] nach niedrig dosierter Allergenbelastung mit und ohne Supplementation von n-3 PUFA kommt. In dieser Arbeit wurden Patienten mit intermittierendem Asthma und Hausstaubmilbenallergie einbezogen und repräsentierten die Milbenallergikergruppe. Sie wurde in einer randomisierten, doppelblinden und placebokontrollierten fünfwöchigen Studie getestet. Die Patienten erhielten entweder in Gruppe A n-3 PUFA-reiche Kapseln oder in Gruppe B PlaceboKapseln über fünf Wochen. Nach einer dreiwöchigen Aufsättigungsphase wurden die Probanden über zehn Werktage zusätzlich mit niedrig dosiertem Milbenallergen provoziert (FEV1-Abfall 5 %). Atemkondensatuntersuchungen wurden mit Hilfe des ECoScreen® und des ECoCheck® (VIASYS Healthcare GmbH) vor Beginn (V1), nach drei Wochen (V2) und nach der letzten Milbenprovokation (V3) durchgeführt. Zur Erfassung der pulmonalen Entzündung erfasste man zusätzlich bei den genannten Visiten die [eNO] als Kontrollparameter. Weiterhin, zur Erfassung des normalen Verlaufs der [H2O2], wurde bei einer gesunden Kontrollgruppe, die weder provoziert noch supplementiert wurde, die [H2O2] im EBC nach identischem zeitlichen Schema erfasst. In der Milbenallergikergruppe nahmen 30 Patienten und in der Kontrollgruppe 13 Probanden an der Studie teil. Aufgrund technischer Schwierigkeiten und nicht auswertbarer Messwerte, wurden in der Milbenallergikergruppe 17 Patienten und in der Kontrollgruppe neun Probanden zu statistischen Analysen herangezogen. In der Verumgruppe (p = 0,246), der Placebogruppe (p = 0,180) und der Kontrollgruppe (p = 0,185) war kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der [H2O2] im EBC zwischen den Visiten vorhanden. Zwischen der Verum- und der Placebogruppe bestand zu keinem Zeitpunkt ein signifikanter Unterschied. In der Milbenallergikergruppe unterschied sich der Verlauf der [H2O2] im EBC deutlich vom Verlauf der [eNO]: Die [H2O2] konnte allenfalls einen Trend (p = 0,101) zwischen den Visiten aufweisen, wobei die [eNO] einen hochsignifikanten (p < 0,001) Unterschied zwischen V3 und V2 aufwies. Es bleibt zum einen offen, ob n-3 PUFA einen antientzündlichen Effekt bei Asthma bronchiale (Grad I, WHO) hat, und zum anderen, inwieweit die Messung der [H2O2] im EBC anhand des ECoCheck® (Fa. VIASYS Healthcare GmbH) als diagnostischer Marker oder zur Verlaufskontrolle bei Asthma bronchiale (Grad I, WHO) geeignet ist.
Das Ziel dieser Arbeit ist eine Darstellung der Etablierung des Films im Bereich der Medizin auf Universitätsebene am Beispiel von Prof. Karl Kleist, Leiter der Psychiatrie in Frankfurt am Main von 1920 bis 1950. Als Primärquellen wurden Akten, Briefe und Filme der Frankfurter Psychiatrie aus der damaligen Zeit gesichtet und ausgewertet. Zusammen mit den Sekundärquellen über Kleist und der Darstellung der politischen Rahmenbedingungen in diesem Zeitraum bildet dies die Grundlage der hier vorliegenden Arbeit. Kleist wurde am 31.Januar 1879 in Mühlhausen im Elsass geboren. Nach dem Medizinstudium in Straßburg, Heidelberg, Berlin und München begann er seine Arbeit 1903 als Assistenzarzt in Halle. Hier lernte er Carl Wernicke kennen, der ihn in seinem weiteren wissenschaftlichen Denken und Vorgehen stark prägte. Es entstand eine neue wissenschaftliche Schule, später bekannt als Wernicke- Kleist- Leonhard- Schule. Nach seiner fünfjährigen Assistenzarztzeit in Halle arbeitete er vorübergehend an Edingers Neurologischem Institut in Frankfurt am Main und im hirnpathologischanatomischen Laboratorium Alzheimers in München innerhalb der Klinik von Emil Kraepelin. Danach wechselte er als Oberarzt an die Nervenklinik in Erlangen, wo er bis 1914 arbeitete. Während des ersten Weltkrieges wurde er in einem Kriegslazarett eingesetzt. Dort sammelte er viele Erfahrungen mit Hirnverletzten. 1916 wurde er Direktor der Psychiatrie in Rostock. 1920 folgte er einem Ruf nach Frankfurt am Main. Kleist wurde Leiter der Städtischen und Universitätsklinik für Gemüts- und Nervenkranke in Frankfurt am Main. Auch nach seiner Emeritierung 1950 war er dort weiter wissenschaftlich tätig. Während der Zeit in Frankfurt am Main förderte er den Film als Lehr- und Forschungsmittel. Zu Beginn wurde er von privaten Stiftungen gefördert, später baute er einen Kontakt zum Medizinisch-Kinematographischen Universitätsinstitut in Berlin auf. Dieses arbeitete eng mit dem Verlag Wissenschaftlicher Filme zusammen. Mit Hilfe dieses Verlages stellte er viele Filme her; als Gegenleistung bekam der Verlag unter anderem die Negative seiner Aufnahmen. Nach dem Konkurs des Verlages kaufte die Deutsche Gesellschaft für wissenschaftliche Filme einen Großteil der Konkursmasse und damit auch Kleists Filme auf. Aufgrund der wirtschaftlichen Verhältnisse konnte das Unternehmen jedoch nicht florieren. Kleist wollte seine aufgenommenen Filme aber wissenschaftlich nutzbar machen und ein umfassendes Archiv von psychiatrischen und neurologischen Filmen erstellen. Kaufen konnte er das Material aufgrund mangelnder finanzieller Möglichkeiten nicht. Er schaffte es allerdings, seine Filme bei der Deutschen Gesellschaft für wissenschaftliche Filme zu vereinen und sie teilweise wissenschaftlich zu nutzen. Bald darauf wurden diese Bestände jedoch von der neu gegründeten Reichsstelle für den Unterrichtsfilm übernommen. Einerseits entsprach diese Zentralisierung Kleists Vorstellungen in Bezug auf eine bessere Übersicht und Nutzung der Filme seines Fachgebietes, andererseits stellte er aber ein fragwürdiges wissenschaftliches Interesse der Reichsstelle für den Unterrichtsfilm fest. Nach dem Krieg erlangte er über viele Umwege den Großteil seiner Filme zurück. Darunter befand sich der in dieser Arbeit exemplarisch analysierte Katatoniefilm. Die Fertigstellung der Filme benötigte damals oft Jahre. Wissenschaftliche Filme mit einer Länge von 15-20 Minuten mit mehreren Sequenzen benötigten bis zur Fertigstellung teilweise über zehn Jahre. Die Gründe hierfür waren vielschichtig. Abgesehen von den technischen Problemen waren Aufnahmen aufwändig und teuer. In die Planung mussten sehr viele Ressourcen investiert werden. Patienten mit seltenen Krankheiten waren für Aufnahmen nicht immer verfügbar und die wirtschaftlichen und politischen Gegebenheiten wie Wirtschaftsdepression und Krieg verminderten die Realisationschancen. Trotz dieser widrigen Umstände schaffte es Kleist eine beachtliche Anzahl an Filmen herzustellen und das Filmwesen zu fördern. Prof. Karl Kleist war ein Gründer des psychiatrischen und neurologischen Films. Er hatte das große Ganze im Blick und strebte stets danach seine Ideale auch im Detail zu verwirklichen.
Die hämatologische Diagnostik wurde in den letzten zwei Jahrhunderten bis zum heutigen Stand stark geprägt und es gibt mittlerweile eine Menge an hämatologischen Diagnostikgeräten. Das Humacount 5 ist ein vollautomatischer hämatologischer Analyzer der mit der Volumetrischen Impedanz Methode Blutbilder erstellt. Ein idealer Einsatzort für das Humacount 5 ist der tägliche Gebrauch sowohl in Ambulanzen als auch auf klinischen Stationen. Es ist ein kompaktes und einfaches Tischgerät, dass auf allen Stationen die für Prävention , Diagnostik, Therapie und Nachsorge Laborwerte benötigen eingesetzt werden kann. Ziel dieser Arbeit war die Testung dieses Gerätes auf Validität, Reliabilität, Objektivität Präzision, Geschwindigkeit und Messgenauigkeit im Vergleich mit der Standardlabormaschine Advia 120. Um auf Häufigkeit und Stärke der Abweichungen zu überprüfen in einem Bereich in dem es äußerst sensitiv arbeiten soll, wurden 50 physiologische Proben benutzt. 250 pathologischen Proben wurden benutzt um eine Auslastung in allen Laborparametern zu erreichen und das Humacount 5 ebenfalls auf Häufigkeit und Stärke der Abweichungen in diesen Bereichen zu überprüfen. Das Humacount 5 liegt mit seinen Werten in einem sehr gutem Variationsbereich die unter den geforderten 5% Abweichintervall liegen. Insgesamt zeigt sich ein sehr gut übereinstimmendes Ergebnis der 22 Laborparameter in der Einteilung auf physiologische Proben und pathologische Proben zwischen dem Advia 120 und dem Humacount 5. In einer zweiten Testreihe wurde die Reliabilität in einem internen Vergleich des Humacount 5 überprüft. Es wurden 50 physiologische und 250 pathologische Proben jeweils zwei mal im Humacount 5 zeitlich direkt hintereinander gemessen. In einer dritten Testreihe werden die 50 physiologischen Proben und die 250 pathologischen Proben verglichen mit einer Messung dieser Proben nach 24 Stunden und in einer vierten Testreihe wurden 10 pathologische Proben jeweils zehn mal hintereinander gemessen. Es haben sich gute Ergebnisse in der Reliabilität und Messgenauigkeit in Bezug auf die Häufigkeit der abweichenden Laborparameter gezeigt. Das Humacount 5 zeigt hierbei besonders, dass in den stark ausgelasteten pathologischen Grenzbereichen der Laborwerte eine sehr hohe Messqualität besteht. Insgesamt betrachtet ist das Humacount 5 also ein sehr valides und reliables Messgerät, das in vielen seiner 22 Laborparameter exzellente Werte abgeliefert hat. Das Gerät wurde in allen Laborparametern vollständig ausgelastet und zeigt sehr sensible Ergebnisse bis in hohe pathologische Werte. Als zweiter Teil der Arbeit wurde der CD4+ Select Test mit einem Standardverfahren in der HIV-Diagnostik, der Flow Zytometrie, verglichen; der CD4+ Select Test ist ein HIVTestverfahren, das CD4 positive Lymphozyten identifizieren und zählen soll. Ziel dieses Teils der Arbeit war die Testung des Verfahrens auf Validität, Reliabilität, Objektivität, Präzision und Messgenauigkeit. Dieses Testverfahren soll vor allem in der HIV Diagnostik und im Patientenmonitoring in der Antiretroviralen Therapie eingesetzt werden. Vor allem ist dieses Testverfahren für die Entwicklungsländer gedacht, die sich das teure Standardverfahren der Flow Zytometrie nicht leisten können. CD4+ Select ist eine kostengünstige aber hochqualitative Alternative für diese Länder. Der CD4+ Select Test wurde validiert anhand bestimmten Kriterien der Firma TriMedCare und auf korrekte Durchführung und korrekte Werte überprüft. Die Blutproben die für die Tests verwendet wurden sind zuvor im Zentrallabor standardisiert gemessen worden. Die CD4 + Werte des CD4+ Select Testverfahrens wurden mit diesen Referenzwerten verglichen. Das Ergebnis des Testverfahrens ist sehr zufriedenstellend und ohne Bedenken in den gewünschten Bereichen einsetzbar. Es ist ein sehr effektiver Test für die CD4+ Lymphozytenbestimmung, der äußerst korrekt arbeitet wenn er sehr sauber durchgeführt wird; außerdem ist er kostengünstig, benötigt wenig Arbeitsaufwand und beinhaltet eine einfache Handhabung. Besonderes Interesse für diese Methode besteht dadurch natürlich in den HIV Ambulanzen und den infektiologischen Fachbereichen.
Die Motivation dieser Arbeit lag in der Formulierungsentwicklung eines nanopartikulären Systems auf Basis von Poly(D,L Milch-co-Glykolsäure) (PLGA) zum Transport eines antiangiogenen Antikörpers zur spezifischen Anreicherung in malignen Tumoren. Durch das partikuläre System soll eine optimierte Therapie mit erhöhten pharmazeutischen Wirkkonzentrationen am Wirkort bei gleichzeitig reduzierten Nebenwirkungen erreicht werden. In der Literatur wurden schon mehrfach unterschiedliche Herstellungsmethoden sowie diverse Untersuchungen der PLGA-Nanopartikel (NP) beschrieben. Dennoch fehlen bisher von Antikörperbeladenen PLGA-NP zur Tumortherapie systematische Untersuchungen der Herstellung, der Charakterisierung physikochemischer Eigenschaften, der Lagerstabilität und der Wirkung in biologischen Systemen. Diese Untersuchungen wurden in dieser Arbeit durchgeführt und die Ergebnisse in vier Teilbereiche gegliedert. Im ersten Teilbereich wurde die Herstellung und Charakterisierung der PLGA-NP etabliert. Dabei wurde zunächst der Einfluss unterschiedlicher Herstellungsparameter und Formulierungen auf unbeladene und Proteinbeladene PLGA-NP untersucht. Charakterisiert wurden die Nanopartikel anhand der Partikelgröße und Polydispersität, dem Zetapotential und den bildgebenden Verfahren TEM und SEM. Neben der Reproduzierbarkeit der physikochemischen Eigenschaften ist für die Entwicklung nanopartikulärer Systeme die exakte Bestimmung der Einbettungseffizienz hochpotenter Proteine von größter Bedeutung. Da an dieser Stelle keine normierten Methoden zur Verfügung standen, wurden drei Bestimmungsmethoden bewertet und die Einbettungseffizienzen untersucht. Im zweiten Teilbereich wurden die Lyophilisation und die Lagerstabilität der PLGA-NP untersucht. Um die kritischen Faktoren wie Partikelgröße und Partikelgrößenverteilung bis zur Applikation gewährleisten zu können, wurde die Lyophilisation der entwickelten PLGA-NP anhand unterschiedlicher Kriterien analysiert. Die Stabilität des erhaltenen Lyophilisats wurde durch eine anschließende Lagerstabilitätsstudie bei unterschiedlichen Klimabedingungen bewertet. Die Charakterisierung der Partikelgrößen und Partikelgrößenverteilungen mittels PCS, AUZ und TEM der PLGA-NP in Gegenwart unterschiedlicher Stabilisatoren erfolgte vor und nach der Lyophilisation sowie nach 4, 8 und 13 Wochen Lagerung bei Klimabedingungen von 4°C, 25°C/60rF und 40°C/75rF. Im dritten Teilbereich der Arbeit werden Ergebnisse zum Freisetzungsverhalten der Proteine aus den PLGA-NP dargestellt. Für die kontrollierte Freigabe der Proteine aus den Nanopartikeln spielt der Abbaumechanismus der Partikel und damit des Polymers eine bedeutende Rolle. Das Abbauverhalten der PLGA-NP wurde daher zunächst über die Veränderung der Partikelgröße und Partikelgrößenverteilung mittels PCS und AUZ untersucht. Dafür wurden PLGA-NP unterschiedlichster Formulierungen bis zu 100 Tage beobachtet und analysiert. Ein wichtiges Ziel dieser nanopartikulären Systeme ist die Freisetzung des Antikörpers über die gewünschte Zeit, damit eine pharmakologische Wirkung erzielt werden kann. Dafür wurden ebenso PLGA-NP unterschiedlichster Formulierungen in einem geeigneten Freisetzungsmedium mittels verschiedener Freisetzungsmodelle und analytischer Methoden untersucht. Neben unterschiedlichen Proteinen wurde auch der Proteinzustand, das Polymer sowie der Zusatz von Hilfsstoffen variiert. Im letzten Teil der Arbeit wurde die biologische Wirkung der Antikörperbeladenen PLGA-NP in Zellkulturversuchen ermittelt. Die Nanopartikel wurden hier auf ihren antiangiogenen Effekt mittels „Attachment- und Detachment-Assay“ sowie auf zellspezifische Bindung und Zellaufnahme mittels FACS und CLSM untersucht. Des Weiteren wurde ein präklinischer Transwell-Versuch entwickelt, um einen biologischen Nachweis des „sustained release“-Effektes der PLGA-NP zu erbringen. Auf Basis dieser Arbeit und der Erkenntnisse vorangegangener Studien scheint es möglich, gut charakterisierte Antikörper-beladene PLGA-NP zur Tumortherapie mit einer pharmakologischen Wirkung zu etablieren und für weiterführende präklinische Untersuchungen einzusetzen.
Der Schreibkrampf ist eine Form der fokalen Dystonie, die durch unwillkürliche Verkrampfungen der Hand beim Schreiben gekennzeichnet ist, wobei es zu abnormen und funktionell beeinträchtigenden Fehlstellungen kommen kann. Hinsichtlich der Pathophysiologie vermutet man neben einer defizienten sensomotorischen Integration eine abnorme kortikale Plastizität. So findet sich bei Schreibkrampf-Patienten eine abnorm verstärkte PAS-induzierte LTP-ähnliche Plastizität (Quartarone et al., 2003). Diese weist wie auch die LTD-ähnliche Plastizität einen Verlust der somatotopen Spezifität auf: Veränderungen der motorkortikalen Erregbarkeit können im Gegensatz zu Gesunden auch durch PAS mit nicht-homologer peripher-elektrischer Stimulation induziert werden (Weise et al., 2006). Darüber hinaus scheint die für das Gleichgewicht von neuronalen Netzwerken notwendige homöostatische Metaplastizität beim Schreibkrampf gestört zu sein, wenn die Interaktion zwischen zwei aufeinanderfolgenden TMS-Protokollen getestet wird, die LTP- und LTD-ähnliche Plastizität hervorrufen (Quartarone et al., 2005). Da es sich beim motorischen Lernen um einen LTP-abhängigen Prozess handelt, war zu vermuten, dass dessen homöostatische Regulierung beim Schreibkrampf ebenfalls gestört ist. Diese Hypothese ist Ausgangspunkt der vorliegenden Untersuchungen. Hierfür wurde die als Modell für assoziative LTP- und LTD-ähnliche Plastizität beim Menschen entwickelte PAS bei 10 Schreibkrampf-Patienten und 10 gesunden bezüglich Alter und Geschlecht angepassten Probanden angewandt. Verschiedene PAS-Protokolle, die entweder eine LTP-ähnliche Steigerung (PAS25ms), eine LTD-ähnliche Reduzierung (PAS10ms) oder keine Veränderung (PAS100ms) der Motorkortex-Exzitabilität induzieren, wurden kombiniert mit einem nachfolgenden motorischen Training, bei dem die Teilnehmer schnellstmögliche Daumenabduktionsbewegungen der rechten Hand über einen Zeitraum von 2x15 Minuten durchführen mussten. Bei den gesunden Probanden führte eine Konditionierung durch PAS25ms- und PAS10ms-Protokolle zu einer homöostatischen Regulierung nachfolgender übungsabhängiger Plastizität mit einer Verschlechterung des motorischen Lernens nach dem fazilitierenden PAS25ms-Protokoll und einer Verbesserung des motorischen Lernens nach einem inhibierenden PAS10ms-Protokoll. Bei den Schreibkrampf-Patienten konnte diese homöostatische Metaplastizität nicht nachgewiesen werden. Zusätzlich korrelierte das Ausmaß dieser Störung (Verlust der Herunterregulierung motorischen Lernens nach Konditionierung mit PAS25ms) mit dem klinischen Schweregrad der Dystonie als behavioralem Korrelat, so dass mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit die Hypothese gestützt werden kann, dass eine gestörte homöostatische Metaplastizität eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie des Schreibkrampfes spielt. Inwieweit sich hieraus auch therapeutische Implikationen bzw. Strategien ableiten lassen, soll in weiteren Studien überprüft werden.
In this thesis, the structure of the C-terminal domain of presenilin-1, the catalytic component of the y-secretase complex, is investigated by NMR spectroscopy. The ysecretase complex has a definitive role in the pathogenic development of Alzheimer's disease, in that it mediates the cleavage of aprecursor to create the amyloid ß peptide. Aggregates of amyloid ß which form amyloid plaques are the most overt clinieal feature observed in the post-mortem brains of Alzheimer's patient. In addition, many of the mutations found in the aggressive early onset familial Alzheimer's disease have been linked to presenilin-1, highlighting its importance in disease progression and deeming it an important target for investigation. One of the greatest challenges for the structural investigation of the y-secretase components is their low expression yields in cell-based systems. We therefore applied continuous-exchange cell-free expression to obtain sufficient amounts of protein for our structural studies. An added benefit of the cell-free expression system is the freedom to incorporate any desired combination of stable-isotope labels directly into sampies. We were therefore able to develop a labeling scheme which targets the amino acid composition of transmembrane a-helices, allowing us to simplify an assignment procedure whieh tends to be cumbersome and diffieult for most a-helical transmembrane proteins. The y-secretase complex is a member of the intramembrane cleaving proteases which, as their name implies, cleave their transmembrane substrates within the bilayer. Single particle analysis of the y-secretase (1) as weil as crystal structures of rhomboid (2) and S2P (3) have revealed the presence of hydrophilie po res within the membrane where catalysis occurs. In light of evidence that certain elements of CTF reside in close proximity or even contribute to the formation of the hydrophilic pore, we chose to study the structure of CTF in mieelles, whieh may be better suited to accommodate CTF in isolation as compared with solid membranes in the absence of the other y-secretase components. The structure of CTF was solved to 1.7 A (backbone r.m.s.d) and revealed the presence of unusual features, including a partially membrane-spanning helix which situates the catalytic asparte at its N-terminus in what would be the center of the membrane where catalysis is proposed to occur, as weil as a severely kinked helix which is partially embedded beneath the surface of the membrane (P6). Interestingly, similar features have been observed in the crystal structure of the GlpG rhomboid. In addition, a soluble helix was found in the long N-terminal loop of CTF which until now has been described as unstructured. The first part of the thesis is designed to provide an introduction to Alzheimer's disease, the role of y-secretase and its presenilin-l catalytic component in disease progression, as weil as cell-free expression and liquid-state NMR techniques involved in the structural investigation of membrane proteins. In chapter 2, the reader is familiarized with the history, the clinical manifestation, and biochemical features of Alzheimer's disease. The chapter goes further to describe the role of the y-secretase complex and its individual components in disease progression and substrate processing. Chapter 3 focuses more specifically on presenilin-l in the context of the newly emerging class of intramembrane proteases. In chapter 4, attention is shifted to the cell-free expression system with special focus on the expression of membrane proteins, and chapter 5 explores the various liquid-state NMR techniques that were required for the characterization of CTF. The second part of the thesis is cumulative and contains original research, method, and review articles that were produced during the course of study. Chapter 6 explores the various techniques and innovations used to study membrane proteins using continuous exchange cell-free expression coupled with NMR spectroscopy. In chapter 7, a new technique, transmembrane segment targeted labeling, is described as a tool that facilitates the backbone assignment of transmembrane proteins which display severe overlap in NMR spectra. Chapter 8 presents the novel NMR structure of the C-terminal fragment of presenilin-l solved in SOS micelles.
Die Zelle repliziert ihre DNA während der S-Phase und segregiert sie dann später in der M Phase des Zellzykluses. Kommt es während dieser Prozesse zu DNA Schädigungen, arretiert die Zelle den Zellzyklus mit Hilfe spezifischer Kontrollmechanismen und versucht den Schaden zu beheben. Der DNA Kontrollpunkt wird bei DNA Schädigungen aktiviert, um mit Hilfe der DNA Reparatur den Schaden zu beheben und somit dafür zu sorgen, dass die DNA fehlerfrei repliziert werden kann. Der zweite Zellzyklus Kontrollpunkt, der Spindel Kontrollpunkt, stellt sicher, dass die Chromosomen während der M Phase unter gleicher Spannung innerhalb der Äquatorialplatte der Metaphase Spindel angeordnet sind. Kann in der Zeit, in der der Zellzyklus Kontrollpunkt aktiv ist, der Schaden nicht behoben werden, so wird Apoptose ausgelöst und die Zelle wird aus dem Zellverband entfernt. Krebszellen haben Strategien entwickelt, Zellzyklus Kontrollpunkte zu umgehen und darüber hinaus normalen Mechanismen der Apoptose zu entkommen. Die genauen molekularen Vorgänge der Deregulierung der Apoptose sind weitestgehend unaufgeklärt. Procaspase 8 ist ein wichtiges Schlüsselenzym des extrinsischen Apoptose Signalweges. Der extrinsische Signalweg wird extrazellulär über die Bindung von Liganden an ihre korrespondierenden Rezeptoren ausgelöst. In dieser Studie wird gezeigt, dass Procaspase 8 an Ser-387 in vitro als auch in vivo von Cdk1/Cyclin B1 phosphoryliert wird. Darüber hinaus zeigt diese Phosphorylierungsstelle die typische Struktur einer Bindungsstelle für Plk1, einer weiteren mitotischen Kinase. Die Interaktion von Procaspase 8 mit Cdk1/Cyclin B1 wird über die DE Domäne („death-effector-domain“ DED) von Procaspase 8 vermittelt. Wird Procaspase 8 an Ser 387 zu Alanin (S387A) mutiert, so wird die Phosphorylierung durch Cdk1/Cyclin B1 fast vollständig verhindert. Wird zudem diese Mutante (S387A) in humanen Krebszellen überexprimiert, so hemmt dies die Apoptose nach Stimulation des Fas Rezeptors. Wird umgekehrt Cyclin B1 mittels RNA Interferenz depletiert und dadurch Cdk1 nicht aktiviert, wird extrinsische Apoptose verstärkt. Diese Studie zeigt erstmals eine gezielte Inhibierung des extrinsischen Apoptose Signalweges durch mitotische Kinasen und schlägt ein Modell vor, in dem Serin/Threonin Kinasen extrinsische Apoptose inhibieren und somit der Tumorzelle ermöglichen, der Apoptose zu entkommen. Darüber hinaus wird ein neuartiger Mechanismus der Inhibition der autokatalytischen Spaltung von Procaspase 8 durch eine mitotische Kinase gezeigt.
Die wichtigste Aufgabe der mitotischen Spindel ist die genaue Segregation der duplizierten Chromosomen in der Mitose. Diese dynamische Struktur wird von sich teilenden Zellen gebildet, um die Bewegung der Chromosomen, das Markenzeichen der Mitose, zu dirigieren. Trotz aller Unterschiede in Form und Größe der Spindeln unterschiedlicher Zelltypen, haben alle eukaryontischen Spindeln fundamentale strukturelle Eigenschaften gemeinsam. Eine der wichtigsten Eigenschaften ist die bipolare Symmetrie. Innerhalb der Spindel sind unterschiedliche Klassen der Mikrotubuli vorhanden, die durch ihre Organisation und durch ihre dynamischen Eigenschaften unterteilt sind. Alle Klassen der Mikrotubuli zeigen dynamische Instabilität. Dennoch weisen die Kinetochor-Mikrotubuli und die Spindel-Mikrotubuli zusätzlich ein anderes Verhalten auf, das als polwärts gerichteter Mikrotubuli-Flux ("Poleward Microtubule Flux") bezeichnet wird. Dabei werden die Tubulin-Untereinheiten stetig an den Plus-Enden der Mikrotubuli eingefügt und dann zu den Minus-Enden getragen, wo sie abgebaut werden. Dieser polwärts gerichtete Mikrotubuli-Flux ist für die Segregation der Chromosomen von großer Bedeutung. Mehrere regulatorische Proteine der Mikrotubuli, einschließlich der destabilisierenden und der depolymerisierenden Proteine, steuern die Dynamik dieser Mikrotubuli, um eine fehlerfreie Bildung der Spindel und eine korrekte Segregation der Chromosomen gewährleisten zu können. Die Kinesin-13 Familie der Depolymerasen gehört zu den prominentesten Modulatoren der Dynamik der Mikrotubuli. Das am Besten charakterisierte und intensiv studierte Mitglied dieser Familie ist das Protein KIF2C/MCAK. Aufgrund der unterschiedlichen Lokalisationen von MCAK während der Mitose, an den Spindelpolen, an den Chromosomen-Armen, an den Centromeren/Kinetochoren, kann MCAK eine Reihe an wichtigen Funktionen erzielen. Allerdings bleibt die Korrektur von Kinetochor-Mikrotubuli Fehlverknüpfungen die wichtigste Aufgabe von MCAK während der Mitose. Diese wesentliche Funktion steht unter der Kontrolle von Aurora B. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass MCAK während der Mitose auch von einem wichtigen Komplex, dem Cyclin B1/CDK1 Komplex, reguliert wird. In der Tat steuert die Kinase CDK1 sowohl die Lokalisation als auch die katalytische Aktivität von MCAK. Mit Hilfe einer systematischen Reihe an Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass MCAK sowohl in vitro als auch in vivo von CDK1 phosphoryliert wird. CDK1 phosphoryliert den katalytischen Bereich von MCAK genau am Threonin 537 und führt zu einer deutlichen Abnahme der Depolymerisierungsaktivität von MCAK in vitro und in humanen Zellen. Diese Inhibition erfolgt wahrscheinlich durch eine Reduzierung der Affinität von MCAK zu den Mikrotubuli-Enden. Die Expression der Phosphostatus-vortäuschenden Mutante T537E in HeLa-Zellen verursachte eine fehlerhafte Verteilung der Chromosomen in der Mitose. Die Chromosomen waren in Anwesenheit der T537E Mutante nicht mehr in der Lage, sich auf der Metaphaseplatte anzuordnen. Darüber hinaus führte die Expression von T537E zu einer signifikanten Reduzierung des centromerischen Abstandes, was auf eine Anhäufung von Kinetochor-Mikrotubuli Fehlverknüpfungen hindeutet. Ferner zeigt die Expression der nichtphosphorylierbaren Mutante T537A in den HeLa-Zellen eine verstärkte Lokalisation an den Spindelpolen, was zum Auftreten von erheblichen Spindel-Aberrationen führte. Basierend auf den Daten der vorliegenden Arbeit wurde ein Modell entwickelt, in dem die Phosphorylierung von MCAK durch CDK1 früh in der Mitose stattfinden muss, um einerseits MCAK zu inaktivieren und andererseits diese Depolymerase aus den Spindelpolen zu verdrängen. Beide Ereignisse sind für den Aufbau einer bipolaren Spindel unentbehrlich. Zu späteren Zeitpunkten der Mitose muss das Threonin 537 dephosphoryliert werden, um eine Reaktivierung von MCAK an den Centrosomen/Kinetochoren zu ermöglichen. Dies wird die Korrektur-Funktion für Kinetochor-Mikrotubuli Fehlverknüpfungen von MCAK wiederherstellen, was eine korrekte Anordnung der Chromosomen auf der Metaphaseplatte fördert.
The single unit doctrine proposes that each one of our percepts and sensations is represented by the activity of specialized high-level cells in the brain. A common criticism applied to this proposal is the one referred to as the "combinatorial problem". We are constantly confronted with unlimited combinations of elements and features, and yet we face no problem in recognizing patterns and objects present in visual scenes. Are there enough neurons in the brain to singly code for each one of our percepts? Or is it the case that perceptions are represented by the distributed activity of different neuronal ensembles? We lack a general theory capable of explaining how distributed information can be efficiently integrated into single percepts. The working hypothesis here is that distributed neuronal ensembles signal relations present in the stimulus by selectively synchronizing their spiking responses. Synchronization is generally associated with oscillatory activity in the brain. Gamma oscillations in particular have been linked to various integrative processes in the visual system. Studies in anesthetized animals have shown a conspicuous increase in power for the gamma frequency band (30 to 60 Hz) in response to visual stimuli. Recently, these observations have been extended to behavioral studies which addressed the role of gamma activity in cognitive processes demanding selective attention. The initial motivation for carrying out this work was to test if the binding-by-synchronization (BBS) hypothesis serves as a neuronal mechanism for perceptual grouping in the visual system. To this aim we used single and superimposed grating stimuli. Superimposed gratings (plaids) are bi-stable stimuli capable of eliciting different percepts depending on their physical characteristics. In this way, plaids can be perceived either as a single moving surface (pattern plaids), or as two segregated surfaces drifting in different directions (component plaids). While testing the BBS hypothesis, we performed various experiments which addressed the role of both stimulus and cortical architecture on the properties of gamma oscillations in the primary visual cortex (V1) of monkeys. Additionally, we investigated whether gamma activity could also be modulated by allocating attention in time. Finally, we report on gamma-phase shifts in area V1, and how they depend on the level of neuronal activation. ...
Krebszellen zeichnen sich häufig durch Expression von tumorassoziierten Antigenen aus, über die grundsätzlich eine spezifische Erkennung durch das Immunsystem möglich ist. Ansätze zur Immuntherapie von Krebserkrankungen zielen darauf ab, das Potential der körpereigenen Immunabwehr zur Tumorabwehr auszunutzen. Für die Aktivierung von tumorspezifischen T-Zellen ist die Präsentation von Peptidepitopen eines Tumorantigens zusammen mit effizienter Kostimulierung durch professionelle antigenpräsentierende Zellen (APCs), insbesondere dendritische Zellen (DCs), entscheidend. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden zur Induktion einer spezifischen Immunantwort gegen das tumorassoziierte Antigen ErbB2/HER2 neuartige zelluläre Vakzine generiert und ihre Aktivität in der Therapie bestehender ErbB2-exprimierender Tumoren analysiert. ErbB2 ist ein Mitglied der epidermalen Wachstumsfaktorrezeptorfamilie und wird von vielen humanen Tumoren epithelialen Ursprungs überexprimiert. Als Rezeptortyrosinkinase ist ErbB2 direkt an der Tumorpathogenese beteiligt und stellt eine wichtige Zielstruktur für unterschiedliche immuntherapeutische Ansätze dar. In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe wurde ein chimäres Tumorvakzin entwickelt, das über die extrazelluläre Domäne des humanen B7-Liganden CTLA-4 die spezifische Beladung von B7-exprimierenden APCs mit einem immunogenen Abschnitt des humanen ErbB2 (HER2/neu) in vivo ermöglicht. Die Immunisierung von naiven Mäusen mit DNA-Vektoren, die für sekretierte CTLA-4-ErbB2 Fusionspoteine kodieren, induzierte in den vorangegangenen Arbeiten eine protektive Immunität gegen anschließend injizierte ErbB2-exprimierende murine Nierenkarzinomzellen (Renca-lacZ/ErbB2). Allerdings war eine therapeutische Vakzinierung mit den DNA-Vektoren gegenüber bereits bestehenden Tumoren nicht mehr wirksam. Zur Erhöhung der therapeutischen Wirksamkeit des CTLA-4-ErbB2 Tumorvakzins wurde in dieser Doktorarbeit eine alternative Behandlungsstrategie entwickelt, bei der das APC-spezifische Fusionsprotein durch ein zelluläres Vakzin in vivo zur Verfügung gestellt wird. Durch stabile Transfektion der aus BALB/c Mäusen stammenden nicht tumorigenen Mammaepithelzelllinie HC11 mit einem CTLA-4-ErbB2 kodierenden DNA-Konstrukt wurde dazu das klonale zelluläre Vakzin HC11/CTLA-4-ErbB2 abgeleitet und funktionell charakterisiert. Von diesem Zellvakzin wurde anhaltend CTLA-4-ErbB2 Fusionsprotein in das umgebende Milieu sezerniert, das in der Lage war, effizient an B7-exprimierende Zellen zu binden. Die dreimalige Immunisierung mit dem zellulären HC11/CTLA-4-ErbB2 Vakzin im wöchentlichen Intervall löste im immunkompetenten BALB/c Mausmodell eine ErbB2-spezifische Immunantwort aus. Mit Hilfe des bereits zuvor in den prophylaktischen DNA-Vakzinierungsexperimenten eingesetzten BALB/c Renca-lacZ/ErbB2 Tumortransplantationsmodells wurde zunächst untersucht, ob das zelluläre HC11/CTLA-4-ErbB2 Vakzin einen Einfluss auf das Wachstum von etablierten ErbB2-exprimierenden Tumoren hat. Die Inokulation des Vakzins in die Nähe von subkutan wachsenden Renca-lacZ/ErbB2 Tumoren führte in BALB/c Mäusen zu einer kompletten Tumorregression in der Mehrzahl der behandelten Tiere. Dabei war der antitumorale Effekt von der starken Induktion ErbB2-spezifischer Antikörper und einer mäßigen ErbB2-spezifischen Aktivität systemischer zytotoxischer T-Zellen begleitet. Durch Vakzinierung und Tumorabstoßung wurde ein Langzeitschutz induziert, der die erneute Abstoßung einer zwei Monate nach dem Primärtumor systemisch applizieren letalen Dosis von Renca-lacZ/ErbB2 Tumorzellen bewirkte. Die Vakzinierung mit HC11/CTLA-4-ErbB2 hatte keinen Einfluss auf das Wachstum ErbB2-negativer Tumorzellen. Ebenso führte die Behandlung mit HC11 Zellen, die ein irrelevantes CTLA-4 Fusionsprotein sezernieren, nicht zur Abstoßung von RencalacZ/ ErbB2 Tumoren. Diese Resultate bestätigen die antigenspezifische Wirkung des zellulären HC11/CTLA-4-ErbB2 Vakzins. Für die Evaluierung von ErbB2-spezifischen Immuntherapien stehen eine Reihe transgener Mausmodelle zur Verfügung, welche die Untersuchung des Einflusses einer bestehenden immunologischen Toleranz gegenüber humanem ErbB2 auf die therapeutische Aktivität zulassen. Ein gut etabliertes und häufig verwendetes Tiermodell sind dabei transgene WAP-Her-2 Mäuse, für die der humane ErbB2-Rezeptor ein Selbstantigen darstellt. In dieser Arbeit wurden durch Kreuzung mit BALB/c WAP-Her-2 F1 Mäuse mit einem genetischen CB6F1 Hintergrund erzeugt. Diese Tiere wiesen eine ausgeprägte immunologische Toleranz gegenüber humanem ErbB2 auf und eigneten sich somit für die Analyse der Aktivität des zellulären HC11/CTLA-4-ErbB2 Vakzins in einem physiologisch relevanten Kontext. Eine therapeutische Vakzinierung mit dem ursprünglichen HC11/CTLA-4-ErbB2 Vakzin führte in diesen WAP-Her-2 F1 Tieren nicht zu einer Abstoßung von Renca-lacZ/ErbB2 Tumoren. Zur Erhöhung der Effektivität von HC11/CTLA-4-ErbB2 in der Therapie von ErbB2-positiven Tumoren in immunologisch toleranten Mäusen wurde daher ein ähnliches zelluläres Vakzin generiert, das zusätzlich das immunmodulatorische Zytokin IL-15 sezerniert. Im Gegensatz zu HC11/CTLA-4-ErbB2 war das optimierte zelluläre HC11/CTLA-4-ErbB2/IL-15 Vakzin auch in immuntoleranten WAP-Her-2 F1 Mäusen therapeutisch wirksam und verzögerte signifikant das Wachstum von ErbB2-exprimierenden Tumoren. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die andauernde Expression und Sekretion des APC-spezifischen CTLA-4-ErbB2 Fusionsproteins durch peritumoral injizierte Epithelzellen eine wirksame antigenspezifische Immunantwort und antitumorale Aktivität gegen etablierte Tumoren induzieren kann. Es ist wahrscheinlich, dass sich ähnliche Zellvakzine auch in menschlichen Krebspatienten als wirksam und nützlich erweisen können. Eine weitere Entwicklung dieses Ansatzes hin zu einer klinisch anwendbaren Immuntherapie erscheint daher sinnvoll.
Background: Nicotine, a component of cigarette smoke, has been implicated in the pathogenesis of lung disease. We examined whether nicotine can change the activity of angiotensin-converting enzyme (ACE), an enzyme that plays an important role in the pathophysiology of atherosclerosis and hypertension. Angiotensin converting enzyme, Dipeptidyl-carboxypeptidase is a glycoproteinpeptidyldipeptid-hydrolase, which devided Histidylleucin-dipeptid of angiotensin I, a relatively inactive Dekapeptide. ACE is located on cell surfaces. Highest concentration of ACE are found in lung and kidney. Determination of ACE serum activity is an established tool for diagnosis and therapy control of pulmonary and extrapulmonary disease. The effect of cigarette smoking on ACE serum activity in healthy subjects is subject of controversial discussion. Aim of this study was to evaluate the effect of chronic cigarette consumption on ACE serum activity in healthy subjects. Angiotensin I will be converted in Angiotensin II, a highly vasoconstriktor. In addition ACE inactivates bradykinin. Increased ACE activity values occur in the serum of patients with active sarcoidosis, smokers, in premature babies with respiratory distress syndrome, and in adults with tuberculosis, Gaucher-Syndrom and a number of other medical conditions of the lung. Material and methods: In this study the significance of angiotensin converting enzyme (ACE) was tested in 250 healthy smokers and non smokers aged between 17 and 65 years. Individual smoking habits were ruled out by a questionnaire. The concentration of ACE was founded by measurements on Hitachi 917 Analyzer. Additionally ASAT, ALAT and GT were determined by conventional methods. The following independent variables were studied: investigative material, antikoagulantien influence of drugs and temperature. Result: ACE concentrations were increased identically in smokers and sarcoidosis patients. By a specificity of 95% and sensitivities between 72% and 90% are detected in each of the groups. ACE serum activities were within their normal limits (8-58U/L) in smokers and non smokers. No sex-related differences of ACE activity were observed in non smokers. The values of ACE serum activity were significantly (Kruskal: p<0,001) higher in smokers than in non smokers. Corresponding to differences of smoking habits slight but not significant differences of ACE were observed between male and female smokers. In smokers a strong correlation between individual smoking habits was similar in male and female smokers. Values of all additionally determined laboratory parameters were also within their normal limits. No significant differences were observed for ASAT, ALAT and g GT between smokers and non smokers of both sexes. ACE activity should be measured on the day of blood collection. The influence of temperature on the stability of the material is considerable; the room temperature shows a decrease in concentration. By storage at -20°C and below there is a visible increase in concentration. Conclusion: It is shown that there is an increase of ACE activity as a function of cigarette consummation. Non specific metabolic factors others than smoking can be excluded by normal values of ASAT, ALAT and g GT. The data suggest, that individual smoking habits should be considered for the interpretation of ACE serum activity.
