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Im Rahmen dieser Dissertation sollte der Effekt der Zelldichte auf Proliferation und Apoptose bei der RKO-Rektumkarzinomzelllinie untersucht werden. Neben Invasion, Entdifferenzierung und Metastasierung kann bei Krebserkrankungen auch eine hohe Wachstumsgeschwindigkeit zu den Charakteristika der Malignität gezählt werden. Bei Leukämien, Lymphomen und bestimmten soliden Tumoren, bei denen eine chirurgische Resektion nur eingeschränkt möglich ist, bedeutet jedoch ein langsames Wachstum, d.h. eine geringe Proliferation der Tumorzellen, in der Regel keine verbesserte Prognose, da sie mit schlechterem Ansprechen auf Chemotherapie und Bestrahlung einhergeht. Die molekularen Ursachen dieser Behandlungsresistenz sind bisher nicht vollständig geklärt und wahrscheinlich nicht bei allen Krebserkrankungen auf identischen Mechanismen beruhend. Vorstellbar ist, dass sich das Gesamtsystem der Zelle während des Teilungsprozesses sensibler gegenüber Schädigungen der DNA, wie sie durch Bestrahlung und die meisten Chemotherapeutika ausgelöst werden, präsentiert. Dies kann durch unterschiedlichste molekulare Mechanismen verursacht sein. Um den möglichen Einfluss des Proliferationsverhaltens einer Zellpopulation auf das Apoptose-Verhalten zu untersuchen, wurde im Rahmen dieser Arbeit versucht, die Proliferationsgeschwindigkeit einer Zellkultur mittels Dichte-Arretierung zu senken. Hierzu wurden RKO-Zellen in konfluenter und subkonfluenter Dichte kultiviert. Ebenfalls wurden Unterschiede bei der Verteilung der Zellen auf die verschiedenen Zellzyklusphasen ermittelt. Durch Inkubation mit CD95L konnte dann ein Zusammenhang von Proliferation und Apoptosesensitivität ermittelt werden, d.h. die „Zellzyklusabhängigkeit“ der CD95L-induzierte Apoptose untersucht werden. Hierbei zeigten sich Zellen mit geringerer Proliferationsrate resistenter gegenüber CD95L. Verschiedene Methoden (z.B. Western-Blot-Analyse, FACS-Messungen) wurden zur Aufklärung der molekularen Ursachen genutzt. Die Arbeit zeigte auch das Vorhandensein eines molekular nicht identifizierten, autokrin in das Medium sezernierten Faktors, der zu verstärkter Resistenz gegenüber CD95L führte. Dieser Faktor erhöhte auch die Migration und Invasivität der RKO-Zellen und verstärkte damit die malignen Eigenschaften der Tumorzellen. Die zukünftige molekulare Identifikation dieses Faktors könnte therapeutisch bedeutsam sein.
Erhöhte Faktorenaktivitäten der Gerinnungsfaktoren VIII und IX standen seit längerer Zeit in dem Verdacht, unabhängige thrombophile Risikofaktoren darzustellen. Die Studienlage hierzu ist bzgl. der Wahl der untersuchten Kollektive, der Messmethoden, sowie der berücksichtigten Einflussgrößen uneinheitlich. Daher wurde die vorliegende Studie durchgeführt, um zum einen in einem Normalkollektiv die die Faktorenaktivität möglicherweise beeinflussenden Störgrössen wie Body Mass Index (BMI) oder ein steigendes Lebensalter zu definieren, und um andererseits die Häufigkeit erhöhter Faktor VIII und IX Aktivitäten bei Patienten mit venösen Thrombosen unter Berücksichtigung dieser Störgrössen im Vergleich zum Normalkollektiv exakt zu analysieren. Es wurden 500 Blutspender konsekutiv als Normalkollektiv eingeschlossen. Diesem wurde ein Patientenkollektiv von 374 konsekutiven Patienten mit venösen Thrombosen gegenübergestellt. Beide Kollektive wurden an Hand eines einheitlichen, standardisierten Fragebogens bezüglich ihrer Eigen- und Familienanamnese befragt. Darüber hinaus erfolgte eine Blutentnahme unter standardisierten Bedingungen. Als Messmethode für die Faktorenaktivität von Faktor VIII und IX wurde ein Einstufengerinnungstest verwendet, hierbei wird die Aktivität eines einzelnen Gerinnungsfaktors gemessen. Alle zu untersuchenden Plasmen wurden auf Lupusantikoagulantien getestet, um Probanden und Patienten mit positiven Lupusantikoagulantien von den weiteren Berechnungen ausschließen zu können, da Lupusantikoagulantien die Faktorenmessergebnisse verfälschen können. Dies wurde in den bisherigen Veröffentlichungen nicht berücksichtigt. Mit Hilfe des Normalkollektives wurde die 90% Perzentile als Cut Off für erhöhte Faktorenwerte definiert (FVIII = 158%; FIX = 151%). Bei Analyse des Faktors VIII konnten mit Hilfe einer linearen Regressionsanalyse folgende Störgrössen als relevant für die Faktorenaktivität innerhalb des Normalkollektives beschrieben werden: Raucher wiesen signifikant niedrigere Faktor VIII – Aktivitäten als Nichtraucher auf, während ein steigender BMI und ein steigendes Lebensalter zu signifikant höheren Faktor VIII -Aktivitäten führten. Ein Einfluss des Geschlechtes, sowie ein signifikanter Einfluss oraler Kontrazeptiva auf die Faktor VIII - Aktivitäten konnte nicht nachgewiesen werden. Die Aktivitäten des Faktor IX zeigten im Normalkollektiv ebenfalls eine Abhängigkeit von steigendem Lebensalter, höheren BMI Werten sowie im Gegensatz zur Faktor VIII – Aktivität auch von der Einnahme oraler Kontrazeptiva, wobei alle diese Zustände zu signifikant höheren Faktor IX Aktivitäten führten. Ein Vergleich der Höhe der Faktor VIII – Aktivitäten der Patienten mit venösen Thrombosen zum Normalkollektiv konnte leider nicht durchgeführt werden, da festgestellt wurde, dass eine unterschiedlich lange Lagerzeit der tiefgefrorenen Plasmaproben der Patienten zu einem Absinken von erhöhten Faktor VIII – Aktivitäten führen kann. Dies wurde in der Literatur bisher nicht beschrieben und war daher zu Beginn der Studie nicht bekannt. Im Gegensatz hierzu blieben die erhöht gemessenen Faktor IX – Aktivitäten auch nach einer längeren Lagerzeit stabil, so dass hier eine Risikoberechnung für erhöhte Faktor IX – Aktivitäten in Bezug auf das Auftreten venöser Thrombosen mit einer korrigierten Odds – Ratio erfolgen konnte. Die für BMI, Alter und Geschlecht korrigierte Odds Ratio betrugt 3,98 mit einem 95% Konfidenzintervall von 2,5 – 6,3. Es ist somit von einem ca. 4 fach erhöhten relativen Risiko für venöse Thrombosen bei erhöhten Faktor IX – Aktivitäten auszugehen, so dass diese einen neuen thrombophilen Risikofaktor für venöse Thrombosen darstellen.
In dieser Arbeit wurden verschiedene Aspekte der Allergie gegen Süßkirsche untersucht. Zunächst wurde die Leistungsfähigkeit eines professionellen Tests mit re-kombinanten Allergenen aus Süßkirsche untersucht. Hierzu wurden rPru av 1, 3 und 4 einzeln eingesetzt, um die Sensibilisierungsmuster von Kirschallergikern aus Mitteleuropa und Spanien zu untersuchen. Vor allem die Untersuchung LTP-sensibi-lisierter Patienten aus diesen Regionen in einer Zahl, die einen statistischen Ver-gleich ermöglichte, offenbarte neue Aspekte des Phänomens schwerer Reaktionen bei solchen Patienten. Die drei rekombinanten Kirschallergene wurden auch kombiniert in einem einzigen Test eingesetzt, um schwer standardisierbare Proteinextrakte als Hilfsmittel zur in vitro Diagnose zu ersetzen. Um die Leistungsfähigkeit dieses Tests umfassend beurteilen zu können, wurde sie mit der des SPT in Birkenpollenallergikern mit und ohne Kirschallergie verglichen. Die mögliche Bedeutung unbekannter Allergene oder Isoformen wurde durch die Abschätzung des Beitrags der bekannten Kirschallergene zum IgE-Bindungsanteil von Kirschextrakt untersucht. Mit dem ImmunoCAP konnten die bereits veröffentlichten regional unterschiedlichen Sensibilisierungsmuster bestätigt werden. Die dominierende Rolle des Bet v 1-Homologen Pru av 1 in Patienten aus Mitteleuropa und damit die Bedeutung der Birkenpollenassoziation in dieser Region, konnte ebenso bestätigt werden wie die überragende Relevanz von Pru av 3 für Kirschallergiker aus Spanien. Der Vergleich der größten bisher publizierten und für statistische Untersuchungen ausreichend großen Gruppe LTP-sensibilisierter Patienten aus Mitteleuropa mit solchen Patienten aus Spanien, legte im Gegensatz zu früheren Studien keine ausschließlich auf die molekularen Eigenschaften von Pru av 3 beschränkte Assoziation von sys-temischen Reaktionen und einer Sensibilisierung gegen LTPs nahe. Die Assoziation scheint eher zwischen der Herkunft LTP-sensibilisierter Patienten und systemischen Reaktionen zu bestehen. Diese Schlussfolgerung konnte gezogen werden, da bei keinem der LTP-sensibilisierten Patienten aus Mitteleuropa systemische Reaktionen auftraten. Weder eine Co-Sensibilisierung gegen Pollen noch eine Allergie gegen andere Nahrungsmittel wie zum Beispiel Pfirsich korrelierten mit dem Auftreten sys-temischer Reaktionen. Eine Erklärung für dieses Phänomen konnte aus den vor-liegenden Daten daher nicht abgeleitet werden. Die Leistungsfähigkeit des rMix-ImmunoCAP mit rPru av 1, 3 und 4 zum Nachweis einer Sensibilisierung gegen Süßkirsche war exzellent. Weder der kommerziell erhältliche Extrakt-ImmunoCAP noch der ImmunoCAP, der einen optimierten Extrakt an der Festphase trug konnte mit diesem Test konkurrieren. Die klinische Sensitivität des rMix-ImmunoCAP war mit ≥95% hervorragend, und der Test stimmte in 92% der Fälle mit dem SPT überein. Eine Unterscheidung zwischen Birkenpollenallergikern ohne Allergie gegen Süßkirsche und Kirschallergikern war hingegen weder mit dem rMix-ImmunoCAP noch mit dem SPT möglich. Die Spezifität beider Tests war von klinisch insignifikanter IgE-Reaktivität gegen Pru av 1 beeinträchtigt und auch die Konzentration spezifischen IgEs erlaubte keine Unterscheidung zwischen beiden Gruppen auf der Ebene einzelner Patienten. Der rMix-ImmunoCAP ist aber sehr gut geeignet eine Sensibilisierung bei einem Verdacht einer Allergie gegen Süßkirsche nachzuweisen, ohne auf weitere Allergene wie Pru av 2 oder Isoformen von Pru av 1 zurückgreifen zu müssen. Damit wurde zum ersten Mal ein diagnostischer Test ein-gesetzt, der einen Proteinextrakt aus Früchten vollständig ersetzen kann Die quantitative Abschätzung des Beitrages der bereits bekannten Allergene aus Süßkirsche zur IgE-Bindung mittel EAST-Inhibition hat gezeigt, dass bei einem Großteil der untersuchten Seren erhebliche Anteile des IgEs gegen Süßkirsche nicht erfasst werden. Die Ursache für dieses Phänomen konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht abschließend aufgeklärt werden, aber es ist als sehr wahrscheinlich anzu-sehen, dass die neu identifizierte Isoform von Pru av 1 zumindest bei einem Teil der Seren hierfür verantwortlich ist. Darüber hinaus waren im Immunoblot bei Seren bei denen die IgE-Bindung nicht vollständig zu inhibieren war IgE-Reaktivität gegen noch unbekannte Strukturen zu erkennen. Neben der Beteiligung glykosilierter Proteine war auch eine Beteiligung von Pru av 2 nicht vollständig auszuschließen, wenngleich im Verlauf dieser Arbeit keine Hinweise auf eine Relevanz dieses Allergens in dem untersuchten Patientenkollektiv gefunden werden konnten. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Grundlagen gelegt, um die Allergenität von Süßkirsche in einem in vitro Modell zu reduzieren. Es wurden Isoformen von Pru av 1 mit einer Kombination aus molekularbiologischen und proteinchemischen Methoden untersucht. Es wurden hierzu Techniken gewählt, die eine weitgehend um-fassende und zuverlässige Identifizierung von Isoformen ermöglichten. Ferner wurde der Gehalt an Pru av 1 von verschiedenen Kirschsorten verglichen, das Splice-Intron von Pru av 1 sequenziert, um die Herstellung eines spezifischen und wirksamen RNAi-Konstruktes zu ermöglichen, sowie die Eignung in vitro regenerierter Kirschpflanzen als Zielorganismus durch den Nachweis von Pru av 1 in den Blättern solcher Pflanzen geprüft. Die in dieser Arbeit verwendeten Methoden haben sich als geeignet erwiesen zuverlässig Isoformen von Allergenen zu identifizieren. Es konnte mit Hilfe einer syn-ergistischen Kombination aus einer cDNA-Bibliothek, PCR, und 2-D-PAGE / MS mit Pru av 1.02 eine neue Isoform von Pru av 1 identifiziert werden. Die mit den molekularbiologischen Methoden erzielten Ergebnisse stimmten dabei mit den Re-sultaten der proteinchemischen Untersuchungen sehr gut überein. In beiden Fällen wurden zwei Pru av 1 Isoformen nachgewiesen und lediglich die eine Variante von Pru av 1.02 mit sehr hoher Sequenzidentität konnte nicht als Protein nachgewiesen werden. Die auf Protein- und DNA-Ebene übereinstimmenden Ergebnisse bezüglich der beiden IgE-bindenden Isoformen, lassen darüber hinaus auf eine weitgehend vollständige Erfassung der Pru av1 Isoformen schließen. Pru av 1.02 besteht aus drei Varianten und zeigte ein anderes IgE-Bindungs-verhalten als das bereits bekannte Pru av 1.0101. Diese Isoform ist daher sowohl für eine zukünftige gentechnische Reduzierung der Allergenität von Süßkirsche als auch für diagnostische Zwecke bedeutsam. Für eine erfolgreiche Reduzierung der Aller-genität von Süßkirsche muss die Expression aller IgE-reaktiven Isoformen des in Mitteleuropa dominierenden Allergens Pru av 1 unterdrückt werden. Wenngleich Pru av 1.0201 zum Nachweis einer Sensibilisierung gegen Süßkirsche nicht not-wendig erscheint, könnte sie jedoch sowohl einen Einfluss auf die Höhe der gemes-senen IgE-Werte und die Ausbildung von Symptomen haben, als auch besser ge-eignet sein zwischen Birkenpollenallergikern mit und ohne Allergie gegen Süßkirsche zu unterscheiden. Abschließend wurden dann die Grundlagen für die gentechnische Redu-zierung der Allergenität von Süßkirsche geschaffen. Der Gehalt an Pru av 1 war in allen elf Kirschsorten sehr ähnlich, und erlaubt daher alle untersuchten Kirschsorten als Ausgangsmaterial einzusetzen. Die Sequenzierung des Splice-Introns aus Pru av 1 ermöglicht es jetzt ein intron-spliced hairpin RNAi-Konstrukt herzustellen. Dieses Konstrukt könnte dann eingesetzt werden, um die Reduktion der Allergenität von Süßkirsche experimentell in einem in vitro Modell zu zeigen. Mit dem Nachweis von Pru av 1 in den Blättern in vitro regenerierter Kirschpflanzen konnte gezeigt werden, dass die Voraussetzungen hierzu gegeben sind.
Mukoviszidose oder zystische Fibrose (CF) ist die häufigste autosomal-rezessiv Erbkrankheit in der westlichen Welt. Sie wird durch Mutationen in einem Gen verursacht, das den „Cystic Fibrosis Transmembran Conductance Regulator“ (CFTR) kodiert. Das CFTR-Protein ist zum einen ein epithelialer Chloridkanal, zum anderen aber auch ein Regulator zahlreicher anderer epithelialer Ionenkanäle und Transporter. Der Ausfall des CFTR-Proteins verursacht eine Multiorganerkrankung, bei der vorwiegend sekretorische Funktionen beeinträchtigt sind. Besonders betroffen sind Lunge und Pankreas, wobei die Beteiligung der Lunge maßgeblich für die Ausprägung der Erkrankung und deren Letalität ist. Die Mehrzahl der Patienten leidet unter rezidivierenden bronchopulmonalen Infektionen und einer exzessiven pulmonalen Inflammation. Einen wesentlichen Beitrag zur Zerstörung der Lunge liefern dabei jedoch körpereigene neutrophile Granulozyten, die in großer Zahl in die Lunge eindringen, ohne jedoch den Erreger beseitigen zu können. Neuere Studien lassen darauf schließen, dass neben den neutrophilen Granulozyten auch Lymphozyten eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Erkrankung spielen. Entzündungsmarker wie Zytokine und Eicosanoide sind nicht nur lokal in den Atemwegen erhöht, sondern auch systemisch, was auf einen generalisierten Entzündungsstatus hinweist. Die Ursache der gestörten Immunantwort bei CF sind immer noch unbekannt und erfordern weitere Untersuchungen. Das Ziel unserer Studien war die vergleichende Untersuchung der Expression und Aktivität der Peroxisom Proliferator-Aktivierten Rezeptoren (PPARs) sowie der 15-Lipoxygenase-1, einem Schlüsselenzym im Eicosanoidstoffwechsel, zwischen Patienten mit CF und gesunden Probanden. Da bekannt ist, dass PPARs sowie die 15-LO-1 in entzündlichen Prozessen regulatorische Funktionen besitzen, und man zudem annimmt, dass CF auf eine übermäßige Immunreaktion zurückzuführen ist, vermuten wir für PPARs bzw. 15-LO-1 ein verändertes Expressionsmuster. Eicosanoide sind wichtige Mediatoren und Modulatoren der inflammatorischen Antwort. Sie sind Derivate mehrfach ungesättigter Fettsäuren. Eine wichtige Rolle spielen sie bei der Thrombozytenaggregation, Kontraktion der glatten Muskulatur, Chemotaxis der Leukozyten, Zytokinproduktion, Schmerzübertragung sowie der Entstehung von Fieber. Einige Eicosanoide verursachen proinflammatorische, andere antiinflammatorische Aktionen, wiederum andere können beides verursachen. Arachidonsäure (AA), eine n-6 mehrfach ungesättigte Fettsäure (PUFA), ist der Vorläufer für potente proinflammatorische Eicosanoide wie Prostaglandin E-2, Thromboxan A2 und Leukotrien B4 und ist in der Phospholipidschicht der Zellmembran gebunden. n-3 PUFA’s wie Docosahexaenoicsäure (DHA) und Eicosapentaensäure werden zu Eicosanoiden wie Prostaglandin E-3, Thromboxan A3 und Leukotrien B5 metabolisiert. DHA besitzt antiinflammatorische Eigenschaften, indem es mit AA um die Aufnahme/Verbindung in die Zellmembran konkurriert, dabei werden die AA Spiegel herunterreguliert. Veränderungen beim Stoffwechsel der Fettsäuren und Eisosanoide wurden bei CF-Patienten von verschiedenen Gruppen beschrieben. Zusätzlich zu dem erhöhten Spiegel proinflammatorischer Leukotriene in Atemwegen, Urin und Serum, wurden erniedrigte Spiegel von DHA im Plasma und übermäßige Freisetzung von AA aus der Zellmembran für CF beschrieben. Desweiteren wurden erhöhte Mengen membrangebundener AA und erniedrigte Mengen membrangebundener DHA in den von CF betroffenen Organen beschrieben. Veränderungen des Fettsäure-Haushalts sind von besonderem Interesse, weil sie die bei CF vorliegender Fehlregulation inflammatorischer Prozesse erklären könnten. Sie sind auch natürliche Liganden von Peroxisom Proliferator-Aktivierten Rezeptoren und darüber hinaus an der Regulation von Entzündungsprozessen beteiligt. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind drei unterschiedliche PPAR-Isoformen identifiziert, PPAR alpha, beta und gamma. Sie sind Transkriptionsfaktoren, die zu der Superfamilie der nukleäreren Rezeptoren gehören, und werden durch endogene Liganden wie Fettsäuren und Eicosanoide aktiviert. Es wurde gezeigt, dass PPARalpha und –gamma antiinflammatorische Aktivität besitzen, die auf Monozyten, Makrophagen, Lymphozyten, glatte Muskelzellen und Endothellzellen wirkt. Ein Modell dazu ist eine durch PPARalpha und -gamma vermittelte Hemmung der proinflammatorischen Eigenschaften des nuklearen Faktor-kappaB (NF-kappaB) und des aktivierenden Proteins-1 (AP-1). Beides sind Transkriptionsfaktoren, die eine Schlüsselrolle bei der inflammatorischen Antwort spielen, indem sie die Expression von Zytokinen, Chemokinen, Zelladhäsionsmolekülen und Wachstumsfaktoren veranlassen. Die PPARs werden unter anderem in peripheren Blutzellen exprimiert. Da die Spiegel einiger endogener Aktivatoren der PPARs bei CF verändert zu sein scheinen, sollte in der vorliegenden Arbeit ein Einfluss auf Expression und Funktion der PPARs untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit wurden Patienten mit CF untersucht, die sich in einem stabilen Zustand befanden und im Rahmen von Routineuntersuchungen in die Klinik kamen. Da die CF-Patienten in unserer Klinik nicht bronchoskopiert werden, konnte kein Versuchsmaterial aus den Atemwegen gewonnen werden. Dennoch gehen wir aufgrund der erhöhten Entzündungsmarker im Blut der CF-Patienten davon aus, dass die Entzündungsreaktionen nicht auf den Respirationstrakt beschränkt sind. Auch in unserer Studie zeigten sich erhöhte IL-8 Spiegel im Plasma von Patienten mit CF. Dies unterstützt die Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen und weist auf systemische proinflammatorische Vorgänge hin. Das Blut wurde über Venenpunktion erhalten. Monozyten, Lymphozyten und neutrophile Granulozyten wurden isoliert und untersucht, da sie aufgrund der Freisetzung von Zytokinen, Chemokinen und durch die Produktion von Antikörpern, wichtige Mediatoren in der Immunantwort sind. Die PPAR mRNA Expression wurde in Monozyten und Lymphozyten mittels RT-kompetitiver Multiplex PCR gemessen und mittels RT-Real-time PCR in neutrophilen Granulozyten. Die PPARgamma Spiegel in diesen Zellen lagen unterhalb der Nachweisgrenze. Die statistische Analyse zeigte dass in Lymphozyten von CF-Patienten gegenüber Gesunden PPARalpha mRNA, aber nicht PPARbeta mRNA, signifikant erniedrigt exprimiert wird (-37%). Die gleiche Differenz konnte auf Proteinebene mit Hilfe von Western Blots detektiert werden. Hinsichtlich der Expression von PPARalpha und PPARbeta zeigten sich in Monozyten und Neutrophilen zwischen CF-Patienten und Gesunden keine signifikanten Unterschiede. Unseren Daten werden von verschiedenen Studien unterstützt. Zum ersten gibt es Hinweise, dass PPARalpha mRNA- und Protein-Expression von ihren eigenen Liganden direkt reguliert werden. Bei Patienten mit CF zeigen sich für die natürlichen Liganden, Eicosanoide und Fettsäuren, veränderte Spiegel, was zu einer verringerten Expression von PPARalpha beitragen könnte. Zum zweiten, da bekannt ist, dass die PPARalpha-Expression in proinflammatorisch aktivierten T-Lymphozyten herunterreguliert ist, wurde zusätzlich überprüft, ob die Lymphozyten von CF-Patienten aktiviert sind. Interleukin-2 Rezeptor im Serum (sIL-2 R) ist ein allgemein anerkannter Marker der Aktivierung von Lymphozyten. Tatsächlich zeigte sich, dass die Konzentration von sIL-2 R im Serum der vorliegenden CF Patienten erhöht ist, was mit den Erkenntnissen anderer Arbeitsgruppen übereinstimmt 128-130. Die verstärkte Aktivierung von Lymphozyten in CF-Patienten könnte eine Erklärung für die erniedrigten PPARalpha-Spiegel bieten. Der verantwortliche Mechanismus dafür ist bis jetzt noch nicht bekannt. Drittens wurde für die proinflammatorischen Zytokine IL-6, TNF-alpha und IL-1 gezeigt, dass sie eine Reduktion der PPARalpha Expression verursachen können. CF-Patienten zeigen erhöhte Spiegel von IL-2, TNF-alpha, IL-6 und IL-8 im Sputum und Serum. Konsequenterweise kann die PPARalpha Expression durch die erhöhten Zytokinspiegel im Serum herunter reguliert werden. Eine weitere Unterstützung der vorliegenden Ergebnisse ergibt sich aus einem Kongressbeitrag von Andersson et al., die über eine epitheliale CF-Zelllinie berichten, die weniger PPARalpha-Protein exprimiert als eine normale epitheliale Zelllinie. Dieselbe Forschungsgruppe fand erniedrigte PPARgamma-Spiegel im CF-Maus-Modell in Geweben, die speziell durch CFTR reguliert werden und ihre Daten weisen darauf hin, dass CFTR eine Rolle bei der PPAR Expression spielen kann. Ein funktionales CFTR-Protein wird auch in Lymphozyten von Gesunden exprimiert. Folglich könnte ein defektes CFTR auch in CF-Lymphozyten für die veränderterte PPARalpha-Expression verantwortlich sein. Ob die beschriebene Veränderung der Menge an PPARalpha mRNA und Protein auch auf funktioneller Ebene zum Tragen kommt, wurde durch immunhistometrische Untersuchungen und die Bestimmung der DNA-Bindungsaktivität des Transkriptionsfaktors überprüft. Die immunhistometrischen Untersuchungen zeigten, dass PPARalpha sowohl bei Gesunden als auch bei CF-Patienten hauptsächlich im Cytosol lokalisiert ist und dass sich nur ein kleiner Teil im Nukleus befindet. Eine Quantifizierung war hierbei nicht möglich. Über eine ähnliche zelluläre Verteilung wurde in humanen Makrophagen wie auch in Mäuselymphozyten berichtet. Die DNA-Bindungstudien zeigten, dass die PPARalpha DNA-Bindungsaktivität in Lymphozyten von CF-Patienten gegenüber Kontrollpersonen um 36% signifikant erniedrigt war. Eine erniedrigte DNA-Bindungsaktivität bei CFTR knock-out Mäuse wurde auch für PPARgamma berichtet. Die Bindungsaktivität konnte wiederhergestellt werden, nachdem die Mäuse mit Troglitazon, einem PPARgamma Agonist, behandelt wurden. Darüber hinaus werden mit hoher Wahrscheinlichkeit auch die Veränderungen des Eicosanoidhaushalts bei CF zu der Verminderung sowohl der Expression als auch der Aktivität von PPARalpha beitragen. Hier ist besonders die bei CF verminderter Menge des PPARalpha–Liganden DHA hervorzuheben. Eine ligandeninduzierte Aktivierung von PPARalpha führt zu einer Abnahme verschiedener proinflammatorische Zytokine in Lymphozyten. Dies geschieht vermutlich über eine Antagonisierung der Aktivität von NF-kappaB. PPARalpha hat einen signifikanten Einfluss auf die Immunantwort. Somit könnte die bei CF-Patienten verminderte PPARalpha-Expression und -Funktion ursächlich oder mitverantwortlich für die inflammatorischen Vorgänge bei CF sein. Die vorliegenden Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Regulierung der Aktivität von PPARalpha durch die Zugabe von DHA oder andere Liganden eine sinnvolle Therapieoption sein kann. Es sollte in weiterführenden Versuchen geklärt werden, ob eine Therapie mit PPARalpha-Aktivatoren einen Einfluss auf die inflammatorischen Vorgänge bei CF haben kann. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht ob CF einen Defekt in der Expression von 15-Lipoxygenase-1 (15-LO-1) verursacht. 15-LO-1 ist ein Schlüsselenzym für die Synthese einiger Eicosanoide wie z.B. 15(S)-HETE und Lipoxin A4. Beide Eicosanoide spielen eine wichtige Rolle in inflammatorischen Vorgängen in der menschlichen Lunge. 15(S)-HETE ist ein von der Arachidonsäure abgeleitetes Eicosanoid, das sich in hoher Konzentration in eosinophilen Granulozyten und Atemwegsepithelien findet. 15(S)-HETE wirkt in den Atemwegen stark mukosekretolytisch und bronchokonstriktorisch. Zum anderen inhibiert 15(S)-HETE die durch die 5-Lipoxygenase katalysierte Konversion von Arachidonsäure zu proinflammatorischen Mediatoren wie LTB4 in neutrophilen Granulozyten. Dies führt zu einer Reduktion der neutrophilen Chemotaxis. Es liegen bisher keine Daten zu 15-HETE-Spiegel in der CF-Lunge vor. Lipoxin A4 verursacht ebenfalls eine Reduktion der Chemotaxis von neutrophilen Granulozyten, supprimiert darüber hinaus aber schon deren Aktivierung. Neben einer direkten Wirkung auf die neutrophilen Granulozyten, sind dabei auch indirekte Effekte beteiligt, wie zum Beispiel die Reduktion der broncho-epithelialen Ausschüttung von IL-8, als einem potenten Chemoattraktor und Aktivator neutrophiler Granulozyten. Tatsächlich ist die Konzentration des anti-inflammatorisch wirksamen LXA4 in der Atemwegsflüssigkeit von CF-Patienten reduziert. Die Expression von15-LO-1 in peripheren Blutzellen ist im Wesentlichen auf die eosinophilen Granulozyten beschränkt. Deren Mukoviszidose oder zystische Fibrose (CF) ist die häufigste autosomal-rezessiv Erbkrankheit in der westlichen Welt. Sie wird durch Mutationen in einem Gen verursacht, das den „Cystic Fibrosis Transmembran Conductance Regulator“ (CFTR) kodiert. Das CFTR-Protein ist zum einen ein epithelialer Chloridkanal, zum anderen aber auch ein Regulator zahlreicher anderer epithelialer Ionenkanäle und Transporter. Der Ausfall des CFTR-Proteins verursacht eine Multiorganerkrankung, bei der vorwiegend sekretorische Funktionen beeinträchtigt sind. Besonders betroffen sind Lunge und Pankreas, wobei die Beteiligung der Lunge maßgeblich für die Ausprägung der Erkrankung und deren Letalität ist. Die Mehrzahl der Patienten leidet unter rezidivierenden bronchopulmonalen Infektionen und einer exzessiven pulmonalen Inflammation. Einen wesentlichen Beitrag zur Zerstörung der Lunge liefern dabei jedoch körpereigene neutrophile Granulozyten, die in großer Zahl in die Lunge eindringen, ohne jedoch den Erreger beseitigen zu können. Neuere Studien lassen darauf schließen, dass neben den neutrophilen Granulozyten auch Lymphozyten eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Erkrankung spielen. Entzündungsmarker wie Zytokine und Eicosanoide sind nicht nur lokal in den Atemwegen erhöht, sondern auch systemisch, was auf einen generalisierten Entzündungsstatus hinweist. Die Ursache der gestörten Immunantwort bei CF sind immer noch unbekannt und erfordern weitere Untersuchungen. Das Ziel unserer Studien war die vergleichende Untersuchung der Expression und Aktivität der Peroxisom Proliferator-Aktivierten Rezeptoren (PPARs) sowie der 15-Lipoxygenase-1, einem Schlüsselenzym im Eicosanoidstoffwechsel, zwischen Patienten mit CF und gesunden Probanden. Da bekannt ist, dass PPARs sowie die 15-LO-1 in entzündlichen Prozessen regulatorische Funktionen besitzen, und man zudem annimmt, dass CF auf eine übermäßige Immunreaktion zurückzuführen ist, vermuten wir für PPARs bzw. 15-LO-1 ein verändertes Expressionsmuster. Eicosanoide sind wichtige Mediatoren und Modulatoren der inflammatorischen Antwort. Sie sind Derivate mehrfach ungesättigter Fettsäuren. Eine wichtige Rolle spielen sie bei der Thrombozytenaggregation, Kontraktion der glatten Muskulatur, Chemotaxis der Leukozyten, Zytokinproduktion, Schmerzübertragung sowie der Entstehung von Fieber. Einige Eicosanoide verursachen proinflammatorische, andere antiinflammatorische Aktionen, wiederum andere können beides verursachen. Arachidonsäure (AA), eine n-6 mehrfach ungesättigte Fettsäure (PUFA), ist der Vorläufer für potente proinflammatorische Eicosanoide wie Prostaglandin E-2, Thromboxan A2 und Leukotrien B4 und ist in der Phospholipidschicht der Zellmembran gebunden. n-3 PUFA’s wie Docosahexaenoicsäure (DHA) und Eicosapentaensäure werden zu Eicosanoiden wie Prostaglandin E-3, Thromboxan A3 und Leukotrien B5 metabolisiert. DHA besitzt antiinflammatorische Eigenschaften, indem es mit AA um die Aufnahme/Verbindung in die Zellmembran konkurriert, dabei werden die AA Spiegel herunterreguliert. Veränderungen beim Stoffwechsel der Fettsäuren und Eisosanoide wurden bei CF-Patienten von verschiedenen Gruppen beschrieben. Zusätzlich zu dem erhöhten Spiegel proinflammatorischer Leukotriene in Atemwegen, Urin und Serum, wurden erniedrigte Spiegel von DHA im Plasma und übermäßige Freisetzung von AA aus der Zellmembran für CF beschrieben. Desweiteren wurden erhöhte Mengen membrangebundener AA und erniedrigte Mengen membrangebundener DHA in den von CF betroffenen Organen beschrieben. Veränderungen des Fettsäure-Haushalts sind von besonderem Interesse, weil sie die bei CF vorliegender Fehlregulation inflammatorischer Prozesse erklären könnten. Sie sind auch natürliche Liganden von Peroxisom Proliferator-Aktivierten Rezeptoren und darüber hinaus an der Regulation von Entzündungsprozessen beteiligt. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind drei unterschiedliche PPAR-Isoformen identifiziert, PPAR alpha, bera und gamma. Sie sind Transkriptionsfaktoren, die zu der Superfamilie der nukleäreren Rezeptoren gehören, und werden durch endogene Liganden wie Fettsäuren und Eicosanoide aktiviert. Es wurde gezeigt, dass PPARalpha und –gamma antiinflammatorische Aktivität besitzen, die auf Monozyten, Makrophagen, Lymphozyten, glatte Muskelzellen und Endothellzellen wirkt. Ein Modell dazu ist eine durch PPARalpha und -gamma vermittelte Hemmung der proinflammatorischen Eigenschaften des nuklearen Faktor-kappaB (NF-kappaB) und des aktivierenden Proteins-1 (AP-1). Beides sind Transkriptionsfaktoren, die eine Schlüsselrolle bei der inflammatorischen Antwort spielen, indem sie die Expression von Zytokinen, Chemokinen, Zelladhäsionsmolekülen und Wachstumsfaktoren veranlassen. Die PPARs werden unter anderem in peripheren Blutzellen exprimiert. Da die Spiegel einiger endogener Aktivatoren der PPARs bei CF verändert zu sein scheinen, sollte in der vorliegenden Arbeit ein Einfluss auf Expression und Funktion der PPARs untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit wurden Patienten mit CF untersucht, die sich in einem stabilen Zustand befanden und im Rahmen von Routineuntersuchungen in die Klinik kamen. Da die CF-Patienten in unserer Klinik nicht bronchoskopiert werden, konnte kein Versuchsmaterial aus den Atemwegen gewonnen werden. Dennoch gehen wir aufgrund der erhöhten Entzündungsmarker im Blut der CF-Patienten davon aus, dass die Entzündungsreaktionen nicht auf den Respirationstrakt beschränkt sind. Auch in unserer Studie zeigten sich erhöhte IL-8 Spiegel im Plasma von Patienten mit CF. Dies unterstützt die Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen und weist auf systemische proinflammatorische Vorgänge hin. Das Blut wurde über Venenpunktion erhalten. Monozyten, Lymphozyten und neutrophile Granulozyten wurden isoliert und untersucht, da sie aufgrund der Freisetzung von Zytokinen, Chemokinen und durch die Produktion von Antikörpern, wichtige Mediatoren in der Immunantwort sind. Die PPAR mRNA Expression wurde in Monozyten und Lymphozyten mittels RT-kompetitiver Multiplex PCR gemessen und mittels RT-Real-time PCR in neutrophilen Granulozyten. Die PPARgamma Spiegel in diesen Zellen lagen unterhalb der Nachweisgrenze. Die statistische Analyse zeigte dass in Lymphozyten von CF-Patienten gegenüber Gesunden PPARalpha mRNA, aber nicht PPARbeta mRNA, signifikant erniedrigt exprimiert wird (-37%). Die gleiche Differenz konnte auf Proteinebene mit Hilfe von Western Blots detektiert werden. Hinsichtlich der Expression von PPARalpha und PPARbeta zeigten sich in Monozyten und Neutrophilen zwischen CF-Patienten und Gesunden keine signifikanten Unterschiede. Unseren Daten werden von verschiedenen Studien unterstützt. Zum ersten gibt es Hinweise, dass PPARalpha mRNA- und Protein-Expression von ihren eigenen Liganden direkt reguliert werden. Bei Patienten mit CF zeigen sich für die natürlichen Liganden, Eicosanoide und Fettsäuren, veränderte Spiegel, wass zu einer verringerte Expression von PPARalpha beitragen könnte. Zum zweiten, da bekannt ist, dass die PPARalpha-Expression in proinflammatorisch aktivierten T-Lymphozyten herunterreguliert ist, wurde zusätzlich überprüft, ob die Lymphozyten von CF-Patienten aktiviert sind. Interleukin-2 Rezeptor im Serum (sIL-2 R) ist ein allgemein anerkannter Marker der Aktivierung von Lymphozyten. Tatsächlich zeigte sich, dass die Konzentration von sIL-2 R im Serum der vorliegenden CF Patienten erhöht ist, was mit den Erkenntnissen anderer Arbeitsgruppen übereinstimmt 128-130. Die verstärkte Aktivierung von Lymphozyten in CF-Patienten könnte eine Erklärung für die erniedrigten PPARalpha-Spiegel bieten. Der verantwortliche Mechanismus dafür ist bis jetzt noch nicht bekannt. Drittens wurde für die proinflammatorischen Zytokine IL-6, TNF-alpha und IL-1 gezeigt, dass sie eine Reduktion der PPARalpha Expression verursachen können. CF-Patienten zeigen erhöhte Spiegel von IL-2, TNF-alpha, IL-6 und IL-8 im Sputum und Serum. Konsequenterweise kann die PPARalpha Expression durch die erhöhten Zytokinspiegel im Serum herunter reguliert werden. Eine weitere Unterstützung der vorliegenden Ergebnisse ergibt sich aus einem Kongressbeitrag von Andersson et al., die über eine epitheliale CF-Zelllinie berichten, die weniger PPARalpha-Protein exprimiert als eine normale epitheliale Zelllinie. Dieselbe Forschungsgruppe fand erniedrigte PPARgamma-Spiegel im CF-Maus-Modell in Geweben, die speziell durch CFTR reguliert werden und ihre Daten weisen darauf hin, dass CFTR eine Rolle bei der PPAR Expression spielen kann. Ein funktionales CFTR-Protein wird auch in Lymphozyten von Gesunden exprimiert. Folglich könnte ein defektes CFTR auch in CF-Lymphozyten für die veränderterte PPARalpha-Expression verantwortlich sein. Ob die beschriebene Veränderung der Menge an PPARalpha mRNA und Protein auch auf funktioneller Ebene zum Tragen kommt, wurde durch immunhistometrische Untersuchungen und die Bestimmung der DNA-Bindungsaktivität des Transkriptionsfaktors überprüft. Die immunhistometrischen Untersuchungen zeigten, dass PPARalpha sowohl bei Gesunden als auch bei CF-Patienten hauptsächlich im Cytosol lokalisiert ist und dass sich nur ein kleiner Teil im Nukleus befindet. Eine Quantifizierung war hierbei nicht möglich. Über eine ähnliche zelluläre Verteilung wurde in humanen Makrophagen wie auch in Mäuselymphozyten berichtet. Die DNA-Bindungstudien zeigten, dass die PPARalpha DNA-Bindungsaktivität in Lymphozyten von CF-Patienten gegenüber Kontrollpersonen um 36% signifikant erniedrigt war. Eine erniedrigte DNA-Bindungsaktivität bei CFTR knock-out Mäuse wurde auch für PPARgamma berichtet. Die Bindungsaktivität konnte wiederhergestellt werden, nachdem die Mäuse mit Troglitazon, einem PPARgamma Agonist, behandelt wurden. Darüber hinaus werden mit hoher Wahrscheinlichkeit auch die Veränderungen des Eicosanoidhaushalts bei CF zu der Verminderung sowohl der Expression als auch der Aktivität von PPARalpha beitragen. Hier ist besonders die bei CF verminderter Menge des PPARalpha–Liganden DHA hervorzuheben. Eine ligandeninduzierte Aktivierung von PPARalpha führt zu einer Abnahme verschiedener proinflammatorische Zytokine in Lymphozyten. Dies geschieht vermutlich über eine Antagonisierung der Aktivität von NF-kappaB. PPARalpha hat einen signifikanten Einfluss auf die Immunantwort. Somit könnte die bei CF-Patienten verminderte PPARalpha-Expression und -Funktion ursächlich oder mitverantwortlich für die inflammatorischen Vorgänge bei CF sein. Die vorliegenden Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Regulierung der Aktivität von PPARalpha durch die Zugabe von DHA oder andere Liganden eine sinnvolle Therapieoption sein kann. Es sollte in weiterführenden Versuchen geklärt werden, ob eine Therapie mit PPARalpha-Aktivatoren einen Einfluss auf die inflammatorischen Vorgänge bei CF haben kann. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht ob CF einen Defekt in der Expression von 15-Lipoxygenase-1 (15-LO-1) verursacht. 15-LO-1 ist ein Schlüsselenzym für die Synthese einiger Eicosanoide wie z.B. 15(S)-HETE und Lipoxin A4. Beide Eicosanoide spielen eine wichtige Rolle in inflammatorischen Vorgängen in der menschlichen Lunge. 15(S)-HETE ist ein von der Arachidonsäure abgeleitetes Eicosanoid, das sich in hoher Konzentration in eosinophilen Granulozyten und Atemwegsepithelien findet. 15(S)-HETE wirkt in den Atemwegen stark mukosekretolytisch und bronchokonstriktorisch. Zum anderen inhibiert 15(S)-HETE die durch die 5-Lipoxygenase katalysierte Konversion von Arachidonsäure zu proinflammatorischen Mediatoren wie LTB4 in neutrophilen Granulozyten. Dies führt zu einer Reduktion der neutrophilen Chemotaxis. Es liegen bisher keine Daten zu 15-HETE-Spiegel in der CF-Lunge vor. Lipoxin A4 verursacht ebenfalls eine Reduktion der Chemotaxis von neutrophilen Granulozyten, supprimiert darüber hinaus aber schon deren Aktivierung. Neben einer direkten Wirkung auf die neutrophilen Granulozyten, sind dabei auch indirekte Effekte beteiligt, wie zum Beispiel die Reduktion der broncho-epithelialen Ausschüttung von IL-8, als einem potenten Chemoattraktor und Aktivator neutrophiler Granulozyten. Tatsächlich ist die Konzentration des anti-inflammatorisch wirksamen LXA4 in der Atemwegsflüssigkeit von CF-Patienten reduziert. Die Expression von15-LO-1 in peripheren Blutzellen ist im Wesentlichen auf die eosinophilen Granulozyten beschränkt. Deren Funktion ist bei der zystischen Fibrose ebenfalls verändert: in CF Serum und Sputum misst man erhöhte Spiegel an eosinophilen granulären Proteinen, obwohl die Anzahl der Eosinophilen normal ist. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob im Rahmen der zystischen Fibrose Veränderungen der Expression der 15-LO vorliegen. Durchflusszytometrische Untersuchungen zeigten nach der statistischen Auswertung, dass die intrazelluläre Expression der 15-LO-1 in eosinophilen Granulozyten von CF-Patienten und gesunden Kontrollpersonen keine Unterschiede aufweist. Dies schliesst nicht aus, dass Unterschiede der 15-LO-1 Expression zwischen CF-Patienten und gesunden Kontrollpersonen im Atemwegsepithel zu finden wären, weil, eine erhöhte Expression der 15-LO-1 bei chronischer Bronchitis und Asthma bronchiale wurde beschrieben. Patientenmaterial für das Atemwegsepithel war jedoch nicht zugänglich und wurde von daher nicht untersucht.Funktion ist bei der zystischen Fibrose ebenfalls verändert: in CF Serum und Sputum misst man erhöhte Spiegel an eosinophilen granulären Proteinen, obwohl die Anzahl der Eosinophilen normal ist. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob im Rahmen der zystischen Fibrose Veränderungen der Expression der 15-LO vorliegen. Durchflusszytometrische Untersuchungen zeigten nach der statistischen Auswertung, dass die intrazelluläre Expression der 15-LO-1 in eosinophilen Granulozyten von CF-Patienten und gesunden Kontrollpersonen keine Unterschiede aufweist. Dies schliesst nicht aus, dass Unterschiede der 15-LO-1 Expression zwischen CF-Patienten und gesunden Kontrollpersonen im Atemwegsepithel zu finden wären, weil, eine erhöhte Expression der 15-LO-1 bei chronischer Bronchitis und Asthma bronchiale wurde beschrieben. Patientenmaterial für das Atemwegsepithel war jedoch nicht zugänglich und wurde von daher nicht untersucht.
Leukämien sind maligne Erkrankungen des hämatopoietischen Systems, die teilweise mit einer sehr schlechten Prognose einhergehen. Die Phänotypen sowie die verursachenden Mutationen in den hämatopoietischen Vorläuferzellen sind vielfältig. 5-10 % aller Akuten Leukämien korrelieren mit genetischen Veränderungen des MLLGens auf Chromosom 11q23. Besonders häufig findet man reziproke, chromosomale Translokationen. Leukämien mit diesen Mutationen zählen fast ausschließlich zu den Hochrisiko-Leukämien, wobei der Partner des MLL-Gens Einfluss auf den Verlauf der Erkrankung hat. Bisher sind 43 Translokationspartner des MLL-Gens bekannt, von denen jedoch in der Routinediagnostik nur die 6 häufigsten, MLLT2, MLLT1, MLLT3, MLLT4, ELL und MLLT10 untersucht werden. Seltene oder unbekannte Partnergene werden von den Analysen ausgenommen. Da das Partnergen aber wichtig für die Risikoeinstufung der Erkrankung ist, ist es notwendig, dieses rasch zu identifizieren, um ein optimales Therapieprotokoll anwenden zu können. Aus diesem Grund wurde eine universelle, PCR-Methode entwickelt und etabliert, die es erlaubt, jede MLL-Translokation, auch ohne vorherige Kenntnis des Partnergens, zu identifizieren. Mit Hilfe dieser Methode ist es möglich, sowohl das Partnergen, als auch den chromosomalen Bruchpunkt basengenau auf DNA-Ebene zu analysieren. Mit dieser Technik sind im Verlauf der Studie 501 Patienten untersucht worden (319 Kinder, 179 Erwachsene, 3 ohne Altersangabe). Bei diesen Analysen wurden 9 neue Partnergene entdeckt: ACACA, SELB, SMAP1, TIRAP, ARHGEF17, BCL9L, KIAA0284, MAML2 und APBB1IP. Für alle positiven Patientenproben sind außer den Partnergenen auch die basengenauen Bruchpunkte kartiert worden. Die Kenntnis des Patienten-spezifischen Bruchpunktes erlaubt eine exakte Quantifizierung der Blastenlast mittels qPCR und ermöglicht somit ein empfindliches Monitoring des Krankheitsverlaufs unter Therapie und die Detektion einer minimalen Resterkrankung (MRD).
Zytolysin A (ClyA) von Escherichia coli ist der Prototyp einer neuartigen Familie von bakteriellen porenbildenden Zytolysinen. Es handelt sich bei diesem Toxin um ein Protein von 34 kDa, das hämolytische und zytotoxische Aktivität aufweist und das in Zellmembranen stabile Poren bildet, indem es sich zu ringförmigen ClyA-Oligomeren zusammenlagert. Das Strukturgen des ClyA-Proteins, clyA, wurde ursprünglich im Chromosom des E. coli-Laborstammes K-12 identifiziert, später wurde es aber auch im Genom von vielen E. coli-Stämmen gefunden, die intestinale Infektionen beim Menschen verursachen (insbesondere in enteroinvasiven, Shigatoxin-produzierenden, enteroaggregativen und enterotoxischen E. coli-Stämmen). Die Expression des clyA-Gens unterliegt einer komplexen Regulation; unter normalen in vitro-Kulturbedingungen ist das clyA-Gen in E. coli stark reprimiert. In mehreren Salmonella enterica Serovar Typhi-Stämmen und in einem S. enterica Serovar Paratyphi A-Stamm (ATCC 9150) wurden kürzlich funktionale (intakte) clyA-homologe Gene gefunden, deren Proteinprodukte 90-91% Aminosäuresequenzidentität zu ClyA von E. coli aufweisen. Im Genom eines aviären (vogelpathogenen) E. coli-Stammes wurde ein intaktes clyA-homologes Hämolysingen identifiziert, dessen Proteinprodukt ca. 75% Identität zu ClyA von E. coli K-12 und anderen E. coli-Stämmen zeigt. Auch in mehreren Shigella flexneri-Stämmen sowie in einem Shigella sonnei- und einem Shigella dysenteriae-Stamm wurden clyA-homologe DNA-Sequenzen nachgewiesen. Alle bisher untersuchten Shigella-Stämme enthalten jedoch nur ein defektes clyA-Gen: in den untersuchten Sh. flexneri-Stämmen weist das clyA-Gen eine identische 11 bp-Deletion auf, welche aufgrund der entsprechenden Leserasterverschiebung zu einem vorzeitigen Abbruch der kodierenden Sequenz führt; in dem untersuchten Sh. sonnei-Stamm ST3112/01 ist das clyA-Gen durch ein Insertionselement (IS1 von Sh. sonnei) unterbrochen; und in dem untersuchten Sh. dysenteriae-Stamm ist ein großer Teil des clyA-Gens deletiert und durch ein IS-Element (iso-IS1 von Sh. dysenteriae) ersetzt. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden zwei weitere Sh. sonnei-Stämme, ein weiterer S. enterica Serovar Paratyphi A-Stamm sowie verschiedene andere Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae hinsichtlich des Vorhandenseins von clyA bzw. von clyA-homologen DNA-Sequenzen untersucht. Aus den beiden Sh. sonnei-Stämmen ST2757/01 und ST3135/01 und aus dem S. enterica Serovar Paratyphi A-Stamm FR1/99 konnten durch PCR clyA-spezifische DNA-Fragmente amplifiziert werden. Die Sequenzierung des clyA-spezifischen PCR-Produktes von S. enterica Serovar Paratyphi A FR1/99 zeigte, dass dieser Stamm ein intaktes clyA-Gen enthält, welches einschließlich der flankierenden DNA-Sequenzen 100% Nukleotidsequenzidentität zum clyA-Gen des Serovar Paratyphi A-Stammes ATCC 9150 aufweist. Um die Promotorregion dieses clyA-Gens (clyAS. enterica Serovar ParatyphiA) einzugrenzen, wurde es mit unterschiedlich langen 5'-flankierenden DNA-Sequenzen amplifiziert und in den Plasmidvektor pUC18 kloniert. Plasmidkonstrukte, die stromaufwärts vom clyAS. enterica Serovar ParatyphiA-Gen die ersten 102 bzw. 128 5'-flankierenden Basenpaare enthielten, führten nach Transformation in einen E. coli-Laborstamm (E. coli K-12-Derivat DH5a) zu einem ähnlich starken hämolytischen Phänotyp, während ein isogenes Plasmidkonstrukt mit 471 bp 5'-flankierender DNA-Sequenz deutlich schwächere hämolytische Aktivität vermittelte. Innerhalb der ersten 102 bp stromaufwärts vom clyAS.enterica Serovar ParatyphiA -Startcodon scheinen demnach regulatorische Sequenzen zu liegen, die die Expression dieses Gens gestatten, während DNA-Sequenzen, die mehr als 128 bp vor dem ATG-Startcodon liegen, die Expression anscheinend eher behindern. Die von Sh. sonnei ST2757/01 und Sh. sonnei ST3135/01 erhaltenen clyA-spezifischen PCRProdukte zeigten identische Größen; es wurde deshalb nur mit einem der beiden Stämme (ST2757/01) weitergearbeitet. Eine DNA-Sequenzanalyse ergab, dass Sh. sonnei ST2757/01 ein clyA-Gen enthält, welches an zwei Stellen (zwischen Nukleotidposition 80 und 81 und zwischen Nukleotidposition 354 und 355 von clyA) durch IS1 von Sh. sonnei unterbrochen ist. Die hintere der beiden IS1-Insertionen war dabei identisch mit der IS1-Insertion, die im clyA-Gen des bereits früher untersuchten Sh. sonnei-Stammes (ST3112/01) nachgewiesen worden war. Aus Stämmen der Species Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter gillenii, Citrobacter murliniae, Citrobacter braakii, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Hafnia alvei, Yersinia enterocolitica, Proteus mirabilis und Morganella morganii konnten durch PCR keine clyA-homologen DNA-Sequenzen amplifiziert werden. Da auch in Southern Blot-Analysen mit einer clyA-spezifischen, 712 bp großen Gensonde keiner dieser Stämme eine signifikant positive Reaktion zeigte, wurde gefolgert, dass diese Stämme kein clyA-Gen und keine clyA-ähnlichen Sequenzen besitzen. Es spricht somit einiges dafür, dass das Zytolysingen clyA innerhalb der Familie der Enterobacteriaceae nur in den Gattungen Escherichia, Salmonella und Shigella vorkommt.
