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In der vorliegenden Arbeit werden die angewendeten Kräfte, die von drei Behandlergruppen (Studenten, Zahnärzte und Spezialisten) während der lateralen Kondensation von Guttapercha aufgebracht werden, in Abhängigkeit vom Qualifikationsgrad des Behandlers und der unterschiedlichen Kanalkonizität untersucht. Die Behandlergruppen bestehen aus jeweils 12 Personen. Jeder Proband füllt in folgender Reihenfolge einen vorgefertigten Kunststoffkanal der Konizität .02, .04, .06 und p30 (ProTaper F3) nach der Methode der lateralen Kondensation unter Verwendung von AH plus Sealer und Guttapercha. Dabei werden von einem Kraftsensor die entstehenden vertikalen Kräfte gemessen, aufgezeichnet und dann mittels geeigneter Software hinsichtlich folgender Ergebnisgrößen ausgewertet: • Absolute Maxima der angewendeten Kraft bei Wurzelkanalfüllung • Durchschnittswerte der angewendeten Kraft • Häufigkeitsverteilung der Kraftmesswerte • Zugkraftwerte (Minima der angewendeten Kraft) • Streuungsmaße (Standardabweichung und Varianz) • Anzahl der auftretenden Kraftspitzen pro Kanalfüllung • zugrunde liegende probandenspezifische Füllmuster • Anzahl der zur Kanalfüllung verwendeten Guttaperchastifte • benötigte Kanalfüllzeit Folgende Ergebnisse sind erarbeitet worden: 1. Die 36 Probanden haben durchschnittliche Maximalwerte von 1,10-2,12 kg eingesetzt: Spezialisten wendeten im Mittel 2,12 kg an, Studenten 1,48 kg und Zahnärzte 1,10 kg. 2. Die Durchschnittswerte der eingesetzten Lasten der 36 Probanden liegen zwischen 0,51-0,92 kg: Spezialisten wendeten im Mittel 0,92 kg an, Studenten 0,65 kg und Zahnärzte 0,51 kg. Auch hier kondensieren die Spezialisten mit höheren Kraftwerten. 3. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Behandlergruppen bestehen bei: • Maximalkraft: bei allen Konizitäten • Durchschnittskraft: bei den Konizitäten .02 und .04 • Minimalkraft: keine signifikanten Unterschiede • Standardabweichung: bei allen Konizitäten • Kraftspitzen: keine signifikanten Unterschiede 4. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Kanalkonizitäten bestehen bei: a) Studenten • Maximalkraft: keine signifikanten Unterschiede • Durchschnittskraft: zwischen den Konizitäten .04 und .06 • Minimalkraft: keine signifikanten Unterschiede • Standardabweichung: keine signifikanten Unterschiede b) Zahnärzten • Maximalkraft: keine signifikanten Unterschiede • Durchschnittskraft: zwischen den Konizitäten .06 und p30 • Minimalkraft: keine signifikanten Unterschiede • Standardabweichung: keine signifikanten Unterschiede c) Spezialisten • Maximalkraft: zwischen den Konizitäten .04 und .06 • Durchschnittskraft: bei allen Konizitäten bis auf zwischen .02 und .04 sowie zwischen .06 und p30 • Minimalkraft: keine signifikanten Unterschiede • Standardabweichung: keine signifikanten Unterschiede 5. Es gibt bei den untersuchten Kraftwerten keine signifikanten Unterschiede zwischen weiblichen und männlichen Behandlern. 6. Es wurde ein individuelles Kraftauftragsmuster bei den Behandlern der unterschiedlichen Gruppen festgestellt. 7. Mit ansteigender Konizität werden von allen Behandlergruppen signifikant mehr Guttaperchastifte in den Kanal eingebracht. Zahnärzte tendieren dazu, weniger Guttaperchastifte zu verwenden und die Kanäle schneller zu füllen, als die Probanden der anderen beiden Gruppen.
The purpose of this study was to reconstruct the depositional environment, the genesis and the composition of Miocene coals in the Kutai Basin, East Kalimantan, Indonesia and to improve our understanding of the factors controlling the organic and inorganic composition, variation of biomarkers, and the peat forming vegetation of the coals. To achieve the aim methods belonging to three different disciplines were applied: 1. Coal petrology (chapter 3) 2. Inorganic geochemistry: sulfur, pyrite and mineral matter distributions (chapter 4) 3. Organic geochemistry of saturated, aromatic hydrocarbon fractions and stable carbon isotopic composition (chapter 5 and 6) Coal petrology Coal developes from peat deposited in mires, mainly in swamps and raised bogs. It is therefore necessary to consider how peat was formed in the past. Coal contains a variety of plant tissues in different degrees of preservation. Tissues of distinct origin are microscopically identifiable and can frequently be related to certain parts of the plant, such as cuticles, woody structures, spores, algal, resin, etc. Together with the particles of less certain origin they are termed macerals which are the petrographic components of coal. During and after deposition of plant remains in sedimentary basins, the organic matter will undergo a sequence of physical, biochemical and chemical changes, which finally results in the formation of coals of increasing rank depending mainly on the temperature influence. The process of coalification begins with practically unaltered plant material and peat, and continues with increasing rank through brown coal, bituminous coal, and finally to anthracite as well as graphite. Coal petrography provides valuable of data of maceral and mineral percentages with reflectance values, which can be used to reconstruct the depositional environment and the coalification processes. In lower rank coals, the material is represented by a group of macerals called huminite, and in bituminous and anthracite coals by a group of macerals called vitrinite. Coal petrography analyses have been carried out on samples from some Miocene coal seams from Kutai Basin. The study has shown that huminite reflectance values of coal samples from ...
Der Typ I Interferonrezeptor, der aus den Transmembranproteinen ifnar1 und ifnar2 besteht, nimmt eine wichtige Rolle bei der angeborenen und erworbenen Immunantwort ein. Durch Bindung von Typ I Interferonen werden antivirale, antiproliferative und immunmodulatorische Aktivitäten in der Zelle induziert. Die Wirkung der Interferone wird bereits bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten eingesetzt. Es ist bislang nicht bekannt, wie die verschiedenen Typ I Interferone nach Bindung an einen gemeinsamen Rezeptor, unterschiedliche Zellantworten induzieren. So unterscheiden die Typ I Interferone sich nicht hinsichtlich ihrer Bindungsstelle oder der Stöchiometrie der Bindung an ifnar1 bzw. ifnar2. Sie weisen jedoch unterschiedliche Affinitäten zu den Rezeptoruntereinheiten auf, wobei ihnen eine niedrigere Affinität zu ifnar1 gemeinsam ist. Bislang konnte keine Interaktion zwischen den Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen werden. Es wird angenommen, dass bei der Rezeptorassemblierung das Interferon zunächst an ifnar2 bindet und anschließend ifnar1 rekrutiert. Es wird postuliert, dass die unterschiedlichen Zellantworten für verschiedene Typ I Interferone auf Unterschieden in der Stabilität der ternären Komplexe beruhen könnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die Struktur und Dynamik des Interferonrezeptors in vitro für die Typ I Interferone IFNa2 und IFNb charakterisiert. Die Struktur des ternären Komplexes aus den extrazellulären Domänen von ifnar1 und ifnar2 mit IFNa2 wurde mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Über Einzelpartikelanalyse aufgereinigter Komplexe von IFN mit den extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) konnte ein Strukturmodell des ternären Komplexes erstellt werden. Dieses zeigte eine Verschiebung der membranproximalen Domänen von ifnar1-EC und ifnar2-EC wie sie bereits für den Rezeptor für Erythropoietin und den Wachstumsfaktor beobachtet wurden, welche zu den Typ I Zytokinrezeptoren gehören. Die Struktur des ternären Komplexes ermöglicht als erste Struktur eines Typ II Zytokinrezeptors einen Einblick in die Architektur des Komplexes und mögliche Aktivierungsmechanismen. Die Strukturen der Komplexe für die verschiedenen Typ I Interferone IFNa2 und IFNb wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf, was auf einen gemeinsamen Aktivierungsmechanismus hinweist. Temperatur-abhängige Messungen von Bindungskinetik und –affinität ergaben sehr unterschiedliche Energiehyperflächen für die Ligandenbindung an ifnar1- und ifnar2-EC, und wiesen auf einen mehrstufigen Prozess und mögliche Konformationsänderungen bei der Bindung an ifnar1-EC hin. Zur Analyse der Dynamik von ifnar1-EC wurden daher verschiedene fluoreszenzbasierte Assays etabliert. Eine besondere Herausforderung bestand darin, das Protein ortsspezifisch und stöchiometrisch mit zwei verschiedenen Fluorophoren zu koppeln. Ifnar1-EC wurde an verschiedenen Stellen kovalent mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Es wurde gezeigt, dass nach Bindung eines geeigneten tris-NTA-Fluorophor-Konjugats an den C-terminalen His-Tag die Fluoreszenz abstandsabhägig durch Förster-Resonanz-Energie-Transfer gelöscht wurde. Für ifnar1-EC wurde eine ligandeninduzierte Abstandsänderung detektiert. Die detaillierte Analyse ergab nach Bindung von IFNa2 eine Abstandszunahme von 13 A vom N- zum C-Terminus. Durch die Interferonbindung nimmt demnach ifnar1-EC eine gestrecktere Konformation ein. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in Anwesenheit von ifnar2-EC und für IFNb erhalten. Die Einzelmolekülanalysen mittels Fluoreszenz Korrelationsspektroskopie (FCS) zeigten sowohl einen Verlust der Flexibilität von ifnar1-EC nach Ligandenbindung als auch ein ligandeninduziertes Rearangement der Ig-ähnlichen Domänen. Die Änderung der Flexibilität wurde durch Messungen der Fluoreszenzlebensdauer bestätigt. Untersuchungen der Kinetik der Ligand-induzierten Konformationsänderung mittels Stopped-Flow Messungen bestätigten eine mehrstufige Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen nach Ligandenbindung. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass sich nach Ligandenbindung die Zugänglichkeit des Tryptophans in der membranproximalen Domäne von ifnar1-EC ändert. Da die membranproximale Domäne nicht bei der Ligandenbindung beteiligt ist, deutet dieser Effekt auf eine Propagation der Ligand-induzierten Konformationsänderung in diese Domäne hin. Das Tryptophan könnte mit der Membran interagieren, was auf eine wichtige Rolle der membranproximalen Domäne für die korrekte Orientierung von ifnar1 in der Membran hindeut. Die Stopped-Flow Analyse zeigte, dass es sich hierbei um einen einstufigen Prozess handelt, der mit der Interferonbindung korreliert. Die Ergebnisse wiesen insgesamt auf eine Ligand-induzierte Flexibilitätsänderung und Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen bei ifnar1-EC hin. Vermutlich wird nach Ligandenbindung das Signal in die membranproximale Domäne von ifnar1-EC propagiert. Die Strukturen der ternären Komplexe mit den verschiedenen Typ I Interferonen wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf. Auch die Ergebnisse der fluoreszenzbasierten Assays zeigten keine Unterschiede für IFNa2 und IFNb, was die Hypothese stützt, dass die differentielle Aktivität der Interferone nicht auf grundsätzlichen Unterschieden in der Architektur des ternären Komplexes beruht, sondern in der unterschiedlichen Dynamik der Komplexe codiert sein könnte.
The present study consists of two parts: The first part is made up of questions concerning the cognitive underpinnings of auditory verbal hallucinations in schizophrenia. As this thesis framed schizophrenia as a multivariate problem, neural correlates to auditory verbal and visual hallucinations were investigated in the second part. The main finding is that vividness of mental imagery was increased in all putative high-risk groups as well as the patients themselves, compared with low-schizotypy controls. Therefore, it seems that vivid imagery is a trait rather than a state marker, and may be related to the genetic liability to develop schizophrenia. However, no evidence was found for a linear relationship between vividness of mental imagery and predisposition to hallucinate. Self-reported imagery vividness and predisposition to hallucinate did not depend on psychomotor speed or intelligence. In addition, individual psychopathology ratings did not correlate significantly with the mental imagery scores. Furthermore, the analysis of the control orientation and the degree of dysfunctional psychopathological status across the schizophrenia spectrum, showed an independence of control orientation and dysfunctional status from each other, as well as from other markers of schizophrenia or schizophrenic-like individuals. As a conclusion, external control orientation seems to be a symptom or a trait marker of schizophrenia. The results lead to the assumption that, beside schizophrenic individuals, first-degree relatives and schizotypy controls have some impairments and visible signs without suffering from the illness directly. This would lead to the further assumption that the illness schizophrenia is not only genetic but also dependent on environmental factors. In the second part of the study, we investigated anatomical and functional brain abnormalities in the schizophrenia patients compared with first-degree relatives and healthy controls. Here, the results followed the continuum of healthy controls, first-degree relatives and schizophrenic patients in the functional and anatomical data sets, and in the language lateralization. The decrease of lateralisation correlated with the severity of symptoms in the patient group. The investigation of visual hallucinations showed activity in higher visual areas during the experience of visual hallucinations in a schizophrenia patient and in a blindfolded subject. The activity in higher visual areas followed the boundaries of category-selective areas in both subjects. In contrast to the memory-related areas found in the schizophrenic patient experiencing visual hallucinations, we did not observe memory-related areas during visual hallucinations induced by blindfolding. This suggests that the neural mechanisms underlying hallucinations in schizophrenia are at least partly distinct from those operational in cortical deafferentation. It is proposed that individual differences in psychopathology, as well as neuropsychological and psychosocial functioning may provide further means to understand the complex and highly dynamic aspects of hallucinations specifically and schizophrenia in general. The enlargement of the subject sample to high-schizotypy controls and first-degree relatives of patients allowed new insights into the mental imagery debate and the dysfunctional connectivity pattern known to be responsible for psychotic symptoms. Further topics of research are discussed.
Reisen sind aus verschiedenen Gründen mit erhöhten gesundheitlichen Risiken verbunden, insbesondere dann, wenn damit lange Reisezeiten, beengte Reiseverhältnisse, klimatische und Ernährungsumstellungen sowie vermehrte physische und psychische Belastungen verbunden sind. Besonders gefährdet sind Reisende, deren Leistungsfähigkeit durch bedeutsame chronische Erkrankungen eingeschränkt sind, wozu die Erkrankungen des kardiovaskulären Formenkreises zählen. Häufig verzichten herzkranke Patienten deshalb auf Urlaubsreisen, weil sie das damit verbundene Gesundheitsrisiko scheuen. Die Deutsche Herzstiftung e. V. und die Deutsche Gesellschaft für Prävention und Rehabilitation von Herz-Kreislauferkrankungen (DGPR) empfehlen daher speziell für Herzkranke angebotene Reisen. Diese sogenannten „Herzreisen“ werden nach strengen Richtlinien durchgeführt und verstehen sich als ärztlich begleitete Gruppenreisen, die spezielle Angebote für Herzkranke enthalten. Hierzu zählen, ähnlich wie in den ambulanten Herzgruppen (AHG), ein tägliches Bewegungs- und Entspannungsprogramm, die Durchführung von Arzt-Patient-Seminaren, Arztsprechstunden sowie spezielle diätetische Angebote und cholesterinreduzierte Mahlzeiten. Diese Reisen und alle in diesem Zusammenhang organisierten Ausflüge werden von 2 bis 3 in der Notfallmedizin erfahrenen Ärzten begleitet, die immer eine Notfallausrüstung (Notfallkoffer, EKG-Gerät, Defibrillator) mit sich führen. Über das Auftreten von Erkrankungen, Komplikationen, Verletzungen und erforderliche ärztliche Kontrolluntersuchungen bei Herzkranken und nicht herzkranken Vergleichspersonen bei Urlaubs- bzw. Herzreisen lagen jedoch bisher keine wissenschaftlichen Daten vor. Ziel dieser prospektiven Untersuchung war es, Erkenntnisse über die Art und Häufigkeit kardiovaskulärer und anderer Komplikationen oder Erkrankungen zu gewinnen, die im Rahmen kommerzieller Urlaubsreisen bei Herz-Kreislaufpatienten auftreten und wie sie von den begleitenden Ärzten allein oder mit Hilfe der medizinischen Einrichtungen vor Ort gelöst werden können. Deshalb wurden die Daten aller Herzpatienten und Begleitpersonen analysiert (n = 588), die in den Jahren 2000 und 2001 an Urlaubsreisen der Firma Kalina, Köln, unter ärztlicher Betreuung teilgenommen haben. Die Datenerfassung der hauptsächlich als Flugreisen angebotenen Herzreisen war durch einen speziell entwickelten Anamnesebogen und ein Sprechstunden-/Betreuungsprotokoll möglich, die vor den Reisen an die begleitenden Ärzte ausgegeben wurden. 421 Herzpatienten (71,6 %) und 165 Begleitpersonen (28,1 %) nahmen an den untersuchten Herzreisen teil. Die Geschlechtsverteilung der Herzpatienten war sehr ausgeglichen ( 48,0 %, 51,8 %), unter den Begleitpersonen befanden sich jedoch deutlich mehr Frauen (82,4 %). Das mittlere Alter der Herzpatienten lag bei 66,5 Jahren, das der Begleitpersonen bei 60,9 Jahren. Die evaluierte Gruppe der Herzpatienten bestand aus teilweise schwer kardial erkrankten Personen, die häufig sogar an mehreren kardialen Erkrankungen gleichzeitig litten. Sie unterschieden sich von den Begleitpersonen vor allem im Bezug auf die Prävalenz von Begleiterkrankungen, (kardialen) Risikofaktoren und die Einnahme kardial wirksamer Medikamente. Wie zu erwarten war, kam es auf Herzreisen zu kardiovaskulären und auch anderen Zwischenfällen, die mit dem speziellen Patientenkollektiv und seinen Vorerkrankungen in Verbindung gebracht werden konnten. Alle Zwischenfälle wurden von den begleitenden Ärzten jedoch sicher gelöst, so dass die ständige Anwesenheit eines Arztes inklusive Notfallausrüstung zu Recht gefordert wird. Nur in Ausnahmefällen kam es zu schwereren Komplikationen, die die begleitenden Ärzten nicht selbst behandeln konnten und die eine ambulante Behandlung bei einem anderen Arzt oder eine stationäre Aufnahme im Krankenhaus notwendig machten. Die auf den Reisen aufgetretenen Komplikationen sind jedoch selten und unterscheiden sich zahlenmäßig nicht von denen, die im Rahmen anderer kardiologischer Rehabilitationen oder der ambulanten Herzgruppen auftreten. Auf Herzreisen muss allerdings aufgrund des speziellen Gefahrenpotentials von Herzpatienten schon aus statistischen Gründen immer mit Komplikationen gerechnet werden. Anders als in Berichten von Krasemann und Laubinger kam es während des 2-jährigen Untersuchungszeitraumes von Herzreisen zu keinem tödlichen Zwischenfall oder zum Auftreten eines Myokard- oder Reinfarktes. Im Vergleich zu den Begleitpersonen traten jedoch überdurchschnittlich mehr allgemeine und leichtere kardiale Probleme und auch medizinisch kritischere Komplikationen auf. Die Ergebnisse unserer Untersuchung bestätigen die Annahmen anderer Autoren, dass Herzreisen sicher durchführbar sind. Sie tragen dem Bedürfnis der Herzpatienten Rechnung, auch im Urlaub ein subjektives Gefühl der Sicherheit durch einen Arzt vermittelt zu bekommen und einen medizinischen Ansprechpartner zu haben, der im Notfall eingreifen kann. Die Herzreisen entsprechen damit wichtigen Zielen in der kardiologischen Rehabilitation und tragen zu einer weiteren Wiedereingliederung in den Alltag bei. Den Patienten wird es trotz Herzerkrankung ermöglicht, mit reduziertem Risiko, betreut in den Urlaub zu fahren und krankheitsangepasste Freizeitaktivitäten durchzuführen. Somit kann die Herzreise einen wichtigen Beitrag in der kardiologischen Rehabilitation leisten.
In dieser prospektiven, randomisierten, doppelblinden und plazebo-kontrollierten Studie wurde an einem Kollektiv von 23 Hausstaubmilben-Allergikern (Grad 1° - max. 2° nach WHO/GINA) die entzündungshemmende Wirkung einer 5-wöchigen n-3 PUFA Supplementierung (0,69 g/ Tag) nach niedrig dosierten Allergeninhalationen untersucht. Die Probanden wurden durch Randomisierung entweder auf die Gruppe A (n=12) oder auf die Gruppe B (n=11) verteilt. Gruppe A nahm über einen Zeitraum von 5 Wochen eine Fettsäuremischung aus EPA 450 mg/Tag, DHA 180 mg/Tag, GLA 60 mg/Tag und STA 60 mg/Tag ein. Gruppe B wurde über den gleichen Zeitraum mit einer Kontroll-Fettsäuremischung aus ungesättigten und einfach gesättigten Fettsäuren supplementiert. Nach 3 Wochen wurden die Probanden täglich an 5 aufeinander folgenden Tagen in 2 zusammenhängenden Wochen mit niedrig dosierten Milbenallergenen provoziert. Die Sputuminduktion erfolgte bei den Visiten 1 (V1), 2 (V2) und 12 (V12) jeweils eine Stunde nach den Provokationen, gemäß einer standardisierten, bereits vorbeschriebenen Technik. Blutproben wurden vor der Supplementierung, nach 3 Wochen und nach ein- und zweiwöchiger Allergenprovokation entnommen. Das Sputum wurde nach der Induktion sofort aufbereitet und die ECP-Konzentrationen im Sputumüberstand und in den Serumproben mit Hilfe eines Chemiluminescence-Immunoassay (Biermann, Bad Nauheim, Deutschland) bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass die EPA-Konzentrationen im Plasma und in den Erythrozytenmembranen während der Supplementierung signifikant höhere Werte in der n-3 PUFA-Gruppe aufwiesen, was für eine gute Compliance der Probanden über den gesamten Supplementierungszeitraum spricht. Außerdem war der Prozentsatz an eosinophilen Granulozyten im Sputum nach täglicher Allergenprovokation in der Plazebogruppe tendenziell größer als in der n-3 PUFA Gruppe, die Anstiege der ΔECP-Konzentrationen im Sputum beider Gruppen verfehlten nur knapp die Signifikanzgrenze (p < 0,06 und p < 0,09). Der prozentuale Anteil der Eosinophilen im Serum unter n-3 PUFA Supplementierung war deutlich geringer verglichen mit der Plazebogruppe. Innerhalb der Plazebogruppe kam es bei dem prozentualen Anteil eosinophiler Granulozyten im Serum zu einem signifikanten Anstieg zwischen Visite 2 und Visite 7 (p = 0,002), bzw. zwischen Visite 2 und Visite 12 (p = 0,01). Ebenso kam es innerhalb der n-3 PUFA Gruppe bei dem prozentualen Anteil eosinophiler Granulozyten im Serum zu einem signifikanten Anstieg zwischen Visite 2 und Visite 7 (p = 0,003), bzw. zwischen Visite 2 und Visite 12 (p = 0,02). Beim Vergleich zwischen der Plazebo- und der n-3 PUFA Gruppe fällt ein signifikanter Unterschied bezüglich des prozentualen Anteils der eosinophilen Granulozyten im Serum bei Visite 7 (p = 0,02) und bei Visite 12 (p = 0,04) mit niedrigeren Werten in der n-3 PUFA-Gruppe auf. Verglichen mit der Plazebogruppe waren die ΔECP-Serum-Konzentrationen in der n-3 PUFA Gruppe nach einer Woche Allergeninhalation bei Visite 7 signifikant niedriger (Plazebo: 20,52 ng/ml ± 9,93; n-3 PUFA: -1,68 ng/ml ± 4,36; p < 0,05). Dieser Unterschied war nach 2-wöchiger Allergeninhalation bei Visite 12 immer noch deutlich vorhanden, erreichte aber nicht mehr das Signifikanzniveau (Plazebo: 158,46 ng/ml ± 58,17, n-3 PUFA: 131,63 ng/ml ± 33,66; p >0,05). In beiden Gruppen war jedoch im Verlauf zwischen Visite 7 und Visite 12 ein signifikanter Anstieg der ΔECP-Serum-Konzentrationen im Serum zu verzeichnen. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Supplementierung mit n-3 PUFA aufgrund dieser Ergebnisse als eine mögliche Methode zur entzündungshemmenden, nicht medikamentösen Therapie bei Patienten mit leichtgradigem Asthma bronchiale anzusehen ist. Unsere Untersuchung liefert Hinweise, dass eine Reduzierung der bronchialen Entzündungsreaktion mittels einer 5-wöchigen täglichen Nahrungsergänzung mit 0,69 g n-3 PUFA bei Probanden mit allergischem Asthma möglich ist.
Die extrakorporale Zirkulation ist mit einer Reihe inflammatorischer Reaktionen und dadurch verursachten pathologischen Veränderungen verschiedener Organsysteme verbunden. {2}{17}{40}-{42}{56}{57} Dies wird zu einem großen Teil durch die Aktivierung der Leukozyten nach dem Kontakt mit der Fremdoberfläche der EKZ und nachfolgender Ausschüttung von Entzündungsmediatoren vermittelt. {36}-{38} Die freigesetzten proteolytischen Enzyme der Leukozyten rufen eine pathologische Hyperpermeabilität des Endothels mit massiver Einschwemmung neutrophiler Granulozyten ins Gewebe und möglicher Parenchym- und Organschädigung hervor. {2}{17}{56}{57} Um diese inflammatorische systemische Reaktion (SIRS) zu verringern, wurden Versuche unternommen, den Aufbau und die Fremdoberfläche der Herz-Lungen-Maschine biokompatibler zu gestalten. {3}-{9}{18}-{23} Ebenfalls wurden im Rahmen klinischer Studien Therapieansätze auf pharmakologischer Ebene evaluiert. {10}-{13}{15}-{17} Das Prinzip der Leukozytendepletion mittels eines speziell angefertigten Filters wurde in den dreißiger Jahren entwickelt. Es fand Anfang der siebziger Jahre in der Transfusionsmedizin seine erste routinierte Anwendung. {31} In der Herzchirurgie wurde der Leukozytenfilter Ende der achtziger Jahre eingeführt. Dort wurde er in der arteriellen und venösen Linie sowie für die Kardioplegie und zur Filtrierung des Restblutes aus dem Kardiotomiereservoir eingesetzt. {62}{92}{93}{95}-{97} In der vorliegenden Studie erfolgte die Leukozytendepletion in der arteriellen Linie der EKZ bei 80 Patienten mittels eines Leukozytenfilters (Leukoguard LG6, Pall, Dreieich, Deutschland). Da die Filterkapazität und –effizienz zeitlich begrenzt sind, wurde der Einsatz des Filters in der kritischen Phase der Reperfusion evaluiert. Während dieser Phase erreicht die Leukozytenaktivierung den Höchstwert (Gruppe III: 10 Minuten vor Aortenklemmöffnung und für die ersten 20 Minuten der cardiopulmonalen Reperfusion, Gruppe IV: nach erfolgter 20minütiger Reperfusionsphase bis Ende der EKZ). Zum Vergleich wurde der Leukozytenfilter auch während des Gesamtdauer der CCB angewendet (Gruppe II). Bei der Kontrollgruppe kam ein Standardfilter zum Einsatz. Die Patientengruppen wurden aus 20 radomisierten Patienten gebildet. Zu bestimmten peri-, intra- und postoperativen Zeitpunkten wurden folgende Parameter untersucht: PMN-Elastase, Procalcitonin, MDA (Malondialdehyd), MPO (Myeloperoxidase), NSE (Neuronenspezifische Enolase), S100-Protein, CK, CK-MB, Kreatinin und Harnstoff. Ebenso wurden die Leukozyten-, Erythrozyten- und Thrombozytenzahlen sowie der Hämatokrit- und Hämoglobinwert gemessen. Die Sauerstoffsättigung wurde mittels des Sauerstoffdruckes der Sauerstofffraktion und -indizes untersucht. Zusätzlich wurde die Dauer der Intubation, des Aufenthaltes auf der Intensivstation und des stationären Gesamtaufenthaltes ermittelt. Bei allen diesen Parametern konnten unter den Gruppen keine signifikanten Differenzen festgestellt werden. Die sensitiven Marker der Leukozytenaktivierung und der systemischen inflammatorischen Reaktion zeigten den in der Literatur beschriebenen typischen Kurvenverlauf. {106}{107}{135}{126}-{128}{148} Jedoch blieb der positive Einfluss der Leukozytendepletion aus. Die im Blutkreislauf gemessenen Leukozytenzahlen ebenso wie die Erythrozyten- und Thrombozytenzahlen konnten durch den Filtrationsvorgang nicht statistisch absicherbar reduziert werden. Auch die intraoperative Leukozytose wurde nicht signifikant reduziert. Offenbar reicht die Filterleistung nicht aus, um entsprechende Mengen an Leukozyten zurückzuhalten. Würde es sich hierbei ausschließlich um eine rasche Kapazitätsausschöpfung des Filters handeln, müsste jedoch zumindest am Anfang des Filtrationsvorganges eine Verringerung der Leukozytenzahlen feststellbar sein. Vermutlich wird der lokale Filtrationseffekt des Leukozytenfilters durch die massive systemische Mobilisation der Leukozyten durch weitere Aktivierung aufgrund von Entzündungsmediatoren und Endothelschäden überdeckt. Die Ergebnisse deuten des Weiteren darauf hin, dass die Leukozyten durch den Filtrationsvorgang ihre Funktion nicht verlieren. Sie sind weiterhin in der Lage, Entzündungsmediatoren auszuschütten und systemische inflammatorische Reaktionen in Gang zu setzen. Eine neue Filtergeneration, die neben der Verbesserung der mechanischen Filtration eine pharmakologische Inaktivierung der Leukozyten bewirkt, bleibt Gegenstand weiterer Forschung.
