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An den Folgen der HIV-Infektion sind bisher mehr als 15 Millionen Menschen gestorben und die Zahl der Neuinfektionen wächst ständig. Nach Einführung der hochaktiven antiretroviralen Kombinationstherapie (HAART) 1995 konnte die HIV-Replikation im Patienten unterdrückt und der Verlauf der Krankheit verzögert werden. Aber die Bildung resistenter HIV-Stämme während der Therapie und die hohe Toxizität der Medikamente limitieren diese Erfolge. Einen neuen Therapieansatz bietet die genetische Modifikation von T-Lymphozyten zur "intrazellulären Immunisierung" der Zielzellen von HIV. Dabei werden die Zellen mit einem retroviralen Vektor transduziert und exprimieren ein antivirales Gen, das sie vor der HIV-Infektion schützt. In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe von Laer wurde der retrovirale Vektor M87- Ineo entwickelt, der die Expression des membranverankerten Fusionsinhibitors C36/T20 auf der Zelloberfläche ermöglicht. Durch das Peptid sind die Zielzellen effizient vor der Infektion mit HIV geschützt (Hildinger et al., 2001). Das therapeutische Gen von M87-Ineo besteht aus dem Signalpeptid von LNGFR für die Translokation in das ER, dem inhibitorischen Peptid C36/T20, das von HIV-1 gp41 abgleitet ist, einem flexiblen Linker sowie aus der Transmembrandomäne von LNGFR für die Verankerung in der Plasmamembran. In der vorliegenden Arbeit wurde dieser retrovirale Vektor erfolgreich für die klinische Applikation zur Gentherapie der HIV-Infektion optimiert. Ziel war es, die potentielle Immunogenität des exprimierten Peptides zu minimieren, die Expression zu erhöhen sowie der Resistenzbildung entgegenzuwirken. Der Linker im Basiskonstrukt M87-Ineo ist abgeleitet aus dem Gelenk des murinen Antikörpers von IgG2 und verleiht dem Hemmpeptid Flexibilität. Um die potentielle Immunogenität des exprimierten Peptides zu reduzieren, wurde der Linker des murinen Antikörpers IgG2 durch Gelenke ("Hinge") von humanen Antikörpern der IgG-Klasse ersetzt. Das Konstrukt mit der humanen "Hinge" von IgG2 exprimierte genauso hoch wie das Basiskonstrukt und hemmte mindestens so effizient die HIV-Replikation. Durch die N-terminale Verlängerung des C-Peptids um 10 Aminosäuren konnte das Risiko der Resistenzbildung minimiert werden. Das verlängerte C-Peptid war in der Lage, HIV-Hüllproteine zu hemmen, die gegen das C36/T20-Peptid resistent sind. Das optimierte Peptid von M87o bestand somit aus dem Membrananker von trunkiertem CD34, dem Linker von humanem IgG2 sowie aus dem verlängerten C-Peptid (C46). Weiterhin wurde ohne Verlust der Expression oder Hemmwirkung des membranverankerten C-Peptids ein RNAElement (RRE decoy) erfolgreich als weiteres Hemmprinzip in den Vektor eingefügt, um die Bildung resistenter HIV-Stämme zu unterbinden. Durch Einsatz eines optimierten Leaderelementes im retroviralen Vektor konnte die Expression des inhibitorischen Peptides mehr als verzehnfacht werden. Damit konnte das Peptid und dessen Hemmung erstmals auch in primären Zellen nachgewiesen werden. Der Vergleich zwischen dem Basiskonstrukt M87-Ineo und dem optimierten Konstrukt M87o-RRE-Ineo zeigte, dass die erhöhte Expression auch mit einer wesentlich verbesserten Hemmwirkung einherging. In Zell-Zellfusionsassays wurde außerdem nachgewiesen, dass die Wirkung des C-Peptids auf der Hemmung des Viruseintritts von HIV in die Zelle beruht. Für die klinische Applikation wurde der Vektor M87o-RRE konstruiert, der die optimalen Vektorelemente und Peptidmodule enthielt, aber aus dem das Neomycin-Resistenzgen entfernt wurde. Dies führte zu einer nochmals höheren Expression des C-Peptids sowie zur weiteren Verminderung der Immunogenität des retroviralen Vektors. Das Markergen wurde ohnehin nicht mehr benötigt, da die genetisch modifizierten Zellen aufgrund der hohen Transgenexpression einfach detektiert werden konnten. Der optimierte Vektor M87o-RRE hemmte die HIV-Replikation so effizient, dass bisher keine resistenten Stämme isoliert werden konnten. Bei Toxizitätsstudien in Maus und Rhesusmacaquen konnten keine Nebenwirkungen oder Immunogenität beobachtet werden. Durch die erfolgreiche Optimierung steht nun für die klinische Studie der Phase I der bestmögliche retrovirale Vektor zur Verfügung.