Analyse von Heuristiken
(2006)
Heuristiken treten insbesondere im Zusammenhang mit Optimierungsproblemen in Erscheinung, bei solchen Problemen also, bei denen nicht nur eine Lösung zu finden ist, sondern unter mehreren möglichen Lösungen eine in einem objektiven Sinne beste Lösung ausfindig gemacht werden soll. Beim Problem kürzester Superstrings werden Heuristiken herangezogen, da mit exakten Algorithmen in Anbetracht der APX-Vollständigkeit des Problems nicht zu rechnen ist. Gegeben ist eine Menge S von Strings. Gesucht ist ein String s, so dass jeder String aus S Teilstring von s ist. Die Länge von s ist dabei zu minimieren. Die prominenteste Heuristik für das Problem kürzester Superstrings ist die Greedy-Heuristik, deren Approximationsfaktor derzeit jedoch nur unzureichend beschränkt werden kann. Es wird vermutet (die sogenannte Greedy-Conjecture), dass der Approximationsfaktor genau 2 beträgt, bewiesen werden kann aber nur, dass er nicht unter 2 und nicht über 3,5 liegt. Die Greedy-Conjecture ist das zentrale Thema des zweiten Kapitels. Die erzielten Ergebnisse sind im Wesentlichen: * Durch die Betrachtung von Greedyordnungen können bedingte lineare Ungleichungen nutzbar gemacht werden. Dieser Ansatz ermöglicht den Einsatz linearer Programmierung zum Auffinden interessanter Instanzen und eine Vertiefung des Verständnisses solcher schwerer Instanzen. Dieser Ansatz wird eingeführt und eine Interpretation des dualen Problems wird dargestellt. * Für die nichttriviale, große Teilklasse der bilinearen Greedyordnungen wird gezeigt, dass die Länge des von der Greedy-Heuristik gefundenen Superstrings und die des optimalen Superstrings sich höchstens um die Größe einer optimalen Kreisüberdeckung der Strings unterscheiden. Da eine optimale Kreisüberdeckung einer Menge von Strings stets höchstens so groß ist wie ein optimaler Superstring (man schließe einen Superstring zu einem einzelnen Kreis), ist das erzielte Ergebnis für die betrachtete Teilklasse der Greedyordnungen stärker als die klassische Greedy-Conjecture. * Es wird eine neue bedingte lineare Ungleichung auf Strings -- die Tripelungleichung -- gezeigt, die für das eben genannte Hauptergebnis wesentlich ist. * Schließlich wird gezeigt, dass die zum Nachweis der oberen Schranke von 3,5 für den Approximationsfaktor herangezogenen bedingten Ungleichungen (etwa die Monge-Ungleichung) inhärent zu schwach sind, um die Greedy-Conjecture selbst für lineare Greedyordnungen zu beweisen. Also ist die neue Tripelungleichung auch notwendig. Zuletzt wird gezeigt, dass das um die Tripelungleichung erweiterte System bedingter linearer Ungleichungen inhärent zu schwach ist, um die klassische Greedy-Conjecture für beliebige Greedyordnungen zu beweisen. Mit der Analyse von Queueing Strategien im Adversarial Queueing Modell wird auch ein Fall betrachtet, in dem Heuristiken auf Grund von anwendungsspezifischen Forderungen wie Online-Setup und Lokalität eingesetzt werden. Pakete sollen in einem Netzwerk verschickt werden, wobei jeder Rechner nur begrenzte Information über den Zustand des Netzwerks hat. Es werden Klassen von Queueing Strategien untersucht und insbesondere untersucht, wovon Queueing Strategien ihre lokalen Entscheidungen abhängig machen sollten, um ein gewisses Qualitätsmerkmal zu erreichen. Die hier erzielten Ergebnisse sind: * Jede Queueing Strategie, die ohne Zeitstempel arbeitet, kann zu einer exponentiell großen Queue und damit zu exponentiell großer Verzögerung (im Durchmesser und der Knotenzahl des Netzwerks) gezwungen werden. Dies war bisher nur für konkrete prominente Strategien bekannt. * Es wird eine neue Technik zur Feststellung der Stabilität von Queueing Strategien ohne Zeitnahme vorgestellt, die Aufschichtungskreise. Mit ihrer Hilfe können bekannte Stabilitätsbeweise prominenter Strategien vereinheitlicht werden und weitere Stabilitätsergebnisse erzielt werden. * Für die große Teilklasse distanzbasierter Queueing Strategien gelingt eine vollständige Klassifizierung aller 1-stabilen und universell stabilen Strategien.
Schlusswort Ziel der Arbeit war es, mit Hilfe des gegenstandsbezogenen Ansatzes der Grounded Theory ein Modell zu entwickeln, das die konstitutiven bzw. essentiellen Momente und Dimensionen der Berufswahlberatung darzu-stellen vermag und das als Systematik für Praktiken zur der Umsetzung dienen kann. Durch die mikroanalytische Untersuchung konnten vielfältige Aktivitäten der Akteure erfasst werden, die auf spezifische Anforderungen der Berufswahlberatung und auf Kunstfertigkeiten der Professionellen schließen ließen. Die untersuchten Berufsberatungsgespräche brachten zum Vorschein, welche Schwierigkeiten ein autonomes Berufswahlentscheiden für den Heranwachsenden bedeuten kann. Diese Schwierigkeiten, aber auch die Fraktionierung des Klientels sowie der produktive Umgang mit involvierten Pädagogisch-Professionellen können als die zentralen Herausforderungen, die das Handlungsfeld Berufswahlberatung an die professionellen Berater stellt, angesehen werden. In Anbetracht der gesellschaftlichen Bedeutung von Berufswahl und der diffizilen Aufgabe, eine produktive Berufsberatung hervorzubringen, mutet die gegenwärtige begriffliche Verfremdung der Berufswahlberatung als sog. Vermittlungsgespräch abstrus und unverständlich an. Die damit zum Ausdruck kommende Missachtung des bei der Realisierung einer Berufslaufbahn zentralen Aspekts des autonomen Berufswahlentscheidens muss wohl auf die zunehmende Knappheit von adäquaten Arbeits- und Ausbildungsplätzen zurückgeführt werden, die nicht nur objektiv den Entscheidungsspielraum vieler Heranwachsenden einschränkt, sondern auch antiliberale Stimmung hervorruft. Um so wichtiger erscheint es, dass durch erziehungswissenschaftliche Forschung pädagogisch arbeitende Professionelle unterstützt werden, damit diese sich im Rahmen ihrer Spielräume autonom, d.h. entsprechend den gesellschaftlich verankerten Wertvorstellungen und Grundsätzen sowie bezogen auf die Sachhaltigkeit des jeweiligen Einzelfalls rational verhalten können. Der hier praktizierte Ansatz, systematisch auf der Grundlage der Feldforschung Anforderungen zu rekonstruieren, die die Berufswahlberatung an deren Akteure stellt, und darüber hinaus passende Praktiken zu konstruieren, könnte, so meine ich, ein gangbarer Weg dafür sein, um für die Praktiker im o.g. Sinn relevantes Wissen hervorzubringen, werden hierbei doch begriffliche Vorstellungen darüber gewonnen, welche Anforderungen bei der Durchführung einer Berufswahlberatung unter bestimmten gesellschaftlich verankerten Wertsetzungen gestellt werden und welche Mittel (Praktiken) dafür in der Praxis verwendet werden können. Auch wenn das in der Arbeit entworfene Theoretische Modell empirisch fundiert und gesättigt ist, muss doch schon aufgrund des begrenzten Korpus eingeräumt werden, dass dem Modell eher grundlegender Charakter zukommt. Offen bleibt eine weitergehende, gezielte und differenzierte Auseinandersetzung mit einzelnen Anforderungen und Praktiken der Berufswahlberatung. Dazu können weitere Forschungsanstrengungen unternommen werden, um weitere Gesprächsprotokolle zu erhalten und das Modell weiter auszudifferenzieren. Es können aber auch gedankenexperimentelle Überlegungen angestrengt werden, etwa um weitere entsprechend den Anforderungen geeignete Praktiken zu entwerfen.
Aortale Partikelfiltration zur Reduktion von neurologischen Komplikationen in der Koronarchirurgie
(2006)
Eine verminderte Neuropathogenität nach kardialen Eingriffen, die durch technischen Fortschritt erreicht werden könnte, wird durch das alternde Patientenkollektiv mit steigender Inzidenz für Arteriosklerose und erhöhtem Risiko zerebraler Komplikationen ausgeglichen. Zerebrale Dysfunktionen bleiben die häufigste Ursache für postoperative Morbidität und Mortalität. Als wichtigste Quelle partikulärer Embolien gilt die aortale Verkalkung. Der Zusammenhang zwischen partikulären Embolien und konsekutiver zerebraler Dysfunktion ist bekannt. Kritischer Zeitpunkt für die Embolisation der Gewebspartikel in das Gehirn ist die Öffnung der Aortenklemme. Es konnte gezeigt werden, dass die Platzierung eines intraaortalen Filters kurz vor Öffnung der Aortenklemme, die Inzidenz der neurologischen und neuropsychologischen Komplikationen in einer Hochrisiko-Patientengruppe reduzierte. Die vorliegende prospektiv randomisierte Studie untersuchte 50 Patienten mit niedrigem Risikoprofil, die sich im Zeitraum August 1999 bis Februar 2001 einer aortokoronaren Bypassoperation mit kardiopulmonalem Bypass, unterzogen. Bei 25 Patienten wurde der intraaortale Filter (Embol-X Inc, Mountain View, CA) eingesetzt. Zur Beurteilung der Effizienz der intraaortalen Filtration wurden neuropsychologische Untersuchungen (Mosaik-Test, Benton-Test, Zahlenverbindungs-Test, Zahlennachsprech-Test, d2-Test, Beck-Depressions-Inventar) erhoben und als laborchemisches Korrelat das S-100B-Protein und die NSE bestimmt. Die neuropsychologischen Untersuchungen wurden präoperativ, 5 Tage und 2 Monate postoperativ durchgeführt. Die Laborparameter wurden zu fünf Abnahmezeitpunkten bestimmt (vor Narkoseeinleitung, nach Beginn der extrakorporalen Zirkulation, 10 Minuten nach Öffnen der Aortenklemme, eine Stunde und 24 Stunden postoperativ) bestimmt. Die Patientengruppen zeigten hinsichtlich der demografischen und intraoperativen Daten keine statistisch signifikanten Unterschiede.Neurologische Komplikationen fanden sich in keiner der Gruppen. Die Ergebnisse der neuropsychologischen Untersuchungen zeigten im Gruppenvergleich für keinen Zeitpunkt einen signifikanten Gruppenunterschied. Die Mittelwerte des S-100B-Protein-Konzentration der Gruppe mit Filter waren zu allen Abnahmezeitpunkten niedriger als in der Gruppe ohne Filter, das Signifikanzniveau von 5% wurde nur zum Abnahmezeitpunkt nach Beginn der EKZ erreicht; es handelte sich hierbei also nicht um einen methoden-, sondern wahrscheinlich patientenbedingten Unterschied. Die Mittelwerte der NSE-Konzentration unterschieden sich im Gruppenvergleich nicht. Die Tatsache, dass sich weder aus den neuropsychologischen Untersuchungen, noch der NSE-Konzentration pathologische Werte ergaben, sehen wir im niedrigen Risikoprofil des Patientenkollektivs begründet. Bei sonst homogener Risikofaktorverteilung wurden bei 7 von 50 Patienten palpatorisch aortale Plaques oder Verkalkungen nachgewiesen (14%). Die Daten der zwei Patienten aus der Gruppe ohne Filter und der 5 Patienten aus der Gruppe mit Filter wurden gesondert ausgewertet. Trotz des erhöhten Risikos zeigte sich bezüglich der postoperativen Ergebnisse kein Unterschied. Ob dieser Risikoausgleich der intraaortalen Filtration zuzuschreiben ist, bleibt zum jetzigen Zeitpunkt eine Annahme. Zusammenfassend konnten wir in dieser Patientengruppe mit niedrigem Risikoprofil bezüglich der neurologischen und neuropsychologischen Ergebnisse keinen Behandlungsvorteil der intraaortalen Filtration feststellen. Weitere Untersuchungen von Patientengruppen mit aortaler Verkalkung oder Plaquebildung werden notwendig sein, um den Nutzen der aortalen Filtration beurteilen zu können.
Apoptose ist ein gemeinsamer Pathomechanismus vieler Autoimmunerkrankungen, so auch im Rahmen der Schilddrüsenautoimmunerkrankungen, deren häufigste Hashimoto Thyreoiditis und Morbus Basedow (Graves’ disease) darstellen. Während eine gesteigerte Apoptoserate der Schilddrüsenzellen bei Hashimoto Thyreoiditis zur Entwicklung einer Hypothyreose führt, sind es bei Morbus Basedow die infiltrierenden Lymphozyten, die durch Apoptose zu Grunde gehen, während die Schilddrüsenzellen unter dem protektiven Einfluß anti-apoptotischer Signale proliferieren können. Der zu Grunde liegende Pathomechanismus wird in der Reifung und Aktivierung des Immunsystems angenommen. Einige potentielle Ursachen sind eine insuffiziente systemische Elimination autoreaktiver Lymphozyten im Rahmen der positiven und negativen Selektion im Thymus, ein Versagen der peripheren immunological ignorance, oder eine inadäquate Aktivierung von Lymphozyten in einem pro-inflammatorischen Milieu. All diese Mechanismen können durch eine inadäquate Apoptose ausgelöst oder verstärkt werden. Die Fas/FasL-induzierte Kaskade ist einer der Haupt-Signalwege in der Apoptose-Induktion. Seine Bedeutung im Rahmen von Autoimmunerkrankungen ist vielfach untersucht, und eine Assoziation genetischer Polymorphismen in Fas und seinem Liganden wurde bereits für einige organspezifische und generalisierte Erkrankungen gezeigt (Typ I Diabetes, Multiple Sklerose, Rheumatoide Arthritis u.a.). Das genetisch vermittelte Risiko dieser Erkrankungen wird bisher vor allem der HLA DQ-Region und Polymorphismen im CTLA-4-Gen zugeschrieben. Aufgrund der funktionellen Relevanz der Fas/FasL-vermittelten Apoptose im Rahmen autoimmuner Schilddrüsenerkrankungen wurden im Rahmen dieser Arbeit Kandidatengene untersucht, die von funktioneller Relevanz für die Entstehung autoimmuner Schilddrüsenerkrankungen sind: die Apoptose-regulierenden Faktoren Fas, FasL und Bcl-2. 209 Familien kaukasischen Ursprungs mit insgesamt 730 Individuen, bei denen mindestens eines der Kinder an Hashimoto Thyreoiditis (n = 100) oder an Morbus Basedow (n = 109) erkrankt war, wurden genotypisiert auf zwei Polymorphismen des Fas-Gens (g-670 G-A in der Promotorregion, g-154 C-T in Exon 7), drei FasL Genpolymorphismen (C -843 T und EBP im Promotor, A IVS2nt-124 G in Intron 2) und einen Polymorphismus im Bcl-2-Gen. Nach Durchführung einer indirekten Haplotypisierung, Chi2- und Extended Transmission Disequilibrium-Test waren weder einzelne Fas- bzw. FasL-Polymorphismen noch kombinierte Haplotypen mit Hashimoto Thyreoiditis oder Morbus Basedow assoziiert. Bei der Analyse des Bcl-2 Polymorphismus ergab sich eine Tendenz zu einer Assoziation des G-Allels mit beiden Thyreopathien. Subgruppen-Analysen (männliche vs. weibliche Patienten, CTLA-4-Genotypen, DQ-Haplotypen) ergaben keinen weiteren Informationsgehalt, die Daten italienischer und deutscher Familien unterschieden sich ebenfalls nicht. Zusammenfassend ergeben die Daten keinen signifikanten Beitrag der untersuchten Varianten in Bcl-2, Fas oder FasL zum genetischen Risiko autoimmuner Schilddrüsenerkrankungen. Zur Entwicklung möglicher diagnostischer und therapeutischer Optionen für autoimmune Schilddrüsenerkrankungen wird die Untersuchung weiterer funktionell bedeutsamer Regulatoren der apoptotischen Signaltransduktionswege von Bedeutung sein.
1.) Zahlreiche Medikamente werden nach Einnahme nahezu unverändert wieder ausgeschieden und gelangen über Abwasser und Kläranlagen in die aquatische Umwelt. 2.) Die gemessenen Konzentrationen erscheinen gegenüber anderen Kontaminantengruppen vergleichsweise niedrig, sind jedoch angesichts der Tatsache, dass Medikamente biologisch hoch aktive Substanzen sind, besorgniserregend. Das Beispiel Ethinylöstradiol zeigt, dass bereits im ng/l-Bereich Effekte auftreten. Abgesehen vom Beispiel Ethinylöstradiol lagen bislang keine Erkenntnisse über chronische Effekte von Medikamenten bei umweltrelevanten Konzentrationen vor. 3.) Die in der Umwelt festgestellten Arzneimittelwirkstoffe werden fast ausschließlich in Ab-, Oberflächen- und Grundwasser detektiert. Angaben über Medikamentanreicherungen in Sedimenten liegen nur vereinzelt vor. 4.) Angaben über die Ökotoxizität von Medikamenten beruhen bislang fast ausschließlich auf bei sehr hohen Substanzkonzentrationen durchgeführten Akuttests. Die Übertragung auf umweltrelevante Verhältnisse erfolgte durch Einbeziehung hoher Sicherheitsfaktoren. 5.) Die vorliegende Arbeit zeigt, dass in komplexeren Tests bereits bei sehr viel niedrigeren Konzentrationen Effekte auftreten. Diese Effekte sind nicht unmittelbar toxisch, beeinträchtigen jedoch die Entwicklung und Fortpflanzung der Versuchsorganismen nachhaltig. 6.) Als Modellsubstanzen für die in Oberflächengewässern nachgewiesenen Pharmaka wurden das Antiepileptikum Carbamazepin, Clofibrinsäure als Metabolit zahlreicher Lipidsenker, das Antibiotikum Ciprofloxacin und das Antidepressivum Fluoxetin ausgewählt. Sämtliche Pharmaka werden in der Umwelt weit verbreitet nachgewiesen. 7.) Als Testorganismen dienten die Zuckmücke Chironomus riparius, die Zwergdeckelschnecke Potamopyrgus antipodarum und der aquatische Annelide Lumbriculus variegatus. C. riparius ist ein bereits standardisierter Versuchsorganismus, L. variegatus ist zur Zeit im Standardisierungsverfahren (OECD 2004B) und für ökotoxikologische Untersuchungen empfohlen (ASTM 1995). Außerdem wurde mit den Einzellern Blepharisma japonicum und Tetrahymena thermophila ein Destruentenmikrokosmos entwickelt. Beide Einzeller sind ebenfalls erprobte Versuchsorganismen (PAULI 1996, FOX & MORIN 2001). 8.) Von den vier untersuchten Pharmaka erwiesen sich im getesteten Konzentrationsbereich Carbamazepin und Fluoxetin für jeweils einen der Testorganismen als schädlich. Carbamazepin blockierte ab einer Sedimentkonzentration von 234 µg/kg Sediment (Trockengewicht) die Entwicklung von C. riparius. Fluoxetin führte ab einer Testkonzentration von 2 µg/l zu einer Reduzierung der Embryonenzahl bei P. antipodarum. Die EC10 für Carbamazepin wurde zu 113 µg/kg Sediment berechnet, die EC10 für Fluoxetin zu 0,81 µg/l. Beide Konzentrationen sind bei Berücksichtigung der im TGD vorgesehenen Sicherheitsfaktoren umweltrelevant (PEC/PNEC > 1). Als Grundlage dieser Berechnung dienten gemessene Umweltkonzentrationen im Sediment beziehungsweise Wasser. Ein negativer Effekt von Ciprofloxacin auf L. variegatus erschien anhand der Daten zwar möglich, konnte jedoch nicht statistisch belegt werden. Für Clofibrinsäure ergaben sich keine Hinweise auf negative Effekte im getesteten Konzentrationsbereich. 9.) Die vorliegenden Berechnungen sind weitaus tragfähiger als bisher vorliegende, da sie auf chronischen Toxizitätsdaten und gemessenen Umweltkonzentrationen beruhen, statt auf Akutdaten und geschätzten Umweltkonzentrationen. 10.) Die in den Versuchen festgestellten, sehr niedrigen Effektkonzentrationen lassen Effekte auch bei umweltrelevanten Konzentrationen als wahrscheinlich erscheinen. Indirekte Effekte wie vermindertes Futterangebot für Prädatoren oder Verschiebungen im Artenspektrum sind denkbar. 11.) Der Destruentenmikrokosmos erwies sich als prinzipiell geeignet, Effekte von Xenobiotika auf Einzeller zu untersuchen, da die Positivkontrolle funktionierte. Die Daten aus den Versuchsansätzen zeigen jedoch, dass Versuchsdesign und Haltung der Testorganismen weiter entwickelt werden müssen. 12.) Die vorliegenden Daten zeigen, dass Pharmaka bei umweltrelevanten Konzentrationen ein ökologisches Risiko darstellen können. Maßnahmen zur Risikominderung sind dringend erforderlich. Angesichts des therapeutischen Nutzens der Substanzen erscheinen Verbote nicht durchsetzbar.
Arten von Aschersonia Mont. (Anamorphe von Hypocrella spp., Clavicipitaceae, Hypocreales, Sordariomycetidae, Askomycota) parasitieren Weiße Fliegen und Schildläuse. Petch (1921) stellte eine Monographie über Hypocrella und Aschersonia vor. Seit dieser Zeit wurden einige Arten neu beschrieben und vereinzelte Artkomplexe revidiert. Die vorgestellte Arbeit ist seit rund 80 Jahren das umfassendste Werk über die Gattung Aschersonia. Hierfür wurden Proben in Kuba, Malaysia, Mexico, Panama, Taiwan und Thailand gesammelt und z.T. kultiviert. Es werden 20 Arten detailliert vorgestellt und illustriert. Die Arten sind: A. acutispora, A. aurantiaca, A. australiensis, A. badia, A. basicystis, A. blumenaviensis, A. caespiticia [A. insperata, syn. nov.], A. columnifera, A. crenulata, A. duplex, A. hypocreoidea [A. goldiana, syn. nov.; A. confluens, syn. nov.], A. marginata, A. oxystoma, A. philippinensis, die Anamorphe von H. rhombispora, A. samoensis, A. taitensis [A. aleyrodis, syn. nov.; A. placenta, syn. nov.; A. tamurai, syn. nov.], die Anamorphe von H. tubulata, A. turbinata [A. coffeae, syn. nov.] und A. viridans. Hierzu wurden auch wichtige Merkmale wie Stromataform und Konidiengröße in situ und in vitro charakterisiert. Mit anderen gültigen Beschreibungen von Arten, die nicht untersucht werden konnten, gibt es 32 Arten. Zum ersten Mal wurden ausführliche Daten über die Wirtsinsekten sowie die Trägerpflanzen berücksichtigt. Erstmals wurde die Verbreitung der Aschersonia-Arten kritisch beleuchtet. Die Funde von A. acutispora, A. basicystis, A. hypocreoidea, A. oxystoma, A. turbinata und A. viridans sind Erstnachweise für Panama. Die Funde von A. australiensis, A. hypocreoidea, A. marginata und A. tubulata sind Erstnachweise für Taiwan. Zum ersten Mal wird für Arten der Gattung Aschersonia ein dichotomer Bestimmungsschlüssel vorgestellt. Es werden drei Hypothesen zur Phylogenie der Aschersonia spp. vorgestellt: 1. Die Stellung der Aschersonia spp. innerhalb der Clavicipitaceae basierend auf Sequenzdaten des LSU-Gens: Aschersonia bildet eine schwach unterstützte Paraphylie, dabei steht A. badia basaler als die übrigen Aschersonia-Arten. 2. Die Beziehung der Aschersonia spp. zueinander: A. badia und eng verwandte Arten parasitieren ausschließlich Weiße Fliegen und stehen basal. Arten einer zweiten Gruppe parasitieren Arten der Aleurodidae und Coccidae und Arten einer dritten Gruppe parasitieren ausschließlich Arten der Coccidae. 3. Eine phylogenetische Hypothese basierend auf Sequenzdaten der ITS: Es gibt noch zu wenig Sequenzen um eine eindeutige Aussage treffen zu können.
Medizinisch-technische Innovationen haben oftmals ihren Ursprung außerhalb des medizinischen Bereichs. Trotzdem werden diese Innovationen erstaunlich positiv aufgenommen, wobei durch sie ein sozialer Wandel, sowohl in der Medizin als auch in der Gesellschaft, in Gang gebracht wird. Dass eine anfangs unbekannte Technologie, die nicht dem ärztlichen Umfeld entstammt, eine große Euphorie auslöst – und nicht Skepsis – ist erstaunlich und bietet sich für Untersuchungen an. Dies ist umso bedeutender, da immer mehr Technologien von außerhalb in der Medizin Einfluss gewinnen. Die Auswirkungen sind hierbei äußerst langfristig. Die Radiologie bietet hierfür interessante Beispiele: Die Röntgenstrahlen wurden vor 110 Jahren entdeckt und haben unverzichtbare Verfahren der diagnostischen Radiologie ermöglicht. Der Computertomograph existiert seit 33 Jahren und hat in dieser Zeit deutliche Fortentwicklungen vollzogen. Die digitalen Bilder des Computertomographen haben heute eine Qualität erreicht, die damals undenkbar war. An das Internet oder die Teleradiologiewurde bei Erfindung des Computertomographen nicht gedacht, dennoch bilden digitale Bilder die Grundlage für weitere Verknüpfungen zwischen Informationstechnik und der Medizin. Die Computertomographie ist daher Ausgangspunkt für eine Digitalisierung in der Medizin. Die Diffusionsforschung technischer Innovationen kann nur unzureichend den extrem raschen Diffusionsverlauf der Computertomographen erklären. Es werden dort nur unzureichend Gründe berücksichtigt, die aus der Medizin kommen. Ein näherer Blick, welche Einflüsse bei der Einbettung medizinisch-technischer Innovationen gegeben sind, die in nichtmedizinischen Bereichen nicht existieren, lohnt sich. Ein Erkenntnisfortschritt kann nur erzielt werden, wenn diese Gründe untersucht werden. Oft wird der allgemeine medizinisch-technische Fortschritt als Erklärungsmuster für vielfältige Veränderungen in der Medizin genommen, lohnend ist jedoch eine Fokussierung auf eine konkrete Technologie. Der medizinisch-technische Fortschritt ist insgesamt für die Erstellung eines Erklärungsmusters zu diffus, um hinreichende Aussagekraft zu liefern. Die Dimensionen des medizinischen und des technischen Fortschrittsunterscheiden sich. Der medizinische Fortschritt bezieht sich auf die Gesundheit, während der technische Fortschritt Produktivitätssteigerungen bezweckt. Obwohl sich durch den Technikeinsatz Änderungen für Ärzte und Gesellschaft ergeben, und Technik in der Medizin an Einfluss gewonnen hat, hat die theoretische Verknüpfung nicht in dem Maß stattgefunden, wie die Technik Einfluss in der Medizin gefunden hat. Theorien, die für Innovationen eine allgemeine Gültigkeit besitzen, werden für die Medizin unzureichend angepasst, daher besteht nur eine oberflächliche Verbindung beider Bereiche. Die Besonderheiten der Medizin bleiben dadurch unbeobachtet oder gehen verloren. Ob ein generalisierender Ansatz das Entstehen und Verbreiten medizinisch-technischer Innovationen richtig erfassen kann, ist zweifelhaft. Soziotechnische Allianzen zwischen Radiologen und Industrie ermöglichen die Einführung einer Innovation. Die teuere Entwicklung der Technologie stellt für den Unternehmer ein Wagnis dar. Die gegenseitigen Beziehungen zwischen Industrie und Radiologen reduzieren das Risiko des Unternehmers und erhöhen die Chance des Arztes ein neues brauchbares Hilfsmittel zu erhalten. Teuere Geräte werden so möglich, da die Akzeptanz in der Medizin signalisiert wurde, dennoch stehen die Auswirkungen des Technikeinsatzes in der Medizin und für die Gesellschaft zu diesem Zeitpunkt noch gar nicht fest. Der medizinische Nutzen ist u. U. ebenfalls noch ungeklärt.
Hintergrund: Die elektrische Stimulation des Hörnerven durch Cochlea Implantate ist eine mittlerweile weit verbreitete und effiziente Therapiemöglichkeit für Patienten mit profunder sensorineuraler Schwerhörigkeit. Nach entsprechender Adaptationszeit ermöglicht das Cochlea Implantat ein ausreichendes Sprachverständnis in Ruhe. In alltäglichen Situationen, die meist durch das Vorhandensein von Hintergrundgeräuschen gekennzeichnet sind, ist das Sprachverstehen jedoch mangelhaft. Hier liegt die Schwäche von Cochlea Implantaten. Da immer mehr Patienten mit signifikantem Restgehör cochlea-implantiert werden, stellte sich die Frage des Nutzen dieses Restgehörs – welches bei herkömmlichen Implantationen zumeist verloren geht. Die hier vorgestellte Methode der kombinierten elektrisch-akustischen Stimulation kombiniert akustisches Resthörvermögen im Tieffrequenzbereich und Cochlea Implantat auf dem ipsilateralen Ohr. Diese Methode setzt somit einen Erhalt des Resthörvermögens auf dem implantierten Ohr voraus. Ziel dieser Disseration: Das primäre Ziel dieser Dissertation war die Evaluation der Sprachdiskriminationsleistungen von Patienten, die mit der elektrischakustischen Stimulation ipsi- als auch kontralateral versorgt wurden. Außerdem sollten die chirurgischen und audiologischen Daten des Restgehörerhaltes ausgewertet werden. Patienten: Insgesamt wurden an der Frankfurter HNO Universitätsklinik 23 Patienten mit signifikantem Restgehör für die elektrisch-akustische Stimulation implantiert und in die Datenanalyse dieser Dissertation inkludiert. Als Indikationsbereich für die elektrisch-akustische Stimulation war ein Hörverlust von <= 65 dB HL in mindestens zwei Frequenzen im Tieffrequenzbereich (< 1.000 Hz), ein Hörverlust von > 65 dB HL bei 1.000 Hz und >= 75 dB HL in den hohen Frequenzen über 1.000 Hz zu sehen. Das Einsilberverständnis vor der Operation sollte bei <= 45% bei Umgangstonlautstärke liegen. Methodik: Um die Chancen für den Hörerhalt zu erhöhen, wurden limitierte Elektrodeninsertionen mit der Insertionstiefe von nur 360 Grad angestrebt. Der Erhalt von Tieftonrestgehör wurde mittels reintonaudiometrischen Messungen kontrolliert. Das Sprachverständnis der Patienten wurde mittels Freiburger Einsilbertest in Ruhe und mittels des HSM Satztestes ohne und mit Hintergrundrauschen zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen. Alle Messungen wurden unter rein akustischen Bedingungen, nur mit Cochlea Implantat und mit der Kombination von elektrischer und akustischer Stimulation (ipsilateral und kontralateral) durchgeführt. Ausgewertet und verglichen wurden die präoperativen Ergebnisse mit den ersten postoperativen Ergebnissen sowie den aktuellsten Messergebnissen. Ergebnisse: Bei 26% der Patienten wurde ein kompletter Erhalt des Restgehörs trotz Implantation erreicht. Partiell konnte bei 65% der Patienten das Restgehör geschont werden. Neun Prozent ertaubten durch die Implantation. Fünf weitere Patienten mit zunächst partiellem Hörerhalt (33,3 %) ertaubten im weiteren zeitlichen Verlauf. Insgesamt zeigte sich in den Sprachverständnistests eine Überlegenheit der simultanen elektrischen und akustischen Stimulation gegenüber der alleinigen elektrischen Stimulation. Dies machte sich vor allem im Störschall bemerkbar. Patienten die durch die Implantation ertaubten oder im zeitlichen Verlauf danach ihr Restgehör verloren, konnten durch das Cochlea Implantat alleine überdurchschnittliche Sprachdiskiminationswerte verzeichnen und diese durch die zusätzliche kontralaterale Hörgeräte-Nutzung nochmals verbessern. Schlussfolgerungen: Insgesamt konnte in dieser Dissertation gezeigt werden, dass der chirurgische Erhalt von Tieftonrestgehör durch die hier angewandte Implantationsmethode gut realisiert werden kann. Alle bimodal versorgte Patienten (ipsilateral und kontralateral) zeigten bezüglich des Sprachverstehens einen deutlichen Benefit von der zusätzlichen akustischen Stimulation. Dieser Benefit machte sich besonders in alltäglichen Hörsituationen mit Hintergrundrauschen bemerkbar. Demnach ist der Erhalt von signifikantem Tieftonrestgehör bei sorgfältig selektieren Patienten immer anzustreben, um durch die simultane ipsilaterale akustische und elektrische Stimulation ein bestmögliches Sprachverständnis zu ermöglichen.
Augmented Reality ist eine Technologie, mit der die Wahrnehmung der realen Umgebung durch computergenerierte Sinnesreize verändert bzw. erweitert wird. Zur Erweiterung dieser „angereicherten Realität“ werden virtuelle Informationen wie z.B. 3D-Objekte, Grafiken und Videos in Echtzeit in Abbildern der realen Umgebung dargestellt. Die Erweiterungen helfen dem Anwender Aufgaben in der Realität auszuführen, da sie ihm Informationen bereitstellen, die er – ohne AR – nicht unmittelbar wahrnehmen könnte. Die Zielsetzung ist, dem Benutzer den Eindruck zu vermitteln, dass die reale Umgebung und die virtuellen Objekte koexistent miteinander verschmelzen. Für AR-Anwendungen existieren zahlreiche potenzielle Einsatzgebiete, doch verhindern bisher einige Probleme die Verbreitung dieser Technologie. Einer breiten Nutzung von AR-Anwendungen steht beispielsweise die Problematik gegenüber, dass deren Erstellung hohe programmiertechnische Anforderungen an die Entwickler stellt. Zur Verminderung dieser Probleme ist es wünschenswert Benutzern ohne Programmierkenntnisse (Autoren) die Entwicklung von AR-Anwendungen zu ermöglichen. Zum anderen bestehen technologische Probleme bei den für die Registrierung der virtuellen Objekte essenziellen Trackingverfahren. Weiterhin weisen die bisherigen AR-Anwendungen im Allgemeinen und die mittels autorenorientierter Systeme erstellten AR-Applikationen im Besonderen Defizite bezüglich der Authentizität der Darstellungen auf. Dabei sind hauptsächlich inkorrekte Verdeckungen und unrealistische Schatten bei den virtuellen Objekten verantwortlich für den Verlust des Koexistenzeindrucks. In dieser Arbeit wird unter Berücksichtigung der Trackingprobleme und auf Basis von Analysen, die die wichtigsten Authentizitätskriterien bestimmen, ein Konzept zur authentischen Integration von virtuellen Objekten in AR-Anwendungen erarbeitet und dargelegt. Auf diesem Integrationsprozess basierend werden Konzepte für Werkzeuge mit grafischen Benutzungsschnittstellen abgeleitet, mit denen Autoren die Erstellung von AR-Anwendungen mit hoher Darstellungsauthentizität ermöglicht wird. Einerseits verfügen die mit diesen Werkzeugen erstellten AR-Anwendungen über eine verbesserte Registrierung der virtuellen Objekte. Andererseits stellen die Werkzeuge Lösungen bereit, damit die virtuellen Objekte der AR-Anwendungen korrekte Verdeckungen aufweisen und über Schatten und Schattierungseffekte verfügen, die mit der tatsächlichen Beleuchtungssituation der realen Umgebung übereinstimmen. Sämtliche dieser Autorenwerkzeuge basieren auf einem in dieser Arbeit dargelegten Prinzip, bei dem die authentische Integration mittels leicht verständlicher bzw. wenig komplexer Arbeitsschritte und auf Basis der Verwendung einer Bildsequenz der realen Zielumgebung stattfindet. Die Konzepte dieser Arbeit werden durch die Implementierung der Autorenwerkzeuge validiert. Dabei zeigt sich, dass die Konzepte technisch umsetzbar sind. Die Evaluierung basiert auf der Gegenüberstellung eines in dieser Arbeit entwickelten Anforderungskatalogs und verdeutlicht die Eignung des Integrationsprozesses und der davon abgeleiteten Konzepte der Autorenwerkzeuge. Die Autorenwerkzeuge werden in eine bestehende, frei verfügbare AR-Autorenumgebung integriert.
Elche stellen eine Problemart in der Zootierhaltung dar. Sie erreichen im Zoo entgegen dem Trend, dass Tiere in Menschenobhut älter werden als ihre frei lebenden Artgenossen, meist weniger als die Hälfte des biologisch möglichen Alters. Besonders schwierig gestaltet sich die adäquate Fütterung, da die Tiere sehr stark von der Gabe frischer Laubäsung abhängen und die Fütterung mit Ersatzfuttermitteln, wie z.B. Heu, langfristig nicht erfolgsversprechend ist. Zudem sind die Tiere sehr anfällig für Parasiten und eine von Schafen übertragene Viruserkrankung (Bösartiges Katarrhalfieber). Ihr hoher Platzbedarf und das Problem der innerartlichen Aggression machen die Haltung dieser größten Hirschart zusätzlich kompliziert. In dieser Arbeit wird die Methode der Angewandten Chronoethologie in der Zootierhaltung vorgestellt, die sich die von der Inneren Uhr gesteuerten Verhaltensrhythmen einer Tierart zur Beurteilung ihres Wohlbefindens und ihrer Haltungsbedingungen in der künstlichen Zooumwelt zu Nutze macht. Der Besitz einer Inneren Uhr stellt in der hochgradig rhythmisch organisierten Umwelt einen Selektionsvorteil im Sinne einer frühzeitigen Anpassung an wiederkehrende Umweltbedingungen dar. Die Innere Uhr ist so alt wie das Leben selbst, genetisch fixiert, über Zeitgeberreize mit ihrer Umwelt synchronisiert und regelt die Lebensvorgänge von Organismen auf allen organisatorischen Ebenen, auch auf der Ebene des Verhaltens. Ist der normale Verhaltensrhythmus einer Tierart bzw. eines Individuums bekannt, ist es möglich, aus Abweichungen von der Norm auf Störungen des Organismus - auf Unwohlsein - zu schließen. Anhand des Vergleiches von drei Elchhaltungen mit jeweils zwei Tieren, die unter verschiedenen Bedingungen gehalten wurden, konnten mit Hilfe zeitgeraffter Videoaufzeichnung und dem Einsatz eines Speichertelemetriesystems die folgenden Faktoren als einflussreich auf das Verhaltensmuster von Elchen in Menschenobhut identifiziert werden. Die nächtliche Aufstauung von Elchen ist aufgrund des Raum- und Reizmangels in den Boxen ein erheblicher Eingriff in das natürliche, gleichmäßig über Tag und Nacht verteilte Verhaltensmuster der Tiere. Außerdem sind sie in ihrem Verhalten hochgradig vom täglichen Ablauf des Pflegeralltags im Zoo beeinflusst. Feste Fütterungszeiten können einen starken Zeilgeberreiz darstellen- den die Elche in den beiden naturferneren Haltungen stärker zu antizipieren scheinen als den Zeitgeber „Licht". Größe und vor allem Strukturierung des Außengeheges haben einen Einfluss auf dessen zeitliche und räumliche Nutzung. Abschüssige Gehegeteile können die unerwünschte Verhaltensweise Grasen fördern. In unseren mitteleuropäischen Breiten leiden die Elche im Sommer unter Hitzestress, was sich in verringerter Aktivität widerspiegelt. Ein hohes Besucheraufkommen kann die Tiere ebenfalls in ihrem Verhalten beeinflussen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass sich der Elch schnell an die Zoogegebenheiten und viele Besucher gewöhnt. Durch den Vergleich der verschiedenen Haltungsbedingungen konnten in der vorliegen Arbeit Vorschläge zur Verbesserung der Haltung von Elchen in Menschenobhut und zu ihrem zeitlichen Management gemacht werden. Der Elch hat sich aufgrund des für Wiederkäuer typischen, sehr geregelten Verhaltensrhythmus aus alternierenden Aktivitäts- und Ruhephasen, der auch unter den verschiedenen Haltungsbedingungen prinzipiell bestehen bleibt, als sehr gut geeignetes Modelltier für die Anwendbarkeit der Methode der Angewandten Chronoethologie in der Zootierhaltung herausgestellt. Abweichungen von der Norm können leicht erkannt werden. Änderungen im Verhaltensmuster m Form erhöhter lokomotorischer Aktivität lassen bei den untersuchten Tieren auf Unwohlsein (Krankheit, Abweichungen von der täglichen Routine, unterbundenes Brunftverhalten) schließen und können im Sinne eines chronoethologischen Paradigmas als eine indikative Verhaltensweise gewertet werden. Das Ziel einer vollständig automatisierten Verhaltenserfassung- und Auswertung mittels Bewegungsmeldern soll im restringierten Raum der Elchbox in einem weiteren Projekt verwirklicht werden, um damit Tierpflegern, Zooveterinären und Verantwortlichen ein gut handhabbares Mittel zur objektiven und langfristigen Beurteilung des Wohlbefindens ihrer Schützlinge zur Verfügung stellen zu können.
Ein ausführliches Beratungsgespräch nach der Geburt eines Kindes mit Lippen- oder Gaumen-Spalte sollte in der ersten Lebenswoche erfolgen und ist neben einer möglicherweise bereits pränatal erfolgten Beratung entscheidend für das Verhältnis zwischen Behandlungsteam und den Eltern der betroffenen Kinder. Fragen zur Ernährung und zur Operation sind für die Eltern erstrangig. Dabei sind sowohl der Inhalt als auch die Gesprächsführung wichtig. Die Stillberaterin hat in unserem Team als nicht ärztliche Bezugsperson eine wichtige fachliche und vertrauensbildende Aufgabe. Administrative Fragen sollten ebenso angesprochen werden, um die Eltern auch hier zu entlasten. Handlungsbedarf besteht offensichtlich bei der unmittelbar postnatalen Betreuung und Aufklärung der Familien, insbesondere, wenn die Geburt in einem peripheren Krankenhaus erfolgt. Es sollte insbesondere in peripheren Geburtskliniken eine präzisere Information und Aufklärung zur Spaltbildung ermöglicht werden. Daneben wurde vielfach der Wunsch nach psychologischer Unterstützung und Begleitung der Eltern in dieser sensiblen postnatalen Zeit geäussert. Von den aufklärenden Personen wird mehr Einfühlungsvermögen und Selbstsicherheit auch die eigenen Gefühle zu zeigen erwartet. Es muss den Eltern im Gespräch mehr Möglichkeit zum Reden und zum Gefühle zeigen gegeben werden und der Austausch mit anderen Eltern, die Kinder mit Spalten haben, soll angesprochen werden. Allgemein müssen grössere Bemühungen unternommen werden, die Eltern zufrieden zu stellen.
Fragestellung: In zahlreichen Studien wurden die Regulationsmechanismen der endothelialen NO-Synthase aufgedeckt und untersucht. Neben vielen Faktoren, die bei der Aktivierung eine Rolle spielen, kommt der Phosphorylierung einzelner Aminosäuren des Proteins eine besondere Bedeutung zu. In dieser Arbeit werden die Aminosäure Threonin 495 und Serin 1177 untersucht mit der speziellen Fragestellung nach einer synergistischen Wirkung. Zielsetzung: Unter der Annahme, dass sowohl die Dephosphorylierung an Thr 495 als auch die Phosphorylierung an Ser 1177 zur Aktivierung der eNOS beitragen, wurde eine eNOS-Mutante untersucht, die an Thr 495 antiphosphomimetisch und an Ser 1177 phosphomimetisch substituiert wurde. Diese wurde in Bezug auf die Relaxationsfähigkeit mit dem Wildtyp der eNOS und einer eNOS verglichen, die ausschliesslich an Ser 1177 phosphomimetisch substituiert wurde. Material und Methoden: Für die Experimente wurden Knock-out-Mäuse verwendet deren Endothelzellen keine NO-Synthase exprimiert. Mit Hilfe eines Adenovirus als Vektor wurden die Endothelzellen der Arteria Carotis mit den entsprechenden eNOS Mutanten transfiziert. Im Organbad konnte das intakte Gefäß unter physiologischen Bedingungen auf die Reaktion nach Gabe von vasoaktiven Substanzen untersucht werden. Ergebnisse : Mit Hilfe der entwickelten Methode ist es möglich, die Relaxationsfähigkeit von Gefäßen aus eNOS-Knock-out-Mäusen wieder vollständig herzustellen. Im Relaxationsverhalten nach Stimulation mit Acetylcholin zeigten Gefäße, die jeweils mit einer der drei eNOS-Mutanten transfiziert waren, keinen großen Unterschied. Zur Vorspannung der Gefäße wurde jedoch deutlich mehr Phenylephrin benötigt bei den Gefäße, die mit der T495A/S1177D eNOS transfiziert waren. Nach Hemmung mit L-NAME kontrahierten diese Gefäße am stärksten und sie zeigten auch die höchste intazelluläre Konzentration basalen cGMPs im RIA. Schlussfolgerung : Die alleinige Phosphorylierung von Serin 1177 führt nicht zu einer vollständigen Aktivierung der eNOS, während eine Phosphorylierung an Serin 1177 in Kombination mit einer Dephosphorylierung von Threonin 495 die NO Produktion steigert und diese Endothelzellen basal hohe Konzentrationen an NO enthalten.
Apoptose ist für grundlegende Prozesse des Lebens wie die Embryonalentwicklung und die Infektabwehr unentbehrlich. Defekte im Apoptoseprozess haben ernste Erkrankungen wie z.B. Krebs zur Folge. Ein charakteristisches Kennzeichen von Krebszellen ist deren Apoptoseresistenz, die verhindert, dass Krebszellen auf natürlichem Wege vernichtet werden. Die Tumorzellen reagieren im allgemeine nicht mehr auf Zelltod-Signale, die z. B. bei Nähr- und Sauerstoffmangel oder einem Angriff durch Effektorzellen des Immnunsystems empfangen werden. Ein wesentlicher Grund dafür sind Mutationen im Signalweg der Apoptose. Häufig wird in Tumoren die Überaktivierung von antiapoptotischen Proteinen beobachtet. Die Aufklärung der Apoptose-Signalwege und die Charakterisierung der ihnen zu Grunde liegenden molekularen Interaktionsmechanismen sind wichtig für die Erklärung der Pathogenesse vieler Erkrankungen. Daher ist es von großem Interesse, neue anti-apoptotische Proteine zu identifizieren, die als Targets zur Entwicklung alternativer therapeutischer Strategien benutzt werden können. Ein wichtiger Bestandteil des Apoptoseweges ist das Mitochondrium. Ausgangspunkt für den mitochondrialen oder intrinsischen Apoptose-Signalübertragungsweg ist die Freisetzung von Cytochrom c (Cyt c) und anderen apoptogenen Faktoren aus dem Mitochondrien. Zytoplasmatisches Cytochrom c bindet zusammen mit ATP oder dATP an das Adaptorprotein Apaf-1 und induziert daraufhin eine Konformationsänderung sowie die Oligomerisation von Apaf-1. Die Selbstassoziation von Apaf-1 führt zur zusätzlichen Rekrutierung von Caspase-9, die in diesem des sogenannten Apoptosomskomplexes durch die Erhöhung ihrer lokalen Konzentration autokatalytisch aktiviert wird. Aktive Caspase-9 wiederum spaltet und aktiviert Effektorcaspasen wie Caspase-3, die zelluläre Targetproteine spalten und damit den Zelltod verursachen. Viele apoptotische Stimuli aktivieren den mitochondrialen Apoptoseweg. Defekte im intrinsischen Signalweg finden sich häufig im Tumoren und sind oft mit Resistenzen gegen apoptoseauslösende Krebstherapien assoziert. Anti-apoptotische Proteine, die mit dem apoptotischen Programm an dieser Stelle interferieren und in Tumoren überexprimiert werden, stellen attraktive Targets für Tumortherapien dar. In der Arbeitsgruppe von Dr. Martin Zörnig am Georg-Speyer-Haus wurde ein S. pombe Hefesystem etabliert, um in einem funktionellen „Survival-Screen“ neue anti-apoptotische Säugergene aus Tumor-cDNA-Banken zu identifizieren. Hefen können durch die Expression bestimmter pro-apoptotischer Säugerproteine abgetötet werden. Dieser Hefezelltod weist äusserliche Gemeinsamkeiten mit apoptotischen Zellen multizelluläre Organismen auf. Frühere Studien haben gezeigt, dass es möglich ist, mit Hilfe dieses Screens tatsächlich anti-apoptosische Säugerproteine zu identifizieren, die den induzierten Hefezelltod inhibieren können. In einem Screen, bei dem das Apaf-1 Homolog in C.elegans, CED-4, als Killerprotein verwendet wurde, konnte unter anderem das Gen Aven isoliert werden, das nicht nur CED-4-induzierten Zelltod in Hefe, sondern auch Apaf-1/Casp-9-vermittelte Apoptose in Säugerzellen inhibiert. Dabei wurde ein unvollständiges ΔAven-cDNA-Plasmid isoliert, dem das 5´-Ende fehlte. Diese Verkürzung ist vermutlich auf ein vorzeitiges Abbrechen der cDNA-Synthese durch die Reverse Transkriptase zurückzuführen. Die vollständige humane Aven cDNA wurde im Rahmen einer Kooperation von Prof. J. M. Hardwick (J. Hopkins University, Baltimore USA) bereitgestellt, zusammen mit zwei polyklonalen anti-Aven Antiseren. Die Antisera erkennen die N-terminalen Aminosäuren 98-112 (anti-Aven A) sowie am C-terminus aa 256-268 (anti-Aven B). In der AG Zörnig wurde ein zusätzliches Antiserum (anti-Aven C) gegen ein Peptid generiert, das die letzten 17 Aminosäuren des humanen und des Maus-Aven-Proteins erkennt. Aven wurde in der Gruppe von M. Hardwick als anti-apoptotisches Protein beschrieben, das an das anti-apoptotische Bcl-2 Familienmitglied Bcl-xL und Apaf-1 bindet (Chau et al., 2000). Aven wurde mit Hilfe eines „Hefe-2-Hybrid Screens“ mit Bcl-xL als Köder („bait“) isoliert. Es wurde publiziert, dass Aven die Apaf-1 Selbstassoziation (und damit Caspase-9-Aktivierung) verhindert. Das humane Aven Gen kodiert für insgesamt 362 Aminosäuren. Die Sequenz ist in zahlreichen Spezies hoch konserviert. Aven mRNA Expression wurde in vielen Geweben (Herz, Nieren, Pankreas, Testis und Skelet-Muskulatur) und in mehreren Zelllinien gefunden. Dies deutet auf eine ubiquitäre Expression hin. In der Zelle ist Aven hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert. Immunfluoreszenzanalysen der Arbeitsgruppe Hardwick zeigten zusätzlich eine schwache Expression des Proteins im Nukleus. In der Arbeitsgruppe Zörnig konnte gezeigt werden, dass die isolierte Deletionsmutante ΔAven (aa 180-362) CED-4-induzierten Zelltod in Hefen inhibiert (Doktorarbeit M.L. Brezniceanu, unpublizierte Daten). Eine anti-apoptotische Wirkung konnte für ΔAven zusätzlich im Säugersystem verifiziert werden. Durch Überexpressionsstudien eines ΔAven- GFP-Fusionskonstruktes wurde Apaf-1/Caspase-9-induzierte Apoptose in der humanen Kolonkarzinomzelllinie RKO inhibiert. Weitere Experimente zeigten, dass sich in Tumoren des Kolons, der Niere und der Schilddrüse erhöhte Aven mRNA-Mengen nachweisen lassen und dass Aven auf mRNA-Ebene während der Entwicklung der Brustdrüse reguliert wird (unpublizierte Daten). Im Rahmen dieser Arbeit wurde Aven biochemisch und genetisch näher charakterisiert. Dabei wurden sowohl das volle-Länge-Aven sowie die artifizielle ΔAven Deletionsmutante untersucht. Zunächst wurde ein Teil der publizierten Daten verifiziert. Beschrieben ist eine Bindung zwischen Aven und Bcl-xL, die durch die N-terminale Domäne von Aven (Aminosäure 74-108) vermittelt wird. ΔAven, das den N-Terminus nicht enthält, sollte daher nicht an Bcl-xL binden können. In einem Immunpräzipitations-Experiment mit dem anti-Aven B Antiserum wurde entsprechend einer Interaktion mit Bcl-xL nur für das volle-Länge-Aven-Protein, nicht aber für ΔAven nachgewiesen. Den Publizierten Daten zufolge bindet Aven mit den Aminosäuren 180 bis 300 an Apaf-1, und diese Interaktion konnte in einem weiteren Ko-Immunpräzipitations-Experiment bestätigt werden. Ein Ziel dieser Arbeit bestand darin, den Einfluß von Aven auf die Bildung des Apoptosoms zu untersuchen. Dafür wurden Apoptosom-Immunpräzipitations-Experimente mit 293T Zelllysaten etabliert, in denen man endogene Apaf-1/Caspase-9-Komplexe nachweisen konnte. Durch Zugabe von Cytochrom c und dATP direkt zu den Zelllysaten wurde die Bildung des Apoptosoms induziert, das anschließend mit einem monoklonalen anti-Caspase-9 Antiköper immunpräzipitiert werden konnte. Bei gleichzeitiger Überexpression von ΔAven wurde weniger Apaf-1 mit Caspase-9 ko-immunpräzipitiert, ein Hinweis darauf, dass die Apoptosombildung unterdrückt wurde. Das Ergebnis wurde durch die Beobachtung bestätigt, dass Caspase-9-Spaltung und -Aktivierung durch ΔAven vermindert wurde. Interessanterweise konnte eine Überexpression des volle-Längen Aven-Proteins die Bildung des Apoptosoms nicht verhindert. Apaf-1 wurde wie bei den Lysaten nichttransfizierter Zellen mit Caspase-9 Ko-immunopräzipitiert, und die Caspase-9 Spaltprodukte p35 und p37, die bei Aktivierung des Apoptosoms entstehen, wurden unverändert detektiert. Bei den beschriebenen Ko-Immunpräzipitationsexperimenten konnte auch eine Bindung von Aven und ΔAven an Caspase-9 (und nicht nur an Apaf-1) nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass der C-Terminus von Aven für die Bindung an Caspase-9 wichtig ist. Interessanterweise nahm die Bindung von ΔAven an Caspase-9 nach Apoptosominduktion ab, während kein Unterschied in der Bindung des vollständigen Aven-Proteins an Caspase-9 vor oder nach Apoptosominduktion beobachtet werden konnte. Wegen der Bindung von Aven und ΔAven an Caspase-9 konnte mit diesen Experimenten nicht festgestellt werden, ob Aven bzw. ΔAven Teil des gebildeten Apoptosomkomplexes sind, d. h. ob sie auch nach Apoptosombildung an Apaf-1 binden. Eine Hemmung der Apoptosomsbildung führt zur Inhibierung der Caspase-Aktivierungskaskade und damit zu verringerter Caspase-3 Aktivität. Entsprechend wurde die Caspase-3-Aktivität nach in vitro Apoptosominduktion bei Überexpression von ΔAven inhibiert, während das volle-Länge Aven keinen Einfluß auf die Caspase-3-Aktivität hatte. In weiteren Verlauf des Projektes wurden funktionelle Apoptoseexperimente mit transfizierten RKO-Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten eine Protektion durch Aven und ΔAven nach Staurosporin- und UV- Behandlungen. Dabei zeigte ΔAven einen stärkeren anti-apoptotischen Effekt als das volle-Länge-Aven in vivo. Die Tatsache, dass ΔAven ein höheres anti-apoptotisches Potential als das volle-Länge-Aven-Protein aufweist, deutet auf eine mögliche Spaltung oder Konformationsänderung von Aven in vivo hin, die zur Entstehung eines aktiven anti-apoptotischen C-terminalen Proteins führt. Um dies nachzuweisen, wurden einzel- und doppel-getaggte Fusionskonstrukte kloniert. Western Blot Analysen mit dem anti-Aven B Antiserum zeigten zusätzlich zu der volle-Längen-Aven- Bande (50 kDa) eine kleinere immunreaktive Bande mit einer Größe von ca. 35 kDa. Nach Apoptoseinduktion nahm die relative Menge dieser kleineren Bande zu. Das 35 kDa Aven-Spaltprodukt wurde nicht nur nach Überexpression, sondern auch auf endogener Proteinebene detektiert. Es konnte gezeigt werden, dass diese Spaltung Caspasen-abhängig ist. Eine Behandlung der Aven-überexprimierenden Zellen vor Apoptoseinduktion mit dem Caspase-Inhibitor z-VAD-fmk blockierte die Spaltung von Aven vollständig. Gleiche Ergebnisse konnten mit dem endogenen Protein gezeigt werden. Obwohl die Aven-Sequenz keine in silico vorausgesagten Spaltstellen für Caspasen enthält, zeigten in vitro Experimente mit rekombinanter Caspase-3, dass Aven von Caspase-3 direkt prozessiert wird. In vivo Experimente mit Wildtyp-MCF-7-Zellen, die keine endogene Caspase-3 exprimieren, sowie mit transfizierten MCF-7-Zellen, die Caspase-3 stabil exprimieren, bestätigten dies. Aven wurde nur in den mit Caspase-3 transfizierten MCF-7-Zellen nach Staurosporin-Behandlung in das 35 kDa Fragment gespalten. Western Blot Analysen mit Antikörpern, die das N-terminale Ende von Aven erkennen (anti-Flag oder anti-Aven A) zeigten eine zusätzliche kleinere Bande. Dieses Spaltprodukt ist ungefähr 30 kDa groß, und im Vergleich mit dem 35 kDa Aven-Peptid veränderte sich seine Expression kaum unter apoptotischen Bedingungen. Dieses Aven-Fragment ist jedoch nicht das Ergebnis einer Caspase-Spaltung, weil seine Entstehung nicht durch z-VAD-fmk inhibiert wurde. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass auch Serin-Proteasen nicht für diese Spaltung verantwortlich sind. Western Blot Analysen mit Antikörpern, die gegen den C-Terminus von Aven gerichtet sind, zeigten erstaunlicherweise kein zusätzlichen Aven-Spaltprodukte, sondern nur das volle Länge-Aven-Protein. Offensichtlich ist das entstehende C-terminale Fragment nach Spaltung durch Caspase-3 instabil und kann nicht nachgewiesen werden. Zusätzliche, nicht näher identifizierte 40 und 45 kDa große Aven Spaltprodukte wurden in MCF7-Zellen detektiert, die jedoch nicht in RKO-, HeLa-, oder 293T-Zellen beobachtet wurden. Mit Hilfe einer frei verfügbaren Software (GrabCas; ein Programm, das auch Granzyme Bund Caspase-Spaltstellen voraussagt, die sich von den Konsensusspaltsequenzen unterscheiden) sowie mit Western Blot Analysen von verschiedenen Aven-Deletionsmutante sollten potenzielle Schnittstellen näher charakterisiert werden. Dabei wurde die Spaltung durch Caspase-3 bei D293 (oder D287) bestätigt. Außerdem wurden zusätzliche mögliche Spaltstellen bei aa 240 oder zwischen aa 142-175 in Aven gefunden. Eine Spaltung zwischen den Aminosäuren 142 und 175 würde zu einem ähnlichen C-terminalen Aven-Peptid führen wie das artifizielle ΔAven und sollte von daher potente anti-apoptotische Eigenschaften aufweisen. Eine weitere Spaltstelle wurde ungefähr bei aa 100 kartiert. Die Isolierung von Aven Spaltprodukten aus eindimensionalen SDS-PA Gelen für eine nachfolgende massenspektrometische Analyse war aus technischen Gründe leider nicht erfolgreich. Die vorausgesagte Aven-Prozessierungsstellen sowie die in Western Blot Analysen beobachteten Aven-Fragmente lassen die Schlussfolgerung zu, dass Aven nach proteolytischer Aktivierung (d. h. nach Abspaltung inhibierender N-terminaler Sequenzen) anti-apoptotische Eigenschaften annimmt. Das generierte C-terminale Peptid wird dann möglicherweise durch Caspase-3-Spaltung bei D293 inaktiviert, wenn ein starker apoptotischer Stimulus auftritt. Zu Aufklärung der physiologischen Funktion von Aven in Normalgewebe und um zu untersuchen, ob Aven bei der Tumorentstehung eine Rolle spielt, wurden verschiedene Mausmodelle etabliert. Dazu wurde die humane Aven-cDNA zum einen unter der Kontrolle eines Hühner-ß-Aktin-Promotors und eines CMV-Enhancers kloniert. Diese Kombination regulatorischer Elemente sollte zu einer hohen und ubiquitären Expression des Transgens führen. Zusätzlich wurde die humane Aven-cDNA in den Vektor p1017 unter die Kontrolle des proximalen lck-Promotors kloniert, der eine Expression in unreifen T Zellen erlaubt. Die Etablierung der Mauslinien wurde in Kollaboration mit dem GSF-Institut für Experimentelle Genetik (AG Prof. M. Hrabé de Angelis) in München durchgeführt. Bei einer Untersuchung der Organe zeigte sich, dass in der ß-Aktin Aven-transgenen Maus eine starke Überexpression von Aven nur im Herz nachgewiesen wurde. Diese transgenen Mäuse werden zurzeit in Kollaboration mit Dr. S. Barrère-Lemaire (Institut of Functional Genomics, Montpellier, Frankreich) analysiert. Des Weiteren wurde im Rahmen dieser Arbeit auch eine lck Aven-Maus Linie untersucht. Western Blot Analyse zeigten eine starke Proteinexpression des Transgens im Thymus und auch in reifen T-Zellen (Milz). Mit Hilfe des anti-Aven C Antiserums konnte im Western Blot ein weiteres, vorher nicht beobachtetes Aven-Spaltprodukt in Thymozyten und aufgereinigten periphären T-Zellen nachgewiesen werden. Diese Überexpression von Aven in Thymozyten und gereinigten T-Zellen hatte jedoch keine messbare Inhibition von Apoptose zur Folge. Dagegen wurde eine Inhibition der aktivierungsinduzierten Proliferation von T-Zellen in transgenen Aven-Mäuse beobachtet. Bemerkenswerterweise zeigten die transgenen Aven-Mäuse keine spontane Tumorentwicklung obwohl eine Korrelation zwischen Aven-Expression und einer schlechten Prognose in Kinderleukämien publiziert worden ist. Um zu untersuchen, ob Aven in Kombination mit anderen Onkogenen in Tumorentstehung oder Progression kooperieren kann, sollen transgene Aven-Mäuse mit anderen transonkogenen Mausstämmen (z.B. p53-/- Mäusen) gekreuzt werden.