In der folgenden Arbeit werden Eigenschaften von Verzweigungsprozessen in zufälliger Umgebung (engl. branching processes in random environment, kurz BPREs) untersucht. Das Modell geht auf Smith (1969) und Athreya (1971) zurück. Ein BPRE ist ein einfaches mathematisches Modell für die Entwicklung einer Population von apomiktischen (d.h. sich ungeschlechtlich fortpflanzenden) Individuen in diskreter Zeit, wobei die Umgebungsbedingungen einen Einfluß auf den Fortpflanzungserfolg der Individuen haben. Dabei wird angenommen, dass die Umgebungsbedingungen in den einzelnen Generationen zufällig sind, und zwar unabhängig und identisch verteilt von Generation zu Generation. Man denke z.B. an eine Population von Pflanzen mit einem einjährigen Zyklus, die in jedem Jahr anderen Witterungsbedingungen ausgesetzt sind, wobei angenommen wird, dass diese sich unabhängig und identisch verteilt ändern. In Kapitel 1 wird eines der wichtigsten Hilfsmittel zur Beschreibung von BPREs, die sogenannte zugehörige Irrfahrt, eingeführt und die Klassifizierung von BPREs beschrieben. In Kapitel 2 werden bekannte Resultate, insbesondere zu kritischen, schwach subkritischen und stark subkritischen Verzweigungsprozessen, wiederholt. In Kapitel 3 wird der sogenannte intermediär subkritische Fall behandelt. Mithilfe von funktionalen Grenzwertsätzen für bedingte Irrfahrten wird die genaue Asymptotik der Überlebenswahrscheinlichkeit des Prozesses, die bereits in Vatutin (2004) bewiesen wurde, unter etwas allgemeineren Voraussetzungen gezeigt. Anschließend wird untersucht, wie häufig der Prozess, bedingt auf Überleben, nur noch aus einem Individuum besteht. Im letzten Teil des Kapitels wird ein funktionaler Grenzwertsatz für die zugehörige Irrfahrt, bedingt aufs Überleben des Prozesses, gezeigt. Diese konvergiert, richtig skaliert, gegen einen Levy-Prozess, der darauf bedingt ist, sein Minimum am Ende anzunehmen. In Kapitel 4 werden große Abweichungen von BPREs untersucht. Die Ratenfunktion des BPRE wird sowohl für den Fall mindestens geometrisch schnell abfallender Tails, als auch für den Fall von Nachkommenverteilungen mit schweren Tails bestimmt. Wie sich herausstellt, hängt die Ratenfunktion von der Ratenfunktion der zugehörigen Irrfahrt, der exponentiellen Abfallrate der Überlebenswahrscheinlichkeit sowie, bei Nachkommenverteilungen mit schweren Tails, auch von den Tails derselben ab. In der Ratenfunktion spiegeln sich die wahrscheinlichsten Wege, um Ereignisse der großen Abweichungen zu realisieren, wider, was in Kapitel 4.3 beschrieben wird. In Kapitel 4.4 wird im speziellen Fall von Nachkommenverteilungen mit gebrochen-linearer Erzeugendenfunktion die Ratenfunktion für Ereignisse bestimmt, bei denen ein superkritischer BPRE überlebt, aber klein im Vergleich zum Erwartungswert bleibt. In Kapitel 4.5 werden die großen Abweichungen, bedingt auf die Umgebung untersucht (engl. quenched). In diesem Fall können unwahrscheinliche Ereignisse nur über den Verzweigungsmechanismus und nicht mehr über eine außergewöhnliche Umgebung realisiert werden. Zum Abschluss der Dissertation werden Verzweigungsprozesse in zufälliger Umgebung, bedingt auf Überle-ben, simuliert. Dazu wird eine Konstruktion nach Geiger (1999) angewendet. Diese erlaubt es, Galton-Watson Bäume in variierender Umgebung, bedingt auf Überleben, entlang einer Ahnenlinie zu konstruieren. Der Fall geometrischer Nachkommenverteilungen, auf den wir uns in Kapitel 5 beschränken, erlaubt die explizite Berechnung der benötigten Verteilungen. Als Anwendung des Grenzwertsatzes aus Kapitel 3.1 können nun intermediär subkritische Verzweigungsprozesse, bedingt auf Überleben, wie folgt simuliert werden: Zunächst wird die Umgebung zufällig bestimmt, und zwar als Irrfahrt, bedingt darauf ihr Minimum am Ende anzunehmen. Anschließend wird, der Geiger-Konstruktion folgend, ein Verzweigungsprozess in dieser Umgebung, bedingt auf Überleben, simuliert. Zum Abschluss wird in einem kurzen Ausblick auf aktuelle Forschung verwiesen. Im Anhang befinden sich einige technische Resultate.
Der Neocortex der Säugetiere weist charakteristische Schichtungen auf, und jede dieser Schichten enthält verschiedene Typen von Neuronen, die in stereotypen Mustern angeordnet sind. Die Ausbildung dieser geschichteten Struktur ist nur dann möglich, wenn korrekte Migration von Neuronen von proliferativen Zonen zu deren Endpositionen stattfindet. Die exakte Migration und Schichtung wird von Mutationen beeinflusst, die entweder die migratorische Fähigkeit der Neuronen beeinträchtigen, oder deren Fähigkeit, die Position zu erkennen, an der sie die Wanderung beenden sollten (Gupta et al., 2002, Rice et al., 2001, Walsh et al., 2000). In den letzten Jahren wurde das extrazelluläre Protein Reelin als wichtiger Faktor bekannt, der sich auf mehrere Schritte der neuronalen Migration und Schichtung in der Großhirnrinde auswirkt (zusammengefasst in (Tissir et al., 2003). Das sekretierte Glykoprotein Reelin kontrolliert die Migration der Neuronen durch die Bindung an zwei Lipoproteinrezeptoren, den Very-low-density lipoprotein Rezeptor (VLDLR) und den Apolipoprotein E Rezeptor 2 (ApoER2) (D'Arcangelo et al., 1999). Die Bindung von Reelin an ApoER2 und VLDLR ruft die Phosphorylierung von Disabled-1 (Dab1) (D'Arcangelo et al., 1999, Howell et al., 1997), einem Adapterprotein, das an die intrazelluläre Domäne der Rezeptoren bindet, hervor, indem sie Kinasen der Src-Familie (SFKs) aktiviert (Arnaud et al., 2003, Bock et al., 2003a). Außer der Bedeutung des Reelin-Signalwegs für die korrekte Entwicklung des Nervensystems und dem Wissen, dass die Unterbrechung dieses Signalwegs zu verschiedenen neurologischen Krankheiten wie Epilepsie, Schizophrenie und der Alzheimerkrankheit führt (Costa et al., 2002, Botella-Lopez et al., 2006, Herz et al., 2006), ist die molekulare Grundlage der Aktivierung dieses Signalwegs an der Zellmembran noch kaum charakterisiert. Da VLDLR und ApoER2 keine intrinsische Kinaseaktivität besitzen, wurde die Existenz eines Korezeptors für mindestens eine Dekade vermutet, und die genaue Natur dieses Korezeptors ist unbekannt. EphrinBs, Transmembranliganden für Eph-Rezeptoren, besitzen die Fähigkeit zur Signalgebung, die für synaptische Plastizität und Angiogenese durch Sprossung erforderlich ist, indem sie die Aktivität anderer Transmembranrezeptoren wie AMPAR beziehungsweise VEGFR2 beeinflussen (Sawamiphak et al., 2010b, Segura et al., 2007, Essmann et al., 2008). Darüber hinaus führt die Stimulation von cortikalen Neuronen in Kultur mit löslichen EphB-Rezeptoren zur Rekrutierung und Aktivierung von SFKs in Membranpatches, in denen sich ephrinB-Liganden befinden (Palmer et al., 2002). Deshalb nehmen wir an, dass ephrinB in vivo funktionell mit dem Reelin-Signalweg verbunden sein könnte. Der Fokus dieser Arbeit liegt darin, zu zeigen, dass das neuronale Wegweisermolekül ephrinB einen entscheidenden Korezeptor für die Reelin-Signalgebung während der Entwicklung geschichteter Strukturen im Gehirn darstellt. Um zu erforschen, ob ephrinB und die Reelin-Signalgebung in vivo genetisch interagieren, wurden zuerst Mäuse mit Compound-Mutationen hergestellt, die eine Nullmutation im Gen für ephrinB3 tragen und heterozygot für Reelin sind (rl/+; b3-/-). Reeler ist eine autosomal rezessive Mutation der Maus, die, wenn sie heterozygot auftritt, keinen offenkundigen Phänotyp aufweist (Caviness et al., 1972, Caviness et al., 1978). Wir zeigen, dass ephrinBs genetisch mit Reelin interagieren, da Mäuse mit Compound-Mutationen (rl/+; b3 -/-) und ephrinB1-, B2- und B3-Dreifach-Knockouts die verschiedenen Defekte in der Entwicklung phänokopieren, die im Neocortex, Hippocampus und Cerebellum der reeler-Mäuse beobachtet wurden. Eines der Kennzeichen des reeler-Phänotyps ist die gestörte Schichtung der Großhirnrinde mit einer Marginalzone (MZ), die eine äußerst große Zahl an Zellen enthält (Caviness, 1982). Sowohl die Compound-Mäuse als auch die Triple-ephrinB1B2B3-knockouts zeigten eine Zunahme der Zellzahl in der MZ. Um die cortikalen Defekte detailliert zu charakterisieren, wurde die Verteilung von postmitotischen migrierenden Neuronen im Cortex von rl/+; b3-/- Compound-Mäusen mit Hilfe von unterschiedlichen schichtenspezifischen Markern für früh (Tbr1) (Hevner et al., 2001) und spät entstandene (SatB2 and Brn1) (Britanova et al., 2008, McEvilly et al., 2002) Neuronen, analysiert . Unsere Untersuchungen ließen die veränderte cortikale Schichtung in den rl/+; b3-/- Compound-Mäusen erkennen. So befanden sich früh entstandene Neuronen in den oberen cortikalen Schichten und spät entstandene in den unteren cortikalen Schichten, was für eine outside-in-Schichtung spricht, wie man sie von reeler kennt. Interessanterweise ist eine der frühesten strukturellen Abnormalitäten, die man im reeler-Cortex erkennen kann, die Unfähigkeit, die Preplate, die reich an extrazellulärer Matrix ist, in die Marginalzone und die Subplate aufzuspalten (Sheppard et al., 1997). Zum Zeitpunkt E17.5 zeigten rl/+; b3-/- Compound-Mäuse eine beachtliche Anhäufung von Chondroitin-Sulfat-Proteoglykan (CSPG), einer Komponente der extrazellulären Matrix, im gesamten Neocortex mit einer ungeteilten Schicht an der Oberfläche, welche übermäßig viel CSPG enthielt und somit die abnorme Teilung der Preplate der reeler-Maus nachahmte. Um zu bestätigen, dass die beobachteten Effekte auf die Schichtung des Cortex der rl/+; b3-/- Compound-Mäuse als Folge der Beeinträchtigung der neuronalen Migration auftritt, wurden zusätzlich BrdU-Puls-Experimente durchgeführt. BrdU wird in sich teilende Vorläuferzellen eingebaut und spiegelt deshalb das migratorische Verhalten von neu entstandenen Neuronen zum Zeitpunkt der Injektion wieder. Schwangeren Weibchen wurde BrdU zu den Zeitpunkten E12.5, E15.5 und E17.5 injiziert und die Gehirne wurden am postnatalen Tag 20 ausgewertet. Die Verteilung der mit BrdU gekennzeichneten Neuronen zu verschiedenen Zeitpunkten der Entwicklung in der Großhirnrinde bestätigte unsere Untersuchungen, die mit Hilfe der schichtspezifischen Marker durchgeführt worden waren. Deshalb deuten unsere Ergebnisse an, dass die beobachteten Defekte in der Schichtung des Cortex tatsächlich eine Folge von beeinträchtigter neuronaler Migration sind. Es wurde beobachtet, dass auch geschichtete Strukturen im Hippocampus in den rl/+; b3-/- Compound-Mäusen verändert sind, was für einen Crosstalk zwischen ephrinB3 und Reelin auch während der Entwicklung des Hippocampus spricht. Die CA1-Region des Hippocampus zeigte eine lockere Verbindung der pyramidalen Zellschichten, welche zu einer signifikanten Erhöhung der Dicke dieser Region und zu einer Einwanderung von Pyramidalzellen in das Stratum oriens führte. Darüber hinaus haben die Anomalien in den dendritischen Verzweigungen von Pyramidalneuronen der CA1-Region, die in Richtung der Reelin-produzierenden Cajal-Retzius-Zellen im stratum locunosum moleculare projizieren, in den rl/+; b3-/- Compound-Mäusen eine auffallende Ähnlichkeit mit denen, die in reeler-Mutanten beobachtet wurden. Reelin fungiert auch als Differenzierungsfaktor und Positionierungssignal für radiale Gliazellen, die positiv für glial fibrillary acidic protein (GFAP) sind und ein Gerüst für die korrekte Migration von neu entstandenen Granularzellen, die auf das Netzwerk der Granularzellen im Gyrus dentatus zuwandern (Forster et al., 2002) bilden. In rl/+; b3-/- Compound-Mäusen ist dieses Gerüst aus radialen Gliazellen schwerwiegend beeinträchtigt, was ebenfalls zu einer lockeren Organisation der Granularzellen im Gyrus dentatus führt. Die Ataxie in reeler-Mäusen ist das Ergebnis einer schwerwiegenden Fehlorganisation im Cerebellum dieser Mutanten (Tissir et al., 2003). Interessanterweise wurden nur milde Defekte in den Granularzellen, die sich in der internen Granularschicht des Cerebellums von rl/+; b3-/- Compound-Mäusen angesammelt haben, und keine Defekte in der Migration und der Verzweigung der Purkinjezellschicht, festgestellt. Stattdessen ist ephrinB2 in den Purkinjezellen des Cerebellums stark exprimiert (Liebl et al., 2003) und obwohl keine bedeutenden Defekte der Migration dieser Zellen festgestellt wurden, zeigte die Untersuchung der Verzweigung der Purkinjezellen in b2-/- Mäusen eindeutige Defekte, die bereits in einfachen ephrinB2-Mutanten auftraten. Bedeutend ist, dass die Defekte in der Verzweigung bei rl/+; b2-/- Compound-Mäusen signifikant verstärkt waren, was darauf hindeutet, dass der Reelin-Signalweg im Cerebellum spezifisch ephrinB2 benötigt. Um Einblicke in den Mechanismus zu erhalten, wie ephrinB-Liganden den Crosstalk mit Reelin durchführen, um die korrekte Positionierung von Neuronen in den geschichteten Strukturen des Gehirns zu kontrollieren, wurde als nächstes die biochemische Interaktion dieser beiden Signalwege untersucht. In einer gerichteten proteomischen Untersuchung mit Hilfe der Tandem affinity purification-mass spectometry-Methode (Angrand et al., 2006) von Proteinen aus eine Neuroblastom-Zelllinie, die ephrinB binden, wurde Reelin als ein Protein, das mutmaßlich mit ephrinB interagiert, identifiziert. Zunächst bestätigten wir die Fähigkeit von Reelin, mit ephrinBs zu assoziieren mit Ko-Immunpräzipitation beider endogener Proteine aus Gehirnlysaten. Das extrazelluläre Protein Reelin zeigte eine starke Bindung an die extrazelluläre Domäne von ephrinB3 und auch von ephrinB2, was andeutet, dass beide ephrin-Liganden die Funktionen von Reelin in vivo beeinflussen könnten. Die Stimulierung von cortikalen Neuronen mit Reelin führt zu einer effektiven Tyrosin-Phosphorylierung des Adapters Dab1. Da die Stimulation von cortikalen Neuronen mit einer löslichen, vorgeclusterten Form von EphB-Rezeptoren zur Rekrutierung und Aktivierung von Src-Kinasen in ephrinB-Clustern führt (Palmer et al., 2002), nehmen wir an, dass ephrinBs Src-Kinasen in VLDLR- und ApoER2-Rezeptor-Clustern rekrutieren und aktivieren könnten. Aktivierte Src-Kinasen phosphorylieren dann wiederum das Adapterprotein Dab1, das an VLDLR und ApoER2 gebunden ist und initiieren die weitere Signalgebung. In Übereinstimmung damit ko-immunpräzipitiert phosphoryliertes Dab1 zum Zeitpunkt E16.5 mit ephrinBs, während die neuronale Migration und die Schichtung des Cortex stattfindet. Darüber hinaus konnten wir beobachten, dass ephrinB3, das durch EphB3-Fc aktiviert wurde, sowohl Reelin, als auch ApoER2 und VLDLR in ephrinB3-Membranpatches in cortikalen Neuronen anhäuft. Die Aktivierung von ephrinB-Liganden durch Stimulation von cortikalen Neuronen mit EphB3-Fc führt zur Rekrutierung und Phosphorylierung von Dab1 in ephrinB-Clustern. Als nächstes befassten wir uns mit der Notwendigkeit von der durch ephrinB vermittelten Rekrutierung und Aktivierung von Src-Kinasen für den Reelin-Signalweg, indem wir Loss-of-function-Studien sowohl in cortikalen Neuronen in Kultur als auch in vivo in Mäusen durchführten. Cortikale Neuronen, die aus ephrinB3- und ephrinB2-Knockouts isoliert wurden, zeigten eine signifikante Beeinträchtigung der durch Reelin vermittelten Phosphorylierung von Dab1 und die Phosphorylierungslevels von Dab1 in ephrinB3 Mausmutanten waren stark verringert, was andeutet, dass ephrinBs Korezeptoren, die notwendig für einwandfreie Signalgebung durch Reelin sind, darstellen. Um die Bedeutung von ephrinBs für die Kontrolle der Funktion von Reelin zu untersuchen, arrangierten wir eine Reihe von Rescue-Experimenten sowohl in Neuronenkulturen als auch während der neuronalen Migration im Cortex in vivo. Aus reeler-Mäusen isolierte cortikale Neuronen zeigten die erwartet verringerte Phosphorylierung von Dab1, die rückgängig gemacht werden konnte, indem die Neuronen mit exogenem Reelin stimuliert wurden. Noch bedeutender ist die Tatsache, dass die Phosphorylierung von Dab1 durch die alleinige Aktivierung von ephrinBs mit EphB wiederhergestellt werden konnte, was die Bedeutung der ephrinBs als Korezeptoren für die Aktivierung des Signalwegs über die Rezeptoren für Reelin, VLDLR und ApoER2, wiederspiegelt. Um die Rolle von ephrinBs als Korezeptoren für den Reelin-Signalweg während der neuronalen Migration in der Großhirnrinde zu unterstreichen, setzten wir ähnliche Rescue-Experimente in organotypischen Schnittkulturen an. In den Schnitten von reeler-Mäusen und Wildtyp-Wurfgeschwistern wurde die Migration von Neuronen, die durch Fc als Kontrolle und EphB3-Fc stimuliert wurde, nach drei Tagen in Kultur untersucht. Die reeler-Schnitte zeigten den typischen reeler-Phänotyp in der Großhirnrinde. In Übereinstimmung mit der Annahme einer wirksamen Regulation des Reelin-Signalwegs war die Aktivierung von eprhinB mit EphB-Rezeptoren in der Lage, die migratorischen Defekte in reeler-Schnitten aufzuheben. Zusammengefasst identifizieren unsere Ergebnisse ephrinBs als Korezeptoren für den Reelin-Signalweg, die für die Funktion von Reelin in der neuronalen Migration während der Entwicklung der geschichteten Strukturen der Großhirnrinde, dem Hippocampus und dem Cerebellum notwendig sind. Unsere genetischen Analysen von ephrinB-Mutanten zeigen gemeinsam mit starken biochemischen Untersuchungen, dass ephrinBs in vivo für zahlreiche Aktivitäten von Reelin erforderlich sind.
Hintergrund und Problemstellung: Viele vermeidbare Medikamentennebenwirkungen bei älteren Patienten haben ihre Ursache in der fehlenden Dosisanpassung bei Niereninsuffizienz. Beim Patienten über 65 Jahre liegen die Serumkreatininwerte oft noch im Normbereich, während die tatsächliche Nierenfunktion schon deutlich beeinträchtigt ist. Eine genauere Beurteilung der Nierenfunktion ist mit der Berechnung der glomerulären Filtrationsrate möglich. In der vorliegenden Untersuchung wurde in einer Praxisgemeinschaft einer hausärztlich tätigen Internistin und einer Fachärztin für Allgemeinmedizin in Frankfurt retrospektiv exploriert, ob niereninsuffiziente Patienten als solche erkannt wurden und wenn ja, ob sie dosisadaptiert mit Medikamenten versorgt wurden, bzw. in wie vielen Fällen sie fehlerhafte Verordnungen erhielten. Methode: Eine Zielpopulation von 100 Patienten mit moderater bis schwerer Nierenfunktionseinschränkung (Kreatinin-Clearance von 60 oder kleiner) wurde retrospektiv hinsichtlich der verordneten Medikation untersucht. Dabei wurde die glomeruläre Filtrationsrate mittels Cockroft-Gault-Formel errechnet. Bei nierensensiblen Substanzen wurde die in der Fachinformation empfohlene Dosis mit der tatsächlich verordneten Dosis verglichen. Ergebnisse: Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen, dass von 232 auswertbaren Patienten 102 eine errechnete Kreatinin-Clearance von weniger als 60 ml/min aufwiesen, obwohl bei 48 Patienten der Serumkreatininlevel noch im Normbereich lag. Eine Dosisanpassung wegen Niereninsuffizienz war bei 261 von 613 Verordnungen erforderlich und wurde in 189 Fällen wie empfohlen umgesetzt. In 72 Fällen (27%) wurde sie nicht korrekt durchgeführt. Hier wurde die Dosis 32 mal nicht angepasst, 40 mal wurde trotz Kontraindikation verordnet. Das Risiko einer Fehlverordnung war signifikant assoziiert mit dem Vorliegen einer schweren Nierenfunktionsstörung (GFR < 30ml/min). Mit dem Vorliegen eines normalen Serumkreatininwerts waren keine signifikanten Assoziationen nachweisbar. Die Substanzen Metformin, Ramipril, Enalapril, HCT, Spironolacton und Simvastatin machten den Hauptanteil der Fehlverordnungen im Bereich der Dauermedikation aus. Bei den temporären Verordnungen waren im Schwerpunkt Antibiotika (Cefuroxim, Cefpodoxim, Levofloxacin) und Antiphlogistika (Diclofenac, Ibuprofen) betroffen. Schlussfolgerung: In einer durchschnittlichen Hausarztpraxis kommen in signifikanten Maße Fehlverordnungen vor. Die Gründe hierfür sind vielfältig. Insbesondere das Verschreibungsverhalten von Hausärzten hat eine zentrale Bedeutung für die Patientensicherheit bei Medikamentenverordnung und sollte unbedingt Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.
Mesenchymale Stromazellen stellen derzeit eine der vielversprechensten Zellpopulationen dar und werden in Hinblick auf ihre zahlreichen Fähigkeiten und Eigenschaften intensiv erforscht. In dieser Arbeit konzentrierten wir uns auf das für die Behandlung von immunvermittelten Erkrankungen wertvolle immunmodulatorische Potential der mesenchymalen Stromazellen. Dieses ist für standardmäßigplastikadhärent isolierte MSCs vielfach belegt. Der große Nachteil dieser Isolierungsmethode jedoch, ist die Gewinnung nur sehr heterogener Zellpopulationen, was das klonogene, proliferative und möglicherweise auch immunsuppressive Potential dieser Zellen betrifft. Deshalb schien es uns sinnvoll, die Eigenschaften mesenchymaler Stromazellen zu untersuchen, welche nach einer alternativen Selektionsprozedur, die sich des Oberflächenmarkers CD271 (LNGFR) bedient, und homogenere Zellpopulationen von MSCs hervorbringt. Den auf diese Art isolierten und angereicherten MSCs wird in der Literatur bereits ein erhöhtes klonogenes und proliferatives Potential bescheinigt, welches wir im Rahmen dieser Arbeit überprüften und schließlich auch bestätigen konnten. Im Zentrum dieser Dissertation standen jedoch Untersuchungen zum immunsuppressiven Potential dieser alternativselektierten MSCs, welches bis Dato noch nicht erforscht war. Zur Beantwortung der Frage, ob CD271-selektierte MSCs ein vergleichbares oder möglicherweise durch ihre Homogenität erreichtes, verbessertes immunsuppressives Potential auf Immunzellen entfalten, kultivierten wir diese Zellen mit auf unterschiedliche Weise stimulierten PBMNCs und evaluierten darunter deren Proliferationspotential. Wir fanden heraus, dass CD271+-MSCs in bestimmten Konzentrationen ein im Vergleich mit PA-MSCs erhöhtes immunsuppressives Potential auf allogen stimulierte PBMNCs entfalten und dabei in keinem unserer Versuche den standardmäßig selektierten MSCs unterlegen waren. Bei einem Anteil von 50% MSCs an der Zellsuspension vermögen CD271+- MSCs die Proliferation in stärkerem Maße zu inhibieren, als es PA-MSCs tun. Werden MSCs und PBMNCs in gleichem Verhältnis kultiviert, unterscheidet sich das Maß der Inhibition durch die beiden Zelltypen nicht signifikant. Betrug der Anteil der eingesetzten MSCs an der Zellsuspension nur geringe 1%, stimulierten CD271+-MSCs nicht die Proliferation der Lymphozyten, während es unter dem Einfluss von PA-MSCs zu signifikanter Proliferationssteigerung kam. Insgesamt stellte sich das immunmodulatorische Potential der CD271+-MSCs, genau wie das der PA-MSCs als dosisabhängig dar. Je höher der MSC-Anteil an der Zellsuspension, desto höher war das Suppressionspotential auf die Lymphozytenproliferation. Vergleichbare Ergebnisse lieferten Versuche, in denen MSCs zusammen mit IL-2 stimulierten allogenen PBMNCs eingesetzt wurden, was beweist, dass CD271+-MSCs auch maximal stimulierte PBMNCs signifikant proliferativ hemmen können. In Versuchen mit mitogen stimulierten PBMNCs konnten wir nachweisen, dass CD271+-MSCs auch die Proliferation von zuvor mit PHA, ConA und IL-2 stimulierten PBMNCs inhibieren. Im Gegensatz zu PA-MSCs vermochten sie aber nicht, die proliferationsfördernde Wirkung des Staphylokokken-Enterotoxin-B (SEB) aufzuheben. Um den Mechanismen der immunsuppressiven Fähigkeit mesenchymaler Stromazellen näher zu kommen, untersuchten wir drei erst kürzlich beschriebene mögliche Mediatoren der MSCvermittelten Immunmodulation. Wir analysierten die Wirkung mesenchymaler Stromazellen auf regulatorische T-Zellen, auf die Produktion von PGE2 und NO. Unter der Präsenz der MSCs kam es in der Population der allogen-stimulierten PBMNCs zu keiner signifikanten Zu- oder Abnahme an regulatorischen CD4+/CD25+-Zellen. Innerhalb der Population der regulatorischen T-Zellen kam es jedoch unter dem Einfluss der CD271+-MSCs zu einer signifikanten Zunahme der primitiveren Subpopulation CD4+CD25+CD45RA+ T-regulatorischer Zellen, welcher in der Literatur eine robuste suppressive Aktivität nach in vitro-Expansion bescheinigt wird. NO konnten wir durch unsere Untersuchungen als möglichen Mediator der Immunmodulation ausschließen. Es ergaben sich keine signifikanten Unterschiede für den NO-Gehalt in PBMNC-Kulturen, die in Anwesenheit oder Abwesenheit von MSCs inkubiert worden waren. Auch NO-Blockierungsversuche erbrachten keinen Effekt auf die Zellproliferation. Jedoch fanden wir eine signifikant positive Korrelation zwischen der PGE2-Konzentration und dem inhibitorischen Effekt von CD271+-MSCs auf die Proliferation der PBMNCs. Dass das PGE2 in unseren Experimenten das wichtigste Vermittlermolekül des immunsuppressiven Effekts von CD271+-MSCs darstellt, konnten wir zusätzlich in Versuchen mit dem PGE2-Syntheseinhibitor Indomethacin beweisen. In Zusammenschau mit Daten anderer Arbeitsgruppen ist insgesamt die Schlussfolgerung zulässig, dass es sich bei der Immunmodulation durch MSCs um einen komplexen Mechanismus handelt, der sowohl lösliche Faktoren, als auch Immunzellen einschließt und welcher weiterer Erforschung bedarf. Anhand unserer Untersuchungen konnten wir zeigen, dass CD271-selektierte MSCs neben der verbessert klonogenen und proliferativen Aktivität eine teilweise erhöhte und mindestens ebenbürtige immunsuppressive Fähigkeit, verglichen mit den nach Standard angereicherten MSCs, aufweisen. Letztlich befürworten und bestärken unsere Ergebnisse einen Einsatz CD271-angereicherter mesenchymaler Stromazellen zur Behandlung immunvermittelter Erkrankungen und versprechen eine vielseitige Verwendung dieser Zellen in Zukunft. Die vorliegende Arbeit leistet einen wichtigen Beitrag zur notwendigen Standardisierung und Weiterentwicklung der Gewinnung und Anreicherung funktionsfähiger mesenchymaler Stromazellen und zum sicheren und raschen Einsatz dieser Zellen im klinischen Gebrauch. Weil es sich bei den vorgestellten Ergebnissen allerdings ausschließlich um ex vivo Experimente handelt, sind weitergehende Untersuchungen im Tierexperiment notwendig.
In der vorliegenden Arbeit konnten wir in den einzelnen Lipidfraktionen die gleichen Unterschiede zeigen, die bereits in anderen Untersuchungen aufgezeigt worden waren. Vor allem in den Phospholipiden, im Plasma und in den Erythrozyten ließen sich für die cis-Linolensäure (C18:2ω6c), die Arachidonsäure (C20:4ω6) und die Docosahexaensäure (C22:6ω3) Erniedrigungen beschreiben. Auch in den Cholesterylestern und den Triglyceriden, die als direkte Nahrungsfette gewertet werden können, zeigt sich diese Verteilung, so dass von einer Unterversorgung mit diesen Fettsäuren ausgegangen werden muß. Die Ergebnisse zeigen, dass bereits wenige Fettsäuren zur Beurteilung der Fettsäure-Situation bei Cystische Fibrose-Patienten ausreichen, so dass in Folgeuntersuchungen auf die Auswertung bei Cystische Fibrose-Patienten aller Fettsäuren verzichtet werden kann. Die Gruppen sollten zur Stabilisierung und besseren Reproduzierbarkeit der Werte vergrößert werden. In Folgeuntersuchungen sollte die Ernährung und der Ernährungstatus dokumentiert werde. Die Patienten in unserer Gruppe hatten alle die gleiche Mutation (ΔF 508) und waren adäquat ernährt. Im Einzelnen lässt sich jedoch nicht mehr sagen in welcher Form und Menge Fett zugeführt worden waren. Die Verteilungsmuster in den Triglyceriden und den Cholesterylestern lassen jedoch eindeutig, wie schon in der Literatur beschrieben, auf einen essentiellen Fettsäuremangel schließen. Keiner der Patienten erhielt eine zusätzliche Substitution mit ultralangkettigen mehrfach ungesättigten Fettsäuren der ω3/ω6- Familien. Es lässt sich nur mit Hilfe der Literatur diskutieren welche Ursachen bei unseren Patienten für den essentiellen Fettsäuremangel verantwortlich sind, da unsere Arbeit lediglich eine Erhebung über den Ist-Zustand darstellt. Für die Klärung der Malabsorption müssten Untersuchungen angeschlossen werden, die mit einer Substitution von ultralangkettigen mehrfach ungesättigten Fettsäuren einhergehen. Das Membranverhalten und Rezeptorverhalten kann über die Messung der Phospholipide konkretisiert werden. Im Bezug auf die inflammatorische Antwort könnten die Leukotriene und andere Mediatoren der inflammatorischen Antwort parallel gemessen werden. Als weiteres Ergebnis zeigten sich bei den von uns untersuchten Cystische Fibrose-Patienten im Vergleich zur Kontrollgruppe keine oder nur in Spuren vorhandene trans-Fettsäuren.
LmrA is a member of the ATP Binding Cassette (ABC) transporter family of membrane proteins and a structural and functional homologue of P-glycoprotein1, 2. ABC-transporters share a common architecture of two transmembrane domains and two nucleotide binding domains. The NBDs are highly conserved in this transporter family whereas the TMDs are highly diverse3. The TMDs recognize the substrate and the NBDs bind and hydrolyze ATP and thus contribute the energy for substrate translocation. ABC transporters as a protein family transport a high number of substrates including peptides, nutrients, ions, bile acids, lipids and other lipophilic compounds. LmrA is a multidrug transporter that recognizes a number of hydrophobic substrates including fluorescent dyes and antibiotics1, 4-6. LmrA is a native protein of the gram-positive bacterium Lactococcus lactis. In this thesis, L. lactis was used as a homologous expression host for the preparation of LmrA for a variety of experiments. Wildtype LmrA as well as a number of cysteine mutants were successfully expressed in L. lactis, purified and subsequently characterized by a variety of biochemical assays (Chapter 4). LmrA can be expressed to very high amounts in L. lactis. The purification and reconstitution were optimized for the requirements of solid-state NMR experiments in this thesis. For the first time, an ABC transporter has been reconstituted in synthetic lipids to a ratio of up to 1:150 (mol/mol). LmrA was shown to be active under magic angle spinning conditions with these reconstitution ratios. By taking advantage of the slower ATP hydrolysis by LmrA ΔK388 (lysine deletion in the Walker A motif), a real-time 31P solid-state NMR ATPase assay was established (Chapter 5). This assay allowed, for the first time, the investigation of all phosphor nuclei during the ATP hydrolysis cycle of a membrane protein simultaneously and in real time7. This assay has been successfully adapted to investigate both ATP hydrolysis and substrate phosphorylation of diacylglycerol kinase (together with S. Wollschlag) and ATP hydrolysis at high temperatures of the thermophilic ABC transporter ABC1 from Thermos thermophilus (together with A. Zutz). In the course of this thesis, the gene for LmrA has been cloned into expression vectors suitable for Escherichia coli and the heterologous expression of LmrA was established (Chapter 4). The functionality of the heterologously expressed protein has been investigated and compared to L. lactis LmrA. In these experiments, LmrA was shown to yield a distinct multidrug resistance phenotype in its E. coli host and to show secondary active multidrug transport in the absence of ATP and presence of a proton gradient [Hellmich et al, in prep] (Chapter 4). Previously, it had been shown that LmrA acts as a seconadary active transporter when the NBDs are truncated8. The overexpression in minimal and defined medium and the purification of LmrA from E. coli have been optimized. Isotope labeling for ssNMR has been established and the first multinuclear ssNMR experiments have been carried out on a functional ABC transporter (Chapter 8). ABC transporters couple two cycles: upon ATP binding, the NBDs dimerize, hydrolyze the ATP, subsequently release Pi and ADP and finally dissociate. During this cycle, conformational changes are relayed to the TMDs which utilize the energy from ATP binding and/or hydrolysis to translocate the respective substrate. The prehydrolysis state can be trapped by beryllium fluoride, whereas the post-hydrolysis state of this cycle can be trapped by vanadate9-12. Trapping protocols for these reagents were successfully established for LmrA in this thesis (Chapter 4). This allowed for the investigation of different catalytic states by both ssNMR and EPR. A general 19F labeling protocol for membrane proteins has been established in the course of this thesis and successfully applied to proteorhodopsin (together with N. Pfleger)13 and LmrA (chapter 6). Single cysteine mutants of LmrA that line out the dimer interface have been labeled with a fluorine label for ssNMR. In the apo state, the 19F labeling indicates highly flexible transmembrane domains, a finding that is supported by 13C ssNMR and EPR measurements. The addition of drugs has a different effect on different positions within the LmrA dimer, therefore indicating that different drugs are recognized at a different position within the protein. For P-glycoprotein and LmrA it has been previously shown by biochemical methods that different drug binding sites co-exist. For a 19F label attached at position 314 (LmrA E314C), the spectra showed two distinct peaks with similar populations. This could hint towards a structural asymmetry within the LmrA dimer that might also be reflected in the alternating ATP hydrolysis at the NBDs. E314 has been specifically implicated with drug transport. Thus, structural asymmetry at this position might be functionally relevant for guiding a substrate through the transporter. Structural asymmetry within a homodimeric ABC transporter has also been shown for BtuCD, the E. coli vitamin B12 importer14. In addition, the conserved glutamates in EmrE, a small multidrug resistance protein, were shown to be asymmetric in the drug bound state15. Both, uniformly 13C/15N labeled as well as selectively amino acid type labeled LmrA has been investigated in different conformational states. Interestingly, significant dynamic changes in the b-sheet regions of LmrA (confined to the NBDs) were observed in the pre-hydrolysis (beryllium fluoride) and transition state (vanadate trapped) state. These were interpreted as the transition from a domain in fast conformational exchange in the apo state to one of intermediate exchange in the nucleotide bound state. A significant change in NBD mobility upon nucleotide binding was previously also shown with 2H ssNMR on LmrA16. By EPR it was shown that LmrA in both the vanadate and BeFx trapped states displays a significantly higher rigidity and therefore defined distances, whereas the apo state resembled a “floppy” protein with no preferred distance distribution. This concurs with data obtained from 19F ssNMR with fluorine labeled single-cysteine mutants. Here, in agreement with the EPR data, a higher label (and possibly) protein mobility was observed in the apo state displaying rather broad line widths. Upon trapping with vanadate, the line widths of the majority of fluorine-labeled mutants decreased due to an enhanced protein rigidity and a more homogenous environment of the fluorine labels. A similar observation was made when increasing the temperature that can be explained due to higher protein flexibility at increased temperatures. Solution NMR was employed to investigate the isolated soluble NBD of LmrA (Chapter 9). First 2D and 3D spectra were successfully obtained and could be utilized for a preliminary assignment of a significant fraction of residues. Additionally, binding of ATP and ADP in absence and presence of magnesium was investigated. Finally, the effects of peptides emulating the coupling helices of the full-length transporter on the soluble NBD were investigated. Strikingly, binding of one of these peptides only occurred in the presence of nucleotides (whereas the other showed no binding at all) hinting towards a tightly coupled regulation of the NBD and TMD during the substrate translocation/ATP hydrolysis cycle based on nucleotide binding.
Nikotinabhänigkeit und -abstinenz sind mit erniedrigtem bzw. erhöhtem Körpergewicht assoziiert. Dem Nucleus arcuatus kommt eine Schlüsselrolle bei der Körpergewichtsregulation zu, und es wurde bereits gezeigt, dass eine inadäquate Genexpression in diesem hypothalamischen Kerngebiet zu Adipositas führen kann. Obwohl bekannt ist, dass Nikotin die Genexpression im Hypothalamus beeinflussen kann, sind die genauen Mechanismen, die zu den anorektischen Effekten führen, noch weitgehend unbekannt. Diese Studie wurde durchgeführt, um eine Methode zu etablieren, mit der umfassende und informative Genexpressionsprofile im Nucleus arcuatus - unter anderem - in Abhänigkeit von Nikotinwirkungen erstellt werden können. Hierzu wurden Microarrays mit einer limitierten Zahl an Genen hergestellt, für die teilweise bereits Informationen zu Nikotin-abhängiger Gegenregulation verfügbar waren. Fünfundzwanzig Fischer-Ratten wurden miniosmotische Pumpen implantiert, die entweder Nikotin (9mg/kg Körpergewicht/ Tag) oder physiologische Kochsalzlösung freisetzten. Nach einer Woche wurde ein Teil der Tiere getötet, während bei den übrigen Tieren die Effekte einer dreitägigen Nikotinabstinenz untersucht wurden. Die Nikotinbehandlung war mit einer reduzierten Gewichtszunahme sowie einer erhöhten Rektaltemperatur (p=0,001) assoziiert. Die Nikotinabstinenz führte dagegen zu einer gesteigerten Gewichtszunahme (p=0,012), einer erniedrigten Rektaltemperatur sowie einer höheren Serumglukosekonzentration (p=0,028). Für die Serumkonzentrationen von Insulin, Leptin, Cholesterin oder Triglyceriden konnten keine signifikanten Unterschiede aufgezeigt werden, was möglicherweise aber auf die relativ geringe Anzahl an Versuchstieren zurückzuführen ist. Mit den Microarray-Studien ließen sich die vorbeschriebenen Daten für die Nikotin-abhängige Regulation der Genexpression von NPY sowie teilweise auch von POMC bestätigen. Darüberhinaus konnten neue Informationen im Hinblick auf die Nikotinabhängige Regulation der Genexpression von AGRP, LepRb, Insulinrezeptor, MC3R, NPY-Y5-Rezeptor, Prohormone-Convertase-1, POMC und SOCS-3 gewonnen werden. Zusätzlich zu den neuen Daten stellen wir somit einen methodischen Ansatz vor, mit dem Expressionsprofile für viele hundert hypothalamischen Genen in Abhängigkeit von Manipulationen des Körpergewichts erstellt werden können, um so dann tiefgreifende Einsichten in die neuronalen molekularen Mechanismen der Körpergewichtskontrolle nehmen zu können.