Klinische Forschung zum Mammakarzinom in Deutschland wird von zahlreichen Faktoren bestimmt. Um die förderlichen und hinderlichen Faktoren bei der Planung und Durchführung von klinischer Forschung darstellen zu können, werden diese am Beispiel der größten deutschen Brustkrebsforschungsgruppe, der German Adjuvant Breast Cancer Group, GABG, dargestellt. In die GABG-Studien wurden seit der Gründung der Forschungsgruppe im Jahr 1981 in 18 Studien 9.692 Patientinnen eingebracht. Grundlage sind neben den Erfahrungen einer langjährigen Tätigkeit als Studienkoordinatorin dieser Forschungsgruppe die Ergebnisse einer schriftlichen und einer mündlichen Befragung der teilnehmenden Kliniken. Diese Arbeit beleuchtet die bei der Planung zu berücksichtigenden Kriterien wie, z.B. rechtliche und finanzielle Grundlagen, Kooperation mit der Klinikverwaltung, mit der Pharmazeutischen Industrie und mit anderen Studiengruppen, die Abhängigkeit von Ethikkommissionen und von der Qualität der Zentren sowie das Interesse der Öffentlichkeit an klinischer Forschung generell. Trotz förderlicher Einflüsse gibt es schon im Anfangsstadium einer klinischen Studie Defizite, die den Beginn einer Mammakarzinom-Studie in Deutschland behindern und teilweise sogar verhindern können. Die Effizienz von klinischer Forschung zum Mammakarzinom in Deutschland könnte wesentlich besser sein, wenn klinische Forschung in Kooperation statt in einem Nebeneinander gleichartiger Studiengruppen zum Mammakarzinom mit den fast gleichen Studieninhalten stattfinden würde. Bei der Durchführung der Studien zum Mammakarzinom gibt es im Rahmen der hier dargestellten Studiengruppe Ansätze, die die Effizienz von Studien bereits gesteigert haben. Dazu gehören positive Beispiele von gelungener Kommunikation mit den Prüfzentren, geeignete Fortbildungsangebote für Prüfärzte und für niedergelassene Ärzte sowie für das Dokumentationspersonal der teilnehmenden Kliniken. Mit der Darstellung der hinderlichen Faktoren bei der Durchführung der Studien in der GABG werden die Defizite der klinischen Forschung zum Mammakarzinom in Deutschland beispielhaft vorgestellt. Defizite sind neben der geringen Stellung der klinischen Forschung in Deutschland in der mangelnden Institutionalisierung und den strukturellen Defiziten klinischer Forschung sowie in den daraus resultierenden rigiden Verwaltungsstrukturen zu finden. Zudem wird auf die fehlende Ausbildung für klinische Forschung und den kaum gelernten Umgang mit dem Patienten als hinderliche Faktoren hingewiesen. Die schlechten Arbeitsbedingungen für Prüfärzte, der ständige Prüfarztwechsel, sowie das geringe kulturelle Ansehen der klinischen Forschung in Deutschland sind weitere Gründe für die mangelnde Patienteneinbringung in Studien und für die zeitverzögerte Dokumentation von klinischen Studien. Die Verwertung der Studienergebnisse ist innerhalb der GABG, aber auch im internationalen Vergleich noch zu gering. Zum Schluss werden Vorschläge für die Verbesserung der klinischen Forschung zum Mammakarzinom in Deutschland gemacht. Dazu gehört ihre bessere Institutionalisierung, mehr staatliche Förderung (DFG-Mittel) und damit die Stärkung der Unabhängigkeit von der Industrie, die vermehrte Kooperation zwischen allen beteiligten Gruppierungen, die Umsetzung des von der EU geforderten „einen Ethik- Votums“, die Aufstockung und bessere Bezahlung von Personal für klinische Forschung, die Einführung einer Ausbildung und die Verstärkung der Fort- und Weiterbildungsanstrengungen für klinische Forschung. Abgerundet wird dies durch die Forderung nach Qualitätssicherung durch GCP/ICH Konformität bei der Ausführung der mit klinischer Forschung verbundenen Tätigkeiten. Ziel sollte weiterhin die Steigerung der Veröffentlichungen der Forschungsergebnisse in internationalen Journalen, in der Fachpresse, aber auch in der Laienpresse sein. Nur so kann das Interesse der Öffentlichkeit und noch nicht erkrankter Frauen an klinischer Forschung in Deutschland geweckt werden. Mit dem Ausblick auf eine Neustrukturierung der GABG durch Gründung der German Breast Group (GBG), einer Forschungs GmbH, die als Plattform für klinische Studien zum Mammakarzinom eine schnellere, zielgerichtetere und damit erfolgreichere Umsetzung klinischer Forschung in Deutschland mit verbesserter Therapie zum Wohle des Patienten anstrebt, wird diese Arbeit abgeschlossen.
