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PPARs gehören wie die Steroidhormon-Rezeptoren (z. B.Glucocorticoid-, Estrogen- oder Testosteron-Rezeptoren) zur Superfamilie der nukleären Rezeptoren. Es existieren drei PPAR-Subtypen, die als PPARalpha, PPARbeta/delta und PPARgamma bezeichnet werden und von drei verschiedenen Genen kodiert werden. Fibrate sind PPARalpha-Agonisten, welche die Plasma-Triglyceridspiegel reduzieren und gleichzeitig eine moderate Steigerung des HDL-Cholesterols bewirken. Thiazolidindione (Glitazone) sind PPARgamma-Agonisten, die bei Typ-2-Diabetes-mellitus indiziert sind und als Insulinsensitizer wirken. Duale PPARalpha/gamma-Agonisten stellen eine neue Klasse von Arzneistoffen dar, die zukünftig zur Behandlung von Typ-2-Diabetikern mit gestörtem Lipidprofil eingesetzt werden könnten. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde eine Leitstrukturoptimierung des selektiven PPARalpha-Agonisten Pirinixinsäure (WY 14643) durchgeführt. Die pharmakologische In-vitro-Charakterisierung der Substanzen erfolgte mit Hilfe subtypspezifischer Reportergen-Assays. Zusätzlich wurde gezeigt130, dass Chinolinderivate der Pirinixinsäure 5-LOX-inhibierende Eigenschaften in polymorphnukleären Leukozyten zeigen. Zunächst wurde eine geeignete Synthesestrategie zur Darstellung von Pirinixinsäurederivaten etabliert, was zur Charakterisierung und Identifizierung einer Serie von potenten dualen PPARalpha/gamma-Agonisten und 5-LOX-Inhibitoren führte. Die Synthesestrategie zur Darstellung von sowohl im Arylamino-Bereich (W) als auch in alpha- Position (R) modifizierten Derivaten der Pirinixinsäure bestand in einer vierstufigen Reaktionsfolge (I–IV; siehe Abb.). ... Die PPAR-Modulatoren (Carbonsäuren) 4, 8, 14, 32–38, 41 und 42 wurden in-vitropharmakologisch unter Anwendung subtypselektiver Reportergen-Assays (hPPARalpha, beta, gamma) charakterisiert. Die 5-LOX-Modulatoren (Carbonsäureester) 3, 7, 8, 13, 14, 24–29, 31–42 und 50 wurden in-vitro-pharmakologisch unter Anwendung des 5-LOX-Standardassays in intakten PMNL (polymorphnukleäre neutrophile Leukozyten) evaluiert. Die vorliegende Untersuchung deckte auf, dass der Ersatz des 2,3-Dimethylanilin-Strukturelements der Pirinixinsäure durch 6-Aminochinolin zu einem Gesamtverlust des PPARalpha/gamma-Agonismus führt. Durch Strukturmodifikationen im Arylamino-Bereich der Leitstruktur WY 14643 mit für 5-LOX-Non-Redoxinhibitoren typischen Pharmakophorresten, Tetrahydropyran-4-yl (Substanzen 13–14) und Methoxychinolin-2-yl (Substanz 43), konnte eine signifikante Steigerung des 5-LOX-inhibitorischen Potenzials erzielt werden [IC50 7 mikro M (13) bzw. 4 mikro M (43)]. Die alpha-alkylsubstituierten Carbonsäurederivate 33–38 zeigten sowohl am hPPARalpha als auch am hPPARgamma eine mit der aliphatischen Kettenlänge steigende Potenz. Am hPPARalpha erwiesen sich das alpha-Hexyl-Derivat 35 und das alpha-Butyl-Derivat 34 mit EC50-Werten von 1,9 mikro M (35) bzw. 11,5 mikro M (34) entsprechend einer Steigerung der Aktivität gegenüber WY 14643 um den Faktor 20 (35) bzw. den Faktor 4 (34) als besonders potent. Im Falle des hPPARgamma zeigten ebenso das alpha-butylsubstituierte Derivat 34 und der alpha-hexylsubstituierte Ligand 35 die höchste Aktivität mit EC50-Werten von 8,7 mikro M (34) bzw. 5,8 mikro M (35) und einer Steigerung der Aktivität gegenüber WY 14643 von Faktor 6 (35) bzw. Faktor 9 (34). Die Einführung von alpha-Alkylsubstituenten in das Grundgerüst der Pirinixinsäure führt möglicherweise zum Besetzen der linken proximalen Bindungstasche und somit zu einer im Vergleich zur Leitstruktur WY14643 stärkeren Bindung in die Ligandenbindungstasche des Rezeptors. Die Besetzung dieser proximalen Bindungstasche entscheidet jedoch nicht über die PPAR-Selektivität, da diese sowohl von hPPARalpha- als auch von hPPARgamma-Agonisten belegt wird. PPARalpha/gamma-Selektivität kann zum einen durch das Besetzen der linken bzw. rechten distalen Bindungstasche erzielt werden, zum anderen durch die Auswahl verschiedener acider Kopfgruppen. Aufgrund unterschiedlicher Aminosäuresequenzen der Bindungstaschen der einzelnen PPAR-Subtypen ergibt sich für die Kopfgruppen der PPAR-Modulatoren im hPPARalpha und hPPARgamma eine durch den sterischen Einfluss von Carboxyl- bzw. TZD-Kopfgruppen verursachtes unterschiedliches Wasserstoffbrückennetzwerk. Im Vergleich mit Pirinixinsäure konnte nur durch die Einführung der größeren Alkylketten (n-Butyloder n-Hexyl) ein stark erhöhter dualer PPARalpha/gamma-Agonismus erreicht werden. Die Substitution des sekundären Amins der Chinolin-6-ylverbindungen durch einen Ether-Sauerstoff in den Substanzen 41 und 42 sowie die Einführung eines Linkers, genauer einer Methylengruppe, zwischen dem Chinolin-6-ylrest und dem Scaffold (Derivate 29 und 36), führt zu einer verminderten Aktivität sowohl an hPPARalpha als auch an hPPARgamma. Eine mögliche Erklärung hierfür könnte sein, dass an entsprechender Position der Liganden-Bindungstasche eine Wasserstoffbrücken-Akzeptor-Position vorhanden ist, welche zur Erhöhung der Affinität beiträgt. Offensichtlich wird, durch die Ausbildung einer Wasserstoffbrücke zwischen der NH-Funktion und einem Wasserstoffbrücken-Akzeptor innerhalb der LBP im Falle von WY 14643 ein hoher Bindungsbeitrag erreicht. Daten bezüglich der Inhibierung der 5-Lipoxygenase demonstrieren, dass 6-Aminochinolinderivate potente 5-LOX-Inhibitoren sind. Die Einführung eines 3,5-Bis-(2,2,2-trifluor-ethoxy)-phenylrestes in 6-Position des alpha-hexylsubstituierten Scaffolds führt zu Ligand 38. Dieser ist ein potenter dualer PPARalpha/gamma-Agonist mit einem EC50-Wert von 11 mikro M an hPPARalpha bzw. 7,7 mikro M an hPPARgamma und ein stark wirksamer 5-LOX-Inhibitor mit einem IC50-Wert von 1 mikro M im 5-LOX-PMNL-Standardassay. Die Substanz 38 wurde in präklinischen Studien eingesetzt. Vier Stunden nach oraler Administration bei Mäusen (n = 6) wurde einen Plasmaspiegel von 40 mikro M erreicht. Im Hinblick auf eine Steigerung der PPAR-agonistischen Aktivität und der Reduktion der hepatotoxischen Eigenschaften der Leitstruktur Pirinixinsäure wurde eine Leitstrukturoptimierung durch Einführung der größeren Alkylketten in alpha-Position zur pharmakophoren Carboxyl-Funktion durchgeführt. Für die inhibierende Wirkung auf die 5-LOX scheint das Chinolin-Strukturelement verantwortlich zu sein, während die Potenz der Inhibition durch das Substitutionsmuster moduliert wird.
Das extrem thermophile Eubakterium Thermus thermophilus ist in den letzten Jahren zu einem Modell für thermophile Organismen geworden und verdankt seinen Statuszum Teil seiner hohe Wachstumsrate, den guten Zellerträgen und der konstitutivenExpression eines natürlichen Kompetenzapparates, der seine genetische Manipulation ermöglicht. Die Verfügbarkeit von kompatiblen Plasmiden und bis zu vier thermostabilen Antibiotikaresistenzmarkern konnten den Wert des Organismus in Hinblick auf biotechnologische Anwendungen noch weiter steigern und tatsächlich besteht nach wie vor ein ungebrochenes Interesse an der Struktur- und Funktionsaufklärung thermophiler Proteine. Der Focus der hier vorliegenden Arbeit richtete sich auf eine der insgesamt zwei terminalen Oxidasen der Atmungskette von T. thermophilus, die Cytochrom ba3 Oxidase. Es wurden verschiedene rekombinante Varianten des Proteins, die sich hinsichtlich der Position und Länge des verwendeten Histidin-Tags unterschieden, kloniert, exprimiert und aufgereinigt. Das Einfügen eines internen His12-Tags in einen periplasmatischen Loop zwischen den Transmembranhelices IV und V führte zu einer rekombinanten Version der Oxidase, die in ihren Eigenschaften dem nativen Wildtyp entsprach und sich durch die in dieser Arbeit etablierte Aufreinigungsstrategie relativ schnell, in guten Ausbeuten und hoher Reinheit aufreinigen ließ. Weiterhin konnten verschiedene Punktmutationen von möglicherweise am Elektronentransfer beteiligten Aminosäureresten generiert und die resultierenden Proteine aufgereinigt und über ihre enzymatische Aktivität charakterisiert werden. Eine weiterführende Charakterisierung der Mutanten erfolgte im Rahmen einer Kooperation und ist bisher noch nicht abgeschlossen. Das Herzstück dieser Arbeit machte jedoch die Definition der Transkriptionseinheit der Cytochrom ba3 Oxidase und die sich daraus ergebenden Fragestellungen aus. So konnte gezeigt werden, dass das ba3 Operon zusätzlich zu den Strukturgenen der dort kodierten Untereinheiten noch mindestens ein, höchst wahrscheinlich jedoch zwei zusätzliche Gene enthält: cbaX und cbaY. Bioinformatische Charakterisierungen ordneten CbaY der diversen Gruppe von sekundären Transportern zu, und es konnte experimentell gezeigt werden, dass seine Anwesenheit für die Expression der Cytochrom ba3 Oxidase förderlich ist. CbaX hingegen konnte über die durchgeführte Homologiesuche keine Funktion zugeordnet werden; uncharakterisierte Homologe waren einzig in der Thermaceae Gruppe zu finden. Durch Deletions- und Komplementationsstudien konnte dem Protein eine entscheidende Rolle in der Assemblierung der ba3 Oxidase bescheinigt werden. CbaX scheint eine zentrale Aufgabe bei der Häm a Insertion in Untereinheit I zu spielen und könnte, ohne Sequenzhomologie aufzuweisen, die Rolle des Surf1-Proteins übernehmen, welches in den sequenzierten Organismen der Thermaceae Gruppe nicht konserviert ist. Die homologe Expression und Aufreinigung von CbaX führte nicht zur erwarteten Ausbeute und Reinheit des Proteins, konnte aber durch immunologische Experimente eine potentielle Interaktion von CbaX und der Cytochrom ba3 Oxidase nachweisen.
Die vorliegende Arbeit hat die Charakterisierung und Untersuchung des Stabilitätsverhaltens von
Parvulustat (PL), einem Homologen des α-Amylase-Inhibitors Tendamistat, zum Inhalt. Zur
weitreichenden Charakterisierung wurden verschiedene Proteinregionen des Parvulustats der CTerminus,
das hydrophobe Cluster, die Disulfidbrücken sowie die Proline auf ihren jeweiligen
Einfluss auf die Struktur und die thermodynamische Stabilität untersucht. In der vorliegenden
Zusammenfassung werden die Ergebnisse dieser Studien komprimiert präsentiert:
· Charakterisierung des Parvulustat-Wildtyps
Es galt vorweg herauszufinden, wie sich der Inhibitor unter nativen und denaturierten
Bedingungen verhält, um Rückschlüsse auf seine Merkmale und Strukturen zu ziehen. Die
erzielten Ausbeuten und die hohe Reinheit des isolierten Parvulustats erlaubten eine umfassende
Charakterisierung, einschließlich zahlreicher Kristallisationsexperimente, die vermuten lassen,
dass eine Kristallisation möglich sein sollte. Aufgrund der Tatsache, dass die Struktur des
Parvulustats bis 2009 unbekannt war, wurde die sekundäre Struktur mittels Circulardichroismus
und Fluoreszenzspektroskopie untersucht. Die Analyse des fernen UV-CD-Spektrums bei pH 7,0
und 25°C offenbarte eine „all-b-sheet“ Protein-Struktur. Mittels Fluoreszenzspektroskopie wurde
deutlich, dass die aromatischen Aminosäuren exponiert vorliegen. Um zunächst einen Einblick in
die Strukturveränderungen und die thermodynamische Stabilität zu erhalten, wurde der
temperaturinduzierte Entfaltungsübergang mittels CD-Spektroskopie verfolgt. Das Angleichen der
bei 230 nm gemessenen CD-Daten nach der linearen Extrapolations-Methode für eine
Zweizustands-Faltung ergab einen Tm-Wert von 82°C und D H(Tm) von 201,6 kJ/mol. Die
beträchtlichen Werte veranschaulichen die hohe Stabilität des Parvulustats. Eine aus den CDMessungen
bei 50° ergebende Übergangskurve zeigte, dass sich die Sekundärstruktur mit einem
Übergangsmittelpunkt bei 5,62 M GdnHCl kooperativ und reversibel entfaltet. Das Protein
entfaltet sogar infolge einer pH-Wert-Senkung bis auf pH 1 nicht vollständig, sondern es wechselt
direkt in einen Säure-Zustand („acid-state“). Dieser Zustand zeigt spektroskopisch die gleichen
Eigenschaften wie das native Protein, wobei die volle Inhibierungs-Aktivität nicht erhalten bleibt.
In sehr basischem Milieu bei pH 14 nimmt Parvulustat einen alkalisch denaturierten
Zwischenzustand IB an, der sich erheblich von dem GdnHCl-denaturierten, dem säurebehandelten
oder vom „molten globule“ Zustand unterscheidet. Allgemein behielt Parvulustat
über ein breites pH-Wert Spektrum (1,0-10,0) die native Struktur, bzw. eine „native like“ Struktur,
was erneut auf die enorme Stabilität des Proteins hindeutet. Die von Rehm et al. (Rehm et al.,
Theoretischer Teil
-4-
2009) aufgeworfene Hypothese des „induced fit“ Inhibierungsmechanismus des Parvulustats
konnte durch die in dieser Arbeit durchgeführten Experimenten bekräftigt werden. Mittels
Sekundärstrukturbestimmungen des Parvulustats unter Komplexbildung mit der a-Amylase
konnte eindeutig gezeigt werden, dass strukturelle Veränderungen am Inhibitor im Komplex
vorliegen. Durch zahlreiche Tests konnte festgestellt werden, dass die WRY-Region des
Parvulustats sich der Struktur der a-Amylase anpasst. Die Komplexierung des Parvulustats
bewirkte aber eine thermodynamische Destabilisierung der Inhibitor-Struktur.
· Einfluss des C-Terminus auf die Stabilität des Parvulustats
Um die Ursachen für die hohe Stabilität des Parvulustats auch im Vergleich zu Tendamistat (Tm:
79°C) zu finden, wurde der Einfluss des hoch flexiblen C-Terminus untersucht. Die Derivate mit
um zwei (PL-2AA), vier (PL-4AA) und sieben (PL-7AA) Aminosäuren verkürztem C-Terminus
wurden isoliert und analysiert. Die Entfaltungstemperaturen der verkürzten Derivate des
Parvulustats sinken mit abnehmender Zahl der Aminosäuren. Die Ergebnisse suggerieren, dass
der C-Terminus des Parvulustats eine entscheidende Rolle in der strukturellen Vollständigkeit des
Proteins während der thermischen Entfaltung spielt und damit auch in der Faltung (Tab.: 2.1). Der
Vergleich der Inhibitoraktivitäten der verkürzten Proteine mit dem nativen Parvulustat ergibt für
die Varianten PL-2AA und PL-4AA eine dem Wildtyp ähnliche Aktivität. Die Variante PL-7AA
weist eine leicht verringerte Aktivität auf.
Tabelle 2.1: ...
Einfluss hydrophober Oberflächenclustern auf Stabilität und Faltung
des Parvulustats
Parvulustat besitzt in der Mitte des ersten b-Faltblatts, um die Position 22 liegend, einen
hydrophoben Oberflächencluster. Wie mit Hilfe von Substitutionsexperimenten in dieser Region
gezeigt werden konnte, ist die thermodynamische Stabilität des Parvulustats in hohem Maße von
der Bildung dieses kleinen aber wichtigen hydrophoben Kerns bestimmt. Demnach muss das b-
Faltblatt I und das b-Hairpin I eine entscheidende Rolle in der Faltung von Parvulustat spielen.
Position 22 ist in zweierlei Hinsicht für die Stabilität des Parvulustats wichtig: einerseits durch die
energetisch wichtigen Wasserstoffbrückenbindungen und zum zweiten steuert die Stelle zur
Formation des hydrophoben Kerns bei. Die Daten suggerieren, dass es auch eine
thermodynamische Kopplung zwischen dem hydrophoben Effekt und der Präsenz von
Wasserstoffbrückenbindungen geben könnte. Zumindest aus der Sicht der Stabilität ist es
eindeutig, dass interatomare Interaktionen wie Wasserstoffbrückenbindungen, van-der-Waalsund
Dipol-Dipol-Wechselwirkungen notwendig sind, um eine stabile Bildung von b-Faltblättern
in Parvulustat und seinen Derivaten zu verwirklichen.
· Der Effekt der Proline auf die Stabilität des Parvulustats
Der Effekt der Substitution des Prolins durch Alanin an verschiedenen Positionen des Parvulustats
wurde ebenfalls untersucht. Im Ganzen betrachtet führt auch die Mehrfachsubstitution von Prolin
zu keiner nennenswerten strukturellen Veränderung im Parvulustat. Die durchgeführten
thermischen Entfaltungsexperimente bestätigen diese Beobachtungen. Alle Einzelmutanten (P5A,
P42A, P48A, P72A) zeigten eine höhere thermische Stabilität als der Wildtyp (Abb. 2.1).
Abbildung 2.1: Tm-Werte des Parvulustat-Wildtyps und seinen Prolin Mutanten.
Theoretischer Teil
-6-
Die fast gleich bleibenden Tm-Werte bzw. die Erhöhung der Stabilität des Parvulustats sind durch
die strukturelle Fluktuationen zu erklären, denn die rigide XAS-Pro-Bindung wurde durch die
flexible XAS-Ala-Bindung ersetzt.
· Der Einfluss der Disulfidbindung auf die Stabilität des Parvulustats
Der Einfluss der zwei Disulfidbrücken des Parvulustats wurde bezüglich Aktivität, spektraler
Eigenschaften sowie Stabilität untersucht. Hierfür wurden 25 Inhibitorvarianten mittels gezielter
Mutagenese gewonnen, in denen jeweils zwei Cysteinreste, die im natürlich vorkommenden
Parvulustat Disulfidbrücken bilden, durch andere Aminosäuren ersetzt wurden. Die Ergebnisse
zeigten, dass die Faltung Parvulustats ein zwei Zustand Verhalten besitzt, das außer in
Tendamistat in keinem anderen disulfid-verknüpftem Protein gefunden wurde. Dieses Verhalten
wurde durch die Entfernung von Disulfidbrücken nicht beeinflusst. Wie durch die CD- und
fluoreszenzspektroskopischen Experimente belegt werden konnte, ist die native Struktur des
Parvulustats durch die Entfernung der C43-C70-Disulfidbindung tiefgreifend verändert worden.
Passend zu den Veränderungen der Struktur haben die Mutationen schwerwiegende
Destabilisierungseffekte auf das Protein verursacht, was auch an der Erniedrigung der Freien
Gibbs Energie der Denaturierung und der Tm-Werte zu erkennen ist. Die Untersuchung des
Einflusses der Aminosäure-Substitution in den Positionen 43 und 70 auf die thermodynamische
Stabilität des Parvulustats führt zum Ergebnis, dass die Hydrophobizität und Polarität des Restes
70 einen bedeutenden Effekt auf die Stabilität des Proteins besitzt. Die Betrachtung der
thermodynamischen Daten macht deutlich, dass der Beitrag der freien Energie zur Stabilisierung
nicht nur abhängig von der eingeführten Aminosäure ist, sondern zum Teil auch von dem
strukturellen Kontext abhängt. Die Daten zeigen, dass die Substitution des Alanins an der Stelle
70 durch Leucin oder Threonin die Struktur um 0,3 bzw. 1,7 kJ/mol stabilisieren. Zusätzliche
Beiträge zum Unterschied bezüglich des ΔG°-Werts zwischen den Varianten C43AC70L/T und
C43L/TC70A können sich auch durch die unterschiedliche lokale Umgebung, wie z.B. die
Seitenketten von benachbarten Aminosäuren um die zwei Mutationsstellen ergeben. Der Tm-Wert
des Wildtyp-Proteins beträgt 82°C. Die Vergleiche dieser Größe mit der von der stabilsten
Cystein-defizitären Doppelmutante C43AC70T (47,3°C) ergibt eine Differenz von 34,7°C. Dieses
Ergebnis untermauert, dass die Disulfidbindung 2 eine extrem wichtige strukturelle Komponente
in der ungewöhnlich hohen Stabilität des Parvulustats darstellt.
Das Ziel der Arbeit war es dennoch die Daten der Stabilitäten einzelner Disulfidmutanten zu
sammeln und zu erfassen, um dadurch allgemeine Grundregeln für eine rationale Gestaltung der
Elimination beider Disulfidbrücken im Sinne einer vorhersagbaren Auswirkung auf die
Proteinstabilität zu bekommen.
Theoretischer Teil
-7-
Der Versuch ein disulfidfreies Protein in großen Mengen aus S. lividans zu isolieren, stellte sich
aber als extrem schwierig dar. Nach der Änderung des Stamms des Wirtsorganismus
(Streptomyces lividans TK23), Erhöhung der Qualität der Protoplasten und der Expressions-
Bedingungen (19°C, 150 rpm) konnten auf dem SDS-Gel stärkere Banden des Derivats
C9AC25TC43AC70T-4AA beobachtet werden. Die Expression der Mutante
C9AC25TC43AC70L-4AA konnte hingegen nicht nachgewiesen werden. Die anschließende
Reinigung des Derivats C9AC25TC43AC70T-4AA des Parvulustats mittels Gelfiltration und RPHPLC
bzw. Isolierung des Proteins aus dem SDS-Gel brachte das erwünschte Produkt. Dieses
konnte mit der MALDI-Massenspektroskopie eindeutig nachgewiesen werden. Das aktive
Cystein-freie Derivat C9AC25TC43AC70T-4AA konnte auch auf dem a-Amylase Plattentest
nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Expression und der Nachweis einer
cystein-freien Variante möglich sind, dennoch haben die Ausbeuten dieses Proteins für
weiterreichende Analytik nicht ausgereicht. Demnach sind die Disulfidbrücken für die Stabilität
und Struktur des Parvulustats von enormer Bedeutung dennoch sind sie nicht zwingend
erforderlich für die Aktivität und die Expression in S. lividans.
Lichtgesteuerte Channelrhodopsine (ChR) haben im letzten Jahrzehnt neue Wege zur Untersuchung neurophysiologischer Zusammenhänge eröffnet. Die ersten grundlegenden Charakterisierungen von Channelrhodpsin-1 und Channelrhodopsin-2 (ChR-1 und ChR-2) zeigten bereits die hohe Selektivität dieser Ionenkanäle für Protonen gegenüber monovalenten und divalenten Kationen und veranschaulichten die Dominanz der einwärtsgerichteten gegenüber den auswärtsgerichteten Kationenströmen durch die Kanalpore (Einwärtsgleichrichtung) (Nagel et al., 2002; Nagel et al., 2003). Nach Expression von Channelrhodopsin können erregbare Zellen mit einem Ruhepotential von -60 mV durch Licht depolarisiert und Aktionspotentiale (AP’s) ausgelöst werden (Boyden et al., 2005; Li et al., 2005; Nagel et al., 2005b). Aufgrund der Einwärtsgleichrichtung von ChR nehmen die lichtaktivierten Ströme mit zunehmender Depolarisation ab, sodass die vollständige Ausbildung des AP’s nicht gestört wird. Dadurch wird ChR zu einem optimalen optogenetischen Werkzeug. Dennoch ist die Einwärtsgleichrichtung bisher wenig detailliert charakterisiert. Auch die zugrunde liegenden Mechanismen sind nicht genau bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte anhand von Patch-Clamp Messungen gezeigt werden, dass zwei Mechanismen die Rektifizierung des Kanalstroms durch ChR-2 hervorrufen: eine Spannungsabhängigkeit der Einzelkanalleitfähigkeit und eine Spannungsabhängigkeit der Offenwahrscheinlichkeit. Die Spannungsabhängigkeit der Einzelkanalleitfähigkeit ist von der Art der geleiteten Ionen abhängig und konnte experimentell über die Unterschiede der stationären IV-Kurve für H+ und Na+ bei symmetrischen Ionenkonzentrationen bewiesen werden. Des Weiteren wurden die Resultate für unterschiedliche Ionenbedingungen anhand eines Ionenbindungsmodells mit einem „3-Barrieren 2-Bindungsstellen“ Profil für die Kanalpore simuliert. Die Spannungsabhängigkeit der Offenwahrscheinlichkeit ist an eine Lichtadaption des ChR-2 Proteins gekoppelt. Diese Lichtadaption konnte mithilfe von repetitiven Messungen, d.h. Strommessungen mit mehrfachen kurzen Lichtblitzen (10 ns), gezeigt werden. Da die Lichtadaption wie auch die Kanalkinetik stark vom pH abhängig sind, ist anzunehmen, dass mechanistisch wichtige De- und Reprotonierungsreaktionen mit diesen Prozessen einhergehen. Ferner konnte über die Untersuchung der elektrophysiologischen Eigenschaften der ChR-2 Mutante E90A eine Region im Protein identifiziert werden, die höchstwahrscheinlich am Protonentransport durch die Kanalpore beteiligt ist. Die Mutante E90A wies eine verringerte Protonenleitfähigkeit und eine natriumabhängige Blockierung der lichtaktivierten Ströme bei niedrigem extrazellulären pH auf. Doppelbelichtungsexperimente mit gelbem oder kurzwelligem blauen Licht ergaben außerdem neue Hinweise auf die Identität einiger Intermediate des Photozyklus. Die vorgestellten Ergebnisse weisen darauf hin, dass die bisher beschriebene „lichtadaptierte“ Form, die als P480 Intermediat bezeichnet wird, eher einem P520 Intermediat entspricht. Außerdem konnte im Rahmen dieser Arbeit eine funktionelle Beteiligung des Intermediats P390, in dem die Schiff Base deprotoniert ist, am Photostrom von ChR-2 im Wildtyp-Protein gezeigt werden. Diese Beteiligung ist bisher nur für ChR-2 Mutanten bekannt (Bamann et al., 2010). Neben der Untersuchung der Kanaleigenschaften von ChR-2 wurde in dieser Arbeit auch der Frage nachgegangen, ob an den Photozyklus von ChR-2 eine vektorielle Protonenverschiebung über der Membran gekoppelt ist. Mithilfe der BLM-Technik und Patch-Clamp Messungen an elektrofusionierten HEK-293 Zellen (Zimmermann et al., 2006) konnte gezeigt werden, dass auch ohne elektrochemische Triebkraft lichtaktivierte Ströme (Pumpströme) zu beobachten sind, die einer vektoriellen Protonenverschiebung von 0,2 - 0,4 Ladungen pro Photozyklus entsprechen. Die Doppelbelichtungsexperimente und der vektorielle Protonentransport geben einen Einblick in den Zusammenhang zwischen Photozyklus und den funktionalen Zuständen des Kanals. Die Ergebnisse zeigen das komplexe Geflecht zwischen Spannungsabhängigkeit, der Kinetik und den offenen Zuständen und wurden in einem Modell zusammengefasst. Weiterhin wurde in dieser Arbeit eine stabile Zelllinie für die Expression von ChR-1 etabliert, die eine genauere Charakterisierung dieses Proteins möglich macht. Es konnte gezeigt werden, dass ChR-1 ebenso wie ChR-2 eine Kationenleitfähigkeit besitzt. Aus zeitaufgelösten Messungen wurde außerdem ermittelt, dass ChR-1 gegenüber ChR-2 eine verkürzte Zykluszeit besitzt. Die verkürzte Zykluszeit von ChR-1, die zu kleineren Gesamtstromamplituden im Vergleich zu ChR-2 führt und die vergleichsweise geringere Expression, v.a. in transienten Expressionssystemen, limitiert dessen neurophysiologische Anwendung. Zusammenfassend stellt die vorliegende Dissertation eine detaillierte biophysikalische Charakterisierung von Channelrhodopsinen dar, die neue Erkenntnisse über die mechanistische Kopplung der Kanalfunktion an den Photozyklus hervorbringt. Zudem kann sie eine Grundlage für die gezielte Suche nach Channelrhodopsin Mutanten bieten, deren Kinetik oder analeigenschaften für die neurophysiologische Anwendung optimiert sind.
An chemischen Synapsen diffundieren von der präsynaptischen Nervenendigung ausgeschüttete Neurotransmitter durch den synaptischen Spalt und aktivieren Rezeptormoleküle in der postsynaptischen Plasmamembran. Eine schnelle und zuverlässige Kommunikation an Synapsen bedingt, dass die Rezeptoren in Clustern direkt gegenüber den aktiven Zonen der Präsynapsen angereichert sind. Eine hohe Rezeptorendichte in der postsynaptischen Membran wird durch sog. Gerüstproteine, die mit den Rezeptormolekülen assoziieren, erreicht. Bisher wurden für verschiedene Synapsen unterschiedliche Gerüstproteine identifiziert. An glutamatergen Synapsen werden Rezeptoren durch u.a. das Postsynaptic Density 95 (PSD 95)-Protein, an cholinergen Synapsen durch Rapsyn, und an GABAergen und glyzinergen Synapsen durch Gephyrin verankert. An inhibitorischen Synapsen wurde bisher ausschliesslich Gephyrin als Ankerprotein für Glyzin- und GABAARezeptoren identifiziert. An exzitatorischen glutamatergen Synapsen dagegen regulieren weitere Gerüstproteine wie Shank, Homer und das Glutamatrezeptor interagierende Protein (GRIP) die Lokalisation, den Transport und die Stabilität verschiedener Glutamatrezeptor- Subtypen. Gephyrin wurde ursprünglich als peripheres Membranprotein zusammen mit dem Glyzin-rezeptorkomplex aufgereinigt. Es bindet an die große intrazelluläre Schleife der ß-Untereinheit des Glyzinrezeptors. Experimente mit Antisense-Oligonukleotiden und Gephyrin-defizienten Mäusen zeigten, dass Gephyrin essentiell für die synaptische Lokalisation von Glyzinrezeptoren und α2- und γ2-Untereinheiten enthaltenden GABAARezeptoren ist. Die Rezeptorlokalisation an der Synapse wird durch eine stabile Verankerung des Gephyrin-Gerüstes am Zytoskelett gewährleistet. Die Gerüstbildung erfolgt durch die Oligomerisierung zweier Gephyrin-Domänen, der aminoterminalen G-Domäne und der carboxyterminalen E-Domäne, wodurch ein hexagonales Gephyrinnetzwerk entsteht, welches für die Clusterbildung an der Synapse notwendig ist. Live-imaging Studien in Neuronenkulturen zeigten, daß an Rezeptor-Transportvesikel gebundenes Gephyrin kontinuierlich an und von aktiven Synapsen weg transportiert wird, was eine hochdynamische Modulation des Gephyrin-Gerüsts nahelegt. Der retro- und anterograde Transport von Gephyrin wird durch Dynein bzw. Kinesin bewerkstelligt. Einige zytosolische Proteine wie Profilin, das Mena/Vasodilator-stimulierte Phosphoprotein (VASP) und Collybistin (Cb) spielen in der Zytoskelett-Regulation eine Rolle und interagieren mit Gephyrin. Cb ist notwendig für die Gephyrin-Clusterbildung an bestimmten GABAergen Synapsen. Im Hippocampus Cb-defizienter Mäuse befindet sich kein Gephyrin an den Postsynapsen. Cb gehört zur Familie der Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (GEF), die durch eine DH-PH (Dbl Homologie-/Pleckstrin-Homologie) Tandem-Domäne charakterisiert sind und existiert in zwei Spleißvarianten, CbI und CbII. Die DH-Domäne aktiviert spezifisch das kleine G-Protein Cdc42, und die PH-Domäne interagiert mit Phosphoinositol-3-Phosphat (PI3P). In vitro-Studien haben gezeigt, dass die Interaktion von Gephyrin mit Cb II eine Reduktion der GEF-Aktivität für Cdc42 bewirkt. Basierend auf diesen Resultaten wurde vorgeschlagen, dass Gephyrin die Cdc42-Aktivierung durch Cb beendet. Dieser Mechanismus könnte für die initiale Bildung inhibitorischer Synapsen notwendig sein. Analysen mit Domänen-deletierten Cb-Konstrukten zeigten, dass sowohl die DH- als auch die PH-Domäne für die Bildung von submembranären Gephyrin-Microclustern an der Plasmamembran notwendig sind. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der Gephyrin-Gerüstbildung durch Cb weiter untersucht. Insbesondere wurde geklärt, inwiefern Cdc42-Aktivierung bzw. PI3P-Bindung durch Cb an der Gephyrin-Gerüstbildung beteiligt ist. Zusätzlich wurde anhand einer eigens erzeugten GFP-Gephyrin transgenen Maus untersucht, ob sich die Stabilität des Gephyrin-Gerüsts während der Differenzierung ändert und in die Regulation der Stabilität und Plastizität inhibitorischer Synapsen involviert ist. Die Rolle von Cdc42 in der Gephyrin-Gerüstbildung wurde mittels einer konstitutiv aktiven Spleißvariante von Cb untersucht. Basierend auf Homologien zu anderen bereits charakterisierten GEFs und der publizierten Kristallstruktur des CbII-Cdc42 Komplexes wurden Aminosäurereste in der DH-Domäne von Cb mutiert, um die Cdc42-Aktivierung zu unterbrechen (CB T61A, K192A und NE232-233AA). In vitro GTPase-Aktivierungsassays und Filopodien-Induzierung in NIH-3T3-Zellen bestätigten, dass diese Mutationen die Cdc42-Aktivierung reduzierten bzw. aufhoben. Dennoch induzierten sie die Gephyrin-Gerüstbildung in heterologen Zellen und hippocampalen Neuronen ähnlich effektiv wie Wildtyp-Cb II. Die Rolle von Cdc42 in der synaptischen Gephyrin-Clusterbildung wurde außerdem in konditionell Cdc42-defizienten Mäusen, in denen das Cdc42-Gen selektiv im Vorderhin inaktiviert wurde, untersucht. Die Dichte von Gephyrin- und das GABAA-Rezeptor-Clustern war bei Verlust von Cdc42 im Hippocampus nicht verändert. Dies steht im Gegensatz zu einem fast 80%igen Verlust von Gephyrin- und GABAA-Rezeptor-Clustern im Hippocampus von Cb-defizienten Mäusen. Diese Ergebnisse zeigen, dass Cdc42 für die Gephyrin-Gerüstbildung an inhibitorischen Synapsen nicht notwendig ist. Die Rolle der PH-Domäne von Cb bei der Gephyrin-Clusterbildung wurde ebenfalls durch Mutagenese-Experimente analysiert. Viele PH-Domänen haben die Fähigkeit, Phosphoinositide zu binden und damit Membranbindung zu vermitteln, während andere PHDomänen, die nicht an Phosphoinositide binden, nur nach Bindung weiterer Liganden mit Membranen assozieren. In früheren Arbeiten war gezeigt worden, dass humanes Cb PI3P bindet. Hier wurde eine mögliche Beteiligung von Phospholipid-Bindung an der Gephyrin-Gerüstbildung durch Substitution zweier basischer Reste in der β3- und β4- Schleife, R303 und R304, mit Asparaginen untersucht. Ein Lipid-Dot-Blot-Assay mit der Cb II-RR303-304NN-Mutante zeigte einen völligen Verlust der PI3P-Bindung in vitro. Die Expression dieser Mutante in heterologen Zellen und hippocampalen Neuronen zeigte, dass die Gerüstbildung und die synaptische Lokalisation von Gephyrin Phosphoinositidbindung erfordern. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die Aktivierung von Cdc42, nicht aber die PI3P- Bindung, für die Cb II-vermittelte Gephyrin-Gerüstbildung entbehrlich ist. Cb hat also zumindest zwei biologische Funktionen: Einerseits ist die DH-Domänen vermittelte Aktivierung von Cdc42 notwendig für die Regulation des Aktinzytoskeletts und die Bildung von Filopodien; andererseits wird die PH-Domänen-abhängige und Cdc42-unabhängige Phospholipidbindung für die Gephyrin-Gerüstbildung an inhibitorischen Postsynapsen benötigt. Um die Dynamik von Gephyrin an inhibitorischen Synapsen zu untersuchen, wurde eine transgene Maus entwickelt, welche GFP-Gephyrin unter der Kontrolle des Neuronspezifischen Thy1-Promotors exprimiert. In verschiedenen Hirnregionen der transgenen Mauslinie, wie Hippocampus, Stammhirn, Rückenmark und Kortex, wurde punktuelle synaptische GFP- Fluoreszenz beobachtet. Diese GFP-Gephyrin-Fluoreszenz kolokalisierte mit einem inhibitorischen Präsynapsenmarker, dem vesikulären inhibitorischen Aminosäuretransporter (VIAAT). Immunfärbungen von Hirnschnitten mit Gephyrin-spezifischen Antikörpern zeigten, daß die durchschnittliche Größe und Dichte der GFP-Gephyrin-Cluster mit denen endogener Gephyrin-Cluster identisch waren. Eine Western-Blot Analyse inhibitorischer synaptischer Proteine zeigte keinen Unterschied zwischen Thy1-GFP-Gephyrin- und Wildtyp-Mäusen auf, ebensowenig wie elektrophysiologische Untersuchungen von GFP-Gephyrin-positiven und -negativen Neuronen. Sowohl die durchschnittliche Amplitude der mIPSCs als auch deren Frequenz waren nicht signifikant verändert, was dafür spricht, dass die transgene Expression von GFP- Gephyrin keine funktionellen Veränderungen verursacht. Verhaltensversuche zeigten gleiche Ergebnisse für Thy1-GFP-Gephyrin und WTMäuse. Daher kann die GFP-Gephyrin-Maus als verlässliche Reporterlinie für Studien zur Gephyrin-Dynamik an inhibitorischen Synapsen im Hippocampus und in einigen anderen Hirnregionen eingesetzt werden. Die Dynamik des synaptischen Gephyrin-Gerüsts wurde an inhibitorischen Postsynapsen in organotypischen entorhinal-hippocampalen Schnittkulturen aus GFPGephyrin-Mäusen untersucht. Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP)-Analysen individueller GFP-Gephyrin-Cluster in 1-Woche- und 4-Wochen-alten Kulturen zeigten eine entwicklungsabhängige Stabilisierung der GFP-Gephyrin-Cluster auf. Diese Stabilisierung ist eng verbunden mit einer Größenzunahme der Gephyrin-Cluster an GABAergen Synapsen. Mit elektrophysiologischen Ableitungen wurde eine Reifung der GABAergen synaptischen Übertragung ebenfalls während dieser Periode beobachtet. Die Stabilisierung und Grössenzunahme des Gephyrin-Gerüsts spiegelte sich in einer erhöhten miniature inhibitory postsynaptic current (mIPSC)- Amplitude wieder. Außerdem wies die Zunahme der mIPSCFrequenz auf eine effiziente Reifung der präsynaptischen Endigungen hin, die immunhistochemisch durch eine Zunahme der VIAAT-Immunfluoreszenz erhärtet werden konnte. Ein möglicher Einfluss der GABAergen, synaptischen Aktivität auf die Grösse und Stabilität der Gephyrin-Cluster wurde in reifen Neuronenkulturen durch pharmakologische Modulation der GABAA-Rezeptoren untersucht. Die Behandlung 4-Wochen-alter Kulturen mit GABAA-Rezeptor-Antagonisten und mit dem potenzierenden Benzodiazepin Diazepam zeigte eine homöostatische Regulation der Stabilität und Größe des Gephyrin-Gerüsts durch die Aktivität inhibitorischer Synapsen auf. Zusammenfassend sind diese Resultate starke Hinweise für dynamische Veränderungen in synaptischen Gephyrin-Gerüsten während der Reifung und Aktivitäts-induzierten Plastizität GABAerger Synapsen
Die Verfügbarkeit synthetischer Oligonukleotide hat der Entwicklung einer Vielzahl molekularbiologischer, biochemischer und medizinischer Anwendungen den Weg geebnet. Und sind viele diese Anwendungen für sich genommen schon hochinteressant, so eröffnet die Kombination mehrerer Methoden oft noch ganz neue Möglichkeiten. In der vorliegenden Doktorarbeit ist es gelungen, die Technik der photolabilen Schützung auf die Anwendungen von siRNAs und molecular beacons zu übertragen und diesen damit die Option der orts- und zeitaufgelösten Aktivierung zu ermöglichen. Durch die Einführung eines Nukleotids mit 2-(2-nitrophenyl)propyl-geschützter Nukleobase in eine siRNA, konnte der katalytische Schritt der RNA-Interferenz, die mRNA-Spaltung, unterbunden werden. Hierzu wurde das photolabil modifizierte Nukleotid so in der siRNA positioniert, dass es gegenüber der mRNA-Schnittstelle bzw. in unmittelbarerer Nachbarschaft zu dieser lag. Dabei war das modifizierte Nukleotid selbst kein Ribonukleotid sondern ein Desoxynukleotid. Zuvor konnte gezeigt werden, dass die Einführung einzelner Desoxynukleotide in eine siRNA keinerlei Einfluss auf deren Aktivität hat. Als Modellsystem diente der RFP/eGFP-Reportergenassay, wobei die Plasmide mit der siRNA in die verwendeten HeLa-Zellen kotransfiziert wurden. Die verwendete siRNA regulierte dabei die eGFP-mRNA, die gemessene Fluoreszenz wurde auf die RFP-Fluoreszenz normiert. In der Studie gelang es, ein sauberes „An/Aus-Verhalten“ zu erzielen, das heißt, die modifizierte siRNA zeigte zunächst keinerlei Einfluss auf die eGFP-mRNA. Bestrahlte man diese siRNA jedoch für drei Minuten bei 366 nm, erzielte man eine Unterdrückung der eGFP-Expression, die der einer unmodifizierten siRNA entsprach. Dies funktionierte für vor der Transfektion bestrahlte siRNAs ebenso, wie für solche, die erst nach der Transfektion in der Zelle entschützt wurden. Vereinfachte Darstellung der lichtaktivierbaren RNA Interferenz. Links: solange die Photoschutzgruppe (rot) auf dem Führungsstrang sitzt wird das Substrat des RISC nicht geschnitten. Rechts: Bestrahlung mit UV-Licht entfernt die Photoschutzgruppe und aktiviert die RNAi-Maschinerie. Ein bis jetzt ungeklärtes und noch näher zu untersuchendes Phänomen ist die Stabilität der Modifikationen in der Zelle. Aus bisher nicht eindeutig zu benennender Ursache fand nach einer definierten Zeit eine Aktivierung der ausgeschalteten siRNA statt, ohne dass diese bestrahlt wurde. Versuche mit photolabil modifizierten Nukleotiden an anderen Positionen innerhalb der siRNA, sowie eine Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie-Studie mit fluoreszenzmarkierter siRNA und fluoreszenzmarkiertem RISC erlaubten es Rückschlüsse auf den Schritt der RNAi zu ziehen, der durch die Einführung der Basenmodifikation blockiert wird. Offenbar handelt es sich tatsächlich um den katalytischen Schritt der mRNA-Spaltung, ein Einbau der modifizierten siRNA in den RISC findet statt. Zudem zeigte die erfolgreiche Inaktivierung der für die FCS-Studie genutzten anti-TK siRNA, dass der Ansatz, die Modifikation im Bereich der Schnittstelle einzubauen, von der anti-eGFP siRNA auf andere siRNAs übertragbar ist. Im zweiten erfolgreichen Projekt gelang es, molecular beacons durch Einführung zahlreicher photolabiler Basenmodifikationen lichtaktivierbar zu machen. Hierzu wurde ein bereits beschriebener GAPDH-molecular beacon verwendet. Modifiziert man die Schleife dieses molecular beacon mit sieben photolabilen Basenschutzgruppen (NPP und NPE) so gelingt es die Bindung desselben an seine komplementäre Ziel-RNA komplett zu unterbinden, während ein GAPDH-beacon mit drei oder fünf Modifikationen noch in verringertem Maße bindungsfähig ist. Dieses Verhalten wurde sowohl mittels einfachen Auslesens der Fluoreszenzintensität, als auch anhand eines PA-Geles belegt. Eine große Herausforderung bei diesem Projekt stellte die Aufreinigung des hochmodifizierten molecular beacon dar, der neben Fluorophor und Quencher auch zahlreiche Photoschutzgruppen trägt. Diese gelang schließlich durch den Einsatz einer extra densely bond-RP-HPLC-Säule und wiederholter HPL-Chromatographie. Ebenfalls konnte der große Vorteil eines lichtaktivierbaren molecular beacon, die Möglichkeit der präzisen Ortsauflösung der Aktivierung, dargestellt werden. Hierzu wurde modellhaft die Ziel-RNA auf einer Objektträgeroberfläche immobilisiert. Die dann aufgetragene molecular beacon-Lösung zeigte zunächst keine Fluoreszenz. Diese trat erst nach Bestrahlung und auch nur begrenzt auf den wenige Quadratmikrometer großen Bestrahlungsbereich auf.
Innerhalb der letzten 30 Jahre haben sich photoaktivierbare Verbindungen („caged compounds“) zu einem äußerst wertvollen Werkzeug entwickelt. Seit der erstmals publizierten Anwendung von lichtaktivierbarem ATP im Jahre 1978 durch Hoffman et al. konnten viele neue Erkenntnisse im Bereich der Physiologie, Molekularbiologie und Biochemie mit Hilfe von photoaktivierbaren Verbindungen gewonnen werden. Hierunter versteht man Substanzen, deren biologische Wirksamkeit temporär inaktiviert ist, jedoch durch Bestrahlung mit Licht wiederhergestellt werden kann. Die Inaktivierung wird durch spezielle, lichtreaktive Chromophore erreicht, sogenannten photolabilen Schutzgruppen („cages“). Der Einsatz dieser Technik zur Aktivierung von Nukleinsäuren eröffnet ein weites Feld an Anwendungsmöglichkeiten. So ist auf diese Weise eine orts- und zeitaufgelöste Kontrolle der Aktivität von z.B. Antisense-DNA, siRNA oder Aptameren durch Licht möglich. Während der vorliegenden Doktorarbeit konnten zwei neuartige photolabil geschützte Desoxythymidine als Phosphoramidite zum Einsatz in der automatisierten DNA-Synthese dargestellt werden. Hierfür wurden jeweils NDBF-OH bzw. pHP-OH in O4-Position der Nukleobase eingeführt. Es konnte gezeigt werden, dass sich die beiden Nukleoside nach ihrem Einbau in DNA mittels UV-Licht entschützen lassen. Die photolabilen Schutzgruppen besaßen jedoch nur eine geringe chemische Stabilität unter verschiedenen basischen Abspaltbedingungen und sind deshalb nicht für die automatisierte DNA-Festphasensynthese unter Standardbedingungen geeignet. Durch Homologisierung der NDBF-Gruppe mit einer zusätzlichen Methyleneinheit zu hNDBF-OH wurde eine verbesserte Variante synthetisiert, welche eine ausreichende Basenstabilität und hervorragende photochemische Eigenschaften aufweist. Wie im Arbeitskreis Heckel gezeigt werden konnte, ist mittels in O6-Position hNDBF-modifiziertem Desoxyguanosin sowohl die DNA-Festphasensynthese unter Standardbedingungen möglich, als auch die spätere Photolyse dieser Schutzgruppe bei einer Wellenlänge von 420 nm. Hierdurch eröffnet sich zum ersten Mal die Möglichkeit, bei Verwendung von beispielsweise NPP und hNDBF, photolabil geschützte Bereiche in Nukleinsäuren wellenlängenselektiv durch Licht unterschiedlicher Wellenlänge zu aktivieren. In einem weiteren Projekt wurden erfolgreich photoaktivierbare Varianten des bivalenten Fusionsaptamers HD1-22 getestet. HD1-22 besitzt zwei Aptamerdomänen, HD1 und HD22, welche jeweils an eine der beiden Exosites I bzw. II von Thrombin binden. Im konkreten Fall konnten wir die Blutgerinnungsaktivität von Thrombin unter Verwendung einer photolabil geschützten Aptamersequenz von vollständig aktiv zu komplett inaktiv modulieren: Vor der UV-Bestrahlung war lediglich die Exosite II durch die HD22-Domäne blockiert. Dies erlaubte keinerlei Bindung des natürlichen Antikoagulans Antithrombin III an Thrombin – weder durch Heparin vermittelt noch ohne Beteiligung von Heparin. Der Zugang zur Exosite I war hingegen nicht eingeschränkt, die Blutgerinnungsaktivität des Thrombins somit durch die Rekrutierung von Fibrinogen an die Exosite I vollständig aktiv und nicht durch Antithrombin inhibierbar. Durch lichtvermittelte Entschützung der HD1-Domäne konnte nun eine Inaktivierung der Exosite I erfolgen, welche durch die hohe Bindungsaffinität der HD22-Aptamerdomäne stärker ausfiel als bei der ausschließlichen Verwendung eines HD1 Aptamers. Die koagulative Wirkung des Thrombins wurde somit vollständig aufgehoben. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde der Grundstein für die Entwicklung eines kovalenten, lichtaktivierbaren Thrombin-Thrombinaptamer-Reagenzes gelegt. Dieses könnte zur gezielten Thromboembolisierung bei bestimmten malignen Tumorerkrankungen eingesetzt werden, um das entartete Gewebe von der Blut- und damit Nährstoffversorgung abzuschneiden. Zudem könnte so möglicherweise während einer Tumorexzision die Freisetzung von metastasierenden Krebszellen unterbunden werden. Das Reagenz besteht aus der von Heckel et al. publizierten „ausschaltbaren“ Variante des HD1-Aptamers. Diese besitzt einen photolabil geschützten Gegenstrang. Solange die Schutzgruppe intakt ist, bindet das Aptamer an die Exosite I von Thrombin und verhindert auf diese Weise die Rekrutierung von Fibrinogen. Wird die Sequenz jedoch mit UV-Licht bestrahlt, so erfolgt die Entschützung des Gegenstrangs und durch die folgende Basenpaarung eine Inaktivierung des HD1 Aptamers. Hieraus resultiert die Freisetzung von aktivem Thrombin, welches direkt zur Ausbildung eines Thrombus führt. Durch die – ebenfalls photospaltbare – kovalente Anbindung des „ausschaltbaren“ HD1 an die Proteinoberfläche werden eine vorzeitige Dissoziation des Aptamers und damit eine vorzeitige Wiederherstellung der Proteinaktivität verhindert.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde eine Variante des Anti-Thrombin-Aptamers HD1 entwickelt, die vor Belichten aktiv war und sich durch Belichten deaktivieren ließ. Dazu wurde das Wildtyp-Aptamer am 5'-Ende um eine GAAA-Schleife und eine Gegenstrangregion, bestehend aus vier Nukleotiden, erweitert. Dies reichte für eine vollständige Inaktivierung des Aptamers aus. In die Gegenstrangregion wurde ein photolabil geschütztes Nukleotid eingebaut, das die Bildung einer Haarnadelstruktur vorübergehend verhindert. Dazu wurde ein Desoxycytidin-Derivat synthetisiert, das an seiner N4-Position mit einer 1-(2-Nitrophenyl)ethyl-Gruppe modifiziert war. Durch die Maskierung der Antisense-Region wies das Aptamer vor Belichtung blutgerinnungshemmende Aktivität auf, allerdings in geringerem Maße als das Wildtyp-Aptamer. Durch Belichten wurde die Gegenstrangregion freigesetzt und dadurch die aktive Konformation des Aptamers zerstört, sodass es keine blutgerinnungshemmende Wirkung mehr besaß. In einem daran anknüpfenden Projekt sollte eine mit Licht ausschaltbare HD1-Variante mit verbessertem Schaltverhalten entwickelt werden, deren Aktivität vor dem Belichten mit der des Wildtyp-Aptamers vergleichbar ist. Tests zeigten, dass eine 5'-Erweiterung des Aptamers stets einen Aktivitätsverlust zur Folge hatte. Getestet wurden verschiedene Linker-Sequenzen, D-Spacer (Abasic Sites) und nicht nukleotidische Linker wie Glykollinker oder alkylische Linker. Eine Erweiterung am 3'-Ende brachte dagegen fast immer Aptamervarianten hervor, deren Aktivität die des Wildtypaptamers überstiegen. Um diese verbesserten Aptamervarianten zu deaktivieren, war eine Antisense-Region bestehend aus bis zu neun Nukleotiden nötig. Für eine photolabil geschützte Variante wurde zusätzlich ein Desoxyadenosinderivat mit N6-1-(2-Nitrophenyl)ethylmodifikation synthetisiert. Es zeigte sich, dass eine photolabile Schutzgruppe nicht ausreichte um die Antisense- Region zu neutralisieren. Aptamervarianten mit vier oder fünf photolabilen Schutzgruppen in der Antisenseregion waren vor dem Belichten aktiver als das Wildtyp-Aptamer HD1 und konnten durch Belichten vollständig deaktiviert werden. In einem weiteren Projekt dieser Arbeit wurde eine photolabil geschützte Glukosamin-6- phosphat-Variante synthetisiert, um eine lichtabhängige Spaltung des glmS-Ribozyms aus Bacillus subtilis zu induzieren. Dazu wurde GlcN6P an der Aminofunktion über eine Carbonyllinker mit einer 2-(2-Nitrophenyl) propylgruppe modifiziert. In vitro konnte gezeigt werden, dass mit dieser Verbindung durch Belichten die Spaltung eines glmS-EGFP-mRNA-Konstrukts induziert werden konnte. In HeLa-Zellen wurde untersucht, ob sich dieses System zur Regulation der EGFP-Expression eignet. Da erste Versuche erfolglos blieben, wurde eine lipophile, zellgängige Variante des photolabil geschützten GlcN6Ps synthetisiert. Versuche, in denen dieses Derivat getestet wird, werden zur Zeit von unseren Kooperationspartnern durchgeführt. In einem weiteren Projekt wurden Desoxyguanosinderivate für die DNA-Festphasensynthese synthetisiert, die an ihrer O6-Position mit einer p-Hydroxyphenacylgruppe bzw. mit einer 1-(3-Nitrodibenzofuran-2-yl)ethylgruppe modifiziert wurden. Diese wurden in ein Desoxyoligonukleotid eingebaut und es konnte gezeigt werden, dass die photolabilen Schutzgruppen durch Belichten abgespalten werden. Beide photolabilen Modifikationen waren allerdings unter den basischen DNA-Abspaltbedingungen zu instabil, als dass sie sich für den routinemäßigen Einsatz zur Herstellung lichtaktivierbarer Nukleinsäuren eignen würden. Im letzten Teil der Arbeit wurde eine photolabile Schutzgruppe entwickelt, die über einen zusätzlichen Aminolinker verfügt [2-(4-(Aminomethyl)-2-nitrophenyl)-propanol]. Die Aminofunktionalität war für die Dauer der DNA/RNA-Festphasensynthese mit einer Trifluoracetylgruppe geschützt, die unter den basischen Abspaltbedingungen ebenfalls entfernt wird. Mit dieser photolabilen Schutzgruppe wurden ein Thymidinderivat an der O4-Position und ein Desoxyguanosinderivat an der O6-Position modifiziert. Das Desoxyguanosinderivat wurde erfolgreich in der Oligonukleotidfestphasensynthese eingesetzt. Die photolabile Schutzgruppe konnte durch Belichten vollständig von der synthetisierten Nukleinsäure abgespalten werden. Darüber hinaus gelang es, über die Aminofunktionalität die heterobifunktionalen Crosslinker SMCC und SMPB mit der Nukleinsäure zu verknüpfen. Auf diese Weise ist eine reversible Vernküpfung der Nukleinsäure mit einem nahezu beliebigen Bindungspartner möglich. Durch Belichten kann die Nukleinsäure in ihrer ursprünglichen Form wiederhergestellt werden.
Protein-Protein Interaktionen der NADH: Ubichinon-Oxidoreduktase (Komplex I) aus Yarrowia lipolytica
(2010)
Protein-Protein Interaktionen der NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase (Kolmplex I) aus Y. lipolytica In der inneren Mitochondrienmembran sind die Atmungskettenkomplexe I bis IV und die ATP-Synthase lokalisiert. Parallel zum Elektronentransport werden Protonen von der NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase (Komplex I), der bihydrochinon:Cytochrom c-Oxidoreduktase (Komplex III) und der Cytochrom c-Oxidase (Komplex IV) über die Membran in den Intermembranraum gepumpt. Der resultierende chemiosmotische Gradient wird von der ATPase verwendet um ATP zu generieren. Die NADH:Ubichinon- xidoreduktase ist der Startpunkt des Elektronentransfers. Der Komplex I wurde in verschiedenen Organismen in Interaktion mit Komplex III und IV beobachtet. Diese funktionellen Einheiten werden als Respirasomen oder Superkomplexe bezeichnet (Pfeiffer und Schägger, 2000). Der Komplex I in prokaryotischen Zellen stellt die kleinstmögliche Variante dieses Enzyms dar. Da er in der Lage ist, alle bioenergetischen Reaktionen durchzuführen, werden die beteiligten 14 Untereinheiten als zentrale Untereinheiten bezeichnet (Fearnley et al. 1992). In den Eukaryoten findet sich ein Enzym, das je nach Organismus bis zu 31 weitere, sogenannte akzessorische Untereinheiten aufweist. Da diese Untereinheiten keine Homologie mit bakteriellen Proteinen aufweisen, wird davon ausgegangen, dass sie eher eine Funktion im Assemblierungsprozess ausüben als am Elektronentransfer oder der Translokation der Protonen beteiligt zu sein. Ziel dieser Arbeit war es daher mögliche Interaktionspartner des Komplex I oder weitere Untereinheiten zu finden. Für die Detektion möglicher Interakteure sollten neben einem Two-Hybrid-Screen noch weitere Methoden etabliert werden. Als Modellsystem wurde Yarrowia lipolytica verwendet. Unter Verwendung des BacterioMatchII® Systems konnte die mitochondriale Malat-Dehydrogenase, ein Enzym des Citrat-Zyklus, als ein Interaktionspartner des Komplex I gefunden werden. Bei der Reaktion entsteht NADH, das Energieäquivalent, welches dem Komplex I Elektronen liefert. Im Kontext des Substratchannelings deutet die Interaktion der mitochondrialen Malat- ehydrogenase auf hochgeordnete Stukturen im Matrixraum hin, die einen Transfermechanismus oder eine zielgerichtete Diffusion des NADH gewährleisten könnten. Durch die Kombination der Methoden Immunpräzipitation, Gelelektrophorese und MALDI-MS konnten erstmals Hinweise auf Superkomplexe in Y. lipolytica gefunden werden, was dann durch mehrdimensionale Gelelektrophorese bestätigt werden konnte. In dieser Arbeit konnten die Superkomplexe I1III2 ,I1III2IV1 und I1III2IV2 identifiziert werden. Ein vollständiges Respirasom mit einer Stöchiometrie von I1III2IV4 konnte nicht gezeigt werden. Desweiteren konnte die Anwesenheit eines Komplex I-Dimers nachgewiesen werden. In dem bisher postulierten Modell der respiratory strings werden die Superkomplexe durch tetramere Komplex IV-Module zu hochmolekularen Strukturen verknüpft (Wittig et al., 2006). Die detektierten Komplex I-Dimere lassen vermuten, dass sie zusammen mit dem tetrameren Komplex IV als Linker-Moleküle die Superkomplexe zu einem zweidimensionalen respiratory patch verbinden. Zudem konnte eine neue Untereinheit des Komplex I, genannt NEBM, durch das Zusammenspiel von LILBID- und MALDI-Massenspektrometrie und Gelelektophorese identifiziert werden. Durch MALDI-Massenspektrometrie wurde diese Untereinheit de novo sequenziert. Die Charakteristik des identifizierten Proteins entspricht den sogenannten single-transmembrane domain Untereinheiten (Brandt et al., 2005; Brandt 2006), die eventuell eine Funktion in der Assemblierung des Komplex I einnehmen könnten. Weder bei den Messungen der NADH:HAR- noch der dNADH:DBQ-Aktivität zeigte der Deletionsstamm enzymatisch aktiven Komplex I. Weder in blau-nativer Elektrophorese noch in silbergefärbten 2D SDS-Gelen war ein Komplex I noch ein Subkomplex sichtbar und auch In-Gel-Aktivitäts-Tests verliefen für die Detektion von Komplex I im Deletionsstamm negativ. Erst durch eine Western Blot Analyse konnte ein Subkomplex mit einer Größe von ca. 300kDa detektiert werden. Unter Berücksichtigung der für den Rinderkomplex vorgeschlagenen Einteilung des Komplex I in die Subkomplexe Iα und Iβ (Brandt et al. 2006) könnte der detektierte Subkomplex Iβ zugeordnet werden, da er zwei Untereinheiten beinhaltet, die diesem Komplex zuzuordnen sind. Die NEBM Untereinheit könnte also an der Assemblierung der NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase beteiligt sein. Erstmals konnten Superkomplexe in Y. lipolytica Mitochondrien nachgewiesen werden. Die Identifizierung der neuen NEBM Untereinheit vervollständigt die Kenntnisse über die Untereinheitenzusammensetzung. Das Wechselspiel mit anderen Proteinen und die Zusammensetzung des Komplexes können für die Strukturaufklärung und zur Analyse des Reaktionsmechanismus wichtig sein. Somit leisten diese Ergebnisse einen wichtigen Beitrag zur Charakterisierung der NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase aus Y. lipolytica.