In der vorliegenden Arbeit konnte die β-Carotin-Ketolase aus dem Cyanobakterium Synechocystis PCC 6803 nach heterologer Expression in E. coli gereinigt und enzymatisch charakterisiert werden. Die Funktion der β-Carotin-Ketolase wurde in vivo durch Komplementierung von β- Carotin-produzierenden E. coli-Transformanten überprüft. Die β-Carotin-Ketolase agierte hier auch als Diketolase und synthetisierte sowohl Echinenon als auch Canthaxanthin. Untersuchungen der Substratspezifität der β-Carotin-Ketolase in vivo und in vitro ergaben, daß nur Carotinoide erkannt werden, die einen β-Iononring ohne Hydroxygruppe in Position C3 aufwiesen. So wurden die Carotinoide β-Carotin, Echinenon, β-Cryptoxanthin und α-Carotin als Substrate erkannt und zu Echinenon, Canthaxanthin, 3’-Hydroxyechinenon und 4-Keto-α-Carotin umgesetzt. Zeaxanthin, 3’-Hydroxyechinenon, 4-Ketozeaxanthin sind keine Substrate der β-Carotin-Ketolase. Die β-Carotin-Ketolase kann einen ε-Iononring, wie in α-Carotin, nicht modifizieren. Die β-Carotin-Ketolase mit einer apparenten Molmasse von 61 kDa wurde durch pPQE30crtO und pPEU30crtO als rekombinantes Polypeptid mit sechs N-terminalen Histidinen in E. coli heterolog exprimiert. Die kinetischen Parameter der β-Carotin-Ketolase konnten in in vitro-Enzymaktivitätstests bestimmt werden. Der KM-Wert für das Substrat β-Carotin lag bei 41,6 μM und der dazugehörende Vmax-Wert bei 1,318 μmol mg-1 h-1. Für das Substrat Echinenon wurde ein KM-Wert von 35,3 μM und ein Vmax-Wert von 0,339 μmol mg-1 h-1 ermittelt. Die Spezifität der β-Carotin-Ketolase war für β-Carotin dreimal höher als für Echinenon. Es konnte keine Kofaktorabhängigkeit nachgewiesen werden, aber eine starke Abhängigkeit der β-Carotin-Ketolase von molekularem Sauerstoff. Die Zugabe des Detergenz Nonidet P-40 in in vitro-Enzymaktivitätstests erhöhte die enzymatische Aktivität der β-Carotin-Ketolase deutlich. Durch die Metallionen-Affinitätschromatographie konnte das Enzym annährend zur Homogenität (93%) unter Erhalt seiner enzymatischen Aktivität gereinigt werden. Dabei blieb die enzymatische Aktivität der β-Carotin-Ketolase nicht nur erhalten, sondern steigerte sich im Vergleich zur Aktivität in der cytosolischen Fraktion um den Faktor 4,5. Die funktionelle Expression der β-Carotin-Ketolase in höheren Pflanzen Nicotiana tabacum, N. tabacum CrtZ Linie U3, N. glauca und Solanum tuberosum Baltica 47-18 erfolgte unter der Kontrolle des konstitutiven CaMV 35S-Promotors. Außer in der Transformante N. glauca CrtO schien die Integration der Ketolase in das Genom der Pflanzen und die Expression von CrtO die Fitness der Transformanten, gemessen am Chlorophyllgehalt und der photosynthetischen Effizienz, nicht negativ beeinflußt zu haben. Der Gesamtcarotinoidgehalt in den Blättern von N. tabacum CrtO und N. tabacum CrtZ Linie U3 CrtO änderte sich trotz der Integration des crtO-Gens kaum im Vergleich zu den Wildtypen. In Blättern von S. tuberosum Baltica 47-18 CrtO konnte eine leichte Erhöhung des Gesamtcarotinoidgehaltes beobachtet werden. Dagegen kann es in Blättern von N. glauca CrtO zu einer Verdoppelung des Carotinoidgehaltes bei gleichzeitig halbiertem Chlorophyllgehalt. In den Blättern akkumulierten Ketocarotinoide mit Anteilen von 5% in N. tabacum CrtO, 12% in S. tuberosum Baltica 47-18 CrtO, 18% in N. tabacum CrtZ Linie U3 CrtO und 16-33% in N. glauca CrtO. Die Anteile der synthetisierten Ketocarotinoide setzten sich in den Blättern von N. tabacum CrtO und N. tabacum CrtZ Linie U3 CrtO aus Echinenon, 3’-Hydroxyechinenon und Ketolutein zusammen, während in Blättern von N. glauca CrtO und S. tuberosum Baltica 47-18 CrtO Echinenon, 3’-Hydroxyechinenon und 4-Ketozeaxanthin enthalten waren. In Nektarien von N. tabacum CrtO und N. tabacum CrtZ Linie U3 CrtO wurde der Gesamtcarotinoidgehalt verdoppelt bis verdreifacht im Vergleich zu den Nektarien des entsprechenden Wildtyps. Es akkumulierten Echinenon, 3’-Hydroxyechinenon, 4-Ketozeaxanthin und Ketolutein. Dabei enthielten die Nektarien von N. tabacum CrtZ Linie U3 CrtO die meisten Ketocarotinoide. Die Nektarien von N. glauca CrtO enthielten deutlich weniger Ketocarotinoidanteile, obwohl der Gesamtcarotinoidgehalt fast dreimal so hoch ist wie in N. tabacum CrtO und N. tabacum CrtZ Linie U3 CrtO. Es akkumulierten nur Echinenon, 3’-Hydroxyechinenon und Ketolutein. Die anderen Blütenorgane von N. glauca CrtO wiesen deutlich höhere Anteile an Ketocarotinoiden auf, zeigten aber wie die Nektarien gegenüber dem Wildtyp keine deutlichen Unterschiede im Gesamtcarotinoidgehalt. Für die Synthese von Astaxanthin war eine Interaktion zwischen der β-Carotin-Hydroxylase und der β-Carotin-Ketolase von entscheidender Bedeutung. Die Akkumulation von „Intermediaten“ der Astaxanthin-Biosynthese in N. tabacum CrtO, N. tabacum CrtZ Linie U3 CrtO und N. glauca CrtO wies auf eine erfolgreiche Interaktion hin. Einzig in den Knollen der CrtO-Transformanten von S. tuberosum Baltica 47-18 konnte Astaxanthin mit einem Anteil von 2% am Gesamtcarotinoidgehalt nachgewiesen werden. Die Nektarien N. tabacum CrtZ Linie U3 CrtO erwiesen sich neben den Knollen als am besten für die Produktion von ketolierten und hydroxylierten Carotinoiden. Die Transformation von N. glauca mit einem Gen der Carotinoidbiosynthese wurde in der vorliegenden Arbeit erstmals durchgeführt, zeigte aber nicht die erwartete Produktion größerer Mengen an Ketocarotinoiden in Kronblättern. Außerdem ist es in der vorliegenden Arbeit erstmals gelungen, in der Kartoffelknolle durch die Einführung einer cyanobakteriellen β-Carotin-Ketolase die Biosynthese von Ketocarotinoiden zu etablieren, um das für die Ernährung wichtige Ketocarotinoid Astaxanthin zu akkumulieren.
Von Juni 1990 bis Februar 1991 wurde bei 9 Patienten eine immunszintigraphische Untersuchung mit dem Technetium-99m markierten, intakten, murinen, monoklonalen Anti-CEA-Antikörper BW 431/26 (Behring-Werke, Marburg) im Rahmen einer Phase-I-III-Studie durchgeführt. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, daß die Immunszintigraphie potentiell ein diagnostisch leistungsfähiges Verfahren ist, dem als Prinzip eine bildgebende Darstellung der spezifischen Interaktion radioaktiv markierter, monoklonaler Antikörper mit tumorzellständigen Antigenen zugrunde liegt (Baum 1989). Nach Dokumentation der Anamnese, der Ergebnisse anderer bildgebender Verfahren - und soweit erfolgt - von Operationsbefunden und Histologie, erfolgte eine Auswertung der Kinetik des Tc-99m markierten Antikörpers im Blut sowie eine Ganzkörperuntersuchung, getrennt nach anatomischen Regionen und Organen sowie einzelnen Tumorlokalisationen, wozu die Immunszintigraphie auch mit anderen bildgebenden Verfahren (Sonographie, CT, Endoskopie, Röntgen, Szintigraphie) verglichen wurde. Mögliche Indikationen zur Immunszintigraphie mit dem monoklonalen Antikörper BW 431/26 sind demnach: • Staging des Blasenkarzinoms zum Ausschluß extravesikaler Tumormanifestationen • Primärtumorsuche von unbekannten, CEA-exprimierenden Primärtumoren, die konventionell nicht auffindbar/darstellbar sind • Diagnostik von Lebermetastasen • Diagnostik von Lokalrezidiven bei vesikalen und rektosigmoidalen Karzinomen • Diagnostik von Lymphknotenmetastasen abdominell und thorakal • Diagnostik von extrahepatischen Läsionen bei Patienten mit bekannter Lebermetastasierung. Die kinetischen Eigenschaften des Tc-99m markierten monoklonalen Anti-CEAAntikörpers BW431/26, seine Verteilung und Anreicherung in den verschiedenen Organen und in CEA-exprimierenden Tumoren, die gute Verträglichkeit bei insgesamt geringer Strahlenbelastung, lassen die Immunszintigraphie als geeignet zum patientengerechten Staging von CEA-exprimierenden Tumoren erscheinen. Dieses Verfahren ermöglicht als Ganzkörperuntersuchung auch eine gute Übersicht über das Tumorgeschehen. Um allerdings wiederholte Untersuchungen im Rahmen der Nachsorge durchführen zu können, wird künftig die klinische Erforschung humaner Antimaus-Antikörper-Reaktionen und deren immunologischen Verhaltens nach erneuter Applikation des murinen Antikörpers erforderlich sein.
Anhand einer osmotischen Auffschlussmethode für B. subtilis konnte ohne Zugabe von Detergenzien erreicht werden, dass die beiden Modifikationsproteine SpaB und SpaC in löslicher Form vorliegen. Demzufolge handelt es sich bei dem Subtilin-Synthetase-Komplex nicht um einen starren membranständigen Komplex, sondern um eine transiente Assoziation der SpaB/C-Proteine mit dem Transportprotein SpaT während der Modifikationsreaktion. Durch Interaktionsstudien mit heterolog produzierten Subtilinpräpropeptid (SubHAHis) konnte eine spezifische Interaktion mit dem löslichen SpaC-Protein gezeigt werden. Komplementationsversuche zeigten, dass der DspaC amyE::spaS-Stamm durch das SpaCsowie das EriC-, jedoch nicht durch das NisC-Protein komplementiert wird. Ebenfalls ist ein C-terminal verkürztes bzw. verlängertes SpaC-Protein nicht in der Lage ist, Subtilin richtig zu modifizieren. Mit Hilfe einer in vitro Mutagenese der ligandierenden Aminosäuren Cystein 303, Cystein 349 und Histidin 350 konnte gezeigt werden, dass das Zink-Ion des SpaC-Proteins an der katalytischen Reaktion beteiligt ist. Beim Ausschalten der Aminosäuren Histidin 212 und Tyrosin 304 konnte ebenfalls ein Ausfall der Subtilinproduktion beobachtet werden. Es wäre denkbar, dass beide Aminosäuren in einer Säure/Base-Reaktion bei der Subtilinmodifikation involviert sein könnten. Die Aminosäure Tryptophan 302 hingegen bildet mit dem C-terminalen ALL-Motiv des Proteins ein hydrophobes Cluster, was eine Rolle beider Elemente in Stabilisation des Reaktionszentrums und Substratbindung nahe legt. Für das SubHAHis konnte gezeigt werden, dass es von der Modifikationsmaschinerie akzeptiert und auch produziert wird, jedoch entsteht ebenfalls ein Heterodimer zwischen dem SubHAHis und den Modifikationsproteinen SpaB und SpaC, an dessen Formation der Hexa-Histidin-Tag maßgeblich beteiligt ist. Eine mögliche Heterodimerformation im Subtilinproduzenten ATCC 6633 konnte unter bestimmten Bedingungen ebenfalls nachgewiesen werden, was auf eine mögliche kovalente Zwischenstufe bei der Lanthioninbrückenbildung hinweist. Des Weiteren konnte durch in vitro Mutagenese-Studien gezeigt werden, dass die katalytische Reaktion des SpaC-Proteins an der Heterodimerformation beteiligt ist. Das SpaC-SubHAHis Heterodimer konnte erfolgreich angereichert und mittels Peptidmassenkartierung eindeutig als kovalentes Heterodimer zwischen den beiden Proteinen identifiziert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass bei der Modifikation des Subtilinpräpropeptids durch das SpaC-Protein eine transiente kovalente Bindung zwischen dem Präpropeptid und dem SpaCProtein ausgebildet wird. Die Bildung eines möglichen Heterodimers zwischen SpaC und dem Subtilinpräpropeptid konnte ebenfalls unter bestimmten Bedingungen beim Wildtyp nachgewiesen werden. Dieser Befund legt nahe, dass es sich bei der Heterodimerbildung um eine katalytische Zwischenstufe bei der Modifikation des Präpropeptids durch das SpaC handeln könnte, welches durch die Anwesenheit des Hexa-Hisitidin-Tags arretiert wird. Neben dem bekannten Subtilinproduzenten B. subtilis ATCC 6633 konnten weitere Stämme der W23-Untergruppe der Spezies B. subtilis als Subtilinproduzenten identifiziert werden, was impliziert, dass ein Merkmal der W23-Gruppe die Produktion von Subtilin ist und diese als Biomarker dienen könnte. Des Weiteren konnte beobachtet werden, dass ein um die Aminosäuren Glycin und Serin C-terminal verlängertes Subtilin (Subtilin-GS) eine gesteigerte Subtilin-Autoinduktion hervorruft. Durch die Zugabe von Mangan zu einer Subtilin-Produzierenden Kultur konnte ebenfalls gezeigt werden, dass das Mangan alleine einen steigernden Einfluss auf die Induktion des PspaB-Promotors besitzt, während eine gesteigerte Aktivität des PspaS-Promotors nur bei der gleichzeitigen Anwesenheit von Subtilin beobachtet werden konnte. Durch die gezielte Zugabe von Mangan und Subtilin-GS ist es dementsprechend möglich, eine erhöhte Autoinduktion und somit eine erhöhte Produktion an Subtilin zu erreichen.
Ferrocenbasierte Polymere haben in den vergangenen Jahrzehnten reges Interesse hervorgerufen, welches in ihren einzigartigen optischen und elektronischen Eigenschaften begründet ist. Diese sind auf die Anwesenheit der redoxaktiven Eisenionen sowie auf kooperative Effekte entlang des Polymerstrangs zurück zu führen. Die substanzspezifischen Merkmale hängen dabei nicht nur von der Position der Ferroceneinheiten im Makromolekül ab, sondern auch von der chemischen Natur der verbrückenden Einheiten. Hier bewähren sich solche Atome und Gruppen, die in der Lage sind, Elektronendichte zu übertragen. Ein in dieser Hinsicht besonders viel versprechendes Element ist Bor, da es im sp2-hybridisierten Zustand ein leeres p-Orbital besitzt und dieses für die Übertragung von Ladungsdichte zur Verfügung stellen kann. Vor diesem Hintergrund galt es nun auf der Basis neuartiger Kondensationsreaktionen zunächst Diferrocenylborane zu synthetisieren und anhand ausgewählter Derivate Kenntnisse über charakteristische Eigenschaften dieser Substanzklasse zu gewinnen. Die kurzkettigen Moleküle dienten als Modellverbindungen für Poly(ferrocenylen)e, welche im Mittelpunkt des zweiten Teils dieser Arbeit standen. .... In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass sich das neuartige Polymer [-fc-B(Br)-]n (33) hervorragend als Edukt eignet, um vielfältige borverbrückte Poly(ferrocenylen)-Derivate sowohl mit trigonalen als auch mit tetragonalen Borzentren darzustellen. Die beschriebenen Systeme weisen eindeutige Merkmale von Eisen-Eisen-Wechselwirkungen entlang der Polymerhauptkette auf, wobei sich das Ausmaß dieser Interaktionen über die Wahl der Substituenten an den Boratomen gezielt beeinflussen lässt. Die dargestellten Materialien besitzen somit großes Potential für die Entwicklung „Molekularer Drähte“ auf der Nanoskala.
Charakterisierung prolylhydroxylase-vermittelter Effekte in der Physiologie von Glioblastomen
(2006)
Der Transkriptionsfaktor HIF übernimmt eine Schlüsselrolle in der Adaption an Hypoxie. In der Tumorgenese werden dem HIF-System in Abhängigkeit von HIF-Proteinmengen sowohl pro- als auch anti-tumorigene Effekte zugeschrieben. Die Regulation von HIF-Proteinmengen erfolgt maßgeblich über vier Mitglieder der Enzymfamilie der 2-Oxoglutarat-abhängigen Dioxygenasen, PHD1-4. Aufgabe dieser Arbeit war die Charakterisierung prolylhydroxylase-vermittelter Effekte in der Physiologie von Glioblastomen. Es konnte gezeigt werden, dass sich die vier PHD-Orthologe in ihrer zellulären Lokalisation in Glioblastomzellen unterscheiden. Während PHD1 nukleär sowie perinukleär und PHD2 eher homogen verteilt in Zytoplasma und Nukleus zu finden waren, zeigten PHD3 und PHD4 eine exklusiv perinukleäre Lokalisation. Kolokalisations-Studien der PHDs mit subzellulären Strukturen ergab vor allem ein hohes Maß an Kolokalisation der Orthologe PHD1, PHD3 und PHD4 mit den Mitochondrien. Weiterhin variierten die mRNA-Expressionshöhen der PHDs in verschiedenen Glioblastomzelllinien, wobei PHD1 und PHD2 die höchste Expression aufwiesen und PHD4 die niedrigste. Zudem induzierte Hypoxie die mRNA-Expression von PHD2 und PHD3, wobei die PHD3-Induktion bis zu zwei Log-Stufen umfasste. Auch auf Proteinebene bestätigte sich die Hypoxie-Induzierbarkeit von PHD2 und PHD3, während Proteinmengen der anderen beiden Orthologe davon nicht beeinflusst wurden. Überexpressions- sowie Knockdown-Studien identifizierten PHD2 als ein HIF-1alpha-Zielgen, während PHD3 durch HIF-1alpha und HIF-2alpha reguliert wurde. Trotz ihrer O2-Abhängigkeit behielten die PHDs, insbesondere PHD2 und PHD3, auch unter niedrigen pO2 ihre enzymatische Aktivität und reduzierten effektiv HIF-Proteinmengen sowie -Zielgenexpression. Des weiteren übernehmen die PHDs eine anti-apoptotische Rolle, da PHD-Inhibierung zu erhöhter, PHD-Überexpression dagegen zu reduzierter Apoptose-Induktion führte. Offenbar agieren die PHD-Orthologe in Glioblastomzellen als negatives Feedback-System, das über effektive und gleichzeitig variable Regulation von HIF-Leveln, bzw. -Aktivität das Gleichgewicht zwischen Zell-Überleben und Zelltod entscheidend beeinflusst.
Replizierende Murine Leukämieviren (MLV) können wertvolle Werkzeuge für die humane Krebsgentherapie werden, da sie das Transgen innerhalb des gewünschten Gewebes verteilen, ihr Genom stabil integrieren und einen natürlichen Tumortropismus aufweisen. In vorliegender Arbeit wurde ein System zur visuellen Analyse der MLV‐Replikation sowie der Virusbindung an Zielzellen mittels Einfügung fluoreszierender Proteine etabliert und als Werkzeug für dasDesign und die Optimierung dieser Viren als Gentherapievektoren benutzt. Zuerst wurde die Kodierungskapazität dieser Retroviren durch Aufteilen der viralen Gene auf zwei semireplikative Vektoren vergößert. Die Kopplung der Genome mit fluoreszierenden Proteinen ermöglichte ebenfalls in diesem Zusammenhang die Beobachtung der Repliktion aber auch die einfache Aufdeckung von Rekombinationsereignissen. Die Ergebnisse zeigten den Bedarf weiterer Optimierungen, stellten allerdings einen Vorreiter auf diesem Forschungsgebiet dar und zeigten das Potential dieses Systems auf (Sliva et al., 2004a). Zusätzlich zum natürlichen Tumortropismus sollte die Sicherheit von replizierenden Retroviren für die Tumortherapie erhöht werdn. Gezielte Veränderungen des ecotropen Hüllproteins zu EGFR‐exprimierenden Zellen mittels gerichteter Evolution sowie der Versuch, den Wirtstropismus des Env mit der Insertion des Liganden SDF‐1α auf humane CXCR4‐exprimierende Zellen auszuweiten, sind jedoch gescheitert. Diese Daten müssen sich in die Reihe der erfolglos gebliebenen Versuche, den Wirtstropismus des ecotropen Env auf humane Zellen auszuweiten, einreihen (Sliva et al., 2004b). Abschließend wurde shRNA als therapeutisches Effektormolekül erfolgreich mittels replikationskompetenter MLV in Zielzellen überragen, was zur deutlichen Herabsetzung des Proteinlevels des Zielproteins der siRNA führte (Sliva et al., 2006). Diese modifizierten Viren sind ein gutes Werkzeug zur einfachen in vitro Untersuchung von Genfunktionen, und könnten auch eine Erleichterung für die Untersuchung von Genfunktionen innerhalb von proliferierendem Tumorgewebe darstelln. Des Weiteren präsentieren die Ergebnisse und Beobachtungen dieser Arbeit einen großen Schritt in Richtung Anwendung dieser Virn für die humane Gentherapie. Denn gekoppelt mit z.B. einer tumorspezifischen Expression der shRNA‐Expressionskassette und der intelligenten Wahl der siRNA‐(Ziel)Sequenz, die nach Applikation zum Tod von malignen Tumorzellen führt, wären sie die perfekte Waffe gegen solide Tumoren.
Die sekretorischen Phospholipasen A2 (sPLA2) sind eine Familie von Enzymen, die die Fähigkeit besitzen, die Hydrolyse der mittleren (sn-2) Esterbindung aus Phospholipiden zu katalysieren. Die Produkte dieser Hydrolyse, freie Fettsäuren und Lysophospholipide, sind nicht nur Bausteine für die Synthese von Lipiden, sondern sie haben wichtige Funktionen als Lipid „second-messenger“ in zellulären Signaltransduktionsprozessen. In der Klasse der sekretorischen PLA2 wurden in Säugern bisher 10 Isoenzyme identifiziert, wobei die sPLA2-IIC beim Menschen nur als Pseudogen vorkommt. In der murinen Epidermis scheinen eines oder mehrere dieser Enzyme eine Rolle bei der Bildung der epidermalen Permeabilitätsbarriere zu spielen. Darüber hinaus kontrollieren sie die Freisetzung von Arachidonsäure für die Produktion von Eicosanoiden, die sowohl für die Proliferation der Keratinozyten als auch für inflammatorische Prozesse und die Entstehung von Tumoren in der Haut von entscheidender Bedeutung sind. Da bislang weder das detaillierte Expressionsmuster der einzelnen sPLA2-Enzyme noch deren spezifische Funktionen in muriner Epidermis bekannt war, wurde in der vorliegenden Arbeit eine umfassende Analyse an Schnitten von neonataler Maushaut und an murinen Papillomschnitten durchgeführt. Zusätzlich zum Nachweis der sPLA2-Expression in vivo wurden primäre murine Keratinozyten in vitro verwendet, um die Auswirkungen der Differenzierung der Keratinozyten auf die Expression der verschiedenen sPLA2-Enzyme zu untersuchen. Die Tumorzellinie HEL30 wurde zur Durchführung funktioneller Studien und für Kolokalisationsstudien verwendet. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass in den Keratinozyten der neonatalen Maushaut in vivo sowie in isolierten primären murinen Keratinozyten alle bisher bekannten sPLA2 Enzyme exprimiert sind. Für die sPLA2-IB, -IIE, -IIF, -V und -XII konnte sowohl in den Keratinozyten der neonatalen Maushaut als auch in den primären Keratinozyten eine Expression vor allem in den differenzierten Zellen nachgewiesen werden. Dass diese Enzyme somit wahrscheinlich mit Differenzierungsprozessen gekoppelt sind, zeigte sich am Beispiel der sPLA2-V, die im murinen Papillom, welches vorwiegend aus proliferierenden Keratinozyten steht, nicht exprimiert war. Hingegen waren sPLA2 -IIA, -IID, und -X fast ausschließlich in Keratinozyten der Basalzellschicht der Epidermis und in den proliferierenden primären Keratinozyten exprimiert. Dies läßt vermuten, dass diese Enzyme eventuell eine Rolle bei der (Hyper-)Proliferation von Keratinozyten spielen. Darüber hinaus sind diese Enzyme auch in der Lage, Arachidonsäure freizusetzen, und sind somit eventuell an der Eicosanois-Homöostase beteiligt. Um eine eventuelle Beteiligung der basal exprimierten sPLA2 Enzyme an der Eicosanoidbiosynthese nachzuweisen, wurden Immunfluoreszenzstudien an neonataler Maushaut und an murinen Hautpapillomen des 2-Stufen-Tumorpromotionsmodells durchgeführt. Wie zuvor beschrieben waren alle drei Enzyme in der Basalzellschicht der neonatalen Maushaut exprimiert. Im Gegensatz dazu war die sPLA2-IIA im murinen Papillom nur am äußersten, nicht mehr hochproliferativen, Papillomrand zu detektieren. Die sPLA2-X dagegen zeigte eine starke Expression in den hochproliferativen basalen Keratinozyten dieses Gewebes. Für die sPLA2-IID konnte im Papillom ein Expressionsmuster festgestellt werden, das bis in die suprabasalen Schichten reicht. Betrachtet man die Expression der phospho-cPLA2, so konnte dieses Enzym in der neonatalen Maushaut vor allem in der Basalzellschicht, aber auch suprabasal im Stratum spinosum detektiert werden. Im Papillom zeigt dieses Enzym dagegen eine sehr starke Expression im gesamten Gewebe. Wie erwartet konnte COX-2 in der neonatalen Maushaut nicht detektiert werden, während das Expressionsmuster dieses Enzymes im Papillom mit dem der sPLA2-IID und phospho-cPLA2 korreliert Um Hinweise über die Expression und Funktion von sPLA2 –IID, -X und cP LA2 im Karzinom zu bekommen, wurde als Modellsystem die murine Karzinomzelllinie HEL30 verwendet. Diese Zellen produzieren bereits konstitutiv eine hohe Menge an PGE2. Eine TPA Stimulation dieser Zellen induziert eine zusätzlich stark erhöhte PGE2 Produktion. Anhand der Ergebnisse aus den Western Blot Analysen konnte gezeigt werden , dass sPLA2-IID und -X in den HEL30-Zellen auf Proteinebene exprimiert sind, jedoch konnte keine Veränderung der Proteinexpression dieser beiden Enzyme nach TPA-Behandlung der HEL30 Zellen detektiert werden. Dies führte zu der Annahme, dass diese Enzyme eventuell, wie die cPLA2, über ihre Enzymaktivität oder eine zelluläre Translokation reguliert werden. Durch den Einsatz des sPLA2-Inhibitors Me-Indoxam konnte jedoch weder die konstitutive noch die TPA-stimulierte PGE2 Produktion gehemmt werden, was vermutlich, wie die anschließenden siRNA Studien zeigen, auch an der Eigenschaft dieses Inhibitors liegen könnte nicht membrangängig zu sein. Weiterhin konnte durch den Einsatz des COX-2-spezifische Inhibitors Celecoxib und des COX-1-präferierende Inhibitor Indomethazin gezeigt werden, dass COX-2 vor allem an der TPA induzierte PGE2-Freisetzung, und COX-1 sowohl an der konstitutiven als auch an der der TPA induzierten PGE2-Freisetzung aus HEL30 Zellen beteiligt sind. Die Ergebnisse der Untersuchungen mit dem cPLA2-Inhibitor Pyrrolidin-1 lassen vermuten, dass in diesen Zellen die cPLA2 vor allem an der TPA induzierten PGEs-Synthese beteiligt ist, aber nicht an der konstitutiven Freisetzung. Während in unbehandelten HEL30 Zellen die sPLA2-IID im Cytosol exprimiert ist und eine schwache Kolokalisation mit COX-2 zeigt, verlagert sich dieses Enzym nach 20 minütiger TPA Stimulation, in Richtung Kernmembran und zeigt nun eine sehr starke Kolokalisation mit COX-2. Nach Inkubation der HEL30 Zellen mit einer siRNA, die die Expression der sPLA2-IID ausschalten sollte, war sowohl die konstitutive als auch die TPA-induzierte PGE2-Biosynthese signifikant reduziert. Gleichzeitig konnte durch den Einsatz der siRNA eine Reduktion des sPLA2-IID-Proteins beobachtet werden. Dies deutet an, dass die sPLA2-IID mit beiden Cyclooxygenasen gekoppelt sein könnte und ihr Substrat je nach Stimulation und Änderung der Lokalisation dem einen oder dem anderen Enzym zur Verfügung stellt. Somit konnte in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass die sPLA2-IID intrazellulär katalytisch aktiv ist und signifikant zur PGE2-Biosynthese beiträgt. Um genauere Aussagen über die Bedeutung dieser sehr interressanten Ergebnisse machen zu können, sind weitere Untersuchungen nötig, um herrauszufinden, ob die Herunterregulierung der sPLA2-IID - z.B. in Form einer sPLA2-IID-knockout-Maus - Konsequenzen für die Hyperproliferation derKeratinozyten hat, und somit einen Einfluß auf die Progression der Tumorpromotion ausüben könnte. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit ein spezifisches Expressionsmuster für die Gruppen I, II, V, X und XII sPLA2 in der murinen Haut beschrieben werden, welches mit der Regulation von Wachstum und Differenzierung verbunden ist. Hieraus läßt sich schließen, dass die einzelnen sPLA2 Enzyme unterschiedliche Funktionen in der epidermalen Homöostase sowohl unter normalen als auch pathologischen Bedingungen ausüben.
Das aktuell diskutierte Modell der lichtabhängigen Magnetrezeption bei Vögeln beschreibt, dass die Richtung des Erdmagnetfelds durch Radikalpaarprozesse in spezialisierten Photorezeptoren wahrgenommen wird. Dabei werden Cryptochrome, eine Klasse photoaktiver Flavoproteine, als potentielle Kandidaten für das Radikalpaarmodell und damit als mögliches Magnetrezeptormolekül diskutiert. Verhaltensbiologische Experimente mit Zugvögeln zeigen, dass der Magnetrezeptionsprozess offensichtlich stark lateralisiert im rechten Auge stattfindet und dass dieser Prozess Licht aus dem blau-grünen Teil des Spektrums benötigt. Cryptochrome absorbieren Licht in diesem Bereich und besitzen darüber hinaus biochemische Eigenschaften, die für die Funktion des Radikalpaarmodells entscheidend sind. Vor dem Hintergrund dieser Überlegungen habe ich untersucht, ob Cryptochrom (CRY) in der Retina des Rotkehlchens, Erithacus rubecula, einem nachtziehenden Singvogel, zu finden ist. Mit molekulargenetischen Methoden konnte ich erstmals drei individuell exprimierte Cryptochrome aus der Rotkehlchenretina isolieren: Erithacus (e)-CRY1a, -CRY1b und -CRY2. Während eCRY1a und eCRY2 fast vollständig homolog zu Cryptochrom 1 und 2 in der Retina des Haushuhns sind, besitzt eCRY1b eine noch unbeschriebene C-terminale Domäne, die auf neue Proteinbindungseigenschaften und Interaktionspartner hindeutet. Die Identifizierung eines Kernlokalisierungssignals bei eCRY2 weist auf dessen Lokalisierung im Zellkern hin und macht seine Funktion als sensorischer Lichtrezeptor eher unwahrscheinlich. Ein mit Hilfe der Aminosäurensequenz erstelltes Proteinmodell von eCRY1 zeigt, dass dieser Typus zwei Cofaktoren besitzt: das katalytische Chromophor Flavinadenindinukleotid (FAD) und das lichtsammelnde Pterin Methenyltetrahydrofolat (MTHF). eCRY1a und eCRY1b sind Spleißprodukte des gleichen Gens; ihre C-terminalen Domänen sind auf unterschiedlichen Exonen codiert. eCRY1a und eCRY1b besitzen beide keine Membranbindedomäne und liegen zytosolisch vor. Weil jedoch laut Radikalpaartheorie die magnetosensitiven Rezeptoren zumindest im Moment der Photonenabsorption in einer bestimmten Anordnung und Raumrichtung vorliegen müssen, benötigen beide eCRY1-Varianten daher mindestens einen sphärisch fixierten Interaktionspartner. In meiner Arbeit diskutiere ich Opsine als mögliche Partner, da diese in den Aussensegmenten der Photorezeptoren stark geordnet und in konstanter Raumrichtung vorliegen. Die Genexpression von eCRY1a und eCRY1b unterscheidet sich sowohl zwischen den Augen als auch zwischen den CRY-Varianten. Im Mittel waren die Expressionswerte von eCRY1a in der Rotkehlchenretina fünf- bis zehnmal höher als die von eCRY1b. In der Dämmerung und nachts ist eCRY1a im linken Auge signifikant höher exprimiert als im rechten Auge. Im Gegensatz dazu ist die Expression von eCRY1b in beiden Augen gleich, zeigt jedoch einen signifikanten Anstieg zu Beginn des Zuges in der Dämmerung. Durch die unterschiedlichen Expressionsraten von eCRY1a und eCRY1b verschiebt sich zum Zeitpunkt der Richtungsentscheidung des Vogels in der Dämmerung das Verhältnis zwischen den beiden Cryptochrom1-Varianten im rechten Auge zugunsten von eCRY1b. Die Ergebnisse meiner Expressionsstudie deuten darauf hin, dass die in Verhaltensversuchen nachgewiesene Lateralisation des Magnetkompass bereits auf Rezeptorebene in der Retina beginnen könnte. mRNA in situ- als auch immunohistochemische Untersuchungen dieser Arbeit zeigen, dass bei Zugvögeln sowohl die mRNA als auch die Proteine beider eCRY1-Typen in den Innensegmenten der retinalen Photorezeptoren lokalisiert sind. Die räumliche Nachbarschaft zu Opsinen unterstützt die Annahme einer möglichen Interaktion zwischen diesen und Cryptochrom. Darüber hinaus lässt dieser Befund Spekulationen zu, dass die neuronale Verarbeitung der aus den Photorezeptoren stammenden magnetischen Richtungsinformation analog zum bildverarbeitenden Sehen stattfinden könnte. Modelle für eine mögliche Verschaltung und Signalverarbeitung der Cryptochromsignale werden in dieser Arbeit diskutiert. Insgesamt unterstützen die Befunde meiner Arbeit die im Radikalpaarmodell diskutierte Annahme, dass Cryptochrome eine entscheidende Rolle bei der Perzeption von magnetischer Kompassinformation bei Zugvögeln spielen und möglicherweise als Magnetrezeptormoleküle fungieren. Darüber hinaus könnten die Ergebnisse einen wichtigen Beitrag zu einem besseren Verständnis des Gesamtprozesses der Magnetrezeption bei Tieren leisten, und zwar von der Rezeptorzelle bis zur Verhaltensantwort. Meine Ergebnisse tragen möglicherweise auch dazu bei, die bekannten neurowissenschaftlichen und funktionell morphologischen mit den entsprechenden ethologischen Ergebnissen zu verknüpfen. Ich würde es sehr begrüßen, wenn meine Arbeit zu weiterführender Forschung auf diesem spannenden Gebiet anregt und zu einem besseren Verständnis der noch unbekannten Aspekte der Magnetrezeption beitrüge.
In der Arbeit wurde der Deutschunterricht im Iran in Bezug auf seine Gegenstände, Ziele, Methoden und die ihn anbietenden Institutionen auf diskurstheoretischer Grundlage besonders im Hinblick auf Aspekte interkultureller Kommunikation beschrieben und untersucht. Wenn gerade die kommunikativen Aspekte des Deutschunterrichts in den Blick genommen werden, darf nicht übersehen werden, dass dabei nicht nur rein sprachliche, sondern auch kulturelle Aspekte des Lehrens und Lernens zu berücksichtigen sind. Die Ziele der Arbeit in Fragen der Deutschdidaktik ergeben sich aus besonderer Beachtung dieser Aspekte und sind auf Forschung, Lehre und Analysemethoden bezogen. Die einzelnen Kapitel sind explorativ und vermitteln insgesamt einen Eindruck von der Vielfalt der Fragestellungen und so auch von den neueren Entwicklungen und Fragestellungen, die sich in der unterrichtlichen Kommunikation bei iranischen Deutschlernern und –lehrern aufgetan haben. Das umfangreiche Material, das hier erstmals in einer bearbeitungsfähigen Form zur Verfügung gestellt wurde, bietet den Lesern reiche Möglichkeiten, weitere Phänomene interkultureller Kommunikation selbst zu entdecken und zu untersuchen. Darüber hinaus wird sprachliches Handeln im DaF-Unterricht im Hinblick auf „interkulturelle Kommunikation“ und auf die Möglichkeit, die „Diskursanalyse“ als Untersuchungsmethode darauf anzuwenden, beleuchtet.
Die Überzeugung, dass der Computer nicht als Werkzeug, sondern als Medium zu denken sei, hat in den zurückliegenden Jahren die Debatte zu einer Medientheorie des Computers wesentlich geprägt. Damit war insbesondere eine bestimmte Auffassung des Technischen verbunden. Die Effekte der technischen Medien lassen sich, so der Gedanke, nicht über die Aktivierung anthropologischer Schemata begreifen, vielmehr müssen die Medien in ihrer Technizität ernst genommen werden. Dies heißt aber nichts anderes, als dass der Technik ein Eigenwert zuzugestehen sei, der sich gerade nicht vom Menschen her konturieren lässt. Hierüber diskreditiere sich dann letztlich eine Rede von den Medien als werkzeughaften Extensionen des Menschen. Demgegenüber soll in dieser Arbeit der Vorschlag unterbreitet werden, den Computer eben doch wieder vom Werkzeug her zu denken. Damit soll jedoch keinesfalls über den erreichten Stand medientheoretischer Positionen hinweggesehen werden. Mit dem Medienbegriff umzugehen bedeutet nicht zuletzt, den epistemischen Status mitzureflektieren, den die Medien inne haben. Sie geben den Rahmen vor, in dem sich die Subjekte äußern können. Die Medien strukturieren diese Äußerungen bereits vorab bzw. ermöglichen überhaupt erst bestimmte Äußerungsformen. Sich hierüber Rechenschaft abzulegen bedeutet aber nicht notwendig, die Metapher einer werkzeughaften Nutzung des hoch technischen neuen Mediums als trügerisch verwerfen zu müssen. Gerade diese Nutzungsweise unterscheidet den Computer vom vorherrschenden Medienparadigma des 20. Jahrhunderts, von Film und Fernsehen und dem daraus abzuleitenden Status des Rezipienten als Rezipienten. Die vorliegende Arbeit betreibt also Werbung für einen produktiven Gebrauch des neuen Mediums, wobei es jedoch nicht darum geht, den Computer als eine Art Befreiung von den "Zwängen" der anderen technischen Medien zu positionieren. Sofern Medien überhaupt -- im strengen Sinne – Zwänge ausüben, so wäre doch nicht einzusehen, warum dies beim Computer anders sein sollte. Dennoch: Dass es so etwas wie eine "Creative Commons" gibt, dass es immer selbstverständlicher wird, wenn Nutzer ihre kreativen Produkte nicht nur mit anderen Nutzern teilen, sondern sie es darüber hinaus ermöglichen, dass auf Basis ihrer Produkte weitergearbeitet werden kann, nährt die Vermutung eines sich ändernden Verhältnisses zwischen den Nutzern und den Medien. Zentrales Ziel dieser Arbeit ist daher zunächst, die sich in der Medienwissenschaft bereits etablierte Perspektive auf den Computer als eines Textmediums zu kritisieren, da hierüber allzu leichtfertig eine bestimmte Nutzungsweise des Computers verabsolutiert werden kann: Einzig der programmierende Zugriff gilt als emanzipativ. Daran anschließend möchte ich nach einer kurzen Diskussion des Medienbegriffes das in der Softwareentwicklung lange Zeit bestimmende Gestaltungskonzept der Werkzeugnutzung für eine neuerliche Verwendung in der Medienwissenschaft vorschlagen. Vorteil ist, dass hiermit auch Nutzerpraxen adäquat einbezogen werden können, die sich auf den "Oberflächen" der Software abspielen. Betrachtet man Medien nicht als bloße Übertragungskanäle und versucht man, die produktive Seite von Medientechnologien in den Blick zu nehmen, dann weist die "Botschaft" des neuen Mediums in die Richtung eines Wechsels vom Rezipienten zum Produzenten. In dieser Perspektive erscheinen die Nutzer nicht mehr nur als Anhängsel der Technik. Sie sind nicht von ihr aus zu bestimmen, ebenso wenig wie die Medientechnik rein vom Menschen her zu bestimmen wäre. Um die These einer werkzeughaften Verwendbarkeit des Computers auszuführen, konzentriert sich die vorliegende Arbeit auf bestimmte Texte, die genauer diskutiert und in die Argumentation integriert werden. Dies erscheint mir fruchtbarer als der Versuch, das gesamte Spektrum der neueren Diskussion um den Computer als Medium aufgreifen und synthetisieren zu wollen. Die Gliederung verläuft dementsprechend weitgehend entlang dieser (theoretischen) Referenzen.
Die vorliegende Untersuchung wurde im Rahmen des Verbundprojekts „BIOTA West Afrika“ durchgeführt und befasst sich mit der raum/zeitlichen Analyse der Landbedeckung und der räumlichen Modellierung von Mustern der Pflanzenvielfalt in drei Untersuchungsgebieten in Burkina Faso und Benin. Der erste Teil der Untersuchung beinhaltet die Dokumentation und Analyse der Landbedeckung und Landnutzung und ihrer raum/zeitlichen Veränderungen entlang eines Klimagradienten vom ariden Norden Burkina Fasos bis in den semiariden Norden Benins. Auf der Basis von multitemporalen LANDSAT - Satellitendaten und umfangreichen Geländedaten werden im sahelischen und den sudanischen Untersuchungsgebieten Karten der Landbedeckung mit hoher räumlicher und thematischer Auflösung erstellt. Je nach Untersuchungsgebiet können zwischen zehn und fünfzehn Landbedeckungsklassen differenziert werden. Die Gesamtklassifikationsgüte erreicht Werte zwischen 74% und 87%. In den sudanischen Untersuchungsgebieten werden Landnutzungsveränderungen mit Hilfe von LANDSAT - Satellitendaten, Luftbildern und Geländedaten über einen Zeitraum von ca. 15 Jahren (1986 – 2001) dokumentiert. Für beide Untersuchungsgebiete werden gravierende Landnutzungsveränderungen festgestellt. Der Anteil der ackerbaulich genutzten Fläche steigt für das nordsudanische Untersuchungsgebiet von 17% auf 41% und für das südsudanische Untersuchungsgebiet von 10% auf 14%. Im Mittelpunkt des zweiten Teils dieser Untersuchung steht die Frage nach den räumlichen Mustern der Pflanzenvielfalt und ihrer zeitlichen Veränderungen in den Untersuchungsgebieten der Sahel-, der Nord- und Südsudanzone. Zur Bearbeitung dieser Aufgabenstellungen kommt ein breites Methodenspektrum zur Anwendung. Kernstück der Untersuchung ist die Entwicklung eines verbesserten methodischen Ansatzes der Biodiversitätsmodellierung. Dazu werden bereits existierende räumliche Modellierungsansätze durch die Einbindung von Satellitendaten weiterentwickelt. Auf der Basis von georeferenzierten botanischen Daten (aktuell über 4500 pflanzensoziologische Aufnahmen mit insgesamt 104000 Datensätzen) werden für das sahelische, nord- und südsudanische Untersuchungsgebiet modellierte Verbreitungskarten von 138, 123 und 165 Pflanzenarten erstellt. Die Güte der Karten wird auf der Basis von unabhängigen Geländedaten überprüft. Die einzelnen Verbreitungskarten werden gebietsweise zusammengefasst, so dass im Ergebnis für jedes Untersuchungsgebiet eine hochauflösende Karte der Pflanzenvielfalt vorliegt. Im Rahmen einer Fallstudie werden die zeitlichen Veränderungen der Verbreitungsgebiete von Nutzbaumarten über einen Zeitraum von 13 Jahren untersucht. Es werden aktuelle und historische Verbreitungsgebiete der Nutzbaumarten auf der Basis von hochauflösenden Satellitendaten modelliert und die Veränderungen der Verbreitungsgebiete vor dem Hintergrund des Landnutzungswandels im Untersuchungsgebiet analysiert. Für 17 der 18 untersuchten Baumarten werden rückgängige Verbreitungsgebiete beobachtet.
Die vorliegende Fall-Kontroll-Studie untersucht den Zusammenhang zwischen der Belastung durch berufsbezogene psychosoziale Einflussfaktoren und bandscheibenbedingten Erkrankungen im Bereich der Lendenwirbelsäule bei Männern. Die Probanden der Fallgruppe wurden über vier Kliniken und zwei orthopädische Arztpraxen im Frankfurter Raum gewonnen (94 Patienten mit gesichertem symptomatischen lumbalen Bandscheibenvorfall und 94 Patienten mit radiologisch gesicherten, mit Beschwerden einhergehenden Osteochondrosen oder Spondylosen im Bereich der Lendenwirbelsäule). Sie wurden verglichen mit 197 anamnestisch rückengesunden Probanden (107 Bevölkerungskontrollen, 90 wegen Urolithiasis behandelte Kontrollpersonen mit röntgenologisch ausgeschlossener Osteochondrose/Spondylose). In einem strukturierten Interview wurden sämtliche Berufstätigkeiten von mindestens einem Jahr Dauer gesondert erfasst mit Schwerpunkt auf die physikalische Belastung durch Heben, Tragen und Tätigkeiten mit Belastung durch Ganzkörperschwingungen sowie auf die psychosoziale Belastung am Arbeitsplatz durch Monotonie, Langeweile, fehlende Möglichkeit des Einsatzes eigenen Wissens oder eigener Fähigkeiten, mangelnde Information über Pläne der Abteilung oder des Betriebes, mangelnde Zufriedenheit mit Vorgesetzten und Kollegen, psychische Belastung durch den Umgang mit Klienten, Arbeiten unter Zeitdruck und durch das Gefühl, zu viel Verantwortung tragen zu müssen. Zusätzlich wurden Daten erhoben zu Alter, Gewicht und Größe, Rauchgewohnheiten, Schulbildung, zu sportlichen Aktivitäten und außerberuflichen physikalischen Belastungen, zur Belastung durch sog. life-events sowie zum Gesundheitszustand des Achsenskeletts mit Schwerpunkt auf jemals aufgetretene Beschwerden im Bereich der Lendenwirbelsäule. Als Effektschätzer für die relativen Erkrankungsrisiken wurden mittels logistischer Regression Odds Ratios berechnet, adjustiert für Alter, Region, Staatsangehörigkeit, andere Erkrankungen mit Beteiligung der Lendenwirbelsäule und Belastung durch Heben, Tragen und Arbeiten in extremen Rumpfbeugehaltungen. Es fand sich ein grenzwertig signifikanter Zuammenhang zwischen psychischer Belastung durch den Umgang mit Klienten und dem Auftreten mit Beschwerden einhergehender osteochondrotischer und/oder spondylotischer Veränderungen im Bereich der Lendenwirbelsäule (OR=10,4; CI95%=1,0-113) sowie ein signifikanter Zusammenhang zwischen mehr als zehn Berufsjahren, in denen unter starkem Zeitdruck gearbeitet werden musste, und dem Auftreten eines behandlungsbedürftigen lumbalen Bandscheibenvorfalls (OR=2,9; CI95%=1,3-6,3). Diese Ergebnisse können verstanden werden als ein erster Hinweis auf einen möglichen Zusammenhang zwischen psychosozialer Belastung am Arbeitsplatz und dem Auftreten nicht nur von Schmerzen im Bereich der Lendenwirbelsäule (low back pain), sondern auch von mittels bildgebender Verfahren und/oder intraoperativ gesicherten morphologischen Korrelaten der Beschwerdesymptomatik. Ein alternativer Erklärungsansatz liegt in dem möglichen Einfluss psychosozialer beruflicher Faktoren auf Schmerzempfinden bzw. Schmerzverarbeitung und auf die Inanspruchnahme medizinischer Versorgung. Weitere und größere epidemiologische, aber auch psychobiologische und psychoimmunologische Studien werden notwendig sein, um eine mögliche Verursachung bandscheibenbedingter Erkrankungen durch berufsbezogene psychosoziale Belastungsfaktoren und die sie vermittelnden Mechanismen nachzuweisen.