R-Flurbiprofen wird als das „inaktive“ Isomer des NSAIDs Flurbiprofen angesehen, weil es in vitro die Cyclooxygenase-Aktivität in therapeutischen Konzentrationen nicht hemmt. Dennoch zeigte sich, dass R-Flurbiprofen antinozizeptive und antikanzerogene Effekte hervorruft, obwohl das R-Enantiomer bei Ratte und Mensch nur marginal zum S-Enantiomer epimerisiert wird. Um diese Effekte näher untersuchen zu können, wurden sowohl in vivo als auch molekularbiologische Experimente durchgeführt: R- und S-Flurbiprofen wurden intraperitoneal in den Do sierungen 1, 3, 9 mg/kg und Dexamethason (Kontrolle) in einer intraperitonealen Dosis von 0.5 mg/kg Ratten verabreicht. Die Effekte von R- und S-Flurbiprofen und Dexamethason wurden in der Zymosan-induzierten Hinterpfotenentzündung im Vergleich zu Vehikel untersucht. Die Gruppengröße umfasste 3 – 6 Ratten pro Behandlung. Außerdem wurden Gewebeproben aus der entzündeten Pfote und dem Rückenmark auf eine PGE2-Freisetzung, Expression von COX mRNA und COX Protein hin untersucht. Weiterhin wurde die Hemmung der Aktivierung von Transkriptionsfaktoren (NFkB und AP-1) in RAW 264.7 Mausmakrophagen gemessen. R-Flurbiprofen zeigte in der Zymosan-induzierten Hinterpfotenentzündung der Ratte eine ähnliche antiinflammatorische Aktivität wie Dexamethason. Dieser beobachtete Effekt läßt sich zumindest teilweise über eine Hemmung der NFkB Aktivität erklären. R-Flurbiprofen hemmte: 1.) die LPS-induzierte NFkB DNA-Bindungsaktivität in RAW 264.7 Makrophagen, 2.) die Translokation der p65 Untereinheit in den Kern dieser Zellen und 3.) die Zymosan induzierte NFkB abhängige Gentranskription in der entzündeten Pfote und dem Rückenmark von Ratten. S-Flurbiprofen zeigte ähnliche Effekte, war jedoch weniger potent. R-Flurbiprofen hemmte ebenfalls die DNA Bindungsaktivität von AP-1, einem anderen wichtigen Transkriptionsfaktor bei Entzündungsprozessen. Da R-Flurbiprofen eine wesentlich geringere gastrointestinale Toxizität aufweist, lässt es sich möglicherweise als antiinflammatorische Substanz bei Erkrankungen einsetzen, in der die vermehrte oder konstitutive NFkB und AP-1 Aktivierung an pathophysiologischen Prozessen beteiligt ist. Zusammengefasst lässt sich der antiinflammatorische Effekt von R-Flurbiprofen über eine verminderte COX-2 Expression und eine Hemmung der Aktivierung der Transkriptions faktoren NFkB und AP-1 erklären.
Die intensiven gekühlten Schwerionenstrahlen des ESR-Speicherrings in Kombination mit dem dort installierten Überschallgastarget bieten einzigartige Möglichkeiten, Elektroneneinfangprozesse bei unterschiedlichen Projektilenergien zu untersuchen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Emission der charakteristischen Balmerstrahlung detailliert nach (n, j)-Zuständen untersucht; die Lyman-alpha-Strahlung konnte aufgrund der großen Feinstrukturaufspaltung des 2p3/2-Niveaus darüber hinaus auch nach der Besetzung der magnetischen Unterzustände untersucht werden. Hierbei wurde gezeigt, dass der Einfangmechanismus einen starken Einfluss auf die Besetzung der magnetischen Unterzustände und damit auf die Winkelabhängigkeit der Emission der charakteristischen Photonen hat. Erstmals konnte an einem schweren Stoßsystem die Multipolmischung beim Ly-alpha1-Übergang mit großer Genauigkeit nachgewiesen werden; es ergab sich eine sehr gute Übereinstimmung mit der theoretischen Vorhersage. Aus dem Vergleich der Messung der Anisotropie bei höheren Energien mit der Vorhersage einer relativistisch exakten Theorie wurde geschlossen, dass die Messwerte nur dann erklärt werden können, wenn die Mischung von E1- und M2-Übergängen berücksichtigt wird. Durch den Vergleich der als zuverlässig anzusehenden Vorhersage für den REC-Prozeß mit den Messwerten konnte, erstmals für atomare Übergänge in Schwerionen, die Beeinflussung der messbaren Anisotropie durch Mischung der Strahlung unterschiedlicher Multipolaritäten aufgedeckt werden. Hiermit war es möglich, das Übergangsratenverhältnis Gamma M2 / Gamma E1 und daraus das Übergangsamplitudenverhältnis <M2>/<E1> zu extrahieren. Dieser kleine Beitrag(<1%) ist mit anderen Methoden nicht zu vermessen. Die beiden nichtrelativistischen Theorien, den nichtradiativen Einfang in das Projektil beschreiben, liefern bei den totalen Einfangswirkungsquerschnitten nahezu gleiche Ergebnisse in Übereinstimmung mit dem Experiment. Auch die (n, j)-differentiellen Querschnitte zeigen bei dem Vergleich mit den gemessenen Balmerspektren eine sehr gute Übereinstimmung. Erst wenn die magnetischen Unterzustände in die Untersuchung miteinbezogen werden, weichen die beiden Theorien voneinander ab. Unter Einbeziehung der Multipolmischung stimmt die Vorhersage der CDW-Theorie mit den Messwerten überein; die andere Theorie unterschätzt das Alignment des 2p3/2-Zustands und die daraus folgende Anisotropie der Lyman-alpha1-Strahlung. Es muss hervorgehoben werden, dass es durch die Anwendung der Abbremstechnik für nacktes Uran gelungen ist, diese Prozesse in einem Bereich extrem starker Störung (Q/v) zu untersuchen. Dieser Bereich ist im Allgemeinen experimentell nicht zugänglich und ist eine Herausforderung für die theoretische Beschreibung. Wie sich aus den Ausführungen zu den Zerfallskaskaden ergibt, ist die Messung des Alignments bei niedrigen Stoßenergien stark von Kaskadeneffekten beeinflusst. Das bedeutet, dass das Alignment der Lyman-alpha1-Strahlung sowohl durch den direkten Einfang als auch durch die Zerfallskaskade bestimmt ist. Dieses resultiert in einer von der jeweiligen Theorie abhängigen Vorhersage, wodurch sich eine integrale Aussage über die Güte einer bestimmten Beschreibung ableiten lässt.