Durchgeführte Arbeiten und Ergebnisse: Zur Erschließung des Themas Lebensmittelverpackungen im Chemieunterricht wurde zunächst eine grundlegende fachliche Recherche durchgeführt, um mögliche thematische Schwerpunkte zu identifizieren und Grundlagen für eine experimentelle Zugänglichkeit zu erarbeiten. Parallel hierzu wurde der derzeitige Stand der fachdidaktischen Forschung unter besonderer Berücksichtigung des Themas Lebensmittelverpackungen erhoben. Es zeigte sich, dass nur vereinzelt auf diese Themenstellung eingegangen wird. Dabei steht allerdings, wie etwa bei dem Recycling von Joghurtbechern, die stoffliche Weiterverwendung von Abfällen im Vordergrund, während die Anforderungen an die Eigenschaften einer Verpackung keine Rolle spielen. Daher erfahren Bau und Funktion unterschiedlicher Verpackungsmaterialien in der vorliegenden Arbeit eine besondere Berücksichtigung. Die vorliegende Arbeit umfasst im Wesentlichen zwei Schwerpunkte: - Die schulexperimentelle Erschließung des Themas Lebensmittelverpackungen für unterschiedliche Klassenstufen, - die exemplarische Ausarbeitung von Unterrichtseinheiten, die die Möglichkeit der Integration der Experimente in die Schulpraxis aufzeigen. Bei der experimentellen Entwicklung stand die Barrierefunktion der Lebensmittelverpackungen und im Hinblick auf die Verträglichkeit mit Lebensmitteln deren chemische Zusammensetzung im Vordergrund. Gesichtspunkte wie die mechanische Belastbarkeit, z. B. die Reißfestigkeit einer Verpackungsfolie, wurden erst in zweiter Linie erarbeitet. Die Struktur-Eigenschaftsbeziehungen wurden thematisiert. Zunächst wurde eine Versuchsreihe ausgearbeitet, die die Funktion von Aluminiumschichten in Lebensmittelverpackungen in das Zentrum der Betrachtung stellt. Hierbei konnte zur Bestimmung der Dicke einer Aluminiumschicht mit schulischen Mitteln ein Verfahren ausgearbeitet werden, in dem die Aluminiumanteile einer ausgemessenen Fläche einer Verpackung gelöst und anschließend über eine Titration bestimmt werden. Diese Versuchsreihe kann auf viele Beispiele angewandt werden und liefert zuverlässige Ergebnisse. Der Nachweis unterschiedlicher Kunststoffe in Lebensmittelverpackungen stand im Mittelpunkt einer zweiten Versuchsserie. Hierbei wurden Versuche zur Analyse von Verpackungsstoffen (Polyolefine und Polykondensate) entwickelt und zusammengestellt. Einfache Versuche zeigen die Möglichkeit zur Trennung der Schichten von Verbundfolien sowie die chemische Beschaffenheit der verwendeten Polymere. Es wird anhand der gewählten Beispiele auf die unterschiedlichen Eigenschaften von Folien, wie Sauerstoffdurchlässigkeit und Wasserdampflöslichkeit, eingegangen. Dabei wird die gezielte Kombination unterschiedlicher Folien berücksichtigt. Eine wesentliche Fragestellung bei der Auswahl von Lebensmittelverpackungen ist die Frage nach der Barrierewirkung gegenüber unerwünschten Stoffen, z.B. von Sauerstoff. Hierbei gelang es, eine Zink-Luft-Batterie so in eine geeignete Schaltung einzubauen, dass sie zum Nachweis des Sauerstoffdurchtritts durch eine Folie verwendet werden kann. Allerdings ist dieser bei üblicherweise verwendeten Folien so gering, dass im Sinne einer didaktischen Reduktion für einen Modellversuch Backpapier eingesetzt wird, um ein Experiment zu erhalten, das in einer Schulstunde durchgeführt werden kann. Eine weitere umfangreiche Versuchsserie wurde zur Durchlässigkeit von PET-Flaschen gegenüber Kohlenstoffdioxid entwickelt. Besonders interessant für Schülerinnen und Schüler sind dabei Experimente, die zeigen, dass PET Kohlenstoffdioxid in geringen Mengen speichert. Exemplarische Unterrichtsentwürfe zeigen, welche konkreten Möglichkeiten für die Umsetzung des Themas gegeben sind. Hierfür wurden exemplarisch Entwürfe zum Forschend-entwickelnden Unterrichtsverfahren, zum Analytisch-synthetischen Verfahren, zum Expertenunterricht, zur Chemie im Kontext, zum Wahldifferenzierten Chemieunterricht und zum Projektunterricht / projektorientierten Chemieunterricht ausgearbeitet. Insgesamt vermittelt die vorliegende Arbeit einen umfassenden Zugang zum Thema Lebensmittelverpackung im Chemieunterricht, wobei ausgehend von den fachlichen Grundlagen die schulexperimentellen Möglichkeiten und Wege der unterrichtlichen Umsetzung entwickelt wurden.
Chloridkanäle und -transporter sind an wichtigen physiologischen Prozessen beteiligt [Jentsch et al., 2002; Zifarelli & Pusch, 2007; Jentsch, 2008] und mutationsbedingte Funktionsdefekte können mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht werden [Planells-Cases & Jentsch, 2009]. Trotz der großen physiologischen Relevanz bilden diese Proteine eine unterrepräsentierte Klasse in der pharmakologischen Wirkstoffsuche [Verkman & Galietta, 2009], auch aufgrund fehlender adäquat robuster und Durchsatz-starker Testsysteme. Vor allem die Vertreter der intrazellulären CLC-Proteine, von denen bereits zwei eindeutig relevanten Krankheiten zugeordnet werden konnten (ClC-5 – Dent´sche Krankheit; ClC-7 – Osteopetrose), entziehen sich aufgrund ihrer vesikulären Lokalisation den klassischen elektrophysiologischen Methoden. Aus diesem Grund kam in dieser Arbeit die SSM-Technik [Schulz et al., 2008] zur Charakterisierung des lysosomalen Cl-/H+-Antiporters ClC-7 zum Einsatz. Bei geeigneter Membranpräparation können mit dieser Methode auch vesikuläre Transportprozesse elektrophysiologisch untersucht werden. Neben der grundlegenden biophysikalischen Untersuchung von ClC-7 war es mit Hilfe der SSM-Technik möglich, die Protonen-gekoppelte Antiportaktivität dieses vesikulären CLC-Vertreters nachzuweisen. Außerdem wurde ein robuster Assay etabliert, der auch die pharmakologische Untersuchung von ClC-7 erlaubt. Mit diesem konnte gezeigt werden, dass ClC-7 spezifisch durch die Chloridkanalblocker DIDS und NPPB mit relativ hoher Affinität (DIDS: IC50= 39 µM, NPPB: IC50= 156 µM) zu inhibieren ist. Da ClC-7 auch als potentielles Target in der Osteoporose-Therapie diskutiert wird [Schaller et al., 2005], bietet die SSM-Technik somit eine Plattform für pharmakologische Untersuchungen an diesem Transporter. Neben dem Wildtyp Protein wurde weiterhin die Funktionalität einer physiologisch wichtigen, der Osteopetrose zuzuordnenden Mutante (G215R), untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Mutante noch immer eine signifikante Transportaktivität besitzt, jedoch einen schweren Lokalisationsdefekt aufweist und nicht mehr korrekt in die Lysosomen transportiert wird. Durch Koexpression der funktionalen beta-Untereinheit Ostm1 [Lange et al., 2006] war es möglich, die lysosomale Lokalisation teilweise, jedoch nicht vollständig wiederherzustellen. Dieser Effekt könnte somit ein Grund für den relativ milden Krankheitsverlauf der mit dieser Mutation verbundenen autosomal dominanten Osteopetrose (ADOII, Alberts-Schönberg Krankheit) sein. Da die SSM-Technik bisher ausschließlich zur Untersuchung primär und sekundär aktiver Transporter zum Einsatz kam [Schulz et al., 2008; Ganea & Fendler, 2009], wurde weiterhin die Eignung der Methode zur Charakterisierung passiver Ionenkanäle anhand des ligandengesteuerten P2X2 Rezeptors überprüft. Ein Vergleich der gewonnenen elektrophysiologischen und pharmakologischen Daten lieferte gute Übereinstimmungen mit den Ergebnissen konventioneller elektrophysiologischer Untersuchungen. So konnte gezeigt werden, dass sich die SSM-Technik auch zur Charakterisierung von Ionenkanälen eignet. Da Ströme über Ionenkanäle bei den klassischen Methoden über eine extern angelegte Spannung gesteuert werden, solch eine Kontrolle bei der SSM-Technik jedoch nicht möglich ist, wurde schließlich in dieser Arbeit versucht, mit Hilfe der lichtgesteuerten Protonenpumpe Bakteriorhodopsin (bR) eine Spannungskontrolle zu etablieren. Anhand eines Fusions-basierten Modellsystems [Perozo & Hubbell, 1993] konnte gezeigt werden, dass lichtgesteuerte Ionenpumpen prinzipiell zur Kontrolle von Ionenkanälen an der SSM genutzt werden können. Allerdings eignet sich bR aufgrund seiner geringen Plasmamembranexpression in CHO Zellen nicht zur direkten Koexpression und Steuerung von Vertebraten-Proteinen. Der Einsatz eukaryotischer Ionenpumpen, kombiniert mit Anionendiffusionspotentialen [Perozo & Hubbell, 1993], könnte sich allerdings als erfolgsversprechend erweisen und die SSM-Technik auch für die Charakterisierung von stark spannungsabhängigen Ionenkanälen öffnen.
Die vorliegende Arbeit beinhaltet die Untersuchung des Schwingungsenergietransfers im N-Methylazetamid (NMA) Molekül und von Wärmetransportprozessen im lichtschaltbaren 310-Aib-Oktapeptid. Dazu unternahmen wir Nichtgleichgewichts-MD-Simulationen und analysierten den zeitlichen Energiefluss in den jeweiligen Biomolekülen. Die Simulationsergebnisse wurden dann im Rahmen der in Kapitel 2 vorgestellten Theorien zum Energietransfer diskutiert. ...
Neue Synthesestrategien als Thema des Chemieunterrichts - Experimente zur Kombinatorischen Chemie
(2010)
In der vorliegenden Dissertation wurde die experimentelle Umsetzung der Thematik Kombinatorische Chemie für den Chemieunterricht in der Sekundarstufe II ausgearbeitet. Dazu wurden geeignete Experimente erarbeitet, die einen Einblick in die Kombinatorische Chemie und somit in die neuen Arbeitmethoden der heutigen Chemie schaffen. Mit deren Hilfe gängige Synthesemethoden wie die Split and Combine-Synthese, Teabag-Methode, Spot-Methode und Pin-Methode aufgezeigt werden können und von den Schülern selbst durchgeführt werden. Als ein vorteilhaftes Modell zum Aufzeigen der Arbeitsweise der Kombinatorischen Chemie haben sich Farbstoffe erwiesen, da sie schnell darstellbar sind und keiner aufwendigen Detektion der entstandenen Produkte bedürfen. Als erstes Farbstoffsystem wurden Azofarbstoffe ausgewählt, da sie auch im fakultativen Themenbereich „Farben“ im Chemieunterricht thematisiert werden. Die Übertragung der normalerweise in Lösung hergestellten Azofarbstoffe auf die Festphasenchemie musste zuerst eine geeignete und kostengünstige Festphase gefunden werden. Hierbei haben sich im Handel erhältliche Ionenaustauscher (Harze ohne Linker), die auch zur Wasseraufbereitung verwendet werden, als geeignet herausgestellt. Die erforderlichen Reaktionsbedingungen der Lösungsreaktionen wurden erprobt, optimiert und auf die Festphasenchemie übertragen. Eine Übertragung der Syntheseprinzipien auf drei weitere Farbstoffsysteme wie der Fluoreszenzfarbstoffe der Pyrydin- und Pyrylium-Reihe sowie der Oxidationsfarbstoffe schloß sich an. Nunmehr stehen für den schulischen Einsatz, aber auch für die Ausbildung, einfache Systeme zur Verfügung, die anhand schnell und problemlos durchzuführender Experimente einen Zugang zu unterschiedlichen Methoden der Kombinatorischen Chemie vermitteln können. Dabei bieten die Experimente Anregungen für weitere Arbeiten. Als problematisch stellte sich jedoch der Zugang zu mehrstufigen kombinatorischen Synthesen auf dem Gebiet der Farbstoffe dar. Hier stößt man mit den aus didaktischen Überlegungen sehr einfach gewählten Beispielen an eine Grenze. Ergänzend wurde die Thematik Kombinatorische Chemie mit hochbegabten Schülern der Internatsschule Schloß Hansenberg und interessierten Schülern aus dem Raum Frankfurt, die an dem Projekt Science Camp teilnahmen, erprobt und das Verständnis für diese Thematik mittels eines Fragebogens untersucht. Ein direkter Vergleich beider Schülergruppen konnte aufgrund unterschiedlicher schulischer Bildung nicht vorgenommen werden, weshalb die Auswertung lediglich erste Eindrücke vermittelt. Danach ist das bisher ausgearbeitete Konzept in Lerngruppen mit hochbegabten Schülern gut einsetzbar. Ein Vergleich mit durchschnittlich leistungsstarken Lerngruppen steht noch aus. Eine wünschenswerte Erweiterung und ein Ausbau der Thematik aus Sicht der Schulchemie sollte anorganische Systeme mit einbeziehen und Strategien der Dekonvolution.
Qualität und Qualitätsmanagement in der universitären naturwissenschaftlichen Lehrerfortbildung
(2010)
Vor dem Hintergrund der politischen Entwicklungen in Hessen und der allgemeinen Debatte über Qualität im Bildungsbereich sollte im Lehrerfortbildungszentrum Chemie (lfbz-Chemie) der Universität Frankfurt am Main eine systematische Qualitätsentwicklung etabliert und dieses Vorhaben wissenschatflich begleitet werden. Die wissenschaftliche Arbeit besteht aus drei Säulen: - Eine erste, qualitative Studie sollte Qualitätskriterien und -indikatoren liefern. - In einer Fallstudie am lfbz-Chemie Frankfurt sollte die Einführung von Instrumenten des Qualitätsmanagements aus dem gewerblichen Weiterbildungsbereich beobachtet und bewertet werden. - Eine bundesweite Umfrage unter universitären Fortbildungsanbietern im naturwissenschaftlichen Bereich sollte sowohl die Struktur der anbietenden Institutionen als auch die allgemeine Einstellung der Befragten zum professionellen Qualitätsmanagement (QM) nach einem im gewerblichen Bereich geläufigen Modell (LQW) beleuchten. Die Qualitätsindikatoren und -kriterien fielen sehr spezifisch für die naturwissenschaftliche Lehrerfortbildung aus. Allein die drei folgenden Bereiche erfassen zwei Drittel aller Nennungen: die „Qualität der Teamer bzw. Moderatoren“, die „Fortbildungsgestaltung“ und die „Zielgruppenorientierung (Schulbezug)“. Nimmt man die Anzahl der Indikatoren und Kriterien pro Bereich als Maßstab, fokussieren die Befragten sehr stark auf Anforderungen, die die Professionalität des Personals betreffen. Zur Orientierung für die Qualitätsarbeit am lfbz-Chemie (Fallstudie) wurde das QM-Modell LQW 2 gewählt; als kleinere Instrumente kamen die Tabellen nach dem Vorbild der Balanced Scorecard (BSC) nach Kaplan und Norton sowie die Stärken-Schwächen-Analyse zum Einsatz. Als erstes Ergebnis der Fallstudie kristallisierten sich drei Arbeitsbereiche heraus: Personalorganisation, Evaluation und Innovationen. Diese Arbeitsfelder ergänzten die identifizierten Anforderungen an Fortbildung somit um Bereiche, die eher der organisatorischen Ebene zuzuordnen sind. Es ließ sich in der Fallstudie feststellen, dass ein ganzes Qualitätsmanagementmodell wie LQW 2 nur als Anregung für den einen oder anderen, als wichtig erachteten Bereich dienen konnte, während sich kleinere Instrumente eher als handhabbar erwiesen. Außerdem konnte postuliert werden, dass - ein persönlicheres Eingehen auf die Ziele und Aufgaben der einzelnen Personen im Sinne eines Total Quality Managements vermutlich zu besseren Ergebnissen geführt hätte als die Konzentration auf allgemeine Themen und die Orientierung am eher abstrakten Modell, - Erfolge sehr nachdrücklich kommuniziert werden müssen und - möglichst eine Person aus dem Stammpersonal für den Bereich Qualität verantwortlich sein sollte. Um ergänzend zur Fallstudie zu allgemeineren Schlüssen gelangen zu können, wurde eine Charakterisierung der universitären Fortbildungsanbieter mittels Clusteranalyse mit Daten der bundesweiten Umfrage durchgeführt. Sie zeigte vier Typen von Anbietern auf. Insgesamt fanden sich neben der Gruppe der großen Anbieter, zu denen auch das lfbz-Chemie gehört, nur vergleichsweise kleine Anbieter. Die in der Fallstudie erhaltenen Ergebnisse können somit nur eingeschränkt auf die meisten Anbieter übertragen werden. Insgesamt konnten Stärken und Schwächen der universitären Anbieter identifiziert werden, mit denen sich die universitäre naturwissenschaftliche Lehrerfortbildung von der gewerblichen Weiterbildung abhebt. Stärken lagen vor allem in den besonderen Kompetenzen, die an der Hochschule anzutreffen sind. Problemfelder lagen ausgerechnet hauptsächlich im Personalbereich. Als spezifische Schwächen der universitären Anbieter im Personalbereich kann z. B. die Stellung der Fortbildung als Nebenaufgabe oder der Verlust von Know-how durch die Fluktuation des Personals gelten. Auch allgemein kann ein Modell wie LQW 2 als Anregung für die Qualitätsarbeit in der universitären Lehrerfortbildung dienen, nicht jedoch umfassend umgesetzt werden. Die „kleineren“ Instrumente können dagegen eher als allgemein geeignet betrachtet werden. Während die „großen“ Anbieter durch verbesserte personelle Ressourcen für Aufgaben wie die Qualitätsarbeit unterstützt werden könnten, bietet sich für die „kleinen“ Anbieter eher die Unterstützung durch eine zentrale Stelle der Universität an, um die Fortbildungsanbieter doch noch in ein professionelles Qualitätsmanagement einbinden zu können.
Die Genexpression in prokaryotischen Organismen unterliegt einer Vielzahl von Regulationsmechanismen, deren Aufgabe darin besteht, die Zelle an sich ändernde Umweltbedingungen anzupassen, um so das Überleben des prokaryotischen Organismus zu gewährleisten. Eine Reihe von Hitzeschock- und Virulenzgenen unterliegen temperaturabhängiger Regulation, mit dem Ziel, die Zelle an die sich ändernde Umgebung anzupassen. Die Messung der Temperatur erfolgt dabei über temperatursensitive RNA-Elemente, sogenannte RNA-Thermometer, die sich üblicherweise in der 5’-untranslatierten Region der Gene befinden, die sie regulieren. Sie unterdrücken die Translationsinitiation, indem sie die Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz bei niedrigen Temperaturen über Basenpaarung blockieren und dadurch die Bindung des Ribosoms verhindern. In Kapitel 2 der vorliegenden Arbeit wurde die thermodynamische Stabilität der temperatursensitiven Haarnadelschleife 2 des Salmonella FourU RNA-Thermometers über einen breiten Temperaturbereich analysiert. Freie Enthalpie-, Enthalpie- und Entropie-Werte für die Basenpaaröffnung der einzelnen Nukleobasen innerhalb der RNA wurden über die temperaturabhängige Messung von Iminoprotonen-Austauschraten mittels NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Austauschraten wurden für die Wildtyp-RNA und die A8C-Mutante bestimmt und miteinander verglichen. Es zeigte sich, dass die Wildtyp-RNA durch das außergewöhnlich stabile Basenpaar G14-C25 stabilisiert wird. Dies konnte durch die Untersuchung der Entfaltung der destabilisierenden G14A-C25U-Doppelmutante verifiziert werden. Über CD-spektroskopsiche Untersuchungen konnte der globale Entfaltungsübergang der jeweiligen RNA analysiert werden. Das Mismatch-Basenpaar innerhalb des Wildtyp-RNA-Thermometers (A8-G31) erwies sich als Ursache für die geringere Kooperativität des Entfaltungsübergangs der Wildtyp-RNA im Vergleich zur A8C-Mutante. Enthalpie- und Entropie-Werte für die Basenpaaröffnung einzelner Nukleotide sind für beide RNAs linear korreliert. Die Steigungen dieser Korrelationen stimmen mit den Schmelzpunkten der RNAs überein, die über CD-Spektroskopie bestimmt wurden. Entfaltung der RNA tritt also genau dann auf, wenn alle Nukleotide gleiche thermodynamische Stabilitäten besitzen. Die Resultate sind mit einem Reißverschluss-Mechanismus für die RNA-Helix Entfaltung konsistent und erklärbar, in dem die Stapelinteraktionen der benachbarten Nukleobasen innerhalb der RNA-Helix verantwortlich für die beobachtete Kooperativität sind. Die Ergebnisse weisen auch auf die Wichtigkeit der RNA-Lösungsmittel-Interaktion für die Stabilität der RNA-Struktur hin. So konnten langreichweitige Wechselwirkungen der A8C-Mutation auf die Stabilität der G14-Nukleobase identifiziert werden, die möglicherweise über die Hydrathülle der RNA vermittelt werden. Schließlich konnte für das FourU-Motiv eine Mg2+-Bindestelle identifiziert werden, die die temperaturabhängige Stabilität des RNA-Thermometers beeinflusst. Es besteht also die Möglichkeit, dass Änderungen der intrazellulären Mg2+-Konzentration die Expression des agsA-Gens in vivo modulierend beeinflussen. In Kapitel 3 dieser Arbeit wurden die dynamischen Eigenschaften des Phosphodiesterrückgrats einer perdeuterierten cUUCGg-Tetraloop-14mer-RNA untersucht. Dazu wurden die Relaxationseigenschaften aller 31P-Kerne dieser RNA bei magnetischen Feldstärken von 300, 600 und 900 MHz untersucht. Dipolare Relaxationsbeiträge konnten unterdrückt werden, indem eine perdeuterierte RNA-Probe in einem D2O-Puffer verwendet wurde. Um die 31P-Relaxationsdaten (R1, R2) interpretieren zu können, wurde zusätzlich mittels Festkörper-NMR die Chemische Verschiebungsanisotropie (CSA) der 31P-Kerne des Phosphodiesterrückgrats bestimmt. Die Messungen wurden bei verschiedenen Salzkonzentrationen und unter unterschiedlichen Hydratationsbedingungen durchgeführt. Aus den Daten konnte ein 31P-CSA-Wert von 178.5 ppm im statischen Zustand (S2 = 1) bestimmt werden. Auf der Grundlage der durchgeführten R1- und R2-Messungen wurde eine Modelfree-Analyse durchgeführt, um Informationen über die schnellen Dynamiken des Phosphodiesterrückgrats zu erhalten. Die Resultate zeigen, dass die Dynamiken des Phosphodiesterrückgrats auf der Subnanosekundenzeitskala stärker ausgeprägt sind als die Dynamiken der Ribofuranosylreste und der Nukleobasen. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Dynamik einer individuellen Phosphatgruppe zu der jeweiligen 5’-benachbarten Nukleobase korreliert ist. In Kapitel 4 dieser Arbeit wird die Entwicklung neuer Methoden beschrieben, mit denen Torsionswinkelinformation aus der Analyse kreuzkorrelierter Relaxationsraten gewonnen werden können. Im ersten Teil des Kapitels wird die Entwicklung einer neuen NMR-Pulssequenz beschrieben, über die der glykosidische Torsionswinkel Chi in 13C,15N-markierten Oligonukleotiden bestimmt werden kann. Mit dem neuen quantitativen Gamma-HCNCH-Experiment ist es möglich, die dipolaren kreuzkorrelierten Relaxationsraten Gamma-C6H6-C1´H1´ (Pyrimidine) und Gamma-C6H6-C1´H1´ (Purine) zu messen. Die kreuzkorrelierten Relaxationsraten wurden an einer 13C,15N-markierten cUUCGg-Tetraloop-14mer-RNA bestimmt. Die aus den Raten extrahierten Chi-Winkel wurden mit bereits vorhandener Strukturinformation verglichen. Sie stimmen bemerkenswert gut mit den Winkeln der Kristallstruktur des Tetraloops überein. Zusätzlich wurde die neue Methode an einer größeren 30mer-RNA, dem „Stemloop D“ (SLD) aus dem Coxsackievirus-B3-Kleeblatt, getestet. Für die SLD-RNA wurde der Effekt von anisotroper Rotationsdiffusion auf die Relaxationsraten untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Chi-Winkelbestimmung besonders für Nukleotide in der anti-Konformation sehr genau ist und die Methode eine eindeutige Unterscheidung von syn- und anti-Konformation zulässt. Im zweiten Teil von Kapitel 4 wird die Entwicklung des Gamma-HCCCH-Experiments beschrieben. Hierbei handelt es sich um eine neue NMR-Pulssequenz zur Messung der Gamma-C1´H1´-C3´H3´-Rate in 13C-markierten RNAs. Die Funktionsfähigkeit der neuen Methode wurde an einer cUUCGg-Tetraloop-14mer-RNA demonstriert. Zusätzlich dazu wurden die analytischen Gamma-C1´H1´-C3´H3´(P,nü_max)-, Gamma-C1´H1´-C4´H4´(P,nü_max)- und Gamma-C2´H2´-C4´H4´(P,nü_max)-Abhängigkeiten mathematisch hergeleitet. Die an der 14mer-RNA gemessenen Gamma-C1´H1´-C3´H3´-Raten wurden mit Hilfe der Gamma-C1´H1´-C3´H3´(P,nü_max)-Beziehung analysiert. Die Ergebnisse für die Pseudorotationsphase P sind konsistent mit Referenzwinkeln aus der 14mer-NMR-Struktur und den bereits bekannten (Gamma-C1´H1´-C2´H2´)/(Gamma-C3´H3´-C4´H4´)-Ratenverhältnissen. Die neue Methode liefert zusätzliche Informationen, um Konformation (P, nü_max) und Dynamik S2(C1´H1´-C3´H3´) der Ribosereste in RNA-Molekülen genauer beschreiben zu können. In Kapitel 5 dieser Arbeit wird die Entwicklung des 3D-HNHC-Experiments, einer neuen NMR-Pulssequenz, beschrieben. Dieses Experiment ermöglicht es, die H2-, C2- und N1-Resonanzen in Adenin-Nukleobasen 13C, 15N-markierter RNA-Oligonukleotide miteinander zu korrelieren. Die Funktionsfähigkeit der neuen Methode wurde an einer mittelgroßen, entsprechend markierten 36mer-RNA demonstriert. Die neue Methode vereinfacht die Zuordnung der Kerne der Adenin-Nukleobasen, da Zuordnungsmehrdeutigkeiten aufgrund überlappender Resonanzen in der 1H-Dimension aufgelöst werden können. In Kombination mit dem TROSY-relayed-HCCH-COSY-Experiment liefert das neue 3D-HNHC-Experiment das fehlende Glied für die Zuordnung der Imino-H3-Resonanzen der Uracil-Nukleobasen über das AU-Basenpaar hinweg zu den H8-Resonanzen der Adenin-Nukleobasen.
Das Ziel dieser Arbeit ist die Synthese von nicht-kovalenten supramolekularen Komplexen, um nachfolgend aus den Kristallstrukturen dieser Verbindungen bessere Einsichten über die H-Brückenwechselwirkungen zwischen den organischen Molekülen zu erlangen. Um an dieses Ziel zu kommen, wurde ein Konzept zur gezielten Synthese von supramolekularen Komplexen entwickelt. Die Steuerung des Co-Kristallisationsprozesses ist keine einfache Aufgabe, deshalb darf der Verlauf einer solchen Synthese von nicht-kovalenten Verbindungen nicht einfach dem Zufall überlassen werden. Der Start erfolgt mit einer gründlichen Auswahl der Verbindungen durch Intuition mit Hilfsmitteln (Chemikalienkataloge und chemische Datenbanken). In einem Selektionsabschnitt werden chemische Datenbanken, analytische Methoden und rechnergestützte Programme zu Hilfe genommen. Aussichtsreiche Kandidaten werden mit dem Programm SUPRA getestet; so zeigt sich, ob das gewünschte H-Brückenmuster prinzipiell realisierbar ist. Auch die verschiedenen Vorproben zum Test auf H-Brücken gebundene Komplexe (siehe Kapitel 8 und 9) liefern wertvolle Informationen. Mit den so ausgewählten Kandidaten wurden schließlich Kristallisationsversuche angesetzt. Falls möglich können Strukturvorhersagen der jeweiligen Komplexe mit Hilfe von Strukturvorhersageprogrammen getroffen werden (siehe Kapitel 7). Die erhaltenen Co-Kristalle werden anschließend am Einkristalldiffraktometer gemessen und darauf folgend die Kristallstrukturen gelöst. Um die Reaktionsbedingungen zur Bildung von bestimmten supramolekularen Komplexen kontrollieren zu können, wurden die Gitterenergie des Komplexes berechnet und die Schmelzpunkte bestimmt. Mit Kenntnis der Gitterenergie des Komplexes, der Edukte bzw. der Pseudokomplexe kann die Reaktionsbedingung so eingestellt werden, dass nur eine bestimmte Verbindung bei einer vorgegebenen Reaktionsbedingung auskristallisiert. Der Einfluss bzw. die Auswahl von Lösungsmitteln darf bei Co-Kristallisationsprozessen nicht vernachlässigt werden. Der erste Abschnitt dieser Arbeit befasst sich mit der Synthese von supramolekularen Komplexen aus Komponenten, die ausschließlich zwei Protonen-Akzeptoren bzw. zwei Protonen-Donoren (AA-DD-Muster) beinhalten. Die fehlgeschlagenen Experimenten passen zur Trefferquote dieser Verbindungsklasse in der CSD. Der Grund für diesen Misserfolg ist grundsätzlich auf die geometrische Anordnung der freien Elektronenpaare der Akzeptoren zurückzuführen. Sind Sauerstoffatome an solchen H-Brückenmustern als H-Akzeptoren beteiligt, ist es oft nicht möglich, eine lineare Anordnung der H-Donorengruppe mit diesen Sauerstoffatomen als Akzeptoren zu bewerkstelligen. Nach erfolglosen Bemühungen wandten wir uns Verbindungen zu, die mindestens drei Akzeptoren bzw. Donoren im jeweiligen Molekül aufweisen. Für dieses Experiment wurden zunächst starre, kleine organische Moleküle ausgesucht. Das AAA-DDD-Muster konnte im gesamten Verlauf dieser Arbeit nicht hergestellt werden. Es ist nicht leicht, eine Verbindung zu synthetisieren, bei der alle H-Akzeptorgruppen auf einer Seite benachbart angeordnet sind. Eine Literaturaussage, dass Verbindungen mit dem AAA-DDD-Muster die stabilsten aller dreifach gebildeten Wasserstoffbrückenbindungen sind, konnte daher nicht experimentell verifiziert werden. Unsere Gruppe hat daraufhin versucht, die bekannten H-Brückenmuster aus den Watson-Crick-Basenpaarungen (AAD-DDA) sowie das ADA-DAD-Muster nachzuahmen. Nur mit dem Muster ADA-DAD konnten Erfolge erzielt werden. Die entsprechenden Komplexe konnten nicht nur erfolgreich synthetisiert, sondern auch durch die Einführung sterisch anspruchsvoller Substituenten die Bildung von unerwünschten Wasserstoffbrückenmustern gezielt verhindert werden. Nachdem die Synthese von zahlreichen Komplexen gelang, sind wir zu pharmazeutischen Wirkstoffen übergegangen. Mit diesem Schritt soll eine Brücke zur Pharmazie geschlagen werden. Vier pharmazeutische Wirkstoffe mit definiertem Wasserstoffbrückenmuster wurden ausgesucht und anschließend mit den passenden Gegenstücken zur Kristallisation angesetzt. Nur für Trimethoprim konnten Co-Kristalle erhalten werden. Mit diesem Wirkstoff konnte anschließend gezeigt werden, wie sich Moleküle in bestimmten chemischen Umgebungen im Festkörper anpassen und ihre geometrische Anordnung ändern, um die bestmöglichen Wechselwirkungen zu erreichen. Sämtliche Kristallstrukturen von Trimethoprim, die in der CSD in neutraler Form aufzufinden sind, demonstrieren, wie flexibel diese Verbindung in Abhängigkeit von der Umgebung ihre Konformation ändert. In dieser Arbeit konnte auch gezeigt werden, wie Kristallisationsbedingungen verändert werden sollten, um den gewünschten Komplex herstellen zu können. Die Schmelzpunktbestimmung sowie die Kombination mit der Gitterenergie dienten dazu, für die gegebenen Verbindungen die passenden Bedingungen für den Kristallisationsprozess zu ermitteln. Die Schmelztemperaturen von drei in der Struktur ähnlichen Komplexen liegen jeweils zwischen den Schmelztemperaturen ihrer Ausgangsverbindungen, was zu der Annahme verleitet, dass bei höheren Temperaturen die Verbindungen mit höheren Schmelztemperaturen und somit stabileren Kristallgittern bevorzugt gebildet werden. Wird die Temperatur gesenkt, so könnten alle Formen von Kristallen (die der Edukte, Pseudokomplexe und der supramolekularen Komplexe) in einer einzigen Probe anfallen. Um die Gültigkeit dieser Annahme zu überprüfen, bedarf es der Durchführung von Pulveraufnahmen der gesamten Proben. Diese konnten aufgrund der geringen Mengen an Kristallsubstanz nicht realisiert werden. In Zukunft wird das Augenmerk besonders auf die Erforschung von supramolekularen Komplexen mit anspruchsvolleren Freiheitsgraden gelegt. Diese Komplexe sollen mehrere Rotationsfreiheitsgrade besitzen bzw. aus mehr als vier H-Brücken komplementär zusammengesetzt sein. Darüber hinaus ist unsere Gruppe immer noch bemüht, Komplexe zu co-kristallisieren, die am Ende die Muster bzw. die Konstellationen aufweisen, die von vornherein konzeptionell ausgearbeitet wurden.
Um die Bedeutung bestimmter Neurone oder Klassen von Neuronen innerhalb von Nervensystemen zu untersuchen, sind Methoden, die eine Manipulation der Aktivität der Neurone in vivo erlauben, besonders nützlich. Die bisher zur Verfügung stehenden Methoden haben jedoch Einschränkungen in beispielsweise der Zelltypspezifität, der zeitlichen Präzision, der Reversibilität oder der Anwendbarkeit in frei beweglichen Tieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden optogenetische, d.h. auf der Expression lichtempfindlicher Proteine basierende Methoden entwickelt, um eine präzise Manipulation des Membranpotentials definierter Neurone durch Licht zu ermöglichen. Die Techniken wurden daraufhin zur Untersuchung z.B. der Neurotransmission sowie der Funktion kleiner Netzwerke im Nervensystem des Nematoden Caenorhabditis elegans verwendet. Die zelltypspezifische heterologe Expression des lichtgesteuerten Kationenkanals Channelrhodopsin-2 (ChR2) aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii ermöglichte es, Muskel- oder Nervenzellen der Nematoden durch blaue Beleuchtung innerhalb weniger Millisekunden zu depolarisieren. Dadurch ließen sich spezifische Verhaltensweisen in frei beweglichen Tieren auslösen. Dieser Ansatz wird in Zukunft die Untersuchung der Bedeutung einzelner Neurone innerhalb ihrer Schaltkreise deutlich erleichtern. So konnte hier gezeigt werden, dass die Photostimulation des propriorezeptiven Neurons DVA eine signifikante Erhöhung der mittleren Körperbiegungswinkel während der sinusförmigen Fortbewegung der Tiere zur Folge hatte. Außerdem wurde versucht, die Anwendbarkeit von ChR2 durch die gezielte Manipulation der subzellulären Lokalisation mittels Fusion mit speziellen Peptiden oder Proteinen zu erhöhen. Des Weiteren wurde eine zur Verwendung von ChR2 analoge Methode zur Hemmung von Neuronen durch Licht entwickelt. Hierfür wurde die lichtgetriebene Cl--Pumpe Halorhodopsin aus Natronomonas pharaonis (NpHR) zelltypspezifisch in C. elegans exprimiert. Durch Photoaktivierung von NpHR mit gelbem Licht war es möglich, Muskelzellen und cholinerge Neurone zu hyperpolarisieren und somit in ihrer Aktivität zu hemmen. Dies führte in frei beweglichen Tieren zu einer augenblicklichen Paralyse verbunden mit einer drastischen Reduktion der Schwimmfrequenz und einer Erhöhung der Körperlänge. Die Aktionsspektren von ChR2 und NpHR sind unterschiedlich genug, um eine unabhängige Photoaktivierung der beiden Proteine mit blauem und gelbem Licht zu ermöglichen. Dadurch konnte die Aktivität von Muskelzellen und cholinergen Neuronen nach Koexpression der beiden Proteine bidirektional kontrolliert werden. Es wurden somit Methoden entwickelt, die in vivo eine zeitlich äußerst präzise Manipulation des Membranpotentials definierter Neurone mit Licht verschiedener Wellenlängen ermöglichen. Die Beobachtung der dadurch induzierten Verhaltensänderungen erlaubt es, zuverlässige Aussagen über die Bedeutung einer Nervenzelle für die Ausprägung eines Verhaltens zu treffen und wird die Erforschung der Nervensysteme von C. elegans und anderen Modellorganismen deutlich vereinfachen. Schließlich wurden in dieser Arbeit optogenetische Methoden zur Untersuchung der synaptischen Übertragung an neuromuskulären Synapsen (neuromuscular junctions, NMJs) von C. elegans entwickelt. Hierfür wurde ChR2 in GABAergen oder cholinergen Neuronen exprimiert, um eine lichtgesteuerte Freisetzung des inhibitorischen Neurotransmitters GABA bzw. des exzitatorischen Neurotransmitters Acetylcholin (ACh) an NMJs zu erreichen. Die Methode wurde OptIoN getauft, ein Akronym für „Optogenetic Investigation of Neurotransmission“, also „optogenetische Untersuchung der Neurotransmission“. Die GABA-Freisetzung hatte ähnlich wie die NpHR-vermittelte Photoinhibition von Muskelzellen eine Reduktion der Schwimmfrequenz und Erhöhung der Körperlänge zur Folge. Die Ausschüttung von ACh verursachte hingegen starke Muskelkontraktionen verbunden mit einer Reduktion der Körperlänge. Die Änderungen der Körperlänge waren bei Mutanten mit verschiedenen Neurotransmissionsdefekten signifikant unterschiedlich im Vergleich zum Wildtyp. Außerdem kam es während längerer Beleuchtungsphasen in Mutanten mit defektem Recycling der synaptischen Vesikel (SV) zu einer verstärkten Abnahme der lichtinduzierten Effekte. OptIoN ermöglicht es dadurch erstmals, die Mechanismen des SV-Recyclings in C. elegans Verhaltensexperimenten zu untersuchen. In elektrophysiologischen Messungen ließen sich durch kurze Lichtpulse wiederholt und mit hoher Frequenz Neurotransmitter-spezifische postsynaptische Ströme evozieren. Diese Ströme waren in Mutanten mit gestörter SVExozytose reduziert und gingen bei wiederholter Stimulation in Mutanten mit defektem SVRecycling schneller zurück. Die Verwendung von OptIoN erleichtert die elektrophysiologische Untersuchung neuronaler Defekte und stellt erstmals eine Möglichkeit dar, Vorgänge der neuronalen Plastizität in dem genetischen Modellsystem C. elegans zu untersuchen. Das Potential von OptIoN zeigte sich unter anderem auch in der Identifizierung eines neuen, über metabotrope GABA-Rezeptoruntereinheiten vermittelten Mechanismus zur heterosynaptischen Hemmung cholinerger Neurone.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Lewis-Säure-katalysierte Friedel-Crafts-Alkylierungen unter Verwendung von Bismut(III)-Salzen als Katalysator untersucht. Bismut(III)-Salze haben gegenüber vielen anderen Metallsalzen den Vorteil, dass sie ungiftig, luftstabil und preiswert sind. In der Regel werden bei der Friedel-Crafts-Alkylierung überstöchiometrische Mengen einer Lewis-Säure wie AlCl3 benötigt und insbesondere Alkylchloride als Reaktionspartner eingesetzt, was eine hohe Menge unerwünschter Abfallprodukte zur Folge hat. Der Einsatz katalytischer Mengen Bi(OTf)3 und die Verwendung von Benzylalkoholen als elektrophile Reaktionspartner beheben diesen gravierenden Nachteil, da hier lediglich Wasser als Nebenprodukt gebildet wird. So konnte innerhalb der vorliegenden Arbeit zunächst eine effiziente Bi(OTf)3-katalysierte Alkylierungen von 1,3-Diketonen unter Verwendung von Benzyl- und Allylalkoholen als Elektrophile entwickelt werden. Mit lediglich 1 Mol-% Bi(OTf)3 konnten die gewünschten 3-alkylierten 1,3-Diketone in guten Ausbeuten isoliert werden. Weiterhin konnten neben Allyl- und Benzylalkoholen auch Styrene als Elektrophile genutzt werden. Unter Verwendung von 0.5 - 5 Mol-% Bi(OTf)3 konnten sowohl Arene, als auch 1,3-Dicarbonylverbindungen wie z. B. Acetylacetonat als nucleophile Reaktionspartner eingesetzt werden. Die entsprechenden 1,1-Diarylalkane und benzylierten 1,3-Dicarbonyle wurden dabei in hohen Ausbeuten erhalten. Um eine Anwendung für die zuvor entwickelten Methoden zu schaffen, wurde im weiteren Verlauf die Bismut(III)-katalysierte Benzylierung und Hydroalkylierung von 4-Hydroxycoumarinen untersucht. Die so erhaltenen Warfarinderivate sind von hohem medizinischem Nutzen, da diese Verbindungen als hoch potente Vitamin K Antagonisten eine breite Anwendung in der Thrombosevorbeugung oder als Rodentizide finden. Im zweiten Teil dieser Arbeit ging es um die Entwicklung neuer, chiraler Brønsted-Säure Katalysatoren. Die asymmetrische Brønsted-Säure Katalyse ist ein wachsendes Forschungsfeld und es konnten in den letzten Jahren viele enantioselektive Transformationen unter Verwendung chiraler BINOL-Phosphorsäurediester entwickelt werden. Bis vor kurzem waren BINOL-Phosphorsäurediester aufgrund ihres milden pH-Werts auf die Aktivierung von prochiralen Iminen beschränkt. Kürzlich wurden jedoch N-triflierte Phosphoramide als eine neue Klasse hoch potenter Brønsted-Säuren beschrieben. Während dieser Arbeit wurden zunächst verschiedene BINOL-basierte N-Triflylphosphoramide synthetisiert. Ausgehend von H8-BINOL konnte hier eine effiziente 3-Schritt Synthese dieser neuen Katalysatorklasse entwickelt werden. Dieser Syntheseweg verzichtet auf Schutzgruppen und ist daher in kürzerer Zeit und in besseren Ausbeuten durchführbar, als die zuvor beschrieben Synthesewege der ungesättigten BINOL-Phosphate oder N-Triflylphosphoramide. Strukturell wurden die auf diese Weise synthetisierten N-Triflylphosphoramide durch Röntgenstrukturanalyse, NMR und TXRF weiter untersucht und deren Aktivität gegenüber verschiedenen prochiralen Carbonylverbindungen überprüft. Hierbei wurde festgestellt, dass N-Triflylphosphoramide, im Vergleich zu BINOL-Phosphorsäurediestern, deutlich besser in der Lage sind, die asymmetrische Nazarov-Cyclisierung von Divinylketonen zu katalysieren. Die gewünschten Cyclopentenone konnten nach sehr kurzen Reaktionszeiten in hohen Ausbeuten und sehr guten Selektivitäten von bis zu 98% ee isoliert werden. Darauf aufbauend wurde die Brønsted-Säure-katalysierte Aktivierung von ungesättigten α-Ketoestern untersucht. Bei der Verwendung von N-Methylindol als Nucleophil konnten die 4-substituierten α-Ketoester unter Verwendung von 5 Mol-% eines 3,3’-silylierten-N-triflylphosphoramids in hohen Ausbeuten und sehr guten Enantioselektivitäten isoliert werden. Neben der erwarteten 1,4-Addition trat, abhängig von der gewählten Brønsted-Säure, eine Doppeladdition des Indols in 2-Position des α-Ketoesters auf. Das so erhaltene Bisindol zeigte hierbei völlig unerwartet atropisomeres Verhalten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Bildung dieses Bisindols vermutlich über eine carbokationische Spezies verläuft und es sich somit um eine enantioselektive Sn1-artige nucleophile Substitution handelt. Darauf aufbauend wurde eine N-Triflylphosphoramid-katalysierte Alkylierung von γ-Hydroxylactamen entwickelt. Hier kommt es Brønsted-Säure-katalysiert zu der Bildung eines N-Acyliminium-Ions, welches schließlich durch Indol als Nucleophil abgefangen wird. Auf diese Weise konnten verschieden substituierte γ-Hydroxylactame in die entsprechenden Indol-substituierten Analoga in hohen Enantioselektivitäten überführt werden. Dies ist das erste Beispiel einer hoch enantioselektiven, Brønsted-Säure-katalysierten Substitution von γ-Hydroxylactamen.
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass bei verschiedenen Hämostasedefekten eine unterschiedliche Aktivierung des Gerinnungssystems besteht. So wiesen Personen mit heterozygoter Prothrombin-Mutation (G20210A) eine massiv erhöhte Thrombinbildung auf, während sie in den üblichen Globaltests (Prothrombinzeit (PT) und aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT)) und der Thrombinzeit (TZ) nicht pathologisch waren. Bei Personen mit reaktiv aktiviertem Gerinnungssystem war ebenfalls eine erhöhte Thrombinbildung nachweisbar, zudem war die aPTT verkürzt. Dagegen zeigten Personen mit Antiphospholipidsyndrom und Personen mit heterozygoter/homozygoter FV-Leiden-Mutation eine leicht gesteigerte Thrombinbildung, ferner waren die anderen plasmatischen Tests (PT, aPTT, TZ), außer der Lupus-Antikoagulans-sensitiven aPTT, unauffällig. In dieser Arbeit wurde mit dem Thrombingenerierungstest (TGT) eine Methode etabliert und evaluiert, um die in-vitro Wirksamkeit neuer Antithrombotika auf die Blutgerinnung zu untersuchen. Die verwendeten Antithrombotika repräsentieren 3 Klassen oral applizierbarer, niedermolekularer Substanzen: 1. Thrombininhibitoren (Dabigatran und Melagatran) 2. FXa-Inhibitoren (Rivaroxaban und Apixaban) 3. Duale Thrombin/FXa-Inhibitoren (BR4965 und BR4966) Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Antithrombotika je nach Wirkmechanismus (FXa-Hemmung, Thrombinhemmung oder duale Thrombin/FXa-Hemmung) unterschiedliche Effekte auf die TGT-Parameter ETP (endogenes Thrombinpotential) und PEAK (größte Thrombinbildungsgeschwindigkeit) haben. Während der PEAK gut geeignet war, die antihämostatische Wirkung von selektiven FXa-Inhibitoren abzubilden, wurde das ETP durch die FXa-Inhibitoren nicht so stark beeinflusst, insbesondere in plättchenarmen Plasma (PPP). Im Gegensatz dazu hatten die selektiven Thrombininhibitoren eine gute dosisabhängige Wirkung auf das ETP, jedoch keine auf den PEAK. Mehr noch wurde für Inhibitoren mit thrombinhemmender Komponente beobachtet, dass sie den PEAK der Thrombinbildung erhöhen statt reduzieren, wenn sie in niedrigen Konzentrationen zugegeben wurden. Dieses Phänomen war umso stärker ausgeprägt, je höher die Thrombinselektivität der Substanz war. Erwartungsgemäß zeigten die beiden dualen Thrombin/FXa-Inhibitoren sowohl Eigenschaften von FXa-Inhibitoren, als auch von selektiven Thrombininhibitoren, wobei die Substanz BR4965 in ihrer Wirkung eher den FXa-Inhibitoren ähnelte und BR4966 eher den selektiven Thrombininhibitoren. In PPP und PRP (plättchenreichem Plasma) von Personen mit aktiviertem Gerinnungssystem (heterozygote/homozygote FV-Leiden Mutation, heterozygote Prothrombin-Mutation oder reaktiv aktiviertes Gerinnungssystem) zeigten die Antithrombotika ähnliche Effekte auf die Thrombinbildung wie bei gesunden Probanden. Lediglich in PRP von Patienten mit Antiphospholipidsyndrom verursachten die Inhibitoren eine stärkere Hemmung der Thrombinbildung, insbesondere die FXa-Hemmer. Der Einfluss des FXa-Inhibitors Rivaroxaban auf die PT erwies sich als dosisabhängig und korreliert eng mit dem Plasmaspiegel, so dass mit diesem Globaltest ein einfacher Monitoring-Test zur Verfügung steht. Es ist aber zu beachten, dass die PT in Sekunden abgelesen werden muss, denn nur für eine Ablesung in Sekunden, aber nicht in % (= Quick-Wert) ergab sich eine enge Korrelation mit den Plasmaspiegeln. Für das Monitoring von selektiven Thrombininhibitoren wie Dabigatran war die aPTT besser geeignet. Die Heparin-induzierte Thrombozytopenie Typ II (HIT Typ II) ist eine schwerwiegende Komplikation der Heparin-Therapie. Daher wurde untersucht, ob die neu entwickelten Antithrombotika auch das Risiko für die Enstehung einer HIT Typ II bergen. Hierzu wurde auf Basis der Thrombinbildung ein Testsystem entwickelt, in dem gezeigt wurde, dass Plättchenfaktor 4 (PF4) die gerinnungshemmende Aktivität von Heparinen, aber nicht die der neuen Antithrombotika neutralisiert. Hieraus ist zu schließen, dass PF4 an Heparine binden kann, aber nicht an die neuen Antithrombotika. Folglich sollte das Risiko einer HIT Typ II unter den neuen Antithrombotika gering sein, da hierfür zunächst Antikörper an den Komplex aus PF4 und Heparin (bzw. PF4/Antithrombotikum) binden müssen. Abschließend wurde der Einfluss der neuen Inhibitoren auf die Ausbildung der Thrombozyten- Leukozyten-Aggregate untersucht, da bei akuten thromboembolischen Ereignissen (z.B. Herzinfarkt) erhöhte Werte von Thrombozyten-Leukozyten-Aggregaten nachgewiesen wurden. Alle untersuchten Substanzen hatten eine inihibitorische Wirkung auf die Ausbildung der Thrombozyten-Leukozyten-Aggregate, wobei der hemmende Effekt umso stärker ausgeprägt war, je höher die Thrombinselektivität des Inhibitors war. In dieser Arbeit wurde mit dem Thrombingenerierungstest (TGT) eine Methode etabliert und evaluiert, um die in-vitro Wirksamkeit neuer Antithrombotika auf die Blutgerinnung zu untersuchen. Die verwendeten Antithrombotika repräsentieren 3 Klassen oral applizierbarer, niedermolekularer Substanzen: 1. Thrombininhibitoren (Dabigatran und Melagatran) 2. FXa-Inhibitoren (Rivaroxaban und Apixaban) 3. Duale Thrombin/FXa-Inhibitoren (BR4965 und BR4966) Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Antithrombotika je nach Wirkmechanismus (FXa-Hemmung, Thrombinhemmung oder duale Thrombin/FXa-Hemmung) unterschiedliche Effekte auf die TGT-Parameter ETP (endogenes Thrombinpotential) und PEAK (größte Thrombinbildungsgeschwindigkeit) haben. Während der PEAK gut geeignet war, die antihämostatische Wirkung von selektiven FXa-Inhibitoren abzubilden, wurde das ETP durch die FXa-Inhibitoren nicht so stark beeinflusst, insbesondere in plättchenarmen Plasma (PPP). Im Gegensatz dazu hatten die selektiven Thrombininhibitoren eine gute dosisabhängige Wirkung auf das ETP, jedoch keine auf den PEAK. Mehr noch wurde für Inhibitoren mit thrombinhemmender Komponente beobachtet, dass sie den PEAK der Thrombinbildung erhöhen statt reduzieren, wenn sie in niedrigen Konzentrationen zugegeben wurden. Dieses Phänomen war umso stärker ausgeprägt, je höher die Thrombinselektivität der Substanz war. Erwartungsgemäß zeigten die beiden dualen Thrombin/FXa-Inhibitoren sowohl Eigenschaften von FXa-Inhibitoren, als auch von selektiven Thrombininhibitoren, wobei die Substanz BR4965 in ihrer Wirkung eher den FXa-Inhibitoren ähnelte und BR4966 eher den selektiven Thrombininhibitoren. In PPP und PRP (plättchenreichem Plasma) von Personen mit aktiviertem Gerinnungssystem (heterozygote/homozygote FV-Leiden Mutation, heterozygote Prothrombin-Mutation oder reaktiv aktiviertes Gerinnungssystem) zeigten die Antithrombotika ähnliche Effekte auf die Thrombinbildung wie bei gesunden Probanden. Lediglich in PRP von Patienten mit Antiphospholipidsyndrom verursachten die Inhibitoren eine stärkere Hemmung der Thrombinbildung, insbesondere die FXa-Hemmer. Der Einfluss des FXa-Inhibitors Rivaroxaban auf die PT erwies sich als dosisabhängig und korreliert eng mit dem Plasmaspiegel, so dass mit diesem Globaltest ein einfacher Monitoring-Test zur Verfügung steht. Es ist aber zu beachten, dass die PT in Sekunden abgelesen werden muss, denn nur für eine Ablesung in Sekunden, aber nicht in % (= Quick-Wert) ergab sich eine enge Korrelation mit den Plasmaspiegeln. Für das Monitoring von selektiven Thrombininhibitoren wie Dabigatran war die aPTT besser geeignet. Die Heparin-induzierte Thrombozytopenie Typ II (HIT Typ II) ist eine schwerwiegende Komplikation der Heparin-Therapie. Daher wurde untersucht, ob die neu entwickelten Antithrombotika auch das Risiko für die Enstehung einer HIT Typ II bergen. Hierzu wurde auf Basis der Thrombinbildung ein Testsystem entwickelt, in dem gezeigt wurde, dass Plättchenfaktor 4 (PF4) die gerinnungshemmende Aktivität von Heparinen, aber nicht die der neuen Antithrombotika neutralisiert. Hieraus ist zu schließen, dass PF4 an Heparine binden kann, aber nicht an die neuen Antithrombotika. Folglich sollte das Risiko einer HIT Typ II unter den neuen Antithrombotika gering sein, da hierfür zunächst Antikörper an den Komplex aus PF4 und Heparin (bzw. PF4/Antithrombotikum) binden müssen. Abschließend wurde der Einfluss der neuen Inhibitoren auf die Ausbildung der Thrombozyten- Leukozyten-Aggregate untersucht, da bei akuten thromboembolischen Ereignissen (z.B. Herzinfarkt) erhöhte Werte von Thrombozyten-Leukozyten-Aggregaten nachgewiesen wurden. Alle untersuchten Substanzen hatten eine inihibitorische Wirkung auf die Ausbildung der Thrombozyten-Leukozyten-Aggregate, wobei der hemmende Effekt umso stärker ausgeprägt war, je höher die Thrombinselektivität des Inhibitors war.
Azopeptide: Peptide mit eingebauten lichtgesteuerten Schaltern sind interessante Systeme, um konformationelle Dynamik in Peptiden zu untersuchen. In dieser Arbeit ist es gelungen einen solchen Schalter herzustellen und in ein von Robertson et al. entworfenes Modellsystem als Teil des Peptidrückgrats einzuführen. Es wurde somit die Synthese von Peptiden mit eingebauten lichtgesteuerten Schaltern fortgeführt und auf ein größeres System übertragen. Die zu erwartenden Probleme bei der Synthese eines Systems dieser Größe (30 Aminosäuren + Schalter) konnten durch Modifizierung der Standardsynthese für Peptide (Fmoc-Strategie) an der Festphase erreicht werden. Es war daher möglich, ausreichende Mengen des Peptids herzustellen sowie die freie SH-Gruppe des Peptids mit einer Schutzgruppe zu versehen, was dem Molekül zu weiterer Stabilität verhalf. Das Azopeptid wurde mit UV/vis- und Ultrakurzzeit-Spektroskopie, und besonders im Vergleich mit dem Schalter AMPB alleine, charakterisiert. Hierbei wurden folgende Erkenntnisse offen gelegt: - Das Azopeptid in Wasser verhält sich bei Belichtung (367 nm) sehr ähnlich dem AMPB (7) in DMSO (isosbestischer Punkt bei 288 nm) - Die thermische Rückreaktion lässt sich bei 330 nm biexponentiell fitten, bei 260 nm nicht, was Rückschlüsse auf mangelnde Stabilität des Azopeptids nach Belichtung zulässt (freie SH-Gruppe). - Der Abfall des angeregten Zustandes des Azopeptids folgt multiexponentiellen Kinetiken auf Zeitskalen zwischen einigen hundert fs bis zu wenigen ps. - Der Schalter AMPB (7) in DMSO verhält sich bei Belichtung (367 nm) sehr ähnlich dem beidseitig entschütztem Schalter (8) in Wasser. - Es sehr ähnliche Kinetiken für AMPB (7) in DMSO und das Azopeptid in Wasser über den gesamten spektralen Bereich werden gefunden; Absorptionsaufbau erfolgt innerhalb der Zeitauflösung des Experiments, Unterschied um einen Faktor 2 in der Zerfallsdynamik, die für das Azopeptid langsamer ist. Parvulustat: Parvulustat ist wie Tendamistat ein alpha-Amylase-Inhibitor; die Struktur von Tendamistat ist bereits sehr gut sowohl durch NMR als auch durch Röntgenkristallographie untersucht ist. Mit Parvulustat teilt Tendamistat nur 29,6 % Sequenzidentität bei ähnlicher Länge und gleicher Funktion der beiden Proteine. Es war daher von großem Interesse, die Struktur von Parvulustat aufzuklären um Ähnlichkeiten und Unterschiede der beiden Proteine diskutieren zu können. In dieser Arbeit ist es gelungen mit Hilfe der hochauflösenden, heteronuklearen 3D NMR-Spektroskopie in Lösung und iterativen Rechungsmethoden die Struktur des Proteins Parvulustat, anhand von 15N- und 13C,15N-markierten Proben, in sehr guter Qualität aufzuklären. Weiterhin ist es gelungen, dynamische Eigenschaften des Proteins durch Relaxationsdaten darzustellen. Basierend auf diesen Daten war es möglich die beiden Proteine Parvulustat und Tendamistat umfassend miteinander zu vergleichen und Schlüsse bezüglich ihres Bindungsmechanismus zu ziehen. Insgesamt ist zwischen beiden Proteinen eine große Ähnlichkeit zu verzeichnen, aber es wurden auch einige Unterschiede festgestellt: beide Proteine besitzen zwar die gleiche beta-Faltblatt-Struktur, jedoch sind bei Parvulustat die einzelnen Stränge etwas kürzer ausgebildet. Weiterhin hat in Parvulustat ein Strang eine andere Krümmung, weil ein Prolin anstelle eines Leucins in Tendamistat sitzt und durch seine einzigartige Form die Struktur in dieser Region ändert. Bezug nehmend auf die Ladungsverteilung beider Proteine ist festzustellen, dass beide durch ein hydrophobes Herzstück stabilisiert werden und sich insgesamt sehr ähnlich sind, bis auf die Position R44 in Parvulustat bzw. Y46 in Tendamistat, was in Parvulustat eine positive Ladung an der Oberfläche generiert. Generell ist noch zu sagen, dass man beim Interpretieren der Daten in Bezug auf Tendamistat vorsichtig sein muss, da es durchaus Unterschiede in der Datenakquise gibt: im Gegensatz zu Tendamistat dessen Struktur anhand von homonuklearen 2D NMR-Techniken aufgeklärt wurde, waren für Parvulustat bereits 3D Pulssequenzen verfügbar, NMR-Spektrometer mit höheren Feldern, weiterentwickelte Rechenprogramme, so dass u. a. auch die Relaxationsdaten einflussnehmend in die Strukturrechnung mit eingebaut werden konnten.