Nach Eickholz (2005) ist die bakterielle Plaque die notwendige, wenn auch nicht die alleinige Ursache für die Entwicklung der entzündlichen Zerstörung des Zahnhalteapparats bei Parodontitis. Die Plaque-Bakterien geben Stoffwechselprodukte ab, die zur Reizung des Zahnfleisches bis hin zur Zahnfleischentzündung mit einhergehenden Blutungen und der Bildung von Zahnfleischtaschen führen. Jeder Parodontitis geht immer eine Gingivitis voraus, während nicht jede Gingivitis zu einer Parodontitis führen muss (Löe et al. 1986). Der Entzündungsprozess kann sich auf den gesamten Zahnhalteapparat ausbreiten und letztendlich zum Zahnverlust führen (GABA 2005). Die Parodontalbehandlung stützt sich auf die Beseitigung oder zumindest auf die Verringerung der pathogenen Mikroorganismen. Dies erfolgt durch Kürettage und Wurzelglättung der Wurzeloberfläche. Die Effektivität der Parodontalbehandlung ist jedoch nur dann gesichert, wenn während der Nachsorgephase eine Patienten-Compliance gesichert ist. In der vorliegenden Studie werden relevante Daten aus den Patientendaten der Poliklinik für Parodontologie in Frankfurt am Main entnommen und zusammen mit den Daten einer aktuellen Untersuchung analysiert. Es sollte der Therapieerfolg in Abhängigkeit zur Compliance des Patienten bewertet werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie lassen sich wie folgt zusammenfassen: Zur Nachuntersuchung hatten sich 76 Patienten (46 Frauen und 30 Männer) mit einem durchschnittlichen Alter von 63,5 Jahren zur aktuellen Untersuchung erneut vorgestellt. Diese Patienten waren vor 10 – 21 Jahren am Carolinum einer systematischer Parodontalbehandlung unterzogen worden. 32 Patienten (Testgruppe) hatten danach regelmäßig (1 - 2 x jährlich) am Recall teilgenommen, während 44 Patienten (Kontrollgruppe) nicht regelmäßig zum Recall erschienen waren. 12 der 76 Patienten waren Raucher. Als klinische Parameter dienten Zahnverlust, Approximalraum-Plaque-Index (API), Taschensondierungstiefe, Blutung nach Sondierung (BOP), sondierbare Furkationen und gingivale Rezessionen. Die Resultate ergeben, dass bei der Testgruppe 2,13 Zähne und bei der Kontrollgruppe 1,3 Zähne seit Therapiebeginn verloren wurden. Der durchschnittliche Zahnverlust aller Patienten betrug 1,65 Zähne. Betrachten wir nur die Raucher, so haben diese 3,08 Zähne pro Patient im Durchschnitt verloren. Der durchschnittliche API- Wert lag vor der Behandlung bei der Testgruppe bei 25%, nach 1 Jahr bei 31,9% und beim aktuellen Befund bei 41%. Die Kontrollgruppe hatte vor der Behandlung einen API von 24,6%, nach 1 Jahr 50,4% und beim aktuellen Befund 50,3%. Die durchschnittliche Sondierungstiefe wurde bei der Testgruppe ein Jahr nach Behandlung um 0,37 mm und bei der aktuellen Untersuchung um 0,87 mm reduziert. Bei der Kontrollgruppe wurde die durchschnittliche Sondierungstiefe nach dem ersten Jahr um 0,26 mm und zum aktuellen Befund um 0,34 mm gesenkt. Von Bedeutung ist die Beurteilung der Blutung nach Sondierung, welcher den Entzündungsgrad des Zahnhalteapparats widerspiegelt. Patienten der Testgruppe hatten im ersten Jahr nach Behandlung ihren durchschnittlichen BOP um 12,3% und zur aktuellen Untersuchung um weitere 10% auf 21,7% reduziert. Bei der Kontrollgruppe wurde der durchschnittliche BOP im ersten Jahr um 10,1% und zur aktuellen Untersuchung um weitere 5,5% auf 25,5% reduziert. Die sondierbaren Furkationen haben in beiden Gruppen zugenommen. Beim aktuellen Befund waren im Durchschnitt bei der Testgruppe 2,8 und bei der Kontrollgruppe 2,6 Parodontien sondierbar. Hinsichtlich der Rezessionen gab es bei der Test- und Kontrollgruppenpatienten keine Unterschiede. In beiden Gruppen hatte die Rezession im Durchschnitt auf einen Wert von 1 mm behandlungsbedingt zugenommen. Mit dieser Untersuchung konnte belegt werden, dass bei der Testgruppe ein besserer parodontaler Zustand (API, Taschentiefen, BOP) nach einer systematischen Parodontalbehandlung erzielt und erhalten werden konnte, als es bei der Kontrollgruppe, die nicht regelmäßig zum Recall erschien, der Fall war. Demnach kann dem am Carolinum praktizierten Recallsystem ein gewisser günstiger Einfluss auf die Zahn- und Parodontalgesundheit zugeschrieben werden. Man hätte sich Daten gewünscht, die diesen Effekt noch stärker untermauern. Es ist jedoch zu bedenken, dass alle Recall-Termine nur Momentaufnahmen des Patienten ergeben, die nichts darüber aussagen können, wie mundgesundheitsbewusst sich dieser Patient in der monatelangen Zeit zwischen seinen Zahnarztterminen verhält. Solange keine besseren Möglichkeiten der Einflussnahme seitens des Zahnarztes bestehen, muss deshalb das Recall-System mit seinen nachweisbaren (wenn auch bescheidenen) Erfolgen, als praktikable Methode hin zur besseren oralen Gesundheit angesehen werden.
Die durch das humane Zytomegalievirus (HCMV) ausgelöste Retinitis kann bei HIV-Infizierten und immunsuppremierten Patienten zu einer Einschränkung der Sehfähigkeit bis hin zu Erblindung geführt. Die HCMV-Retinitis schädigt die Retina, diese Schäden sind in der Regel nicht reversibel. Stets besteht auch die Gefahr des Ausbrechens der Infektion im kontralateralen Auge. Die Therapie kann zu schweren Nebenwirkungen führen, jedoch konnte durch die Entwicklung des oral anwendbaren Valganciclovir eine deutliche Vereinfachung der Behandlung erreicht werden. Mit der Untersuchung der HCMV-Replikation in retinalen Pigmentepithel (RPE)-Zellen steht ein Versuchsmodell zur Verfügung, in welchem sowohl die Vermehrung des Virus in einer für die HCMV-Retinitis bedeutsamen Zelllinie untersucht werden kann, als auch Erkenntnisse über das Verhalten des Virus in immunprivilegierten Geweben gewonnen werden können. Über Valproinsäure (VPA) ist bekannt, dass dieses Medikament zu einer gesteigerten Replikation des HI-Virus führt, auch wurde für supertherapeutische Konzentrationen ein Einfluss auf die Replikation von HCMV beschrieben. Valproinsäure erfährt neben ihrer ursprünglichen Indikation als Antiepileptikum zunehmend eine Erweiterung des Indikationsspektrums. Neben der Verwendung bei psychiatrischen Erkrankungen, insbesondere bipolaren Erkrankungen und der Schmerztherapie stellt die Anwendbarkeit von VPA und Derivaten des Medikaments in der Therapie maligner Tumore eine interessante Entdeckung dar. Obwohl gezeigt werden konnte, dass VPA neben einer Beeinflussung des Neurotransmitter-Stoffwechsels unter anderem zu einer Hemmung der Histondeacetylase (HDAC), zu Veränderungen an intrazellulären Signaltransduktionskaskaden, dem NO-Stoffwechsel und peroxysomal Proliferator-aktivierten Rezeptoren führt, ist eine genaue Zuordnung der Wirkmechanismen zu den Effekten des Medikaments noch nicht vollständig möglich. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Valproinsäure auch in therapeutischen Konzentrationen und in einer für die HCMV-Retinitis wichtigen Zelllinie zu einer Replikationssteigerung des HCMV führt. Die Replikationssteigerung zeigte sich sowohl im vermehrten Auftreten von frühen und späten Virusproteinen als auch in der vermehrten Abgabe von infektionsfähigen Viren an das Kulturmedium. In Zellkulturen ist die Vorbehandlung mit VPA vor der Infektion mit HCMV entscheidend für die Steigerung der Replikation, es lässt sich eine Konzentrations- und Zeitabhängigkeit der Replikationssteigerung für den untersuchten Bereich zeigen. Die in der vorliegenden Arbeit vorgestellten Ergebnisse lassen es unwahrscheinlich erscheinen, dass die Steigerung der HCMV-Replikation über eine Stimulation der an der intrazellulären Signaltransduktion beteiligten Enzyme PKC, ERK1/2 und p38 vermittelt wird. Ebenso weisen vorliegende Ergebnisse darauf hin, dass die durch VPA bedingte HCMVReplikationssteigerung nicht durch eine Veränderung der iNOS- und der PPAR-Aktivität bedingt ist. Es ist publiziert, dass VPA die HDAC inhibiert und dass die Replikation von HCMV, wie auch die anderer Viren, zum Teil über die Acetylierung von Histonen reguliert wird. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass auch in RPE-Zellen VPA zu einer Hemmung der HDAC führt, welche im untersuchten Rahmen zeit- und konzentrationsabhängig ist. In dieser Arbeit werden zudem eine Reihe von Parallelen zwischen dem HDAC-Inhibitor TSA und VPA aufgezeigt. Auch TSA führt in RPE-Zellen zu einer Stimulation der HCMV-Replikation. Unterschiede zwischen VPA und TSA zeigten sich im früheren Auftreten und kürzeren Anhalten der Stimulation der Virusreplikation nach TSA-Vorbehandlung. Diese Unterschiede könnten jedoch Ausdruck einer unterschiedlichen Pharmakokinetik der beiden Wirkstoffe sein. Die Ergebnisse vorliegender Arbeit lassen die Hemmung der HDAC und eine hieraus folgende Hyperacetylierung von Histonen durch VPA als wahrscheinlichste Ursache für die stimulierende Wirkung des Medikamentes auf die HCMV-Replikation erscheinen.
Die Transplantatvaskulopathie als Zeichen der chronischen Transplantatabstoßung befällt sowohl die epikardialen als auch die intramyokardialen Arterien des Transplantats. Die transendotheliale Migration der glatten Gefäßmuskelzellen und die Intimaproliferation mit Formation einer Neointima stellen die wichtigsten Charakteristika der TVP dar. Die NO-Synthetasen und die Plasminogen-Aktivatoren scheinen, eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der TVP zu spielen. e-NOS besitzt eine antiproliferative Wirkung und verhindert die Entwicklung der TVP. Die Rolle von i-NOS wird in der Literatur überwiegend als TVP-begünstigend bezeichnet. t-PA ist an der Migration und u-PA an der Proliferation der glatten Gefäßmuskelzellen beteiligt. Die vorliegende Arbeit konnte den Einfluß von CsA, FK-506 und MMF auf die Expression der obengenannten Faktoren in den arteriellen Gefäßen von Herztransplantaten aufzeichnen. Darüber hinaus sollte durch die Bestimmung von α-Aktin das Verhalten der glatten Gefäßmuskelzellen während der chronischen Abstoßung aufgezeichnet und interpretiert werden. Anhand eines etablierten Rattenmodells der heterotopen Herztransplantation wurden drei Medikamentengruppen (CsA, FK-506 und MMF) und eine Kontrollgruppe aufgestellt und die dazu gehörenden Tiere an bestimmten Zeitpunkten nach Transplantation sakrifiziert. Die gefrierhistologischen Schnitte der Transplantaten wurden immunhistochemisch auf i-NOS, e-NOS, t-PA, u-PA und α-Aktin gefärbt. Die Intensität der Färbung und der Anteil der befallenen Arterien (Prävalenz) jeder Gruppe wurden bei der Auswertung der Schnitte bestimmt und mit Hilfe des nicht parametrischen Tests von Kruskal und Wallis wurden die Gruppen statistisch auf Unterschiede verglichen. Die Versuche der vorliegenden Arbeit konnten die Expression der NO-Synthetasen in der Neointima der epi- und intramyokardialen Gefäße nachweisen. Die i-NOS-Expression wurde durch alle untersuchten Medikamente reduziert. Zusätzlich war MMF bezüglich der Reduktion der i-NOS-Expression effizienter als FK-506 und CsA. Unter CsA-Behandlung wurde die e-NOS-Expression erst nach anfänglich hohen Werten reduziert, während unter MMF-Behandlung diese Reduktion sich von Anfang an bemerkbar machte. Aus diesen Befunden läßt sich schließen, daß alle untersuchten Medikamente eine Endothelschädigung, z.B. bedingt durch NO-Toxizität, durch die Reduktion der i-NOS-Expression verhindern. Bezüglich der Plasminogen-Aktivatoren konnten die Versuche der vorliegenden Arbeit ihre Expression in der Neointima der epi- und intramyokardialen Gefäße nachweisen. u-PA wurde durch alle untersuchten Medikamente in seiner Expression beeinträchtigt, wobei MMF im Vergleich zu CsA und FK-506 eine signifikant höhere Reduktion zeigte. t-PA wurde nur durch MMF und CsA reduziert, wobei unter CsA-Behandlung eine fast kontinuierliche Abnahme der t-PA-Expression während der Versuchsdauer beobachtet wurde. Da t-PA an der Migration und u-PA an der Proliferation der glatten Gefäßmuskelzellen beteiligt sind, lassen sich hier folgende Schlüsse ableiten: Die Proliferation der glatten Gefäßmuskelzellen kann durch alle untersuchten Medikamente verringert werden, während die Migration nur unter CsA- und MMF-Behandlung reduziert wird. MMF reduziert die Proliferation der glatten Gefäßmuskellzellen effizienter als CsA und FK-506, so daß angenommen wird, daß die Reduktion der Plasminogen Aktivatoren einen besonderen Wirkungsmechanismus von MMF darstellt. Die Expression der Plasminogen-Aktivatoren in der Neointima weist das Vorhandensein von glatten Gefäßmuskelzellen nach, so daß sie, da letzteres ein histologisches Zeichen der TVP darstellt, als Indikatoren der TVP-Entwicklung angewendet werden können. α-Aktin, das charakteristisch für die G0-Phase des Zellzyklus der glatten Gefäßmuskelzellen ist, wurde in der Neointima der arteriellen Gefäße identifiziert und seine Expression in der Neointima durch alle untersuchten Medikamente reduziert. Demnach befinden sich viele der glatten Gefäßmuskelzellen der Neointima nicht in der proliferativen Phase, obwohl sie die Migration abgeschlossen haben. Alle untersuchten Medikamente reduzieren die Remodellierung der Neointima durch die glatten Gefäßmuskeltzellen.
Ziel: Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Durchführbarkeit und die Sicherheit des perkutanen Verschlusses des linken Vorhofohres mit dem PLAATO™ System (ev3 Inc., Plymouth, Minnesota, USA) zu beurteilen. Einleitung: Patienten mit Vorhofflimmern haben ein fünffach erhöhtes Risiko, einen Schlaganfall zu erleiden. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass bei Patienten mit nicht-rheumatischem Vorhofflimmern mehr als 90% der linksatrialen Thromben ihren Ursprung im linken Vorhofohr haben. Der transvenöse Verschluss des linken Vorhofohres ist ein neuer Ansatz, um embolische Ereignisse in diesen Patienten zu verhindern. Methodik: Innerhalb einer prospektiven, multi-zentrischen Studie wurde bei 111 Patienten (Alter 71 ± 9 Jahre) versucht, das linken Vorhofohr zu verschließen. Alle Patienten hatten eine Kontraindikation für eine lebenslange Antikoagulation und mindestens einen weiteren Schlaganfallrisikofaktor. Der primäre Endpunkt war das Auftreten eines Schlaganfalls, Tod kardialer oder neurologischer Ursache, das Auftreten eines Herzinfarkts oder das Erfordernis einer kardiovaskulären Operation, das mit dem Eingriff unmittelbar in Zusammenhang stand, innerhalb des ersten Monats nach Implantationsversuch. Ergebnisse: Die Implantation war bei 108 der 111 Patienten (97,3%, 95% Konfidenzinterval [KI]: 92,3%-99,4%), die insgesamt 113 Eingriffe unterliefen, erfolgreich. Bei einem Patienten (0,9%, 95% KI: 0,02%-4,9%) war eine kardiovaskuläre Operation erforderlich. Derselbe Patient verstarb während seines Krankenhausaufenthalts an einer neurologischen Ursache. Bei drei weiteren Patienten wurde eine Perikardpunktion aufgrund eines Hämoperikards durchgeführt. Die durchschnittliche Nachuntersuchungszeit betrug 9,8 Monate. Zwei Patienten erlitten einen Schlaganfall. Weder eine Dislokation des Verschlusssystems, noch ein mobiler Thrombus wurden ein und sechs Monate nach Systemimplantation im transösophagealen Ultraschall beobachtet. Schlussfolgerung: Der Verschluss des linken Vorhofohres durch das PLAATO™ System ist eine neuartige Methode, die unter Inkaufnahme eines vertretbaren Risikos durchgeführt werden kann. Möglicherweise wird dieses Verfahren in Zukunft eine alternative Behandlungsmethode bei Patienten mit Vorhofflimmern und einer Kontraindikation für eine lebenslange Antikoagulation darstellen.
Die Na,K-Pumpe ist ein integrales Membranenzym und gehört zur Gattung der P-Typ-ATPasen. Das Enzym setzt bei der Hydrolyse von ATP die resultierende freie Energie in aktiven Transport zur Errichtung eines Na+/K+-Konzentrationsgradienten über der jeweiligen Plasmamembran um. Diese Funktion wird mit einer strukturellen Alternierung zwischen zwei Hauptkonformationen E1 und E2 des Enzyms in Verbindung gebracht. In der vorliegenden Arbeit erfolgte eine Charakterisierung von Sekundärstruktur- und Proteinmikroumgebungsänderungen bei Teilreaktionen der Na,K-ATPase mittels reaktionsinduzierter und zeitaufgelöster FTIR-Differenzspektroskopie. Die hier verwendete IR-Durchlichttechnik setzt voraus, daß das zu untersuchende Enzym in hochreiner, hochkonzentrierter (1 mM) und aktiver Form in einen Proteinfilm in Gegenwart eines geschützten, photolytisch spaltbaren ATP-Derivats (caged ATP) überführt werden kann. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal eine umfassende IR-spektroskopische Beschreibung von einzelnen Teilreaktionen innerhalb des E1/E2-Reaktionsmodells der Na,K-ATPase durchgeführt. Die Untersuchung des Enzyms in Form eines Proteinfilms mit einer Schichtdicke von etwa 5 µm ist aufgrund der hohen Hintergrundabsorption des Wassers und der geringen Extinktionskoeffizienten der Proteinschwingungsmoden erforderlich. Der überwiegende Teil der Messungen wurde mit (1-(2-nitrophenyl)ethyl)-caged ATP und Schweinenierenenzym bei 5° und 15°C durchgeführt. Nach Abspaltung der Schutzgruppe mittels eines UV-Blitzes und somit der Freisetzung von ATP wurden zeitabhängig (Millisekunden bis Sekunden) die Differenzspektren verschiedener Teilreaktionen im Bereich von 2000 bis 950 cm-1 ermittelt. Der große Vorteil dieser Technik besteht in der Möglichkeit der Registrierung von Zustandsänderungen einzelner Aminosäuren des Proteins, in Bezug auf die Sekundärstruktur, Phosphorylierung, Protonierung und Kationenkoordination. Besonders gut können Änderungen an den Seitenketten der Aminosäuren Aspartat und Glutamat detektiert werden. Die enzymatische ATP-Hydrolyseaktivität der Na,K-ATPase wurde in den Proteinfilmen IR-spektroskopisch anhand der V as (PO2-) bei 1246 cm-1 bestimmt. Die Messungen der spezifischen Aktivität von Schweinenierenenzym ergab bei 15°C einen Wert von 34 nmol Pi mg-1 min-1. Vergleichsmessungen, die mit einem Standardaktivitätstest in Annäherung an die Protein-filmbedingungen durchgeführt wurden, ergaben Ergebnisse von der gleichen Größenordnung. In Abhängigkeit von der Zusammensetzung des kationischen Mediums konnten nach der photochemischen Freisetzung von ATP IR-Differenzspektren von drei verschiedenen Teilreaktionen untersucht werden: (1) ATP-Bindung, (2) Bildung des Phosphoenzyms E1P, (3) Bildung des Phosphoenzyms E2P. Des weiteren wurden Differenzspektren der AMPPNP-Bindung, der ADP-Bindung und der Ammoniumbindung, die mit der K+-Bindung vergleichbar ist, ermittelt. Alle Teilreaktionen führten zu unterschiedlichen Differenzspektren, die charakteristisch für die jeweiligen Zustandsänderungen sind. Durch geeignete Differenzbildung konnten ebenfalls die Differenzspektren der Phosphorylierung (EATP -> E1P) und der Phosphoenzym-Konversion (E1P -> E2P) berechnet werden. Sekundärstrukturänderungen können bei der IR-Spektroskopie innerhalb des Amid I-Bereichs zwischen 1700 und 1610 cm-1 detektiert werden. Die Ergebnisse der IR-Differenzspektroskopie zeigen, daß die Sekundärstruktur der Na,K-ATPase bei allen untersuchten Teilreak-tionen weitgehend konserviert bleibt. Unter den ermittelten Differenzspektren der Teilreaktionen resultiert die größte Netto-Sekundärstrukturänderung in einer Größenordnung von etwa 0,2 % (~3 Aminosäuren/Protomer) bei der E2P-Bildung. Als Folge der Bindung von ATP und ADP an das Enzym gibt es Evidenzen für die Beteiligung von Arginin. Die Bindung von AMPPNP an die Na,K-ATPase hingegen zeichnet sich klar durch andere molekulare Wechselwirkungen unter Beteiligung von Asp und/oder Glu aus. Die Phosphorylierung der Na,K-ATPase in Gegenwart von 1,2 M Na+ (E1P-Bildung) kann anhand von zwei Signalen der V (C=O) bei 1739 und 1709 cm-1, wobei eines der phosphorylierten Seitenkette Asp 369 zugeordnet wird, detektiert werden. Das zweite Signal wird der Protonierung eines Seitenkettenrestes Asp oder Glu zugerechnet, welches in Verbindung mit der Na+-Okklusion bei der E1P-Bildung stehen dürfte. Weitere Signale, die in Zusammenhang mit den molekularen Vorgängen bei der Phosphorylierung und Na+-Koordination stehen, können in der spektralen Region um 1550 cm-1 (V as(COO-)) und 1400 cm-1 (V s(COO-)) detektiert werden. Das Differenzspektrum der Phosphorylierung der Na,K-ATPase in Gegenwart von 130 mM Na+ (E2P-Bildung) enthält keine Beiträge der Kationenokklusion oder -deokklusion. Dennoch enthält das Differenzspektrum der E2P-Bildung die Information über die Transformation der Kationenbindungsstellen von E1 -> E2. Während E1 den Na+-affinen Zustand darstellt, repräsentiert E2 den K+-affinen Zustand der Na,K-ATPase. Das Signalprofil der Differenzspektren der E2P-Bildung unterscheidet sich stark von dem der E1P-Bildung. Neben der Phosphorylierung an Asp 369, die auch hier oberhalb von 1700 cm-1 anhand eines V (C=O)-Signals detektiert wird, können weitere positive und negative Signale sowohl oberhalb von 1700 cm-1 als auch im Bereich um 1550 cm-1 (V as(COO-)) und 1400 cm-1 (V s(COO-)) nachgewiesen werden. Bei der Transformation der Kationenbindungsstellen von E1 -> E2 können somit starke Änderungen an den Seitenketten von Asp und/oder Glu detektiert werden, die auf eine Neuorganisation der Kationenbindungsstellen der Na,K-ATPase schließen lassen. An dieser Neuorganisation sind sowohl Ände-rungen des Protonierungszustandes als auch Änderungen in der Koordinationssphäre der kationenkoordinierenden Gruppen Asp und/oder Glu beteiligt. Da von der Na,K-ATPase keine hochauflösenden Kristallstrukturen existieren, wurden die Kristallstrukturen der Ca-ATPase des sarkoplasmatischen Retikulums, ebenfalls eine P-Typ-ATPase, zur Erläuterung des Mechanismus der Kationenbindung herangezogen (Toyoshima et al., 2004b). Zur Ca-ATPase existieren bereits analoge IR-Differenzuntersuchungen. Dies bot die Möglich-keit des direkten Vergleichs gleicher Teilreaktionen innerhalb des gemeinsamen E1/E2-Reaktionsmodells. Dieser Vergleich zeigt, daß die Sekundärstrukturen beider Enzyme bei den jeweiligen Teilreaktionen weitgehend konserviert bleiben. Bei der Ca-ATPase können die größten Netto-Sekundärstrukturänderungen von etwa 0,3 % des Enzyms (~3 Aminosäuren/Enzym) als Folge der ATP-Bindung beobachtet werden (Barth et al., 1996). Bei dieser Teilreaktion werden bei der Na,K-ATPase die kleinsten Sekundärstrukturänderungen detektiert. Beim Vergleich der Signalprofile beider Enzyme weist der sekundärstrukturrelevante Amid I-Bereich bei der Phosphoenzym-Konversion auf konträre Strukturrelaxationen hin. Die Differenzspektren der Ca-ATPase im Vergleich zur Na,K-ATPase deuten auf eine sich unterscheidende Kationenkoordination hin. Durch eine Kombination der Resultate von IR-Differenz- und Fluoreszenzspektroskopie der FITC-Na,K-ATPase zur Charakterisierung von Enzymzuständen, konnte ein Modell zum Mechanismus der Inhibierung der Na,K-ATPase durch das Herzglucosid Ouabain postuliert werden. Durch Fluoreszenzmessungen an der FITC-Na,K-ATPase konnte gezeigt werden, daß Ouabain in Gegenwart von 20 mM Na+ an das Enzym bindet, was bei 130 mM Na+ nicht mehr der Fall ist. Aufgrund von IR-Differenzsignalen der E2P-Bildung, aufgenommen bei 20 mM Na+, ist es möglich, oberhalb von 1700 cm-1 (ν(C=O)), bei 1554 cm-1 (V as(COO-)) und bei 1408 cm-1 (V s(COO-)) zwischen der an Asp 369 phosphorylierten und unphosphorylierten Na,K-ATPase zu unterscheiden. Nach Ouabain-Zugabe hingegen konnten diese Signale nicht mehr detektiert werden. Bezüglich der Inaktivierung des Enzyms im Standardaktivitätstest, für dessen Ablauf Na+-Konzentrationen von um die 130 mM eingesetzt werden, kann gefolgert werden, daß Ouabain nicht an das freie, sondern an das phosphorylierte Enzym bindet und somit die Inaktivierung der Na,K-ATPase nach sich zieht.
Im Jahre 1876 führte der bis dahin unbekannte Militärchirurg namens Nikolaj Vladimirovic Eck (1849-1908) in St. Petersburg weltweit erstmals erfolgreich eine Nahtverbindung zwischen zwei Blutgefäßen (V. cava und V. portae) durch. Im Gegensatz zu dieser bedeutenden chirurgischen Pioniertat in einer Zeit, in der zuvor nur einfache Gefäßnähte zur Rekonstruktion bei Arterienverletzungen durchgeführt worden waren, ist in der medizinhistorischen Literatur fast nichts über das Leben und das Werk dieses Chirurgen angegeben. Ziel dieser Arbeit war es daher, das Leben und Werk dieses russischen Chirurgen an Hand der noch vorhandenen russischen Quellen zu erforschen. In der vorliegenden Arbeit sollen deshalb die Werke dieses russ. Chirurgen zusammengestellt, aus der russischen Sprache übersetzt und seine Bedeutung für die Geschichte der Chirurgie aufgezeigt werden. Die von Eck erstmals durchgeführte portocavale Anastomose bei Tieren sollte die Möglichkeit prüfen, ob eine solche Gefäßverbindung möglicherweise bei Patienten mit Leberzirrhose zur Behandlung des Aszites eingesetzt werden könnte. Diese Gefäßverbindung ging seit etwa 1890 als „Eck’sche Fistel“ in die Weltliteratur ein. Bis dahin war in der medizinischen Literatur nur von Übernähungen, Umstechungen und Unterbindungen von Blutgefäßen, aber noch nicht von Gefäßanastomosierungen berichtet worden. 1911 wurde auf dem Berliner Chirurgenkongreß gefordert, bei Patienten mit „Ascites infolge von Lebercirrhose eine Eck´sche Fistel zur Beseitigung desselben anzulegen“. Noch im selben Jahr führte Paul Rosenstein in Berlin erstmals beim Menschen eine Seit-zu-Seit Anastomose bei einem Patienten mit Aszites durch. Nikolaj Vladimirovic Eck wurde am 9. November 1849 in St. Petersburg als Sohn des Arztes Vladimir Jegorovic Eck (1818-1875) geboren, der Professor an der Kaiserlichen Medizinisch-Chirurgischen Akademie für Militärärzte in St. Petersburg war. 1860 erfolgte die Einschulung N. V. Ecks in die dritte Klasse des Gymnasiums zu St. Petersburg, vorher hatte er Privatunterricht genossen. 1865-1871 studierte er an der Militärakademie seiner Heimatstadt. Für seine 1871 noch als Medizinstudent publizierte Arbeit "Über die Polypen des Kehlkopfes" bekam er eine Auszeichnung der Akademie. 1872-1878 war Eck Leiter der chirurgischen Abteilung des Militärkrankenhauses in St. Petersburg. 1877-1878 nahm er als Militärarzt am russisch-türkischen Krieg teil. Nach seiner Rückkehr nach St. Petersburg erfolgten seine Verabschiedung aus dem Militärdienst und eine Tätigkeit in verschiedenen Zivilkrankenhäusern. 1883-1884 war Eck Delegierter der russischen Regierung bei der internationalen Hygienekonferenz in Alexandria. Auch 1885 war er Delegierter der russischen Regierung bei der internationalen Hygienekonferenz in Rom. 1888 erfolgte die Publikation seiner Dissertation über die Sterblichkeit in Russland. Eck starb am 5. April 1908. Eck war einer der führenden Chirurgen Russlands. 1877 publizierte er im „Militärmedizinischen Journal“ einen Fallbericht über die in Russland erste erfolgreiche transabdominelle Entfernung des „supravaginalen Teiles der Gebärmutter“ bei einer Patientin mit einem Uterusmyom. Außerdem wurden von ihm mindestens drei operative Exstirpationen von großen, zystischen Ovarialtumoren per Laparotomie („Ovariotomien“) in Narkose (wahrscheinlich mit Chloroform) durchgeführt. 1882 wurde von Eck angeblich erstmals in Russland eine Pylorusresektion wegen Magenkarzinom erfolgreich durchgeführt (1 Jahr nach der ersten erfolgreichen Operation durch Theodor Billroth in Wien). Bereits 1882 forderte Eck nach der Magenresektion wegen Tumoren im Pylorusbereich auf eine direkte Anastomosierung des Magenrestes mit dem Duodenum zu verzichten, sondern den Duodenalstumpf durch Naht blind zu verschließen und eine Gastrojenunostomie anzulegen. Dieser Gedanke wurde dann 1885 von Billroth in Wien erstmals beim Menschen erfolgreich durchgeführt [Operation nach Billroth II].
Um die Veränderungen von der Natur- zur Kulturlandschaft des Hochtals von St. Antönien (Graubünden, Schweiz) zu erfassen, wurden unterschiedliche natürliche Archive, wie Böden, Moore und Bäume innerhalb eines Methodenverbunds aus Bodenkunde, Palynologie und Dendroökologie untersucht. Das Gerüst für die Paläoumweltrekonstruktion bilden dabei die Pollenanalysen der Moorprofile Capelgin (1680 m ü. NN) und Groß Ried (1720 m ü. NN) am NE-exponierten Hang des Chrüzes. Sie reichen bis ins Boreal zurück. Um bestimmte Landschaftszustände, wie Rodungen oder Nutzungsänderungen, zu beschreiben, erwiesen sich Bodenprofile ebenfalls als sehr aufschlussreiche landschaftsgeschichtliche Zeugnisse. Mit den dendroökologischen Untersuchungen war es möglich, kalenderjahrgenaue Angaben zur Wiederbewaldungsdynamik und zum Erosionsgeschehen zu machen. Der Beginn der Alpweidrodungen im Hochtal liegt in der Spätbronzezeit, damit wurde ein weiterer Beweis geliefert, dass auch die klimatisch weniger begünstigten nördlichen Randalpen schon in dieser Epoche vom Menschen genutzt wurden. Flächenhafte Brandrodungen um Weideland zu gewinnen, sind dann für die Eisen- und Römerzeit belegt. Die Ergebnisse des Methodenverbunds gaben zudem einen genaueren Einblick in das Wirkungsgefüge Mensch und Umwelt. Ein Schwerpunkt liegt dabei auf der Betrachtung der eisenzeitlichen Alpweidrodungen. Nach den Brandrodungen war es nicht möglich, die Flächen in Weideland zu überführen, sondern es gab zunächst eine Phase erhöhter Geomorphodynamik mit Ausbreitung der Grünerle.
Am Beispiel des Chirurgen Dr. med. Friedrich Wilhelm Fabricius (1810-1872) im Hospital zum Heiligen Geist in Frankfurt am Main, wird der Weg der Chirurgie vom Handwerk zur Wissenschaft dargestellt. Dr. med. Friedrich Wilhelm Fabricius war bei seinem Dienstantritt im Jahre 1845 der erste Hospitalwundarzt in der 700jährigen Geschichte des Hospitals zum Heiligen Geist in Frankfurt am Main, der an einer Universität Medizin studiert hatte. Seine Vorgänger als Hospitalwundarzt des Hospitals zum Heiligen Geist waren bis dahin alle nicht akademisch ausbebildete Wundärzte gewesen, die eine Ausbildung bei einem Handwerksmeister in der Zunft der Barbiere absolviert hatten. Friedrich Wilhelm Fabricius wurde am 12. November 1810 als Sohn des wohlhabenden Frankfurter Kaufmannes Philipp Julius Fabricius (1775-1849) und Maria Antoinette Franziska Fabricius, geborene Steinhäuser (1786-1859), in Frankfurt am Main geboren. Nach Besuch des Frankfurter Gymnasiums mit dem Abitur als Abschluß studierte er Medizin in Heidelberg und Göttingen. Seine Promotion erfolgte 1831 (Dr. med., chir. et art. obstet.) an der Universität Göttingen bei dem Anatom und Chirurgen Conrad Johann Martin Langenbeck. Das Thema seiner Dissertationsarbeit lautet in deutscher Übersetzung: „Über eine Luxation des Oberschenkelknochens in den Ramus descendens des Sitzbeines“. Nach seiner Rückkehr von einer wissenschaftlichen Reise nach Berlin, Prag, Wien, Paris und London, erhielt er 1832 die Zulassung als praktischer Arzt in Frankfurt am Main. Im Jahre 1834 gründete Fabricius zusammen mit den Ärzten Heinrich Hoffmann („Struwwelpeter-Hoffmann“), Simon Moritz Ponfick, David Eduard Schilling jun., Adolf Schmidt und Johann Georg Varrentrapp jun. die Armenklinik. Nach der Heirat mit Anna Elisabeth Dionysia Heimberger 1835 wurde im Jahre 1839 ein gemeinsamer Sohn geboren, der den Namen seines Großvaters und Taufpaten Philipp Julius bekam. 1841 veröffentlichte Fabricius einen Artikel „Zur Behandlung der Contracturen und Ankylosen des Kniegelenks“ in dem „Archiv für die gesammte Medicin“. Im Jahre 1845 war Fabricius Mitbegründer des „Ärztlichen Vereins“ in Frankfurt, zusammen mit 24 anderen Kollegen, darunter waren auch die Mitbegründer der Armenklinik. Fabricius wurde 1848 zum Vorsitzenden des „Ärztlichen Vereins“ gewählt. Als Ziele des Vereins gibt die Satzung von 1845 gegenseitige wissenschaftliche Belehrung und Förderung des kollegialen Lebens an, später kamen die Förderung der öffentlichen Gesundheitspflege und die Wahrung der Standesinteressen hinzu. Analysiert man die Operationsverfahren, die Fabricius in der Zeit als Hospitalwundarzt im Hospital zum Heiligen Geist von 1845-1872 durchgeführt hat, so zeigt sich, daß von ihm vor allem Amputationen an den Extremitäten (Finger bis Oberarm bzw. Hüfte), inkarzerierte Schenkel- bzw. Leistenhernien und Phimosenoperationen durchgeführt wurden. Fabricius behandelte vor allem Patienten mit septischen Krankheitsbildern, mit Verletzungen, aber auch Patienten mit Bindehautentzündungen. Heute, im Zeitalter der Spezialisierungen, würde man diese Patienten in Spezialabteilungen für septische Chirurgie, Traumatologie und Augenheilkunde behandeln.
Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem Wiederaufbau der Stadt Frankfurt in den Jahren 1945 bis 1965. Die wichtigsten Stationen dieser Nachkriegsjahre werden mit der Architektengemeinschaft Alois Giefer und Hermann Mäckler verknüpft. Giefer und Mäckler haben in dieser Stadt viele Bauaufgaben vom Wohnungsbau über den Kirchenbau bis zum Ausbau des Frankfurter Flughafens übernommen. Mit der erstmaligen Präsentation des Gesamtwerkes dieser Architektengemeinschaft soll das Interesse für die Architekten und darüber hinaus auch für die Frankfurter Nachkriegsmoderne geweckt werden. Dieses Anliegen scheint besonders in der heutigen Zeit notwendig zu sein, da diese Architekturepoche in Frankfurt durch Abriß bedroht ist. ...
Hydroxyethylstärke (HES) ist das in Deutschland vorrangig eingesetzte Präparat für die Indikationen Volumenersatz und Hämodilution. Mögliche Störungen der Gerinnung werden häufig als eine nicht ungefährliche Nebenwirkung beim Einsatz von HES angesehen. Allerdings ist offen, ob alle HES-Präparate mit unterschiedlicher physikalisch-chemischer Struktur diese Nebenwirkung in gleicher Form hervorrufen. Da bislang systematische Untersuchungen zur Beeinflussung der Blutgerinnung durch HES weitgehend fehlen, sollten entsprechende Untersuchungen an freiwilligen Versuchspersonen vorgenommen werden. Als Prüfpräparat wurde hochsubstituierte, hochmolekulare 6% HES 450/0,7 ausgewählt, da ein solches am stärksten chemisch verändertes Präparat des natürlichen Amylopektins am ehesten für die Auslösung von Nebenwirkungen in Frage kommen könnte. Die Untersuchungen wurden an 10 gesunden, freiwilligen, männlichen Probanden vorgenommen. Dabei wurde den Probanden an drei aufeinander folgenden Tagen jeweils ein Liter einer 6%igen HES Lösung HES 450/0,7, (Hextend®) innerhalb von 240 Minuten intravenös infundiert. Durch regelmäßige Blutentnahmen wurden über einen Zeitraum von 30 Tagen die HES-Konzentration und die Gerinnungsparameter kontrolliert. Dabei sollte insbesondere die Rotationsthrombelastographie eingesetzt werden, da dieser relativ neu entwickelten Methode besondere Aussagekraft zugemessen wird. Wie bereits in früheren Studien aufgezeigt, konnte erneut bestätigt werden, dass hochsubstituierte 6% HES 450/0,7 nur verlangsamt aus dem Kreislaufsystem eliminiert wird und dementsprechend auch Wochen nach der Applikation als persistierende Fraktion noch deutlich nachweisbar ist. Die HES-Konzentration erreichte ein Maximum von 18,8 mg/dl am dritten Infusionstag und war am zehnten Folgetag noch mit 6,6mg/dl nachzuweisen. Die erhebliche Beeinflussung der Blutgerinnung durch die verwendete hochsubstituierte 6% HES 450/0,7 konnte über die verschiedenen Gerinnungsparameter sichergestellt werden. Sowohl alle gemessenen Gerinnungsparameter, als auch die Konzentrationen wichtiger Gerinnungsfaktoren, erreichten am dritten Infusionstag ihre maximale hypokoagulatorische Abweichung vom Ausgangswert vor der Infusionsserie. Die Coagulation Time (CT) + 21%, die Clot Formation Time (CFT) + 132%, die Maximum Clot Firmness (MCF) – 21%, die aktivierte partielle Thromboplastin-Zeit (Time) (aPTT) + 45%, die International Normalized Ration (INR) der Thromboplastinzeit (Quick-Test) + 14%. Die Konzentration von Fibrinogen nahm um 22% ab, die Faktor VIII-Aktivität (FVIII:C) um minus 74%, weshalb auch die Konzentration des von-Willebrand-Faktors (vWF-Ag) abnehmen musste, und zwar um bis zu 80%. Der einzige Gerinnungsparameter, der sich im Sinne einer Hyperkoagulabilität veränderte, war die Thrombinzeit (TZ), die sich im Gegensatz zu den anderen Messungen der Gerinnungsabläufe um bis zu 23% beschleunigt zeigt. Auf die Calciumkonzentration hatte die Applikation von insgesamt drei Litern 6% HES 450/0,7 über die gesamte Messperiode keinen erkennbaren Einfluss. Am 2. Folgetag war die CT um +14% und die CFT am 10. Folgetag um + 155%, die MCF am 10. Folgetag um - 18%, die aPTT am 6. Folgetag um + 9% im Sinne einer Hypokoagulabilität statistisch signifikant verändert. Die Erhöhung der INR-Werte war hingegen ab dem ersten Folgetag nicht mehr statistisch signifikant. Die Fibrinogenkonzentration war am 10. Folgetag noch um 15% ähnlich verringert wie FVIII:C mit minus 22%. Die Konzentration von vWF-Ag war am 2. Folgetag um 77% erniedrigt. Auch an den Folgetagen blieb die TZ der einzige hyperkoagulatorisch veränderte Wert mit -9% am 10. Folgetag. Der Hämatokritwert erniedrigte sich infolge der Hämodilution um maximal 25% am dritten Infusionstag und blieb am zehnten Folgetag noch um 15% verringert. Die Werte von CT, CFT, MCF, aPTT, TZ und Fibrinogen veränderten sich entsprechend der durch die HES-Applikation bedingten Hämodilution, die sich gut am Hämatokritwert abschätzen lässt. Als besonders wichtig erscheint in diesem Zusammenhang jedoch das Ergebnis, dass auch noch 10 Tage nach HES-Applikation die Störung der Gerinnung (CT, CFT, MCF, aPTT) nachgewiesen werden kann. Die bei den Untersuchungen verwendete Dosierung (3x60g in drei Tagen) liegt deutlich unter den Empfehlungen zur Maximaldosierung von hochsubstituierter 6% HES 450/0,7. Es ist dementsprechend davon auszugehen, dass die signifikanten Gerinnungsstörungen bei Ausschöpfung der Empfehlungen erheblich stärker ausgeprägt wären und zu einer erheblichen Gefährdung der Patienten führen könnten. Die Gerinnungsstörung bei hochdosierter Applikation von hochsubstituierter 6% HES 450/07 in einer Dosierung innerhalb der therapeutischen Grenzen ist dementsprechend als mögliche Komplikation und unter Umständen als erhebliche Gefährdung des Patienten zu beachten. Die derzeitig gültigen Dosierungsrichtlinien für hochsubstituierte 6% HES 450/0,7, aber auch HES 200/0,6, wären unter Berücksichtigung der vorhersehbaren Störung der Gerinnung insbesondere für Mehrfachinfusionsen zu überdenken. Diese Überlegungen zur Dosisbegrenzung gelten nicht für mittelsubstituierte HES 0,4 und 0,5.
In der heutigen Zeit sieht sich das kulturelle Erbe der Völkergemeinschaft der Gefahr ausgesetzt, von der rasanten Entwicklung der Medientechnologien in den Hintergrund gedrängt und zerstört zu werden. Die Globalisierung von Wirtschaft und Gesellschaft führt auch zu einer kulturellen Globalisierung und damit zur Dominanz des von der westlichen Welt gelebten Kulturimperialismus. Einzelne Kulturformen verlieren ihren Platz in der Kulturweltgemeinschaft und wichtige Kulturgüter wie Literatur, Sprache, Mythen, Darstellungen oder Riten werden nach und nach verdrängt. Aus diesen Gründen ist es notwendig, dass sich die Theater- und Medienwissenschaftler mit diesen Kulturformen auseinandersetzen, sie erforschen und im Bewusstsein der Menschen erhalten. Diese Arbeit stellt eine unabhängige Untersuchung dar, die in dieser Form innerhalb eines geschlossenen gesellschaftlichen Systems nicht möglich gewesen wäre. Die letzte deutschsprachige Dissertation über den Stand der For-schung zu diesem Thema wurde vor knapp vierzig Jahren verfasst. Seitdem ist auch keine Untersuchung der Rezeption dieser Kunstform in Theater, Film und Medien in Europa erfolgt. Meiner Kenntnis nach existiert auch im Iran keine ver-gleichbare wissenschaftliche Arbeit, die sich mit dem untersuchten Themengebiet beschäftigt. Die Ta¬ziyeh ist eine sakrale Theaterform aus dem Iran, die sich über lange Zeit großer Beliebtheit in der eigenen Bevölkerung und Anerkennung durch westliche Reisende erfreute. Obwohl der Vormarsch der Medientechnologien, insbesondere die Verbreitung des Fernsehens und des Kinos im letzten Jahrhun-dert auch dazu geführt hat, dass das Ta¬ziyehritual zurückgedrängt wurde, ist es bemerkenswert, dass modernes Theater, Film und Fernsehen im Iran ihrerseits durch die Ta¬ziyehkultur und –praxis bis heute beeinflusst werden. Ich untersuche in meiner Promotionsarbeit die Geschichte und Auffüh-rung der Ta¬ziyeh, sowie ihre Rezeption im Theater, Film und Fernsehen im Iran. Die Ta¬ziyeh ist ein auf religiösen Riten beruhendes Passionsspiel, welches durch die Ideale und den Glauben der Schiiten begründet wurde und seinen Ursprung im Mythos des  hat. Für das Verständnis der Ta¬ziyeh ist über die Begriffsklärung hinaus sowohl ein grundlegender Überblick über die schiitische Glaubensrichtung, als auch ein Abriss der altiranischen Geschichte und Kultur im ersten Teil dieser Ar-beit unerlässlich. Außerdem werde ich auf die konkrete Ausgestaltung des schiiti-schen Passionsspiels eingehen. Besonders wichtig erscheinen mir hierbei der Ort der Aufführung des Schauspiels, die Dekoration und Requisiten, sowie die Art der Aufführung, zu der eine genaue Beschreibung der Schauspieler, ihrer Rollen, ihrer Kostüme, der begleitenden Musik und der für die Vorstellung benötigten Tiere gehört. Im weiteren Verlauf der Arbeit soll dann detailliert auf die theatralische Entwicklung der Ta¬ziyeh in der Zeit des 15.– 20. Jahrhunderts anhand von Be-richten berühmter Iranreisender eingegangen und eine Rezeption des letzten Jahr-hunderts im Hinblick auf die Ta¬ziyeh besprochen werden. Im dritten Teil der Arbeit analysiere ich nach der Klärung der Ta¬ziyehhistorie und -ästhetik in den ersten beiden Teilen schließlich ausführlich die Rezeption und Praxis der Ta¬ziyeh im modernen Theater, Film und anderen Medien im Iran. Diese Untersuchung bildet aus Sicht der Theater- und Medien-wissenschaften den wesentlichen Kern der Arbeit, in dem die im Untersuchungs-gegenstand beschriebene Synthese herausgearbeitet wird. Dafür werden exempla-risch zwanzig Werke bedeutender Künstler des Irans herangezogen, die den Ein-fluss des sakralen Rituals in einem säkularen Medium eindeutig aufzeigen. Den Abschluss der Arbeit bildet eine Synopsis der Untersuchungen, so-wie ein Ausblick auf die gegenwärtige Entwicklung der Ta¬ziyeh.
Für die geplanten Untersuchungen wurde eine eigene Methode für die Kultur primärer humaner Bronchialepithelzellen etabliert. Die Bronchialepithelzellen wurden aus Lungenteilresektaten durch eine cytologische Bürstung gewonnen. Die verwendeten Kulturschalen wurden mit Kollagen beschichtet. Als serumfreie Kulturmedien wurden ein Expansionsmedium und ein Differenzierungsmedium verwendet. Dabei enthielt das Expansionsmedium proliferationsfördernde Supplemente, was zu einer deutlich gesteigerten Zellausbeute gegenüber der Verwendung handelsüblicher Medien führte. Im Differenzierungsmedium wurden Supplemente verwendet, die für die Differenzierung und Ziliogenese bronchialer Epithelzellen erforderlich sind. Die Kultur erfolgte an einer Luft-Medium-Grenzfläche, die für Bronchialepithelzellen eine physiologische Umgebung darstellt. Die Charakterisierung der Kulturen zeigte keine Verunreinigungen mit Fibroblasten, Muskelzellen oder Zellen mesenchymalen Ursprungs. Das charakteristische kopfsteinplasterartige Erscheinungsbild, sowie der immunhistochemische Nachweis von Cytokeratin 18 belegten den bronchoepithelialen Charakter der Kulturen. In der vorliegenden Arbeit wurde mit der RT-kompetitive Multiplex-PCR (RCMP) eine Technik entwickelt, mit deren Hilfe die Expression von Genen in niedriger Kopienzahl oder aber in Proben mit geringer RNA-Menge nachgewiesen werden kann. Geringe Ausgangsmengen an RNA wiesen vor allem die Primärkulturen von humanem Bronchialepithel, als auch frische Gewebebürstungen des Bronchial- und Nasenepithels auf. Die RCMP basiert auf einer kompetitiven PCR und kombiniert eine exogen interne und endogen interne Standardisierung. Damit wurde die mRNA-Expression von bis zu vier Genen in einem Ansatz analysiert. Die RCMP löst dabei mehrere Probleme herkömmlicher PCR-Verfahren: 1. mRNAs mit hoher oder niedriger Kopienzahl können in einem Ansatz koamplifiziert werden. 2. Die semiquantitative Quantifizierung ist unabhängig von den Syntheseeffizienzen von Target und Referenzgenen. 3. Die RCMP kontrolliert Schwankungen der initialen RNA-Menge. 4. Die Unabhängigkeit der RCMP von der Kenntnis der initialen RNA Menge erlaubt auch die Bestimmung von Probenmaterial in dem nur geringe mRNA-Mengen vorhanden sind. Damit eignet sich die RCMP besonders für Expressionsstudien Materialien wie Bioptaten, Nasal- oder Bronchialbürstungen, sowie den Kulturen primärer Bronchialepithelzellen. Mit Hilfe der RCMP wurden erstmals die mRNA der Osmolyttransporter BGT-1, SMIT und TAUT in Bronchialepithelzellen nachgewiesen. Nach Behandlung mit hyperosmotischen Medien wurde die mRNA-Expression dieser Transporter stark induziert. Bronchialepithelzellen perzeptieren osmotische Belastungen und versuchen, ihnen entgegenzuwirken. Hyperosmotische Belastungen können in Bronchialepithelien zu einer Inflammation ohne zugrunde liegende Infektion führen. Dabei wird zeit- und dosisabhängig sowohl die Sekretion als auch die Expression von IL-8 induziert. An dieser Induktion ist die p38 MAP-Kinase beteiligt. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind sowohl an der Induktion der IL-8 Sekretion und Expression beteiligt, als auch an der Aktivierung der p38 MAPKinase. Weiterhin zeigte sich, dass die Induktion der Sekretion von IL-6 und IL-8 abhängig von osmotisch bedingten Änderungen des Zellvolumens ist. Auch hier wird bereits die p38 MAP-Kinase durch das Zellvolumen reguliert. Die Ergebnisse legen ein mögliches Modell für die initialen Vorgänge in der CF-Lunge nahe. Die Veränderungen des Ionenhaushalts bei der cystischen Fibrose, sowie die eingeschränkte Zellvolumenkontrolle bei CF-Zelllinien, weisen darauf hin, dass ein defektes CFTR-Protein zu einer von neutrophilen Granulozyten dominierten Inflammation führen kann, ohne das die Lunge bereits mit Erregern besiedelt wurde.