Im Laufe der letzten Jahre hat sich die Aufmerksamkeit auf die Entwicklung von neuen RNA-bindenden Molekülen gerichtet. Grund dafür waren neue Erkenntnisse über die strukturelle und funktionelle Komplexität der RNA. So spielen spezifische RNA-Protein-Wechselwirkungen eine essentielle Rolle bei regulatorischen Prozessen. Die Spezifität dieser Interaktionen wird durch die dreidimensionale RNA-Struktur bestimmt. Somit bieten diese Wechselwirkungen ein attraktives Angriffsziel für die Suche nach niedermolekularen Substanzen, die in die regulatorischen Prozesse pathogener Organismen eingreifen. So gibt es im Replikationszyklus des HI-Virus mehrere essentielle Schritte, die der Interaktion zwischen charakteristischen, viralen RNA-Strukturen und der viralen Proteine bedürfen. Ein prominentes Beispiel ist die Verpackung der viralen RNA. Es handelt sich um einen hochspezifischen Prozess, bei dem aus einer Vielzahl von zellulären, viralen, gespleißten und ungespleißten RNA-Fragmenten, spezifisch die virale genomische RNA in die neu entstehende Partikel verpackt wird. Die Spezifität der Verpackung basiert auf der Erkennung der dreidimensionalen ps-Verpackungsstruktur am 5´-Ende der ungespleißten, viralen RNA durch die NCp7-Domäne des p55Gag- Vorläuferproteins. Die NCp7-Domäne ist durch zwei Zinkfingermotive, die in allen Onko- und Lentiviren mit Ausnahme der Spumaviren konserviert sind, gekennzeichnet. Durch die zentrale Rolle im HIV-1 Replikationszyklus bietet die ps-NCp7-Interaktion ein potentielles Angriffziel für antivirale Interventionen. Das langfristige Ziel des Projektes war die Identifizierung von Peptidliganden für das HIV-1 ps-Signal mittels der Phage-Display-Methode, welche die Basis für die Entwicklung antiviraler Moleküle liefern sollen. Die Methode des Phage-Display basiert auf der Affinitätsselektion von Peptiden, die als Fusionsproteine mit dem Hüllprotein an der Oberfläche eines Bakteriophagen exprimiert werden. Sie wurde sehr erfolgreich für die Selektion von Peptidliganden für Antikörper oder andere Proteindomänen eingesetzt. Für RNA-Targets gibt es nur gelegentliche Hinweise. Im Vordergrund des Projektes standen strukturelle Erkennungsmerkmale der Ligand-RNAWechselwirkung. Zur Identifizierung von Peptidliganden für das ps-Verpackungssignal sowie deren Teilelement SL3, das ebenfalls Verpackungsaktivitäten aufweist, wurden kommerzielle Phagen-Banken mit zufälliger Aminosäuresequenz eingesetzt. Im Rahmen des ersten Teilabschnitts konnten Phagen selektiert werden, die spezifisch an die Targetstrukturen gebunden haben und die Grundlage für die Ableitung von Peptidmotiven bildeten. Insgesamt konnten neun Motive abgeleitet werden, darunter das tryptophanreiche HXWPWW-Motiv, das Aminosäurehomologien zum nativen Liganden, dem NCp7-Protein, zeigte. Die Spezifität zur Ziel-RNA wurde mittels ELISA, CD-Spektroskopie und Peptidfilter-Bindungsstudien analysiert. Für die tryptophanreichen Peptide wurde die Affinität zur ps- und SL3-RNA ermittelt. Sie lag für das HWWPWWPeptid bei ca. 25 ± 2µM zur ps-RNA und bei ca. 34 ± 2µM zur SL3, also deutlich unter der Affinität des NCp7 (ca. 30nM). Entsprechend ließ sich das HWWPWW-Peptid in einem Kompetitions-ELISA mit ps-RNA als Target durch das native p55Gag- und NCp7-Protein, jedoch nicht durch ein unrelevantes RNA-bindendes Protein, verdrängen. Anschließend wurden mittels der CDspektroskopischen Mutationsanalyse die Bindungseigenschaften der Peptide optimiert, so dass zwei weitere Liganden, das HWWAWW- und HAWPWWPeptid, als potentielle ps-Liganden ermittelt werden konnten. Im zweiten Teil der Arbeit erfolgte die funktionelle Analyse der identifizierten Peptide hinsichtlich ihrer inhibitorischen Eigenschaften. Dazu wurden in HR´YFP-Zellen Pseudoviren, die das verpackbare Konstrukt ps-Yfp, sowie HIV-1 Gag-Pol und das Env des VSV-G enthielten, in Gegenwart des ps-bindenden Peptides, das als Rfp-Vpr-Fusionprotein vorlag, generiert. Eine Hemmung der Peptide auf die Verpackung der viralen RNA sollte dadurch messbar sein, dass die produzierten Pseudoviren weniger von der verpackbaren ps-Yfp-RNA enthielten als die Kontrollviren, die in Gegenwart eines Kontrollpeptids generiert wurden. Die Menge der Virus-RNA in den Partikeln wurde mittels einer quantitativen PCR-Methode, der Real-time-PCR, bestimmt. Einen hemmenden Einfluss auf die Verpackung der ps-Yfp-RNA und somit eine Inhibition der ps-NCp7-Interaktion hatte das HWWAWW-Peptid. Durch den Einsatz von 3 µg der HWWAWW-Rfp-Vpr-Vektors konnte die RNA-Menge um das fast 4000-fache im Vergleich zum Kontrollansatz reduziert werden.