Determinanten der Langzeitprognose von Patienten mit implantierbaren Cardioverter-Defibrillatoren
(2010)
Die Effektivität der ICD-Therapie in der Verhinderung des Plötzlichen Herztodes ist unbestritten. Implantierbare Defibrillatoren können ventrikuläre Tachykardien und Kammerflimmern mit hoher Sicherheit beenden und damit den Plötzlichen Herztod mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit verhindern. Die vorliegende Studie untersuchte Determinanten der Langzeitprognose von Patienten nach ICD-Implantation. Dabei zeigte sich in unserer Studie bei einer jährlichen Mortalität von 7,2% eine Sterblichkeit am Plötzlichen Herztod von < 1% pro Jahr, was den Nutzen des ICD unterstreicht. Bei der Analyse der Mortalitätsparameter waren ein hohes Alter der Patienten, fortgeschrittene Herzinsuffizienz mit entsprechendem NYHA-Stadium sowie eine deutlich eingeschränkte linksventrikuläre Ejektionsfraktion gute Vorhersagevariablen für die Prognose nach ICD-Implantation mit hohem prädiktiven Wert für die Mortalität. Ebenso scheint die ICD-Indikation ein wichtiger Parameter für die Langzeitprognose zu sein (sekundärprophylaktisch ICD-implantierte Patienten verstarben signifikant häufiger als Patienten, die zur Primärprophylaxe mit einem ICD versorgt wurden), primärprophylaktische Patienten stellen ein Patientenkollektiv mit per se besserer Prognose dar. Bezüglich der Auswertung des Auftretens adäquater Therapien erwiesen sich männliches Geschlecht, hohes Alter, Einnahme antiarrhythmischer Medikation sowie die sekundärprophylaktische ICD-Indikation als bedeutsame Parameter für eine erhöhte ICD-Interventions-Wahrscheinlichkeit. Zur Frage der prognostischen Bedeutung adäquater Therapien zeigte sich, dass im Auftreten adäquater Therapien ebenfalls eine gute Vorhersagevariable für die Langzeitprognose zu sehen ist. Die Auftretenswahrscheinlichkeit von adäquaten ICD-Therapien korrelierte jedoch nichtsignifikant mit dem Plötzlichen Herztod und somit scheinen vorhergehende ICD-Interventionen kein erhöhtes Risiko für diesen darzustellen. Die technische Weiterentwicklung hat in den letzten Jahren zu einer Größenreduktion der ICD´s, zur Vereinfachung der Systemimplantation mit verschwindend geringen peri- und postoperativen Komplikations- und Mortalitätsraten sowie durch die Verlängerung der Systemlebensdauer zum zunehmenden Einsatz von implantierbaren Defibrillatoren als bevorzugte Therapieform mit unbestrittener Effektivität in der Terminierung lebensbedrohlicher Arrhythmien, geführt. Trotzdem wären zukünftig prospektive Studien zur weiteren Risikostratifizierung und Evaluation möglicher diagnostischer Marker zur noch genaueren Abgrenzung von Hochrisikopatienten wünschenswert. Zukünftiges Ziel sollte es zudem sein, diejenigen Patientenpopulationen sicher zu identifizieren, die zwar ein geringeres individuelles Risiko haben dem Plötzlichen Herztod zu erliegen, jedoch absolut gesehen häufiger daran versterben.
Neuere Daten weisen p53 eine wichtige Rolle in der Verarbeitung von Mangelsignalen zu und deuten darauf hin, dass p53-abhängige molekulare Mediatoren des Warburg-Effektes Glukoseverbrauch und mitochondriale Funktion regulieren. Wir stellten deshalb die Hypothese auf, dass p53-wildtyp (p53wt) in Gliomzellen den metabolischen Bedarf reduzieren kann, der durch deregulierte Signaltransduktionsprozessen unter Mangelbedingungen zu Stande kommt. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl die shRNA-vermittelte p53-Gensuppression als auch die Temperatur-sensitive dominant-negative p53V135A Mutante in humanen p53wt-Gliomzellen Glukoseverbrauch und Laktatproduktion erhöht, den Sauerstoffverbrauch reduziert und den Hypoxie-induzierten Zelltod steigert. Überdies konnte beobachtet werden, dass eine zelluläre p53-Suppression die Expression von Synthesis of Cytochrome c Oxidase 2 (SCO2), eines Effektors, der in der Atmungskette benötigt wird, reprimiert. Die Restoration von SCO2 in p53wt-defizient-Zellen konnte Glukoseverbrauch, Laktatproduktion und Sauerstoffverbrauch wieder normalisieren, und vermittelte zugleich eine Resistenz gegenüber Hypoxie von Rotenone, einem Inhibitor des Komplex I der Atmungskette, abhängige Weise. Dies zeigte, dass die SCO2-vermittelten Effekte von einer intakten oxidativen Phosphorylierung abhängig waren. Schließlich vermittelte eine Gensuppression von SCO2 in p53wt-Gliomzellen eine Sensibilisierung dieser Zellen gegenüber moderater Hypoxie. Es konnte auch gezeigt werden, dass p53 und HIF-1alpha miteinander kooperieren, um SCO2 unter Hypoxie zu induzieren, was suggeriert, dass i) SCO2 ein neues HIF-1alpha Zielgen sein könnte und ii) SCO2 ein neues Zielprotein darstellen könnte, um Atmung und ROS-Prävention über HIF-alpha zu modulieren. Diese Befunde deuten darauf hin, dass Gliomzellen einen Nutzen aus dem Aufrechterhalten eines p53wt-Status erzielen können, da dies ihre Vulnerabilität gegenüber moderater Tumor-Hypoxie reduzieren kann, und dass dieser Effekt SCO2-vermittelt ist. Dennoch konnte die Sensitivität von p53wt-defizient-Zellen gegenüber hochgradiger Hypoxie-induziertem Zelltod nicht über die Effekte von SCO2 erklärt werden, da diese Oxidase ihre Funktionen nur unter ausreichend oxyschen Bedingungen erfüllen kann. Um die Mechanismen aufzuklären, die p53wt-Zellen vor hochgradiger Hypoxie Schutz verleihen, wurde die Rolle von TIGAR (Tp53 Induced Glycolysis and Apoptosis Regulator), eines weiteren kürzlich charakterizierten metabolischen p53-Zielgens, untersucht. TIGAR zeigt Ähnlichkeit mit der Fruktose-Bisphosphatase-2-Domäne des bifunktionalen Enzyms 6-Phosphofrukto-2-Kinase/Fruktose-2,6-Biphosphatase 2, und reduziert die intrazellulären Konzentrationen von Fruktose-2,6-Bisphosphat (FBP-2). FBP-2 ist ein Glykolyse-Regulator, der in höheren Konzentrationen die Glykolyse hemmt und den Pentose-Phosphat-Weg (PPP) induziert, was zu einer Verringerung der intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies-Konzentrationen (ROS) führt. Die Überexpression von TIGAR in p53wt-Zellen verstärkte die Glykolyse-Hemmung unter normoxischen Bedingungen und erlaubte oxidative Phosphorylierung als kompensatorischen metabolischen Mechanismus. Zudem förderte TIGAR die Expression von Lon, einer Protease, die Untereinheiten der Atmungskette modulieren kann, und zugleich als Radikalfänger fungiert. Jedoch reduzierte TIGAR die Expression von SCO2. Die Restoration von TIGAR in p53wt-defizient-Zellen konnte die Sensibilität gegenüber hochgradiger Hypoxie aufheben. TIGAR reduzierte auch die ROS-Menge und verringerte die Sensitivität gegenüber oxidativen Stress. Zugleich sensibilisierte die Gensuppression von TIGAR in p53wt-Gliomzellen diese Zellen vor hochgradiger Hypoxie. Zudem korrelierte die Expression von HIF-1alpha mit der TIGAR-Expression, was eine neue Rolle von HIF-1alpha in der Regulation des Hypoxie-induzierten Zelltodes und der Protektion vor ROS vermuten ließ. Die Expression der Transketolase-Like-1 (TKTL1), eines Isoenzym der Transketolase im Pentose-Phosphat-Weg, ist in vielen Tumoren hochreguliert. Es wurde spekuliert, dass TKTL1 Zellen Schutz vor oxidativem Zellstress vermitteln kann. Zugleich ist bekannt, dass TKTL1 mit hohen phospho-Akt-Mengen in Gliomen korreliert. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass TKTL1 ein indirektes p53-Zielgen ist, welches über TIGAR reguliert werden kann. Eine Suppression der TKTL1-Expression in TIGAR-exprimierenden Zellen konnte die über TIGAR vermittelten protektiven Effekte gegenüber endogenen ROS, oxidativem Stress und Hypoxie-induziertem Zelltod aufheben. Folglich wurde hier ein bis jetzt unbekannter Zusammenhang zwischen TIGAR, TKTL1 und HIF-1alpha entdeckt. Ebenso konnte eine TKTL1-Suppression mittels siRNA wie die TIGAR-Suppression die HIF1-alpha-Transaktivierungsfähigkeit reduzieren, was zu der Vermutung Anlass gab, dass TKTL1 HIF1-alpha unter Hypoxie reguliert.
Elefanten sind die größten landlebenden Säugetiere und werden schon seit Jahrhunderten in Menschenobhut gehalten. In der heutigen Zeit liegt der Schwerpunkt der Elefantenhaltung auf dem Unterbringen dieser anspruchsvollen Tiere in verhaltensgerechten Bedingungen, die auch das Wohlbefinden der Tiere berücksichtigen. Es mangelt jedoch an langfristigen Studien, die Veränderungen im Verhalten und im Wohlbefinden von Elefanten in Menschenobhut erforschen. Vor allem das nächtliche Verhalten fand bisher wenig Beachtung, obwohl Studien im natürlichen Lebensraum als auch in Menschenobhut zeigen, dass Elefanten den größten Teil der Nacht aktiv sind. Die vorliegende Studie konzentriert sich daher auf eine langfristige Überwachung des nächtlichen Verhaltens von Afrikanischen Elefanten und stellt, unter Anwendung chronoethologischer Methoden, die haltungsbedingten Einflüsse auf das Verhaltensmuster dar. Es wurden insgesamt 16 Afrikanische Elefanten (Loxodonta africana) mit Zeitraffer-Videoaufnahmen überwacht, im Opel-Zoo in Kronberg 600 Nächte, im Tiergarten Schönbrunn in Wien 300 Nächte und im Wuppertaler Zoo 70 Nächte. Dies ergibt bei einer Erfassungszeit von jeweils 16:00 Uhr bis 8:00 Uhr für alle Elefanten zusammen eine Summe von 64.320 Stunden Verhaltensregistrierung. Es konnte nachgewiesen werden, dass das nächtliche Verhalten von Elefanten durch die Haltungsbedingungen beeinflusst wird. Drei Haltungssysteme konnten zum ersten Mal in einer Studie direkt miteinander verglichen und Unterschiede aufgezeigt werden. Auch eine saisonale Abhängigkeit des nächtlichen Verhaltens konnte beobachtet werden. Es stellte sich heraus, dass Elefanten im Winter mehr und früher schlafen als im Sommer. Dies muss im nächtlichen Management berücksichtigt werden. Soziale Kontakte beeinflussen das nächtliche Verhalten ebenfalls. Es konnte erstmals beschrieben werden, dass Elefanten sich gegenseitig aus dem „Schlaf im Liegen“ aufwecken und dieses „Aufwecken“ einen Einfluss auf die Schlafdauer im Liegen hat. Die Verfügbarkeit von Nahrung ist ebenfalls ein wichtiger Faktor. Es konnte gezeigt werden, wie Elefanten zu unterschiedlichen Zeiten der Nacht auf zusätzliche Futtergaben reagieren und dass sie zu bestimmten Zeiten durch das zusätzliche Nahrungsangebot gestört werden. Unter Anwendung chronoethologischer Methoden konnte herausgearbeitet werden, dass Störungen im nächtlichen Verhaltensmuster durch vermehrtes „Weben“ erhöhte „Lokomotion“ und Reduzierung des Schlafverhaltens angezeigt werden. Beim Auftreten von Krankheiten mit Schmerzen wird die schmerzende Stelle gekühlt, indem sie mit z.B. Matsch beworfen wird. Die in dieser Studie dargestellten Einflüsse auf das nächtliche Verhalten von Afrikanischen Elefanten wurden vorher noch nicht beschrieben oder systematisch untersucht. Sie stellen wichtige Erkenntnisse für die zukünftige Haltung und das Management von Elefanten dar, sowohl im Hinblick auf eine weitere Optimierung als auch in Bezug auf die Beurteilung ihres Wohlbefindens.
Das C-reaktive Protein (CRP) ist ein systemischer Marker für unspezifische Infektionen und wird bei einer Entzündungsreaktion in der Leber produziert. Seine Serum-Konzentration steigt im Rahmen einer Immunreaktion innerhalb von 24 - 48 Stunden auf ein vielfaches an und induziert zahlreiche Prozesse des Immunsystems. Erhöhte CRP-Werte konnten als Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen identifiziert werden. Zahlreiche Querschnittsstudien konnten erhöhte Serum-CRP-Werte bei Parodontitispatienten im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen finden. Der Anstieg des Serum-CRP könnte ursächlich an den Zusammenhängen zwischen Parodontitis und kardiovaskulären Erkrankungen beteiligt sein. Die Neutrophile Elastase ist ein weiterer systemischer Parameter, der im Rahmen chronischer Entzündungsreaktionen, wie der chronischen obstruktiven Lungenerkrankung (COPD), erhöhte Werte annimmt. Zahlreiche Studien konnten erhöhte Leukozytenzahlen bei Parodontitispatienten finden. Bisher wurde von den meisten Studien die Erhöhung des CRP-Wertes, sowie weiterer anderer Entzündungsparameter im Zusammenhang mit Parodontitis untersucht. Nach unserem Kenntnisstand konnten lediglich erhöhte Elastase-Werte im Zusammenhang mit Gingivitis gezeigt werden. Ziel der Untersuchung: Vergleich der Entzündungsparameter (CRP, Elastase, Leukozytenzahl, LBP, IL-8, IL-6) bei parodontal gesunden Probanden (Pro) und Patienten mit aggressiver (AgP) und chronischer Parodontitis (ChP). Methode: Es wurden 30 Pro (Sondierungstiefe (ST) < 3,6 mm oder < 5 mm ohne Bluten auf Sondieren (BOP), BOP < 10 %), 31 Patienten mit ChP (ST ≥ 3,6 mm und Attachmentverlust (AL) ≥ 5 mm ≥ 30 % der Stellen, Alter ≤ 35 Jahre) und 29 Patienten mit AgP (klinisch gesund (d.h. keine Allgemeinerkrankungen, die für Parodontitis prädisponieren), ST ≥ 3,6 mm > 30 % der Stellen, röntgenologischer Knochenabbau von ≥ 50 % der Wurzellänge an ≥ 2 Zähnen, Alter ≥ 18 Jahre und ≤ 35 Jahre) wurden klinisch auf folgende parodontologische Parameter untersucht: Entzündungsbefund, Plaquebefund, ST, AL, BOP. Bei allen Patienten wurde der BMI erhoben und Blutproben zur Bestimmung von CRP (untere Nachweisgrenze: 0,01 mg/dl), Elastase, Leukozytenzahl, LBP, IL-8 und IL-6 entnommen. Ergebnisse: Es wurden 30 Pro (16 Frauen, 8 Raucher), 31 Patienten mit ChP (12 Frauen, 10 Raucher) und 29 Patienten mit AgP (16 Frauen, 9 Raucher) eingeschlossen. Die Ergebnisse der CRP-Konzentration (Pro: 0,10 ± 0,12; ChP: 0,17 ± 0,23; AgP: 0,55 ± 0,98 mg/dl [p < 0,001]), der Elastase-Werte (Pro: 10,0 ± 4,7; ChP: 17,1 ± 12,3; AgP: 32,0 ± 14,6 mg/dl [p < 0,001]) unterschieden sich in allen drei Gruppen signifikant, wohingegen keine signifikanten Unterschiede in der Leukozytenzahl und der Konzentrationen von IL-8 festzustellen war. Die Werte für LBP (p < 0,01) waren signifikant höher in der AgP-Gruppe als in der Pro-Gruppe und der ChP-Gruppe (Pro = ChP < AgP). Die IL-6 Konzentration war in der Kontrollgruppe signifikant niedriger (p < 0,001) als in den Testgruppen (Pro < ChP = AgP). Die unterschiedlichen CRP-Werte in den Testgruppen sind teilweise durch den BMI zu erklären (p = 0,003). Schlussfolgerung: Die Konzentrationen für Serum-CRP und Elastase sind signifikant erhöht bei Patienten mit aggressiver Parodontitis im Vergleich zu parodontal gesunden Probanden als auch zu Patienten mit chronischer Parodontitis. Erhöhte Serum-CRP-Werte könnten bei Patienten mit aggressiver Parodontitis zu einem erhöhten kardiovaskulären Risiko beitragen.
Dynamische Proteininteraktionen sind die Grundlage biologischer Prozesse, ihr korrekter Ablauf ist essentiell für die intakte Physiologie aller Organismen. Die Aufklärung der Struktur und Funktion von Proteinen inklusive ihrer komplexen Interaktionen, ist entscheidend für das Verständnis biologischer Prozesse. Methoden zur Untersuchung von Protein-Interaktionen sind in der Regel auf die Modifikation von Proteinen angewiesen. Zum Einen ist die selektive Markierung von Proteinen mit spektroskopischen Sonden – insbesondere mit Fluorophoren – ein wichtiger Ansatz zur in vivo und in vitro Interaktionsanalyse. Zum Anderen gewinnen festphasenbasierte Analysemethoden zunehmend an Bedeutung. Multivalente Chelatoren (MCH) bieten vielseitige Möglichkeiten, rekombinante Proteine reversibel an spektroskopische Sonden oder Oberflächen anzubinden und haben dadurch ein enormes Potential für Anwendungen zur funktionalen Charakterisierung von Proteinen. Ziel dieser Arbeit war es, die Energetik und Dynamik der Interaktion von MCH mit Oligohistidinen zu charakterisieren, um diese insbesondere zur Organisation von Proteinen in Mikro- und Nanostrukturen einzusetzen. Die Interaktion der MCH mit Histidin-Tags unterschiedlicher Länge und Sequenz wurde in Lösung und an Oberflächen charakterisiert. Es zeigte sich, dass die zunehmende Länge und die Redundanz auf Seiten des Histidin-Tags in einer erhöhten Affinität resultierten. Das Einführen einzelner Spacer-Aminosäuren resultierte hingegen in einer drastischen Reduktion der Komplexstabilität. Ein Alanin-Scanning zeigte, dass vor allem die zentralen Histidine besonders wichtig für eine stabile Bindung sind. Dieser Effekt lässt sich dadurch erklären, dass es sich bei der MCH-Oligohistidin-Interaktion um einen äußerst dynamischen Prozess handelt, bei dem die Metallkoordinationsstellen mit ständig wechselnden Histidinen interagieren. Diese Permutation erhöht die Entropie des Komplexes, und ist somit Grund für die erhöhte Affinität mit steigender Redundanz des Histidin-Tags. Anhand von Chelator-Dichte-Arrays konnte gezeigt werden, dass die Stabilität der Bindung von Histidin-getagten Proteinen nicht nur mit der Multivalenz der Chelatoren, sondern auch mit der MCH-Dichte ansteigt. In Kompetitionsexperimenten mit Hexa- und Dekahistidinen auf den MCH-Dichte-Arrays wurden veränderte Stabilitäten beobachtet. Die Stabilität von H6 ver5. veringert sich in Anwesenheit von H10, wobei sich die scheinbare Affinität von H10 in Anwesenheit von H6 erhöht. Dies wird auf die gleichzeitige Interaktion mit verschiedenen MCH-Molekülen auf der Oberfläche, die Oberflächenmultivalenz, zurückgeführt. Um diesen Effekt anhand von MCHMolekülen mit definiertem Abstand zu untersuchen, wurde ein Tris-NTABiotin-Konjugat (BTTris-NTA) hergestellt und auf Streptavidin-Oberflächen bzw. fluoreszenzmarkiertem Streptavidin eingesetzt. Echtzeit TIRFS-RIf-Kompetitionsexperimente zeigten eine veränderte Bindungskinetik für H6 in Anwesenheit von H10, welche darauf zurückzuführen ist, dass H6 aktiv durch H10 verdrängt wird. Dieser Effekt ist offenbar auf die dynamische Interaktion des Oligohistidins mit multiplen Chelatoren auf der Oberfläche zurückzuführen, welche den aktiven Austausch von H6 gegen H10 ermöglicht. Sowohl auf Oberflächen als auch in Lösung wurden für die Interaktion von Streptavidin-gebundenem BTTris-NTA mit Oligohistidinen um Faktor 3-5 erhöhte Affinitäten, im Vergleich zu freiem Tris-NTA, festgestellt. Interaktionsanalysen in Lösung zeigten maximale Komplex-Stöchiometrien von 1:2 für die Interaktion von Streptavidin-BTTris-NTA mit Oligohistidinen. Diese Stöchiometrien sowie die erhöhte Affinität lassen sich durch die gleichzeitige Interaktion von zwei benachbarten an Streptavidin gebundenen BTTris-NTA-Molekülen mit einem Oligohistidin erklären. Die räumliche Nähe der Tris-NTA-Moleküle erhöht die Redundanz auf Seiten des Chelators, was sich wiederum positiv auf die Entropie auswirkt und damit zu einer erhöhten Affinität führt. Diese Ergebnisse bestätigen den postulierten Effekt der Oberflächenmultivalenz. Es wurde gezeigt, dass BTTris-NTA die reversible Biotinylierung Histidingetagter Proteine ermöglicht, und damit eine Brücke zwischen den zwei am meisten eingesetzten Werkzeugen der Biochemie, dem Histidin-Tag und dem Biotin-(Strept)Avidin-System, schlägt. BTTris-NTA findet in verschiedenen Bereichen Anwendung: zur Umwandlung kommerzieller (Strept)Avidin-Oberflächen in Tris-NTA-Oberflächen, in Phage-Display-Screenings und Western Blot Analysen sowie zur Markierung von Rezeptoren auf Zelloberflächen. Die Biotinylierung über BTTris-NTA ermöglicht es zudem, auch Proteine geringer Konzentrationen (<10 nM) effizient auf Streptavidinoberflächen zu immobilisieren. Diese Selbstassemblierung Histidin-getagter Proteine wurde zur Organisation von Proteinen auf Oberflächen in Mikro- bis Nanometer-Dimensionen genutzt.
ABCB9 is a peptide transporter belonging to the ATP-binding cassette (ABC) transporter subfamily B. Due to its high sequence identity to the transporter associated with antigen processing (TAP) the protein was named TAP-like (TAPL). The primary aim of this PhD thesis was the functional characterization of the TAPL transport complex. Despite the lack of TAPL function in the classical MHC class I pathway an involvement of TAPL in antigen presentation was still suggested. Apart from the crucial role of TAP for peptide delivery into the ER, TAP-independent translocation pathways in professional antigen presenting cells (pAPC) have been proposed, but not identified so far. Remarkably, TAPL mRNA and protein expression is strongly induced during differentiation of monocytes to immature and mature dendritic cells. This result was confirmed in the promonocytic cell line THP-1, which was used as a model system for monocyte to macrophage differentiation. By using quantitative immunofluorescence microscopy and subcellular fractionation, TAPL was detected in the lysosomal compartment co-localizing with the lysosome associated membrane protein 2 (LAMP-2) thus excluding the ER-localization formerly reported. Furthermore, by in vitro assays, a TAPL-specific and ATPdependent translocation of peptides into isolated lysosomes was demonstrated. Hence, TAPL is a candidate mediating peptide transport in alternative antigen presentation pathways in pAPCs. The presence of an extra N-terminal transmembrane domain (TMD0) lacking sequence homology to any known protein distinguishes TAPL from most other ABC transporters of its subfamily. By dissecting the TAPL translocation complex into its four putative transmembrane helices containing TMD0 and the core complex, distinct functions to the core complex and TMD0 were assigned. The core-TAPL complex composed of six predicted transmembrane helices and the nucleotide-binding domain (NBD) was expressed transiently in HeLa or stably in Raji cells. Crude membranes containing core-TAPL showed the same peptide transport activity as wt-TAPL demonstrating that the six core helices and the NBD are sufficient for peptide transport. This result also shows that the core transport complex is correctly targeted to and assembled in the membrane. Strikingly, in contrast to the wt transporter, the core complex localizes only partially to lysosomes and is mistargeted to the plasma membrane as observed by immunofluorescence microscopy and confirmed biochemically by cell surface biotinylation. Thus, a crucial role for TMD0 in proper subcellular targeting can be postulated. The vast majority of biological processes are mediated by protein complexes, hence characterization of such protein-protein-interactions is essential for understanding protein function on the cellular level. To identify interaction partners of TAPL, the transporter was isolated by tandem affinity purification. By tandem mass spectrometry the membrane proteins LAMP-1 and LAMP-2 were deciphered as specific proteins interacting with wt-TAPL. Notably, core-TAPL lacks these interactions indicating a role for TMD0 in recruiting other proteins. These results were verified for endogenous TAPL by co-immunoprecipitation. Using cells deficient in LAMP-1 and/or in LAMP-2 an escort function for the LAMP proteins was excluded. Very importantly, the physiological function of the LAMP-1and LAMP-2 interaction with TAPL is an increase in stability, since in their absence half-life of TAPL is drastically reduced.
Zu den wichtigsten Zielgrößen der Unternehmen gehört die Kundenzufriedenheit. Diese wird von Unternehmensseite mit Hilfe von technischen Hilfsmitteln gemessen und analysiert, um sie kontinuierlich steigern zu können. Dabei spielt vor allem eine große Rolle, welche internen oder externen Faktoren mit der Kundenzufriedenheit in Zusammenhang stehen und diese beeinflussen. Der Einfluss der Mitarbeiterzufriedenheit auf die Kundenzufriedenheit wurde vor allem in den letzten Jahren verschiedentlich diskutiert. In der Automobilindustrie kann von einer positiven Wirkung der Händlerzufriedenheit auf die Zufriedenheit der Kunden ausgegangen werden. Dabei werden nicht alle Zufriedenheiten des Händlers mit den Leistungen des Herstellers einen gleich großen Einfluss ausüben. In der vorliegenden Studie wurde untersucht, welche Händlerzufriedenheitsdimensionen auf die Service- und auf die Kaufzufriedenheit des Kunden wirken. Diese Fragestellung wurde anhand eines, in einem deutschsprachigen Land erhobenen, Datensatzes von einem deutschen Premium-Automobilhersteller analysiert. Es wurden sämtliche Händlerzufriedenheiten mit dem Hersteller als auch alle Zufriedenheiten mit den Kundenprozessen abgefragt und nach einer Dimensionalitätsprüfung mittels der Analysemethode Hierarchisch Lineare Modelle getestet. Wie erwartet bestätigte sich die Hypothese, dass die Händlerzufriedenheit einen positiven Einfluss auf die Kundenzufriedenheit mit dem Service hat. Bei den Testungen des Zusammenhangs mit der Kundenkaufzufriedenheit ergaben sich jedoch keine signifikanten Ergebnisse. Auffällig ist bei den Ergebnissen auch, das nur die Händlerzufriedenheiten eine Wirkung aufweisen, bei denen eine Beziehungskomponente mit dem Hersteller im Vordergrund steht und es weniger um die standardisierten Leistungen des Herstellers in Bezug auf die Produkte geht. Die Relevanz dieser personalen Elemente und die Differenzierung zwischen dem Service- und dem Kaufprozess werden diskutiert.
Top-down and bottom-up approaches are the general methods used to analyse proteomic samples today, however, the bottom-up approach has been dominant in the last decade. Establishing a bottom-up method involves not only the choice of adequate instruments and the optimisation of the experimental parameters, but also choosing the right experimental conditions and sample preparation steps. LC-ESI MS/MS has widely been used in this field due to its advanced automation. The primary objective of the present study was to establish a sensitive high-throughput nLC-MALDI MS/MS method for the identification and characterisation of proteins in biological samples. The method establishment included optimisation and validation of parameters such as the capillaries in the HPLC systems, gradient slopes, column temperature, spotting frequencies or the MS and MS/MS acquisition methods. The optimisation was performed using two HPLC-systems (Agilent 1100 series and Proxeon Easy nLC system), three spotters and the 4800 MALDI-TOF/TOF analyzer. Furthermore, samples preparation protocols were modified to fit to the established nLCMALDI- TOF/TOF-platform. The potentials of this method was demonstrated by the successful analysis of complex protein samples isolated from lipid particles, pre-adipocytes/adipocytes tissues, membrane proteins and proteins pulled-down from protein-proteins interaction studies. Despite the small amount of proteins in the lipid particles or oil bodies, and the challenges encountered in studying such proteins, 41(6 novel + 14 mammal specific + 21 visceral specific) proteins were added to the already existing proteins of the secretome of human subcutaneous (pre)adipocytes and 6 novel proteins localised in the yeast lipid particles. Protein-protein interaction studies present another area of application. Here the analytical challenges are mostly due to the loss of binding partner upon sample clean-up and to differentiate from non-specific background. Novel interaction partners for AF4•MLL and AF4 protein complex were identified. Furthermore, a novel sample protocol for the analysis of membrane proteins, based on the less specific protease, elastase, was established. Compared to trypsin, a higher sequence coverage and higher coverage of the transmembrane domains were achieved. The use of this enzyme in proteomics has been limited because of its non specific cleavage. However, from the results obtained in these studies, elastase was found to cleave preferentially at the C-terminal site of the amino acids AVLIST. The advantage of the established protocol over conventional protocols is that the same enzyme can be used for shaving of the soluble dormains of intact proteins in membranes and the digestion of the hydrophobic domain after solubilisation. Furthermore, the solvents used are compatible with the nLC-MALDI method setup. In addition, it was also shown that for less specific enzymes, a higher mass accuracy is required to reduce the rate of false positive identifications, since current search engines are not perfectly adapted for these types of enzymes. A brief statistical analysis of the MS/MS data obtained from the LC-MALDI TOF/TOF system showed that for less specific enzymes, under high-energy collision conditions, approximately 43 % of the fragment ions could not be matched to the known y- b type ions and their resultant internal fragments. This limitation greatly influenced the search results. However, this limitation can be overcome by modifying the N-terminal amino acids with basic moieties such as TMT. The use of elastase as a digestion enzyme in proteomic workflow further increased the complexity of the sample. Therefore, orthogonal multidimensional separation was necessary. Offgel-IEF was used as the separation technique for the first dimension. Here peptides are separated according to the pI. However, the acquired samples could not be loaded to the nLC due to the high viscosity of the concentrated samples when using the standard protocol. In order to achieve compatibility of the Offgel-IEF to the nLC-MALDI-TOF/TOF-platform, the separation protocol of the Offgel-IEF was modified by omitting the glycerol, which was the cause of the viscous solution. The novel glycerol free protocol is advantageous over the conventional method because the samples could directly be picked-up and loaded onto the pre-column without resulting in an increase in back pressure or a subsequent pre-column clogging. The glycerol free protocol was then assessed using purple membrane and membrane fraction of C. glutamicum. The results obtained were comparable to those applied in published reports. Therefore, the absence of glycerol did not affect the separation efficiency of the Offgel-IEF. In addition the applicability of elastase and the glycerol free Offgel-IEF for quantitation of membrane proteins was assessed. Most of the unique peptides identified were in the acidic region and 85 % were focused only into one fraction and approximately 95 % in only two fractions. These results are in accordance with previously published results (Lengqvist et al., 2007). When compared with theoretical digests of the proteins identified in this study, it can be concluded that basic moiety (TMT) on the peptide backbone, did not affect the separation efficiency of the Offgel-IEF. In an applied study, changes in the protein content of yeast strain grown in two different media were relatively quantified. For example, prominent proteins, such as the hexose tranporter proteins responsible for transporting glucose accross the membrane, were successfully quantified. Last but not least, the nLC-MALDI-TOF/TOF platform also served as a basis for the development of a high-throughput method for the identification of protein phosphorylation. The establishment of such a method using MALDI has been challenging due to the lack of sensitive matrices, such as CHCA for non-modified peptides, which exhibit a homogenous crystallisation and thus yield stable signal intensity over a long period of time in an automated setup. The first step of this method was the establishment of a matrix/matrix mixture with better crystal morphology and higher analyte signal intensity than the matrix of choice, i.e. DHB. From MS and MS/MS measurements of standard phosphopeptides, a combination of FCCA and CHAC in a 3:1 ratio and 3 mM NH4H2PO4 facilitated high analyte signal intensities and good fragmentation behaviour. Combining a custom-packed biphasic column for the enrichment of phosphopeptides, the applicability of the matrix mixture was assessed in anautomated phosphopeptide analysis using standard phosphopeptides spiked to a 20-fold excess BSA digest. These analyses showed that this method is reproducibile and both flow throughs can be analysed. Applying the method to the analysis of 2 standard phosphoproteins, alpha/beta-casein, and a leukemia related protein, ENL, 13 phosphopeptides from both alpha/beta-Casein and 13 phosphopeptides with 6 phosphorylation sites from the ENL were identified. As a general conclusion, it can be stated that the nLC-MALDI-TOF/TOF method established here in various modifications for different analytical purposes is a robust platform for proteomic analyses.
An chemischen Synapsen diffundieren von der präsynaptischen Nervenendigung ausgeschüttete Neurotransmitter durch den synaptischen Spalt und aktivieren Rezeptormoleküle in der postsynaptischen Plasmamembran. Eine schnelle und zuverlässige Kommunikation an Synapsen bedingt, dass die Rezeptoren in Clustern direkt gegenüber den aktiven Zonen der Präsynapsen angereichert sind. Eine hohe Rezeptorendichte in der postsynaptischen Membran wird durch sog. Gerüstproteine, die mit den Rezeptormolekülen assoziieren, erreicht. Bisher wurden für verschiedene Synapsen unterschiedliche Gerüstproteine identifiziert. An glutamatergen Synapsen werden Rezeptoren durch u.a. das Postsynaptic Density 95 (PSD 95)-Protein, an cholinergen Synapsen durch Rapsyn, und an GABAergen und glyzinergen Synapsen durch Gephyrin verankert. An inhibitorischen Synapsen wurde bisher ausschliesslich Gephyrin als Ankerprotein für Glyzin- und GABAARezeptoren identifiziert. An exzitatorischen glutamatergen Synapsen dagegen regulieren weitere Gerüstproteine wie Shank, Homer und das Glutamatrezeptor interagierende Protein (GRIP) die Lokalisation, den Transport und die Stabilität verschiedener Glutamatrezeptor- Subtypen. Gephyrin wurde ursprünglich als peripheres Membranprotein zusammen mit dem Glyzin-rezeptorkomplex aufgereinigt. Es bindet an die große intrazelluläre Schleife der ß-Untereinheit des Glyzinrezeptors. Experimente mit Antisense-Oligonukleotiden und Gephyrin-defizienten Mäusen zeigten, dass Gephyrin essentiell für die synaptische Lokalisation von Glyzinrezeptoren und α2- und γ2-Untereinheiten enthaltenden GABAARezeptoren ist. Die Rezeptorlokalisation an der Synapse wird durch eine stabile Verankerung des Gephyrin-Gerüstes am Zytoskelett gewährleistet. Die Gerüstbildung erfolgt durch die Oligomerisierung zweier Gephyrin-Domänen, der aminoterminalen G-Domäne und der carboxyterminalen E-Domäne, wodurch ein hexagonales Gephyrinnetzwerk entsteht, welches für die Clusterbildung an der Synapse notwendig ist. Live-imaging Studien in Neuronenkulturen zeigten, daß an Rezeptor-Transportvesikel gebundenes Gephyrin kontinuierlich an und von aktiven Synapsen weg transportiert wird, was eine hochdynamische Modulation des Gephyrin-Gerüsts nahelegt. Der retro- und anterograde Transport von Gephyrin wird durch Dynein bzw. Kinesin bewerkstelligt. Einige zytosolische Proteine wie Profilin, das Mena/Vasodilator-stimulierte Phosphoprotein (VASP) und Collybistin (Cb) spielen in der Zytoskelett-Regulation eine Rolle und interagieren mit Gephyrin. Cb ist notwendig für die Gephyrin-Clusterbildung an bestimmten GABAergen Synapsen. Im Hippocampus Cb-defizienter Mäuse befindet sich kein Gephyrin an den Postsynapsen. Cb gehört zur Familie der Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (GEF), die durch eine DH-PH (Dbl Homologie-/Pleckstrin-Homologie) Tandem-Domäne charakterisiert sind und existiert in zwei Spleißvarianten, CbI und CbII. Die DH-Domäne aktiviert spezifisch das kleine G-Protein Cdc42, und die PH-Domäne interagiert mit Phosphoinositol-3-Phosphat (PI3P). In vitro-Studien haben gezeigt, dass die Interaktion von Gephyrin mit Cb II eine Reduktion der GEF-Aktivität für Cdc42 bewirkt. Basierend auf diesen Resultaten wurde vorgeschlagen, dass Gephyrin die Cdc42-Aktivierung durch Cb beendet. Dieser Mechanismus könnte für die initiale Bildung inhibitorischer Synapsen notwendig sein. Analysen mit Domänen-deletierten Cb-Konstrukten zeigten, dass sowohl die DH- als auch die PH-Domäne für die Bildung von submembranären Gephyrin-Microclustern an der Plasmamembran notwendig sind. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der Gephyrin-Gerüstbildung durch Cb weiter untersucht. Insbesondere wurde geklärt, inwiefern Cdc42-Aktivierung bzw. PI3P-Bindung durch Cb an der Gephyrin-Gerüstbildung beteiligt ist. Zusätzlich wurde anhand einer eigens erzeugten GFP-Gephyrin transgenen Maus untersucht, ob sich die Stabilität des Gephyrin-Gerüsts während der Differenzierung ändert und in die Regulation der Stabilität und Plastizität inhibitorischer Synapsen involviert ist. Die Rolle von Cdc42 in der Gephyrin-Gerüstbildung wurde mittels einer konstitutiv aktiven Spleißvariante von Cb untersucht. Basierend auf Homologien zu anderen bereits charakterisierten GEFs und der publizierten Kristallstruktur des CbII-Cdc42 Komplexes wurden Aminosäurereste in der DH-Domäne von Cb mutiert, um die Cdc42-Aktivierung zu unterbrechen (CB T61A, K192A und NE232-233AA). In vitro GTPase-Aktivierungsassays und Filopodien-Induzierung in NIH-3T3-Zellen bestätigten, dass diese Mutationen die Cdc42-Aktivierung reduzierten bzw. aufhoben. Dennoch induzierten sie die Gephyrin-Gerüstbildung in heterologen Zellen und hippocampalen Neuronen ähnlich effektiv wie Wildtyp-Cb II. Die Rolle von Cdc42 in der synaptischen Gephyrin-Clusterbildung wurde außerdem in konditionell Cdc42-defizienten Mäusen, in denen das Cdc42-Gen selektiv im Vorderhin inaktiviert wurde, untersucht. Die Dichte von Gephyrin- und das GABAA-Rezeptor-Clustern war bei Verlust von Cdc42 im Hippocampus nicht verändert. Dies steht im Gegensatz zu einem fast 80%igen Verlust von Gephyrin- und GABAA-Rezeptor-Clustern im Hippocampus von Cb-defizienten Mäusen. Diese Ergebnisse zeigen, dass Cdc42 für die Gephyrin-Gerüstbildung an inhibitorischen Synapsen nicht notwendig ist. Die Rolle der PH-Domäne von Cb bei der Gephyrin-Clusterbildung wurde ebenfalls durch Mutagenese-Experimente analysiert. Viele PH-Domänen haben die Fähigkeit, Phosphoinositide zu binden und damit Membranbindung zu vermitteln, während andere PHDomänen, die nicht an Phosphoinositide binden, nur nach Bindung weiterer Liganden mit Membranen assozieren. In früheren Arbeiten war gezeigt worden, dass humanes Cb PI3P bindet. Hier wurde eine mögliche Beteiligung von Phospholipid-Bindung an der Gephyrin-Gerüstbildung durch Substitution zweier basischer Reste in der β3- und β4- Schleife, R303 und R304, mit Asparaginen untersucht. Ein Lipid-Dot-Blot-Assay mit der Cb II-RR303-304NN-Mutante zeigte einen völligen Verlust der PI3P-Bindung in vitro. Die Expression dieser Mutante in heterologen Zellen und hippocampalen Neuronen zeigte, dass die Gerüstbildung und die synaptische Lokalisation von Gephyrin Phosphoinositidbindung erfordern. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die Aktivierung von Cdc42, nicht aber die PI3P- Bindung, für die Cb II-vermittelte Gephyrin-Gerüstbildung entbehrlich ist. Cb hat also zumindest zwei biologische Funktionen: Einerseits ist die DH-Domänen vermittelte Aktivierung von Cdc42 notwendig für die Regulation des Aktinzytoskeletts und die Bildung von Filopodien; andererseits wird die PH-Domänen-abhängige und Cdc42-unabhängige Phospholipidbindung für die Gephyrin-Gerüstbildung an inhibitorischen Postsynapsen benötigt. Um die Dynamik von Gephyrin an inhibitorischen Synapsen zu untersuchen, wurde eine transgene Maus entwickelt, welche GFP-Gephyrin unter der Kontrolle des Neuronspezifischen Thy1-Promotors exprimiert. In verschiedenen Hirnregionen der transgenen Mauslinie, wie Hippocampus, Stammhirn, Rückenmark und Kortex, wurde punktuelle synaptische GFP- Fluoreszenz beobachtet. Diese GFP-Gephyrin-Fluoreszenz kolokalisierte mit einem inhibitorischen Präsynapsenmarker, dem vesikulären inhibitorischen Aminosäuretransporter (VIAAT). Immunfärbungen von Hirnschnitten mit Gephyrin-spezifischen Antikörpern zeigten, daß die durchschnittliche Größe und Dichte der GFP-Gephyrin-Cluster mit denen endogener Gephyrin-Cluster identisch waren. Eine Western-Blot Analyse inhibitorischer synaptischer Proteine zeigte keinen Unterschied zwischen Thy1-GFP-Gephyrin- und Wildtyp-Mäusen auf, ebensowenig wie elektrophysiologische Untersuchungen von GFP-Gephyrin-positiven und -negativen Neuronen. Sowohl die durchschnittliche Amplitude der mIPSCs als auch deren Frequenz waren nicht signifikant verändert, was dafür spricht, dass die transgene Expression von GFP- Gephyrin keine funktionellen Veränderungen verursacht. Verhaltensversuche zeigten gleiche Ergebnisse für Thy1-GFP-Gephyrin und WTMäuse. Daher kann die GFP-Gephyrin-Maus als verlässliche Reporterlinie für Studien zur Gephyrin-Dynamik an inhibitorischen Synapsen im Hippocampus und in einigen anderen Hirnregionen eingesetzt werden. Die Dynamik des synaptischen Gephyrin-Gerüsts wurde an inhibitorischen Postsynapsen in organotypischen entorhinal-hippocampalen Schnittkulturen aus GFPGephyrin-Mäusen untersucht. Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP)-Analysen individueller GFP-Gephyrin-Cluster in 1-Woche- und 4-Wochen-alten Kulturen zeigten eine entwicklungsabhängige Stabilisierung der GFP-Gephyrin-Cluster auf. Diese Stabilisierung ist eng verbunden mit einer Größenzunahme der Gephyrin-Cluster an GABAergen Synapsen. Mit elektrophysiologischen Ableitungen wurde eine Reifung der GABAergen synaptischen Übertragung ebenfalls während dieser Periode beobachtet. Die Stabilisierung und Grössenzunahme des Gephyrin-Gerüsts spiegelte sich in einer erhöhten miniature inhibitory postsynaptic current (mIPSC)- Amplitude wieder. Außerdem wies die Zunahme der mIPSCFrequenz auf eine effiziente Reifung der präsynaptischen Endigungen hin, die immunhistochemisch durch eine Zunahme der VIAAT-Immunfluoreszenz erhärtet werden konnte. Ein möglicher Einfluss der GABAergen, synaptischen Aktivität auf die Grösse und Stabilität der Gephyrin-Cluster wurde in reifen Neuronenkulturen durch pharmakologische Modulation der GABAA-Rezeptoren untersucht. Die Behandlung 4-Wochen-alter Kulturen mit GABAA-Rezeptor-Antagonisten und mit dem potenzierenden Benzodiazepin Diazepam zeigte eine homöostatische Regulation der Stabilität und Größe des Gephyrin-Gerüsts durch die Aktivität inhibitorischer Synapsen auf. Zusammenfassend sind diese Resultate starke Hinweise für dynamische Veränderungen in synaptischen Gephyrin-Gerüsten während der Reifung und Aktivitäts-induzierten Plastizität GABAerger Synapsen
Seit Einführung der Operationen mit HLM vor etwa 50 Jahren haben zahlreiche Veränderungen von Komponenten zu Fortschritten bezüglich einer verbesserten Biokompatibilität der EKZ geführt (Daniel S 1996; Gu Y 1993). Die EKZ ist nach wie vor eine Voraussetzung für die Mehrzahl der Herzoperationen und ist mit einer systemischen inflammatorischen Reaktion verbunden (SIRS), welche für eine postoperative Organdysfunktion verantwortlich sein kann. Herz-, Lungen- und Nierenfunktion als auch Gerinnungssystem sind in verschiedenem Ausmaß betroffen (Kirklin JK (1983); Westaby S 1987). Dieser Ganzkörperschaden ist ein multifaktorieller Prozess, der hauptsächlich durch den Kontakt von Blut mit fremden Oberflächen verursacht wird und sowohl zu einer Aktivierung der Leukozyten als auch der Komplementkaskade führt (Gourlay T 2001; Levy JH 2003). In Zeiten der minimal-invasiven Herzchirurgie besteht nun nicht nur die Absicht, das chirurgische Trauma zu reduzieren, sondern auch die pathologischen Auswirkungen der EKZ zu minimieren. Deshalb führten neuartige Konzepte und Strategien zur Entwicklung minimierter extrakorporaler Zirkulationssysteme, die vor allem durch reduzierte Fremdoberflächen und geringeres Primingvolumen charakterisiert sind (von Segesser LK 2003). Das CorX™ System folgt diesem Konzept und besteht aus einem geschlossenen System mit sehr geringere Oberfläche, einer integrierten Pumpe mit Oxygenator und einem Luftelimierungssystem. Außerdem wird weder ein Kardiotomie-Reservoir noch eine perikardiale Saugung verwendet, um den zusätzlichen Blutluftkontakt zu vermeiden. Das Ziel dieser Untersuchung war, dass CorX™ System in einer prospektiv randomisierten Studie mit einer konventionellen HLM in Bezug auf perioperative klinische und biochemische Parameter bei koronararteriellen Bypassoperationen in einem Niederigrisiko Patientenkollektiv zu vergleichen. 200 Patienten wurden entweder der CorX™ System-Gruppe (n = 100, Gruppe A) oder der Standard-HLM-Gruppe (n = 100, Gruppe B) zugeteilt. Neben der Auswertung von perioperativen Daten und routinemäßigen Blutproben waren vor allem die Lungenfunktion und der Myokardschaden Gegenstand dieser Untersuchung. Die PMNElastase und TCC dienten dazu, die inflammatorische Reaktion zu beurteilen. Demographische und operative Patientendaten unterschieden sich zwischen beiden Gruppen nicht, sie waren daher vergleichbar. Die postoperative Lungenfunktion zeigte postoperativ keinen signifikanten Unterschied in beiden Gruppen. Zwar war der Oxygenierungsindex in der ersten postoperativen Messung in der CorX-Gruppe signifikant niedriger, dies hatte aber keine Auswirkungen auf die Ergebnisse der Lungenfunktionstests am 5. postoperativen Tag. In der CorX™-Gruppe beobachteten wir verminderte CK-MB Werte postoperativ, was auf einen signifikant niedrigeren Herzmuskelzelluntergang hinweist. Auch dieses Ergebnis hatte aber keine klinische Relevanz. Eine Stunde nach HLM waren sowohl PMN-Elastase als auch TCC signifikant niedriger in Gruppe A im Vergleich zu Gruppe B (PMNE:76±44ng/ml vs 438±230ng/ml, p<0,0001; TCC: 16±8IU/ml vs 29±19IU/ml, p<0,0001). Dies zeigt eine deutlich verminderte inflammatorische Reaktion in der CorX-Gruppe auf, welche sich aber klinisch in diesem Niedrigrisikopatientengut nicht ausgewirkt hat. Die klinischen Ergebnisse hinsichtlich Morbidität und Mortalität, Intensiv- und Krankenhausaufenthalt waren nicht signifikant unterschiedlich im Gruppenvergleich. Das CorX™ System ist sicher und erfordert nur eine kurze Trainingsperiode für das chirurgische Team. Es wurde von den Kardiotechnikern gut angenommen und sogar gegenüber der konventionellen HLM favorisiert. Die inflammatorische Reaktion nach EKZ war signifikant reduziert, jedoch gab es bei Niedrigrisikopatienten keinen messbaren Unterschied bei Betrachtung der klinischen Ergebnisse. Die Reduktion der inflammatorischen Reaktion durch den Einsatz einer minimierten HLM könnte bei Hochrisikopatienten aber von großer Bedeutung sein.