Einfluß der Lagerung auf die Oxygenierung während der Einlungenventilation in der Thoraxchirurgie
(2008)
Einleitung: Die Einlungenventilation ist für thoraxchirurgische Eingriffe unerläßlich, um optimale Operationsergebnisse zu erzielen. Die hierbei vorgenommene funktionelle Trennung der Lungenflügel ermöglicht die Ruhigstellung des OP-Situs und eine kontrollierte Volumenreduktion. Aufgrund der unterbrochenen Beatmung einer Lunge gelangt desoxygeniertes, gemischt-venöses Blut in den Systemkreislauf und senkt dort den O2-Gehalt (Rechts-Links-Shunt). Das Ausmaß der durch eine Einlungenventilation entstehenden Hypoxämie ist sehr variabel, bislang nicht voraussagbar und unterliegt einer Reihe von Faktoren, welche die Größe der Durchblutung der nicht beatmeten Lunge beeinflussen. Methoden: An 50 konsekutiven Patienten der ASA-Risikogruppen I bis III wurden in Links- oder in Rechtsseitenventilation thoraxchirurgische Eingriffe vorgenommen. Zwischen den Operationstechniken bestanden keine signifikanten Unterschiede. Erhoben wurden zu determinierten Meßzeitpunkten Werte der Blutgasanalyse sowie die Beatmungsparameter. Ergebnisse: In beiden Gruppen zeigten ppeak und pplateau im Verlauf der Narkose fünf Minuten und 30 Minuten nach Beginn der Einlungenventilation eine signifikante Zunahme (p < 0,05), Sauerstoffpartialdruck und Horowitz-Quotient sanken in diesem Zeitraum signifikant (p < 0,05). Nach Wiederaufnahme der DLV bewegten sich die Parameter erneut im Ausgangsniveau. Für das AMV wurden in Linksseitenbeatmung bei DLVEnde signifikant niedrigere Werte in Bezug auf die drei vorangegangenen Meßzeitpunkte verzeichnet. In der Gruppe der Rechtsseitenventilierten wies die Sauerstoffsättigung einzig zum Meßzeitpunkt DLVEnde einen signifikanten Anstieg im Vergleich zu ELV+30 auf (p < 0,05). In der zweiten Gruppe bestand eine Signifikanz zu DLVEnde bereits bei ELV+5. Im Vergleich beider Gruppen wurden für keine der untersuchten Variablen signifikante Differenzen verzeichnet. Schlußfolgerungen: Hinsichtlich der Oxygenierung besteht bei der Anwendung der Einlungenventilation im Rahmen thoraxchirurgischer Eingriffe nach der vorliegenden Untersuchung kein signifikanter Unterschied zwischen der Durchführung in Rechts- und Linksseitenventilation. Im Verlauf der Anästhesie mußten in beiden Gruppen höhere Beatmungsdrücke appliziert werden. Es zeigten sich im Vergleich der Gruppen hinsichtlich aller drei Parameter (pmax; pplateau; PEEP) keine signifikanten Unterschiede. Im Rahmen dieser klinischen Studie wurde erstmals der Einfluß der Lagerung auf die Oxygenierung in Kombination mit einem speziellen Beatmungsregime während der ELV untersucht. Zur Vermeidung einer Hypoxämie unter ELV in Narkose kann hiermit festgestellt werden, daß vor allem die suffiziente Lungenseparation mit einer individuell angepaßten Beatmungsstrategie und der optimalen inspiratorischen Sauerstoffkonzentration für die Aufrechterhaltung der adäquaten Oxygenierung obligat ist.
Der tägliche und jahreszeitliche Wechsel in den Lichtverhältnissen bedeutet für alle Lebewesen eine regelmäßige und fundamentale Veränderung ihrer Lebensbedingungen. Mit Hilfe einer inneren Uhr können Lebewesen regelmäßige Veränderungen ihrer Umwelt im Tagesgang und während des Jahres antizipieren. Diese Innere Uhr sitzt bei Säugetieren im hypothalamischen Nucleus suprachiasmaticus (SCN) und generiert einen zirkadianen Rhythmus, der durch Signale des retinohypothalamischen Traktes mit den Umweltbeleuchtungsbedingungen synchronisiert wird. Bei Wirbeltieren werden die Elemente, die an der Genierung von zirkadianen Zeitsignalen beteiligt sind zu einem spezifischen neuronalen Schaltkreis im Gehirn, dem photoneuroendokrinen System (PNS), zusammengefasst. Im PNS werden im Pinealorgan photoperiodische Signale in die zirkadian rhythmische Synthese des Neurohormons Melatonin umgesetzt. Dabei ist die vom zentralen Oszillator im SCN gesteuerte Freisetzung von Noradrenalin (NA) aus sympathischen postganglionären Nervenfasern in das Pinealorgan der entscheidende Reiz zur nächtlichen Ankurbelung der Melatoninbiosynthese. Melatonin wird ausschließlich in der Nacht gebildet und fungiert daher als ein Zeithormon. Unmittelbar nach der Synthese wird Melatonin in die Blutbahn abgegeben und liefert allen Zellen, die mit spezifischen Melatoninrezeptoren ausgestattet sind, die aktuelle Licht- und Zeitinformationen. NA bewirkt in allen untersuchten Säugetieren die Aktivierung des Schlüsselenzyms der Melatoninsynthese, der Arylalkylamin N-Acetyltransferase (AANAT). Die Transkription der Aanat wird durch eine cAMP-abhängige Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors CREB (cyclicAMP response element binding protein) eingeleitet. Der inhibitorische Transkriptionsfaktor ICER (inducible cAMP early repressor) ist in die Abschaltung der erhöhten Melatoninsyntese am Ende der Nacht involviert. Die Transkription von Icer erfolgt ebenfalls durch die NA-induzierte Aktivierung der cAMP-Signalkaskade. In Säugetieren, persistiert der Rhythmus der Melatoninausschüttung, wenn das Tier unter konstanter Dunkelheit gehalten wird, wird aber durch eine akute Lichtexposition während der Nacht unterdrückt. Beim Syrischen Hamster ist die photoperiodische Abhängigkeit der Melatoninsynthese für die Hemmung der hypothalamohypophysären-gonadalen Achse mit Beginn des Herbstes notwendig und sichert den optimalen Zeitpunkt z.B. für die saisonale Reproduktion, den Winterschlaf, die Migration oder den täglichen Schlaf. Allerdings kann im Unterschied zu Ratte und Maus beim Syrischen Hamster kein Anstieg der Melatoninkonzentration im Pinealorgan während des Tages induziert werden. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die fehlende Induzierbarkeit der Melatoninsynthese während des Tages beim Syrischen Hamster besser zu verstehen, und zu untersuchen, ob auch im Pinealorgan des Syrischen Hamsters, wie bei Ratte und Maus, der inhibitorische Transkriptionsfaktor ICER vorkommt und reguliert ist. Um die Nicht-Induzierbarkeit der Melatoninsynthese zu erklären wurde eine eventuelle Abhängigkeit der ICER Menge im Pinealorgan von der Photoperiode untersucht. Die Unterdrückung der Funktion der hypothalomo-hypophysären-gonadalen Achse unter Kurztag Photoperiode wurde durch die Gewichtsabnahme der Gonadengewichte bestätigt. Die immunhistochemische Analyse bestätigte das Vorkommen des ICER Proteins im Pinealorgan des Syrischen Hamsters und es konnte eine statistisch signifikante Korrelation zwischen der Dauer der Lichtperiode und der Expression des ICER Proteins gezeigt werden. Bei einer Langtag Photoperiode von 16 h Licht wurde ein schnellerer Anstieg und insgesamt höhere ICER Protein Werte als bei der Kurztag Photoperiode beobachtet. Unabhängig von der Photoperiode, waren die ICER Werte niedrig zum Beginn der Nacht und stiegen zum Ende der Nacht an. ICER Minimalwerte wurden in beiden Photoperioden 5 und 6 h nach Beginn der Dunkelperiode beobachtet und lassen sich durch einen aktiven Abbau erklären, der zeitgleich mit der NA-Ausschüttung aus den sympathischen Nervenendigungen stattfindet. Während der gesamten Lichtphase zeigte sich unabhängig von der Photoperiode ein erhöhter ICER Proteinspiegel im Pinealorgan des Syrischen Hamsters, der möglicherweise die Stimulation der Melatoninsynthese während des Tages im Unterschied zur Ratte und der Maus nicht ermöglicht. Die hier präsentierten Daten lassen sich gut in bereits erarbeitete Modelle der transkriptionellen Regulation des Aanat Gens und der posttranslationellen Mechanismen in der Regulation der Melatoninsynthese beim Nager einfügen. Sie zeigen, dass auch beim Syrischen Hamster die transkriptionelle Regulation der Melatoninbiosynthese eine wichtige Rolle zu spielen scheint und das darin offensichtlich der inhibitorische Transkriptionsfaktor des cAMP Signaltransduktionsweges, ICER, ähnlich wie bei Maus und Ratte, involviert ist. Weiterhin könnte die erhöhte Präsenz von ICER während des Tages erklären, warum zu dieser Zeit eine Aktivierung des cAMP-Signaltransduktionsweges nicht zu einem Anstieg der Melatoninbiosynthese führt.
In this study I analysed past and recent Daphnia populations from Lake Constance and Greifensee. Herefore, I first established a set of microsatellite markers applicable to European Hyalodaphnia species (chapter 1). Primers were also identified for species specific fragment lengths. 32 markers were then available to characterize the resting egg banks of Daphnia galeata and D. hyalina. Chapter 2 presents the reconstruction of the taxonomic composition in these two ecologically different lakes. This part of my work shows that the eutrophication that occurred in both lakes in the mid of the last century has strongly influenced the Daphnia populations. In both lakes Daphnia galeata established and hybridized with the indigenous D. hyalina. Interspecific hybridization resulted in introgression on the mitochondrial and nuclear level. In chapter 3 resting eggs from the sediments of the 1960s, 1970s, 1980s, 1990s and 2000s were characterized with microsatellite markers. The aim was to specify the extent of interspecific hybridization and nuclear introgression assuming that the genetic exchange between both species has an impact on their adaptation to their habitat. In life history experiments D. galeata and D. galeata x hyalina clones hatched from different time periods showed significant differential responses to food quality. Therefore, the question had to be answered how the Daphnia resting egg bank and the planktonic population are connected. In chapter 4 hatching experiments were conducted to bridge this gap of scientific knowledge in the life cycle of cyclic parthenogenetic waterfleas. Only D. galeata individuals were able to establish a clonal lineage after maturity. All observed recombinant individuals did not reproduce at all or firstly went through another sexual phase of reproduction i.e. produced resting eggs. In order to compare the findings of chapter 4 with the taxon composition of the recent planktonic population of Daphnia in Lake Constance, samples were taken over one season (between May 2005 and September 2006). During the season, the taxonomic composition of Daphnia changes severely with D. galeata being most abundant during the warm season and D. hyalina in the cold season. Moreover, some individuals were detected, that did not follow this pattern. With mitochondrial analysis those individuals were identified as mitochondrial introgressants and processed to life history experiments. Significant differences in the somatic growth rate under different temperatures (5°C, 12.5°C and 20°C) were related to the origin of the mitochondrial genome rather than the nuclear taxonomic assignment of the individual.
The findings of this study show that all organisms exposed to rapid ecological changes and their microevolutionary reaction to those.
Disruption of the complex gastrointestinal ecosystem between the resident microflora and the colonic epithelial cells has been associated with increased inflammation and altered cell growth. Possible endpoints of this disturbance are IBD and CRC. The data presented in this thesis, entitled "PPARgamma as molecular target of epithelial functions in the gastrointestinal tract", shed further light on the underlying molecular mechanisms contributing to the well ordered homeostasis of this gastrointestinal ecosystem. Except for elucidating important roles for mesalazine and the dietary HDAC inhibitors butyrate and SFN in a) the modulation of cellular growth, b) the induction of APs, and c) the control of NFkappaB signalling in CRC cells, the involvement of the nuclear hormone receptors PPARgamma und VDR as "gatekeepers" in these intricate regulatory mechanisms were established. Future work will be engaged in analysing whether these in vitro findings are also physiologically relevant in regard to prevention and therapy of gastrointestinal diseases. Within the scope of this work, in Paper I and II it could be demonstrated that butyrate and mesalazine act via PPARgamma to induce their anti-proliferative and pro-apoptotic actions along the caspase signalling pathway. Activation of the intrinsic and extrinsic signalling trail and the down-regulation of anti-apoptotic proteins are responsible for increased caspase-3 activity caused by butyrate. In contrast, mesalazine merely activates this cascade via the extrinsic trail and the IAPs. Moreover, a signal transduction pathway leading to increased cell death via p38 MAPK - PPARgamma - caspase-3 in response to butyrate was unveiled. In addition, there is strong evidence that mesalazine-mediated pro-apoptotic and growth-inhibitory abilities are controlled by PPARgamma-dependent and -independent mechanisms which appear to be triggered at least in part by the modulation of the tumor suppressor gene PTEN and the oncoprotein c-myc, respectively. In Paper III and IV the induction of the APs HBD-2 and LL-37 in response to the dietary HDAC inhibitors butyrate and SFN was pinpointed. Regarding the molecular events of this regulation, the data presented in this thesis provide strong evidence for the involvement of VDR in HBD-2- and LL-37-induced gene expression, while the participation of PPARgamma was excluded. Moreover, the role for p38 MAPK and TGF-beta1 in the up-regulation of LL-37 caused by butyrate was established. In contrast, SFN-mediated induction of HBD-2 is modulated via ERK1/2 signalling. The findings in Paper V clearly refer to the involvement of the nuclear hormone receptors PPARgamma and VDR in butyrate-mediated suppression of inducible NFkappaB activation dependent on the stimulated signalling pathway caused by LPS or TNFalpha. Moreover, an inhibitory role for VDR in the regulation of basal NFkappaB activation was revealed. On the contrary, a modulating role for PPARgamma on basal NFkappaB could be debarred. Altogether the data presented in this thesis not only provide new insights in the understanding of the fundamental gastrointestinal physiology regulated by nuclear hormone receptors, but also may offer opportunities for the development of potential drug targets and therapeutic strategies in the treatment of IBD and CRC.
Die chirurgische Resektion ist eine kurative Behandlungsmöglichkeit für das hepatozelluläre Karzinom (HCC). Neben dem Tumorstadium sind das Ausmaß der zugrunde liegenden Leberzirrhose und die Leberfunktion von außergewöhnlicher Bedeutung für die Prognose des HCCs. Wegen neuer Entwicklungen in der Leberchirurgie konnten die Ergebnisse der Leberresektionen in Zirrhose bezüglich der Mortalitäts-, Morbiditäts- und Langzeitüberlebensraten verbessert und mehr und mehr an die Resultate der Resektionen in zirrhosefreier Leber angeglichen werden. Trotzdem bleibt die Leberzirrhose ein Risikofaktor für HCC-Patienten. Es wurden neue multimodale Therapiekonzepte entwickelt, weil das Langzeitüberleben der HCC-Patienten, unabhängig vom Zirrhosestatus, weiterhin unbefriedigend ist. Ein solches Konzept ist die präoperative transarterielle Chemoembolisation (TACE) kombiniert mit einer anschließenden chirurgischen Leberresektion. Das Ziel der präoperativen TACE ist eine Verbesserung des tumorfreien Überlebens (DFS) und somit auch des Gesamtüberlebens nach einer Leberresektion. Methode: Zwischen dem August 2002 und dem Dezember 2005 wurden in der Klinik für Allgemein- und Gefäßchirurgie, Klinikum der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main, 49 Patienten mit einem HCC reseziert. In einer retrospektiven Analyse wurden die Ergebnisse der Patienten mit Resektionen von HCCs in Zirrhose (zirrHCC, n=26) mit den Resektionen von HCCs ohne Zirrhose (oHCC, n=23) in Hinblick auf Überlebensraten, Mortalität, Morbidität und Leberfunktionseinschränkung verglichen. Bei 15 Patienten, die reseziert wurden, erfolgte eine präoperative TACE. Es wurde untersucht, ob HCC-Patienten, die sich sowohl einer Resektion als auch einer präoperativen TACE (Res+TACE-Gruppe, n=15) unterzogen haben, ein besseres Outcome haben als ausschließlich resezierte Patienten (Res-Gruppe, n=27). Ergebnisse: Vergleicht man das frühpostoperativ bestimmte maximale Bilirubin (p=0.137), den minimale Quick-Wert (p=0.481), das maximale GOT (p=0.847) und das maximalen GPT (p=0.156), so war der Unterschied zwischen der zirrHCC-Gruppe und der oHCC-Gruppe bezüglich der postoperativen Leberfunktionseinschränkung unter dem statistisch signifikanten Niveau. Die Komplikationsrate war in der zirrHCC-Gruppe (57.7%) nicht statistisch signifikant höher als in der oHCC-Gruppe (43.5%) (p=0.157). Innerhalb der ersten 30 postoperativen Tage verstarb kein Patient. Somit hatten wir eine Mortalitätsrate von 0% sowohl in der zirrHCC-Gruppe als auch in der oHCC-Gruppe. Für die zirrHCC-Gruppe errechnete sich ein medianes Überleben von 62.8 Monaten (SD: 14.2; Konfidenzintervall: 35.0 – 90.7 Monate). In der oHCC-Gruppe betrug die durchschnittliche Überlebensdauer 84.0 Monate (SD: 17.0; Konfidenzintervall: 50.7-117.3 Monate). Im Log-Rank-Test war dieser Unterschied statistisch nicht signifikant (p=0.132). In der Res+TACE-Gruppe (66.7%) war die postoperative Komplikationsrate höher im Vergleich zu der Res-Gruppe (44.4%). Hier wurde im Chi-Quadrat-Test ein statistischer Trend nachgewiesen (p=0.091). Patienten, die neben der Resektion zusätzlich präoperativ mit einer TACE therapiert wurden, lebten nicht signifikant länger als die Patienten, die ausschließlich reseziert wurden (Res vs. Res+TACE: mittlere Überlebensdauer: 90.7 Monate vs. 60.6 Monate; SD: 14.0 vs. 15.4; Konfidenzintervall: 53.2-108.1 vs. 38.9- 99.4 Monate) (p=0.275). Patienten mit präoperativer TACE waren im Durchschnitt 45.9 Monate nach der Operation tumorfrei. Bei den ausschließlich resezierten Patienten betrug das DFS 52.7 Monate (p=0.605). Schlussfolgerung: In unserer Studie war die postoperative Leberfunktionseinschränkung und die Komplikationsrate bei den resezierten Patienten mit Leberzirrhose (zirrHCC) nicht höher als bei Patienten mit zirrhosefreier Leber (oHCC). Auch bezüglich der Mortalitäts- und Langzeitüberlebensraten gab es keine Unterschiede zwischen diesen beiden Patientengruppen. Die HCC-Patienten in unserer Studie haben nicht von einer präoperativen TACE profitiert. Die präoperative TACE hat zu mehr Komplikationen in der Res+TACE-Gruppe geführt. Die Patientenkollektive (Res vs. Res+TACE) unterscheiden sich weder bezüglich klinisch-pathologischer Faktoren noch bezüglich tumorbedingter Faktoren. Die genaue Ursache für das häufigere Vorkommen von postoperativen Komplikationen bei den präoperativ transarteriell chemoembolisierten HCC-Patienten konnten den uns vorliegenden Daten nicht entnehmen. Durch die präoperative TACE konnten weder die Überlebensrate noch das DFS verbessert werden.
Crohn´s disease (CD) and Ulcerative colitis (UC) are idiopathic inflammatory disorders. Environmental factors, infectious microbes, ethnic origin, genetic susceptibility, and a dysregulated immune system can result in mucosal inflammation. However, the etiology of both CD and UC still remains largely unclear. Inflammatory bowel diseaserelated animal models suggest that a combination of genetic susceptibility factors and altered immune response driven by microbial factors in the enteric environment may contribute to the initiation and chronification of the disease. The intestinal immune system represents a complex network of different lymphoid and non-lymphoid cell populations as well as humoral factors. In inflammatory bowel disease, the controlled balance of the intestinal immune system is disturbed at all levels. In CD, naïve T cells preferably differentiate into Th1 or Th17 producing cells, while in UC, these cells differentiate into aberrant Th2 cells. Overall, in active inflammatory bowel disease effector T cell activity (Th1, Th17, Th2) predominates over regulatory T cells. Animal models of intestinal inflammation are indispensable for our understanding of the pathogenesis of CD and UC. When chosen appropriately, these models proved to be a helpful tool to investigate pathophysiological mechanisms, as well as to test emerging therapeutic options in the preclinical phase. 2,4,6-Trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) and oxazolone are the two major chemicals applied to induce Th1- and Th2-skewed intestinal inflammation, respectively. Colitis can be induced in susceptible strains of mice by intrarectal instillation of the haptenating substances TNBS or oxazolone in ethanol, which is necessary for an initial desintegration of the epithelial barrier. TNBS or oxazolone are believed to haptenize colonic autologous or microbiotic proteins rendering them immunogenic to the host immune system. While TNBS administration in the presence of ethanol results in a transmural infiltrative disease in the entire colon based on an IL-12/IL-23 driven, Th1-or Th17 mediated response, oxazolone instillation finally leads to a colitis caused by a polarized Th2 IL-13-dominated lymphocyte response. Rectal oxazolone instillation in ethanol produces a more superficial inflammation that affects the distal half of the colon rather than the whole colon. Therapeutic modulation of the disturbed immune response in patients with inflammatory bowel disease still represents a complex challenge in the clinic. Currently, none of the therapeutic measure are disease specific and they generally target the pathophysiology downstream of the driving immunpathology. So, there is still the need to develop a tailored approach to prevention of the initiation and perpetuation of the inflammatory cascade before tissue injury occurs. One important aspect of this approach might involve the induction or re-establishment of immunological tolerance. FTY720 following rapid phosphorylation to FTY-P by endogenous sphingosine kinases acts as a sphingosine-1-phosphate (S1P) receptor agonist and represents the prototype of a new generation of S1P receptor modulators. While changing currently its proposed mode of action still focus on the fact, that FTY720 effectively inhibits the egress of T-cells from lymph nodes, thereby reducing the number of antigen-primed/restimulated cells that re-circulate to peripheral inflammatory tissues. However, recent studies indicate, that its immunomodulatory properties might be more complex and exerted not only via interactions with other S1P receptor subtypes but also via a direct modulation of the inflammatory capacity of dendritic cells (DC) resulting in a modified regulation of T cell effector functions as well as in an induction of regulatory T cells and function. 1,25(OH)2D3, the active form of vitamin D, is a secosteroid hormone that has in addition to its central function in calcium and bone metabolism pronounced immune regulatory properties. The biological effects of calcitriol are mediated by the vitamin D receptor (VDR), a member of the superfamily of nuclear hormone receptors. A number of studies identified calcitriol/VDR as prominent negative regulators of Th1-type immune responses, whereas Th2 responses are not affected or even augmented. These effects have been mainly explained by direct activities on lymphocytes, subsequent studies clearly supported a role of calcitriol in modulating monocyte differentiation or DC maturation. However, to translate the immunosuppressive capacities of calcitriol into an effective immunointervention, a great challenge was the design of structural analogs of calcitriol that are devoid of adverse effects related to hypercalcemic activity. The intense study of the 25-oxa series generated a large number of calcitriol analogs exhibiting substantial dissociation between possible immunomodulatory capacities and undesired hypercalcemia. Especially, the combination of the 22-ene modification with the 25-oxa element as realized in ZK156979 yielded a very promising set of new analogs for further characterization in animal models resembling human autoimmune diseases. So, the overall aim of the studies presented here was to evaluate strategies of enhancing regulatory immunity in mouse models of Th1- and Th2-mediated colitis as a new therapeutic approach. To this end we used FTY720, 22-ene-25-oxa vitamin D (ZK156979), as well as the combination of calcitriol and dexamethasone to evaluate the respective pro-tolerogenic potential in intestinal inflammation models in mice. First, to induce Th1-mediated colitis a rectal enema of TNBS was given to Balb/c mice. FTY720 was administered i.p. from day 0-3 or 3-5. FTY720 substantially reduced all clinical, histopathologic, macroscopic, and microscopic parameters of colitis analyzed. The therapeutic effects of FTY720 were associated with a down-regulation of IL-12p70 and subsequent Th1 cytokines. Importantly, FTY720 treatment resulted in a prominent up-regulation of FoxP3, IL-10, TGFβ and CTLA4. Moreover, we observed a significant increase of CD25 and FoxP3 expression in isolated lamina propria CD4+ T cells of FTY720-treated mice. The impact of FTY720 on regulatory T cell induction was further confirmed by concomitant in vivo blockade of CTLA4 or IL-10R which significantly abrogated its therapeutic activity. Thus, our data provide new and strong evidence that besides its well-established migratory properties FTY720 down-regulates proinflammatory signals while simultaneously inducing the functional activity of CD4+CD25+ regulatory T cells. In a second approach, the rectal instillation of oxazolone yielded a Th2-mediated colitis. Treatment with FTY720 prominently reduced the clinical and histopathologic severity of oxazolone-induced colitis, abrogating body weight loss, diarrhea, and macroscopic and microscopic intestinal inflammation. The therapeutic effects of FTY720 were associated with a prominent reduction of the key Th2 effector cytokines IL-13, IL-4 and IL-5. Moreover, FTY720 inhibited GATA3 and T1/ST2 expression, which represent distinct markers for Th2 differentiation and Th2 effector function. Thus, our data are supportive for the view that FTY720 exhibits beneficial prophylactic as well as therapeutic effects in Th2-mediated experimental colitis by directly affecting Th2 cytokine profiles, probably by reducing GATA3 and T1/ST2. Recently, we described 22-ene-25-oxa-vitamin D (ZK156979) as a representative of a novel class of low calcemic vitamin D analogs showing prominent immunomodulative capacities. Here, we used the Th1-mediated TNBS colitis to test its anti-inflammatory properties in vivo. We found that treatment with ZK156979 clearly inhibited the severity of TNBS-induced colitis without exhibiting calcemic effects. Both early and late treatment abrogated all the clinical macroscopic and microscopic parameters of colitis severity; in addition we observed a clear down-regulation of the relevant Th1 cytokine pattern including the T-box transcription factor, T-bet. On the other hand, application of ZK156979 increased local tissue IL-10 and IL-4. Finally, as a new approach we evaluated the pro-tolerogenic potential of calcitriol and dexamethasone in acute Th1-mediated colitis. Calcitriol and/or dexamethasone were administered i.p. from day 0-3 or from day 3-5 following the instillation of the haptenating agent. The combination of these steroids most effectively reduced the clinical and histopathologic severity of TNBS colitis. Th1-related parameters were down- while Th2 markers like IL-4 and GATA3 were up-regulated. Clearly distinguishable from known steroid effects calcitriol in particular promoted regulatory T cell profiles as indicated by a marked increase of IL-10, TGFß, FoxP3 and CTLA4. Furthermore, analysis of DC mediators responsible for a pro-inflammatory differentiation of T cells revealed a clear reduction of IL-12p70, and IL23p19 as well as IL-6 and IL-17. Thus, our data suggest the concept of a steroid-sparing application of calcitriol derivatives in inflammatory bowel disease. Furthermore, the data presented suggest that early markers of inflammatory DC and Th17 differentiation might qualify as new target molecules for both calcitriol as well as for selective immune modulating vitamin D analogs. In conclusion the data of these published investigations added to the substantial progress in understanding the biology of tolerogenic DC and regulatory T cells with respect to their roles in health and disease achieved in the past years. This has led to an increasing interest in the possibility of using DC and regulatory T cells as biological therapeutics to preserve and restore tolerance to self antigens and alloantigens. Especially DC may be helpful to exert their important roles in directing tolerance and immunity by modulation of subpopulations of effector T cells and regulatory T cells. The data demonstrated in the present studies may assist to define the divergent implications of new therapeutic concepts for the treatment of inflammatory bowel disease, especially with regard to a possible auspicious impact on pro-tolerogenic DC and regulatory T cell functions. However, further studies are needed to fulfil our understanding of the complex immunomodulatory profiles of FTY720 as well as of calcitriol and its low calcemic analog ZK156979, thus accelerating their entry into the clinic as new therapeutic options for the cure of inflammatory bowel disease.
Untersuchung von Rezeptor-Ligand-Komplexen mittels organischer Synthese und NMR-Spektroskopie
(2008)
Viele biologische Prozesse basieren auf der spezifischen Bindung eines Liganden an einen Rezeptor. Die Wechselwirkung zwischen dem Rezeptor und seinem Ligand kann im Wesentlichen durch zwei verschiedene Modelle beschrieben werden: zum einen das vom E. Fischer eingeführte Schlüssel-Schloss-Prinzip und zum anderen das von Koshland beschriebene "induced-fit-model". Bei dem Schlüssel-Schloss-Prinzip liegt der Ligand in der Bindetasche des Rezeptors wie ein Schlüssel im Schloss. Ganz anders hierzu setzt die induzierte Anpassung ("induced-fit-model") eine konformationelle Änderung des Proteins durch den Liganden für die Bindung voraus. Ändern sich jedoch die Konformationen von Substrat und Rezeptor in einer gegenseitigen Beeinflussung, dann spricht man von "double-induced-fitmodel". Die Untersuchung dieser Erkennung auf molekularer Ebene ist von großer Wichtigkeit, denn sie dient zum besseren Verständnis und damit auch zur gezielten Beeinflussung solcher Prozesse. Wie wird der Ligand von einem Rezeptor selektiv erkannt und gebunden? Für die Erkennung und Bindung spielen spezifische nichtkovalente Wechselwirkungen eine wichtige Rolle. Zum Repertoire der nichtkovalenten Wechselwirkungen gehören die elektrostatische Wechselwirkungen, die Wasserstoffbrückenbindung und der hydrophobe Effekt.
In der vorliegenden Arbeit werden anhand von drei ausgewählten Beispielen solche Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Liganden mit ihrem Rezeptor untersucht. In den ersten beiden Kapiteln werden Proteine und im letzten Kapitel RNA als Rezeptor untersucht. Die einzelnen Kapitel beginnen jeweils mit einer kurzen Einführung der Rezeptoren und der dazugehörenden Liganden, schließlich wird dann die Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung beschrieben. Als Rezeptor wurden in der vorliegenden Arbeit Proteine (Kinasen und Membranproteine) und strukturierten Elemente der RNA (Aptamerdomäne der purinbindenden Riboswitche und der SELEX-RNA) gewählt. Membranproteine der Atmungskette, Kinasen und Riboswitches stellen zusätzlich attraktive Rezeptoren für das Wirkstoffdesign dar. Die damit interferierenden Liganden umfassen Substrate, Cofaktoren, Metabolite und Inhibitoren. Die Untersuchung der Wechselwirkung erfolgte mittels NMR-Spektroskopie und organischer Synthese.