Zur Erforschung der in vivo Effekte von UVA-Strahlung, Creme-PUVA-Behandlung und der Alterungsprozesse auf die kleinmolekularen Antioxidantien in humaner Haut, insbesondere auf die wasserlöslichen Formen Askorbinsäure und Harnsäure sowie das fettlösliche alpha-Tokopherol, entnahmen wir Hautproben von 9 Patienten, die sich einer UVA-Provokation unterzogen, und Hautproben von 11 Patienten, die eine Creme-PUVA-Bestrahlung erhielten. Jedem Probanden wurden eine Kontrollbiopsie und eine Biopsie unmittelbar nach der Bestrahlung entnommen. Zusätzlich wurden Proben nach 48 h gewonnen. Da relativ geringe Mengen an Probenmaterial zur Verfügung standen, wurde eine neue Methode zur Extraktion von wasser- und fettlöslichen Antioxidantien im Gewebe in einem Arbeitsschritt etabliert. Um die Unterschiede in den Hautschichten zu berücksichtigen, wurden die gefrorenen Hautbiopsien horizontal in eine 1.5 mm dicke obere Schicht und eine 1.5 mm dicke untere Schicht getrennt. Wir fanden einen signifikanten Unterschied zwischen der Menge von Askorbinsäure und alpha- Tokopherol im oberen Kompartiment der Haut (Epidermis und obere Dermis) im Vergleich zum unteren Kompartiment der Haut (untere Dermis und obere Subkutis). Askorbinsäure hatte eine 7-fach höhere Konzentration in den oberen 1.5 mm (p < 0.0001), wohingegen alpha-Tokopherol eine 7-fach größere Konzentration in den unteren 1.5 mm der Haut aufwies (p < 0.0003). Die Konzentration von Harnsäure war geringfügig höher in den oberen 1.5 mm (p < 0.005). Beim Vergleich der unbehandelten Hautproben mit den UVA-bestrahlten Proben, fanden wir eine Erniedrigung der Askorbinsäure in den oberen 1.5 mm der Haut nach Behandlung (p < 0.05), aber keine signifikanten Unterschiede für Harnsäure und alpha-Tokopherol. In der Creme-PUVA-behandelten Haut fanden wir keine Veränderungen bzgl. der hydrophilen Antioxidantien, wohingegen sich alpha-Tokopherol direkt nach der Bestrahlung im unteren Kompartiment signifikant erhöhte (p < 0.01). Bezüglich möglicher altersabhängiger Veränderungen der kleinmolekularen Antioxidantien ergab sich keine signifikante Korrelation zwischen den Konzentrationen von Askorbinsäure, Harnsäure und alpha-Tokopherol in unbehandelter Haut und dem chronologischen Alter der Probanden. Die hier vorliegenden Untersuchungen zeigen damit, dass Askorbinsäure sich bei Dosen von UVA-Bestrahlung verringert, bei denen alpha-Tokopherol und Harnsäure noch unverändert bleiben. Unsere Daten lassen vermuten, dass Creme-PUVA-Behandlung keinen verringernden Effekt auf die kleinmolekularen Antioxidantien in humaner Haut hat und daher aus oxidativer Sicht eine sichere Therapie darstellt. Vielmehr scheint sich die Konzentration von alpha-Tokopherol in unteren Schichten der Haut während der PUVA-Behandlung zu erhöhen, obwohl nur eine sehr geringe Menge an alpha;-Tokopherol in der PUVA-Creme enthalten ist. Der genaue Grund hierfür bleibt unklar und sollte Gegenstand künftiger Untersuchungen sein.
Die radikale Zystektomie in Kombination mit einer pelvinen Lymphadenektomie gehört zur Standardtherapie in der Behandlung des muskelinvasiven Harnblasenkarzinoms. Der Stellenwert der pelvinen Lymphadenektomie liegt nicht nur als Staging-Maßnahme vor, sondern erfolgt auch unter onkologischen Aspekten zur Verbesserung der lokoregionären Tumorkontrolle. Ob der Patient von der zeitaufwendigen und eventuell auch morbiditäsreichen extensiven Lymphknotendissektion profitiert, versuchen einige retrospektive Analysen zu beantworten. Seit den frühen achtziger Jahren, als Skinner berichtete, dass durch die pelvine Lymphadenektomie Patienten mit Lymphknotenmetastasen möglicherweise geheilt werden können, wird der therapeutische Nutzen der Lymphadenektomie im Rahmen der radikalen Zystektomie beim muskelinvasiven Urothelkarzinom der Harnblase kontrovers diskutiert. Es gibt Hinweise in der Literatur, dass Patienten von der pelvinen Lymphadenektomie profitieren, wenn der Lymphknotenbefall minimal ist und der Blasentumor die Organgrenzen noch nicht überschritten hat. Der tatsächliche Nutzen der Lymphknotenentfernung ist jedoch weiterhin umstritten. Bislang ist unklar, ob durch die Lymphadenektomie das Überleben von Patienten mit positiven Lymphknoten verlängert werden kann und ob eine erweiterte Lymphadenektomie die Ergebnisse verbessert. Es existieren bislang jedenfalls keine überzeugenden Daten, die beweisen , dass die systemische Ausbreitung eines malignen Tumorleidens tatsächlich mit einer lokalen Therapiemaßnahme kurativ behandelt werden kann. Der Stellenwert der Lymphadenektomie beim muskelinvasiven Harnblasenkarzinom ist noch lange nicht geklärt. Angefangen von der Durchführung, Ausdehnung, Verteilung bis zur Auswertung und die daraus resultierenden Konsequenzen, sind bis heute noch nicht standartisiert. Diese Faktoren spielen jedoch eine wesentliche Rolle zur Verbesserung der Behandlungsergebnisse beim lymphogen metastasierten Harnblasenkarzinom. In der folgenden retrospektiven Analyse haben wir anhand unseres Krankengutes das Überleben lymphknotenpositiver Patienten nach radikaler Zystektomie untersucht und in Subgruppen klassifiziert sowie miteinander verglichen. Die Lymphknotendichte als Prognosefaktoren für das fortgeschrittene Harnblasenkarzinom sollte daraus evaluiert werden.
Die vorliegende prospektive Studie untersucht 66 retrograde und 4 antegrade geschlossene Marknagelungen bei Humerusschaftfrakturen mit einem ab dem 22. Patienten modifizierten Russell-Taylor-Nagel in einem Untersuchungszeitraum von 5 Jahren (1995 bis 2000). Behandelt wurden 52 frische Verletzungen, davon 2 offene Frakturen, 17 pathologische Frakturen und eine verzögerte Knochenbruchheilung. Nach der AO-Klassifikation waren außer C2 und C3 Frakturen alle Frakturtypen vertreten. Das durchschnittliche Patientenalter betrug 54 Jahre. Als schwerwiegendste intraoperative Komplikation sahen wir in 4 Fällen (5,7%) eine iatrogene Humerusfraktur, die eine zusätzliche Plattenosteosynthese erforderte. 6 distale Fissuren bedurften keiner weiteren Therapie. Eine posttraumatische Osteitis trat in keinem Fall auf. Ein Verfahrenswechsel war nicht notwendig. Bei 88% der Patienten ergab sich nach einem Jahr ein Punktestand von gut oder sehr gut nach dem Score nach Kwasny, wo neben der klinischen und radiologischen Untersuchung auch subjektive Befunde und die Kosmetik miteinbezogen wurden. Zusammenfassend beurteilen wir den von retrograd eingebrachten Russell-Taylor-Nagel mit seiner von uns vorgenommenen Modifizierung als ein geeignetes Implantat zur Stabilisierung von Humerusschaftfrakturen. Wesentliche Komplikationen des Verfahrens können unter Beachtung bestimmter technischer Regeln vermieden werden.
Die Populationsdurchseuchung mit Coxsackieviren im Raum Frankfurt am Main der Jahre 2000 bis 2002
(2006)
In dieser Arbeit wurde die Epidemiologie von Coxsackieviren durch retrospektive Auswertung der Antikörperantworten im Neutralisationstest untersucht. Dabei wurden die Durchseuchungen mit Coxsackieviren nach der Höhe der Titerstufen, nach der Abhängigkeit vom Geschlecht und vom Alter ausgewertet und Vergleiche zur wissenschaftlichen Literatur angestellt. Das Untersuchungsmaterial stammte von 689 Patienten aus dem Einzugsgebiet der Johann Wolfgang Goethe-Universitätsklinik. Vom untersuchten Patientenkollektiv wiesen zwischen ca. 8 und ca. 70 Prozent neutralisierende Antikörper gegen die Coxsackieviren der Serotypen A16, A9 und B1-B6 auf. Die höchste Anzahl an neutralisierenden Antikörpern waren gegen die Coxsackieviren des Serotyps B3 mit über 70 Prozent zu finden. Am niedrigsten war die Durchseuchung mit dem Coxsackievirus des Serotyps B6. Die Antikörpertiter wurden von 1:10 bis 1:1280 angegeben, wobei lediglich die Titerstufe 1:1280 als epidemiologisch auffällig gilt. Bei uns waren die niedrigen und mittleren Titerstufen häufiger vertreten als die hohen Titerstufen (1:1280). Von den im Neutralisationstest als positiv befundenen Seren wiesen gegen Coxsackievirus A9 nur 2,43% einen solchen erhöhten Antikörpertiter auf. Gegen Coxsackievirus B1 waren es 6,31%, gegen Coxsackievirus B2 4,83%, gegen B3 4,17%, gegen B4 4,66% und gegen B5 6,27%. Gegen Coxsackievirus A16 und B6 wurden keine signifikant erhöhten Antikörpertiter gefunden. 386 Seren stammten von männliche, 279 Seren von weiblichen Personen. Bei den restlichen Seren war keine Geschlechtsangabe dokumentiert worden. Prozentual gesehen, konnte man erkennen, dass Frauen häufiger neutralisierende Antikörper gegen die Coxsackieviren der Serotypen A16, B1, B4 und B5 besaßen, Männer dagegen gegen die Coxsackieviren der Serotypen A9, B2, B3 und B6. Bezogen auf alle acht untersuchten Coxsackieviren zeigten 53,05 % der Frauen neutralisierende Antikörper gegen Coxsackieviren auf und 51,78 % der Männer, statistisch gesehen ergab sich folglich kein signifikanter Unterschied. Bei Coxsackieviren der Gruppe A9, B1, B2, B3 und B5 waren mehr hohe Titerstufen beim männlichen Geschlecht zu finden, bei B4 beim weiblichen Geschlecht. Die Durchseuchungsraten waren über alle Altersgruppen konstant, folglich konnten keine mit dem Alter ansteigenden Durchseuchungsraten festgestellt werden. Die niedrigsten Antikörpertiter waren, außer bei Coxsackievirus-B5, in der Altersstufe der 1-4jährigen zu finden. Offenbar erfolgt die Durchseuchung mit Coxsackieviren folglich im Kleinkindesalter. Eine Bevorzugung einer bestimmten Altersgruppe war nicht zu erkennen, eine homogen niedrige Verteilung (~ 40%) im Gegensatz zu den anderen Serotypen konnte man bei den Coxsackieviren des Serotyps B1 ermitteln. Eine besonders hohe Verteilung fand sich dagegen bei Coxsackieviren der Gruppe B3 (~ 70%). Beim Vergleich mit der wissenschaftlichen Literatur konnten keine wesentlichen Veränderungen an der Populationsdurchseuchung mit Coxsackieviren festgestellt werden. Besonders im Raum Frankfurt blieben die Durchseuchungsraten fast identisch zu früheren Studien von vor 12-14 Jahren. Somit kann man eine Epidemie mit Coxsackieviren in den untersuchten Jahren ausschließen. Auch blieb die Durchseuchung mit Coxsackieviren unabhängig vom Geschlecht und vom Alter, wobei die niedrigeren Titerstufen durchweg häufiger vertreten waren.
Pneumoperitoneum mit Kohlendioxid steht im Verdacht, die Proliferation intraabdomineller Tumorzellen zu beeinflussen. Vorangegangene Versuche haben bereits gezeigt, daß isobares Kohlendioxid die Proliferation von Kolonkarzinomzellen in vitro und in der Ratte stimulieren. In der vorliegenden Arbeit wurden Zellen des Colon-Karzinoms CX-2 und des Pancreas-Karzinoms DAN-G mit Kohlendioxid unter iso- und hyperbaren Bedingungen behandelt. Das Tumorwachstum wurde bis zum 15. Tag nach der Exposition durch DNA-Färbung mit Pico-Green gemessen. An den ersten vier Tagen nach Expositon ist das Tumorwachstum bei beiden Zellinien signifikant vermindert. Ab dem fünften Tag ist das Wachstum von DAN-G bei allen Drücken bis zum Ende des Untersuchungszeitraumes signifikant erhöht. Bei CX-2 hängen Ausmaß und Dauer der Proliferationssteigerung von der Höhe der jeweiligen Drücke ab. Schlußfolgerung: Kohlendioxid beeinflußt das Wachstum humaner Karzinomzellen. Das Ausmaß des Effektes hängt im Wesentlichen von der Höhe des Gasdruckes während der Exposition ab.
Leukämien sind eine heterogene Gruppe von malignen Erkrankungen der hämatopoetischen Zellen. Die Pathogenese der akuten myeloischen Leukämie (AML) ist durch einen Differenzierungsblock charakterisiert [Gelmetti V MCB 1998, Ruthardt M MCB 1997, Grignani F Cell 1993, Testa U Leukemia 1998]. Die akute Promyelozyten Leukämie (APL) ist eine gut charakterisierte Unterform der AML, die in 95% der Fälle die t(15;17) und in 2% die t(11;17) beinhaltet. Die resultierenden Fusionsproteine PML/RARalpha und PLZF/RARalpha (X-RARalpha) geben in verschiedenen Modellen den leukämischen Phänotyp wieder und induzieren einen Differenzierungsblock. Im Tiermodell induziert die Expression von PML/RARalpha und PLZF/RARalpha eine Leukämie. Die Behandlung mit all-trans-Retinolsäure (t-RA) ist in der Lage den Differenzierungsblock in PML/RARalpha, aber nicht in PLZF/RARalpha positiven Blasten zu überwinden. Diese beiden Fusionsproteine blockieren die Differenzierung durch verschiedene Mechanismen, so z.B. durch die aberrante Rekrutierung von Histon-Deazetylase-Korepressor-Komplexen (HD-NCR) und die Deregulierung differenzierungsspezifischer Transkriptionsfaktoren wie VDR oder c/EBPa [Puccetti E Blood 2004]. Der Vitamin D3 Rezeptor (VDR) ist ein Mitglied der hormoninduzierbaren Transkriptionsfaktoren und bindet direkt an PML/RARalpha, was zur funktionellen Inaktivierung von VDR und Blockierung der VitD3-induzierten Differenzierung führt [Puccetti 2002]. Das Ziel dieser Arbeit war es zunächst, zu untersuchen, ob XRARalpha in der Lage sind andere differenzierungsrelevante Transkriptionsfaktoren, wie PU.1 und GATA-1, zu binden und dadurch funktional zu inaktivieren. GATA-1 und PU.1 sind Schlüsselfaktoren der myeloischen Differenzierung. Kürzlich wurde gezeigt, dass der Knockout dieser beiden Transkriptionsfaktoren zur Leukämogenese beiträgt [Rosenbauer F 2005, Stachura 2005]. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass X-RARalpha sowohl GATA-1, als auch PU.1 direkt binden, ohne ihre Expressionsniveaus zu beeinflussen. Die DNA-Bindungskapazität dieser beiden Transkriptionsfaktoren auf ihre Zielpromotoren war durch X-RARalpha deutlich reduziert. Die Behandlung mit t-RA restorierte die Bindung von GATA-1, aber nicht von PU.1, was darauf schließen lässt, dass die funktionale Inaktivierung von GATA-1 ligandenabhängig, die von PU.1 -unabhängig ist. Die transkriptionelle Aktivität auf künstliche Zielpromotoren war in Gegenwart von X-RARalpha bei PU.1 stark reduziert, auf GATA-1 hatten X-RARalpha in diesem Zusammenhang keinen Einfluss. Die Überexpression dieser Transkriptionsfaktoren in X-RARalpha-positiven hämatopoetischen Stammzellen hat die aberrante Selbsterneuerung leukämischer Stammzellen (LSZ) reprimiert. Während PU.1 Differenzierung erzeugte, tat GATA-1 dies nicht. Die Vermutung liegt nahe, dass die Inhibition von Dissertation von Anita Seshire 2 GATA-1 über seinen Azetylierungsstatus in Gegenwart von X-RARalpha stattfindet, durch die Sequestrierung eines weiteren Proteins der Histon-Azetyltransferase (HAT) CBP/p300, die für die Azetylierung von GATA-1 verantwortlich ist. Zusammengenommen lassen diese Daten darauf schliessen, dass PU.1 durch die Interaktion mit PML/RARalpha seinem Wirkungsort entzogen wird (sequestriert) und das die Inhibition von GATA-1 ein Zusammenspiel aus Sequestrierung und Chromatin-Modellierung durch X-RARalpha ist. Die Fähigkeit von X-RARalpha, den leukämischen Phänotyp zu induzieren ist an ihre Fähigkeit zur Oligomerisierung und zur Formierung sog. Makrokomplexe gekoppelt [Grignani 1996, Minucci 2000, Puccetti 2005]. Um die Zusammensetzung dieser Makrokomplexe zu entschlüsseln, wurde ein Mockkontrollierter TAP-Proteomics-Screen mit PLZF/RARalpha in KG-1 Zellen durchgeführt. Es konnten verschiedene Proteine identifiziert werden, die spezifisch an PLZF/RARalpha binden und vermutlich eine Rolle für die Leukämogenese spielen. Die identifizierten Proteine spielen eine Rolle bei der Migration, den kleinen GTPasen, epigenetischer Regulation und Stammzellselbsterneuerung. Das „adenomatous poliposis coli“ Protein (APC) wurde als spezifischer Interaktionspartner für PLZF/RARalpha identifiziert und ist ein Hauptinhibitor des Wnt-Signalwegs. Die Deregulierung des Wnt-Signalwegs spielt eine bedeutende Rolle in der Leukämogenese durch die aberrante Induktion der Selbsterneuerung leukämischer Stammzellen [Zheng 2004]. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass APC direkt an PLZF/RARalpha, aber nicht PML/RARalpha bindet ß-catenin/TCF vermittelte Transkriptionssignale, die zur Leukämogenese beitragen können, aktiviert. Die Bindung an APC ist abhängig von der Oligomerisierungsfähigkeit des PLZF/RARalpha und daher von der korrekten Konformation der Proteininteraktionsdomäne BTB/POZ, was durch POZ-Punktmutanten nachgewiesen wurde, die auch nicht mehr in der Lage waren ß-catenin/TCF-vermittelte Transkription in derselben Stärke wie PLZF/RARalpha zu aktivieren. Die Überexpression von APC in PLZF/RARalpha-positiven LSZ hat ihre aberrante Selbsterneuerung vollkommen reprimiert. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die Interaktion von APC, GATA-1 oder PU.1 mit XRARalpha und der konsequente Sequester einen wichtigen Mechanismus zur Leukämogenese stellen. Weiterhin hat sich gezeigt, dass die Überexpression dieser Proteine, die aberrante Selbsterneuerung überwinden kann und teilweise Differenzierung erzeugt. Es konnten der Wnt-Signalweg als valides Ziel für neue Therapieansätze identifiziert werden und die molekularen Mechanismen der Pathogenese der APL weiter aufgeklärt werden.
Das sympathische Nervensystem entsteht aus Vorläuferzellen der Neuralleiste, die an die dorsalen Aorta gelangen und dort die primären sympathischen Ganglien bilden. Der Entwicklungsverlauf dieser Zellen hängt von den Signalen ab, welche sie während ihrer Wanderung empfangen. Die Differenzierung der Vorläuferzellen wird an der dorsalen Aorta angeregt. Als Signalmoleküle dienen die BMPs, die von der dorsalen Aorta gebildet und sezerniert werden. Die BMPs induzieren in den Vorläuferzellen die Expression der Transkriptionsfaktoren Mash1, Phox2b, Hand2 und Phox2a, die notwendig für den weiteren Differenzierungsprozess sind. Diese Transkriptionsfaktoren steuern direkt oder indirekt die Expression der terminalen Differenzierungsgene TH, DBH, SCG10 und NF160. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die Zink-Finger-Transkriptionsfaktoren Gata2 und Gata3 ebenfalls eine essentielle Funktion in der Entwicklung sympathischer Neurone ausüben. Im Huhnembryo wird, im Gegensatz zur Situation in der Maus, in den sympathischen Vorläuferzellen nur Gata2 exprimiert. Gata2 wird nach den Transkriptionsfaktoren Mash1, Phox2b, Hand2 und Phox2a, jedoch vor den noradrenergen Markergenen TH und DBH exprimiert. Die Expression von Gata2 ist BMP-abhängig, wie durch BMPÜberexpression und BMP-Funktionsblockierung gezeigt wird. Die Überexpression von Mash1, Phox2b und Hand2 in Vorläuferzellen führt zur Expression von Gata2. In der Phox2b-Nullmutante sind Gata2 und Gata3 nicht exprimiert. Damit ist Gata2/3 unterhalb von Mash1, Phox2b und Hand2 in der BMP-induzieren Signalkaskade einzuordnen. Die Funktionsblockierung von Gata2 im Huhnembryo und die Eliminierung des Gata3-Gens in der Maus ergaben eine starke Reduktion in der Größe der sympathischen Ganglien. Zusätzlich war die Expression des noradrenergen Markergens TH stark reduziert. Die Überexpression von Gata2 in Neuralleistenvorläuferzellen führt vorwiegend zur Entstehung von Neuronen, die keine autonomen Eigenschaften aufweisen und TH-, Phox2b- und Mash1-negativ sind. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass Gata2 im Huhn und Gata3 in der Maus Mitglieder des regulatorischen Netzwerks von Transkriptionsfaktoren sind, das essentiell für die Entwicklung sympathischer Neurone ist. Die Funktion der Gata-Faktoren in der noradrenergen Differenzierung autonomer sympathischer Neurone scheint jedoch von der Interaktion mit Koregulatoren abhängig zu sein, die in sympathischen Vorläuferzellen vorhanden sind. In Vorläuferzellen, welche diese Kofaktoren nicht erhalten, induziert Gata2 nahezu ausschließlich nicht-adrenerge Neurone. Gata2 könnte mit Phox2a/b und Hand2 interagieren, oder mit anderen unbekannten Faktoren die in den sympathischen Vorläuferzellen exprimiert sind. Die Entwicklung sympathischer und parasympathischer Neurone wird von BMPs sowie von den Transkriptionsfaktoren Mash1 und Phox2b gesteuert. Der Differenzierungsprozess in sympathischen und parasympathischen Ganglien führt zu unterschiedlichen Transmitterphänotypen. Sympathische Ganglien bestehen vorwiegend aus noradrenergen, parasympathische Ganglien dagegen aus cholinergen Neuronen. Hand2 wird in sympathischen Neuronen und nicht in parasympathischen Ziliarneuronen exprimiert und gilt als Transkriptionsfaktor der den noradrenergen Transmitterphänotyp spezifiziert. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass auch die Transkriptionsfaktoren Gata2/3 nicht in parasympathischen Ziliarganglien exprimiert werden. Die Expressionsanalysen an mehreren parasympathischen Ganglien zeigte jedoch, dass die Expression von Gata2/3- nicht vollständig mit der noradrenergen Genexpression korreliert. Die Analyse der Gata2/3- Expression im Locus ceoruleus, dem wichtigsten noradrenergen Zentrum im Gehirn ergab, dass Gata2 und Gata3 im LC des Huhnembryos nicht exprimiert werden. Die Expression von Gata2/3 hängt somit nicht zwingend mit den noradrenergen Phänotyp zusammen. Die selektive Funktion von Gata2/3 in der Entwicklung peripherer noradrenerger Neurone zeigt zudem, dass der noradrenerge Phänotyp in den peripheren und zentralen Neuronen unterschiedlich reguliert wird.
Die Rolle des cAMP/CREB-Signalwegs in der noradrenergen Differenzierung sympathischer Nervenzellen
(2006)
Um die sympathische Differenzierung in Abwesenheit von CREB zu untersuchen, wurden zunächst Embryonen von CREB-Null-Mäusen analysiert. In diesen Mäusen wiesen die sympathischen Ganglien an Embryonaltag E10,5 und E12 keine Unterschiede in der Differenzierung zu heterozygoten und wildtyp-Ganglien auf. Es wurde deshalb vermutet, dass die mit CREB interagierenden Transkriptionsfaktoren CREM und ATF1 den Verlust von CREB im sympathischen Ganglion funktionell kompensieren. Da Mäuse mit einem Knock-out von CREB und CREM bereits vor E10 sterben, konnte die Entwicklung sympathischer Ganglien in diesen Mäusen nicht weiter untersucht werden. Durch Immunfärbung gegen ATF1 in CREB-deletierten Mäusen und in situ-Hybridisierung gegen CREM und ATF1 wurde gezeigt, dass im Rumpf der CREB-KO-Maus keine drastische Hochregulation der Expression beider Gene stattfindet. Eine geringfügige Hochregulation konnte aber nicht ausgeschlossen werden kann. Um die cAMP/CREB-Signaltransduktion in Ganglienvorläuferzellen auszuschalten, und Kompensation durch CREM und ATF1 zu umgehen, wurden die dominant-negative Effektoren ACREB und PKA-R(I)mut verwendet. ACREB blockiert die Funktion von CREB, CREM und ATF1 (Ahn et al., 1998). Durch PKA-R(I)mut sollte die Aktivität von PKA inhibiert werden. Die Funktionalität beider Effektoren wurde in differenzierenden Zellkulturen bestätigt. Um in vivo geeignete Expression der Inhibitoren zu erzielen, wurden verschiedene Methoden des Gentransfers im Huhnembryo erprobt. Durch Infektion der Neuralplatte des Embryos mit Retroviruskonzentrat konnte frühe embryonale Expression der dominant-negativen Effektoren in Neurallleistenzellderivaten erzielt werden. Die Expression von ACREB im Embryo zeigte, dass CREB in der initialen adrenergen Differenzierung bis E4 erforderlich ist, die sympathischen Ganglien wiesen reduzierte adrenerge Genexpression auf. In späteren Embryonalstadien ist dieser Effekt nicht mehr nachzuweisen. Im Gegensatz zur Inhibition von CREB, hatte die Inhibition von PKA durch PKAR(I)mut keine Auswirkungen auf die Ganglienentwicklung in vivo. Durch pharmakologische Inhibition von PKA wurden kleinere Ganglien erzielt, ein selektiver Effekt auf die adrenerge Differenzierung wurde auch in diesem in vivo Experiment nicht beobachtet. Dies widerspricht den Hinweisen aus Zellkultur auf die selektive Funktion von PKA in der adrenergen Differenzierung. Der Befund, dass die Funktion von CREB in vivo auf die initiale adrenerge Differenzierung sympathischer Neurone beschränkt ist, und nicht für den Erhalt adrenerger Differenzierung erforderlich ist, wurde in vitro in differenzierten sympathischen Neuronen des Embryo bestätigt. ACREB und PKA-R(I)mut hatten keine bzw. nur geringe Auswirkungen auf den Anteil TH-positiver Neurone in Kulturen sympathischer Neurone aus Embryonen der Embryonaltage E7 und E12. Somit konnte erstmals in vivo eine physiologische Rolle für CREB in der Differenzierung sympathischer Neurone gezeigt werden: CREB ist für die initiale Expression von TH erforderlich.
Die folgende Arbeit ist eine von drei Dissertationen des interdisziplinären Forschungsvorhabens „Landschaftsarchäologie im Hessischen Ried“, das im Rahmen des Frankfurter Graduiertenkollegs „Archäologische Analytik“ stattfand. Das Projekt bestand aus einer archäologisch-historischen (MAURER 2003), einer bodenkundlichen (KANNENGIEßER Diss. in Arbeit) sowie dieser palynologischen Dissertation. Gemeinsam beschäftigen sich diese Arbeiten mit der Landschaftsrekonstruktion des nördlichen Hessischen Rieds. Die palynologischen Untersuchungen hatten das Ziel, die bisher weitgehend unbekannte ‚jüngere’ Vegetationsgeschichte von der vorrömischen Eisenzeit bis etwa zum 5. Jh. n. Chr. zu rekonstruieren. Zwischen der Eisenzeit und dem Frühmittelalter gab es im Hessischen Ried mehrere kulturelle Umbrüche. In der Spätlatènezeit siedelte eine keltische Bevölkerungsgruppe im nördlichen Hessischen Ried. Deren Spur verliert sich aber im 1. Jh. v. Chr. Erst nach einer ‚Fundlücke’ von etwa 50 Jahren findet man schließlich Überreste eine elbgermanische Population (LENZ-BERNHARD & BERNHARD 1991). Über Lebensweise und Anzahl dieser germanischen Bevölkerung wissen wir fast nichts. Zumindest ein Teil von ihnen aber diente im römischen Heer. Etwa ab dem Jahr 13/12 v. Chr. in augusteischer Zeit stand das Ried unter dem Einfluss des seitdem am Rhein stationierten römischen Militärs (MAURER 2003). Im Zuge der Okkupation kamen römische Soldaten mitsamt ihrem Tross von Angehörigen und Marketendern an den Rhein. Da sehr wenig über die zuvor ansässige Bevölkerung bekannt ist, ist es unklar, wie sich die Bevölkerungsstärke und damit der Bedarf an landwirtschaftlicher Nutzfläche während dieser Zeit veränderte. In der mittleren Kaiserzeit (ca. 70–260 n. Chr.) bildete das Hessische Ried das südöstliche Vorfeld der Provinzhauptstadt Mogontiacum (Mainz) bzw. das Umland des Auxiliarkastells/Zivilvicus Groß-Gerau-„Auf Esch“. In die sog. „agri decumates“ rechts des Rheins (Tacitus, GERMANIA 29, 3) gesellten sich nach und nach noch gallische Siedler zur römischen Bevölkerung. Es ist zu erwarten, dass sich die kulturellen Umbrüche dieser Zeit auch im Landschaftsbild widerspiegelten. Beispielsweise werden vielerorts den Römern die ersten großflächigen Waldrodungen und Raubbau an der Landschaft zugeschrieben (BEHRE 1988, CÜPPERS 1990, DUMAYNE 1993). In den letzten Jahren mehren sich allerdings die Indizien dafür, dass zumindest in einigen Gebieten einschneidende Landschaftseingriffe bereits in der Eisenzeit stattgefunden haben und die Landschaft bei Ankunft der Römer schon weitgehend entwaldet und anthropogen geprägt war (BUNNIK et al. 1995, STOBBE 1996, 2000, STOBBE & KALIS 2001, 2002, DÖRFLER et al. 2000, KOOISTRA 1996, DUMAYNE 1993, DUMAYNE-PEATY 1998). Auch für das nördliche Hessische Ried bestätigt die vorliegende Arbeit dieses Bild. Schon in der Eisenzeit entstand im Hessischen Ried eine weitgehend geöffnete Landschaft mit Grünlandflächen und Äckern. Die Vegetationsveränderungen beim Übergang von der Bronzezeit zur Eisenzeit (um 800 BC) sind dabei weit deutlicher als beim Übergang von der Eisenzeit zur Römischen Kaiserzeit. In der Römerzeit wurde zwar der Ackerbau intensiviert und einige typische Kulturpflanzen wurden eingeführt, doch das restliche Pollenspektrum verändert sich kaum. Beim Rückzug der römischen Armee vom Odenwaldlimes kam es zu einer leichten Regeneration der Buche im Umland. Während der Völkerwanderungszeit sieht man in den Profilen keine deutliche Waldregeneration, sondern nur einen leichten Rückgang der Bewirtschaftung.
Beim Übergang vom Wachstum zur Entwicklung entsteht in Dictyostelium discoideum aus einzelnen vegetativ wachsenden Zellen ein multizellulärer Organismus, der in der Lage ist ausdauernde Sporen zu bilden. Während der im multizellulären Verband stattfindenden morphologischen Veränderungen und Zelldifferenzierung nimmt die Proteinkinase A (PKA) eine Schlüsselfunktion ein. Der C-Modul bindende Faktor A (CbfA), ursprünglich aufgrund seiner spezifischen Bindung an eine regulatorische DNA-Sequenz des Non-LTR Retrotransposons TRE5-A.1 in D. discoideum entdeckt, ist für den Übergang vom Wachstum zur Differenzierungsphase essentiell. Zellen der CbfA-Mangelmutante JH.D2 weisen im Vergleich zu denen des Wildtyp-Stamms AX2 ein verlangsamtes Wachstum und eine verzögerte Einleitung der Aggregation und der Entwicklung auf. Charakteristisch für diese CbfA-Mutante ist die Unterexpression der mRNA für die katalytische Untereinheit der Proteinkinase A (PkaC). Da die Expression der PkaC sowohl auf der Transkriptions- als auch auf der Translationsebene reguliert ist, wurde in dieser Arbeit ein monoklonaler Antikörper gegen die katalytische Untereinheit hergestellt, um den Proteingehalt an PkaC in Zellen der CbfA-Mutante zu untersuchen. Dabei konnte eine starke Unterexpression der PkaC in den CbfA-depletierten Zellen nachgewiesen werden. Demnach scheint es einen mittelbaren Zusammenhang zwischen der Menge an CbfA und dem sich selbst verstärkenden cAMP-abhängigen Signaltransduktionssystem der Zellen zu geben, da ein Mangel an cAMP eine fehlende Aktivierung der sich selbst induzierenden PKA nach sich zieht. Für D. discoideum konnte erstmals eine reproduzierbare 2D-gelelektrophoretische Trennmethode etabliert werden, mit der es gelang, differentiell exprimierte Proteine im Stadium der frühen Entwicklung zwischen den untersuchten D. discoideum-Stämmen AX2 und JH.D2 aufzufinden. Die Anwendung der DIGE-Technologie ermöglichte dabei die Detektion von ca. 30-40 differentiell exprimierten Proteinen. Durch die massenspektrometrische Untersuchung dieser Proteine unter Verwendung der MALDI-TOF Methode in Kombination mit dem Peptid-Massen-Fingerabdruck konnten insgesamt ca. 30% der differentiell exprimierten Proteine identifiziert werden. Dabei stellte sich heraus, daß vor allem Proteine mit essentiellen Funktionen im zellulären Stoffwechsel in der CbfA-Mangelmutante JH.D2 auf geringerem Niveau exprimiert wurden als im Wildtyp-Stamm AX2. Dies könnte eine Erklärung für die letalen Auswirkungen eines vollständigen knockouts von CbfA in D. discoideum liefern. Zusätzlich wurde mit Hilfe der DIGE-Technologie die Funktion der C-terminalen Domäne des CbfA-Proteins untersucht. Für diese Experimente wurde eine CbfA-Mutante verwendet, die den C-Terminus konstitutiv überexprimiert. Die daraus resultierenden Proteinmuster haben gezeigt, daß die C-terminale Domäne unabhängig vom Rest des Proteins sowohl induzierenden als auch reprimierenden Einfluß auf die Proteinexpression nimmt. Diese Ergebnisse zeigen eine unerwartet komplexe Funktion des Proteins CbfA in der Regulation von Genen während der untersuchten Lebensphasen von D. discoideum.
In der vorliegenden Studie wurden zwei Polyether und sechs additionsvernetzende Silikone hinsichtlich ihrer Dimensionsgenauigkeit untersucht. Mit Hilfe einer zu diesem Zweck hergestellten V2A-Stahlform konnte das Dimensionsverhalten isoliert betrachtet werden, ohne Einflussnahme anderer Parameter wie zum Beispiel durch die Desinfektion oder die Gipsexpansion. Von jedem Material wurden zehn Abformungen genommen, die mit Hilfe eines Stereomikroskops hinsichtlich ihres Dimensionsverhaltens vermessen wurden. Die Messungen wurde zu zwei Zeitpunkten durchgeführt: der erste Zeitpunkt entsprach dem vom Hersteller frühest möglichen angegebenen Termin zur Modellherstellung, die zweite Vermessung erfolgte nach insgesamt 90-minütiger Lagerung. Im Ergebnis zeigte sich, dass die Messstrecke 1 – 2 die wenigsten signifikanten Differenzen im Vergleich zu den durch Vorvermessungen erhaltenen Referenzwerten aufwies, während die Messstrecken 1 – 3, 1 – 4, 2 – 3 und 3 – 4 sich überwiegend signifikant von diesen unterschieden. Alle Materialien banden teilweise unter Kontraktion, teilweise unter Expansion ab. Hinsichtlich der Vermessungszeitpunkte lies sich bei Honigum ein verbessertes Dimensionsverhalten zum zweiten Vermessungszeitpunkt konstatieren. Bei den anderen getesteten Materialien war keine Abhängigkeit des Dimensionsverhaltens von den beiden Vermessungszeitpunkten feststellbar. Gegenüber den Referenzwerten reichten die Dimensionsveränderungen von 0,001 % bis zum Maximum von 0,19 %. Cirka zehn Prozent der erhaltenen Werte befanden sich in einem Bereich von > 0,1 % bzw. < -0,1 %. Insgesamt konnte den untersuchten Materialien zu beiden Vermessungszeitpunkten ein sehr gutes Dimensionsverhalten konstatiert werden, wobei weder die beiden Materialgruppen Polyether und additionsvernetzende Silikone qualitative Unterschiede zueinander aufwiesen, noch die jeweiligen Produkte selbst.
Hintergrund und Fragestellung: Hörbahn und die kortikalen Hörzentren benötigen eine frühzeitige regelmäßige akustische Stimulation für ihre Reifung. Ohne die Reizung in den ersten Lebensjahren gehen ungenutzte neuronale Vernetzungen zugrunde bzw. werden gar nicht erst entwickelt. Deshalb kommt der Einführung eines universellen Neugeborenen-Hörscreenings zur Detektion frühkindlicher Hörstörungen in den letzten Jahren eine große Bedeutung zu. Zur Sicherstellung eines effektiven Screenings muss ein optimales objektives Verfahren gewählt werden, basierend auf OAE- und ABR-Technologien, eingesetzt in Form von Mono- oder Kombinationsverfahren. Voraussetzung für den Einsatz als Screening-Gerät sind höchstmögliche Sensitivität und Spezifität, eine einfache Bedienung sowie Kostengünstigkeit. Desweiteren ist dabei jenen Verfahren der Vorrang zu geben, welche, bei immer kürzer werdenden Liegezeiten der Patientinnen und Zunahme ambulanter Geburten, mit nur einem einzigen Test eine Rate an Testauffälligen von unter 4% erreichen. Patienten und Methode: An 473 Kindern wurden in drei Geburtskliniken monaural Hörscreening-Untersuchungen durchgeführt. Zur Verfügung standen hierbei das Kombinationsgerät echo-screen TA® zur Messung von TEOAE und AABR, sowie das MB11 BERAphon® mit zwei verschiedenen Verfahren zur Messung von AABR, einerseits der Zeitgang-AABR, andererseits einer steady-state-AABR. Ergebnisse: Mit nur einer einzigen Messung erreichten alle Verfahren bis auf die Zeitgang-AABR des MB11 BERAphon® eine Testauffälligen-Rate von 5 % bzw. darunter. Zudem bietet das Kombinationsgerät echo-screen TA® die Möglichkeit, ein mittels TEOAE-Verfahren als auffällig getestetes Kind anschliessend mittels AABR-Verfahren zu überprüfen. Die mittlere Messzeit betreffend zeigte sich das TEOAE-Verfahren des echo-screen TA® erwartungsgemäß schnell. Bei den AABR-Verfahren lieferte das MB11 BERAphon® mit der steady-state-AABR vor dem echo-screen TA® und vor der Zeitgang-AABR ein Ergebnis. Im Vergleich der mittleren Untersuchungszeiten zeigte sich die längste Untersuchungszeit für die kombinierte TEOAE- und AABR-Messung des echo-screen TA®. Betrachtet man jedoch die einzelnen Verfahren untereinander, so zeigte sich auch hier der geringe Zeitaufwand des TEOAE-Verfahrens. Das AABR-Verfahren des echo-screen TA® erwies sich, aufgrund der zu klebenden Elektroden, als zeitaufwendiger als die AABR-Verfahren des MB11-BERAphon®. Die Sensitivität ergab für alle hier verwendeten Verfahren 100%. Alle Verfahren, bis auf die Zeitgang-AABR des MB11 BERAphon® zeigten sehr gute Verfahrensspezifitäten von über 96%. In der Kostenanalyse wurde deutlich, dass die alleinigen TEOAE-Messungen des echo-screen TA® günstiger als die AABR-Messungen waren. Dennoch sind auch die AABR-Verfahren des MB11 BERAphon® aufgrund des eingeschränkten Materialverbrauchs nicht mehr deutlich kostenintensiver. Schlussfolgerung: Unter Berücksichtigung aller zu erfüllenden Kriterien eines Hörscreening-Gerätes sind sowohl die steady-state-AABR das MB11 BERAphon® als auch das Kombinationsverahren des echo-screen TA® für ein universelles Hörscreening geeignet. Kosten und Zeitaufwand des echo-screen TA® sind beim Gebrauch beider Verfahren (TEOAE und AABR) im Vergleich zum Monoverfahren (steady-state-AABR des MB11 BERAphon® ) höher und bedingten in der hier vorgestellten Studie einen leichten Vorteil der steady-state-AABR bei ansonsten nahezu ausgeglichenen Ergebnissen. Die Zeitgang-AABR des MB 11 BERAphon® konnte die gültigen Qualitätskriterien zum Studienzeitpunkt nicht erfüllen, wobei anwenderbedingte Gründe weitestgehend ausgeschlossen werden können.
Der Prävention und Therapie von diabetischer Nephropathie kommt immer mehr Bedeutung zu, da sie der Hauptgrund für terminale Niereninsuffizienz ist. Ein möglicher Therapieansatz ist die Hemmung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems mit Angiotensin Converting Enzyme Inhibitoren oder kombinierten ACE und neutrale Endopaptidase (Vasopeptidase) Inhibitoren. Trotz der therapeutischen Effektivität einer pharmakologischen Hemmung des RAAS ist die Bedeutung von ACE und NEP in der Pathogenese der diabetischen Nephropathie noch nicht vollständig geklärt. Auf Gewebsebene kann die erhöhte Bildung und Akkumulation von AGEs zur Entwicklung von diabetischer Nephropathie beitragen (73) und der ACE-Inhibitor Ramipril kann die Anreicherung von fluoreszierenden AGEs in der Niere und im Serum von Typ I diabetischen, hypertensiven Ratten verhindern (73). Da AGEs unterschiedliche Strukturen und Effekte auf Proteine haben, sollte der Einfluss des ACEInhibitors Ramipril und des Vasopeptidase Inhibitors AVE7688 auf die Akkumulation von den drei prototypischen AGEs 3-DG-Imidazolon, Pentosidin und CML in einem Typ II diabetischen Tiermodell untersucht werden. Für den AGE-Subtyp CML wurde zusätzlich noch die Konzentration im Serum und die CML Clearance in ZDF Ratten bestimmt. Des Weiteren sollte der Effekt von Ramipril und AVE7688 auf die AGE Bildung in vitro analysiert werden. Die Charakterisierung der ZDF Ratten ergab, dass es zu einer 40, 50 und 55%igen Akkumulation der AGE-Subtypen 3-DG-Imidazolon, Pentosidin und CML in der Niere von 37 Wochen alten ZDF Ratten kommt. Diese Akkumulation konnte durch die Behandlung mit AVE7688 komplett verhindert werden, während Ramipril nur die CML Akkumulation in 37 Wochen alten ZDF Ratten leicht reduzierte. Auch wurde die CML Akkumulation im Serum von 37 Wochen alten ZDF Ratten durch AVE7688 verhindert. AVE7688 reduzierte nicht nur die AGE Akkumulation, sondern verbesserte auch die CML Clearance, während Ramipril keinen Effekt hatte. Die Effekte zur AGE Reduktion gingen einher mit einer Verhinderung der Albuminurie durch AVE7688 und einer 30%igen Reduktion durch Ramipril. In vitro Studien zu AGE Bildung zeigten, dass AVE7688 die Bildung von CML und Pentosidin verhindern kann und dass chelatierende Eigenschaften von AVE7688 an diesem Effekt beteiligt sein könnten. Ramipril hatte nur sehr schwach chelatierende Eigenschaften und keinen Einfluss auf die in vitro Bildung von CML oder Pentosidin. Neben der Akkumulation von AGEs trägt auch die Aktivierung der intrazellulären Signaltransduktion des Receptor of Advanced Glycation End Products (RAGE) zur Entwicklung von diabetischer Nephropathie bei. Dies wurde in doppelt transgenen diabetischen Mäusen gezeigt, die aufgrund der RAGE Überexpression verstärkt diabetische Nephropathie im Vergleich zu diabetischen Mäusen mit normaler RAGE Expression entwickeln (64). Die Aktivierung der RAGE Signaltransduktion mit den Liganden AGEs und S100B führt zu Entzündungsprozessen und zu einer Hochregulation der RAGE Expression (97). Da es in ZDF Ratten zur Akkumulation von AGEs kommt, wurde untersucht, ob ihr Rezeptor RAGE vermehrt in ZDF Ratten exprimiert wird und ob AVE7688 oder Ramipril die RAGE Expression beeinflussen. Die Substanzen könnten zum einen die RAGE-Liganden Interaktion direkt beeinflussen oder über eine Reduktion der Liganden die RAGE Expression verändern. Um dies zu untersuchen, wurde zunächst biochemisch die Interaktion von RAGE mit den Liganden AGEs und S100B näher analysiert, und die Bindedomaine von RAGE charakterisiert. Anhand dieser Daten wurde der Effekt von AVE7688 und Ramipril auf die biochemische RAGE-Liganden Interaktion und zelluläre RAGE Aktivierung in Makrophagen im Vergleich zu einem RAGE Antagonisten untersucht. In den ZDF Ratten korrelierte die AGE Akkumulation mit einer erhöhten RAGE Expression in der Niere von 37 Wochen alten ZDF Ratten. AVE7688, nicht jedoch Ramipril, reduzierte die erhöhte RAGE Expression in den ZDF Ratten. Bei der Charakterisierung der RAGE-Liganden Interaktion stellte sich heraus, dass AGEs, die Pentosidin und CML enthalten, ebenso wie S100B an RAGE binden und dass die V-Domaine von RAGE ausreichend für die Bindung der Liganden ist. Kreuzkompetitionen zeigten, dass AGEs und S100B innerhalb der gleichen Bindungsstelle von RAGE binden und dass AGEs, die Pentosidin enthalten, wesentlich affiner an RAGE binden als reine CML AGEs, wobei S100B von den untersuchten Liganden am affinsten an RAGE gebunden hat. Eine Untersuchung des Einflusses der Substanzen auf die RAGE-Liganden Interaktion ergab, dass die aktiven Metabolite von AVE7688 und Ramipril in physiologisch relevanten Konzentrationen keinen Effekt auf die Interaktion von RAGE mit AGEs oder S100B hatten. Da weder AVE7688 noch Ramipril die RAGE-Liganden Interaktion beeinflussten, wurde ein Homologiemodell der RAGE V-Domaine erstellt, um die Struktur eines RAGE Antagonisten besser vorhersagen zu können. Anhand des Modells konnte eine stark positiv geladene Fläche identifiziert werden, was vermuten lies, dass elektrostatische Wechselwirkungen an der RAGE-Liganden Interaktion beteiligt sein könnten. Diese Hypothese wurde durch die Daten unterstützt, dass Heparin aufgrund seiner negativen Ladung an die RAGE V-Domaine bindet und die Bindung von AGEs und S100B an RAGE kompetieren kann. Punktmutationen von ausgewählten positiven Resten innerhalb der RAGE V-Domaine zeigten, dass die Mutation von einer Aminosäure kaum einen Effekt hatte, während die Mutation von drei oder fünf positiv geladenen Resten, die Bindung der Liganden an RAGE reduzierte. Auch zellulär konnte Heparin die RAGE vermittelte Sekretion von TNFα in Makrophagen verhindern. Die erhöhte AGE Clearance und die Inhibition der AGE Bildung, vermutlich durch die chelatierenden Eigenschaften von AVE7688, könnten zur Reduktion der renalen AGE Akkumulation und einer Verbesserung der Nephropathie bei Typ II Diabetes beitragen. Die Daten lassen auch vermuten, dass die Aktivierung der RAGE Signaltransduktion bei Diabetes durch AVE7688 verhindert werden kann, wobei AVE7688 keinen Effekt auf die Bindung der pathogenen RAGE-Liganden AGEs und S100B an RAGE hatte. Die Inhibition der RAGE Signaltransduktion könnte auf eine Reduktion der Liganden zurückgeführt werden, wobei der Effekt eine differenzielle Regulation der Expression von sRAGE nicht ausgeschlossen werden kann. Dieser neu identifizierte Wirkungsmechanismus der Vasopeptidasehemmung trägt mutmaßlich zur hohen Wirksamkeit dieser Substanzklasse bei diabetischer Nephropathie bei.
Ein gen-interner Transkriptionsstart koinzidiert mit einem Rekombinations-Hotspot imhumanen MLL-Gen
(2006)
Chromosomale Veränderungen des humanen MLL-Gens sind für 5-10% der akuten Leu-kämien im Säuglings- und Erwachsenenalter verantwortlich. Davon entstehen wiederum 5-10% der MLL-Aberrationen therapiebedingt. Das auf Bande 11q23 betroffene Gen wird als das Mixed Lineage Leukemia (MLL), Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL-1), Human Homo-log of trithorax (HRX) oder als Human Trithorax 1 (Htrx1) bezeichnet. Mittlerweile sind fast 90 cytogenetische Aberrationen der Bande 11q23 bekannt. Die häufigsten Partnergene des MLL sind AF4 (40%), AF9 (27%), sowie ENL (7%), AF6 (6%), ELL (~5%) und AF10 (4%). Die Bruchpunkte von MLL-Translokationen sind nicht einheitlich über das 92 kb große humane MLL-Gen verteilt, sondern liegen alle in einer ca. 8.3 kb großen Bruchpunkts-clusterregion (bcr). Innerhalb dieser Region sind die Bruchpunkte nicht homogen verteilt. Bruchpunkte von Patienten mit de novo-Leukämien und einem Alter von über einem Jahr sind überwiegend in der 5’-Hälfte der bcr, dem sog. Subcluster I (SCI), lokalisiert. Die Bruchpunkte von Patienten mit therapiebedingten Leukämien sowie Säuglingen (<1 Jahr) liegen dagegen vornehmlich in der 3’-Hälfte der bcr, dem sog. Subcluster II (SCII). Da DNA-Doppelstrangbrüche (DNA-DSB) auf zwei unterschiedlichen Chromosomen eine aus-reichende Voraussetzung für das Entstehen chromosomaler Translokationen sind, stellte sich die Frage, ob aufgrund der inhomogenen Verteilung der Translokationsbruchpunkte innerhalb der MLL bcr, bestimmte Bereiche dieser Region für DNA-DSB besonders anfällig sind. Bisher konnte aufgeklärt werden, dass in SCII, durch Apoptose-auslösende Ereignisse oder cytotoxische Agenzien DNA-DSB sehr leicht induziert werden können. Durch Arbeiten in unserer Gruppe konnte im SCII ein ca. 200 bp großer Bereich um die MLL Intron 11/Exon 12-Grenze lokalisiert werden, in dem sich der größte Teil aller Etoposid-induzierten DNA-Doppelstrangbrüche konzentrierte. Dies galt jedoch nicht für eine perfekte TopoisomeraseII Konsensussequenz im Exon 12, die bisher mit einer Vielzahl Therapie-assoziierter Translokationsbruchpunkte in Verbindung gebracht wurde. Dieser Hotspot kolokalisiert außerdem mit einer scaffold/matrix attachment region (S/MAR), sowie einer DNaseI-hypersensitiven Stelle. Des Weiteren fanden sich in der Literatur Hinweise, dass SCII im Gegensatz zu SCI eine verstärkte Histonacetylierung besitzt. Die potentielle Anwesenheit eines Promotors wurde durch Computeranalysen bestätigt. In einer murinen embryonalen Fibroblasten-Zelllinie, die durch die Insertion einer LacZ/Neo-Kassette in Exon 4 des Mll-Gens einen Transkriptionsstop trug, wurden in anschließenden RT-PCR Experimenten sowohl alle Möglichkeiten des alternativen Spleißens ausge-schlossen, als auch der Start eines Transkripts unmittelbar vor Exon 12 detektiert. Zusätzlich durchgeführte Affymetrix-Chip-Experimente bestätigten die Anwesenheit von Mll-Transkript-signalen in der verwendeten Mll k.o.-Zelllinie. In nachfolgenden Versuchen konnte durch eine weitere Kartierung der Transkriptionsstart auf bis zu +/- 15 bp an der Intron 11/Exon12-Grenze festgelegt werden. Um nun die im Mausmodell gewonnenen Resultate auch im humanen System zu überprüfen, wurden die homologen Regionen des murinen und humanen Mll/MLL-Gens vor ein Luci-ferasereportergen kloniert. Durch RT-PCR konnte der gen-interne Transkriptionsstart im SCII des humanen MLL-Gens ebenfalls lokalisiert werden. Damit wurde gezeigt, dass genetische Instabilität und Transkriptionsinitiation im SCII des humanen MLL-Gens kolokalisieren. Durch die anfangs durchgeführten in silico-Analysen in Maus und Mensch, wurden Deletions-mutanten generiert, mit deren Hilfe die Bedeutung der einzelnen Module dieser Promotor-region ermittelt wurde. Hierbei zeigte sich, dass die Anwesenheit von zwei Retroelementen in der menschlichen Sequenz eine Enhancer-Funktion vermittelt. Dagegen zeigte die homologe murine Sequenz, für die keine erhöhte Anfälligkeit für DNA-DSB bekannt ist, nur schwache Promotoraktivität. Da Histon Modifikationen beim Prozess der Transkription eine entscheidende Rolle spielen, wurde auch die nähere Umgebung des gen-internen Promotors in den murinen k.o.-Zellen untersucht. In der k.o.-Linie zeigte die Region stromaufwärts der putativen Transkriptionsinitiation die Signatur von inaktivem Chromatin (di-methyliertes H3 K9), wohingegen stromabwärts von Mll Exon 12 Chromatinstrukturen nachgewiesen wurden, die aktiv transkribiert werden (tri-methyliertes H3K4), und damit einen weiteren Beweis für die besondere Chromatinstruktur dieser Region lieferten. Durch Western-Blot Experimente wurde das Protein, das durch das Transkript des gen-internen Promotors kodiert wird, nachgewiesen. Das verkürzte murine Mll-Protein wird also, wie sein humanes Pendant, proteolytisch durch die Taspase1 gespalten, so dass sich ein MLL-Mini-Komplex ausbilden kann.