Eine Autoimmunreaktion impliziert Verlust der Autotoleranz und ermöglicht Immunreaktionen gegen körpereigene Antigene. Bei autoimmuner Erkrankung der Schilddrüse Typ M. Basedow führt die Aktivierung von T-Lymphozyten zur vorübergehenden und sequentiellen Expression von spezifischen Molekülen auf der Zelloberfläche, z.B. CD25 oder HLA-DR. Dass die CD4+CD25+-, CD8+CD25+-Zellen sowie HLA-DR-positive T-Zellen eine wesentliche Rolle in der Autoimmunität der Schilddrüse haben, ist erwiesen. Dennoch sind die genauen pathophysiologischen Mechanismen ungeklärt. Zusätzlich haben mehrere Studien eine Erhöhung der B-Zellen, insbesondere die Erhöhung der Anzahl von CD19+CD25+-Zellen bei Ophtalmopathie, sowie eine Erhöhung der zytotoxischen Aktivität der NK-Zellen beschrieben. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, mit Hilfe der Durchflusszytometrie die Veränderungen in der Expression von Aktivierungsmarkern CD25, HLA-DR und CD94 auf peripheren und intrathyreoidalen Lymphozytensubpopulationen bei M. Basedow und Struma zu bestimmen. Im ersten Teil der Arbeit wurden periphere Lymphozytensubpopulationen von M. Basedow, Struma, und Kontrollgruppe untereinander verglichen. Die Analyse von peripheren T-Helferzellen CD3+CD4+CD25- zeigte sowohl bei M. Basedow- als auch bei Struma-Patienten eine signifikant niedrigere Anzahl im Vergleich zur Kontrolle, während die peripheren CD3+CD4+CD25+-Zellen signifikant höhere Werte gegenüber der Kontrollgruppe aufwiesen. Im Rahmen der Untersuchung traten die peripheren aktivierten B-Zellen (CD45+CD19+CD25+) sowie peripheren NK-Zellen (CD45+CD56+CD94-, CD45+CD56+CD94+, CD45+CD8-CD56+, CD45+CD3-CD56+ und NK-T-Zellen (CD45+CD8+CD56+, CD45+CD3+CD56+) bei Struma in eine signifikant erhöhten Anzahl im Vergleich zur Kontrolle auf. Die nicht aktivierten B-Zellen (CD45+CD19+CD25-) zeigten bei Patienten mit M. Basedow eine signifikante Erhöhung der Anzahl verglichen mit der Strumagruppe. Diese Ergebnisse zeigen deutliche Unterschiede in den Aktivierungsmustern von M. Basedow und Struma gegenüber der Kontrolle. Somit kann man bei beiden Erkrankungen über eine immunologische Reaktion in der Peripherie sprechen, die sich deutlich von der bei gesunden unterscheidet. Dennoch war in der Peripherie bei M. Basedow-Patienten die Aktivierung von B-Zellen, wahrscheinlich autoimmun bedingt, beeinträchtigt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden intrathyreoidale Lymphozytensubpopulationen von M. Basedow- und Struma-Patienten untereinander verglichen. Die Anzahl der intrathyreoidalen CD3+CD4+CD25--Zellen von M. Basedow war signifikant höher im Vergleich zu Struma, andererseits waren die Werte der CD45+CD19+CD25+-Zellen signifikant niedriger. Zusätzlich wurde bei M. Basedow-Patienten eine Analyse der Verhältnisse zwischen aktivierten und nicht aktivierten intrathyreoidalen Lymphozytensubpopulationen durchgeführt. Der Anteil nicht aktivierter T-Helferzellen (CD4+CD25-), zytotoxischer Zellen (CD8+CD25-) und B-Zellen (CD19+CD25-) war höher als der Anteil aktivierter T-Helferzellen (CD4+CD25+), zytotoxischen Zellen (CD8+CD25+) und B-Zellen (CD19+CD25+). Die hier vorgestellten Ergebnisse legen nahe, dass die Fähigkeit der CD4+CD25+-Zellen, die Proliferation von CD4+CD25--Zellen zu unterdrücken, bei M. Basedow-Patienten beeinträchtig ist. Dies führt bei diesen Patienten zu einer Zunahme der CD4+CD25--Subpopulation. Die Änderung der Verhältnisse von intrathyreoidalen aktivierten zu nicht aktivierten T-Helferzellen scheint hierbei mit der Entwicklung von M. Basedow assoziiert zu sein. Im dritten Teil der Arbeit wurden periphere und intrathyreoidale Lymphozyten von M. Basedow gegenübergestellt. Die Anzahl von intrathyreoidalen aktivierten zytotoxischen Zellen von M. Basedow mit dem Phänotyp CD3+CD8+CD25+ war erhöht im Vergleich zur Peripherie. Derselbe Vergleich wurde auch bei Struma durchgeführt. Dabei zeigten die intrathyreoidalen CD3+CD4+HLA-DR+- CD3+CD4+CD25+- CD3+CD8+CD25+- und CD3+CD8+HLA-DR+-Zellen sowie CD45+CD56+CD94--NK-Zellen höhere Werte als Periphere. Somit konnten wir zeigen, dass bei M. Basedow die Aktivierung von CD3+CD4+HLA-DR+- CD3+CD4+CD25+- und CD3+CD8+HLA-DR+-Zellen in der Schilddrüse unterdrückt ist. Dies könnte als Unterscheidungsmerkmal zwischen M. Basedow und Struma wichtig sein. Im vierten Teil der Arbeit wurden die peripheren und intrathyreoidalen Lymphozyten nach der Kultivierung mit Thyreozyten verglichen. Die Kultivierung von peripheren CD3+CD4+HLA-DR--Zellen mit Thyreozyten von Patienten mit M. Basedow bzw. Struma zeigte eine Vermehrung dieser Zellen im Vergleich zur Kultivierung ohne Thyreozyten. Die Struma-Patienten zeigten jedoch bei Kultivierung mit Thyreozyten höhere Anzahlen von intrathyreoidalen aktivierten T-Helferzellen (CD3+CD4+HLA-DR+) und zytotoxischen Zellen (CD3+CD8+HLA-DR+), als kultiviert ohne Thyreozyten. Aufgrund der Ergebnisse in diesem Teil der Arbeit kann angenommen werden, dass ein hemmender Einfluss von Thyreozyten auf intrathyreoidalen CD3+CD4+HLA-DR+- und CD3+CD8+HLA-DR+ -Zellen bei M. Basedow vorhanden ist.
Etablierung eines universellen Testsystems zur funktionellen Analyse neuer MLL-Fusionspartner
(2010)
Leukämische Erkrankungen entstehen häufig aufgrund genetischer Aberrationen. Dabei handelt es sich in den meisten Fällen um reziproke chromosomale Transloka-tionen, die an der Entstehung chimärer Fusionsgene mit intaktem Leserahmen betei-ligt sind und letztendlich zur Expression neuartiger Fusionsproteine führen. Das auf Chromosom 11 Bande q23 lokalisierte MLL-Gen (Mixed Lineage Leukemia) spielt bei einigen dieser chromosomalen Aberrationen eine wichtige Rolle. Es entstehen Fusi-onsproteine, die phänotypisch sowohl mit akuten myeloischen Leukämien (AML) als auch mit akuten lymphatischen Leukämien (ALL) assoziiert sind. Diese hämatopoie-tischen Erkrankungen werden aufgrund ihrer ungünstigen Prognose und schlechter Heilungschance als Hochrisiko-Leukämien klassifiziert. Neben Translokationen des MLL-Gens sind für die Leukämogenese noch weitere genetische Aberrationen von Bedeutung. Ebenso spielen, allerdings in geringerem Maße, Deletionen, Inversionen sowie Insertionen eine Rolle. Allen chromosomalen Translokationen sowie den übrigen chromosomalen Veränderungen geht mindestens ein DNA-Doppelstrangbruch voraus. Dieser findet sowohl beim MLL als auch beim Partnergen in sogenannten Bruchpunktsregionen statt. Inzwischen sind 104 verschiedene Veränderungen des MLL-Gens bekannt, von de-nen 64 auf molekularer Ebene charakterisiert wurden. Allein über 20 Partnergene wurden in den letzten fünf Jahren im Diagnostikzentrum DCAL (Diagnostic Center of Acute Leukemia) des Universitätsklinikums Frankfurt identifiziert. Allerdings sind bis heute noch keine universellen Ansätze zur Etablierung eines Tiermodells zur Unter-suchung neuer Partnergene bekannt. Somit ist es von großem Interesse möglichst schnell und zuverlässig dieses Ziel zu erreichen, um weitere Informationen über das onkogene Potential der beteiligten MLL-Partner zu erhalten. Als neue Kandidaten wurden im Rahmen dieser Arbeit DCPS, MAML2 sowie NRIP3 untersucht, die auf die Positivkontrolle ENL und auf die Negativkontrolle LASP1 bezogen wurden. Zunächst wurde ein universelles retrovirales Vektorsystem entwickelt, welches den MLL-N-Terminus (Exon 1 - Exon 9) trägt. Das zu untersuchende Partnergen kann durch Einklonieren der entsprechenden DNA-Sequenz in diesen Vektor eingefügt werden. Um ein authentisches Fusionsprodukt mit durchgehendem Leserahmen zu erhalten, sind die beiden Gene durch eine intronische Sequenz voneinander separiert. Die korrekte Fusion konnte auf Transkriptebene via RT-PCR nachgewiesen werden. In Vorversuchen wurden die Konstrukte MLL•DCPS, MLL•ENL (Positivkontrolle), MLL•LASP1 (Negativkontrolle), MLL•MAML2 sowie MLL•NRIP3 in murine hämato-poietische Progenitorzellen (Ba/F3 und 32D) transduziert. Die erfolgreiche Infektion konnte sowohl fluoreszenzmikroskopisch als auch auf Transkriptebene nachgewie-sen werden. Des Weiteren zeigten die Konstrukte unterschiedliche Einflüsse auf die Hox-Genexpression der Hox-Gene a5, a7, a9, a10, b3 und b4. Zur Untersuchung wachstumstransformierender und proliferierender Eigenschaften der Fusionsproteine folgten nach Abschluss der Vorversuche erste Transduktionsex-perimente mit murinen Lin-/Sca1+-hämatopoietischen Zellen. Mittels eines Methylcel-lulose-Assays sollten die transformierenden Eigenschaften der MLL-Fusionen über-prüft werden. Lediglich die Positivkontrolle wies wachstumstransformierende Eigen-schaften auf. Somit legen die bisherigen Ergebnisse die Vermutung nahe, dass noch weitere Faktoren für die Leukämogenese relevant sein müssen. Um Aussagen über das Verhalten der zu untersuchenden MLL-Fusionen in vivo tref-fen zu können, wurden retroviral infizierte, Lin-/Sca1+-aufgereinigte hämatopoietische Stammzellen in Empfängermäuse transplantiert. Bis zum jetzigen Zeitpunkt konnten bei den Mäusen noch keinerlei Symptome einer leukämischen Erkrankung diagnosti-ziert werden. Es ist abzuwarten, ob die transplantierten Mäuse in den nächsten Wo-chen leukämische Verhaltensauffälligkeiten aufweisen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erfolgreich ein Testsystem etabliert werden, das es ermöglicht, neue Partnergene in kürzester Zeit funktionell zu analysieren. So können in Zukunft hoffentlich neue Erkenntnisse zur Leukämogenese gewonnen werden, die eventuell neue Therapieansätze ermöglichen.
Verschiedene Studien konnten bereits demonstrieren, dass Versuchspersonen dazu tendieren, ihre Aufmerksamkeit eher zu Gesichtern mit bedrohlichem Ausdruck als zu solchen mit neutralem Ausdruck zu orientieren. In der vorliegenden Studie wurde mittels neurokognitiver Verhaltensexperimente versucht, diesen als „Attentional Bias“ in Millisekunden messbaren Ef-fekt zu replizieren und unter Wahrnehmungsbedingungen von unbewusst bis bewusst zu un-tersuchen. Entscheidend war hierbei, in wie weit die verschiedenen Wahrnehmungsbedingun-gen zu einem Attentional Bias unterschiedlicher Stärke oder sogar verschiedener Polarität führen, i.e. einer Hinwendung oder einer Abwendung der Aufmerksamkeit gegenüber bedrohlichen Gesichtern. Die Gegenüberstellung von bewusster und unbewusster Wahrnehmung bedrohlicher Gesichter stand hierbei im Kontext der Hypothese, dass unbewusst und bewusst wahrgenommene bedrohliche Gesichter über zwei verschiedene neuroanatomische Wege verarbeitet werden und deshalb die Orientierung der Aufmerksamkeit unterschiedlich beeinflussen. Zur Messung des Attentional Bias wurde die „Dot-Probe-Aufgabe“ verwendet. Um die verschiedenen Wahrnehmungsbedingungen zu stellen wurden dabei vier verschiedene Präsenta-tionszeiten (17, 34, 100 und 400 ms) sowie die Technik der Rückwärtsmaskierung benutzt. Da in anderen Studien häufig ein Einfluss der Ängstlichkeit von Probanden auf deren Aufmerksamkeitsorientierung dargestellt werden konnte, wurde auch eine Gruppierung der Probanden in hoch-, niedrig- und durchschnittlich ängstliche vollzogen; dies jedoch primär in dem Interesse, die Ängstlichkeit als entscheidende Einflussgröße ausschließen und möglichst allgemeingültige Aussagen machen zu können. Unter unbewusster Wahrnehmung (17 ms Präsentationszeit) zeigte sich ein signifikanter, negativer Attentional Bias von -5,46 ms (t (29) = -2,57, p = 0,02), hingegen waren die Attentional Bias-Werte bei den längeren Präsentationszeiten nicht signifikant von Null verschieden. Für die Präsentationszeit als eigener Faktor zeigte sich ein marginal signifikanter Einfluss auf den Attentional Bias (F (3, 87) = 2,20, p = 0,09). Die nach Gruppierung der Probanden in über-, unter- und durchschnittlich ängstliche erfolgte Auswertung konnte sowohl für die unter- wie auch die überdurchschnittlich ängstlichen Probanden (nicht jedoch für die durchschnittlich ängstlichen) einen Trend zu einer Abwendung der Aufmerksamkeit von bedrohlichen Gesichtern bei unbewusster Wahrnehmung zeigen. Angesichts dieses Befundes bleibt offen, wie sehr die Gesamtergebnisse gerade durch diese Gruppen geprägt worden sind. Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass unter Bedingungen unbewusster Wahrnehmung bedrohliche Gesichter zu einer Abwendung der Aufmerksamkeit (negativer Attentional Bias) führen. Dies steht im klaren Kontrast zu den Ergebnissen von Mogg und Bradley (1999a) und Fox (2002). Es wird somit in Frage gestellt, dass bedrohliche Gesichter bei unbewusster Wahrnehmung Aufmerksamkeit auf sich ziehen und nicht zu einer Abwendung dieser führen. Weiter deuten die Ergebnisse darauf hin, dass bei zunehmendem Einfluss bewusster Wahrnehmung zwischen bedrohlichen und neutralen Gesichtern kein Unterschied bezüglich ihrer Wirkung auf die Aufmerksamkeitsorientierung besteht. Verschiedene Ansätze werden hier als mögliche Erklärung eines negativen Attentional Bias bei unbewusster Wahrnehmung diskutiert. Die unterschiedliche Richtung der Aufmerksamkeitsorientierung unter bewusster im Vergleich zu unbewusster Wahrnehmung spricht für eine frühe, unbewusst erfolgende, grobe Ver-arbeitung bedrohlicher Gesichter, sowie eine später erfolgende, komplexere Verarbeitung die-ser, welche mit einer Neubewertung einhergeht. Im Kontext der bestehenden Literatur macht das Ergebnis der Studie deutlich, dass die Zusammenhänge zwischen der Orientierung unserer Aufmerksamkeit, emotionalen visuellen Eindrücken und unserem Bewusstsein noch nicht ausreichend geklärt sind. Es bedarf weiterer Forschung
Einleitung: Eine frühe Unterscheidung zwischen ischämischem Schlaganfall und intrazerebraler Blutung durch die Verwendung eines Biomarker-Tests könnte bereits in der prähospitalen Phase eine fallspezifische Akuttherapie ermöglichen. Basierend auf einzelnen Messungen in der Akutphase des Schlaganfalls konnten wir zeigen, dass ein Anstieg des sauren glialen Faserproteins (GFAP) im peripheren Blut von Patienten mit intrezerebraler Blutung wesentlich früher messbar ist als bei Patienten mit ischämischem Schlaganfall. Das Ziel der vorliegenden Studie war, das diagnostische Zeitfenster des Serum- GFAP- Spiegels zur Differenzierung zwischen intrazerebralen Blutung und ischämischen Schlaganfall zu charakterisieren. Materialien und Methoden: In diese prospektive Studie wurden 63 Schlaganfallpatienten eingeschlossen, die innerhalb von 6 Stunden nach Symptombeginn in der Klinik eintrafen. Mithilfe bildgebender Verfahren wurde bei 18 dieser Patienten eine intrazerebrale Blutung und bei 45 der Patienten ein ischämischer Schlaganfall diagnostiziert. Zu den Zeitpunkten von 1, 2, 3, 4, 6, 12, 24 und 48 Stunden nach Symptombeginn wurden den Patienten Blutproben entnommen (wenn sie zu dieser Zeit zur Verfügung standen). Im Serum dieser Proben wurde mittels eines ELISA-Tests die GFAP-Konzentration bestimmt. Ergebnisse: Innerhalb der ersten 24 Stunden nach Symptombeginn blieben die medianen GFAP-Werte im Serum der Ischämie-Patienten unterhalb der Nachweisgrenze. Die GFAP-Konzentrationen im Serum von Patienten mit intrazerebraler Blutung hingegen waren bereits im Zeitraum zwischen 2 und 6 Stunden nach Symptombeginn signifikant höher als beim ischämischen Schlaganfall. (p<0,001 für alle 4 Zeitpunkte). Unter der Verwendung der receiver operating characteristic curve Analyse lag die diagnostische Sicherheit von GFAP zur Differenzierung zwischen ischämischem und intrazerebraler Blutung bei >0,80 innerhalb des 2-6 Stunden Zeitfensters. Die GFAP-Werte von Patienten mit intrazerebraler Blutung korrelierten zum Zeitpunkt zwei Stunden nach Symptombeginn mit dem Blutungsvolumen (r=0,755, p=0,007). Zusammenfassung: In dieser Untersuchung konnte gezeigt werden, dass das Zeitfenster von 2-6 Stunden nach Symptombeginn bezüglich der Verwendung eines GFAP-Tests für die Differenzierung zwischen ischämischem Schlaganfall und intrazerebraler Blutung geeignet zu sein scheint. In der sehr frühen Phase des Schlaganfalls (etwa <2 Stunden) ist die Sensitivität des Tests zur Erkennung intrazerebraler Blutungen jedoch eher gering, was die Verwendung eines GFAP-Tests in der prähospitalen Phase limitiert.
Mikrozensus online
(2010)
Diese Arbeit untersucht, unter welchen Voraussetzungen Online-Befragungen effizient in die Datenerhebung des Mikrozensus zu implementieren sind. Zu konstatieren ist folgende Ausgangssituation: Seit nun mehr zehn Jahren gehören Online-Befragungen zu dem festen Repertoire der Umfrageforschung. Sowohl in der Markt- und Meinungsforschung, hier hat der Anteil von Online-Befragungen in Vergleich zu den etablierten Befragungsformen seit dem Jahre 2000 um rund 30 % zugenommen, als auch in der sozialwissenschaftlichen Forschung ist diese Form der Datenerhebung nicht mehr wegzudenken. Den großen Stellenwert, den Online-Befragungen mittlerweile in der Umfrageforschung erlangt haben, konnten sie bis dato in der amtlichen Statistik nicht erreichen. Zwar etablierten sich Online-Erhebungen auch hier im Rahmen des angestrebten Bürokratieabbaus, dies aber nur im Bereich der Unternehmensstatistiken. Einzig den Unternehmen stehen mit den beiden Internetportalen IDEV (Internet Datenerhebung im Verbund) und eSTATISTIK.core gegenwärtig zwei innovative Online-Meldeverfahren zur Verfügung, die im Zuge des angestrebten Bürokratieabbaus zur Entlastung der Unternehmen von ihren Aufgaben im Rahmen der amtlichen Statistik beitragen. Im Bereich der amtlichen Bevölkerungsstatistik findet diese Innovation ganz im Gegensatz zu der übrigen sozial-wissenschaftlichen Forschung wenig Anklang. Gleichwohl sind nicht nur Unternehmen, sondern auch Bürger durch die verpflichtende Teilnahme an amtlichen Statistiken in einem erheblichen Maße belastet. Zwar ist die Teilnahme bei den meisten bevölkerungsstatistischen Befragungen freiwilliger Natur, aber alleine der Befragungsumfang – ein Interview im Mikrozensus dauert beispielsweise für eine erwerbstätige Person ca. 30 Minuten – bedeutet für die betroffenen Haushalte einen beachtlichen Zeitaufwand der, wie diese Arbeit darlegt, durch Online-Befragungen spürbar zu vermindern ist. Will man die Anwendungsmöglichkeiten von Online-Befragungen für bevölkerungsstatistische Erhebungen wie den Mikrozensus sachgerecht beurteilen, ist zu berücksichtigen, dass Bevölkerungsbefragungen der amtlichen Statistik unter anderen Voraussetzungen stattfinden als nicht amtliche Befragungen. Zwar gelten für beide die gesetzlichen Datenschutzbestimmungen, die amtlichen Statistiken unterliegen aber überdies dem Legalitätsprinzip. Das Legalitätsprinzip, welches für jede durchzuführende Bundesstatistik ein eigenes Gesetz vorsieht, schafft nicht nur die rechtliche Grundlage für Bundesstatistiken, sondern reglementiert auch restriktive ihre Durchführung. Vor jeder Bundesstatistik steht somit ein Gesetz, dass den Befragtenkreis, den Berichtszeitraum, die Periodizität der Erhebung, die Erhebungsmethodik und insbesondere die Auskunftspflicht explizit anordnet. Es werden hiermit Rahmenbedingungen gesetzt, deren Erfüllung unabdingbar für den Einsatz von Online-Befragungen innerhalb der Mikrozensuserhebung sind. Außer den vorgefundenen gesetzlichen Rahmenbedingungen sind bei der Anwendung von Online-Befragungen auch die spezifischen Vorzüge und Probleme dieser Datenerhebungsmethodik zu bedenken, um diese substanziiert in einer Mikrozensuserhebung zum Einsatz bringen zu können. Als Vorteile von Online-Befragungen gelten gemeinhin die erweiterte Funktionalitäten in der Fragebogengestaltung. Diese reduzieren einerseits die oben beschriebene Belastung der Bürger bei einer Teilnahme an Befragungen, andererseits tragen sie zu einer nachhaltigen Steigerung der Datenintegrität bei. Ebenso ist mit Online-Befragungen durch den Wegfall von Interviewer- und Wegekosten eine augenfällig kosteneffizientere Erhebungsdurchführung möglich. Den beschriebenen Vorteilen stehen jedoch auch Schwächen, wie beispielsweise Stichprobenrepräsentativität oder Erreichbarkeit der Befragten gegenüber. Diese sind für eine effiziente Einbindung von Online-Befragungen in den Mikrozensus gleichwohl zu bedenken. Aufbauend auf einer ausführlichen Beschreibung der aktuellen Mikrozensuserhebung wird nach einer systematischen Darstellung der Vor- und Nachteile von Online-Befragungen ihre Umsetzung im Mikrozensus erörtert. Von großer Bedeutung für die Umsetzung Erhebung sind die bei der Durchführung entstehenden Kosten, die Stichprobengewinnung und deren Repräsentativität sowie im Falle des Mikrozensus die Einhaltung der Auskunftspflicht. Im Lauf der Arbeit wird gezeigt, dass Online-Befragungen als eigenständige Erhebungsmethodik angesichts der mangelnden Stichprobenrepräsentativität sowie des nicht flächendeckenden Internetzugangs der deutschen Bevölkerung nicht in der Lage sind, die im Mikrozensus etablierten Befragungsformen vollständig zu ersetzen. Ihr Einsatz als Ergänzung zu den beiden etablierten Erhebungsformen aber durchaus möglich und sinnvoll ist. Betrachtet man den Einsatz von Online-Befragungen im Mikrozensus unter ökonomischen Gesichtspunkten, so lassen sich im Hinblick auf die hohe Wiederverwertbarkeit von elektronischen Fragebögen in erheblichem Umfang Kosten bei der Erstellung von Erhebungsunterlagen einsparen. Auch lässt sich das Mahnverfahren, in das nicht auskunftsbereite Haushalte gelangen, sowohl zeitlich als auch personell rationeller gestalten. Für die Kontrolle der eingegangenen Erhebungsunterlagen ist angesichts der hohen Automatisierung von Online-Befragungen ein geringerer Arbeitsaufwand notwendig. Der ökonomische Aspekt bezieht sich nicht alleine auf die Durchführungskosten. Der Mikrozensus ist ein wichtiger nationaler Bestandteil der europäischen amtlichen Statistik. Wie die Arbeit nachweist verkürzt sich infolge der direkten Datenerfassung durch den Befragten und des geringeren Kontrollaufwands der erhobenen Daten die Zeit für die Datenaufbereitung. Damit ist eine schnellere Bereitstellung der Mikrozensusergebnisse für die Zwecke der nationalen und europäischen amtlichen Statistik möglich. Der Kosteneffizienz stehen naturgemäß in anderen Bereichen höhere Ausgaben gegenüber. So ist bei einer Einführung von Online-Befragungen mit Mehrausgaben in Rahmen der Hard- und Softwarebeschaffung zu rechnen. In Anbetracht der bereits vorhanden informationstechnologischen Ausstattung (Server, Laptops, IT-Fachkräfte) in den Statistischen Landesämter schlägt die Durchführung von Online-Befragungen mit einem geringen finanziellen Mehraufwand zu Buche. Auch ermöglichen Online-Befragungen, die bereits hohe Datenintegrität noch zu steigern. Neben den bereits in CAPI-Befragungen erprobten Verfahren wie Plausibilitätskontrollen oder der automatischen Filterführung, die fehlerhafte Dateneingaben vermeiden, lässt sich zur Sicherung der hohen Datenqualität das bereits seit Langem in der Dateneingabe verwandte Signierungsverfahren für die Erfassung von Beruf und Wirtschaftszweig verwenden. Übertragungsfehler, die infolge der manuellen Dateneingabe auftreten, sind damit weitgehend auszuschließen. Neben den beschriebenen ökonomischen Aspekten und dem der Datenintegrität ist es die Bürgernähe, welche eine Erweiterung des im Mikrozensus verwandten Methodenmixes um Online-Befragungen rechtfertigt. Durch das anspruchsvolle Frageprogramm, das im umfangreichen Selbstausfüllerbogen zu bearbeiten ist, sind die vom Mikrozensus betroffenen Haushalte durch ihre Teilnahme einer erheblichen zeitlichen Belastung ausgesetzt. Mit den erweiterten Funktionalitäten von Online-Fragebögen (z. B. automatische Filterführung und Signierungsverfahren) lässt sich die Bearbeitungszeit für die selbstausfüllenden Haushalte erheblich verringern. Dies wirkt sich nicht nur positiv auf die Datenqualität aus, sondern vermittelt auch ein Bild von der amtlichen Statistik als ein innovatives am Bürger orientierten Institution. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass Online-Befragungen dank der beschriebenen Vorteile eine sinnvolle Ergänzung zu den bereits etablierten Datenerhebungsverfahren im Mikrozensus bilden. Ihr Einsatz darüber hinaus auch in anderen bevölkerungsstatistischen Erhebungen sinnvoll sein kann.
Die akustische Mikroskopie stellt ein neuartiges bildgebendes Verfahren zur zerstörungsfreien Werkstoffprüfung dar, das erst seit kurzem in der Medizin eingesetzt wird und bei dem reflektierte Ultraschallwellen zur Bilderzeugung verwendet werden. Auf diese Weise können neue Informationen bezüglich der Materialparameter des untersuchten Gewebes erlangt werden. Neben einer enorm großen Bandbreite an möglichen Auflösungen bietet diese Technik die Möglichkeit, opake Objekte zu durchdringen und ihr Inneres abzubilden. Durch seine nicht-destruktive Art und die Notwendigkeit einer Kopplungsflüssigkeit bietet diese mikroskopische Methode zudem die Option lebende Zellen und Gewebe zu untersuchen. Das Ziel der durchgeführten Arbeit war es, die Interpretation von akustischen Bildern des menschlichen Gewebes zu erleichtern. Zu diesem Zweck analysierten wir SAM-Abbildungen von Knochengewebe im Vergleich zu anderen Untersuchungsverfahren. Neben einer qualitativen Bewertung der Morphologie gleichartiger Strukturen wurden ausgedehnte morphometrische Messungen und energiedispersive Röntgenanalysen durchgeführt. Als Methoden für den qualitativen Vergleich wurden konventionelle mikroskopische Techniken wie Polarisations-, Fluoreszenz-, Durchlicht-, Auflicht- und Rasterelektronenmikroskopie sowie Mikroradiographie vergleichend verwendet. Der morphometrische Vergleich erfolgte zwischen ultraschall- und auflichtmikroskopisch erzeugten Abbildungen. Weiterhin wurde die Beziehung zwischen akustischen Grauwertdarstelllungen und energiedispersiven Röntgenanalysen bewertet. Als Untersuchungsmaterial dienten Mandibulaknochen von sieben Beagle-Hunden. Die Mandibula eines jeden Hundes wurde beidseits mittels Osteoskalpell nach Sachse (Bien Air, CH-Biel) und CO2-Laser (entwickelt im Center of Advanced European Studies and Research, D-Bonn) am Margo ventralis im unbezahnten Kieferabschnitt osteotomiert. Nach einer dreiwöchigen Heilungsphase wurden die Knochen entnommen und vor der Schnittfertigung in Polymethylmethacrylat eingebettet. Beim qualitativen Vergleich der Morphologie gleichartiger Strukturen fanden sich bei SAM-Abbildungen und bei Aufnahmen, die mit den anderen mikroskopischen Techniken erzeugt wurden, weitgehende Übereinstimmungen hinsichtlich gröberer morphologischer Merkmale wie Umriss, flächiger Ausdehnung und Lage von Perforationen. Diese Gemeinsamkeiten konnten sowohl an Kallusgewebe als auch an osteonalem Knochen beobachtet werden. Unterschiede fanden sich hinsichtlich feinerer morphologischer Merkmale wie der geometrischen Übereinstimmung im Detail und der flächigen Ausdehnung bei höherer Vergrößerung. Zudem stellte sich die Binnenstruktur von Kallus und osteonalem Knochengewebe differenzierter dar als mit Hilfe der anderen mikroskopischen Techniken. Morphometrische Messungen zeigten, dass Strukturen, die im Bereich des Osteotomiespalts gemessen worden waren, im Ultraschallbild tendenziell größer abgebildet werden als in Auflichtaufnahmen. Im Gegensatz dazu wurden Strukturen im Bereich des kortikalen Knochens im ultraschallmikroskopischen Bild eher unterschätzt. Diese Ungenauigkeit bei der Abbildung von Strukturen im Ultraschallbild lässt sich am ehesten dadurch erklären, dass durch unterschiedliche Eindringtiefen des Ultraschalls auch unterschiedlich dicke Ebenen der Probe abgebildet werden. Wird eine dickere Schicht der Probe durch das akustische Mikroskop dargestellt als durch das Auflichtmikroskop, so kann es zu einer Überschätzung der Strukturen kommen und umgekehrt. Anhand energiedispersiver Röntgenanalysen konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die Zunahme des Calcium- bzw. des Phosphorgehalts nicht alleine eine Aufhellung der Grautöne im Ultraschallbild verursachen kann. Auch der Vergleich mit Abbildungen der Elektronenmikroskopie ließ Unterschiede der Grauwerte erkennen. Demzufolge wird das akustische Bild nicht nur durch den Mineralgehalt, die Dichte und die atomare Zusammensetzung des Knochengewebes beeinflusst. Damit konnte mit der vorliegenden Untersuchung nachgewiesen werden, dass die Ultraschallmikroskopie ein neuartiges Verfahren darstellt, mit dem sich Knochen nicht nur in seiner Mikrostruktur morphologisch darstellen lässt, sondern mit der sich auch neuartige Informationen über funktionelle Parameter auf Nanoebene gewinnen lassen. Die Bedeutung dieser enormen Möglichkeiten sind im Moment noch nicht abschätzbar, weitere Untersuchungen müssen folgen.
Einleitung: Seit der Entschlüsselung des menschlichen Genoms ist die Bedeutung genetischer Forschung im Bereich der Prävention und Therapie chronischer Erkrankungen, zum Beispiel des Typ-1-Diabetes, stark gestiegen. Großangelegte multizentrische Forschungsarbeiten wie die Projekte des International Type 1 Diabetes Genetics Consortium (T1DGC) arbeiten an der Aufdeckung noch unbekannter genetischer Prädispositionen zur Entwicklung eines Typ-1-Diabetes und benötigen dafür die Hilfe von Multiplex-Familien. Die Rekrutierung dieser Familien ist schwierig, da in nur 15% der Familien mit Typ-1-Diabetes mehrere Familienangehörige betroffen sind. Um die Motivation zur Studienteilnahme eines solch kleinen Kollektivs besser zu verstehen, wurde die Einstellung zu genetischer Forschung aus Teilnehmersicht untersucht. Hintergrund sind hier die bei vielen Forschern vorhandenen ethischen Bedenken hinsichtlich der psychischen Belastung bei genetischen Untersuchungen für die Teilnehmer. So besteht ein – bisher kaum untersuchter - allgemeiner Konsens, dass die Konsequenzen von Genanalysen für die Betroffenen nicht einzuschätzen sind. Somit stehen die Forscher vor dem Dilemma, welches in der Notwendigkeit, Genanalysen durchzuführen, und in der Furcht vor einer zu hohen psychischen Belastung der teilnehmenden Personen besteht. Dies hat derzeit zur Folge, dass den Teilnehmern die Ergebnismitteilung in der Regel verwehrt wird. Ergebnisse: Von 180 angeschriebenen füllten 140 Teilnehmer des T1DGC-Projektes einen Fragebogen hinsichtlich ihrer Meinung zu genetischer Forschung und ethischen Fragestellungen anonym aus: 88,6% der Teilnehmer äußerten, dass sie generell genetische Forschung als sehr wichtig ansehen. Es gaben 60% der Befragten an, dass sie nicht genügend Informationen über das Projekt erhalten hatten. 95% der Teilnehmer wünschten ein vollständiges Verständnis der wichtigsten Studiendetails. Als bevorzugte Informationswege gaben die Teilnehmer schriftliche Informationen per Post oder durch eine Internet-Website an. 83,2% der Befragten möchten über das Vorliegen einer erblichen Hochrisiko-Konstellation für das Auftreten von Komplikationen informiert werden. Im Falle des Nachweises eines Hochrisikogens für Typ-1-Diabetes möchten 87,6% darüber aufgeklärt werden. 96,4% der Teilnehmer sind generell an einer Ergebnismitteilung interessiert. Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede im Antwortverhalten in Abhängigkeit von Betroffenenstatus, Alter, Geschlecht, Staatsangehörigkeit, Familienstand sowie Schul- bzw. Berufsabschluss. Schlussfolgerung: Für die Teilnehmer genetischer Studien zum Thema Typ-1-Diabetes ist der Wunsch nach ausführlicher, individuell angepasster Information grundlegend. Es muss festgestellt werden, dass die Teilnehmer am International Type 1 Diabetes Genetics Consortium (T1DGC) sich gut betreut, doch letztlich nicht ausreichend informiert gefühlt haben. Daraus lässt sich ableiten, dass neben dem individuellen Beratungsgespräch auch schriftliche Informationen mit klar konzipierter Wissensaufbereitung in Form von Websites, Broschüren und Rundbriefen (in elektronischer und/oder gedruckter Form) empfehlenswert sind. Ein wichtiges Ergebnis ist ferner, dass die Befragten die Sorge vieler Wissenschaftler und Ärzte nicht teilen, die Mitteilung eines erhöhten Erkrankungs- bzw. Komplikationsrisikos für einen Typ-1-Diabetes würde als zusätzliche Belastung empfunden werden. Im speziellen Fall der Multiplexfamilien bestanden allerdings bereits Erfahrungen mit der untersuchten Erkrankung des Typ-1-Diabetes. Eine Mitteilung, ob nun negativ oder positiv, wird im Vergleich zum Wissen um das Risiko keineswegs als psychische Bürde, sondern vielmehr als Chance zur Einflussnahme wahrgenommen. Es muss allerdings festgehalten werden, dass die Ergebnisse dieser Untersuchung sich mit dem Typ-1-Diabetes auf eine chronische, jedoch gut therapierbare und nicht generell lebenszeitverkürzende Erkrankung beziehen. Für die Übertragbarkeit der Ergebnisse auf andere genetisch-bedingte Erkrankungen ist weitere Forschung notwendig. Der bisher bestehende Konsens, im Rahmen genetischer Studien keine Ergebnismitteilung bezüglich chronischer, unheilbarer Krankheiten durchzuführen, muss überdacht werden. Den Studienteilnehmern ist das Recht auf Selbstbestimmung ein grundlegender Wert. Diese Selbstbestimmung beinhaltet, dass das Pro und Contra einer Ergebnismitteilung selbst eingeschätzt werden kann. Möchte ein Studienteilnehmer das Ergebnis der Auswertung seiner biologischen Proben erhalten, sollte ihm dies nicht verwehrt werden.