Kompakte Sterne stellen neben weissen Zwergen und schwarzen Löchern eine der möglichen Endzustände der Evolution von Sonnen dar. Diese extrem dichten astrophysikalischen Objekte können als Restobjekte von massiven Sternen im Zentrum von Supernova-Explosionen entstehen. Allein in unserer Galaxie sind derzeit ca. 1500 solcher Objekte bekannt. Die Materie innerhalb der kompakten Sterne stellt neben der frühen Urknall-Phase, die dichteste, uns zugängliche Energieform im gesamten Universum dar; sie beschreibt den letzten stabilen Zustand bevor die Materie unaufhaltsam kollabiert und durch die Bildung eines Ereignishorizontes von der Aussenwelt abgetrennt wird. Die Eigenschaften der kompakten Sterne werden massgeblich durch zwei fundamentale Kräfte bestimmt: Die Quanten-Chromodynamik (QCD), die den Kräfteaustausch der elementaren Quarks durch farbgeladene Gluonen beschreibt, und die Allgemeine Relativitätstheorie, die die attraktive, gravitative Wechselwirkung der Sterne durch eine Verformung ihrer raumzeitlichen Struktur formuliert. In den ersten beiden Kapiteln der vorliegenden Arbeit wird zunächst die derzeitige Theorie der elementaren Wechselwirkungen mittels einer eichtheoretischen Formulierung beschrieben. Astrophysikalische Folgerungen der Allgemeinen Relativitätstheorie, wie die Raumzeitkrümmung innerhalb und ausserhalb kompakter Sterne und die Theorie schwarzer Löcher werden im Detail diskutiert und mittels dreidimensionaler Diagramme veranschaulicht. Im dritten Kapitel werden die numerisch erhaltenen Resultate der Eigenschaften der kompakten Sterne zusammengefasst und in folgende Gruppen untergliedert: Neutronensterne, Quarksterne, hybride Sterne und Zwillingssterne. Die mögliche Realisierung des Quark-Gluon-Plasmas im Inneren der kompakten Sterne wird diskutiert. Anhand von existierenden und zukünftig geplanten astrophysikalischen Beobachtungsmöglichkeiten (z.B. Gravitationswellendetektoren) wird die experimentelle Überprüfbarkeit der dargestellten Ergebnisse aufgezeigt.
Es wurden die Herstellung von protaminbasierten Oligonukleotid-Nanopartikel („binäres System“) physikochemisch charakterisiert. Vermischt man Oligonukleotide mit einer wässrigen Protaminlösung entstehen nach wenigen Sekunden sehr kleine Partikel (<20 nm). Der Partikeldurchmesser nimmt mit der Zeit zu und stabilisiert sich nach etwa 30 Minuten. Danach sind die NP für mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur stabil. Die Größe, die Größenverteilung und die Gestalt der Partikel wurden bestimmt. Diese runden Partikel konnten in ihrer Größe durch die Veränderung von Protamin- und ON-Konzentration in ihrer Größe gesteuert werden (etwa 100-1000 nm Durchmesser). Die Veränderung der Kettenlänge der Oligonukleotide (10-25 mer) zeigte einen nur geringen Einfluss auf die Größe und Größenverteilung der Partikel. Auch konnte die Oberflächenladung (Zetapotential) der Partikel durch die Veränderung des Protamin/OligonukleotidVerhältnisses gesteuert werden. Analytische Ultrazentrifugations-Messungen (durchgeführt vom AK Prof. Schubert) mit diesen Partikeln zeigte das diese schon in geringen Salzkonzentrationen (15 mM NaCl) nach wenigen Minuten zur Aggregation neigen. Diese konnte durch 15% Polyethylenglykol 20.000 Lösung gestoppt werden. Dies war ein wichtiger Hinweis, dass man mittels Makromolekülen die Partikelpräparationen stabilisieren kann. Ferner wurde die Zusammensetzung der Partikel, sowohl hinsichtlich der Oligonukleotide und als auch des Protamingehaltes bestimmt. Mehr als 90% des Wirkstoffes konnte in die Nanopartikel eingebunden werden. Da das von uns verwendete Protamin keine aromatische Aminosäure beinhaltet (Absorptionsmaximum kleiner 200 nm) und die Standard-Proteinnachweise wie z.B. BCA-Assay nur ungenügende Nachweisgrenzen aufweisen, wurde eine neue Protamin-Quantifizierungmethode mittels ortho-Phthaldialdehyd (OPA) und N-Acetyl-L-Cystein (NAC) für die Mikrotiterplatten erarbeitet. Damit war es möglich, auch in Anwesenheit von DNA, Protamin und Protaminsalze in einer Konzentration von 250 ng/ml sicher nachzuweisen. Ein weiteres Problem mit diesem binären Partikelsystem, neben der Aggregationsneigung, zeigte sich in verschiedenen Zellmodellen (durchgeführt von Norbert Dinauer, AK von Briesen). Die Partikel wurden zwar im großen Maße von humanen Macrophagen, humanen T-Zellen aufgenommen, aber danach langsam freigegeben. Auch wurden