In den letzten 25 Jahren HIV-Forschung wurden einige Medikamente entwickelt, die in der Lage sind, den Ausbruch der Krankheit AIDS hinauszuzögern. Als Gemeinsamkeit dieser Arzneimittel ist die Interaktion mit regulatorischen Proteinen des HIV-Lebenscyclus zu erwähnen. In den letzten Jahren intensivierte sich jedoch auch die Forschung auf RNA als Angriffsort für Wirkstoffe, da sie in zahlreichen biochemischen Prozessen involviert ist. Aufgrund der vielfältigen Sekundär- und Tertiärstruktur der RNA bietet sie Bindungsstellen für Proteine, Antibiotika und weitere kleine Moleküle. Die Affinität zwischen RNA und dem Liganden, z.B. einem Peptid, basiert auf Wasserstoffbrücken, Coulombschen Kräften und Stapelwechselwirkungen. Das Konzept dieser Arbeit bestand darin, peptidische RNA-Liganden zu entwickeln, die u.a. aufgrund von Stacking mit den Nucleobasen der RNA eine starke Bindung eingehen. In Anbetracht der Tatsache, dass lediglich vier unterschiedliche natürliche aromatische Aminosäuren existieren, wurden Synthesewege entwickelt, um eine Vielfalt nicht-natürlicher Bausteine zu gewährleisten. In diesem Projekt wurden (L)-Methionin bzw. (L)-Glutaminsäure als chirale Ausgangsverbindungen, in Abhängigkeit von der benötigten Seitenkettenlänge (C2 für Met, C3 für Glu), verwendet. Der Schlüsselschritt in beiden Syntheserouten ist mit der Heck- bzw. Negishi- Kupplung eine Übergangsmetall-katalysierte C-C-Knüpfungsreaktion. Auf beiden Wegen konnten in zehn Stufen Fmoc-geschützte -Aminosäuren dargestellt werden. Diese Bausteine wurden zusammen mit natürlichen Aminosäuren zu peptidischen Bibliotheken aufgebaut, die entweder über kombinatorische oder parallele Festphasensynthese hergestellt wurden. Über homogene Assays wurden die besten RNA-Binder identifiziert. In ersten Experimenten wurden ausgewählte Peptide auf ihre Affinität zum TAR-Element von HIV-1 untersucht. Ein Farbstoff-markiertes Tat-Peptid wurde in dieser Anwendung vom Test- Liganden verdrängt. Alternativ konnte über die Fluoreszenz der Pyren-Peptide eine direkte Bestimmung von Bindungskonstanten erfolgen. Mit dem Tripeptid 172 (IC50 = 900 nM, Kd = 50 nM) konnte eine vielversprechende Verbindung identifiziert werden. In Untersuchungen mit HIV-1-infizierten HeLa-P4- (IC50 = 125 microM) bzw. MT-4-Zellen (EC50 = 46 microM) wurde die antivirale Eigenschaft von 172 bewiesen. Des Weiteren wurden u.a. für das Peptid 172 antimikrobielle Tests gegen B. subtilis (MIC = 22 microM) und S. aureus (MIC = 31 microM) durchgeführt.
Einleitung: Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) zählt zu den zehn häufigsten Karzinomen weltweit. Auch in Deutschland wie in anderen Industriestaaten ist die Inzidenz ansteigend. Nur wenige Patienten kommen für ein kuratives Verfahren wie Resektion oder Lebertransplantation infrage, dementsprechend ist die Prognose insgesamt schlecht. Die Prognose eines HCC lässt sich z.B. mit dem „Cancer of the Italian Liver Program“ (CLIP)-Score abschätzen. Als palliatives Verfahren ist die transarterielle Chemoembolisation etabliert. Diese Arbeit untersucht zwei Prognosefaktoren, das alpha-fetoprotein (AFP) und die Restembolisatbelegung nach TACE in Hinblick auf eine Abschätzung des Erfolges einer TACE. Darüber hinaus werden zwei Scoring-Systeme (CLIP- und Tokyo-Score) auf ihre Aussagekraft überprüft, und die Auswirkung einer Zirrhose und einer Hepatitis auf das Gesamtüberleben dargestellt. Material und Methode: Insgesamt sind 89 Patienten mit HCC mittels TACE behandelt worden (22 vor oder nach Leberresektion, 9 vor Lebertransplantation, 58 TACE alleine). Die TACE wird standardisiert mit einer Mischung aus Mitomycin C und Lipiodol Ultra-Fluid durchgeführt. Postinterventionell erfolgen Kontroll-CTs am Folgetag und vier bis sechs Wochen nach TACE zur Kontrolle des Embolisats. In dieser retrospektiven Analyse werden der AFP-Verlauf periinterventionell und die Embolisatbelegung 4-6 Wochen nach TACE in Hinblick auf das Patientenüberleben (ÜLZ) bei Patienten mit alleiniger TACEBehandlung untersucht. Ergebnisse: Bei 43 Patienten der 58 hat zum Zeitpunkt der Diagnosestellung eine Leberzirrhose bestanden (Child A: 33, Child B: 7, Child C: 3). Der CLIP-Score verteilt sich folgendermaßen: CLIP „0“: 18, „1“: 22, „2“: 13, „3“: 4. Die Patienten haben im Median 2 Behandlungen (Range: 1-8) erhalten. Bei 13 Patienten hat der AFP-Wert vor TACE unter 15 ng/ml gelegen. Nach dem CLIP- und dem Tokyo-Score lässt sich die Überlebenszeit der Patienten nicht abschätzen (CLIP: p=0,317, Tokyo: p=0,355). Eine Zirrhose oder Hepatitis hat laut den Ergebnissen dieser Arbeit keinen Einfluss auf das Überleben (Zirrhose: p=0,136, Hepatitis: p=0,345). Wenn sich im CT vier bis sechs Wochen nach eine gute Restembolisatbelegung darstellt, liegt die Überlebenszeit bei 42 Monaten, bei den restlichen Patienten war diese 13,6 Monate (p=0,174) Eine Reduktion des AFP postinterventionell um 30, 50 oder 80 Prozent des Ausgangswertes zeigen keinen statistischen Vorteil in der medianen Überlebenszeit (30%: p=0,82, 50%: p=0,46, 80%: p=0,9). Ein AFP-Wert präinterventionell unter 15 ng/ml bedeutet statistisch keinen signifikanten Vorteil im Überleben (p=0,53). Patienten mit einem postinterventionellen AFP-Wert unter 15 ng/ml überleben 17,2 Monate länger als Patienten mit einem Wert über 15 ng/ml, insgesamt 31,4 Monate (p=0,027). Schlussfolgerung: Im Gegensatz zu vielen anderen Arbeiten zeigt sich kein Vorteil im Überleben, wenn man relative AFP-Veränderungen und AFP kleiner 15 ng/ml präinterventionell als Faktoren heranzieht. Auch eine gute Restembolisation bedeutet keinen signifikanten Vorteil hinsichtlich des Überlebens. Eine neue Erkenntnis ist die Tatsache, dass bei Patienten mit einem AFP-Wert postinterventionell kleiner als 15 ng/ml die Überlebenszeit signifikant verlängert wird. Dieser Erfolgsparameter ist bisher in keiner bisher veröffentlichten Arbeit dargestellt worden.
Das proinflammatorische Zytokin Interleukin (IL)-18 scheint an einer Vielzahl von Entstehungsprozessen pathologischer Erkrankungen, darunter rheumatoide Arthrits und Artherosklerose, sowie Tumorwachstum und Metastasierungsfähigkeit von Tumoren, beteiligt zu sein. Da die biologische Aktivität der Matrix-Metallo-Proteinase-9 (MMP-9) ebenfalls entscheidenden Einfluss auf die Pathologie dieser Erkrankungen hat, wurden die Auswirkungen von IL-18 auf die MMP-9-Produktion in peripheren Blutmonozyten (PBMC) untersucht. Darüber hinaus richtete sich unser Augenmerk auf die Möglichkeiten einer immunopharmakologischen Intervention mittels anti-Tumor-Nekrose-Faktorα (anti-TNFα) oder IL-10. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß die MMP-9-Produktion in PBMC durch IL-18 gesteigert wird. Dabei ist die Potenz von IL-18 bei der Freisetzung von MMP-9 vergleichbar mit derjenigen von TNFα. Durch die Verwendung neutralisierender monoklonaler Antikörper konnte gezeigt werden, dass die Freisetzung von MMP-9 von einer endogenen TNFα-Produktion abhängig ist. Während IL-18 und TNFα die Protease induzieren, ergibt eine Inkubation mit IFNγ keine Effekte auf die Freisetzung von MMP-9 in den PBMC. Die hier beschriebene Induktion von MMP-9 durch IL-18 ließ sich ebenfalls in humanen Vollblutkulturen nachweisen. Das antientzündliche Zytokin IL-10 ist in der Lage, die Sekretion von MMP-9 sowohl aus unstimulierten als auch aus PBMC, die zuvor mit IL-18 inkubiert wurden, konsequent zu unterdrücken. Die Produktion des tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) bleibt von einer Stimulation mit IL-18 unberührt, wohingegen eine Zugabe von IL-10 die Sekretion von TIMP-1 aus PBMC steigert. Die vorliegende Arbeit erweitert somit die proentzündlichen Wirkungsweisen von IL-18 auf PBMC, betont die herausragende Rolle einer intermediären TNFα-Produktion und stellt einen Zusammenhang her zwischen den biologischen Funktionen von IL-18 und der pathologischen Potenz von MMP-9.
Stickstoffmonoxid (NO) ist ein evolutionär konservierter pleiotroper Botenstoff. Im Nervensystem fungiert NO als Transmitter, als Komponente des unspezifischen Immunsystems wirkt es bakterizid, und im kardiovaskulären System vermittelt es Vasodilatation und Inhibition der Thrombozytenaggregation. Die Regulation der Aktivität und Verfügbarkeit der drei NO-Synthase-Isoformen (NOS) ist außerordentlich komplex, erfolgt unter anderem durch zahlreiche Proteininteraktionen und ist durch eine bemerkenswerte Dynamik der subzellulären Verteilung der NOS gekennzeichnet. Die molekularen Mechanismen dieser Prozesse sind gegenwärtig nicht vollständig verstanden. NOSIP (NOS interagierendes Protein) wurde initial als ein Protein identifiziert, das die subzelluläre Verteilung von endothelialer NOS (eNOS) verändert. Überexpression von NOSIP bewirkt eine Umverteilung der eNOS von der Plasmamembran in intrazelluläre Kompartimente, die zu einer signifikanten Aktivitätsminderung führt. Im Hinblick auf die Bedeutung der subzellulären Lokalisation in der Regulation der eNOS-Aktivität und lokaler Verfügbarkeit von NO war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, die subzelluläre Verteilung von NOSIP zu charakterisieren. Immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass sich endogenes NOSIP vorwiegend im Zellkern findet. In Datenbankanalysen wurde kein klassisches nukleäres Lokalisationssignal (NLS) identifiziert. Bei genauer Betrachtung der Primärsequenz fand sich jedoch eine diskontinuierliche Sequenz mit einer Häufung basischer Aminosäuren. Sukzessive Mutation dieses hypothetischen Motivs führte zu einer Umverteilung des Proteins aus dem Zellkern ins Zytoplasma. Mittels Pulldown-Experimenten konnte gezeigt werden, dass NOSIP an das zur Kernimportmaschinerie gehörende Adapterprotein Importin-α bindet, während NLS-defiziente Mutanten nicht mehr in der Lage waren diese Interaktion einzugehen. Wie Heterokaryon-Experimente belegten, wandert NOSIP zwischen Zellkern und Zytoplasma. Dies deutet auf einen dynamischen nukleären Import- und Exportmechanismus hin, der die Grundlage für eine Interaktion mit zytoplasmatisch lokalisierter eNOS darstellt. Der nukleäre Export von NOSIP wurde durch Leptomycin B nicht beeinflusst, welches den Export von Proteinen blockiert, die eine Leucin-reiche nukleäre Export-Sequenz (NES) besitzen. Zusammengefasst belegen die in dieser Arbeit erhobenen Daten, dass NOSIP ein vorwiegend nukleäres Protein ist. Obwohl diese Verteilung durch ein atypisches zweiteiliges NLS vermittelt wird, umfasst der nukleäre Import von NOSIP die Interaktion mit Importin-α, welches typischerweise den Import von Proteinen vermittelt, die über ein klassisches NLS verfügen. NOSIP ist nicht topographisch im Zellkern fixiert, sondern wandert konstant zwischen Zellkern und Zytoplasma. Da der nukleäre Export von NOSIP nicht durch Leptomycin B beeinflusst wird, erscheint es unwahrscheinlich, dass NOSIP an die typische CRM1-Bindungsstelle für Frachtproteine bindet. Dies lässt sich gut mit der Tatsache in Einklang bringen, dass NOSIP kein Leucin-reiches NES besitzt. Unabhängige Beobachtungen unserer Arbeitsgruppe weisen darauf hin, dass NOSIP in der G2-Phase des Zellzyklus aus dem Zellkern ins Zytoplasma transloziert, wodurch eNOS in dieser kritischen Phase der Zellteilung inhibiert werden kann.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der geochemischen und isotopischen Analyse detritischer Zirkonminerale aus rezenten Sedimenten des weit verzweigten Orange- und Vaal River Flusssystems in Südafrika. Zirkone kristallisieren überwiegend aus krustalen Schmelzen und sind äußerst resistent gegenüber jeglicher Zerstörung und damit ein idealer Kandidat zur Rekonstruktion früherer Krustenbildungsprozesse der geologischen Erdgeschichte. Der kombinierte Ansatz der U-Pb Altersdatierung, der Hf Isotopie und der Spurenelementgeochemie mittels Laserablation und des Einsatzes induktiv-gekoppelter Sektorfeld- und Multikollektormassenspektrometer ermöglicht es die krustale Wachstums- und Entwicklungsgeschichte des südafrikanischen Kratons zu erfassen. Die mehr als 1200 U-Pb Analysen der Zirkone weisen 4 tektonische Hauptphasen des südafrikanischen Kontinents nach: 1. die Panafrikanische Orogenese (0.5-0.7 Ga), 2. das Namaqua-Natal Faltengürtelorogen (1.0-1.3 Ga), 3. die Kheis Orogenese (1.8-2.0 Ga) und 4. die westliche Kaapvaal-Kratonisierung (2.9-3.2 Ga). Allerdings zeigt sich, dass die 13 Probenlokationen überwiegend lokale bzw. regionale U-Pb Altersdaten ihrer umgebenden Herkunftsgebiete liefern. Die Hf Isotopie der Zirkone der verschiedenen tektonischen Hauptphasen Südafrikas stellen ihre differenzierte Akkretions- und Aufschmelzungsgeschichte dar. Die panafrikanischen Zirkone zeigen eine ausgeprägte Durchmischung von juvenilem und recyceltem Material. Die mesoproterozoischen (Namaquan) Zirkone entstanden aus juvenilem Magma während eines Inselbogen-Kontinent-Kollisionsereignisses. Die paläoproterozoischen und archaischen Zirkone sind Produkte von aufgeschmolzener prä-existierender kontinentaler Kruste oder vom Mantel abstammende Schmelzen, die durch kontinentale Kruste kontaminiert wurden. Die berechneten Hf Modellalter, so genannte „Mantelextraktionsalter" ergeben zwei Maxima, die zwei Stadien juvenilem Krustenwachstums einschließen, einmal vor 1.4 und 3.2 Ga. Dieses krustale Wachstum zeigt eine Übereinstimmung mit den progressiv episodischen Modellen von Nagler & Kramers (1998) sowie Condie (2000) mit Höhepunkten zwischen 3.0 und 2.0 Ga sowie den Studien von Wang et al. (2008) mit krustalen Wachstumsperioden von 1.6 bis 2.2 und 2.9 bis 3.4 Ga auf dem Nordamerikanischen Kontinent und auf dem Gondwana-Kontinent (Australien) von Hawkesworth & Kemp 2006) und implizieren wohl ein globales kontinentales Krustenwachstum. Die Abgrenzung und Wiedererkennung der Zirkone anhand der chemischen Zusammensetzung zu möglichen Muttergesteinen zeigen noch keine viel versprechenden Ergebnisse. Generell weisen die Zirkone eine magmatische granitoide Zusammensetzung kontinentalen Ursprungs auf. Eine Auffälligkeit stellen die erhöhten Spuren- und leichten Seltenenerdelemente in Zirkonen jeglicher Altersklassen dar. Nachfolgende Arbeiten müssen zeigen, wie und ob diese Anreicherungen Einfluss auf die chemische Zusammensetzung, die U-Pb Datierung und vor allem die Hf-Isotopie der Zirkone haben.
This thesis deals with the analysis of “presolar” silicates and oxides by high resolution mass spectrometry and electron microscopy techniques. This “stardust” was identified by its extreme oxygen isotopic anomalies, which point to nucleosynthetic reactions in stellar interiors, in the carbonaceous chondrite Acfer 094. Isotopic, chemical and mineralogical studies on these stardust grains therefore allow the testing of astrophysical questions on Earth, which are otherwise only accessible by spectroscopy and theoretical models. The class of presolar silicates has been identified only six years ago in 2002, although it was known already from spectroscopic observations that silicates represent the most abundant type of dust in the galaxy. The development of the “NanoSIMS” was a crucial step in this respect, because this ion probe with its superior spatial resolution of only 50 nm allowed the detection of the typically 300 nm sized presolar silicates. A total of 142 presolar silicates and 20 presolar oxides were identified within Acfer 094, whose matrix therefore contains 163 ± 14 ppm presolar silicates and 26 ± 6 ppm presolar oxides. This is among the highest amounts reported so far for any primitive solar system material. The majority of detected stardust grains derive from asymptotic giant branch stars of 1 – 2.5 Msun and close-to-solar or slightly lower-than-solar metallicity. However, by measuring the Si isotopic compositions of some enigmatic grains, it could be shown that there is a sub-class of presolar silicates characterized by an extreme enrichment of 17O and a moderate enhancement of 30Si relative to solar, whose origins might be explained by formation in binary stellar systems. About 10% of all grains exhibit an enrichment in 18O and some of them also of 28Si relative to solar, which most likely point to an origin in type II supernova explosions. The Si isotopic measurements also allowed to quantify the effect of the s-process on the Si isotopes in low-mass asymptotic giant branch stars. The results agree well with theoretical predictions. The grains were furthermore characterized by SEM and the chemistries of about half of the grains were determined by Auger electron spectroscopy. The majority of grain morphologies are consistent with what is expected from condensation experiments. However, a lot of grains are altered by Fe-rich minerals, which are either of primary condensation or of secondary ISM or solar nebula origin. Furthermore, complex presolar grains consisting of refractory Al-rich grains attached to silicate material could be identified, which have been predicted by condensation theory and observational evidence. Nine presolar silicates were analyzed by combined NanoSIMS/TEM studies. The majority of grains are Mg-rich and amorphous, which is in contrast to astrophysical evidence, which mainly postulate crystalline Mg-rich and amorphous Fe-rich circumstellar condensates. However, the grains might have been rendered amorphous by secondary processes in the ISM or could have condensed under non-equilibrium, low-temperature conditions in the circumstellar outflow. The grains are more likely characterized by a variable, pyroxene-like chemistry, which could be a result of sputtering in the ISM, which preferentially removes Mg. The detected crystalline presolar silicates in this study and in other work are all olivines, whereas grains with a pyroxene stoichiometry are all amorphous except one. This supports astrophysical models which point to different formation pathways for these two types of grains and therefore different crystallinity. However, the relatively high Fe content of three detected presolar olivines in this study and in other work is in contrast to astrophysical evidence and theoretical considerations, which predict essentially Fe-free crystalline grains. It is therefore possible that the infrared spectra might also be compatible with less Mg-rich olivines. The only crystalline presolar silicate with a pyroxene-like stoichiometry is the unusual grain 1_07: although it is chemically enstatite, the electron diffraction pattern could only be indexed to silicate perovskite, which is stable above ~23 GPa. The discovery of a high-pressure phase of presolar origin shows that dust grains encountering interstellar shocks might not necessarily be completely destroyed. In astrophysical models it is in principle also possible that a fraction of larger grains might survive such a shock wave encounter as a high-pressure modification, which is supported by this discovery.
The geodynamic processes and the chemical and thermal evolution of the mantle beneath the Kaapvaal craton (South Africa) was investigated with further regard to diamond formation. For this, 31 coarse-grained peridotites and 21 individual subcalcic garnets from heavy mineral concentrates (HMC) from the Finsch mine were studied for their major and trace element compositions, Lu-Hf and Sm-Nd isotope composition. Furthermore, processes in the Earth’s mantle that follow kimberlite sampling and propagation were studied in polymict peridotite breccia from Kimberley mines. Inter mineral equilibrium of the peridotites was tested by comparing the results from different, independent thermometers. These, well equilibrated peridotites stem from a restricted pressure of 5 to 6.5 GPa (depth ~160-200 km) and a temperature range of 1050-1250°C, following the 40 mW/m2 conductive geotherm. The majority of the samples display a well developed anti-correlation of oxygen fugacity with pressure, which is in contrast to the sheared and oxidised, younger kimberlite erupted peridotites from Kimberley. All analysed samples have homogeneous trace element mineral chemistry. Variations in trace elements among Finsch peridotites reflect their complex nature and the intricate development of the subcratonic mantle. The 3.6 Ga is the oldest crustal age recorded in the Kaapvaal craton, and is confirmed by the Lu-Hf model age of a highly radiogenic subcalcic garnet in this study. Therefore, this age probably represents the oldest depletion (partial melting event) of the subcratonic mantle beneath the Kaapvaal craton. Both, subcalcic garnets and Finsch peridotites yield Lu-Hf isochron ages of around 2.5 Ga, which probably represent the last depletion event of the Kaapvaal craton. Several older (than 2.5 Ga) depletions were also necessary to explain higher isochron initials of the both isochrones. The Cr# and HREE concentrations and ratios of the Finsch subcalcic garnets and peridotites indicate that partial melting of the Kaapvaal craton happened at different depths. One group of subcalcic garnets (group-1) experienced depletion at high pressure in the garnet stability field and another one (group-2) at low pressures in the spinel or plagioclase stability field. Major and trace elements indicate that up to 50%, of the melt was remover from the primitive (primer) mantle in at least two melting events. Thus, first continental crust was created early (> 2.5 Ga) from high degrees of partial melting of the lithospheric mantle. According to the Sm-Nd isotope signatures at least two metasomatic events took place significantly after 2.5 Ga. As monitored by group-1 subcalcic garnets, the first enrichment was produced by a fluid and occurred at around 1.3 Ga. The second metasomatic event was much later at 500-300 Ma ago and has changed both Nd and Hf isotopic compositions of group-2 subcalcic garnet as well as some Finsch peridotites. During partial melting any carbon species will be dissolved in the melt and removed from the residue. Therefore, any diamond growth before the last depletion (~2.5 Ga) would have been probably completely removed from the lithospheric mantle. Consequently, carbon was apparently reintroduced into the system, i.e. during Metasomatism, and triggered the growth of diamonds. The Sm-Nd isotope systematics of the subcalcic garnets of this study indicates that enrichment occurred at ~1.3 Ga or later, which implies non-Archean, late diamond growth in Finsch. Fertilisation of the subcontinental craton associated with the percolation of group-2 (~120 Ma) or even younger (~90 Ma) group-1 kimberlites and their precursors are not observed in Finsch peridotites, but are well presented in mantle xenoliths from Kimberley. Therefore, these younger events were studied on specific mantle xenoliths, polymict breccia from Kimberley. A polymict peridotite found at the Boshof road dump, Kimberley, represents a mechanical mixture of upper mantle clasts and minerals (opx, cpx, garnet and olivine) of different lithologies, cemented by fine-grained olivine and minute amounts of interstitial ilmenite, phlogopite and sulphide. According to Ni in garnet thermometry, single porphyroclastic garnets were sampled and mixed during ascent in a 100 km stratigraphic column, starting from ~250 km until ~120 km. During this ascent, melt has reacted with the porphyroclasts and at theirrims neoblastic minerals were formed, i.e. neoblastic opx around opx porphyroclast, neoblastic garnet around garnet porphyroclast, and neoblastic opx around cpx porphyroclast. Analyses of those neoblastic minerals indicate that volatile-rich, kimberlite-like melt was the agent that collected the mantle minerals and amalgamated this xenolith. Several complex processes were responsible for the formation of the polymict breccia. They comprise melt degassing at high pressures that probably created “explosive” Brecciation of the cratonic roots (~250 km), propagation of the melt that collected different porphyroclasts on a way and amalgamation at around 120 km. The whole process of “explosive” brecciation, turbulent transport and mixing of mantle porphyroclasts and melt, porphyroclast dissolution and neoblast precipitation happened very fast and was part of the kimberlite formation. Therefore, the here studied sample probably represents one frozen part (with variable mantle clasts) of the kimberlitic magma precursor, with kimberlite eruption at ~90 Ma years ago in Kimberley.
Structural analysis of the enzyme N-formylmethanofuran:tetrahydromethanopterin formyltransferase
(2008)
Archaea represent a third domain of life and some archaea exhibit a high degree of tolerance to extreme environmental conditions. Several members are methanogens and present in many anaerobic environments. Most methanogens are able to maintain growth simply on H2 and CO2 via the enzymatically catalyzed reaction 4H2 + CO2 > CH4 + 2 H2O. The archaeon Methanopyrus kandleri grows optimally at temperatures of 84°C to 110°C, pH values of 5.5 to 7.0 and NaCl concentrations 0.2% to 4%. The enzyme N-formylmethanofuran tetrahydromethanopterin formyltransferase (MkFTR) catalyzes the transfer of a formyl group from the cofactor N-formylmethanofuran (FMF) to the cofactor tetrahydromethanopterin (H4MPT), the second step of the above reaction. X-ray crystallographic analysis yielded insights into the structure and function of MkFTR, (1) the MkFTR monomer exhibits a pseudo-two fold structure suggestive of an evolutionary gene duplication. (2) The structure is a D2 homo-tetramer with prominent cleft-like surface features. Analysis of the interface contacts showed that the tetramer is best described as a dimer of dimers. The clefts were associated with the monomer:monomer interface and were weakly occupied by extra electron density which might be attributed to the H4MPT analog folate. (3) This suggested that the clefts are active sites and their association with oligomer interfaces suggested a basis for the dependence of activity on oligomerization. (4) The thermal stability of MkFTR most likely arises from the greater number of H- and ionic-bonds within the monomer and between monomers with respect to mesophilic protein structures. (5) The structure showed a large number of surface exposed negatively charged, glutamate and aspartate residues. These residues explain the salt dependent oligomerization, as only at high enough salt concentration is the electrostatic charge compensated by cation binding and neutralized allowing oligomerization. (6) These residues also improve the solubility of MkFTR at high salt concentration by increased charge repulsion. (7) Comparison of MkFTR structures from low and hight salt conditions showed that surface glutamate residues bind slightly more water molecules at high salt conditions further contributing to MkFTR solubility at high salt concentration.
Hintergrund: Leitlinien können potentiell die gesundheitliche Versorgung verbessern. Ihre evidenzbasierte Entwicklung ist aufwendig, insbesondere bei komplexen Krankheitsbildern, wie chronischer Herzinsuffizienz. Transkontextuelle Leitlinienadaptationen sind problematisch, da kontextuell beeinflusste Empfehlungen der Quellleitlinie die Zielleitlinie verzerren können. Forschungsgegenstand ist eine Verfahrensentwicklung zur systematischen Evaluation von Leitlinien (systematischer Leitlinienreview, SLR) und deren Erprobung am Gegenstand, der Entwicklung einer evidenzbasierten Leitlinie zur hausärztlichen Versorgung der chronischen Herzinsuffizienz. Methode: Der SLR umfasst folgende Verfahrensschritte: 1) Systematische Recherche nach evidenzbasierten Leitlinien, 2) Auswahl von Quellleitlinien nach prädefinierten Kriterien, 3) Bewertung der methodischen Qualität (AGREE-Instrument), 4) Systematische Framework-Entwicklung (klinische Fragen als strukturbildendes Raster der Zielleitlinie), 5) Datenextraktion aus den Quellleitlinien, 6) Systematisch-vergleichende Konsistenzanalyse der Empfehlungen, 7) Informationssynthese im Leitlinien-Erstentwurf, 8) Validierung der Evidenzbezüge und Prüfung der Konkordanz zu Empfehlungen, 9) Überarbeitung des Leitlinien-Erstentwurfs und Formulierung weiteren Forschungsbedarfs. Ergebnisse: N=16 Quellleitlinien erfüllten die Einschlusskriterien (zwei Reviewer, Übereinstimmung K=0,95), davon zeigten fünf eine hohe methodische Qualität. Zum Framework (27 Fragen) wurden N=35 komplexe Empfehlungen identifiziert, darunter waren n=25 konsistent, n=9 inkonsistent, n=1 nicht vergleichbar (einzelne Leitlinienempfehlung). 14/25 konsistenten Empfehlungen waren konsensbasiert (Diagnostik, nicht-pharmakologische Therapie, diastolische Herzinsuffizienz), 7/25 basierten auf belastbarer Evidenz, 4/25 hatten differierende Evidenzlevel. 3/9 Inkonsistenzen waren bedeutsam (BNP-Tests, AT1-Blocker). Für n=16 Empfehlungen wurden Evidenzbelege reevaluiert: die Mehrzahl war kongruent. Einzelne Inkongruenzen (fehlende Evidenzbelege, überoptimistische Trends, inadäquate Risikobewertung), Inkonsistenzen und konsensbasierte Empfehlungen indizierten Forschungsbedarf. Der Erstentwurf wurde nach sechs Monaten fertiggestellt. Diskussion: Die Hauptlimitation der vorgelegten Studie ist die fehlende Zweit-begutachtung, die nur in der Auswahl der Quellleitlinien erfolgte. Schlussfolgerung: Der systematische Leitlinienreview ist ein systematischer, valider, transparenter und effektiver Ansatz zur Entwicklung evidenzbasierter Leitlinien.