1. Hintergrund und Ziel der Studie: Bei der Thrombolysetherapie des akuten ischämischen Schlaganfalls ist die Dosierung des Thrombolytikums strikt an das Körpergewicht des Patienten gebunden. Dies ist notwendig um die Effektivität der Therapie zu gewährleisten und um das Auftreten von Blutungskomplikationen weitestgehend zu verhindern. Aufgrund unterschiedlichster Faktoren, wie beispielsweise Einschränkungen des Bewusstseinszustands, oder aber Aphasie und Dysarthrie, sind viele potentielle Lyse-Patienten jedoch nicht in der Lage, ihr Körpergewicht dem behandelnden Arzt mitzuteilen. In vielen Fällen fehlen in der Akutsituation die Zeit, sowie die entsprechenden technischen Möglichkeiten, insbesondere bettlägerige Patienten zu wiegen. Folglich wird das Körpergewicht oftmals vom Arzt nach Augenmaß abgeschätzt, was erwiesenermaßen mit Ungenauigkeiten verbunden ist. Ziel der Studie war es, Approximationsmethoden zu entwickeln, die das Körpergewicht des Patienten anhand einfach erhältlicher anthropometrischer Maße zuverlässig zu bestimmen vermögen. 2. Methoden: Auf Grundlage anthropometrischer Daten einer bevölkerungsbasierten Population von 6.954 erwachsenen Probanden wurden, mittels linearer Regression, Approximationsformeln zur Abschätzung des Körpergewichts erstellt. Diese Formeln beinhalteten die Parameter „Körpergröße“, „Bauchumfang“ und „Hüftumfang“, sowie teilweise das Lebensalter der Person. Die verwendeten Parameter stellten allesamt unabhängige Prädiktoren des Körpergewichts dar. Die geschlechtsspezifischen Formeln wurden anschließend anhand einer unabhängigen Gruppe von 178 Patienten (90 Männer, 88 Frauen, Durchschnittsalter: 67,3 Jahre [±15,6 Jahre]) validiert. Einschlusskriterium war hierbei die Verdachtsdiagnose eines Schlaganfalls bei einer notfälligen stationären Aufnahme in die neurologischen Klinik des Klinikums der Johann-Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main im Zeitraum April bis August 2006. Unter Verwendung des Goldstandards „Wiegung“, wurde die Genauigkeit der anthropometrischen Gewichtsapproximationen mit der Genauigkeit von jeweils zwei unabhängigen visuellen Schätzungen von in der Schlaganfall-Thrombolyse erfahrenen Ärzten verglichen. Für die klinische Nutzung wurden Approximationshilfen (ein Internet-Rechner und Nomogramme) entwickelt, die den Gebrauch der anthropometrischen Approximationsformeln erleichtern sollen. 3. Ergebnisse: Unter Verwendung der anthropometrischen Approximationsformeln konnten genauere Abschätzungen des wahren Körpergewichts erzielt werden, als durch rein visuelle Schätzung. Für die einfachsten und gleichzeitig genauesten Approximationsformeln (Approximationsmodell 1) betrug die durchschnittliche absolute Abweichung vom gewogenem Körpergewicht 3,1 kg (± 2,6 kg). Die Formeln waren somit signifikant genauer als die beiden Schätzungen durch Ärzte (Schätzung 1: 6,5 kg [± 5,2 kg], Schätzung 2: 7,4 kg [± 5,7 kg]; p < 0,001 für die Genauigkeitsvergleiche zwischen der jeweiligen Schätzung und der Approximation). Die Verwendung der Approximationsformeln reduzierte den Anteil aller Schätzungen, die mehr als 10% vom wahren Körpergewicht abwichen, von 31,5% (Schätzung 1) bzw. 40,4% (Schätzung 2) auf 6,2% (Approximationsmodell 1). In lediglich einem Fall (0,6%) wich das approximierte Gewicht mehr als 20% vom wahren Körpergewicht ab, wohingegen dies in 4,6% (Schätzung 1), respektive 8,5% (Schätzung 2) der Fälle für die Schätzungen zutraf. Die Benutzung der auf den Approximationsformeln basierenden Nomogramme führte zu keiner relevanten Verschlechterung der Schätzgenauigkeit (durchschnittliche absolute Abweichung vom gewogenen Körpergewicht 3,11 kg [± 2,69 kg], Anteil der Fehlschätzungen > 10% des Körpergewichts: 7,3%). Mit einer durchschnittlichen absoluten Abweichung vom wahren Körpergewicht von 2,7 kg (± 2,4 kg) und einem Anteil von 3,4% der Gewichtsschätzungen mit einer Abweichung von mehr als 10% vom wahren Gewicht, waren lediglich die Gewichtsangaben der Patienten selbst genauer als die anthropometrischen Approximationen. Die Messung der anthropometrischen Parameter dauerte durchschnittlich 99,5 Sekunden (± 36,7 s), für die Berechnung des Körpergewichts mittels Nomogramm wurden im Durchschnitt 56,7 Sekunden (± 15,3 s) benötigt. Die Übereinstimmung der Messergebnisse zwischen verschiedenen Untersuchern war hoch (Intraclass correlation Coefficients [ICC] für Körperlänge: 0,9978 [95% Konfidenzintervall 0,9954 - 0,9991], ICC für Bauchumfang: 0,9891 [0,9771 - 0,9953], ICC für Hüftumfang: 0,9921 [0,9836 - 0,9966]). 4. Schlussfolgerung: Durch die Verwendung von Approximationsformeln, basierend auf einfach bestimmbaren anthropometrischen Messgrößen (Körperlänge, Bauch- und Hüftumfang) ist es möglich, innerhalb kurzer Zeit eine relativ genaue Abschätzung des Körpergewichts von Schlaganfallpatienten zu erhalten. In Situationen, in denen das Körpergewicht des Patienten nicht umgehend erfragbar oder durch Wiegung bestimmbar ist, kann die vorgeschlagene Approximationsmethode helfen, grobe Schätzfehler und in der Folge Dosierungsfehler bei dosiskritischen Medikamenten zu minimieren.
Die vorliegende Arbeit soll klären, in wieweit erhöhte Serumprolaktinwerte mit psychischen Auffälligkeiten korrelieren. 34 Patienten, die in dem Zeitraum von 1977 bis 1999 in der endokrinologischen Ambulanz der Universitätsklinik Frankfurt am Main, mit der Diagnose Prolaktinom, Hyperprolakteinämie und hormoninaktives Adenom behandelt wurden. beantworteten einen Fragebogen mit 18 offenen Fragen zu deren Befindlichkeit zu Beginn und im Verlauf der Behandlung.. Von diesen 34 Patienten zeigten 10 psychische Auffälligkeiten. Dabei bedeuteten 10 betroffene Patienten immerhin einen Anteil von 29,4% Nach Ausschluss von Patienten mit erhöhten Hormonparametern, Erkrankungen oder anderweitiger Medikamentation die Depressionen verursachen könnten, verblieben 8 Patienten, deren psychische Auffälligkeiten möglicherweise auf den erhöhten Serumprolaktinspiegel zurückzuführen waren. 2 leichte Depressionen, laut der ICD 10 F 31.9, traten bei einem Prolaktinwert von 377,4 ng/ml und 4,1 ng/ml auf. 3 Patienten zeigten die Symptome einer mittelschweren Depression, F 31.1, diese Fälle traten bei Serumprolaktinspiegel von 10,3, 3000 und 53 ng/ml auf. Eine Manisch-Depressive Manie trat bei 4770 ng/ml auf. Ein Fall einer Agoraphobie, ICD 10 F 140.0 konnte bei einem Serumprolaktinwert von 6,6 ng/ml beobachtet werden, währenddem eine Karzinophobie, F 40.2, bei einem Serumprolaktinwert von 105,3 diagnostiziert wurde. Psychische Auffälligkeiten traten also bereits in den Bereichen mäßig erhöhter und normaler Prolaktinspiegel auf. Unsere Ergebnisse besagen, dass zwischen psychiatrischen Auffälligkeiten und erhöhten Prolaktinwerten keine Korrelation besteht. Sie beträgt zu Anfang der Behandlung tau b = .048 p = .745, zu Ende der Behandlung wurde tau b =.101, p = .484 gefunden. Der Durchschnitt der während der Behandlung gemessenen Prolaktinwerten korreliert mit dem Auftreten von psychischen Auffälligkeiten mit tau b = .073, p = .620. Auch die Differenz der Prolaktinwerte zwischen Anfang und Ende der Behandlung korreliert nicht mit dem Auftreten psychischer Auffälligkeiten. Tau b beträgt .050, p= .731 Die bei der Patientin S.M. beobachtete Koinzidenz von hohen Serumprolaktinspiegel und psychischen Auffälligkeiten, die den Anstoß zu dieser Untersuchung gegeben hatte, ließ sich nicht auf die gesamte Stichprobe im Sinne eines statistischen Zusammenhanges generalisieren. Die Hypothese, dass eine enge Korrelation zwischen psychischen Auffälligkeiten und einem hohen Prolaktinspiegel besteht, kann anhand der vorliegenden Daten nicht aufrechterhalten werden.
Development of a computational method for reaction-driven de novo design of druglike compounds
(2010)
A new method for computer-based de novo design of drug candidate structures is proposed. DOGS (Design of Genuine Structures) features a ligand-based strategy to suggest new molecular structures. The quality of designed compounds is assessed by a graph kernel method measuring the distance of designed molecules to a known reference ligand. Two graph representations of molecules (molecular graph and reduced graph) are implemented to feature different levels of abstraction from the molecular structure. A fully deterministic construction procedure explicitly designed to facilitate synthesizability of proposed structures is realized: DOGS uses readily available synthesis building blocks and established reaction schemes to assemble new molecules. This approach enables the software to propose not only the final compounds, but also to give suggestions for synthesis routes to generate them at the bench. The set of synthesis schemes comprises about 83 chemical reactions. Special focus was put on ring closure reactions forming drug-like substructures. The library of building blocks consists of about 25,000 readily available synthesis building blocks. DOGS builds up new structures in a stepwise process. Each virtual synthesis step adds a fragment to the growing molecule until a stop criterion (upper threshold for molecular mass or number of synthesis steps) is fulfilled. In a theoretical evaluation, a set of ~1,800 molecules proposed by DOGS is analyzed for critical properties of de novo designed compounds. The software is able to suggest drug-like molecules (79% violate less than two of Lipinski’s ‘rule of five’). In addition, a trained classifier for drug-likeness assigns a score >0.8 to 51% of the designed molecules (with 1.0 being the top score). In addition, most of the DOGS molecules are deemed to be synthesizable by a retro-synthesis descriptor (77% of molecules score in the top 10% of the decriptor’s value range). Calculated logP(o/w) values of constructed molecules resemble a unimodal distribution centred close to the mean of logP(o/w) values calculated for the reference compounds. A structural analysis of selected designs reveals that DOGS is capable of constructing molecules reflecting the overall topological arrangement of pharmacophoric features found in the reference ligands. At the same time, the DOGS designs represent innovative compounds being structurally distinct from the references. Synthesis routes for these examples are short and seem feasible in most cases. Some reaction steps might need modification by using protecting groups to avoid unwanted side reactions. Plausible bioisosters for known privileged fragments addressing the S1 pocket of trypsin were proposed by DOGS in a case study. Three of them can be found in known trypsin inhibitors as S1-adressing side chains. The software was also tested in two prospective case studies to design bioactive compounds. DOGS was applied to design ligands for human gamma-secretase and human histamine receptor subtype 4 (hH4R). Two selected designs for gamma-secretase were readily synthesizable as suggested by the software in one-step reactions. Both compounds represent inverse modulators of the target molecule. In a second case study, a ligand candidate selected for hH4R was synthesized exactly following the three-step synthesis plan suggested by DOGS. This compound showed low activity on the target structure. The concept of DOGS is able to deliver synthesizable and bioactive compounds. Suggested synthesis plans of selected compounds were readily pursuable. DOGS can therefore serve as a valuable idea generator for the design of new pharmacological active compounds.
Biodegradation and elimination of industrial wastewater in the context of whole effluent assessment
(2010)
The focus of this thesis is on the assessment of the degradability of indirectly discharged wastewater in municipal treatment plants and on assessing indirectly discharged effluents by coupling the Zahn-Wellens test with effect-based bioassays. With this approach persistent toxicity of an indirectly discharged effluent can be detected and attributed to the respective emission source. In the first study 8 wastewater samples from different industrial sectors were analysed according to the “Whole-Effluent Assessment“ (WEA) approach developed by OSPAR. In another study this concept has been applied with 20 wastewater samples each from paper manufacturing and metal surface treating industry. In the first study generally low to moderate ecotoxic effects of wastewater samples have been determined. One textile wastewater sample was mutagenic in the Ames test and genotoxic in the umu test. The source of these effects could not be identified. After treatment in the Zahn-Wellens test the mutagenicity in the Ames test was eliminated completely while in the umu test genotoxicity could still be observed. Another wastewater sample from chemical industry was mutagenic in the Ames test. The mutagenicity with this wastewater sample was investigated by additional chemical analysis and backtracking. A nitro-aromatic compound (2-methoxy-4-nitroaniline) used for batchwise azo dye synthesis and its transformation products are the probable cause for the mutagenic effects analysed. Testing the mother liquor from dye production confirmed that this partial wastewater stream was mutagenic in the Ames test. The wasteweater samples from paper manufacturing industry of the second study were not toxic or genotoxic in the acute Daphnia test, fish egg test and umu test. In the luminescent bacteria test, moderate toxicity was observed. Wastewater of four paper mills demonstrated elevated or high algae toxicity, which was in line with the results of the Lemna test, which mostly was less sensitive than the algae test. The colouration of the wastewater samples in the visible band did not correlate with algae toxicity and thus is not considered as its primary origin. The algae toxicity in wastewater of the respective paper factory could also not be explained with the thermomechanically produced groundwood pulp (TMP) partial stream. Presumably other raw materials such as biocides might be the source of algae toxicity. In the algae test, often flat dose–response relationships and growth promotion at higher dilution factors have been observed, indicating that several effects are overlapping. The wastewater samples from the printed circuit board and electroplating industries (all indirectly discharged) were biologically pre-treated for 7 days in the Zahn–Wellens test before ecotoxicity testing. Thus, persistent toxicity could be discriminated from non-persistent toxicity caused, e.g. by ammonium or readily biodegradable compounds. With respect to the metal concentrations, all samples were not heavily polluted. The maximum conductivity of the samples was 43,700 micro S cm -1 and indicates that salts might contribute to the overall toxicity. Half of the wastewater samples proved to be biologically well treatable in the Zahn–Wellens test with COD elimination above 80%, whilst the others were insufficiently biodegraded (COD elimination 28–74%). After the pre-treatment in the Zahn–Wellens test, wastewater samples from four companies were extremely ecotoxic especially to algae. Three wastewater samples were genotoxic in the umu test. Applying the rules for salt correction to the test results following the German Wastewater Ordinance, only a small part of toxicity could be attributed to salts. In one factory, the origin of ecotoxicity has been attributed to the organosulphide dimethyldithiocarbamate (DMDTC) used as a water treatment chemical for metal precipitation. The assumption, based on rough calculation of input of the organosulphide into the wastewater, was confirmed in practice by testing its ecotoxicity at the corresponding dilution ratio after pre-treatment in the Zahn–Wellens test. The results show that bioassays are a suitable tool for assessing the ecotoxicological relevance of these complex organic mixtures. The combination of the Zahn–Wellens test followed by the performance of ecotoxicity tests turned out to be a cost-efficient suitable instrument for the evaluation of indirect dischargers and considers the requirements of the IPPC Directive.
Behaviorale und neuronale Effekte eines Emotionserkennungstrainings bei Autismus-Spektrum-Störungen
(2010)
Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Wirksamkeit eines computerbasierten Emotionserkennungstrainings bei Personen mit Autismus-Spektrum-Störungen (ASS) zu überprüfen. Dies geschieht durch den Vergleich einer mit dem Frankfurter Training des Erkennens von fazialem Affekt (FEFA) trainierten und einer nicht trainierten Personengruppe mit ASS. Das FEFA ist das einzige deutschsprachige Emotionserkennungstraining, das mit dem Ziel entwickelt wurde, die Erkennung von Basisemotionen in Gesichtsausdrücken bei autistischen Menschen zu verbessern. Da ASS mit deutlichen, nicht ursächlich behandelbaren Beeinträchtigungen in der sozialen Interaktion und Kommunikation einhergehen, bieten übende Verfahren eine Möglichkeit, soziale Fertigkeiten aufzubauen und die Symptomatik abzumildern. Das Erkennen emotionaler Zustände anderer Personen stellt eine relevante Basisfähigkeit für angemessenes sozial-kommunikatives Verhalten dar. Autistischen Personen gelingt die Emotionserkennung oft nicht und es gibt Hinweise, dass sie emotionale Gesichtsausdrücke neuronal anders verarbeiten als nicht autistische Menschen. Daher werden in dieser Studie neben Testverfahren zur Emotionserkennung funktionelle Bildgebungsverfahren (fMRT) eingesetzt, um neuronale Aktivierungsmuster mitzuerfassen. Die Studie gliedert sich in zwei Teile. Im ersten Teil wird ein Querschnittsvergleich durchgeführt, bei dem die Emotionserkennungsfertigkeiten durchschnittlich begabter Personen mit ASS (n=40) sowie deren neuronale Aktivierungsmuster bei der Wahrnehmung emotionaler, fazialer Reize mit denen einer, nach Alter und nonverbaler Intelligenz parallelisierten, unauffälligen Kontrollgruppe (n=26) verglichen werden. Diese Vergleiche zeigen, dass der ASS-Gruppe in den verwendeten Emotionserkennungstests deutlich weniger korrekte Zuordnungen gelingen als der unauffälligen Kontrollgruppe. Darüber hinaus weist die ASS-Gruppe auch in einem Gesichtererkennungstest und einem Wortschatztest gegenüber den unauffälligen Kontrollen Beeinträchtigungen auf. In fMRT-Aufgaben zur impliziten Emotionserkennung ist bei den unauffälligen Kontrollen eine Mehraktivierung in neuronalen Arealen, die mit sozial-emotionaler Reizverarbeitung in Zusammenhang stehen, feststellbar, und zwar im fusiformen Gyrus, der Amygdala und auch im dorsalen lateralen präfrontalen Kortex. Bei Aufgaben zur expliziten Emotionserkennung und der Wahrnehmung neutraler Gesichter bestehen keine Unterschiede in den neuronalen Aktivierungen zwischen den Gruppen in den interessierenden Regionen (Regions of Interest). Der zweite Teil der Studie umfasst die Trainingsevaluation. Hierzu wird das FEFA-Training mit 15 autistischen Personen in acht Einzelstunden innerhalb eines Zeitraums von fünf bis sechs Wochen durchgeführt. Die parallelisierte ASS-Kontrollgruppe besteht ebenfalls aus 15 Personen, die keine Intervention erhalten. Die vor dem Training (bzw. der Wartezeit) erfassten Emotionserkennungsfähigkeiten und neuronalen Aktivierungsmuster werden mit den unmittelbar nach dem Training (bzw. der Wartezeit) erhobenen verglichen. Zudem werden zu einem dritten Messzeitpunkt, etwa vier Wochen nach Beendigung des Trainings, die Testleistungen der beiden ASS-Gruppen einander erneut gegenüber gestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass die trainierte ASS-Gruppe in allen verwendeten Tests zur Erkennung von Basisemotionen deutliche, stabile Verbesserungen erreicht, die mit einer Mehraktivierung im fusiformen Gyrus und der Amygdala bei Aufgaben zur impliziten Emotionserkennung einhergehen. Keine Verbesserungen werden bei der Erkennung komplexer emotionaler und mentaler Zustände sowie in der, von den Eltern eingeschätzten, affektiven Reaktivität im Alltag erzielt. In einem visuellen Gedächtnistest und einem Konzentrationstest, die zur Kontrolle der Spezifität des Trainings zu allen Messzeitpunkten angewendet werden, sind keine Verbesserungen in der trainierten ASS-Gruppe feststellbar. Somit kann davon ausgegangen werden, dass keine emotionsunspezifischen Fertigkeiten trainiert wurden. Das FEFA-Training wird von den Teilnehmern hinsichtlich des Ablaufs und des subjektiv erlebten Behandlungserfolges als überwiegend positiv bewertet. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass die Anwendung des FEFA-Trainings über einen relativ kurzen Zeitraum bei autistischen Personen mit normativer Intelligenz die Emotionserkennungsleistung verbessert, allerdings sind darüber hinaus weitere Interventionen erforderlich, um einen Transfer in den Alltag zu ermöglichen.
Die kongenitale HCMV-Infektion ist der wichtigste Auslöser geistiger Retardierung viraler Genese und ist für die meisten neurosensorischen Hörstörungen nicht genetischen Ursprunges verantwortlich. Die Entwicklung neuer Strategien zur Prävention der HCMV-Infektion bei Neugeborenen ist also von höchster Dringlichkeit. Die Einführung von universellen Screeningprogrammen bei Neugeborenen könnte die frühzeitige Erkennung einer Infektion und somit einen frühen therapeutischen Einsatz ermöglichen. Um dies in die Praxis umsetzen zu können, wird jedoch eine Vereinfachung der Probengewinnung und die Entwicklung einer schnellen und sensitiven Nachweismethode benötigt. Die Anwendbarkeit von verschiedenen im Handel für DNA-Analysen angebotenen Filterpapieren zur Sammlung von Urinproben für die HCMV-Diagnostik mittels PCR wurde untersucht und mit Referenzmethoden verglichen. Es wurden zwei mit Reagenzien behandelten Papiere, das Indicating FTA® Classic Card (Ind FTA Filterpapier) und das FTA® Elute (FTA Elute Filterpapier) und ein unbeschichtetes Papier, das 903® Specimen Collection Paper (903-Filterpapier) eingesetzt. Insgesamt waren alle Papiere leicht einzusetzen, gut verträglich und die Gewinnung von Proben gestaltete sich problemlos. Dilutionsreihen aus Zellkulturüberstand aus einer mit dem HCMV-Laborstamm AD169 infizierten Fibroblastenkultur wurden zur Sensitivitätsbestimmung der Methode eingesetzt. Während bei der Anwendung der Indicating FTA® Classic Cards die Nachweisgrenze der Methode bei 4.000 Kopien/ml lag, wurden beim FTA® Elute- und 903® Specimen Collection-Paper noch Proben mit 400 Kopien/ml erfasst. Ferner wurden 70 klinische Proben mittels Ind. FTA-Papier getestet und 10 mittels FTA Elute- und 903-Filterpapier. Die Sensitivität der Methode betrug im Vergleich zum "Shell Vial Assay" 43,2% beim Einsatz des Ind. FTA-, 60% beim 903- und 70% beim FTA Elute-Filterpapiers. Im Vergleich zur PCR aus mit Qiagen isoliertem Urin erreichte die Methode eine Sensitivität von jeweils 58,3% mit Ind. FTA-, 50% mit dem 903-, und 83,3% mit FTA Elute-Filterpapier. Eine Korrelation zwischen Viruslast in der Filterpapier-Probe und in der mit Qiagen isolierten Urinprobe bestand nur beim FTA Elute Filterpapier. Der Nachweis von HCMV-DNA aus auf FTA Elute-Filterpapier getrockneten Urinproben scheint ein vielversprechender Ansatz in der HCMV-Diagnostik zu sein. Um diese Methode für epidemiologische und/oder diagnostische Zwecke empfehlen zu können, müssten noch umfangreichere klinische Studien durchgeführt werden.
Das Ziel dieser Arbeit war es, eine neuartige, drei-dimensionale Messmethode (BodyScan) zur Körperoberflächenbestimmung an Neugeborenen zu evaluieren. Die exakte Bestimmung der Oberfläche ist, besonders in der Pädiatrie, von großer Bedeutung für die Beurteilung physiologischer Parameter und der Dosierung von Medikamenten bzw. Infusionstherapien. Bestimmungen der Körperoberfläche mit 3D-Scannern liegen zwar für Erwachsene in zahlreichen Studien vor, jedoch wurden Neugeborene aus technischen Gründen bislang nicht untersucht, da ihre komplette Oberfläche in einem Scan nicht dargestellt werden kann. Das verwendete Messgerät „BodyScan“ der Firma 3D-Shape GmbH, Erlangen, arbeitete mit einer Messmethode, die es ermöglichte eine kontaktfreie, schonende, drei-dimensionale Vermessung der Körperoberfläche vorzunehmen (Streifenprojektionstechnologie). Die Neugeborenen konnten nur in liegender Position vermessen werden. Mit Hilfe einer Spiegelkonstruktion war es möglich drei Körperseiten des Neugeborenen im gescannten Bild zu erfassen. Diese gescannte Fläche wurde mit einem Korrekturfaktor zur gesamten Körperoberfläche extrapoliert. Dazu wurde der BodyScan vor Beginn der Studie mit einem artifiziellen Objekt (Messpuppe) kalibriert. Die genaue Oberfläche der Messpuppe war zuvor von einem ähnlichen genormten Gerät (BodyScan3DShape) auf 1632,24 cm², als Zähler des Korrekturfaktors bestimmt worden. Danach fanden 20 Messungen der Puppe mit dem Studien-Scanner statt. Es konnte gezeigt werden, dass der BodyScan die Körperoberfläche der Messpuppe mit einen Fehler von unter 0,1 % genau bestimmen konnte. Die ermittelte mittlere Oberfläche war der Nenner des so erhobenen Korrekturfaktors für unseren BodyScan, der schließlich 1,9787 betrug. Danach wurden 209 gesunde Neugeborenen, geboren in der Universitätsklinik Frankfurt am Main, untersucht. Sie wurden mit dem BodyScan in Bauch- und Rückenlage abgebildet, und die Körperoberfläche wurde zu beiden Ansichtsmodi computerunterstützt ermittelt. Die Ergebnisse des BodyScan wurden mit herkömmlichen, als empirischer Standard betrachteten Methoden, und zwar aus der Literatur bekannten Formeln nach DU BOIS & DU BOIS (1916), nach BOYD (1935), nach HAYCOCK ET AL. (1978), nach MEBAN (1983), und nach MOSTELLER (1987) verglichen. Zwei Neugeborene wurden außerdem mit der Geometrischen Methode untersucht, dazu wurden verschiedene Strecken und Umfänge einzelner Körperteile vermessen und deren Oberfläche mittels mathematischer Formeln bestimmt. Zudem wurde auch ein Subkollektiv von 25 Neugeborenen aus dem Gesamtkollektiv hinsichtlich der Ergebnisse der Körperoberflächenbestimmung mit dem BodyScan und den Formeln gesondert betrachtet. Dieses Subkollektiv setzte sich aus Neugeborenen zusammen, welche unter optimalen Bedingungen abgebildet wurden und von welchen qualitativ „sehr gute“ Aufnahmen erstellt wurden. Die durchschnittliche Körperoberfläche eines unter optimalen Bedingungen vermessenen Neugeborenen betrug mit dem BodyScan 2163,66 cm². Der Vergleich mit den fünf Formeln zur Oberflächenberechnung zeigte zwar geringfügige Abweichungen , aber dennoch gute Übereinstimmung der Ergebnisse unter den optimalen Studienbedingungen [besonders mit den Formeln nach DU BOIS & DU BOIS (1916), HAYCOCK ET AL. (1978), MEBAN (1983) , und MOSTELLER (1987)]. Die durchschnittliche Abweichung des BodyScans von den Formeln lag hier bei 2,55%. Als weiteres Ergebnis erhielten wir gute Übereinstimmungen für die Körperlängenbestimmung durch den BodyScan sowohl im Vergleich zu den Messungen der Hebammen als auch zu denen des Infantometers. Er betrug weniger als 0,1 % Fehler bei der Messpuppe und 2,8 % bei den Neugeborenen. Abschließend kann die Körperoberflächenmessung an Neugeborenen mit dem BodyScan als valide Methode bezeichnet werden. Sie setzt jedoch eine exakte Einstellung des Probanden in der Apparatur voraus. Weitere Untersuchungen sollten an kranken Neugeborenen und Frühgeborenen stattfinden, da die Methode wenig belastend und durch die Verwendung von weißem Licht unschädlich ist.
Zielsetzung: Die Evaluation der transarteriellen Chemoembolisation (TACE) bei nicht resektablen primären (CCC) und sekundären (Lebermetastasen verschiedener Primärtumoren) Lebermalignomen anhand des lokalen Tumoransprechens, des klinischen Ansprechens und der Überlebensdaten. Material und Methodik: Im Zeitraum vom 1999 bis 2009 wurden in unserem Tumorzentrum 898 Patienten mit CCC und Lebermetastasen mittels TACE behandelt. Die behandelten Tumorentitäten waren im Einzelnen das cholangiozelluläre Karzinom (CCC) (n=46; 5,1%) sowie Lebermetastasen des: kolorektalen Karzinoms (CRC) (n=463; 51,7%), Mammakarzinoms (n=208; 23,2%), Aderhautmelanoms (n=33; 3,7%), Nierenzellkarzinoms (n=22; 2,5%), neuroendokrinen Karzinoms (NET) (n=48; 5,4%), Magenkarzinoms (n=25; 2,8%), Ovarialkarzinoms (n=30; 3,3%) und nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinoms (NSCLC) (n=21; 2,3%). Als Zytostatika wurden Mitomycin C (8 mg/m²), Gemcitabine (1000 mg/m²), Irinotecan (150 mg/m²) und Cisplatin (60 mg/m²) verwendet. Als Embolisat wurden Lipiodol und Microsphären (EmboCept®) verwendet. Mindestens drei TACE Sitzungen pro Patient wurden in vierwöchigen Abständen ambulant durchgeführt. Das radiologische Tumoransprechen wurde mittels Magnetresonanztomographie (MRT) und/oder Computertomographie (CT) bestimmt und nach den RECIST-Kriterien klassifiziert. Das klinische Ansprechen wurde im Verlauf der Behandlung in neoadjuvant, palliativ und symptomatisch eingeteilt. Die Überlebensdaten wurden nach der Kaplan-Meier-Methode berechnet. Ergebnisse: Die Mindestzahl der durchgeführten TACE war drei. Bei 46 Patienten mit CCC wurden bei 11% PR, bei 60,7% SD und bei 28,3% PD bei einer medianen Überlebenszeit von 14,5 Monaten dokumentiert. 2,2% der Patienten wurden neoadjuvant, 73,9% palliativ und 23,9% symptomatisch behandelt. Bei 463 Patienten mit Lebermetastasen des CRC wurden bei 14,7% PR, bei 48,2% SD und bei 37,1% PD dokumentiert. Die mediane Überlebenszeit lag bei 14 Monaten. 12,9% der Patienten wurden neoadjuvant, 72,4% palliativ und 14,7% symptomatisch behandelt. Bei 208 Patienten mit Lebermetastasen des Mammakarzinoms wurden bei 13% PR, bei 50,5% SD und bei 36,5% PD bei einer medianen Überlebenszeit von 18,5 Monaten dokumentiert. Die Patienten wurden zu 18,75% neoadjuvant, zu 15,38% symptomatisch und zu 65,87% palliativ behandelt. Bei Patienten mit Lebermetastasen des Aderhautmelanoms wurden bei 15,2% PR, bei 42,4% SD und bei 42,4% PD dokumentiert. Die mediane Überlebenszeit betrug 18 Monate. Die klinische Situation war zu 3% neoadjuvant, zu 24,2% symptomatisch und zu 72,8% palliativ. Bei Patienten mit Lebermetastasen des Nierenzellkarzinoms wurden bei 13,7% PR, bei 59% SD und bei 27,3% PD bei einer medianen Überlebenszeit von 6,6 Monaten dokumentiert. Die klinische Situation war zu 81,8% palliativ und zu 18,2% symptomatisch. Bei Patienten mit Lebermetastasen des NET wurden bei 18,8% PR, bei 52,1% SD und bei 29,1% PD dokumentiert. 81,2% der Patienten wurden palliativ und 18,8% symptomatisch behandelt. Patienten mit Lebermetastasen des Magenkarzinoms hatten eine mediane Überlebenszeit von 10,5 Monaten. SD wurde bei 60% und PD bei 40% dokumentiert. 76% der Patienten wurden palliativ und 24% symptomatisch behandelt. Bei den Patientinnen mit Lebermetastasen des Ovarialkarzinoms wurden bei 20% PR, bei 26,7% SD und bei 53,3% PD dokumentiert. Die mediane Überlebenszeit betrug 23,7 Monate bei folgendem klinischen Ansprechen: 13,3% symptomatisch und 86,7% palliativ. Für Patienten mit Lebermetastasen des NSCLC wurden bei 14,3% PR, bei 47,6% SD und bei 38,1% PD bei medianer Überlebenszeit von 11,7 Monaten dokumentiert. Die Patienten wurden wie folgend behandelt: 81% palliativ und 19% symptomatisch. Schlussfolgerung: TACE bei primären (CCC) und sekundären (Lebermetastasen verschiedener Primärtumoren) Lebermalignome stellt ein gut verträgliches, minimal invasives, lokoregionales Verfahren dar, das zu einem guten Tumoransprechen, Lebensverlängerung sowie Verminderung der Symptomatik führt.
Reziproke chromosomale Translokationen sind häufig mit Leukämien assoziiert und gelten in den meisten Fällen als Erkrankungsursache. Das MLL-Gen auf der Chromosomenbande q23 des Chromosoms 11 ist an einer Vielzahl chromosomaler Translokationen beteiligt, und die dadurch erzeugten reziproken MLL-Fusionsgene sind ausschließlich mit Hochrisikoleukämien assoziiert. Die häufigste Aberration ist eine reziproke Translokation zwischen den beiden Genen MLL und AF4 (4q21), die t(4;11)-Translokation, die in ca. 80% aller Akuten Lymphatischen Leukämien bei Kleinkindern, aber auch bei älteren Patienten mit einer Sekundärleukämie, auftritt. Die leukämischen Blasten dieser Patienten sind meist gegen konventionelle Therapien resistent, so dass t(4;11) Leukämien mit einer ungewöhnlich schlechten Prognose verbunden sind. Welches der beiden Fusionsproteine, MLL-AF4 oder AF4-MLL, die bei der t(4;11)-Translokation entstehen für die Entstehung der Leukämie verantwortlich ist, wird noch kontrovers diskutiert. Bisherige Publikationen zeigen die Onkogenität beider Fusionsproteine, und ihr Potential, Leukämien im Mausmodell hervorzurufen. Frühere Studien dieser Arbeitsgruppe zeigen die onkogene Wirkung des AF4-MLL Fusionsproteins, dessen Expression zur Wachstumstransformation von murinen Zellen und einer Akuten Lymphatischen Leukämie in der Maus führt. Die onkogene Wirkung von AF4-MLL entsteht, sobald das Fusionsprotein nach seiner Prozessierung durch die Endopeptidase Taspase1 heterodimerisiert und dadurch vor SIAH-vermitteltem proteasomalen Abbau geschützt wird. So kann sich das heterodimerisierte Protein - anders als das AF4-Wildtyp Protein - in den Zellen anhäufen und zu unkontrolliertem Wachstum führen. Um die Heterodimerisierung des AF4-MLL Fusionsproteins kompetitiv zu inhibieren, wurden im Rahmen dieser Arbeit kleine Fragmente aus der C-terminalen Interaktionsdomäne FYRC von MLL exprimiert. Dazu wurde die Interaktion kleiner Peptide aus der FYRC-Domäne mit dem N-terminalen Fragment des AF4-MLL Proteins mithilfe eines Biosensorsystems und Co-Immunopräzipitationen getestet. Anschließend wurden die kleinsten Peptide, die noch an das N-terminale Fragment binden können (B1 und B3), ausgewählt, und zusammen mit AF4-MLL co-exprimiert. Mithilfe von Western Blot-Analysen von gereinigtem AF4-MLL·N konnte gezeigt werden, dass die Expression dieser Peptide dazu führt, dass das C-terminale Fragment nicht mehr an das N-terminale Fragment binden kann. Durch diese Inhibition der Heterodimerisierung kann der AF4-MLL Multiproteinkomplex nicht vollständig aufgebaut werden, da auch die C-terminalen Komplexpartner WDR5 und RBBP5 nur noch eingeschränkt binden können. Zusätzlich wurde die Stabilität der prozessierten Fragmente AF4-MLL·N und MLL·C im Falle einer Inhibition der Dimerisierung untersucht. Offensichtlich sind beide Fragmente nur stabil, wenn sie miteinander heterodimerisiert sind. Eine Blockierung der Interaktion durch kompetitive Peptide führt dazu, dass sowohl AF4-MLL·N als auch MLL·C proteasomal degradiert werden. Da auch das MLL-Wildtyp Protein über die Interaktionsdomänen FYRN und FYRC heterodimerisiert, wurde zusätzlich der Effekt der Expression der Peptide auf die Viabilität von MLL-exprimierenden Zellen untersucht. Dazu wurden die Peptide B1 und B3 in sechs unterschiedlichen Zelllinen, von denen zwei die t(4;11)-Translokation tragen, exprimiert. Anschließend wurde nach einer PI-Färbung der Anteil apoptotischer Zellen mithilfe eines Durchflusszytometers ermittelt. Die vorliegenden Daten deuten darauf hin, dass keines der beiden Peptide einen starken Einfluss auf Zelllinien hat, die das Wildtyp-MLL Gen besitzen. Die Apoptose der vier untersuchten Zelllinien war kaum erhöht, wenn diese Peptide exprimiert wurden. Interessanterweise scheint das Peptid B1 dagegen einen Apoptosefördernden Effekt auf diejenigen Zellen zu haben, die das AF4-MLL Protein exprimieren. Basierend auf den vorliegenden Daten kann die Aussage getroffen werden, dass es prinzipiell möglich ist, das AF4-MLL Fusionsprotein spezifisch anzugreifen. Eine Blockierung der Heterodimerisierung blockiert die Ausbildung des onkogenen AF4-MLL Multiproteinkomplexes. Dies führt zudem dazu, dass die beiden Taspase1-prozessierten Fragmente AF4-MLL·N und MLL·C proteasomal degradiert werden. Die Inhibition der Heterodimerisierung von AF4-MLL ist mit einer leicht erhöhten Apoptoserate in t(4;11)-positiven Zellen verbunden. Diese Beobachtung könnte in Zukunft von Bedeutung sein, wenn über neue Therapieansätze bei t(4;11) Leukämien nachgedacht werden sollte.
In der vorliegenden Arbeit wurden 494 endodontisch behandelte Zähne aus der studentischen Ausbildung des Zentrums der Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde der Universität Frankfurt am Main retrospektiv ausgewertet und eine Langzeitprognose erhoben. Die Überlebenszeit der Zähne wurde bezüglich des Einflusses der Behandlungsparameter auf die Prognose analysiert. Die Auswahl der Patientenfälle erfolgte nach dem Zufallsprinzip. Jede begonnene Wurzelkanalbehandlung kam unabhängig von der Ausgangssituation zur Auswertung, sofern ein vorgegebenes standardisiertes Behandlungsprotokoll zur Anwendung kam. Im Unterschied zu vielen Studien wurde die Extraktion als Misserfolg gewertet und als finales Ereignis definiert. Vom Patientenpool in dieser Arbeit wurden die Parameter Alter, Geschlecht, behandelter Zahn, radiologische und klinische Ausgangssituation, Ausgangsbefunde und Diagnose, Kofferdamverwendung, Sitzungen, provisorische Füllungen, Stiftinsertion und prothetische Versorgungen erfasst und der Überlebensanalyse nach Kaplan-Meier zugeführt. Die Irrtumswahrscheinlichkeit wurde mit dem Log-Rang-Test ermittelt und ausgewertet. Bei 449 Patienten wurde die Wurzelkanalbehandlung nach vorgegebener standardisierter Therapie mit manueller Aufbereitung und lateraler Kondensation unter Verwendung des Sealers AH Plus® oder AH 26® (Dentsply DeTrey, Konstanz) durch unterschiedliche Behandler abgeschlossen. In 55 Fällen wurde eine Revisionsbehandlung durchgeführt. 45 Zähne wurden aus unterschiedlichen Gründen vor Beendigung der Therapie extrahiert. Diese Gruppe wurde mit den übrigen Zähnen bezüglich der Parameter der Therapie verglichen, um Gründe für die vorzeitige Zahnentfernung offen zulegen. Der Nachuntersuchungszeitraum umfasste bis zu 21 Jahren. Die Recall-Rate erreichte 58,1% bei einer Nachkontrollzeit von 5 Jahren und 25,6% bei 10 Jahren und liegt damit auf hohem Niveau. Die durchschnittliche Überlebenswahrscheinlichkeit der Zähne lag bei 76% nach 5 Jahren und 44% nach 20 Jahren. Statistisch signifikant mehr Extraktionen vor Beendigung der Wurzelkanalbehandlung fanden sich bei Molaren, bei Perkussionsempfindlichkeit vor Trepanation, bei symptomatischen Zähnen mit LEO, bei Therapie ohne Kofferdamverwendung, bei mehr als 10 Sitzungen mit anschließendem provisorischem Verschluss sowie bei Frauen. Hinsichtlich der Unterschiede in der Überlebenserwartung erwiesen sich nur die Parameter Altersstruktur und Stift- beziehungsweise Einzelkronenversorgung als signifikant. Die Zähne in der Gruppe der 41 bis 60-Jährigen zeigten eine deutlich bessere Überlebenswahrscheinlichkeit als die Zähne der Patientengruppe der 61 bis 80-Jährigen. Mit Einzelkrone versorgte Zähne zeigten einen signifikant besseren Langzeiterfolg unabhängig von einer Versorgung mit Wurzelkanalstift. Alle übrigen ausgewerteten Parameter des Ausgangszustandes, der Wurzelkanalbehandlung sowie die Diagnose der einzelnen Zähne waren hinsichtlich des Unterschiedes der Überlebenswahrscheinlichkeit nicht signifikant. Diese Studie ermittelte die Überlebenswahrscheinlichkeit von endodontisch behandelten Zähnen aus der studentischen Ausbildung. Für die angewandte Standardtherapie wurde eine Erfolgsangabe ermittelt, welche zukünftige Vergleiche mit Therapiealternativen zulässt. Die Ergebnisse dieser Studie ermitteln die postendodontische Versorgung als den wesentlichen Parameter für den Langzeiterfolg wurzelkanalbehandelter Zähne. Auf diesem Gebiet sollte deshalb weiter Forschung betrieben werden.