Die genetische Information innerhalb einer Zelle kodiert nicht nur die spezifische Struktur und Funktion von Proteinen, sondern auch die Entstehung dieser Struktur durch den Prozess der Proteinfaltung. Aus zahlreichen experimentellen und theoretischen Studien wurde offensichtlich, dass Faltung und Entfaltung von Proteinen in vielen zellulären Prozessen eine entscheidende Rolle spielt. Diese Beobachtungen führten zu der zwangsläufigen Erkenntnis, dass das Unvermögen von Proteinen sich korrekt zu falten oder korrekt gefaltet zu bleiben der Auslöser für viele verschiedene Arten biologischen Fehlverhaltens ist und infolgedessen unterschiedliche Krankheitsformen mit sich bringt. Die strukturelle und dynamische Charakterisierung von nicht-nativen Proteinzuständen ist daher eine wichtige Grundlage einerseits zur Erforschung der krankheitsauslösenden Prozesse, andererseits aber auch zum generellen Verständnis der Proteinfaltung an sich. Allein hochauflösende NMR-Experimente können detaillierte Informationen über Struktur und Dynamiken solcher Zustände auf atomarer Ebene liefern. In der vorliegenden Arbeit wurde die C-terminale Domäne des humanen Prionenproteins [hPrP(121-230)] unter Bedingungen untersucht, bei denen dieses Protein permanent in einem nicht-nativen Zustand vorliegt. Dies wurde durch die Verwendung einer hochmolaren Harnstofflösung (8 M, pH 2,0) erreicht. Zur Untersuchung dieses nicht-nativen Zustands mittels NMR wurde das PrP(121-230) in E.coli-Zellen isotopenmarkiert exprimiert und in Mengen von einigen Milligramm aufgereinigt. Nach der sequentiellen Zuordnung der 13Ca-, 13Cb-, 13CO-, 1Ha- und 1HN-Resonanzen konnte aus den sekundären chemischen Verschiebungen auf Regionen innerhalb der Polypeptidkette geschlossen werden, die erhöhte b-faltblattartige Konformationsanteile enthalten. Heteronukleare Relaxa-tionsraten wurden zur Untersuchung der konformationellen Dynamik herangezogen. Auch hier konnten Regionen verminderter Mobilität (hydrophobe Cluster) nachgewiesen werden, die mit den zuvor entdeckten Bereichen aus der Analyse der chemischen Verschiebungen übereinstimmten. Die Messung von R1r-Relaxationsraten erbrachte zudem keine Hinweise auf konformationellen Austausch auf der μs-ms-Zeitskala. Weiterhin wurde der Einfluss der Disulfidbrücke auf Konformation und Dynamik des hPrP(121-230) untersucht. Dies wurde durch die Reduktion der Disulfidbrücke und die anschließende Methylierung der beiden Cysteine erreicht. Im Gegensatz zu der Analyse der chemischen Verschiebungen zeigte die Auswertung der konformationellen Dynamiken dramatische Unterschiede zwischen den oxidierten und reduzierten Zuständen des hPrP(121-230). Insbesondere im Bereich um die beiden Cysteine konnten große Unterschiede festgestellt werden; im reduzierten Zustand führte die zusätzliche Bewegungsfreiheit zu erhöhten Dynamiken und gab den Blick auf zusätzliche hydrophobe Bereiche frei, die im oxidierten Zustand durch hohe Relaxationsraten verdeckt geblieben waren. Ein weiterer wesentlicher Unterschied zwischen dem oxidierten und dem reduzierten Zustand des hPrP(121-230), der mit Hilfe des Fluoreszenzfarbstoffes Thioflavin T beschrieben werden konnte, bestand in der Fähigkeit Fibrillen auszubilden; während das oxidierte hPrP diese Eigenschaft besaß, führte der Verlust der intakten Disulfidbrücke zu einer Proteinkonformation, die nicht mehr zur Bildung von fibrillären Strukturen im Stande war. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden die strukturellen, dynamischen und kinetischen Charakteristika des hPrP(121-230) mit denen des murinen Prionenproteins mPrP(121-232) sowohl im oxidierten als auch im reduzierten Zustand verglichen. Auf der Basis der chemischen Verschiebungen und der heteronuklearen Relaxationsdaten konnte gezeigt werden, dass beide Proteine in den jeweiligen komplementären Zuständen (oxidiert bzw. reduziert) sehr ähnliche strukturelle und dynamische Eigenschaften besitzen. Aufgrund einiger Aminosäureaustausche in den beiden Proteinsequenzen kommt es jedoch zu kleineren Unterschieden, die jedoch nur in lokalen Bereichen der Polypeptidkette zum Tragen kommen. Somit konnte gezeigt werden, dass das mPrP(121-232) als ein geeignetes Modellsystem für das humane Prionenprotein dienen kann. Abschließend wurde der Einfluss von insgesamt zwölf verschiedenen Punktmutationen, die beim Menschen mit Prionenerkrankungen assoziiert sind, auf das Aggregationsverhalten des mPrP(121-232) untersucht. Dabei fiel zum einen auf, dass die Aggregation mit zunehmender Proteinkonzentration schneller verlief, zum anderen aber auch, dass es insbesondere bei geringen Proteinkonzentrationen zu signifikanten Unterschieden in der Aggregationsgeschwindigkeit der verschiedenen mutierten Proteinkonstrukte kommt. Zusammenfassend ist festzustellen, dass in dieser Arbeit strukturelle und dynamische Eigenschaften der nicht-nativen Zustände von hPrP(121-230) und mPrP(121-232) sowohl im oxidierten als auch im reduzierten Zustand durch die Verwendung von NMRspektroskopischen Experimenten charakterisiert werden konnten. Zudem konnte mit Hilfe von Fluoreszenzspektroskopie das Aggregationsverhalten der einzelnen Proteinzustände beschrieben und in einem ersten Schritt der Einfluss von verschiedenen Punktmutationen auf die Aggregationsgeschwindigkeit ermittelt werden.
Hintergrund: In den letzten Jahren ist der Diabetes mellitus zunehmend in den Fokus des weltweiten Interesses gerückt. Zahlreiche Arbeiten konnten eindrucksvoll aufzeigen, dass der Diabetes mellitus mit einer erhöhten Morbidität, einer verringerten Lebensqualität und Lebenserwartung sowie mit enormen Kosten für den einzelnen sowie die Gesellschaft verbunden ist. Um dieser „Lawine“ entgegenzutreten, sind in den letzten Jahren zahlreiche Anstrengungen unternommen worden. Eine war die Einführung zahlreicher neuer Wirkstoffe und Wirkstoffklassen, wie beispielsweise der kurzwirksamen Insulinanaloga. Aus pathophysiologischer Sicht bieten die Insulinanaloga gegenüber dem entsprechenden kurzwirksamen Humaninsulin zahlreiche Vorteile. Seit Einführung des ersten kurzwirksamen Insulinanalogas steht aber auch die Frage im Raum, ob und in wie weit die erheblichen Mehrkosten, die eine Therapie mit Insulinanaloga im Vergleich zu kurz wirksamem Humaninsulin verursachen, durch einen Zusatznutzen gerechtfertigt sind. Ein Cochrane-Review aus dem Jahr 2006 sowie eine Bewertung des Instituts für Qualität und Wirtschaftlichkeit im Gesundheitswesen aus dem Jahr 2005 bescheinigten den kurzwirksamen Insulinanaloga nur einen geringen bzw. keinen Zusatznutzen im Vergleich zu Humaninsulin. Werden neben dem IQWiG-Bericht weitere Quellen herangezogen, die Aussagen zum Nutzen von Medikamenten machen, wie beispielsweise Leitlinien, finden sich zum Teil widersprüchliche Aussagen, obwohl alle zuvor genannten Publikationen für sich in Anspruch nehmen, die Grundlagen der Evidence based Medicine zu berücksichtigen. Sowohl innerhalb der primären (Klinische Studien) und sekundären (Metaanalysen, HTAs, Leitlinien) klinischen Evidenz, als auch im Vergleich zu Studien zur Pharmakokinetik und –dynamik herrscht eine Diskrepanz, die weiterer Analysen im deutschen Versorgungskontext bedarf. Methodik und Daten: Es wurde ein systematischer Review zu Metaanalysen über den Vergleich von kurzwirksamen Insulinanaloga vs. kurzwirksamem Humaninsulin wie auch zu Leitlinien hinsichtlich Empfehlungen zur Anwendung von kurzwirksamen Humaninsulin bzw. Insulinanaloga in der Evidenz und Versorgungsrealität von kurzwirksamen Insulinanaloga in der Behandlung des T2DM 3 Behandlung von Typ-2-Diabetikern durchgeführt. Die identifizierten Publikationen wurden nach internationalen Kriterien und mit Methoden der EbM bewertet. In einem zweiten Schritt, wurde die Versorgungsrealität, abgebildet über Routinedaten der Gesetzlichen Krankenversicherung Gmünder ErsatzKassse, untersucht. Hierfür wurden sowohl die Stammdaten, Arzneimitteldaten, Stationäre- und ambulante Daten sowie Daten aus den Disease Management Programmen verwendet. Die Identifikation von Typ-2-Diabetikern die erstmals ein kurzwirkendes Insulin nutzten, erfolgte über ein mehrstufiges Prinzip, welches eine Erweiterung der „internen Diagnosevalidierung“ nach Ferber und Kollegen darstellt. In einem abschließenden dritten Schritt werden die Ergebnisse aus dem deutschen Versorgungskontext mit den Angabenaus der publizierten klinischen Evidenz abgeglichen. Ergebnisse: Neben dem Abschlussbericht des IQWiG konnten über die systematische Evidenzrecherche zwei weitere systematische Reviews inklusiver Metaanalyse sowie 16 Leitlinien identifiziert und in die Untersuchungen eingeschlossen werden. Im Vergleich der verschiedenen Datensätze zeigt sich eine große Diskrepanz zwischen Studienpatienten auf der einen und Patienten im deutschen Versorgungskontext auf der anderen Seite. Insgesamt konnte die vorliegende Arbeit die nicht ausreichende Evidenzbasis für einen Zusatznutzen der Analoga erneut bestätigen und weiteren Forschungsbedarf aufzeigen. Fazit: Die kurzwirksamen Insulinanaloga sind nur ein Beispiel für Arzneistoffe (-klassen), bei denen Fragen zur Kosten-Nutzen-Relation aufgrund hoher Tagestherapiekosten und eines geleichzeitig beschränkten Budgets der GKV relevant sind. Die Zukunft unseres Gesundheitssystems wird mit davon abhängen, wie das Verfahren der Kosten-Nutzen-Bewertung konkret in Deutschland umgesetzt wird bzw. wie der Marktzugang geregelt werden soll. Eine Grundbedingung ist hierbei, dass die Versorgungs- wie auch die Outcomeforschung in Deutschland ausgebaut, der Umgangmit fehlenden Daten umfassend diskutiert wird und die verfügbaren Daten stärker miteinander verknüpft werden.
Strukturelle Analyse des CusCBA-Systems von Escherichia coli Kupfer ist als Kofaktor in vielen Enzymen ein essentielles Spurenelement. Die Aufrechterhaltung der Kupferhomöostase ist für die Zelle enorm wichtig, da es sich um ein redox-aktives Übergangsmetall handelt, das selbst in geringsten Konzentrationen toxisch wirkt. Gewöhnlich ist in der Zelle kein einziges freies Kupferion nachweisbar, da die Zelle redundante Mechanismen für die Detoxifikation von Kupfer besitzt. Ein Mechanismus zur Detoxifikation von Kupfer und Silber in E. coli ist das Cus-System. Es handelt sich um einen vierteiligen Effluxkomplex, der sich aus dem inneren Membranprotein CusA, dem periplasmatischen Membranfusionsprotein CusB und dem TolC ähnlichen äußeren Membranprotein CusC zusammensetzt. Das vierte Protein dieses Systems, CusF, dient im Periplasma als Kupferchaperon. Dieser Komplex ermöglicht das Ausschleusen von Cu(I)- und Ag(I)-Ionen aus dem Cytoplasma über das Periplasma und die äußere Membran in einem einzigen Schritt. In dieser Arbeit sollte die Röntgenstruktur des periplasmatischen Proteins CusB geklärt werden, um anhand struktureller Daten analysieren zu können wie CusA und CusC über CusB miteinander verbunden sind und welche Konformationsänderungen dabei vonstatten gehen. CusB wurde dafür über Ni2+-Chelat-Affinitätschromatographie und Größenausschluss-Chromatographie bis zur Homogenität gereinigt. Das Protein lag in Lösung als Monomer vor. Kristalle von CusB wurden nach der Dampfdiffusionsmethode des hängenden Tropfens hergestellt, wobei Kristalle in nur einem von 500 verschiedenen Ansätzen entstanden sind. Röntgenstreuung wurde bis zu einer Auflösung von 8 Å am ESRF (European Synchrotron Radiation Facility) in Grenoble gemessen. Die Streuung der Kristalle ließ starke Anisotropie und hohe Mosaizität erkennen. Um die Qualität der Kristalle von CusB zu verbessern, wurden Kristalle des Proteins ohne Hexahistidinanhängsel hergestellt. Diese Kristalle zeigten in Röntgenstreuungsexperimenten keine Verbesserung der Auflösung und Qualität. Die Röntgenstrukturen und Analysen durch Protease-Verdau von den zu CusB verwandten Proteinen AcrA und MexA zeigten, dass in diesen die N-Termini und C-Termini unstrukturiert sind. Deswegen wurden zunächst Konstrukte von CusB hergestellt in denen verschieden lange Bereiche des N-Terminus deletiert wurden. Ein Konstrukt von CusB, in dem die ersten 20 Aminosäuren deletiert waren, konnte in 10 von 500 Ansätzen kristallisiert werden. Nach Feinabstimmung der initialen Ansätze wurde für Kristalle dieses Konstrukts eine Auflösung von 5,3 Å am ESRF in Grenoble gemessen. Allerdings wies die Röntgenstreuung ebenfalls ein starke Anisotropie und Mosaizität auf, so dass die Struktur dieses Proteins nicht gelöst werden konnte. Strukturelle Analyse des RNAi-Suppressors B2 des Nodamura Virus: RNAi (RNA-Interferenz) bezeichnet einen sequenzspezifischen RNA-Degradationsprozess, um die Synthese eines Proteins zu verhindern. Zwei RNA-Typen wirken als Auslöser der RNAi: Doppelsträngige RNA dient als Vorläufer von siRNAs (small interfering RNAs), während einzelsträngige RNA mit Stamm-Schleifen-Strukturen als Vorläufer der miRNA (microRNA) dient. SiRNA und miRNA werden durch die Typ III Endonuklease Dicer im Cytoplasma produziert, sind 21-30 Nukleotide lang mit charakteristischen 2-NukleotidÜberhängen am 3’-Ende. Über den Komplex aus Dicer und dem doppelsträngige RNA-bindenden Protein R2D2 werden diese kleinen RNAs an das Protein Argonaute (AGO) abgeben. Dieses baut einen Strang der doppelsträngigen, kleinen RNAs über seine RNAse-Aktivität ab und hält den anderen (Führungs-) Strang gebunden. Daraufhin wird entweder komplementäre mRNA abgebaut oder die Translation komplementärer mRNA verhindert. RNAi dient im Organismus unter anderem der Verteidigung gegen Viren, wobei die Expression viraler Proteine durch RNAi verhindert wird. Durch Koevolution haben Viren allerdings Mechanismen zur Unterdrückung der RNAi in den Wirtszellen entwickelt. Ein RNAi Suppressor ist das Protein B2 des Nodamura Virus (NMV B2). Um Mechanismen und Gemeinsamkeiten der RNAi Suppression durch Viren analysieren zu können, wurde in dieser Arbeit die Röntgenstruktur der RNA bindenden Domäne von NMV B2 gelöst. Hierfür wurde ein Konstrukt (Aminosäuren 1-79) bis zur Homogenität aufgereinigt. Kristalle wurden mit einer Proteinkonzentration von 15 mg/ml mittels der Dampfdiffusions-Methode des hängenden Tropfens hergestellt. Diese wuchsen innerhalb von zwei Tagen als lange Nadeln mit Ausmaßen von 200 x 10 x 10 μm. Bei Messungen am ESRF in Grenoble wurde eine Auflösung bis 2,5 Å erreicht. Das Protein kristallisierte mit einem Dimer pro asymmetrischer Einheit. Die Kristalle wuchsen in der Raumgruppe P212121 mit den Einheitszelldimensionen a = 32.2, b = 56.6, c = 98.6. Die Phase wurde über molekularen Ersatz mit der Struktur des homologen Proteins B2 des Flock House Virus (FHV B2) bestimmt. Die Struktur stellte sich als ein gestrecktes Dimer mit einer Größe von ca. 55 x 10 x 15 Å, bestehend aus drei Alpha-Helices pro Monomer dar. Trotz geringer Sequenzidentität von NMV B2 und FHV B2 zeigten beide Strukturen ein Vier-Helix-Bündel, das von einer sehr kurzen Helix am C-Terminus bedeckt ist. Bei einem Vergleich der RNA-bindenden Aminosäurereste der beiden Strukturen fällt ein hoher Grad an Konservierung auf. Von zehn RNA-interagierenden Resten sind fünf identisch. Die RNA bindenden Reste werden von beiden Monomeren des Dimers beigetragen. So ist wohl mindestens ein Dimer für die RNA-Bindung durch B2 Proteine notwendig.
Regulation des matrizellulären Proteins SMOC-1 durch Zytokine und Stickoxid in Rattenmesangiumzellen
(2009)
Zytokine stimulieren in Mesangiumzellen die Produktion und die Freisetzung großer Mengen entzündlicher Mediatoren. In dieser Arbeit wurden mit Hilfe der RAP-PCR („RNA arbitrarily primed polymerase chain reaction“), einer auf mRNA basierenden „Differential display“-Methode, die Effekte von Interleukin-1β (IL-1β) auf das Genexpressionsmuster in glomerulären Rattenmesangiumzellen untersucht. Dabei wurde das matrizelluläre Glykoprotein „Secreted modular calcium-binding protein-1“ (SMOC-1) identifiziert, welches in Mesangiumzellen durch IL-1β herunterreguliert wird. SMOC-1 wird von verschiedenen Zelltypen exprimiert und sezerniert, doch seine biologische Funktion konnte bisher nicht aufgedeckt werden. Weitere Experimente bestätigten, dass die mRNA- und Proteinexpression von SMOC-1 durch proinflammatorische Zytokine, wie IL-1β und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) herunterreguliert wird. Dieser Effekt wird zu einem großen Teil durch die endogene Freisetzung von Stickoxid (NO) aufgrund der Aktivität der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) und der nachfolgenden Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase (sGC) vermittelt. Außerdem tragen auch reaktive Sauerstoffver-bindungen (ROS), deren Bildung durch die Zytokine verstärkt wird, zur Herunter-regulierung der SMOC-1-Expression bei. Durch In-situ-Hybridisierungsexperimente konnte ferner gezeigt werden, dass die Hemmung der NO-Synthese durch den spezifischen iNOS-Inhibitor L-NIL in einem Rattenmodell der anti-Thy1.1-Glomerulonephritis die SMOC-1-Expression deutlich erhöhte. Dies belegt somit auch in vivo die biologische Relevanz von NO in der Modulierung der SMOC-1-Expression. Die funktionelle Rolle von SMOC-1 in Mesangiumzellen wurde durch die Hemmung der SMOC-1-Expression mit Hilfe einer spezifischen siRNA untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Hemmung von SMOC-1 eine deutliche Inhibierung der mRNA-Expression von „Transforming growth factor β1“ (TGF-β1) sowie dessen Gesamtproteinspiegel zur Folge hat. Auch die Aktivität von TGF-β1 wurde reduziert, wie anhand der verringerten Spiegel an aktivem TGF-β1-Protein und der verringerten mRNA-Expression bekannter TGF-β-regulierter Gene, wie „Connective tissue growth factor“ (CTGF), „Plasminogen activator inhibitor-1“ (PAI-1) und Biglykan gezeigt wurde. Diese Ergebnisse deuten auf eine Rolle von SMOC-1 bei der Modulierung des TGF-β1-Signalwegs hin. Zusammenfassend betrachtet scheint NO die SMOC-1-Expression in der akuten glomerulären Entzündung zu vermindern und dadurch die TGF-β-getriebenen profibrotischen Signalprozesse zu limitieren. Der zweite Aspekt dieser Arbeit befasst sich mit der Rolle von Peroxisomen-Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPAR) in der IL-1β-vermittelten Expression der induzierbaren NO-Synthase. PPARα-Aktivatoren steigern in Mesangiumzellen die IL-1β-induzierte Aktivität der iNOS, während die Hemmung von PPARα durch spezifische Inhibitoren oder siRNA die iNOS-Expression/-Aktivität deutlich reduziert. Die Ergebnisse von Promotor-studien zeigten die essentielle Rolle einer möglichen PPAR-Bindestelle im iNOS-Promotor. IL-1β scheint die Bildung eines endogenen PPAR-Liganden zu induzieren, wodurch die Bindung von PPAR-Proteinkomplexen an das regulatorische DNA-Element im iNOS-Promotor verstärkt und dessen Aktivität gesteigert wird. Daneben scheinen jedoch auch Nebeneffekte der PPAR-Aktivatoren, wie die Freisetzung von ROS, zur synergistischen Wirkung auf die IL-1β-induzierte iNOS-Expression beizutragen. Die Wirkung von dualen PPARα/γ-Aktivatoren auf entzündliche Prozesse wird seit längerem diskutiert, daher wurden die biologischen Effekte von neu synthetisierten möglichen dualen PPARα/γ-Aktivatoren auf Entzündungsparameter, wie z. B. die iNOS-Expression, in Mesangiumzellen untersucht. Alle untersuchten Aktivatoren steigerten in der Form von Esterverbindungen die IL-1β-induzierte Expression der iNOS sowie der sekretorischen Phospholipase A2 (sPLA2), während die entsprechenden freien Säuren wenig Effekte zeigten. Diese proinflammatorische Wirkung scheint jedoch weniger auf einer Aktivierung des PPAR-Rezeptors zu beruhen als auf der Freisetzung von ROS, die durch die Aktivatoren teilweise deutlich erhöht wurde. Weitere Experimente zur Charakterisierung der PPAR-spezifischen Wirkung der Aktivatoren sowie zur optimalen Wirkkonzentration sind nötig, bevor der Effekt dieser Aktivatoren auf die inflammatorische Genexpression genau bewertet werden kann.
Kraftfelder sind ein vielseitiges Werkzeug zur schnellen Berechnung vielfältiger Moleküleigenschaften. Die Qualität der damit erhaltenen Vorhersagen ist auch ein Maß, wie gut die wichtigen Einflussgrößen verstanden und vor allem in das Kraftfeld-Modell integriert sind. Bei der Parametrisierung müssen viele Effekte gegeneinander ausbalanciert werden, da die Kraftfeldterme nicht unabhängig voneinander betrachtet werden können. Umfangreiche Testrechnungen sind erforderlich, um die notwendige Qualität der Parameter sicher zu stellen. Eine Automatisierung dieses Prozesses bringt nicht nur eine enorme Zeitersparnis, sie zwingt auch zur sorgfältigen Definition von Vorgaben und Qualitätskriterien. Die Formulierung einer Strategie in einem Programm anstelle von „intelligentem Raten“ fördert zudem ein tieferes Verständnis. Bei einer Änderung der Strategie muss nur das entsprechende Programm geändert werden, dem Entwickler bleibt der manuelle Test erspart. Automatische Methoden zur Plausibilitätsprüfung vermeiden Probleme durch Fehler bei der Dateneingabe von Hand. Die programmgesteuerte Erstellung aussagekräftiger Protokolle und Grafiken macht die Fülle der bei der Parametrisierung und Evaluierung eines Kraftfeldes anfallenden Informationen für den Benutzer überschaubar. Probleme und deren Zusammenhang können so leichter erfasst werden. Für das MOMO-Kraftfeld konnten auf diese Weise verbesserte und neue Parameter für Wasserstoffbrücken abgeleitet werden, zwei empirische Punktladungsmodelle und deren Verträglichkeit mit zwei quantenchemischen Modellen verbessert und prinzipielle Probleme bei deren Vereinbarkeit erkannt werden sowie die automatische Parametrisierung von Bindungslängen, Bindungswinkeln und Torsionswinkeln ermöglicht werden. Bei Letzterem konnte jedoch keine Verbesserung gegenüber den Originalparametern erreicht werden, was nicht weiter verwunderlich ist, da diese seit Jahrzehnten entwickelt worden sind, wohingegen Wasserstoffbrücken und Partialladungen erst später hinzugekommen sind und nicht so umfangreich wie die bindenden Kraftfeldterme getestet wurden. Voraussetzung für die hier gewählte Vorgehensweise, alle Arbeiten weitgehend zu automatisieren und Strategien immer in Programme umzusetzen, waren sehr umfangreiche Programmierarbeiten. Ziel war es, auf einfache Weise die Steuerung des Kraftfeldes aus kleineren Programmen, die spezielle Probleme bearbeiten, zuzulassen. Durch die Nutzung zahlreicher Open-Source-Projekte, die gemeinsam die gewünschte Funktionalität zur Verfügung stellen, konnte der Aufwand auf die dazu passende Implementierung des MOMO-Kraftfeldes und das Verbinden mit der von diesen Projekten bereitgestellten Software beschränkt werden. Der Kern des MOMO-Kraftfeldes wurde aus Geschwindigkeitsgründen in der Compilersprache C geschrieben, Datenein- und -ausgabe und die Programme zur Parametrisierung und Auswertung wurden in Python geschrieben.
Die Gentherapie bietet eine interessante alternative Behandlungsoption bei der Therapie der HIV-Infektion und könnte langfristig die Standardmedikation mit antiretroviralen Substanzen ergänzen oder ersetzen. Antivirale Genprodukte, die frühe Schritte im HIV-Replikationszyklus hemmen, bevor sich das Virus in das Genom der Zielzelle integriert hat, sind dabei besonders vielversprechend. Hierzu zählen insbesondere die von der C-terminalen heptad repeat Region des HIV-Hüllglykoproteins gp41 abgeleiteten C-Peptide, die hochwirksame Inhibitoren des Viruseintritts sind. Während des HIV-Eintrittsprozesses interagieren sie mit den viralen gp41 N-Helices und verhindern somit die Ausbildung des zur Fusion von viraler und zellulärer Membran erforderlichen Sechs-Helix-Bündels. Die Sekretion antiretroviraler C-Peptide durch genmodifizierte T-Lymphozyten in vivo birgt großes therapeutisches Potential: Nach Freisetzung in den extrazellulären Raum können die Peptide nicht nur genmodifizierte sondern auch unbehandelte Nachbarzellen vor HIV-Infektion schützen (Bystander-Effekt). Somit könnte selbst mit den heute zur Verfügung stehenden Methoden, mit denen lediglich ein Teil aller potentiellen HIV-Zielzellen modifiziert werden kann, die Virusreplikation effektiv unterdrückt werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden daher C-Peptid-basierte in vivo sezernierte antivirale Eintrittsinhibitoren (iSAVE) für die HIV-Gentherapie entwickelt. Kurze Peptide, wie die antiviralen C-Peptide, werden von eukaryotischen Zellen aufgrund von Größenbeschränkungen beim Eintritt in den Sekretionsweg jedoch nur schlecht sezerniert. Um die effiziente Sekretion von iSAVE-Peptiden durch genmodifizierte humane Zellen zu erreichen, wurde das C-Peptid daher verlängert. Hierbei wurde das therapeutische Peptid einerseits um nicht antiviral aktive Gerüstelemente ergänzt. Andererseits wurden Concatemer-Konstrukte generiert, in denen zwei C-Peptide jeweils über einen flexiblen oder proteolytisch spaltbaren Linker verbunden sind. Die unterschiedlichen iSAVE-Peptid-Varianten wurden in vitro in transfizierten und transduzierten Zelllinien und in primären humanen T-Lymphozyten charakterisiert. Hierbei wurden Sekretionseffizienz und Prozessierung sowie antivirale Aktivität und Bystander-Inhibition der sezernierten Peptide untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Effizienz der C-Peptidsekretion stark mit der Peptidlänge korreliert, so dass durch Sequenzverlängerungen die Sekretion deutlich gesteigert werden konnte. Darüber hinaus waren N-Glykane für die effiziente Sekretion der C-Peptide unerlässlich. Die antiretrovirale Aktivität hingegen reduzierte sich mit zunehmender Peptidlänge dramatisch und wurde auch durch N-Glykane leicht beeinträchtigt, so dass weder die durch Gerüstelemente verlängerten C-Peptide, noch die ungespaltenen C-Peptid-Concatemere antiretrovirale Wirkung zeigten. Durch die Generierung proteolytisch spaltbarer C-Peptid-Concatemere konnten die strukturellen Erfordernisse für effiziente Sekretion mit hoher inhibitorischer Aktivität vereinbart werden. Die Prozessierung der Concatemere durch die Proprotein-Convertase Furin war allerdings nicht einfach zu erreichen. Nur das Einfügen eines flexiblen Linkers mit optimierter Furinerkennungssequenz zwischen den beiden C-Peptiden erlaubte die effiziente Spaltung in monomere Peptide mit hoher antiretroviraler Aktivität. Therapeutisch wirksame Peptidkonzentrationen dieser optimierten iSAVE-Peptide wurden sowohl von transfizierten und transduzierten Zelllinien als auch von primären humanen T-Zellen sezerniert. Nach Freisetzung in den extrazellulären Raum konnten die Peptide nicht nur genmodifizierte sondern auch unbehandelte Nachbarzellen in vitro vor HIV-1 Eintritt und Infektion schützen. Die generierten iSAVE-Peptide bilden damit eine hervorragende Grundlage für die weitere präklinische und klinische Entwicklung eines neuen Gentherapieansatzes zur Behandlung der HIV-Infektion.
Die gezielte Modifikation von Proteinen für die Erforschung des Proteoms stellt eine entscheidende Herausforderung dar. Sie wird meistens dann zwingend notwendig, wenn das intrinsische Signal zum Auslesen ungeeignet ist. So ist es z.B. für die größte Anzahl von fluoreszenzbasierenden Methoden unerlässlich, das zu untersuchende Protein spezifisch und einheitlich mit einem Fluorophor zu markieren. Eine weitere Schwierigkeit ist die gerichtete Immobilisierung von Proteinen für deren Charakterisierung an Oberflächen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die spezifische Markierung, Manipulation und strukturierte Immobilisierung von rekombinanten Proteinen analysiert. Dafür wurde mit dem hauptsächlich aus der Proteinreinigung bekannten NTA/Oligohistidin-System gearbeitet. Verwendet wurden multivalte NTA-Chelatorköpfen mit zwei (bisNTA), drei (trisNTA) oder vier (tetrakisNTA) NTA-Gruppen pro Molekül. Durch die Multivalenz können hervoragende Bindungsaffinitäten im nanomolaren Bereich erzielt werden, die die stabile, stöchiometrische, nicht kovalente und damit reversible Modifikation His-getaggter Proteine in Lösung und an Grenzflächen erlaubt. Fluoreszente trisNTAs wurden vielfach erfolgreich für die Markierung His-getaggter Proteine eingesetzt. Dabei wurde die Beobachtung gemacht, dass die Ni2+-Ionen im trisNTA die Emission des benachbarten Fluorophors stark quenchen und dadurch die Einsatzmöglichkeiten der Verbindung reduzieren. Durch die räumliche Trennung der beiden Gruppen mit starren, biokompatiblen Polyprolin-Helices konnte erstmals systematisch demonstriert werden, dass das Ausmaß der Fluoreszenzlöschung abstandsabhängig ist. Bei der Verwendung von 12 Prolinen (3.6 nm lange Helix) wurde mit einem ATTO565-Derivat eine Intensitätserhöhung um etwa 70%, und bei einem OregonGreen488-Derivat um etwa 40% erreicht. Bei den Verbindungen können der Abstand der beiden Gruppen voneinander und der Fluorophor nahezu frei gewählt werden, so dass eine Optimierung in Hinblick auf die jeweilige Fragestellung ohne Probleme möglich ist. In Kooperationen untersucht wurden z.B. die ATP-Hydrolyse von MDL1 und die ATP-Bindung von TAP. Die deutlich verbesserte Quantenausbeute, die stabile Bindung an einen His-Tag und die geringe Größe machen die Verbindungen zu idealen Reportersonden für die Einzelmolekül-Fluoreszenz-Analyse. Die gezielte Manipulation eines makromolekularen Proteinkomplexes mit einem kleinen Molekül wurde in einem weiteren Projekt untersucht. Das tetrakisNTA wurde verwendet, um die His-getaggten Eingänge des alphaN-His6 Proteasoms von Thermoplasma acidophilum gezielt zu blockieren. Durch den Abbau von Fluoreszein-markiertem Casein konnte die Aktivität der Proteasomkomplexe in Echtzeit verfolgt werden. Unter Zugabe von tetrakisNTA fand kein Abbau statt, während dieser ohne oder nach Entfernen der tetrakisNTAs von den Eingängen im gleichen Maße detektierbar war. Die Aktivität der Peptidase-Schnittstellen im blockierten Zustand konnte durch die Überschichtung eines nativen Gels mit einem Peptidsubstrat demonstriert werden. Die Ergebnisse belegen, dass die His-Tags an den Eingängen des Proteasomkomplexes so umstrukturiert werden, dass der Eintritt von Proteinen reversibel blockiert wird. Neben der gezielten Manipulation des Proteasoms wurde außerdem erstmals die spezifische Fluoreszenzmarkierung His-getaggter Proteine in kompletten E. coli Zelllysaten mittels nativer PAGE nachgewiesen. Um neue Anwendungsgebiete für das trisNTA zu erschließen, sollte dieses mit einem 1.4 nm großen Goldcluster modifiziert werden. Damit könnte die Position von His-Tags in Proteinkomplexen mittels Elektronenmikroskopie visualisiert werden. Mittels Gelfiltration mit MBP-H6 wurde nachgewiesen, dass die entwickelten Goldcluster teilweise mehr als eine trisNTA-Gruppe auf der Oberfläche hatten, wobei eine Trennung der Partikel nach der Anzahl der NTA-Gruppen nicht möglich war. Die Partikel wurden erfolgreich für die spezifische Markierung des alphaN-His6 Proteasoms verwendet. In der Einzelpartikelanalyse deutlich erkennbar waren der markierte Proteasomkomplex und die Lage des trisNTA-Goldclusters. Die Verwendung solcher Goldpartikel in der EM bringt entscheidende Vorteile im Hinblick auf die Strukturaufklärung von Proteinen mit sich. Orthogonale NTA/His-Tag Bindungspaare, bei denen ein bestimmtes, multivalentes NTA-Molekül einen definierten His-Tag bindet, würden einen großen Nutzen für die spezifische Markierung oder Immobilisierung verschiedener His-getaggter Proteine bringen. Durch die Verwendung teilweise rigider His-Tags und möglichst starrer bisNTAs sollten solche Bindungspaare realisiert werden. Die Synthese rigider bisNTAs mit unterschiedlichen Abständen zwischen den NTA-Gruppen konnte erfolgreich etabliert werden. Allerdings zeigten Fluoreszenztitrationen mit verschieden Fluoreszeinmarkierten His-Peptiden nicht die erhofften Unterschiede in den Affinitäten. Im letzten Teil der Arbeit wurden durch intramolekulare His-Tags inaktive trisNTAs synthetisiert. Diese können durch Licht gespalten und damit aktiviert werden (photoaktivierbare trisNTAs, PAtrisNTAs). Die Verbindungen mit unterschiedlicher Anzahl an Histidinen im intramolekularen Tag wurden systematisch in Lösung und an Oberflächen charakterisiert. Dazu wurden HPLC-Studien, Gelfiltrationen und SPR-Experimente durchgeführt. Die strukturierte Organisation von Proteinen auf solchen lichtaktivierbaren Oberflächen wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie demonstriert. Außerdem konnten durch die Laserlithographie gezielt verschiedene His-getaggte Proteine in situ in definierten Bereichen immobilisiert werden. Die Biokompatibilität der Oberflächen wurde erfolgreich durch die strukturierte Organisation aktiver, Virusbindender Rezeptor-Partikel gezeigt. Im Prinzip sollte das Konzept die lichtinduzierte Aufkonzentrierung von His-getaggten Rezeptoren in lebenden Zellen ermöglichen. Durch das Clustern ausgelöste Vorgänge könnten so gezielt herbeigeführt und analysiert werden.
Die Fluoreszenz der organischen Verbindung ''Pigment Yellow 101'' wurde mittels zeitaufgelöster Anreg-Abtast-Spektroskopie im sichtbaren Spektralbereich untersucht. P.Y. 101 und ein Derivat mit zusätzlichen Methylgruppen an den Azin-Kohlenstoffatomen, wurden mit zwei Derivaten verglichen, die keine Hydroxygruppen tragen und nicht fluoreszieren. Es konnte gezeigt werden, dass die Fluoreszenz bei diesen Verbindungen eine intrinsische Eigenschaft ist, die von der Reihenfolge der angeregten Zustände bestimmt wird. Bei Derivaten mit Hydroxygruppe entspricht der niedrigste angeregte Zustand einem pp*-Übergang, welcher hauptsächlich durch Fluoreszenz zurück in den Grundzustand gelangt. Bei den Verbindungen ohne Hydroxygruppe fehlt die stabilisierende Wasserstoffbrücke, die zur Absenkung des entsprechenden Zustands führt, so dass bei diesen Derivaten der unterste angeregte Zustand einem np*-Übergang entspricht, der optisch verboten ist und somit nicht direkt populiert wird. Bei der Anregung wird ein höher angeregter Zustand bevölkert, der in den niedrigsten angeregten Zustand relaxiert, welcher über eine konische Durchschneidung schnell und strahlungsfrei erreicht werden kann. Der niedrigste angeregte Zustand schneidet seinerseits den Grundzustand, so dass auch die Repopulierung des Ausgangszustands schnell, effizient und strahlungslos abläuft. Eine ganz andere Art der Photochemie wird bei Azobenzol (AB) und AB-Derivaten beobachtet. Durch Isomerisierung um die N-N-Doppelbindung wird ein Photoprodukt gebildet, das cis-Isomer. Die Quantenausbeute der Isomerisierung ist dabei abhängig davon, welcher elektronische Übergang angeregt wurde. Substituenten am AB üben unterschiedlichen Einfluss auf die elektronischen Eigenschaften aus: Elektronegative Gruppen in meta-Position zur Diazobrücke verändern die Lage der Absorptionsbanden kaum, ebensowenig die Rate der thermischen Rückisomerisierung und auch die Dynamik nach Photoanregung zeigt keine signifikanten Unterschiede in Abhängigkeit vom Substituenten und kann in Analogie an unsubstituiertes AB interpretiert werden. Nach Anregung des np*-Übergangs zerfällt der angeregte Zustand biexponentiell. Die Anregung des pp*-Übergangs, dem optisch erlaubten Übergang, führt zur Population des zweiten angeregten Zustands. Entlang einer konischen Durchschneidung wird schnell und effizient der erste angeregte Zustand populiert. Dieser Prozess zeigt sich bei den zeitaufgelösten Messungen in einer schnellen Zerfallszeit, die nur wenige hundert Femtosekunden beträgt. Die nun folgenden Prozesse finden im ersten angeregten Zustand statt und sind vergleichbar mit den Prozessen nach np*-Anregung. Der Hauptunterschied zwischen den beiden Dynamiken im S1-Zustand ist die Ausgangsgeometrie, mit der die Moleküle diesen Zustand populieren (Franck-Condon-Bereich bei direkter Anregung, bzw. eine große Bandbreite an Geometrien nach dem S2-S1-Übergang), sowie die Schwingungsenergie die das System jeweils besitzt. Auch nach ursprünglicher S2-Anregung können zwei Zerfallszeiten dem ersten angeregten Zustand zugeordnet werden, die analog der direkten Population als Geometrieänderung in Richtung des Potentialminimums und Isomerisierung bzw. Rückkehr in den Grundzustand interpretiert werden und in der Größenordnung von einer bzw. fünf Pikosekunden liegen. Die Modifizierung von Peptiden mit Azobenzol stellt einen Weg dar, zeitlich synchronisiert, eine Störung in der Struktur zu induzieren. Dieses Konzept wurde bereits erfolgreich zur Untersuchung der Faltung zyklischer Peptide eingesetzt. Modifizierte Kollagenstränge sind eine Erweiterung dieses Prinzips, da sie eine Möglichkeit darstellen, die Tertiärstruktur eines Peptids zu adressieren. Für das vorliegende Azokollagen konnte gezeigt werden, dass die gewählte Aminosäuresequenz auch nach Anbringen der Azobenzolklammer zu gefaltetem Kollagen führt, welches thermodynamisch stabil ist. Der Schmelzpunkt der Tripelhelix liegt unter den gewählten Bedingungen bei 55°C. Die Isomerisierung des Azobenzols induziert eine Störung der Tertiärstruktur, die zur teilweisen Entfaltung der Tripelhelix führt, was ein reversibler Prozess ist. Eine vollständige Entfaltung findet erst bei Temperaturen oberhalb des Schmelzpunkts statt. Zeitaufgelöste Messungen im sichtbaren Spektralbereich zeigten, dass die Schalterdynamik durch Anbringung an das Peptid nicht signifikant im Vergleich zum reinen AB-Schalter verändert wird.
CpG-Oligodesoxynukleotide (CpG-ODN) sind von medizinischem Interesse aufgrund ihrer immunstimulierenden Wirkung, die durch chemische Wechselwirkungen zwischen dem Toll-like-Rezeptor 9 und dem CpG-Oligodesoxynukleotid ausgelöst wird. Um die molekulare Grundlage dieser DNA-Protein-Erkennung näher zu erforschen und um neue modifizierte CpG-Oligodesoxynukleotide mit einem verbessertem Wirkungsprofil für medizinische Anwendungen zu synthetisieren, wurde diese Arbeit angefertigt. Untersucht wurde, welche Synthesestrategie eine effiziente Syntheseroute zur Modifizierung von CpG-Oligodesoxynukleotiden ermöglicht. Als prinzipiell interessante Modifikationen wurden solche gewählt, die dem CpG-ODN-Liganden, Toll-like-Rezeptor 9, zusätzliche Wechselwirkungen eröffnen, wie die H-Brückenwechselwirkungen durch OH, NH2, NO2 oder pi-Stacking-Wechselwirkungen, wie durch z. B. Phenyl oder Pyren. Zunächst wurde in Erwägung gezogen, die bislang in der Literatur nicht für CpG-ODN unter-suchte Position 6 von Cytidin mit OH oder NH2 modifizieren. Hierfür wurde die allgemeine Synthesestrategie verwendet, bei der die Cytosin-Derivate stereoselektiv durch Vorbrüggen-Glykosilierung mit peracetylierter Ribose zum Nukleosid umgesetzt werden. Anschließend erfolgte die Deacetylierung, die regiospezifische Einführung der Tetra-(iso-propyl)-di-siloxan-Schutzgruppe an der 3´,5´-Position. Danach sollte die 2´-OH-Funktion mit Thio-phenylchlorid verestert und nach Barton McCombie desoxygeniert werden. Nach Dimethoxy-triphenylmethylierung an der 5´-OH-Funktion sollte die Umsetzung zum Phosphoramidit erfolgen. ...
Die vorliegende Arbeit ist aus drei Teilen aufgebaut. Im ersten, relativ kurz gehaltenen Kapitel wird die klassische Standard-Industrie-Solarzelle auf der Basis monokristallinen Siliziums vorgestellt. Der bisherige Herstellungsprozess der Standard-Industrie-Solarzelle, der in wesentlichen Teilen darauf abzielt, diese Verluste zu minimieren, dient als Referenz für die Entwicklung neuer Fertigungsverfahren, wie sie in den Kapiteln 2 und 3 dieser Arbeit vorgestellt werden. Den ersten thematischen Schwerpunkt dieser Arbeit bildet die Entwicklung eines alternativen Wafering-Konzeptes zum Multi-Drahtsägen, der klassischen Technologie zur Fertigung von Silizium-Wafern. Die Basis des neuen, hier vorgestellten Wafering-Prozesses bildet das Laser-Micro-Jet-Verfahren (LMJTM). Dieses System besitzt eine Reihe von Vorteilen gegenüber klassischen „trockenen“ Laserverfahren. Das ursprünglich auf reinem, deionisiertem Wasser als Strahlmedium aufbauende System wurde im Rahmen dieser Arbeit so modifiziert, dass der Flüssigkeitsstrahl nunmehr nicht nur als flüssiger Lichtleiter dient, sondern gleichzeitig auch als Transportmedium für Ätzmittel, welche den thermischen Abtrag des Siliziums durch den Laserstrahl unterstützen. Ausgehend vom aus der Literatur bekannten chemischen Verhalten des Siliziums wurden 3 Ätzsysteme für Silizium vorgestellt. Dabei wurden Vor- und Nachteile für deren technischen Einsatz diskutiert. Den praktischen Teil dieses Arbeitspaketes bildete der Test zweier Ätzmedien im Experiment. Dabei konnte gezeigt werden, dass wasserfreie Strahlmedien basierend auf perfluorierten Lösemitteln mit bereits sehr geringen Zusätzen gasförmigen Chlors als Ätzmittel für Silizium wässrigen alkalischen Ätzsystemen jeder Konzentration prinzipiell überlegen sind- Parallel zur Evaluation des Einflusses der chemischen Beschaffenheit des Flüssigkeitsstrahls auf den Abtragsprozess fand auch eine Untersuchung verschiedener Prozessparametereinflüsse statt, etwa der Laserleistung, der Laserlichtwellenlänge, etc. Den zweiten thematischen Schwerpunkt der Arbeit bildet die Modifizierung der nasschemischen Schritte zwischen dem Wafering und dem ersten Hochtemperatur-Fertigungsschritt in der Solarzellen-Produktion, der Emitterdiffusion. Diese nasschemischen Schritte umfassen bei der Standard-Industrie-Solarzelle in der Regel eine zum Teil aufwändige Reinigung der Wafer-Oberflächen von partikulären und metallischen Kontaminationen, die vor allem vom Wafering-Prozess herrühren, als auch eine Texturierung der Substrate. Kernanliegen des praktischen Teils dieses Arbeitspaketes ist zum einen die Suche nach alternativen Texturmitteln zum 2-Propanol, dem klassischen Badadditiv in basischen Ätzbädern, das in der Praxis über zahlreiche Nachteile verfügt, etwa einem relativ niedrigen Siedepunkt, der zu seinem permanenten Ausgasen aus der Lösung führt. Zum anderen sollte der auf die Textur folgende Reinigungsprozess rationalisiert werden, um Prozesskosten zu minimieren, entweder durch eine Straffung des Prozesses durch Verringerung des Chemikalienverbrauchs und einer Reduzierung der Prozesszeit oder durch eine Verringerung der Chemikalienkosten. Bei der Suche nach neuen Texturmitteln wurden 45 verschiedene organische Substanzen verschiedener Verbindungsklassen hinsichtlich ihrer Texturwirkung auf monokristallinen Silizium-substraten getestet. Mit 1-Pentanol und p-Toluolsulfonsäure wurden zwei Substanzen ermittelt, welche in der Zukunft als praktikable Alternativen zu 2-Propanol als Texturadditive dienen könnten. Im Kontext der Suche nach neuen Reinigungsverfahren wurden eine Reihe verschiedener neuer Reinigungssequenzen getestet, die sich entweder durch veränderte - in der Regel verringerte - Badkonzentrationen, durch neue Badsequenzen, welche auf bestimmte Teilschritte verzichten oder durch neue Badkompositionen, etwa durch Hinzuziehen von Komplexbildnern für metallische Verunreinigungen von den klassischen Reinigungsprozessen unterscheiden. Der Erfolg des Reinigungseffektes der nasschemischen Sequenzen wurde anhand der Ladungsträger-Lebensdauer in den Wafern abgeschätzt. Dabei konnte gezeigt werden, dass mit Hilfe von LMJ produzierte (gelaserte) Wafer-Oberflächen wesentlich straffere Reinigungsprozesse erfordern als drahtgesägte Substrate. Neben einer deutlichen Straffung des Reinigungsprozesses ist auch eine Verkürzung der Texturzeit bei den mit Lasern geschnittenen Oberflächen möglich, die wiederum ihren Grund im geringeren Schädigungsgrad dieser Oberflächen hat, der einen geringeren Materialabtrag durch die Ätzbäder erfordert, als bei drahtgesägten Wafern. Abschließend konnte noch gezeigt werden, dass drahtgesägte Substrate, die bei gleicher Prozesszeit mit den neuen Texturmitteln prozessiert wurden, über erheblich höhere mechanische Stabilitäten verfügen, als jene, bei denen das klassische Texturmittel 2-Propanol eingesetzt wurde.
Die Erforschung der neuartigen Materialien BST, PZT und SBT für den Einsatz in neuartigen Speichertechnologien wie dem FeRAM besteht aus vielen unterschiedlichen Teilbereichen. Im Rahmen dieser Dissertation wurden primär zwei Hauptbereiche analysiert. Als Erstes wurden sowohl die Mechanismen der Oberflächenausbildung (Wachstumsverfahren, Prozeßparameter, Substrat Einflüsse) von einzelnen Filmen, als auch die Wechselwirkungen der Schichten untereinander und deren Auswirkung auf das Schichtsystem, untersucht. Im zweiten Schritt wurde das elektrische Verhalten, und die auftretenden Phänomene sowohl qualitativ als auch quantitativ erfaßt und bewertet. Als Elektrodenmaterial für die di/ferroelektrische Speicher kann nicht wie gewohnt dotiertes Silizium/Polysilizium verwenden werden. Da Platin den chemischen und thermischen Belastungen bei der Herstellung dieser Filme besonders gut gewachsen ist, wird es bevorzugt als Elektrode eingesetzt. Bei dem Aufbau der Pt-Elektrode erfolgt die größte Veränderung des Systems durch die RTP-Oxidation des reaktiven Titans. Die Rauhigkeit des vorher sehr fein kristallinen Ti-Films steigt auf das Vierfache bei einer gleichzeitigen Verdreifachung der Korngröße. Da in vielen Bauelementen Si oder Poly-Si in Kombination mit einer Ti/TiN-Barriere als Basis für den Pt-Film fungieren, wurde bei den nächsten Experimenten der Einfluß des Substrates und der TiN-Sputtertemperatur auf die Topologie/Morphologie der Elektrode untersucht. Nur durch Anpassung der TiN Sputterleistung, eine niedrige Substrattemperatur und der Kombination aus N2-RTP Temperung (nach TiN) und O2-Temperung (nach Pt), gelingt es die Rauhigkeit und Kristallitgrößen des entstandenen Filmsystems zu minimieren. Bei der Charakterisierung der di/ferroelektrischen Materialien BST, PZT und SBT wurden zum einen das Wachstum und die beim Aufbau der Schichten auftretenden Phänomene anhand verschiedener Abscheidungstechniken untersucht/verglichen. Zum anderen sind mehrere Schichtdicken, Schichtabfolgen und eine Reihe unterschiedlich getemperter Proben analysiert worden. Die mittels Sputtern hergestellten BST Filme belegen, dieses Material hat typischerweise ein columnares Kristallwachstum und läßt sich sehr fein kristallin aufbringen. Bei der reaktiven Abscheidung aus der Gasphase (MOCVD) hat sich schnell gezeigt, das komplexe Material System BST reagiert bereits bei Variation eines Parameters extrem unterschiedlich. So findet bei einer hohen Substrattemperatur (690°C) ein fließender Übergang vom zwei dimensionalen (2D, Frank-van der Merwe), zum drei dimensionalen (3D, Stranski-Krastanov) Wachstum statt. Wird BST bei 600°C abgeschieden, liegt von Anfang an ein gemischter 2D/3D Schichtaufbau vor, der überwiegend in einen 3D inselartigen Aufbau (Vollmer-Weber) übergeht. Senkt man die Temperatur auf 450°C, bildet sich auf der Oberfläche Haze, der durch eine instabile Gasphasenreaktion an der Oberfläche entsteht und sich hauptsächlich aus Strontium- und Bariumoxid zusammensetzt. Gesputtertes PZT besitzt im Vergleich zu BST eine um den Faktor 6 höhere Wachstumsrate, und bildet zweimal so breite Kristallite aus. Es hat eine relativ feinkörnige Struktur und seine Kristalle wachsen wie beim BST columnar auf. Die MOD Technik erzeugt einen relativ homogenen SBT-Schichtaufbau mit Korngrößen bis zu 135 nm. Erst nach dem Ferroanneal entstehen bis zu dreimal größere Kristalle, die von markanten Korngrenzen getrennt werden und große Kristallflächen mit Unterstrukturen haben. Die mit der MOCVD Methode hergestellten SBT-Proben zeigen teilweise Wachstumsphänomene in Form von Hillocks, die im EDX allerdings keine Unterschiede in der Zusammensetzung aufweisen. Die systematische Untersuchung der Wechselwirkung von Temperatur (600-800°C) und Schichtdicke (ca. 80-175 nm) bei konstanter Temperzeit hat ergeben, daß die Filme bei einem 600°C Ferroanneal kleine Hillocks besitzen, die erst ab 700°C nicht mehr zu beobachten sind. Neben der topographischen Analyse von Di- und Ferroelektrika gibt es einen zweiten sehr wichtigen Aufgabenbereich, die elektrische Charakterisierung dieser Materialien. Da alle herkömmlichen Verfahren diese Daten nur Integral erfassen können, eröffnet die Rastersondenmikroskopie hier erstmalig die Chance, sowohl Topographie als auch elektrische Parameter simultan und mit hoher Ortsauflösung (10-50 nm) zu analysieren. Die ersten Versuchsreihen wurden mit dem EFM gemacht und haben sich mit dem Polarisationsverhalten von PZT und SBT beschäftigt. Zu diesem Zweck wurde ein Experiment entwickelt, bei dem das Ferroelektrikum durch gezielte Polarisationen in zwei definierte Zustände entgegengesetzter maximaler Polarisation versetzt wird. Die Ergebnisse konnten mit dem Oberflächenpotential Mikroskop reproduziert werden, allerdings reagiert das Oberflächenpotential Mikroskop deutlich stärker auf freie Ladungen als das EFM. Um zwischen Ladungsartefakt und realer Beobachtung unterscheiden zu können, wurde ein Verfahren zur Konditionierung und Ladungsentfernung der Probe entwickelt, ohne die Probe merklich zu manipulieren. Da bei den EFM-Untersuchungen viele verschiedene elektrostatische Phänomene aufgetreten sind, ist eine generelle Betrachtung zur Fragestellung, was bildet das erhaltene EFM-Signal eigentlich ab, gemacht worden. Dazu wurde ein deutlich vereinfachtes Ladungsmodell vorgestellt, das den Polarisationsvorgang mit seinen unterschiedlichen Einzelprozessen beschreibt. Zusammenfassend ist zu sagen, daß EFM ein elektrostatisches Gesamtfeld detektiert, das aus verschiedenen Komponenten besteht, die in der Regel qualitativ und nicht quantitativ miteinander verknüpft sind. Im Gegensatz zu makroskopischen Messungen haben zeitabhängige Untersuchungen an SBT gezeigt, die abgebildete Polarisation verringert sich bereits nach wenigen Tagen signifikant. Eine Erklärung für den Signalverlust ist die Annahme, daß sich über die Zeit primär nur die SBT-Oberfläche verändert, da ihr die elektrisch und chemisch stabilisierende Pt-Elektrode fehlt. Eine weitere Überlegung geht davon aus, durch die EFM-Spitze hat eine wesentlich höhere Feldstärke auf das Ferroelektrikum eingewirkt und das Material dadurch stärker gestreßt. Die Untersuchung der temperaturabhängigen Relaxation von ferroelektrischen Filmen liefert weitere interessante Erkenntnisse. Ohne obere Pt-Elektrode kann man bereits ab 130°C einen deutlichen Polarisationsverlust beobachten (Curie-Punkt SBT: 310°C). Die Temperversuche sprechen damit für die Hypothese, durch die fehlende obere Elektrode wurde bei der Polarisation erhöhter Streß in das SBT eingeprägt und das System hat darauf mit stark beschleunigter Relaxation reagiert. Es kann jedoch nicht abschließend geklärt werden, was auf das Materialverhalten einen größeren Einfluß ausübt, die Oberflächenladungen oder die fehlende obere Pt-Elektrode. In weiteren Experimenten wurde die Bildung der ferroelektrischen Phase und deren Störungen untersucht. Versuche mit unterschiedlicher Ferroannealtemperatur bei MOD SBT-Schichten haben gezeigt, die Kristallphasenbildung wird hauptsächlich von der Annealtemperatur gesteuert. Bei einer Temperatur von 600°C wird nur eine partielle Phasenumwandlung erzielt, dagegen liegt bei 800°C eine vollständige Umwandlung in den pseudotetragonalen Perowskit vor. Die Untersuchung eines mittels MOCVD-Verfahren abgeschiedenen SBT-Films ergab eine nicht vollständig polarisierte Oberfläche. Da sich bei einer Substrattemperatur von 640°C primär eine a/b-Kristallachsenorientierung ausbildet, die Probe jedoch nur partiell polarisierbar war, ist höchstwahrscheinlich die Substrattemperatur während der Abscheidung zu niedrig gewesen. Zum Abschluß der Versuche wurde der Polarisationsbereich zunächst auf wenige Mikrometer verkleinert und schließlich sogar auf einzelne Kristalle eingeschenkt. Obwohl es gelingt, einzelne Kristalle zu polarisieren, zeigen diese Experimente deutlich die Limitierungen des EFMs auf. Die ersten Messungen mit dem Piezoresponse-SPM haben ergeben, daß es möglich ist, subkristalline Polarisationsstrukturen ohne nennenswerte Topographieartefakte und „Übersprechen“ abzubilden. Mit dem C-AFM ist in sehr hoher Orts- und Stromauflösung das Leckstromverhalten von BST, PZT und SBT untersucht worden. Da diese di- und ferroelektrischen Materialien eine polykristalline Struktur haben, treten neben Fehlertypen wie Fremdatomdefekten und Leerstellen auch noch eine Vielzahl anderer Kristallbaufehler (Versetzungen, Korngrenzen, ...) auf, die zu erhöhten Leckströmen führen. Auch die Morphologie der Filme beeinflußt das elektrische Verhalten der Materialien. Bei den als Erstes vermessenen BST-Proben ist eine starke Schichtdicken- und Feldstärken-Abhängigkeit zu beobachten. So wird das Leckstromverhalten bei dünnen BST-Proben und niedrigem Potential von extrinsischen Fehlern in Form von Fremdatomdefekten, Leerstellen und verschiedenen Kristallbaufehlern dominiert. Erhöht man allerdings die Feldstärke, so bestimmen die intrinsischen Fehler die Leckstrompfade, da durch das hohe Potential die Bandstruktur solange degradiert bis ein elektrischer Durchbruch vorliegt. Bei höheren Schichtdicken (70 nm) werden durch den intrinsischen Streß des Films hervorgerufene Leckströme erkennbar. Sie treten erst ab einem kritischen Zug- oder Druckstreßniveau in Insel/Domänen-ähnlicher Form auf, der in der topographischen Aufnahme nicht sichtbar ist. Im Gegensatz zu amorphen Materialien wie dem SiO2 spielt bei BST, PZT und SBT die Filmdicke nur eine untergeordnete Rolle, da eine partielle Dünnung nicht automatisch einen erhöhten Leckstrom zur Folge hat. Da ferroelektrische Materialien eine Leckstromgenerierung besitzen die komplexer ist, und einem anderen Zeitablauf folgt, als bei einem Dielektrikum, wurde zuerst das ferroelektrische PZT mit dem C-AFM analysiert. Die ersten Untersuchungen an einer PZT-Probe haben allerdings sehr schnell gezeigt, zwischen BST und PZT gibt es keine nennenswerten Unterschiede im Leckstromverhalten. Für die Herstellung von SBT-Schichten werden hauptsächlich das MOD und das MOCVD Verfahren verwendet. Um festzustellen welche der beiden Abscheidetechniken das bessere Leckstromverhalten hat, wurden MOD und MOCVD SBT-Filme charakterisiert. Diese Untersuchungen haben gezeigt, bei MOCVD Filmen treten die Leckströme hauptsächlich in den Bereichen auf, die leicht vereinzelte oder nicht dicht verwachsene Korngrenzen und Kristallecken besitzen. Im Vergleich dazu weisen die MOD Schichten in ähnlichen Bereichen deutlich wenigere und niedrigere Leckströme auf. Den Einfluß von Topologie und Filmdicke hat die Analyse einer mit 90 nm MOD SBT beschichteten Stufe (120 nm) belegt, da dort nur im Kantenbereich extrem erhöhte Leckströme zu beobachten sind. Das Degradationsverhalten von SBT ist außerdem auch noch dickenabhängig. Dies beweisen I/V Spektren, die bei C-AFM Messungen an unterschiedlich dicken MOD SBT-Schichten (90/180 nm) aufgenommen wurden. Es zeigt sich, speziell bei höheren Feldstärken liegt bei der dünnen SBT-Probe (90 nm) eine um den Faktor vier steilere Degradation vor.