In dieser Arbeit wurden potentielle Mitglieder des Proteinnetzwerks um Ataxin-2 untersucht, um Rückschlüsse auf die bisher unbekannte Funktion von Ataxin-2 machen zu können. Ataxin-2 ist das Krankheitsprotein der Spinozerebellären Ataxie Typ 2, einer Polyglutaminerkrankung, bei der die Expansion eines Polyglutamintraktes zur Degeneration von Purkinje-Neuronen führt. Da die Funktion von Ataxin-2 bisher nicht ermittelt werden konnte, sollte die Charakterisierung seiner Protein-Interaktoren es ermöglichen, Einblicke in seine Funktion zu gewinnen. Dazu wurden die drei Kandidaten „Similar to golgin-like“, TRAP und alpha-Actinin-1 untersucht, die alle drei mit Hilfe von Hefe-2-Hybrid Screens identifiziert worden waren. Im Fall von „Similar to golgin-like“, einem aus Genom und cDNA-Fragmenten hervorgesagten Protein unbewiesener Existenz, konnte eine mutationsabhängige Modulation der Bindungsstärke an Ataxin-2 im Hefe-2-Hybrid-System gezeigt werden, die sich allerdings mit rekombinanten Proteinen in Koimmunpräzipitationen in Säuger-Zellen nicht reproduzieren ließ. Beide Proteine kolokalisierten am ER, unabhängig von der Länge des pathogenen Polyglutamintraktes-2 in Ataxin. Gegen ein SIM-Peptid hergestellte Antikörper zeigten eine exklusive Expression im menschlichen Gehirn und wurden erfolgreich zum Nachweis eines endogenen Komplexes aus Ataxin-2 und SIM-IR im krankheitsrelevanten Gewebe eingesetzt. Allerdings war es nicht möglich, mittels 5’-RACE und 2D-Gel Massenspektrometrie die potentiellen Isoformen von SIM näher zu charakterisieren. Zur funktionellen Analyse von SIM wurden intrazelluläre Transportvorgänge am Golgi-Apparat untersucht, aber ein Einfluss von SIM / Ataxin-2 ließ sich nicht belegen. Im Fall des Interaktions-Kandidaten TRAP wurden Antikörper hergestellt und mit einem bereits publizierten polyklonalen Antikörper, der TRAP in rattus norvegicus erkennt, verglichen. Die Expressionsmuster zeigten eine identische Expression im Hirn und der Testis. Eine Kolokalisations-Studie wies sowohl TRAP als auch Ataxin-2 am ER nach. Allerdings erwiesen sich alle verwendeten Antikörper als ungeeignet für Immunpräzipitationen, so dass die physiologische Existenz des endogenen TRAP-Ataxin-2 Komplexes nicht bewiesen werden kann. Im Fall des Interaktor-Kandidaten alpha-Actinin-1 ließ sich die Interaktion mit Ataxin-2 sowohl für die endogenen Proteine in der zytosolischen Fraktion von Mausgehirnen als auch für die rekombinanten Proteine in Säuger-Zellen belegen. Beide Proteine konnten im Zytosol und zu kleineren Anteilen an der Plasmamembran kolokalisiert werden. Als verantwortliche Subdomänen im Fall von Ataxin-2 wurde der N-terminale Bereich des Proteins in der Nähe der pathogenen Expansion, im Fall von alpha-Actinin-1 die Aktin-bindende Domäne durch GST-pulldown Analysen identifiziert. Darauf aufbauend wurde in Patienten-Fibroblasten das Aktinzytoskelett und die Dynamik von alpha-Actinin-1 in Anwesenheit der Ataxin-2-Polyglutamin-Expansion untersucht, wobei allerdings kein Unterschied zu erkennen war. Anschließend an die Analyse des Zytoskeletts wurde ein möglicher Einfluss von Ataxin-2 und seiner Polyglutamin-Expansion auf die EGF-Rezeptorinternalisierung studiert, da eine Rolle von Ataxin-2 auf die Endozytose in parallelen Analysen der Arbeitsgruppe wahrscheinlich wurde. Hierzu wurden Säuger-Zellen mit alpha-Actinin-1 transfiziert und die Internalisierung mikroskopisch und mittels Analyse der ERK1/2 Aktivierung verfolgt. Ergänzt wurden die Experimente durch Analysen zur ERK1/2 Aktivierung in Patienten- und Kontroll-Fibroblasten. Entgegen den Erwartungen hatte die Überexpression von alpha-Actinin-1 keinen Einfluss auf die Internalisierung, und bei keinem der Ansätze zeigte sich eine signifikante Veränderung der ERK1/2 Aktivierung. Auch Transkriptombefunde aus SCA2-KO Gewebe, nach denen einzelne Gene des Zytoskeletts oder der Rezeptor-Endozytose ihre Expression ändern, ließen sich nicht mit Konsistenz validieren. Abschließend wurden Experimente zur subzellulären Lokalisation von Ataxin-2 durchgeführt, die eine Lokalisation am ER und nicht wie bisher berichtet am Golgi-Apparat sicherten und Ergebnisse zur Assoziation mit Polyribosomen bekräftigten. Obwohl somit bei allen drei Proteininteraktor-Kandidaten glaubwürdige Befunde für eine Ataxin-2 Bindung sprechen, ist derzeit eine funktionelle Analyse der Assoziationen nicht möglich und eine klare Definition der physiologischen Rolle von Ataxin-2 lässt sich aus diesen Daten nicht ableiten, wenn auch die prominente Lokalisation von Ataxin-2 am rauen endoplasmatischen Retikulum mit einem Einfluss von Ataxin-2 auf die ribosomale Translation und die Sekretion in Cisternen kompatibel ist.
In der vorliegenden Arbeit wurde die zelluläre Verteilung der beiden Ekto-Nukleotidasen TNAP (gewebeunspezifische Form der alkalischen Phosphatase) und NTPDase2 (Nukleosidtriphosphatdiphosphohydrolase) in den embryonalen, postnatalen und adulten neurogenen Zonen des Mäusehirns untersucht.
• Mittels enzym- und immunhistochemischer Markierungen wurde die TNAP erstmals auf den Zellen der SVZ (subventrikuläre Zone) und des RMS (rostraler Migrationsstrom) nachgewiesen.
• Immunhistochemische Doppelfärbungen von Gewebeschnitten und von akut isolierten Zellen aus der SVZ adulter und postnataler (P15) Mäuse zeigten, dass die TNAP von allen drei Typen neuronaler Vorläuferzellen (Typ B-, C- und A-Zellen) der SVZ exprimiert wird.
• Enzymatische Markierungen verschiedener Embryonal- und Postnatalstadien (ab Embryonalstadium14, E14) ergaben, dass die TNAP schon im Stadium E 14 im Bereich der Seitenventrikel exprimiert wird:
o In den frühen Embryonalstadien lag die TNAP über die gesamte Gewebedicke, von der ventrikulären bis zur pialen Oberfläche vor.
o Im Laufe der weiteren Entwicklung war eine im Kortex beginnende und sich später bis in das Striatum ausweitende Reduktion der TNAP-Aktivität zu beobachten. Mit zunehmender Reifung des Gehirns wurde die Schicht der TNAP-positiven Zellen dünner und beschränkte sich schließlich auf die SVZ.
• Die NTPDase2 war erst im Zeitraum zwischen E18 und P2 nachweisbar. Sie war im Bereich der Seitenventrikel lokalisiert und auf die an die Ventrikel angrenzenden Zellen beschränkt. Im Laufe der weiteren Entwicklung wandern die NTPDase2-positiven Zellen offensichtlich in die SVZ ein und ab P14 waren sie zu hüllartigen Strukturen angeordnet, die eine Doppelmarkierung für TNAP und NTPDase2 aufwiesen und Gruppen DCX-positiver Zellen (Typ-A Zellen, Neuroblasten) umschlossen.
• Die Markierung mit dem Neuroblastenmarker DCX war bereits zum Stadium E14 möglich. In diesem Altersstadium wurden lediglich die Zellen im Bereich des Kortex gefärbt. Im Laufe der postnatalen Entwicklung verlagerten sich die DCX-positiven Zellen ihren Schwerpunkt in den Bereich der SVZ. Bereits ab P10 lagen in der SVZ Gruppen von DCX/TNAP-doppelpositiven Zellen vor, Anzeichen für eine Konzentrierung der Neurogenese auf die SVZ.
• Die Ausschaltung des TNAP-Gens (TNAP-Knockout-Mäuse) hatte keinen offensichtlichen Einfluss auf die Ausbildung der Seitenventrikel oder die Ausbildung und zelluläre Zusammensetzung der SVZ.
• In der zweiten wesentlichen neurogenen Zone des Säugerhirns, dem Gyrus dentatus des Hippokampus, konnte die TNAP nicht nachgewiesen werden, obwohl die dortigen Vorläuferzellen NTPDase2 exprimieren.
Die vorliegenden Daten belegen erstmals eine Assoziation der TNAP mit neuronalen Vorläuferzellen und erlauben zusammen mit den Markierungen für NTPDase2 und weitere zelluläre Marker neue Einsichten in die zelluläre Entwicklung der adulten SVZ. Darüber hinaus stützen sie die Vorstellung einer Beteilung purinerger Signalwege an der Steuerung der embryonalen, postnatalen und adulten Neurogenese.
RNA interference (RNAi) is triggered by recognition of double-stranded RNA (dsRNA), and elicits the silencing of gene(s) complementary to the dsRNA sequence. RNAi is thought to have emerged as a way of safeguarding the genome against mobile genetic elements and viral infection, thus maintaining genomic integrity. dsRNA is first processed into small interfering RNAs (siRNA) by the enzyme Dicer. siRNAs are ~21 to 25 -nt long, and contain a signature 5’ phosphate group and a two nucleotide long 3’ overhang (Bernstein et al., 2001). The siRNA is then loaded into the RNA-induced si-lencing complex (RISC), of which Argonaute is the primary catalytic component (Liu et al., 2004). Energetic asymmetry of the siRNA ends allows for its directional loading into RISC (Khvorova et al., 2003; Schwarz et al., 2003). Argonaute cleaves the passen-ger strand of the siRNA, leaving the guide strand of the siRNA bound to RISC (Gregory et al., 2005; Matranga et al., 2005; Rand et al., 2005). This single-stranded guide strand siRNA bound to Argonaute is able to recognize target mRNA in a sequence-specific manner, and cleaves the mRNA. Argonaute 2 in complex with single-stranded siRNA is sufficient for mRNA recognition and cleavage, thus forming a minimal RISC (Rivas et al., 2005). miRNAs, endogenously expressed small RNA genes which typically contain mismatches and non-Watson-Crick base pairing, are processed by this general pathway, although typically modulate gene expression by translational repression as opposed to cleavage of their target mRNA. The number of Argonaute genes is highly variable between species, ranging from one in S. pombe to twenty-seven in C. elegans. Earlier crystal structures of Argonaute apoen-zymes show the architecture of Argonaute to be a multidomain protein composed of N terminal, PAZ, MID, and PIWI domains (Song et al., 2004; Yuan et al., 2005). These multi-domain proteins are present in both prokaryotic and eukaryotic organisms. The role of Argonaute proteins in prokaryotes is still unknown, but based similarity to eu-karyotic Argonautes, they may also be involved in nucleic acid-directed regulatory pathways. These proteins have served as excellent models for learning about the struc-ture and function of this family of proteins. RNAi has found a widespread application for the simple yet effective knockdown of genes of interest. The catalytic cycle of RISC requires the binding of a number of different nucleotide structures to Argonaute, and we expect Argonaute to undergo a number of conforma-tional changes during the cycle of mRNA recognition by RISC (Filipowicz, 2005; Tom-ari and Zamore, 2005). Nevertheless, it remains unclear how the multi-domain ar-rangement of Argonaute recognizes and distinguishes between single-stranded and dou-ble-stranded oligonucleotides, which correspond to the Dicer-processed siRNA product, guide strand siRNA, and the guide strand / mRNA duplex. The Argonaute protein from Aquifex aeolicus was cloned, expressed, crystallized and solved by molecular replacement. Relative to earlier Argonaute structures, a 24° reorientation of the PAZ domain in this structure opens a basic cleft between the N-terminal and PAZ domains, exposing the guide strand binding pocket of PAZ. A 5.5-ns molecular dynamics simulation of Argonaute showed a strong tendency of the PAZ and N-terminal domains to be mobile. Binding of single-stranded DNA to Argonaute was monitored by total internal reflection fluorescence spectroscopy (TIRFS). The experi-ments showed biphasic kinetics indicative of large conformational changes, and re-vealed a hotspot of binding energy corresponding to the first 9 nucleotides, the so-called “seed region” most crucial for sequence-specific target recognition. As RNAi may have evolved as a way of safeguarding the genome viral infection, it is not surprising that viruses have evolved different strategies to suppress the host RNAi response in the form of viral suppressor protein. (Hock and Meister, 2008; Lecellier and Voinnet, 2004; Rashid et al., 2007; Song et al., 2004; Vastenhouw and Plasterk, 2004). These viral suppressors are widespread, having been identified in a number of different viral families. Not surprisingly, they generally share little sequence homology with one another, although they appear to exist as oligomers built upon a ~ 100-200 amino acid protomer. Tomato aspermy virus, a member of the Cucumoviruses, encodes for protein 2B (TAV 2B, 95 a.a., ~11.3 kDa) that acts as an RNAi suppressor. Intriguingly, a similar genomic arrangement is seen in RNAi suppressors in the Nodaviruses, a family of viruses that can infect both plants and animals, such as Flock house virus b2 (FHV b2). The 2B and b2 proteins are both derived from a frameshifted ORF within the RNA polymerase gene (Chao et al., 2005). In spite of this genomic similarity, the 2B and b2 proteins share little sequence identity, and it is not well understood how the Cucumovirus 2B proteins suppress RNAi. To address how TAV 2B suppresses RNAi, the oligonucleotide-binding properties of TAV 2B were studied. TAV 2B shows a preference for double-stranded RNA oligonucleotides corresponding to siRNAs and miRNAs, and also binds to single-stranded RNA oligonucleotides. A stretch of positively charged residues between amino acids 20-30 are critical for RNA binding. Binding to RNA oligomerizes and induces a conformational change in TAV 2B into a primarily helical structure. These studies sug-gest that suppression of RNAi by TAV 2B may occur by targeting different stages of the RNAi pathway. TAV 2B falls under the category of more general RNAi suppres-sors, with potentially multiple targets for suppression.
The µ-opioid receptor is the primary target structure of most opioid analgesics and thus responsible for the predominant part of their wanted and unwanted effects. Carriers of the frequent genetic µ-opioid receptor variant N40D (allelic frequency 8.2 - 17 %), coded by the single nucleotide polymorphism A>G at position 118 of the µ-opioid receptor coding gene OPRM1 (OPRM1 118A>G SNP), suffer from a decreased opioid potency and from a higher need of opioid analgesics to reach adequate analgesia. The aim of the present work was to identify the mechanism by which the OPRM1 118A>G SNP decreases the opioid potency and to quantify its effects on the analgesic potency and therapeutic range of opioid analgesics.
To elucidate the consequences of the OPRM1 118A>G SNP for the effects of opioid analgesics, brain regions of healthy homozygous carriers of the OPRM1 118A>G SNP were identified by means of functional magnetic resonace imaging (fMRI), where the variant alters the response to opioid analgesics after painful stimulation. Afterwards, the µ-opioid receptor function was analyzed on a molecular level in post mortem samples of these brain regions. Finally, the consequences of the OPRM1 118A>G SNP for the analgesic and respiratory depressive effects of opioids were quantified in healthy carriers and non-carriers of OPRM1 118A>G SNP by means of experimental pain- and respiratory depression-models.
To identify pain processing brain regions, where the variant alters the response to opioid analgesics after painful stimulation, we investigated the effects of different alfentanil concentration levels (0, 25, 50 and 75 ng/ml) on pain-related brain activation achieved by short pulses (300 msec) of gaseous CO2 (66% v/v) delivered to the nasal mucosa using a 3.0 T magnetic head scanner in 16 non-carriers and nine homozygous carriers of the µ-opioid receptor gene variant OPRM1 118A>G. In brain regions associated with the processing of the sensory dimension of pain (pain intensity), such as the primary and secondary somatosensory cortices and the posterior insular cortex, the activation decreased linearly in relation to alfentanil concentrations, which was significantly less pronounced in OPRM1 118G carriers. In contrast, in brain regions known to process the affective dimension of pain (emotional dimension), such as the parahippocampal gyrus, amygdala and anterior insula, the pain-related activation disappeared already at the lowest alfentanil dose, without genotype differences.
Subsequently, we investigated the µ-opioid receptor-expression ([3H]-DAMGO saturation experiments, OPRM1 mRNA analysis by means of RT-PCR), the µ-opioid receptor affinity ([3H]-DAMGO saturation and competition experiments) and µ-opioid receptor signaling ([35S]- GTPγS binding experiments) in post mortem samples of the human SII-region, as a cortical projection region coding for pain intensity, and lateral thalamus, as an important region for nociceptive transmission. Samples of 22 non-carriers, 21 heterozygous and three homozygous carriers of OPRM1 118A>G SNP were included into the analysis. The receptor expression and receptor affinity of both brain regions did not differ between non-carriers and carriers of the variant N40D. In non-carriers, the µ-opioid receptors of the SII-region activated the receptor bound G-protein more efficiently than those of the thalamus (factor 1.55-2.27). This regional difference was missing in heterozygous (factor 0.78-1.66) and homozygous (factor 0.66-1.15) carriers of the N40D variant indicating a reduced receptor-G-protein-coupling in the SII-region.
Finally, the consequences of the alteration of µ-opioid receptor function in carriers and noncarriers of the genetic variant was investigated using pain- and respiratory depression-models. Therefore, 10 healthy non-carriers, four heterozygous and six homozygous carriers of the µ- opioid receptor variant N40D received an infusion of four different concentrations of alfentanil (0, 33.33, 66.66 and 100 ng/ml). At each concentration level, analgesia was assessed by means of electrically (5 Hz sinus 0 to 20 mA) and chemically (200 ms gaseous CO2 pulses applied to the nasal mucosa) induced pain, and respiratory depression was quantified by means of hypercapnic challenge according to Read and recording of the breathing frequency. The results showed that depending on the used pain model, both heterozygous and homozygous carriers of the variant N40D needed 2 – 4 times higher alfentanil concentrations to achieve the same analgesia as non-carriers. This increase seems to be at least for homozygous carriers unproblematic, because to reach a comparable respiratory depression as non-carriers, they needed 10-12 times higher alfentanil concentrations.
The results of this work demonstrate that the µ-opioid receptor variant N40D causes a regionally limited reduction of the signal transduction efficiency of µ-opioid receptors in brain regions involved in pain processing. Thus, the painful activation of sensory brain regions coding for pain intensity is not sufficiently suppressed by opioid analgesics in carriers of the variant N40D. Due to the insufficient suppression in hetero- and homozygous carriers of the variant N40D, the concentration of opioids has to be increased by a factor 2 - 4, in order to achieve the same analgesia as in non-carriers. At the same time, the respiratory depressive effects are decreased to a greater extent in homozygous carriers of the N40D variant as they need a 10 - 12 times higher opioid concentration to suffer from the same degree of respiratory depression as non-carriers. Due to the increased therapeutic range of opioid analgesics, an increase of the opioid dose seems to be harmless, at least for homozygous carriers of the N40D variant.
Arabidopsis thaliana besitzt 21 Hitzestress-Transkriptionsfaktoren die von zentraler Bedeutung für die Aktivierung der Hitzestress-Antwort sind. Der HsfA2 ist dabei der am stärksten exprimierte Hsf und akkumuliert in der Pflanze wie andere Hitzestress- Proteine. Nach ca. einer Stunde HS ist die maximale Transkriptmenge zu verzeichnen, während das sehr stabile Protein noch mindestens 21 Stunden nach dem Stress vorhanden ist. Durch Analyse einer SALK T-DNA-Insertionslinie mit einem kompletten HsfA2-Knockout wurden Zielgene des HsfA2 identifiziert. Am stärksten ist die Ascorbat-Peroxidase 2 (APX2) betroffen, deren Transkript in Knockout-Pflanzen fast völlig fehlt. Außerdem sind sHsps, einzelne Mitglieder der Hsp70- und Hsp100-Familien, sowie Transkripte von Genen, deren Funktion noch nicht bekannt ist, reduziert. In transienten GUSReporter- Assays wurde das Aktivierungs-Potential des HsfA2 an den Promotoren der folgenden Gene bestätigt: Hsp18.1-CI, Hsp25.3-P, Hsp22.0-ER, Hsp26.5-MII, Hsp70b und Hsp101-3. Dabei zeigte sich, dass jeweils ca. 0,5kb der stromaufwärts des Startcodons liegenden regulatorischen Sequenzen zur Gen-Aktivierung ausreichen. Für den APX2-Promotor konnte durch Deletionsanalysen zudem das entscheidende HSE-Dimer identifiziert werden. In EMSAs mit rekombinanten GST-Fusions-Proteinen wurde die spezifische Bindung des HsfA2 hier bestätigt, während eine Mutante HsfA2(R98A) nicht mehr an die DNA bindet. Mit Proteinextrakten aus hitzegestresster Arabidopsis-Zellkultur konnte die Bedeutung dieses HSE-Dimers für die Bindung endogener Faktoren im Hitzestress ebenfalls nachgewiesen werden. Auch für die oben genannten Hsps sowie Hsp17.4-CI, Hsa32 und die zwei unbekannten Proteine At1g0370 und At4g21320 konnte die DNA-Bindung des GST-HsfA2 im EMSA gezeigt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde HsfA2 erstmals als Voll-Längen-Protein untersucht. Durch Analyse von NLS-Mutanten wurde nachgewiesen, dass nur eine Hälfte der als bipartit vorhergesagten NLS funktionell ist und somit die NLS monopartit ist. Weitere Mutanten wie z.B. Deletionen von Sekundärstruktur-Elementen der DBD oder der Oligomerisierungsdomäne zeigen die Notwendigkeit dieser Bestandteile für die Funktionalität des HsfA2. Außerdem ist offenbar der N-terminale Bereich vor der DBD wichtig für die Proteinstabilität. Um die DNA-Bindungsdomänen aller 21 verschiedenen Arabidopsis-Hsfs auf ihre Bindungsfähigkeit zu untersuchen, wurden Konstrukte verwendet, die jeweils die DBD in Fusion mit dem C-Terminus des HsfA2 enthielten. Diese chimären Hsfs wurden in transienten GUS-Reporter-Assays und EMSAs untersucht. Dabei zeigte sich, dass ein Großteil der Proteine immer an die analysierten DNA-Fragmente bindet, wenn auch mit unterschiedlicher Intensität, während die A6a- und B3-DBDs dies gar nicht oder nur extrem schlecht vermochten. Durch Mutation einzelner Aminosäurereste ließ sich das zumindest für B3 verbessern. Der HsfA3 ist ein weiterer im Hitzestress induzierter Hsf. Allerdings ist sein Transkript erst nach ca. drei Stunden vorhanden und nimmt in der frühen Erholungsphase noch zu. Unter den 21 Hsfs ist er der einzige, der spezifisch durch DREB2A induziert wird. In transienten GUS-Reporter-Assays und EMSAs konnten im HsfA3-Promotor zwei DREs als Bindungsstellen des DREB2A identifiziert werden, die gleichermaßen notwendig sind. Desweiteren wurde das Aktivator-Potential des HsfA3 und fünf DREBs (1A, 1B, 1C, 2A und 2B) an potentiellen Zielgenen untersucht. Dabei konnten drei Gruppen definiert werden: A) Gene die nur durch HsfA3 induziert werden (Hsp18.1-CI, Hsp25.3-P, Hsp70b und Hsp101-3), B) Gene die hauptsächlich durch HsfA3 aber teilweise auch durch DREBs (besonders 2A und 2B) induziert werden (Hsp17.4-CI, Hsp17.6-CII, Hsp26.5-MII und GolS1) und C) Gene die nur durch DREBs induziert werden (RD29A, COR47 und KIN1). In dualen Reporter-Assays wurde die Transkriptionskaskade DREB2A -> HsfA3 -> Hsp bestätigt. Die direkte DNA-Bindung der DREBs bzw. des HsfA3 an den Promotoren wurde in EMSAs nachgewiesen und für Hsp26.5-MII und Hsp18.1-CI durch Kartierung auf kleine Bereiche eingegrenzt. Aus der Literatur ist bekannt, dass HsfA1a/A1b konstitutiv exprimiert werden und ebenfalls Einfluß auf viele Hitzestress-Gene besitzen. So lässt sich spekulieren, dass diese bereits in der frühen Hitzestress-Phase die Induktion der HS-Antwort regulieren könnten, während HsfA2 die Expression von HS-Genen verstärkt und HsfA3 später möglicherweise für die volle Ausprägung der Thermotoleranz wichtig ist.
Platelets are anucleate cells that play a major role in hemostasis and thrombosis in the vasculature. During primary hemostasis platelets adhere to sites of vascular damage and the initial platelet coat is reinforced by additional platelets forming a stable aggregate. At the same time platelets secrete their intracellular granules containing substances that further activate platelets in an autocrine and paracrine fashion and affect local coagulation and endothelial smooth muscle cell function. The small guanine nucleotide binding protein Rap1 regulates the activity of the platelet integrin alphaIIbbeta3 and thus platelet aggregation. Rap1 activity is controlled by guanine nucleotide exchange factors and GTPase activating proteins. In platelets, Rap1GAP2 is the only GTPase activating protein of Rap1. In order to identify Rap1GAP2-associated proteins, a genetic two-hybrid screening in yeast was performed and synaptotagmin-like protein 1 (Slp1, also called JFC1) was found as a new putative binding partner of Rap1GAP2. Slp1 is a tandem C2 domain containing protein and is known to bind to Rab27, a small GTPase involved in platelet dense granule secretion. The direct interaction between Rap1GAP2 and Slp1 was confirmed in yeast and in transfected cells. More importantly, Slp1 is expressed in platelets and binding of endogenous Rap1GAP2 and Slp1 was verified in these cells. The Rap1GAP2 and Slp1 interaction sites were mapped by mutational analysis. Rap1GAP2 binds through the -TKXT- motif within its C-terminus to the C2A domain of Slp1. Moreover, the Slp1 binding -TKXT- motif of Rap1GAP2 was confirmed by complementary approaches using short synthetic Rap1GAP2 peptides. The C2A domain of Slp1 is a phospholipid binding domain and thus mediates binding of Slp1 to the plasma membrane. Phospholipid overlay assays revealed that simultaneous binding of Slp1 via its C2A domain to Rap1GAP2 and to phospholipids can occur. In addition, the interaction between Rap1GAP2 and Slp1 is regulated by cAMP-dependent protein kinase (cAK or PKA), and kinase activation in platelets enhanced binding of endogenous Rap1GAP2 to Slp1. In-vitro phosphorylation assays revealed that Slp1 is a substrate of PKA, and serine 111 was identified as phosphorylation site. Since Slp1 is a Rab27 binding protein, a trimeric complex of Slp1, Rab27 and Rap1GAP2 is conceivable. The association of Slp1, Rab27 and Rap1GAP2 was investigated by immunofluorescence and co-immuno-precipitation experiments in both, transfected cells and platelets. By Slp1 affinity chromatography and subsequent mass spectrometric analysis additional Slp1 binding proteins were identified in platelets, and binding of Slp1 to Rab8 was confirmed in pull-down assays. To investigate the functional significance of the interaction between Rap1GAP2 and Slp1, an assay system was established to determine serotonin secretion of streptolysin-O permeabilized platelets. Addition of recombinant Slp1 protein to permeabilized platelets strongly inhibited platelet dense granule secretion, whereas addition of recombinant Rap1GAP2 protein or synthetic Rap1GAP2 peptide enhanced secretion. Deleting the Slp1 binding -TKXT- motif abolished the stimulatory effect of Rap1GAP2 on secretion. Addition of Rap1 to permeabilized platelets had no effect on secretion. These findings indicate that the Rap1GAP2 effect on platelet secretion does not depend on the GTPase activating function of Rap1GAP2, but is rather dependent on the -TKXT- mediated interaction of Rap1GAP2 with Slp1. In addition, in-vitro GAP assays revealed that Slp1 binding to Rap1GAP2 does not affect the Rap1GAP activity of Rap1GAP2, and adhesion assays excluded a role for the Rap1GAP2/Slp1 interaction in cell adhesion. Altogether, the results of the present study demonstrate that besides its function in platelet aggregation by controlling the activity of the small guanine nucleotide binding protein Rap1, Rap1GAP2 is involved in platelet dense granule secretion by the new -TKXT- mediated interaction with the Rab27 and membrane binding protein Slp1. In addition, the interaction between Rap1GAP2 and Slp1 is embedded into an elaborate network of protein-protein interactions in platelets which appear to be regulated by phosphorylation. Future studies will in particular aim to dissect the molecular details of Rap1GAP2 and Slp1 action in platelet secretion and investigate the potential biochemical and pharmacological value of the unique protein binding -TKXT- motif of Rap1GAP2.
High field strength element systematics and Lu-Hf & Sm-Nd garnet geochronology of orogenic eclogites
(2008)
Concerning the Bulk Silicate Earth (BSE), the depleted mantle and the continental crust are thought to balance the budget of refractory and lithophile elements, resulting in complementary trace element patterns. However, the two high field strength elements (HFSE) Niob and Tantal appear to contradict this mass balance. All reservoirs of the silicate Earth exhibit subchondritic Nb/Ta ratios, possibly as a result of Nb depletion. The two HFSE Zr and Hf on the other hand seem not to be fractionated between the silicate reservoirs. They show more or less chondritic Zr/Hf ratios. In this study a series of orogenic eclogites from different localities was analyzed to determine their HFSE concentrations and to contribute to the question if eclogites could form a hidden reservoir to account for the mass imbalance of the BSE. The results show that the orogenic eclogites have subchondritic Nb/Ta ratios and near chondritic Zr/Hf ratios. The investigated eclogites show no fractionation of Nb/Ta ratios and no enrichment of Nb compared to e.g. MOR-basalts, the likely precursor of these rocks. With an average Nb/Ta ratio of 14.9 these eclogites could not balance the differences between BSE and chondrite. Additionally, with an average Nb/Ta ≈ MORB they also cannot balance the small differences in the Nb/Ta of the crust and the mantle. LA-ICPMS analyses of rutiles in these eclogites reveal a zonation of Nb/Ta ratios in this mineral, with rutile cores having higher Nb/Ta than rutile rims. As a consequence, Laser Ablation data of rutiles have to be evaluated carefully and cannot necessarily reflect a bulk rock Nb and Ta composition, although over 90% of these elements reside in rutile.