intrazellulär Aggregate gefunden. Humanes Serum Albumin (HSA) zeigte einen positiven Effekt auf die Aggregationsneigung (AlPrO-Nanopartikel). Es fungiert hierbei als ein Schutzkolloid, welches nur zu einem geringen Teil in die Partikelmatrix inkorporiert wird (<10%). Der Großteil des HSA befindet sich in der äußeren wässrigen Phase. Es ist zu vermuten dass es sterische die Partikel an der Sekundäraggregation hindert. Zusätzlich konnten primäre Komplexe vor der Zugabe von HSA aus HSA und Protamin beobachtet werden (Durchmesser 14 nm). Dies führt zu einem veränderten Self-Assembly der Nanopartikel gegenüber dem binären System. AlPrO-Partikel, hergestellt mit 1 mg/ml HSA, waren über Stunden stabilisiert in Zellmedium. Sie sind von runder Gestallt und 200-350 nm im Durchmesser groß. Sie weisen eine leicht negative Oberflächenladung auf, was auf eine Abdeckung der Partikeloberfläche mit HSA hinweist. Nahezu die gesamte eingesetzte Menge des Oligonukleotides wurde in die Partikelmatrix inkorporiert (> 90%). Es war möglich Partikel dieser Qualität mit unmodifizierten-, phosphorothioat modifizierten Oligonukleotiden und doppelsträngiger RNA (siRNA) herzustellen. Die von uns entwickelten AlPrO-Nanopartikel stellen eine neue Möglichkeit der peptidbasierte Transfektion von Oligonukleotiden in Zellen dar.
In dieser Arbeit wurden zwei Idealkristallsysteme und drei Systeme, die im weitesten Sinne als Domänenkristalle zu bezeichnen sind, mit quantenmechanischen Methoden untersucht, die auf Dichte-Funktional-Theorie basieren. Dabei wurden je nach System unterschiedliche Eigenschaften der jeweiligen Kristalle betrachtet. Zusätzlich wurden die berechneten Domänenkristalle jeweils mit entsprechenden Idealkristallen bezüglich ihrer Stabilität verglichen. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass sich die hier verwendeten Rechenmethoden sehr gut zur Untersuchung von Grundzuständen und Strukturen unter hydrostatischem Druck sowie von Bindungseigenschaften eignen. Desweiteren lieferten die Ergebnisse starke Hinweise darauf, dass Kristalle mit Strukturgradienten nur dann existieren können, wenn sie sich vom Idealkristall um sehr geringe Energien unterscheiden, die unter der Fehlergrenze der hier angewendeten Methode (2-3 kJ/Mol) liegen.
Der Transport von antigenen Peptiden in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums ist ein zentraler Vorgang bei der Antigenprozessierung und ihrer MHC-Klasse-I-vermittelten Präsentation auf der Zelloberfläche. Intrazelluläre Translokation über die ER-Membran erfolgt mit Hilfe von TAP, eines ATP-abhängigen ABC-Transporters. Einer ATP-unabhängigen Substratbindung folgt der eigentliche Transportschritt, dessen Energetisierung einer ATP-Spaltung bedarf. In der vorliegenden Dissertation wurde die ATPase-Aktivität des TAP-Komplexes aufgeklärt und detailliert charakterisiert. Es wurde eine schnelle und schonende Isolierungs- und Rekonstitutionsmethode entwickelt, die es erlaubt, den partiell aufgereinigten TAP-Komplex in Liposomen einzubauen und Funktionsstudien in vitro durchzuführen. Zum ersten Mal war es damit möglich, die Peptid-stimulierte TAP-spezifische ATP-Hydrolyse direkt zu beobachten und deren kinetische Parameter zu bestimmen. Eine direkte Korrelation zwischen Bindungsaffinität des Peptides zu TAP (Bindungskonstante KD) und der halbmaximalen Stimulation der ATPase-Aktivität von TAP (Km,pep) wurde festgestellt. Die Versuche mit den verzweigten Peptiden zeigten, dass Peptide, die nicht transportiert werden können, keine Stimulation der ATPase-Aktivität hervorrufen. Somit wurde die allosterische Interaktion zwischen Peptidbindung, ATP-Hydrolyse und Peptidtransport nachgewiesen. Nach der Entfernung des peptidexportierenden Sec61-Komplexes aus den Proteoliposomen konnte die vorläufige Stöchiometrie des Transportschrittes bestimmt werden. Eine weitere Anwendung fand die Rekonstitutionsmethode bei der Aufklärung des molekularen Wirkungsmechanismus des TAP-Inhibitors US6, indem der TAP-Komplex zusammen mit der aktiven ER-luminalen Domäne von US6 in die Proteoliposomen rekonstituiert wurde. Die Bindung von US6(delta147-183) an die ER-luminalen Bereiche von TAP blockiert die ATP-Bindung an die zytoplasmatischen NBD des Transporters. Die Peptid-induzierte ATP-Hydrolyse wird durch die Inhibition der ATP-Bindung unterbunden, wohingegen die Peptid- und ADP-Bindung von TAP nicht beeinflusst sind.