Das große therapeutische Potential der RNA Interferenz wird dadurch deutlich, dass sich wenige Jahre nach der Entdeckung die ersten potentiellen RNAi Medikamente in den klinischen Teststudien befinden. Jedoch müssen bis zur therapeutischen Anwendung im großen Maße noch einige Hindernisse überwunden werden. Um eine optimale Wirkung der siRNAs gewährleisten zu können müssen folgende Punkte beachtet werden: - Erhöhte Nuclease-Resistenz - Effiziente zelluläre Aufnahme - Keine Off-Target Effekte - in vivo geringe Toxizität Das richtige Design der siRNAs ist somit von enormer Bedeutung. Hierfür bedient man sich verschiedener Modifikationsmöglichkeiten wie z.B. Basenmodifikationen, Modifikationen an der 2´-O-Position sowie am Phosphatrückrat. Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit ist es gelungen verschiedene Syntheserouten zur Darstellung von Nucleosiden mit kationischen sowie neutralen 2´-O-Modifikationsmotiven zu erarbeiten und zu optimieren. ...
In jüngster Zeit werden vom humanen Immundefizienzvirus-1-abgeleitete lentivirale Vektoren auch in der Gentherapie eingesetzt. Obwohl diese Vektoren nicht-mitotische Zellen transduzieren können, sind sie für einen Gentransfer in primäre ruhende Zellen oft nicht geeignet. In der Abteilung „Medizinische Biotechnologie“ des Paul-Ehrlich-Insituts wurde ein vom simianen Immundefizienzvirus SIVsmmPBj-abgeleiteter lentiviraler Vektor entwickelt, welcher im Gegensatz zu HIV-1-abgeleiteten Vektoren effizient in der G0-Phase des Zellzyklus arretierte humane Fibroblasten und humane primäre Monozyten transduzieren kann (Mühlebach et al., 2005). Im dieser Arbeit wurde das Potenzial dieses neuen Vektors für mögliche Anwendungen in der Gentherapie untersucht, indem seine Transduktionsfähigkeit für weitere primäre Zellen bestimmt wurde. Dabei waren humane hämatopoetische Stammzellen von besonderem Interesse, da sie die Vorläuferzellen aller Zellen des Blutes sind und die Eigenschaft zur Selbsterneuerung besitzen. Die Effizienz des Gentransfers in unstimulierten Stammzellen mit dem SIVsmmPBj-Vektor war jedoch nicht höher als mit anderen lentiviralen Vektoren. Interessanterweise konnte aber ein Einfluss der lentiviralen Vektoren auf das in vitro-Differenzierungspotenzial der transduzierten Stammzellen in die verschiedenen Vorläuferzellen beobachtet werden: Nach Transduktion mit dem SIVsmmPBj- und einem HIV-2-abgeleiteten Vektor differenzierten die Stammzellen bevorzugt in granulozytäre Vorläuferzellen, während die Transduktion mit einem HIV-1-abgeleiteten Vektor die Anzahl aller Vorläuferzellen deutlich reduzierte und insbesonders die Differenzierung in Makrophagenvorläuferzellen verminderte. Zur Untersuchung ihres Differenzierungs-potenzials in vivo wurden transduzierte hämatopoetische Stammzellen zur Repopulierung des Knochenmarks von NOD/SCID-Mäusen eingesetzt. Hierbei wurde jedoch kein Einfluss der verschiedenen lentiviralen Vektoren auf die Differenzierung der Stammzellen beobachtet. Allerdings konnte nur in einem sehr geringen Anteil der transplantierten Zellen eine Expression des übertragenen Gens nachgewiesen werden, so dass nicht ausgeschlossen werden kann, dass die transduzierten Zellen die Fähigkeit zur Repopulierung verloren hatten. Insgesamt ist jedoch zu sagen, dass entgegen der Erwartungen der neue Vektor keinen Vorteil gegenüber HIV-1-Vektoren zur Transduktion von hämatopoetischen Stammzellen aufweist. Weiter wurde die Transduktionsfähigkeit des SIVsmmPBj-Vekors für humanen B-Lymphozyten, Makrophagen und dendritische Zellen untersucht. Auf ruhenden B-Lymphozyten besaß der SIVsmmPBj-Vektor keinen Transduktionsvorteil gegenüber einem HIV-1-abgeleiteten Vektor, während Makrophagen und dendritische Zellen mit signifikant höherer Effizienz transduziert werden konnten. Die hohe Transduktionseffizienz des SIVsmmPBj-Vektors für Monozyten und dendritische Zellen eröffnet die Möglichkeit einer Anwendung in der Immuntherapie, da dendritische Zellen die professionellsten und effektivsten Antigen-präsentierenden Zellen sind. Daher wurde die generelle Eignung des SIVsmmPBj-Vektors für immuntherapeutische Anwendungen untersucht. Ein Tumor-assoziiertes Antigen (Mart-1) wurde in Monozyten übertragen und die transduzierten Zellen zu reifen dendritischen Zellen maturiert. Diese Zellen besaßen die Fähigkeit, Antigen-spezifische zytotoxische T-Zellen zu generieren, deren Funktion durch Sekretion von Zytokinen, in Einzelfällen auch durch spezifische Lyse von Mart-exprimierenden Tumorzellen nachgewiesen wurde. Weiterhin wurde gezeigt, dass nach Transduktion von Monozyten und deren Differenzierung zu Makrophagen auch diese prinzipiell in der Lage sind, Antigen-spezifische zytotoxische T-Zellen zu generieren. Obwohl hier keine vergleichenden Untersuchungen zur Effizienz des T-Zell-Primings durchgeführt werden konnten, ist die prinzipielle Eignung des SIVsmmPBj-abgeleiteten Vektors für eine Immuntherapie damit nachgewiesen. Schließlich wurde untersucht, ob die Maus oder nicht-menschliche Primaten als Tiermodelle für eine mögliche Weiterentwicklung des Vektors in Frage kommen. Murine Monozyten konnten jedoch nicht effizient transduziert werden. Hingegen erwies sich der SIVsmmPBj-Vektor als gut geeignet zur Transduktion von simianen Monozyten, so dass ein Affenmodell für Anwendungen des SIVsmmPBj-Vektors, wie beispielsweise zur Tumor-Immuntherapie oder für Vakzinierungsstudien, in Frage kommt.
In dieser Arbeit sollte die Bindung von Tetrahydromethanopterinderivaten an zwei Enzyme des methanogenen, CO2-reduzierenden Energiestoffwechselweges strukturell charakterisiert werden. In jenem Stoffwechselweg verläuft die schrittweise Reduktion von CO2 über die Bindung an den C1-Carrier Tetrahydromethanopterin (H4MPT), ein Tetrahydrofolat-Analogon, welches unter anderem in methanogenen Archaeen zu finden ist. Die thermophilen bzw. hyperthermophilen Ursprungsorganismen der untersuchten Enzyme, Methanothermobacter marburgensis, Methanocaldococcus jannaschii und Methanopyrus kandleri, sind aufgrund ihrer Anpassung an extreme Habitate durch spezielle genomische, strukturelle und enzymatische Eigenschaften von strukturbiologischem Interesse. Beim ersten in dieser Arbeit untersuchten Enzym handelte es sich um den aus acht Untereinheiten bestehenden membrangebundenen N5-Methyl-H4MPT:Coenzym M-Methyltransferasekomplex (MtrA-H). Dieser katalysiert in einem zweistufigen Mechanismus den Methyltransfer von H4MPT zum Co(I) der prosthetischen Gruppe 5’-Hydroxybenzimidazolylcobamid (Vitamin B12a), um die Methylgruppe dann auf Coenzym M zu übertragen. Gleichzeitig findet ein der Energiekonservierung dienender vektorieller Natriumtransport über die Membran statt. Für den Mtr-Komplex aus M. marburgensis (670 kDa) lag bereits ein Protokoll zur Reinigung unter anaeroben Bedingungen vor. Dieses wurde im Rahmen dieser Arbeit verbessert, für die Isolierung und Reinigung unter aeroben Bedingungen vereinfacht und für die Erfordernisse der zur Strukturbestimmung verwendeten elektronenmikroskopischen Einzelpartikelmessung optimiert. Neben der Präparation des kompletten Komplexes MtrA-H wurde als Alternative die Präparation des Enzymkomplexes MtrA-G unter möglichst vollständiger Abtrennung der hydrophilsten Untereinheit MtrH gewählt. Mit der zu diesem Zweck entwickelten Methode konnte das Abdissoziieren von MtrH besser als im etablierten Protokoll kontrolliert und somit die Homogenität der Probe deutlich verbessert werden. Dies schafft zum einen die Vorraussetzungen für eine Kristallisation zur Röntgenstrukturanalyse, zum anderen war auch in bei der elektronenmikroskopischen Einzelpartikelmessung erkennbar, dass mit dem Mtr-Komplex ohne MtrH bessere Ergebnisse zu erzielen sind. Parallel zu den Untersuchungen am Gesamtkomplex sollten die den Cobamid-Cofaktor bindende Untereinheit MtrA sowie die H4MPT-bindende Untereinheit MtrH in für die Kristallisation und röntgenkristallographische Untersuchung ausreichender Menge und Qualität gereinigt werden. Hierfür wurden MtrA und MtrH aus oben genannten Organismen für die heterologe Expression in E. coli kloniert, die Expressionsbedingungen optimiert und Reinigungsprotokolle etabliert. Anschließend wurden die Untereinheiten umfangreichen Kristallisationsversuchen unterzogen. Die Untereinheit MtrA aus M. jannaschii konnte ohne die C-terminale Transmembranhelix als lösliches Protein in E. coli produziert und als Holoprotein bis zur Homogenität gereinigt werden. Bei M. kandleri MtrA gelang die Herstellung von geringen Mengen teilweise löslichen StrepII-Fusionsproteins ohne C-terminale Transmembranhelix in E. coli. Eine Produktion der Untereinheit MtrH in E. coli als lösliches Protein war bei keiner der in dieser Arbeit getesteten Varianten möglich. Mit dem in Einschlusskörperchen exprimierten Protein aus M. marburgensis wurde eine Reinigung und Rückfaltung versucht. Auch eine Co-Expression der Untereinheiten MtrA und MtrH, durch welche eine bessere Faltung und Löslichkeit erreicht werden sollte, war nur in Einschlusskörperchen möglich. Das zweite in dieser Arbeit untersuchte Enzym, die F420 abhängige N5,N10 Methylen-H4MPT-Dehydrogenase (Mtd), katalysiert den reversiblen, stereospezifischen Hydrid-Transfer zwischen reduziertem F420 (F420H2) und Methenyl-H4MPT+, welches hierbei zu Methylen-H4MPT reduziert wird. Die Reaktion verläuft über einen ternären Komplex bestehend aus Protein, Substrat (Methylen-H4MPT) und Cosubstrat (F420), welcher strukturell charakterisiert werden sollte. Das gereinigte, rekombinante Enzym aus M. kandleri wurde mit verschiedenen H4MPT- und F420-Derivaten co-kristallisiert, die Struktur des ternären Komplexes röntgenkristallographisch bestimmt und die Bindung von H4MPT und F420 analysiert. Methenyl-H4MPT+ und F420H2 sind in der in dieser Arbeit gelösten Kristallstruktur in katalytisch aktiver Konformation gebunden, jedoch kann bei einer Auflösung von 1,8 Å nicht beurteilt werden, ob Methylen-H4MPT und F420 oder Methenyl-H4MPT+ und F420H2 vorlagen. Ein Vergleich mit der Struktur von M. kandleri-Mtd (KMtd) ohne Substrat und Cosubstrat ergab nur äußerst geringe Abweichungen in der Proteinkonformation, sodass sich KMtd überraschenderweise als Beispiel für ein Enzym mit ungewöhnlich starrer, vorgegebener Bindetasche erwies.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Protein CtaG aus Paracoccus denitrificans eingehend charakterisiert. Es wurde überprüft, ob dieses 21 kDa große Membranprotein als Kupferchaperon und Assemblierungsfaktor für die Untereinheit I der Cytochrom c Oxidase, das heißt für die Biogenese des CuB-Zentrums, in Frage kommt. Eine bioinformatische Analyse zeigte zunächst, dass CtaG, ein Homolog des eukaryotischen Proteins Cox11, zu den am stärksten konservierten Assemblierungsfaktoren der Cytochrom c Oxidase gehört. Interessanterweise sind diese Proteine alle an der Biogenese der redoxaktiven Metallzentren beteiligt, und nur sie sind auch in Paracoccus denitrificans konserviert. Somit stellt Paracoccus ein ideales Modellsystem dar, um die essentiellen Schritte der Biogenese der Cytochrom c Oxidase zu untersuchen. Ein lösliches Fragment von CtaG (CtaGLF) wurde heterolog in E. coli exprimiert und mit Hilfe eines spaltbaren His6-tags aufgereinigt. Es wurde ein Protokoll entwickelt, mit dessen Hilfe die Aggregation des löslichen Fragments minimiert und das Protein in hochreiner, aggregatfreier Form isoliert werden kann. Rekonstitutionsversuche zeigten, dass CtaGLF ein spezifisch Cu(I)-bindendes Protein ist. Nach der heterologen Expression in E. coli ist CtaGLF kofaktorfrei. Ein Protokoll zur in vitro Rekonstitution mit Kupferionen wurde entwickelt, mit welchem ein stöchiometrisches Kupfer/Protein-Verhältnis erreicht wird. Gelfiltrations- und ICP-MS-Analysen zeigten, dass CtaGLF Kupferionen ausschließlich als Dimer bindet. Rekonstitutionen bei denen Cu(I), Cu(II), Co(II), Fe(II), Mn(II), Mg(II) und Ni(II) sowohl einzeln als auch simultan angeboten wurden, führten zwar zu wenig reproduzierbaren absoluten Stöchiometrien, bestätigten aber, dass CtaGLF bevorzugt Cu(I) bindet. Mutagenesestudien bewiesen einerseits, dass drei Cysteinreste maßgeblich für die Kupferbindung verantwortlich sind und deuteten andererseits darauf hin, dass zwei identische, punktsymmetrische Bindungsstellen des CtaGLF-Dimers die Kupferionen koordinieren. Mit Hilfe einer Multiseq-Analyse wurden zunächst hochkonservierte Oberflächenreste von CtaG identifiziert. Eine Auswahl dieser Aminosäuren wurde per gerichteter Mutagenese ersetzt und der Effekt dieser Mutationen auf Stöchiometrie, Affinität und Dimerisierung von CtaGLF wurde untersucht. Die Affinitäten wurden dabei mit Hilfe von Kompetitionsexperimenten mit dem Cu(I)-spezifischen Chelator BCA analysiert. Insgesamt vier mögliche Szenarien für die Kupferbindung von CtaG wurden postuliert und anhand der Datenlage diskutiert. Das Szenario III, welches die Datenlage am besten zu erklären vermag, sieht eine trigonale Koordination der Kupferionen vor, an welcher die Cysteine des hochkonservierten CFCF-Motivs einer Polypeptidkette ein gemeinsames Koordinationsfeld mit dem nahe der Transmembranhelix gelegenen Cystein 38 der jeweils anderen Polypeptidkette bilden. Mit Hilfe von UV/Vis-spektroskopischen Messungen wurde gezeigt, dass die Bindung von Kupferionen an CtaGLF zu einer Absorption bei 358 nm führt. Diese kann mit einem Extinktionskoeffizienten von E delta 358 nm = 936 M-1cm-1 zur Beobachtung des Kupfertransfers von CtaGLF auf einen Akzeptor verwendet werden. Um eine Beteiligung von CtaG bei der Insertion des CuB-Ions in die Untereinheit I der Cytochrom c Oxidase (UE I) zu beweisen, wurden zwei Arbeitshypothesen aufgestellt und empirisch untersucht: Die erste Hypothese geht von einer posttranslationalen Kupferinsertion aus. Die UE I wird laut dieser Hypothese zunächst vollständig exprimiert und in die Membran inseriert, bevor das Kupferion über einen Kanal in das 13 Å unterhalb der Membranoberfläche gelegene aktive Zentrum der Oxidase inseriert wird. Drei Ansätze wurden zur empirischen Überprüfung dieser Hypothese verfolgt: Erstens wurde ein in vitro Transferassay etabliert, bei dem heterolog exprimierte, kofaktorfreie UE I als Akzeptor für Kupferionen von CtaGLF diente. Zweitens wurden bioinformatische Analysen durchgeführt um potentielle Interaktionsflächen zwischen CtaG und UE I zu identifizieren. Und drittens wurde mit Hilfe koaffinitätschromatographischer Versuche eine Interaktion zwischen CtaG und kofaktorfreier UE I untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sprechen allesamt gegen eine posttranslationale CtaG-vermittelte Insertion von Kupferionen in die UE I der Cytochrom c Oxidase. Die zweite Hypothese geht davon aus, dass die prosthetischen Häm- und Kupfergruppen bereits vor der vollständigen Membraninsertion, das heißt kotranslational auf die UE I übertragen werden. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden ebenfalls mehrere Ansätze verfolgt: Erstens wurde die UE I in Gegenwart und Abwesenheit von CtaG heterolog in E. coli exprimiert und anschließend aufgereinigt. In Abwesenheit weiterer Assemblierungsfaktoren ist CtaG in diesem System nicht dazu in der Lage den Kupfergehalt der UE I zu erhöhen. Zweitens wurde mit Hilfe von Blau-Nativ Gelen und Crosslinking-Versuchen im nativen Wirt Paracoccus denitrificans nach einer Wechselwirkung zwischen CtaG und UE I gesucht. Insbesondere die Ergebnisse der Crosslinking-Versuche deuten auf einen Assemblierungskomplex hin, der sowohl CtaG als auch die UE I der Cytochrom c Oxidase enthält. In einem dritten Ansatz wurde ein zellfreies Expressionssystem etabliert, welches direkten Zugang zu naszierenden Ketten der UE I ermöglicht. Dieses System erscheint vielversprechend und dient derzeit als Basis für weitere Biogenesestudien. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass CtaG ein spezifisch Cu(I)-bindendes Protein ist, das im Zuge der Kupferbindung dimerisiert und in Paraoccus denitrificans in einem hochmolekularen Komplex gemeinsam mit UE I vorliegt. Die gegenwärtige Datenlage spricht dafür, dass CtaG als Kupferchaperon an der Biogenese der Cytochrom c Oxidase beteiligt ist und das CuB-Ion in einem kotranslationalen Mechanismus in die UE I der Cytochrom c Oxidase inseriert.
Tumoren epithelialen Ursprungs weisen häufig eine vermehrte Expression und/oder Mutationen des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (EGFR) auf. Durch die übermäßig starke bzw. permanente Vermittlung von Überlebens- und Proliferationssignalen an die betroffene Zelle trägt dies direkt zum Voranschreiten der Tumorerkrankung bei. Für eine Reihe von Tumorentitäten ist bekannt, dass eine abnorme Expression von EGFR mit einer schlechteren Prognose für den Krankheitsverlauf und die mittlere Überlebenszeit betroffener Krebspatienten korreliert. Begleitend zur systemischen Chemotherapie solcher Tumoren wird eine gerichtete Therapie zur Eindämmung der EGFR-vermittelten Signaltransduktion durch den Einsatz von Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKI) oder EGFR-spezifischer monoklonaler Antikörper (mAb) erzielt. Bei der therapeutischen Anwendung monoklonaler anti-EGFR Antikörper wurden in einigen Fällen lediglich milde Nebenwirkungen wie z.B. Hautausschläge beobachtet, wobei das Auftreten dieser Effekte mit dem Therapieerfolg korrelierte. Eine Reihe von monoklonalen Antikörpern, die gegen ErbB Rezeptor-Tyrosinkinasen gerichtet sind, sind mittlerweile zur Tumortherapie zugelassen, darunter der chimäre anti-EGFR Antikörper Cetuximab (Erbitux®, ImClone/BMS/Merck) zur Behandlung von metastasierenden Kolonkarzinomen sowie Karzinomen des Kopf- und Halsbereichs, der humane anti-EGFR Antikörper Panitumumab (Vectibix®, Amgen) bei metastasierenden Kolonkarzinomen, und der humanisierte anti-ErbB2 Antikörper Trastuzumab (Herceptin®, Genentech/Roche) bei Brustkrebs. Weitere Antikörper befinden sich derzeit in fortgeschrittenen Phasen der klinischen Entwicklung, darunter der humanisierte anti-EGFR Antikörper Matuzumab (Merck/Takeda). Klinische Daten zeigen, dass Patienten mit EGFR positiven Tumoren, die gegenüber etablierter Chemotherapie resistent sind, von der Behandlung mit anti-EGFR Antikörpern profitieren. Durch aktivierte EGF-Rezeptoren induzierte mitogene Signale werden vermindert bzw. blockiert, indem die Antikörper mit hoher Affinität an ErbB Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden und die Ligandenbindung bzw. die Dimerisierung verhindern, die zur Bildung aktivierter Rezeptor Dimere nötig ist. Auf diese Weise wird die mitogene Signalübertragung aktivierter ErbB-Rezeptor Dimere verhindert und die Proliferation der Tumorzelle wird verlangsamt oder kommt zum Stillstand. Es gibt Hinweise, dass darüber hinaus sekundäre Effektormechanismen des Immunsystems wie die antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) oder die komplementabhängige Zytotoxizität (CDC) gegen Antikörper-markierte Tumorzellen die anti-tumorale Wirksamkeit dieser Antikörper noch verstärken. Die lebensverlängernde Wirkung der Behandlung mit diesen Antikörpern ist ein Beispiel für die erfolgreiche Anwendung einer zielgerichteten Krebstherapie durch passive Immuntherapie. Zu Beginn dieser Arbeit waren die genauen Bindungsstellen der therapeutischen anti-EGFR Antikörper Cetuximab und Matuzumab noch unbekannt. Die Kenntnis der Lage der Epitope auf dem EGFR Molekül könnte wichtige Hinweise zur Aufklärung der Wirkungsmechanismen dieser Antikörper liefern und Ansätze zur weiteren Optimierung dieser Therapeutika aufzeigen. Aus vorangegangenen Experimenten war bekannt, dass Cetuximab und Matuzumab Epitope auf dem EGFR erkennen, die eine intakte Raumstruktur des Rezeptors voraussetzen. Diese Beobachtungen konnten in dieser Arbeit bestätigt werden, ferner konnte die Lage der Epitope auf die EGFR Ektodomäne III/L2 eingegrenzt werden. Da sowohl Cetuximab als auch Matuzumab nicht-lineare, konformationelle Epitope erkennen, wurde eine Variante der Phage Display Methode zur Identifizierung von Peptiden gewählt, die mit den hypervariablen Regionen (CDR) dieser Antikörper interagieren, welche die Bindungsspezifität der Antikörper vermitteln. Ziel dieser Experimente war die Identifizierung von Peptiden, welche die konformationellen Epitope von Cetuximab bzw. Matuzumab in linearer bzw. zyklisch restringierter Form nachbilden. Die Aminosäuresequenzen solcher sogenannter Mimotope könnten zur Identifizierung entsprechender Oberflächenstrukturen am EGFR Molekül herangezogen werden. In der vorliegenden Arbeit wurden aus kommerziell erhältlichen Bibliotheken genetisch modifizierter M13 Bakteriophagen, die randomisierte lineare bzw. zyklische Peptide als N-terminale Fusion am Oberflächenprotein pIII exponieren (M13KE), unter Anwendung der „Delayed Infectivity Panning“ (DIP) Methode Peptide angereichert, die von Cetuximab bzw. Maztuzumab erkannt werden. Zur Anreicherung von M13KE Bakteriophagen mit CDR-spezifischen Fusionspeptiden mittels DIP wurde zunächst ein „single-chain“ Antikörperfragment aus der cDNA von Matuzumab konstruiert und in den bakteriellen Expressionsvektor pIB-Tx kloniert. Mit dem resultierenden Konstrukt pIB-Tx-scFv(E72K) bzw. dem bereits vorhandenen analogen Konstrukt pIB-Tx-scFv(225), welches das „single-chain“ Antikörperfragment von Cetuximab enthält, wurden E. coli HB101 Bakterien transformiert, um die bakterielle Oberflächenexpression dieser Antikörperfragmente zum Einsatz in DIP Experimenten zu erreichen. In alternierenden positiven und negativen Selektionsrunden wurden unter Einsatz dieser scFv-exprimierenden E. coli HB101 Bakterien in Biopanning Experimenten Phagen mit solchen Fusionspeptiden angereichert, die selektiv an die „single-chain“ Antikörperfragmente von Cetuximab bzw. Matuzumab binden. Phagen ELISA Experimente mit M13KE Einzelklonen zeigten, dass aus allen eingesetzten Bibliotheken Phagen mit Fusionspeptiden isoliert werden konnten, die an den jeweiligen parentalen Antikörper des zur Selektion eingesetzten „single-chain“ Antikörperfragmentes binden. Ein Teil der Phagenklone wies eine zumindest partielle Kreuzreaktivität zu dem entsprechenden anderen anti-EGFR Antikörper auf, obwohl sie auf Bindung an diesen nicht selektioniert worden waren. Die Sequenzanalyse der Fusionspeptide lieferte keine gemeinsame Consensus Sequenz, es konnten jedoch kurze, gemeinsame Sequenzmotive identifiziert werden. In MTT-Zytotoxizitätsassays wurden diese Klone als mögliche Kompetitoren der Bindung des gegen EGFR gerichteten Immuntoxins scFv(225)-ETA in MTT-Zytotoxizitätsassays eingesetzt. Ein Teil der selektionierten Fusionspeptide war in der Lage, die Bindung der aus dem „single-chain“ Antikörperfragment von Cetuximab scFv(225) bestehenden Zellbindungsdomäne des Immuntoxins scFv(225)-ETA an EGFR exprimierende Zellen zu kompetieren. Auch für einige Fusionspeptide, die zunächst nur auf Bindung an Matuzumab selektioniert worden waren, wurde dies beobachtet. Peptide, welche die Bindung des Immuntoxins an EGFR kompetieren, weisen in ihren pIII-Fusionspeptiden laut Sequenzanalyse die gemeinsamen Sequenzmotive KTL bzw. YPLG auf. Nach einem Abgleich der Sequenzen der kompetierenden, kreuzreaktiven Peptide mit KTL bzw. YPLG Motiven wurden zwei Peptide ausgewählt und zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt. In MTT-Zytotoxizitätsassays wurde zunächst bestätigt, dass die synthetischen Peptide in der Lage sind, durch Kompetition spezifisch die Bindung des gegen EGFR gerichteten Immuntoxins scFv(225)-ETA und dessen zytotoxische Wirkung auf EGFR exprimierende Zellen zu verhindern. Kaninchenseren und aus diesen affinitätsgereinigte anti-Peptid Antikörper zeigten in ELISA Experimenten konzentrationsabhängige Bindung an die immobilisierten synthetischen Peptide. Die Bindung der anti-EGFR Antikörper Cetuximab und Matuzumab an die synthetischen Peptide konnte ebenfalls bestätigt werden. In einer Reihe von Experimenten wurde untersucht, ob die Immunisierung mit potentiellen Mimotopen der anti-EGFR Antikörper eine endogene humorale Immunantwort gegen den humanen EGFR bewirkt hatte. Die Bindung der affinitätsgereinigten anti-Peptid Antikörper an den Rezeptor auf der Oberfläche EGFR-exprimierender Tumorzellen wurde zunächst in Durchflusszytometrie (FACS) Experimenten analysiert. Für die gereinigten anti-Peptid Antikörper wurde spezifische Bindung an murine Renca-lacZ/EGFR Zellen sowie an humane A431 Vulvakarzinomzellen detektiert, die den humanen EGFR auf der Oberfläche exprimieren. Die Bindung an A431 konnte durch Vorinkubation der Antikörper mit einem Überschuss der entsprechenden synthetischen Peptide vollständig verhindert werden. In einer weiteren Serie von FACS Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Bindung der Antikörper Cetuximab und Matuzumab an EGFR durch eine Vorinkubation von Renca-lacZ/EGFR Zellen mit den gereinigten anti-Peptid Antikörpern deutlich reduziert werden konnte. Dies ist ein Beweis für die Fähigkeit der in Immunisierungsexperimenten generierten anti-Peptid Antikörper, die Bindungsstellen von Cetuximab und Matuzumab am EGFR zumindest teilweise zu besetzen. Diese Beobachtungen zeigen, dass durch Immunisierung mit den hier ausgewählten synthetischen Peptiden in Versuchstieren die Bildung von Antikörpern mit ähnlichen Eigenschaften wie Cetuximab bzw. Matuzumab und somit eine endogene Immunantwort gegen den humanen EGFR ausgelöst werden konnte. In Immunfluoreszenz Experimenten wurde die Bindung der anti-Peptid Antikörper an Renca-lacZ/EGFR Zellen erneut überprüft und mittels konfokaler Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) visualisiert. In diesen Experimenten wurde für gereinigte anti-Peptid Antikörper (KTL Motiv bzw. YPLG Motiv) Bindung an die Zelloberfläche bzw. membrannahe intrazelluläre Strukturen beobachtet, die der Lokalisierung der Bindungssignale der parallel getesteten anti-EGFR Antikörper Cetuximab, Matuzumab und dem murinen anti-EGFR Antikörper R-1 entsprach. Die Bindung der anti-Peptid Antikörper konnte durch Zugabe eines Überschusses der jeweiligen synthetischen Peptide verhindet werden. In einer weiteren Serie von Immunfluoreszenz Experimenten wurde der humane EGFR auf Renca-lacZ/EGFR Zellen gleichzeitig mit anti-KTL bzw. anti-YPLG Peptid Antikörpern aus Kaninchen sowie dem murinen anti-EGFR Antikörper R-1 detektiert. Durch eine Überlagerung der Signale konnte eindeutig eine Kolokalisation nachgewiesen werden. Dies ist ein Beweis dafür, dass es sich bei der Bindung der anti-Peptid Antikörper an die Oberfläche von Renca-lacZ/EGFR um Bindung an den humanen EGFR handelt. In Lysaten von EGFR exprimierenden Zelllinien konnte mit gereinigten anti-Peptid Antikörpern ein Protein detektiert werden, dessen Größe dem humanen EGFR entspricht. Die durch Stimulation des humanen EGFR mit dem natürlichen Peptidliganden EGF hervorgerufene Autophosphorylierung des Rezeptors in A431 Zellen konnte durch Zugabe von anti-Peptid Antikörpern teilweise inhibiert werden, allerdings nicht in dem gleichen Ausmaß, wie dies für die als Positivkontrollen eingesetzten anti-EGFR Antikörper Cetuximab und Matuzumab beobachtet wurde. In MTT-Zytotoxizitätsassays konnte darüber hinaus eine teilweise Kompetition der Bindung des rekombinanten Toxins TGF!-ETA an EGFR-exprimierende A431 Zellen, und somit eine teilweise Kompetition des natürlichen Peptidliganden TGF! an EGFR durch Vorinkubation mit anti-Peptid Antikörpern nachgewiesen werden. Zur näherungsweisen Quantifizierung der Affinitäten der anti-Peptid Antikörper und der anti-EGFR Antikörper Cetuximab und Matuzumab für die synthetischen Peptide (KTL Motiv und YPLG Motiv) bzw. für die gereinigte extrazelluläre Domäne des humanen EGFR (sEGFR) wurden ELISA Bindungstests durchgeführt. Die aus den Bindungskurven berechneten Affinitätswerte zeigen, dass die anti-Peptid Antikörper an sEGFR im nanomolaren Bereich binden und damit ca. 200-fach niedrigere Affinitäten für den Rezeptor besitzen als die affinitätsoptimierten anti-EGFR Antikörper Cetuximab bzw. Matuzumab. Die Affinitäten der anti- Peptid Antikörper für die synthetischen Peptide liegen ebenfalls im nanomolaren Bereich, während Cetuximab und Matuzumab lediglich mikromolare Affinitäten für die Peptide besitzen. Durch „Epitope Mapping“ in silico vorhergesagte mögliche Oberflächenstrukturen auf EGFR, welche die Peptidmimotope mit KTL bzw. YPLG Motiven nachbilden, sind direkt benachbart zu den mittlerweile publizierten Bindungsstellen von Matuzumab und Cetuximab bzw. EGF in der Ektodomäne III/L2 von EGFR (Li et al., 2005; Schmiedel et al., 2008) und zeigten im Falle des Peptides mit KTL Motiv Übereinstimungen mit Teilen beider Epitope. Möglicherweise ist dieses Peptid in der Lage, alternative Strukturen mit KTL bzw. KTI Motiven an der Oberfläche von EGFR nachzubilden, die Gemeinsamkeiten mit beiden Epitopen von Cetuximab bzw. Matuzumab besitzen und daher von beiden Antikörpern erkannt werden können. Eine endgültige Klärung der Bindung der hier identifizierten Peptide an Cetuximab bzw. Matuzumab bzw. der Bindung der anti-Peptid Antikörper an EGFR könnte in nachfolgenden Untersuchungen mittels Röntgenkristallographie bzw. NMR strukturell aufgeklärt werden – die hierzu nötigen Peptide bzw. Proteine liegen bereits in gereinigter Form vor. Eine Optimierung der hier identifizierten Mimotope zur Steigerung der Affinitäten der induzierten anti-Peptid Antikörper für EGFR könnte zur Entwickung von Vakzinen führen, die eine Alternative zur wiederholten, kostenintensiven passiven Immunisierung von Patienten mit EGFR-exprimierenden Tumoren mit monoklonalen Antikörpern darstellen könnte.
Es ist gelungen, self-assembled Monolayers auf Wasserstoff-terminierten Germaniumoberflächen zu präparieren. Für die Charakterisierung wurden unterschiedliche Methoden herangezogen. Neben der Oberflächentopographie, die mit dem AFM untersucht wurde, konnten die Proben durch röntgenspektroskopische Methoden qualitativ und quantitativ vor, während und nach der Präparation analysiert werden. Im Zusammenspiel dieser Methoden war eine umfassende Interpretation der Ergebnisse möglich, die viele neue Erkenntnisse im Bereich der Grundlagenforschung auf dem Halbleitersubstrat Germanium (Ge) ermöglichten. Motivation für diese Arbeit war das Interesse, Ge als Substrat im Bereich der Halbleitertechnologie zu verwenden. Ge hat eine bessere Ladungsträgerbeweglichkeit und andere Vorteile gegenüber Silicium (Si). Der Einsatz scheitert momentan, da das ca. 1-2 nm dicke native Oxid auf der Oberfläche des Ge anders als beim Si wasserlöslich ist. Daher ist eine Renaissance der Grundlagenforschung auf diesem Gebiet zu verzeichnen. Auf der Suche nach einer definierten und passivierten Oberfläche lag der Gedanke nah, dieses Ziel durch das Self-Assembly thiolischer Alkane zu erreichen. Diese Methode ist auf Goldoberflächen sehr gut erforscht und man erhält aus einer entsprechenden Lösung durch einfachste nasschemische Präparation eine bei Laborbedingungen stabile Monolage. Um das Konzept der self-assembled Monolayers auf Ge zu übertragen, war es zunächst notwenig, die Oxidschicht des Substrats so zu entfernen, so dass eine Wasserstoff-terminierte Oberfläche zurückbleibt, die eine möglichst geringe Rauheit aufweist. Dies gelang letztendlich mit einem Tauchbad in verdünnter oder konzentrierter Fluorwasserstoffsäure (Flusssäure, HF) für 5 min bzw. 40 s. Die Rauheit der Proben wurde durch AFM-Aufnahmen bestimmt und liegt bei RMS=0,34 nm. Die chemische Beschaffenheit wurde durch XPS und Totalreflexionsröntgenfluoreszenz am Synchrotron (Sr-TXRF) untersucht. Die referenzfreie Quantifizierung zeigte, dass sich auf der Oberfläche noch Sauerstoff befand, der durch XPS auch dem auf der Oberfläche verbliebenem Wasser zugeordnet werden konnte. Durch Untersuchungen an der Absorptionskante des Sauerstoffs mit NEXAFS konnte diese These untermauert werden. In einem nächsten Schritt gelang die Präparation der SAMs mit Molekülen mit unterschiedlichen Kopfgruppen. Diese definierten die neuen Eigenschaften der Substratoberfläche und sind auch für die Verwendung des Substrats von großer Bedeutung. Es wurden die Kopfgruppen so gewählt, dass eine Detektion durch röntgeninduzierte Fluoreszenz möglich war. Daher fiel die Wahl auf ein fluoriertes Acetat und eine Phosphorsäure als Kopfgruppe jeweils eines Mercaptoundecans. Als Lösemittel diente schließlich wasserfreies Dichlorethan. Für die Abbildung der zunächst in Inseln wachsenden Monolage durch das AFM war die Kopfgruppe zwar unerheblich. Mit dieser Methode ließ sich der Einfluss der Kopfgruppe auf die Anordnung dokumentieren. Es war bei ausgewählten Proben möglich, eine Bedeckung der Oberfläche mit den Thiolen per AFM zu vermessen. Diese lag bei ca. 50 %. Ein Nachweis der Moleküle erfolgte unter anderem durch XPS. Durch diese Methode konnte allerdings noch nicht nachgewiesen werden, ob die Moleküle nur ungeordnet auf der Oberfläche adsorbiert sind, oder tatsächlich chemisch gebunden und aufgerichtet sind. Dies erfolgte durch Messungen an der Synchrotronstrahlenquelle. Durch referenzfreie TXRF konnte die Belegung des Substrats mit Fluor analysiert werden. Da das Fluor jedoch auch ein Rückstand des HF-Tauchbades hätte sein können, wurde durch NEXAFS nachgewiesen, dass bei den Proben, die lange in thiolischer Lösung waren, die Fluorspezies, die bei den frisch HF-getauchten Proben vorhanden ist, praktisch nicht mehr existiert. Im Umkehrschluss wurde auch eine auf Gold präparierte Monolage des gleichen Moleküls mit NEXAFS vermessen. Die Fluorspektren ähnelten sich trotz des unterschiedlichen Substrats. Bei der Röntgenfluoreszenz am Glanzwinkel (GIXRF) können Intensitätsmaxima ein stehendes Wellenfelds oberhalb des Substrats abhängig vom Winkel des einfallenden Strahls verändert werden. Diese Methode kam zum Einsatz um nachzuweisen, dass sich die Moleküle der Kopfgruppe oberhalb des Schwefels und oberhalb des Ge befinden. Durch mathematische Berechnungen ist man in der Lage, die Höhe der Monolage und den Verkippungswinkel der Moleküle zu ermitteln. Dieser lag bei ca. 45° und einer 1,4 nm hohen Monolage. Diese Aussagen wiederum stimmen mit den am AFM erzielten Ergebnissen in erster Näherung überein. Durch das Zusammenspiel fünf unterschiedlicher Methoden war es möglich, diese vielfältigen Erkenntnisse in dem Forschungsfeld der Ge-Oberflächen zu generieren.
Die Entwicklung neuer und Verbesserung bestehender Methoden zur theoretischen Beschreibung molekularer Systeme ist eine der wichtigsten Aufgaben der theoretischen Chemie, vor allem zur Berechnung elektronisch angeregter Zustände zur Simulation von Spektren. Das Ziel dieser Arbeit ist in diesem Zusammenhang die Weiterentwicklung des algebraisch-diagrammatischen Konstuktionsverfahrens (ADC), einer Methode zur Berechnung elektronisch angeregter Zustände, und die Bereitstellung effizienter Computerprogramme zum theoretischen Studium optischer Eigenschaften von "open-shell" Molekülen. Im Vordergrund stehen hierbei die physikalisch richtige Beschreibung von ladungsgetrennten Zuständen und solchen mit hohem Doppeltanregungscharakter. Verbesserte theoretische Methoden sind notwendig, da die zu berechnenden Systeme häufig für eine Beschreibung mit vorhandenen hochgenauen ab initio Methoden zu groß sind. Einfachere, durchführbare Methoden wie z.B. semi-empirische oder DFT-basierte Methoden, die es erlauben, sehr große Molekülsysteme mit mehr als 100 Atomen zu beschreiben, weisen häufig große, nicht vorhersagbare Fehler auf. Experimente im Forschungsgebiet angeregter Zustände von Molekülen finden spektroskopisch statt und erfordern auf der anderen Seite eine Unterstützung durch zuverlässige theoretische Voraussagen. Die Weiterentwicklung der Theorie ist also auch im allgemeinen Interesse der Chemie, Biologie und der anderen Naturwissenschaften. Teil 1 dieser Arbeit umfasst die Theorie, während in Teil 2 deren Anwendung auf ausgewählte Systeme zu finden ist. Nach einer allgemeinen Einführung in die Problematik und grundlegenden Methoden der Quantenchemie in Kapitel 1, wurde im ersten Teil von Kapitel 2 die Methode zur Berechnung angeregter Zustände und ihrer Eigenschaften vorgestellt, auf der diese Arbeit basiert, nämlich das algebraisch-diagrammatische Konstruktionsverfahren (ADC). Dabei sind Eigenschaften von ADC zu betonen, die es von den anderen Methoden unterscheidet. Zum einen werden in ADC alle angeregten Zustände energetisch zuverlässig beschrieben, das heißt Rydberg-, Ladungstransfer- und doppelt angeregte Zustände findet man im Anregungsspektrum an der richtigen Position. Andererseits ist die Methode eine der schnellsten zur Beschreibung doppelt angeregter Zustände (z.B. bei Polyenen) und eignet sich, deren Relevanz im Spektrum zu ermitteln. Denn die beiden Schemata ADC(2)-s und ADC(2)-x unterscheiden sich in der störungstheoretischen Behandlung doppelt angeregter Zustände um eine Ordnung, ADC(2)-s beschreibt sie in nullter Ordnung, ADC(2)-x in erster. Im folgenden Abschnitt stehen die ausführlichen Gleichungen des ADC-Verfahrens für unseren Computercode. Kapitel 2 wurde abgeschlossen durch die Gleichungen der Erweiterung von ADC zur Behandlung von "open-shell" Molekülen auf UADC. Kapitel 3 umfasst die Beschreibung der "intermediate state representation" (ISR), die zur Berechnung von Eigenschaften angeregter Zustände dient und die theoretische Herleitung des UADC-Verfahrens erlaubt. Am Anfang von Teil 2 in Kapitel 4 steht die Untersuchung der Genauigkeit und Zuverlässigkeit des neu entwickelten UADC-Verfahrens. Dabei wurden elf verschiedene, mittelgroße, aromatische Moleküle ausgewählt, zu denen in der Literatur auch experimentelle Daten zu Vergleichszwecken zu finden waren. Das Ergebnis ist sehr überzeugend und nur minimal aufwändiger als ADC. Kapitel 5 zeigt eine erste Anwendung von UADC auf größere Moleküle und stellt die Eigenschaft der Bestimmung von doppelt angeregten Zuständen von ADC und UADC noch einmal heraus. Der Vergleich der Polyene mit ihren "open-shell" Partnern, den Polyen-Radikalkationen und den neutralen Polyenylradikalen, zeigte, dass der Einfluss der Doppeltanregungen in den Radikalen kleiner ist, für eine exakte Beschreibung der angeregten Zustände ist er jedoch nicht zu vernachlässigen. Danach wurde eine Extraplation der angeregten Zustände von langkettigen Polyenen, Polyenradikalkationen und Polyenylradikalen vorgenommen, die den konjugierten pi-Systemen von Karotinoiden als Modellsysteme dienen. Die Beschreibung der Polyene bestätigte die experimentellen Vorhersagen zu Karotinoiden. Eine erste Anwendung der ISR bezüglich der Berechnung von Eigenschaften angeregter Zustände ist mit der Berechnung von Dipolmomenten angeregter Zustände in Kapitel 6 durchgeführt worden. Die Ergebnisse zeigen eine gute Übereinstimmung mit anderen Methoden und Messergebnissen. Eine weitere Anwendung der ISR ist die Berechnung von resonanten Zwei-Photonen-Absorptionsspektren, mit deren Hilfe spektroskopisch "dunkle" Zustände detektiert werden können. Die zur Berechnung notwendigen Übergangsdipolmomente zwischen angeregten Zuständen aus der ISR wurden dazu in einer sogenannten "sum-over-states" Näherung verwendet. Eine mögliche andere Berechnung über einen geschlossenen Ausdruck mit Hilfe der ADC-Näherung ist noch nicht implementiert.
Channelrhodopsine sind blaulichtsensitive, Retinal-bindende Proteine aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii. Channelrhodopsin 2 (ChR2) wurde als heptahelikaler, kationenselektiver Ionenkanal charakterisiert (Nagel et al., 2003). Wie die zur selben Proteinfamilie gehörende Protonenpumpe Bakteriorhodopsin (bR) wird ChR2 durch Licht aktiviert; allerdings wird hierbei ein passiver Strom ausgelöst, bei dem Kationen entsprechend ihres elektrochemischen Gradienten fließen. Aufgrund dieser Eigenschaft eignet sich ChR2 zur lichtinduzierten Depolarisation von Zellen und zur Auslösung von Aktionspotentialen in Neuronen, über deren Membran ein Konzentrationsgradient von Kationen anliegt (Boyden et al., 2005). Die Stimulation elektrischer Aktivität von ChR2-exprimierenden Neuronen im Hirngewebe von Mäusen, die ChR2 transgen exprimieren, kann beispielsweise genutzt werden, um die Konnektivität von Neuronen und Hirnbereichen zu untersuchen (z.B. Wang et al., 2007). Für diese und weitere Anwendungen war es interessant, ChR2 zelltyp- oder regionenspezifisch in Mäusen zu exprimieren. Zu diesem Zweck sollte ChR2/eGFP bicistronisch oder ChR2-YFP als Fusionsprotein unter einem ubiquitären Promotor exprimiert werden; die Expression sollte aber durch ein Stop-Element unterbunden werden, das von loxP-sites flankiert ist (unaktiviertes Transgen). Das Enzym Cre- Rekombinase entfernt durch Rekombination das Stop-Element an diesen Erkennungssequenzen, wodurch die ChR2-Expression ermöglicht werden sollte (aktiviertes Transgen). Die Cre-Rekombinase kann dabei sowohl viral als auch transgen unter zelltyp- und regionenspezifischen Promotoren exprimiert werden und damit die regionale Spezifität und den Zeitpunkt der ChR2-Expression bestimmen. Es wurden drei Mauslinien über Pronukleus-Injektionen erhalten, die den Reporter β-Galactosidase des unaktivierten Transgens exprimierten. Die Verpaarung von Mäusen dieser Linien mit Cre-Rekombinase-exprimierenden Mauslinien führte aber nur zu einer ineffizienten Aktivierung des Transgens, so dass ChR2-Expression einzig mittels RT-PCR nachgewiesen werden konnte. Nach viraler Expression der Cre-Rekombinase im Hippokampus konnte eine Aktivierung des ChR2-Transgens auch mittels Immunfluoreszenz gezeigt werden. Mangels GFP-Fluoreszenz waren die transgenen Linien aber nicht für gezielte elektrophysiologische Ableitungen verwendbar. In einem zweiten Ansatz wurden transgene Mäuse über embryonale Stammzellen (ES-Zellen) generiert. Bei diesem Ansatz wird eine geringere Kopienzahl des Transgens ins Genom integriert. In den ES-Zellen konnte durch transiente Cre-Rekombinase-Expression gezeigt werden, dass das Transgen effizient aktiviert werden konnte. Aus mehreren ES-Zell-Klonen wurden chimäre Mäuse erhalten, die zum jetzigen Zeitpunkt auf Keimbahntransmission getestet werden. Wie ChR2 einen Kationenkanal bildet und welche Transmembrandomänen und Aminosäuren daran beteiligt sind, ist unbekannt. Daher wurde im zweiten Teil dieser Arbeit untersucht, ob die Positionen E90, E97 und E101, welche in der zweiten Transmembranhelix untereinander zu liegen scheinen, Teil einer Ionenpore sein könnten. Um den Einfluss dieser Aminosäuren auf die Kationenleitung und/ oder – selektivität zu untersuchen, wurden diese Positionen substituiert und die resultierenden ChR2-Mutantenproteine in Xenopus laevis Oozyten exprimiert und elektrophysiologisch analysiert. Um Na+- bzw. Protonen-mediierte Ströme unterscheiden zu können, wurden Na+-haltige und Na+-freie Puffer verschiedener pH-Werte verwendet. Lichtinduzierte Ströme von ChR2E97A, ChR2E97Q, ChR2E97K und ChR2E101K waren im Vergleich zum Wildtyp stark reduziert, ausschließlich bei pH 4 zu detektieren und wohl hauptsächlich durch Protonen getragen. Die isofunktionale, aber ladungsneutrale Mutation ChR2E90Q zeigte nur geringe Unterschiede zum Wildtyp. Alaninsubstitution (E90A) als auch Ladungsinversion (E90K) führte zu starken Veränderungen des ChR2-Stroms im Vergleich zum Wildtyp. ChR2E90A zeigte im Vergleich zum Wildtyp reduzierte Protonenströme sowie einen erhöhten Natriumstrom, der durch Protonen inhibierbar war. Die Ladungsinversion ChR2E90K führte zu allgemein stark verminderten Leitfähigkeiten, lediglich bei pH 4 konnten noch Ströme gemessen werden. Die Ergebnisse sind der erste Hinweis auf eine Beteiligung von Glutamatresten an der Ionenleitfähigkeit in der Transmembranhelix 2 von ChR2.
Die vorliegende Arbeit befasste sich in erster Linie mit der Regulation des P2X2 Rezeptors (P2X2R) durch Phosphoinositide (PI). P2X Rezeptoren sind durch extrazelluläres ATP aktivierte Kationenkanäle, die ubiquitär unter Vertebraten, v. a. im zentralen wie peripheren Nervensystem exprimiert werden. Bis heute sind 7 verschiedene Untereinheiten dieser Rezeptorfamilie bekannt, die nach homo- oder heterotrimerer Assemblierung unterschiedliche funktionelle Phänotypen ausbilden. Die P2X Rezeptoren sind an einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen beteiligt. Für ihre Beteiligung am zellulären Signalgeschehen wurde in der Vergangenheit der Begriff der purinergen Signaltransduktion geprägt. PI4,5P2 ist ein zelluläres, an der Innenseite der Plasmamembran verankertes Phospholipid, dem zahlreiche, essentielle Funktionen zukommen. Dass es auch Signalfunktion besitzen kann, wurde erst spät (1980) bekannt; dass es darüber hinaus zudem membranäre Transportsysteme reguliert, konnte erst in den letzten Jahren gezeigt werden. Die ersten Kanäle, für die eine Phosphoniositid (PI)-Beeinflussung nachgewiesen wurde, waren die einwärts gleichrichtenden K+-Kanäle. 2006 wurden die ersten vorläufigen Hinweise publiziert, dass auch die Kanalfunktion der P2X Rezeptoren durch Phosphoinositide beeinflusst werden kann. Darauf aufbauend wurde in der vorliegenden Arbeit der P2X2R nach Expression in Xenopus Oozyten elektrophysiologisch auf eine mögliche Regulation durch PIPns untersucht. Um die in der Oozyte vorliegenden PI-Level gezielt während der Messung ändern zu können, wurde die spannungsgesteuerte Phosphoinositid-Phosphatase Ci-VSP coexprimiert. Ci-VSP, die der PTEN-Phosphatase strukturell sehr ähnlich ist, wurde 2005 aus der Schlauchascidie Ciona intestinalis kloniert. In der veröffentlichten Klonierungsarbeit wurde bereits gezeigt, dass Ci-VSP in der Lage ist, bekannte PI4,5P2-sensitive Membrankanäle, wie z. B. bestimmte K+-Kanäle, spannungsabhängig zu inhibieren. Es konnte in TEVC-Experimenten gezeigt werden, dass die durch Depolarisation induzierte Aktivierung dieser Phosphatase den P2X2 Rezeptorstrom in seiner Desensibilisierung sowohl beschleunigt als auch verstärkt. Dieser Effekt war spannungsabhängig und nahm mit höherer Depolarisation zu. Die ermittelte Spannungsabhängigkeit stimmte dabei mit dem sensitiven Potentialbereich der spannungsgesteuerten Ci-VSP-Domäne, gemessen an ihren gating-Strömen, überein. Der „Ci-VSP-Effekt“ auf den P2X Rezeptor konnte nur in Anwesenheit von ATP, d.h. bei aktiviertem Rezeptor, beobachtet werden. Wurden die Oozyten mit Wortmannin, einem PI4-Kinase(PI4K)-Inhibitor, behandelt, zeigte sich eine vergleichbare Veränderung des Rezeptorstroms. Eine PI4K-Inhibition zielt demnach offensichtlich auf die gleichen Regulationsmechanismen wie die Ci-VSP-Aktivierung. In weiterführenden zellfreien Patch Clamp-Messungen an Oozytenmembranen wurden sowohl Einzelkanal- als auch makroskopische Ströme des P2X2R unter Einfluss verschiedener, intrazellulär verabreichter PIs und PI-beeinflussender Enzyme untersucht. Einzig die Zugabe von PI4,5P2 hatte einen deutlich aktivierenden Einfluss auf den makroskopischen Rezeptorstrom, andere getestete PIs (wie auch PI3-Kinase und PTEN-Phosphatase) zeigten keinerlei Wirkung. Vergleichbare Ergebnisse konnten in vorläufigen Einzelkanal-Messungen an diesem Rezeptor Subtyp beobachtet werden. Da die PI4-Kinase offensichtlich an der beobachteten Beeinflussung der P2X2R Desensibilisierung beteiligt ist, wurde die P2X2-Rezeptorsequenz auf potentielle - über sogenannte SH3-Epitope vermittelte - PI4K-Interaktionsbereiche hin untersucht. Diese SH3-Epitope kommen in vielen zellulären Proteinen vor, um Protein-Protein-Interaktionen zu vermitteln. Nach Sequenzanalyse des maßgeblich am Desensibilisierungsgeschehen beteiligten C-Terminus des P2X2R konnte im distalen Teil ein SH3-Bindungsmotiv lokalisiert werden, das daraufhin durch gerichtete Mutagenese (P2X2-P451A/P454A) unwirksam gemacht wurde. Dieser mutierte Rezeptor verhielt sich in seiner Desensibilisierung wie der Wildtyp nach Wortmannin-Behandlung, zeigte also eine intrinsisch verstärkte Desensibilisierung. Eine Wortmannin-Behandlung der Oozyten, die den mutierten Rezeptor exprimierten, führte hingegen zu keiner weiteren Beeinflussung des Rezeptorstroms. Somit konnte letztlich der Schluss gezogen werden, dass die PI4K, und das mit ihr in direkter Verbindung stehende PI4,5P2, einen maßgeblichen Einfluss auf das Desensibilisierungsverhalten des P2X2R hat. Auf Basis der erarbeiteten Befunde wurde ein kinetisches Reaktionsmodell des P2X2R erstellt, das bisher aufgestellte Modelle mit den Ergebnissen dieser Arbeit vereint, aber auch in teilweisem Gegensatz zu dem von FUJIWARA & KUBO [2006] steht. Des Weiteren wurde im Verlauf dieser Arbeit die reversible Inhibition des P2X2R durch eine Reihe von Aminoglykosid-Antibiotika untersucht. Durch Analyse der Dosis-Wirkungs-Beziehungen, der Spannungs- sowie wie ATP-Konzentrations-Abhängigkeit der Inhibition konnte gezeigt werden, dass es sich dabei um einen nicht-kompetitiven open pore block handelte. Durch weiterführende Untersuchungen an einer nicht-desensibilisierenden P2X2/1 Rezeptorchimäre wurde gezeigt, dass eine Aminoglykosid-Inhibition die ATP-Dissoziation von der Rezeptorbindungsstelle signifikant verlangsamte. Dieser Befund deutet auf eine im Vergleich zum geschlossenen Zustand erhöhte Affinität des offenen Zustands für ATP hin. Neben den hier untersuchten Aminglykosiden sind bislang keine weiteren Substanzklassen bekannt, die den P2X2R durch einen derartigen Mechanismus hemmen.
Channelrhodopsin-2, or ChR2, is a light-gated inward rectifying cation channel. Ever since its first characterisation (Nagel et al., 2003), it has been used extensively in the light-activated control of neural cells in culture as well as in living animals like mice, Caenorhabditis elegans and Drosophila melanagaster. Despite its broad application in the field of neuroscience, little is known about the properties of this ion channel. The aim of this thesis is to elucidate the single channel conductance under different conditions using stationary noise analysis on whole cell recordings of a HEK293 cell line that stably expresses the truncated ChR2 (amino acids 1-315), which behaves identically to the full length protein (Nagel et al., 2003). Stationary noise analysis is based on the fact that the ion channel noise due their opening and closing has a characteristic form of a plateau at low frequency points and a following decrease of power with 1/f² in difference power spectra, which are composed of the difference of fast Fourier transformed (FFT) stationary whole-cell recordings with and without illumination. From the parameters yielded by an approximation of the power spectra with a Lorentzian function the single channel conductance can be estimated. The single channel conductance of ChR2 was determined at -60 mV applied for different cations, yielding values of 91 ± 25 fS (Guanidine+), 42 ± 7 fS (Na+), 61 ± 18 fS (Li+) and 37 ± 14 fS (Methylammonium+). With 200 mM Guanidine+ outside of the cells and measurements between 0 mV and -60 mV applied, it could be shown that the inward rectification is still present on the scale of the single channel. Noise Analysis with concentrations between 40 and 200 mM Guanidine+ showed a saturation of the single channel conductance with high Guanidine+ concentrations with a maximal conduction of 129 ± 9 fS (Michaelis Menten approximation: Km = 82 ± 14 mM). Activation Energies of the rate constants k (2πfc, with fc = corner frequency of the Lorentzian function) and koff (1/τoff, with τoff = closing time of the channel at -60 mV) were determined to be 75 ± 23 kJ/mol and 64 ± 11 kJ/mol, respectively, which are similar to the value determined for the Channelrhodopsin-1 closing times (~60 kJ/mol; Nagel et al., 2002). The activation energy of the ChR2 single channel conductance was determined to be 21.2 ± 20.8 kJ/mol, which also is similar to the activation energy of the ChR1 current amplitude (20 kJ/mol; Nagel et al., 2002). The amount of active ChR2 channels in the membrane (160,000 or 226 ChR2/μm²) as well as the single channel current (-7.5 ± 0.6 fA) could be determined by variation of the light intensity (0.05 mW mm-2 to 5.3 mW mm-2). In the course of this thesis, the single channel parameters of the ChR2 mutant H134R were also determined. H134R had been previously published as a “gainof- function” mutant (Nagel et al., 2005a). The increased macroscopic current amplitude of H134R could be explained by an increased lifetime of the channel in comparison to the wildtype ChR2. Within the margin of error both single channel conductances in the presence of 200 mM Guanidine+ of the wildtype (91.1 ± 24.9 fS) and the H134R (89.4 ± 30.7 fS) are the same. In the presence of 200 mM Lithium+ values of 60.6 ± 17.8 fS for the wildtype ChR2 and 50.8 ± 9.6 fS for the H134R mutant were determined. This thesis marks the first in depth analysis of the single channel conductance of ChR2. Using stationary noise analysis the single channel conductance of Channelrhodopsin-1 as well as interesting Channelrhodopsin-2 mutants can also be analysed in the future.