Purpose of the Study: The purpose of the current study was to evaluate the role of radiofrequency (RF) and microwave (MW) ablation in the treatment of pulmonary neoplasms. Materials and Methods: From March 2004 to January 2009, 164 patients (92 males, 72 females; mean age 59.7 years, SD: 10.2) underwent computed tomography (CT)-guided percutaneous RFA of pulmonary malignancies. RFA was performed on 248 lung lesions (20 primary lesions and 228 metastatic lesions) in 248 sessions (one lesion per session). Tumors were pathologically proven and were classified as primary lung neoplasms in 20 patients (non-small cell lung cancer) and as metastatic lung neoplasms in 144 patients. RFA was performed using: a) CelonProSurge bipolar internally cooled applicator b) RITA®StarburstTMXL. From December 2007 to October 2009, 80 patients (30 males, 50 females; mean age 59.7 years, range: 48-68, SD: 6.4) underwent computed tomography (CT) guided percutaneous MW ablation of pulmonary metastases from variable histopathological primaries. MW was performed on 130 lung lesions in 130 sessions (one lesion per session) using Valleylab TM system. Results: The overall success rate of RFA was 67.7% (168/248 lesions), with overall failure rate either due to tumor residue or recurrence on follow up in 32.3% (80/248) with mean time to tumor progress was 5.6 months SD: 2.99 (Range:1-18 months). Complete successful ablation was achieved in patients treated by MWA in 73.1% (95/130 lesions), with failure rate either due to tumor residue or recurrence on follow up in 26.9% (35/130) with mean time to tumor progress 6 months SD: 2.83 (Range:1-12months). Correlation of the histopathological type of the lesion and the end result of ablation therapy revealed insignificant correlation in both RFA and MWA (p > 0.1). The preablation tumor size was one of the most significant factors that determined the end result of ablation. In RFA successful tumor ablation was significant statistically for lesions with maximal axial diameter up to 2.5 cm (110/140) in comparison to lesions of more than 2.5 cm in maximal axial diameter (58/108) (Fisher’s exact test: p < 0.0001). While in MW ablated lesions successful tumor ablation was significant statistically for lesions with maximal axial diameter up to 3 cm (90/110) in comparison to lesions of more than 3 cm in maximal axial diameter (5/20) (Fisher’s exact test: p < 0.001). The location of the lesion was another important factor that determined the end result of ablation. In both RFA and MWA successful ablation was significantly more correlated to peripheral lesions (RFA: 120/160, 80% / MWA: 80/100, 80%) than centrally located lesions (RFA: 48/88, 50%; MWA: 15/30, 50%) (Fisher’s Exact Test: p > 0.001). For successfully RFA ablated cases mean preablation tumor volumes 1.9 cc SD: 0.9 (range: 0.3 - 4.25 cc) while for failed cases the mean tumor volume was 3.7 SD: 2.4 (range: 0.8 – 6.8cc). For successfully MW ablated cases the mean preablation tumor volume: 2.4 cc SD: 2.2 (range: 0.25-8.2 cc) while for failed cases the mean tumor volume was 3.5 SD: 2.6 (range: 0.3 – 7.1 cc). In RFA the survival rates at 12, 24 and 36 months were 90%, 78% and 68% respectively while in MWA treated patients the survival rate within 12 months follow up period was 96% while at 20 month the survival rate was 77%. Complications associated with the ablation therapy were: a) procedure related mortality: 0.4% (1/248) in RFA due to massive pulmonary hemorrhage versus 0% (0/130) in MWA, b) pneumothorax: 11.3% (28/240) in RFA versus 8.5% (11/130) in MWA, c) pulmonary Hemorrhage: 17.7% (44 of 248 sessions) of which one patient had massive uncontrolled bleeding and immediate death versus 6.2% (8/130) in MWA, d) pleural effusion: 3.2 % (8 of 248 sessions) in RFA versus 3.8 % (6/130) in MWA, e) hemoptysis: 4% (10/248) in RFA versus 4.6% (6/130) in MWA ranging from mild tinged sputum to frank bleeding, f) infection: 0.4% (1/248) in RFA, versus 0% in MWA, and g) post ablation pain: 10% (25/248) in RFA versus 9.2% (12/130) in MWA. Pain was generally adequately controlled by analgesics. Conclusion: Radiofrequency and microwave ablation are effective minimally invasive tools and may be safely applied for management of lung malignancy. The success of ablation therapy is significantly correlated to the preablation tumor size, volume and tumor location.
G-protein coupled receptors (GPCRs) are the key players in signal perception and transduction and one of the currently most important class of drug targets. An example of high pharmacological relevance is the human endothelin (ET) system comprising two rhodopsin-like GPCRs, the endothelin A (ETA) and the endothelin B (ETB) receptor. Both receptors are major modulators in cardiovascular regulation and show striking diversities in biological responses affecting vasoconstriction and blood pressure regulation as well as many other physiological processes. Numerous disorders are associated with ET dysfunction and ET antagonism is considered an efficient treatment of diseases like heart failure, hypertension, diabetes, artherosclerosis and even cancer. This study exemplifies strategies and approaches for the preparative scale synthesis of GPCRs in individual cell-free (CF) systems based on E. coli, a newly emerging and promising technique for the production of even very difficult membrane proteins. The preparation of high quality samples in sufficient amounts is still a major bottleneck for the structural determination of the ET receptors. Heterologous overexpression has been a challenge now for decades but extensive studies with conventional cell-based systems had only limited success. A central milestone of this study was the development of efficient preparative scale expression protocols of the ETA receptor in qualities sufficient for structural analysis by using individual CF systems. Newly designed optimization strategies, the implementation of a variety of CF expression modes and the development of specific quality control assays finally resulted in the production of several milligrams of ETA receptor per one millilitre of reaction mixture. The versatility of CF expression was extensively used to modulate GPCR sample quality by modification of the solubilization environment with detergents and lipids in a variety of combinations at different stages of the production process. Downstream processing procedures of CF synthesized GPCRs were systematically optimized and sample properties were analysed with respect to homogeneity, protein stability and receptor ligand binding competence. Evaluation was accomplished by an array of complementary and specifically modified techniques. Depending on its hydrophobic environment, CF production of the ETA receptor resulted in non-aggregated, monodisperse forms with sufficient long-term stability and high degrees of secondary structure thermostability. The obtained results document the CF production of the ETA receptor in two different modes as an example of a class A GPCR in ligand-binding competent and non-aggregated form in quantities sufficient for structural approaches. The presented strategy could serve as basic guideline for the production of related receptors in similar systems.
Während der vergangenen Jahrzehnte stieg die durchschnittliche Lebenserwartung der Bevölkerung in den westlichen Industrieländern durch die Verbesserung der allgemeinen Lebensbedingungen, insbesondere durch die Fortschritte in der Hygiene und der Medizin sowie stabile politische Verhältnisse, kontinuierlich an. Aufgrund dieser demographischen Entwicklung zu einer zunehmend älter werdenden Gesellschaft nimmt auch das Auftreten von progressiven, altersabhängigen Erkrankungen, wie zum Beispiel der Parkinson‟schen Krankheit zu. Dieser Trend stellt sowohl für die betroffenen Patienten und ihre Angehörigen als auch für die Gesundheits- und Sozialsysteme eine gewaltige und kostenintensive Herausforderung dar. Um wirkungsvolle Therapien entwickeln zu können, die früh im Krankheitsverlauf eingreifen und die Manifestation der Erkrankung verhindern oder verzögern beziehungs-weise die darauf abzielen, die Symptome der Erkrankung nach deren Manifestation zu lindern, ist es unerlässlich, die diesen progressiven, altersabhängigen Krankheiten zugrundeliegenden Mechanismen zu erforschen und entsprechende krankheitsspezifische, molekulare Biomarker zu identifizieren. Darüber hinaus stellt die Identifizierung solcher Biomarker einen wichtigen Ansatzpunkt für die klinische Diagnostik und Therapeutik sowie für die Entwicklung neuer therapeutischer Behandlungsstrategien dar. Das subzellulär vorwiegend präsynaptisch lokalisierte Protein alpha-Synuklein blieb in den Jahren nach seiner Erstbeschreibung 1988 durch Luc Maroteaux von der biomedizinischen Forschung weitgehend unbeachtet. Erst die Assoziationen von unterschiedlichen Mutationen des alpha-Synuklein-Gens mit seltenen, autosomal-dominant vererbten, monogenetischen Varianten der Parkinson‟schen Krankheit (PARK1 und PARK4) seit 1997 sowie die Identifizierung des Proteins im Jahre 1998 als Hauptbestandteil von intrazellulären Proteinaggregaten (Lewy-Körpern und Lewy-Neuriten), deren Vorkommen charakteristisch für progressive, neurodegenerative und unter dem Sammelbegriff „Synukleinopathien“ klassifizierte Erkrankungen (wie beispielsweise auch die häufigen, sporadischen Formen der Parkinson‟schen Krankheit) ist, ließen das alpha-Synuklein in den Fokus der biomedizinischen Forschung rücken. Trotz intensiver Bemühungen der weltweiten Forschungsgemeinschaft konnten seitdem in den vergangenen 13 Jahren die physiologischen Funktionen von alpha-Synuklein und die den unterschiedlichen Synukleinopathien zugrundeliegenden, molekularen pathophysiologischen Mechanismen nicht genau identifiziert werden. Stattdessen führte die intensive Forschung an alpha-Synuklein mit den unterschiedlichsten experimentellen Herangehensweisen und Modellsystemen zu verschiedenen und teilweise kontroversen Hypothesen und Theorien über dessen physiologische Funktion und pathophysiologische Wirkungsweisen. Die in dieser Dissertationschrift dargestellten experimentellen Untersuchungen wurden an zwei speziellen transgenen Mausmodellen durchgeführt, die entweder einen vollständigen Mangel (= „knockout“; KO) des alpha-Synuklein-Proteins oder eine transgene Überexpression von humanem, A53T-mutierten alpha-Synuklein aufwiesen. Das Hauptziel der dargestellten Studien war es, neue Erkenntnisse hinsichtlich der physiologischen Funktionen des alpha-Synuklein-Proteins, beziehungsweise der krankheits-relevanten, pathophysiologischen Mechanismen der den familiären PARK1- und PARK4-Varianten der Parkinson‟schen Krankheit zugrundeliegenden alpha-Synuklein-Mutationen (Substitution von Alanin durch Threonin an Position 53 der Aminosäuresequenz (A53T; PARK1) sowie Überexpression (Genduplikation/-triplikation; PARK4)) zu gewinnen...
Lichtgesteuerte Channelrhodopsine (ChR) haben im letzten Jahrzehnt neue Wege zur Untersuchung neurophysiologischer Zusammenhänge eröffnet. Die ersten grundlegenden Charakterisierungen von Channelrhodpsin-1 und Channelrhodopsin-2 (ChR-1 und ChR-2) zeigten bereits die hohe Selektivität dieser Ionenkanäle für Protonen gegenüber monovalenten und divalenten Kationen und veranschaulichten die Dominanz der einwärtsgerichteten gegenüber den auswärtsgerichteten Kationenströmen durch die Kanalpore (Einwärtsgleichrichtung) (Nagel et al., 2002; Nagel et al., 2003). Nach Expression von Channelrhodopsin können erregbare Zellen mit einem Ruhepotential von -60 mV durch Licht depolarisiert und Aktionspotentiale (AP’s) ausgelöst werden (Boyden et al., 2005; Li et al., 2005; Nagel et al., 2005b). Aufgrund der Einwärtsgleichrichtung von ChR nehmen die lichtaktivierten Ströme mit zunehmender Depolarisation ab, sodass die vollständige Ausbildung des AP’s nicht gestört wird. Dadurch wird ChR zu einem optimalen optogenetischen Werkzeug. Dennoch ist die Einwärtsgleichrichtung bisher wenig detailliert charakterisiert. Auch die zugrunde liegenden Mechanismen sind nicht genau bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte anhand von Patch-Clamp Messungen gezeigt werden, dass zwei Mechanismen die Rektifizierung des Kanalstroms durch ChR-2 hervorrufen: eine Spannungsabhängigkeit der Einzelkanalleitfähigkeit und eine Spannungsabhängigkeit der Offenwahrscheinlichkeit. Die Spannungsabhängigkeit der Einzelkanalleitfähigkeit ist von der Art der geleiteten Ionen abhängig und konnte experimentell über die Unterschiede der stationären IV-Kurve für H+ und Na+ bei symmetrischen Ionenkonzentrationen bewiesen werden. Des Weiteren wurden die Resultate für unterschiedliche Ionenbedingungen anhand eines Ionenbindungsmodells mit einem „3-Barrieren 2-Bindungsstellen“ Profil für die Kanalpore simuliert. Die Spannungsabhängigkeit der Offenwahrscheinlichkeit ist an eine Lichtadaption des ChR-2 Proteins gekoppelt. Diese Lichtadaption konnte mithilfe von repetitiven Messungen, d.h. Strommessungen mit mehrfachen kurzen Lichtblitzen (10 ns), gezeigt werden. Da die Lichtadaption wie auch die Kanalkinetik stark vom pH abhängig sind, ist anzunehmen, dass mechanistisch wichtige De- und Reprotonierungsreaktionen mit diesen Prozessen einhergehen. Ferner konnte über die Untersuchung der elektrophysiologischen Eigenschaften der ChR-2 Mutante E90A eine Region im Protein identifiziert werden, die höchstwahrscheinlich am Protonentransport durch die Kanalpore beteiligt ist. Die Mutante E90A wies eine verringerte Protonenleitfähigkeit und eine natriumabhängige Blockierung der lichtaktivierten Ströme bei niedrigem extrazellulären pH auf. Doppelbelichtungsexperimente mit gelbem oder kurzwelligem blauen Licht ergaben außerdem neue Hinweise auf die Identität einiger Intermediate des Photozyklus. Die vorgestellten Ergebnisse weisen darauf hin, dass die bisher beschriebene „lichtadaptierte“ Form, die als P480 Intermediat bezeichnet wird, eher einem P520 Intermediat entspricht. Außerdem konnte im Rahmen dieser Arbeit eine funktionelle Beteiligung des Intermediats P390, in dem die Schiff Base deprotoniert ist, am Photostrom von ChR-2 im Wildtyp-Protein gezeigt werden. Diese Beteiligung ist bisher nur für ChR-2 Mutanten bekannt (Bamann et al., 2010). Neben der Untersuchung der Kanaleigenschaften von ChR-2 wurde in dieser Arbeit auch der Frage nachgegangen, ob an den Photozyklus von ChR-2 eine vektorielle Protonenverschiebung über der Membran gekoppelt ist. Mithilfe der BLM-Technik und Patch-Clamp Messungen an elektrofusionierten HEK-293 Zellen (Zimmermann et al., 2006) konnte gezeigt werden, dass auch ohne elektrochemische Triebkraft lichtaktivierte Ströme (Pumpströme) zu beobachten sind, die einer vektoriellen Protonenverschiebung von 0,2 - 0,4 Ladungen pro Photozyklus entsprechen. Die Doppelbelichtungsexperimente und der vektorielle Protonentransport geben einen Einblick in den Zusammenhang zwischen Photozyklus und den funktionalen Zuständen des Kanals. Die Ergebnisse zeigen das komplexe Geflecht zwischen Spannungsabhängigkeit, der Kinetik und den offenen Zuständen und wurden in einem Modell zusammengefasst. Weiterhin wurde in dieser Arbeit eine stabile Zelllinie für die Expression von ChR-1 etabliert, die eine genauere Charakterisierung dieses Proteins möglich macht. Es konnte gezeigt werden, dass ChR-1 ebenso wie ChR-2 eine Kationenleitfähigkeit besitzt. Aus zeitaufgelösten Messungen wurde außerdem ermittelt, dass ChR-1 gegenüber ChR-2 eine verkürzte Zykluszeit besitzt. Die verkürzte Zykluszeit von ChR-1, die zu kleineren Gesamtstromamplituden im Vergleich zu ChR-2 führt und die vergleichsweise geringere Expression, v.a. in transienten Expressionssystemen, limitiert dessen neurophysiologische Anwendung. Zusammenfassend stellt die vorliegende Dissertation eine detaillierte biophysikalische Charakterisierung von Channelrhodopsinen dar, die neue Erkenntnisse über die mechanistische Kopplung der Kanalfunktion an den Photozyklus hervorbringt. Zudem kann sie eine Grundlage für die gezielte Suche nach Channelrhodopsin Mutanten bieten, deren Kinetik oder analeigenschaften für die neurophysiologische Anwendung optimiert sind.
Die kontrastmittelverstärkte MRT hat in den letzten Jahren als Bildgebungsmethode in der abdominellen Diagnostik eine zunehmende Bedeutung in der klinischen Patientenversorgung gewonnen. Neben der Entwicklung neuer Geräte mit schnellen Untersuchungssequenzen in Atemstillstand, hat auch der Einsatz von MRT-Kontrastmitteln entscheidend dazu beigetragen. Mit der Entwicklung neuer Kontrastmittel - höher konzentriert – stellt sich die Frage, ob und wie sich diese von den Standardkontrastmitteln hinsichtlich der Kontrastierung von Organparenchym, Organläsion und Gefäßen unterscheiden. Diese Studie konzentrierte sich auf mögliche Unterschiede zwischen dem neuen höher konzentrierten Kontrastmittel Gadobutrol und dem Standardkontrastmittel Gd-DTPA im Hinblick auf die Charakterisierung von Nierenläsionen. Gadobutrol 1,0 M (Gadovist®, Schering AG, Deutschland), ein hochmolares Gd-Chelat, hat im Vergleich zu herkömmlichem niedermolaren Gd-DTPA (Magnevist®, Bayer Schering Pharma, Deutschland) einen größeren Effekt auf die Verkürzung der T1-Relaxationszeit bei geringerer Osmolalität und Viskosität. Die höhere Konzentration ermöglicht eine Reduktion des Kontrastmittelvolumens und damit einen kompakteren Bolus. Ziel dieser Studie war die Evaluierung des höher konzentrierten Gadobutrols (1,0 molar) im Vergleich zum niedermolekularen Standardkontrastmittel Gd-DTPA (0,5 molar) in der MRT-Nierendiagnostik hinsichtlich der Differenzierung von Nierenläsionen. Außerdem sollen die erzielten Ergebnisse genutzt werden, um die klinischen Anwendungsmöglichkeiten von Gadobutrol erweitern zu können. Die Ergebnisse der vorliegenden interindividuellen Phase-III-Studie basieren auf der MRT-Untersuchung und Auswertung von 30 Patienten mit verschiedenen Nierenläsionen (benigne und maligne) vor und nach Applikation von Gadobutrol 1,0 M bzw. Gd-DTPA 0,5 M. Die Wahl des Kontrastmittels erfolgte nach einer randomisierten Zuordnung. Hierbei erhielten 15 Patienten Gadobutrol 1,0 M und 15 Patienten Gd-DTPA 0,5 M. Die MRT-Befunde wurden mit einem definierten Goldstandard korreliert. Die Applikation beider Kontrastmittel erfolgte nach der automatisierten Bolusmethode, damit eine dynamische Bildgebung ermöglicht werden konnte. Dabei konnte für beide KM eine gute Verträglichkeit evaluiert werden. Die Ergebnisse dieser Studie haben gezeigt, dass bezüglich der Kontrastierung des Nierenparenchyms signifikante Unterschiede zwischen den untersuchten Gadolinium-Chelaten bestehen. Hierbei zeigte sich in der T1-gewichteten Gadobutrol-verstärkten Dynamik während der nephrographischen Phase eine stärkere Anreicherung in Nierenrinde und Nierenmark mit einem langsameren Übertritt des Kontrastmittels ins Nierenbeckenkelchsystem im Vergleich zur Gd-DTPA-verstärkten Bildgebung. Die stärkere Kontrastierung des Nierenmarks während dieser wichtigen Phase ermöglichte eine bessere Abgrenzung und Sichtbarkeit der Nierenläsionen zum umliegenden Gewebe. Die Nierenläsionen zeigten Unterschiede in der Kontrastmittelaufnahme, mit einem Trend für höhere Werte für die Gadobutrol-Gruppe. Gleiche Resultate ergaben sich für die Gefäßkontrastierung. Hier zeigte Gadobutrol-verstärkte Bildgebung keine wesentliche Erhöhung des arteriellen und venösen Gefäßsignals gegenüber dem Standardkontrastmittel Gd-DTPA. Unter Verwendung beider Kontrastmittel konnte eine gute Bildqualität erzielt werden. Jedoch erzielte dabei das höher konzentrierte Gadobutrol höhere Werte im Vergleich zu dem Standardkontrastmittel Gd-DTPA. Ferner zeigte sich für den Gadobutrol-Kontrast eine verbesserte Abgrenzbarkeit der Nierenläsionen. Bezüglich der diagnostischen Sicherheit in der Differenzierung der Nierenläsionen ließ sich zwischen den beiden Kontrastmitteln kein wesentlicher Unterschied feststellen. Die Ergebnisse dieser Studie weisen darauf hin, dass Gadobutrol 1,0 M als höher konzentriertes MR-Kontrastmittel ein gut geeignetes Kontrastmittel zur Detektion und Differenzierung von Nierenläsionen ist. Es kann ebenso wie das bis jetzt verwendete niedermolare Kontrastmittel Gd-DTPA 0,5 M bei der Abklärung von Nierenpathologien mittels MRT eingesetzt werden.
In der vorliegenden Arbeit soll die selektive Wirkung der Nukleosidanaloga Fludarabin und Cytarabin auf maligne Zellen überprüft werden. Dazu wird die Sensibilität unterschiedlicher Zellen gegenüber den beiden Zytostatika mittels Durchflußzytometrie bestimmt. Außerdem wird als pharmakokinetischer Parameter die intrazelluläre Konzentration des jeweiligen aktiven Metaboliten, F-Ara-ATP und Ara-CTP mit Hilfe der Hochdruckflüssigkeitschromatographie ermittelt. Als Vertreter der gesunden Zellen werden Lymphozyten gesunder Spender sowie in einem einmaligen Versuch hochaufgereinigte CD34+-Stammzellen untersucht. Stellvertretend für maligne Zellen werden die Experimente an Zellen der T-lymphoiden Zelllinie Molt4 und der erythroleukämischen Zelllinie K562 durchgeführt. Anhand der pharmakokinetischen Untersuchungen kann eine höhere Bildung an aktivem Triphosphat in malignen Zellen gegenüber gesunden Lymphozyten sowohl für Fludarabin- als auch für Cytarabininkubation nachgewiesen werden. Stammzellen scheinen eine Stellung zwischen den malignen Zellen und den Lymphozyten einzunehmen. Letztere Ergebnisse bleiben zu verifizieren. Untersuchungen der Sensibilität der malignen Zellen gegenüber Fludarabin und Cytarabin mit Hilfe der Durchflußzytometrie ergeben jeweils eine erhöhte Zytotoxizität gegenüber Molt4-Zellen, nicht jedoch gegenüber K562-Zellen im Vergleich zu gesunden Lymphozyten. Während die pharmakokinetischen Ergebnisse eine erhöhte Sensibilität für maligne Zellen gegenüber Fludarabin und Cytarabin aufgrund höherer intrazellulärer Triphosphatspiegel suggerieren, zeigen die durchflußzytometrischen Messungen, dass sich allein auf dieser Basis keine Aussage über die Sensibilität der Zellen gegenüber dem jeweiligen Zytostatikum machen lässt. Eine selektive Wirkung von Nukleosidanaloga auf maligne Zellen lässt sich anhand der gewonnenen Daten vermuten, aber nicht beweisen. Hierzu sind weitere Untersuchungen unerlässlich.
In der vorliegenden Studie wurde die Erfolgsrate der intrauterinen Insemination im Hinblick auf die andrologischen Parameter analysiert. Der praktische Teil dieser Arbeit bestand darin, einen Fragebogen mit allen interessierenden Merkmalen zu erstellen. Anschließend wurden die Patientendaten aller im Jahre 2003 mittels intrauteriner Insemination in der Frauenklinik der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main behandelter Paare, anhand des erstellten Fragebogens erfasst. Die zusammengetragenen Daten wurden in einer Excel-Datentabelle ausgewertet und anschließend anhand des Chi-Quadrat-Vierfeldertests auf ihre statistische Signifikanz hin überprüft. Das Nichtschwangerenkollektiv, welches sich aus 197 Paaren zusammensetzte, wurde mit dem Schwangerenkollektiv, bestehend aus 35 Paaren, verglichen. Insgesamt wurden 475 Behandlungszyklen durchgeführt. Es kam insgesamt zu 36 Schwangerschaften (2 Schwangerschaften davon bei einem Paar nach Abort in der ersten Schwangerschaft), woraus eine Schwangerschaftsrate von 15,5 % resultiert und eine Wahrscheinlichkeit einer Schwangerschaft pro Behandlungszyklus 7,6 % errechnet wurde. Als die wichtigsten prognostischen Faktoren haben sich folgende Parameter herausgestellt. Erstens die Anzahl an schnell progressiven Spermien im Ejakulat. Es sollten mindestens 1 Million sein, sind weniger als 1 Millionen schnell progressiver Spermien vorhanden, kann mittels intrauteriner Insemination zwar eine Schwangerschaft erzielt werden, jedoch ist die Erfolgsaussicht deutlich geringer. Zweitens der Grad der Teratozoospermie. Eine moderate Teratozoospermie zeigte ein gutes Outcome bei der intrauterinen Insemination, wohingegen bei Paaren mit einer schweren Teratozoospermie die intrauterine Insemination kritisch betrachtet werden muss. In dieser Studie lag die Grenze bei 6 % Normalformen. Paaren mit mindestens 6 % Normalformen im Ejakulat kann zu einer intrauterinen Insemination geraten werden. Somit lässt sich zusammenfassend aus dieser Studie schlussfolgern, dass die intrauterine Insemination als eine im Vergleich zur IVF und ICSI relativ gering invasive und kostengünstige Methode bei moderater andrologischer Sterilität immer noch als Behandlung der ersten Wahl in Betracht kommt. Bei einer schweren männlichen Sterilität sollte die Indikation strenger gestellt werden und Alternativmethoden, wie z. B. die ICSI, als primäre Behandlungsoption zum Einsatz kommen.
Einleitung: Die allgemeine Häufigkeit der Hernien liegt bei 2 bis 4% der Bevölkerung, wobei etwa 75% Leistenhernien sind. Ziel dieser Studie war die Beschreibung der Morbidität nach standardisierter modifizierter Operation nach Lichtenstein mit Verwendung eines selbsthaftenden Netzes. Der Vergleich dieses Kollektivs mit Daten aus der Literatur, in welchen zur Behandlung einer Leistenhernie die herkömmliche Technik nach Lichtenstein angewandt wurde, stellte das sekundäre Studienziel dar. Material und Methoden: Ein von Juli 2007 bis Dezember 2007 therapiertes Patientengut aus 100 Männern und 11 Frauen des Herz-Jesu-Krankenhauses in Fulda wurde detailliert retrospektiv aufgearbeitet und mit den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen verglichen. Die Patienten wurden einmal nach sechs sowie ein weiteres Mal nach 12 Monaten einbestellt, untersucht und mittels standardisiertem Fragebogen zu ihrem postoperativen Verlauf befragt. Die Altersgrenzen zum Zeitpunkt der operativen Versorgung lagen bei 20 und 91 Jahren, der Altersmedian betrug 59. Die Operation nach Lichtenstein ist eines der bevorzugten Verfahren in der Leistenhernienchirurgie. Ergebnisse: Intraoperativ wurde bei 88 Patienten (79,3 %) der Nervus genitofemoralis geschont, bei 23 Patienten (20,7 %) wurde er durchtrennt. Die postoperativen Komplikationen wurden im eigenen Kollektiv unterteilt nach perioperativen (in den ersten 7 Tagen postoperativ), frühen (7. bis 28. Tag postoperativ) und späten Komplikationen (28. Tag bis 12. Monat postoperativ) erfasst. Nur bei einem Patienten kam es auf Grund eines behandlungspflichtigen Hämatoms zu einer unmittelbaren Komplikation. Kein Patient beklagte eine frühe Komplikation, jedoch kam es bei fünf Patienten zu späten Komplikationen. Vier Patienten klagten über ein Rezidiv. Die Diagnose Nervenkompressionssyndrom wurde bei insgesamt drei Patienten gestellt. Die Verbindung zu einer Durchtrennung des Nervus genitofemoralis konnte bei einem Patienten hergestellt werden. Der Median der Operationsdauer lag bei 35 Minuten. Durchschnitt (Mittelwert) betrug die Krankenhausverweildauer 2,2 Tage. Kein Patient verstarb im postoperativen Verlauf. Schlussfolgerung: Die in dieser Arbeit beschriebene modifizierte Lichtenstein-Technik ist eine Innovation der Hernienchirurgie. Der Einsatz eines teilresorbierbaren und selbstfixierenden Zweikomponenten-Maschengewebe aus monofilem Polypropylen und Polylaktatsäure stellt eine kleine Revolution der operativen Versorgung von Leistenhernien dar. Die ersten Ergebnisse zeigen im Vergleich mit Literaturangaben, dass insgesamt mit einer ähnlichen perioperativen Komplikationsrate zu rechnen ist. Momentan liegen erst Einjahreszahlen vor, daher muss auf eine abschließende Beurteilung, vor allem der postoperativen Schmerzsymptomatik sowie Rezidivrate, zum jetzigen Zeitpunkt verzichtet werden. Erfreulich ist das Fehlen von intraoperativen Komplikationen im eigenen Krankengut. Auch erscheint eine deutliche Reduktion der Operationsdauer bei mit der Technik vertrauten Operateuren möglich zu sein. Eine statistisch signifikante Reduktion der Rezidivhäufigkeit nach Lichtenstein-Eingriff konnte durch die neue Technik noch nicht beobachtet werden. Zur Zeit sind die in der Literatur beschriebenen Rezidivraten noch auf einem ähnlichen Niveau. Abschließend zeigt die Beurteilung der selbst erhobenen Daten und ihr Vergleich mit den angeführten Studien, dass der Einsatz eines selbsthaftenden Netzes bedenkenlos als Alternative zur Fixierung mittels Fibrinkleber, Naht- oder Klammermaterial empfohlen werden kann.
Patienten, die sich einer Bypassoperation am offenen Herzen unterziehen erleiden häufig kognitive Beeinträchtigungen durch Mikroembolien, insbesondere ausgelöst durch Luft. Ins Operationsfeld eingeleitetes Kohlendioxid soll durch seine physikalischen Eigenschaften protektiv auf die kognitiven Funktionen wirken. In die Studie waren 69 Patienten eingeschlossen, die sich jeweils einer aortokoronaren Bypassoperation unter Einsatz der Herz-Lungen-Maschine unterzogen. Es erfolgte randomisiert die Einteilung in eine Kontrollgruppe und eine protegierte Gruppe. Am ersten präoperativen und am fünften postoperativen Tag wurde jeweils eine Testbatterie aus sechs verschiedenen Einzeltest mit den Patienten durchgeführt. Als neurokognitives Defizit wurde eine Verschlechterung der Ergebnisse um mindestens 20% im Vergleich zu den präoperativen Werten in zwei oder mehr Einzeltests definiert. Intraoperativ wurde durch einen Zweikanal-Ultraschall-Mikroblasendetektor, der in den Kreislauf der Herz-Lungen-Maschine eingeschaltet war, ein Monitoring von Größe und Anzahl der entstehenden Gasblasen durchgeführt. Die Gruppen wiesen bezüglich der klinischen Parameter keine signifikant unterschiedlichen Werte auf. Der einzig signifikante Unterschied in den gemessenen Werten der Mikrobubbles ist eine Reduktion der Gasblasen zwischen Kanal I und Kanal II in beiden Gruppen. Dies beweist das Vorhandensein und die Funktionsfähigkeit des arteriellen Filters. Jedoch lässt sich ein Trend zur Verringerung von Blasenanzahl und Blasenvolumen unter Verwendung von CO2 erkennen. Die neurokognitiven Tests konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen ausmachen. Somit war kein signifikanter Vorteil für die aortokoronare Bypassoperation unter Protektion durch CO2 auszumachen. Der Neuroscore als Instrument zur Objektivierung eines neurokognitiven Defizits ist diskussionsbedürftig. Da Studien, z. B. im Bereich der minimalinvasiven Chirurgie, den Vorteil von CO2 belegen ist die Anwendung zur Protektion weiter zu empfehlen Jedoch fehlt der endgültige Beweis für den Benefit speziell bei der aortokoronaren Bypassoperation.
In this work we study compact stars, i.e. neutron stars, as cosmic laboratories for the nuclear matter. With a mass of around 1 - 3 solar masses and a radius of around 10km, compact stars are very dense and, besides nucleons, can contain exotic matter such as hyperons or quark matter. The KaoS collaboration studied nuclear matter for densities up to 2-3 times saturation density by analysing kaon multiplicities from Au+Au and C+C collisions. The results show that nuclear matter in the corresponding density region is very compressible, with a compressibility of <200MeV. For such soft nuclear equations of state the maximum masses of neutron stars are ca. 1.8 - 1.9 solar masses, whereas the central densities are higher than 5 times nuclear saturation density and therefore point towards a possible phase transition to quark matter. If quark matter would be present in the interior of neutron stars, so-called hybrid stars, it could be produced already during their birth in supernova explosions. To study this we implement a quark matter phase transition in a hadronic equation of state which is used in supernova simulations. Supernova simulations of low and intermediate mass progenitors and two different bag constants show a collapse of the proto neutron star due to the softening of the equations of state in the quark-hadron mixed phase. The stiffening of the equation of state for pure quark matter halts the collapse and leads to the production of a second shock wave. The second shock wave is energetic enough to lead to an explosion of the star and produces a neutrino burst when passing the neutrinospheres. Furthermore, first studies of the longtime cooling of hybrid stars show, that colour superconductivity can significantly influence the cooling behaviour of hybrid stars, if all quarks form Cooper Pairs. For the so-called CSL phase (colour-spin locking) with pairing energies of several MeV, the cooling of the quark phase is suppressed and the hybrid star appears as a pure hadronic star.
Primäre Hirntumore des Zentralen Nervensystems (gehen aus Nervenzellen, Gliazellen, Hirnhäute (Meningen) und auch Hirngefäße aus. Das anaplastische Astrozytom, Oligodendrogliom und Oligoastrozytom (WHO-Grad III) und auch die bösartigste Form, das Glioblastoma multiforme (WHO-Grad IV) bilden den wesentlichen Anteil der astrozytären Tumoren. Bedingt durch die ungünstige Prognose für Patienten mit Glioblastomen bedarf es einer Optimierung der therapeutischen Maßnahmen. Die momentane Therapie besteht nach Konstitution des Patienten und der Lokalisation des Tumors meist aus der Operation mit angeschlossener Strahlen- und eventueller adjuvanten Chemotherapie. Die Prognose ist abhängig von verschiedenen Faktoren, wie der Ausbreitung und der Lokalisation des Tumors und hat sich in den letzten Jahren leider nur unwesentlich verbessert, da immer noch von einer medianen Überlebenszeit des Patienten zwischen 8 und 15 Monaten im Falle eines Glioblastoms ausgegangen werden kann. Die Entstehung und Progression von malignen Tumorerkrankungen sind eng mit Störungen und Defekten in Signalwegen, die das Zellüberleben und den Zelltod regulieren, verknüpft. Aberrationen, wie die Blockade von Tumorsuppressorgenen, oder die Aktivierung bzw. Überexpression von Onkogenen, führen zur veränderten Expression von Zelltod-inhibitorischen Genen wie den anti-apoptotischen Bcl-2 Familienmitgliedern, und letztendlich zu Abweichungen der normalen zellulären Homöostase. Veränderungen dieser Art bewirken, dass Tumorzellen die Fähigkeit erhalten, unkontrolliert zu proliferieren, infiltrativ zu wachsen und eine eigene Vaskularisierung zu initiieren. Tumorzellen besitzen eine erhöhte Apoptose- und Zelltodresistenz, die maßgeblich durch die stark erhöhte Expression von anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinen gekennzeichnet ist. In der vorliegenden Arbeit stand daher die Fragestellung im Mittelpunkt, inwieweit anti-apoptotische Proteine der Bcl-2-Familie zur Resistenz von malignen Gliomzellen gegen die Apoptose und den autophagischen Zelltod beitragen und wie diese Mechanismen gezielt überwunden werden können. Die Blockade der vier Familienmitglieder der Bcl-2-Subfamilie (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, Bcl-w) wurde über den Einsatz von spezifischen Inhibitoren, den sogenannten BH3-Mimetika, vermittelt. BH3-Mimetika besitzen eine hohe Affinität zur Bindungstasche der Bcl-2-Proteine, wobei durch die Bindung eine Blockade des Proteins hervorgerufen wird. Die eingesetzten BH3-Mimetika haben unterschiedliche Bindungsprofile und können daher ein, zwei oder mehrere Proteine der Bcl-2-Familie inhibieren. Die verwendeten Inhibitoren BH3I-2, HA14-1 und ABT-737, die nur eine limitierte Wirkung auf den Zelltod von Gliomzellen entfalteten, sind allesamt nicht in der Lage, Mcl-1 zu blockieren. Deshalb wurde zusätzlich ein Pan-Bcl-2-Inhibitor, das (-)-Gossypol, verwendet. Dieser Inhibitor hemmt alle anti-apoptotischen Bcl-2-Familienmitglieder, und steigerte über die Inhibition und Degradation von Mcl-1 effizient den Zelltod von Gliomzellen. Dagegen zeigte die (-)-Gossypol-Behandlung in nicht transformierte Astrozytenkulturen keine zytotoxischen Effekte. Zusätzlich wurde nachgewiesen, dass durch das BH3-Mimetikum (-)-Gossypol ein autophagischer Zelltod induziert wird. Unter der Verwendung eines charakteristischen Markerproteins, dem LC3-Protein, konnte nach Induktion des nicht-apoptotischen, autophagischen Zelltodes durch (-)-Gossypol eine Translokation von GFP-LC3 in die Autophagosomen und Autolysosomen festgestellt werden. Viele Gliome weisen eine Methylierung des MGMT-Promotors auf, die es den Zellen erschwert, schnell DNA-Schäden zu reparieren. Aufgrund dieser Methylierung sind diese Tumoren sensitiv für eine Behandlung mit alkylierenden Substanzen (Temozolomid). Auf Grundlage dieser Beobachtungen wurden die kombinatorischen Effekte von BH3 Mimetika und Temozolomid in MGMT-positiven (U87) und MGMT-negativen (U343) Gliomzelllinien verglichen, wobei sich lediglich in MGMT-negativen U343-Gliomzellen signifikante, kombinierte Effekte ergaben. Dieser Zelltod war mit einer Potenzierung der Autophagie assoziiert, nicht jedoch mit einer Aktivierung von Caspasen und einer lysosomalen Dysfunktion. Die Depletion des endogenen Autophagieinhibitors mTOR bewirkte nach den Behandlungen mit (-)-Gossyol und TMZ einen zusätzlichen zytotoxischen Effekt. Im Gegensatz dazu wurde durch lentivirale RNA-Interferenz gegen die Autophagiegene ATG5 und Beclin1 eine potente Reduktion der zellulären Autophagie und des autophagischen Zelltodes erreicht. Insgesamt unterstreichen diese Daten die zentrale Rolle von Bcl-2 Proteinen für die Regulation der Autophagie und legen nahe, dass durch (-)-Gossypol und (-)-Gossypol in Kombination mit Temozlomid in Gliomzellen zytotoxische Autophagie induziert wird.
Die menschliche Kommunikation von Angesicht zu Angesicht findet hauptsächlich auf audiovisueller Ebene statt. Normalerweise liefert der Gesprächspartner sowohl visuelle als auch auditorische Information. Es ist einfacher jemanden zu verstehen, wenn ein visueller Eingang vorliegt, weil visuelle Signale wie Mund- oder Zungenbewegungen komplementäre Informationen zum auditorischen Eingang liefern. In dieser Studie wurden die Hypothesen aufgestellt, dass (I) sowohl die Spracherkennung als auch die Stimmenerkennung bei fehlendem visuellem Eingang durch Zugriff auf visuelle Sprecher-spezifische Informationen optimiert werden kann und, dass (11) diese Optimierung auf Gehirnarealen für die visuelle Gesichtsverarbeitung beruht. Diesen Hypothesen wurde mit Hilfe von Verhaltenstests und der funktionellen Bildgebung in zwei Gruppen nachgegangen: Probanden mit einer mangelnden Fähigkeit, Gesichter zu erkennen (Prosopagnosie), und entsprechende Kontrollprobanden. Die Ergebnisse zeigten, dass das Beobachten einer bestimmten Person beim Reden für 2 min die darauffolgende rein auditorische Spracherkennung sowie die Stimmenerkennung verbessert. Bei beiden Gruppen, sowohl bei den Prosopagnostikern als auch bei den Kontrollprobanden, konnten die verbesserten Verhaltensdaten beim Erkennen des Sprachinhalts auf ein Areal zurückgeführt werden, das für die Verarbeitung von Gesichtsbewegungen zuständig ist. Bessere Verhaltensdaten bei der Stimmenerkennung konnten nur bei den Kontrollprobanden nachgewiesen werden, was auf einem Areal beruht, das der Verarbeitung der Gesichtserkennung zugeordnet wird. Diese Befunde stellen gängige unisensorische Modelle der Sprachverarbeitung infrage, da hier gezeigt werden konnte, dass das Gehirn selbst bei der rein auditorischen Spracherkennung auf zuvor gelernte audiovisuelle Zusammenhänge zurückgreift um die Kommunikation zu optimieren. Das legt die Möglichkeit nahe, dass dieser Optimierung Sprecher-spezifische audiovisuelle interne Modelle zugrunde liegen, welche benutzt werden, um ein sprechendes Gesicht zu simulieren.