Im Rahmen der vorliegenden wissenschaftlichen Abhandlung wurden die Ergebnisse der Angioplastie von Beckenarterienstenosen oder –okklusionen analysiert. Hierbei wurde insbesondere die neue Einteilung von Gefäßläsionen zur Klassifikation nach dem TransAtlantic Inter-Society Consensus (TASC) Dokument herangezogen als auch der Stellenwert der Excimer-Laser assistierten Angioplastie bei diesen Läsionen evaluiert. Die Bedeutung einer kritischen Betrachtung der interventionellen Möglichkeiten in der Therapie der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit (pAVK) liegt zum einen in der weiten Verbreitung dieser Erkrankung als auch in der zunehmenden Prävalenz. Als eindeutige Vorteile der interventionellen Methoden im Vergleich zu operativen Verfahren können die Durchführung in Lokalanästhesie, die geringere Mortalität und Morbidität und der kürzere Krankenhausaufenthalt gelten. Die Rekanalisation von Arterienverschlüssen bereitete jedoch lange Zeit Schwierigkeiten und zeigte die therapeutischen Grenzen der konventionellen Ballonangioplastie auf. Dies führte zur Entwicklung von verschiedenen abtragenden („Debulking“) Verfahren wie z. B. den Excimer-Laser. Mit ihm konnten auch chronische, kalzifizierte Gefäßokklusionen erfolgreich therapiert werden. In dem Zeitraum von Januar 1999 bis Dezember 2001 wurden 91 Patienten mit Gefäßläsionen im Bereich des Beckens therapiert. Dabei handelte es sich um 133 Stenosen, 20 Okklusionen und eine Dissektion. 142 Stents wurden im Rahmen der Interventionen implantiert. Präinterventionell erfolgte die Klassifizierung der Gefäßläsionen nach dem TransAtlantic Inter-Society Consensus (TASC), die Erhebung einer Medikamenten- und Risikofaktoren-Anamnese sowie die Ermittlung der Gehstrecke und der klinischen Stadieneinteilung nach Fontaine. Die postinterventionellen Kontrolluntersuchungen erfolgten in einem Zeitraum von einem Tag nach dem Eingriff sowie nach 1, 3, 6, 12 Monaten und dann jährlich. Im Zuge der Nachuntersuchung wurden neben der aktuellen Anamnese auch eine Überprüfung der Risikofaktoren und der aktuellen Medikamentenanamnese durchgeführt. Zusätzlich beinhaltete die Kontrolluntersuchung die farbkodierte Duplex-Untersuchung der unteren Extremitäten als auch die Bestimmung des Tibio-brachialen Quotienten als Index für den Grad der Durchblutungsstörung. Alle Kontrolluntersuchungen wurden durch die klinischen Partner des Gefäßzentrums (Abt. für Angiologie, Abt. für vaskuläre und endovaskuläre Gefäßchirurgie) der Universitätsklinik Frankfurt durchgeführt. Bei 36, der insgesamt 154 durchgeführten Interventionen, kam der Excimer-Laser zum Einsatz. 55% der Okklusionen (11 von 20) wurden mittels Excimer-Laser therapiert. Trotz des hohen Anteils an Gefäßverschlüssen waren die sekundären Offenheitsraten nach 24 Monaten nahezu identisch mit denen des gesamten Patientenkollektivs (97,14% zu 97,37%). Der technische Erfolg betrug 98,1%, die gesamte Komplikationsrate belief sich auf 3,9%. Die von uns erzielten Ergebnisse liegen im Wertebereich der bislang publizierten Arbeiten und sprechen für den Einsatz der Angioplastie bei Iliakalarterienläsionen. Dies gilt sowohl für Stenosen, als auch für Okklusionen. Lediglich Läsionen im Bereich der A. iliaca externa bei weiblichen Patienten lieferten deutlich schlechtere Ergebnisse (primäre Offenheitsraten nach 24 Monaten: 81,82% Frauen; 90,79% gesamt). Des Weiteren war ein multisegmentaler Gefäßbefall mit einer erhöhten Reinterventionsrate vergesellschaftet. 70% der Läsionen, welche einer Reintervention bedurften, waren multisegmental. Insbesondere nicht passierbare Läsionen stellen das Einsatzgebiet für den Excimer-Laser dar. Die etwas schlechteren primären Offenheitsraten (85,71% zu 90,79%) der Laser-PTA Gruppe im Vergleich zu unserer Gesamt-Gruppe beruhen auf dem größeren Anteil an langstreckigen Gefäßverschlüssen in dieser Gruppe (30,6% zu 7,7%). Die sekundären Offenheitsraten lassen hingegen keine signifikanten Unterschiede mehr erkennen (97,14% zu 97,37%). Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Rekanalisation mittels Angioplastie bei Beckenarterienläsionen sowohl im Falle der AIC als auch der AIE, mit hohem technischen und klinischen Erfolg durchgeführt werden können. Insbesondere die Excimer-Laser assistierte Angioplastie erweitert das Anwendungsspektrum auf langstreckige, chronische Beckenarterien-verschlüsse, mit ermutigenden Resultaten. Die perkutane Rekanalisation von Beckenarterienläsionen stellt somit eine echte Alternative zur chirurgischen Therapie dar und sollte primär angestrebt werden.