In der vorliegenden Dissertation werden mit einem chiralen SU(3)-Modell die thermodynamischen Eigenschaften von stark wechselwirkender hadronischer Materie und die mikroskopischen Medium-Eigenschaften von Hadronen bei hohen Temperaturen und hohen Baryonen-Dichten untersucht. Das verwendete chirale Modell ist ein erweitertes sigma-omega-Modell in Mittlerer-Feld-Näherung (Mean-Field) mit baryonischen und mesonischen effektiven Freiheitsgraden; es basiert auf spontan gebrochener chiraler Symmetrie und Skaleninvarianz. Das Phasenübergangsverhalten des chiralen Modells wird systematisch untersucht und dabei gezeigt, dass es signifikant von den Kopplungen zusätzlicher schwererer hadronischer Freiheitsgrade ('Resonanzen') abhängt. Durch entsprechende Ankopplung des niedrigsten baryonischen Dekupletts kann ein Phasendiagramm in qualitativer Übereinstimmung mit aktuellen Vorhersagen der Gitter-QCD erreicht werden. Alternativ wird die Ankopplung einer schweren baryonischen Test-Resonanz untersucht, welche effektiv für das Spektrum der schweren hadronischen Zustände steht. Hier ergibt sich für einen bestimmten Bereich der Kopplungen sogar eine quantitative Übereinstimmung zu den Gitter-QCD-Vorhersagen bei gleichzeitig guter Beschreibung der Grundzustandseigenschaften von Kernmaterie. Für diese Zustandsgleichung werden Vorhersagen (innerhalb der Modellannahmen) zu geplanten Experimenten gemacht -- konkret wird gezeigt, dass der Phasenübergangsbereich für das CBM Experiment des geplanten Beschleunigerzentrums FAIR an der GSI Darmstadt experimentell zugänglich ist. Weiter wird das chirale Modell auf die Beschreibung von experimentellen Teilchenzahlverhältnissen (Yield-Ratios) aus Schwerionen-Kollisionen von AGS, SPS und RHIC angewendet. Studiert werden Parametersätze mit stark unterschiedlichen Phasendiagrammen aufgrund unterschiedlicher Ankopplung des baryonischen Dekupletts sowie ein ideales Hadronengas. Bei den niedrigen und mittleren Kollisionsenergien zeigt sich eine verbesserte Beschreibung durch die chiralen Parametersätze im Vergleich zum idealen Hadronengas, besonders deutlich für Parametersätze mit Phasendiagramm ähnlich der Vorhersage aus der Gitter-QCD. Die Wechselwirkung im chiralen Modell führt zu Medium-Modifikationen der chemischen Potentiale und der Hadronenmassen. Die resultierenden Ausfrierparameter mu und T sind deshalb gegenüber dem nichtwechselwirkenden Fall signifikant verändert. An den Ausfrierpunkten zeigen sich deutliche Abweichungen der effektiven Massen von den Vakuummassen (5 bis 15 %) und des effektiven baryo-chemischen Potentials vom ursprünglichen Wert (bis zu 20 %). Ferner werden universelle Kriterien für das Ausfrieren diskutiert und isentrope Expansion zu den Ausfrierpunkten untersucht, wo sich eine starke Abhängigkeit der Trajektorien von der Zustandsgleichung ergibt. Schließlich wird der Einfluss des Dilaton-Felds (Gluonkondensat) auf das Phasenübergangsverhalten bei mu=0 studiert, indem das Gluonkondensat an die Dekuplett-Baryonen gekoppelt wird. Es zeigt sich, dass dadurch eine Restauration der Skaleninvarianz im Modell möglich wird, die gleichzeitig auch eine vollständige Restauration der chiralen Symmetrie bewirkt. Die Restauration der Skaleninvarianz erfolgt erst bei Temperaturen, die oberhalb der chiralen Restauration (im nichtseltsamen Sektor) liegen. Diese Modellerweiterung ermöglicht es, zukünftig das Phasenübergangsverhalten -- Restauration von chiraler Symmetrie und Skaleninvarianz -- auch bei nichtverschwindenden Baryonendichten zu untersuchen. Die Resultate dieser Arbeit zeigen die Wichtigkeit der schweren hadronischen Zustände, der Resonanzen, für das QCD-Phasendiagramm. Für die Zukunft ist eine Ankopplung des gesamten hadronischen Massenspektrums an das Modell erstrebenswert, wie sich sowohl aus der Untersuchung der Modellerweiterung um eine Test-Resonanz als auch aus der Anwendung auf experimentelle Teilchenzahlverhältnisse ergibt.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine medikamentöse Therapie mit Atorvastatin bei Patienten mit stabiler KHK zur Steigerung kultivierter EPCs mit verbesserter funktioneller Aktivität führt. Die Daten zeigen des weiteren, dass die Statintherapie nicht die Zahl hämatopoetischer Progenitorzellen erhöht, sondern die Differenzierung in zirkulierende EPCs fördert. Ein Faktor, wie z.B. VEGF, GM-CSF oder TNF-alpha, der die erhobenen Ergebnisse reflektiert bzw. vermittelt, konnte nicht gefunden werden. Allerdings konnte gezeigt werden, dass Atorvastatin über den PI3K-Signaltransduktionsweg, unabhängig von NO, die Differenzierung von EPCs stimuliert. In einer zweiten Studie konnte gezeigt werden, dass auch der ACE-Inhibitor Ramipril vor allem eine Verbesserung der funktionellen Aktivität der EPCs induzierte und ebenfalls zu einer Steigerung der Zahl der kultivierten EPCs führte. Aufgrund der starken Schwankungen der FACS-Messungen bei kleinen Patientenkollektiven besteht eine Diskrepanz zwischen den kultivierten und zirkulierenden EPCs. Auch konnte gezeigt werden, dass die EPC-Zahl und -Funktionalität vor Therapie durch den HGF-Serumspiegel reflektiert wurde und positiv mit ihm korrelierte. Diese Korrelation blieb jedoch unter Ramipriltherapie nicht bestehen, so dass davon auszugehen ist, dass der Einfluss von Ramipril nicht durch HGF, sondern über einen noch zu untersuchenden Mechanismus vermittelt wird. So können Statine und potentiell einige Subgruppen der ACE-Inhibitoren neue Therapieoptionen der KHK eröffnen.
Die Nutzung von Computern hat in unserer Gesellschaft während der letzten Jahre stark zugenommen und eine Umkehrung dieses Trends ist derzeit nicht denkbar. Auch in zunehmend mehr Feldern der Medizin wird Computertechnik genutzt, wobei nicht nur die im medizinischen Sektor Beschäftigten, sondern auch die Patienten immer häufiger mit dem Computer als diagnostischem Hilfsmittel konfrontiert werden. Es erscheint naheliegend, daß psychiatrisch kranke Menschen besonders sensibel hierauf reagieren könnten. Menschen richten ihr Handeln an individuellen Leitschienen aus, sie handeln auf der Grundlage von Einstellungen (englisch: attitude). Akzeptanz beschreibt hingegen einen kurzfristigen Prozeß, die Bereitschaft, etwas Neues anzunehmen. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, welche Rolle die Einstellung zu Computern (‚computer attitude‘) und die Akzeptanz von Computeruntersuchungen bei deren Anwendung an psychiatrischer Patienten spielen. Sie untersucht, ob und wie sich Einstellung und Akzeptanz messen lassen und wodurch sie beeinflusst werden. 160 stationär behandelte psychiatrische Patienten der Klinik für Psychiatrie und Psychotherapie I der J.W. Goethe-Universität beantworteten einen Fragebogen zur Messung der Einstellung gegenüber Computern (GCAS). Ein Teil (N=78) dieser 160 Patienten absolvierte zusätzlich eine umfangreiche Test- und Fragebogenbatterie am Computer und mit herkömmlichen ‚Papierund-Bleistift‘-Verfahren, in deren Verlauf die Akzeptanz der Untersuchung erfaßt wurde. Die Untersuchungszeitpunkte lagen jeweils in enger zeitlicher Nähe zur Aufnahme und zur Entlassung aus der stationären Behandlung. Wiederum ein Teil (N=22) dieser 78 Patienten hatte zwischen Erst- und Zweituntersuchung Gelegenheit, den Computer in einer spielerisch gestalteten Weise als Freizeitinstrument zu nutzen. Die Auswertungen berücksichtigten die Zugehörigkeit zu drei diagnostischen Subgruppen (‚psychotische Störung‘, ‚affektive Störung‘ und ‚andere Störungen‘). Zunächst wurden die Testgütekriterien der selbst entwickelten Instrumente geprüft. Es zeigte sich eine generell positive Einstellung der untersuchten Patienten gegenüber dem Computer (GCAS-Score > 48 bei 76,9% der Patienten). Bezüglich der diagnostischen Subgruppen zeigten sich keine signifikanten Unterschiede. Männliche (Z=2,4; p=0,02), jüngere (R=-0,22; p=0,002) und besser gebildete Patienten (R=0,34; p=0,00001) hatten jedoch eine bessere Einstellung gegenüber Computern. Es fanden sich Unterschiede in der Akzeptanz der Computeruntersuchung in Abhängigkeit von diagnostischer Subgruppe und Einstellung zu Computern. Die spielerische Kurzintervention erwies sich als nicht geeignet die Einstellung gegenüber Computern signifikant zu verändern. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, welchen Einfluß Einstellungen und Akzeptanz auf die Interaktion von Patient und Computer haben. Die Kenntnis dieses Einflusses ist für die Bewertung der am Computer erzielten Testergebnisse eine wesentliche Information.
Adenosintriphosphat (ATP) als universelles Energieäquivalent der Zelle wird durch die oxidative Phosphorylierung synthetisiert, bei der Elektronen entlang des elektrochemischen Gefälles der Atmungskette über verschiedene Redoxkomplexe transferiert und durch die chemiosmotische Kopplung Protonen über die Membran gepumpt werden. Der Protonengradient wird dann von der ATP-Synthase genutzt, um ADP zu ATP zu phosphorylieren. Zentraler Redoxkomplex der Atmungskette vieler Pro- und Eukaryonten ist der bc1-Komplex, der Elektronen von Ubichinol auf Cytochrom c überträgt, von wo sie nachfolgend auf die Cytochrom c-Oxidase transferiert werden. Das mesophile Bodenbakterium Paracoccus denitrificans wird als Modellsystem für den mitochondrialen Elektronentransfer (ET) verwendet, da es eine aerobe Atmungskette exprimiert, die der mitochondrialen homolog ist, allerdings einen wesentlich einfacheren Aufbau der einzelnen Redoxkomplexe aufweist. Auch Thermus thermophilus als extrem thermophiles Bakterium bildet eine vergleichbare aerobe Atmungskette aus, wobei deren Proteine allerdings eine hohe Thermostabilität aufweisen, wodurch sie in das Interesse der Forschung gerückt sind. Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung des ET zwischen Komplex III und IV der Atmungsketten von P. denitrificans und T. thermophilus, die aufgrund ihrer mesophilen und thermophilen Eigenschaften unterschiedliche Mechanismen in der Wechselwirkung ihrer Redoxproteine aufweisen. Es wurden lösliche Redoxfragmente verwendet, um anhand von Mutagenesestudien, Stopped-Flow (SF)- und Laserflash-Kinetiken (LF) unter pre-steady state-Bedingungen sowie FRET-Experimenten den ET zu untersuchen. Für die LF-Experimente wurde eine photoaktive Rutheniumverbindung kovalent an Cyt c552 gekoppelt, durch die bei Laseranregung das Häm photooxidiert und dadurch der ET von einem reduzierten Redoxpartner induziert werden kann. Die Strukturdaten des bc1/Cyt c-Cokomplexes aus Hefe zeigen, dass direkte Kontakte zwischen Cyt c1 und Cyt c durch unpolare Wechselwirkungen und eine zentrale Kation-p-Interaktion vermittelt werden. Daher wurden anhand von Sequenz- und Struktur-alignments äquivalente Aminosäurepositionen im Paracoccus Cyt c1 identifiziert, die an der Wechselwirkung zu Cyt c552 beteiligt sein könnten. Diese wurden durch gerichtete Mutagenese in ihrem Raumvolumen, ihrer Polarität oder Ladung variiert und in kinetischen Studien untersucht. Für die LF-Kinetiken sowie für die FRET-Experimente wurden Oberflächen-Cysteinmutanten des Cyt c1 bzw. c552 generiert, über deren SH-Gruppen kovalent der Rutheniumkomplex bzw. Fluorophore gekoppelt werden konnten. Die ET-Reaktion zeigt zwei Phasen in Abhängigkeit von der Ionenstärke. Bei niedrigen Ionenstärken ergeben sich Geschwindigkeitskonstanten von 109 M -1s-1 und eine geringe Ionenstärkeabhängigkeit (etwa eine effektive Ladung), wohingegen bei Ionenstärken ab 35 mM 2-3 effektive Ladungen pro Redoxpartner beteiligt sind und bimolekulare Geschwindigkeitskonstanten von 107 bis 109 M-1s-1 erhalten werden. Diese Ergebnisse deuten auf die Bildung eines Encounter-Komplexes bei niedrigen Ionenstärken hin, der ein Ensemble verschiedener Distanzen und relativer Orientierungen der Redoxpartner zueinander darstellt. Diese Annahme wurde ebenfalls durch FRET-Experimente bestätigt, durch die selbst bei niedrigen Ionenstärken keine definierten Abstände erhalten werden konnten. Die Geschwindigkeitskonstanten der bimolekularen Reaktion weisen auf einen diffusionskontrollierten Prozess hin, an dem 2 bis 3 effektive Ladungen an der elektrostatischen Annäherung der beiden Redoxpartner beteiligt sind. Diese Ergebnisse werden durch vorherige kinetische Untersuchungen und EPR-Studien des ET von Cyt c552 zum CuA-Fragment der aa3-Oxidase bekräftigt, für den die gleiche Anzahl effektiver Ladungen und die Bildung eines Encounter-Komplex gefunden wurden. Lediglich c1-Mutanten, deren variierte Aminosäuren sich direkt oberhalb der Hämspalte und in der Sequenz um bzw. innerhalb des Hämbindemotivs befinden, bewirken eine Verlangsamung der Gesamtreaktion und ein leicht verändertes Ionenstärkeverhalten, das auf eine leicht verschobene Interaktionsfläche hindeutet. Es wurde durch Sequenz- und Strukturalignments kein aromatischer Rest in direkter Nähe der entsprechenden Position im Paracoccus Cyt c1 gefunden, der wie im Hefekomplex eine stabilisierende Kation-p-Interaktion zwischen den Redoxpartnern vermittelt. Zur Untersuchung des ET zwischen Komplex III und Komplex IV aus T. thermophilus wurde die hydrophile Cytochrom c-Domäne der caa3-Oxidase in Analogie zum Paracoccus-System als lösliches Redoxfragment kloniert, heterolog exprimiert und charakterisiert. Dieses Fragment wurde in SF-Studien eingesetzt, um den ET zu seinen potentiellen Redoxpartnern Cyt cbc des bc-Komplexes und Cyt c552 zu charakterisieren. Es konnte gezeigt werden, dass das ccaa3-Fragment Elektronen von beiden Redoxpartnern empfängt, wobei die ET-Reaktion mit Cyt c552 so schnell verläuft, dass sie durch SF-Techniken nur schlecht aufgelöst und lediglich eine Größenordnung der Geschwindigkeitskonstanten abgeschätzt werden kann (kon ~ 1010 M-1s-1). Die Reaktion mit Cyt cbc verläuft auch noch schnell (kon = 108-109 M-1s-1) und ist nahezu unabhängig von der Ionenstärke, was eine hydrophobe Wechselwirkung zwischen beiden Redoxpartnern bestätigt. Die Ergebnisse deuten erstmals darauf hin, dass ein ET direkt zwischen zwei Redoxproteinkomplexen (bc-Komplex und caa3-Oxidase) stattfindet, ohne dass ein Elektronenüberträger (wie z. B. Cyt c552) zwischengeschaltet ist. Um die Übertragbarkeit der Erkenntnisse, die hier über den ET an löslichen Redoxfragmenten gewonnen wurden, in einem Proteinkomplex zu verifizieren, wurde ein bc1-Komplex verwendet, in dem die für P. denitrificans einzigartige saure Cyt c1-Domäne deletiert ist. Der Komplex wurde für eine erleichterte Aufreinigung mit einem His-tag versehen, homolog exprimiert und erste Aufreinigungs- und Charakterisierungsschritte unternommen. Er soll zukünftig eingesetzt werden, um die Mutationen des löslichen c1-Fragmentes in den Komplex zu überführen und die Mutanten kinetisch mittels pre-steady state- und steady state-Techniken im Vergleich zum bc1WT-Komplex zu untersuchen, ohne dass die Effekte der Punktmutationen durch die hohe negative Ladungsdichte der sauren Domäne überlagert werden.
Ziel dieser Arbeit war es, die Effizienz der Ambulanten Endokrinologie an der Universität Frankfurt mit Hilfe statistischer Methoden zu untersuchen. Die Basis hierfür bildeten die Karteikarten von 449 Kassenpatienten, die im Jahr 2000 die Ambulanz aufsuchten!. Dank dieser großen Zahl von Fällen konnten die meisten Aussagen, die im Rahmen dieser Arbeit gemacht wurden, statistisch signifikant belegt werden. Dies geschah mit Hilfe sogenannter statistischer Tests, mit denen es möglich ist, eine Hypothese gegen eine Alternativaussage auf ihre Gültigkeit zu testen. Zentrale Kernaussagen der Arbeit sind die folgenden: o Der Aufwand, der beispielsweise bei den Laboruntersuchungen investiert wird, ist in der Ambulanten Endokrinologie zwar hoch; er ist aber immer noch geringer als der Aufwand, der von niedergelassenen Ärzten getrieben wird, bis die richtige Diagnose feststeht. Der Grund hierfür liegt vor allem in der Anzahl der Ärzte, die vor der Ambulanz aufgesucht werden. o Der Aufwand bei anderen Untersuchungen, wie zum Beispiel Röntgenaufnahmen, Sonographie- oder Szintigraphieuntersuchungen ist in der endokrinologischen Ambulanz deutlich geringer als außerhalb. o Mitglieder der Ersatzkassen sind als Patienten in der Ambulanten Endokrinologie eindeutig überrepräsentiert, Mitglieder der AOK eindeutig unterrepräsentiert. Trotzdem bilden die AOK-Mitglieder die größte Gruppe unter den Kassenpatienten in der Ambulanz. o Die durchschnittliche Dauer bis zur Diagnose beträgt in der Ambulanten Endokrinologie 5 Tage. Ein Arztbrief wird im Mittel jedoch erst 76 Tage nach der Erstaufnahme verfaßt. Diese relativ lange Zeit ist aber immer noch kürzer als die Zeitspanne vom ersten Aufsuchen eines Arztes bis zur richtigen, als Arztbrief festgehaltenen Diagnose. Diese beträgt nämlich 110 Tage. o Obwohl man vermuten könnte, daß die Diagnosezuverlässigkeit von Hausärzten, Fachärzten und der Uniklinik unterschiedlich ist, konnte ein solcher Unterschied nicht in statistisch signifikanter Weise nachgewiesen werden. Der Anteil der Fälle, bei denen die Diagnose geändert werden mußte, betrug bei Hausärzten etwa 15%, bei Fachärzten 18% und bei anderen Abteilungen der Frankfurter Universitätsklinik 9%. Die letzte Zahl ist zwar deutlich kleiner als die anderen beiden; da aber nur 56 Karteikarten von Patienten vorlagen, die aus der Uniklinik heraus überwiesen wurden, ist hier keine sichere Aussage möglich. o Bei der Weiterversorgung der Patienten nach dem Aufsuchen der Ambulanten Endokrinologie ist in mindestens 85% der Fälle der Hausarzt involviert. In 43% aller Fälle übernimmt der Hausarzt die Weiterversorgung sogar alleine; die Ambulanz wird nicht mehr hinzugezogen. Selbst bei den verbleibenden 15% der Patienten ist davon auszugehen, daß sie sich mittelfristig wieder in die Behandlung des überweisenden Arztes begeben - auch wenn sie sich beispielsweise einer Operation unterziehen müssen. Nur 4 % der Patienten befinden sich seit mehr als 5 Jahren in der Obhut der Ambulanz. Die Befürchtung einiger Hausärzte, sie könnten die Patienten im Falle einer Überweisung an die Ambulante Endokrinologie verlieren, konnte mit all diesen Fakten eindeutig widerlegt werden. Zusammenfassend kann man sagen, daß die Effizienz der Ambulanten Endokrinologie bereits sehr hoch ist: o Eine eindeutige Diagnose ist gegeben. o Die Patienten der Ambulanten Endokrinologie erhalten eine lege artis Behandlung, insbesondere eine individuelle medikamentöse Einstellung. o Für die Krankenkassen bedeutet dies langfristig gesehen eine kostengünstige Versorgung. Neben den statistischen Ergebnissen gestattete es die Arbeit auch, Empfehlungen für eine weitere Effizienzsteigerung der Ambulanz zu machen. In diesem Zusammenhang sind die folgenden Vorschläge zu nennen: oDer Arztbrief sollte früher erstellt werden; unter anderem, um die Kommunikation mit dem Hausarzt, auf dessen Überweisung der Patient angewiesen ist, zu verbessern. o Bei den Karteikarten sollten einige zusätzliche Felder definiert werden, die in standardisierter Weise vom behandelnden Arzt auszufüllen sind. Dies gestattet es, in Zukunft ähnliche Statistiken wie die in dieser Arbeit präsentierten leichter und noch präziser auszuarbeiten. o Generell sollte die Flächendeckung der Endokrinologischen Ambulanzen verbessert werden. Auch die Öffnungszeiten könnten den Bedürfnissen berufstätiger Patienten folgend ausgeweitet werden. All dies ist zwar mit einem hohen finanziellen und personellen Aufwand verbunden; volkswirtschaftlich gesehen dürfte aber durch die präzisere Diagnostik und die bessere medikamentöse Einstellung ein gewisser Kompensationseffekt eintreten. Durch die höhere Patientenanzahl wäre eine bessere Kostendeckung gegeben. Beispielsweise wäre die Auslastung der apparativen Einrichtungen bei einer Ganztagssprechstunde deutlich höher.
Ziel der Untersuchungen ist die Klärung der Frage, ob die Inhalation von LPS eine lokale und systemische Inflammation induziert und wenn dies der Fall ist, wie diese Inflammation nachgewiesen werden kann. Insbesondere soll dabei – im Hinblick auf die Ausführungen in der Einleitung – die Frage beantwortet werden, ob eine LPS-Inhalation zu einer signifikant erhöhten NO-Konzentration in der Ausatemluft führt und deren Messung im klinischen Bereich als einfache, aber sichere Methode zum Nachweis einer Inflammation verwendet werden kann. Zur Klärung dieser Fragestellungen wurden insgesamt 30 gesunde junge Erwachsene in die Studie eingeschlossen (10 Männer, 20 Frauen, mittleres Alter 27,7 ± 4,20 Jahren) und wurden mittels LPS provoziert, um einen lokalen Entzündungsreiz zu setzen. Die Dosen des inhalierten LPS wurden alle 30 Minuten gesteigert (2,5 Mikrogramm, 10,5 Mikrogramm, 42 Mikrogramm and 45 Mikrogramm LPS) bis zu einer kumulativen Höchstdosis von 100 Mikrogramm. Im Verlauf der Untersuchung während und nach der LPS-Provokation reagierten 1/3 (10 von 30) aller Probanden mit subjektiven Beschwerden. Drei Probanden klagten über Husten und Brustschmerzen, drei über bronchiale Obstruktion und die restlichen vier über ein Schwächegefühl und Schüttelfrost. Es fanden sich zudem signifikant (p<0,05) erhöhte Temperaturwerte (Median 8h = 36,78 °C vs. Median 0h = 36,17 °C). Als weiteres Zeichen der Entzündung zeigten sich im Labor signifikant erhöhte Leukozyten (Median 24h = 6,22/nl (Range 3,97 – 10,60) vs. Median 0h = 4,93/nl (Range 2,91 – 7,72)), neutrophile Granulozyten (Median 24h = 3,75/nl (Range 1,9 – 7,3) vs. Median 0h = 2,6/nl (Range 1,2 – 5,1)) und CRP Werte (Median 24h = 0,8 mg/dl (Range 0,1 – 3,2) vs. Median 0h = 0,1mg/dl (Range 0,1 – 0,5)). Signifikant ist der Anstieg der LBP Konzentration (Median 24h = 13,05 Mikrogramm/ml (Range 4,6 – 30,4) vs. Median 0h = 5,95 Mikrogramm/ml (Range 2,6 – 12,6)). Obwohl es einen Anstieg der Konzentration der eosinophile Granulozyten gab (Median 24 h = 0,15/nl (Range 0,04 – 0,77) vs. Median 0 h = 0,13/nl (Range 0,05 – 0,43), konnte die Signifikanz in diesem Fall nicht nachgewiesen werden. Die NO-Messungen ergaben als Basis einen NO (Median 24 h = 12,2 ppb (Range 5,7 – 29,5) vs. Median 0 h = 11,00 ppb (Range 5,8 - 26,4 ppb). Somit konnte nach Inhalation mit LPS kein signifikanter Anstieg der Konzentration des exhalierten NO festgestellt werden. Zwar bestätigte sich die Annahme, dass aus einem lokalen Entzündungsreiz eine systemische Inflammation resultiert, die durch die verschiedenen Entzündungsparameter eindeutig nachgewiesen werden konnte. Auch der Nachweis des kausalen Zusammenhangs zwischen dieser systemischen Inflammation und der LPS-Provokation konnte geführt werden. Im Gegensatz dazu konnte im Rahmen dieser Studie nicht gezeigt werden, dass die Inflammation auf einfache Weise zu einer Erhöhung der NO-Konzentration führt.
Einleitung: Sport und Bewegung sind ein wesentlicher Bestandteil der Adipositastherapie von Heranwachsenden. Die Auswahl therapeutischer Bewegungsangebote und die Belastungsteuerung erfolgen jedoch bislang nicht evidenzbasiert. Zur Einschätzung der individuellen Beanspruchung, Sicherung der Prozessqualität und Identifikation günstiger Bewegungsangebote in der juvenilen Adipositastherapie ist eine objektive Erfassung von Kenngrößen der kardiovaskulären Beanspruchung erforderlich. Methode: In einem Eingangstest wurde bei 20 adipösen Heranwachsenden ohne Komorbidität (12,9±1,8 Jahre, BMI 30,6±3,9 kg/m2, VO2max 29,8±4,5 ml/(kg*min)) der individuelle Zusammenhang zwischen Herzfrequenz (HF) und Sauerstoffaufnahme (VO2) unter standardisierten Ruhe- und Belastungsbedingungen ermittelt. Im Anschluss wurde der HF-Verlauf bei 7 verschiedenen bewegungstherapeutischen Angeboten der 4wöchigen Komplextherapie erfasst. Energieumsatz (EE), Beanspruchung (Irel) sowie der Zeitanteil moderater und intensiver Belastung (MVPA) wurden auf Basis der individuellen HF-VO2 Regression berechnet. Ergebnisse: 7,5 Stunden Bewegungstherapie pro Woche induzierten einen Energiemehrum-satz von 1.871±533 Kcal pro Woche und resultierten in 3,5±1,1h MVPA. EE [KJ/kg/h] und Irel [%VO2R] beim Walking (14,0±2,9; 29±8; Median ± Mediandeviation) unterschieden sich signifikant von Wasserspielen (18,0±4,4; 42±14), Bahnenschwimmen (19,9±5,9; 47±17), 65-85W Fahrradergometrie (19,6±3,7; 46±8), Kräftigungszirkel (18,9±3,7; 44±9), kleinen Spielen (19,0±5,4; 45±16) und großen Spielen (20,6±7,0; 48±19) (p<0.05). Diskussion: Das Resultat zeigt, dass 75% der Kinder und Jugendlichen mit ihrer Teilnahme an der stationären Komplextherapie konservative Empfehlungen zum kontinuierlichen oder kumulierten Umfang moderater bis intensiver körperlicher Aktivität (150 min wöchentlich; Williams et al. 2002) erreichen oder übertreffen. Das untersuchte Programm kann somit für einen Großteil der Patienten als angemessen und richtungsweisend eingeschätzt werden. Allerdings sind nicht alle Teilnehmer mit ausreichender Intensität körperlich aktiv sind, was Forderungen nach bestmöglicher Motivierung aller Teilnehmer und individueller Belastungssteuerung unterstreicht. Mit Ausnahme von Walking ließen sich im Hinblick auf kardiorespiratorische Belastungscharakteristika keine signifikanten Unterschiede zwischen den untersuchten Bewegungsangeboten ermitteln. Im Sinne einer nachhaltigen Veränderung des Bewegungsverhaltens können vor diesem Hintergrund bei der Wahl geeigneter Therapieformen zukünftig die individuellen Neigungen Heranwachsender noch stärker Beachtung finden. Die Ergebnisse unterstreichen damit die hohe praktische Relevanz derartiger Untersuchungen für die zukünftige Gestaltung ambulanter und stationärer Therapieprogramme. Weitere Studien sind nötig, um die Reproduzierbarkeit und Übertragbarkeit der vorliegenden Ergebnisse zu überprüfen und Dosis-Wirkungs-Beziehungen von Bewegung zielgruppenspezifisch zu ermitteln.
Aus Fruktose-gezogenen Zellen von A. woodii, die in Gegenwart von Caffeat als Elektronenakzeptor gewachsen waren, wurde durch Behandlung mit Lysozym und anschliessendem French-Press-Aufschluß bei niedrigem Druck ein zellfreier Rohextrakt unter strikt anaeroben Bedingungen hergestellt. Dieser katalysierte eine H2-abhängige Caffeatreduktion mit Raten von 8,7 – 18,7 nmol/min x mg Protein. Die Aktivität war strikt ATP-abhängig. Nach einer Auftrennung des Rohextraktes in Cytoplasma- und Membranfraktion war die H2-abhängige Caffeatreduktion ausschliesslich in der cytoplasmatischen Fraktion lokalisiert. Die Zugabe von Membranen führte zu keiner Stimulierung der Aktivität. Die Membranfraktion selbst wies keine Caffeatreduktionsaktivität auf. Verschiedene Verbindungen wurden auf ihre Fähigkeit getestet, als artifizielle Elektronendonatoren für die Caffeatreduktion zu fungieren. TMPD, 1,5-Diphenylcarbazid und reduziertes Methylviologen konnten Caffeat nicht reduzieren. In Gegenwart von Phenylendiamin wurde in zellfreiem Rohextrakt und in der Cytoplasmafraktion Caffeatreduktionsaktivität beobachtet. In der Membranfraktion wurde dagegen keine Reduktion von Caffeat mit Phenylendiamin als Elektronendonor nachgewiesen. NADH + H+ konnte als physiologischer Elektronendonor für die Reduktion von Caffeat fungieren. Die NADH-abhängige Caffeatreduktion war ausschliesslich in der cytoplasmatischen Fraktion lokalisiert und strikt abhängig von ATP. Die Beobachtung, dass NADH + H+ als Elektronendonor für die Caffeareduktion fungieren kann, führte zu der Frage, wie im Zuge H2-abhängiger Caffeatreduktion NADH + H+ gebildet wird und welche Enzyme daran beteiligt sein könnten. NAD+-abhängige Hydrogenaseaktivität wurde an Membranen und im Cytoplasma nachgewiesen. Rund 70% der Aktivität waren in der löslichen Fraktion lokalisiert. Die Gegenwart einer Elektronendonor:NAD+-Oxidoreduktase in A. woodii wurde untersucht. Gewaschene Membranen vermittelten die Oxidation von NADH + H+ mit Kaliumhexacyanoferrat oder Benzylviologen als Elektronenakzeptor. Diese Beobachtung wurde als Hinweis auf eine NAD+-Reduktase gewertet, da solche Enzyme in der Regel reversibel sind. Eine Hydrogenase konnte hierfür ausgeschlossen werden, da die NADH-oxidierende Aktivität Sauerstoff-unempfindlich war. Die Aktivität des NADH-oxidierenden Enzyms konnte durch zugesetztes Na+ nicht stimuliert werden. In Analogie zu Na+-translozierenden NADH:Chinon-Reduktasen wurde die NADH-oxidierende Aktivität an gewaschenen Membranen aber durch Ag+ oder Cu2+ in mikromolaren Konzentrationen vollständig inhibiert. Membranen von A. woodii vermittelten die Reduktion von NAD+ mit reduzierten Ferredoxin als Elektronendonor. Ob diese Aktivität durch das gleiche membranständige Enzyme katalysiert wurde, das auch die NADH-Oxidation bewerkstelligte, konnte nicht geklärt werden. Die Ferredoxin-abhängige NAD+-Reduktion wurde durch micromolare Konzentrationen Ag+ vollständig inhibiert. Die Inihibition war aber wahrscheinlich unspezifischer Natur. Mittels vergleichender 2D-Gelelektrophorese wurden zwei Caffeat-induzierte Proteine identifiziert. Ein Vergleich der Peptidsequenzen, die durch ESI-MS/MS-Analyse der Proteine erhalten wurden, mit in Datenbanken hinterlegten Proteinsequenzen, ergab eine große Übereinstimmung zu der großen alpha- bzw. kleinen beta-Untereinheit von heterodimeren Elektronentransfer-Flavoproteinen (ETFP). Die Proteine wurden mit EtfA und EtfB bezeichnet. Anhand der Peptidsequenzen von EtfA und EtfB wurden degenerierte Oligonukleotide abgeleitet, die zur Amplifikation von Fragmenten der kodierenden Gene herangezogen wurden. Die Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der erhaltenen PCR-Produkte untermauerte die Zuordnung von EtfA und EtfB als Untereinheiten eines ETFP. Die Fähigkeit zur Caffeatreduktion ist in A. woodii nicht konstitutiv vorhanden, sondern wird in erst durch Gegenwart des Phenylacrylats induziert. Die Spezifität dieser Induktion wurde untersucht. Suspensionen ruhender Zellen, die aus Caffeat-induzierten Zellen hergestellt worden waren, reduzierten neben Caffeat auch die Phenylacrylate Ferulat oder p-Cumarsäure mit H2 als Elektronendonor. Analoge Beoabachtungen wurden mit Ferulat-induzierten und p-Cumarsäure-induzierten Zellsuspensionen gemacht. Die Ergebnisse legen den Schluß nahe, dass in A. woodii die Reduktion von Phenylacrylaten durch ein induzierbares enzymatisches System bewerkstelligt wird. EtfA und EtfB wurden als MalE-Fusionsproteine dargestellt und gereinigt. Dagegen wurden Antiseren hergestellt. Immunologische Untersuchungen zeigten, dass die Produktion von EtfA und EtfB durch Gegenwart verschiedener Phenylacrylate induziert wird. Die Induktion war unabhängig vom Wachstumssubstrat. In Gegenwart von zu Phenylacrylaten ähnlichen Verbindungen erfolgte keine Induktion. Für EtfA und EtfB wurde eine Funktion als universeller Elektronenüberträger des Phenylacrylat-Reduktionssystems in A. woodii postuliert. Für die H2-abhängige Reduktion von Caffeat und anderer Phenylacrylate wurde die folgende Reaktionssequenz postuliert: die Oxidation des Elektronendonors H2 durch eine Hydrogenase geht einher mit der Bildung von reduziertem Ferredoxin. Dieses wird durch eine membranständige Ferredoxin-NAD+-Oxidoreduktase oxidiert, die den Transfer der Elektronen auf NAD+ mit der Translokation von Na+ koppelt. Ein aus EtfA und EtfB gebildetes ETFP fungiert dann als Elektronenüberträger zwischen NADH + H+ und einer löslichen Phenylacrylatreduktase.
Entrepreneurship eröffnet aus didaktischer und organisatorischer Sicht vielversprechende Chancen zum Bewältigen der Modernitätskrise dualer Berufsausbildung, birgt jedoch auch Risiken in sich. Sowohl didaktische Konzeptionen, die von der – traditionell – funktional-objektivistischen Entrepreneurship-Definition ausgehen (z.B. der „Medienkoffer Selbstständigkeit“), als auch subjektorientierte Ansätze (z.B. die „Arbeitsorientierte Exemplarik“) zeichnen sich dadurch aus, dass sie, anders als duale Berufsausbildung, allgemeine Bildungsinhalte gegenüber fachbezogenen stärker gewichten, was sich u.a. in Fachgrenzen überschreitenden Lehr-/Lernarrangements (Projektunterricht) konkretisiert. Damit wird nicht nur den – Stichworte Lean Production und Globalisierung – veränderten Qualifikationsbedarfen am Arbeitsmarkt entsprochen. Auch bestehen Anknüpfungspunkte zu einem Teil der subjektiven Wissens- und Rationalitätsgrundlagen, die aus Sicht der Theorie der reflexiven Modernisierung in der Zweiten Moderne für unabdingbar erachtet werden (Anerkennung von Unsicherheit/nicht erwarteten Nebenfolgen, Befähigung zur kooperativen Entscheidungsfindung). Die untersuchten Ansatzmöglichkeiten weisen jedoch auch Schwachpunkte auf. Die „Arbeitsorientierte Exemplarik“ stellt zwar eine geschlossene didaktische Konzeption dar. Ihre Umsetzung beschränkt sich jedoch weitgehend auf die Erwachsenenbildung. Zudem fehlen Daten, die es ermöglichen, die Validität der „Arbeitsorientierten Exemplarik“ im Feld zu evaluieren. Umgekehrt liegt eine Vielzahl praxiserprobter und auch evaluierter „Entrepreneurship Education“-Programme, -Projekte und -Lehrgänge vor, die jedoch nicht bildungstheoretisch fundiert sind. Auch drohen „Entrepreneurship Education“ und die „Arbeitsorientierte Exemplarik“ entweder von neoliberalen wirtschaftspolititischen Interessen vereinnahmt oder unmittelbar in den Dienst der Gewinnerzielungsabsichten global operierender Konzerne gestellt zu werden. Während bildungstheoretische und empirische Lücken vergleichsweise einfach – durch Bildungsforschung – geschlossen werden können, verdichten sich im Spannungsfeld zwischen funktional-objektivistischen ökonomischen Interessen und dem anthropologisch begründbaren Ethos nach Entwicklung und Entfaltung individueller Persönlichkeitspotentiale divergierende politische Implikationen, mit denen Entrepreneurship (nicht nur) im Kontext erwerbsarbeitsbezogener Bildung konfrontiert ist. Hier bieten sich zwei Reaktionsmöglichkeiten an: Einerseits eine separierende Sichtweise, die entweder funktional-objektivistischen oder subjektivistisch-individuellen Rationalitäten Vorrang einräumt. Dies hätte zur Folge, dass Entrepreneurship entweder für unternehmerisches Denken und Handeln zu qualifizieren hätte oder, losgelöst von utilitaristischen Erwägungen, die gattungsspezifischen und individuellen Entwicklungsbedürfnisse des Menschen zu entfalten wären. Mit Blick auf die Herausforderungen der Zweiten Moderne erscheint gegenüber einer separierenden eine bündelnde Sichtweise erfolgversprechender, die versucht, Entrepreneurship als Option zur Gestaltung von Gesellschaft zu interpretieren ohne zu vernachlässigen, dass das Subjekt Resultat und Produzent seiner – durch die gegebene primär marktwirtschaftliche Wirtschaftsordnung beeinflussten – Vernetzung, Situierung, Verortung, Gestalt ist. Eine solche Quasi-Subjektbildung hätte neben den in der „Theorie reflexiver Modernisierung“ denominierten subjektiven Wissens- und Rationalitätsgrundlagen auch auf den Ausgleich wirtschafts-, gesellschafts- und sozialpolitischer Interessen zu zielen. Auch in organisatorischer Hinsicht beeinflussen ökonomische Rationalitäten die Modernisierungsmöglichkeiten erwerbsarbeitsbezogener Ausbildung. Zwar können die in das öffentliche Bildungssystem eingebundenen Schulen in nicht-staatlicher Trägerschaft als Repräsentanten des Entrepreneurship-Gedankens die kraft ihrer Rechtsform gegebenen pädagogischen Gestaltungsmöglichkeiten nutzen, um dem Berufsausbildungssystem Modernisierungsimpulse zu induzieren. In diesem Zusammenhang wären etwa Angebote zu nennen, in denen berufsbildende mit allgemeinbildenden Inhalten unter Einbezug neuartiger Theorie-Praxis-Kombinationen verschränkt werden. Auch sind einige Privatschulen an Modellversuchen zur Erprobung neuartiger Bildungsgänge beteiligt, die in Kooperation mit den Kultusministerien durchgeführt werden. Gleichwohl zeichnet sich ab, dass die Entscheidungsträger privater Schulen dazu übergehen, ihrer Auffassung nach moderne Erwerbsarbeitsqualifikation zunehmend außerhalb des Berufsausbildungssystems anzubieten, etwa in Form studienqualifizierender Bildungsgänge, im Rahmen berufsqualifizierender Bildungsangebote, die ausschließlich Abiturienten vorbehalten bleiben, oder gar indem berufsbildende durch Fachhochschulstudiengänge substituiert werden. Wenn nun aber moderne Erwerbsarbeitsqualifizierung zunehmend außerhalb des dualen Systems offeriert wird, so untermauert dies nicht nur die These, dass sich das duale System in einer Modernitätskrise befindet. Auch verstärkt dieses an leistungsstarken Schülern orientierte Angebotsverhalten die Selektionsfunktion, welche die Privatschulen ohnehin schon ausüben, indem sie regelmäßig Schulgeld erheben. Vieles spricht dafür, dass die staatliche Finanzhilfe, die sowieso nur Ersatz-, nicht jedoch Ergänzungsschulen beanspruchen können, allein nicht ausreicht, um den Finanzmittelbedarf der Einrichtungen zu decken. Sollen die (verbleibenden) von den Schulen in freier Trägerschaft ausgehenden Modernisierungsimpulse als nachhaltige Schrittmacher für zeitgemäße Erwerbsarbeitsqualifikation fungieren, so bedarf es nicht nur in finanzieller Hinsicht staatlicher Unterstützung. Auch die je nach Bundesland mehr oder weniger großzügigen schulrechtlichen Privatschulrechtsnormen einschließlich ihrer Anwendung durch die Aufsichtsbehörden bedürfen zumindest der Angleichung. Nicht umsonst konnten die von den Kaufmannsvereinigungen betriebenen Schulen Ende des 19. Jahrhunderts erst dann eine (allerdings auf berufliche Ertüchtigung) fokussierte Modernisierungsfunktion übernehmen, nachdem der Staat die hierfür erforderlichen, gesellschaftspolitisch motivierten, weil gegen die Sozialdemokratie gerichteten Rahmenbedingungen geschaffen hatte. Einen Rahmen, die herausgearbeiteten Spannungsbögen zwischen Theorie und Praxis, partikularistischem und holistischem Paradigma sowie ökonomischen und pädagogischen Interessen neuartig zu betrachten, vermag die Historische Anthropologie bereitzustellen. Historisch-anthropologische Forschung ist multiparadigmatisch und zeichnet sich durch Transdisziplinarität sowie Transnationalität aus. In transdisziplinären Forschungsprojekten können die Vertreter mehrerer Fachdisziplinen auf unterschiedliche Wissenskonstellationen, Fragestellungen, Begriffe sowie methodische Zugänge zurückgreifen und so – Stichwort „Quasi-Subjektivität“ – neuartige Lösungsvorschläge für konkrete Problemstellungen einbringen (vgl. WULF 2004, 262). Beim Überschreiten von durch Fachgrenzen begrenztem Denken „spielt das Staunen, das radikale Fragen, die philosophische Kritik und Selbstkritik eine wichtige Rolle“ (WULF 2004, 264). Staunen dürfte sich aller Voraussicht dann einstellen, wenn nicht nur ernsthaft diskutiert würde, dass private Schulen – unter Voraussetzung veränderter Rahmenbedingungen – den öffentlichen Bildungsauftrag möglicherweise besser umsetzen können als staatliche Einrichtungen, sondern auch seitens der politisch Verantwortlichen die hierfür erforderlichen Maßnahmen ergriffen würden. Transnationale (historisch-anthropologische) Forschung eröffnet zudem die Gelegenheit, Grenzen, genauer: ethnische oder kulturelle Grenzen zu überschreiten. (vgl. WULF 2004, 268). Bezogen auf Entrepreneurship böte sich insofern die Option, die anglo-amerikanische Färbung des Entrepreneurship-Diskurses ebenso zu erweitern wie den zentraleuropäischen Nexus des historischen Subjektbildungsdiskurses.
Entwicklung redoxaktiver para-Hydrochinonliganden und deren Anwendung in der Koordinationschemie
(2006)
Niedrigdimensionale Spinsysteme sind hinsichtlich ihrer magnetischen und elektronischen Eigenschaften von großem Interesse. Einen Zugang zu derartigen Systemen bieten Koordinationspolymere aus paramagnetischen CuII-Ionen (S = ½) und verbrückenden para-Hydrochinon-Liganden. CuII-Ionen eignen sich als Spinträger unter anderem deshalb, weil sie stabile quadratisch-planare Komplexe auszubilden vermögen, wodurch die Entstehung niedrigdimensionaler Strukturen begünstigt wird. Die Attraktivität para-Hydrochinon-basierter Brückenliganden beruht auf deren Redoxaktivität und der Tatsache, dass sie wegen ihrer starren π-konjugierten Struktur in der Lage sind antiferromagnetische Wechselwirkungen zwischen zwei paramagnetischen Metallzentren zu vermitteln. Darüber hinaus sind para-Hydrochinonderivate meist auch in der radikalischen Semichinonform stabil. Hieraus ergibt sich die Möglichkeit in para-Hydrochinon-verbrückte Koordinationspolymere durch elektrochemische Dotierung gezielt zusätzliche ungepaarte Spins zu injizieren. ...
Entwicklung und Evaluation einer Methode zur Messung der Thrombinbildung in plättchenreichem Plasma
(2006)
Die Herstellung von Poly(butylcyanoacrylat)-Nanopartikeln (PBCA-NP) ist seit fast 25 Jahren bekannt. Sie erfolgt meist durch anionische Emulsionspolymerisation von Butylcyanoacrylat unter Verwendung von Dextran 70.000 als Stabilisator. Vereinzelt wurde in früheren Arbeiten bereits Pluronic® F68 als Emulgator für die Polymerisationsreaktion verwendet. Diese Arbeit hat ihren Schwerpunkt in der Herstellung von PBCA-NP mit F68 als Stabilisator. Es konnte gezeigt werden, dass sich mit diesem Hilfsstoff ebenfalls nanopartikuläre Trägersysteme reproduzierbar und im gewünschten Größenbereich um 200 nm herstellen lassen. Diese Partikel besitzen im Gegensatz zu Dextran-stabilisierten NP eine sehr enge Größenverteilung. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die hergestellten NP im Bezug auf ihr Molekulargewicht und ihre Dichte charakterisiert. Ein Partikel besitzt die Masse von ca. 2,5 * 109 Dalton und hat eine Dichte von etwa 1,148 g/cm³. Bei einem PBCA-Nanopartikel handelt es sich jedoch nicht um ein Riesenmolekül, vielmehr wird er durch Agglomeration von relativ kurzen Polymerketten gebildet. Ein Partikel besteht aus ca. einer Million Polymerketten, welche ein Molekulargewicht von ca. 2500 g/mol besitzen. Der Einfluss der Herstellungsparameter auf leere und arzneistoffbeladene Partikel wurde untersucht. Die Partikel wurden hierbei durch die Parameter Partikelgröße, Polydispersität, Partikelausbeute, Zetapotential und Molekulargewicht charakterisiert. Neben der Herstellung durch anionische Emulsionspolymerisation wurden NP durch radikalische Emulsionspolymerisation und Nanopräzipitation erhalten. Auch unter Verwendung dieser Verfahren wurden Trägersysteme im gewohnten Größenbereich um 200 nm gebildet. Zusätzlich zur Herstellung von NP hat sich diese Arbeit auch mit den Charakterisierungsmethoden für kleinpartikuläre Arzneiformen auseinandergesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass die häufig angewendete dynamische Lichtstreuung ein geeignetes Verfahren zur Ermittlung des mittleren Partikeldurchmessers darstellt. Die Ergebnisse dieser Methode stimmen weitgehend mit den Resultaten der zusätzlich verwendeten mikroskopischen Verfahren und der analytischen Ultrazentrifugation überein. Der Einsatz der analytischen Ultrazentrifugation lieferte die best aufgelöste Partikelgrößenverteilung und ermöglichte darüber hinaus die Bestimmung der Dichte der Partikel. Neben der mittleren Größe der Trägersysteme wurde auch das mittlere Molekulargewicht der gebildeten Polymerketten bestimmt. Die hierfür als Standard eingesetzte Gel-Permeations-Chromatographie wurde mit einem relativ neuen Verfahren, der MALDI TOF Massenspektrometrie verglichen. Beide Verfahren lieferten ein zahlenmittleres Molekulargewicht der Polymerketten von 2500 – 3000 Da. Lediglich im Bezug auf das gewichtsmittlere Molekulargewicht zeigten sich größere Unterschiede zwischen beiden Messverfahren, welche jedoch auf das zugrunde liegende Messprinzip und nicht auf das untersuchte PBCA zurückzuführen sind. Mit Hilfe der Massenspektrometrie konnte die chemische Struktur der Polymerketten näher aufgeklärt werden. Neben den Produkten des seit langem postulierten Reaktionsmechanismus finden sich Derivate des Polymers, welche formal durch Abspaltung bzw. Anlagerung von Formaldehyd entstehen. Die Menge an frei vorliegendem Formaldehyd scheint jedoch so gering zu sein, dass sie kaum die Hauptursache für die relative Toxizität der PACA-NP darstellen kann. Darüber hinaus ist es möglich, durch Wahl der Reaktionsbedingungen die Bildung von Derivaten des Ursprungspolymers und von Formaldehyd zu minimieren. Die Ergebnisse in der Herstellung und Charakterisierung von leeren Pluronic® F68-stabilisierten PBCA-NP ließen die Verwendung von Doxorubicin-beladenen NP unter Verwendung dieses Stabilisators für die Gehirntumor-Therapie viel versprechend erscheinen. Die hergestellten Nanopartikel zeigten eine im Vergleich zu Dextran-stabilisierten Doxorubicin-NP signifikant niedrigere Arzneistoffbeladung. Die dessen ungeachtet durchgeführte experimentelle Chemotherapie an Glioblastom-tragenden Ratten lieferte jedoch ermutigende Ergebnisse. Die neu entwickelte Zubereitung führte zu einem vergleichbaren Prozentsatz an Remissionen wie die bisherige Standard-PBCA-Formulierung. Die F68-stabilisierte Formulierung und die bisherige Standard-Formulierung mit Polysorbat 80 zeigten nach Inkubation mit humanem Plasma ein vergleichbares Adsorptionsmuster an Plasmaproteinen. Auf Basis der vorangegangenen Studien und dieser Arbeit erscheint es möglich, eine potente nanopartikuläre Doxorubicin-Zubereitung zu entwickeln, welche ausreichend charakterisiert ist, um ihre Anwendung am Menschen zu vertreten.
Echoviren und Polioviren gehören zur Gruppe der Enteroviren. Während Echoviren heute noch weltweit Infektionen verursachen, konnten durch Einführung der Polioimpfung die Poliomyelitisfälle deutlich reduziert werden. Echoviren verursachen vor allem in den Sommermonaten häufig unspezifische fieberhafte Infekte. Übertragen werden sie allein durch den Menschen, meist über fäkal-orale Schmierinfektionen. Die vorliegende Arbeit ist eine retrospektive epidemiologische Untersuchung zur Antikörperprävalenz gegenüber Echoviren und Polioviren in der Bevölkerung des Rhein-Main-Gebietes. Das Patientenkollektiv umfasst eingesandte Serumproben aus der Universitätsklinik Frankfurt vom 1. Juli 2000 - 30. September 2002. Im Rahmen der Labordiagnostik wurden die Serumproben, am Institut für Medizinische Virologie, auf spezifische Antikörper gegen die Echovirustypen -6,-7,-9,-11 und -30 untersucht. Ebenso wurden Serumproben aus der laufenden Labordiagnostik von insgesamt 8563 Patienten (von 1998 bis 2002) im Institut für Virologie gesammelt und auf Antikörper gegen das Poliovirus (Typ 1,2 und 3) untersucht. Als Testmethode zum Nachweis neutralisierender Antikörper wurde der Neutralisationstest eingesetzt. Die Prävalenz für Echovirus-spezifische Antikörper zeigt für Echovirustyp-30 die höchste Durchseuchung (69,4%). Die Prävalenz für Echovirustyp-9 lag bei 48,1%. Echovirustyp-6, -7 und -1 1 identifizierten wir mit einer relativen Häufigkeit von 28% in den untersuchten Seren. Die Antikörpemrteilung zeigt eine ausgewogene Geschlechterverteilung. Überwiegend stellten sich niedrigtitrige Antikörperspiegel, als Ausdruck einer früheren abgelaufenen Infektion, dar. Eine Epidemie konnte damit ausgeschlossen werden. Vereinzelt nachgewiesene höhere Titer entsprechen einem endemischen Auftreten der Echoviren im Raum Frankfurt. Bezüglich der Altersverteilung konnte keine signifikante Altersgruppe identifiziert werden. Das Risiko eine Echovirusinfektion zu erwerben liegt sicherlich im Kleinkindesalter (Kinder im Alter von 1 bis 4 Jahren), da diese Gruppe die geringste Prävalenz für neutralisierende Antikörper aufwies. .Wir eruierten, für die verschiedenen Echovirus-Serotypen, unterschiedliche altersabhängige Prävalenzspitzen, welche mit dem zyklischen Auftreten der Viren in einer Region vereinbar sind. Besonders für Echovirustyp-30 konnte eine hohe Durchseuchung im höheren Lebensalter festgestellt werden. Zurückführen lassen sich solche Ergebnisse auf die Genom Variation von Echovirustyp-30. Die vermutete negative Serokonversion der Echovirus-Antikörper, und dass damit das verbundene Nachlassen der Immunität, ließ sich auch im Vergleich mit einer Altstudie von 1991 nicht eindeutig durch unsere Untersuchungsergebnisse belegen. Spezifische Krankheitsverläufe ließen sich für Echovirustyp-30, mit einem vermehrten Vorkommen an Meningitis und für Echovirustyp-6 mit vermehrter gastrointestinaler Manifestation nachweisen. Im Jahre 1998 erfolgte die Umstellung der Poliomyelitisimpfung in Deutschland. Nach jahrzehntelanger Verwendung der OPV (oralen Schluckimpfung nach Sabin) wurde diese zugunsten der IPV (inaktivierte Poliovakzine nach Salk) verlassen. Gerechtfertigt wurde die Umstellung dadurch, dass seit 1990 in Deutschland kein autochthoner Poliomyelitisfall mehr aufgetreten ist. Bei fehlendem endemischen und epidemischen Vorkommen des Virus wurde das Risiko für das Auftreten einer VAPP(= vaccine associated paralytic polio), unter Anwendung der OPV, als nicht mehr vertretbar angesehen. In dieser kritischen Umstellungsphase untersuchten wir den Immunitätsstatus der Bevölkerung, um das Risiko einer Einschleppung aus nicht poliofreien Gebieten, und Verbreitung der Poliomyelitis unter der deutschen Bevölkerung zu beleuchten. Die Prävalenz der untersuchten Population zeigt eine gute Immunität gegen Poliovitustyp-1 , und -2. Eine geringere Antikörperprävalenz ließ sich, wie in anderen Studien auch, für Poliovirustyp-3 (73%) identifizieren. Diese lässt sich zurückführen auf eine unterschiedliche Immunogenität der lmpfviren bei Verwendung der OPV. Im Vergleich mit anderen nationalen und internationalen Studienergebnissen bemerkten wir niedrigere Antikörperprävalenz-Werte im untersuchten Patientenkollektiv. Wir vermuten einen Zusammenhang mit dem vermehrten Vorkommen von lmmunsuppremierten Patienten in der Studie. Bei Betrachtung der altersabhängigen Verteilung der Antikörperprävalenz fiel sowohl 1998 als auch im Jahre 2002 ein Defizit an Poliovirusantikörpern, besonders für Poliovirustyp-3, in den Geburtsjahrgängen von 1983-1 987 auf. Wir führten dies auf eine vernachlässigte Auffrischimpfung im Jugendalter zurück. Insgesamt konnte aber von 1998 bis 2002 eine Zunahme der Im,munität gegenüber den Polioviren beobachtet werden. Besonders die alleinigen Empfänger der IPV zeigten eine hervorragende Immunität. Das Defizit an Poliovirustyp-3 Antikörpern konnte durch Verwendung der IPV beseitigt werden. Davon profitierten nicht nur die alleinigen IPV Empfänger, sondern auch Personen, die mit IPV, im Sinne einer Auffrischimpfung, nachgeimpft wurden. Aus Erhebungen der Populationsimmunität wird deutlich in welchen Regionen und in welchen Bevölkerungsgruppen Defizite bestehen und behoben werden müssen, damit eine endgültige und weltweite Eradifikation der Poliomyelitis zukünftig zum Erfolg führen kann.