Basierend auf dem kognitiv-motivationalen Prozessmodell von Vollmeyer und Rheinberg (1998) werden zwei Studien vorgestellt, die sich mit dem selbst regulierten Lernen mit Multimedia im Physikunterricht beschäftigen. Das kognitiv-motivationale Prozessmodell beschreibt, wie die Eingangsmotivation über Mediatorvariablen auf die Leistung, in diesem Fall den Wissenserwerb, wirkt. Wie in früheren Studien gezeigt werden konnte, besteht die Eingangsmotivation aus vier voneinander unabhängigen Faktoren: Herausforderung, Interesse, Erfolgswahrscheinlichkeit und Misserfolgsbefürchtung. Als Mediatorvariablen wurden in beiden Studien die von Schülern verwendeten Strategien, der motivationale Zustand während des Lernens und der funktionale Zustand während des Lernens angenommen. Bei den Strategien handelt es sich genauer gesagt um das beobachtbare Verhalten der Schülers während des Lernens. Mit Motivationalem Zustand sind die gleichen Faktoren wie bei der Eingangsmotivation gemeint, nur dass jetzt die Lerner schon Erfahrung mit der Aufgabe haben. Der funktionale Zustand gibt an, wie sehr ein Lerner auf die Aufgabe konzentriert ist. Ein Konstrukt, das diesen Zustand gut beschreibt, ist Csikszentmihalyis Flow. Ziel der Pilotstudie war es, das Lernen im Schulalltag mit einem Physikprogramm am Computer zu untersuchen. Dazu wurden folgende Hypothesen aufgestellt: 1) Die Eingangsmotivation wirkt auf die Mediatoren. 2) Die Mediatoren wirken auf die Leistung. 3) Die Eingangsmotivation wirkt auf die Mediatoren und diese wiederum auf die Leistung (Prüfung des Prozessmodells). 4) Es gibt Geschlechtsunterschiede bei den Variablen: Eingangsmotivation, hier insbesonders beim Interesse, den Mediatoren und der Leistung. Schüler sollten bei allen Variablen besser abschneiden. In der Pilotstudie hatten 32 SchülerInnen einer 11. Klasse 30 Minuten Zeit, sich ein Physiklernprogramm zum Thema Drehmomente (Wünscher & Ehmke, IPN Kiel, 2002) selbständig zu erarbeiten. Neben der Eingangsmotivation vor Beginn des Lernens (FAM, Rheinberg, Vollmeyer & Burns, 2001) wurde die Motivation und Flow während des Lernens gemessen (FKS; Rheinberg, Vollmeyer & Engeser, 2003; 8 Items aus dem FAM). Die Vorgehensweise am PC wurde mit Hilfe eines Videoüberwachungsprogramms (ScreenVirtuoso) und eines Monitoringprogramms (StatWin) aufgezeichnet. Indikatoren für das Lernen waren die im Anschluss an die Bearbeitung des Lernprogramms in einem Lernfragebogen zu der Lerneinheit erzielte Punktzahl. Als Kontrollvariable wurde zu Beginn das Vorwissen erfasst. Indikatoren für die Strategien waren a) die Schnelligkeit der Bearbeitung (Anzahl der bearbeiteten Abschnitte und Bearbeitungszeit der einzelnen Abschnitte), b) die Aktivität (Mausklicks) und c) die Verwendung der Animationen (Schnelligkeit des Auffindens, Anzahl, Länge und Art und Weise der Nutzung). Die Hypothesen konnten bestätigt werden. Das kognitiv-motivationale Prozessmodell konnte in den meisten Teilen bestätigt werden: Die Eingangsmotivation, vor allem das Interesse, wirkt über Mediatoren, hier besonders über die verwendeten Strategien, auf die Leistung. Die Geschlechtsunterschiede beim Lernen mit einem Physikprogramm am PC (in der Eingangsmotivation, den Vorgehensweisen, und der gezeigten Leistung) waren stärker als erwartet zu Gunsten der Schüler. Die Geschlechtsunterschiede waren bei allen Variablen signifikant. Damit Schülerinnen in dem untersuchten Bereich zukünftig bessere Ergebnisse erzielen, könnte es hilfreich sein, ihr situationales Interesse und die Erfolgszuversicht zu erhöhen. In der Hauptstudie wurde daher der Versuch gemacht, durch eine Veränderung der Instruktion die Motivation, besonders die der Schülerinnen, beim Arbeiten mit einem Physiklernprogramm zu steigern. Hier sollten besonders zwei Faktoren der Eingangsmotivation wichtig sein. Wenn es eine Rolle spielt, für wie fähig sich ein Schüler hält, dann müsste es möglich sein, durch entsprechende Instruktionen die Erfolgswahrscheinlichkeit zu stärken und damit das Lernergebnis zu verbessern. Dies erschien im Hinblick auf die schlechte Erfolgswahrscheinlichkeit der Schülerinnen in der Pilotstudie geboten. Weiterhin wurde der Einfluss, den das Interesse auf die Leistung hat, diskutiert und entsprechend in der Hauptstudie versucht, das Interesse der Schüler zu steigern. Die Hypothesen lauteten: 1) Bei den Experimentalgruppen wird durch die Instruktion die Eingangsmotivation verändert. 2) Da der Einfluss von Vorwissen nicht auszuschließen ist, wird es kontrolliert. Es wird erwartet, dass das Vorwissen mit der Leistung signifikant korreliert. Bei den Experimentalgruppen wird mehr Vorwissen aktiviert als bei der Kontrollgruppe. 3) Durch die Manipulation sollen sich auch die Mediatoren des Lernprozesses verändern. 4) Die Leistung soll sich in Abhängigkeit von der Instruktion in den Experimentalgruppen verbessern. Der Versuchsablauf blieb im Wesentlichen unverändert. In einem 3 x 2 Design wurden 60 Schüler (30 weiblich, 30 männlich) aus der Klassenstufe 11 getestet. Es gab eine Instruktion, worin die Schülerinnen über die Bedrohung durch Geschlechtsrollenstereotype informiert wurden und gebeten wurden, dagegen an zu arbeiten. In einer zweiten Experimentalgruppe sollte das Interesse aller Probanden erhöht werden. Die Ergebnisse waren weitgehend hypothesenkonform. Es konnte gezeigt werden, dass sich mittels der Instruktion die Eingangsmotivation verbesserte und sich dadurch auch Flow-Erleben und Motivation während des Lernens erhöhten, wodurch eine bessere Leistung zustande kommen konnte. Dies ist ein Ergebnis, das für den Schulalltag von Schülern und Lehrern berücksichtigt und umgesetzt werden sollte. Lehrer sollten Schülerinnen in mathematisch-naturwissenschaftlichen Fächern auf das Geschlechtsrollenstereotyp aufmerksam machen, da dies zu besseren Strategien und Leistungen bei deren Lernen führt. Sie sollten überdies das Interesse der Schülerinnen wecken, durch Betonung der persönlichen Relevanz des Themas ebenso wie durch noch zu untersuchende andere, Interesse besser weckende Instruktionen. Allerdings war in der Hauptstudie das Interesse in der Interessegruppe nicht wie erwartet gestiegen, dagegen veränderten sich andere Faktoren der Eingangsmotivation. Die Schüler hielten einen Erfolg für wahrscheinlicher, die Schülerinnen waren ängstlicher. Dennoch verhielten sich die Schülerinnen dieser Gruppe strategisch besser und erzielten auch bessere Leistungen. Die Schüler hatten ein höheres Flow-Erleben, erzielten aber keine besseren Leistungen. In der Stereotypgruppe gab es ebenfalls signifikante Verbesserungen bei allen Prozessvariablen bei den Schülerinnen. Sie hatten erwartungsgemäß eine höhere Erfolgswahrscheinlichkeit, zeigten bessere Lernstrategien und erzielten bessere Leistungen als die Schülerinnen der Kontrollgruppe. Während in der Kontrollgruppe fast alle Geschlechtsunterschiede der Pilotstudie repliziert wurden, gab es in den Experimentalgruppen keine Geschlechtsunterschiede mehr. Insbesondere die Schülerinnen hatten von der Manipulation profitiert. Die Gründe für die Veränderungen in den Experimentalgruppen wurden diskutiert und weitere Forschungsansätze aufgeführt. Erfreulich ist, dass im Schulalltag beim Lernen mit einem Computerprogramm Flow-Erleben erzeugt werden konnte. Ebenfalls erfreulich ist, dass der Benachteiligung von Schülerinnen beim Lernen mit Physikprogrammen wirksam begegnet werden konnte. Der Lernprozess konnte ein weiteres Stück im Schulalltag erforscht werden und mit Hilfe von Monitoringprogrammen konnten objektive Indikatoren für das Vorgehen bzw. die Strategien von Schülern beim Lernen am Computer bestimmt werden. Als günstiger Strategieindikator erwies sich vor allem die Länge und Güte der Nutzung von Animationen. Das kognitiv-motivationale Prozessmodell konnte erneut bestätigt werden und sollte in weiteren Forschungen als theoretischer Hintergrund herangezogen werden.
CAP (c-Cbl assoziiertes Protein) ist ein Adapterprotein, welches zusammen mit ArgBP2 und Vinexin die SoHo-Protein-Familie bildet. Es besitzt in seinem N-terminalen Bereich eine SoHo-Domäne und im C-Terminus drei SH3-Domänen, über welche es mit einer Vielzahl von Proteinen interagieren kann. CAP spielt bei verschiedenen Signaltransduktionsvorgängen und der Reorganisation des Aktinzytoskelettes eine Rolle. So wurde ihm eine Funktion im PI3-Kinase-unabhängigen Insulinsignalweg zugeschrieben. In Zell-Zell-Kontakten ist CAP zusammen mit Nectin und Afadin Bestandteil des NAPSystems, welches parallel zu Cadherin-Catenin-Adhäsionen existiert. In Fokalkontakten bindet CAP an FAK, Paxillin und Vinculin, welche wichtig für die Regulation der Zell-Matrix-Adhäsionen sind. In der vorliegenden Arbeit sollte die Funktion von CAP bei der Assoziation mit dem Aktinzytoskelett näher untersucht werden. Es wurde gezeigt, daß die Kolokalisation von CAP mit Vinculin und Aktin dynamisch und vom Ausbreitungsgrad der Zelle und dem Expressionsniveau des Proteins abhängig ist. Ohne funktionelle SH3-Domänen lokalisiert CAP nicht mehr in Fokalkontakten, kann aber bei Überexpression noch eine Ausbildung von Streßfasern induzieren. Die Funktionalität der zweiten und der dritten SH3-Domäne von CAP ist für die Zelladhäsion von Epithelzellen von Bedeutung, da Konstrukte, die in konservierten Aminosäuren der Domänen mutiert worden sind, eine verringerte Zellausbreitung aufweisen. CAP wurde zudem als ein Interaktionspartner und Substrat der Tyrosinkinasen c-Abl und c-Src charakterisiert. Die Assoziation mit den Kinasen wird dabei vor allem über den C-Terminus von CAP vermittelt, und CAP kann direkt mit der Src-Kinase interagieren. CAP wird von c-Abl überwiegend an Tyrosin 360, und von c-Src bevorzugt an Tyrosin 326 phosphoryliert. Diese Tyrosine liegen innerhalb bekannter Konsensus-Motive der Kinasen. Phosphorylierungsdefiziente CAP-Konstrukte sind noch dazu in der Lage, mit Vinculin und Aktin zu kolokalisieren. Tyrosin 326 hat jedoch einen Einfluß auf die Zellausbreitung auf Fibronektin, da ein in dieser Aminosäure mutiertes Konstrukt einen Defekt hierbei aufweist. Den genauen Mechanismus, über welchen CAP seinen Einfluß auf die Zell-Matrix-Adhäsion ausübt, ist noch ungeklärt. Durch die hier erstmals aufgezeigte Phosphorylierung des Adapterproteins erweitern sich dessen Interaktionsmöglichkeiten durch mögliche Bindungen an SH2-Domänen-enthaltende Proteine. CAP könnte als Bindeglied zwischen c-Abl und c-Src und weiteren zytoskelettalen Komponenten dazu beitragen, die Kinasen an Fokalkontakten zu verankern und ihnen neue Substrate zuzuführen. Die Interaktion mit CAP könnte dabei die Aktivität der Kinasen erhöhen. Weiterführende Studien werden die in diesem Signalweg nachgeschalteten Komponenten untersuchen und auch eine putative Rolle der Phosphorylierung von CAP in den bereits bekannten zellulären Zusammenhängen wie dem Insulinsignalweg näher beleuchten.
Reggie-1 (flotillin-2) and reggie-2 (flotillin-1) are membrane microdomain proteins which are associated with the membrane by means of acylation. They influence different cellular signaling processes, such as neuronal, T-cell and insulin signaling. Upon stimulation of the EGF receptor, reggie-1 becomes phosphorylated and undergoes tyrosine 163 dependent translocation from the plasma membrane to endosomal compartments. In addition, reggie-1 was shown to influence actindependent processes. Reggie-2 has been demonstrated to affect caveolin- and clathrin-independent endocytosis. Both proteins form homo- and hetero-oligomers, but the function of these oligomers has remained elusive. Moreover, it has not been clarified if functions of reggie-1 are also influenced by reggie-2 and vice versa. The first aim of the study was to further investigate the interplay and the heterooligomerization of reggie proteins and their functional effects. Both reggie proteins were individually depleted by means of siRNA. In different siRNA systems and various cell lines, reggie-1 depleted cells showed reduced protein amounts of reggie-1 and reggie-2, but reggie-2 knock down cells still expressed reggie-1 protein. The decrease of reggie-2 in reggie-1 depleted cells was only detected at protein but not at mRNA level. Furthermore, reggie-2 expression could be rescued by expression of siRNA resistant wild type reggie-1-EGFP constructs, but not by the soluble myristoylation mutant G2A. This mutant was also not able to associate with endogenous reggie-1 or reggie-2, which demonstrates that membrane association of reggie-1 is necessary for hetero-oligomerization. In addition, fluorescence microscopy studies and membrane fractionations showed that correct localization of overexpressed reggie-2 was dependent on co-overexpressed reggie-1. Thus, hetero-oligomerization is crucial for membrane association of reggie-2 and for its protein stability or protein expression. Moreover, the binding of reggie-2 to reggie-1 required tyrosine 163 of reggie-1 which was previously shown to be important for endosomal translocation of reggie-1. Since reggie-2 was implicated to function in clathrin- and caveolin-independent endocytosis pathways, the effect of reggie-2 depletion on reggie-1 endocytosis was investigated. Indeed, reggie-1 was dependent on reggie-2 for endosomal localization and EGF-induced endocytosis. By FRET-FLIM analysis it could be shown that reggie heterooligomers are dynamic in size or conformation upon EGF stimulation. Thus, it can be concluded that reggie proteins are interdependent in different aspects, such as protein stability or expression, membrane association and subcellular localization. In addition, these results demonstrate that the hetero-oligomers are dynamic and reggie proteins influence each other in terms of function. A further aim was the characterization of reggie-1 and reggie-2 function in actindependent processes, where so far only reggie-1 was known to play a role. Depletion of either of the proteins reduced cell migration, cell spreading and the number of focal adhesions in steady state cells. Thus, also reggie-2 affects actin-dependent processes. Further investigation of the focal adhesions during cell spreading revealed that depletion of reggie-1 displayed different effects as compared to reggie-2 knock down. Reggie-1 depleted cells had elongated cell-matrix-adhesions and showed reduced activation of FAK and ERK2. On the other hand, depletion of reggie-2 resulted in a restricted localization of focal adhesion at the periphery of the cell and decreased ERK2 phosphorylation, but it did not affect FAK autophosphorylation. Hence, reggie proteins influence the regulation of cell-matrix-adhesions differently. A link between reggie proteins and focal adhesions is the actin cross-linking protein -actinin. The interaction of -actinin with reggie-1 could be verified by means of co-immunoprecipitations and FRET-FLIM analysis. Reggie-1 binds -actinin especially in membrane ruffles and in other locations where actin remodeling takes place. Moreover, -actinin showed a different localization pattern during cell spreading in reggie-1 depleted cells, as compared to the control cells. These results provide further insights into the function of both reggie proteins. Their interplay and hetero-oligomerization was shown to be crucial for their role in endocytosis. In addition, both reggie proteins influence actin-dependent processes and differentially affect focal adhesion regulation.
Strong chromofields developed at early stages of relativistic heavy-ion collisions give rise to the collective deceleration of net baryons from colliding nuclei. We have solved classical equations of motion for baryonic slabs under the action of time-dependent chromofield. We have studied sensitivity of the slab trajectories and their final rapidities to the initial strength and decay pattern of the chromofield as well as to the back reaction of produced plasma. This mechanism can naturally explain significant baryon stopping observed at RHIC, an average rapidity loss hδyi ≈ 2. Using a Bjorken hydrodynamical model with particle producing source we also study the evolution of partonic plasma produced as the result of chromofield decay. Due to the delayed formation and expansion of plasma its maximum energy density is much lower than the initial energy density of the chromofield. It is shown that the net-baryon and produced parton distributions are strongly correlated in the rapidity space. The shape of net-baryon spectra in midrapidity region found in the BRAHMS experiment cannot be reproduced by only one value of chromofield energy density parameter ǫ0, even if one takes into account novel mechanisms as fluctuations of color charges generated on the slab surface, and weak interaction of baryon-rich matter with produced plasma. The further step to improve our results is to take into account rapidity dependence of saturation momentum as explained in thesis. Different values of parameter ǫ0 has been tried for different variants of chromofield decay to fit BRAHMS data for net-baryon rapidity distribution. In accordance with our analysis, data for fragmentation region correspond to the lower chromofield energy densities than mid-rapidity region. χ2 analysis favors power-law of chromofield decay with corresponding initial chromofield energy density of order ǫf = 30GeV/fm3.
This work is devoted to the description of mechanisms that might be responsible for avian magnetoreception. Two possible theoretical concepts underlying this phenomenon are formulated and their functionality is proven in realistic geomagnetic fields. It has been suggested that the "magnetic sense" in birds may be mediated by the blue light receptor protein- cryptochrome- which is known to be localized in the retinas of migratory birds. Cryptochromes are a class of photoreceptor signaling proteins that are found in a wide variety of organisms and which primarily perform regulatory functions, such as the entrainment of circadian rhythm in mammals and the inhibition of hypocotyl growth in plants. Recent experiments have shown that the activity of cryptochrome-1 in Arabidopsis thaliana is enhanced by the presence of a weak external magnetic field, confirming the ability of cryptochrome to mediate magnetic field responses. Cryptochrome's signaling is tied to the photoreduction of an internally bound chromophore, flavin adenine dinucleotide (FAD). The spin chemistry of this photoreduction process, which involves electron transfer from a chain of three tryptophans, is modulated by the presence of a magnetic field in an effect known as the radical pair mechanism. Cryptochrome was suggested as a possible magnetoreceptor for the first time in 2000. However, no realistic calculations of the magnetic field effect in cryptochrome were performed. One of the goals of the present thesis is computationally to study the electron spin dynamics in cryptochrome and to show the feasibility of a cryptochrome-based compass in birds. In particular, the activation yield of cryptochrome was studied as a function of an external magnetic field and it was shown that the activation of the protein can be influenced by the geomagnetic field. In the work it has also been proven that cryptochrome provides an inclination compass, which is necessary for bird orientation. The evolution of spin densities as a function of time is also discussed. An alternative mechanism of avian magnetoreception discussed in the thesis is based on the interaction of two iron minerals (magnetite and maghemite) which were only recently found in subcellular compartments within the sensory dendrites of the upper beak of several bird species. The iron minerals in the beak form platelets of crystalline maghemite and assemblies of magnetite nanoparticles (magnetite clusters). The interaction between these particles can be manipulated by an external magnetic field inducing a primary receptor potential via strain-sensitive membrane channels that lead to a certain bird orientation effect. Various properties of the magnetite/maghemite magnetoreceptor system have been considered: the potential energy surface of the magnetite cluster has been calculated and analyzed as a function of the orientation of an external magnetic field; the forces acting on the magnetite cluster were calculated and analyzed; the force differences caused by the change of the direction of external magnetic field were established; the probability of opening the mechanosensitive ion channel was calculated. Finally it has been demonstrated that the iron-mineral based magnetoreceptor provides a polarity magnetic compass. Various conditions at which the magnetoreception process is violated are outlined.
In der vorliegenden Studie wurden 7 Dentin-Adhäsive (Adper Prompt-L-Pop, Prompt L-Pop, Xeno III, I-Bond, One-up-Bond, Prime&Bond NT, Scotchbond 1) bezüglich ihrer Zytotoxizität anhand primärer Gingivafibroblasten im Zellkulturtest untersucht. Die Studie wurde in Vorversuche und Hauptversuche unterteilt. Die Vorversuche dienten unter anderem dazu, im vornherein den pH-Wert zu bestimmen und die Dentin-Adhäsive auf ihre Viskosität in der Petrischale hin zu untersuchen. In den Hauptversuchen wurden die Eluate nach 24 und nach 48 Std. anhand der Parameter „lebende Zellen“ und „tote Zellen“ mittels des Cell Counters ausgewertet. Dem gegenüber stehen deskriptive Ergebnisse die keine statistische Relevanz haben. Die Ergebnisse bezüglich der Zytotoxizität lassen sich wie folgt zusammenfassen: • Scotchbond1, I-Bond und Prime&Bond NT weisen signifikant weniger lebende Zellen auf als die Zellkontrolle. Zueinander erwiesen sich die Materialien als nicht signifikant unterschiedlich. • Adper Prompt-L-Pop, Prompt-L-Pop, Xeno III und One-up-Bond sind bezüglich der Parameter „lebende Zellen“ und „tote Zellen“ nicht signifikant unterschiedlich zur Zellkontrolle. • Der Parameter „tote Zellen“ ergab keinerlei statistische Signifikanz. • Die qualitative Auswertung stimmt mit der quantitativen Ergebnisdarstellung überein. Unter der Limitation dieser in-vitro-Studie kann keine Empfehlung für die klinische Anwendung der Dentinadhäsive „Scotchbond 1“, „I-Bond“ und „Prime&Bond NT“ abgegeben werden.
In the context of information theory, the term Mutual Information has first been formulated by Claude Elwood Shannon. Information theory is the consistent mathematical description of technical communication systems. To this day, it is the basis of numerous applications in modern communications engineering and yet became indispensable in this field. This work is concerned with the development of a concept for nonlinear feature selection from scalar, multivariate data on the basis of the mutual information. From the viewpoint of modelling, the successful construction of a realistic model depends highly on the quality of the employed data. In the ideal case, high quality data simply consists of the relevant features for deriving the model. In this context, it is important to possess a suitable method for measuring the degree of the, mostly nonlinear, dependencies between input- and output variables. By means of such a measure, the relevant features could be specifically selected. During the course of this work, it will become evident that the mutual information is a valuable and feasible measure for this task and hence the method of choice for practical applications. Basically and without the claim of being exhaustive, there are two possible constellations that recommend the application of feature selection. On the one hand, feature selection plays an important role, if the computability of a derived system model cannot be guaranteed, due to a multitude of available features. On the other hand, the existence of very few data points with a significant number of features also recommends the employment of feature selection. The latter constellation is closely related to the so called "Curse of Dimensionality". The actual statement behind this is the necessity to reduce the dimensionality to obtain an adequate coverage of the data space. In other word, it is important to reduce the dimensionality of the data, since the coverage of the data space exponentially decreases, for a constant number of data points, with the dimensionality of the available data. In the context of mapping between input- and output space, this goal is ideally reached by selecting only the relevant features from the available data set. The basic idea for this work has its origin in the rather practical field of automotive engineering. It was motivated by the goals of a complex research project in which the nonlinear, dynamic dependencies among a multitude of sensor signals should be identified. The final goal of such activities was to derive so called virtual sensors from identified dependencies among the installed automotive sensors. This enables the real-time computability of the required variable without the expenses of additional hardware. The prospect of doing without additional computing hardware is a strong motive force in particular in automotive engineering. In this context, the major problem was to find a feasible method to capture the linear- as well as the nonlinear dependencies. As mentioned before, the goal of this work is the development of a flexibly applicable system for nonlinear feature selection. The important point here is to guarantee the practicable computability of the developed method even for high dimensional data spaces, which are rather realistic in technical environments. The employed measure for the feature selection process is based on the sophisticated concept of mutual information. The property of the mutual information, regarding its high sensitivity and specificity to linear- and nonlinear statistical dependencies, makes it the method of choice for the development of a highly flexible, nonlinear feature selection framework. In addition to the mere selection of relevant features, the developed framework is also applicable for the nonlinear analysis of the temporal influences of the selected features. Hence, a subsequent dynamic modelling can be performed more efficiently, since the proposed feature selection algorithm additionally provides information about the temporal dependencies between input- and output variables. In contrast to feature extraction techniques, the developed feature selection algorithm in this work has another considerable advantage. In the case of cost intensive measurements, the variables with the highest information content can be selected in a prior feasibility study. Hence, the developed method can also be employed to avoid redundance in the acquired data and thus prevent for additional costs.
Mit der Ausweitung von Implantatversorgungen auf den Seitenzahnbereich teilbezahnter Patienten haben sich in der internationalen Zahnheilkunde verschiedene Therapiekonzepte mit teilweise konträren Inhalten entwickelt, um die Komplikationsraten der prothetischen Versorgungen zu senken. Ziel dieser Arbeit ist die Analyse von implantatprothetischen Konzepten bei festsitzenden Versorgungen im Seitenzahnbereich sowie der Vergleich internationaler Studien mit der vorliegenden klinischen Langzeitstudie zur Bewährung von Suprastrukturen. Im Rahmen dieser prospektiven klinischen Studie wurden 357 Patienten mit 799 Implantaten im Seitenzahnbereich versorgt und regelmäßig jährlich nachuntersucht. Entsprechend ihrer Versorgung werden 346 implantatgetragene Einzelkronen, 83 verblockte Kronen, 108 reinimplantat- getragene Brücken und 111 Verbundbrücken unterschieden und die Überlebensraten dieser Suprastrukturen verglichen. In der Gruppe der implantatgetragenen Einzelkronen beträgt die Überlebensrate der Implantate nach fünf Jahren 97,9%. Der Anteil komplikationsloser Versorgungen in diesem Zeitraum beträgt 78%. Bei den verblockten Kronen wurden während des Untersuchungszeitraums keine Implantatverluste festgestellt, der Anteil komplikationsloser Versorgungen liegt nach fünf Jahren bei 84%. Im Bereich der reinimplantatgetragenen Brücken frakturierte eines der Implantate unter Belastung, so dass daraus eine 5-Jahres-Überlebensrate der Implantate von 99,6% resultiert. Bei 66,7% der Brücken traten keinerlei prothetische Komplikationen auf. Auch in der Gruppe der Verbundbrücken traten keine Implantatverluste auf. Zudem wiesen die Versorgungen in diesem Bereich mit einem Anteil komplikationsloser Versorgungen von 89,2% nach fünf Jahren die besten prothetischen Ergebnisse auf. In allen vier Gruppen zeigte sich die Dezementierung als häufigstes prothetisches Ereignis. Sowohl die Wahl des Implantatsystems als auch die Liegedauer weisen einen statistisch signifikanten Einfluss auf die Komplikationsrate der Suprastrukturen auf. Dagegen haben der Implantationsort (Ober- bzw. Unterkiefer, Prämolaren- bzw. Molarengebiet), die Zahl der Implantate im Verbund der prothetischen Konstruktion sowie der Implantatdurchmesser keinen statistisch signifikanten Einfluss hinsichtlich des Anteils der Suprakonstruktionen mit Komplikationen. Die festsitzende Versorgung von Implantaten mit bewährten prothetischen Konzepten zeigt in unserer klinischen Studie niedrigere Komplikationsraten als die Literatur. Selbst bei hohen Kaubelastungen, wie sie vor allem im Molarengebiet auftreten, kann auf die Verblockung von Kronen verzichtet werden. Zudem können Implantate im Rahmen einer Pfeilervermehrung mit natürlichen Zähnen verbunden werden, ohne dass daraus eine höhere Rate technischer Misserfolge resultiert. Dabei stellt die Dezementierung als häufigstes Ereignis keine echte prothetische Komplikation dar. Sie ist vielmehr abhängig von der Größe des verwendeten Abutments, von der Oberflächenbeschaffenheit von Abutment und Krone (poliert oder gestrahlt), von der Art des Befestigungszementes sowie von der Passgenauigkeit. Die Ergebnisse dieser klinischen Studie zeigen, dass bei Verwendung eines mechanisch hochfesten Implantatsystems auf spezielle implantatprothetische Konzepte verzichtet werden kann, sondern vielmehr zahnbasierte prothetische Konzepte übertragen werden können.
Seit ca. 1973 werden die schriftlichen Staatsexamina in Deutschland in Anlehnung an das amerikanische Prüfungssystem mit Einfachauswahlfragen (auch als MC-Fragen bezeichnet) durchgeführt. Dieser Fragentypus hat sich auch für universitäre Prüfungen durchgesetzt, trotz ungeklärter Validität und Eignung dieses Fragentyps. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, den Einfluss von Formatunterschieden bei inhaltlich identischen Fragen auf das Prüfungsergebnis aufzuzeigen Hierzu wurden klassische MC-Fragen mit Freitextfragen sowie mit Mehrfachauswahlfragen verglichen. Es wurden fachspezifische Klausuren während der Übergangszeit von der 8. ÄAppO von 1989 auf die jetzt gültige 9. ÄAppO von 2002 so konstruiert, dass inhaltsidentische Fragen in einer Version als MC-Fragen, in der anderen Version in anderem Format gestellt wurden; jeweils eine Hälfte der teilnehmenden Studierenden diente als Kontrollgruppe für die Fragestellung in anderem Format. Ausgewertet wurden 11 Klausuren mit jeweils 15 MC-Fragen und 15 alternativen Fragen im Zeitraum SS 2004 bis WS 2004/2005 in den Fächern Augenheilkunde, Dermatologie, Orthopädie, Psychiatrie, Rechtsmedizin und Urologie, mit insgesamt 1219 teilnehmenden Studenten. MC-Fragen (55%) wurden im Mittel häufiger korrekt beantwortet als AW-Fragen (25%) und FT-Fragen (33%). Wenn bei Auswahlfragen Studierende mit vier von fünf zutreffenden Entscheidungen ebenfalls einbezogen werden, kommen etwa 52% der Studierenden auf „richtige“ Antworten. Insbesondere bei Freitextfragen gab es große fragenspezifische Unterschiede, in einigen Fällen wurden Freitextfragen häufiger zutreffend beantwortet als inhaltsidentische MC-Fragen. Diese Unterschiede legen nahe, dass aktives Wissen mit MC-Fragen nicht prüfbar ist. Teilwissen konnte mit Fragen in den klassischen MC-Formaten nicht ermittelt werden. Wie exemplarisch in dieser Arbeit gezeigt wird, werden bei Fragen im MCFormat für die Entscheidung richtig/falsch nicht alle Aussagen berücksichtigt. Ergebnisse aus MC-basierten Prüfungen ergeben einen deutlich höheren Anteil richtiger Antworten, als dem aktuellen Wissen entspricht; häufig scheint die Entscheidung zwischen zwei Alternativen geraten zu werden. Bei einer Umformulierung in Freitextfragen ergeben sich häufig größere fragenspezifische Differenzen, die suggerieren, dass mit MC-Fragen aktives Wissen nicht prüfbar ist. Die vorliegenden Untersuchungen begründen Zweifel an der Eignung von ausschließlich MC-basierten Prüfungen für die Prüfung höherer Wissensebenen, eine Validität MC-basierter Prüfungen für klinisches Alltags- und Basiswissen scheint nicht gegeben zu sein.