Elektronentransferprozesse in Pd-Komplexen 1,4-Chinon-basierter Bis(pyrazol-1-yl)methan-Liganden
(2009)
PdII-katalysierte Oxidationsreaktionen organischer Verbindungen stellen wichtige synthetische Werkzeuge dar. Um das Übergangsmetall in katalytischen Mengen einsetzen zu können ist es nötig, das im Zuge der Substratumwandlung entstehende Pd0 seinerseits wieder zu reoxidieren. Im großtechnischen Wacker-Prozess setzt man zu diesem Zweck das Redoxsystem CuII/CuI ein, welches Elektronen von Pd0 aufnimmt und sie auf molekularen Sauerstoff überträgt, so dass als einziges Abfallprodukt Wasser entsteht. Da beim Einsatz von Kupfersalzen allerdings Probleme durch unerwünschte Nebenreaktionen auftreten können, stieß man auf der Suche nach alternativen Redox-Cokatalysatoren auf 1,4-Benzochinon. Man nimmt an, dass der Reoxidation von Pd0 eine Koordination des 1,4-Benzochinons an das Übergangsmetallatom vorausgeht. Vor diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Arbeit ein 1,4-Naphthochinon-basierter Bis(pyrazol-1-yl)methan-Ligand entwickelt, dessen Pd-Komplex das katalytisch aktive Übergangsmetallatom und den Redox-Cokatalysator in einem einzigen Molekül vereint. Eine direkte intra- und intermolekulare 1,4-Chinon/Pd-Koordination wird durch das Ligandendesign jedoch verhindert. Anhand dieses Modellsystems sollte dann untersucht werden, ob alternativ zu den etablierten mechanistischen Vorstellungen zum Ablauf des Elektronentransfers, eine durch den Raum verlaufende elektronische Kommunikation der beiden redoxaktiven Zentren möglich ist. Sollte das der Fall sein, wäre man künftig bei der Entwicklung und Optimierung solcher Hybridkatalysatoren nicht auf die Miteinbeziehung des 1,4-Chinons in die Koordinationssphäre des Übergangsmetallions angewiesen, sondern könnte diese ausschließlich an die koordinationschemischen Erfordernisse des Pd-Zentrums anpassen. Nachdem das Modellsystem zur Verfügung stand, galt es im ersten Schritt, die elektrochemischen Eigenschaften von freiem Ligand und PdII-Komplex mittels Cyclovoltammetrie zu bestimmen. Mit Kenntnis der Redoxpotentiale wurden daraufhin elektrochemisch selektiv reduzierte Spezies des Liganden bzw. seines PdII-Komplexes erzeugt und deren UV-vis-Spektren in situ aufgenommen. Letztere lieferten nötige Referenzwerte für die folgenden Experimente. Auf Grundlage dieser Vorarbeiten konnte nun die elektronische Kommunikation der redoxaktiven Zentren in dem Komplex untersucht werden. Da im Modellsystem zunächst beide redoxaktive Zentren in der oxidierten Form vorliegen, war es erforderlich, das PdII-Ion selektiv zu reduzieren, um dem System an der richtigen Stelle Elektronen zuzuführen. Als Reduktionsmittel wurde Triethylamin gewählt; entsprechende Vergleichsexperimente stellten zuvor sicher, dass dieses keine Nebenreaktionen mit dem Liganden selbst eingeht. Im Zuge der Reduktion des PdII-Zentrums ist eine Änderung der UV-vis-spektroskopischen Eigenschaften des Liganden zu beobachten. Ein Vergleich der erhaltenen Daten mit den Referenzspektren der elektrochemisch erzeugten reduzierten Spezies legt den Schluss nahe, dass nach Überführung des PdII-Zentrums in die nullwertige Stufe der durch den Raum verlaufende Übergang eines Elektrons auf den 1,4-Naphthochinon-basierten Liganden erfolgt. Das hierbei entstehende 1,4-Naphthosemichinonradikal wurde zusätzlich ESR-spektroskopisch nachgewiesen.
Die 5-Lipoxygenase (5-LO) ist das Schlüsselenzym in der Biosynthese proinflammatorischer Leukotriene, die maßgeblich an der Entstehung allergischer und entzündlicher Erkrankungen wie Arthritis, Asthma und kardiovaskulären Erkrankungen beteiligt sind (23). Humane 5-LO besteht aus 673 Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht von 77,8 kDa (25). Das Protein besteht aus einer größeren katalytischen Domäne, die ein zentrales Eisen(II)-Atom enthält, dass für die zweistufige LTA4-Bildung aus Arachidonsäure benötigt wird, und einer kleineren C2-ähnlichen Domäne, die Bereiche für die Membran- sowie Ca2+-Bindung enthält. Durch Stimulation von intakten Zellen kommt es zu einer Translokation der 5-LO an die Kernmembran. Die Wechselwirkung mit dem membranständigen FLAP fördert die 5-LO-Leukotrienbildung. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit niedermolekularen Modifikationen der 5-LO durch U-73122 und Glutathion sowie mit der Charakterisierung von 5-LO-Inhibitoren. U-73122 ist ein Inhibitor, der in vitro und in vivo mit einem IC50-Wert von 30 nM bzw. 2,4 µM die 5-LO-Aktivität hemmt (2). U-73122 verfügt über eine thiol-reaktive Maleinimid-Gruppe, wodurch die Substanz kovalent an einige 5-LO-Cysteine (Cys-99, -159 und weitere) binden kann. Entsprechende U-73122-5-LO-Peptide konnten nach Trypsin-Verdau der 5-LO mit MALDI-MS-Messungen nachgewiesen werden. Für diesen Zweck musste eine effiziente Aufreinigung für native 5-LO (Reinheit > 95%) entwickelt werden. Um die Veränderung der 5-LO-Aktivität nach U-73122-Zugabe zu untersuchen, wurden Cystein/Serin-5-LO-Mutanten hergestellt. Es konnte festgestellt werden, dass die Mutante C416S-5-LO nicht mehr effektiv durch U-73122 gehemmt werden konnte. Daher ist anzunehmen, dass U-73122 an Cystein-416 der 5-LO bindet und die 5-LO-Produktbildung hemmt. Auf der 5-LO-Oberfläche kann ein Bereich lokalisiert werden, der einen Zugang für das Substrat zum aktiven Zentrum der 5-LO bilden könnte (238,239). Dieser Bereich liegt in unmittelbarer Nähe zu Cystein-416. Daher besteht die Möglichkeit, dass U-73122, nachdem es an Cystein-416 gebunden hat, diesen Bereich hemmend beeinflussen kann. Es konnte nachgewiesen werden, dass Glutathion an mehrere Cysteine der 5-LO (Cystein-99, -264 und -449) kovalent binden kann. Um Veränderungen der 5-LO-Aktivität durch in vivo Glutathionylierungen zu zeigen, wurden HeLa-Zellen mit 5-LO, Cystein-/Serin-5-LO-Mutanten sowie FLAP transfiziert und mit Diamid inkubiert. Es konnte festgestellt werden, dass die native sowie FLAP-gesteigerte 5-LO-Produktbildung durch Diamid gehemmt wird. Dies konnte ebenfalls für die Mutante 3W-5-LO beobachtet werden. Zusätzlich wurden verschiedene Cystein-/Serin-5-LO-Punktmutanten sowie eine 4fach Mutante (C159S/C300S/C416S/C418S-5-LO = 2D-5-LO) untersucht. Das Verhalten dieser Mutanten konnte in drei Gruppen eingeteilt werden. Gruppe A (C159S-, C300S- und C418S-5-LO) wurde durch Diamid nicht beeinflusst. Gruppe B (C416S- und 2D-5-LO) zeigte eine sehr starke Stimulation der 5-LO±FLAP-Leukotrienbildung nach Zugabe von Diamid. Bei Gruppe C (C99S-, C264S- und C449S-5-LO) konnte eine FLAP-gesteigerte 5-HETE-Bildung beobachtet werden. Durch Diamid kommt es zu Glutathionylierungen von zellulären Proteinen, da reduziertes Glutathion (GSH) zu reaktiveren oxidierten Glutathion (GSSG) umgesetzt wird. An der 5-LO-Oberfläche können in Folge an verschiedenen Cysteinen Glutathione binden. Durch die Glutathion-Bindung wird eine stark polare Struktur auf der 5-LO-Oberfläche eingebracht. Dadurch kommt es zu einer verminderten Membranbindung und Produktbildung der nativen 5-LO. Die 5-LO-Oberfläche der 2D-5-LO-Mutante kann an verschiedenen Positionen keine Glutathione mehr binden, es kommt es zu einer stärkeren Wechselwirkung mit Membranbestandteilen und zu einer erhöhten 5-LO-Leukotrienbildung. Für Celecoxib konnte gezeigt werden, dass neben der COX2-Hemmung auch die 5-LO-Aktivität mit einem IC50-Wert von 3-10 µM gehemmt werden kann (268). Im Rahmen dieser Arbeit wurden HeLa-Zellen mit 5-LO±FLAP transfiziert, um den Einfluss von Celecoxib auf FLAP zu untersuchen. Celecoxib führt zu einer direkten Hemmung der 5-LO. ML3000 (Licofelon) wurde als dualer COX/5-LO-Inhibitor entwickelt und hemmt die 5-LO-Aktivität in intakten Zellen, aber nicht im Homogenat. Daher wurden Versuche mit 5-LO±FLAP-tranfizierten HeLa-Zellen durchgeführt, um den Einfluss von ML3000 auf die FLAP-gesteigerte 5-LO-Leukotrienbildung zu zeigen. Aus diesen und weiteren Ergebnissen unserer Arbeitsgruppe konnte gefolgert werden, dass ML3000 ein FLAP-Inhibitor ist (277). Garsubellin A ist strukturverwandt zu Hyperforin, einem dualen COX/5-LO-Inhibitor (204). Garsubellin A hemmt die 5-LO-Aktivität im Homogenat von PMNL und am gereinigten Enzym mit einer IC50 von 10-30 µM. Verbindungen, die den Bicyclo[3.3.1]nonan-Grundkörper des Garsubellin A und Hyperforin enthalten, wurden auf ihr inhibitorisches Potential getestet. Es konnte gezeigt werden, dass der Bicyclo[3.3.1]nonan-Grundkörper alleine nicht für eine 5-LO-Hemmung ausreicht, sondern eine freie Carbonsäure sowie eine bis zwei Prenylierungen vorliegen müssen, um eine 5-LO-Hemmung zu erzielen. Sind diese Voraussetzungen vorhanden, wird die 5-LO-Aktivität in intakten PMNL mit einer IC50 von 10 µM und an gereinigter 5-LO mit 0,3-1 µM gehemmt.
Innerhalb des adaptiven Immunsystems spielt der Major Histocompatibility Complex (MHC)-Klasse I-Weg der Antigenpräsentation eine essenzielle Rolle bei der Erkennung und Zerstörung Virus-infizierter Zellen. Ein grundlegender Schritt innerhalb dieses Prozesses ist die Translokation endogener Peptide durch den transporter associated with antigen processing (TAP) in das ER-Lumen. Der TAP-Transporter ist zusammen mit verschiedenen Chaperonen und weiteren Faktoren in einem Peptidbeladungskomplex (PLC) assoziiert. Insbesondere Herpesviren, die durch eine lebenslange Persistenz im Wirt und wiederkehrende Reaktivierung unter Stresssituationen gekennzeichnet sind, interferieren direkt mit dem PLC und dem TAP-Transporter. Das varicellovirale Typ-I-Membranprotein UL49.5 inhibiert den TAP-Komplex, wobei das Protein des Rinderherpesvirus (Bovines Herpesvirus 1, BHV-1) zusätzlich die proteasomale Degradation verschiedener Komponenten des PLCs einleitet. Dieser Mechanismus wird durch die C-terminale Domäne des UL49.5-Proteins vermittelt und ist von keinem anderen Virusprotein bekannt. Welche Aminosäuren des Virusproteins jedoch für diese Inhibition und Degradation essenziell sind, wurde bisher nicht aufgeklärt. Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, die Funktionsweise des BHV-1 UL49.5-Proteins zu verstehen und insbesondere zu analysieren, welche Bereiche des Proteins für die proteasomale Degradation des TAP-Komplexes verantwortlich sind. Das UL49.5-Protein wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgreich in Insektenzellen und in HeLa-Zellen exprimiert. Mittels Coimmunpräzipitation (Co-IP) wurde daraufhin die Bindung verschiedener UL49.5-Varianten an den TAP-Komplex analysiert. Unterstützt wurden diese Daten durch einen in vivo Interaktionsscreen (BiFC) und in vitro translatiertes UL49.5. Hierbei stellte sich heraus, dass das UL49.5-Protein in Abwesenheit sämtlicher Komponenten des Immunsystems an beide Untereinheiten des TAP-Transporters bindet. Die Bindung erfolgt sowohl an vollständige TAP-Untereinheiten als auch an den sogenannten coreTAP-Komplex, der nur die inneren sechs Transmembranhelices besitzt. Weiterhin wurden systematisch verkürzte UL49.5-Varianten generiert, um wichtige Reste für TAP-Inhibition und proteasomale Degradation zu identifizieren. Interessanterweise sind weder die N-terminale noch die C-terminale Domäne von UL49.5 für die Bindung an den TAP-Komplex zwingend notwendig. Die Bindung an den TAP-Transporter wird demnach über die Transmembrandomäne von UL49.5 vermittelt. Mit Hilfe von Peptidtransport-Analysen wurde die inhibitorische Aktivität verschiedener UL49.5-Mutanten eingehend untersucht. Zusätzlich wurde eine Untersuchung der MHC I-Oberflächenexpression in transient transfizierten HeLa-Zellen etabliert. In diesen Zellen wurde nach Sortierung eine drastisch reduzierte TAP-Konzentration nachgewiesen, die auf proteasomale Degradation des TAP-Komplexes zurückzuführen war. Die Untersuchung von C-terminal verkürzten UL49.5-Mutanten zeigte, dass die letzten zwei C-terminalen Aminosäuren essenziell für die Induktion der TAP-Degradation sind. Die C-terminale Domäne von UL49.5 konnte jedoch, nach Übertragung auf andere Proteine, keine proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einleiten. Demnach ist ein weiterer Bereich des Proteins für diesen Prozess zwingend notwendig. Erstaunlicherweise waren auch N-terminal verkürzte UL49.5-Proteine deutlich in ihrer inhibitorischen Funktion beeinträchtigt. Bereits nach der Deletion von 10 N-terminalen Aminosäuren war das Protein nicht mehr in der Lage, eine proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einzuleiten. Demnach spielt auch die ER-luminale Domäne von UL49.5 eine wichtige Rolle bei der UL49.5-induzierten TAP-Degradation. Somit wurde ein bisher noch nicht beschriebener neuartiger Inhibitionsmechanismus für das BHV-1 UL49.5-Protein entdeckt. Nach Bindung von UL49.5 über die Transmembrandomäne an beide Untereinheiten des TAP-Transporters scheint die ER-luminale Domäne von UL49.5 ein Signal über die ER-Membran an die zytoplasmatische Domäne zu übertragen, die dann die proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einleitet. Es konnte im Rahmen dieser Doktorarbeit erstmals gezeigt werden, dass additive Effekte eines sehr kleinen Virusproteins auf zwei unterschiedlichen Seiten der ER-Membran zu einer proteasomalen Degradation eines sehr großen Membran-Komplexes führen.
Die mitochondriale Atmungskette und insbesondere die Cytochrom c Oxidase als deren terminales Enzym sind essentiell für den Energiestoffwechsel eukaryotischer Zellen. Die Assemblierung der mitochondrialen Cytochrom c Oxidase mit ihren bis zu 13 Untereinheiten ist noch nicht bis ins Detail aufgeklärt, aber es handelt sich um einen geordneten, stark regulierten Prozess, und Defekte der Assemblierung sind häufig Ursache für neurodegenerative und myopathische Erkrankungen. In Eukaryoten sind bisher mehr als 30 Proteine identifiziert worden, die an der Biogenese der Cytochrom c Oxidase beteiligt sind, darunter Surf1. Beim Menschen führt der Verlust von Surf1 zu einer letalen neurodegenerativen, als Leigh-Syndrom bezeichneten Krankheit, wobei die genaue Rolle von Surf1 bei der Assemblierung der Cytochrom c Oxidase unklar ist. Das Bodenbakteriums Paracoccus denitrificans kann als Modellorganismus für die mitochondriale Atmungskette dienen, da seine aeroben Atmungskettenkomplexe eine deutliche Homologie zu denen der Mitochondrien auf weisen. P. dentrificans besitzt zwei homologe Gene für Surf1, die in Operons mit terminalen Oxidasen assoziiert sind: surf1c ist im cta-Operon lokalisiert, das für Untereinheiten der aa3-Cytochrom c Oxidase kodiert, und surf1q im qox-Operon, das die Gene für die ba3-Ubichinoloxidase enthält. Vorrangiges Ziel dieser Arbeit war es, diese beiden Gene und ihre Translationsprodukte zu charakterisieren und auf ihre Funktion hin zu untersuchen. Chromosomale Einzel- und Doppeldeletionen beider surf1-Gene führten zu einem spezifischen Aktivitätsverlust der jeweiligen Oxidase in Membranen, wobei surf1c und surf1q unabhängig von einander für ihre korrespondierenden Oxidasen zuständig sind und keine überlappenden Funktionen besitzen. Dies war der erste experimentelle Hinweis, dass ein Surf1-Protein auch bei der Assemblierung einer Chinoloxidase eine Rolle spielt. Untersuchungen an aufgereinigter aa3-Cytochrom c Oxidase ergaben, dass der Hämgehalt im Fall der surf1c-Deletion stark vermindert ist. Diese Ergebnisse bestätigten frühere Vermutungen, dass Surf1 eine Rolle beim Häm-Einbau in UEI spielt. Diese Arbeit untersuchte zum ersten Mal aufgereinigtes Surf1-Protein und lieferte mit der Charakterisierung weitere Hinweise auf seine Rolle beim Häm a-Einbau in terminale Oxidasen. So konnte gezeigt werden, dass sowohl Surf1c und als auch Surf1q Häm a in vivo binden. Mit Hilfe spektroskopischer Methoden und der isothermen Titrationskalorimetrie konnte die Bindung von Häm a an apo-Surf1c und Apo-Surf1q quantifiziert werden. Beide Proteine binden Häm a mit submikromolaren Affinitäten in einer 1:1 Stöchiometrie. Ligandenbindungspektren wiesen weiterhin darauf hin, dass das Eisenatom des Häm a in Surf1 nur über fünf Liganden koordiniert ist. Über gerichtete Mutagenese konnte der konservierte Histidinrest His193 für Surf1c und His202 für Surf1q als möglicher fünfter Ligand des Eisenatoms identifiziert werden. Untersuchungen zur Wechselwirkung mit anderen Proteinen zeigten eine direkte Interaktion zwischen der Häm a Synthase und den beiden Surf1-Proteinen in vivo und in vitro, die zuvor noch für kein anderes Surf1-Homolog beschrieben war. Zusätzlich konnte ein Transfer von Häm von der Häm a Synthase auf Surf1c bzw. Surf1q in vitro erreicht werden. Für Surf1c ließ sich außerdem eine Interaktion mit Untereinheit I der Cytochrom c Oxidase nachweisen. Obwohl die Funktion von Surf1 im Rahmen der Biogenese der Cytochrom c Oxidase noch nicht abschließend geklärt werden konnte, liefern die Ergebnisse dieser Arbeit nichtsdestotrotz klare Hinweise auf eine direkte Beteiligung von Surf1 beim Einbau der Häm a-Kofaktoren, und ein neues Modell für die Funktion von Surf1 konnte erstellt werden.
Ein bekanntes Beispiel für regulatorische RNA-Protein-Wechselwirkung stellt der Komplex der TAR-RNA von HIV-1 und dem viralen Protein Tat dar. Dieser Komplex ist wichtig für die effiziente Transkription des viralen Genoms. Essentiell für die Erkennung der Stem-Loop Struktur ist die Wechselwirkung des Tat-Proteins mit dem aus drei Nukleotiden bestehenden Bulge der TAR-RNA. Das Wissen über die Prinzipien der Erkennung von Tat zu TAR-RNA sollte es möglich machen, spezifische Liganden zu designen, die als antivirale Tat Antagonisten angreifen können. Das Ziel dieser Arbeit war die Synthese von RNA Liganden für die Festphasenpeptidsynthese (FPPS) basierend auf heteroaromatischen Bausteinen. Als Strategie wurde gewählt, die heteroaromatischen Reste über Amid-Bindungen an ein Fmoc geschütztes (2-Aminoethyl)glycin-Rückgrat einzufügen. Die peptidomimetischen Bausteine X konnten in der FPPS zur Synthese von Tripeptiden mit der allgemeinen Struktur Arg-X-Arg und Modifikationen mit Lysin eingesetzt werden. Die Bindungsaffinitäten der Tripeptide und kleinen Moleküle zur TAR-RNA von HIV-1 wurden über einen fluoreszenzbasierten Assay bestimmt. Der Assay verwendet ein doppelt endmarkiertes Tat-Peptid mit Fluorescein und Rhodamin als Farbstoff. Durch Verdrängung des Tat-Peptides durch einen konkurrierenden Liganden kommt es zur Konformationsänderung des Peptides, die zur Löschung der Lichtemmission führt. Dabei zeigen die Tripeptide H2N-(D)Arg-Lactam-(D)Arg-CONH2 (154) und H2N-(D)Arg-Amidin-(D)Arg-CONH2 (158) IC50-Werte von 2-3 mikroM, die auch durch Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS) bestätigt wurden. In massenspektrometrischen Untersuchungen von 158 bzw. Tat-Protein mit TAR-RNA konnten bei beiden Peptiden 1:1 und 1:2-Komplexe beobachtet werden. 158 zeigt antivirale Eigenschaften (IC50 = 10-50 mikroM) in HeLa P4-Zellassays. Durch NMR-Untersuchungen und molekulardynamische Berechnungen war es möglich, eine Konformationsänderung der TAR-RNA durch eine Wechselwirkung mit Guanidinium-Gruppen festzustellen. Ein weiteres Ziel der Arbeit war daher ausgehend von den gewonnenen Daten die Untersuchung des Bindungskonzeptes von Diaminopyrazolen und Indazolen. Diaminopyrazole mit kleinen Resten und Triaminopyrazol übertreffen im protonierten Zustand den dikationischen Liganden Argininamid. In Übereinstimmung mit dem Bindungsmodell verhalten sich protonierte Aminopyrazole wie „Super-Guanidine“ hinsichtlich der TAR-RNA. Das Einfügen des Triaminopyrazols in ein Phenazin-Grundgerüst führt zu Verbindungen, die im protonierten und reduzierten Zustand zusätzliche Wasserstoffbrückenbindungen eingehen können und nicht planar, aber lipophil sind. Der Austausch von Stickstoff zu Sauerstoff im Phenazinring sollte den reduzierten Zustand stabilisieren. Die resultierende Struktur ist jedoch zersetzlich, so dass auf weitere Untersuchungen verzichtet wurde.
Die Aufklärung der dreidimensionalen Helix-Struktur der DNA, des Trägermoleküls der genetischen Information aller Lebewesen, durch Watson und Crick im Jahre 1953 ermöglichte eine ganz neue Sichtweise auf ihre Eigenschaften und viele zelluläre Prozesse. Von besonderem Interesse sind hier u.a. Mechanismen, bei denen die DNA an den Phosphaten nucleophil substituiert wird, wie dies beispielsweise bei der Rekombination oder der Transkription geschieht. Dies ist daher interessant, weil sich die DNA gegenüber nucleophilen Angriffen in verschiedenen Experimenten als überaus stabil und reaktionsträge gezeigt hat. Spezialisierte Enzyme wie die Staphylokokkennuklease oder Restriktionsendonukleasen nutzen u.a. Metall-Ionen, um Phosphoryltransfer-Reaktionen zu katalysieren und in eine akzeptable Zeitskala zu verschieben. Die Topoisomerase vom Typ I zeigt eindrucksvoll, dass Katalyse solcher Reaktionen auch ohne Metall-Ion möglich ist, womit auch gleichzeitig die Quelle für eine potentielle oxidative Schädigung der DNA entfernt ist. Leider ist die Palette der natürlich vorkommenden Enzyme begrenzt. Die Erforschung und Entwicklung von künstlichen Nukleasen ermöglicht daher potentiell den zukünftigen Einsatz neuer, maßgeschneiderter Werkzeuge für die Biochemie und die Biotechnologie, sowie langfristig die Bereitstellung neuartiger Chemotherapeutika. Vom aktiven Zentrum der Staphylokokkennuklease abgeleitete Moleküle auf Bisguanidinium-Naphthol-Basis bzw. deren Derivate zeigten in der Vergangenheit deutliche Aktivität als metallfreie, unspezifische Spalter von Plasmid-DNA. Die vorliegende Arbeit beschreibt die weitere Entwicklung und Charakterisierung neuer unspezifischer und potentiell sequenzselektiver Bisguanidinium-Naphthol-Derivate. Hierbei wurde eine neue, zuverlässige Synthesestrategie für Bisguanidinium-Naphthole und parallel dazu ein neuer und flexibler Weg der Flüssigphasen-Synthese von DNA-bindenden Polyamiden ausgearbeitet, um daraus DNA-bindende Konjugate herzustellen. Vier unspezifische Moleküle (45, 94, 95, 97) und zwei Konjugate (46 und 140) wurden dann bei physiologischen Bedingungen auf ihre Spaltaktivität gegenüber Plasmid-DNA und linearer Duplex-DNA untersucht. Bei allen oben genannten Verbindungen konnte - verglichen mit der Stamm-Verbindung 36 aus Vorgängerarbeiten - eine erhöhte Aktivität gegenüber Plasmid-DNA bestimmt werden, die im Falle der Konjugate zwischen 4000- und 8000-fach liegt. Zur weiteren Charakterisierung wurden Experimente in Anwesenheit von EDTA oder Mg2+, zur pH-Abhängigkeit und zur Kinetik der Spalt-Reaktion durchgeführt. Erste Testreihen zum Nachweis sequenzselektiver DNA-Spaltung lieferten kein abschließendes Ergebnis, gaben jedoch erste Hinweise auf Selektivität, welche zur Zeit näher untersucht und überprüft werden.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung von neuen enantioselektiven und diastereoselektiven Brønsted-Säure katalysierten Reaktionen. Das Aktivierungsprinzip entspricht dabei einer klassischen Säure-Base-Reaktion, in der eine Brønsted-Säure einen Elektronenpaar-Donor protoniert, woraus die Bildung eines Ionenpaares resultiert. Erweitert man dieses Konzept durch den Einsatz einer chiralen Protonenquelle und verwendet als Base ein prochirales Substrat, wie ein Imin, so entsteht durch dessen Protonierung ein chirales Ionenpaar, wodurch das Substrat einerseits aktiviert wird und anderseits asymmetrische Induktion über das chirale Anion erfährt. Greift in dem darauf folgenden Schritt ein Nucleophil selektiv über eine Seite des positiv geladenen Elektrophils an, so bildet sich enantioselektiv ein neues Stereozentrum. Die Natur nutzt dieses Prinzip zum Aufbau von optisch reinen α-Aminosäuren. So katalysiert die Glutamatdehydrogenase (GDH) die Darstellung von Glutaminsäure durch Protonierung des entsprechenden α-Iminoglutarats, wodurch der nachfolgende Hydrid-Angriff mittels Nicotinamidadenindinukleotid (NADH) selektiv die (L)-Aminosäure liefert. Dieses Konzept konnte während der eigenen Diplomarbeit auf die enantioselektive Brønsted-Säure katalysierte Transferhydrierung von Ketiminen übertragen werden. Dabei simuliert eine chirale Protonenquelle 1 das Enzym (GDH) und das Reduktionsmittel NADH wird durch ein synthetisches Analogon, das Hantzsch Dihydropyridin 8a ersetzt ... Die vorliegende Arbeit ist kumulativ verfasst. Der größte Teil der hier vorgestellten Ergebnisse ist bereits veröffentlicht oder zur Publikation eingereicht. Die experimentellen Daten sind Bestandteil der in Kapitel 10 aufgeführten Publikationen und werden nicht gesondert diskutiert. Folgende Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht: Highly Enantioselective Organocatalytic Carbonyl-Ene Reaction with strongly Acid, Chiral Brønsted Acids as Efficient Catalysts Rueping M., Theissmann T., Kuenkel A., Koenigs R.M., Angewandte Chemie International Edition 2008, 47, 6798, Angewandte Chemie 2008, 120, 6903. Asymmetric counterion pair catalysis: An enantioselective Brønsted acid-catalyzed protonation Rueping M., Theissmann T., Raja S., Bats J.W., Advanced Synthesis & Catalysis 2008, 350, 1001. An enantioselective chiral brønsted acid catalyzed imino-azaenamine reaction Rueping M., Sugiono E., Theissmann T., Kuenkel A., Köckritz A., Pews-Davtyan A., Nemati N., Beller M., Organic Letters 2007, 9, 1065. Remarkably low catalyst loading in Brønsted acid catalyzed transfer hydrogenations: Enantioselective reduction of benzoxazines, benzothiazines, and benzoxazinones Rueping M., Antonchick A.P., Theissmann T., Angewandte Chemie International Edition 2006, 45, 6751, Angewandte Chemie 2006, 118, 6903. A highly enantioselective brønsted acid catalyzed cascade reaction: Organocatalytic transfer hydrogenation of quinolines and their application in the synthesis of alkaloids Rueping M., Antonchick A.P., Theissmann T., Angewandte Chemie International Edition 2006, 45, 3683, Angewandte Chemie 2006, 118, 3765. Metal-free Brønsted acid catalyzed transfer hydrogenation - New organocatalytic reduction of quinolines Rueping M., Theissmann, T., Atonchick A.P., Synlett 2006, 1071. The twinned crystal structure of diiodobis(triphenylphosphine) palladium(II) dichloromethane disolvate at 173 K Theissmann T., Bolte M., Acta Crystallographica Section E, 2006, E62, 1056. Folgende Manuskripte wurden zur Veröffentlichung eingereicht: First Enantioselective Chiral Brønsted Acid Catalyzed Synthesis of 4´-Substituted Tetrahydroquinolines Rueping M., Theissmann T., Stoeckel M., Atonchick A.P. Asymmetric Organocatalytic Reductions in the Enantioselective Synthesis of Fluoroquinolones, Flumiquine and Levofloxacin Rueping M, Stoeckel M., Theissmann T., Haack K. Synthesis and Structural Investigations of H8-BINOL-derived N-triflylphosphoramides Rueping M., Nachtsheim B.J., Koenigs R., Ieawsuwan W., Theissmann T. Buchbeitrag: Metal-free Brønsted Acid Catalyzed Transfer-Hydrogenation: Enantioselective Synthesis of Tetrahydroquinolines Rueping M., Theissmann T., Atonchick A.P., Catalysts for Fine Chemical Industry, Vol. 5, 2006
Verglichen mit normal progredierenden HIV-1 Infizierten weisen Langzeit Nicht-Progredierende (LTNP), trotz chronischer Infektion und ohne antivirale Therapie, keinerlei Anzeichen einer klinischen Progression sowie stabil hohe CD4+-Zellzahlen und eine geringe Viruslast auf. Für diesen ungewöhnlichen Infektionsverlauf wurden mehrere virologische, genetische und immunologische Ursachen in der Literatur beschrieben. Anhand einer gut charakterisierten LTNP-Kohorte und einer Kontrollgruppe mit vergleichbaren klinischen Markern, wurde hier der Einfluss der einzelnen Faktoren, vor allem der humoralen Immun-antwort, auf den Infektionsverlauf analysiert. Die Analyse viraler und patienteneigener Gene zeigt, dass keiner der LTNP die ccr5Delta32 Mutation aufweist und auch der Vergleich der viralen Proteine Env, Nef, Rev, Tat und Vpr ergab keine zwingende Ursache für ein Ausbleiben der Progression. So zeigt sich zwar eine Anreicherung von Insertionen in den Variablen Schleifen (v.a. V1/V2) in den Env der LTNP-Viren, die Funktionalität der viralen Hüllproteine wurde jedoch mit Hilfe HIV-1 Env-rekombinanter Reporterviren aufgezeigt. Die HIV-1 Env-rekombinanten Reporterviren der LTNP unterschieden sich weder in ihrer Infektiosität, noch in der Effizienz der frühen Replikationsschritte von den korrespondierenden Viren der HIV-1 Kontrollpatienten, was einen entscheidenden Einfluss der Hüllproteine auf den Infektionsverlauf nahezu aus-schließt. Seitens der zellulären Immunantwort wurden in einigen LTNP HLA-B Typen identifiziert, die in der Literatur mit einem verlangsamten Infektionsverlauf und einer aus-geprägten zellulären Immunantwort in Verbindung gebracht wurden. Die Untersuchung der zellulären Immunantwort der LTNP (außerhalb dieser Arbeit) ergab jedoch keine Besonder-heiten, was den Einfluss der identifizierten HLA-B Typen auf den nicht-progredierenden Infektionsverlauf relativiert. Die humorale Immunantwort der Patienten wurde in umfassen-den Neutralisationsstudien mit Hilfe der HIV-1 Env-rekombinanten Reporterviren analysiert. Hierbei zeigte sich, dass die LTNP, verglichen mit den HIV-1 Kontrollpatienten, eine signifikant bessere humorale Immunantwort besitzen. Zusammen mit den zuvor gewonnenen Erkenntnissen legt dies einen entscheidenden Einfluss neutralisierender Antikörper am Nicht-Progredieren der LTNP nahe. Durch den Einsatz HIV-1 Env-spezifischer Peptidphagen wurde die humorale Immunantwort der zwei Patientengruppen weiter untersucht, wobei einige Unterschiede zwischen der Antikörperantwort der LTNP und HIV-1 Kontrollpatienten aufgezeigt wurden. Mit Hilfe dieser Peptidphagen wurde in Versuchstieren eine HIV-1 Env-reaktive Immunant-wort induziert. Die Fusion von Myelomzellen mit den B-Zellen der immunisierten Tiere und die anschließende Selektion führten zur Isolierung HIV-1 Env-spezifischer Hybridomazellen. Um sich den Vorteil der langjährigen Antikörperreifung in den Patienten selbst zu Nutze zu machen und gezielt breit-neutralisierende Antikörper zu isolieren, wurden, ausgehend von B-Zell mRNA der LTNP, patienteneigene scFv Phagen Display Bibliotheken erstellt. Die in vitro Selektion dieser scFv Phagen Display Bibliotheken mit unterschiedlichen HIV-1 Env Varianten führte zur Isolierung einiger HIV-1 Env spezifischer scFv-Phagen. Die Untersuchung der Bindungseigenschaften des reaktivsten scFv-Phagens zeigte eine breite Reaktivität gegen unterschiedliche HIV-1 Env Varianten, die durch HIV-1 positives Serum kompetiert werden konnte. Das Epitop dieses scFv-Phagens wurde in der Variablen Schleife 3 von HIV-1 Env lokalisiert. Diese Arbeit zeigt den entscheidenden Einfluss der humoralen Immunantwort für die nicht-progredierende Infektion der hier untersuchten LTNP und gibt erste Hinweise auf mögliche Ursachen für die außergewöhnlich breite Serumreaktivität. Die Identifikation charakteristischer Eigenschaften in der humoralen Immunantwort, sowie die Identifizierung der hierfür verantwortlichen Antikörper kann bei der Entwicklung aktiver oder passiver Vakzine von entscheidendem Vorteil sein oder als Ausgangspunkt für neue therapeutische Ansätze dienen.
Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Formulierungsentwicklung eines nanopartikulären Arzneistoffträgers für Zytostatika zur Gewinnung einer „Drug Targeting“ Zubereitung. Im Fokus der Arbeit stand dabei die Stabilität der unterschiedlichen Zubereitungen. Die untersuchten Partikel waren dabei auf Basis von humanem Serumalbumin. Mittels einer etablierten Desolvatationsmethode ließen sich reproduzierbar Nanopartikel im Größenbereich von 200 nm herstellen. Zur Partikelgrößenbestimmung bediente man sich sowohl der hotonenkorrelationsspektroskopie (PCS) als auch der Analytischen Ultrazentrifugation (AUZ). Bei der Untersuchung verschiedener HSA-Chargen, stellte sich heraus, dass das Ausgangsmaterial einen Einfluss auf die Partikelgröße besaß. Nichtsdestotrotz waren die Partikelgrößenschwankungen aufgrund von unterschiedlichen HSA-Chargen gering. Durch Einlagerung von Doxorubicin in die Partikelmatrix kam es zu einer wesentlichen Partikelvergrößerung, so dass die resultierten Partikel eine Größe von etwa 400 nm aufwiesen. Die Inkorporation des Arzneistoffs in die Partikelmatrix war reproduzierbar und stabil. Auch der Einsatz von Serumalbumin aus rekombinanter Quelle erwies sich als geeignet um Nanopartikel herstellen zu können. Allerdings waren unbeladene Partikel aus diesem Material wesentlich größer als Nanopartikel, die aus dem Standardmaterial hergestellt wurden. Doxorubicinbeladene Partikel zeigten wiederum eine vergleichbare Größe wie Partikel aus HSA. Allerdings war die Beladung der rHSA-Nanopartikel geringer als die der SA-Nanopartikel. Dies zeigte sich besonders bei der geringeren Quervernetzung von 40%. Als Fazit lässt sich sagen, dass prinzipiell eine Herstellung von sowohl Leerpartikeln als auch Doxorubicin-beladenen Partikeln möglich war. Die Biodegradierbarkeit von Nanopartikeln ist eine wichtige Voraussetzung für einen therapeutischen Einsatz kleinpartikulärer Strukturen, damit diese nicht im Körper kumulieren. Zudem könnte bei nicht abbaubaren Partikeln die Idee der intrazellulären Freigabe des eingebetteten Arzneistoffs aus der Partikelmatrix nicht verwirklicht werden. Vorversuche haben gezeigt, dass sich Nanopartikel auf Basis von HSA mit einer Reihe von Enzymen abbauen lassen. Versuche, Nanopartikel aus rHSA enzymatisch abzubauen, führten zu vergleichbaren Abbaukinetiken wie bei Partikeln aus HSA. Zu den eingesetzten nzymen zählten Proteinase K, Protease, Trypsin, Pankreatin, Pepsin und Cathepsin B, die mit Partikel aus rHSA mit den Quervernetzungen 40, 60, 80 und 100% inkubiert wurden. Alle Abbaukinetiken zeigten dabei, dass die Abbaugeschwindigkeit vom Grad der Quervernetzung abhängig war. 40% quervernetzte Nanopartikel wurden am schnellsten, 100% quervernetzte Partikel am langsamsten enzymatisch degradiert. Die Abbauversuche mit Cathepsin B bei zwei verschiedenen pH-Werten zeigten, dass die Wahl des richtigen pH-Werts entscheidend für einen effektiven Abbau ist, denn nur bei einem pH-Wert von 5,4 wurden die Nanopartikel von Cathepsin B abgebaut. Im Gegensatz dazu, wurden die Nanopartikel bei pH 6,4 kaum degradiert. Des Weiteren wurden Beladungsversuche von HSA-Nanopartikeln mit Cisplatin durchgeführt. Dabei wurden im ersten Schritt Adsorptionsversuche an gelöstes HSA durchgeführt, da viele Arzneistoffe eine hohe Plasmaeiweißbindung besitzen, wenn sie sich im Blutkreislauf des Menschen befinden. Diese Tatsache sollte bei der Herstellung von arzneistoffhaltigen Nanopartikel auf Basis von humanem Serumalbumin ausgenutzt werden. Vor dem eigentlichen Desolvatationsprozess wurden gelöstes HSA und Cisplatin bei unterschiedlichen pH-Werten und für unterschiedliche Zeitintervalle inkubiert, um eine Adsorption des Cisplatins an das Protein zu erreichen. Dadurch soll es bei der anschließenden Desolvatation zu einer effektiveren Inkorporation des Arzneistoffs kommen. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass bei sauren pH-Werten die Adsorption schwächer ausfällt als bei einem pH-Wert von 8,0. Zudem war die Adsorption umso ausgeprägter, je länger die Inkubation stattfand. Bei einem pH-Wert von 8,0 führten steigende Konzentrationen an eingesetztem Cisplatin bei konstanter Menge an HSA, zu höheren Konzentrationen an adsorbiertem Arzneistoff. Prozentual gesehen, führten aber zunehmende Mengen an eingesetztem Cisplatin zu geringeren Adsorptionsraten. Als Fazit muss aber festgehalten werden, dass Cisplatin eine geringe Tendenz zur Adsorption an gelöstes HSA zeigte. Die Herstellung von Cisplatin-beladenen HSA-Nanopartikeln zeigte, dass die Desolvatation bei pH 8,0 zu guten Ergebnissen führte. Zum einen wiesen die erhaltenen Nanopartikel gute physikochemische Eigenschaften mit nahezu quantitativen Partikelausbeuten auf, zum anderen besaßen die Partikel eine hohe Beladungseffizienz. Dabei galt, je höher die eingesetzte Menge an Cisplatin war, umso mehr Cisplatin wurde in die Matrix der Partikel eingelagert. Die Dauer der zuvor stattfindenden Adsorption spielte dabei eine eher untergeordnete Rolle im Vergleich zu den Adsorptionsversuchen. Eine Erklärung für diese Beobachtung könnte sein, dass die Zugabe des Desolvatationsmittels Ethanol, in welchem Cisplatin sehr schwer löslich ist, zu einer verstärkten Interaktion zwischen Arzneistoff und Protein führt und diese Komponenten zusammen ausfallen, nahezu unabhängig von der zuvor stattfindenden Adsorptionsphase. Um die Idee einer „Drug Targeting“ Zubereitung umsetzen zu können, wurden mit Hilfe von Polyethylenglykol-Ketten sowohl Leerpartikel als auch arzneistoffbeladene Nanopartikel auf ihrer Oberfläche mit monoklonalen Antikörpern modifiziert. Als Verum wurde dabei Trastuzumab verwendet, als Kontrolle diente ein IgG-Antikörper von Sigma, der kein Target besitzt. Sowohl eine adsorptive Bindung als auch die kovalente Kopplung der Antikörper an die Oberfläche der nanopartikulären Strukturen konnte reproduzierbar durchgeführt werden. Dabei spielte es keine Rolle, ob die Partikel mit Arzneistoff beladen waren oder nicht. Trastuzumab zeigte ein hohes Maß an adsorptiver Bindung an die Oberfläche von HSA-Nanopartikeln, die bei dem Kontollantikörper nicht festgestellt werden konnte. Von allen Partikelpräparationen wurden die Partikelgröße, die Größenverteilung, das Zetapotential und die Partikelausbeute bestimmt. Durch das Aufbringen neuer Oberflächenstrukturen, kam es zu keiner wesentlichen Veränderung der Partikelgröße bzw. der Oberflächenladung. Durch die zahlreichen Umsetzungsschritte, die für eine Oberflächenmodifikation nötig sind, kam es bei Nanopartikeln ohne Arzneistoffbeladung zu einem Verlust an Partikelausbeute. Da die Doxorubicin-beladenen Partikel viel größer waren als Leerpartikel, ließen sie sich einfacher und effektiver abzentrifugieren, was in einem geringeren Partikelausbeuteverlust sichbar wurde. Da die Gefriertrocknung zu den Standardmethoden zählt Zubereitungen eine gute Haltbarkeit zu verleihen, wurden eine Reihe von nanopartikulären Zubereitungen der Lyophilisation unterzogen und im Hinblick auf ihre Langzeitstabilität unter verschiedenen Lagerungsbedingungen getestet. Dabei stellte sich heraus, dass es mittels Gefriertrocknung möglich war aus HSA-Nanopartikelsuspensionen einfach und reproduzierbar Lyophilisate herzustellen. Als geeignete Hilfsstoffe kristallisierten sich dabei die Zucker Sucrose, Trehalose, der Zuckeralkohol Mannitol und Emulgatoren wie Tween® 80 und Pluronic® F68 heraus. Als ungeeignet zeichnete sich der Einsatz von L-Arginin und eines Natriumphosphat-Puffers pH 8,0 ab. Larginin führte schon vor dem Gefriertrocknen zu einer Partikelvergrößerung, die nach der Lyophilisation noch ausgeprägter war. Puffer auf Basis von Natriumsalzen führen zu einem starken pH-Shift während des Gefriertrocknungsprozesses. Dies führte beim Einsatz des Phosphat-Puffers pH 8,0 zu einem starken Partikelwachstum. Gefriertrocknungsprozesse mit unterschiedlichen Geräten haben gezeigt, dass der Zusatz von Sucrose bzw. Trehalose oder Mannitol ab einer Konzentration von 2% (m/V) zu guten physikochemischen Eigenschaften der rekonstituierten Proben führte. Hilfsstoffkombinationen, wie sie in der Literatur beschrieben sind, waren für die Stabilisierung der nanopartikulären Strukturen nicht nötig. Die Langzeitlagerungsstabilitätsdaten der gefriergetrockneten HSA-Nanopartikel über 13 Wochen bei unterschiedlichen Temperatur- und Luftfeuchtigkeitsbedingungen zeigten eine Überlegenheit der Hilfsstoffe Sucrose und Trehalose im Vergleich zu Mannitol. Als geeignete Hilfsstoffkonzentration stellte sich hier ein 3%iger (m/V) Zusatz heraus. Versuchsansätze mit unterschiedlichen Gefriertrocknern und somit unterschiedlichen Prozessen zeigten, dass nicht nur die Auswahl der Hilfsstoffe, sondern auch die Bedingungen des Gefriertrocknungsprozesses Einfluss auf die Lagerungsstabilität hatten. Ein kontrollierter Prozess zeigte sich dabei gegenüber dem schnellen Einfrieren mittels Stickstoff als überlegen. Von Nanopartikelsuspensionen mit den Hilfsstoffen Trehalsoe, Sucrose und Mannitol wurden die Glasübergangstemperaturen bestimmt. Die Ergebnisse deckten sich im Wesentlichen mit den in der Literatur beschriebenen Daten, so dass schlussgefolgert werden kann, dass die HSA-Nanopartikel keinen wesentlichen Einfluß auf die Glasübergangstemperatrur hatten. Zusätzlich wurde die Restfeuchte der Lyophilisate direkt nach der Gefriertrocknung und nach 13 wöchiger Einlagerungszeit bestimmt. Die Proben wiesen direkt nach dem Prozess eine Restfeuchte von ungefähr 3% auf, durch Lagerung der Partikel bei erhöhter Luftfeuchtigkeit kam es zu einem Anstieg des Wassergehalts in den Proben. Mit den Hilfsstoffzusätzen Trehalose, Sucrose und Mannitol ließen sich auch Doxorubicin-beladene HSA-Nanopartikel gefriertrocknen. Dabei kam es nach der Rekonstitution dieser Partikel zu keinem Austreten des eingelagerten Arzneistoffs. Zusätzlich wurden oberflächenmodifizierte Partikel lyophilisiert. Dabei bestand die Modifikation zum einen aus Methoxypolyethylenglykol-Ketten. Zum anderen wurden über NHS-PEG-Mal Crosslinker kovalent monoklonale Antikörper auf die Oberfläche von HSANanopartikeln gebunden. Zusätzlich wurden auch HSA-NP in Suspension einer Untersuchung bezüglich Langzeitlagerungsstabilität unterworfen. Dabei wiesen auch HSA-Nanopartikel in Suspension bei verschiedenen Einlagerungsbedingungen eine hohe Stabilität auf. Partikel, die über einen Zeitraum von 210 Tagen eingelagert wurden, zeigten bei den Temperaturen 4°C, 20°C und 30°C im Hinblick auf Partikelgröße und Polydispersität kaum Veränderungen. Die Lagerung der Nanopartikel bei Minusgraden führte allerdings zu Mikropartikeln. Bei der Untersuchung der Partikelüberstände hinsichtlich herausgelöstem HSA zeigte sich, dass je höher die Lagerungstemperatur und je länger die Einlagerung war, umso mehr HSA löste sich aus der mittels Glutaraldehyd fixierten Matrix heraus. Bei den eingefrorenen Partikeln löste sich über die gesamte Lagerungszeit kein Protein aus den Nanopartikeln heraus. Zellkulturexperimente zeigten, dass im Gegensatz zu Kontrollzubereitungen, Nanopartikel, die an ihrer Oberfläche therapeutisch wirksame Antikörper trugen, spezifisch von Krebszellen aufgenommen wurden und im Zellinneren den eingebetteten Arzneistoff freisetzten. Daraus resultierte eine spezifische Toxizität dieser Zubereitungen gegenüber Tumorzellen. Dies ist ein erster Ansatz, um zeigen zu können, dass durch nanopartikuläre Trägersysteme die unerwünschten Nebenwirkungen der unspezifisch wirkenden Zytostatika reduziert werden können. In weiteren Versuchen, vor allem mit Hilfe von in vivo Versuchen muss gezeigt werden, dass das Partikelsystem stabil genug ist, ausreichend lang im Körper zirkulieren zu können. Nur so ist das Trägersystem in der Lage, sein Zielgewebe zu erreichen. Zudem müssen Tierversuche die in der Literatur beschriebene Anreicherung des Partikelsystems im Tumorgewebe verifizieren. Dies ist nur möglich, wenn die Nanopartikel in der Lage sind, das Gefäßsystem im Bereich des Tumorgewebes zu verlassen und anschließend in die Tumormasse einwandern können. Nur dann können die in den Zellkulturversuchen gezeigten Effekte greifen.
Die 5-Lipoxygenase (5-LO) ist das Schlüsselenzym bei der zellulären Leukotriensynthese. Sie katalysiert zunächst die Umwandlung von AA zu 5-Hydroperoxyeicosatetraensäure (5-HPETE) und als zweiten Schritt die Dehydratisierung der 5-HPETE zum instabilen Epoxid Leukotrien A4 (LTA4). Leukotriene sind wichtige Mediatoren bei Entzündungsprozessen und allergischen Reaktionen. Die 5-LO besteht aus zwei Domänen, einer N-terminalen regulatorischen Domäne (AS 1-121) und einer C-terminalen katalytischen Domäne (AS 120-673). Die katalytische Domäne besteht hauptsächlich aus a-Helices, die regulatorische hingegen hat fast ausschließlich b-Faltblätter als Sekundärstrukturelemente. Mit ihrem aus acht Faltblättern bestehenden antiparallelen b-Sandwich hat sie Ähnlichkeit mit einer C2- Domäne. Sie besitzt eine Ca2+-Bindungsstelle und ist maßgeblich bei der Bindung des Enzyms an Membranen beteiligt. Für einige Inhibitoren und zelluläre Faktoren existieren Hinweise, dass sie an die C2-ähnliche Domäne der 5-LO binden, die direkten Beweise fehlen jedoch. Die katalytische Domäne enthält das aktive Zentrum mit einem prosthetischen Eisen und drei Phosphorylierungsstellen. In der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal erfolgreich eine Methode zur Überexpression und Aufreinigung der regulatorischen Domäne in E. coli entwickelt, die eine große Ausbeute des Zielproteins erbringt. In einer einfachen one-step Aufreinigung können bis zu 80 mg Fusionsprotein aus MBP und der regulatorischen Domäne der 5-LO (MBP-5LO1-128) pro Liter Expressionskultur gewonnen werden. Ein Verdau mit TEV-Protease führt zur effizienten Abspaltung des MBP. Die weitere Aufreinigung mit hydrophober Interaktionschromatogragphie ergibt eine Ausbeute von 3,4 mg reiner regulatorischer Domäne. Dabei weisen sowohl das Fusionsprotein, als auch die abgespaltene regulatorische Domäne eine Reinheit von über 95% auf. Leider ist die momentan erreichbare Konzentration der reinen regulatorischen Domäne noch nicht ausreichend, um damit NMR-Messungen zur Strukturaufklärung durchführen zu können. Es konnte bestätigt werden, dass die katalytische Domäne der 5-LO alleine nicht zu einer Umsetzung von Arachidonsäure in der Lage ist. Der Verlust der enzymatischen Aktivität ist vermutlich nicht auf eine Fehlfaltung der Proteindomäne zurückzuführen. Die korrekte Faltung der katalytischen Domäne konnte durch eine - wenn auch schwache - Bindung der Domäne an ATP gezeigt werden konnte. Die Zugabe von regulatorischer Domäne zu rekombinanter, aufgereinigter WT 5-LO hat unter gewissen Bedingungen (Abwesenheit von PC) einen stimulierenden Effekt auf die Aktivität des Gesamtenzyms. Dieser Effekt könnte durch eine „Dimerisierung“ der regulatorischen Domäne mit WT 5-LO hervorgerufen werden. In Gegenwart von PC ruft die regulatorische Domäne eine Hemmung der 5-LO-Aktivität hervor. Außerdem ist MBP-5LO1-128 (im Gegensatz zu MBP alleine) in der Lage, das Zwischenprodukt der 5-LO, 5-HPETE, in einer 1:1 Reaktion zu reduzieren. Diese Fähigkeit könnte zur Unterdrückung einer Selbstaktivierung der 5-LO physiologisch bedeutend sein. Interessant ist, dass die Reduktion in Anwesenheit von Ca2+, PC oder PC und Ca2+ deutlich verringert war. Ca2+ führte vor allem in Abwesenheit von PC zu einer deutlichen Verminderung der 5-HPETE-Reduktion. In Gegenwart von PC zeigt Ca2+ nur einen minimalen Einfluss auf die 5-HPETE-Reduktion. Es existieren deutliche Hinweise für eine Konformationsänderung von C2-Domänen durch Ca2+-Bindung [105; 106]. Geht man davon aus, dass dies auch für die C2-ähnliche Domäne der 5-LO zutrifft, erklärt sich damit die Verminderung der 5-HPETE-Menge in Gegenwart von Ca2+. Es ist gut vorstellbar, dass eine Ca2+-induzierte Konformationsänderung zu einer schlechteren Zugänglichkeit der für die Reduktion wichtigen Aminosäureseitenketten führt. Die Anwesenheit von PC führte zu einer noch stärkeren Hemmung der 5-HPETEReduktion, als die Zugabe von Ca2+. Die Beobachtung, dass 5-HPETE in Anwesenheit von PC teilweise vor einer Reduktion geschützt wird, ist in Übereinstimmung mit Ergebnissen von Rakonjac [62]. Vermutlich werden die, für die Reduktion wichtigen Aminosäureseitenketten bei Bindung der Domäne an die PC-Micellen teilweise verdeckt. Cystein 99 könnte eine Rolle bei dieser Reaktion spielen. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass es bei der Reduktion von 5-HPETE nicht zu einer maßgeblichen Ausbildung von Disulfidbrücken kommt. Vorstellbar wäre die Ausbildung einer Hydroxysulfonylgruppe am Cystein. Eine Beteiligung von Cystein 99 wird durch die Ergebnisse des Dockings von 5-HPETE an das Homologiemodell der 5-LO und experimentelle Daten aus anderen Arbeiten (M. Hörnig, O. Rådmark) unterstützt. Um den genauen Mechanismus aufzuklären und die physiologische Relevanz zu zeigen sind weitere umfassende Untersuchungen nötig. Um eine Bindung von Hyperforin, LP 121, C06 und B02 an die regulatorische Domäne zu untersuchen wurde ein Kompetitionsassay entwickelt. Dabei wurde rekombinante, aufgereinigte 5-LO mit dem entsprechenden Inhibitor versetzt und dann versucht, die Hemmung mit Hilfe der regulatorischen Domäne aufzuheben. Greift der Inhibitor an der regulatorischen Domäne an, so sollte die Zugabe von MBP-5LO1-128 bewirken, dass ein Teil des Inhibitors an die regulatorische Domäne bindet, er sich somit nicht mehr an der 5-LO befindet und seine Wirkung vermindert wird. Um sicher zu gehen, dass die beobachteten Effekte nicht artifiziell sind, wurde ein Inhibitor, der an der katalytischen Domäne der 5-LO angreift als Negativkontrolle für den Assay benutzt. Für diesen Zweck wurde der Eisenligandinhibitor Zileuton ausgewählt. Es ist bekannt, dass Zileuton das Eisen im aktiven Zentrum der 5-LO chelatiert und nicht an die regulatorische Domäne bindet. Die Hemmung von Zileuton konnte erwartungsgemäß durch Zugabe der regulatorischen Domäne nicht aufgehoben werden. Hyperforin und B02 zeigten eine deutlich verminderte 5-LOHemmung bei steigender Menge an MBP-5LO1-128. Die Hemmung durch LP 121 und C06 wurde nicht von der regulatorischen Domäne beeinflusst. Es konnte also ein effektives und einfaches Screeningverfahren zur Untersuchung der Bindung von 5-LO-Inhibitoren an die regulatorische Domäne entwickelt werden, mit der Einschränkung, dass der Assay nur für den Nachweis einer reversiblen Bindung von Inhibitoren an die regulatorische Domäne tauglich ist. Dieser Assay wird sich in Zukunft als wichtiges Tool bei der Suche nach neuen 5-LO-Inhibitoren erweisen, da die Substanzen mit einem direkten Angriff des aktiven Zentrums bisher nicht zu effektiven und nebenwirkungsarmen Arzneimitteln geführt haben.
Die trimeren P2X–Rezeptoren sind nicht–selektive Kationenkanäle, die durch Adenosintriphosphat (ATP) aktiviert werden. Es gibt sieben Untereinheiten (P2X1–7). P2X–Rezeptoren sind in nahezu jedem Gewebe exprimiert und dort an den verschiedensten physiologischen Vorgängen beteiligt. Neben den „Cys–Loop“–Rezeptoren und den ionotropen Glutamat–Rezeptoren stellen die P2X–Rezeptoren eine eigenständige Familie von Neurotransmitter–gesteuerten Rezeptoren dar. Eine Untereinheit der trimeren P2X–Rezeptoren besteht aus den intrazellulären N– und C–Termini und zwei Transmembrandomänen, die über eine große extrazelluläre Domäne verbunden sind. Da weder ein P2X–homologes lösliches Protein für Kristallisationsstudien noch ein Gewebe zur Aufreinigung großer Mengen von P2X–Rezeptorprotein zur Verfügung steht, stützen sich Struktur–Funktions–Studien auf einzelpunktmutierte Rezeptoren in heterologen Expressionsystemen. Einige Aminosäuren, die bei Austausch gegen Alanin eine deutliche Verschiebung der Dosis–Wirkungs–Kurve von ATP bewirken und von denen daher vermutet wird, dass sie an der Agonisten–Bindung beteiligt sind, wurden bereits identifiziert. Ob sich die Agonisten–Bindungstasche der P2X–Rezeptoren zwischen zwei Untereinheiten, wie bei den nikotinischen Acetylcholin–Rezeptoren, oder innerhalb einer Untereinheit, vergleichbar mit den ionotropen Glutamat–Rezeptoren, befindet, ist weitgehend ungeklärt. Um die Lokalisation der ATP–Bindungstasche zu bestimmen, wurden, basierend auf vorhandener Literatur, potenziell an der ATP–Bindung beteiligte Aminosäuren des P2X1–Rezeptors durch zielgerichtete Mutagenese gegen Cysteine ausgetauscht und die P2X–Rezeptormutanen in Xenopus laevis–Oozyten exprimiert. Das Ziel dabei war, quervernetzte Cystein–Mutanten durch Disulfidbrückenbildung zwischen den substituierten Cysteinen zu identifizieren und so die Distanz von Aminosäure–Seitenketten, die an der Agonisten–Bindung beteiligt sind, zu bestimmen. Für die biochemischen Untersuchungen wurden entweder alle neu gebildeten Proteine der Oozyten metabolisch durch Inkubation mit radioaktivem [35S]–Methionin oder selektiv die Plasmamembran– ständigen Proteine mit Sulfo–NHS–Fluoreszenz–Farbstoffen markiert. Die Rezeptormutanten wurden affinitätschromatographisch über ein N–terminales Hexahystidyl–Motiv unter nicht–denaturierenden Bedingungen aufgereinigt und mit nicht–reduzierender SDS–Polyacrylamid–Gelelektrophorese (PAGE) auf Expression sowie mit Blauer–Nativer–PAGE auf korrekte Trimerisierung überprüft. Darüber hinaus wurden homologe Cystein–Substitutionen einer P2X2–1–Chimäre, welche dieselben Bindungseigenschaften des P2X1–Rezeptors besitzt, mittels der Zwei–Elektroden–Spannungsklemme charakterisiert (TEVC). Die Koexpression der verschiedenen P2X–Mutanten ergab eine spontane Quervernetzung über Disulfidbrücken zwischen den P2X1 K68C– und F291C–Mutanten, die in nicht–reduzierenden SDS–PAGE–Gelen über eine Dimerbildung nachgewiesen werden konnte. Dies deutet auf eine geringe Distanz zwischen diesen Cystein–substituierten Aminosäuren hin. Die Ausbildung der Disulfidbrücke konnte nach Reduktion der Quervernetzung während der Aufreinigung und durch Zugabe von ATP verhindert werden. In funktionellen Studien der P2X2–1 K68C/F291C–Doppelmutante war es entsprechend möglich die Disulfidbrücke reversibel zu reduzierenden. In den Mutantenkanäle exprimierenden Xenopus–Oozyten wurde der geringe Rezeptorstrom durch Reduktion mit DTT ca. 60fach potenziert und dadurch überhaupt messbar gemacht. Die Reoxidation durch H2O2 wurde wie in den biochemischen Experimenten in Anwesenheit von ATP ebenfalls verhindert. Da die Aminosäuren K68 und F291 des P2X1–Rezeptors möglicherweise an der Agonisten–Bindung beteiligt sind, sind diese Ergebnisse die ersten direkten experimentellen Hinweise auf die Aposition von Domänen benachbarter Untereinheiten, die an der Agonisten–Bindung beteiligt sind. Demnach befindet sich die ATP–Bindungstasche an der Grenzfläche zwischen zwei Untereinheiten der P2X–Rezeptoren. Die Koexpression homologer Cystein–substituierter P2X2–, P2X3– und P2X4–Rezeptoren zeigte analog zu den P2X1–Experimenten eine spontane Dimerisierung der P2X2 K69C– und F289C–Mutanten. Eine mäßige Quervernetzung von zwei Untereinheiten der P2X3 K63C– und F280C– sowie der P2X4 K67C– und F294C–Mutanten konnte nach Anwendung einer ca. 0,5 nm langen Cystein–spezifischen quervernetzenden Substanz erreicht werden. Die paarweise Kombination der P2X1–, P2X2–, P2X3–und P2X4–Cystein–Mutanten zeigte selbst nach Anwendung quervernetzender Substanzen nur in der Kombination von P2X1–K68C und P2X2–F289C eine Quervernetzung von zwei unterschiedlichen Untereinheiten eines heteromeren P2X1/2–Rezeptors. Diese Kombination konnte in elektrophysiologischen Messungen durch Reduktion der Disulfidbrücke spezifisch messbar gemacht und somit die Heteromerisierung dieser Untereinheiten eindeutig aufgezeigt werden. Zusammenfassend deutet die geringe Distanz der an der Quervernetzung beteiligten Cystein–Mutationen der P2X1–, P2X2– und homomeren P2X1/2–Rezeptoren auf ein konserviertes strukturelles Motiv dieser P2X–Subtypen hin, welches in P2X3– und P2X4–Rezeptoren nicht konserviert zu sein scheint. Diese Ergebnisse liefern wichtige Hinweise auf die generelle Struktur der P2X–Rezeptoren und werden maßgeblich zur Interpretation einer zukünftigen Kristallstruktur beitragen.