Die rheumatoide Arthritis stellt mit einer weltweit homogen verteilten Inzidenz von 30-300/100000 Menschen sowie einer Prävalenz von 1-2% eine häufig vorkommende, chronisch progredient verlaufende Autoimmunerkrankung dar. Der hohe Leidensdruck der Erkrankten, deren Lebenserwartung trotz moderner Therapeutika noch immer unter dem der Normalbevölkerung liegt, sowie die immensen volkswirtschaftlichen Kosten durch Minderung der Erwerbsfähigkeit und Therapie, fordern grundlegende Verbesserungen in der Diagnostik der RA. Die Hand- und Fingergelenke weisen mit über 90% Beteiligung im Verlauf sowie rund 40% Beteiligung in frühen Stadien der Erkrankung die häufigsten Gelenkveränderungen im Vergleich zu anderen Körperregionen auf. Aufgrund dieser statistischen prozentualen Gelenkbeteiligung wird als bildgebendes Verfahren der Früh- bzw. Erstdiagnostik meist ein Röntgenbild der Hände angefertigt. Hierfür ist ein Scoring-System mit Stadieneinteilung seit Längerem etabliert (nach Larsen). Eine gerade im Frühstadium der RA vorkommende Weichteilveränderung kann allerdings konstruktionsbedingt radiologisch nur unzureichend beurteilt werden, des Weiteren ist eine Strahlenbelastung nicht von der Hand zu weisen. Hier kann die Ultraschalluntersuchung als ergänzendes bzw. ersetzendes Mittel ihre eindeutigen Vorteile ausspielen, da die entzündlichen Veränderungen wie Erguss und Synovitis an den Gelenken sicher erkannt werden können und keinerlei schädliche Strahlung auftritt. In Ermangelung einer objektivierbaren Einteilung dieser arthrosonographisch erfasster Daten soll es Ziel dieser Arbeit sein, eine Stadieneinteilung der Weichteil-, Knorpel- und Knochenveränderungen der Knochenbinnenräume der rheumatoiden Hand analog der radiologisch erfassten Larsen-Stadien zu erstellen. Dieses Staging soll ein weites Spektrum von leichten Gelenkergüssen bis hin zur völligen Gelenkdestruktion umfassen. Als Patientengut dienen 35 Personen, bei denen von erfahrenen Rheumatologen ohne Kenntnis des Ultraschall-Befundes aus klinischen Aspekten die Diagnose RA gesichert ist. Um eine möglichst breit gefächerte Stadieneinteilung zu ermöglichen, handelt es sich bei den Patienten um Menschen verschiedenen Geschlechtes und Alters, Krankheitsdauer sowie –aktivität (ambulante, wenig betroffene bis schwer betroffene, stationäre Patienten) differieren ebenfalls stark. Alle Patienten erfüllen mind. 4 der in der Einleitung erwähnten Diagnosekriterien der ACR (von 1987). Als Kontrollgruppe fungieren 10 nicht an RA erkrankte Probanden verschiedenen Alters und Geschlechtes. Die arthrosonographischen Untersuchungen werden mittels moderner Ultraschallgeräte der Marke Siemens (Erlangen, Deutschland) mit 7,5 bzw. 10 MHz Linearschallkopf ohne Vorlaufstrecken durchgeführt. Diese Gerätetypen und Schallköpfe werden von der DEGUM als für diese Art der Untersuchung adäquat empfohlen. Die Untersuchung umfasst an beiden Händen die Carpal- (unterteilt in radiale und ulnare Seite), Carpometacarpal I-, Metacarpophalangeal I-V-, sowie IP I- und PIP II-V-Gelenke. Die Beurteilung erfolgt in definierten longitudinalen und transversalen Schnitten von dorsal und palmar. Kriterien sind Gelenkergüsse (im Gelenkspalt bzw. Recessus, eventuell mit pericapitaler Synovialitis), Erosionen, Usuren und Kortikalisdefekte bis hin zu schweren kortikalen Destruktionen. Analog zu den radiologischen Larsen-Stadien werden die Gelenkveränderungen in ansteigender Ausgeprägtheit von 0 bis 5 eingestuft. Stadium 0 stellt den Normalbefund dar. Stadium 1 beschreibt Veränderungen am Gelenk ohne ossäre Beteiligung. Dieses lässt sich weiter unterteilen in einen reinen Gelenkerguss im Gelenkspalt (Stadium 1a) bzw. im Recessus (Stadium 1b). Treten beide Veränderungen in einem Gelenk ohne ossäre Beteiligung auf, bezeichnen wir dies als Stadium 1c, evtl. unter Mitbeteiligung einer nur im power-Doppler zu differenzierenden Synovialitis. Stadium 2 beschreibt bereits ossäre Veränderungen im Sinne kleiner (unter 2mm) Erosionen eines Gelenkpartners. Sind diese Veränderungen stärker ausgeprägt (über 2mm), handelt es sich um Usuren (Stadium 3). Kortikalisdefekte, bei denen der Gelenkspalt noch zu differenzieren ist, definieren das Stadium 4, wohingegen beim Stadium 5 dies nicht mehr der Fall ist und auch keine knöchernen Leitstrukturen mehr erkennbar sind. Insgesamt gesehen lassen sich bei 60,9% der 897 untersuchten Gelenke Veränderungen feststellen. Stadium 0 (kein pathologischer Befund) ließ sich somit bei 39,1% der untersuchten Gelenke nachweisen. Die einzelnen Stadien nehmen prozentual von der Gesamtheit der Befunde mit der Zunahme der Ausgeprägtheit der Gelenkveränderungen ab. So kommt Stadium 1 bei 26,3% der untersuchten Gelenke vor, Stadium 2 bei 19,5%, Stadium 3 bei 10,4%, Stadium 4 bei 3,5%, Stadium 5 lediglich bei 1,2% vor. Der Vergleich der arthrosonographischen Untersuchungsergebnisse mit dem etablierten DAS 28 (disease activity score) ergibt einen signifikant hohen Korrelationskoeffizienten (nach Spearman) von 0,9, der mit den Parametern der klinischen Untersuchung (geschwollene Gelenke; druckschmerzhafte Gelenke) 0,83 bzw. 0,86. Diese Ergebnisse zeigen die hohe Aussagekraft des Untersuchungsverfahrens Arthrosonographie. Dieses Verfahren ist aufgrund seiner Vorteile (Erkennung von Weichteilveränderungen sowie Knorpel- und Knochendestruktionen, kostengünstig, beliebig oft wiederholbar, unschädlich, ubiquitär verfügbar) gegenüber anderen bildgebenden Verfahren (Röntgen, CT, MRT, Szintigraphie) zur (Früh-)Diagnostik der RA hervorragend geeignet.
Resistenzen gegen Medikamente sind ein grundlegegendes Problem in der Therapie der HIV-Erkrankung. Durch Kombinationstherapien (Highly Active Antiretroviral Therapy, HAART) und den vermehrten Einsatz von Genotypisierungen wird versucht der Entwicklung von therapieassoziierten Mutationen entgegenzuwirken. Zwischen Januar 1995 und Oktober 2001 wurde in 1403 Patientenproben der Frankfurer HIV-Ambulanz die Genotypisierung der Reversen Transkriptase untersucht und auf therapierelevante Mutationen hin ausgewertet. Die Auswertung der allgemeinen Mutationsprävalenzen zeigt die höchste Prävalenz der während einer Nukleosidanaloga-Therapie vorgefundenen Mutationen im Gesamtkollektiv auf Position 184 (50%) sowie 215 (49%), 41 (42%), 67 (31%) und 210 (30%). Aufgrund der Häufung dieser Mutationen ist von einer deutlich reduzierten Sensitivität gegen mindestens vier wichtige Kombinationswirkstoffe einer HAART (AZT, d4T, 3TC, ABC) auszugehen. Damit entspricht das Frankfurter Kollektiv internationalen Studien (Chantratita et al., 2002; Tanuri et al., 2002). Die mit 20% häufigste NNRTI-Mutation ist K103N. Aufgrund der mit der Mutation assoziierten Gruppenresistenz gegen alle derzeit verfügbaren NNRTIs ist der Einsatz dieser Medikamentenklasse in einer HAART eingeschränkt. Primäre Resistenzen gegen ddI und ddC werden insgesamt selten detektiert. Bezogen auf die einzelnen Kalenderjahre weist die Auswertung der einzelnen Mutationen über die Jahre 1995 bis 2001 hinweg einen deutlicher Rückgang der Mutationen vor allem zwischen 1998 und 2000 auf. Insbesondere konnten Multiresistenzen, vermittelt über entweder L210W+T215Y/F oder M184V+>3TAMs, und beginnende AZT-/d4T-Resistenz, Leitmutation ist T215Y/F, aber auch NNRTI-Resistenz, hauptsächlich hervorgerufen durch K103N, reduziert werden. Hingegen bleibt L210W als späte AZT-/d4T-Mutation von 1995 bis 2001 auf etwa gleichem Niveau. Anhand der NNRTI-Mutationen kann aufgezeigt werden, welchen Einfluss die Zulassung der Medikamente auf die Ausbildung der Mutationen hat. In den letzten Jahren häufen sich Anfragen nach Sequenzierungen bei Low-Level-Patienten (< 1000 Viruskopien/ml). Anhand der Auswertung der 33 Low-Level-Patientenproben lässt sich nachweisen, dass die Qualität von Genotypisierungen im Low-Level-Bereich (< 1000 bis 250 Viruskopien/ml) im Gegensatz zu Herstellerempfehlungen nicht beeinträchtigt ist. Dadurch bietet sich die Möglichkeit, mit Resistenzen assoziierte Mutationen frühzeitig entdecken und so ein virologisches Versagen bzw. eine weitere Selektion von Mutationen verhindern zu können. Durch Therapiewechsel können Viruslasten (VL) langfristig unter Nachweisgrenzenniveau gesenkt werden, was die Entwicklung von Mutationen erschwert. Die ausgewerteten Low-Level-Patientenverläufe weisen gehäuft zwei Mechanismen der Aufrechterhaltung der niedrigen VL auf. Zum einen kommt es selbst nach langjähriger HAART zur Entwicklung nur der M184V-Mutation, welche die Entwicklung weiterer TAMs verzögert. Bei anderen Patienten vermitteln genotypisch nachgewiesene Multiresistenzen eine Reduktion der viralen Fitness mit Einschränkung der Replikationsfähigkeit.
Bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit (KHK) wird angenommen, dass es aufgrund der Apoptose von Endothelzellen zu einer Störung des endothelialen Zusammenhaltes kommt, was ein Fortschreiten der Atherosklerose zur Folge hat. Unter normalen Bedingungen bewirkt eine Gefäßwandverletzung eine Mobilisierung von im Knochenmark befindlichen endothelialen Progenitorzellen, was möglicherweise zur Reendothelisation der verletzten Gefäßwand beiträgt. Personen mit kardiovaskulären Risikofaktoren und einer manifesten KHK jedoch haben eine niedrigere Anzahl zirkulierender EPCs. Aus diesem Grund untersuchten wir bei Patienten mit stabiler KHK und mit ACS das Gleichgewicht zwischen zirkulierenden EPC und zirkulierenden apoptotischen maturen endothelialen Zellen (CAEC), und beobachteten, ob Statine ECs bei Patienten mit KHK vor der Apoptose schützen.
Die Bestimmung der EPCs erfolgte mit Hilfe der Durchflusszytometrie (FACS) durch die Inkubation mit CD133 und KOR. Es zeigte sich, dass Patienten mit einem AMI im Vergleich zur Kontrollgruppe die niedrigsten Werte an zirkulierenden EPCs aufwiesen (ca. 3,5fach niedriger), gefolgt von Patienten mit instabiler und stabiler KHK. Die Anzahl zirkulierender ECs hingegen (CD45-negativ, CD146-positiv und vWF-positiv) war bei Patienten mit AMI im Vergleich zur Kontrollgruppe um das 5fache erhöht (P < 0,01).
Um die Anzahl an CAEC zu bestimmen, ermittelten wir mittels einer 4-Kanal-Durchflusszytometrie die Annexin V-positiven Zellen aus CD45-negativen, CD146- positiven und vWF-positiven zirkulierenden Zellen aus peripheren Blutproben von Patienten mit KHK.
Wir konnten zeigen, dass diese Zellen bei Patienten mit AMI im Vergleich zu einem gesunden alters- und geschlechtskompatiblen Probandenkollektiv um das 10fache erhöht waren. (P < 0,05)
Um ein Maß für die veränderte Balance verschiedener Endothelzellen zu erhalten, ermittelten wir einen "Schädigungsindex" (Quotient aus CAEC und EPC), der bei Patienten mit stabiler KHK bereits ein relatives Überwiegen der Apoptose bei unzureichend erniedrigten EPCs anzeigte und bei Patienten mit AMI die ungünstigste Konstellation mit einem um das 30fache erhöhten Index ergab.
Da kardiovaskuläre Risikofaktoren bekanntermaßen die Atheroskleroseentstehung begünstigen, untersuchten wir, ob sie auch Einfluss auf die Anzahl zirkulierender CD133- positiver EPCs haben. In einer multivariaten Analyse blieben die Krankheitsaktivität der KHK und eine positive Familienanamnese als unabhängige signifikante Prädiktoren einer reduzierten Anzahl zirkulierender CD133-positiver EPCs bestehen.
Um die Herkunft der ECs zu bestimmen, wurden selektiv Blutproben aus der Aortenwurzel und der V.cordis mag na untersucht. Patienten mit ACS wiesen einen transkoronaren Anstieg der CAEC um 35% in der V.cordis magna verglichen mit der Aorta auf. Ebenso war bei Patienten mit ACS der "Schädigungsindex" in der V.cordis magna signifikant höher als in der Aorta.
Hydroxymethyl- Glutaryl- Goenzym-A-Reduktasenhibitoren (Statine) senken die kardiovaskuläre Ereignisrate sowohl in der Primär- als auch in der Sekundärprävention kardiovaskulärer Erkrankungen.
Eine retrospektive Studie mit n = 34 Patienten mit KHK zeigte, dass die Anzahl an CAEC bei Patienten ohne Statin signifikant niedriger war als bei den Patienten, die ein Statin bekommen hatten (mittlere Dosis 20mg per os). Zudem zeigte sich bei der Berechnung des Schädigungsindex, dass die Statintherapie eine Abnahme des Quotienten um das 15- fache bewirkte. Um dieses Ergebnis zu bestätigen maßen wir in einer prospektiven Studie die CAEC-Level bei n = 9 Patienten mit KHK vor und nach einer 4- wöchigen Behandlung mit Atorvastatin. Die Behandlung mit Atorvastatin führte zu einer signifikanten Abnahme sowohl der CAEC- Level als auch der prozentualen Apoptoserate.
Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass bei Patienten mit akuter KHK das Gleichgewicht zwischen EPG und apoptotischen maturen Endothelzellen gestört ist und dass eine Statintherapie das Gleichgewicht zwischen Endothelzellverletzung und vaskulären Reparaturmechanismen in Richtung einer Erhaltung des endothelialen Zusammenhaltes beeinflusst.
Nach Implantation einer Totalendoprothese kommt es zu einer veränderten Krafteinleitung in das Femur und zu Knochenumbauprozessen ( Bone Remodeling ). Viele Faktoren, wie z. B: Geschlecht, Alter, Gewicht, Knochenqualität, Design beeinflussen die Menge des Remodelings. Hauptursache des postoperativen Knochendichteverlustes ist jedoch das sogenannte Stress Shielding. Aufgrund der veränderten Krafteinleitung kann es zu proximaler Atrophie und zu distaler Hypertrophie kommen. Dank ihrer hohen Präzision und Reproduzierbarkeit bietet sich die DEXA Technik an, um periprothetische Knochendichteänderungen zu untersuchen. In der vorliegenden Studie wurden osteodensitometrische Untersuchungen des proximalen Femurs nach Implantation einer zementfreien anatomischen CTX-Prothese gemacht. Die Studie umfasste 34 zufällig ausgewählte PatientInnen. Die CTX-Prothese ist aus einer Titanlegierung gefertigt und zeichnet sich durch ihre Antetorsion und ihre relativ kurze Länge aus. Sie ist zu 85 % Hydroxyapatit beschichtet, wobei die Spitze frei ist. Die periprothetische Knochendichtemessungen begannen in der ersten Woche postoperativ und erfolgten dann im Abstand von je 2 Monaten im ersten halben Jahr. Die Abschlussuntersuchung erfolgte 1 Jahr nach der Operation. Die BMD wurde in 7 ROI´s ( Region of interest ) nach Gruen gemessen. Es wurden Doppelmessungen durchgeführt und das arithmetische Mittel für die Statistik verwendet. Postoperativ und nach einem Jahr wurden ebenfalls die LWS und die kontralaterale Hüfte mitgemessen. Während des ersten Jahres nach der Implantaion der CTX-Prothese kam es vor allem im proximalen Teil zu Knochenatrophie, welche sich hauptsächlich im Calcarbereich zeigte ( - 22.3 % nach einem Jahr ). Im mittleren Teil der Prothese wurde nur lateral eine Atrophie von bis zu – 2,7 % gefunden. Medial war während des ganzen Jahres keine statistisch Signifikante Änderung zu beobachten. Im distalen Drittel kam es zu einer leichten Hypertrohie von bis zu + 1,70 %. Die gesamte periprothetische Dichte zeigte jedoch keine Veränderung, so dass man annahmen kann, dass sich proximale Atrophie und distale Hypertrophie kompensieren. Als Ursache des proximalen Verlustes ist das sogenannte Stress shielding aufgrund der fehlenden Krafteinleitung und der postoperativen Entlastungsphase zu nennen. Die distale Zunahme lässt sich mit ungünstiger Krafteinleitung erklären. Es zeigte sich eine enge Korrelation zwischen dem T-Score der Lendenwirbelsäule, als Mass der systemischen Mineralisierung, bzw. dem T-Score der kontralateralen Hüfte, als Mass für den peripheren Mineralisierungsgrad, und der periprothetischen Knochendichteänderung. Die Korrelation bestand hauptsächlich in ROI 7, das auch die grösste Abnahme erfuhr. Die anderen Korrelationskoeffizienten waren insgesamt schwächer ausgebildet oder sogar negativ. Patienten mit einem T-Score > 0 an der Wirbelsäule zeigten einen geringeren periprothetischen Dichteverlust als Patienten mit einem T-Score < 0: - 14,3 % im Gegensatz zu – 24,6 % in ROI 7. Bei Patienten mit Werten < - 2,5 SD war der Verlust sogar noch grösser: bis zu – 40 % der ursprünglichen Knochendichte. Daraus lässt sich schliessen, dass fester Knochen wesentlich stabiler und ausgeglichener auf eine Prothesenimplantation reagiert als osteopenischer Knochen. Der Vergleich mit Daten nach implantierter Geradschaftprothese (PPF) zeigte praktisch keinen Unterschied des periprothteischen Knochenverlustes in den verschiedenen ROI´s. Es zeigt sich lediglich eine geringere distale Hypertrophie während des ersten postoperativen Jahres. Somit weist ein anatomisch-adaptierter CTX-Schaft weder Schutz vor Verlust der Knochendichte auf noch kommt es zu einer Verhinderung des „stess shieldings“. Über den Langzeitverlauf der CTX-Prothese lässt sich zum jetzigen Zeitpunkt noch keine Aussage machen. Ebenso bleibt abzuwarten welchen Stellenwert die Bisphosphonate in der Therapie der Hüftendoprothetik haben werden.
Die technische Entwicklung kleiner, mobiler Ultraschallgeräte erlaubt den Einsatz der Sonographie auch außerhalb der Klinik. In der vorliegenden Arbeit wird untersucht, ob die präklinische Sonographie mit einem mobilen Ultraschallgerät eine praktikable Methode darstellt, um am Unfallort abdominelle Blutungen zu diagnostizieren und inwieweit dies Einfluß auf die Therapie und das Management schwerverletzter Patienten hat. Die präklinische Sonographie wurde an 61 Patienten durchgeführt, bei denen eine intraabdominelle Verletzung nicht auszuschließen war. Unmittelbar nach Klinikaufnahme wurde der präklinisch festgestellte Ultraschallbefund mittels erneuter Ultraschalluntersuchung bzw. Computertomographie des Abdomens im Rahmen der Schockraumdiagnostik kontrolliert. Bei einer Untersuchungsdauer von durchschnittlich 2.8 ± 1.2 min wurde bei 16 Patienten (26.2 %) freie Flüssigkeit gefunden, 7 mit massivem, 9 mit diskretem pathologischen Befund. 4 der Patienten mit ausgeprägtem Befund wurden unmittelbar nach Klinikaufnahme laparotomiert und 3 aufgrund einer Milzruptur splenektomiert. Drei Patienten verstarben am Unfallort u.a. aufgrund ihrer abdominellen Verletzungen. Die präklinische Sonographie ergab schließlich ein falsch positives Ergebnis, jedoch kein falsch negatives Ergebnis, welches eine Spezifität von 97,9% und eine Sensitivität von 100% ergibt. In 36% der Einsätze wurde das präklinische Management modifiziert und in 21 % aufgrund der sonographischen Diagnose die Wahl der Zielklinik beeinflußt. Die präklinische Sonographie hat sich als sichere und fehlerarme Methode zur präklinischen Diagnostik abdomineller Blutung bewährt und stellt für den Einsatz im Notarztdienst eine sinnvolle Erweiterung der Diagnostik dar. Die Pilotstudie war Grundlage für eine Multicenterstudie der Deutschen Rettungsflugwacht, die klären soll, ob die präklinische Sonographie generell für den Einsatz im Rettungsdienst empfohlen werden kann.
Die vakuumassistierte stereotaktische Brustbiopsie (Mammotome) bei mammographisch verdächtigen aber nicht palpablen und sonographisch nicht nachweisbaren Veränderungen der Brust ist mittlerweile ein probates Verfahren. In der vorliegenden Studie werden 152 Mammotombiopsien genauer untersucht. Es werden die konventionellen, vor der Biopsie angefertigten, und wenn vorhanden Film-Folien- Vergrößerungsaufnahmen mit den während der Biopsie angefertigten digitalen Ausschnittsmammographien verglichen, um eventuell vorhandene Unterschiede deutlich zu machen. Die Veränderungen werden in die BI-RADS-Klassifikation eingeteilt und mit der gewonnenen Histologie korreliert. Die durchschnittliche Dauer einer Biopsie beträgt 49,2 min, zum Auffinden und korrektem Einspannen der Brust in den Biopsietisch sind 1,47 Fehlversuche nötig und es werden 2,75 Rotationen pro Biopsie durchgeführt. Die Entfernung der Läsion erfolgt in 32,9% der Läsionen komplett, 51,5% werden überwiegend entfernt und 12,5% können nur unvollständig entfernt werden. Im Durchschnitt werden 15,53 Mikrokalzifikationen im Film-Folien- und 14,45 Mikrokalzifikationen im digitalen Bild gezählt, in den Film-Folien- Vergrößerungsaufnahmen sind 17,98 Mikrokalzifikationen sichtbar. Signifikant sind diese Unterschiede nur in der Gruppe der Läsionen mit 1 – 5 Mikroverkalkungen, hier sind in der digitalen Ausschnittsmammographie signifikant mehr Verkalkungen zu sehen. In der Gruppe der Läsionen mit 16 – 30 Mikroverkalkungen sind ebenfalls signifikante Unterschiede zwischen den beiden Aufnahmen zu sehen, wobei hier die Film-Folien-Mammographie mehr Verkalkungen sichtbar macht. Die Läsionen werden nach Betrachten der Film-Folien- Mammographien in signifikant höhere BI-RADS-Kategorien eingeteilt, als nach Beurteilung der digitalen Ausschnittsmammographien. Die histologische Untersuchung ergibt 7 invasive Karzinome, 30 in situ Karzinome, 14 ADHs und 101 benigne Veränderungen, wobei hier die duktale Hyperplasie und die Mastopathie den größten Anteil haben. Der Vergleich mit dem in der Literatur angegebenen Anteil an malignen Befunden in den einzelnen BI-RADS-Kategorien zeigt, dass die Film-Folien-Bilder recht gute Ergebnisse erzielen (27,5% maligne Befunde in Kategorie 4 und 6,5% in Kategorie 3-4), während die digitalen Bilder zu hohe Malignitätsanteile (45,0% in Kategorie 4) liefern. Es zeigt sich, dass bei der Unterscheidung von malignen Befunden und Präkanzerosen von benignen Befunden, die Film-Folien-Aufnahme signifikant bessere Ergebnisse erzielt als die digitale, gleiches gilt für die Unterscheidung von DCIS und ADH. Die Präparateradiographie zeigt, dass in 76,3% der Biopsien in der ersten Rotation Mikrokalk sichtbar ist, die histologische Diagnose kann aber in 92,1% der Biopsien bereits nach der ersten Rotation gestellt werden, auch wenn kein sichtbarer Kalk entnommen wurde. In 52 Fällen folgte auf die Biopsie eine operative Gewebeentnahme bzw. Tumorentfernung aus der Brust. In 13 Fällen ist die Veränderung im OP-Präparat nicht mehr nachweisbar, hier ist davon auszugehen, dass sie mit der Biopsie vollständig entfernt wurde. Bei 5 Läsionen wurde die Diagnose nach der OP als maligner eingestuft, die underestimation-rate beträgt 9,6%. Die Film-Folien-Mammographieaufnahmen eignen sich zur Einteilung in die BI-RADS-Klassifikation und Feststellung des Malignitätsrisikos besser, als die digitalen Ausschnittsmammographien.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es festzustellen (im Rahmen einer Doppelblindstudie mit 32 Patienten), ob der Einsatz des neu entwickelten Kontrastmittels Gd-EOB-DTPA in der MRT-Diagnostik im Vergleich zum herkömmlichen Gd-BOPTA gleichwertige Ergebnisse hervorbringt in Bezug auf Detektion und Charakterisierung von fokalen Leberläsionen und in der Gefäß- und Leberparenchymdarstellung. Gd-EOB-DTPA zeigte eine sehr gute Verträglichkeit, die sich in der vorliegenden Studie als gleichwertig zu Gd-BOPTA erwies. Einen Vorteil gegenüber Gd-BOPTA bietet Gd-EOB-DTPA durch eine frühere leberspezifische Phase; auf diese Weise lassen sich dynamische Sequenzen und hepatospezifische Untersuchungen in einem einzigen Untersuchungsdurchgang vornehmen. Insgesamt kann Gd-EOB-DTPA als hochwertiges, Gd-BOPTA gleichgestelltes hepatospezifisches MRT-Kontrastmittel betrachtet werden und ist sicherlich für den breiten klinischen Einsatz gut geeignet.
1. Die einzelnen Schritte der instrumentellen Zahnextraktion in der Antike sind dem heutigen Vorgehen im Prinzip sehr ähnlich: das Ablösen des supraalveolären Faserapparates, die Luxation und das Herausziehen des gelockerten Zahnes aus der Alveole längs der Zahnachse. 2. Wurzelreste sollten – folgen wir der antiken Literatur – durch eine spezielle Wurzelfaßzange, der „rizagra“, entfernt werden. Die antiken Texte erwähnen nicht die operative Entfernung von Wurzelresten durch Osteotomie. Der Hebel zur Zahnentfernung war den Römern höchstwahrscheinlich unbekannt. 3. Aufgrund der unkalkulierbaren Risiken bildeten sich in der Antike immer wiederkehrende Therapieschritte heraus, die für die Behandlung eines schmerzhaften Zahnes von sämtlichen Autoren medizinischer Abhandlungen empfohlen wurden: - medikamentöse Schmerzausschaltung - medikamentöse Lockerung der Zähne durch Gifte und starke Ätzmittel - Ziehen des gelockerten oder des bereits durch pathologische Prozesse beweglichen Zahnes mit den Fingern - Extraktion des Zahnes mittels einer Zange 4. Die instrumentelle Entfernung des Zahnes wurde nur im äußersten Notfall vorgenommen und wurde in erster Linie von Allgemeinärzten durchgeführt. Ärzte, die auf Zahnbehandlungen spezialisiert waren, werden zwar erwähnt („medicus dentalis“), kommen aber hauptsächlich in den Großstädten (Rom, Alexandria) vor und bilden dadurch die Ausnahme. Von einer „Zahnärzteschaft“ in der Antike kann daher keine Rede sein; wir müssen eher von einem „Außenseiterstatus“ dieses Berufsstandes ausgehen. 5. Die Zahnzange („odontagra“, „forceps“, „dentiducum“) bestand in der Antike aus Eisen. 6. Griff- und Faßteil aller Zangen bilden eine Gerade und entsprechen nach moderner Klassifizierung von Zahnzangen dem Typus der Oberkieferzahnzange. Demnach handelt es sich bei den römischen Zangen um ein Instrument, das die Unterscheidung in Unter- und Oberkiefer nicht kannte. Die einzelne Zange wurde sowohl im Ober- als auch im Unterkiefer sowie auf der linken als auch auf der rechten Kieferseite eingesetzt. Daher könnte man von einer Universalzange sprechen, allerdings mit einer entscheidenden Einschränkung: Die Römer unterschieden den Einsatz von Zangen für den Front- und Seitenzahnbereich. Die Faßenden oder Branchen lassen sich in unterschiedlichen Größen nachweisen, die ähnliche Abmessungen haben wie heutige Zahnzangen. Möglich ist auch, daß es sich bei den „kleineren“ Exemplaren um die in der antiken Literatur beschriebene Wurzelfaßzange, die „rizagra“, handelt. Im Gegensatz hierzu kommen die medizinischen Zangen aus Bronze als Zahnzangen nicht in Betracht, da ihre größere Branchenbreite eine optimale Zahnextraktion nicht erlaubt. Sie fallen zu groß aus und würden bei Luxationsbewegungen wie auch beim Greifen die Nachbarzähne unweigerlich beschädigen. 7. Die bis heute aufgefundenen Zangen decken einen Zeitraum ab, der von der Zeitenwende bis in die Spätantike des 4. nachchristlichen Jahrhunderts reicht. Die ältesten Fundstücke aus datierbaren Fundkomplexen sind die Zangen aus dem Bereich des augusteischen Fundplatzes von Augsburg-Oberhausen (früheste Zangentypen) bis hin zu dem Grabfund von Gadara (Jordanien) aus der Mitte des 4. Jahrhunderts n. Chr. Innerhalb dieser Zeitspanne bleiben die wesentlichsten Konstruktionsmerkmale der Zangen – bis auf die Gestaltung der Enden der Branchen – konstant, eine Erscheinung, die uns auch von der übrigen materiellen Sachkultur der Römer bekannt ist. Bewährte Werkzeuge, Instrumente oder Waffen werden über Jahrhunderte kaum verändert. 8. Zu den wesentlichen Konstruktionsmerkmalen zählen: - die bajonettförmige Gestaltung der Faßenden / Aufbiegung der Branchen - Die Hebelverhältnisse zwischen Griff und Zangenbranchen, die sich zwischen 1:1,7 und 1:2,5 bewegten und damit deutlich unter den Werten heutiger Zahnzangen mit 1:5 liegen, erlaubten demnach nur eine verminderte Kraftwirkung bei der Extraktion. - Das mit einem Schmiermittel beschichtete Zangenschloß setzte sich wahrscheinlich immer aus einem Eisenstift zusammen, der durch zwei angenietete, weichere Buntmetallscheiben fixiert wurde. Die Scheiben setzten die Reibung herab und gaben gleichzeitig den beiden eisernen Schenkeln der Zange eine entsprechende Führung bei Zangenöffnung und Zangenschluß. - Die relativ dünn ausgebildeten, runden oder kantigen Griffe wurden wohl mit einer Griffumwicklung (Textil, Leder) versehen, wodurch ein ergonomisches Zufassen erlaubt und ein Abrutschen der Hand bei Luxations- und Zugbewegungen verhindert wurde. - Ein Abgleiten der organischen Griffumwicklung vom Metall wurde durch die auffälligen und unterschiedlich ausgeführten Verdickungen am Griffende unterbunden. - Durchgängig läßt sich bei der Ausbildung der Branchen eine Veränderung hin zu einer Zahnzange erkennen, die den Zahn mögichst vollständig umfaßt. Im Verlauf von drei Jahrhunderten wurde eine technische Verbesserung vorgenommen: Die anfängliche kneifzangenartige Gestaltung der Branchen wurde zugunsten einer vertieften und hohlkehlartig ausgeformten Gestaltung der Faßenden aufgegeben, aus der sich schließlich die jüngsten Fundstücke mit dornenartigen Branchen entwickelten. Damit wurde der Halt der Zange am Zahn deutlich verbessert und die Gefahr einer Kronenfraktur herabgesetzt. 9. Trotz der beschriebenen Veränderungen der Zahnzangen blieben diese Instrumente von Anfang an multifunktional einsetzbar, da sie nicht nur zum Zahnziehen, sondern auch zum Entfernen von Splittern, Geschossen und Pfeilspitzen verwendet wurden. Daraus resultiert, daß sich keine ausgeprägte Typenvielfalt entwickelte, ein Phänomen, das wir auch von anderen medizinischen Gerätschaften aus der Römerzeit kennen. Bewährte Instrumente wurden über Jahrhunderte eingesetzt, ohne wesentliche Veränderungen zu erfahren. 10. Offenbar verläuft die Entwicklung der Zahnzange parallel zur Herausbildung einer medizinischen Betreuung innerhalb der römischen Armee. Beginnend in der Regierungszeit des Augustus hält diese Entwicklung bis in die Spätantike an. Ein gewisser Einfluß aus Griechenland ist wahrscheinlich, eine Weiterentwicklung durch die Römer gesichert. Möglich ist aber auch, daß die Zahnzange in der vorliegenden Form eine römische Erfindung ist. 11. Der Typus der römischen Zahnzange war dem Mittelalter nach heutigem Stand der Forschung unbekannt. Das europäische Mittelalter nahm Neuerungen aus der Welt der Araber auf (z.B. den Hebel) und entwickelte eigene Instrumente (z.B. den Pelikan). Bis in die Neuzeit (der Zeit des Barock und des Absolutismus) hinein war die Zahnheilkunde weitgehend in den Händen von Handwerkern (Barbiere, Zahnbrecher, niedere Wundärzte). Ob die Kenntnis der römischen Zahnzangen an dieser Entwicklung etwas geändert hätte, ist unwahrscheinlich. Erst durch den technischen Fortschritt des 19. und 20. Jahrhunderts kann die Zahnextraktion sicher und vorhersehbar durchgeführt werden (anatomische Zahnzange, Lokalanästhesie, Röntgenstrahlen, elektrische Lichtquellen und Motoren, kompressorbetriebene Absauganlagen).
HINTERGRUND Ziel dieser Studie war es Normwerte bei gesunden Frankfurter Kindern für die Fahrradergometrie in halbliegender Position mithilfe des Godfrey Protokolls zu erstellen. Normwerte Gesunder sind in der Kinderkardiologie der Uniklinik Frankfurt vor allem für die Untersuchung von herzkranken Kindern als Referenzwerte wichtig. METHODEN Die Fahrradspiroergometrie erfolgte bei 122 Schülern (65 Jungen und 57 Mädchen) im Alter von 7 bis 15 Jahren. Alle Tests fanden unter vergleichbaren Bedingungen statt und wurden von zwei erfahrenen Untersuchern durchgeführt. Die Belastung begann bei 20 Watt und wurde jede Minute entsprechend der Körpergröße gesteigert. Kinder, die kleiner als 150 cm groß waren, wurden um 15 Watt/min gesteigert, Kinder über 150 cm Körpergröße hatten Belastungsstufen von 20 Watt/min zu bewältigen. ERGEBNISSE Ein Fragebogen gab Auskunft über den alltäglichen Bewegungsumfang der Schüler neben dem Sportunterricht. Es zeigte sich, dass ein Großteil der Probanden im Vereinssport aktiv war und dass der Schulweg nur bis zu einer Distanz von etwa 2 km auch zu Fuß oder per Fahrrad zurückgelegt wird. Geschlechtsspezifische Unterschiede in der Fahrradergometrie konnten bereits in den präpubertären Jahrgängen zugunsten der Jungen festgestellt werden. Auch das Alter erwies sich bei den Schülern abgesehen von den weiblichen, älteren Jahrgängen (13-15 Jahre) als guter Bezugspunkt für Leistung. Ebenso auffällig wie die nahezu gleiche Leistung der Mädchen diesen Alters waren auch die annähernd gleichen Körpergrößen. Mithilfe linearer Regression konnte eine Normalverteilung der Leistung aller Probanden bezogen auf die Körpergröße belegt werden. Das Alter ist ein angemessener Bezugspunkt für die Leistung solange Kinder wachsen. Besser ist die Körpergröße, da sie auch die Leistung von Kindern, deren Größe nicht dem Alter entspricht, angemessen beurteilt. Verglichen mit vorherigen Fahrradergometriestudien fiel die niedrigere Leistung der Frankfurter Probanden auf. Der direkte Vergleich mit der Godfrey Studie (Godfrey 1974) ergab sowohl geringere Arbeitslasten bezogen auf die Körpergröße der Frankfurter Schüler, als auch höhere maximale Herzfrequenzen und Sauerstoffaufnahmen der Godfrey Probanden. Auch Kölner Schüler, die 1987 von Klemt (Klemt 1987) auf dem Fahrradergometer belastet wurden, zeigten eine größere Leistungsfähigkeit. Das Klemt Protokoll führt durch lang andauernde Belastungsstufen, die körpergewichtsabhängig definiert werden, zu langen Belastungszeiten. Darin könnte ein Grund für bessere Leistungen der Kölner Kinder liegen. Die WIAD Studie (WIAD 2003) stellte erhebliche Leistungsminderungen bei über 20.000 deutschen Schülern in Ausdauer-, Kraft-, und Koordinationstests fest. Die Abnahme der Leistungsfähigkeit liefert einen Grund für niedrigere maximale Arbeitslasten der Frankfurter Kinder. Dennoch stellte sich die Frage ob die Frankfurter Kinder tatsächlich ausbelastet waren und welchen Einfluss die halbliegende Position in der Ergometrie einnimmt. Die Bestimmung der Ausbelastung einzelner Probanden anhand von Ausbelastungskriterien stellte sich schwierig dar. Ein Plateauwert der maximalen Sauerstoffaufnahme konnte nicht zuverlässig ermittelt werden. Maximale Herzfrequenzen der Frankfurter Probanden streuten weit und lagen im Durchschnitt unter denen zur Ausbelastung geforderten Werten. Diesen niedrigen Herzfrequenzen standen hohe Werte der Atemäquivalente und des relativen Atemminutenvolumens entgegen, die eine Ausbelastung anzeigten. Wichtig erscheint es neben objektiven Messdaten, die je nach Untersuchungsbedingungen starken Schwankungen unterliegen, auch subjektive Ausbelastungskriterien zu berücksichtigen. Die überwiegende Mehrheit an Fahrradergometerstudien findet in sitzender Position statt. Veröffentlichte Daten der liegenden Fahrradergometrie berichten von niedrigeren maximalen Arbeitslasten und maximalen Herzfrequenzen. Diese Beobachtung konnte durch unsere Probanden gestützt werden. Unterschiedlich wurde der Einfluss der Position auf das pulmonale System beurteilt. Unserer Beobachtung zufolge führt die halbliegende Position zu niedrigeren maximalen Sauerstoffaufnahmen, höheren Atemminutenvolumina und Atemäquivalenten. Die Lunge arbeitet weniger ökonomisch als im Sitzen. Die Atemhilfsmuskulatur kommt weniger effizient zum Einsatz. Möglich ist, dass die maximalen Schlagvolumenwerte bei Belastung im Sitzen höher sind als im Liegen. Darin könnte ein Grund für niedrigere Sauerstoffaufnahmen in liegender Position gefunden werden. SCHLUSSFOLGERUNG Die Maximalleistung bei Kindern während der Fahrradergometrie wird bedeutend durch die Körpergröße, die körperliche Fitness, das Belastungsprotokoll und die Position des Probanden auf dem Ergometer beeinflusst. Diese Studie belegt reduzierte Leistungen der Probanden in halbliegender Position mit größeren Anforderungen an das ventilatorische System. Untersuchungen, die speziell sitzende und liegende Fahrradergometrie bei den selben Probanden durchführen, sind nötig, um vor allem die Hintergründe für die schlechtere Atemökonomie zu erforschen und die Reaktion des Schlagvolumens auf Belastung zu beobachten.
Der Brustkrebs ist eine der häufigsten Todesursachen bei der Frau. In Deutschland und den industriell fortgeschrittenen Ländern erkrankt jede zehnte Frau im Laufe ihres Lebens an Brustkrebs. Nach Schätzungen der International Agency for Research on Cancer (IARC) erkrankten im Jahr 2004 ca. 1,2 Millionen Frauen weltweit an Brustkrebs. In den USA wurden ca. 215.990 Frauen mit einem invasiven Brustkrebs 2004 diagnostiziert (Breast Cancer: Statistics on Incidence, Survival, and Screening: http://imaginis.com/breasthealth/statistics.asp). Laut Berechnungen der IARC für das Jahr 2000 liegt die altersstandardisierte Neuerkrankungsrate für die industrialisierten Länder bei 63 Fällen (Weltstandard – WSR) je 100.000, bei den weniger entwickelten Regionen bei 23 Fällen je 100.000. Die Erkrankungsrate in Deutschland liegt mit 70,1 (WSR) deutlich unter den USA mit 99,6 (weiße Frauen - WSR) je 100.000 und geringfügig über dem Durchschnitt der EU mit 68,57 (WSR) je 100.000 (Stabenov und Eisinger 2001). Es gibt große Fortschritte in der Früherkennung, Diagnostik und Therapie des Brustkrebses, die eine bessere und längere Überlebenschance für die erkrankten Frauen bedeuten: Die Magnetresonanz(MR)-Mammographie hat einen neuen Stellenwert in der Diagnostik des Brustkrebses gefunden. Die Kernspintomographie ist die zurzeit sensitivste Methode zur Detektion von Karzinomen bei Hochrisikofrauen (Loibl et al. 2003). Seit Mitte der neunziger Jahre können bei unklaren Befunden MR-gesteuerte Biopsien oder präoperative Markierungen durchgeführt werden (Diebold et al. 2004). Die intraoperative Strahlentherapie verkürzt die mehrwöchige postoperative Strahlentherapie. Die Rate der brusterhaltenden Operationen nimmt stetig zu. Die endokrine Therapie beim hormonsensitiven Brustkrebs mittels dreijähriger ovarieller Downregulation und fünfjähriger Tamoxifenbehandlung hat sich fest etabliert. Es gibt klare Vorteile der stadiengerechten primären systemischen Therapie. In Zukunft könnten monoklonale Antikörper auch außerhalb von Studien zum Einsatz kommen. Man findet heute in den meisten westlichen Industrieländern eine rückläufige Mortalität an Brustkrebs. Die Inzidenz des Brustkrebses wächst jedoch in den westlichen Industrieländern seit 25 Jahren stetig weiter. Änderungen der Lebensweise, des Fortpflanzungsverhaltens und verbesserte Diagnostik erklären diese Entwicklung jedoch nur zum Teil. Die Vorsorge- und Früherkennungsprogramme haben leider nicht den erhofften Erfolg gebracht: Nur etwa ein Drittel der Frauen geht regelmäßig zu den angebotenen Vorsorgeuntersuchungen. Der Nutzen eines Mammographie-Screening-Programms wird kontrovers diskutiert (Miller et al.1992, Baines 1994, von Minckwitz und Kaufmann 1997, Gotzsche und Olsen 2000), manche Autoren machen Mammographien sogar für einen Teil der Inzidenzsteigerung bei jungen Frauen verantwortlich. Zielgruppen des Screenings sind aktuell Frauen zwischen dem 50. und dem 69. Lebensjahr. Derzeitig wird ein Screening-Intervall von 24 Monaten für diese Frauen empfohlen. Bisher ist eine evidenzbasierte Mortalitätsreduktion der Mammographie-Screenings für jüngere Frauen nicht nachgewiesen worden (Jackisch et al. 2004). Es muss daher nach weiteren Ursachen geforscht werden, die diese stetige Steigerung der Inzidenz erklären. Seit Mitte des 20. Jahrhunderts nimmt der Prozentsatz der Frauen in der Arbeitswelt stetig zu, so dass man hier neben den zivilisatorisch bedingten Veränderungen der Umwelt und des Konsumverhaltens arbeits- und berufsspezifische Ursachen für die Entstehung des Brustkrebses vermutet. Weltweit ist in den letzten zehn bis 20 Jahren eine Vielzahl von Studien mit kontroversen Ergebnissen in der Fachliteratur publiziert worden, die die Rolle dieser neuen Faktoren zu klären versuchen. Wir führten daher eine Fall-Kontroll-Studie zur Untersuchung arbeitsund umweltbedingter chemischer und physikalischer Faktoren für die Entstehung eines Brustkrebses durch. Im ersten Teil dieser Arbeit, die sich ausschließlich mit der Hypothese einer chemischen Verursachung befasst, erfolgt die Darstellung des heutigen Standes der Forschungsergebnisse zum Brustkrebs. Es werden Hypothesen zur Entstehung des Brustkrebses und die publizierte Literatur vorgestellt. Im zweiten Teil der Arbeit werden dann die Methodik und die Ergebnisse dieser Fall-Kontroll-Studie dargestellt. Im dritten Teil dieser Arbeit werden schließlich die Ergebnisse dieser Studie diskutiert und zu den bekannten internationalen Forschungsergebnissen in der Literatur ins Verhältnis gesetzt. Die Arbeit wird anhand der Kriterien für Qualität und Kausalität von Sir Austin Bradford Hill analysiert. Die Methodik der Arbeit wird auf systematische Fehler und Verzerrungen untersucht. Zum Schluss wird eine Zusammenfassung der Arbeit gezogen, und es wird ein Ausblick auf die künftig zu erwartenden Ergebnisse der Forschung unternommen.
In der vorliegenden Arbeit wurden festkörperunterstützte Membranen in Verbindung mit schnellen Lösungswechseln als Methode zur Messung von elektrogenen Transportvorgängen in biologischen Membranen untersucht und charakterisiert. Parallel zu einem manuellen Messsystem wurde eine Technologie auf der Basis eines Pipettierroboters mitentwickelt und charakterisiert, die es erlaubt, automatisierte Messungen mit erhöhtem Durchsatz durchzuführen. Die Sensoren wurden als Sensorarray auf der Basis einer standardisierten 96er Mikrotiterplatte realisiert. Zur Lösungshantierung kam ein Pipettierroboter zum Einsatz, der mit einer selbstentwickelten Injektionseinheit bestückt wurde. In dieser Injektionseinheit ließen sich die verwendeten Lösungen überschichten, wodurch ein Lösungswechsel von einer substratfreien zu einer substrathaltigen Lösung durchgeführt werden konnte. Mit dem beschriebenen System konnten die in dieser Arbeit behandeleten Proteine EAAC1 und NhaA erfolgreich aktiviert und charakterisiert werden. Hinsichtlich der Transportaktivität wurden mit beiden Proteinen vergleichbare Ergebnisse erzielt wie mit dem manuellen Messsystem. Aus kultivierten CHO-Zellen, die den neuronalen Glutamattransporter EAAC1 rekombinant und fuktional exprimierten, wurden EAAC1-haltigen Cytoplasmamembranen in einem Aufreinigungsschritt (Membranpräparation) gewonnen. Die derart vorliegenden Membranfragmente konnten erfolgreich auf der festkörperunterstützten Membran angelagert werden. In der Abwesenheit von Natriumionen war der EAAC1 nicht aktiv, und er konnte durch den spezifischen kompetitiven Inhibitor TBOA inhibiert werden (Inhibitionskonstante Ki = 1µM). Es wurde beobachtet, dass die Transportströme des EAAC1 in der Abwesenheit von Kaliumionen eine andere Kinetik aufwiesen als in der Anwesenheit von Kaliumionen, und die Affinität für L-Glutamat war in der Abwesenheit von Kaliumionen verringert (K0,5 = 144 µM). Analysen der Signalformen ergaben eine reduzierte Relokationsrate, wobei es wahrscheinlich ist, dass der EAAC1 ohne Kaliumionen einen Single-Turnover durchführt. Eine weitere Eigenschaft des EAAC1 ist die Fähigkeit, bestimmte Anionen zu leiten. Diese Anionenleitfähigkeit ist strikt Natriumabhängig und wird durch die Bindung von L-Glutamat getriggert. Wenn bei einem Experiment zusätzlich bestimmte Anionen (z.B. Chlorid oder Thiocyanat) anwesend waren, wies der Transportstrom des EAAC1 in der Abwesenheit von Kaliumionen eine negative Komponente auf. Diese Komponente konnte auf den Einstrom der Anionen entlang des durch den Glutamattransport aufgebauten elektrischen Gradienten zurückgeführt werden. Des Weiteren konnte die Anionenleitfähigkeit mit Anionensprüngen in der Anwesenheit von L-Glutamat und Natriumionen direkt induziert werden. Damit wurden erstmals kanalartige Ionenströme an der festkörperunterstützten Membran nachgewiesen. Der Anionenstrom wies dabei die gleiche Abhängigkeit von der Glutamatkonzentration auf (K0,5 = 31 µM) wie der Transportstrom. Der Übergang in den leitfähigen Zustand und der Transport hängt demnach von dem gleichen L-glutamatgebundenen Zustand des EAAC1 ab. Dies konnte auch unter Verwendung des Inhibitors HIP-B gezeigt werden. HIP-B wurde erstmals an EAAC1 getestet und wies eine Inhibitionswirkung auf den Transportstrom auf, die nicht auf eine kompetitive Bindung zurückzuführen war. Die Anionenleitfähigkeit ließ sich mit HIP-B hingegen nicht inhibieren. Der bakterielle Natrium-Protonen-Austauscher NhaA lag rekonstituiert in Liposomen vor, die auf der festkörperunterstützten Membran angelagert wurden. Bedingt durch die RSO-Orientierung des NhaA, konnte der Natriumtransport entgegen der natürlichen Transportrichtung (extrazelluläre Natriumbindung) untersucht werden. Der Transportstrom wies eine ausgeprägte Abhängigkeit vom pH-Wert auf. Bei neutralen bzw. sauren pH-Werten (pH <= 7) war die Aktivität des NhaA gegenüber dem alkalischen Bereich (7 < pH < 9) erheblich reduziert. Dieses Verhalten entspricht Literaturangaben für die Intrazellulärseite des NhaA. Dennoch war der NhaA bei einem neutralen pH-Wert nicht vollständig inaktiv. Die Affinität für Natriumionen konnte bei einem pH-Wert von 8,5 zu K0,5 = 11 mM und bei pH 7,0 zu K0,5 = 180 mM bestimmt werden. Neben einer Verringerung der Wechselzahl sinkt im neutralen/sauren Bereich also auch die Affinität für Natriumionen. Durch die Verwendung von Liposomen, in denen der NhaA mit verschiedenen Lipid- zu Protein-Verhältnissen rekonstituiert wurde, konnte gezeigt werden, dass die Messströme auf die Aufladung der Liposomen zurückführbar sind. Der Transportstrom konnte mit der amiloridähnlichen Substanz 2-Aminoperimidin inhibiert werden (Ki = 3 µM). Eine Inhibitionswirkung war nur zu beobachten, wenn der pH-Wert kleiner als pH 8 war. Zusammmen mit der ausgeprägten pH-Wertabhängigkeit kann dieses Phänomen auf eine pH-induzierte Konformationsänderung des NhaA zurückgeführt werden.