Proteorhodopsin (PR) originally isolated from uncultivated γ-Proteobacterium as a result of biodiversity screens, is highly abundant ocean wide. PR, a Type I retinal binding protein with 26% sequence identity, is a bacterial homologue of Bacteriorhodopsin (BR). The members within this family share about 78% of sequence identity and display a 40 nm difference in the absorption spectra. This property of the PR family members provides an excellent model system for understanding the mechanism of spectral tuning. Functionally PR is a photoactive proton pump and is suggested to exhibit a pH dependent vectorality of proton transfer. This raises questions about its potential role as pH dependent regulator. The abundance of PR in huge numbers within the cell, its widespread distribution ocean wide at different depths hints towards the involvement of PR in utilization of solar energy, energy metabolism and carbon recycling in the Sea. Contrary to BR, which is known to be a natural 2D crystal, no such information is available for PR til date. Neither its functional mechanism nor its 3D structure has been resolved so far. This PhD project is an attempt to gain a deeper insight so as to understand structural and functional characterization of PR. The approach combines the potentials of 2D crystallography, Atomic Force Microscopy and Solid State NMR techniques for characterization of this protein. Wide range of crystalline conditions was obtained as a result of 2D crystallization screens. This hints towards dominant protein protein interactions. Considering the high number of PR molecules reported per cell, it is likely that driven by such interactions, the protein has a native dense packing in the environment. The projection map represented low resolution of these crystals but suggested a donut shape oligomeric arrangement of protein in a hexagonal lattice with unit cell size of 87Å*87Å. Preliminary FTIR measurements indicated that the crystalline environment does not obstruct the photocycle of PR and K as well as M intermediate states could be identified. Single molecule force spectroscopy and atomic force microscopy on these 2D crystals was used to probe further information about the oligomeric state and nature of unfolding. The data revealed that protein predominantly exists as hexamers in crystalline as well as densely reconstituted regions but a small percentage of pentamers is also observed. The unfolding mechanism was similar to the other relatively well-characterized members of rhodopsin family. A good correlation of the atomic force microscopy and the electron microscopy data was achieved. Solid State NMR of the isotopically labeled 2D crystalline preparations using uniformly and selectively labeling schemes, allowed to obtain high quality SSNMR spectra with typical 15N line width in the range of 0.6-1.2 ppm. The measured 15N chemical shift value of the Schiff base in the 2D crystalline form was observed to be similar to the Schiff base chemical shift values for the functionally active reconstituted samples. This provides an indirect evidence for the active functionality of the protein and hence the folding. The first 15N assignment has been achieved for the Tryptophan with the help of Rotational Echo Double Resonance experiments. The 2D Cross Polarization Lee Goldberg measurements reflect the dynamic state of the protein inspite of restricted mobility in the crystalline state. The behavior of lipids as measured by 31P from the lipid head group showed that the lipids are not tightly bound to the protein but behave more like the lipid bilayer. The 13C-13C homonulear correlation experiments with optimized mixing time based on build up curve analysis, suggest that it is possible to observe individual resonances as seen in case of glutamic acid. The signal to noise was good enough to record a decent spectrum in a feasible period. The selective unlabeling is an efficient method for reduction in the spectral overlap. However, more efficient labeling schemes are required for further characterization. The present spectral resolution is good for individual amino acid investigation but for uniformly labeled samples, further improvement is required.
The increasing resistance of almost all pathogenic bacteria to antibiotics (multidrug resistance) causes a severe threat to public health. The mechanisms underlying multidrug resistance include the induced over expression of multidrug transporters which extrude a variety of lipophilic and toxic substrates in an energy dependent fashion through the membrane out of the cell. These proteins are found in all transporter families. The work described in this thesis is dedicated to drug-proton antiporters from the small multidrug resistance (SMR) family. These efflux pumps with just four transmembrane helices per monomer are so far the smallest transporters discovered. Their oligomeric state, topology, three dimensional structure, catalytic cycle and transport mechanism are still rather controversial. Therefore, the aim of this thesis was to directly address these questions for the small multidrug resistance proteins Halobacterium salinarium Hsmr and Escherichia coli (E. coli) EmrE using a number of biophysical methods such as NMR, transport assays, mass spectrometry and analytical ultracentrifugation. Especially the work on Hsmr has been challenging due to the halophilic nature of this protein. In Chapter 1, key questions and the most important biophysical techniques are introduced followed by Material and Methods in Chapter 2. Depending on experimental requirements, cell free or ‘classical’ in vivo expression has been used for this thesis. Cell free expression as an option for the production of small multidrug transporters has been explored in Chapter 3. It has been possible to produce the SMR family members Hsmr, EmrE, TBsmr and YdgF in vitro. The expression of Hsmr was investigated in more detail under different experimental conditions. Hsmr was either refolded from precipitate or maintained in a soluble form during expression in the presence of detergents and liposomes. Furthermore, amino acids for which no auxotrophic strains were available could be labelled successfully. This expression system has been also used for preparing labelled samples of EmrE as described in Chapter 9. In vivo in E. coli expression of Hsmr, as described in Chapter 4, provided large amounts of proteins if fermenter production was used. Uniform labelling and selective unlabelling with stable isotopes (13C, 15N) for NMR spectroscopy was achieved in vivo in a more efficient and cost effective manner than using the cell free approach for this protein. Hsmr could be purified successfully from both in vitro and in vivo expression media. Hsmr is expressed in vivo and in vitro with N-terminal formylation. The Nterminal formylation is unstable and Hsmr in the presence of low salt concentrations was amenable to N-terminal degradation. It was found that Hsmr shows longest stability in Fos-ß-choline® 12 and sodium dodecyl sulphate, but best reconstitution conditions were found, when dodecyl maltoside is used and exchanged with Escherichia coli lipids. A molar protein lipid ratio of 1 to 100, amenable to solid state nuclear magnetic resonance, has been achieved. Sample homogeneity was shown by freeze fracture electron microscopy. The oligomeric state of Hsmr in detergent has been assessed by SDS PAGE, blue native PAGE, size exclusion chromatography, analytical ultracentrifugation and laser induced liquid bead ion desorption mass spectrometry (LILBID) as described in Chapter 5. A concentration and detergent dependent monomer-oligomer equilibrium has been found by all methods. The activity of Hsmr under the sample preparation conditions used here was shown using radioactive and fluorescence binding as well as fluorescence and electrochemical transport assays (Chapter 6). For transport studies, a stable pH gradient was generated by co-reconstitution of Hsmr with bacteriorhodopsin and subsequent sample illumination. Based on the observed long term stability of Hsmr in Fos-ß-choline® 12 and sodium dodecyl sulphate, liquid state NMR experiments were attempted in order to assess the correct folding of Hsmr in detergent micelles (Chapter 7). 1D proton and 2D HSQC spectra of U-15N Hsmr revealed a poor spectral dispersion, low resolution and only a small number of peaks. These are at least partly due to long rotational correlation times of the large protein detergent complex. This problem has been overcome by applying solid-state NMR to Hsmr reconstituted into E. coli lipids (Chapter 8). Uniform 13C labelled samples were prepared and two dimensional proton-driven spin diffusion and double quantum-single quantum correlation spectra were acquired successfully. Unfortunately, the spectral resolution was not yet sufficient for further structural studies. Reasons for the observed linebroadening could be structural heterogeneity or molecular motions which interfere with the NMR timescale. Therefore, the protein mobility has been probed using static 2H solid state NMR on Ala-d3-Hsmr. It could be shown, that parts of Hsmr are remarkably mobile in the membrane and that this mobility can be limited by the addition of the substrate ethidium bromide. Ethidium bromide as well as tetraphenylphosphonium (TPP+) is typical multidrug transporter substrates. The membrane interaction of TPP+ in DMPC membranes has been resolved by 1H MAS NMR. It was found that it penetrates into the interface region of the lipid bilayers and therefore behaves like many other transporter substrates adding to the hypothesis that the membrane could act as a pre-sorting filter. Finally, Chapter 9 is dedicated to the characterisation of the essential and highly conserved residue Glu-14 in EmrE by solid-state NMR. In order to avoid spectral overlap, the single Glu EmrE E25A mutant was chosen instead of the wildtype. The protein has been produced in vitro to take advantage of reduced isotope scrambling in the cell free expression system as verified by analytical NMR spectroscopy. Correct labelling of EmrE was tested by MALDI-TOF and solid-state NMR. The dimeric state of DDM solubilised EmrE has been probed by LILBID. The labelled protein was reconstituted into E. coli lipids to ensure a native membrane environment. Activity was determined by measuring ethidium bromide transport. Freeze fracture EM revealed very homogeneous protein incorporation even after many days of MAS NMR experiments. 2D 13C double quantum filtered experiments were used to obtain chemical shift and lineshape information of Glu-14 in EmrE. Two distinct populations were found with backbone chemical shift differences of 4 - 6 ppm which change upon substrate binding. These findings indicate a structural asymmetry at the assumed dimerisation interface and are discussed in the context of a model for shared substrate/proton binding. These studies represent the first successful use of cell free expression to prepare labelled membrane proteins for solid-state NMR and allow for the first time an NMR insight into the binding pocket of a multidrug efflux pump.
Antibiotic resistance of pathogenic bacteria is a major worldwide problem. Bacteria can resist antibiotics by active efflux due to multidrug efflux pumps. The focus of this study has been the mycobacterial multidrug transporter TBsmr because it belongs to the small multidrug resistance (SMR) family whose members are a paradigm to study multidrug efflux due to their small size. SMR proteins are typically 11-12 kDa in size and have a four-transmembrane helix topology. They bind cationic, lipophilic antibiotics such as ethidium bromide (EtBr) and TPP+, and transport them across the membrane in exchange for protons. To understand the molecular mechanism of multidrug resistance, we have to gain information about the structure and function of these proteins. The research described in this thesis aimed to deduce details about the topology, transport cycle and key residues of TBsmr using biophysical techniques. Solid-state NMR (ssNMR) can provide detailed insight into structural organization and dynamical properties of these systems. However, a major bottleneck is the preparation of mg amounts of isotope labeled protein. In case of proteoliposomes, the problem is compounded by the presence of lipids which have to fit into the small active volume of the ssNMR rotor. In Chapter 3, an enhanced protein preparation is described which yields large amounts of TBsmr reconstituted in a native lipid environment suitable for further functional and structual studies. The achieved high protein-to-lipid ratios made a further characterization by ssNMR feasible. The transport activity and oligomeric state of the reconstituted protein in different types of lipid was studied as shown in Chapter 4. The exact oligomeric state of native SMR proteins is still uncertain but a number of biochemical and biophysical studies in detergent suggest that the minimal functional unit capable of binding substrate is a dimer. However, binding assays are not ideal since a protein may bind substrate without completing the transport cycle which can only be shown for reconstituted protein in transport assays.By combining functional data of a TPP+ transport assay with information about theoligomeric state of reconstituted TBsmr obtained by freeze-fracture electron microscopy, it could be shown that lipids affect the function and the oligomeric state of the protein, and that the TBsmr dimer is the minimal functional unit necessary for transport. The transport cycle must involve various conformational states of the protein needed for substrate binding, translocation and release. A fluorescent substrate will therefore experience a significant change of environment while being transported, which influences its fluorescence properties. Thus the substrate itself can report intermediate states that form during the transport cycle. In Chapter 5, the existence of such a substrate-transporter complex for the TBsmr and its substrate EtBr could be shown. The pH gradient needed for antiport has been generated by co-reconstituting TBsmr with bacteriorhodopsin. The measurements have shown the formation of a pH-dependant, transient substrate-protein complex between binding and release of EtBr. This state was further characterized by determining the Kd, by inhibiting EtBr transport through titration with non-fluorescent substrate and by fluorescence anisotropy measurements. The findings support a model with a single occluded intermediate state in which the substrate is highly immobile. Liquid-state NMR is a useful tool to monitor protein-ligand interactions by chemical shift mapping and thus identify and characterize important residues in the protein which are involved in substrate binding. In agreement with previous studies (Krueger-Koplin et al., 2004), the detergent LPPG was found to be highly suitable for liquid-state NMR studies of the membrane protein TBsmr and 42% of the residues could be assigned, as reported in Chapter 6. However, no specific interactions with EtBr were found. This observation was confirmed by LILBID mass spectrometry which showed that TBsmr was predominantly in the non-functional monomeric state. Functional protein was prepared in proteoliposomes which can be investigated by solidstate NMR (Chapter 7). Besides the essential E13, the aromatic residues W63, Y40, and Y60 have been shown to be directly involved in drug binding and transport. Different isotope labeling strategies were evaluated to improve the quality of the NMR spectra to identify and characterize these key residues. In a single tryptophan mutant of reconstituted TBsmr W30A, the binding of ethidium bromide could be detected by 13C solid-state NMR. The measurements have revealed two populations of the conserved W63 residue with distinct backbone structures in the presence of substrate. There is a controversy about the parallel or anti-parallel arrangement of the protomers in the EmrE dimer (Schuldiner, 2007) but this structural asymmetry is consistent with both a parallel and anti-parallel topology.
The respiratory chain is composed of protein complexes residing in the inner mitochondrial membrane of eukaryotes or in the cytoplasmic membrane of prokaryotes. This cellular energy converter transforms a redox potential stored in low potential substrates into an electrochemical potential across the respective membrane. Typical respiratory chains contain the complexes I, II, III and IV named according to their sequence in the respiratory chain reaction. Electrons of low potential substrates enter at complex I or II and are passed via complex III to complex IV where they are transferred to oxygen. The transport of electrons between the complexes is mediated by small electron shuttles like quinol or cytochrome c. Two different models describe their exchange either by (1) random collision of freely diffusible electron shuttles and membrane protein complexes or (2) arrangement of the complexes in supercomplexes enabling direct channeling of electron shuttles. In the Gram positive bacterium Corynebacterium glutamicum, the complex III to complex IV electron shuttle cytochrome c is not diffusible but a covalently bound part of the diheme cytochrome subunit QcrC of complex III. Therefore, the complexes III and IV have to form a supercomplex for electron transduction. The aim of this thesis was to purify and characterise this obligatory supercomplex III/IV of C. glutamicum. To gain sufficient biomass of C. glutamicum as starting material for purification, a phosphate buffered minimal medium was developed that enabled yield of total 120 g wet cell mass (38 g dry mass) in 12 L (6×2 L) shaking cultures. The determined conversion factor of glucose into biomass was 0.46 g/g indicating an intact respiratory chain. The yield was increased by bioreactor cultivation to ~690 g wet cell mass (~220 g dry mass) in ~10 L culture volume. A previously described homologous expression system was applied that produces the complex IV subunit CtaD with a fused Strep-tag II to facilitate purification. Affinity purifications using the Strep-tag II affinity to Strep-Tactin resin yielded a mixture of complexes and supercomplexes. Two supercomplex III/IV versions named supercomplex A and B and free complex IV were identified in this mixture by size exclusion chromatography, redox difference spectroscopy and two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis including blue native polyacrylamide electrophoresis. The here presented downscaled blue native polyacrylamide electrophoresis method with analysis times of ~1 h enabled efficient screening of factors influencing the stability of supercomplex III/IV. The screening resulted that the integrity of supercomplex III/IV is preserved by using neutral detergents at minimal detergent to protein ratios for solubilisation and low detergent concentrations for purification and storage slightly above the required critical micellar concentration. Furthermore, pH <=7.5 is required for stability of supercomplex III/IV. Large biomass yields enabled upscaling of supercomplex III/IV affinity purification. Application of the identified stability conditions resulted in affinity purified samples free of supercomplex B. The major component supercomplex A was efficiently separated from residual free complex IV by preparative size exclusion chromatography. Concentration of purified supercomplex A by ultracentrifugation resulted in integrity of the supercomplex for several days at 4 °C. Purified supercomplex A contains ten different previously described subunits. The heme content of supercomplex A relative to the protein mass is heme A: 6.0 μmol/g, heme B: 6.5 μmol/g, and heme C: 5.8 μmol/g determined by redox difference spectroscopy and biochemical protein quantification. This indicates an equimolar ratio of complex III and complex IV in supercomplex A. Supercomplex A has quinol oxidase activity that is inhibited by stigmatellin or sodium azide. The turnover number of transferred electrons per complex III monomer is 148 s−1 at 25° C. The homogeneity and stability of the prepared supercomplex A enabled the growth of threedimensional crystals of up to 0.1 mm in length. Their composition of supercomplex A was verified by redox difference spectroscopy of intact crystals and blue native polyacrylamide electrophoresis of dissolved crystals. The crystals diffracted X-rays corresponding to a resolution of ~10 Å. Electron microscopy of negative stained samples revealed the uniform shape of purified supercomplex A particles with dimensions of 22 × 9 nm in the view plane. Combined heme quantification, size determination, determined activity, symmetry considerations, and particle shape indicate that supercomplex A has a central dimer of complex III and two monomers of complex IV on opposite sides. This conformation is functionally reasonable because it provides each complex III monomer with one complex IV monomer as electron acceptor. Therefore, the stoichiometry of supercomplex A is most likely III2IV2. The sensitivity of supercomplex A to detergents indicated a role of phospholipids in its stability. Therefore, a method for phospholipid identification and quantification was developed that is suitable for detergent solubilised crude and purified membrane protein samples. The analysis combines separation of phospholipid classes according to their head group by normal phase high performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection. Calibration with external standard allows quantification of phospholipid amount in the range of 0.25-12 μg. The method is verified by analysing the phospholipid content of the well characterised complex III of Saccharomyces cerevisiae. The reduction of its phospholipid content during its purification steps is monitored. The complex III sample purified to crystallisation quality contains the phospholipid content that was also observed in previously reported structures determined by X-ray crystallography. Purified stable supercomplex A from C. glutamicum revealed a large content of bound phospholipids. The main differences between intact supercomplex A and a mixture of potentially disintegrated smaller complexes is that intact supercomplex A has a doubled phosphatidic acid content and an increased phosphatidyl glycerol content. The importance of the small anionic phosphatidic acid for mediation of contacts between complexes in a supercomplex is discussed. The total phospholipid content of stable supercomplex A is sufficient for a complete belt surrounding the supercomplex in the membrane plane. This indicates that also all essential internal phospholipid binding positions are occupied and potentially stabilise supercomplex A.
Die vorliegende Arbeit diente der Gewinnung neuer Erkenntnisse über die historische Entwicklung und Typisierung von Fragesätzen. Die Analyse basiert auf Materialien verschiedener indogermanischer Sprachen (Griechisch, Armenisch, Gotisch, Altkirchenslavisch, Altrussisch) sowie einer außerindogermanischen kaukasischen Sprache (Altgeorgisch). Primär wurden Bibeltexte aus dem Alten und Neuen Testament anhand von Faksimileausgaben und elektronischen Textcorpora untersucht. Die Arbeit demonstrierte anhand von über 540 Beispielen, welche Kriterien, graphische oder grammatische Mittel, Fragewortstellung oder Satzgliederfolge, in den überlieferten Texten für die Entschlüsselung von Fragesätzen hilfreich waren. Für jede betrachtete Sprache wurde eine möglichst ausführliche Klassifikation der Hauptfragesatztypen vorgelegt. Ferner gehörte zum Untersuchungsobjekt der Arbeit die in den Fragesätzen implizierte Antworterwartung. Für die weitere Analyse dieser Erscheinung wurden die Fragesätze aufgrund ihrer formalen Kennzeichen für Antworterwartung und Bedeutung eingeteilt. Anhand des übereinzelsprachlichen Vergleiches war es möglich, die spezifischen interrogativen Charakteristika aufzuzeigen, die in den einzelnen Sprachen für die jeweiligen schriftlich fixierten Perioden typisch waren. Wenn relevant, wurden auch Daten aus jüngeren Sprachstufen herangezogen. Die zum Schluss vorgestellte Gegenüberstellung von indogermanischen und kaukasischen Sprachen war erforderlich, um nicht nur genetisch bedingte sprachspezifische Charakteristika von Fragesätzen aufzuzeigen, sondern auch allgemeinsprachliche spezifische Merkmale zu eruieren.
Talentierte Nachwuchsspieler fördern, dieser Aufgabe nehmen sich sowohl Fußballverbände als auch Fußballvereine an. Vereine kommen dieser Aufgabe in ihren Vereinsjugendmannschaften nach; der DFB - als Dachverband des organisierten Fußballs in Deutschland - widmet sich seit 2002 im Rahmen seines Talentförderprogramms verstärkt diesem Aufgabenfeld. Wesentliche Schwerpunkte des DFB-Talentförderprogramms stellen das Erlernen und Festigen von technischen und individualtaktischen Elementen dar. Konzeptionell untermauert werden derartige Fördermaßnahmen durch die Ausbildungskonzeption des DFB. Diese beschäftigt sich neben dem systematischen technisch-taktischen und konditionellen Leistungsaufbau auch mit der Persönlichkeitsförderung talentierter Nachwuchsspieler. Ziel dieser Arbeit ist es, aufbauend auf bisherigen Untersuchungsergebnissen der Unterrichtswissenschaft diesbezügliche Möglichkeiten kooperativer Vermittlungsformen im Fußball-Juniorentraining zu beleuchten. So werden Zusammenhänge bzw. Perspektiven diskutiert und Effekte kooperativer Trainingsformen veranschaulicht. Im Rahmen der theoretischen Auseinandersetzung wird deutlich, dass die Fußballtechnik mit ihren charakteristischen Merkmalen auf der Schnittstelle zwischen rein fertigkeitsbezogenen und typisch taktischen Anforderungen liegt: Technik und Taktik verschmelzen demnach in der Spielsituation. Ein Techniktraining mit einer Zentrierung auf Bewegungsabläufe wird dieser Komplexität nicht gerecht. Entscheidend für die erfolgreiche Bewältigung einer Spielsituation sind neben verlaufsbezogenen Bewegungsmerkmalen auch Wahrnehmungs- und Entscheidungskomponenten sowie die Bewältigung von Druckkomponenten. In diesem Zusammenhang erscheint es lohnend, Fähigkeiten aufzubauen, die eine erfolgreiche Lösung des übergeordneten Problems – die Einsicht in Sinnzusammenhänge – ermöglichen (vgl. SINNING 2003; RIEPE 2000; SCHERER 1995). Die Einsicht in die Struktur (Zusammengehörigkeit) von Informationen, die vorher so nicht vorhanden war, stellt somit - neben der Förderung der Eigeninitiative und der Verantwortung für das eigene Lernen - die Intention kooperativer Trainingsformen im Fußball-Juniorentraining dar. Hierbei erscheinen insbesondere die Entwicklung eigener Ideen und Lösungen im Training und die daraus resultierende erfolgreiche Handlungsfähigkeit in Spielsituationen von Bedeutung. So werden im empirischen Arbeitsteil Auswirkungen kooperativer Trainingsformen auf das „Entscheidungsverhalten“ talentierter Nachwuchsspieler bzw. das „Effektverhalten individualtaktischer Aktionen“ analysiert. Gleichermaßen werden Effekte kooperativer Trainingsformen im Bereich der „Teamkompetenz“ überprüft. Es bleibt festzuhalten, dass es bei den kooperativ Trainierenden im Entscheidungsverhalten zu einer nachhaltigen (Intervall AT - RT) signifikanten Verbesserung kommt - bei traditionell trainierten Probanden ist ein diesbezüglicher Fortschritt im Rahmen dieser Untersuchung nicht zu beobachten. Gleichermaßen signifikant verbessert sich die Teamkompetenz (Solidaritätsfähigkeit) der kooperativ trainierenden Probanden unmittelbar im Anschluss an den Trainingszeitraum (Intervall ET - AT). Im Intervall zum RT tritt zudem keine signifikante Verschlechterung in der späten Phase des Lernprozesses auf. Diese Untersuchungsergebnisse stehen im Einklang mit bisherigen unterrichts- bzw. sportwissenschaftlichen Befunden (GRÖBEN und KRAUSS 2004; BÄHR et al. 2007) und unterstützen den im Theorieteil dieser Arbeit entwickelten Ansatz einer Implementierung kooperativer Trainingsformen in das Fußball-Juniorentraining. Hingegen erfährt das Effektverhalten individualtaktischer Aktionen - sprich die erfolgreiche Umsetzung eines Passes, Dribblings oder Torschusses - durch ein traditionelles Training unmittelbar (Intervall ET - AT) eine signifikante Verbesserung. Kooperative Trainingsformen erzielen in diesem Zusammenhang keinen vergleichbaren Effekt. Darüber hinaus lassen sich im Rahmen dieser Untersuchung - aufgrund des vorliegenden Stichprobeneffektes - keine validen Aussagen hinsichtlich der intergruppenspezifischen Entwicklung der Variablen „Entscheidungsverhalten“ und „Effektverhalten individualtaktischer Aktionen“ treffen. An dieser Stelle sei nochmals angemerkt, dass der vorliegende Stichprobeneffekt trotz eines umfassenden Parallelisierungsverfahrens (vgl. 3.4.1) zum Tragen kommt. Daher erscheint es bei weiterführenden Untersuchungen sinnvoll, sich im Rahmen des Parallelisierungsverfahren verstärkt mit der Qualität von Beobachtungs-/ Einteilungskriterien zu beschäftigen bzw. die Beobachtungen der Experten hinsichtlich ihrer Validität zu prüfen. Abschließend betrachtet, sollte es in Anbetracht der Ziele und Schwerpunkte, die im Rahmen der Talentförderung im Juniorenfußball eine Rolle spielen (vgl. DFB-Ausbildungskonzeption), weiterhin ein wissenschaftliches Anliegen sein, aufbauend auf den vorliegenden Befunden und Erhebungsinstrumenten (Bewertungsbogen zum Entscheidungsverhalten und Effektverhalten individualtaktischer Aktionen), Möglichkeiten kooperativer Trainingsformen im Fußball-Juniorentraining zu analysieren. Eine verstärkte Differenzierung zwischen „lernen“, „üben“ und „trainieren“, sollte in diesem Zusammenhang bei zukünftigen Forschungsarbeiten Berücksichtigung finden. Theoretische Begründungszusammenhänge sowie erste positive empirische Ergebnisse kooperativer Trainingsformen konnten mit Hilfe dieser Arbeit aufgezeigt werden.
Twentieth-century scholars have thought little about the attractions of Descartes’ thinking. Especially in feminist theory, he has a bad press as the ‘instigator’ of the body-mind-split – seen as one of the theoretical bases for the subordination of women in Western culture. Seen from within seventeenth-century discourse it is the dictum that can be inferred from his writings that ‘the mind has no sex’ and which can be seen as an appeal to think about rational capacities in the utopian perspective of a gender neutral discourse. My work analyses this “face” of Cartesianism as it was adapted in favour of English seventeenth-century women. How were the specific tenets of Descartes’ philosophy employed on behalf of English women in the second half of the seventeenth century in England? My focus is on Descartes as a thinker, who – whatever his real or imagined intention might have been – provided women in seventeenth-century England with tools with which to change their status, in other words: with instruments of empowerment. So why were Descartes’ arguments so attractive for women? Descartes had argued for equal rational abilities among individuals in a gender neutral way. He had further critiqued generally accepted truth with his universal doubt. I believe this specific combination of ideas, affirming their rational capabilities, was seen by a number of women as an invitation to become involved in spheres of activity from which they were previously excluded. Moreover, a specific set of Descartes’ arguments provided a number of English women with a strategy to extend female agency. Not only did Descartes’ views legitimate female rationality, they also allowed an acknowledgement that this female intellect was equally connected to “truth” as that of their male contemporaries. As a consequence, women developed an increased self-esteem and inspiration to pursue their own independent study (and in some cases publishing). These ideas eventually helped to bring forward a demand for female education, as girls and women were still excluded from formal education in seventeenth-century England. My general thesis is that Cartesianism, as one of the earliest universalist theories on the nature of human reason, introduced new possibilities into the English debate over the nature and, hence, social position of women. It brought a radical twist to the already existing discussion on women by offering new critical tools which were taken up to argue on behalf of English women. In my work I examine the specific historical conditions of the reception of Descartes’ thought in England, the philosophical appeal of his ideas for women and analyse the writings of two English ‘disciples’ of Descartes: Margaret Cavendish, Duchess of Newcastle and Mary Astell.
Die Festlegung von Prognose und Therapie hormonabhängiger Tumore wie dem Mammakarzinom, erfolgt heutzutage vor allem über die Bestimmung des Hormonrezeptorstatus. Dieser biologische Zusammenhang hat zu einem wachsenden Interesse an Östrogen-regulierten Proteinen geführt, welche eine über die des Hormonrezeptorstatus hinausgehende prognostische Aussagekraft liefern könnten. Da bekannt ist, dass die Aktivität der endothelialen NO-Synthase (eNOS) durch Östrogen beeinflusst wird, hatte die vorliegende Arbeit den Einfluss von eNOS auf die Prognose von Mammakarzinomen zur Zielsetzung. Die drei Fragestellungen hierfür waren die Lokalisierung der eNOS-Expression, die Korrelation von eNOS mit den klinisch wichtigen Prognosefaktoren (besonderes Interesse galt den hormonellen Parametern), sowie der Einfluss von eNOS auf das Überleben der Patientinnen. Es wurden Gewebeproben von 163 Patientinnen untersucht, der eNOS-Status der in Paraffin eingebetteten Mammakarzinome wurde immunhistochemisch mittels APAAP-Methode bestimmt. Zu allen Fällen lagen die etablierten Prognosefaktoren (Tumorgröße, Lymphknotenstatus, Grading, Hormonrezeptorstatus, Alter) sowie die Verlaufsbeobachtungen vor. Soweit aus den verfügbaren Daten hervorgeht, ist dies der größte Stichprobenumfang an Patientinnen, bei dem die eNOS-Expression in primären Mammakarzinomen nachgewiesen wurde. Die Expression von eNOS konnte in den Tumorzellen der Mammakarzinome lokalisiert werden. Es bestanden signifikante Zusammenhänge zwischen der eNOS-Expression und dem Hormonrezeptor-/ Menopausenstatus, sowie der Zyklushälfte zum Operationszeitpunkt. Es konnte keine signifikante Korrelation zwischen der eNOS-Expression und dem Grading, TNM-Status oder Alter der Patientinnen nachgewiesen werden. Gleichermaßen konnten wir keinen signifikanten Unterschied im Überleben feststellen, dennoch zeigte sich ein kürzeres Gesamtüberleben bei Patientinnen mit eNOS-positiven Tumoren. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass invasive Mammakarzinomzellen eNOS exprimieren und dass ein erhöhter Östrogenspiegel im Blut mit einer erhöhten eNOS-Expression einhergeht. Obwohl eNOS als unabhängiger Prognosefaktor ungeeignet ist, so gibt das Vorhandensein des Enzyms Hinweis auf eine ungünstigere Prognose. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass eNOS hormonell geregelt wird, dass dieser Zusammenhang im Allgemeinen eine Rolle bei der Entwicklung von Brustkrebs spielt und im Speziellen dass eNOS ein tumorfördernder Parameter sein könnte. Weitere Untersuchungen werden notwendig sein, um die tatsächliche Rolle von eNOS in der Tumorbiologie zu klären.