In der Vergangenheit wurden verschiedene Fusionstranskripte, welche normalerweise bei Leukämie-assoziierten chromosomalen Translokationen auftreten, in hämatopoetischen Zellen gesunder Personen gefunden. Da diese Personen keine entsprechenden chromosomalen Abberationen aufwiesen, ist es sehr wahrscheinlich, dass diese Fusionstranskripte durch trans-Spleißen entstehen. Während dieser Arbeit konnten durch inverse PCR, welche an unbehandelter cDNA gesunder Probanden durchgeführt wurde, intragenische trans-Spleiß-Produkte nachgewiesen werden. Interessanterweise weisen das MLL-Gen und seine fünf häufigsten Translokationspartner AF4, AF9, AF10, ELL und ENL ein großes Spektrum an trans-gespleißten RNAs auf. Nur in einem weiteren Mitglied der MLL-Familie (MLL3) konnte intragenisches trans-Spleißen nachgewiesen werden. Für verschiedene als Kontrolle verwendete Haushaltsgene konnte kein intragenisches trans-Spleißen nachgewiesen werden. Intergenische trans-Spleiß-Ereignisse konnten durch direkte PCR und RACEExperimente für die Gene MLL, ELL und ENL nachgewiesen werden. Bemerkenswerterweise entsprechen ein intragenisches trans-Spleiß-Produkt des MLL-Gens dem Transkript der chromosomalen Abberationen MLL-PTD und ein intergenisches trans-Spleiß-Produkt des MLL-Gens dem Transkript der chromosomalen Abberationen MLL•AF4. In Hefe konnte gezeigt werden, dass RNA als Vorlage für DNA-Reparaturen dienen kann. Somit lag der Schluß nahe, dass die oben genannten trans-gespleißten RNAs möglicherweise einen Einfluss auf die DNA-Reparatur haben. Dass RNA nicht nur in Hefen sondern auch in Menschen als Vorlage für DNA-Reparaturen dienen kann, konnte im Zuge dieser Arbeit durch mehrere in vitro Experimente mit Kernextrakten aus humanen Zelllinien bestätigt werden. Allerdings konnte keinerlei Einfluss von (trans-)gespleißter RNA auf die DNA-Reparatur in zahlreichen in vitro Experimenten nachgewiesen werden. Mit einem daraufhin etablierten in vivo System konnte ebenfalls ein Einfluss von (trans-) gespleißter RNA auf die DNA-Reparatur ausgeschlossen werden. Weiterhin konnten mit Hilfe der durchgeführten RACE-Experimente vorzeitige Polyadenylierungen von Transkripten in den Bruchpunktsregionen von MLL, AF4, AF9 und ENL identifiziert werden. Durch diese ungewöhnliche Termination der Transkription werden stark verkürzte Transkripte erzeugt, welche in kurze Proteinisoformen translatiert werden können. Ein Vergleich von 274 unterschiedlichen Bruchpunktsequenzen mit größeren direkten und indirekten Sequenzwiederholungen zwischen der Bruchpunktsregion von MLL und den Bruchpunktsregionen seiner häufigsten Translokationspartner wurde ebenfalls durchgeführt. Eine signifikante Korrelation zwischen den Sequenzwiederholungen und der Lokalisation der Bruchpunkte war jedoch nicht erkennbar. Bei diesem Vergleich fielen allerdings Häufungen von Bruchpunkten im MLL-Gen mit AF4, AF9 und ENL als Translokationspartner auf, wobei sich die Ursache für diese Häufungen auf Topoisomerase II Spaltstellen zurückführen ließ.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden modifizierte Nukleoside synthetisiert, um ihren Einfluss auf die Stabilität von RNA-Duplexen zu untersuchen. Bei den fluorierten Benzimidazol-Nukleosidanaloga handelt es sich um universelle Basen, die bei der Basenpaarung nicht zwischen den vier natürlichen Nukleosiden unterscheiden können. Die dabei auftretende Destabilisierung der RNA-Duplexe sollte durch die Änderung physikalisch-chemischer Eigenschaften vermindert werden. Durch die Synthese der fluorierten Indol-Nukleosidanaloga mit denselben Fluoratompositionen sollte nachgewiesen werden, welche Rolle ein ausfallendes Stickstoffatom im Fünfring-System spielt. Weitere Untersuchungen wurden so entwickelt, dass die zwei spC-F in 4,6DFBI wie auch in 4,6DFI mit Stickstoffatomen getauscht wurden. So wurde noch eine neue Serie Nukleosidanaloga synthetisiert (Abbildung 9.2). Schließlich wurde noch 1-Desoxy-D-ribofuranose AS als absischer Baustein synthetisiert. Die Synthese der Indol- und 9-Deazapurin-Nukleosidanaloga wurde über eine Glycsilierungsreaktion mit geeignet geschützter Deoxyribose durchgeführt. Dies wurde über vier Stufen, ohne Aufreinigung, aus Deoxyribose synthetisiert. Die entsprechenden Deoxy-nukleoside wurden danach in fünf Schritten zu Ribo-nukleosiden transformiert. Nach der Entschützung von Toluoyl-Gruppen wurden die 5´- und 3´-OH Gruppen sukzessiv geschützt. Nach simultaner 5´-OH Entschützung und 3´-OMs Eliminierung, wurden die gewünschten Ribonukleoside durch katalytische Dihydroxilierung erhalten. Die Darstellung der Verbindung 7NP erfolgte über die Silyl-Hilbert-Johnson-Reaktion. Der abasische Baustein AS wurde ausgehend von 2,3,5-Tri-O-benzyl-ribofuranose durch Dehydroxylierung und anschließende Entschützung erreicht. Von allen Nukleosiden gelang es Kristalle aus Wasser oder Methanol zu erhalten und röntgenkristallographisch zu untersuchen. Die Kristallpackungen zeigten eine sehr interessante Anordnung der Moleküle. Alle Fluorindol-Nukleoside mit Ausnahme von 7-N-Purin-Nukleosid 7NP zeigten nicht die für aromatische Systeme normale Fischgräten-Struktur, sondern eine Anordnung, in der die Moleküle gegenüberliegen. Die Kristallpackung besteht abwechselnd aus hydrophilen und lipophilen Schichten. Die hydrophilen Schichten bestehen aus den Zuckeruntereinheiten und die lipophilen aus den Fluoraromaten. Die Zucker sind durch Wasserstoffbrücken miteinander verbunden. Für die Orientierung der Moleküle zueinander sind aber die Fluoratome verantwortlich. In der Kristallpackung von 7-Fluorindol-Nukleosid 7FI kann ein Fluor-Wasserstoff-Abstand von nur 230 pm detektiert werden. Dies ist deutlich kürzer als die Summe der van-der-Waals Radien von Fluor und Wasserstoff von 2,55 Å. Der Abstand wird zwischen dem Fluor des einen Nukleosids und einem Wasserstoff eines gegenüberliegenden Nukleosids gemessen. Der Abstand von 2,30 Å ist einer der kürzesten jemals in Kristallen gemessenen F-H Abstände des Typs Csp²-F...H-Csp². Bedingt durch diesen kurzen Abstand kann von einer F...H Wasserstoffbrücke gesprochen werden. Auf der anderen Seite in der Kristallstruktur von 4-Fluorindol-Nukleosid 4FI konnte ein F-H Abstand von 2,69 Å nachgewiesen werden, welcher deutlich länger als die Summe der van-der-Waals Radien von Fluor und Wasserstoff ist. Die Nukleoside wurden auf ihre Lipophilie hin untersucht. Zu diesem Zweck wurden Octanol-Wasser Verteilungskoeffizienten der Nukleoside gemessen. Die fluorierten Nukleoside zeigten im Gegensatz zu den nichtfluorierten Nukleosiden eine deutlich größere Lipophilie. Nach Umsetzung der Nukleoside zu den Phosphoramiditen konnten diese kupplungsfähigen Monomere in den RNA-Festphasensynthesen eingesetzt und in RNA 12mere eingebaut werden. Um den Einfluss der aromatischen Fluorosubstitutionen auf die thermodynamische Stabilität von RNA-Duplexen zu untersuchen, wurden UV/VIS- und CD- spektroskopische Messungen an monomodifizierten RNA 12meren durchgeführt. Aus den erhaltenen Schmelzkurven wurden die Schmelzpunkte bestimmt (Abbildung 9.3) und die thermodynamischen Daten ausgerechnet. Die Anwendung hydrophober, Fluorsubstituierter Nukleobasen führte im Fall der fluorierten Indol-Nukleoside zu Destabilisierung im Vergleich mit natürlichen Basenpaaren. Aus den folgenden Resultaten lässt sich zusammenfassen: 1. Position der Fluoratom in fluorierten Indole spielt eine wesentliche Rolle für die Stabilität des RNA-Duplex 2. 6FI bildet die stabilste Basenpaaren mit natürlichen Basen. 3. Basenpaarung von 4FI trägt eine deutlich höhere Destabilisierung. Für diese Modifikation wurden auch die längsten Abstandwerte zwischen C-F…H in der Kristallpackung gemessen. (Die Vermutung liegt nahe, dass diese Base sich außerhalb des Duplex befindet). 4. Alle Fluorindol-Basenanaloga zeigen die Tendenz zur Paarung mit Adenosin. 5. Bei 4,6DFI handelt sich um universelle Base. Um noch weniger destabilisierende universelle Basen zu finden, wurde das Forschungsfeld mit Methoden aus dem Bereich der strukturellen Bioinformatik, Molekül-dynamiksimulationen und freie Energie-Rechnungen ausgeweitet. Resultierende Simulationen führten zu zwei neuen Basen: 7NP als Analogon zu 4,6DFBI und 9DP als Analogon zu 4,6DFI (siehe Kapitel 8). Theoretische Rechnungen ließen sich bestätigen durch experimentelle Ergebnisse Die so entstandene Serie von Purin-Basenanaloga hat uns gezeigt, dass der Austausch von Fluoratomen durch Stickstoffatome stabilisierende Effekte bringt. Die chemischen Änderungen beeinflussen die physikalischen Eigenschaften, welche dadurch Stabilisierung oder Destabilisierung des RNA-Duuplex dirigieren. In Abbildung 9.5 befinden sich ausgerechnete Dipolmomente. Somit können wir für diese Serie folgendes resümieren: * 4,6FI als universelles Base Analogon zu 4,6DFBI zeigt geringere destabilisierende Effekte auf den 12mer RNA-Duplex. * Umtausch von Fluoratomen in den beiden Basen (4,6DFI und 4,6DFBI) resultiert in deutlich besserer Basenpaarung. * Auserrechnete thermodynamische Parametern (von gemessenen Tm-Werten) wurde ersichtlicht, dass höhere Tm-Werte durch geringere Destabilisierung aus Solvatation resultieren, nicht aus erhöhten Stacking Effekten des RNA-Duplex.
Ideale universelle Nucleosid-Analoga könnten im Hinblick auf therapeutische Oligonucleotide einen Fortschritt in der Entwicklung darstellen. Zudem bieten solche Nucleosidanaloga auch aus synthetischer Sicht Vorteile: Durch ihre Struktur sind chemische Modifikationen – wie beispielsweise Modifizierungen an der Zuckereinheit – leichter zugänglich, als bei den natürlichen Nucleosiden. Ein Ziel der vorliegenden Doktorarbeit bestand darin, bereits bekannte universelle Nucleosidbausteine solchermaßen zu modifizieren, das bei ihrer Anwendung in Oligonucleotiden ihre Vorteile besser zum Tragen kommen. Vor diesem Hintergrund besaßen vor allem protonierbare 2´-O-Modifikationsmotive eine besondere Relevanz. Im Vergleich zur bereits bekannten 2´-O-Aminoethyl-Modifikation des 4,6-Difluorbenzimidazol-Nucleosidbausteins konnte eine um eine Methyleneinheit längere 2´-O-Aminopropylfunktion des Nucleosids hergestellt werden. Dabei wurde eine Syntheseroute eingeschlagen, mit der diese Modifikation in hohen Ausbeuten und hoher Reinheit aus dem 3´-,5´-Markiewicz-geschützten Nucleosid eingeführt werden konnte. Grundlage dieser Modifizierungsmethode ist eine Michael-Addition von Acrylnitril an die 2´-OH-Funktion unter basischen Bedingungen. Damit konnte ein 2´-O-Cyanoethylrest an das Nucleosid geknüpft werden; dieser wurde als Modifikationsmotiv beibehalten und es konnte das entsprechende 3´-Phosphoramidit hergestellt werden. Außerdem lässt sich ein 2´-O-Cyanoethylrest mittels Raney-Nickel-katalysierter Hydrierung in das primäre Amin überführen. Durch diese Michael-Addition-Reduktionssequenz konnte die erwähnte 2´-O-Aminopropylmodifikation in nur zwei Stufen mit einer Gesamtausbeute von über 80 % an das Difluorbenzimidazolnucleosid geknüpft werden. Die 2´-O-Aminopropylfunktion wurde zudem als Ausgangspunkt zur Kupplung weiterer erfolgsversprechender Modifikationsmotiven verwendet: In diesem Ansatz wurden mittels standardisierter Peptidkupplungschemie Carbonsäurederivate an die freie Aminofunktion gekuppelt. Hierdurch waren neuartige 2´-O-Modifizierungen, wie z.B. Lysin- oder auch Laurinsäurekonjugate zugänglich; diese waren über den Propylamidlinker mit dem Nucleosid verbunden. Im Hinblick einer polykationischen Modifizierung konnte auch ein Sperminderivat an die Aminopropylfunktion gekuppelt werden. Sämtliche dieser Konjugate konnten ebenfalls nach mehrstufigen Synthesen in das 3´-Phosphoramidit überführt werden und wurden schließlich erfolgreich in RNA-Oligonucleotide eingebaut. Für den Einbau der 2´-modifizierten universellen Nucleosidanaloga in RNA-Oligonucleotide wurden zunächst kurze 12mer-Sequenzen gewählt, die sich bereits als gute Testsysteme für spektroskopische Untersuchungen herausgestellt haben. Hernach konnten mit diesen Duplexen spektroskopische Untersuchungen wie UV-Schmelzkurvenanalysen und CD-Spektroskopie durchgeführt werden. Zudem stand die biologische Testung dieser Modifikationen in synthetisch zugänglichen siRNA-Oligonucleotiden im Fokus dieser Arbeit. Um die Flexibilität der Konjugationsmethode zu erhöhen konnte auch eine postsynthetische Kupplung an das festphasengebundene RNA-Oligomer etabliert werden. Dies wurde durch den Einbau des geeignet geschützten 2´-Aminopropyl-Nucleosidbausteins in ein RNA-Oligomer erreicht: Durch einfache Zugabe von Bocanhydrid in den Reduktionsansatzes gelang eine simultane Boc-Schützung des 2´-O-Aminopropylderivats in quantitativer Ausbeute. Diese Prozedur konnte auch auf ein 7N-Purinnucleosidanalogon übertragen werden, welches im Hinblick auf die thermodynamische Stabilisierung eines RNA-Duplexes einem 4,6-Difluorbenzimidazolbaustein gegenüber überlegen zu sein scheint. Die Boc-geschützen Derivate wurden als Phosphoramidite in die automatisierte Festphasensynthese von Oligonucleotiden eingesetzt. Der große synthetische Vorteil dieser Methode besteht einerseits in ihrer einfachen Durchführbarkeit, andererseits in ihrer effizienteren und ökonomischeren Vorbereitung: Es muss nur jeweils ein Phosphoramiditbaustein (mit Boc-geschützter 2´-O-Aminopropylfunktion) synthetisiert und in ein Oligonucleotid eingebaut werden. Sowohl mit dem 4,6-Difluorbenzimidazolnucleosid, als auch mit seinem 7N-Purin-Pendant konnten erfolgreiche Festphasenkupplungen durchgeführt werden. Im Hinblick auf die thermodynamischen Eigenschaften konnten vor allem für das 7N-Purinnucleosid interessante Resultate erzielt werden: Das via Festphasenkupplung erhaltene RNA-12mer, welches eine Argininmodifikation am 2´-O-Aminopropyl-7N-Purinnucleosid trägt, zeigt eine im Vergleich zum unmodifizierten A-U-Basenpaar ähnliche Stabilität bei leicht erhöhtem Tm-Wert. Um den Ursprung dieses Effekts genauer zu ergründen wären weitere thermo-dynamische Untersuchungen anhand des 7N-Purinbausteines z.B. mit anderen Modifikations-motiven oder auch an unterschiedlichen Positionen im Oligomer sinnvoll.
Untersuchung möglicher Wege zur Präparation von Nioboxynitriden mittels thermischer Kurzzeitprozesse
(2008)
In dieser Arbeit wurden mögliche Wege zur Präparation von Nioboxynitriden mittels thermischer Kurzzeitprozesse (Rapid Thermal Processing (RTP)) in dünnen Metallfilmen untersucht. Die dafür verwendeten Nb-Filme wurden mittels Magnetronsputtern auf ein thermisch oxidiertes Siliziumsubstrat (SiO2/Si-Substrat) aufgebracht. Die SiO2-Schicht hatte eine Dicke von 100 nm und soll die unerwünschte Reaktion zwischen Si und Nb vermeiden, welche zur Bildung von Niobsiliziden bei der RTP-Temperung führen kann. Um Nioboxynitride zu präparieren wurden Nb-Filme in mehreren Schritten mittels RTP behandelt. Durch die Variation der Ansatzreihenfolge (Oxidation und Nitridierung), der Reaktionsgase (O2, N2, NH3), der Reaktionstemperatur und der Reaktionszeit sowie der Schichtdicke der Proben wurde die Möglichkeit der Bildung von Nioboxynitriden untersucht. Es stellte sich heraus, dass die Bildung von Nioboxynitriden bei der Nitridierung der Nb2O5-Filme in Ammoniak erfolgt. Die Nb2O5-Filme wurden durch die Oxidation der as-deposited Nb-Filme im molekularem Sauerstoff bei 450 °C (nach 5 min Oxidation) bzw. bei 500 °C (nach 1 min Oxidation) hergestellt. Die gebildete Nb2O5-Phase wurde dem orthorhombischen beta-Nb2O5 zugeordnet. Die Oberfläche der Nb2O5-Filme zeigte Rissbildung sowie sichtbare Delamination bzw. Ablösung der Nb-Filme vom Substrat. Dies wird durch das Stressaufkommen im Film bei der direkten Oxidation des as-deposited Films im O2-Strom erklärt. Das Stressaufkommen wird durch eine starke Ausdehnung des Kristallgitters von Niob bei der Bildung des Nb2O5 sowie durch eine hohe Oxidationsrate des as-deposited Nb-Films in O2 hervorgerufen. Das Herabsetzen der Oxidationsgeschwindigkeit verringerte den Stress zwischen dem Metall und Niobpentoxid und verbesserte die Oberflächenqualität des Films nach der Temperung. Eine Herabsetzung der Reaktionsgeschwindigkeit wurde durch die Änderung der Ansatzreihenfolge erreicht. Die Oxidation der vorher nitridierten Nb-Filme führte zu einer langsameren Bildung des Nb2O5 im Vergleich zu den Filmen, die einer direkten Oxidation im O2-Strom ausgesetzt wurden. Dies wurde durch die Barrierefunktion der bei der Nitridierung gebildeten Niobnitride gegen den eindiffundierenden Sauerstoff hervorgerufen. Bei der Oxidation wurde die Diffusion des Sauerstoffes im nitridierten Film durch den Stickstoff gehemmt, was zu einer Abnahme der Oxidationsgeschwindigkeit und somit zu einer langsameren Bildung des Nb2O5 führte. Die Oxidation der zuvor nitridierten Filme führte zu wesentlich niedrigerem Stress zwischen dem Niob und den gebildeten Oxidphasen als zwischen dem Niob und dem Niobpentoxid bei der direkten Oxidation des Niobs in molekularem Sauerstoff. Die weitere Nitridierung der Filme, bei denen bei der Oxidation der bereits nitridierten Filme die Bildung nur einer Nb2O5-Phase erfolgte, führte zur Bildung von zwei Phasen: Nb4N3 und NbxNyOz. Die Zusammensetzung des gebildeten Nioboxynitrides entspricht am wahrscheinlichsten einer Zusammensetzung von NbN0.6O0.2. Sowohl die 200 als auch 500 nm-Filme zeigten nach der dreifachen Temperung eine hohe Porosität. Die hohe Porosität der Probe wurde durch Gasbildung und -diffusion (H2, H2O) im Innern des Films bei der Temperung des Nb2O5-Films in NH3 verursacht. Die EFTEM/EELS-Untersuchungen zeigten, dass sich beim dünnen 200 nm-Film zwei ausgeprägte Zonen (an der Oberfläche – Nb4N3, im Bulk bzw. am Interface – NbxNyOz) gebildet haben. Beim 500 nm-Film zeigte sich, dass die stickstoffhaltigen sowie stickstoff- und sauerstoffhaltigen Zonen, welche entsprechend Nb4N3 und NbxNyOz zugeordnet wurden, im ganzen Film ziemlich gleichmäßig verteilt sind. Ein Hinweis auf die Bildung eines Nioboxynitrides durch die Nitridierung der unvollständig oxidierten Nb-Filme im molekularen Stickstoff wurde nicht gefunden. Bei diesen Temperungen erfolgte die Bildung von unterschiedlichen Oxid- und Nitridphasen. Es wurde festgestellt, dass die Oxidation sowie die Nitridierung der Nb-Filme zu einem texturierten Wachstum der gebildeten Phasen führten. Die SiO2-Schicht auf dem (100)-orientierten Silizium wirkte sich auf das Schichtwachstum des auf das Silizium aufgebrachten Niobs aus und beeinflusste die Kristallstruktur der entstandenen Nb-Schicht und der bei den RTP-Temperungen gebildeten Phasen. Bei dünnen Schichten, wirkt sich dieser Effekt stärker aus, da der Einfluss des Substrates mit wachsender Schichtdicke abnimmt. Die bei der Oxidation gebildeten Nioboxide stellten eine starke Diffusionsbarriere für den bei der Nitridierung eindiffundierenden Stickstoff dar, was zur Aufstauung von Stickstoff in den an der Oberfläche liegenden Filmschichten führte. Die Analyse der erhaltenen SIMS-Daten zeigte, dass bei der Nitridierung der bereits oxidierten Filme die Diffusion des Stickstoffes zwei gleichzeitig ablaufende Prozesse verursacht. Von einer Seite verdrängt der eindiffundierende Stickstoff den Sauerstoff aus dem Film. Andererseits führt die Diffusion des Stickstoffes aufgrund des Schneepflug-Effekts zur Aufstauung des Sauerstoffes in den tiefliegenden Bereichen des Films. Gleichartige Diffusionsprozesse wurden bei der Oxidation der bereits nitridierten Filme beobachtet. Die Nioboxide, welche am Interfacebereich detektiert wurden, bildeten sich durch die Reaktion zwischen Niob und dem aus der SiO2-Schicht ausdiffundierenden Sauerstoff. Die Gegenwart der schon vorhandenen Nioboxide hemmte allerdings die Ausdiffusion des Sauerstoffes aus der SiO2-Schicht des Substrates im Vergleich zu den unoxidierten Filmen.
Untersuchungen zum Target und Wirkmechanismus der eNOS-Transkriptionsverstärker AVE9488 und AVE3085
(2008)
Die Substanzen AVE9488 und AVE3085 der neuen chemischen Klasse der eNOS-Transkriptionsverstärker führen zu einer signifikanten Aktivierung des eNOSPromotors, die in vitro und in vivo in einer Erhöhung der eNOS-Expression auf mRNAund Proteinebene resultiert. Als Folge davon kommt es zu einer signifikant gesteigerten Synthese von bioverfügbarem Stickstoffmonoxid (NO). Dieser Effekt führt in Kombination mit einer ebenfalls beobachteten Normalisierung der eNOS-Entkopplung zu einer deutlichen antiatherosklerotischen Wirkung in ApoE-Knockout-Mäusen. AVE9488 und AVE3085 wurden initial durch eine phänotypische Reihentestung chemischer Bibliotheken in einer stabilen eNOS-Promotor-Reporter-Endothelzelllinie identifiziert. Daher waren bis zum heutigen Zeitpunkt molekulare Targets und ihre Wirkweise unbekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand daher darin, Targetproteine der eNOS-Transkriptionsverstärker zu identifizieren, zu validieren und Hinweise auf den zugehörigen Wirkmechanismus zu sammeln. Zur Identifizierung potenzieller Zielproteine wurden zwei unterschiedliche Strategien verfolgt. In einem genomischen Ansatz sollten einzelne, für die Aktivierung des eNOSPromotors durch AVE9488 und AVE3085 essentielle Transkriptionsfaktoren identifiziert werden. Eine in silico-Analyse des für die Substanzwirkung notwendigen 300bp-Promotorbereichs vor Transkriptionsstart auf konservierte Transkriptionsfaktor-Bindemotive ergab potenzielle Bindungsstellen für insgesamt 105 Transkriptionsfaktoren. In Gel-Retardierungsexperimenten mit Oligonukleotiden, die aufbauend auf der bioinformatischen Analyse die konservierten cis-Elemente in diesem Sequenzbereich abdeckten, und Kernextrakten aus Endothelzellen, die mit AVE9488 behandelt worden waren, konnte eine Abschwächung der DNA-Protein-Komplexbildung beobachtet werden. Diese Effekte konnten jedoch mit dieser Technologie aufgrund der hohen Anzahl möglicher bindender Transkriptionsfaktoren nicht auf einzelne eingeengt werden. Im Folgenden wurden daher einzelne Transkriptionsfaktoren ausgewählt, die eine nachgewiesene Rolle bei der Regulation der eNOS-Transkription besitzen, und auf ihre Bedeutung bei der Substanz- ermittelten eNOS-Promotoraktivierung untersucht. Nach Ausschaltung durch siRNA von Sp1, GATA-2, Ets-1, MAZ und PATZ1 im eNOS-Transkriptionstest konnten bei Sp1, GATA-2 und MAZ lediglich eine Erniedrigung der basalen eNOS-Promotoraktivitätfestgestellt werden. Da die Substanz-induzierte eNOS-Transkriptionserhöhung bei keinem der untersuchten Transkriptionsfaktoren beeinflusst wurde, scheinen diese Proteine bei diesem Prozess keine Rolle zu spielen. Als zweite Strategie kamen Proteomik-Techniken zur Identifizierung möglicher Targetprot eine durch ihre direkte biochemische Affinität zum Pharmakophor der eNOS-Transkriptionsverstärker zum Einsatz. Durch die chromatographische Anreicherung bindender Proteine aus Endothelzelllysaten an spezifischen Affinitätsmaterialien und der Markierung rekombinanter, humaner Proteine auf Protein-Mikroarrays mit Biotinmarkierten eNOS-Transkriptionsverstärkern konnte eine Gesamtliste mit insgesamt 18 potenziellen Targetkandidaten ermittelt werden. Die weitere zelluläre Validierung dieser Kandidaten erfolgte durch ihre siRNA-vermittelte Ausschaltung im eNOS-Transkriptionstest. Innerhalb aller potenziellen Targets konnte nur nach Ausschalten von Häm-bindenden Protein 1 (HEBP1) der eNOS-Promotor durch AVE3085 nur noch signifikant abgeschwächt gegenüber der Kontrolle aktiviert werden. Dieses Protein stellte somit den einzigen Targetkandidaten dar, der bei der Aktivierung des eNOS-Promotors eine Rolle zu spielen scheint. Nach rekombinanter Expression des humanen HEBP1 konnte die Bindung der eNOS-Transkriptionsverstärker an dieses Protein durch zwei unabhängige biochemische Methoden konfirmiert werden. Bei Messungen der Tryptophanfluoreszenz des HEBP1 konnte der eNOS-Transkriptionsverstärker 9257 den Liganden Hämin, der eine Quenchung der Fluoreszenz bewirkt, aus der Bindung verdrängen. Weiterhin konnte mit Hilfe einer Fluoreszenz-markierten eNOS-Substanz ihre direkte Bindung an das HEBP1 durch Messung der Fluoreszenzpolarisation nachgewiesen und ein KD-Wert von 11,7μM ermittelt werden. Abschließend konnte in ersten Untersuchungen der Hebp1-Expression in einem Herz-Kreislauf-relevanten Tiermodell für chronische Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt die differentielle Hochregulation des Hebp1-Gens um den Faktor 2,5 unter pathologischen Bedingungen nachgewiesen werden, die jedoch nicht durch die Behandlung mit AVE3085 beeinflusst wurde.
Mannheimia haemolytica und Pasteurella multocida gehören zu den Verursachern der unter Rindern weltweit verbreiteten Enzootischen Bronchopneumonie. Derzeitige Impfstoffe und Antibiotika gegen diese Bakterien können die Verbreitung der Krankheit nicht maßgeblich einschränken, weshalb Bedarf an neuen Medikamenten besteht. Bei der Besiedelung der Lunge treffen M. haemolytica und P. multocida auf Eisenmangel. Die Aufnahme von Eisen ist ein wesentlicher Faktor bei der Kolonisierung und Persistenz pathogener Bakterien im Wirt, da Eisen essentiell ist. Medikamente, die an Proteinen der Eisenversorgung angreifen, können deshalb zur Eindämmung der Bronchopneumonie beitragen. Um einen Überblick über die Gene von M. haemolytica und P. multocida zu erhalten, die bei der Adaptation an Eisenmangel beteiligt sind, wurden die Bakterien in der vorliegenden Arbeit in vitro unter Eisenmangel kultiviert, denn die meisten bakteriellen Gene, die an der Eisenaufnahme beteiligt sind, werden erst bei Eisenmangel transkribiert. Mittels Mikroarray-Analyse der Transkriptome wurden erstmals die in vitro eisenregulierten Gene von M. haemolytica und erstmals auch die eisenregulierten Gene eines Rinder-Isolats von P. multocida identifiziert. Der in dieser Arbeit verwendete Mikroarray war ein Multigenom-Mikroarray und stellt die offenen Leserahmen beider Bakterien dar. Mit der Mikroarray-Analyse wurden 129 Gene von M. haemolytica identifiziert, die bei Wachstum unter Eisenmangel eine veränderte Transkription aufwiesen. Die größte Gruppe der Gene mit verstärkter Transkription bildeten die Gene, die für Rezeptoren und Transporter kodieren. Von diesen kodieren etwa drei Viertel für Proteine, die an der Aufnahme von Eisen aus verschiedenen Quellen beteiligt sind. Die größte Gruppe der Gene mit verminderter Transkription wurde von Genen gebildet, die für Proteine des Energie-Stoffwechsels kodieren. Damit wurde auch für M. haemolytica das Prinzip bestätigt, dass Bakterien bei Eisenmangel verstärkt Gene transkribieren, deren Proteine an der Eisenaufnahme beteiligt sind, während Gene für eisenhaltige Proteine des Energie-Stoffwechsels vermindert transkribiert werden. Bei der Analyse des Transkriptoms von P. multocida wurden 173 Gene mit veränderter Transkription identifiziert. Auch bei P. multocida konnte mit der funktionellen Klassifizierung der kodierten Proteine die größte Gruppe an Genen mit verstärkter Transkription den Transport- und Bindungsproteinen zugeordnet werden. Die größte Gruppe an Genen mit verminderter Transkription wurde auch bei P. multocida von Genen gebildet, die für Proteine des Energie-Stoffwechsels kodieren. Beim Vergleich des Transkriptoms von M. haemolytica mit dem von P. multocida wurden mehr Unterschiede als Gemeinsamkeiten festgestellt. Nur 40 der 1424 homologen Gene zeigten die gleiche Richtung in der Änderung in der Transkription. Unter den 15 homologen Genen mit verstärkter Transkription waren die Gene, die für einen Hämoglobin-Rezeptor, die ABC-Transportsysteme FbpABC und YfeABCD sowie das Energie liefernde System TonB-ExbBD kodieren. In den 25 homologen Genen mit verminderter Transkription waren 15 Gene enthalten, deren kodierte Proteine am Energie-Stoffwechsel beteiligt sind. Dies waren die Proteine NapABCDFGH des Nitrat-Reduktase-Komplexes, die Proteine NrfABCD des Nitrit-Reduktase-Komplexes und die Proteine FrdABCD des Komplexes der Fumarat-Reduktase. Ein auffälliger Unterscheid war, dass bei M. haemolytica die gesamten Gene verstärkt transkribiert wurden, deren Proteine an der Aufnahme von Eisen aus Transferrin beteiligt sind. Bei P. multocida dagegen konnte das Gen für den Transferrin-Rezeptor nicht nachgewiesen werden. Somit gehört das in dieser Arbeit verwendete Isolat von P. multocida vermutlich zu den 30% der Rinder-Isolate von P. multocida, die keinen Transferrin-Rezeptor besitzen, aber die Rinderlunge besiedeln können (Ewers et al., 2006). Im Vergleich zu M. haemolytica fielen bei P. multocida die vielen verstärkt transkribierten Gene auf, die an der Aufnahme von Eisen aus dem Blut beteiligt sind. Die Transkription dieser verschiedenen Transporter deutet auf eine gute Adaptation von P. multocida für die Verwendung von Eisen aus dem Blut des Wirts hin, die bei M. haemolytica in diesem Maß nicht gegeben scheint. Für M. haemolytica wurde die in vivo-Relevanz einiger eisenregulierter Gene überprüft, die in der Mikroarray-Analyse eine erhöhte Transkription zeigten. Dazu wurde die RNA untersucht, die aus dem Lungengewebe von infizierten Rindern isoliert worden war. In diesem Gewebe wurde die Transkription von 11 Genen mittels RT-PCR nachgewiesen. Für die Gene, die für die Hämoglobin-Rezeptoren von M. haemolytica kodieren, wurde mittels quantitativer real time PCR auch eine Verstärkung der Transkription im Lungengewebe nachgewiesen. Die Verstärkung der Transkription in vivo war der transkriptionellen Verstärkung in vitro vergleichbar, was auf eine Funktion der Hämoglobin-Rezeptoren bei der Infektion in vivo hindeutet. Zur Untersuchung der Regulation des Eisenhaushalts von M. haemolytica wurde versucht, das Gen fur zu deletieren, das für den Hauptregulator des Eisenhaushalts kodiert, was jedoch nicht gelungen ist. In einem antisense-Ansatz konnte jedoch gezeigt werden, dass der Stamm mit dem fur-antisense-Plasmid ein signifikant verzögertes Wachstum hatte, was auf die essentielle Funktion des Gens fur in M. haemolytica hinweist. Ein antisense-Ansatz ist noch kein Beweis für die essentielle Funktion eines Gens. Doch die mit Gioia et al. (2007) übereinstimmenden Schwierigkeiten bei der Herstellung einer ∆-fur-Mutante von M. haemolytica sowie das verringerte Wachstum in Gegenwart der fur-antisense-mRNA deuten stark auf eine essentielle Funktion dieses Gens hin.
IL-18 ist ein proinflammatorisches Zytokin mit tumorsuppressiven Eigenschaften. Daher befindet es sich derzeit in klinischen Studien der Phase II zur Behandlung immunsensitiver Tumore. Erste Ergebnisse dieser Studien sind vielversprechend, zumal IL-18 im Vergleich zu beispielsweise IL-1Beta und IL-12 eine hohe Verträglichkeit im Menschen aufweist. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass IL-18 nicht nur in soliden Tumoren, sondern auch in leukämischen Zellen wie AML-Zellen zur Expression eines Genmusters führt, welches hohes antileukämisches Potential aufweist. Diese Erkenntnis wurde mittels einer Microarray-Analyse gewonnen und in unabhängigen Versuchen überprüft. Zu den hochregulierten Genen gehören neben IFNY und Fas-Ligand die in der vorliegenden Arbeit untersuchten angiostatischen Chemokine IP10 und I-TAC sowie EBI3, die Beta-Kette des heterodimeren Zytokins IL-27. Da die Regulation des humanen EBI3-Gens bislang schlecht charakterisiert war, schloss sich eine Promotoranalyse des humanen EBI3-Promotors an. Diese brachte hervor, dass zwei NFKB-Bindungsstellen des Promotors für die Expression von EBI3 unter dem Einfluß von proinflammatorischen Zytokinen unabdingbar sind. Der humane Promotor wurde dabei in dieser Arbeit zum ersten Mal im humanen Kontext betrachtet. Weiterhin konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass IL-27 die Fähigkeit besitzt, humane myeloisch-leukämische Zellen zu aktivieren und Signale in Form von STAT1 und STAT3-Phosphorylierung sowie Hochregulation von SOCS3- Expression zu induzieren. Interessanterweise lassen sich die potentiell tumorsuppressiven Eigenschaften von IL-18 in Bezug auf KG1 Zellen durch eine Zugabe von Zink verstärken. So kommt es unter dem Einfluß von Zink zu einer Verstärkung der Expression von IFNY und EBI3. Dieser synergistische Effekt besitzt allgemeinere Gültigkeit, da die hier durchgeführten Experimente an humanen PBMC zeigten, dass eine Erhöhung des extrazellulären Zinkgehalts um den Faktor 2 im Vergleich zu dem physiologisch zugänglichen Zinkgehalt im Blutplasma zu einer Potenzierung der Freisetzung von IFNY durch die proinflammatorischen Zytokine IL-1Beta, IL-18 und IL-12 führt. Diese Ergebnisse waren besonders in Bezug auf IL-1Beta unerwartet und tragen ihren Anteil zum Verständnis der erhöhten Sensibilität von Leukozyten unter zinksupplementierten Bedingungen bei. Weitere Studien werden zeigen, ob eine Therapie mit IL-18 und möglicherweise auch in Kombination mit Zink eine alternative Option bei AML Patienten bietet, die besonders responsiv auf dieses Zytokin reagieren.
Eine in vivo Modifizierung von Blutstammzellen wäre für eine Reihe gentherapeutischer Therapieansätze vorteilhaft. Dies würde voraussetzen, dass retrovirale Vektoren gezielt auf Blutstammzellen ausgerichtet werden können. Für dieses sogenannte Zelltargeting bietet sich das vom Milznekrose-Virus von Vögeln (SNV) abgeleitete Vektorsystem an, bei dem die Rezeptorbindungsdomäne des Env-Proteins modifiziert werden kann. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte ein SNV-basierter retroviraler Zelltargeting-Vektor entwickelt werden, der einen selektiven Gentransfer in die primären humanen CD34-positiven hämatopoetischen Zellen ermöglicht. Zur weitergehenden Charakterisierung des SNV-Vektorsystems sollte geklärt werden, ob das Env-Protein des SNV ein mit anderen gamma-retroviralen Env-Proteinen vergleichbares R-Peptid aufweist, dessen mögliche Rolle bei viralem Zelleintritt ebenfalls untersucht werden sollte. Um eine Zielzell-Spezifität des SNV-Vektors zu erreichen, wurde die gesamte SU-Domäne des SNV-Env-Proteins mit einem einkettigen Antikörperfragment (scFv) ersetzt, das gegen das CD34 Molekül gerichtet ist,. Mit diesem modifizierten Env gelang es, [(antiCD34-TM)SNV]-Vektorpartikel herzustellen, die spezifisch CD34-positive Zellen transduzierten. Essentiell für die Erzeugung solcher Vektoren war die Etablierung einer stabilen Verpackungszelllinie, die Vektorpartikel mit einem Titer von 2x105 i.E./ml produzierte. In Transduktionsexperimenten mit verschiedenen Zelllinien wurde gezeigt, dass [(antiCD34-TM)SNV]-Vektoren eine deutliche Präferenz für CD34+-Zellen und nicht für CD34--Zellen besitzen, wobei der Unterschied in der Transduktionseffizienz zwischen CD34-positiven und –negativen Zellen um den Faktor 100 lag. [(antiCD34-TM)SNV]-Vektoren waren in der Lage, den Reportergentransfer auch in primäre humane Stammzellen zu bewirken. Hierzu wurde ein Transduktionsprotokoll so optimiert, dass die aus dem Nabelschnurblut isolierten CD34+-Zellen transduziert werden konnten. Der für diese Zielzellen bestimmte Vektortiter betrug bis zu 2x106 i.E./ml. In einem Gemisch von primären CD34+- und CD34--Zellen konnte der Vektor zwischen dem Target- und Nontarget-Zellen unterscheiden. Somit wurde zum ersten Mal nicht nur Spezifität, sondern auch Selektivität des SNV-Vektorsystems demonstriert. Dieses Ergebnis ist für eine Weiterentwicklung des Vektors für die in vivo Anwendung in Rahmen einer Gentherapie eine wichtige Voraussetzungen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Fusionsvorgang bei Virus-Eintritt näher untersucht. Anlass dafür war die experimentelle Beobachtung, dass das Env-Protein des SNV bei der Virusknospung von einer viralen Protease innerhalb der zytoplasmatischen Domäne proteolytisch gespalten wird. Ein Sequenz-Vergleich des SNV TM-Proteins mit dem MLV TM-Protein ergab Hinweise darauf, dass es sich um die Abspaltung des sogenannten R-Peptides analog zu MLV handeln könnte. Die Expression von SNV-Env- Mutanten mit einem entsprechend verkürzten C-Tail (Env delta R) führte zur Synzytien-Bildung. Die bildung hochfusogener Oberflächenhüllproteine durch die Abspaltung des R-Peptids konnte auch für andere gamma-Retroviren gezeigt werden. Die Synzytienbildung konnte quantitativ unter den Env delta R-Varianten verschiedener gamma-Retroviren in einem etablierten Fusionsassay verglichen werden. Das Env delta R des endogenen Retrovirus des Schweins (PERV) des Typs A erwies sich als potentestes Fusionsagens. Als Folge der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wurde postuliert, dass die Abspaltung des R-Peptides ein allgemeiner Mechanismus bei der Partikelreifung der gamma-Retroviren ist und eine fusionsregulierende Rolle besitzt. Eine Weiterentwicklung fusionsaktiver Env-Varianten als mögliche therapeutische Gene für eine Tumor-Gentherapie ist somit diskutierbar.
Der Typ I Interferonrezeptor, der aus den Transmembranproteinen ifnar1 und ifnar2 besteht, nimmt eine wichtige Rolle bei der angeborenen und erworbenen Immunantwort ein. Durch Bindung von Typ I Interferonen werden antivirale, antiproliferative und immunmodulatorische Aktivitäten in der Zelle induziert. Die Wirkung der Interferone wird bereits bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten eingesetzt. Es ist bislang nicht bekannt, wie die verschiedenen Typ I Interferone nach Bindung an einen gemeinsamen Rezeptor, unterschiedliche Zellantworten induzieren. So unterscheiden die Typ I Interferone sich nicht hinsichtlich ihrer Bindungsstelle oder der Stöchiometrie der Bindung an ifnar1 bzw. ifnar2. Sie weisen jedoch unterschiedliche Affinitäten zu den Rezeptoruntereinheiten auf, wobei ihnen eine niedrigere Affinität zu ifnar1 gemeinsam ist. Bislang konnte keine Interaktion zwischen den Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen werden. Es wird angenommen, dass bei der Rezeptorassemblierung das Interferon zunächst an ifnar2 bindet und anschließend ifnar1 rekrutiert. Es wird postuliert, dass die unterschiedlichen Zellantworten für verschiedene Typ I Interferone auf Unterschieden in der Stabilität der ternären Komplexe beruhen könnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die Struktur und Dynamik des Interferonrezeptors in vitro für die Typ I Interferone IFNa2 und IFNb charakterisiert. Die Struktur des ternären Komplexes aus den extrazellulären Domänen von ifnar1 und ifnar2 mit IFNa2 wurde mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Über Einzelpartikelanalyse aufgereinigter Komplexe von IFN mit den extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) konnte ein Strukturmodell des ternären Komplexes erstellt werden. Dieses zeigte eine Verschiebung der membranproximalen Domänen von ifnar1-EC und ifnar2-EC wie sie bereits für den Rezeptor für Erythropoietin und den Wachstumsfaktor beobachtet wurden, welche zu den Typ I Zytokinrezeptoren gehören. Die Struktur des ternären Komplexes ermöglicht als erste Struktur eines Typ II Zytokinrezeptors einen Einblick in die Architektur des Komplexes und mögliche Aktivierungsmechanismen. Die Strukturen der Komplexe für die verschiedenen Typ I Interferone IFNa2 und IFNb wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf, was auf einen gemeinsamen Aktivierungsmechanismus hinweist. Temperatur-abhängige Messungen von Bindungskinetik und –affinität ergaben sehr unterschiedliche Energiehyperflächen für die Ligandenbindung an ifnar1- und ifnar2-EC, und wiesen auf einen mehrstufigen Prozess und mögliche Konformationsänderungen bei der Bindung an ifnar1-EC hin. Zur Analyse der Dynamik von ifnar1-EC wurden daher verschiedene fluoreszenzbasierte Assays etabliert. Eine besondere Herausforderung bestand darin, das Protein ortsspezifisch und stöchiometrisch mit zwei verschiedenen Fluorophoren zu koppeln. Ifnar1-EC wurde an verschiedenen Stellen kovalent mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Es wurde gezeigt, dass nach Bindung eines geeigneten tris-NTA-Fluorophor-Konjugats an den C-terminalen His-Tag die Fluoreszenz abstandsabhägig durch Förster-Resonanz-Energie-Transfer gelöscht wurde. Für ifnar1-EC wurde eine ligandeninduzierte Abstandsänderung detektiert. Die detaillierte Analyse ergab nach Bindung von IFNa2 eine Abstandszunahme von 13 A vom N- zum C-Terminus. Durch die Interferonbindung nimmt demnach ifnar1-EC eine gestrecktere Konformation ein. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in Anwesenheit von ifnar2-EC und für IFNb erhalten. Die Einzelmolekülanalysen mittels Fluoreszenz Korrelationsspektroskopie (FCS) zeigten sowohl einen Verlust der Flexibilität von ifnar1-EC nach Ligandenbindung als auch ein ligandeninduziertes Rearangement der Ig-ähnlichen Domänen. Die Änderung der Flexibilität wurde durch Messungen der Fluoreszenzlebensdauer bestätigt. Untersuchungen der Kinetik der Ligand-induzierten Konformationsänderung mittels Stopped-Flow Messungen bestätigten eine mehrstufige Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen nach Ligandenbindung. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass sich nach Ligandenbindung die Zugänglichkeit des Tryptophans in der membranproximalen Domäne von ifnar1-EC ändert. Da die membranproximale Domäne nicht bei der Ligandenbindung beteiligt ist, deutet dieser Effekt auf eine Propagation der Ligand-induzierten Konformationsänderung in diese Domäne hin. Das Tryptophan könnte mit der Membran interagieren, was auf eine wichtige Rolle der membranproximalen Domäne für die korrekte Orientierung von ifnar1 in der Membran hindeut. Die Stopped-Flow Analyse zeigte, dass es sich hierbei um einen einstufigen Prozess handelt, der mit der Interferonbindung korreliert. Die Ergebnisse wiesen insgesamt auf eine Ligand-induzierte Flexibilitätsänderung und Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen bei ifnar1-EC hin. Vermutlich wird nach Ligandenbindung das Signal in die membranproximale Domäne von ifnar1-EC propagiert. Die Strukturen der ternären Komplexe mit den verschiedenen Typ I Interferonen wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf. Auch die Ergebnisse der fluoreszenzbasierten Assays zeigten keine Unterschiede für IFNa2 und IFNb, was die Hypothese stützt, dass die differentielle Aktivität der Interferone nicht auf grundsätzlichen Unterschieden in der Architektur des ternären Komplexes beruht, sondern in der unterschiedlichen Dynamik der Komplexe codiert sein könnte.
Das Ziel dieser Arbeit war es, RNA-Strukturen als potentielle Zielstrukturen für die Medikamentenentwicklung zu untersuchen. Hierbei ging es im Speziellen um die Anwendung Virtueller Screening Verfahren für die RNA-Liganden-Vorhersage. Hierzu wurde die als TAR-Motiv (transactivating response element) bekannte RNA-Struktur der mRNAs des HI-Virus ausgewählt. Diese Struktur wurde gewählt, da mit den vier PDB-Einträgen 1ANR, 1ARJ, 1LVJ und 1QD3 bereits experimentell motivierte Strukturmodelle zum Beginn der Untersuchung vorlagen. Ausschlaggebend war hierbei auch das Vorhandensein eines Tat-TAR-FRET-Assays im Rahmen des SFB 579, in welchem diese Arbeit angefertigt wurde. Die Aufmerksamkeit, welche dem HI-Virus im Rahmen der Bekämpfung der Immunschwächekrankheit bereits zukam, führte bei dem gewählten Testmodell ebenfalls zu einem, wenn auch immer noch überschaubaren Datensatz bereits getesteter Substanzen, der als Grundlage für einen Liganden-basierten Ansatz als erste Basis dienen konnte. Basierend auf diesen Voruntersuchungen ergaben sich die weiteren Schritte dieser Arbeit. Die Arbeit lässt sich zusammenfassend in vier zum Teil parallel verlaufende Phasen einteilen: Phase 1:Bestandsaufnahme bekannter Informationen über die Zielstruktur · experimentell bestimmte Zielstrukturen · experimentell bestimmte Liganden/Nichtliganden der Zielstruktur Phase 2: Ableiten eines ligandenbasierten Ansatzes zur Vorhersage von potentiellen Bindern der Zielstruktur aus Substanzbibliotheken, der nicht auf Strukturdaten der Zielstruktur beruht. Phase 3: Analyse der bekannten Konformere der Zielstruktur auf konstante Angriffspunkte für ein spezielles Liganden-Design. Phase 4: Einbinden der bekannten Strukturinformationen der Zielstruktur zur weiteren Verfeinerung der Auswahlverfahren neuer Kandidaten für die weitere experimentelle Bestimmung des Bindeverhaltens. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mittels der Anwendung von künstlichen neuronalen Netzen in einem ligandenbasierten Ansatz durch virtuelles Screening der Chemikalien-Datenbanken verschiedener Lieferanten fünf neue potentielle TAR-RNA-Liganden identifiziert werden (drei davon mit einem Methylenaminoguanidyl-Substrukturmotiv), sowie als „Spin-Off“ durch die Anwendung der ursprünglich nur für den Tat-TAR-FRET-Assay vorgesehenen Testsubstanzen in einem Kooperationsprojekt (mittels CFivTT-Assay) zwei neue potentiell antibakterielle Verbindungen identifiziert werden. Die Beschäftigung mit der offensichtlichen Flexibilität der TAR-RNA und damit einer nicht eindeutig zu definierenden Referenz-Zielstruktur für das Liganden-Docking führte zur Erstellung eines Software-Pakets, mit dem flexible Zielstrukturen – basierend auf den Konformer-Datensätzen von MD-Simulationen – auf konstante Angriffspunkte untersucht werden können. Hierbei wurde ausgehend von der Integration eines Taschenvorhersage-Programms (PocketPicker) eine Reihe von Filtern implementiert, die auf den hierzu in einer MySQL-Datenbank abgelegten Strukturinformationen eine Einschränkung des möglichen Taschenraums für das zukünftige Liganden-Design automatisiert vornehmen können. Des Weiteren ermöglicht dieser Ansatz einen einfachen Zugriff auf die einzelnen Konformere und die Möglichkeit Annotationen zu den Konformeren und den daraus abgeleiteten Tascheninformationen hinzuzufügen, so dass diese Informationen für die Erstellung von Liganden-Docking-Versuchen verwendet werden können. Ferner wurden im Rahmen dieser Arbeit ein neuer Deskriptor für die Beschreibung von Taschenoberflächen eingeführt: der auf der „Skalierungs-Index-Methode“ basierende molekulare SIMPrint. Die Beschäftigung mit der Verteilung der potentiellen Bindetaschen auf der Oberfläche der Konformerensemble führte ferner zur Definition der Taschenoberflächenbildungswahrscheinlichkeit (Pocket Surface Generation Probability – PSGP) für einzelne Atome einer Zielstruktur, die tendenziell für die Einschätzung der Ausbildung einer potentiell langlebigen Interaktion eines Liganden mit der Zielstruktur herangezogen werden kann, um beispielsweise Docking-Posen zu bewerten.
Die Identifikation neuer Hits und Leitstrukturen sind die ersten Schritte bei der Entwicklung neuer Arzneistoffe. Dieser Herausforderung wird derzeit primär mittels High-Throughput-Screening oder der gezielten Modifikationen bekannter Liganden begegnet. Eine weitere Option ist das computerbasierte virtuelle Screening, das es kostengünstig ermöglicht, in kurzer Zeit sehr viele Moleküle auf ihre potentielle biologische Aktivität hin zu untersuchen. Der in dieser Arbeit verwendete Ansatz zur Identifikation neuer Inhibitoren der 5-Lipoxygenase und der Cyclooxygenase-2 beruht auf dem Verfahren des ligandenbasierten virtuellen Screenings. Unter der Voraussetzung der Kenntnis mindestens eines Referenzliganden können so mittels einer Ähnlichkeitsanalyse potentielle neue strukturelle Grundgerüste identifiziert werden. Zu diesem Zweck wurde ein auf atomaren Partialladungen und der dreidimensionalen Struktur der Moleküle basierender Deskriptor (Charge3D/TripleCharge3D) entwickelt. In retrospektiven Studien mit Cyclooxygenase-2 Inhibitoren wurde die Effektivität der neuen Deskriptoren überprüft und mittel eines evolutionären Algorithmus optimiert. Der Charge3D Deskriptor erreicht Anreicherungsfaktoren bis zu 16,1 im ersten Perzentil der durchsuchten Datenbank, wohingegen der TripleCharge3D Deskriptor mit seiner detailierteren Ladungsauftrennung Werte von bis zu 24,8 erreichte. Ein ebensolches retrospektives Screening wurde für 5-Lipoxygenase Inhibitoren durchgeführt. Den maximalen Anreicherungsfaktor von 6,1 im ersten Prozent der Datenbank erreichte hier der Charge3D Deskriptor, der TripleCharge3D Deskriptor erreichte 5,3. Diese wesentlich geringeren Werte sind auf die Diversität der 5-LO Inhibitoren (54 Inhibitoren mit 39 verschiedenen Grundgerüsten) und deren unterschiedliche Inhibitortypen (Redox, nicht Redox und Eisen-bindende Inhibitoren) mit ihren jeweiligen Bindemodi zurückzuführen. In Screenings nach 5-LO Inhibitoren in der Naturstoffdatenbank der Firma AnalytiCon Discovery und COX-25-LO Dualinhibitoren in Datenbanken der Firma Asinex konnten unter Verwendung der beiden Deskriptoren Inhibitoren, mit für diese Targets bislang unbekannten Scaffolds identifiziert werden. Unter Verwendung des 2D Pharmakophor Deskriptors CATS wurden zuerst zwei neue Scaffolds für Inhibitoren der 5-LO identifiziert. Struktur 1 ist den in vitro Assaydaten zufolge ein direkter Inhibitor der 5-LO. Struktur 2 hingegen erreicht seine Wirkung nicht nur über die direkte Interaktion mit der 5-LO. Eine Erklärung dafür wäre die Wechselwirkung mit dem 5-LO aktivierenden Protein FLAP, der Hemmung der Translokation der 5-LO zur Kernmembran, oder die Inhibition 5-LO aktivierender bzw. inaktivierender Kinasen. In nachfolgenden Screenings mit den Strukturen 1 und 2 als Referenzstrukturen konnten mittels der Charge Deskriptoren Substanzderivate (17 Moleküle) mit 5-LO inhibitorischer Wirkung (5 Moleküle mit IC50 Werte ≤ 1 μM an partiell aufgereinigter 5-LO), identifiziert werden. Für das Screening nach COX-2/5-LO Dualinhibitoren wurden 11 Strukturen mit 7 unterschiedlichen Scaffolds unter Verwendung der Charge Deskriptoren aus gewählt. Drei Moleküle zeigten keine 5-LO Aktivität, und jeweils eines nur in intakten PMNLs bzw. im S100 Zellüberstand. Die restlichen 6 Moleküle waren in beiden 5-LO Assays aktiv (intakte PMNLs IC50 zwischen 2 und 15 μM, S100 Zellüberstand 5-LO zwischen 0.5 μM und 25 μM). Somit zeigten 7 Moleküle im S100 Assay Aktivität und konnten als direkte Inhibitoren der 5-LO identifiziert werden. Im Cyclooxygenase-2 Aktivitätsassay mit intakten MonoMac6 Zellen zeigte eine der 11 Strukturen zudem eine geringe (IC50 = 70 μM) inhibierende Aktivität. Modifikationen zur Verbesserung der COX-2 Hemmung könnten in einem potenten COX-2/5-LO Dualinhibitor resultieren, der beispielsweise in der Schmerzbehandlung eingesetzt werden könnte. Ein weiteres Projekt war die Erstellung eines Homologiemodells der 5-LO basierend auf der 15-Lipoxygenase Struktur des Kaninchens (PDB-Struktur: 1LOX). Die Sequenzidentität der beiden Strukturen (1LOX / humane 5-LO) lag bei 37 %. Das Modell wurde zum einen zur Vorhersage von zugänglichen Caspase-6 Schnittstellen an der 5-LO angewandt, und zum anderen wurden Dockingexperimente in Aktiven Zentrum und in Bereichen der C2-like Domäne der 5-LO durchgeführt. Hyperforin, ein bekannter Inhibitor d er 5-Lipoxygenase, wurde an verschiedenen Stellen des Modells für Dockingexperiment eingebracht. Die im Aktiven Zentrum erreichten Scorewerte (Chemscore = -9±1) deuteten hier auf eine unfavorisierte Bindungsstelle hin. BWA4C (ein bekannter Eisenbinder) und ZM230487 (ein nicht-redox Inhibitor) erhielten im Aktiven Zentrum Scorewerte von 27±0,1 und 22±2,5, wodurch eine Bindung als wahrscheinlich angenommen werden kann. Weitere Dockingexperimente an der C2-like Domäne, und speziell am Interface zwischen der C2-like und der katalytischen Domäne, ergaben ähnlich hohe Chemscorewerte für Hyperforin, BWA4C und ZM230487. Aus diesen Resultaten ließ sich kein eindeutiger Bindemodus für Hyperforin ableiten. Eine Positionierung im Aktiven Zentrum ist nach diesen Experimenten unwahrscheinlich, so dass die Existenz einer weiteren, experimentell noch nicht identifizierten Bindestelle vermutet werden kann. Eine solche Interaktionsfläche könnte als Ansatzpunkt für die Entwicklung weiterer 5-Lipoxygenaseinhibitoren eine zentrale Rolle einnehmen.