Das Zytolysin ClyA von Escherichia coli ist der Prototyp einer neuartigen Familie von porenbildenden, bakteriellen Zytolysinen, welche in verschiedenen Vertretern der Enterobacteriaceae vorkommen. Es handelt sich bei diesem Toxin um ein Protein von 34 kDa, das hämolytische und zytotoxische Aktivität aufweist und das in Zellmembranen stabile Poren einführt, indem es sich zu ringförmigen ClyA-Oligomeren zusammenlagert. Die vorliegende Dissertation sollte einen Beitrag zur funktionalen Charakterisierung des ClyA-Proteins von E. coli K12 liefern. Insbesondere sollte die Bedeutung der N-terminalen Region für den Sekretionsmechanismus, für die hämolytische und porenbildende Aktivität, für die Interaktion mit Zielmembranen und für die Fähigkeit zur Oligomerisierung des Proteins analysiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden hierzu ClyA-Derivate mit spezifischen Mutationen innerhalb des N-terminalen Bereiches hergestellt und auf ihre Funktions-tüchtigkeit überprüft. Diese Untersuchungen gingen von den bestehenden Erkenntnissen aus, dass die Sekretion von ClyA über eine periplasmatische Zwischenstufe verläuft und keine N-terminale Prozessierung des Toxins erfolgt. Es wurde festgestellt, dass bereits kurze, sukzessive Deletionen innerhalb der beginnenden N-terminalen Region, wie die Deletion der Aminosäuren an Position zwei bis fünf (ClyA∆2-5) und sechs bis zehn (ClyA∆6-10), einen deutlich hemmenden Effekt auf den Transfer von ClyA über die zytoplasmatische Membran zur Folge hatte, welcher durch die Deletion der Aminosäuren an Position zwei bis zehn (ClyA∆2-10) weiter verstärkt wurde. Größere N-terminale Mutationen, wie die Deletionen der Aminosäuren an Position zwei bis fünfzehn (ClyA∆2-15) und zwei bis zwanzig (ClyA∆2-20) sowie interne Deletionen, die Aminosäuren jenseits von Aminosäureposition zehn betrafen (ClyA∆6-15, ClyA∆11-15, ClyA∆11-20, ClyA∆16-20), führten zur fast vollständigen Inhibierung (ClyA∆6-15) oder totalen Blockierung (ClyA∆11-15, ClyA∆11-20, ClyA∆16-20, ClyA∆2-20, ClyA∆2-15) des Transports von ClyA in den periplas-matischen Raum. Während die hämolytische Aktivität der ClyA-Mutanten ClyA∆2-5, ClyA∆6-10 und ClyA∆2-10 zwar abnahm, jedoch im Vergleich zu der des wildtypischen ClyA-Proteins noch verhältnismäßig hoch war, beeinflussten die weiteren Deletionen (ClyA∆6-15, ClyA∆11-15, ClyA∆11-20, ClyA∆16-20, ClyA∆2-15, ClyA∆2-20) die hämolytische Eigenschaft des Toxins ganz erheblich. So verursachten diese Mutationen eine massive Abnahme (ClyA∆6-15) bzw. einen kompletten Verlust (ClyA∆11-15, ClyA∆11-20, ClyA∆16-20, ClyA∆2-20, ClyA∆2-15) der zytolytischen Aktivität des ClyA-Proteins gegenüber Erythrozyten. Untersuchungen an künstlichen Lipidmembranen ergaben, dass die Deletion der Aminosäuren an Position zwei bis fünf, sechs bis zehn und zwei bis zehn die porenbildende Aktivität des ClyA-Proteins nur unwesentlich beeinträchtigt. Dagegen störte die Deletion der Aminosäuren an Position zwei bis fünfzehn und zwei bis zwanzig die porenbildende Eigenschaft von ClyA so tiefgreifend, dass keine (ClyA∆2-20) oder nur Transmembranporen mit extrem geringem Innendurchmesser (ClyA∆2-15) erzeugt wurden. Daneben spiegelten instabile Membranporen, die durch die ClyA-Mutanten ClyA∆6-15, ClyA∆11-15, ClyA∆11-20 und ClyA∆16-20 im künstlichen Lipid-Bilayer gebildet wurden, die negativen Auswirkungen dieser Mutationen auf die porenbildende Aktivität des Toxins wider. Die gesammelten Daten unterstreichen somit nicht nur die essentielle Bedeutung der N-terminalen Region des Zytolysins ClyA von E. coli K12 für den Transport in den periplasmatischen Raum, sondern auch für die hämolytische und porenbildende Eigenschaft des Toxins. Allerdings wurde die hämolytische und porenbildende Aktivität des ClyA-Proteins erst durch Mutationen ab Aminosäureposition zehn signifikant beeinträchtigt. Demgegenüber verdeutlichten Untersuchungen zum Bindungsverhalten an Zielzellen sowie Crosslinking-Experimente, dass die N-terminale Aminosäuresequenz von Position zwei bis zwanzig von ClyA weder für die Bindung an Erythrozyten noch für die Oligomerisierung des Toxins einen wesentlichen Faktor darstellt.
Zur erfolgreichen Behandlung von Tumorerkrankungen sind effiziente Therapien notwendig. Oftmals kommt es nach einer klassischen Tumortherapie zum Auftreten von Rezidiven, die aus residuellen Tumorzellen hervorgehen. Grund hierfür können eine bereits erfolgte Metastasierung oder Resistenzmechanismen der Tumorzellen sein. Auf Grund ihrer Fähigkeit Gewebe aktiv zu infiltrieren bietet der Einsatz zytotoxischer Lymphozyten im Rahmen einer zellulären Immuntherapie den Vorteil, auch bereits metastasierte Tumorzellen zu erreichen. Dadurch können auch Tumorzellen eliminiert werden, die Resistenzmechanismen meist im oberen Teil apoptotischer Signalkaskaden aufweisen. Eine spezifische Ausrichtung zytotoxischer Lymphozyten auf Tumorantigene ist grundsätzlich über chimäre Antigenrezeptoren möglich. Dabei bietet die Generierung von Tumor-spezifischen zytotoxischen Effektorzelllinien den Vorteil, Zellklone mit definierter Aktivität und Spezifität bereitstellen zu können. Im Hinblick auf einen klinischen Einsatz scheint hierfür die Natürliche Killerzelllinie NK-92 besonders geeignet. Die Ergebnisse einer klinischen Studie mit parentalen NK-92 Zellen zeigten eine gute Verträglichkeit ohne Nebenwirkungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden NK-92 Zellen genetisch so modifiziert, dass sie chimäre Antigenrezeptoren mit Spezifität für die Tumorantigene CD20, EpCAM, GD2 und CD138 exprimieren. In der Tumortherapie stellen das mit Tumoren der B-Zell-Reihe assoziierte CD20-Molekül und das auf den meisten Tumorzellen epithelialen Ursprungs exprimierte EpCAM-Protein wichtige Zielantigene monoklonaler Antikörper dar. Studien zeigten, dass auch die auf Tumorzellen des Neuroblastoms bzw. Multiplen Myeloms exprimierten Moleküle GD2 bzw. CD138 geeignete Angriffspunkte für immuntherapeutische Ansätze sein könnten. Die chimären Antigenrezeptoren sind aus einem Antigenspezifischen scFv-Antikörperfragment aufgebaut, das über ein Fragment der CD8alpha-Kette mit der CD3zeta-Kette als Signaltransduktionsdomäne verbunden ist. Nach retroviraler Transduktion zeigte sich eine hohe und homogene Oberflächenexpression dieser Rezeptoren auf modifizierten NK-92 Zellen. Auf das Oberflächenprotein CD20 ausgerichtete NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen wiesen gegen CD20- positive Tumorzelllinien und primäre Tumorzellen eine hohe zytotoxische Aktivität auf. Im Vergleich waren parentale NK-92 Zellen gegen diese Tumorzellen nicht oder deutlich weniger aktiv. Dabei war die zytotoxische Aktivität der NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen mit dem monoklonalen anti-CD20 Antikörper Rituximab kompetitierbar. Mit Hilfe der gegen parentale und modifizierte NK-92 Zellen resistenten Zelllinie NIH3T3 wurde gezeigt, dass allein über die stabile Expression des CD20-Proteins in NIH3T3 Zellen die Resistenz gegen modifizierte NK-92 Zellen überwunden werden kann. NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen waren in der Lage, CD20-positive NIH3T3-CD20 Zellen auch bei niedrigen E/T-Verhältnissen effizient abzutöten. In Mischkulturen aus NIH3T3 und NIH3T3-CD20 Zellen war zudem eine selektive zytotoxische Aktivität der NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen ausschließlich gegen Antigen-positive Zellen nachweisbar. Über die Analyse von Zellkonjugaten zwischen zytotoxischen Effektorzellen und ihren Zielzellen, deren Bildung grundsätzliche Voraussetzung für eine Eliminierung ist, wurden Hinweise erhalten, dass der chimäre Antigenrezeptor hierzu keinen Beitrag zu leisten scheint, sondern vor allem die anschließende Aktivierung der modifizierten NK-92 Zellen bewirkt. Mit EpCAM-spezifischen NK-92-scFv(MOC31)-Zeta Zellen war auch bei niedrigen E/T-Verhältnissen eine effiziente Abtötung von unterschiedlichen Tumorzelllinien epithelialen Ursprungs möglich. Eine erfolgreiche Blockierung dieser zytotoxischen Aktivität mit dem monoklonalen Antikörper MOC31 bestätigte, dass diese spezifisch über den chimären Antigenrezeptor vermittelt wurde. Die untersuchten epithelialen Zelllinien erwiesen sich dagegen als vollkommen resistent gegen parentale bzw. mit demleeren Expressionsvektor modifizierte NK-92-Mock Zellen. Weitere Ergebnisse zeigten, dass die zytotoxische Aktivität von NK-92-scFv(MOC31)-Zeta Zellen tatsächlich über Granzym B vermittelt wird. Eine erhöhte FasL-Oberflächenexpression infolge der Cokultur mit Antigen-positiven Zielzellen war dagegen nicht nachweisbar. Anhand dieser Ergebnisse kann eine signifikante Beteiligung von FasL an der zytotoxischen Aktivität der modifizierten NK-92 Zellen ausgeschlossen werden. Weiterhin wurden therapeutische Effekte von NK-92-scFv(MOC31)-Zeta Zellen in einem Xenograftmodell in NOD-scid/scid Mäusen mit einer humanen EpCAM-positiven Tumorzelllinie untersucht. Hier wurde im Vergleich zur Kontrollgruppe durch Behandlung mit EpCAM-spezifischen NK-92 Zellen, unerwarteterweise aber auch mit NK-92-Mock Zellen, ein signifikant längeres Überleben der Tiere beobachtet. Nach der Ableitung CD138-spezifischer NK-92-scFv(B-B4)-Zeta Zellen wurde zwar eine hohe zytotoxische Aktivität gegen CD138-positive Zelllinien erhalten. Es war jedoch keine im Vergleich zu parentalen NK-92 Zellen weiter verstärkte Zytotoxizität nachweisbar. Als Ursache hierfür ist eine mangelnde Funktionalität des scFv-Antikörperfragments im Kontext des chimären Antigenrezeptors denkbar. Da die Bindungseigenschaften von scFv-Fragmenten entscheidend durch die Anordnung ihrer schweren und leichten Antikörperketten zueinander beeinflusst werden können, wurden NK-92 Zellen etabliert, die ein scFv-Fragment mit umgekehrter Orientierung der Antikörperketten in ihrem chimären Antigenrezeptor tragen. Diese werden derzeit im Rahmen einer externen Zusammenarbeit auf ihre Funktionalität hin überprüft. Zur Konstruktion gegen das Disialogangliosid GD2 gerichteter chimärer Antigenrezeptoren wurden parallel zwei scFv-Fragmente des Antikörpers ch14.18 eingesetzt, die sich in der Orientierung der schweren und leichten Antikörperketten zueinander unterscheiden. Mit den Antigenrezeptorkonstrukten modifizierte NK-92 Zellen zeigten eine im Vergleich zu parentalen NK-92 und NK-92-Mock Zellen stark erhöhte Zytotoxizität gegen GD2 exprimierende humane Tumorzelllinien. Dabei wurde weder bei der Expressionsdichte der chimären Antigenrezeptoren noch in der zytotoxischen Aktivität modifizierter NK-92 Zellen mit unterschiedlicher Anordnung der variablen Antikörperdomänen im scFv Antikörperfragment ein signifikanter Unterschied beobachtet. Mit der extrazellulären Domäne von CTLA-4 als Modellprotein wurde der mögliche Einsatz einer zu scFv-Antikörperfragmenten alternativen Antigenbindungsdomäne geprüft. CTLA-4 wird normalerweise auf T-Zellen exprimiert und bindet an CD80 bzw. CD86 auf APCs. CD80- und/oder CD86-positive Zielzellen wurden von NK-92-sCTLA-4-Zeta Zellen im Vergleich zu parentalen NK-92 Zellen spezifisch und mit hoher Effizienz lysiert. In Zytotoxizitätsassays wurde mit Hilfe einer sowohl gegen parentale als auch modifizierte NK-92 Zellen resistenten Tumorzelllinie gezeigt, dass allein die stabile Expression des CD86 Proteins in dieser Zelllinie ausreicht, um die Resistenz gegen NK-92-sCTLA-4-Zeta Zellen aufzuheben. Daraus kann geschlossen werden, dass grundsätzlich auch der Einsatz von zu scFv- Antikörperfragmenten alternativen Antigenbindungsdomänen eine spezifische Ausrichtung und effiziente Aktivierung von NK-92 Zellen gewährleistet. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die genetische Modifikation der Natürlichen Killerzelllinie NK-92 zur Ausrichtung auf Tumor-spezifische Zielstrukturen einen grundsätzlich geeigneten Ansatz zur Behandlung maligner Erkrankungen darstellt. Eine Weiterentwicklung Antigen-spezifischer NK-92 Derivate als mögliche Zelltherpeutika erscheint daher sinnvoll und vielversprechend.
In dieser Arbeit werden Monozyten mit Hilfe der Ficoll-Trennung und Positivanreicherung durch das MACS-Magnetsystem gewonnen und durch die Zytokine GM-CSF und Interleukin 4 stimuliert. Nach zwei Tagen weisen die Zellen eine veränderte Morphologie auf, adhärieren zum Teil an Plastik und zeigen sowohl in der adhärenten als auch der nonadhärenten Fraktion charakteristische Merkmale dendritischer Zellen: In der Mikroskopie längliche, fädige Zytoplasmaausläufer sowie in der Durchflusszytometrie das Erscheinen der Oberflächenmarker CD1a und CD40. Die Zellen sind zu diesem Zeitpunkt zu ca. 90% unreife dendritische Zellen, wie die fehlende Ausprägung des Reifemarkers CD83 zeigt. Als unreife dendritische Zellen sind sie somit geeignet für die Antigenaufnahme; zur weiteren Ausreifung ist die Zugabe anderer Zytokine, z.B TNF α, notwendig. Als Mediengrundlage eignen sich sowohl RPMI+FCS als auch X-Vivo 15 und X-Vivo 20, wobei X-Vivo 15 und X-Vivo 20 aufgrund ihrer immunologischen Vorteile RPMI vorzuziehen sind. Ausblick Insgesamt sind schon vielversprechende Wege aufgezeigt worden, dendritische Zellen für die Immuntherapie zu gewinnen, und zwar sowohl aus CD34+ Stammzellen als auch aus CD14+ Monozyten. Wichtig wäre an dieser Stelle ein genauer Vergleich zwischen aus Monozyten und aus CD34+ Vorläuferzellen generierten Zellen in der Laborpraxis. Zum einen sollte hier untersucht werden, aus welcher Ausgangszelle sich größere Mengen an dendritischen Zellen generieren lassen. Die genaue Ermittlung der Zellzahl an jedem Kulturtag wäre hier von Bedeutung. Zum anderen sollte auch die Funktionalität der jeweiligen Zellen, etwa in der mixed-lymphocte-reaction, analysiert und miteinander verglichen werden, und zwar vor und nach zusätzlicher Gabe von TNF alpha. Die Mediengrundlagen X-Vivo 15 und X-Vivo 20 haben sich als gute Alternativen zu dem herkömmlich verwendeten RPMI 1640 gezeigt. An dieser Stelle wäre noch eine vergleichende Analyse der beiden Medien wichtig, und zwar im Hinblick auf die oben genannte Fragestellung der Zellzahl, Ausprägung der Oberflächenmarker und Funktionalität .
Die Entwicklung neuer und die Adaption bestehender Methoden ist weiterhin eine der vordringlichsten Aufgaben der Forschung zur Bekämpfung der tödlichen Infektion mit dem HI-Virus. So wurde im ersten Teil dieser Arbeit untersucht, ob die Methode der Generierung MHC-unabhängiger Immunantworten gegen Oberflächenproteine, die bereits in der experimentellen Tumortherapie verwendet wird, für die HIV Therapie adaptiert werden kann. In dieser Arbeit war das HIV Hüllprotein Env das Zielmolekül. Der zweite Teil der Arbeit versucht, Erkenntnisse aus der HIV-Forschung für alternative Tumortherapieansätze am Beispiel des kutanen T-Zell Lymphoms zu verwenden. Der erste Teil beschäftigt sich mit der Verwendung des Hüllproteins Env von HIV als Zielstruktur für die Generierung MHC-unabhängiger Immunantworten gegen HIV-infizierte Zellen. Hierfür wurden CD4, 5-Helix sowie zwei Varianten von DC-SIGN als HIV Env-bindende Liganden als chimäre T Zell-Rezeptoren, zusammen mit Teilen von CD3 und CD28, in humanen Zellen exprimiert. Die Funktionalität der Konstrukte konnte gezeigt werden, ein therapeutischer Effekt in vitro war jedoch nicht nachweisbar. Der zweite Teil untersucht die Verwendung des HIV Hüllproteins als therapeutischem Gen zur Behandlung des kutanen T-Zell Lymphoms. Die Pseudotypisierung von MLV-basierenden Vektoren mit HIV Env ermöglicht das zielzellspezifische Eindringen der Vektoren in humane CD4-positive Zellen. Aus diesen Zellen besteht auch das kutane T Zell Lymphom (CTCL). MLV/HIV pseudotypisierte retrovirale Vektoren, die die 89.6P Variante des HIV Hüllproteins Env als therapeutisches Gen transportieren, wurden generiert und zunächst in vitro getestet. Das Wachstum von CTCL-Zellen konnte durch Zugabe dieser Vektorpartikel verhindert und die Zellzahl unter den Ausgangswert reduziert werden. Die Verwendung im Maus-Experiment zeigte einen vergleichbaren Erfolg wie die Verwendung der Herpes simplex Thymidinkinase, obwohl von syn Env nur etwa ein Viertel der Vektorpartikel appliziert wurde. Ein bystander-Effekt ließ sich damit also nachweisen. Die Verwendung chimärer T-Zell-Rezeptoren für MHC-unabhängige Immunantworten gegen HIV-Reservoirs im Körper ist ein vielversprechender Therapieansatz. Neben der Verwendung HIV Env-bindender zellulärer Proteine könnte das Spektrum möglicher Liganden durch die Verwendung Subtypen-übergreifender, nicht-inhibitorischer Antikörper, erweitert werden. Dies ist möglich, da für die Immunantwort lediglich die Bindung an das Hüllprotein notwendig ist. Zur Erhöhung des therapeutischen Effektes des retroviralen Gentransfers zur Therapie kutaner T-Zell Lymphome eignen sich hoch fusogene virale Hüllproteine, die auf diese Weise einen noch stärkeren bystander-Effekt ermöglichen. Die in dieser Arbeit beschriebenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieser sehr groß sein muss, solange replikationsinkompetente Vektoren verwendet werden.
Ausgangspunkt der Überlegungen war die Beobachtung, daß die Germanistik nach 1966/68 als „disziplinäre Einheit“ in die „Krise“ geriet. Erklärt werden kann dies mit dem Verlust ihrer bis dato unhinterfragten einheitsstiftenden Fundamente: Plötzlich wurden der Nationenbegriff, der bürgerliche Literaturbegriff und der Bildungsbegriff zur Zielscheibe der Kritik und Forderungen nach Aktualität oder gesellschaftlicher Relevanz bestimmten das Denken. Die „Dichtersterne“ und Geistesgrößen am „Bildungshimmel“, die die Götter abgelöst hatten, wurden entthront; die Hochsprache wurde als Machtinstrument enttarnt. Ob es sich bei der „Krise“ tatsächlich um eine „Krise“ handelt oder um einen „Segen“, hängt vom Betrachterstandpunkt ab. In dieser Hinsicht spaltete sich denn auch die disziplinäre Gemeinschaft in zwei Hälften. Lediglich die Lehrerbildung blieb als „Klammer“ für das Fach erhalten. Diese beiden „Hälften“ entfalteten in den letzten Jahrzehnten unterschiedliche Strategien, wie mit der Situation umzugehen sei: Stiegen die einen aus der Germanistik aus („Die Ratten verlassen das sinkende Schiff.“), versuchten die anderen das Schiff wieder flott zu bekommen, also der Germanistik wieder zu der gesellschaftlichen Bedeutung zu verhelfen, die ihr historisch und faktisch zusteht – als Wissenschaft von der deutschen Sprache, Literatur und Kultur – und dies gegen alle Widerstände. Zu diesen Widerständen gehört erstens ab Mitte der 60er Jahre die Szientifizierung1, die zwei Funktionen erfüllt: Sie verschafft wissenschaftliches Renommee (Professionalisierungsstrategie) für ein Fach bzw. dessen Teilfächer, die als soft sciences traditionell dem Vorwurf der Unwissenschaftlichkeit ausgesetzt sind – so v.a. die subjektiv operierende Literaturwissenschaft –, und sie demonstriert Distanz zur Politik bzw. Ideologiefreiheit. Zu diesen Widerständen gehört zweitens – wenn man den wissenschaftspolitischen Prognosen der Systemtheorie folgt – die subdisziplinäre Ausdifferenzierung, die quasi natürlich und unaufhaltsam von statten geht und zwei Folgen zeitigt: die Auflösung in Teildisziplinen und die Distanzierung von außerhalb des Wissenschaftssystems liegenden Funktionen und Leistungen. Auch das Nichtüberschreiten der (Wissenschafts-)Systemgrenze demonstriert Ideologiefreiheit. Gesellschaftliche Diskussionen („Zuwanderung“; „deutsche Leitkultur“ etc.) als außerhalb des Wissenschaftssystems liegend dürfen von der Germanistik nicht aufgegriffen werden – auch dies ist eine Frage des wissenschaftlichen Ansehens im Elfenbeinturme. Dabei verwandeln sich merkwürdigerweise Leistungen für das politische System (Sprachen-, Kultur- bzw. Bildungspolitik) zum schlechten, Leistungen für das ökonomische System oder das „Beschäftigungssystem“ zum guten Ton...
Glycin ist ein wichtiger inhibitorischer Neurotransmitter im zentralen Nervensystem. Um die glycinerge Erregungsübertragung zu sichern, muss die Glycinkonzentration an Synapsen präzise reguliert werden. Hierfür sind die Glycintransporter, GlyT1 und GlyT2, verantwortlich. Der GlyT2 ist ein präsynaptisches Protein, das in glycinergen Nervenendigungen nahe der aktiven Zone lokalisiert ist. Das über den Transporter aus dem extrazellulären Raum aufgenommene Glycin steht anschließend für die Befüllung der synaptischen Vesikel durch den vesikulären inhibitorischen Aminosäuretransporter (VIAAT) zur Verfügung. Die GlyT2-Defizienz führt in Mäusen zu einem letalen Phänotyp und verdeutlicht die Notwendigkeit eines hochaffinen Glycinaufnahmesystems in glycinergen Neuronen. Um mögliche Mechanismen zu untersuchen, die zur präzisen Lokalisation des GlyT2 in der Präsynapse führen, wurde das PDZ-Domänenbindungsmotiv (PDZ-DBM) am extremen C-Terminus bzw. die lange N-terminale Domäne dieses Transporters deletiert. Durch biochemische und pharmakologische Analysen von transfizierten HEKT-Zellen konnte gezeigt werden, dass der Verlust des PDZ-DBM oder der N-terminalen Domäne die Proteinexpression, die Glykosylierung und die Transportaktivität des GlyT2 nicht beeinflussten. Längere Deletionen des N-Terminus (ΔAA1-184) setzten jedoch die Effizienz der Glycinaufnahme herab und ergaben im Vergleich zum wt-Protein einen um 60% reduzierten vmax-Wert, während die apparente Glycinaffinität (KM-Wert) unverändert blieb. Lokalisationsstudien und Oberflächenbiotinylierungen zeigten GlyT2 wt-Immunreaktivität an der Plasmamembran, die sich qualitativ und quantitativ nicht von denen der N- und C-terminalen Mutanten unterschied. Das PDZDBM und die N-terminale Domäne spielen folglich in der Prozessierung und der Transportfunktion des GlyT2 eine untergeordnete Rolle. Möglicherweise reduziert die fast vollständige Deletion der N-terminalen Domäne jedoch die Stabilität des GlyT2. In transfizierten hippocampalen Neuronen wurde der Einfluss des PDZ-DBM und der N-terminalen Domäne hinsichtlich der GlyT2 Lokalisation analysiert. Die transfizierten Mutantenproteine zeigten eine diffuse Verteilung mit partiellen Anreicherungen von GlyT2-Immunreaktiviät. Das wt-Protein kolokalisierte mit Synaptophysin, exzitatorischen synaptischen Markern wie PSD95 und mit den inhibitorischen Markern Gephyrin und VIAAT. Nach Deletion des PDZ-DBM hingegen zeigte der GlyT2 eine um ca. 50% verminderte Kolokalisation mit allen untersuchten synaptischen Markern. Damit konnte hier erstmals eine Funktion des PDZ-DBM für die Anreicherung von GlyT2 an Synapsen gezeigt werden. Mit N-terminalen Deletionsmutanten transfizierte hippocampale Neurone wiesen kolokalisierende GlyT2ΔN-PSD95-Puncta zumeist in MAP2-positiven Neuriten auf, während das wt-Protein zumeist in MAP2-negativen Neuriten kolokalisierte. MAP2 ist ein mikrotubuli-assoziertes Protein, das in Dendriten, aber nicht in Axonen, auftritt und somit eine Unterscheidung derselben ermöglicht. Aufgrund der Überexpression in transfizierten Neuronen war die GlyT2-Immunreaktivität aber sowohl in axonalen als auch dendritischen Neuriten zu beobachten. Zusätzlich zu der in größeren Clustern gefundenen synaptischen GlyT2ΔN-Immunreaktivität war eine Färbung hauptsächlich in sehr kleinen Strukturen (<= 1 μm) nachzuweisen, die Transportvesikeln entsprechen könnten. Dies ist mit einem längeren Verbleib der Deletionsmutanten in intrazellulären Strukturen erklärbar. Im Hippocampus wird GlyT2 endogen nur sehr schwach in einer Subpopulation von putativ glycinergen Neuronen exprimiert. Um die Lokalisation der N-terminalen GlyT2-Proteine in Zellen zu untersuchen, die eine hohe endogene GlyT2-Expression aufweisen, wie spinalen Neuronen, die sich aber nur schlecht transfizieren lassen und in Kultur keine adulte GlyT2-Lokalisation aufweisen, wurden BAC-transgene Mäuse generiert, die myc-markierte GlyT2ΔN-Proteine unter Kontrolle des GlyT2-Promotors exprimieren. Der Vorteil von BAC-transgenen Mauslinien ist, dass sie aufgrund der Verwendung des endogenen Promotors das Transgen nur schwach überexprimieren. Founder-Mäuse, in denen der jeweilige modifizierte BAC-Klon (mGlyT2 wt, ΔAA14-174 oder ΔAA14-184) integriert wurde, wurden identifiziert und mit C57BL/6J-Mäusen verpaart, um so transgene Mauslinien zu etablieren und die Lokalisation der mutierten GlyT2-Proteine zu analysieren. Zusätzlich wurde eine BAC-transgene Cre-Mauslinie generiert, die die Cre-Rekombinase in GlyT2-positiven Zellen exprimiert. Durch die Verpaarung mit konditionalen oder transgenen Mauslinien soll mit diesen GlyT2/Cre-Mäusen die Funktion einzelner Genprodukte in glycinergen Zellen untersucht werden. In dieser Arbeit wurden außerdem die Glycinrezeptor (GlyR) α-Untereinheiten (UE) in GlyT2-defizienten Mäusen untersucht. GlyT2 -/- Tiere sterben in der zweiten postnatalen Woche nach der Geburt und zeigen einen starken neuromotorischen Phänotyp. Da in demselben Zeitraum ein Austausch der embryonalen α2- durch die adulte α1-UE erfolgt, wurde die Entwicklung der α1- und der Gesamt-α- Immunreaktivität in Rückenmarksschnitten von wt und GlyT2 -/- Tieren analysiert und miteinander verglichen. Die Daten zeigen, dass der α-UE-Austausch in den GlyT2-defizienten Tieren ähnlich wie in wt Tieren erfolgt. In α1-GlyRs ist die Öffnungszeit des aktivierten Kanals kürzer als bei α2-GlyRs. Zusammen mit der geringeren Ausschüttung an Glycin aufgrund der GlyT2-Defizienz lässt sich so das Auftreten des Krampf-Phänotyps der GlyT2 -/- Mäuse nach erfolgtem UE-Austausch erklären.
Das hauptsächliche Interesse der vorliegenden Arbeit bestand darin, die wechselseitigen Wahrnehmungen und Bewertungen von griechischen und türkischen Migranten der zweiten Generation in Deutschland – im Hintergrund des so genannten ‚griechisch-türkischen Konfliktes’ - auch unter Berücksichtigung eines Vorurteilskonzeptes - zu erforschen. Hierbei ging es weniger darum, nach möglichen Konfliktlösungen für die bestehenden Konflikte zu suchen. Vielmehr sollten die Innenansichten der Befragten zu unterschiedlichen Themengebieten ergründet und vorgestellt werden, insbesondere den gegenseitigen Wahrnehmungen und möglicherweise vorurteilsbehafteten Einstellungen galt hier das besondere Interesse. Dabei bestand die Intention darin, eine stärker integrierte Vorurteilsforschung im Rahmen der Migrationsforschung zu erzielen. Die vorliegende Arbeit zielte ferner in ihrer Anlage nicht auf jene, auf der Ebene von Großgruppen und Milieus angesiedelten, kollektiven Orientierungen ab. Es ging vielmehr um die Darstellung von Innenansichten von ‚Subjekten’, von den einzelnen Trägern der jeweiligen Kollektive sowie ihre Ansichten und Einstellungen voneinander. Es war interessant herauszuarbeiten, dass scheinbar, trotz der nicht persönlich erlebten Konflikte, doch ein nicht unbeachtliches Konfliktpotential im Denken der Angehörigen beider Konfliktparteien vorhanden war, auch wenn von einer offenen Konfliktaustragung bewusst und vehement Abstand genommen wurde. Insofern kann in jedem Falle ein so genannter ‚Konflikt-Import’ – das Wissen um die Konflikte und Vorurteile und teilweise die Verinnerlichung dieser – bejaht werden. Konflikte sind latent vorhanden, sind aber glücklicherweise weit davon entfernt, in manifeste Konflikte umzukehren oder auszuarten. Erfreulich war vielmehr die gegenteilige Beobachtung: trotz des Konfliktpotentials in Form von Konfliktwissen, gab es die Tendenz der zunehmenden freundschaftlichen Begegnungen. Denn angesichts der Tatsache, das Europa auch in der Zukunft weiter zusammenwachsen wird, sind insbesondere individuelle Kontakte zwischen Jugendlichen beider Nationen eine wichtige Voraussetzung für ein friedliches Zusammenleben, da gerade sie künftig die Situation sowohl in Deutschland als auch in ihren Herkunftsländern bestimmen werden. Denn eben individuelle, persönliche Kontakte ermöglichen günstige Voraussetzungen für gesellschaftliche und kulturelle Entwicklungen und Förderungen der Zukunft und tragen zur Bildung einer möglichen ‚gemeinsamen’ Kultur in der Diaspora bei. Die Ergebnisse der qualitativen Befragungen haben vor Augen geführt, dass im Hinblick auf interethnische Beziehungen in jedem Falle noch Forschungsdefizite in der Migrationsforschung vorhanden sind. Ebenso sei vorwegzunehmen, dass die vorliegende Arbeit weniger von repräsentativem als vielmehr von exemplarischen Charakter ist. Dies sollte bezwecken, dass die Ergebnisse dieser Arbeit in weiteren Untersuchungen validiert werden sollten, um auf diese Weise eine größere Reichweite zu erzielen....
In der hier vorliegenden Arbeit wurden Fragen der atomaren Korrelation sowie Verschränkung untersucht und ein Beobachtungsfenster geöffnet, durch welches es möglich ist, Einblick in die Grundzustandswellenfunktion von Helium zu erhalten. Der Elektronentransfer (Pq++He->P(q-1)++He+) in schnellen Ion-Atom-Stößen findet im Bereich des Überlapps der Wellenfunktionen des gebundenen Anfangs- und Endzustandes statt [JOpp28a, MMcD70]. Daher kann diese Reaktion besonders selektiv an der Grundzustandswellenfunktion angreifen. Die bei der Transferionisation (Pq++He->P(q-1)++He2++e-) zusätzlich stattfindende Ionisation involviert auch das zweite Elektron. Dadurch ist es möglich die komplexe Vielteilchendynamik zu untersuchen und wie später in dieser Arbeit gezeigt wird, unter bestimmten Bedingungen auch sensitiv auf die Anfangszustandskorrelation zu sein! Die Messungen wurden mit H+-, He+- und He2+-Projektilen bei Einschussenergien von 40 - 630 keV/u (1,25 < vP < 5,02 a. u.) durchgeführt. Durch den Elektronentransferprozess wird auch die Vermessung des Endzustandes, den Impulsen, aller drei Teilchen (Projektil, Elektron und He2+-Rückstoßion) erleichtert. Durch das umgeladene, dann neutrale, Projektil werden zusätzlich die Post-Collision-Effekte minimiert. Zur experimentellen Untersuchung kommt die seit Jahren etablierte Technologie des Reaktionsmikroskops (COLTRIMS, COLd Target Recoil Ion Momentum Spectroscopy) zum Einsatz [HSch89, RDoe00a, JUll03], die sich durch eine 4¼-Impulsakzeptanz für alle emittierten Teilchen auszeichnet. Nach Kreuzung der Projektilionen mit einem kalten und wohl lokalisierten Gasstrahl werden die umgeladenen Projektile detektiert. Die im Überlappbereich entstehenden Elektronen und Ionen werden mittels elektrischer und magnetischer Felder ebenfalls auf orts- und zeitauflösenden Detektoren projiziert. Anhand des Auftreffortes und der Flugzeit können die dreidimensionalen Impulsvektoren eindeutig rekonstruiert werden. Je nach Energie Projektile dominieren unterschiedliche atomare Reaktionsmechanismen. Entsprechend sind es zwei Fragenkomplexe, denen sich diese Arbeit hauptsächlich widmet: - Was ist die Reaktionsdynamik? Welche Mechanismen tragen zur Reaktion bei und wie hängen diese von Projektilladung und -energie ab? - Lässt sich die Grundzustandswellenfkt. mit dieser Technik abbilden? Die erzielten Ergebnisse sehen wie folgt aus: - Im Bereich langsamer Stöße (vP <= vB;e) wird der Stoßprozess in einem quasimolekularen Bild beschrieben (Sattelpunktionisation). Hier konnten im Wesentlichen die experimentellen Ergebnisse von Schmidt zum symmetrischen Stoßsystems He2+/He [LSch00] bestätigt und zu höheren Projektilgeschwindigkeiten fortgeschrieben werden (60 keV/u). Für die Stoßsysteme He+/He und H+/He wurden sehr ähnliche Emissionsstrukturen im Impulsraum gefunden. - Bei allen untersuchten Projektilenergien und Stoßsystemen wurde eine vom Elektroneneinfang unabhängige Stoßionisation durch Wechselwirkung mit dem Projektil (Binary Encounter, BE) gefunden. Die Erwartung, dass der Targetkern nur Beobachter der Ionisation ist, wurden eindeutig widerlegt und die Abweichungen als Folge von Korrelationseffekten gedeutet. - Speziell für das Stoßsystem He+/He bei 60 keV/u wurden sehr viele im Geschwindigkeitsraum um vP verteilte Elektronen beobachtet und einem Dreistufenprozess zugeschrieben: Zuerst erfolgt die Ionisation des Projektils und anschließend ein resonanter Zweielektroneneinfang. - Wird ein Elektron sehr schnell entfernt, wie durch den Elektroneneinfang bei hohen Projektilgeschwindigkeiten (vP ¸ 3 a. u.) findet die Ionisation sehr häufig durch Shake-off [TAbe67] statt. Die Elektronen wurden entgegen der Strahlrichtung emittiert, zu negativen Longitudinalimpulsen. Darüberhinaus wurde kein Unterschied zwischen den verschiedenen Projektilen beobachtet. Da für den Shake-off-Prozess unter den hier realisierten Bedingungen das Projektil nicht mit dem emittierten Elektron wechselwirkte, spiegelt die Elektronenimpulsverteilung direkt den, durch den Elektroneneinfang präparierten Anteil, der Grundzustandswellenfunktion wider [AGod04, MSch05]. Theoretische Rechnungen bestätigen, dass die rückwärtige Elektronenemission nur durch die stark korrelierten nicht-s2-Anteile im Heliumgrundzustand zu erklären ist. Diese Beimischungen höherer Drehimpulse von weniger als 2 % konnten entgegen der verbreiteten Lehrmeinung zum ersten Mal experimentell nachgewiesen und vermessen werden.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Insektenzellen /Baculovirus-System für die heterologe Expression der NTPDase6 etabliert. Nach der Herstellung und Selektion des NTPDase6-positiven Baculovirus wurden drei Insektenzelllinien hinsichtlich der optimalen Expressions-bedingungen für die NTPDase6 analysiert. In Sf9(+Serum)-, Sf9(-Serum)- und High FiveTM-Zellen wurde eine Expression und Sekretion des aktiven Enzyms nachgewiesen. Ferner konnte durch die Analyse mit PNGaseF eine partielle N-Glykosilierung experimentell gezeigt werden. Die Aktivität im Kulturüberstand übertraf generell die Aktivität in der löslichen Zellfraktion. Die höchste GDPase-Aktivität war mit 22,96 nmol Pi /(106 Zellen x min) nach 6 Tagen im Kulturüberstand der SF9(-Serum)-Zellen zu verzeichnen. Nachdem die Erntequelle sowie der Erntezeitpunkt feststanden, wurden in den folgenden Experimenten verschiedene chromatographische Verfahren für eine Reinigung der NTPDase6 analysiert. Eine Bindung der NTPDase6 konnte für die Chromatographie mit Con A-Sepharose 4B, Q Sepharose Fast Flow, Reactive Red 120-Agarose, Reactive Green 19-Agarose, Cibacron Blue 3GA-Agarose und die Reactive Brown 10-Agarose verzeichnet werden. Hingegen wurde eine nur partielle Bindung der NTPDase6 für die Reactive Yellow 86-Agarose, Reactive Blue 4-Agarose und die Ni2+-NTA-Agarose nachgewiesen. Nicht oder kaum NTPDase6-bindend waren die CM Cellulose, GDP-Agarose, Protino Ni-TED und BD TALON. Ebenfalls analysiert wurde die Größenausschluss-Chromatographie mit Sephacryl S-100 HR unter verschiedenen Bedingungen. Für das finale Reinigungsschema wurde die Con A-Sepharose 4B-Chromato-graphie aufgrund der geringen Kosten und des großen Volumens als erster Reinigungsschritt eingesetzt. Als zweite Phase der sequentiellen Reinigung wurde die Cibacron Blue 3GA-Agarose ausgewählt, da in der Pilotstudie über die Reaktivfarbstoffe mit diesem Material die höchste Elution der GDPase-Aktivität beobachtet werden konnte. Für den dritten Schritt wurde aufgrund der hohen Trennschärfe die Ni2+-NTA-Agarose verwendet. Insgesamt wurde mit diesen drei Schritten eine 180 fache, partielle Reinigung der NTPDase6 erreicht. Es erwies sich, dass die erhaltene Proteinmenge für die geplanten Röntgenstrukturanalyse und die Elektronenspin-Resonanz-Spektroskopie nicht ausreichte. Als weitere Möglichkeit für die Untersuchung des angereicherten Enzyms stand die MALDI-TOF-Analyse zur Verfügung. In diesen Untersuchungen wurde die Aminosäuresequenz zu 43,9 % verifiziert und es ergaben sich Hinweise darauf, dass die potenzielle N256-Glykosilierungssstelle bei der heterologen Expression in Insektenzellen nicht genutzt wird. Weiterhin wurden die potenziellen N-terminale Signalpeptide und Spaltstellen der NTPDase6 in silico mit Hilfe des SignalP 3.0-Algorithmus analysiert. Diese Untersuchungen ergaben putative Spaltstellen an den Aminosäurepositionen L25 und A40 mit einer Wahrscheinlichkeit von 37 % und 7 %. Mit Triton X-114-Separationen wurde ferner nachgewiesen, dass 60,7 % der NTPDase6 in der Zelle in löslicher Form und 39,3 % in membrangebundener Form vorliegen. Die hier erbrachten Nachweise einer putativen N-terminalen Spaltstelle und der intrazellulären Spaltung des hydrophoben Signalpeptides deuten darauf hin, dass es sich bei der Sekretion des Proteins um einen physiologischen Vorgang handelt. Es ist wahrscheinlich, dass die gleichzeitige Lokalisation des Enzyms im Golgi-Apparat und im Kulturüberstand einen physiologisch relevanten Mechanismus darstellt und das Enzym extra- sowie intra-zellulär für die Hydrolyse von 5’-Nukleosid-Diphosphaten verantwortlich ist. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Lokalisation der NTPDase6 in vivo untersucht. Dazu wurden NTPDase6-Antikörper hergestellt und mit Hilfe von Immunoblots sowie in der Immunzytologie charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die NTPDase6-Antikörper nur in der Immunzytologie verwendet werden können. Zur Untersuchung der zellspezifischen Expression der NTDPase6 wurden anschließend immunhistologische Analysen am adulten Rattengehirn durchgeführt. Markierte Zellen präsentierten sich z.B. im gesamten Kortex des Gehirns, im Gyrus dentatus des Hippokampus, im Corpus striatum und im Septum. Die markierten Zellen zeigten eine organelläre Fluoreszenz im Bereich des Zellkerns, die eine Markierung von Golgi-Stapeln vermuten lässt. Nur in Zellen mit einem großen Nukleus, bei welchen es sich um große Nervenzellen handeln dürfte, konnte die beschriebene Fluoreszenz nachgewiesen werden. Diese Markierungen als NTPDase6-spezifisch zu beurteilen ist jedoch schwierig, da die Präimmunkontrollen eine schwache, organelläre Fluoreszenz im Bereich des Zellkerns von Zellen mit einem großen Nukleus aufwiesen. Insgesammt liefern die Untersuchungen einen neuen Beitrag zum Verständnis der Struktur und der Prozessierung der NTPDase6 sowie ein Verfahren zur heterologen Expression und zur anschließenden partiellen Aufreinigung des Enzyms.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Strahllagemonitor entwickelt, der nur aufgrund der Signale aus den HOM-Dämpfern einer Linearbeschleunigerstruktur die Strahllage mit hoher Genauigkeit bestimmen kann. Ein solcher Monitor hat gegenüber anderen Konzepten einige einzigartige Vorteile. Der HOM-Dämpfer-Strahllagemonitor benötigt keine zusätzlichen Einbauten im Strahlrohr oder der Beschleunigerstruktur. Daher wird keine zusätzliche Länge benötigt. Auch wird eine zusätzliche Emittanzerhöhung durch zusätzliche Impedanzen der Einbauten vermieden. Beide Punkte sind wichtig für den Betrieb eines linearen Kolliders. Ein zweiter Vorteil ist die Messung der Strahllage bezüglich der elektrischen Achse der verwendeten Dipolmode. Wenn als Dipolmode die höhere Mode mit dem störendsten Einfluß auf den Strahl verwendet wird, verfährt die Positionsregelung der Struktur diese automatisch auf die Position, an der der Einfluß dieser Mode minimal ist. Da die anderen Dipolmoden ähnliche Feldgeometrien haben, ist anzunehmen, das ihr Einfluß damit auch weitestgehend minimiert wird. Zur eindeutigen Bestimmung der Strahlposition in der Ebene wurde ein Verfahren entwickelt, daß die Amplituden und die Startphasendifferenz zwischen einer Dipolmode und einer höheren Monopolmode ausnutzt. Durch passende Wahl der Hohlleitergeometrie kann eine monopolartigen Mode in den Dämpferzellen etabliert werden, die das nötige Monopolsignal liefert und in der Frequenz mit der Dipolmode übereinstimmt. Diese Mode vereinfacht erheblich die entwickelte Signalverarbeitungsschaltung. Die Shuntimpedanz dieser Mode wird durch die Geometrie der Hohlleiter bestimmt und kann so eingestellt werden, daß sie für den Betrieb des Strahllagemonitors ausreicht, aber den Strahl noch nicht nennenswert beeinflußt. Durch die Verwendung einer strahlinduzierten Monopolmode als Phasenreferenz ist der Monitor unabhängig von externen Referenzsignalen und funktioniert ohne eingeschaltete Beschleunigungshochfrequenz oder bei falscher Phasenlage des Strahls. Dies ermöglicht es, die Beschleunigerstrukturen auch dann genau zu justieren, wenn der restlichte Beschleuniger noch nicht richtig eingestellt ist oder wenn zu Wartungszwecken einzelne Sektionen während des Betriebs nicht mit Hochfrequenz versorgt werden. Um die Eignung des vorhandenen SBLC-HOM-Dämpfers als Strahllagemonitor zu überprüfen wurden dreidimensionale numerische Feldberechnungen im Frequenz- und Zeitbereich und Messungen an der Dämpferzelle durchgeführt. Für die Messungen ohne Strahl wurde ein Strahlsimulator konstruiert und aufgebaut, der computergesteuerte Messungen mit variablen Ablagen des simulierten Strahls mit einer Auflösung von 1,23 μm erlaubt. Da die vollständige 6 m lange, 180-zellige Beschleunigerstruktur nicht für Messungen zur Verfügung stand und sich auch mit den verfügbaren Computern nicht dreidimensional simulieren ließ, wurde ein eindimensionales ersatzkreisbasiertes Modell des Vielzellers untersucht. Das Ersatzbild aus 879 konzentrierten Bauelementen berücksichtigt die Verstimmung von Zelle zu Zelle, die Zellenverluste, die Dämpferverluste und die Strahlanregung in Abhängigkeit von der Ablage. An dem Ersatzkreis lassen sich die gefangenen Moden und die Wirkung der Dämpfer beobachten. Es liefert bei der Simulation im Zeitbereich als Ergebnis Signale, die verwendet wurden, um die Funktion der Signalverarbeitungsschaltung an der vollständigen Beschleunigerstruktur zu untersuchen. Das eindimensionale Modell hat jedoch auch einige Einschränkungen. Es berücksichtigt nicht die Änderung der Randbedingungen in den Einzelzellen in Abhängigkeit vom Phasenvorschub. Auch beschränkt sich die Simulation auf einen kleinen Teil des durch den Strahl angeregten Frequenzbereiches. Es ist nicht auszuschließen, daß andere Frequenzen die Signalverarbeitungsschalung negativ beeinflussen. Ebenfalls unberücksichtigt bleibt der Einfluß der von Sendeklystron eingespeisten Hochfrequenzleistung. Um diese Einflüsse zu untersuchen wäre es erforderlich, Messungen am realen 180-Zeller mit Strahl und Klystron durchführen zu können. Die vorgenommenen Messungen am Einzeller zeigen, daß das Meßprinzip funktioniert, der vorhandene HOM-Dämpfer als Strahllagemonitor verwendbar ist und die entwickelte Signalverarbeitungsschaltung geeignet ist genaue Positionsinformationen zu liefern. Abgesehen von den ober angesprochenen Einschränkungen bestätigen die Simulationen des 180-Zellers die Übertragbarkeit der Ergebnisse auf Vielzeller. Die Messungen und Simulationen lassen eine Auflösung des fertigen Strahllagemonitors am 180-Zeller in der Größenordnung 1–10 μm und eine relative Genauigkeit kleiner 6,2 % erwarten. Es hat sich gezeigt, daß zur Erzielung hohe Genauigkeit zwei Komponenten des Strahllagemonitors besondere Aufmerksamkeit zu schenken ist. Zum einen muß der HOM-Dämpfer mit den paarweisen Auskoppelstellen präzise, mit guter Symmetrie gefertigt sein. Zum anderen hat der 180°-Hybrid am Eingang der Signalverarbeitungsschaltung großen Einfluß auf die erzielbare Genauigkeit. Beide Komponenten sind wichtig, um die monopol- und dipolartigen Komponenten aus dem ausgekoppelten Signalgemisch sauber voneinander trennen zu können. Wie die Messungen zeigten, ist ein schmalbandiger, auf die verwendete Meßfrequenz spezialisierter, selbst gefertigter Ringhybrid für diese Aufgabe erheblich besser geeignet als ein kommerziell erhältlicher Breitbandhybrid. Bei dem Ringhybrid gibt es jedoch auch noch Verbesserungsmöglichkeiten. Der Ringhybrid wurde präzise gefertigt. Er hat jedoch keine Abgleichmöglichkeit. Eine Korrekturmöglichkeit der Amplitude und Phase an den Eingängen könnte die Auflösung und Genauigkeit noch etwas steigern. Wenn bei der Simulation ein idealer 180°-Hybrid angenommen wird verschwindet ein Großteil des Fehlers. Der nächste Schritt bei der Weiterentwicklung der Signalverarbeitung könnte darin bestehen, die zur Zeit noch getrennt aufgebauten Hochfrequenzkomponenten auf einer gemeinsamen Platine zu integrieren. Zusammen mit dem Mikroprozessorsystem auf einer zweiten Platine entsteht so ein kompaktes System, daß sich preisgünstig in der für einen linearen Kollider erforderlichen großen Stückzahl fertigen läßt.
Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese und der Einkristallzüchtung der beiden Spin-Leiter-Verbindungen SrCu203 und Sr2Cu3O5 unter hohem Druck. Zunächst wird in einer Reihe von Versuchen ein geeignetes Tiegelmaterial ermittelt. Dabei stellen sich eine Doppeltiegelkonstuktion mit einem einkristallinen Magnesiumoxid-Innentiegel und einem verschweißbaren äußeren Platintiegel als beste Materialkombination heraus. Die Standzeit eines Versuchs lässt sich hiermit von den in der Literatur üblichen 30 Minuten um das 50 bis 100-fache verlängern. Durch Verwendung dieser Tiegelkombination können erstmals Züchtungsexperimente von SrCu203 und Sr2Cu305 aus der Schmelze erfolgreich durchgeführt werden. Für beide Zusammensetzungen konnten Kristalle mit Kantenlängen bis zu 2 mm hergestellt werden. Die besten Wachstumsbedingungen für SrCu203 liegen zwischen 3 und 5 GPa und zwischen 1400°C und etwa 1200°C. Diese Bedingungen wurden für stöchiometrische und auf etwa 70% Cu0 erhöhte Einwaagenzusammensetzungen ermittelt. Für Sr2Cu305 gelten ähnliche Züchtungsparameter. Durch die Züchtungsexperimente wurden neue Phasen, wie eine unbekannte Modifikation von Sr2Cu305 und eine nicht näher identifizierte ,243'-Phase gefunden. Das Auftreten der Fremdphase Sr2Cu02(C03) war zunächst überraschend und klärte sich durch den Herstellungsprozess der MgO-Einkristalle auf. Der Einbau des aus dem Tiegel stammenden gelösten Magnesiums wird in der die Cu203-Schichten trennenden Strontiumschicht erwartet. Damit erlangt es keine Wirkung auf die Spin-Leiter-typischen Effekte. Durch zahlreiche Messungen mit wellenlängendispersiver Röntgenanalyse am Rasterelektronenmikroskop wurden die maßgeblichen Reaktionswege aufgeklärt und die besten Wachtumsbedingungen sowie die Fremdphasenreaktionen ermittelt. Die Ergebnisse der Raman- und IR-Spektroskopie bestätigen das Auftreten der Struktur- beziehungsweise verbindungstypischen 2-Magnonen- und 2-Magnonplus-Phonon-Quasiteilchen. Durch Polarisationsmikroskopie und optische Transmissionsuntersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass es sich bei den Proben um Einkristalle handelt. Die thermische Ausdehnung zeigt eine deutliche Anisotropie. Die Achsen in a- und b-Richtung besitzen niedrige und von der C-Richtung deutliche verschiedene lineare Ausdehnungskoeffizienten.
In allen bislang durchgeführten Experimenten zur Mutagenese von embryonalen Stammzellen war auffällig, dass Gene, die für sekretierte oder membranständige Proteine kodieren, stark unterrepräsentiert waren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Genfallen untersucht, die speziell diese Gene mutieren sollten. Als Selektionskassetten tragen beide Genfallen den 5' Bereich des humanen CD2, der eine kryptische Spleißakzeptorsequenz enthält und für eine Transmembrandomäne kodiert, als Fusion mit der bakteriellen Neomycinphosphotransferase. U3Ceo trägt diese Kassette als klassische retrovirale Genfalle im LTR des Mouse Molony Leukemia Virus, wogegen die ebenfalls retrovirale FlipRosaCeo Genfalle die Selektionskassette im Viruskörper enthält. Diese wird von Rekombinaseerkennungssequenzen flankiert, welche eine konditionale Aktivierung der Mutation für die spätere Analyse in einem Mausmodell ermöglichen. Beide Genfallen zeigten mit ca. 80% aller Integrationen eine hohe Spezifität für Gene, die für sezernierte und membranständige Proteine kodieren. Allerdings war die Frequenz für Insertionen in sogenannte „hot spots“ bei beiden Genfallen aufgrund der geringeren Zahl an Zielgenen höher als bei anderen im GGTC verwendeten Genfallen (z.B. FlipRosabetageo). Innerhalb dieser „hot spots“ zeigte sich die bekannte Präferenz retroviraler Genfallenvektoren, in das 5’ Ende von Genen zu integrieren, wobei hier meist die größten Introns zu finden sind. Ebenso zeigte sich für die in dieser Arbeit untersuchten sekretorischen Genfallen genau wie bei anderen bekannten Genfallen eine bevorzugte Integration in Chromosomen mit einer hohen Gendichte. Die Funktionalität der konditionalen Genfalle konnte in vitro sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten durch Einbringen der Genfalle und der jeweiligen Rekombinasen bestätigt werden. In ES Zellen, die eine X-chomosomale Integration aufwiesen, wurde der Mechanismus durch transiente Expression der Rekombinasen in Klonen überprüft. Hierbei stellte sich heraus, dass das Wildtyptranskript eines mutierten Gens nach der einmaligen Rekombination der FlipRosaCeo wieder exprimiert wird und nicht durch die auf dem Gegenstrang befindliche Genfalle beeinflusst wird. Nach einer weiteren Rekombination mittels FLPe konnte der mutagene Ausgangszustand der Genfalle wieder hergestellt werden. Die Mutagenität der beiden Genfallen wurde durch Überprüfung der Konzentration der restlichen endogenen Transkripts der mutierten Gene per quantitativer PCR an X-chromosomalen Klonen analysiert. Hier konnte bei etwa 80% der untersuchten Klone eine sehr starke Mutation des jeweils getroffenen Gens festgestellt werden. Zur in vivo Überprüfung der U3Ceo Genfalle wurde ein Mausmodell durch Blastozysteninjektion des ES Zellklons M076C04 generiert. Die Integration der Genfalle in das erste Intron des Gens C030019F02Rik sollte eine deutliche Verkürzung des membranständigen Genproduktes bewirken. In Gehirnen von homozygoten Mäusen konnte die Expression des Wildtyptranskripts nicht mehr festgestellt werden, so dass diese Mauslinie eine Nullmutation des Gens trägt. Die in dieser Arbeit untersuchte KO Maus zeigte bisher keinen feststellbaren Phänotyp, obwohl das Genprodukt in vielen Spezies hoch konserviert vorliegt und auch nur in bestimmten Bereichen im Organismus nachweisbar ist, so dass eine wichtige Funktion des Proteins anzunehmen ist. Eine weitere Analyse dieser Mauslinie wird sich dieser Arbeit anschließen.