In der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, OTS-, MPTMS-, und MPTMS/OTS gemischte SAMs aus der Lösung auf SC-1 chemisch oxidierten Siliziumwafern („SiO2“) zu präparieren. Die Adsorption der OTS oder MPTMS SAMs auf SiO2 wird von zwei konkurrierenden Reaktionen bestimmt, d.h. „Selbstaggregation” in der Ausgangslösung und “Oberflächendehydration” des SiO2 -Substrates. Die beiden Alkylsiloxan-SAMs weisen unterschiedliches Bildungsverhalten auf. Die Reifungsdauer der Ausgangslösung vor der Adsorption wirkt sich signifikant auf die Bildung der OTS SAMs aus, demgegenüber ist bei MPTMS SAMs kein Einfluß zu beobachten. Für OTS SAMs sind große Dendriten oftmals von kleinen Rundinseln umgeben, dagegen für MPTMS SAMs treten prinzipiell nur sporadisch verteilte kleine Rundinseln auf. Die Abwesenheit des Chlor-Signals in XPS-Spektren bestätigt, dass innerhalb der Adsorption die Si-Cl Bindungen der OTS-Moleküle zum größten Teil hydrolysiert werden. Doch für MPTMS SAMs ist in C 1s-Spektren ein Peak bei 286.4 eV, der der unhydrolysierten Si-OCH3 Bindung entspricht, zu beobachten. Die Hydrolysefähigkeit der Si-Cl Bindung des OTS ist erwartungsgemäß stärker als jene der Si-OCH3 Bindung des MPTMS. Diese Tendenz samt dem Unterschied in der Alkylkettenlänge wirkt sich beträchtlich auf die Bildung und die Morphologie der adsorbierten Inseln aus. Bei gleicher Konzentration (5 mM) und Reifungsdauer der Ausgangslösung bilden sich OTS SAMs viel schneller als MPTMS SAMs bei Raumtemperatur. Sie hat auch eine größere Oberflächenbedeckung wegen der seitlichen Vernetzung zur Folge. Diese Beobachtung zeigt eine prognostizierbare kinetische Schwierigkeit zur Präparation der OTS/MPTMS gemischten SAMs durch Koadsorption. Grund hierfür ist, dass die Adsorption voraussichtlich von OTS-Molekülen dominiert wird. Darüber hinaus ist Aggregation zwischen hydrolysierten OTS- und MPTMS-Molekülen nicht ausgeschlossen. Neben der Koadsorption steht in der zweistufigen Adsorption ein weiteres herkömmliches Verfahren zur Verfügung. Das Endprodukt kann nach der Reaktionsreihe der Silane mit „OTS+MPTMS“ oder „MPTMS+OTS“ gemischte SAMs bezeichnet werden. Unter Berücksichtigung der individuellen Oberflächenbedeckung und Morphologie wurde eine Rezeptur aufgestellt, in der die Adsorption jeweils höchstens 30s (für OTS) und 20 min (für MPTMS) dauert. Angesichts der vielfältigen Inselstruktur, d.h. Monoschicht, polymerisierte Bälle, und sogar Multischicht, ist eine Phasenunterscheidung nach der Dicke, z.B. mittels AFM, nicht zu erwarten. Die Existenz der lateralen unvernetzten Si-OH Gruppen der adsorbierten OTS-Inseln könnte die Präparation der homogenen OTS+MPTMS gemischten SAMs erschweren. In diesem Fall ist es fraglich, ob die hydrolysierten MPTMS-Moleküle vollständig wie geplant mit oberflächnahen OH-Gruppen von SiO2 reagieren. Mit einer umgekehrten Reaktionsreihe löst sich das Problem von selbst, da die adsorbierten MPTMS-Inseln hauptsächlich unhydrolysierte seitliche Si-OCH3 Gruppen besitzen. Die morphologische Erkennbarkeit unterstützt die Machbarkeit der Präparation der MPTMS+OTS gemischten SAMs. Die unterschiedlichen Messmodi des AFM, mit denen die Morphologie der OTS SAMs aufgenommen wurde, ergaben deutliche Unterschiede in ihrem Erscheinungsbild. Im Vergleich zum Tappingmodus sind die Grenzen der OTS-Inseln auf Kontaktmodus-Bildern nur undeutlich erkennbar. Die großen Inseln erscheinen nicht so dendritisch. Die Ursache dieser Phänomene könnte am Wassermeniskus zwischen Spitze und Probe liegen, da die Messung nicht in Flüssigkeit, sondern an Luft durchgeführt wurde. Auf LFM-Bildern sind die adsorbierten OTS-Inseln heller als unbedecktes SiO2, während die MPTMS-Inseln dunkler als SiO2 aussehen. Eine ähnliche Auswirkung der Messmodi auf die Morphologie der MPTMS SAMs wurde nicht beobachtet. Durch die Adsorption von 1-Decanthiol lässt sich die Si3N4-AFM-Spitze modifizieren. Eine solche CH3-terminierte Spitze ist hydrophob und verursacht einen gegenteiligen Helligkeitskontrast auf LFM-Bildern der adsorbierten OTS-Inseln.
Cytochrome c oxidase (CcO), also called Complex IV of the aerobic respiratory chain, is located in the plasma membrane of prokaryotes and in the inner mitochondrial membrane of eukaryotes. The redox energy of dioxygen reduction is used to translocate protons across the membrane resulting in an electrochemical proton gradient. The generated proton gradient is exploited by the adenosine-5’-triphosphate synthase. In this work, bacterial four-subunit aa3-Type CcO from Paracoccus denitrificans (ATCC 13543, 4 SU-wt ATCC CcO) was used for analyses. 1) The recombinant homologously produced 4 SU-wt CcO (4 SU-wt rec CcO) was functionally compared with the native 4 SU-wt ATCC CcO. The 4 SU-wt rec CcO showed functional deficiencies as determined by UV-vis spectroscopy and electron paramagnetic resonance (EPR) studies. Total X-ray Reflection Fluorescence measurements show in both wild type CcOs the same ratio of the redoxactive Fe and Cu (2 Fe : 3 Cu) indicating full complement of the functional metals. If CcO contains only subunit I and II, it loses its functional integrity during continuous turnover activity. The importance of subunit III for integrity of CcO was demonstrated using 2 SU-wt rec CcO. Crystallisation trials of suicide inactivated 2 SU-wt rec CcOs have been ineffective using standard crystallisation conditions. Crystals of active 2 SU-wt rec CcO (positive control) have been obtained under these conditions and this result indicates possible structural changes in suicide inactivated 2 SU-wt rec CcO. The structure of active 2 SU-wt rec CcO was determined to 2.25 Å resolution. 2) Terminal oxidases require four electrons for the cleavage of the dioxygen bond (O=O). In general, the catalytic cycle of CcO is described by the electron input and thus by the different redox states of the metal centres: the O, E, R, P and F state. The two-electron reduced R intermediate is able to donate four electrons for dioxygen reduction forming the P state. The P intermediate is an oxoferryl state implying the lack of an electron for the R -> P transition, because the metal centres can only provide three electrons (Fe+II forms Fe+IV and Cu+II forms Cu+I). The P state, where the dioxygen bond is already broken, shows an oxoferryl state (FeIV=O2-) and a nearby tyrosine is proposed to form a tyrosyl radical representing the donor of the missing electron. H2O2-induced artificial intermediates provide the opportunity to investigated different catalytic intermediates in detail. Mixing equimolar amounts of H2O2 to CcO in the O state induces the "two-electron" reduced PH state at high pH and the electronically equal "two-electron" reduced F• H state at low pH. The addition of an excess amount of H2O2 leads to the three-electron reduced FH state. Functional studies using the 4 SU-wt ATCC CcO have demonstrated a bound peroxide (O- - O-) intermediate during the catalytic cycle. Using EPR it was previously shown that Y167 hosts a radical species in PH/F• H state which suggests that Y167 could provide this "missing electron". While X-ray structural models of CcO and Fourier-transformed infrared (FTIR) measurements of oxygenated ("pulsed") 4 SU-wt ATCC CcO suggest a bound peroxide in the O state, UV-vis and EPR spectroscopic studies indicate that other intermediates may also contain such peroxide species. Equimolar and excess amounts of H2O2 induce the PH/F• H and FH states, respectively and catalase treatment of the FH state leads, contrary to the natural direction of the catalytic cycle, to the apparent transition of the FH -> PH/F• H states, which is accompanied by reappearance of an EPR signal from the Y167• radical. The novel PFH/F• FH states are presented here and we postulate that the FH state hosts a superoxide (or peroxide) adduct at CuB in the binuclear site. In addition, the novel P10 state is also introduced having a maximum at lambda = 612 nm in the difference absorption spectrum (minus the O state). The P10 state is induced by mixing CcO in the O state with a pH 10 buffer. This pH 10 induced state resembles standard P states such as PCO, PH and PR. However, the P10 state evolves out of the O state without addition of reduction equivalents. Using EPR spectroscopy it was shown that Y167 hosts a radical species in the P10 state such as in the PH state. In summary, all functional data presented here provide evidence for a peroxide bound during the O state. Finally, a new model for the natural catalytic cycle is proposed. If the O state contains a peroxide, it is also likely that the E and R state contain this species. Even the oxoferryl intermediates P and F states may complex a peroxide at CuB in the binuclear site. 3) The amino acid residue Y167, which hosts the radical in the PH/F•H states, is not directly part of the binuclear site of CcO. For identification of the primary electron donor, two tryptophan variants of CcO, W272F and W164F, which are located nearby the binuclear site, were produced. Evidence is provided that W272 is a kinetically fast electron donor for the O2 molecule. The electron is replenished by Y167, or probably by Y280 in the natural cycle. The Y167 radical is detectable by EPR spectroscopy after treatment with equimolar amounts of H2O2 in the active variant W164F, but is absent in the inactive variant W272F. 4) CcO contains two proton conducting pathways, the D- and the K-pathway. Proteoliposomes of the variants H28A and D30N, mutations located at the entrance of the D-pathway, both show the identical proton pumping activity as the 4 SU-wt rec CcO (pumped H+/e- = 1). The variant N113D shows abolished proton pumping (pumped H+/e- = 0), but a relative high cytochrome c oxidation activity (63 %). G196D displays no cytochrome c oxidation and proton pumping activity. Overall, the addition or removal of a negative charge within the D-pathway such as in D124N, N131D, N113D and G196D leads to a decoupled phenotype indicating the high degree of electrostatic coupling in CcO.
This work presents a contribution to the literature on methods in search of lowdimensional models that yield insight into the equilibrium and kinetic behavior of peptides and small proteins. A deep understanding of various methods for projecting the sampled configurations of molecular dynamics simulations to obtain a low-dimensional free energy landscape is acquired. Furthermore low-dimensional dynamic models for the conformational dynamics of biomolecules in reduced dimensionality are presented. As exemplary systems, mainly short alanine chains are studied. Due to their size they allow for performing long simulations. They are simple, yet nontrivial systems, as due to their flexibility they are rapidly interconverting conformers. Understanding these polypeptide chains in great detail is of considerable interest for getting insight in the process of protein folding. For example, K. Dill et al. conclude in their review [28] about the protein folding problem that "the once intractable Levinthal puzzle now seems to have a very simple answer: a protein can fold quickly and solve its large global optimization puzzle simply through piecewise solutions of smaller component puzzles".
1.) Die A1AO-ATP-Synthase wurde aus Membranen von P. furiosus unter Erhalt der Struktur isoliert. Das Enzym wurde durch PEG-Fällung, Dichtegradientenzentrifugation, Anionenaustausch-Chromatographie und Gelfiltration zur Homogenität gereinigt. 2.) Die neun aus dem Gencluster vorhergesagten Untereinheiten konnten durch Maldi-TOF-Analysen oder MS/MS identifiziert werden. Die molekulare Masse der A1AO-ATP-Synthase wurde durch LILBID-Analysen zu 730+/-10 kDa bestimmt. 3.) Die funktionelle Kopplung der A1- und AO-Domäne wurde durch Studien mit dem Inhibitor DCCD und TBT nachgewiesen. Weitere ATP-Synthase spezifische Inhibitoren wie DES, Dienestrol und Hexestrol waren in der Lage, das Enzym zu inhibieren. Die I50-Werte betrugen für DES 0,36 mM, für Dienestrol 0,52 mM und für Hexestrol 0,59 mM. 4.) Die ATPase-Aktivität war bei 100°C und pH 6 optimal. Das Enzym hydrolysierte Mg-ATP als bevorzugtes Substrat mit einer maximalen Geschwindigkeit von 1,7 U/mg und einem KM von 0,63 mM. 5.) Die ATPase-Aktivität war Na+-abhängig. Der KM-Wert betrug 0,6 mM. Li+ konnte Na+ substituieren, K+ war dazu nicht in der Lage. Die Wirkung des Inhibitors DCCD (I50 100 μM) konnte durch Zugabe von 5 mM NaCl bis zu einer Konzentration von 0,25 mM aufgehoben werden. Dies war der erste Nachweis einer Na+-abhängigen A1AO-ATP-Synthase. 6.) Das für die c-Untereinheit kodierende Gen wurde aus chromosomaler DNA amplifiziert und sequenziert. Die Genverdopplung konnte bestätigt werden, ebenso die Vorhersage nur einer Ionenbindestelle (Helix 4). Durch LILBIDAnalysen wurde eine Verdopplung der c-Untereinheit aufgrund der molekularen Masse (15,8 kDa) im gereinigten Komplex nachgewiesen. 7.) Die Bildrekonstruktion aus 7400 Einzelbildern zeigte einen Komplex aus zwei Domänen, die durch einen zentralen und zwei periphere Stiele miteinander verbunden sind. Ausgehend von den Summenbildern wurde erstmals eine D-Rekonstruktonsmappe einer A1AO-ATP-Synthase generiert, mit einer Auflösung von 23 Å. In diese 3D-Rekonstruktionsmappe wurden Untereinheiten gelöster Struktur modelliert. Mit Hilfe dieser Daten konnte die voraussichtliche Stöchiometrie der A1AO-ATP-Synthase von P. furiosus zu A3B3CDFE2H2ac10 bestimmt werden. 8.) Durch LILBID-Analysen mit erhöhter Laserintensität wurde ein Subkomplex mit einer molekularen Masse von 233-236 kDa detektiert. Biochemische Daten weisen auf einen Komplex aus einer Kopie der Untereinheit a und 10 Kopien der Untereinheit c hin. Zusammen mit der 3D-Rekonstruktion wurden unabhängige Evidenzien für einen c-Ring bestehend aus 10 Kopien des Monomers mit je 4 transmembranenen Helices und nur einer Ionenbindestelle erhalten. Dies würde eine Na+/ATP-Stöchiometrie von 3,3 ergeben und erklären, warum die A1AO-ATP-Synthase von P. furiosus trotz der V-Typ artigen c-Untereinheit ATP synthetisiert. 9.) Mit dem gereinigten Enyzm wurde eine 3D-Kristallisation durchgeführt. Die resultierenden Kristalle hatten tetraedrische Gestalt, waren 10 x 5 nm groß und wuchsen über einen Zeitraum von 30 Tagen. Die Kristalle beugten Röntgenstrahlen bis zu einer Auflösung von 15 Å. 10.) Zum Nachweis einer möglichen Na+-Abhängigkeit der ATP-Synthase von M. jannaschii wurde ein Na+-armer Puffer mit Sulfit hergestellt, da bereits eine Sulfitabhängigkeit der ATPase-Aktivität nachgewiesen wurde. Es konnte für die A1AO-ATP-Synthase keine Na+-Abhängigkeit der ATPase- Aktivität zwischen 0,07-400 mM nachgewiesen werden. 11.) Ein Subkomplex konnte durch mehrmaliges Auftauen und Einfrieren der A1AO-ATP-Synthase-haltigen Proteinlösung erhalten werden. Der Komplex enthielt die Untereinheiten ABFDacx. Die Untereinheiten C, E und H fehlten dem Komplex, was zu einem Zerfall in hydrophile und hydrophobe Domäne während der Präparation führte. Es konnten in der elektronenmikroskopischen Untersuchung nur Kopfteile detektiert werden. 12.) Die heterolog produzierte A1AO-ATP-Synthase aus M. mazei Gö1 wurde durch das Detergenz Dodecylmaltosid am besten aus der Cytoplasmamembran von E. coli solubilisiert. 13.) TBT ist ein potenter Inhibitor der heterolog produzierten A1AO-ATP-Synthase (I50=60 μM). Der Wirkort konnte durch Vergleichsmessung mit der heterolog produzierten A1-Domäne identifiziert werden. TBT interagiert mit der AODomäne archäeller ATP-Synthasen und ist daher geeignet, die Kopplung der heterolog produzierten A1AO-ATP-Synthase nachzuweisen.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Gruppen von quasi-Automorphismen von Graphen, genauer gesagt, von gefärbten Graphen. Ein gefärbter Graph ist ein Graph, dessen Kantenmenge in eine disjunkte Vereinigung von Mengen von Kanten einer bestimmten Farbe zerlegt ist. Ein Automorphismus eines solchen Graphen muss insbesondere die Farben der Kanten respektieren. Ein quasi-Automorphismus eines solchen Graphen ist eine Bijektion der Eckenmenge auf sich selbst, die nur endlich oft die Autmomorphismeneigenschaft verletzt, d.h. nur endlich viele Kanten nicht respektiert und nur endlich viele Kanten neu entstehen läßt. Die Menge der quasi-Automorphismen eines Graphen bildet eine Untergruppe in der Gruppe der Permutationen der Eckenmenge. Eine Auswahl interessanter Beispiele solcher Gruppen und manche ihrer Eigenschaften sind neben einigen grundsätzlichen Überlegungen Thema dieser Arbeit. Die erste Klasse von Graphen, die wir untersuchen, sind Cayley-Graphen (endlich erzeugter) Gruppen. Dabei werden wir zeigen, dass die quasi-Automorphismengruppe eines Cayley-Graphen nicht von dem (endlichen) Erzeugendensystem abhängt. Wir werden zeigen, dass für eine einendige Gruppe $G$ die quasi-Automorphismengruppe des Cayley-Graphen stets als semidirektes Produkt der finitären Permutationen von $G$ und der Gruppe $G$ selbst zerfällt. In der Klasse der mehrendigen Gruppen gibt es genau $2$ Gruppen für die das ebenfalls gilt, nämlich die Gruppe der ganzen Zahlen ...Z und die unendliche Diedergruppe $D_infty$. In allen anderen Gruppen ist das oben erwähnte semidirekte Produkt stets eine echte Untergruppe. Trotzdem werden wir im Ausblick eine Konstruktion angeben, die für eine gegebene Gruppe $G$ einen Graphen $Gamma$ liefert, dessen quasi-Automorphismengruppe als semidirektes Produkt von $S_Gamma$ -- so bezeichnen wir die Gruppe der finitären Permutationen der Ecken von $Gamma$ -- und $G$ zerfällt. Des Weiteren werden wir die quasi-Automorphismengruppe des ebenen binären Wurzelbaumes betrachten. Wir werden zeigen, dass diese eine Erweiterung von (Richard) Thompsons Gruppe VV durch die Gruppe der finitären Permutationen ist, eine Präsentierung entwickeln und die Endlichkeitseigenschaften dieser Gruppe und einiger Untergruppen beleuchten. Insbesondere werden wir einen Zellkomplex konstruieren, auf dem die Gruppe der quasi-ordnungserhaltenden quasi-Automorphismen, welche das Urbild der Untergruppe FF von VV unter der kanonischen Projektion ist, mit endlichen Stabilisatoren operiert. Diese Operation erfüllt dabei die Bedingungen, die nötig sind, um mit Hilfe von Browns Kriterium nachzuweisen, dass die Gruppe vom Typ FPunendlich ist. Das co-Wort-Problem einer Gruppe $G$ bezüglich eines unter Inversion abgeschlossenen Erzeugendensystems $X$ ist die Sprache aller Worte aus dem freien Monoid $X^*$, die unter der kanonischen Projektion auf ein Element ungleich der Identität in $G$ abgebildet werden. Wir werden zeigen, dass das co-Wort-Problem der quasi-Automorphismengruppe des ebenen binären Wurzelbaumes eine kontext-freie Sprache bildet. Sei $mathop{coCF}$ die Klasse der Gruppen mit kontextfreiem co-Wort-Problem. Diese Klasse ist abgeschlossen bezüglich Untergruppenbildung und alle Gruppen, deren Zugehörigkeit zu $mathop{coCF}$ bisher nachgewiesen wurde, sind Unterguppen der quasi-Automorphismengruppe des ebenen binären Wurzelbaumes. Die $n$-strahligen Houghton-Gruppen erweisen sich als quasi-Automorphismengruppen von Sterngraphen, d.h. von Graphen, die disjunkte Vereinigungen von $n$ Strahlen verschiedener Farben sind. Wir werden uns mit geometrischen Phänomenen der Cayley-Graphen dieser Gruppen beschäftigen. Insbesondere werden wir nachweisen, dass die $2$-strahlige Houghton-Gruppe Houn[2] beliebig tiefe Sackgassen besitzt. Eine Sackgasse der Tiefe $k$ in einem Cayley-Graphen ist ein Element, dessen Abstand zur Identität mindestens so groß ist, wie der Abstand zur Identität aller Elemente im $k$-Ball um das Element. Sogar in einem stärkeren Sinne, der in dieser Arbeit definiert wird, ist die Tiefe der Sackgassen unbeschränkt. Um dies und verwandte Fragen besser behandlen zu können, entwickeln wir Modelle, die eine Beschreibung der Cayley-Graphen von Houn[n] ermöglichen. Im abschließenden Ausblick thematisieren wir einige Ansätze, in denen wir interessante Anwendungen von quasi-Automorphismengruppen sehen.
Hypoxic pulmonary vasoconstriction (HPV) redistributes pulmonary blood flow from areas of low oxygen partial pressure to areas of normal or relativity high oxygen availability, thus optimising the matching of perfusion to ventilation and preventing arterial hypoxemia. Generalised alveolar hypoxia results in a sustained increase in pulmonary artery pressure which in turn leads to structural changes in the walls of the pulmonary vasculature (pulmonary vascular remodelling). Recent findings have indicated a role for cytochrome P450 (CYP) epoxygenase-derived epoxyeicosatrienoic acids (EETs) in hypoxia-induced pulmonary vasoconstriction. Given that the intracellular concentration of EETs is determined by the soluble epoxide hydrolase (sEH), which metabolises EETs to their less active dihydroxyeicosatrienoic acids (DHETs), we assessed the influence of the sEH and EETs on pulmonary artery pressure, acute and chronic HPV, and pulmonary vascular remodelling in the mouse lung. In isolated lungs from wild-type mice, acute HPV was significantly increased by sEH inhibition, an effect abolished by pre-treatment with CYP epoxygenase inhibitors and the EET antagonist 14,15-EEZE. The acute hypoxia-induced vasoconstriction and EET production were greater in lungs from sEH-/- mice than from wild-type mice and sEH inhibition had no further effect on HPV in lungs from the former animals, while MSPPOH (CYP epoxygenase inhibitor) and 14,15-EEZE decreased the response. Exogenous application of 11,12-EET increased pulmonary artery pressure in a concentration-dependent manner and enhanced acute HPV in wild-type lungs, while 14,15-EET and 11,12-DHET were without significant effect on pulmonary artery pressure. 5-HT2A receptor antagonism or Rho kinase inhibition shifted the EET concentration-response curve to the right and abrogated the EET- and sEH inhibition-induced potentiation of acute hypoxic vasoconstriction. In lungs from wild-type and sEH-/- mice, hypoxic preconditioning (hypoxic ventilation for 10 minutes) enhanced the 5-HT response. 1-Adamantyl-3-cyclohexylurea (ACU), a sEH inhibitor, further amplified the hypoxia-induced 5-HT-hypersensitivity in wild-type mice. However, after hypoxic preconditioning, the sEH-/- lungs displayed a striking leftward shift in the 5-HT response. 11,12-EET can activate TRPC6 channels in endothelial cells by eliciting its translocation to the plasma membrane, more specifically to membrane domains enriched with the caveolae marker caveolin-1. This effect was also observed in rat pulmonary artery smooth muscle cells overexpressing the channel. Exposure of the latter cells to acute hypoxia also stimulated the intracellular translocation of TRPC6 to caveolae, an effect that was sensitive to the EET antagonist. The EET-induced translocation of TRPC6 channels was prevented by a 5-HT2A receptor antagonist but not by a Rho kinase inhibitor. Moreover, while acute hypoxia and 11,12-EET increased pulmonary pressure in lungs from TRPC6+/- mice, lungs from TRPC6-/- mice did not respond to either stimuli. These results indicate that the sEH and CYP-derived EETs are involved in acute HPV and that EET-induced pulmonary contraction under normoxic and hypoxic conditions involves a TRPC6 channel, a 5-HT2A receptor-dependent pathway and Rho kinase activation. In the second part of the study the role of the sEH in the development of pulmonary hypertension and vascular remodelling induced in mice by exposure to hypoxia (10% O2) for 21 days was analysed. In wild-type mice, chronic hypoxia decreased the pulmonary expression/activity of the sEH, induced right heart hypertrophy and erythropoiesis, and increased the number of partially and fully muscularised pulmonary resistance arteries (by 3-fold). Moreover, in HEK 293 cells, hypoxia (1% O2 up to 24 h) decreased sEH promoter activity by 50%. In isolated lungs, pre-exposure to chronic hypoxia significantly increased baseline perfusion pressures and potentiated the acute HPV. While an sEH inhibitor, ACU, potentiated acute HPV in lungs from mice maintained in normoxic conditions, it had no effect on HPV in lungs from mice exposed to hypoxia. The EET antagonist, 14,15-EEZE, abolished the sEH inhibitor-dependent increase in acute HPV in normoxic lungs and decreased HPV in chronic hypoxic lungs. Hypoxia-induced right heart hypertrophy and erythropoiesis were more pronounced in sEH-/- than in wild-type mice. Under normoxic and hypoxic conditions the muscularisation of resistance pulmonary arteries was greater in lungs from sEH-/- mice than in lungs from wild-type mice. sEH-/- mice also displayed an enhanced acute HPV, compared to that observed in wild-type mice and chronic exposure to hypoxia did not further potentiate acute HPV. However, in the presence of 14,15-EEZE responses returned to levels observed in normoxic lungs from wild-type animals. Furthermore, immunohistochemistry demonstrated an extensive expression of the sEH in the medial wall of pulmonary arteries from human donor lungs. Whereas sEH expression was not detectable in samples from pulmonary hypertension patients, indicating that the sEH is involved in hypoxia-induced pulmonary vascular remodelling and hypoxic pulmonary vasoconstriction. Taken together, the results presented in this thesis indicate that the expression/activity of the sEH is an important determinant of the magnitude of acute and chronic hypoxia-induced pulmonary vasoconstriction and pulmonary vascular remodelling by inactivating vasoconstrictor CYP-derived EETs. As sEH inhibitors are currently being developed for the treatment of human systemic hypertension, it should be noted that these compounds may even promote the development of pulmonary hypertension.