Das Ziel des adaptiven Entwurfs von Substanzbibliotheken ist es, die vollständige biologische Testung einer molekularen Screeningbibliothek zu vermeiden. Stattdessen erfolgt, geleitet durch Optimierungsalgorithmen, eine "intelligente" Navigation durch den chemischen Raum, um so bevorzugt Substanzen mit gewünschten Eigenschaften auszuwählen. In einer retrospektiven Studie wurden die Optimierungsalgorithmen "Zufallssuche", "Simulated Annealing", "Evolutionsstrategie" und "Partikelschwarmoptimierung" im Hinblick auf den Entwurf von Bibliotheken von Serinproteaseinhibitoren systematischen verglichen. Die Gesamtzahl verfügbarer Substanztestungen wurde auf 300 beschränkt, um Laborbedingungen zu simulieren. Als Ergebnis zeigten sich besonders die Evolutionsstrategien für einen Einsatz in einer Niedrigdurchsatzscreening-Kampagne geeignet, da diese effizient mit großen Populationen und wenigen Iterationen arbeiteten. Der zweite Teil dieser Arbeit beschreibt den erfolgreichen Entwurf einer fokussierten Bibliothek von RNA-Liganden. In einer hybriden, prospektiven Optimierungsstudie wurden nach dem Vorbild einer iterativen Niedrigdurchsatzscreening-Kampagne vom Computer vorgeschlagene Moleküle im Labor getestet. Die Substanzen wurden auf Inhibition einer spezifischen molekularen Wechselwirkung im Replikationszyklus von HIV getestet (Tat-TAR-Interaktion). In vier Generationen wurden 9 von 170 untersuchten Verbindungen positiv auf Inhibition der Tat-TAR-Interaktion getestet (Trefferquote: 5,3%), wobei lediglich 0,089% der Verbindungen der Screeningbibliothek untersucht wurden. Die zwei potentesten Kandidaten wiesen einen IC50 von 51 uM bzw. 116 uM auf.
Ionenkanäle bilden therapeutische Schlüsselstellen für viele Erkrankungen und sind daher vor allem für die pharmakologische und medizinische Forschung von herausragender Bedeutung. Der Forschungsbedarf ist enorm und dementsprechend groß auch die Nachfrage nach elektrophysiologischen Systemen, die eine Analyse von Ionenkanälen und/oder Wirkstoffen im Hochdurchsatz erlauben. Derzeitige Hochdurchsatzsysteme basieren zumeist auf modifizierten Patch-Clamp-Verfahren, weisen aber im Vergleich zu manuellen Patch-Clamp-Systemen noch einige Nachteile auf. In der vorliegenden Arbeit wurde daher im Rahmen eines vom Bundesministerium für Bildung und Forschung geförderten BioChancePlus-Projektes eine alternative Methode, die Fakir-Methode, entwickelt und ihre Einsatzmöglichkeit in Hochdurchsatzsystemen evaluiert. Bei der Fakir-Methode werden Zellen in einem inhomogenen, elektrischen Wechselfeld mit Hilfe dielektrophoretischer Kräfte zu Metallnanoelektroden hin beschleunigt, aufgrund ihrer Bewegungsenergie von letzteren penetriert und dadurch elektrisch kontaktiert. Dies ermöglicht die anschließende, intrazelluläre Messung in physiologischer Lösung. Im Vergleich zur Patch-Clamp-Methode hat die Fakir-Methode die Vorteile, dass das Zytoplasma der Zelle erhalten bleibt und dass mit einer geringen Zelldichte gearbeitet werden kann. Auf der anderen Seite polarisiert die Elektrode schnell und die genaue, intrazelluläre Zusammensetzung während der Messung ist nicht bekannt. Für die Realisierung der Fakir-Methode im Experiment wurde eine Mikrofluidikkammer mit austauschbaren Metallmikro- und Metallnanoelektroden- Chips entwickelt, die die mikroskopische Beobachtung des Kontaktierungsprozesses ermöglichte. Die Charakterisierung der Elektroden erfolgte sowohl durch Potentialmessungen als auch mit Hilfe von Impedanzspektroskopie. Um die dielektrophoretische Attraktion von Zellen genauer steuern zu können, wurde zudem ein Amplitudenmodulator entwickelt. Zellen konnten sowohl einzeln, als auch in Gruppen kontaktiert werden. Intrazelluläre Potentialmessungen von HEK293-Zellen, die den blaulichtgesteuerten Kationenkanal Channelrhodopsin-2 (ChR2) exprimierten, zeigten, dass mit Hilfe der Fakir-Methode von Membranproteinen verursachte Spannungsänderungen gemessen werden können. Beim Fakir-Modell auftretende Schwierigkeiten wurden analysiert und die Ergebnisse genutzt, um ein Konzept für eine hochreproduzierbare Herstellung von Nanoelektroden-Arrays unter Verwendung der 2-Photonenpolymerisations- Technolgie (2PP) zu entwerfen. Für den Einsatz als Biosensoren sind große Zellen besonders geeignet. Eine effektive Vergrößerung von Zellen kann durch die Multi-cell-Elektrofusion erreicht werden. Diese Art der Herstellung von Riesenzellen ist insbesondere deshalb so interessant, weil die Elektrofusion problemlos in ein automatisiertes Mikrofluidiksystem eingebunden werden kann. Neben HEK293-Zellen konnten nach Entwicklung geeigneter Protokolle für die Herstellung von Protoplasten auch Saccharomyces cerevisiae und Pichia pastoris zu Riesenzellen elektrofusioniert werden. Solche Riesenzellen wurden im Rahmen dieser Arbeit biophysikalisch charakterisiert. Neben Kapazitätsmessungen zeigten sowohl die Expression von YFP in den Membranen als auch die Verwendung von fluoresceinhaltiger Patch-Clamp- Pipettenlösung, dass es sich bei den Riesenzellen um einheitliche Kompartimente handelte und somit die gesamte Membranfläche für elektrophysiologische Experimente zur Verfügung stand. Vergleichende Patch-Clamp-Messungen von ChR2-exprimierenden Ursprungs- und Riesenzellen ergaben nicht nur, dass das überexprimierte Protein auch nach der Elektrofusion noch funktional war, sondern auch, dass die Expressionsdichte unverändert blieb. Damit bilden elektrofusionierte Riesenzellen weit über ihre Einsatzmöglichkeiten in Hochdurchsatzsystemen hinaus ein vielversprechendes Werkzeug, um zum Beispiel elektrogene Membranproteine mit geringer Stromamplitude nachzuweisen oder in der giant-inside-out- Konfiguration elektrophysiologische Messungen durchzuführen. Lipophile Anionen können eingesetzt werden, um die elektrischen Eigenschaften der Membranen zu verändern und die Zellstabiliät während des Elektromanipulationsprozesses zu verbessern. Daher wurde für vier verschiedene lipophile Anionen die Spannungsabhängigkeit der Erhöhung der spezifischen Membrankapazität in Patch- Clamp-Experimenten mit HEK293-Zellen analysiert.
Der Cytochrom bc1 Komplex spielt in der mitochondrialen Atmungskette eine zentrale Rolle, er ist am Aufbau des Protonengradienten über die innere Mitochondrien-Membran beteiligt. Die Funktionsweise dieses integralen Membranproteinkomplexes ist trotz mehrerer gelöster Strukturen noch nicht vollständig verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Komplex aus P. denitrificans untersucht und dabei mehrere Beiträge zu Struktur und Funktion dieses bakteriellen Modellsystems geleistet, wie z.B. seinem Oligomerenzustand in Detergenz-gelöster Form und zur Frage der Monomer:Monomer-Interaktion. Zur Strukturaufklärung des Cytochrom bc1 Komplexes aus P. denitrificans wurde ein chimärer Komplex zur Kristallisation eingesetzt, der in der Lage ist ein, Antikörper-Fragment zu binden, das bereits mit Erfolg zur Strukturbestimmung des Hefe-Komplexes verwendet wurde. Diese Experimente führten vermutlich wegen mangelnder Proteinstabilität nicht zum gewünschten Ergebnis. Eine zweite Mutante, bei der eine stark saure Domäne des Cyt c1 deletiert vorliegt (Δac Cytochrom bc1 Komplex), konnte jedoch erfolgreich kristallisiert und Diffraktionsmuster bis etwa 3,5 Ǻ erhalten werden. Die Kristalle weisen derzeit noch Inhomogenitäten, wahrscheinlich durch den Einfrierprozess, auf und werden gegenwärtig weiter optimiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte der lange diskutierte Oligomerenzustand des Cytochrom bc1 Komplexes aus P. denitrificans in solubilisiertem Zustand als Tetramer, beziehungsweise unter Einbeziehung struktureller und mechanistischer Daten und Überlegungen als Dimer eines Dimers, geklärt werden. Dies erfolgte durch eine für Membranproteine neue Form der Massenspektrometrie, die als LILBID-MS bezeichnet wird. Diese Daten konnten die bisher vorläufigen Beobachtungen aus BN-Gelelektrophorese und Gelfiltrationsversuchen eindeutig und unabhängig bestätigen. Darüber hinaus sollten noch Beiträge zur funktionellen Monomer:Monomer-Wechselwirkung geliefert werden. Hierfür wurde zunächst ein P. denitrificans Stamm erzeugt, der stabil zwei unterschiedliche fbc-Operons trägt und exprimiert: eine Wildtyp-Version mit Strep-tag und eine mit einem His-tag und einer inaktivierenden Mutation im Cyt b. Aus diesem Stamm sollte durch eine Tandem-Aufreinigung ein gemischter Cytochrom bc1 Komplex isoliert werden. Dies gelang nicht, wie in Westernblots, turnover und pre-steady-state Aktivitätsuntersuchungen gezeigt wurde, da sich der Komplex als Tetramer erwies und damit eine eindeutige Aufreinigung nicht möglich war. Die Lösung für dieses Problem liegt im Δac Cytochrom bc1 Komplex, der wie LILBID-MS Ergebnisse zeigten, lediglich als Dimer vorliegt; dazu müssen zukünftig die Affinitäts-tags und die inaktivierende Mutation auf diesen Komplex übertragen werden. Der zweite Beitrag zur Funktionsuntersuchung wurde anhand von Mutanten konservierter saurer Aminosäuren und von Tyrosinen im und um das QP-Zentrum geliefert, mit anschließenden Aktivitätsuntersuchungen, Inhibitor-Bindungstudien mit Stigmatellin und elektrochemisch-induzierten Redox-FTIR-Differenzspektren. Die Mutanten E295Q, E81Q und Y297Q zeigten eine verringerte Sensitivität für Stigmatellin. Die FTIR-Differenzspektren belegen, dass die Mutation der Positionen E295 und D278 die Signale für protonierte Seitengruppen verschieben. Die Mutation der Seitengruppen Y302, Y297, E81 und E295 beeinflussen direkt das oxidierte Chinon und das Proteinrückgrat. Die Bedeutung der lange diskutierten Seitengruppe E295 ließ sich als direkter Interaktionspartner mit dem Hydrochinon bestätigen. Die wichtige Rolle der Seitengruppen in Positionen E295 und Y302 konnte bestätigt werden. Darüber hinaus wurden die Seitengruppen D278 und E81 als wesentliche Wechselwirkungspartner für die Hydrochinon-Oxidation identifiziert. Die Seitengruppen des QP-Zentrums unterliegen durch das Wasserstoffbrückennetzwerk starken Wechselwirkungen, wodurch die Bindungstasche eine gewisse Toleranz gegenüber Veränderungen zeigt.
Ein früherer Vorschlag zum Reaktionsmechanismus der DFPase, der eine Wasseraktivierung durch den Rest H287 postulierte, mußte nach neuen experimentellen Daten verworfen werden. Daher lag zu Beginn der hier vorliegenden Arbeit kein Vorschlag für den Mechanismus der DFPase vor, der die experimentellen Daten erklären konnte. Für das längerfristige Ziel, die katalytischen Eigenschaften der DFPase gezielt verändern zu können, war es daher notwendig, zunächst den Mechanismus der Hydrolyse von Verbindungen wie DFP durch die DFPase näher zu untersuchen. Durch computergestützte Modellierung im aktiven Zentrum der DFPase (Docking) wurde die Bindung von DFP und anderen Substraten der DFPase genauer untersucht und mit vorhandenen experimentellen Daten verglichen. Diese Arbeiten führten auch zur theoretischen Untersuchung des Bindungsverhaltens von O,O-Dialkylphosphoroamidaten als potentiellen Inhibitoren der DFPase. Diese den Dialkylfluorophosphaten strukturell sehr ähnlichen Substanzen werden durch die DFPase nicht umgesetzt. Die Ergebnisse der Dockinguntersuchung führten schließlich zu der Synthese von drei Phosphoroamidaten unter der Untersuchung ihres Verhaltens als Inhibitoren der DFPase. DIe Charakterisierung erfolgte dabei über enzymkinetische Methoden sowie NMR-Experimente. Mit dem stärksten Inhibitor O,O-Dicyclopentylphosphoroamidat gelang die Kristallisation eines Komlexes mit der DFPase, der mit der Methode der Röntgenbeugung strukturell bestimmt werden konnte. Dieser Komplex belegt die Bindung der Phosphorylgruppe von Substraten an das katalytisch wirksame Calciumion im aktiven Zentrum der DFPase und zeigt die vorherrschenden Bindungskräfte zwischen Ligand und Protein auf. Eine Reihe von Mutanten der DFPase, bei denen gezielt die koordinierenden Aminosäuren des katalytischen Calciumions verändert wurden, ergänzte die bereits in früheren Arbeiten erzeugten Mutanten. Die katalyischen Eigenschaften dieser Mutanten und ihre Fähigkeit zur Metallbindung gestatten es, diese Metallbindungsstelle genauer zu beschreiben und lassen zusammen mit den Dockingexperimenten und der Struktur des Inhibitor-Enzymkomplexes vermuten, dass der calciumkoordinierende Aminosäurerest D229 als aktives Nukleophil im Reaktionsmechanismus der DFPase fungiert. Diese Vermutung ließ sich mit experimentellen Daten untermauern. Durch 18O-Isotopenmarkierung konnte gezeigt werden, dass ein Sauerstoffatom von D229 auf das entstehende Produkt übertragen wird. Hierdurch konnte die Existenz eines Phosphoenzymintermediats nachgewiesen werden. Des weiteren gelang es, Kristalle der DFPase zu züchten, die für Neutronenbeugungsexperimente geeignet waren. Im Rahmen dieser Experimente gelang die Aufnahme eines vollständigen Datensatzes und die Lösung der Neutronenbeugungsstruktur der DFPase in einer Auflösung von 2,2 Å. Diese Neutronenstruktur, in der Wasserstoffatome im Unterschied zu Röntgenstrukturen gut sichtbar sind, zeigt eindeutig, dass der Rest D229 wie erforderlich deprotoniert und dass das in der Bindungstasche an das Calciumion koordinierende Wassermolekül nicht als Hydroxid vorliegt. Damit ließ sich die direkte Aktivierung von Wasser durch das Metallion ausschließen. Neben wichtigen Informationen über die Bindungstasche der DFPase lieferte die Neutronenstruktur auch detaillierte Einblicke in das Wasserstoffbrückennetzwerk im zentralen, wassergefüllten Tunnel des Proteins. Über die Bestimmung des Wasserstoff/Deuteriumaustausches von Proteinrückgradamiden konnten weitere Aussagen über die Solvenszugänglichkeit von verschiedenen Proteinbereichen gemacht werden. Für die DFPase konnten strukturell und funktionell ähnliche Proteine identifiziert werden. Neben der Paraoxonase 1 waren dies das Calciumbindeprotein Regucalcin aus Agrobacterium thumefaciens sowie das Drug Resistance Protein 35 aus Staphylococcus aureus. Es konnte gezeigt werden, dass diese Proteine eine der katalytischen Calciumbindestelle der DFPase vergleichbare Metallbindestelle aufweisen und verschiedene Enzymaktivitäten dieser Proteine durch einen Mechanismus mit einem zu D229 analogen Nukleophil erklärt werden können. Ein direkter Vergleich zwischen der DFPase und der humanen Paraoxonase gelang durch Untersuchungen mit fluorogenen Organophosphaten als Substrate. Hierbei konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die DFPase in der Lage ist, Substrate mit einer P-O Bindung hydrolytisch zu spalten. Die unterschiedlich gute Umsetzung der verschiedenen Substrate durch die beiden Enzyme konnte auf der Grundlage der Proteinstrukturen erklärt werden, wobei für die Paraoxonase postuliert wurde, dass der calciumbindende Aminosäurerest D269 als zu D229 analoges Nukleophil wirkt. Abschließend gelang es, zusätzlich eine Zusammensetzung für eine Enzympräparation zu finden, die eine Gefriertrocknung der DFPase mit nur geringem Verlust an enzymatischer Aktivität erlaubt. Ein solches lagerstabiles Enzympulver ist ein notwendiger Schritt hin zu einer praktischen Anwendung der DFPase für die technische Dekontamination von hochtoxischen Nervenkampfstoffen.
Poly(pyrazol-1-yl)borate, die sogenannten Skorpionate, repräsentieren eine der etabliertesten Ligandenklassen in der Koordinationschemie und finden aufgrund ihrer Vielseitigkeit zahlreiche Anwendungen. In den letzten Jahren hat sich ein besonderes Interesse an Bis- und Tris(pyrazol-1-yl)boratliganden entwickelt, die mehrere Skorpionateinheiten im selben Molekül vereinen und dadurch kooperative Effekte zwischen den Metallionen fördern. Diese Liganden können sowohl Einsatz in der homogenen Katalyse als auch in den Materialwissenschaften finden. Die bisher in unserer Arbeitsgruppe entwickelten ditopen Bis(pyrazol-1-yl)borate des Typs L (Abb. 3.1) weisen allerdings eine recht hohe Hydrolyseempfindlichkeit auf, deren Ursache wahrscheinlich im elektronenschiebenden Charakter und der Raumerfüllung der Alkylsubstituenten begründet liegt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden daher zunächst die ditopen Skorpionatliganden M2[3] und M2[6] mit Phenyl- und Pentafluorphenylsubstituenten dargestellt, die in darauf folgenden Hydrolysestudien eine im Vergleich zu L erheblich höhere Beständigkeit gegenüber Feuchtigkeit zeigten. Die Umsetzungen der Liganden Li2[Lpara] (Dissertation Dr. Susanne Bieller; Frankfurt 2005) und Li2[6] mit MnII-chlorid verdeutlichten, dass sich das C6F5-substituierte Heteroskorpionat auch in Bezug auf sein koordinationschemisches Verhalten vom tertButyl-substituierten Liganden unterscheidet. Während Li2[Lpara] mit MnCl2 zu einem chlorid-überbrückten, makrozyklischen, dinuklearen Mangankomplex reagiert, wird mit Li2[6] das in Abb. 3.2 dargestellte Koordinationspolymer {(MnCl2)2(Li(THF)3)2[6]}∞ erhalten. Die Ladung der anionischen Polymerkette wird durch Lithium-Gegenionen ausgeglichen. Um die Bildung von diskreten Komplexen einerseits bzw. von Koordinationspolymeren andererseits gezielt steuern zu können, wurden die mit sterisch anspruchsvollen Pyrazolylsubstituenten versehenen Liganden M2[4], M2[5] und M2[7] (Abb. 3.1) dargestellt. Im Zuge der Kristallisation von Li2[4] zeigte sich, dass diese Verbindung eine hohe Affinität für Chloridionen besitzt. Auch in Anwesenheit eines Überschusses Kronenether führen Spuren des Halogenids zur Ausbildung des in Abb 3.3 gezeigten dinuklearen, chloridverbrückten Lithiumkomplexes Li2Cl[4]. Die ausgeprägte Komplexbildungstendenz lässt Li2Cl[4] im Hinblick auf die Entwicklung von Anionenrezeptoren interessant erscheinen. Komplexe, in denen zwei Metallionen durch zwei Heteroskorpionatliganden in eine makrozyklische Struktur eingebunden werden (Tmeta/para in Abb. 3.4), konnten im Rahmen dieser Arbeit nicht isoliert werden. Ein Hinweis, warum dieses Strukturmotiv ungünstig sein könnte, wurde durch die Charakterisierung des auf einem partiell hydrolysierten Derivat von Li2[Lpara] beruhenden CoII-Makrozyklus Co2[23]2 erhalten. Die Analyse der Strukturparameter dieser Verbindung deutet an, dass die Bildung eines Makrozyklus im Fallder unhydrolysierten Heteroskorpionate aufgrund sterischer Wechselwirkungen zwischen den Pyrazolylringen und der Phenylenbrücke benachteiligt sein sollte. Obwohl zwischen Aryl- und Alkyl-basierte n Heteroskorpionaten erhebliche Unterschiede hinsichtlich ihrer Neigung zur hydrolytischen Zersetzung erkennbar sind, zeigen beide Ligandentypen ähnliche Labilitäten gegenüber der stark Lewis-aziden Verbindung Brommanganpentacarbonyl. Die Reaktionen von Li2[Lpara], Li2[3] und Li2[6] mit Mn(CO)5Br führten zur Spaltung von B-N-Bindungen, die in allen drei Fällen durch Kristallisation des in Abb. 3.5 gezeigten, pyrazolid-verbrückten MnI-Carbonylkomplexes 21 dokumentiert werden konnte. Im Gegensatz zu den Heteroskorpionatliganden zeigen oligotope phenylenverknüpfte Homoskorpionate keine Tendenz, sich unter dem Einfluss von Mn(CO)5Br zu zersetzen. Reaktionen der di- und tritopen Tris(pyrazol-1-yl)borate Li2[15], Li2[16] und Li3[18] lieferten die in Abb. 3.6 dargestellten Mangantricarbonylkomplexe (Mn(CO)3)2[15], (Mn(CO)3)2[16] und (Mn(CO)3)3[18] in guten Ausbeuten. Neben der Darstellung dieser, für materialwissenschaftliche Fragestellungen (Koordinationspolymere, Metallorganische Netzwerke) interessanten Liganden, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit auch der Frage nachgegangen, ob die Verknüpfung zweier Heteroskorpionateinheiten Auswirkungen auf die katalytische Aktivität entsprechender Rhodium-Cyclooctadien-Komplexe in der Polymerisation von Phenylacetylen hat. Sterisch anspruchsvolle Pyrazolylsubstituenten tragende monotope Rhodium-Cyclooctadien- Skorpionatkomplexe konnten in dieser Reaktion bereits erfolgreich als Katalysatoren eingesetzt werden und lieferten regioselektiv cis-transoid-verknüpftes Poly(phenylacetylen). Zunächst wurden die in Abb. 3.7 dargestellten Rhodiumkomplexe (Rh(cod))2[3] und (Rh(cod))2[6] von Bis(pyrazol-1-yl)boraten, die keine sterisch anspruchsvollen Pyrazolylsubstituenten tragen, synthetisiert. Ähnlich wie der analoge einkernige Komplex Rh(cod)[H2Bpz2 ] zeigten (Rh(cod))2[3] und (Rh(cod))2[6] keinerlei katalytische Aktivität. Daher sollten im Anschluss die mit Phenylpyrazolylgruppen ausgestatteten Derivate (Rh(cod))2[5] und (Rh(cod))2[7] synthetisiert und im katalytischen Prozess eingesetzt werden. Im Verlauf dieser Experimente stellte sich heraus, dass die Reaktionen der Alkalimetallskorpionate Li2[5] und K2[7] mit (Rh(Cl)(cod))2 nicht zu den Zielverbindungen, sondern zur Zersetzung der Ligandgerüste führen. In beiden Fällen konnte das Abbauprodukt 22 isoliert werden (Abb. 3.8). Weitere Untersuchungen ergaben, dass 22 in der Lage ist, Phenylacetylen in guten Ausbeuten und regioselektiv (cis-transoid-verknüpftes Poly(phenylacetylen)) zu polymerisieren. 22 stellt somit ein gut zugängliches und leicht zu modifizierendes Katalysatorsystem dar, dessen Optimierung Thema zukünftiger Untersuchungen sein wird.
Ferrocenbasierte Polymere stellen interessante Verbindungen dar. Sie weisen herausragende optische und/oder elektronische Eigenschaften auf, die sich auf die redoxaktiven Eisenionen sowie die kooperativen Effekte entlang des Polymerstrangs zurückführen lassen. Befindet sich Ferrocen in der Hauptkette und sind die Ferrocenbausteine jeweils über ein einzelnes Atom miteinander verbunden, so ist dieses Brückenelement maßgebend für die substanzspezifischen Merkmale des Makromoleküls. Während bereits effiziente Syntheserouten bekannt sind, auf denen sich Atome der Gruppen 14 bis 16 in die Brücke einführen lassen, bereitet die Synthese borverbrückter Poly(ferrocenylene) große Schwierigkeiten. Gerade diese Stoffklasse wäre aber besonders attraktiv, da Boratome sowohl dreifach als auch vierfach koordiniert vorliegen können und über diese Eigenschaft das Ausmaß der elektronischen Wechselwirkungen entlang des Polymerrückgrats ebenso wie die Struktur des Makromoleküls gezielt beeinflussbar ist. Vor diesem Hintergrund galt es im Rahmen der vorliegenden Arbeit, chemisch stabile Poly(ferrocenylene) mit tetrakoordinierten anionischen Boratbrücken darzustellen. Als Grundlage diente die Adduktbildung zwischen lewissauren 1 ,1'-fc(BRz)zDerivaten und dem lewisbasischen doppelt deprotonierten Ferrocen 1,1 '-fcLi2 x 2/3 TMEDA. Frühere Untersuchungen an BMez-verbrückten di- (35) und tri nuklearen (36) Ferrocenkomplexen haben gezeigt, dass diese Verbindungen extrem empfindlich gegenüber Luft und Feuchtigkeit sind. Auch mussten cyclovoltammetrische Messungen an 35 bzw. 36 bei tiefen Temperaturen (-78 Oe) durchgeführt werden, um zu verhindern, dass es zu einer Zersetzung der Moleküle im Zuge der Fe{fI)Oxidation kam. Im Rahmen dieser Arbeit sind Systeme dargestellt worden, bei denen die labilen BMe2-Gruppen durch BPh2- bzw. Borafluorenylbrücken ersetzt sind. An mononuklearen Verbindungen konnten (Diphenylboryl)ferrocen 57, 1, 1'MBis(diphenylboryl) ferrocen 58 und 9-Ferrocenyl-9-borafluoren 61 isoliert und voIlständig charakterisiert werden (Abb. 53). ....
Diese Arbeit teilt sich in zwei Themenblöcke, deren zentrales Element Borat-Anionen darstellen, die unterschiedlichste Funktionen erfüllen. Durch entsprechende Wahl der Substituenten am Bor können sowohl Anionen mit schwach koordinierenden Eigenschaften erzeugt werden, als auch Borate, die sich zum Einsatz als Ligand in der Koordinationschemie eignen. ...
Mit den in dieser Arbeit entwickelten und getesteten Nachweismethoden konnte in verschiedenen Marktstudien gezeigt werden, dass sowohl molekularbiologische als auch immunologische Verfahren für den Nachweis von versteckten Allergenen in Lebensmitteln geeignet und auch miteinander vergleichbar sind. Dies wurde in zwei Studien deutlich, in denen beide Methoden sowohl für den Haselnuss- bzw. Erdnussnachweis miteinander verglichen wurden. In beiden Studien wurde eine sehr gute Übereinstimmung der beiden Verfahren gefunden. Nur in Einzelfällen gab zwischen beiden Methoden Abweichungen im Resultat, was aber fast ausschließlich Proben betraf, die einen sehr geringen Anteil (ca. 10 ppm Protein) Haselnuss bzw. Erdnuss enthielten. Damit konnte erstmals im direkten Vergleich gezeigt werden, dass PCR-basierte Methoden für den Allergennachweis in prozessierten Lebensmitteln genauso gut geeignet sind, wie antikörperbasierte Methoden. Allerdings besteht bis zum heutigen Zeitpunkt das Problem solche Anteile korrekt zu quantifizieren, da es an Referenzmaterialien mangelt, die es ermöglichen würden einen Mengenstandard für ein quantitatives Verfahren herzustellen. Momentan sind quantitative Messungen nur exakt möglich, wenn die zu untersuchende Lebensmittelmatrix genau bekannt ist und ein entsprechender Standard generiert werden kann. Trotzdem bieten beide Verfahren die Möglichkeit prozessierte Lebensmittel sehr empfindlich auf allergene Bestandteile zu untersuchen, um somit sicherzustellen dass die aktuellen gesetzlichen Regelungen und Richtlinien für die Etikettierung von Lebensmitteln, wie die EU-Richtlinie 2006/146/EU bzw. die Lebensmittelkennzeichnungsverordnung (LMKV), von den Lebensmittelherstellern eingehalten werden. Weiterhin bieten die etablierten Nachweismethoden den Herstellern die Möglichkeit, ihre Produktion im Hinblick auf potenzielle Kontaminationsrisiken mit allergenen Zutaten zu überprüfen bzw. die Effizienz der verwendeten Reinigungsmethoden einzuschätzen. Dies wurde erstmals im Rahmen an einer Modellstudie in Zusammenarbeit mit einem Aromenhersteller durchgeführt. In dieser Studie sollte die Effizienz von verschiedenen Reinigungsprozeduren hinsichtlich der Kontaminationsgefahr von allergenfreien Nachfolgeprodukten überprüft werden. Es konnte gezeigt werden, dass der verwendete Reinigungsprozess sehr effektiv abläuft und nicht mit Kontaminationen gerechnet werden muss. Diese Studie hat exemplarisch gezeigt, dass es möglich ist, allergenspezifische Nachweismethoden in einem Betrieb einzusetzen, um die Belastung der Produktionsanlage und der hergestellten Produkte mit potenziellen Allergenen zu überwachen. Prinzipiell sollte es also möglich sein allergenspezifische HAACCP Konzepte innerhalb eines Betriebes zu etablieren, um so die Produktsicherheit noch weiter zu verbessern. Abschließend kann man sagen, dass die Entwicklung von allergenspezifischen Nachweismethoden einen wichtigen Beitrag zur Gewährleistung der Lebensmittelsicherheit darstellt. Nicht nur dass diese Methoden wichtig sind, um bestehendes Recht zu überwachen, sie sind auch für die Lebensmittelproduzenten ein wichtiges Werkzeug die Qualität ihrer Produkte zu erhöhen.
Eine weltweite Veränderung der Lebensweise hat eine Zunahme der Anzahl adipöser Menschen und damit ein verstärktes Auftreten von Typ 2 Diabetes mellitus zur Folge. Eine häufig auftretende Komplikation dieser Erkrankung ist das diabetische Fußulkus, dessen molekularen und zellbiologischen Grundlagen weitestgehend unbekannt sind. Für einen normalen Wundheilungsverlauf ist ein Zusammenspiel vieler Wachstumsfaktoren und Zytokine essentiell. Auch die Insulinsensitivität der Haut scheint von großer Bedeutung zu sein. Die Funktionen von Insulin im Wundheilungsprozess und in der Haut sind weitestgehend unerforscht. Um ein besseres Verständnis für die Bedeutung von Insulin in der Wundheilung zu erhalten, bestand das Ziel dieser Arbeit in der Analyse eines Insulin-regulierten Enzyms in der Haut, der HMG-CoA-Reduktase, während des Heilungsprozesses normaler sowie diabetisch chronischer Wunden. Die HMG-CoA-Reduktase katalysiert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt im Mevalonat-Stoffwechselweg und ist somit indirekt an vielen zellulären Ereignissen beteiligt. Die Verletzung von murinem Hautgewebe führte zu einem Anstieg der HMG-CoA-Reduktase-mRNA-Expression an Tag 3 und an Tag 13 nach Verletzung. Die Lokalisation der HMG-CoA-Reduktase im Wundgewebe zeigte, dass insbesondere die am Wundrand gelegenen Keratinozyten durch eine besonders starke mRNA-Expression des Enzyms charakterisiert waren. Im Gegensatz dazu konnte im diabetischen, chronischen Wundgewebe keine Regulation der mRNA-Expression der HMG-CoA-Reduktase detektiert werden. Wundheilungsrelevante Faktoren, wie Insulin und EGF, induzierten die mRNA-Expression der HMG-CoA-Reduktase in HaCaT-Keratinozyten (in vitro). Für die Insulin-vermittelte mRNA-Induktion konnte gezeigt werden, dass der Transkriptionsfaktor SREBP2 für die Transkription des Gens essentiell war. Neben einer erhöhten Transkription der HMG-CoA-Reduktase wurde ebenfalls eine gesteigerte Enzymaktivität nach Insulin- oder EGF-Stimulation detektiert. Die Induktion der Insulin-vermittelten HMG-CoA-Reduktase-Aktivität stand in einem funktionellen Zusammenhang zur Biosynthese des angiogenen Faktors VEGF. Der Einfluss der HMG-CoA-Reduktase auf die VEGF-Biosynthese war posttranskriptionell über die Phosphorylierung des eIF4E-BP1 vermittelt. Auch im tierexperimentellen Modell (in vivo) konnte durch eine Statin-Behandlung bei Mäusen gezeigt werden, dass die Enzymaktivität der HMG-CoA-Reduktase in Keratinozyten für eine normale VEGF-Expression essentiell war. Die VEGF-Synthese wurde von der Aktivität der HMG-CoA-Reduktase in vivo, wie in vitro nach Insulin-Stimulation, posttranskriptionell beeinflusst. Die Analyse weiterer wundheilungsrelevanter Vorgänge ergab, dass eine Inhibierung der HMG-CoA-Reduktase in vivo wie in vitro eine Verringerung der Keratinozytenproliferation zur Folge hatte. Die Keratinozytenproliferation ist ein wichtiger Vorgang bei der Reepithelisierung einer Wunde. Ist das Wundareal durch Keratinozyten geschlossen, beginnt die Differenzierung der Zellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit konnten zeigen, dass der Differenzierungsprozess von Keratinozyten in vitro mit einer Induktion der HMG-CoA Redukase Aktivität assoziiert war. Eine Hemmung der Enzymaktivität hatte eine Inhibierung der mRNA-Expression von Keratinozyten-Differenzierungsmarkern, wie Involucrin, Filaggrin und Keratin 1 zur Folge. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass die HMG-CoA-Reduktase wichtige Prozesse, wie Wundangiogenese und Keratinozytenproliferation, im kutanen Wundheilungsverlauf beeinflusst.
Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, die über die 1,´-Position phenylenverbrückten Bis(silolyl)verbindungen 120, 123, 125, 156, 158, 160, 135, 137 und 139, sowie die entsprechenden Phenylsilole 126, 163 und 141 (siehe Schema 4.1) zu synthetisieren und NMR-spektroskopisch, massenspektroskopisch und zum Teil auch durch Kristallstrukturen zu charakterisieren. Weiterhin ist es gelungen eine über die 3,3´-Position verknüpfte phenylenverbrückte Bis(silolyl)verbindung 175, sowie auch die Vorstufe zu einer 2,2´-verknüpften Bis(silolyl)verbindung 177 zu synthetisieren und zweifelsfrei zu charakterisieren.
Der Typ I Interferonrezeptor, der aus den Transmembranproteinen ifnar1 und ifnar2 besteht, nimmt eine wichtige Rolle bei der angeborenen und erworbenen Immunantwort ein. Durch Bindung von Typ I Interferonen werden antivirale, antiproliferative und immunmodulatorische Aktivitäten in der Zelle induziert. Die Wirkung der Interferone wird bereits bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten eingesetzt. Es ist bislang nicht bekannt, wie die verschiedenen Typ I Interferone nach Bindung an einen gemeinsamen Rezeptor, unterschiedliche Zellantworten induzieren. So unterscheiden die Typ I Interferone sich nicht hinsichtlich ihrer Bindungsstelle oder der Stöchiometrie der Bindung an ifnar1 bzw. ifnar2. Sie weisen jedoch unterschiedliche Affinitäten zu den Rezeptoruntereinheiten auf, wobei ihnen eine niedrigere Affinität zu ifnar1 gemeinsam ist. Bislang konnte keine Interaktion zwischen den Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen werden. Es wird angenommen, dass bei der Rezeptorassemblierung das Interferon zunächst an ifnar2 bindet und anschließend ifnar1 rekrutiert. Es wird postuliert, dass die unterschiedlichen Zellantworten für verschiedene Typ I Interferone auf Unterschieden in der Stabilität der ternären Komplexe beruhen könnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die Struktur und Dynamik des Interferonrezeptors in vitro für die Typ I Interferone IFNa2 und IFNb charakterisiert. Die Struktur des ternären Komplexes aus den extrazellulären Domänen von ifnar1 und ifnar2 mit IFNa2 wurde mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Über Einzelpartikelanalyse aufgereinigter Komplexe von IFN mit den extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) konnte ein Strukturmodell des ternären Komplexes erstellt werden. Dieses zeigte eine Verschiebung der membranproximalen Domänen von ifnar1-EC und ifnar2-EC wie sie bereits für den Rezeptor für Erythropoietin und den Wachstumsfaktor beobachtet wurden, welche zu den Typ I Zytokinrezeptoren gehören. Die Struktur des ternären Komplexes ermöglicht als erste Struktur eines Typ II Zytokinrezeptors einen Einblick in die Architektur des Komplexes und mögliche Aktivierungsmechanismen. Die Strukturen der Komplexe für die verschiedenen Typ I Interferone IFNa2 und IFNb wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf, was auf einen gemeinsamen Aktivierungsmechanismus hinweist. Temperatur-abhängige Messungen von Bindungskinetik und –affinität ergaben sehr unterschiedliche Energiehyperflächen für die Ligandenbindung an ifnar1- und ifnar2-EC, und wiesen auf einen mehrstufigen Prozess und mögliche Konformationsänderungen bei der Bindung an ifnar1-EC hin. Zur Analyse der Dynamik von ifnar1-EC wurden daher verschiedene fluoreszenzbasierte Assays etabliert. Eine besondere Herausforderung bestand darin, das Protein ortsspezifisch und stöchiometrisch mit zwei verschiedenen Fluorophoren zu koppeln. Ifnar1-EC wurde an verschiedenen Stellen kovalent mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Es wurde gezeigt, dass nach Bindung eines geeigneten tris-NTA-Fluorophor-Konjugats an den C-terminalen His-Tag die Fluoreszenz abstandsabhägig durch Förster-Resonanz-Energie-Transfer gelöscht wurde. Für ifnar1-EC wurde eine ligandeninduzierte Abstandsänderung detektiert. Die detaillierte Analyse ergab nach Bindung von IFNa2 eine Abstandszunahme von 13 A vom N- zum C-Terminus. Durch die Interferonbindung nimmt demnach ifnar1-EC eine gestrecktere Konformation ein. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in Anwesenheit von ifnar2-EC und für IFNb erhalten. Die Einzelmolekülanalysen mittels Fluoreszenz Korrelationsspektroskopie (FCS) zeigten sowohl einen Verlust der Flexibilität von ifnar1-EC nach Ligandenbindung als auch ein ligandeninduziertes Rearangement der Ig-ähnlichen Domänen. Die Änderung der Flexibilität wurde durch Messungen der Fluoreszenzlebensdauer bestätigt. Untersuchungen der Kinetik der Ligand-induzierten Konformationsänderung mittels Stopped-Flow Messungen bestätigten eine mehrstufige Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen nach Ligandenbindung. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass sich nach Ligandenbindung die Zugänglichkeit des Tryptophans in der membranproximalen Domäne von ifnar1-EC ändert. Da die membranproximale Domäne nicht bei der Ligandenbindung beteiligt ist, deutet dieser Effekt auf eine Propagation der Ligand-induzierten Konformationsänderung in diese Domäne hin. Das Tryptophan könnte mit der Membran interagieren, was auf eine wichtige Rolle der membranproximalen Domäne für die korrekte Orientierung von ifnar1 in der Membran hindeut. Die Stopped-Flow Analyse zeigte, dass es sich hierbei um einen einstufigen Prozess handelt, der mit der Interferonbindung korreliert. Die Ergebnisse wiesen insgesamt auf eine Ligand-induzierte Flexibilitätsänderung und Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen bei ifnar1-EC hin. Vermutlich wird nach Ligandenbindung das Signal in die membranproximale Domäne von ifnar1-EC propagiert. Die Strukturen der ternären Komplexe mit den verschiedenen Typ I Interferonen wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf. Auch die Ergebnisse der fluoreszenzbasierten Assays zeigten keine Unterschiede für IFNa2 und IFNb, was die Hypothese stützt, dass die differentielle Aktivität der Interferone nicht auf grundsätzlichen Unterschieden in der Architektur des ternären Komplexes beruht, sondern in der unterschiedlichen Dynamik der Komplexe codiert sein könnte.
Untersuchung von Rezeptor-Ligand-Komplexen mittels organischer Synthese und NMR-Spektroskopie
(2008)
Viele biologische Prozesse basieren auf der spezifischen Bindung eines Liganden an einen Rezeptor. Die Wechselwirkung zwischen dem Rezeptor und seinem Ligand kann im Wesentlichen durch zwei verschiedene Modelle beschrieben werden: zum einen das vom E. Fischer eingeführte Schlüssel-Schloss-Prinzip und zum anderen das von Koshland beschriebene "induced-fit-model". Bei dem Schlüssel-Schloss-Prinzip liegt der Ligand in der Bindetasche des Rezeptors wie ein Schlüssel im Schloss. Ganz anders hierzu setzt die induzierte Anpassung ("induced-fit-model") eine konformationelle Änderung des Proteins durch den Liganden für die Bindung voraus. Ändern sich jedoch die Konformationen von Substrat und Rezeptor in einer gegenseitigen Beeinflussung, dann spricht man von "double-induced-fitmodel". Die Untersuchung dieser Erkennung auf molekularer Ebene ist von großer Wichtigkeit, denn sie dient zum besseren Verständnis und damit auch zur gezielten Beeinflussung solcher Prozesse. Wie wird der Ligand von einem Rezeptor selektiv erkannt und gebunden? Für die Erkennung und Bindung spielen spezifische nichtkovalente Wechselwirkungen eine wichtige Rolle. Zum Repertoire der nichtkovalenten Wechselwirkungen gehören die elektrostatische Wechselwirkungen, die Wasserstoffbrückenbindung und der hydrophobe Effekt.
In der vorliegenden Arbeit werden anhand von drei ausgewählten Beispielen solche Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Liganden mit ihrem Rezeptor untersucht. In den ersten beiden Kapiteln werden Proteine und im letzten Kapitel RNA als Rezeptor untersucht. Die einzelnen Kapitel beginnen jeweils mit einer kurzen Einführung der Rezeptoren und der dazugehörenden Liganden, schließlich wird dann die Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung beschrieben. Als Rezeptor wurden in der vorliegenden Arbeit Proteine (Kinasen und Membranproteine) und strukturierten Elemente der RNA (Aptamerdomäne der purinbindenden Riboswitche und der SELEX-RNA) gewählt. Membranproteine der Atmungskette, Kinasen und Riboswitches stellen zusätzlich attraktive Rezeptoren für das Wirkstoffdesign dar. Die damit interferierenden Liganden umfassen Substrate, Cofaktoren, Metabolite und Inhibitoren. Die Untersuchung der Wechselwirkung erfolgte mittels NMR-Spektroskopie und organischer Synthese.
In den letzten 25 Jahren HIV-Forschung wurden einige Medikamente entwickelt, die in der Lage sind, den Ausbruch der Krankheit AIDS hinauszuzögern. Als Gemeinsamkeit dieser Arzneimittel ist die Interaktion mit regulatorischen Proteinen des HIV-Lebenscyclus zu erwähnen. In den letzten Jahren intensivierte sich jedoch auch die Forschung auf RNA als Angriffsort für Wirkstoffe, da sie in zahlreichen biochemischen Prozessen involviert ist. Aufgrund der vielfältigen Sekundär- und Tertiärstruktur der RNA bietet sie Bindungsstellen für Proteine, Antibiotika und weitere kleine Moleküle. Die Affinität zwischen RNA und dem Liganden, z.B. einem Peptid, basiert auf Wasserstoffbrücken, Coulombschen Kräften und Stapelwechselwirkungen. Das Konzept dieser Arbeit bestand darin, peptidische RNA-Liganden zu entwickeln, die u.a. aufgrund von Stacking mit den Nucleobasen der RNA eine starke Bindung eingehen. In Anbetracht der Tatsache, dass lediglich vier unterschiedliche natürliche aromatische Aminosäuren existieren, wurden Synthesewege entwickelt, um eine Vielfalt nicht-natürlicher Bausteine zu gewährleisten. In diesem Projekt wurden (L)-Methionin bzw. (L)-Glutaminsäure als chirale Ausgangsverbindungen, in Abhängigkeit von der benötigten Seitenkettenlänge (C2 für Met, C3 für Glu), verwendet. Der Schlüsselschritt in beiden Syntheserouten ist mit der Heck- bzw. Negishi- Kupplung eine Übergangsmetall-katalysierte C-C-Knüpfungsreaktion. Auf beiden Wegen konnten in zehn Stufen Fmoc-geschützte -Aminosäuren dargestellt werden. Diese Bausteine wurden zusammen mit natürlichen Aminosäuren zu peptidischen Bibliotheken aufgebaut, die entweder über kombinatorische oder parallele Festphasensynthese hergestellt wurden. Über homogene Assays wurden die besten RNA-Binder identifiziert. In ersten Experimenten wurden ausgewählte Peptide auf ihre Affinität zum TAR-Element von HIV-1 untersucht. Ein Farbstoff-markiertes Tat-Peptid wurde in dieser Anwendung vom Test- Liganden verdrängt. Alternativ konnte über die Fluoreszenz der Pyren-Peptide eine direkte Bestimmung von Bindungskonstanten erfolgen. Mit dem Tripeptid 172 (IC50 = 900 nM, Kd = 50 nM) konnte eine vielversprechende Verbindung identifiziert werden. In Untersuchungen mit HIV-1-infizierten HeLa-P4- (IC50 = 125 microM) bzw. MT-4-Zellen (EC50 = 46 microM) wurde die antivirale Eigenschaft von 172 bewiesen. Des Weiteren wurden u.a. für das Peptid 172 antimikrobielle Tests gegen B. subtilis (MIC = 22 microM) und S. aureus (MIC = 31 microM) durchgeführt.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von Nanopartikeln als Trägersysteme für nukleosidische Arzneistoffe. Ihr Einsatz verhindert z.B. die Degradierung der Nukleoside und verbessert ihre Aufnahme in Zellen. Die Partikel wurden aus humanem Serumalbumin (HSA) durch Desolvatation hergestellt und mittels Glutaraldehyd stabilisiert. Durch die Kopplung von Trastuzumab an die Partikeloberfläche können HER2-überexprimierende Brustkrebszellen spezifisch erreicht werden. Bindet der Antikörper an den HER2-Rezeptor, kommt es zu einer Internalisierung des Ligand-ezeptorkomplexes und an den Liganden gebundene Partikel werden zusammen mit dem Komplex in die Zellen aufgenommen. Die Kopplung von Trastuzumab an die Oberfläche der HSA-Nanopartikel über eine Thioetherbindung war sehr effizient und stabil.Die Stabilität von Partikelsystemen über lange Lagerzeiten kann durch Gefriertrocknung erhöht werden. Zur Gefriertrocknung trastuzumabmodifizierter Partikel wurden Trehalose, Sucrose und Mannitol in Konzentrationen bis 5% als Hilfsstoffe eingesetzt. Trehalose und Sucrose waren bereits in einer Konzentration von 3% in der Lage, die physikochemischen Eigenschaften der Partikel direkt nach der Gefriertrocknung zu erhalten, die Partikel waren aber nicht lagerfähig. Mit Mannitol war dies direkt nach der Gefriertrocknung auch bei einer Konzentration von 5% nicht in gleichem Umfang möglich, die Partikel konnten aber am besten gelagert werden. Als nukleosidische Wirkstoffe wurden In die Matrix von HSA-Nanopartikeln unter anderem Antisenseoligonukleotide (ASOs) eingebettet. Das inkorporierte ASO P12 gehört zur Gruppe der Phosphorothioate (PTOs) und bewirkt eine Reduktion der Polo-like Kinase 1 (Plk1) auf mRNA- und Proteinebene. Plk1 ist wesentlich an der Zellteilung beteiligt und wird in vielen Tumoren überexprimiert, eine Hemmung von Plk1 führt zur Apoptose der Zellen. Damit das PTO eine Wirkung zeigen kann, muss es intrazellulär aus den Partikeln freigesetzt werden. Deshalb wurden die Partikel enzymatisch abgebaut. Die Wiederfindung der PTOs aus der abgebauten Partikelmatrix betrug maximal 30% und war von der Menge des zur Partikelstabilisierung verwendeten Glutaraldehyds abhängig. Je mehr Glutaraldehyd verwendet worden war, desto schlechter war die Wiederfindung. Eventuell werden die PTOs durch Glutaraldehyd inaktiviert, indem es zu einer Quervernetzung untereinander oder mit Albuminmolekülen kommt. Dennoch konnte in Brustkrebszelllinien eine biologische Wirkung der PTO-beladenen Partikelsysteme gezeigt werden. P12-beladene, trastuzumabmodifizierte Partikel wurden zeitabhängig und rezeptorvermittelt HER2-überexprimierende Zellen aufgenommen. Die Partikel reduzierten die Menge der Plk1-mRNA signifikant. Dies ging mit einer ebenfalls signifikanten Reduktion der Plk1-Proteinmenge einher. Die Folge der Plk1-Reduktion war eine Aktivierung der Caspasen 3 und 7, die die Induktion der Apopotose zeigte. Plk1 kann nicht nur durch PTOs, sondern auch durch Plasmid-DNA, die small hairpin RNA (shRNA) gegen Plk1 exprimiert, gehemmt werden. Die Plasmide blieben bei der Einbettung in die Partikelmatrix intakt, allerdings trat eine Umformung von der supercoiled in die lineare und zirkuläre Form auf. Auch plasmidbeladene, trastuzumabmodifizierte Partikel wurden zeitabhängig und rezeptorvermittelt in HER2-überexprimierende Zelllinien aufgenommen und führten dort zu einer signifikanten Reduktion der Plk1-Proteinmenge. Als weiterer nukleosidischer Wirkstoff wurde noch eine siRNA gegen Plk1 in die HSA-Partikel inkorporiert. Mit siRNA-beladenen Nanopartikeln konnte ebenfalls eine signifikante Reduktion der Plk1-mRNA- und –Proteinmenge beobachtet werden. Partikel aus HSA können nicht nur durch den Einsatz von Glutaraldehyd stabilisiert werden, eine thermische Quervernetzung der Partikelmatrix ist ebenfalls möglich. Die besten physikochemischen Eigenschaften PTO-beladener Partikel wurden bei einer Quervernetzungstemperatur von 105°C über 10 min erzielt. Wurden diese Partikel enzymatisch abgebaut und das PTO aus der Partikelmatrix bestimmt, so konnten bis zu 80% des eingebetteten PTOs intakt detektiert werden. Allerdings waren die Partikel weniger stabil als chemisch quervernetzte Partikel. Bei einer Einlagerung über 6 Wochen stieg der Partikeldurchmesser an, 25% des eingebetteten P12s wurden aus der Matrix freigesetzt und bis zu 20% des Trastuzumabs wurden von der Oberfläche abgelöst. Dennoch war die Reduktion der Plk1-mRNA- und –Proteinmenge in der Zellkultur signifikant und mit der von chemisch stabilisierten Partikeln vergleichbar. Trastuzumabmodifizierte HSA-Nanopartikel stellen somit ein geeignetes Trägersystem für nukleosidische Arzneistoffe dar und führen zu einer spezifischen Wirkung in HER2-überexprimierenden Brustkrebszellen.
In der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, OTS-, MPTMS-, und MPTMS/OTS gemischte SAMs aus der Lösung auf SC-1 chemisch oxidierten Siliziumwafern („SiO2“) zu präparieren. Die Adsorption der OTS oder MPTMS SAMs auf SiO2 wird von zwei konkurrierenden Reaktionen bestimmt, d.h. „Selbstaggregation” in der Ausgangslösung und “Oberflächendehydration” des SiO2 -Substrates. Die beiden Alkylsiloxan-SAMs weisen unterschiedliches Bildungsverhalten auf. Die Reifungsdauer der Ausgangslösung vor der Adsorption wirkt sich signifikant auf die Bildung der OTS SAMs aus, demgegenüber ist bei MPTMS SAMs kein Einfluß zu beobachten. Für OTS SAMs sind große Dendriten oftmals von kleinen Rundinseln umgeben, dagegen für MPTMS SAMs treten prinzipiell nur sporadisch verteilte kleine Rundinseln auf. Die Abwesenheit des Chlor-Signals in XPS-Spektren bestätigt, dass innerhalb der Adsorption die Si-Cl Bindungen der OTS-Moleküle zum größten Teil hydrolysiert werden. Doch für MPTMS SAMs ist in C 1s-Spektren ein Peak bei 286.4 eV, der der unhydrolysierten Si-OCH3 Bindung entspricht, zu beobachten. Die Hydrolysefähigkeit der Si-Cl Bindung des OTS ist erwartungsgemäß stärker als jene der Si-OCH3 Bindung des MPTMS. Diese Tendenz samt dem Unterschied in der Alkylkettenlänge wirkt sich beträchtlich auf die Bildung und die Morphologie der adsorbierten Inseln aus. Bei gleicher Konzentration (5 mM) und Reifungsdauer der Ausgangslösung bilden sich OTS SAMs viel schneller als MPTMS SAMs bei Raumtemperatur. Sie hat auch eine größere Oberflächenbedeckung wegen der seitlichen Vernetzung zur Folge. Diese Beobachtung zeigt eine prognostizierbare kinetische Schwierigkeit zur Präparation der OTS/MPTMS gemischten SAMs durch Koadsorption. Grund hierfür ist, dass die Adsorption voraussichtlich von OTS-Molekülen dominiert wird. Darüber hinaus ist Aggregation zwischen hydrolysierten OTS- und MPTMS-Molekülen nicht ausgeschlossen. Neben der Koadsorption steht in der zweistufigen Adsorption ein weiteres herkömmliches Verfahren zur Verfügung. Das Endprodukt kann nach der Reaktionsreihe der Silane mit „OTS+MPTMS“ oder „MPTMS+OTS“ gemischte SAMs bezeichnet werden. Unter Berücksichtigung der individuellen Oberflächenbedeckung und Morphologie wurde eine Rezeptur aufgestellt, in der die Adsorption jeweils höchstens 30s (für OTS) und 20 min (für MPTMS) dauert. Angesichts der vielfältigen Inselstruktur, d.h. Monoschicht, polymerisierte Bälle, und sogar Multischicht, ist eine Phasenunterscheidung nach der Dicke, z.B. mittels AFM, nicht zu erwarten. Die Existenz der lateralen unvernetzten Si-OH Gruppen der adsorbierten OTS-Inseln könnte die Präparation der homogenen OTS+MPTMS gemischten SAMs erschweren. In diesem Fall ist es fraglich, ob die hydrolysierten MPTMS-Moleküle vollständig wie geplant mit oberflächnahen OH-Gruppen von SiO2 reagieren. Mit einer umgekehrten Reaktionsreihe löst sich das Problem von selbst, da die adsorbierten MPTMS-Inseln hauptsächlich unhydrolysierte seitliche Si-OCH3 Gruppen besitzen. Die morphologische Erkennbarkeit unterstützt die Machbarkeit der Präparation der MPTMS+OTS gemischten SAMs. Die unterschiedlichen Messmodi des AFM, mit denen die Morphologie der OTS SAMs aufgenommen wurde, ergaben deutliche Unterschiede in ihrem Erscheinungsbild. Im Vergleich zum Tappingmodus sind die Grenzen der OTS-Inseln auf Kontaktmodus-Bildern nur undeutlich erkennbar. Die großen Inseln erscheinen nicht so dendritisch. Die Ursache dieser Phänomene könnte am Wassermeniskus zwischen Spitze und Probe liegen, da die Messung nicht in Flüssigkeit, sondern an Luft durchgeführt wurde. Auf LFM-Bildern sind die adsorbierten OTS-Inseln heller als unbedecktes SiO2, während die MPTMS-Inseln dunkler als SiO2 aussehen. Eine ähnliche Auswirkung der Messmodi auf die Morphologie der MPTMS SAMs wurde nicht beobachtet. Durch die Adsorption von 1-Decanthiol lässt sich die Si3N4-AFM-Spitze modifizieren. Eine solche CH3-terminierte Spitze ist hydrophob und verursacht einen gegenteiligen Helligkeitskontrast auf LFM-Bildern der adsorbierten OTS-Inseln.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zwei Knockout-Mutanten für die Cyclophiline CypA1 und CypA2 hergestellt. Für die Konstruktion wurde nicht nur das eigentlich Gen verwendet, sondern auch umliegende Bereiche. Im Endeffekt standen der homologen Rekombination an beiden Seiten des Knockout-Konstrukts ca. 1000 bp zur Verfügung. Zunächst wurden die DNA-Abschnitte der Cyclophiline aus der genomischen DNA von Streptomyces lividans mittels PCR isoliert. Aufgrund des hohen GC-Gehalts wurde die Amplifikation in Fragmenten durchgeführt. Es wurden verschiedene PCR-Bedingungen getestet und für jedes Fragment optimale Bedingungen ermittelt. Nach Aufreinigung und A-Tailing folgte eine Ligation mit pGemT-Easy. Die erhaltenen Fragmente wurden sequenziert und anschließend über mehrere Klonierungsschritte in E. coli wieder zusammengefügt. Dabei wurde eine Apramycinresistenz-Kassette so in das Gen eingebaut, dass die eigentliche Information für das Cylophilin-Gen zerstört wurde. Das daraus resultierende Knockout-Konstrukt wurde in den temperatursensitiven pGM160, einem E.coli-Streptomyces-Shuttle Vektor, kloniert und in Streptomyces lividans transformiert. Nach einem Temperaturshift integrierte der temperatursensitive Vektor über homologe Rekombination in das Genom. Die DNA der potenziellen Mutanten wurde auf den zielgerichteten Einbau des Knockout-Konstrukts im gewünschten Cypclophilin-Gen untersucht. Mittels PCR konnten entsprechende Amplifikate hergestellt werden, die den Nachweis für die erfolgreiche homologe Rekombination lieferten. Der physiologische Zustand des Zellstoffwechsels kann durch extreme Umweltbedingungen wie Nährstoffdefizienz oder Hitzeschock in radikaler Weise verändert werden. Bei diesen Prozessen können Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerasen beteiligt sein, indem sie durch Isomerisation der Prolyl-Bindung ein Enzym modulieren oder bei der Expression von neuen Proteinen im Rahmen der Proteinfaltung mitwirken. Experimente unter veränderten Wachstumsbedingungen wie z.B. Nährstoffdefizienz oder Hitzeschock können Aufschluss darüber geben, ob in diesem Fall Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerasen an der Modulation von Enzymen beteiligt sind.
Das Steroid-Hormon 17ß-Estradiol ist maßgeblich an der Entstehung und Entwicklung von Brustkrebs beteiligt. Die intrazelluläre Verfügbarkeit des aktiven Estrogens, 17ß-Estradiol, wird durch die 17ßHydroxysteroiddehydrogenase (17ßHSDl) reguliert, die die NADPH-abhängige Reduktion von Estron zu Estradiol katalysiert. Damit stellt die 17ßHSD1 einen interessanten Ansatzpunkt für die Entwicklung neuer Inhibitoren im Hinblick auf potente Wirkstoffe gegen Brustkrebs dar. Die 17ß-Hydroxysteroiddehydrogenase 2 bevorzugt hingegen die oxidative Aktivität und wandelt die biologisch aktiven Hydroxysteroide wie Estradiol in ihre inaktiven Ketoformen um. Ein möglicher Inhibitor der 17ß-HSD1 sollte demnach die Funktion der 17ß-HSD2 nicht beeinträchtigen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Strategien und Methoden entwickelt, die 17ßHSD1 durch heterologe Expression erstmals in E. coli darzustellen. Durch NMR-Spektroskopie in Kombination mit Docking konnten detaillierte Aussagen über die Bindungsepitope der untersuchten Liganden gemacht werden. Diese Informationen sind für eine gerichtete Optimierung von Leitstrukturen von großer Bedeutung.