Vibronic (vibrational-electronic) transition is one of the fundamental processes in molecular physics. Indeed, vibronic transition is essential both in radiative and nonradiative photophysical or photochemical properties of molecules such as absorption, emission, Raman scattering, circular dichroism, electron transfer, internal conversion, etc. A detailed understanding of these transitions in varying systems, especially for (large) biomolecules, is thus of particular interest. Describing vibronic transitions in polyatomic systems with hundreds of atoms is, however, a difficult task due to the large number of coupled degrees of freedom. Even within the relatively crude harmonic approximation, such as for Born-Oppenheimer harmonic potential energy surfaces, the brute-force evaluation of Franck-Condon intensity profiles in a time-independent sum-over-states approach is prohibitive for complex systems owing to the vast number of multi-dimensional Franck-Condon integrals. The main goal of this thesis is to describe a variety of molecular vibronic transitions, with special focus on the development of approaches that are applicable to extended molecular systems. We use various representations of Fermi’s golden rule in frequency, time and phase spaces via coherent states to reduce the computational complexity. Although each representation has benefits and shortcomings in its evaluation, they complement each other. Peak assignment of a spectrum can be made directly after calculation in the frequency domain but this sum-over-states route is usually slow. In contrast, computation is considerably faster in the time domain with Fourier transformation but the peak assignment is not directly available. The representation in phase space does not immediately provide physically-meaningful quantities but it can link frequency and time domains. This has been applied to, herein, for example (non-Condon) absorption spectra of benzene and electron transfer of bacteriochlorophyll in the photosynthetic reaction center at finite temperature. This work is a significant step in the treatment of vibronic structure, allowing for the accurate and efficient treatment of complex systems, and provides a new analysis tool for molecular science.
Die vorliegende Dissertation analysiert Großinvestorhandelsstrategien in illiquiden Finanzmärkten. Ein Großinvestor beeinflusst die Preise der Wertpapiere, die er handelt, so dass der daraus resultierende Feedbackeffekt berücksichtigt werden muss. Der Preisprozess wird durch eine Familie von cadlag Semimartingalen modelliert, die in dem zusätzlichen Parameter stetig differenzierbar ist. Ziel ist es, eine möglichst allgemeine Strategiemenge zu bestimmen, für die eine Vermögensdynamik definiert werden kann. Es sind dies vorhersehbare Prozesse von wohldefinierter quadratischer Variation entlang Stoppzeiten. Sie erweisen sich als laglad. Die Vermögensdynamikzerlegung zeigt, dass bei stetigen adaptierten Strategien von endlicher Variation (zahme Strategien) die quadratischen Transaktionskostenterme verschwinden und der Gewinnprozess nur noch aus einem nichtlinearen stochastischen Integral besteht. Es wird gezeigt, unter welchen Bedingungen gewisse Approximationen vorhersehbarer laglad Strategien durch adaptierte stetige Strategien von endlicher Variation möglich sind. Im Fall, dass der Approximationsfehler für die Risikoeinstellung des Großinvestors erträglich ist, kann er seine Investmentziele durch Verwendung dieser zahmen Strategien, Liquiditätskosten vermeidend, erreichen. In diesem Fall ist der Gewinnprozess durch das nicht-lineare stochastische Integral gegeben.
Hintergrund: Träger eines bestimmten Haplotyps des Gens der GTP Cyclohydrolase (GCH1) gaben im Anschluss an eine Diskektomie nach chronischer lumbaler Radikulopathie weniger Schmerzen an und hatten in experimentellen Schmerzmessungen höhere Schmerzschwellen. Die ex-vivo GCH1-Hochregulierung und BH4-Produktion nach Forskolinstimulierung war reduziert, während die Grundwerte der BH4-Konzentration nicht verändert waren. Diese Beobachtungen legen nahe, dass der Haplotyp hauptsächlich Veränderungen zeigt, wenn das GCH1-System provoziert wird. Diese Studie zielt darauf ab, (1) diese Hypothese zu testen und (2) die schmerzprotektiven Eigenschaften, die diesem Haplotyp zuvor zugeschrieben wurden in unabhängigen Rahmen zu reproduzieren. Methodik: Hierzu wurden experimentelle Schmerzmodelle mit Sensitisierung (lokale Hautentzündung, topische Capsaicinapplikation) und ohne Sensitisierung (punktuell-mechanischer Druck, stumpfer Druck, thermischer und elektrischer Schmerz) an 10 homozygoten Trägern und 22 homozygoten Nichtträgern des angeblich schmerzprotektiven GCH1-Haplotyps durchgeführt. GCH1-, iNOS-Hochregulierung und BH4-Produktion wurden ex-vivo in Leukozyten nach LPS-Stimulation für 24 Stunden ermittelt. Ergebnisse: Träger dieses GCH1-Haplotyps hatten höhere Schmerzschwellen für punktuell-mechanischen Druck (von Frey Haare) im Anschluss an eine lokale Hautentzündung (18.1 ± 11.3 vs. 9 ± 2.8 g; p = 0.005) und im kleineren Rahmen für thermischen Schmerz nach Hyperalgesieinduktion durch Capsaicincreme (35.2 ± 0.9 vs. 36.6 ± 2.4 _C; p = 0.026). Dem hingegen konnten bei den Schmerzmodellen ohne Sensitisierung keine genotypabhängigen Effekte beobachtet werden. GCH1-, BH4 und iNOS-Hochregulierung in Leukozyten nach 24-stündiger LPS-Stimulation waren vermindert bei Trägern des GCH1-Haplotyps, woraus sich schließen lässt, dass sich die Genotypgruppen im Hinblick auf die Regulationsvorgänge im Biopterinstoffwechsel unterscheiden. Schlussfolgerung: Diese Studie bestätigt die vorherigen Befunde, dass eine verminderte GCH1-Funktion oder GCH1-Induzierbarkeit als Folge von genetischen Polymorphismen einen schmerzprotektiven Effekt mit sich bringt. Als Erweiterung der Vorresultate zeigt diese Arbeit, dass sich der schmerzprotektive Effekt vorzugsweise in Schmerzmodellen mit Sensitisierung ausprägt. Dies legt eine besondere Rolle von BH4 bei spezifischen Schmerzprozessen nahe.
Gemeinsam ist den Autoimmunendokrinopathien, dass genetische Faktoren als auch Umweltfaktoren für die Ätiologie von Bedeutung sind. Das Vererbungsschema dieser genetischen Prädispositionsfaktoren ist komplex und schließt mehrere Kandidatengene ein. Besonders die HLA-Gene wurden eingehend in den letzten Jahren untersucht. Sie stellen einen wichtigen Risikofaktor für die Entstehung von Autoimmunendokrinopathien dar. Allerdings ist für keinen der bekannten Autoimmunendokrionopathien die genetische Prädisposition, die durch die HLA-Region vermittelt wird, weder ausreichend noch notwendig für die Entwicklung der Erkrankung. So nehmen weitere Kandidatengene eine bedeutende Rolle in der Entstehung von Autoimmunendokrinopathien ein. In den letzten Jahren haben Studien gezeigt, dass diejenigen Mechanismen des Immunsystems, die zur Erhaltung der peripheren T-Zell-Toleranz beitragen, essentiell für die Kontrolle von autoreaktiven T-Zellen sind. Die Elimination bzw. die Störung solcher Mechanismen kann somit in einer Autoimmunerkrankung münden. Folglich sind Gene, die Einfluss auf diese Mechanismen der peripheren Toleranz ausüben, eindeutige Prädispositionsfaktoren für die Entstehung von Autoimmunerkrankungen. CTLA-4 ist ein essentielles inhibitorisches Regulatormolekül für T-Zellen. In vivo- und In vitro- Untersuchungen haben gezeigt, dass CTLA-4 eine bedeutende Rolle in der Regulation von Selbsttoleranz einnimmt. Damit ist CTLA-4 ein entscheidendes Suspezeptibilitätsgen für Autoimmunität im Allgemeinen und könnte insbesondere für die T-Zell-vermittelten Autoimmunendokrinopathien bedeutend sein. Im Rahmen dieser Arbeit wurde nach einem Zusammenhang dieses Genortes mit Typ 1 Diabetes mellitus, Morbus Addison, Hashimoto-Thyreoiditis und Morbus Basedow in der kaukasischen Bevölkerung geforscht. Bei der Suche nach einer Assoziation zwischen CTLA-4 Polymorphismen und Typ 1 Diabetes mellitus zeigt sich eine signifikante Assoziation des -MH30 C/G - und -1661 A/G - Polymorphismus sowie des +49 A/G Exon 1- Polymorphismus des CTLA-4 Gens mit Typ 1 Diabetes mellitus. Beim Polymorphismus –MH30 C/G des CTLA-4 Gen zeigt sich ein signifikant gehäuftes Auftreten des Allels „G“ bei Patienten, die an Typ 1 Diabetes mellitus erkrankt sind. Dabei vermittelt das Allel „G“ bei der Allelfrequenzanalyse - wie auch bei der Genotypenanalyse ein signifikant erhöhtes Diabetes-Risiko. Das Allel „C“ hingegen ist signifikant seltener an Patienten und scheint somit eher protektiv gegen Typ 1 Diabetes mellitus zu wirken. Bei der Untersuchung des -1661 A/G Polymorphismus des CTLA-4 Gens bei Patienten mit Typ 1 Diabetes mellitus zeigt sich das Allel „A“ als krankheitsprädisponierend. Beim +49 A/G Polymorphismus führt die Substitution von Adenin zu Guanin an Position 49 des Exon 1 zu eine Threonin (Thr) /Alanin (Ala) Substitution am Kodon 17 der Signalpeptidsequenz. Die Untersuchung des +49 A/G Polymorphismus in der deutschen Population verdeutlicht, dass der Genotyp „G/G“ sowie das Allel „G“ (Alanin) krankheitsprädisponierend sind. Das Allel „A“ hat eine protektive Wirkung und tritt gehäuft in der Kontrollgruppe auf. Der – 319 – Promotorpolymorphismus zeigt keine Assoziation mit Typ 1 Diabetes mellitus. Die Haplotypanalyse -MH30/-1661 zeigt, dass der Haplotyp „CG“ bei Typ 1 Diabetes mellitus signifikant häufiger auftritt als in der Kontrollgruppe. Der Haplotyp –MH30G/- 1661G hat eine protektive Wirkung. Weiterhin vermittelt der Haplotyp -318/+49G ein erhöhtes Diabetes-Risiko, während der Haplotyp „C/A“ protektiv wirkt. Des Weiteren wurde die Assoziation der oben genannten vier Polymorphismen im CTLA-4 Gen mit der Autoimmunerkrankung Morbus Addison, untersucht. Beim - 1661A/G-Polymorphismus zeigt sich eine signifikant erhöhte Frequenz des Genotyp „A/A“ bei Patienten mit Morbus Addison. Der Genotyp „G/G“ sowie das Allel „G“ des Exon 1- Polymorphismus sind häufiger bei Patienten mit Morbus Addison als bei den Kontrollen und vermitteln somit ein erhöhtes Risiko an Morbus Addison zu erkranken. Im Gegensatz hierzu hat das Allel „A“ eine protektive Wirkung und tritt gehäuft in der Kontrollgruppe auf. Der –MH30 – Polymorphismus und der Promotorpolymorphismus des CTLA-4 Gen zeigen keine relevanten Assoziationen mit Morbus Addison in der deutschen Population. Die Haplotypanalyse der -319 und +49 Polymorphismen zeigt, dass der Haplotyp „C/A“ eine protektive Wirkung hat und daher das Risiko an Morbus Addison zu erkranken, senkt. Der Haplotyp – 319C/+49G birgt dagegen ein erhöhtes Erkrankungsrisiko. Bei Hashimoto-Thyreoiditis zeigte sich, dass der –MH30 C/G-Polymorphismus mit der Erkrankung assoziiert ist. Im Gegensatz zu den Ergebnissen bei Typ 1 Diabetes mellitus zeigt sich das Allel „C“ als krankheitsprädisponierend. Der Genotyp „C/C“ ist signifikant häufiger im Patientenkollektiv als in der Kontrollgruppe. Das Allel „G“ am Genort CTLA-4 –MH30 wirkt dagegen protekiv. Beim -1661 A/G – Polymorphismus treten beide homozygote Genotypen „A/A“ und „G/G“ im Patientenkollektiv häufiger auf als in der Kontrollgruppe. Der heterozygote Genotyp hingegen „A/G“ ist signifikant seltener in der Patientengruppe zu finden als in der Kontrollgruppe und hat somit eine protektive Wirkung. Die Untersuchung des -319 C/T – und des +49 A/G –Polymorphismus zeigt keine Assoziation mit Hashimoto – Thyreoiditis. Die Haplotypanalyse - MH30 / CTLA-4 – 1661 zeigt, dass die Haplotypen „CG“ und „GG“ eine krankheitsprädisponierende Wirkung haben und gehäuft im Patientenkollektiv auftreten als in der Kontrollgruppe. Der Haplotyp -319/ +49 weist bei Patienten mit Hashimoto- Thyreoiditis keine Assoziation auf. Analog zu den anderen oben aufgeführten Autoimmunendokrinopathien wurden auch vier CTLA-4 Polymorphismen auf ihre Korrelation mit Morbus Basedow hin untersucht. Es konnte hier gezeigt werden, dass die untersuchten Polymorphismen keinen wesentlichen Beitrag zur Vermittelung des genetischen Risikos für Morbus Basedow leisten. Die Korrelationsuntersuchung der Polymorphismen zeigte auch keine Assoziation der Haplotypen mit Morbus Basedow. Dies schließt jedoch das CTLA-4 Gen als ein Suspezeptibilitätsgen für Morbus Basedow nicht aus, zumal Assoziationen mit weiteren in dieser Arbeit nicht untersuchten CTLA-4 Polymorphismen bestehen können. Zusammengefasst wird durch die Untersuchung dieser Doktorarbeit die These unterstützt, dass das CTLA-4 Gen eine wichtige Rolle in der Entstehung der Autoimmunendokrinopathien einnimmt. Die hier untersuchten Polymorphismen des CTLA-4 Gens sind prädisponierende Faktoren für Autoimmunendokrinopathien, insbesondere für Typ 1 Diabetes mellitus, Morbus Addison und Hashimoto-Thyreoiditis.
Laut BQS (Bundesgeschäftsstelle Qualitätssicherung) nimmt die Anzahl der durchgeführten Hüftendoprothesenerstimplantationen kontinuierlich zu (2006: 146.853; 2008: 157.350), bedingt nicht zuletzt durch die demographische Entwicklung (zunehmende Alterung der Gesellschaft). Die auftretenden Komplikationen nach solchen Operationen legen es nahe, an einer weiteren Optimierung des Behandlungsverfahrens zu arbeiten. Dabei wurde bisher kaum untersucht, inwieweit bei einer Hüftprothesenimplantation das Rotationsprofil der unteren Extremität die Prothesenauswahl bzw. die Prothesengestalt beeinflussen sollte. Das Resultat der Messung anthropometrischer Rotationsverhältnisse durch Bestimmung des Antetorsionswinkels (AT oder ATWinkel) und Unterschenkelrotationswinkels (UR oder UR-Winkel) an der unteren Extremität und deren Inbezugsetzung zueinander wird in dieser Studie „Rotationsprofil“ genannt. Ein solches Rotationsprofil wird allerdings in der CT-basierten Individualendoprothetik des Hüftgelenks routinemäßig erhoben und sein Ergebnis in die Prothesenrekonstruktion oder -auswahl eingearbeitet. Der Grund für diese Vorgehensweise liegt in der Überlegung, dass es – bei einer wie üblich vorgenommenen Ausrichtung z. B. einer Geradschaftprothese an der Kniekondylenebene – unter Umständen postoperativ zu einer tatsächlichen Retrotorsion bzw. zu Einschränkungen des Bewegungsumfangs im Hüftgelenk kommen kann. Theoretisch ist in extremen Fällen nicht nur eine Luxation des Hüftkopfs vorstellbar, sondern auch eine mittelfristig induzierte Lockerung der Prothese, bedingt durch eine suboptimale Anpassung des ATWinkels im Rahmen der Planung des Prothesendesigns, und damit eine veränderte Krafteinleitung in das proximale Femur. In der hier vorgestellten Studie wird anhand eines größeren Patientenkollektivs, bei dem die Indikation für eine Hüftgelenksprothese aufgrund einer primären oder sekundären Coxarthrose gestellt worden war, das Rotationsprofil an der betroffenen Extremität im CT ermittelt. In dem Patientenkollektiv sollte zunächst eine mögliche geschlechtsspezifische Beziehung zwischen den Variablen AT und UR nachgewiesen werden. Erstmalig wurde eine Analyse des Rotationsprofils in verschiedenen Subgruppen hinsichtlich des Alters (vier Subgruppen) und der Größe des Antetorsionswinkels (fünf Subgruppen) durchgeführt. Es wurde die Hypothese überprüft, ob ein hoher AT-Winkel mit einem hohen UR-Winkel korreliert.
Succinate:quinone oxidoreductases (SQORs) are integral membrane protein complexes, which couple the two-electron oxidation of succinate to fumarate (succinate → fumarate + 2H+ + 2e-) to the two-electron reduction of quinone to quinol (quinone + 2H+ + 2e- → quinol) as well as catalyzing the opposite reaction, the reduction of fumarate by quinol. In mitochondria and some aerobic bacteria, succinate:ubiquinone reductase, also known as complex II of the aerobic respiratory chain or as succinate dehydrogenase from the tricarboxylic acid (TCA or Krebs) cycle, catalyzes the oxidation of succinate by ubiquinone, which is mildly exergonic under standart conditions and not directly associated with energy storage in the form of a transmembrane electrochemical proton potential (Δp). Gram-positive bacteria do not contain ubiquinone but rather menaquinone, a quinone with significantly lower oxidation-reduction (“redox”) midpoint potential. In these cases, the catalyzed oxidation of succinate by quinone is endergonic under standard conditions. Consequently, these bacteria face a thermodynamic problem in supporting the catalysis of this reaction in vivo. Based on experimental evidence obtained on whole cells and purified membranes, it had previously been proposed that the SQR from Gram-positive bacteria supports this reaction at the expense of the protonmotive force, Δp. Nonetheless, it has been argued that the observed Δp dependence is not associated specifically with the activity of SQR because the occurrence of artifacts in experiments with bacterial membranes and whole cells can not be fully excluded. Clearly, definitive insight into the mechanism of catalysis of this intriguing reaction required a corresponding functional characterization of an isolated, membranebound SQR from a Gram-positive bacterium. The first aim of the present work addresses the question if the general feasibility of the energetically uphill electron transfer from succinate to menaquinone is associated specifically to a single enzyme complex, the SQR. The prerequisite to achieve this goal was stable preparation of this enzyme.
Die minimalinvasive Herzchirurgie ist an der Universität Frankfurt seit Ende der 90er Jahre ein etabliertes Verfahren zur Therapie von Mitralklappenvitien. Dabei kommen die rechtslaterale Minithorakotomie und die partielle oberer Sternotomie mit Verwendung der Herz-Lungen-Maschine zum Einsatz. In der Klinik für Thorax-, Herz- und thorakale Gefäßchirurgie in Frankfurt wurde von Januar 1998 bis Dezember 2005 bei 331 Patienten die Mitralklappe rekonstruiert bzw. ersetzt, und zwar über die rechtsseitige Minithorakotomie in 231 Fällen, über die partielle Sternotomie bei 100 Patienten. Ziel der vorliegenden Studie war die Evaluierung perioperativer und postoperativer Komplikationen. Perioperativ starben lediglich in der Chitwood-Gruppe 3 Patienten. Das Langzeitüberleben beider Gruppen nähert sich dem der Normalbevölkerung. Hinsichtlich des Zieles dieser Operationen, die Wiederherstellung der Funktion der Mitralklappe, wurden an der Universität Frankfurt, im Vergleich mit bereits vorliegenden Studien, ähnlich gute Ergebnisse erzielt. Früh- und Spätkomplikationen traten bei beiden Operationsverfahren selten auf. Dies wird vor allem an der geringen Reoperationsrate deutlich. Bei der Nachuntersuchung zeigten sich im Vergleich zum präoperativen Zustand der Patienten hochsignifikante Verbesserungen hinsichtlich NYHA-Klassifikation, also der allgemeinen Leistungsfähigkeit. Die erfassten Patienten konnten auch von der Verbesserung der Ventrikelfunktionsparameter profitieren, worin sich die beiden Gruppen nicht unterschieden. Obwohl die postoperativen Ergebnisse gut waren, gilt doch hervorzuheben, dass es zu einigen Problemen gekommen ist: 6 Patienten der Chitwood-Gruppe, deren Mitralklappe mit Hilfe einer Fraterplastik rekonstruiert wurde, mussten reoperiert werden. Daher wurde die Technik der Fraterplastik seit März 2003 nicht mehr eingesetzt. Die dargestellten Ergebnisse aus der Literatur belegen die Effektivität der beiden minimalinvasiven Therapieformen im Hinblick auf Überleben, spätere Leistungsfähigkeit sowie peri- und postoperativer Komplikationen. Beide Methoden haben bewiesen, für ausgewählte Patienten eine sichere Alternative zur medianen Sternotomie zu sein. Durch die Komplexität des Verfahrens nach Chitwood werden heute die meisten minimalinvasiven Eingriffe über die partielle obere Sternotomie durchgeführt. Inzwischen wurde ihre Anwendbarkeit auf Notfallpatienten und Kombinationseingriffe an den Herzklappen ausgeweitet.
Nachweis von fetaler DNA (Rhesus-Gene) im maternalen Plasma mittels verschiedener Nachweismethoden
(2010)
Die Entdeckung zellfreier fetaler DNA im maternalen Plasma führte in der noninvasiven Pränataldiagnostik zu neuen Methoden. Dazu gehört die PCR-Testung von cffDNA, die eine verlässliche non-invasive diagnostische Methode für ein antenatales Screening von Rh-negativen Schwangeren bietet. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass anhand einer automatisierten Extraktion fetaler DNA - in Verbindung mit einer PCR - eine zuverlässige Vorhersage des fetalen Rhesus-Faktors bzw. Geschlechts möglich ist. Dies wurde durch die Untersuchung von 25 Rh-negativen Schwangeren verifiziert. Mit der FACS™-Methode, die als Alternative bei der Bestimmung des Rh-Faktors untersucht wurde, konnten - aufgrund der unspezifischen Bindung des FITC-Antikörpers - keine hinreichenden Ergebnisse erzielt werden. Anhand des verwendeten Extraktionsautomaten (chemagic® MSM I) konnte mit hoher Effizienz fetale DNA isoliert werden. Die untersuchten manuellen Extraktionsverfahren hingegen erwiesen sich für einen antenatalen Massentest bzw. die Implementierung in die klinische Routine als eher ungeeignet, da diese zum einen mit einem erhöhten Zeitaufwand verbunden waren, und zum anderen die isolierte Menge an cffDNA für eine PCR-Testung nicht ausreichte. Die Anzahl der maternalen Plasmaproben, die in dieser Arbeit untersucht wurden, reicht nicht aus um zu belegen, dass die untersuchten Methoden die gleiche Sicherheit bieten, wie die generelle Immunprophylaxe. Daher sind weitere groß angelegte Feldstudien notwendig.
Hintergrund: Patienten mit einer Lese- und Rechtschreibstörung (LRS) sind von einer langfristigen Behinderung betroffen, die sich nachteilig auf die schulische und soziale Entwicklung auswirkt. Insbesondere stellt die Lesekompetenz einen Grundbaustein der individuellen Bildung dar, ohne die ein fächerübergreifendes Lernen nicht möglich ist. Es besteht die Vermutung, dass die Diagnostik und folglich auch die Therapie der isolierten Rechtschreibstörung in der klinischen Praxis überwiegen und Kinder mit einer (isolierten) Lesestörung übersehen werden. Diese Studie beschäftigt sich mit der Frage, ob Lesestörungen unerkannt bleiben. Ferner ist bekannt, dass Patienten mit einem Asperger-Syndrom bei guter Lesefertigkeit, häufig Defizite im Bereich des Leseverständnisses aufweisen. Es wird untersucht, ob ein Zusammenhang zwischen der Lesefertigkeit und der Ausprägung autistischer Symptomatik besteht. Patienten und Methode: In einem dreimonatigen Zeitraum (T 2: 09/07 – 11/07) werden alle ambulanten und stationären Neuaufnahmen (8 - 17 Jahre) hinsichtlich ihrer Lese- und Rechtschreibfähigkeit sowie autistischer Symptomatik untersucht. Nach Anwendung der Ausschlusskriterien nehmen N = 104 Patienten an den Gruppentestungen teil, die jeweils einen IQ-Test, je nach Altersgruppe zwei bis drei Lesetests und einen Rechtschreibtest beinhalten. Die Eltern der Kinder füllen einen Autismus-, psychopathologischen und Zusatzfragebogen aus. Die Ergebnisse der Leistungstests werden mit den Diagnosestellungen des gleichen Zeitraumes aus dem Jahr 2006 (T 1: 09/06 – 11/06) verglichen, wobei zu dieser Zeit keine forcierten Testungen stattfanden. Ergebnisse: Im Zeitraum T 2 wiesen 14 Patienten (13,5%) eine isolierte Lesestörung auf. Dies entspricht einer viermal häufigeren Diagnosestellung als im Jahr zuvor, bei der nur 3 Patienten (3,3 %) eine alleinige Lesestörung aufwiesen (p = .013). Bei 16 (15,4%) Probanden konnte eine isolierte Rechtschreibstörung diagnostiziert werden. 2006 wurden nur 6 (6,7 %) Kinder mit dieser Diagnose ermittelt (p = .056). Die Diagnose der LRS (F81.0) erhielten im Jahr 2007 20 Kinder (19,2%). Im Jahr zuvor fanden sich bloß 8 (8,9%) Kinder mit einer LRS (F81.0) (p = .041). Die Ergebnisse im Autismusscreening konnten keine Zusammenhänge zwischen der Lesefertigkeit und der Ausprägung autistischer Symptomatik bestätigen. Schlussfolgerung: Lesestörungen bleiben unerkannt. Für ihre Diagnostik ist es von essentieller Bedeutung, bei Vorliegen eines klinischen Verdachts stets Testungen zu Lese- und Rechtschreibstörungen durchzuführen. Einer Routinetestung aller Neuaufnahmen kann jedoch nicht angeraten werden. Es empfiehlt sich alle Patienten zu testen, die eine typische Begleitstörung der LRS aufweisen, z.B. hyperkinetische Störungen.
NMR-spektroskopische Untersuchungen zur Bindung kleiner Moleküle an das Zellzyklusprotein CDC25A
(2010)
Viele verschiedene Funktionen der Zelle werden durch posttranslationale Modifikationen von Proteinen reguliert. Die reversible Phosphorylierung der OH-Gruppen der Aminosäuren Serin, Threonin und Tyrosin ist eine der Möglichkeiten die Aktivität von Proteinen an- und abzuschalten und Interaktion mit Bindungspartnern zu ermöglichen oder zu verhindern. Die Phosphatase CDC25A übernimmt eine zentrale Rolle in der Steuerung des Zellzyklus, unterliegt selbst wiederum einer differenzierten Kontrolle durch Änderung des Expressionslevel, Phosphorylierung und Lokalisation innerhalb der Zelle. Da eine Überfunktion von CDC25A mit einer Vielzahl von verschiedenen Krebserkrankungen assoziiert ist, wird die Entwicklung starker und selektiver Inhibitoren, die auch in vivo wirksam sind, vorangetrieben. Die strukturellen Grundlagen selektiver Inhibition sind allerdings noch unzureichend erforscht. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die Grundlagen für eine erfolgreiche Durchführung von NMR-Experimenten gelegt, für die Proteinproben mit hoher Konzentration und Langzeitstabilität benötigt werden. CDC25A kann nicht in der vollen Länge exprimiert werden und wäre als Vollkonstrukt auch zu groß, um effektiv per NMR untersuchbar zu sein. Durch Erzeugung diverser Konstrukte der katalytischen Domäne von CDC25A konnte ein Expressionslevel erreicht werden, der die Erzeugung ausreichender Mengen an Protein praktikabel macht. Neben des oftmals geringen Expressionslevels ist ein weiteres Problem bei NMR-spektroskopischen Untersuchungen vieler Phosphatasen deren geringe Stabilität während der Aufreinigung und in der endgültigen Probe. Durch Optimierung der Pufferbedingungen für den Zellaufschluss in Bezug auf pH-Wert, Salzkonzentration und Art des Kations per „Incomplete Factorial Design“ konnte die Ausbeute an löslichem Protein erheblich gesteigert werden. Die Verwendung dieser Pufferbedingungen während der ersten Aufreinigungsschritte verminderte auch die Tendenz des Proteins während der Chromatografie auszufallen. Die Zusammensetzung des Puffers für die endgültige NMR-Probe wurde schließlich durch das aus der Kristallografie entlehnte Verfahren der Dampfdiffusion ebenso in Hinblick auf pH-Wert, Salzkonzentration und Art des Anions optimiert. Unter diesen optimierten Pufferbedingungen wurde die katalytische Aktivität des Proteinkonstrukts anhand der Hydrolyse von para-Nitrophenylphosphat nachgewiesen. Acht Substanzen wurden auf Inhibition dieser katalytischen Aktivität getestet. Das natürliche Substrat Phosphotyrosin zeigte eine kompetitive Hemmung, zwei starke und ein schwacher Inhibitor zeigten entsprechend verminderte Reaktionsraten. Von den restlichen 4 Substanzen (Inhibitoren anderer Protein-Tyrosin-Phosphatasen und strukturelle Verwandte) zeigten 3 weitere eine starke Wirkung. Diese hohe Promiskuität gegenüber Inhibitoren stellt ein großes Problem für die strukturgetriebene Wirkstoffentwicklung bei CDC25A und generell aller Phosphatasen dar. Nach Erhalt der fertigen Proben zeigten erste 2D-NMR-Spektren eine geringer als zu erwartende Zahl von Signalen und starke Überlappungen der sichtbaren Signale. Um auszuschließen, das Dimerisierung oder unspezifische Aggregation hierfür verantwortlich sind, wurden DOSY-Spektren gemessen. Aus der Eigendiffusionsrate ergibt sich ein hydrodynamischer Radius, der mit durch HYDROPRO simulierten Werten übereinstimmt und sich deutlich von dem des putativen Dimers absetzt. Daher wird davon ausgegangen, dass die Signalverluste im NMR nicht durch Dimerisierung oder Aggregation ausgelöst werden. Um die Bindung von Inhibitoren auch durch NMR-Spektroskopie nachzuweisen, wurden Saturation-Transfer-Difference-Experimente (STD) durchgeführt. In diesen war aber sowohl für das natürliche Substrat Phosphotyrosin als auch für alle im Enzymtest aktiven Inhibitoren kein Effekt nachweisbar. Dies weist auf eine sehr hohe koff-Rate der Bindung an das Protein hin oder auf eine irreversible chemische Modifikation des aktiven Zentrums, die bis zum Zeitpunkt der Messung bereits abgeschlossen war. Für die strukturbasierte Wirkstoffentwicklung werden spezifische Interaktionspunkte auf der Proteinoberfläche gesucht. Hierfür wurden 15N-HSQC-Spektren mit und ohne Bindungspartner gemessen und die Veränderungen der chemischen Verschiebung bestimmt („chemical shift perturbation“). Es konnten für Phosphotyrosin und die beiden starken Inhibitoren BN82002 und NSC663284 signifikante Veränderungen nachgewiesen werden. Für alle drei Moleküle gab es sowohl komplett einzigartige Veränderungen als auch paarweise übereinstimmende als auch ein Signal das für alle 3 übereinstimmt. Neben den Inhibitoren wurden drei Peptide auf spezifische Interaktion getestet. Das erste entspricht der Zielsequenz des natürlichen Substrats CDK, die anderen beiden sind Teile der Sequenz von CDK an einer nachgewiesenen als auch einer putativen sekundären Interaktionsfläche der beiden Proteine. Auch für die drei Peptide konnten wie für die Inhibitoren individuelle als auch übereinstimmende Signalveränderungen nachgewiesen werden. Als Voraussetzung für die Bestimmung der Oberflächenkontakte, die für die spezifische Bindung von Substrat, Inhibitoren und Interaktionspeptiden nötig sind, wird eine Zuordnung der Signale des 15N-HSQC-Spektrums zu den Aminosäureresten des Proteins benötigt. Hierzu wurden 3D-Tripelresonanz-NMR-Experimente an 15N, 13C-markierten Proben (zusätzlich auch noch 2H-markierte Proben zur Unterdrückung von Relaxationseffekten) durchgeführt. Um die Zuordnung zu unterstützen wurden außerdem Proben mit individuell 15N-markierten Aminosäuren hergestellt, um einem Signal im HSQC zumindest den Typ der Aminosäure zuordnen zu können. Aufgrund der trotz Pufferoptimierung, Deuterierung des Proteins und verringerter Signalüberlagerung in den Spektren der individuell markierten Proben zu geringen Anzahl an Signalen konnten nur kurze Bereiche der Aminosäuresequenz zugeordnet werden. Aufgrund dieser Basis konnte kein aussagekräftiges Mapping erzielt werden.
Übergangsmetallboride und -nitride weisen besondere physikalische und mechanische Eigenschaften auf; sie vereinen dabei sowohl die Merkmale von Metallen als auch von Keramiken. Sie besitzen z. B. große Härten, hohe Schmelzpunkte und hohe Abriebfestigkeiten. Des Weiteren sind sie sehr beständig gegenüber Hitze und Korrosion. Sie zeigen eine hohe elektrische und thermische Leitfähigkeit. In den industriellen Anwendungen kommen oft Übergangsmetallboride und -nitride der 4. und 5. Gruppe zum Einsatz. Die Boride und Nitride des Niobs gelten als potentielle Kandidaten für Baumaterialien, welche hohen Temperaturen standhalten sollen. Niobnitride werden zum Teil schon als Beschichtungen von Turbinenmotoren und in der Raumfahrt eingesetzt. Für den industriellen Einsatz als Beschichtung oder Überzug werden in der Regel dünne Filme benötigt, diese werden oft durch Gasphasenabscheidung aufgebracht. Eine alternative Möglichkeit zur Präparation dünner Filme bietet das Rapid Thermal Processing (RTP). Dabei handelt es sich um einen optischen Schnellheizofen, mit dem Aufheiz- und Abkühlraten bis zu 300 K s-1 erreicht werden können. Im Vergleich zu gängigen Ofenprozessen werden Reaktionszeiten deutlich verkürzt. Durch eine Variation der Reaktionsbedingungen ist es möglich, verschiedene Phasen zu erzeugen und deren Abfolge zu beeinflussen. Zusätzlich können metastabile Phasen und Zwischenstufen abgefangen werden. Als Ausgangsschichten für die in dieser Arbeit untersuchte Darstellung von Niobboriden und -nitriden dienten verschiedene B/Nb- sowie B/Nb2N-Schichtsysteme. Diese wurden mittels Magnetronsputtern bzw. Elektronenstrahlverdampfung auf Si/SiO2-Substraten abgeschieden. Die Ausgangsschichten wurden anschließend in der RTP im Temperaturbereich von 600 °C bis 1200 °C getempert. Die Temperungen wurden in Argon bzw. Ammoniak durchgeführt. Zur Charakterisierung der Proben dienten verschiedene Analyseverfahren (XRD, LM, REM, AFM, SIMS, EPMA). Die folgenden Niobboride sowie -nitride können durch Temperungen in der RTP dargestellt werden. Die hexagonale NbB2-Phase entsteht bei Argon- sowie Ammoniaktemperungen in B/Nb-Schichtsystemen mit einem 1 : 1-Schichtdickenverhältnis. Das NbB2 erweist sich unter den untersuchten Reaktionsbedingungen als effektive Diffusionsbarriere gegenüber Sauerstoff, Kohlenstoff, Wasserstoff und Stickstoff. Weitere boridische Phasen werden nur bei Argontemperungen gefunden. Das tetragonale Nb3B2 entsteht in Schichtsystemen mit einem B : Nb-Verhältnis von 1 : 4 und 1 : 10 sowie mit einem Nb : B : Nb-Verhältnis von 5 : 1 : 5. Die Nb3B2-Phase wird durch Kohlenstoff und Sauerstoff verunreinigt. Die Verunreinigungen stammen sowohl aus den Ausgangsschichten als auch aus anderen Quellen (z. B. Trägermaterial). Durch eine Änderung der Sputter- Methode konnten die in den Ausgangschichten vorhandenen Verunreinigungen reduziert werden. In entsprechend neupräparierten Schichtsystemen mit einem B : Nb-Verhältnis von 1 : 4 und 1 : 10 führt dies bei den Argontemperungen zur Ausbildung des orthorhombischen NbB neben dem Nb3B2. Die Bildung der Nitride erfolgt bei den Ammoniaktemperungen der verwendeten Schichtsysteme (außer bei B : Nb im Verhältnis 1 : 1). Welche Phase dabei entsteht ist abhängig von der gewählten Temperatur. Es zeigt sich dabei von niedrigeren zu höheren Temperaturen folgende Phasenabfolge: hexagonales Nb2N -> hexagonales delta‘-NbN -> kubisches NbN. Beim Übergang zwischen den einzelnen Phasen liegen diese nebeneinander vor. Durch die schnellen Aufheiz- und Abkühlraten des RTP-Systems, bildet sich neben dem Nb2N das kinetisch bevorzugte delta‘-NbN. Die Bildung der delta‘-NbN-Phase wird durch die Ähnlichkeit der beiden Elementarzellen unterstützt. Die Nb2N-Phase der B/Nb2N-Bilayer behindert stark die Eindiffusion des Bors, des Stickstoffes und der Verunreinigungen. Damit ist das Nb2N eine relativ gute Diffusionsbarriere. Ein Teil der Nb2N-Schicht weicht dem Druck der Eindiffusion durch Aufstauungseffekte an der Grenzfläche aus. Die aus der Literatur bekannten Phasen Nb3B4 (orthorhombisch), epsilon-NbN (hexagonal) und Nb5N6 (hexagonal) werden bei den untersuchten Reaktionsbedingungen nicht gefunden. Die vorhandenen Verunreinigungen führen vor allem während der Argontemperungen zu verschiedenen Oberflächenphänomenen und zur Ausbildung carbidischer und oxidischer Phasen. Im Zuge der Ammoniaktemperungen spielen die Verunreinigungen eine deutlich geringere Rolle. Die vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass durch Temperungen in der RTP verschiedene Niobboride sowie -nitride innerhalb weniger Minuten dargestellt werden können. Jedoch sollten für weiterführende Arbeiten reinere Ausgangschichten bzw. anderer Trägermaterialien verwendet werden um die Ergebnisse weiter zu verbessern.
Die Präkonditionierung mit den bakteriellen Zellwandbestandteilen Lipopolysaccharid (LPS) oder Lipoteichonsäure (LTA) führt in vivo zu einer Reduktion der myokardialen Infarktgröße nach Ischämie und Reperfusion (I/R). Hierbei wird durch die Präkonditionierung u.a. die Akkumulation neutrophiler Granulozyten im Ischämiegebiet während der Reperfusionsphase reduziert und somit einer der wichtigsten Mechanismen bei der Entstehung des Reperfusionsschadens am Herzen vermindert. In dieser Studie bedienten wir uns eines ex vivo Modells nach Langendorff mit regionaler I/R und zellfreier Perfusion. Wir konnten erstmalig eine LTA-Präkonditionierung in einem leukozytenfreien System zeigen und somit demonstrieren, dass die LTA-Präkonditionierung Mechanismen involviert, die unabhängig sind von einer Akkumulation neutrophiler Granulozyten. 24 Stunden nach einer Vorbehandlung der Ratten mit LPS, LTA, Kochsalz und/oder Dexamethason wurden die Herzen entfernt und retrograd mit oxygenierter Krebs-Henseleit-Lösung perfundiert. Die Herzen wurden einer 20-minütigen Ischämie, gefolgt von einer 2-stündigen Reperfusionsphase, unterzogen. Das Infarktrisikogebiet (Evans-Blue-Färbung) und das Infarktgebiet (pNBT-Färbung) wurden planimetrisch bestimmt. Die ischämische Präkonditionierung (IPC) wurde als Positivkontrolle unseres Modells verwendet. LTA- und LPS-Präkonditionierung führten - ebenso wie IPC - bei gleicher Dosierung in vergleichbarem Umfang zu einer signifikanten Reduktion der Infarktgröße. Dieser Effekt konnte durch Vorbehandlung mit Dexamethason vollständig aufgehoben werden, so dass gefolgert werden kann, dass die Protektion durch LPS bzw. LTA. von der Modulation der inflammatorischen Vorgänge im Endothel und Myokard mit abhängt.
Ein erblich bedingter Funktionsverlust der DNA Mismatch Reparatur (MMR) Proteine hMSH2 und hMLH1 führt zu genetischer Instabilität und frühzeitiger Ausbildung von Krebserkrankungen, insbesonders des Kolons und des Endometriums. Diese Erkrankung wird nach ihrem Erstbeschreiber als Lynch Syndrom oder im Falle eines kolorektalen Karzinoms auch als erbliches nichtpolypöses kolorektales Karzinom (hereditary non polyposis colorectal cancer, HNPCC) bezeichnet. Neben der DNA Reparatur sind MMR Proteine auch an weiteren regulatorischen Prozessen wie genetischer Rekombination, Antikörperbildung sowie Zellzyklus Regulation und Apoptose beteiligt. Aus onkologischer Sicht ist besonders der letzte Punkt von Interesse, da man davon ausgeht, dass MMR Proteine bei exzessiven DNA-Schäden den Zellzyklus anhalten und entweder die DNA reparieren oder die Apoptose einleiten. Dies ist von klinischer Bedeutung, da viele Chemotherapeutika künstliche DNA-Läsionen hervorrufen, die in MMR defizienten Zellen weder zu einem Zellzyklus Stop noch zur Apoptose führen, so dass die Wirksamkeit bestimmter Substanzen vermindert ist. Aus diesem Grund wurde im Rahmen der vorgelegten Dissertation ein Screening zur Identifikation von Interaktionspartnern von hMLH1 durchgeführt. hMLH1 ist hauptsächlich im Zellkern lokalisiert, über Interaktionspartner im Zytoplasma ist bisher wenig bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein neues bakterielles Zweihybrid-System etabliert. In diesem System besitzen die Wirtszellen keinen Zellkern, so dass die detektierten Interaktionen unabhängig von der intrazellulären Lokalisation stattfinden. Die Klone einer cDNA-Datenbank wurden mit hMLH1 in Bakterienzellen koexprimiert und die Interaktionen durch positives Zellwachstum auf Minimalnährböden angezeigt. Die positiven Klone wurden anschließend sequenziert und die Sequenz mit Hilfe der BLAST-Funktion mit der PubMed Online-Datenbank abgeglichen. Insgesamt wurden 108 bisher unbekannte Interaktionspartner von hMLH1 detektiert. Von diesen konnten zahlreiche Proteine den bekannten Funktionen der MMR zugeordnet werden. Von besonderem Interesse sind einige Interaktionspartner aus den Bereichen Zellzyklus Regulation (ANXA6, LPP2, NDRG1, PTP4A2/RH, RAPGEFL1, SPTLC2 und ARAF1), Apoptose (CTSB, CAPN5, DDX47, DES und Atmungskettenproteine) und ribosomale Proteine (EIF2A, EEF2, RPS2, RPS5 und RPS16). Weitere Untersuchungen müssen zeigen, welche dieser Interaktionspartner sich möglicherweise als prognostische bzw. prädiktive Biomarker nutzen lassen. Weiterhin könnten sich durch fundierte Kenntnis der Interaktion von MMR und Zellzyklus Regulation bzw. Apoptose neue Ansatzpunkte bei der Entwicklung zukünftiger therapeutischer Substanzen ergeben.
Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung lichtinduzierter Strukturänderungen verschiedener photoschaltbarer Moleküle durch zeitaufgelöste Infrarotspektroskopie. Hierzu war es notwendig, eine komplexe Messapparatur zu konzipieren, aufzubauen und zu optimieren. Das entwickelte Anreg-/Abtast-Experiment ermöglicht die Messung kleinster transienter Absorptionsänderungen (delta A<1E-5) im Spektralbereich von 1000 cm^-1 bis 2500 cm^-1 mit einer Zeitauflösung von etwa 0,3 ps. Es können Anregungspulse im Bereich von 258nm bis über 600nm generiert werden. Über ein computergesteuertes Wellenplättchen kann die Polarisation des Anregungslichtes während der Datenaufnahme variiert werden, was eine Auswertung hinsichtlich der molekularen Anisotropie ermöglicht. Die eingesetzten Probenzellen gestatten die Untersuchung geringster Probenmengen (V <20µL) bei Temperaturen bis zu 50°C. Nitrophenylacetat (NPA) wurde hinsichtlich seiner Photodecarboxylierungsreaktion untersucht. Für alle drei Konstitutionsisomere konnte nachgewiesen werden, dass die Freisetzung von CO2 innerhalb von 1 ns erfolgt. Es zeigen sich signifikante Unterschiede zwischen den Reaktionsverläufen der drei Konstitutionen, wobei die erhaltenen Amplituden der Photoproduktspektren mit den bekannten Decarboxylierungsquantenausbeuten korrelieren. Die globale Analyse ergibt einen multiexponentiellen Aufbau des CO2-Signals. Im Fall von meta- und para-NPA erfolgt die Abspaltung von CO2 über einen dominanten Zerfallskanal mit einer Zeitkonstante von t~200 ps. Quantenchemische Rechnungen legen nahe, dass dieser Hauptreaktionspfad über den Triplettzustand verläuft. Bei ortho- NPA wird dieser Zerfallskanal effektiv gequencht, was mit einer schnellen Deaktivierung des angeregten Singulettzustandes durch einen intramolekularen Protonentransfer erklärt wird. Nach diesen Messungen steht fest, dass meta-Nitrophenylacetat hervorragend als caged compound für CO2 geeignet ist. Die Primärdynamik von solubilisiertem Proteorhodopsin (PR) in D2O wurde im infraroten und sichtbaren Spektralbereich sowohl bei saurem als auch bei alkalischem pD-Wert untersucht. Dies erlaubt den direkten Vergleich der in beiden Spektralbereichen gemessenen Daten. Der primäre Protonenaktzeptor Asp97 liegt dabei entweder protoniert (pD=6,4) oder deprotoniert (pD=9,2) vor. Die transienten vis-Absorptionsspektren ergaben, wie bei PR in H2O, einen biexponentiellen Zerfall des angeregten Zustands und die gleichzeitige Bildung des PRK-Photoproduktes. Die Abweichung der bei PR in D2O ermittelten Werte von den publizierten Zeitkonstanten der H2O-Messung wird als kinetischer Isoptopeneffekt interpretiert. Dieser variiert mit dem pD-Wert, was auf Unterschiede der Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerke in der Retinalumgebung hinweist. Die Signaturen der transienten Infrarotspektren werden den C=C- und C=N-Moden des Retinals sowie der Amid I-Mode des Proteins zugeordnet. Es konnte ebenfalls die Bildung des PRK-Produktes nachgewiesen werden, wobei die Isomerisierungsquantenausbeute des Retinals unabhängig von der Protonierung von Asp97 ist. Die im IR bestimmten Zeitkonstanten sind dabei unabhängig vom pD-Wert und weichen von den im Sichtbaren ermittelten Werten ab. Dieser Befund wird mit dem Einfluss der molekularen Temperatur auf die transienten IR-Spektren und dem Auftreten von Kühlprozessen erklärt. Zusätzlich zum Wildtyp-Protein wurde die PR-D97N-Mutante als Modellsystem für PR im sauren pH-Bereich ebenfalls im vis- und IR-Bereich untersucht. Die dabei erzielten Ergebnisse stehen im Einklang mit den bisherigen Ausführungen. Der geringe kinetische Isotopeneffekt weist auf ein ähnliches Wasserstoffbrückennetzwerk wie beim Wildtyp unter sauren Bedingungen hin. Als letztes wurde ein synthetisches Modellcollagen untersucht. Die Seitenkettenverbrückung der Peptidsequenz mit einem Azobenzol-basierten, künstlichen Photoschalter sollte eine lichtinduzierte Entfaltung der Tertiärstruktur ermöglichen. Der isolierte Photoschalter und die gekoppelte Sequenz wurden zunächst unter Gleichgewichtsbedingungen sowohl im UV/vis- als auch im IR -Bereich umfangreich spektroskopisch charakterisiert. Diese Messdaten lagen zum großen Teil bereits vor und wurden in dieser Arbeit einer detaillierten Auswertung unterzogen. Für den isolierten Schalter konnte im IR-Bereich eine umfassende Bandenzuordnung erstellt werden. Dabei wird im photostationären Gleichgewicht eine reversible trans-> cis-Isomerisierung festgestellt, welche keine Temperaturabhängigkeit aufweist. Darüberhinaus wurden polarisationsabhängige, transiente IR-Spektren des isolierten Azoschalters für die trans->cis- und die cis->trans-Isomerisierungsrichtung aufgenommen. Die instantan auftretenden, markanten Differenzsignale können den Amid I- und Amid II-Moden der im Schalter enthaltenen Peptidbindungen sowie den Phenylmoden zugeordnet werden. Die extrahierten kinetischen Parameter sind für beide Isomere nahezu identisch, was durch einen dominanten Beitrag molekularer Kühlprozesse erklärt werden kann. Aufgrund der geringen Isomerisierungsquantenausbeute (< 10 %) können die Differenzspektren der photostationären Gleichgewichte nicht in den Produktspektren dieser Messungen reproduziert werden. Hinsichtlich der ermittelten Anisotropieparameter ergeben sich kleine Unterschiede zwischen beiden Datensätzen. Zusammen mit theoretischen Modellierungen werden diese in Zukunft genauere Aussagen über die Strukturen der Isomere erlauben. Die UV/vis-Absorptionsspektren des gekoppelten Systems zeigen, dass die Absorptionsbanden des Azoschalters durch die Kopplung an das Collagen nicht signifikant beeinflusst werden. Im IR-Absorptionsspektrum konnten wichtige Amid I-, Amid II- und Amid II0-Banden des Azoschalters und der Peptidsequenz sowie eine große Anzahl weiterer Banden zugeordnet werden. Temperaturabhängige Absolut- und Differenzspektren im UV/vis- und IR-Bereich zeigen eine irreversible thermische Denaturierung der Collagentripelhelix ab etwa 50°C. Das verwendete, deuterierte Lösungsmittelgemisch führt zu einem H/D-Austausch. Anhand der Amid II-Bande der in der tripelhelikalen Struktur geschützten Glycine kann die Existenz der Collagenstruktur und ihre Entfaltung nachgewiesen werden. Die Amplituden der photostationären Differenzspektren sind jedoch kleiner als beim isolierten Schalter, was auf eine verringerte Isomerisierungsquantenausbeute hinweist. Die bei Erwärmung beobachtete Vergrößerung der Differenzsignale wird mit einer effizienteren Isomerisierung nach dem Aufschmelzen der Tripelhelix erklärt. Für die trans->cis-Isomerisierungsrichtung wurden transiente IR-Spektren des Azocollagens bei unterschiedlichen Temperaturen aufgenommen. Alle instantan auftretenden Differenzsignale können auf die Schwingungsmoden des Azoschalters zurückgeführt werden. Bei einer Temperatur von 50°C lässt sich ein Einfluss der Peptidsequenz auf die transienten Spektren nicht nachweisen, was mit einer aufgeschmolzenen Tertiärstruktur im Einklang ist. Hingegen wird bei 20°C das Ausbleichen von Amid I-Schwingungsbanden der Peptidsequenz beobachtet, was eindeutig einen Energietransfer auf diese Moden zeigt. Bei 35°C sind die Bleichsignale des Collagens in diesem Bereich bereits deutlich abgeschwächt. Die transienten Spektren des isolierten Azoschalters besitzen keine derartige Temperaturabhängigkeit.
The glycine receptor (GlyR) is the major inhibitory neurotransmitter receptor in spinal cord and brainstem. Heteropentameric GlyRs are clustered and anchored at inhibitory postsynaptic sites by the binding of the large intracellular loop between transmembrane domains 3 and 4 of the GlyRbeta subunit (GlyRbeta-loop) to the cytoplasmic scaffolding protein gephyrin. GlyRs are also cotransported with gephyrin along microtubules in the anterograde and retrograde direction due to the binding of gephyrin to microtubule-associated motor proteins. Additionally, GlyRs undergo lateral diffusion in the plasma membrane from extrasynaptic to synaptic sites and vice versa. Since its discovery, gephyrin has remained for many years the only binding partner interacting directly with the GlyRbeta subunit. In an attempt to elucidate further mechanisms involved in GlyR function and regulation at inhibitory postsynaptic sites, a proteomic screen for putative binding partners to the GlyRbeta loop was performed. Three proteins were identified as putative interactors. In this thesis, the interaction between these putative binding proteins and the GlyRbeta subunit was analyzed and characterized. Binding studies with glutathione-S-transferase fusion proteins revealed that all putative binding proteins, Syndapin (Sdp), Vacuolar Protein Sorting 35 (Vps35) and Neurobeachin (Nbea), interact specifically with the GlyRbeta loop. The Sdp family of proteins are F-BAR and SH3 domain containing proteins. Inmmunocytochemical experiments showed that SdpI as well as the isoforms SdpII-S and SdpIIL colocalize with the full-length GlyRbeta subunit in a mammalian cell expression system. In cultured spinal cord neurons, a partial colocalization of endogenous SdpI with several excitatory and inhibitory synaptic markers was demonstrated. Mapping experiments using deletion mutants narrowed the SdpI binding site down to 22 amino acids. Peptide competition experiments confirmed the specificity of the interaction between SdpI and this sequence of the GlyRbeta subunit. Point mutation analysis revealed a SH3-proline rich domain dependent interaction between SdpI and the GlyRbeta subunit, respectively. In addition, binding studies in mammalian cells showed that both splice variants of SdpII as well as SdpI interact with the GlyR scaffolding protein gephyrin. Although the SdpI and gephyrin binding sites do not overlap, protein competition studies revealed that interaction of the E-domain of gephyrin with the GlyRbeta loop interferes with SdpI binding. Since SdpI is a dynamin binding protein involved in vesicle endocytosis and recycling pathways, a possible function of SdpI in the regulation of GlyR synaptic distribution was investigated. Co-immunoprecipitation experiments confirmed a SdpI-GlyR association in the vesicle-enriched fraction of rat spinal cord tissue. Immunocytochemical studies of SdpI knock out mice showed that the clustering and distribution of GlyRs in the brain stem is unchanged. However, acute down-regulation of SdpI in rat spinal cord neurons by viral shRNA expression led to a reduction in the number and size of GlyR clusters, an effect that could be rescued upon shRNA-resistant SdpI overexpression. Further immunocytochemical analysis of the localization of gephyrin, the gamma2 subunit of the type A gamma-aminobutyric acid receptor (GABAARgamma2 subunit) and the vesicular inhibitory amino acid transporter (VIAAT) under SdpI knock-down conditions showed that both the number and average size of the gamma2-subunit containing GABAA receptor clusters were significantly reduced in spinal cord neurons. In contrast to GlyR and GABAARgamma2 immunoreactivity, the number and average size of gephyrin and VIAAT clusters were barely reduced upon SdpI downregulation. These results suggest that SdpI has a role in GlyR trafficking that can be compensated by other syndapin isoforms or other trafficking pathways. Furthermore, SdpI might be required for the clusters of GlyRs and gamma2-subunit containing GABAARs in spinal cord and brainstem. Vps35 is the core protein of the retromer complex, which mediates the endosome to Golgi apparatus retrieval of different types of receptors in mammals and yeast. Here, protein-protein interaction assays revealed for the first time that Vps35 interacts directly with the GlyRbeta loop as well as with gephyrin. The generation of specific Vps35 antibodies allowed to determine the distribution of this protein in the central nervous system. Immunocytochemical analyses revealed the presence of Vps35 in the somata and neurites of spinal cord neurons, suggesting a possible interaction of Vps35 with the GlyR under physiological conditions. Nbea is a BEACH domain containing, neuron-specific protein. Binding studies revealed a direct interaction between two regions of Nbea and the GlyRbeta loop. Immunocytochemical experiments confirmed a somatic and synaptic distribution of Nbea in primary cultures. In spinal cord neurons, a partial colocalization of Nbea with excitatory and inhibitory synaptic markers suggests a possible interaction of Nbea with the GlyR at inhibitory synaptic sites.
Summary: Information and communication is critical to the successful management of infectious diseases because an effective communication strategy prevents the surge of anxious patients who have not been genuinely exposed to the pathogen ('low risk patients') affecting medical infrastructures (1) and the future transmission of the infectious agent (2). Surge of low risk patients: The arrival of large numbers of low risk patients at hospitals following an infectious diseases emergency would be problematic for three main reasons. First, it would complicate the situation at hospitals receiving exposed patients, delaying the treatment of the acutely ill, creating difficulties of crowd control and tying up medical resources. Second, for the low risk patients themselves, attending hospital following an infectious disease emergency might increase their risk of exposure to the agent in question. Third, the needs of low risk patients may be poorly attended to at hospitals which are already overstretched dealing with medical casualties. Future transmission: Obtaining early information about symptoms and isolating infected patients is the most effective strategy to interrupt the chain of infection in the public in the absence of specific prophylaxis or treatment. Particularly at the beginning of an outbreak, these nonpharmaceutical interventions play an important role in enabling the early detection of signs or symptoms and in encouraging passengers to adopt appropriate preventive behaviour in order to limit the spread of the disease. This thesis includes two papers dealing with this problem: The first part is a systemic literature review of information needs following an infectious disease emergency (Anthrax, SARS, Pneumonic Plague). The key question was: what are the information needs of the public during an infectious disease emergency? The second part is an empirical investigation of information needs and communication strategies at the airport during the early stage of the Influenza Pandemic. The key question here was: what communication strategies help to meet the information needs and to enable the public to behave appropriately and responsibly? Conclusions: Evidence from the anthrax attacks in the United States suggested that a surge of low risk patients is by no means inevitable. Data from the SARS outbreak illustrated that if hospitals are seen as sources of contagion, many patients with non-bioterrorism related health care needs may delay seeking help. Finally, the events surrounding the Pneumonic Plague outbreak of 1994 in Surat, India, highlighted the need for the public to be kept adequately informed about an incident to avoid creating rumours. Clear, consistent and credible information is key to the successful management of infectious disease outbreaks. The results of the empirical investigation suggested that the desire for information is a reflection of current anxiety and does not mirror the objective scientific assessment of exposure. The airport study showed that perceived information needs were directly related to anxiety – the least anxious did not require any further information, the most anxious reported significant information needs concerning medical treatment, public health management and the assessment of the ongoing situation – irrespective of their actual exposure. A communication strategy only focussing on the 'real' exposed individuals neglects the information needs of those worrying about having contracted the virus and seeking medical attendance. Effective communication strategies should enable the general public to detect early signs or symptoms and provide them with behaviour advice to prevent the further transmission of the infectious agent. These include the provision of clear information about the incident, the symptoms and what to do to prevent the further transmission, detailed and regularly updated information in various media formats (telephone, internet, etc.) and rapid triage at hospital entrances to guide patients to the appropriate medical infrastructures. Relevance: These research findings could contribute to a shift in the organisational and communicative approach responding to infectious diseases outbreaks and could be considered relevant for future risk communication and policy decision making.
Um Materie mit Nanometergenauigkeit anzuordnen, ist Selbstorganisation die mächtigste Strategie. DNA (Desoxyribonukleinsäure) ist hierfür ein hervorragendes Baumaterial, da sie ein billiges, programmierbares, biokompatibles und gut verstandenes Polymer ist. Aus diesen Gründen ist DNA zur Basis für ein schnell wachsendes Gebiet geworden: die DNA-Nanotechnologie. Das Ziel dieser Arbeit war es, neue Interaktionsmöglichkeiten für die DNA-Nanotechnologie zu entwickeln und neuartige Strukturen aus DNA-minicircles aufzubauen, einem bislang vernachlässigten Konstruktionselement. ...
Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht eine Untersuchung zum internationalen Talent-austausch, zur Mobilität und zur Ausbildung von medizinischen und natur-wissenschaftlichen Hochschulabsolventinnen und -absolventen des institutionellen BMEP-Programms (BMEP/Biomedical-Exchange-Program) während des Studiums und beim Übergang ins Berufsleben. Das transatlantische Biomedical Exchange Programm ist ein Programm zum Talentaustausch von Graduierten und Post-Graduierten mit den USA und verankert Innovations- und Wissenstransfer-Forschung von universitärer und industrieller Welt in der Life-Science-Industrie1). Das Programm wurde im Jahr 1979 von Prof. Dr. John Boylan, Prof. of Medical and Physiology an der University of New York, Buffalo und Medical School Farmington (Connecticut) und Prof. Dr. Hilmar Stolte von der Medizinischen Hochschule Hannover ins Leben gerufen. Es handelt sich um eine soziologische Aufgabenstellung mit der thematischen Zielsetzung im Bereich der Karriereforschung. Die Untersuchung hat geklärt, ob internationale Ausbildung und interdisziplinäres Wissen einen Wissensvorsprung bedingen, der sich im Hinblick auf internationale Karrieren und Führungspositionen in unserer heutigen Wissens-gesellschaft auswirkt. Um die Arbeit in den bestehenden Forschungskontext einzuordnen, ist es notwendig, sowohl soziologische als auch ökonomische Teilgebiete der Karriere-, Qualifikations- sowie Mobilitätsforschung zu berücksichtigen, was in den Kapitel 3 und Kapitel 4 dargestellt wird. Die Arbeit ist eine erstmalige empirische Untersuchung über das institutionelle, transatlantische und interdisziplinäre Biomedical-Exchange-Program (BMEP) zum Talentaustausch von medizinischen und naturwissenschaftlichen Studenten mit den USA auf der Ebene von universitärer und industrieller Welt. Um die Effektivität und Leistungsfähigkeit des institutionellen BMEP-Programms zu evaluieren, wurden je drei ehemalige Absolventen pro Jahrgang des Programms der Jahrgänge 1979-2004 mit Hilfe eines Fragebogens befragt. Die Untersuchung befasst sich schwerpunktmäßig mit den ursprünglichen Intentionen und Motiven der Teilnehmer, den Schwierigkeiten, die sich auf diesem Wege in die USA ergeben haben und den Absichten, die verwirklicht werden konnten. Sie fragt, ob erfolgreiche internationale Karrieren durch die Teilnahme am BMEP-Programm entstanden sind, sowie Unternehmertum, Selbständigkeit und internationale Science Frontier-Kontakte und ob im Laufe des Programms Publikationen entstanden sind. ....
This thesis investigates the development of early cognition in infancy using neural network models. Fundamental events in visual perception such as caused motion, occlusion, object permanence, tracking of moving objects behind occluders, object unity perception and sequence learning are modeled in a unifying computational framework while staying close to experimental data in developmental psychology of infancy. In the first project, the development of causality and occlusion perception in infancy is modeled using a simple, three-layered, recurrent network trained with error backpropagation to predict future inputs (Elman network). The model unifies two infant studies on causality and occlusion perception. Subsequently, in the second project, the established framework is extended to a larger prediction network that models the development of object unity, object permanence and occlusion perception in infancy. It is shown that these different phenomena can be unified into a single theoretical framework thereby explaining experimental data from 14 infant studies. The framework shows that these developmental phenomena can be explained by accurately representing and predicting statistical regularities in the visual environment. The models assume (1) different neuronal populations processing different motion directions of visual stimuli in the visual cortex of the newborn infant which are supported by neuroscientific evidence and (2) available learning algorithms that are guided by the goal of predicting future events. Specifically, the models demonstrate that no innate force notions, motion analysis modules, common motion detectors, specific perceptual rules or abilities to "reason" about entities which have been widely postulated in the developmental literature are necessary for the explanation of the discussed phenomena. Since the prediction of future events turned out to be fruitful for theoretical explanation of various developmental phenomena and a guideline for learning in infancy, the third model addresses the development of visual expectations themselves. A self-organising, fully recurrent neural network model that forms internal representations of input sequences and maps them onto eye movements is proposed. The reinforcement learning architecture (RLA) of the model learns to perform anticipatory eye movements as observed in a range of infant studies. The model suggests that the goal of maximizing the looking time at interesting stimuli guides infants' looking behavior thereby explaining the occurrence and development of anticipatory eye movements and reaction times. In contrast to classical neural network modelling approaches in the developmental literature, the model uses local learning rules and contains several biologically plausible elements like excitatory and inhibitory spiking neurons, spike-timing dependent plasticity (STDP), intrinsic plasticity (IP) and synaptic scaling. It is also novel from the technical point of view as it uses a dynamic recurrent reservoir shaped by various plasticity mechanisms and combines it with reinforcement learning. The model accounts for twelve experimental studies and predicts among others anticipatory behavior for arbitrary sequences and facilitated reacquisition of already learned sequences. All models emphasize the development of the perception of the discussed phenomena thereby addressing the questions of how and why this developmental change takes place - questions that are difficult to be assessed experimentally. Despite the diversity of the discussed phenomena all three projects rely on the same principle: the prediction of future events. This principle suggests that cognitive development in infancy may largely be guided by building internal models and representations of the visual environment and using those models to predict its future development.
Die P-Typ-ATPasen finden sich in allen Domänen des Lebens und stellen die größte Gruppe aktiver Ionentransporter in Zellen dar. Es handelt sich bei den P-Typ-ATPasen um integrale Membranproteine, die eine große Anzahl verschiedenster Ionen aktiv über eine biologische Membran transportieren. Die für diesen Ionentransport notwendige Energie wird durch Bindung und Hydrolyse von Adenosintriphosphat (ATP) und durch Phosphorylierung des Enzyms gewonnen. Diese, im cytoplasmatischen Teil gewonnene Energie, muss für den Ionentransport von der Phosphorylierungsstelle zur räumlich entfernten transmembranen Ionenbindungsstelle übertragen werden, bei dem das Protein einem Reaktionszyklus mit zwei Hauptkonformationszuständen E1 und E2 unterliegt. Zwischen diesen beiden Zuständen finden große strukturelle Änderungen statt, durch die die Ionenaffintät und die Zugänglichkeit der Ionenbindungsstelle reguliert wird. Da dieser Mechanismus der Energiegewinnung für alle Ionenpumpen dieser Art ähnlich ist, wurde die Ca2+-ATPase und die Na+/K+-ATPase als Modellproteine für die Untersuchung molekularer Mechanismen in P-Typ-ATPasen ausgewählt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit soll die Energietransduktion in P-Typ-ATPasen im Allgemeinen und der Protonengegentransport bzw. ein potentieller Protonentransportweg in der Ca2+-ATPase im Speziellen untersucht werden. Die beiden oben genannten Mechanismen sollen mittels computergestützter Methoden analysiert werden. Vor allem die Ca2+-ATPase ist prädestiniert für computergestützte Untersuchungen, da für diese sehr viele hochaufgelöste Röntgenstrukturdaten vorliegen, wenn auch bisher aufgrund der Größe und Komplexität des Systems nur sehr wenige theoretische Arbeiten durchgeführt wurden. Um den Energietransduktionsmechanismus in P-Typ-ATPasen zu untersuchen, wurde mittels Elektrostatik-Rechnungen der Einfluss eines elektrischen Feldes auf die verschiedenen Transmembranhelices untersucht. Dazu wurde ein Simulationssystem entwickelt, welches aus einem molekularen Kondensator besteht, der im Modell das Anlegen eines homogenen elektrischen Feldes über den Transmembranbereich simuliert. Da es sich bei dem Energietransduktionsmechanismus um einen dynamischen Prozess handelt, wurden die Elektrostatik-Rechnungen um Molekulardynamik-Simulationen erweitert. Mit diesen kann die konformelle Dynamik der P-Typ-ATPasen während der Energietransduktion in die Elektrostatik-Rechnungen einbezogen werden. Aus Spannungsklemmen-Fluorometrie-Experimenten, bei denen eine Spannung über eine Membran angelegt wird, kann geschlossen werden, dass die Helix M5 für die Energietransduktion verantwortlich ist. Mit den in dieser Arbeit durchgeführten Elektrostatik-Rechnungen konnte für verschiedene Enzymzustände der Ca2+-ATPase und für die Na+/K+-ATPase gezeigt werden, dass die Helix M5 die größten Konformeränderungen aufgrund des elektrischen Feldes aufweist. Durch die Erweiterung der Elektrostatik-Rechnungen um die Methode der Molekulardynamik-Simulation konnte zusätzlich die elektrische Feldstärke reduziert werden. Auch dabei zeigte sich, dass auf der Helix M5 die meisten Rotameränderungen durch das elektrische Feld induziert werden. Die aus Experimenten vermutete Rolle der Helix M5 als wichtiges Energietransduktionselement ließ sich mit diesen Simulationsrechnungen bestätigen. Um einen möglichen Protonenweg durch den Transmembranbereich der Ca2+-ATPase aufzuklären, wurden explizite Wassermoleküle in sechs verschiedene Enzymzustände der Ca2+-ATPase eingefügt. Aus Experimenten ist bekannt, dass in der Ca2+-ATPase ein Protonengegentransport stattfindet. Deshalb wurden für verschiedene Enzymzustände der Ca2+-ATPase mittels Elektrostatik-Rechnungen die Protonierungen der eingefügten Wassermoleküle sowie der titrierbaren Aminosäuren bestimmt. Aus den Ergebnissen dieser Rechnungen kann geschlossen werden, dass es sich bei dem Protonentransfer nicht um einen linearen Transport der Protonen handelt. Die Untersuchungen zeigen einen mehrstufigen Prozess, an dem Protonen in verschiedenen Transmembranbereichen der Ca2+-ATPase beteiligt sind. Anhand der berechneten Protonierungszustände der eingefügten Wassermoleküle und der pK-Werte der Aminosäuren im Transmembranbereich konnte weiterhin ein möglicher Protonenweg identifiziert werden.
Die Hämodialyse ist ein etabliertes Verfahren zur Behandlung der terminalen Niereninsuffizienz. Sowohl in Deutschland, als auch international, ist eine Zunahme der Erkrankungshäufigkeit für die terminale Niereninsuffizienz festzustellen, in erster Linie aufgrund einer diabetischen oder hypertonen Nephropathie. Die arteriovenöse Fistel (AVF) hat sich als beste Form des Gefäßzuganges für die Hämodialyse erwiesen. Eine mögliche Komplikation der AVF ist das Dialyseshunt assoziierte Steal-Syndroms (DASS). Die Inzidenz des DASS wird in der Literatur mit 1-8% angegeben, als Risikofaktoren gelten unter anderem Alter und Diabetes mellitus- gerade die Faktoren, die auch für die Zunahme der Nierenerkrankungen verantwortlich sind. Daher ist für die Zukunft mit einem Anstieg der Inzidenz für das DASS unter den über einen Shunt dialysierten, terminal niereninsuffizienten Patienten zu rechnen. Die einzig erfolgsversprechende Behandlung des DASS erfordert ein chirurgisches Vorgehen, andernfalls drohen irreversible trophische Störungen. Ziel der Therapie ist die Beseitigung der Ischämie unter Erhalt der Shuntfunktion. In der vorgestellten Bi-Centerstudie konnten 76 DRIL- Prozeduren ausgewertet werden, die zwischen Mai 1996 und Januar 2008 in der Klinik für Gefäß- und Endovascularchirurgie der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt und in der Chirurgischen/Gefäßchirurgischen Klinik des St. Martinus- Hospitals Olpe an 69 Patienten durchgeführt worden sind. Dabei konnte gezeigt werden, dass die erstmals von Schanzer et al. 1988 beschriebene DRIL- Prozedur geeignet ist, dieses Therapieziel auch langfristig zu erfüllen. Die kombinierte Offenheitsrate sowohl des DRIL- Bypasses als auch des Shunts post DRIL-Prozedur mit Regression oder Beseitigung der Ischämiesymptomatik betrug nach 6 Monaten 89,5%, nach 12 Monaten 80,2% und nach 5 Jahren 60,8%. Die theoretischen Überlegungen zum Verständnis der beim DASS vorliegenden hämodynamischen Verhältnisse erklären die Effektivität der Prozedur und die Überlegenheit gegenüber anderen Verfahren. Schlussfolgerung: Trotz des überwiegend betroffenen multimorbiden Patientenguts ist die technische Durchführbarkeit der DRIL-Prozedur erprobt, sicher und führt zum prompten und nachhaltigen Verschwinden der Ischämiebeschwerden, ohne die Shuntfunktion zu kompromittieren. Aus diesem Grund gehört die DRIL- Prozedur in das Portfolio jedes Shuntchirurgen.
This thesis consists of four chapters. Each chapter covers a topic in international macroeconomics and monetary policy. The first chapter investigates the impact of unexpected monetary policy shocks on exchange rates in a multi-country econometric model. The second chapter examines the linkage between macroeconomic fundamentals and exchange rates through the monetary policy expectation channel. The third chapter focuses on the international transmission of bank and corporate distress. The last chapter unfolds the interest rate channel of monetary policy transmission in-an emerging economy-China, where regulations and market forces co-exist in this transmission.
In der vorliegenden Dissertation wird die Frage der Vereinheitlichung der Quantentheorie mit der Allgemeinen Relativitätstheorie behandelt, wobei entsprechend dem Titel der Arbeit der Beziehung der Grundbegriffe der beiden Theorien die entscheidende Bedeutung zukommt. Da das Nachdenken über Grundbegriffe in der Physik sehr eng mit philosophischen Fragen verbunden ist, werden zur Behandlung dieser Thematik zunächst in einem Kapitel, das die vier jeweils drei Kapitel umfassenden Teile vorbereitet, die Entwicklung der Theoretischen Physik betreffende wissenschaftstheoretische Betrachtungen sowie einige wesentliche Gedanken aus der Klassischen Philosophie vorgestellt, welche für die weitere Argumentation wichtig sind. Bei letzteren geht es neben einer kurzen Schilderung der Platonischen Ideenlehre in Bezug auf ihre Relevanz für die Physik insbesondere um die Kantische Auffassung von Raum und Zeit als a priori gegebenen Grundformen der Anschauung, deren Bezug zur Evolutionären Erkenntnistheorie ebenfalls thematisiert wird. In den beiden ersten Teilen werden die wesentlichen Inhalte der Allgemeinen Relativitätstheorie und der Quantentheorie vorgestellt, wobei der Deutung der beiden Theorien jeweils ein Kapitel gewidmet wird. In Bezug auf die Allgemeine Relativitätstheorie wird diesbezüglich die Bedeutung der Diffeomorphismeninvarianz herausgestellt und in Bezug auf die Quantentheorie wird zunächst die Grundposition der Kopenhagener Deutung verdeutlicht, die im Mindesten als eine notwendige Bedingung zum Verständnis der Quantentheorie angesehen wird, um anschließend eine Analyse und Interpretation des Messproblems und vor allem entscheidende Argumente für die grundlegende Nichtlokalität der Quantentheorie zu geben. Im dritten Teil der Arbeit wird die seitens Carl Friedrich von Weizsäcker in der zweiten Hälfte des letzten Jahrhunderts entwickelte Quantentheorie der Ur-Alternativen beschrieben, in welcher die universelle Gültigkeit der allgemeinen Quantentheorie begründet und aus ihr die Existenz der in der Natur vorkommenden Entitäten hergeleitet werden soll, auf deren Beschreibung die konkrete Theoretische Physik basiert. Es werden sehr starke Argumente dafür geliefert, dass diese Theorie von den bislang entwickelten Ansätzen zu einer einheitlichen Theorie der Natur, welche die heute bekannte Physik in sich enthält, die vielleicht aussichtsreichste Theorie darstellt und damit die Aussicht bietet, auch für das Problem der Suche nach einer Quantentheorie der Gravitation den richtigen begrifflichen Rahmen zu bilden. Ihre große Glaubwürdigkeit erhält sie durch eine die Klassische Philosophie miteinbeziehende philosophische Analyse der Quantentheorie. Dieses Urteil behält seine Gültigkeit auch dann, wenn die Quantentheorie der Ur-Alternativen aufgrund der ungeheuren Abstraktheit der Begriffsbildung innerhalb der Theorie und der sich hieraus ergebenden mathematischen Schwierigkeiten bisher noch nicht zu einer vollen physikalischen Theorie entwickelt werden konnte. Die alles entscheidende Kernaussage dieser Dissertation besteht darin, dass aus einer begrifflichen Analyse der Quantentheorie und der Allgemeinen Relativitätstheorie mit nahezu zwingender Notwendigkeit zu folgen scheint, dass die physikalische Realität auf fundamentaler Ebene nicht-räumlich ist. Dies bedeutet, dass die These vertreten wird, dass es sich bei dem physikalische Raum, wie er gewöhnlich schlicht vorausgesetzt wird, wenn auch in unterschiedlicher Struktur, in Wahrheit nur um eine Darstellung dahinterstehender dynamischer Verhältnisse nicht-räumlicher Objekte handelt. Diese These stützt sich auf die Diffeomorphismeninvarianz in der Allgemeinen Relativitätstheorie und in noch höherem Maße auf die Nichtlokalität in der Quantentheorie, welche sich wiederum nicht nur in konkreten für die Quantentheorie konstitutiven Phänomenen, sondern dazu parallel ebenso im mathematischen Formalismus der Quantentheorie manifestiert. In Kombination mit der Kantischen Behandlung von Raum und Zeit ergibt sich damit ein kohärentes Bild in Bezug auf die eigentliche Natur des Raumes. Die Quantentheorie der Ur-Alternativen ist diesbezüglich als einzige derzeit existierende Theorie konsequent, indem sie auf der basalen Ebene den Raumbegriff nicht voraussetzt und rein quantentheoretische Objekte als fundamental annimmt, aus deren Zustandsräumen sie die Struktur der Raum-Zeit allerdings zu begründen in der Lage ist. Damit befinden sich diese fundamentalen durch Ur-Alternativen beschriebenen Objekte nicht in einem vorgegebenen Raum, sondern sie konstituieren umgekehrt den Raum. Dies ist eine Tatsache von sehr großer Bedeutung. Im vierten Teil wird schließlich die vorläufige Konsequenz aus diesen Einsichten gezogen. Nach einer kurzen Behandlung der wichtigsten bisherigen Ansätze zu einer quantentheoretischen Beschreibung der Gravitation, wird die Bedeutung der Tatsache, dass die Allgemeine Relativitätstheorie und die Quantentheorie eine relationalistische Raumanschauung nahelegen, nun konkret in Bezug auf die Frage der Vereinheitlichung der beiden Theorien betrachtet. Das bedeutet, dass das Ziel also letztlich darin besteht, einen Ansatz zu einer quantentheoretischen Beschreibung der Gravitation zu finden, bei der so wenig räumliche Struktur wie möglich vorausgesetzt wird. In Kapitel 12 wird diesbezüglich ein von mir entwickelter Ansatz vorgestellt, um zumindest eine Theorie zu formulieren, bei der die metrische Struktur der Raum-Zeit nicht vorausgesetzt sondern in Anlehnung an die Eigenschaften eines fundamentalen Spinorfeldes konstruiert wird, das im Sinne der Heisenbergschen einheitlichen Quantenfeldtheorie die Elementarteilchen einheitlich beschreiben soll. Dieser Ansatz geht bezüglich der Sparsamkeit der Verwendung von a priori vorhandener räumlicher Struktur über die bisherigen Ansätze zu einer Quantentheorie der Gravitation hinaus. Er ist aber dennoch nur als ein erster Schritt zu verstehen. Die konsequente Weiterführung dieses Ansatzes würde in dem Versuch bestehen, eine Verbindung zur von Weizsäckerschen Quantentheorie der Ur-Alternativen herzustellen, die überhaupt keine räumliche Struktur mehr voraussetzt. Hierzu konnten bisher nur aussichtsreiche Grundgedanken formuliert werden. Es wird allerdings basierend auf den in dieser Dissertation dargelegten Argumentationen die Vermutung aufgestellt, dass es im Rahmen der von Weizsäckerschen Quantentheorie der Ur-Alternativen möglich ist, eine konsistente quantentheoretische Beschreibung der Gravitation aufzustellen. In jedem Falle scheint die Quantentheorie der Ur-Alternativen die einzige Theorie zu sein, die aufgrund ihrer rein quantentheoretischen Natur in ihrer Begriffsbildung grundsätzlich genug ist, um eine Aussicht zu bieten, diejenige Realitätsebene zu erfassen, in welcher die Dualität zwischen der Quantentheorie und der Allgemeinen Relativitätstheorie zu einer Einheit gelangt.
Viele bösartige Tumore wie das kolorektale Karzinom oder das Mamma-Karzinom metastasieren in die Leber. Je nach Primarius kommen unterschiedliche Therapiestrategien in Frage. Die Laserinduzierte Thermotherapie (LITT) gehört neben vielen anderen minimalinvasiven Therapieformen zu den Thermotherapien und stellt eine Ergänzung zur Operation oder Chemotherapie dar und kann auch besonders bei isoliertem Leberbefall als alleinige Therapiestrategie angewandt werden. Vorteile sind die ambulante Durchführbarkeit und eine geringe Komplikationsrate. Nach CT-gesteuerter Punktion der Metastasen wird die Therapie unter Online-Monitoring im MRT mittels thermosensitiver Sequenzen überwacht. Unter Einwirkung der Laserphotonen auf das Lebergewebe kommt es durch Energieabsorption zu einer Erwärmung und Zerstörung des tumorösen Gewebes. Da der Energiebedarf zur Zerstörung der Metastasen auch bei volumengleichen Läsionen sehr schwankt, galt es anhand dieser Arbeit herauszufinden, ob ein Zusammenhang zwischen dem Energiebedarf und der im CT gemessenen Leberdichte besteht. Hierzu wurden 168 Patienten mit 279 Lebermetastasen unterschiedlicher Herkunft in die Studie eingeschlossen, die sich im Zeitraum von März 2006 bis März 2007 einer LITT-Behandlung unterzogen hatten. 55,4 % der Patienten waren mit einer Transarteriellen Chemotherapie (TACE) vorbehandelt, die aufgrund einer Reduzierung des Blutflusses in der Leber zu einem geringeren Energiebedarf führt. Vor der jeweiligen Laserung wurde im Punktions-CT die Leberdichte anhand der Hounsfieldeinheiten und im 24 h-MRT, sowie in den Kontrolluntersuchungen nach 3, 6 und 12 Monaten das Volumen der induzierten Nekrose bestimmt. Der benötigte Energiebedarf konnte aus der Anzahl, der Laufzeit und der Leistung der Laser errechnet werden. Bei Betrachtung der mittleren Nekrosevolumina konnte ein Rückgang in den Kontrolluntersuchungen verzeichnet werden. Dies spricht für Rezidivfreiheit bei der Mehrzahl der Metastasen an der jeweils gelaserten Stelle. Die Analyse der Überlebenszeiten nach der ersten LITT ergab bei einem Beobachtungszeitraum von 25 Monaten im Gesamtkollektiv eine mittlere Überlebenszeit von 21 Monaten, sowie eine kumulative Überlebensrate von 83,33 %. Patienten mit Metastasen des colorektalen Karzinoms wiesen im Mittel eine Überlebenszeit von 22 Monaten und eine Überlebensrate von 86,11 %, die des Mamma-Karzinoms ebenfalls eine mittlere Überlebenszeit von 22 Monaten und eine Überlebensrate von 84,91 % am Ende des Beobachtungszeitraumes auf. HCC-Patienten überlebten im Mittel 19 Monate und hatten eine Überlebensrate von 76,74 % nach 24 Monaten. Hieraus ergeben sich Überlebenszeiten, die deutlich über denen weiterer minimalinvasiver Verfahren, wie der Radiofrequenzablation oder der Mikrowellentherapie liegen. Ein direkter Vergleich mit den konventionellen Therapiemöglichkeiten, wie der chirurgischen Resektion oder der Chemotherapie gelingt bei unterschiedlichen Studiendaten, sowie -voraussetzungen nur schwer. Überlegen ist die LITT gegenüber der chirurgischen Resektion jedoch in der Krankenhausverweildauer und der geringen Invasivität. Gegenüber einer Chemotherapie ist die LITT hinsichtlich einer fehlenden systemischen Therapiekomponente im Nachteil. Nach anfänglicher Untersuchung des Gesamtkollektivs wurden die Patienten in 2 Gruppen unterteilt. Hierbei war das Unterscheidungsmerkmal die Vorbehandlung mit der TACE. Es wurde jeweils die Korrelation des Energiebedarfs mit der Nekrosengröße und den Hounsfieldeinheiten geprüft. Nachdem sich im Gesamtkollektiv und auch in den Untergruppen kein statistisch signifikanter linearer oder einfach exponentieller Zusammenhang zeigte, konnte nach Einteilung der Hounsfieldeinheiten in Dichtebereiche, sowie Berechnung eines mittleren Energiebedarfs nach erneuter Korrelationsberechnung ein positiver Zusammenhang gezeigt werden, so dass bei steigender Gewebsdichte von einem Mehrbedarf an Energie ausgegangen und eine Laserapplikatorenanzahl anhand der Gewebsdichte berechnet werden kann. Da die Streubreite der Werte um den Mittelwert jedoch sehr groß ist, ist fraglich, ob die Berechnung im Vorfeld der Therapie einen Nutzen für die Kosten- und Zeiteffizienz der LITT erbringt. Beim Vergleich des Energiebedarfes der 2 Untergruppen zeigte sich deutlich ein um ca. 0,5 kJ/cm3 niedriger Energiebedarf in der Gruppe der vorembolisierten Patienten, sowie eine im Durchschnitt höhere Gewebsdichte der TACE-Patienten aufgrund geringerer Durchblutung des Lebergewebes nach der Embolisation.