Zusammenfassung der Diskussion Die Ergebnisse der vorliegenden prospektiven Studie präsentierten die Daten zweier relativ homogener Populationen. Trotz der geringen Fallzahl in beiden Gruppen (Gruppe A mit 28, Gruppe B mit 33 Patienten) konnte durch die Methodik eine Evidenzgraduierung Typ IIa erreicht werden. Gemäß unserem Behandlungsalgorithmus und den Empfehlungen einiger Autoren sollte bei unterschiedlichen Verletzungsmustern mit Einschluß relevanter Begleitverletzungen eine differenzierte Versorgung der distalen Radiusfraktur durchgeführt werden. Speziell die hochenergetischen Traumen mit wesentlichen Begleitverletzungen profitieren nach den Erkenntnissen der vorliegenden Studie und den aktuellen Veröffentlichungen von einem zweizeitigen Vorgehen mit primärer Anlage eines Fixateurs externe. Eine in zweiter Sitzung begleitende Arthroskopie gestattet anschließend eine zeitnahe und suffiziente Behandlung der relevanten Begleitverletzungen. Für die Stabilisierung hat sich in dieser Studie wie auch in der Literatur das Verfahren nach dem Drei-Säulen-Prinzip von Rikli etabliert mit einer dem Verletzungsmuster entsprechenden Versorgung durch eine palmare, dorsale oder kombinierte Plattenosteosynthese. Die osteoporotisch assoziierten Typ A3- oder Typ C1-Frakturen ohne Begleitverletzung benötigen in der Regel nur ein einzeitiges Vorgehen mit palmarer oder dorsaler Plattenosteosynthese. Ein möglicher Vorzug eines Zuganges konnte in der Studie nicht bewiesen werden, auch wenn in der Literatur allgemein eine Tendenz nach palmar zu verzeichnen ist. Als vorteilhaft erwies sich die kleindimensionierte 2,4 mm winkelstabile Formplatte, mit insgesamt geringer Morbidität und Komplikationsrate im Vergleich zu alternativen Plattensystemen oder minimalinvasiven Verfahren. Anhand der vorliegenden Resultate konnte gezeigt werden, dass einer guten anatomischradiologischen Rekonstruktion unter Berücksichtigung biomechanischer Aspekte bedingt durch die Begleitverletzungen, eine gute Funktion folgt. Hervorzuheben ist, dass die Rate der sehr guten bis guten Ergebnisse in allen Scores trotz der komplexen Verletzungsmuster mit hoher Beteiligung relevanter Begleitverletzungen und hochenergetischen Traumen in Gruppe A über 75 Prozent lag, wie auch in Gruppe B mit ausschließlich osteoporotisch assoziierten instabilen distalen Radiusfrakturen. In der gegenwärtigen Literatur beschreiben nur sehr wenige Arbeiten ähnliche Verletzungsmuster, weitere Kriterien zum Erreichen einer homogenen Population fehlen in der Regel. Insgesamt wird deutlich, dass ein direkter Vergleich unserer Ergebnisse mit denen der aktuellen Literatur nicht möglich ist. Es fehlen analoge Studien mit identischer Evidenzgraduierung, Population und Definitionen bezüglich der Komplikationen und Begleitverletzungen. Wird dennoch ein Vergleich mit konventionellen Plattensystemen und dem Fixateur externe angestrebt, zeigen unsere Resultate sehr gute radiologische, funktionelle und subjektive Ergebnisse mit relativ geringen Komplikationsraten und einer frühzeitigen, schmerzfreien Mobilisation obwohl in der Regel in der Literatur weniger komplexe Verletzungsmuster behandelt werden. Auch im Hinblick auf alternative winkelstabile Plattensysteme mit unterschiedlichen Behandlungsalgorithmen zeigen sich trotz komplexer Verletzungen in unserer Population gute und sehr gute Resultate und bestätigen die Erfahrungen aktueller Publikationen. Welchen Einfluss Begleitverletzungen, Komplikationen, Alter und Verletzungsmechanismus auf die Ergebnisse haben, kann nur durch langfristige, kontrollierte und randomisierte Studien ermittelt werden. In der vorliegenden Arbeit beeinflussten vorwiegend Läsionen des TFCC Komplexes, des CRSS, der Sinterung und die Läsion des Ramus superficialis des Nervus radialis die Scores. Damit bekräftigen unsere Untersuchungen, dass ein differenziertes Behandlungsvorgehen bei Verletzungen des TFCC Komplexes, der ligamentären Strukturen und der distalen Ulna angezeigt ist. Als wesentliche Ursache für die Komplikationen waren die kombinierten Zugänge und der Fixateur externe verantwortlich. Jedoch erwiesen sich nur wenige Komplikationen als behandlungsbedürftig und eine operative Revision kam nicht vor. Die Knocheninterponate konnten in den zwei Jahren der Studiendauer mit zunehmender Erfahrung reduziert werden, was den Erfahrungen anderer Autoren entspricht. Um eine Behandlungsrichtlinie aufstellen zu können, bedarf es kontrollierter Studien, die zeigen, welche Verfahren langfristig die besseren Resultate erbringen. Als notwendige Bedingung sind zuvor eine einheitliche Methodik, Behandlungsziel und eine Bewertung der Ergebnisse zu definieren. Zusammenfassung der Studie Zusammenfassung Das Prinzip der Plattenosteosynthese zeigte in der Vergangenheit überwiegend gute Resultate und gilt als etabliertes und sicheres Verfahren bei der Behandlung distaler Radiusfrakturen. Trotzdem wurde über Probleme und Komplikationen bei konventionellen Plattensystemen, abhängig vom Zugangsweg, der Knochenqualität und der Häufigkeit einer vorzeitigen Materialentfernung berichtet. Ziel der vorliegenden prospektiven Studie war es, die Anwendbarkeit einer kleindimensionierten 2,4 mm anatomisch angepassten winkelstabilen Formplatten zur Versorgung komplexer distaler Radiusfrakturen mit osteoporotischen Knochen und mit gelenknahen intraartikulären multiplen Fragmenten zu beurteilen sowie die Ergebnisse unseres Behandlungskonzeptes vorzustellen. Gruppe A (n=28) bestand aus dislozierten, intraartikulären distalen Radiusfrakturen (Typ C ohne Osteoporose) und in Gruppe B (n=33) befanden sich osteoporotisch assoziierte Frakturen (Typ A3 und Typ C). Die Frakturen wurden mit einer 2,4mm winkelstabilen Formplatte (Synthes®) nach dem 3-Säulen-Prinzip entweder palmar, dorsal oder kombiniert versorgt. Je nach Verletzungsmuster erfolgte zunächst eine primäre Stabilisierung mit einem Fixateur extern und späterer Plattenosteosynthese sowie gegebenenfalls Arthroskopie. Die Analyse unserer Daten zeigte für Gruppe A bei 78 Prozent der Patienten ein gutes bis sehr gutes Resultat beim Score nach Gartland und Werley mit einem DASH-Score von 13,9 Punkten. Der radiologische Score nach Lidström zählte 89 Prozent gute bis sehr gute Resultate. In Gruppe B hatten ebenfalls 78 Prozent der Patienten gute bis sehr gute Resultate beim Score nach Gartland und Werley mit einem DASH Score von 20,3 Punkten und 75 Prozent guten bis sehr guten radiologischen Ergebnissen nach dem Score nach Lidström. Die arthroskopisch assistierten distalen Radiusfrakturen mit versorgten relevanten Begleitverletzungen wiesen 73 Prozent gute bis sehr gute Ergebnisse beim Score nach Gartland und Werley mit einem DASH-Score von 19,1 Punkten und 77 Prozent guten bis sehr guten radiologischen Resultaten nach Lidström auf. Es bleibt das „goldene Ziel“ eine stabile, anatomiegerechte Fixation der Fraktur zu erreichen, die eine frühzeitig Bewegung und Rehabilitation ermöglicht. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen bei allen Patienten eine stabile Retention dislozierter, intraartikulärer und osteoporotisch assoziierter distaler Radiusfrakturen höherer Verletzungsgrade. Damit sind die Resultate mit denen der gegenwärtigen Literatur bei winkelstabilen Plattensystemen vergleichbar, auch wenn diese häufig weniger komplexe Verletzungsmuster des distalen Radius aufwiesen. Unser Behandlungsalgorithmus bei intraartikulären Mehrfragmentfrakturen besonders nach Hochrasanztraumen und relevanten Begleitverletzungen mit zweizeitigem Vorgehen und primärer Stabilisierung durch den Fixateur externe hat sich im Vergleich zu den Daten aus der Literatur bewährt. Unter Beachtung der biomechanischen Stabilität sollten Begleitschäden einer zeitigen Behandlung zugeführt werden. Das vorgestellte Verfahren inklusive der assistierten Arthroskopie ist eine adäquate Option bei der Diagnostik und Behandlung von Begleitverletzungen. Weitere prospektive, randomisierte Studien sind zu fordern, um klare Leitlinien zur Behandlung komplexer, distaler Radiusfrakturen zu erstellen. Die im Rahmen der DRG82 Abrechnungsmodalitäten eingeführten Klinikinformationssysteme könnten für eine entsprechende Qualitäts- und Datenerfassung die notwendige Grundlage bilden.
The term cephalic sensory organ (CSO) is used for specialised structures in the head region of adult Opisthobranchia. These sensory organs show a high diversity in form and function, and the gross morphology of these organs differs considerably among taxa. They can be identified as cephalic shields, oral veils, Hancocks organs, lip organs, rhinophores or oral tentacles. Because of this extremely high diversity, the homology and the evolution of these organs have not been clarified yet. My intention was to use neuroanatomical data sets in order to find putative homologous CSOs. In this study, I will show data about immunohistochemical neurotransmitter content and cellular innervation patterns and their applicability as morphological characters for the homologisation of structures. I support earlier investigations that neurotransmitter content is often related to function. In contrast, axonal tracing patterns can be used to homologise nerves. Overall the aim of this study was to reconstruct the evolution of the CSOs of the Opisthobranchia, by projecting our neuroanatomical data sets onto a molecular phylogeny.
1.1 Hintergrund Diese Studie vergleicht in drei Teilen die konservative Behandlung nichtverschobener, nichtdislozierter Unterkiefergelenkfortsatzfrakturen mit der offenen Reposition und Fixierung verschobener und dislozierter Unterkiefergelenkfortsatzfrakturen bei I. Erwachsenen und II. bei Kindern. In einem speziellen III. Teil der Arbeit wird die geschlossene, konservative gegenüber der offenen, operativen Behandlung von nichtdislozierten hohen (Klasse VI nach Spiessl und Schroll1) Gelenkwalzenfrakturen verglichen. 1.2 Patienten und Methodik 1.2.1 Erwachsene 129 Patienten mit 158 Frakturen wurden von 2000 bis 2005 in die Studie aufgenommen. Klassen II bis V, d.h. verschobene und dislozierte Frakturen wurden operiert, also offen reponiert und intern fixiert, fortan als ORIF bezeichnet. Klasse I und VI (nichtverschobene, nichtdislozierte Frakturen) wurden konservativ therapiert und erhielten die geschlossene Therapie, fortan als GT bezeichnet. Nach einem Jahr wurden Gesichtssymmetrie, Schmerz, Fazialisfunktion, Narbenbildung, Reossifikation auf Röntgenkontrollen, Fragmentposition horizontal und vertikal beurteilt sowie inzisale Maximalbewegungen und die Kondylentranslation vermessen. 1.2.2 Kinder 22 Patienten jünger als 14 Jahre wurden von 2000 bis 2005 in die Studie einbezogen. Klasse II bis V nach Spiessl und Schroll, was verschobenen bzw. dislozierten Frakturen entspricht, wurden operiert; Klasse I und VI, entsprechend nicht disloziert und verschoben, konservativ behandelt. In einem Intervall von 1, 2 und 5 Jahren wurde dieses Kollektiv auf dieselbe Art und Weise nachuntersucht wie das Erwachsenenkollektiv. 1.2.3 Klasse VI Es nahmen 22 Patienten zwischen 2001 und 2005 mit 26 Klasse VI Frakturen (4 doppelt) an dieser Studie teil; in randomisiert ausgelegter Weise hatten 9 (41%) ORIF und 13 (59%) GT. Die Nachsorge erfolgte nach einem Jahr auf die bereits beschriebene Art. 1.3 Ergebnisse 1.3.1 Erwachsene Klasse I umfasste 29 Patienten, 37 Frakturen, mit einer relativen Inzidenz von 23%, Klasse II: 23/28/18%, Klasse III: 16/20/13%, Klasse IV: 30/35/22%, Klasse V: 18/23/15%, Klasse VI: 13/15/9%. Klinische Verläufe waren in Klasse I unkompliziert; Klasse II, III und IV erreichten operativ horizontale und vertikale Fragmentreposition mit geringem Knochenumbau. Einzelfälle zeigten persistierenden Schmerz, Dysokklusion und Osteosynthesefrakturen. Die Ergebnisse waren in Klasse V und VI weniger erfolgreich. Obgleich ORIF in Klasse V gute Reposition erreichte, kam es zu ausgeprägtem vertikalen Knochenabbau, Einzelfälle zeigten persistierenden Schmerz, Dysokklusion und Osteosynthesefrakturen. Klasse-VI-Fälle zeigten die schlechteste Translation, ebenfalls ausgeprägten Knochenumbau und gehäuft Dysokklusion. 1.3.2 Kinder 19 (79%) Patienten stellten sich zur Nachsorge vor: Klasse I=8, II=3, III=0, IV=2, V=5, VI=1; 11 Patienten (58%) nach 1 Jahr; 4 (21%) nach 2 Jahren und 4 (21%) nach 5 Jahren. Völlige Symptomfreiheit oder fehlende Motivation war nach telefonischer Aussage der Eltern der Grund für das Nichterscheinen zur Nachsorge. Alle Untersuchten zeigten eine suffiziente Mundöffnung. Ein Klasse-VI-Patient zeigte insuffiziente Kondylentranslation sowie drei Patienten Deflexionen; zwei Patienten partielle Fazialisparesen, die jedoch nach einem Jahr abgeklungen waren; in zwei Fällen wurden gebrochene Osteosynthesematerialien entfernt. Die vertikale und horizontale Kondylenabstützung wurde erfolgreich wiederhergestellt. Nennenswerte Kondylenresorptionen wurden in Klasse V verzeichnet; insgesamt 4 (17%) Misserfolge waren zu verzeichnen, wovon 3 auf Klasse V entfielen. 1.3.3 Klasse VI Insgesamt stellten sich 17 (77%) Patienten zur Nachuntersuchung vor; 8 (47%) wurden geschlossen und 9 (53%) offen therapiert. Alle Patienten zeigten eine normale Mundöffnung. Insuffiziente kondyläre Translation (definiert durch <6mm Translation bei Mundöffnung, Protrusion und Mediotrusion <3mm) trat jeweils bei zwei der ORIF- und GT- Patienten auf. Anhaltender Schmerz bei 2 mit ORIF, Deflexion größer als 4mm ebenfalls bei 2 mit ORIF. Bleibende Nervenparesen wurden nicht verzeichnet. Im Falle eines ORIF- Patienten wurde gebrochenes Osteosynthesematerial entfernt und im Falle eines GT- Patienten war eine starke Dysokklusion erkennbar. Die vertikale Position des medialen Fragments wurde mit ORIF erfolgreich wiederhergestellt, wenn dies auch mit einem beträchtlichen Umbauprozess verbunden war (der laterale Kondylenpol ist bei Klasse VI unverändert). Die geschlossene Therapie versagte in der vertikalen Wiederherstellung des medianen Kondylenpols, zeigte aber weniger Umbauprozesse. Die Winkelabweichung war bei ORIF erfolgreich reduziert, bei der GT konnte eine leichte Winkelvergrößerung verzeichnet werden. 1.4 Schlussfolgerung Klasse V und VI stellen im großen Kollektiv der Erwachsenen nach wie vor die komplexesten Anforderungen, während die übrigen Klassen nach den Richtlinien dieser Studie gut therapiert werden können. Beim kleineren Kollektiv der Kinder ist das Behandlungsprinzip zu 83% erfolgreich, wobei auch hier die größten Probleme bei Klasse V liegen. Innerhalb der Klasse-VI-Studie ergab die GT 2/8 (25%) und ORIF 2/9 (22%) inakzeptable Ergebnisse und postoperativen Kondylenumbau. Insgesamt erreichte hier die Erfolgsrate 75 zu 78%. Wenn hier also nicht die GT zukünftig vorzuziehen ist, könnten hochfeste resorbierbare Osteosynthesen mit intraossärer Lokalisation ein besseres Ergebnis liefern als die Mikroplatten und Schrauben an der dorsalen Kondylenzirkumferenz, die in dieser Studie verwendet wurden. Insgesamt könnte der Gelenkumbau in Klasse V und VI und die Translation in Klasse VI durch noch vorsichtigere Mobilisation und verbesserte Osteosynthese sowie von einem minimalisierten Operationstrauma profitieren.
Hintergrund: Ziel der vorliegenden Studie war es, die Veränderungen von Hämodynamik und Säure-Basen-Haushalt im Zusammenhang mit einer prolongierten intraperitonealen CO2-Insufflation und Kopftief-Lagerung prospektiv zu untersuchen. Methoden: Zehn Patienten der Risikoklassen ASA I - III, die sich einer roboter-assistierten laparoskopischen radikalen Prostatektomie unterzogen, wurden in die Studie eingeschlossen. Die invasiven hämodynamischen Parameter wurden mittels transpulmonaler Thermodilution unter Verwendung des PiCCO®-Systems mit einem Femoralarterienkatheter gemessen. HF, HZV, HI, dPmax, SV, SVI, SVV, MAD, ZVD, SVR, SVRI, ITBV, ITBVI, EVLW, EVLWI, pH, paO2, paCO2, BE, HCO3-, etCO2, AF und AMV wurden in Rückenlage, nach der Kopftief-Lagerung, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h und 4 h nach Anlage des Pneumoperitoneums, nach Ablassen des Pneumoperitoneums in Kopftieflage und abschließend erneut in Rückenlage gemessen. Ergebnisse: Die Kopftief-Lagerung der Patienten verursachte einen signifikanten Anstieg des ZVD (von 10 (± 3) auf 15 (± 2) mmHg), wohingegen alle anderen hämodynamischen Parameter nahezu unverändert blieben. Die Anlage des Pneumoperitoneums rief einen singulären Anstieg des MAD (von 75 (± 13) auf 95 (± 12) mmHg). Kein anderer hämodynamischer Parameter veränderte sich. Selbst nach vier Stunden waren nur milde hämodynamische Veränderungen zu beobachten. Nach Ablassen des Pneumoperitoneums stiegen HF (49 (± 4) vs. 64 (± 12) /min) und HI (2,4 (± 0,2) vs. 3,4 (± 0,7) l/min/m²) signifikant an, während der ZVD zu seinen Ausgangswerten zurückkehrte. Durch das Pneumoperitoneum wurde eine milde respiratorische Azidose hervorgerufen, die sich nach zwei Stunden stabilisierte (pH: 7,45 (± 0,04) vs. 7,37 (± 0,04)). Die AF wurde während des gesamten Beobachtungszeitraumes kontinuierlich gesteigert, wodurch der paCO2 nahezu zu seinen Ausgangswerten zurückkehrte. Schlussfolgerung: Patienten, die sich einer laparoskopischen radikalen Prostatektomie mit einem mindestens vierstündigen Pneumoperitoneum in Trendelenburg-Lagerung unterzogen, erfuhren keinen signifikanten hämodynamischen Abfall und nur geringfügige Veränderungen des Säure-Basen-Haushaltes während Lagerung und Pneumoperitoneum.
Einleitung Ziel dieser retrospektiven Studie war die Evaluation des Eurotransplant Senior Program (ESP) an unserem Zentrum unter besonderer Berücksichtigung operativer Gesichtspunkte und der Vergleich mit älteren Empfängern aus dem regulären Eurotransplant Kidney Allocation System (ETKAS). Patienten und Methoden Die Daten von 73 Patienten (durchschnittliches Empfänger-/Spenderalter 67,1 Jahre / 71,1 Jahre) aus dem ESP- und 51 Patienten (63,6 Jahre/49,7 Jahre) aus dem ETKAS-Programm, die zwischen den Jahren 1999 und 2006 transplantiert wurden, wurden miteinander verglichen. Das mittlere Follow-up betrug 39,5 ± 23,6 Monate. Ergebnisse Die Nierenfunktion der Spender gemessen an der Kreatinin-Clearance (ESP vs. ETKAS: 81,7 vs. 109,9 ml/min), die kalte Ischämiezeit (10,6 vs. 15,1h), die Dauer der Nierenersatztherapie (42,2 vs. 76,8 Monate) sowie die HLA Mismatches (4,1 vs. 2,4) waren zwischen den Gruppen signifikant verschieden (p<0,001). Die primäre Funktionsaufnahme der Transplantate lag im ESP vs. ETKAS bei 74% vs. 69%, 90% vs. 92% der Patienten wurden mit einem funktionierenden Transplantat entlassen (alle p>0,05). Die chirurgische Komplikationsrate lag im ESP vs. ETKAS bei 47% vs. 28% (p=0,031), die Revisionsrate bei 33% vs. 24% (p=0,259). 18% der Patienten aus dem ESP und 14% aus dem ETKAS sind im Verlauf des Follow-up verstorben (p=0,273), 95% davon mit guter Transplantatfunktion. Das 3-Jahres-Patientenüberleben betrug im ESP vs. ETKAS 84% vs. 92% (p=0,252), das zensierte 3-Jahres-Transplantatüberleben 85% vs. 88% (p=0,757). Schlussfolgerungen Es zeigte sich eine deutliche Erweiterung des Spender- und Empfängerpools durch das ESP. Die Transplantationsergebnisse im ESP waren hinsichtlich Patienten- und Transplantatüberleben durchaus mit den Ergebnissen der ETKAS-Gruppe vergleichbar. Patienten und deren betreuende Ärzte sollten allerdings über eine höhere chirurgische Komplikationsrate im ESP informiert sein. Chirurgische Komplikationen können die postoperative Behandlung der Patienten erheblich beeinflussen, bleiben jedoch meist ohne signifikanten Einfluss auf das Transplantationsergebnis.
Gegenstand dieser Arbeit ist die Entwicklung, der Aufbau und die Charakterisierung sowie Messung einer anwendungsspezifischen integrierten Schaltung (engl.: Application Specific Integrated Circuit, ASIC). Sie dient der Auslese der im elektromagnetischen Kalorimeter des PANDA-Experiments eingesetzten Lawinenfotodioden. Jeder Auslesekanal beinhaltet in der Eingangsstufe einen ladungsempfindlichen Vorverstärker, gefolgt von einem Pulsformer sowie zwei Ausgangstreibern. Am Beginn der Entwicklung steht die Machbarkeitsstudie einer integrierten Ausleseelektronik, welche die anspruchsvollen Anforderungen des PANDA-Experiments erfüllt. Aus rauschtheoretischen Untersuchungen resultieren erste Entwurfsparameter für die Schaltung, die mit Hilfe umfangreicher Simulationen verbessert und ergänzt werden. Die technische Umsetzung der Schaltung erfolgt in einem 0,35 Micrometer-CMOS-Prozess der Firma Austria Mikrosysteme. Die Charakterisierung der integrierten Ausleseelektronik ergibt bei einer Umgebungstemperatur von T = - 20° C eine Shapingzeit des Signalpulses von tr = (124 ± 2) ns. Mit dem äquivalenten Rauschwert von ENC = (4456 ± 35) e- und einer maximal möglichen Eingangsladung von 7,84 pC folgt ein dynamischer Bereich von über 10 000. Der ratenunabhängige Leistungsbedarf eines einzelnen Auslesekanals beträgt P = (52, 4 ± 0, 2)mW. Damit erfüllt der in dieser Arbeit beschriebene ASIC Prototyp alle Anforderungen, die vom Experiment an die Ausleseelektronik gestellt werden.
Das Hepatitis C-Virus (HCV) ist ein umhülltes RNA-Virus, das der Virusfamilie Flaviviridae angehört. Fast alle immunkompetenten Patienten bilden während einer HCV-Infektion multispezifische T-Zell-Antworten und neutralisierende Antikörper gegen verschiedene HCV-Hüllglykoproteine. Trotzdem sind sie nicht in der Lage, das Virus erfolgreich zu eliminieren. Etwa 70% der HCV-infizierten Patienten entwickeln eine chronische Infektion, die zu einer progressiven Leberschädigung führen kann. Aufgrund des Fehlens einer geeigneten in vivo oder in vitro Neutralisationsuntersuchung ist wenig über die humorale Immunantwort bzw. die Rolle und Bedeutung der neutralisierenden Antikörper bei der HCV-Infektion bekannt. Ein lang ersehntes Ziel in der HCV-Forschung ist die Entwicklung eines verlässlichen Virus-Systems zur Untersuchung der Interaktionen zwischen Zielzellen und HCV-Hüllglykoproteinen. In meiner Studie wurde die humorale Immunantwort bei 31 chronisch HCV-infizierten Patienten unter Anwendung von Hepatitis C-Pseudopartikeln (HCVpp) untersucht. Die untersuchten Patienten waren mit unterschiedlichen HCV-Genotypen infiziert, befanden sich zum Zeitpunkt der Untersuchung (Probeentnahme) in keiner Therapie und wiesen keine HIV- oder HBV-Koinfektion auf. Als Negativ-Kontrolle standen mir die Serum-Proben von 5 gesunden Probanden zur Verfügung. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass man durch die Anwendung von Hepatitis C-Pseudopartikeln neutralisierende Antikörper bei chronisch HCV-infizierten Patienten nachweisen kann. Gesunde Probanden hingegen wiesen keine neutralisierenden Antikörper auf. Die zur Untersuchung der humoralen Immunantwort hergestellten HCV-Pseudopartikel hatten den Genotyp 1a. Die Serum-Proben der untersuchten Patienten in meiner Studie waren mit HCV-Genotypen infiziert, die sich zum Teil von dem eingesetzten HCVpp-Genotyp unterschieden. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Serum- Proben die Infektiösität der HCVpp mit nahezu gleicher Wirksamkeit reduzierten wie die Serum-Proben von Patienten, die mit dem HCV-Genotyp 1a infiziert waren (kreuzreaktive Eigenschaft der neutralisierenden Antikörper). Im letzten Teil dieser Arbeit wurden die antikörpervermittelte Virusneutralisation und die CD4+- und CD8+-T-Zell-Stimulation bei 22 chronisch HCV-infizierten Patienten gleichzeitig miteinander verglichen. In meiner Studie zeigten 11 Patienten eine starke, 9 Patienten eine schwache und 2 Patienten keine HCV-Neutralisation. Die Ergebnisse der Virusneutralisation waren unabhängig von den Ergebnissen der T-Zell-Stimulation und den HCV-Genotypen. Auch bei fehlender T-Zell- Antwort konnte eine Neutralisation beobachtet werden. Das untersuchte Patientenkollektiv bestand hauptsächlich aus Patienten mit einer chronischen HCV-Infektion, die weder zum Zeitpunkt der Untersuchung (Probeentnahme) noch anamnestisch eine Therapie unterzogen waren. Es gab lediglich zwei therapierte Patienten, die HCV-positiv (Non-Responder) waren. Sie zeigten beide eine starke Neutralisation bei starker CD8+-T-Zell-Antwort aber schwacher bzw. fehlender CD4+-T-Zell-Antwort. Andererseits zeigte ein Patient, der unter Therapie initial Responder war, eine starke T-Zell-Antwort in beiden CD4+- und CD8+-T-Lymphozyten bei schwacher Neutralisation. Vermutlich aufgrund der kleinen Gruppe aber auch in Übereinstimmung mit anderen Studien konnte in meiner Studie keine relevante Korrelation zwischen der Neutralisationsstärke und der T-Zell-Antwort bzw. keine Übereinstimmung der Ergebnisse im Verlauf der Infektion beobachtet werden. Die Ergebnisse meiner Studie haben gezeigt, dass Hepatitis C-Pseudopartikel (HCVpp) geeignete Antigene für die Untersuchung der Aktivität der neutralisierenden Antikörper und die spezifische Stimulation der T-Lymphozyten sind. Die Vorteile dieser Untersuchungsmethode sind ihre leichte Handhabung, die hohe biologische Sicherheit durch replikationsinkompetente und somit vermehrungsunfähige virale Partikel und der eindeutige und schnelle Nachweis durch die standardisierte Durchflusszytometrie. Mit dieser Methode kann eine Untersuchung der HCV-Infektion bzw. -Neutralisation auf reproduzierbare und einfache Weise erfolgen.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von Nanopartikeln als Trägersysteme für nukleosidische Arzneistoffe. Ihr Einsatz verhindert z.B. die Degradierung der Nukleoside und verbessert ihre Aufnahme in Zellen. Die Partikel wurden aus humanem Serumalbumin (HSA) durch Desolvatation hergestellt und mittels Glutaraldehyd stabilisiert. Durch die Kopplung von Trastuzumab an die Partikeloberfläche können HER2-überexprimierende Brustkrebszellen spezifisch erreicht werden. Bindet der Antikörper an den HER2-Rezeptor, kommt es zu einer Internalisierung des Ligand-ezeptorkomplexes und an den Liganden gebundene Partikel werden zusammen mit dem Komplex in die Zellen aufgenommen. Die Kopplung von Trastuzumab an die Oberfläche der HSA-Nanopartikel über eine Thioetherbindung war sehr effizient und stabil.Die Stabilität von Partikelsystemen über lange Lagerzeiten kann durch Gefriertrocknung erhöht werden. Zur Gefriertrocknung trastuzumabmodifizierter Partikel wurden Trehalose, Sucrose und Mannitol in Konzentrationen bis 5% als Hilfsstoffe eingesetzt. Trehalose und Sucrose waren bereits in einer Konzentration von 3% in der Lage, die physikochemischen Eigenschaften der Partikel direkt nach der Gefriertrocknung zu erhalten, die Partikel waren aber nicht lagerfähig. Mit Mannitol war dies direkt nach der Gefriertrocknung auch bei einer Konzentration von 5% nicht in gleichem Umfang möglich, die Partikel konnten aber am besten gelagert werden. Als nukleosidische Wirkstoffe wurden In die Matrix von HSA-Nanopartikeln unter anderem Antisenseoligonukleotide (ASOs) eingebettet. Das inkorporierte ASO P12 gehört zur Gruppe der Phosphorothioate (PTOs) und bewirkt eine Reduktion der Polo-like Kinase 1 (Plk1) auf mRNA- und Proteinebene. Plk1 ist wesentlich an der Zellteilung beteiligt und wird in vielen Tumoren überexprimiert, eine Hemmung von Plk1 führt zur Apoptose der Zellen. Damit das PTO eine Wirkung zeigen kann, muss es intrazellulär aus den Partikeln freigesetzt werden. Deshalb wurden die Partikel enzymatisch abgebaut. Die Wiederfindung der PTOs aus der abgebauten Partikelmatrix betrug maximal 30% und war von der Menge des zur Partikelstabilisierung verwendeten Glutaraldehyds abhängig. Je mehr Glutaraldehyd verwendet worden war, desto schlechter war die Wiederfindung. Eventuell werden die PTOs durch Glutaraldehyd inaktiviert, indem es zu einer Quervernetzung untereinander oder mit Albuminmolekülen kommt. Dennoch konnte in Brustkrebszelllinien eine biologische Wirkung der PTO-beladenen Partikelsysteme gezeigt werden. P12-beladene, trastuzumabmodifizierte Partikel wurden zeitabhängig und rezeptorvermittelt HER2-überexprimierende Zellen aufgenommen. Die Partikel reduzierten die Menge der Plk1-mRNA signifikant. Dies ging mit einer ebenfalls signifikanten Reduktion der Plk1-Proteinmenge einher. Die Folge der Plk1-Reduktion war eine Aktivierung der Caspasen 3 und 7, die die Induktion der Apopotose zeigte. Plk1 kann nicht nur durch PTOs, sondern auch durch Plasmid-DNA, die small hairpin RNA (shRNA) gegen Plk1 exprimiert, gehemmt werden. Die Plasmide blieben bei der Einbettung in die Partikelmatrix intakt, allerdings trat eine Umformung von der supercoiled in die lineare und zirkuläre Form auf. Auch plasmidbeladene, trastuzumabmodifizierte Partikel wurden zeitabhängig und rezeptorvermittelt in HER2-überexprimierende Zelllinien aufgenommen und führten dort zu einer signifikanten Reduktion der Plk1-Proteinmenge. Als weiterer nukleosidischer Wirkstoff wurde noch eine siRNA gegen Plk1 in die HSA-Partikel inkorporiert. Mit siRNA-beladenen Nanopartikeln konnte ebenfalls eine signifikante Reduktion der Plk1-mRNA- und –Proteinmenge beobachtet werden. Partikel aus HSA können nicht nur durch den Einsatz von Glutaraldehyd stabilisiert werden, eine thermische Quervernetzung der Partikelmatrix ist ebenfalls möglich. Die besten physikochemischen Eigenschaften PTO-beladener Partikel wurden bei einer Quervernetzungstemperatur von 105°C über 10 min erzielt. Wurden diese Partikel enzymatisch abgebaut und das PTO aus der Partikelmatrix bestimmt, so konnten bis zu 80% des eingebetteten PTOs intakt detektiert werden. Allerdings waren die Partikel weniger stabil als chemisch quervernetzte Partikel. Bei einer Einlagerung über 6 Wochen stieg der Partikeldurchmesser an, 25% des eingebetteten P12s wurden aus der Matrix freigesetzt und bis zu 20% des Trastuzumabs wurden von der Oberfläche abgelöst. Dennoch war die Reduktion der Plk1-mRNA- und –Proteinmenge in der Zellkultur signifikant und mit der von chemisch stabilisierten Partikeln vergleichbar. Trastuzumabmodifizierte HSA-Nanopartikel stellen somit ein geeignetes Trägersystem für nukleosidische Arzneistoffe dar und führen zu einer spezifischen Wirkung in HER2-überexprimierenden Brustkrebszellen.