Die Eigenschaften, die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Co-Polymeren auf Basis von a-Hydroxycarbonsäuren und Polyolen, unterscheiden sich deutlich von denn entsprechenden reinen Polymeren ohne Polyolkomponente. Die Polymere dieser Klasse, die sich durch Variation der Parameter Alkoholkomponente, Alkohol/Lactid-Verhältnis, Lactid/Glycolid-Verhätnis, L/DL-Verhältnis ergibt sind äußerst vielfältig. Schwerpunktmäßig wurden Polymere untersucht, die als Carbonsäurekomponente Milch- und/oder Glycolsäure enthalten und bei denen Glycerin oder Ethylenglycol als Polyol verwendet wurde. Diese Arbeit verfolgte zum einen das Ziel, grundlegende Erkenntnisse über die neuartige Polymerklasse zu gewinnen und zum anderen die Eignung dieser Polymere als implantierbares Arzneistoffdepot zu untersuchen. Dabei konnte – wie im ersten Teil dieser Arbeit beschrieben – nur ein Ausschnitt aus dem großen Spektrum der Polymere beispielhaft synthetisiert und untersucht werden. Von vornherein ausgeschlossen waren bei diesen Untersuchungen Polymere, deren Glasübergangstemperatur unter Raum- und über Körpertemperatur lagen. Es sollten so lagerstabile, aber nach Applikation ins Gewebe anpassungsfähige Formkörper erhalten werden. Die Untersuchungen mit den entwickelten Polymerstäbchen haben gezeigt, dass sich die Klasse der Polyol-oligolactide/co-glycoliden von herkömmlichen, reinen Polylactiden bzw. Polylactiden/co-glycoliden in einigen Punkten unterscheidet. So wurde bei keinem der Versuche ein inhomogenes Abbauverhalten festgestellt, wie dies in der Literatur bei reinen Polylactiden/co-glycoliden beschrieben ist. Es kam also nicht zu einem beschleunigten Polymerabbau im Inneren der Stäbchen durch Autokatalyse der sich dort akkumulierenden Milchsäure. Die Glycerol-Polymere scheinen eine ausreichende Diffusion der Degradationsprodukte nach außen zu gewährleisten. Dies ist eine wichtige Voraussetzung für die gleichmäßige Freisetzung von Wirkstoffen. Die Eigenschaften der Polymerstäbchen ließen sich auf unterschiedliche Weise beeinflussen. So konnte ihre Wasseraufnahmefähigkeit durch das Verhältnis der Mischung von L-Polymeren zu DL-Polymeren sehr weit variiert werden. Das amorphe DL-Polymer ermöglicht eine erleichterte Wasseraufnahme gegenüber der reinen teilkristallinen L-Variante. Die Co-Polymerisation mit Glycolid bot eine weitere Möglichkeit, die Eigenschaften der Polymere zu beeinflussen. So stieg bei den Polymeren mit gleichem Glycerin/Monomer-Verhältnis die Hydrophilie in der Reihe GOL-DL-1:18 < GOL-DL-1:13,5:4,5 < GOL-DL-1:9:9 < GOL-L-1:4,5:13,5 an. Die Versuche, die im zweiten Teil der Arbeit beschrieben werden, wurden im Rahmen der Entwicklung eines Applikationssystems für niedermolekulare Cyclooligo-peptide durchgeführt, die in der Krebstherapie eingesetzt werden sollten. Es wurde deutlich, dass die bisher verwendeten Polymerstäbchen für eine solche Anwendung nicht geeignet waren. Sie boten der zur Applikation notwendigen Menge an Peptid eine zu geringe Menge an Polymermatrix, was zu einer hohen Beladungsrate führte. Die Folge war ein mechanisch instabiles System, das nach Implantation zerbrechen könnte und so den Wirkstoff unkontrolliert freisetzen würde. Aus diesem Grund wurde ein Verpressungsverfahren gewählt, um Tabletten beziehungsweise stäbchenförmige Presslinge als Applikationssystem zu erhalten. Für beide Varianten wurde das Polymer gemahlen, die zu untersuchenden Hilfs- oder Wirkstoffe eingemischt und dann verpresst. Bei den Untersuchungen zeigte es sich, dass eine gleichmäßige Freisetzung über mehrere Tage mit diesen resorbierbaren Trägersystemen nicht möglich war. Der Grund hierfür war ein zweiphasiger Verlauf der Freisetzung. Im ersten Teil des zweiphasigen Verlaufs wurde eine große Menge des Wirkstoffes zusammen mit der niedermolekularen Komponente ausgespült. In der zweiten Phase wurde der Wirkstoff im Zuge der Degradation der höhermolekularen Komponente langsam freigesetzt. Der Einfluss des Pressdruckes bei Erstellen der Prüfkörper war für die Freisetzung eher von untergeordneter Bedeutung, während eine vermehrte Zumischung von leicht wasserlöslichen Substanzen oder die Verwendung von hydrophileren Polymeren (DL-Lactide anstelle von reinen L-Lactiden) die Freisetzung des Peptides deutlich erhöhte. Im dritten Teil der Arbeit wurde beispielhaft an den Substanzen Gentamicinsulfat, Methotrexat und einem Cyclo-Oligo-Peptid die Freisetzung aus 13 verschiedenen halbfesten Polymersystemen untersucht. Diese Systeme wurden durch Mischung von nieder- mit höhermolekularen Polymeren hergestellt. Die Menge an freigesetztem Arzneistoff korrelierte erwartungsgemäß mit der Oberfläche der Probenkörper. Die Freisetzung des gut wasserlöslichen Gentamicinsulfats erfolgte aus den Systemen mit einem hohen Anteil an niedermolekularem Polymer sehr schnell und vollständig. Systeme mit überwiegend höhermolekularem Polymer gaben den Wirkstoff weniger schnell frei und es konnte gezeigt werden, dass der Wirkstoff sich in beiden Polymeren der Mischung verteilt. Das Freisetzungsverhalten bei dem in Wasser schwerlöslichen Methotrexat war nicht grundsätzlich anders. Die Verteilung zwischen der höher- und niedermolekularen Phase ähnelt der des Gentamicinsulfates. Eine relativ hohe Beladungsrate mit einem hydrophilen Wirkstoff (EMD 121974) führte zu einer deutlich höheren Freisetzung aus dem höhermolekularen Teil des Polymergemisches, so dass insgesamt eine beinahe vollständige Freisetzung erreicht wurde. Das im vierten Teil der Arbeit untersuchte Beschichten von Hydroxylapatit- Zylindern aus einer Kombination von bFGF mit einem Glycerin-L-1:13 Lactid Polymer führte zu einer gleichmäßigeren Freisetzung als bei Zylindern, die ohne Einsatz von Polymer beschichtet wurden. Außerdem war auch noch nach dem 5. Tag eine Freisetzung von bFGF zu beobachten. Eine signifikante Verzögerung des Einwachsens von Knochen in das Implantat nach 42 und 84 Tagen konnte bei der Gruppe mit bFGF/Polymer-Beschichtung histomorphologisch gezeigt werden. Die Poren des Implantates waren mit dem Polymer gefüllt, was das Einwachsen in den ersten Wochen deutlich erschwerte. Erst nach Beginn der Degradation des Polymers war das Eindringen des umgebenden Knochen möglich. Das Polymer GOL-L-1:12 war also aufgrund seiner langsamen Degradation für eine solche Anwendung ungeeignet. Für eine Verwendung als Beschichtungsmaterial sollte ein Polymer deutlich schneller degradieren und die Beschichtungsdicke müsste optimiert werden. Die Charakterisierung der Polyol-oligolactide/co-glycoliden in dieser Arbeit hat gezeigt, dass es sich bei dieser Polymerklasse um eine sehr interessante Variante der resorbierbaren Polymere handelt. Die einfache Synthese, die gute Bioverträglichkeit und die in sehr weiten Bereichen variierbaren Eigenschaften machen diese Polymere zu vielversprechenden Kandidaten bei der Entwicklung von Arzneimittelträgern oder Medizinprodukten.
Lichtsensitive Proteine bzw. Photorezeptoren eignen sich hervorragend für das Studium des Zusammenhangs von Proteinstruktur und –funktion. Lichtrezeptorproteine werden leicht durch Licht angeregt, wodurch eine gute Zeitauflösung für deren Untersuchung erreicht werden kann. Weiterhin sind sie als Signalproteine während der Etablierung des aktiven Zustandes und dessen Zerfalls großen konformationellen und strukturellen Änderungen unterworfen. Ausgehend von diesen Eigenschaften wurde bereits eine große Zahl von Lichtrezeptorproteinen genauer untersucht. Diese vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit lichtinduzierten konformationellen Änderungen in Membranproteinen. Dafür wurden drei verschiedene Systeme herangezogen: das kleine α-helikale Peptid Gramicidin A, der G-Protein gekoppelte Rezeptor Rhodopsin and die BLUF (blue light using FAD) Domäne des hypthetischen Membranproteins Blrp (blue-light regulated phosphodiesterase) aus E. coli. Gramicidin A (gA) ist ein aus dem Bodenbakterium B. brevis isoliertes Antibiotikum, das Transportkanäle für einwertige Kationen wie Lithium, Natrium und Kalium ausbildet. Gelöst in Detergenzmizellen, wurde für gA unerwartet eine Wechselwirkung mit Blaulicht fest gestellt (Abbildung 1). Diese Beobachtung wurde mit statischen und zeitaufgelösten NMRspektroskopischen Methoden genauer untersucht und ist in Kapitel 2 näher beschrieben. Basierend auf den gewonnenen Erkenntnissen wird postuliert, dass einer der Tryptophanreste (Trp9) eine lichtinduzierte konformationelle Änderung erfährt. Ausgehend von der Konformation in Lösung befindet sich die Seitenkette von Trp9 in einem Gleichgewicht (70:30) mit einer zweiten Konformation. Bei der zweiten Konformation handelt es sich möglicherweise um die Orientierung, die der Tryptophanrest unter Festkörper-NMR Bedingungen einnimmt. Die Lebensdauer der neuen Konformation beträgt in etwa eine Sekunde. Der G-Protein gekoppelte Rezeptor Rhodopsin ist verantwortlich für die Verarbeitung von Lichtsignalen in den Stäbchenzellen der Retina. Die Absorption eines einzelnen Photons führt zur Isomerisierung des kovalent gebundenen Chromophors 11-cis-Retinal, wodurch konformationelle Änderungen im Protein veranlasst werden. Der aktivierte Metarhodopsin II (MetaII) Zustand induziert eine Enzymkaskade und schließlich einen Nervenimpuls, das Säugern das Kontrastsehen ermöglicht. Eine große Bandbreite an hochauflösenden NMRspektroskopischen Methoden, (einschließlich zeitaufgelöster und Festkörper-NMR Methoden) wurde im Laufe dieser Arbeit angewandt, um Konformation und Dynamik von bovinem Rhodopsin näher zu untersuchen. In Kapitel 3.1 sind zu Beginn mehrere Optimierungsschritte im Hinblick auf ein kostengünstiges, isotopenmarkiertes Säugerzellenmedium beschrieben. In diesem Zusammenhang wurden mehrere Rhodopsin NMR-Proben hergestellt, wobei der Gehalt an isotopenmarkierten Aminosäuren ca. 50% betrug. Anhand dieser Proben konnte bewiesen werden dass sich mit Lösungs-NMR-Spektroskopie auch sehr große, in Detergenzmizellen stabilisierte Membranproteine (~150 kD Gesamtmasse) detailliert studieren lassen. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf den C-Terminus, für den nach sequentieller Zuordnung (Abbildung 2a) und heteronuklearern Relaxationsmessungen ein Mobilitätsverhalten bestimmt wurde, das dem mittelgroßer Proteine ähnelt. Des Weiteren konnten keinerlei definierte Strukturelemente innerhalb des C-Terminus identifiziert werden, u.a. durch einen Vergleich mit eines 19mer Peptids, dessen Primärsequenz des Rhodopsin C-Terminus entspricht (Abbildung 2a und 2b). In Kapitel 3.2 wird die nichtinvasive Zuordnung der Rückgratresonanzen aller fünf Trytophane mit Hilfe einer Kombination aus Lösungs- und Festkörper-NMR beschrieben. Dazu wurden verschiedene Rhodopsinproben hergestellt, die alle möglichen 13C’i-1-Carbonyl/15Ni-Tryptophan isotopenmarkierten Amidpaare enthielten. Eine Teilzuordnung der Tryptophanindolsignale konnte in Lösung durch Protonen-/Deuteriumaustausch und heteronukleare Relaxationsmessungen erreicht werden. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Kombination aus Lösungs- und Festkörper-NMR-Spektroskopie sehr gut geeignet ist um komplementäre Informationen zu strukturellen und dynamischen Eigenschaften von Rhodopsin zu liefern. Fehlende Zuordnungen in den Lösungspektren konnten durch den Verglich mit Festkörperspektren ergänzt werden und umgekehrt (Abbildung 3). In Kapitel 3.3 ist die erfolgreiche Adaption der zeitaufgelösten NMR-Spektroskopie für die Untersuchung des Rhodopsin MetaII Zerfalls in vitro beschrieben. Die zeitaufgelösten protonendetektieren NMR-Experimente wurden mit unmarkiertem, in Detergenzmizellen stabilisiertem Protein bei verschiedenen Temperaturen aufgenommen, wobei sich die anschließende Auswertung auf die stark tieffeldverschobene Indolregion konzentrierte (Abbildung 4). Für die berücksichtigten Signale traten nach Induktion des aktivierten Zustandes deutliche chemische Verschiebungsänderungen auf, außerdem zeigten sie unterschiedlich schnellen MetaII Zerfall. Zusätzlich zu der erwarteten Zeitkonstante des MetaII Zerfalls (~6 min bei 298 K) konnte erstmalig eine zweite, ca. zehnmal langsamere Zeitkonstante bestimmt werden. Diese zweite Zeitkonstante ist möglicherweise ein Ausdruck für die langsame Entfaltung von Sekundärstrukturelementen nach dem Zerfall des Proteins in Opsin und Retinal. Die BLUF-Domänen verwenden Flavinadeninnukleotid (FAD) als Chromophor und gehören zu der Familie der Blaulichtrezeptoren. In Kapitel 4 wird die Untersuchung des lichtadaptierten Zustandes der E. coli BLUF Domäne auf Protein- und Ligandenebene mit zeitaufgelösten proton- und phosphordetektierten NMR-Experimenten beschrieben. In Abbildung 5 sind die statischen Licht- und Dunkelspektren (jeweils licht- und dunkeladaptiert) dargestellt. Im Folgenden konnte durch Beobachtung der Dunkeladaption bei verschiedenen Temperaturen die Aktivierungsenergie des Lichtzustandes bestimmt werden. Des Weiteren wurden zum ersten Mal phosphordetektierte NMR-Experimente erfolgreich angewandt, um einen biologisch relevanten Vorgang zeitabhängig näher zu bestimmen.
In der vorgelegten Arbeit wurden 50 Mutationen von Aminosäuren im Bereich der Chinoloxidationsbindungsstelle (Qo-Site) des bc1-Komplexes aus Paracoccus denitrificans untersucht. Hierzu wurden die Mutanten erstellt, Kinetiken der Substratbindung bestimmt und EPR Spektren aufgenommen. Mit den gleichen Methoden wurden auch verschiedene Klasse I und Klasse II Inhibitoren der Qo-Site untersucht. Wenngleich der Reaktionsmechanismus auch mit Hilfe dieser Mutationen nicht vollständig aufgeklärt werden konnte, so konnten doch neue Einsichten in die Funktionsweise des bc1-Komplexes gewonnen werden. Verschiedene Modelle wurden vorgeschlagen, um die energetisch günstige aber thermodynamisch unwahrscheinliche Verzweigung der beiden Elektronen des Ubichinols auf die beiden Redoxketten des bc1-Komplexes der Atmungskette zu beschreiben. Da die Redoxpotentiale der beiden primären Elektronenakzeptoren extrem unterschiedlich sind, scheint es zwingend zu sein, dass beide Elektronen den Hochpotentialzweig (Rieske, Cytochrom c1, Cytochrom c) durchlaufen. Energetisch bietet jedoch die Wiederverwendung eines der beiden Elektronen den immensen Vorteil der realen Verdopplung der Protonenpumpleistung. Die wichtigsten Mutationen der vorliegenden Arbeit betreffen die vermuteten direkten Bindungspartner des Ubichinols, bE295 und fH155. Das Histidin ist Teil der beweglichen Rieske Untereinheit des bc1-Komplexes, das Glutamat ist Teil eines hoch konservierten Abschnitts des Cytochrom b. Aufgrund der gemessenen Wirkungen der untersuchten Mutationen auf die kinetischen Kennzahlen und EPR Parameter der eingesetzten Substrate und Inhibitoren lassen sich folgende Schlüsse ziehen. Die Bindung des Chinol-Substrats in der Qo-Site benötigt die korrekte Ausrichtung und den unveränderten Bindungspartner fH155 der Rieske [2Fe-2S]-Gruppe. Das Fehlen des zweiten vermuteten Bindungspartners bE295, der ein Teil des hochkonservierten PEWY-Loops ist, wird hingegen toleriert. Die Aktivitäten bei Mutationen dieser Aminosäure liegen mit bis zu 56% im Vergleich zum Wildtyp (bE295A) relativ hoch. Auch unter Berücksichtigung von möglichen bypass Reaktionen ist es fraglich, ob das Glutamat des PEWY-Loops ein direkter Bindungspartner des Substrats ist. Der Inhibitor Stigmatellin bindet im bc1-Komplex von Paracoccus denitrificans irreversibel in der Qo-Site, auch wenn einer der beiden vermuteten Bindungspartner (bE295 bzw. fH155) nicht verfügbar oder verändert ist. Daraus kann man schließen, dass die Bindung des Stigmatellins im Wesentlichen von seiner Seitenkette im Bereich des Chinol-Eintrittskanals des bc1-Komplexes stabilisiert wird. Wechselwirkungen der bizyklischen Kopfgruppe mit Aminosäuren der Chinoloxidationsbindungstasche sind hierfür nicht zwingend notwendig. Weitere durchgeführte Mutationen lassen folgende weitere Rückschlüsse zu: Der korrekte Bindungsraum der Qo-Site ist für eine maximale Umsatzgeschwindigkeit des bc1-Komplexes erforderlich. Dies zeigen Mutationen von bG158 und bV161. Die Struktur des hochkonservierten PEWY-Loops ist mitentscheidend für die Aktivität des bc1-Komplexes. Störungen der Konfiguration in diesem Bereich führen zu einer deutlichen Abnahme der Aktivität. Dies lassen Mutationen von bY297, bP294 und bW296 erkennen. Der ef-Loop hat einen Einfluss auf die Bewegungsvorgänge der Rieske-Kopfgruppe. Er ist jedoch nicht sehr flexibel (bL286H). Veränderungen im Wasserstoffbrückennetzwerk der Rieske-Kopfgruppe führen zu einer deutlichen Verminderung der Elektronentransferraten (bY159F, bS157A und bF151H). Die Bindungsregionen von Klasse I Inhibitoren in der Qo-Site überlappen mit denen des natürlichen Substrats. Sie sind jedoch nicht identisch, was sich im unterschiedlichen Verhalten einiger Mutationen auf die Aktivität von Substrat und die Inhibitionswirkung von Klasse I Hemmstoffen ausdrückt. Die Untersuchungen der Auswirkungen von Mutationen auf einen vermuteten Wasserkanal im Bereich des Häm bL und auf eine angenommene Zinkbindungsstelle im gleichen Bereich zeigen keine eindeutig interpretierbaren Ergebnisse. Die Mutationsstudien im Bereich des Cytochrom c1 wurden begonnen. Zusätzliche Mutanten in diesem Bereich könnten weiterführende Aufschlüsse über die Wechselwirkung der Rieske-Kopfgruppe mit Cytochrom c1 bringen. Die vorgelegte Studie lässt erkennen, dass die Vorgänge in der Qo-Site des bc1-Komplexes aus Paracoccus denitrificans höchst komplex sind. Zusätzliche Untersuchungen der erzeugten Mutanten mit Hilfe weiterer Detektionsmethoden, insbesondere CD- und FTIR-Messungen, könnten in Zukunft eine noch bessere Einsicht in die Vorgänge dieses wichtigen Komplexes der Atmungskette geben.
Humane hämatopoetische Stammzellen (HSCs) besitzen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und übernehmen die kontinuierliche Neubildung aller zellulären Bestandteile des Blutes. Aufgrund der zunehmenden klinischen Bedeutung der HSCs ist es essentiell die molekularen Mechanismen, die den Prozess der Vermehrung und Differenzierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen steuern, aufzuklären und deren funktionelle Bedeutung zu verstehen. Das Ziel der Arbeit war die Identifizierung, Charakterisierung und gerichtete Modulation funktionell relevanter Signalwege, die am Differenzierungsprozess von HSCs zu myeloiden Effektorzellen beteiligt sind. Für diese Untersuchung wurde ein Expansionsprotokoll für humane HSCs, sowie ein Differenzierungsprotokoll für das humane myeloide DC Differenzierungsmodell entwickelt. In der Arbeit wurden drei wichtige Signalwege der Zelle, die Mitogenen Signalkaskade (MAPK), Protein Kinase C (PKC) gekoppelten Prozessen und dem JAK/STAT Signalweg untersucht. Die vorliegende Arbeit zeigt, daß die Stimulation der HSCs mit GM-CSF und IL-4 zu einer zeitlich begrenzten Aktivierung von MAPK/ERK1/2, PKC delta, JAK2, sowie STAT5 und STAT6 führte. Kommerzielle Inhibitoren von MEK, PKC und Januskinase hemmten selektiv diese Aktivierung und führten zu einer veränderten Hämatopoese. Die Aktivierung dieser Signalwege ist daher für die myeloide Differenzierung von HSCs zu Dendritischen Zellen von entscheidender Bedeutung. Einer der entscheidenden nuklearen Faktoren für die myeloide Differenzierung ist der Ets-Transkriptionsfaktor PU.1, dessen Aktivität durch Phosphorylierung reguliert sein könnte. Obwohl die funktionelle Rolle von PU.1 in der Differenzierung von HSC in der vorliegenden Arbeit nicht vollständig geklärt werden konnte, wurde jedoch erstmals im in vitro Kinase-Assay gezeigt, daß PU.1 durch PKC delta, aber nicht durch MAPK/ERK2 spezifisch phosphoryliert wird. In einem PU.1-spezifischen Luciferasereporter-Assay wurde die transkriptionelle Aktivität von PU.1 durch die Inhibition von PKC delta und MAPK/ERK1/2 deutlich reduziert. Weiterführende Experimente in einem komplexen Differenzierungsmodell von humanen HSCs wiesen darauf hin, daß durch den gezielten Einsatz von Signalweginhibitoren eine Verschiebung der Verhältnisse der gebildeten Blutzellkolonieformen erreicht werden kann. So war die Differenzierung zu Erythrozyten von der Mitogenen Signalkaskade unabhängig, wohingegen die Differenzierung zu Makrophagen eine deutliche Abhängigkeit von der Aktivität der Mitogenen Signalkaskade sowie von der Aktivierung des Protein Kinase C Signalwegs zeigte. Im Gegensatz dazu führte die Inhibition der Januskinasen (JAKs) zu einer Hemmung der Differenzierung in allen Kolonieformen. Insgesamt zeigten die Ergebnisse, daß der MAPK/ERK und PKC delta Signalweg bei der Differenzierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen eine wichtige Rolle spielen und eine gerichtete Steuerung der Differenzierung durch den Einsatz spezifischer Signalweginhibitoren möglich erscheint.
Das Bakterium Thermus thermophilus hat sich in den letzten Jahren zu einem Modell für thermophile Organismen entwickelt. Die maximale Wachstumstemperatur liegt bei bis zu 85°C, so dass auch Proteine und die gesamte Zellstruktur an diese hohen Temperaturen adaptiert sein müssen. Aufgrund der allgemein erhöhten Stabilität werden diese Proteine zunehmend für biotechnologische Prozesse und zur Strukturbestimmung verwendet. Im Energiehaushalt der Zelle ist der Elektronentransfer von NADH zu molekularem Sauerstoff ein wesentlicher Bestandteil und wird durch transmembrane Enzymkomplexe vermittelt. In dieser Arbeit konnten vier direkt aufeinanderfolgende Gene (fbcC, fbcX, fbcF, fbcB) identifiziert werden, die in einem 3,1 kb großen Operon mit einem GC-Gehalt von 69% organisiert sind und für die Untereinheiten eines putativen Thermus bc-Komplexes kodieren. Die in silico translatierte DNA-Information konnte für ausführliche Sequenzvergleiche und eine erste Charakterisierung der bc-Untereinheiten genutzt werden. Während Cytochrom b und das Rieske-Protein typische Eigenschaften zu anderen prokaryotischen Untereinheiten aufweisen, unterscheidet sich die Cytochrom c-Untereinheit hinsichtlich Topologie und Verwandtschaft von klassischen c1-Komponenten. Darüber hinaus wurde eine zusätzliche Untereinheit FbcX identifiziert, die keine Entsprechung in bisher bekannten bc-Komplexen hat. Das gesamte Operon mit vorangestellter d70 Promotorregion wurde amplifiziert, in einen Thermus/E.coli-Shuttlevektor mit hitzeoptimierter Kanamycinresistenz eingefügt und so plasmidkodiert für die Überexpression in T. thermophilus HB27 genutzt. Der membranständige Gesamtkomplex wurde nach Solubilisierung mit ß-D-Decyl-Maltosid stabil in Lösung gebracht und anschließend über eine Metallaffinitätssäule stöchiometrisch als vier-Untereinheiten Komplex aufgereinigt. Der Gesamtkomplex sowie seine Einzelkomponenten und deren Cofaktoren waren somit für eine nähere Charakterisierung verfügbar. Alle vier Genprodukte konnten als Untereinheiten des bc-Komplexes in T. thermophilus über N-terminale Sequenzierung und MALDI-MS/MS eindeutig identifiziert werden. Der in vitro Aktivitätstest zeigte keine Hemmbarkeit des aufgereinigten Thermus Komplexes durch klassische bc-Inhibitoren, was auf eine deutlich abweichende Substratbindung dieses Menachinol-oxidierenden Komplexes hinweist. Durch Optimierung des Thermus/E.coli-Shuttlevektors wurde auch die homologe Überexpression weiterer Thermus-Membranproteine ermöglicht. Dazu gehört neben der ba3-Oxidase auch ein MDL-ähnlicher ABC-Transporter. Weiterhin wurde gezeigt, dass die thermostabilen Eigenschaften sowohl des bc-Komplexes als auch des ABC-Transporters in Detergenzumgebung erhalten bleiben. Dieser Nachweis konnte darüber hinaus auch für den heterolog exprimierten und aus E. coli aufgereinigten ABC-Transporter erbracht werden, der im isolierten Zustand die gleiche Aktivität wie das aus Thermus aufgereinigte Äquivalent aufweist. Neben dem bc-Gesamtkomplex, der ba3-Oxidase und Cytochrom c552 wurden in dieser Arbeit weitere Komponenten der thermophilen Atmungskette in löslicher Form oder mit Membrananker, zum Teil auch heterolog in E. coli exprimiert und unter Erhalt der Redox-Cofaktoren aufgereinigt. Mit der Identifizierung und Charakterisierung eines intakten Cytochrom bc-Komplexes konnte die Lücke im Verständnis der thermophilen Atmungskette von T. thermophilus geschlossen und die Grundlage für weitere Struktur- und Funktionsanalysen dieses membranintegralen Enzymkomplexes geschaffen werden.
Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag in der Synthese und strukturellen Charakterisierung von sandwichartig aufgebauten kupferhaltigen Organosiloxanen. Diese sollten nach Möglichkeit kristalline Eigenschaften aufweisen und ein interessantes magnetisches Verhalten zeigen. Es galt, die Beziehungen zwischen molekularer Struktur und magnetischen Eigenschaften herauszuarbeiten, um auf der Basis experimenteller Daten dem maßgeschneiderten Design neuer molekularer Magnete näher zu kommen. .... Die in der hier vorgelegten Arbeit erzielten Ergebnisse belegen, dass der Weg zur gezielten Erzeugung molekularer Magnete erfolgreich beschritten wurde. Es wird weiteren Arbeiten vorbehalten bleiben, Cluster der nun vorliegenden Art chemisch so zu verknüpfen, dass daraus polymere Ketten oder Netzwerke entstehen. Deren magnetisches Verhalten lässt erwarten, dass damit möglicherweise neue Materialien zugänglich werden, die dem Anspruch eines molekularen Magneten voll gerecht werden.
Der Einsatz von Mikrowellen zur Synthese von Organosilicioumverbindungen ist bislang nicht beschrieben und wird mit der vorliegenden Arbeit eingeführt. Dazu wurde eine Haushaltsmikrowelle durch Öffnen des Sicherheitskäfigs und entsprechender Abschirmung so modifiziert, dass mit den üblichen Labormaterialien gearbeitet werden konnte. Exemplarische Reaktionen in flüssiger Phase, wie die Synthese von Silatranen und silatrananalogen Verbindungen, können gegenüber der klassischen Reaktionsführung bis zum Faktor 60 bei vergleichbaren Ausbeuten und Reinheiten beschleunigt werden. Auch die direkte Konversion von SiO2 in reaktive Verbindungen gelingt unter Mikrowellenbedingungen deutlich beschleunigt. Weitere Modifikationen der Apparatur ermöglichen die Durchführung von Festphasen-Gas Reaktionen unter Verwendung von Silicium und verschiedenen Reaktionsgasen. Verwendet wurden dazu Cl2, HCl, CH3Cl sowie Gemishce dieser Gase. Auch wurden die Reaktionen unter verschiedenen Stufen der Argonverdünnung durchgeführt. Erstaunlicherweise glüht dabei das Silicium innerhalb von Sekunden mit einer Temperatur von über 1000°C. Die Untersuchungen zeigen eine hohe Tendenz zur Bildung von monomeren Siliciumverbindungen, sobald Methylchlorid beteiligt ist, wird bevorzugt das technisch bedeutsame Me2SiCl2 beobachtet. Alle Ergebnisse gehen konform mit der Annahme, dass durche Mikrowelle aktiviertes Silicium bereitgestellt wird. Dadurch kann es zur Bildung und Stabilisierung von intermediären Silylenen kommen, die in verschiedene Bindungen der Reaktionspartner insertieren. Bemerkenswert ist auch die geringe elektrische Leistung von 200 Watt, die in allen diskutierten Umsetzungen ausreicht, um die gewünschten Reaktionen durchzuführen. Darüber hinaus wurde auch der Unterschied zwischen Multimode- und Singlemodegeräten untersucht. Nur bei Verwendung von Multimodegeräten könenn die beschriebenen Ergebnisse erzielt werden. Beim Einsatz von Singlemodegeräten entsprechen die Resultate denen, die bei klassischer thermischer Reaktionsführung erzielt werden.
In Eukaryonten findet der Prozess des Spleißens im Spleißosom, einer sich permanent reorganisierenden, molekularen Maschine, statt. In diesem Prozess werden die kodierenden Sequenzen, die Exons, von den nicht kodierenden Sequenzen, den Introns, getrennt und zusammengefügt. Durch die permanente Reorganisation des Spleißosoms war es bisher nicht möglich, die dreidimensionale Struktur der unterschiedlichen Komplexe in einer hohen Auflösung zu bestimmen. Tuschl et al. haben ein Ribozym entwickelt. Dieses bildet über den Angriff einer 2'-Hydroxylgruppe eines Adenosins auf das Phosphatrückgrat eines Guanosins ein Lariat. Diese Reaktion ist vergleichbar dem ersten Schritt der Spleißreaktion. In dieser Arbeit wurde das Ribozym vor der Ausbildung der Lariatstruktur charakterisiert. Eine Voraussetzung zur Strukturaufklärung mit NMR ist die Zuordnung der Resonanzen. Die Zuordnung zeigte, dass ein Teil der linearen Form des Ribozyms in zwei Konformationen vorliegt. Hier findet ein langsamer konformationeller Austausch statt, der die Resonanzüberlagerung erhöht und damit die Zuordnung der Signale erschwert. Aus diesem Grund wurden unterschiedliche Isotopen markierte Proben für die Zuordnung verwendet. Zur Verifizierung der Sekundärstruktur wurden neben NMR-Experimenten Mutationsstudien am Ribozym eingesetzt. Das Ribozym bildet zwischen g1-c12 und g17-c27 eine Helix. Die Helix weist neben kanonischen Basenpaarungen auch nicht kanonische Basenpaarungen auf. Die Adenosine am Anfang der Helix interagieren mit Nukleotiden in 3'-Position des branchpoint Adenosins. Dadurch befindet sich das branchpoint Adenosin a48 nahe dem g1. Zwischen diesen beiden Nukleotiden findet die Umesterung statt, in der das Lariat gebildet wird. Nach der Lariatbildung sind in den NMR Spektren nur noch die Resonanzen der kurzen Helices P1 und P2 zu beobachten. Die anderen Resonanzen unterliegen einem konformationellen Austausch. Die Struktur des Ribozyms verändert sich also nach der Lariatbildung beträchtlich. In der Spleißreaktion, aber auch in anderen katalytischen Prozessen besitzt die 2'-Hydroxylgruppe der RNA eine essentielle Funktion. Auch die wesentlichen strukturellen Unterschiede zwischen der RNA und DNA sind auf die 2'-Hydroxylgruppe zurückzuführen. Bislang liegen jedoch nur moleküldynamische Berechnungen und NMR-spektroskopische Untersuchungen an einzelnen Nukleotiden vor, die sich mit der Konformation der 2'-Hydroxylgruppe beschäftigen. In dieser Arbeit wurden erstmals die Konformationen der 2'-Hydroxylgruppen einer dreißig Nukleotide umfassenden RNA, der TAR-RNA, mit Hilfe von 3J-Kopplungen und NOEs bei niedrigen Temperaturen in Lösung ermittelt. Die Konformationsanalyse ergibt, dass die 2'-Hydroxylgruppen der unteren Helix der TAR-RNA in einem konformationellen Gleichgewicht zwischen der O3'- und der Basendomäne vorliegen. In beiden Orientierungen können sich die 2'-Hydroxylgruppen am Aufbau eines Netzwerks aus Wassermolekülen beteiligen, in dem zwei Wassermoleküle die große Furche der RNA Helix überspannen. Durch den Wechsel der 2'-Hydroxylgruppen zwischen der O3'- und Basen-Domäne unterliegt das Netzwerk einer stetigen Reorganisation.
Chlamydomonas reinhardtii ist eines der bekanntesten Modellsysteme der Forschung, um photo-, zell- und molekularbiologische Fragestellungen zu untersuchen. Die phototaktischen Reaktionen dieser einzelligen Grünalge werden durch mikrobielle Rhodopsine, sogenannte Photorezeptoren initiiert, deren Chromophor all-trans-Retinal ist. Eines dieser Rhodopsine ist Channelrhodopsin 2 (ChR2). Ein Sequenzvergleich mit anderen mikrobiellen Rhodopsinen aus Archaebakterien, wie z.B. der lichtgetriebenen Protonenpumpe Bakteriorhodopsin, zeigt eine Homologie von bis zu 20 %. Aus diesem Grund kann angenommen werden, dass die hydrophobe N-terminale Hälfte mit circa 300 von 737 Aminosäuren ebenso aus einem Siebentransmembranhelixmotiv besteht, wie dies für Rhodopsinmoleküle typisch ist. Seit der Entdeckung 2003 durch Nagel et al. ist bekannt, dass es sich bei ChR2 um einen lichtgetriebenen, kationenselektiven Ionenkanal handelt, der in dieser Form bisher nicht bekannt war. Diese biophysikalische Charakteristik konnte durch detaillierte elektrophysiologische Daten erhoben werden. Sie lieferten zudem die Erkenntnis, dass ChR2 als „Werkzeug“ in der Neurobiologie verwendet werden kann, da die lichtinduzierte Depolarisation zum Feuern von Aktionspotentialen in ChR2-exprimierenden Neuronen führt. Die vorliegende Arbeit sollte dazu beitragen, die molekularen Mechanismen von ChR2 aufzuklären, indem elektrophysiologische, spektroskopische und biochemische Daten miteinander korreliert wurden. Dazu wurde ChR2 funktionell in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris exprimiert. Ein Glykosylierungstest konnte belegen, dass Pichia pastoris in der Lage ist, die für ChR2 erforderliche N-Glykosylierung durchzuführen. Mit einer 90%igen Expression war es somit möglich, ausreichend Protein für eine Metallchelat-Affinitätschromatographie zu gewinnen. Weiterhin konnte die bestehende Funktionalität nach der Isolierung von ChR2 nachgewiesen werden. Dies erfolgte zum einen über Messungen des charakteristischen Photostroms mittels der BLM-Technik. Zum anderen konnte dies durch spektroskopische Messungen der spezifischen Absorption von ChR2 bei 480 nm bestätigt werden. Die zeitaufgelöste Laserblitzabsorptionsspektroskopie lieferte zudem Differenzspektren des isolierten ChR2, die erstmalig das Vorhandensein eines spektral verschiedenen Intermediats bei 540 nm zeigten. Zusammen mit dem Zeitverlauf aller vier korrespondierenden Intermediate und der Hinzunahme elektrophysiologischer Daten konnte somit ein linearer Photozyklus bestehend aus vier Zuständen erstellt werden (erstellt durch Dr. Christian Bamann). Die ersten drei Intermediate des Photozyklus P1-P3 werden demnach durch die rotverschobene Spezies beschrieben, mit einer Relaxationszeit von unter einer Millisekunde. Dieses rote Intermediat spiegelt die Konformationsänderung des Retinals wider und geht mit dem Öffnen des Kanals einher. Die Zustände P2 und P3 konnten beide als kationenleitende Zustände identifiziert werden. Das Schließen des Kanals wird durch den Übergang von P3 zu P4 (spektral mit dem Grundzustand gleich) vermittelt. Das Zurückkehren in den Grundzustand folgt einem langsamen Prozess im Bereich von mehreren Sekunden. Biochemische, spektroskopische und elektrophysiologische Daten haben damit erfolgreich zur weiteren Aufklärung der molekularen Funktionsweise von ChR2 beigetragen. Mit diesen Ergebnissen ist nun die Erschließung neuer Informationen über die verschiedenen Signaltransduktionswege von Membranproteinen möglich.
Die Arbeit überprüft die Zusammensetzung der F1FO-ATP-Synthase in Säugetiermitochondrien, dem Enzymkomplex, der das meiste ATP für den Energiebedarf einer Zelle liefert. Es sind zwei neue Proteine identifiziert und als ATP-Synthase assoziiert verifiziert worden, das sog. dapit protein (diabetes-associated protein in insulin-sensitive tissue; Datenbanknummer in NCBI für Rattus norvegicus, gi|19424210) bzw. 6.8 kDa mitochondrial proteolipid (Datenbanknummer in NCBI für Rattus norvegicus, gi|109478763). Bis jetzt sind beide Proteine nicht zusammen mit dem Komplex V detektiert worden, da es sich bei beiden Proteinen um sehr kleine Membranproteine (kleiner 7 kDa) handelt und sie sehr leicht in Gegenwart von Detergenzien verloren gehen. Die etablierte Strategie zur milden Aufreinigung von Komplex V, die eingesetzte gelelektrophoretische Trennung und die gewonnenen Erkenntnisse zur Identifizierung solch kleiner Proteine können sicherlich auch Lösungsansätze für andere ungelöste Problemfälle in der Proteinkomplexanalytik liefern. Da beide neuen Proteine in die Modulation des metabolischen Zellzustandes involviert sein könnten, sind die erarbeiteten Daten für weitere funktionelle und biochemische Untersuchungen der ATP-Synthase äußerst nützlich. Außerdem könnten die Ergebnisse für neurologische und klinische Studien hinsichtlich der Ursachenforschung von Funktionsstörungen in den Mitochondrien von Interesse sein, da eines der zwei neuen Proteine früher schon mit Diabetes in Zusammenhang gebracht worden ist (dapit, diabetesassociated protein in insulin-sensitive tissue). Für ein bakterielles Multihäm c-Typ Cytochrom konnte massenspektrometrisch gezeigt werden, dass es auf eine unkonventionelle Weise Häm bindet. Durch massenspektrometrische Charakterisierung des Proteins konnte erstmals nachgewiesen werden, dass es nicht nur die Häm c-Bindemotive CX2-4CH und CXXCK, sondern auch Häm c-Bindemotive der Form CXnCH in Bakterien gibt. Diese Erkenntnis führt in der Molekularbiologie zu neuen Fragen, z. B. welche speziellen Lyasen (cytochrome c haem lyases) letztendlich für das Einfügen der Häm-Gruppe an solche neuen Motive verantwortlich sind. Auch die computerbasierte Vorhersage von c-Typ Cytochromen wird dieses Wissen wohl zukünftig in Suchstrategien umsetzen, um die neuen Häm c-Bindemotive bei der Genomanalyse von Organismen nicht zu übersehen. In dem Feld der Identifizierung und Charakterisierung von Membranproteinen im Allgemeinen konnten grundlegende Erkenntnisse zum Umgang mit alternativen Enzymen und deren Potential für einen zukünftigen Einsatz erarbeitet werden. Schwerpunktmäßig wurden die Enzyme Chymotrypsin, Elastase und Pepsin untersucht. Es konnte für alle drei Kandidaten gezeigt werden, dass sie bevorzugt an einer begrenzten Anzahl von Aminosäuren spalten. Besonders für Elastase ist diese Erkenntnis neu, da sie in der Literatur bisher als unspezifisches Enzym wie Proteinase K geführt wurde. Auch wenn die Spezifität der drei Enzyme nicht zu 100% wie bei Trypsin festgelegt werden kann, sondern es sich nur um eine Bevorzugung gewisser Aminosäuren handelt, sind die enzymatischen Spaltungen reproduzierbar. Selbst eine Auswertung der MS-Spektren mittels Peptide Mass Fingerprint (PMF) ist deshalb auch bei diesen weniger spezifischen Enzymen möglich. Die Intensität der MS-Signale muss aber berücksichtigt werden, was bei bisherigen PMF-Suchen jedoch nicht in der Art und Weise geschieht, wie es für diese Enzyme nötig wäre. An einigen Membranproteinen konnte letztendlich bereits beispielhaft gezeigt werden, dass der Einsatz von weniger spezifischen Enzymen für die Identifizierung des Proteins und der nachfolgenden Charakterisierung (z. B. Identifizierung von posttranslationale Modifikationen) vorteilhaft ist. Für Elastase konnte in diesem Zusammenhang auch demonstriert werden, dass sie problemlos in Lösungsmittelsystemen mit einem hohen organischen Anteil (Acetonitril, Isopropanol, Methanol) einsetzbar ist. 100% Sequenzabdeckung lassen sich aber auch bei weniger spezifischen Enzymen trotz der größeren Anzahl an Schnittmöglichkeiten nur erahnen. Zwei Hauptursachen hierfür sind wahrscheinlich die schlechte Zugänglichkeit des Enzyms zum Membranprotein bzw. die Bevorzugung bestimmter enzymatischer Fragmente in MALDI und ESI. Polyacrylamidgele mit alternativen Quervernetzern, bei denen sich die Geldichte vor dem Verdau verringern lässt, könnten die Zugänglichkeit zum Membranprotein zukünftig vielleicht positiv beeinflussen. Der Einsatz von organischen Lösungsmitteln und bestimmter Detergenzien beim Verdau verbessert ebenfalls die Zugänglichkeit zum Membranprotein. Die Zahl der Tenside, die mit der Massenspektrometrie sehr gut kompatibel sind, ist aber sehr gering, wie Untersuchungen in dieser Arbeit ebenfalls ergeben haben. Außerdem beschränkt sich die Anwendung von diesen Detergenzien ausschließlich auf MALDI. Die zu erwartenden Fortschritte bei der Identifizierung und Charakterisierung von Membranproteinen umschreibt daher besonders gut ein Aphorismus von Christian Morgenstern (deutscher Schriftsteller; 1871 – 1914): „Es gibt nur ein Neues: Die Nuance.“ Einige Nuancen sind in dieser Arbeit enthalten. In der Zukunft werden aber viele weitere solcher Nuancen das Überwinden der Hürde „Membran Proteomics“ immer realistischer werden lassen.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Entwicklung eines geeigneten Assays (eines standardisierten Reaktionsablaufs) für die Analyse der Funktion und Aktivität der Transporter für organische Kationen (OCT) mit Hilfe der auf einer festkörperunterstützten Membran (SSM) basierenden Elektrophysiologie. Die zweite Kernaufgabe war die Entwicklung der Expressionssysteme für die heterologe OCT-Expression. In den neunzigen Jahren wurden neue Membranproteine, OCT1-3, identifiziert, die eine wichtige Komponente für den Transport der strukturell unterschiedlichen organischen Kationen im menschlichen Organismus darstellen (Gründemann et al., 1994; Koehler et al., 1997; Koepsell et al., 1998; Zhang et al., 1998). Da etwa fünfzig Prozent der in der Klinik gebräuchlichen Medikamente und viele andere exogene Substanzen (Xenobiotika) polare organische Verbindungen sind, die bei einem physiologischen pH-Wert (7,4) überwiegend in protonierter Form als Kationen vorliegen und mittels OCT aus dem Körper ausgeschieden werden, gehören diese Proteine zu den pharmazeutisch bedeutenden Zielmolekülen (Targets) bei der Entwicklung neuer Medikamente. Letztere stellt einen sehr langwierigen Prozess dar, der die Untersuchung zahlreicher Substanzbibliotheken auf ihre Wirkung auf bestimmte Targets voraussetzt. Aufgrund der rasanten technischen Entwicklung in der Laborautomatisierung und der digitalen Mikroskopie können mittlerweile mehrere tausend Wirkstoffkandidaten in Ultra-High-Throughput-Screenings (UHTS) am Tag getestet werden, von denen aber nur ein minimaler Prozentsatz eine erste positive Reaktion (Hit) mit dem Target zeigt. Die Ergebnisse aus dem primären Screening-Prozess werden in einem zweiten Screening-Prozess weiter bearbeitet. In diesen High-Content-Analysen (HCA) werden dabei entgegen den ersten Untersuchungen die Substanzen nicht mehr einzig auf ihre Interaktion mit dem Target getestet. Vielmehr werden möglichst alle Informationen gesammelt und Effekte analysiert. Zurzeit werden folgende Assays dafür eingesetzt (Geibel et al., 2006): 1) radioaktive Assays, wie Ligandbindungsassays, Flux-Assays; 2) Fluoreszenzassays auf Basis von spannungs- oder ionenabhängigen Farbstoffen; 3) Flux-Assays auf Basis von Atom-Absorptions-Spektroskopie (AAS); 4) manuelle patch-clamp-Assays. Allerdings können diese Assays wegen unterschiedlicher Einschränkungen nur begrenzt eingesetzt werden. So treten bei den Fluoreszenzassays aufgrund der Farbstoff-Substanz-Interaktionen oft falsche positive Ergebnisse auf. Methoden mit radioaktiv markierten Substraten sind aus sicherheitstechnischen Gründen mit hohem Aufwand und entsprechenden Kosten verbunden. Das patch-clamp-System verfügt zwar über eine hohe Sensitivität und einen hohen Informationsgehalt, ist jedoch für das Screening wegen des geringen Durchsatzes und erheblicher Kosten nicht effizient. Diese Beispiele zeigen die Notwendigkeit der Entwicklung neuer Techniken für die pharmazeutische Wirkstoffsuche. Die SSM-basierte elektrophysiologische Detektionstechnologie ermöglicht die Untersuchung der Transportproteine in ihren nativen Membranen mit hoher Sensitivität ohne Fluoreszenzmarkierung (Geibel et al., 2006; Kelety et al., 2006). Diese Methode hat besondere Vorteile gegenüber anderen bei der Erforschung von Transporter-Proteinen, die im Gegensatz zu Ionenkanälen relativ wenig Ladung pro Zeiteinheit (1-104 Moleküle s-1) transportieren, und viele Techniken wegen der geringeren Empfindlichkeit für deren Untersuchung nicht geeignet sind.
Ein wichtiges Element zur Steuerung der Transkriptionseffizienz im Replikationszyklus des HI-Virus ist das Tat/TAR-System. Im Rahmen dieser Arbeit wurden einige kleine heterozyklische Verbindungen synthetisiert, die als potenzielle Inhibitoren des Tat-TAR-Komplexes von HIV-1 wirken sollten. Nach der Synthese des 1H-Pyrazol-3,4,5-triamin-sulfates sollte diese Verbindung dann in größere Strukturmotive eingebettet werden, von denen man sich erhoffte, dass sie in ihrer reduzierten Form in der Lage sein sollten, weitere H-Brücken zu benachbarten Basen der RNA auszubilden und dadurch die Affinität zu erhöhen. Es zeigte sich, dass die im Rahmen dieser Dissertation synthetisierten Phenazinderivate zwar alle mit Natriumdithionit reduziert werden konnten, diese Strukturen aber nicht luftstabil waren.
Das “Protein Associated with Myc” spielt in den verschiedenen physiologischen Vorgängen eine Rolle. Dazu zählen Prozesse der Synaptogenese und Schmerzverarbeitung ebenso wie eine Regulation des Pteridin- und cAMP-Stoffwechsels. Auf welche Weise PAM die unterschiedlichen Effekte vermittelt, ist bislang nur in Ansätzen verstanden. Um die Wirkmechanismen von PAM aufzuklären, wurden in dieser Arbeit seine biochemischen Funktionen untersucht. Die These, dass PAM als E3 Ubiquitinligase aktiv ist, konnte in vitro mittels biochemischer Versuche zweifelsfrei bestätigt werden. Sowohl das nativ aufgereinigte, humane PAM, als auch der heterolog expremierte C-Terminale Bereich (C-PAM), der die katalytisch aktive RING Finger Domäne enthält, wiesen die Fähigkeit zur Ubiquitinkettenbildung und Autoubiquitinierung auf. Bei der Identifikation eines möglichen Zielproteins rückte das Protein TSC2 und der damit verbundene TSC2 / mTOR Signalweg in den Fokus. Für das gewählte Modell-System HeLa Zellen ließ sich eine Interaktion von PAM und TSC2 durch Ko-Immunopräzipitationen und Immunzytochemie nachweisen. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass das vollständige, native PAM, nicht aber die isolierte RING Finger Domäne, TSC2 polyubiquitinieren und zum proteasomalen Abbau markieren kann. TSC2 ist ein negativer Regulator der mTOR Kinaseaktivität, in dem es den stimulatorischen Einfluss von Rheb auf mTOR inhibiert. PAM wird in HeLa Zellen durch das Phospholipid Sphingosin-1-Phosphat (S1P) aktiviert. Nach S1P Behandlung der Zellen war eine Phosphorylierung der Proteinkinase mTOR nachweisbar. Diese ging mit einer Aktivierung der Kinaseaktivität einher, wie die rapamycinsensitive Phosphorylierung der mTOR Zielproteine p70S6K und 4E-BP1 zeigte. Durch Gabe von Rezeptor-Agonisten/-Antagonisten konnte eine Beteiligung des S1P1 und S1P2 Rezeptors ausgeschlossen werden. Der zunächst vermutete Mechanismus eines S1P induzierten, PAM-abhängigen Abbaus von TSC2 konnte trotz vielfältiger Herangehensweisen nicht nachgewiesen werden. Eine Phosphorylierung als Indikation einer Inaktivierung war ebenfalls nicht detektierbar. Auch die GAP Aktivität von TSC2 auf Rheb, wird in in vitro Versuchen durch die Interaktion mit PAM nicht vermindert. Durch eine Verminderung der TSC2 Expression mittels spezifischer siRNA zeigte sich, dass TSC2 nicht in die S1P-abhängige mTOR Aktivierung involviert ist. Auch regulatorische Proteinkinasen wie AKT, ERK oder PI3K, die durch S1P aktiviert werden können, sind an dem Signalweg nicht beteiligt, wie die Hemmung dieser Enzyme mit spezifischen Inhibitoren zeigte. Dagegen konnte eine Beteiligung von PAM und Rheb zum einen mittels Proteintransfektion bestätigt werden, zum anderen ließen sich die S1P Effekte durch Hemmstoffe verhindern, die für eine Aktivierung von PAM, respektive Rheb, nötig sind. Durch Nukleotidbindungsstudien war ein Einfluss von PAM auf den GTP-Beladungszustand von Rheb nachweisbar. Sowohl in einem GTPS Bindungsversuch als auch in einem GDP Dissoziationsexperiment erhöhte PAM konzentrationsabhängig die GTP Bindung bzw. den GDP/GTP Austausch an Rheb. In dieser Arbeit wird damit erstmalig eine duale Funktion eines Proteins als Ubiquitinligase und GEF beschrieben. So konnte die postulierte Aktivität von PAM als Ubiquitinligase bestätigt und TSC2 als Zielprotein identifiziert werden. Gleichzeitig wurde ein TSC2 unabhängiger Weg der mTOR Aktivierung aufgeklärt, an dem PAM und Rheb beteiligt sind. Als möglicher Mechanismus kommt eine Aktivität von PAM als Guanin-Nukleotid Austausch Faktor (GEF) auf Rheb in Frage. Durch Beschreibung von PAM als negativem Regulator von TSC2 und Aktivator von Rheb trägt diese Arbeit einen wichtigen Beitrag zur TSC2 / mTOR Forschung bei. Umgekehrt ermöglicht sie eine neue Sichtweise auf partiell PAM-abhängige Vorgänge wie Synaptogenese und Nozizeption, indem sie TSC2 / mTOR in diese Prozesse integriert.
Eine wichtige Klasse von Membranproteinen ist die der aktiven sekundären Transporter. Diese Proteine werden in allen Spezies gefunden und verwenden einen Gradienten von löslichen Substanzen, um den Transport von Substraten voran zu treiben. Dieser Transportprozess ist essentiell, um die chemische Zusammensetzung des Zytoplasmas, wie Kalium- oder Natriumkonzentration von der des umgebenden Milieus unterschiedlich zu halten. Die Konzentration von K+ und Na+ in der Zelle sind wichtig für ein konstantes Zellvolumen, für die pH-Homöostase, für die Erregbarkeit von Nervenzellen und füür die Akkumulierung von Zuckern und Aminosöuren über Kotransportsysteme. In Bakterien wie Escherichia coli wird mit der Oxidation von Substraten durch die Elektronentransportkette ein Protonengradient und gleichzeitig eine Potentialdifferenz erzeugt. Ein Beispiel für einen sekundären Transporter, der diese Potentialdifferenz ausnutzt ist der Na+/H+-Antiporter NhaA, einer der am besten untersuchten Antiporter aus E. coli (Hunte, Screpanti et al. 2005). Dieser Antiporter ist essentiell für die Fähigkeit von Bakterien im alkalischen pH-Bereich zu überleben. Auch bei Säugetieren, sind die Isoformen der humanen Natrium/Protonen-Antiporter SLC9A1-SLC9A8 (NHE1-8) unentbehrlich für eine Reihe physiologischer Prozesse. So wird über die Antiporter-Aktivität nicht nur der Säure-Base-Haushalt und das Verhältnis des Zellvolumens zur Menge an Elektrolyten reguliert, Antiporter spielen ebenso eine wichtige Rolle bei der Adhäsion, Migration und Proliferation der Zelle (Orlowski and Grinstein 2004). Anomalien in diesem Bereich sind charakteristisch für maligne Zellen. Die Rolle von NHE1 in der Entwicklung von Tumoren ist daher ein wichtiger Ansatzpunkt für die Entwicklung von Krebsmedikamenten. Im Herz ist NHE1 die dominierende Isoform und wird damit zu einem pharmakologisch wertvollen Zielprotein (Malo and Fliegel 2006). Struktur und Mechanismus der meisten Antiporter ist bis dato jedoch noch nicht bekannt. Neben den klassischen Methoden der Pharmaentwicklung wird die strukturbasierende Wirkstoffentwicklung immer wichtiger um effiziente Medikamente ohne Nebenwirkung zu herzustellen. Hierfür werden jedoch 3D-Strukturen von Proteinen, sowie genaue Kenntnisse von deren Mechanismus benötigt. Zieht man in Betracht, dass 70% aller bis jetzt entwickelten Medikamente als Ziel ein Membranprotein haben, wird die Notwendigkeit klar, eine möglichst große Anzahl von Membranproteinstrukturen verfgbar zu haben. Wie bereits erwähnt ist die Klasse der monovalenten Kation/Proton-Antiporter aufgrund ihrer vielfältigen Aufgaben, eine äußerst wichtige Zielgruppe für die strukturbasierende Wirkstoffentwicklung. Die große Anzahl an entschlüsselten Genomen eröffnet hier ein breites Forschungsfeld füür die Strukturbiologie. In dieser Arbeit wurden daher Techniken und Methoden aus Hochdurchsatz-orientierten Strukturgenomikprojekten übernommen, um eine große Anzahl von Zielproteinen in ausreichender Menge für die funktionelle Charakterisierung und für die Kristallisation zu produzieren. Als Zielorganismen wurden Salmonella typhimurium LT2, Helicobacter pylori 26695, Aquifex aeolicus VF5 und Pyrococcus furiosus ausgewählt. Die Grundlage dieser Entscheidung hierfür waren die humanpathogenen Eigenschaften der beiden zuerst genannten Organismen und die Hyperthermophilie der beiden letzteren. Dadurch konnten sowohl klinische Anwendungsmöglichkeiten, als auch die potentiell höhere Stabilität der hyperthermophilen Proteine genutzt werden. Als Proteinzielgruppe wurden die monovalenten Kation/Proton-Antiporter aus allen 4 Organismen ausgewählt. Des Weiteren wurden Antiporter zweier eukaryotischer Systeme, Saccharomyces cerevisiae und Homo sapiens in die Zielproteingruppe aufgenommen. In dieser Arbeit wurden 24 verschiedene monovalente Kation/Proton-Antiporter untersucht. Von diesen 24 Zielproteinen konnten 12 in Expressionsvektoren kloniert und produziert werden. Von diesen 12 Antiportern konnten die Zielproteine STM0039 (STNhaA), HP1552 (HPNhaA), STM1556 (NhaC) und PF2032 (NhaC) in einer für die Kristallisation ausreichenden Homogenität und Ausbeute gereinigt werden. Mit der Ausnahme von HP1552 ist bis heute in keiner Veröffentlichung über diese Zielproteine berichtet worden. Durch Komplementationsexperimente mit dem E. coli-Deletionsstamm EP432 konnten eine Reihe von Zielproteine (STM0039, HP1552, PF2032, Aq_2030, STM1806, STM1556) bezüglich ihrer Fähigkeiten zum Na+/H+-Antiport untersucht werden. Die Ziel-proteine STM0039, STM1556 und HP1552 konnten zum ersten Mal kloniert, produziert, gereinigt und anschlieáen in Liposomen rekonstitutiert werden.Weiterhin konnte durch SSM-Messung die pH-Regulation der Zielproteine STM0039 und HP1552 gezeigt werden. Im Gegensatz zu bisherigen Literaturangaben ist HP1552 im pH-Bereich von pH 6 bis 8,5 nicht konstitutiv aktiv, sondern erfährt eine ähnliche Aktivierung wie STM0039 oder ECNhaA. STM0039 lässt sich zudem durch 2-Aminoperimidin inhibieren. Für STM0039 konnten die ersten Proteinkristalle der inaktiven Konformation bei pH 4 erzeugt werden. Weiterhin wurde in dieser Arbeit ein gegen das Zielprotein STM0039 gerichtetes scFV-Antikörperfragment (F6scFv) eingehend charakterisiert. Durch die Ko-Kristallisation des Antikörperfragments F6scFv mit STM0039 konnten die ersten 3 dimensionalen Kristalle in einer aktiven Proteinkonformation bei pH 7,5 erzeugt werden. Neben den bereits verfeinerten Kristallisationsbedingungen für das Zielprotein STM0039 wurden erfolgreich erste Kristallisationsbedingungen für STM0086 und PF2032 gefunden. Es wurde eine Vielzahl von Produktions- und Reinigungsprotokollen füür die Zielproteine etabliert. Dadurch ist der Grundstein füür weitergehende Charakterisierungs- und Kristalli-sationsexperimente gelegt. Die in dieser Arbeit etablierte Kombination von Hochdurch-satzmethoden mit klassischen Vorgehensweisen zur Proteincharakterisierung lassen sich leicht auf anderen Membranproteinklassen bertragen und die Geschwindigkeit der ver-schiedenen Schritte bis zur Strukturlösung stark beschleunigen.