Für ein Assessment Center zur Auswahl von Versicherungs-Außendienstmitarbeitern wurde geprüft, ob Beobachterexperten und Beobachternovizen zu ähnlichen oder zu unterschiedlichen Schlussfolgerungen über die Teilnehmer kommen. Eine ähnliche Schlussfolgerung sollte dabei Indikator dafür sein, dass ein Beobachtertraining (hier: Verbesserung der Beobachterexpertise durch wenigstens einmalige Teilnahme an einem AC als Beobachter) ohne Auswirkungen bleibt. Verglichen wurden die Ergebnisse dieser Beobachtergruppen mit dem AC-Leiter als "Oberexperten" und der AC-Assistenz. Im Rahmen der vorliegenden Untersuchung wurden die Daten von 37 AC mit insgesamt 267 Kandidaten und 171 Beobachtern in zwei unterschiedlichen Datensätzen überprüft. Es konnte nachgewiesen werden, dass sowohl Experten wie auch Novizen eine hohe Übereinstimmung mit der Gesamtrangfolge über die Teilnehmer hatten; hinsichtlich der übungsbezogenen und der merkmalsbezogenen mittleren Korrelationen sowie der mittleren Korrelationen innerhalb der einzelnen Übungen wurden kaum signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen Beobachtergruppen festgestellt. Aus diesem Grunde kann geschlossen werden, dass die Teilnahme an einem AC als Beobachter nicht notwendigerweise die Beobachterexpertise verbessert. Angesichts der hohen Übereinstimmung der Beobachtergruppen mit der Gesamtrangfolge über die Teilnehmer kann geschlossen werden, dass für den vorliegenden einfachen AC-Typ verbunden mit der spezifischen Art der Ergebnisgewinnung der Verzicht auf ein Beobachtertraining nicht notwendigerweise eine Verschlechterung der AC-Ergebnisse bedeutet.
Bei den Non-Hodgkin Lymphomen (NHL) handelt es sich um eine heterogene Gruppe von Erkrankungen, die mit Strahlen- und Chemotherapie behandelt werden können. Im Frühstadium lassen sich mit der Bestrahlung Heilung erzielen, im forgeschrittenen Stadium und bei Rückfällen sind aber, zumindest bei den niedrigmalignen Lymphomen, keine Heilung mehr durch Chemotherapie und Strahlentherapie möglich. Ein neuartiger Therapieansatz erscheint nun möglich mit der Anwendung des ersten monoklonalen Antikörpers in der Hämatologie. Rituximab ist ein chimärer monoklonaler Antkörper mit humanen konstanten IgG1- und Kappa-Regionen und variablen Regionen eines Maus-Antikörpers gegen das CD20-Antigen, das von fast allen B-Zellen und auch den meisten Lymphomzellen exprimiert wird Rituximab richtet sich daher auch gegen normale, nicht maligne B-Zellen, schädigt aber nicht die Stammzellen, die wiederum für die Neubildung von B-Zellen zuständig sind. Die Wirkung des Antikörpers beruht dabei auf verschiedenen Mechanismen der Indukation von Apoptose sowie auf einer direkten Zytotoxizität. Rituximab besitzt bereits in der Anwendung als Monotherapie eine erhebliche antitumorale Aktivität. Die bisherigen Studien belegen, daß Rituximab als Monotherapie gegen B-Zell-Lymphome wirksam ist, diese aber auch nicht dauerhaft heilen kann. Daher stellt sich die Frage nach dem kombinierten Einsatz von Rituximab mit konventionellen Chemotherapien. Die grundsätzlich verschiedenartigen Wirkungs-, Toxizitäts- und Resistenzmechanismen sprechen für eine derartige Therapiekombination. In in vitro durchgeführten Versuchsreihen konnten syneristische Effekte der Kombination aus Chemotherapie und Rituximab beobachtet werden. Insbesondere scheint Rituximab einen chemotherapie- sensiblisierenden Effekt zu haben. in einer randomisierten Studie von Hiddemann et al. konnte die Überlegenheit von einer Polychemotherapie CHOP plus Rituximab gegenüber CHOP allein demonstriert werden. Die Remissionsrate war für die Kombinationstherapie CHOP plus Rituximab signifikant höher im Vergleich für CHOP alleine. Der Vorteil für die Kombination aus CHOP plus Rituximab war bei den Mantelzell-Lymphomen noch ausgeprägter. In unserer Arbeitsgruppe untersuchten wir in einer im Jahre 2000 initiierten Phase-II-Studie die Kombination von Bendamustin plus Rituximab bei Patienten mit fortgeschrittenen progredienten rezidivierten oder refraktären niedrigmalignen oder Mantelzell-Lymphomen. Ein anderes Therapieschema, welches bei diesen Lymphomentitäten in einer Studie geprüft wurde, war die Kombination aus Cladribin und Mitoxantron plus Rituximab. Bei hochmalignen wurde die Kombination aus Rituximab plus Gemcitabin, Oxaliplatin und Bendamustin untersucht. Ziel und Gegenstand dieser retrospektiven Untersuchung war, die eigenen Ergebnisse im Kontext mit anderen Studienergebnissen zu bewerten und diskutieren. 139 Patienten mit therapierefraktärem oder rezidiviertem Non-Hodgkin-Lymphom sind im Zeitraum von 1999 bis 2003 mit einer Rituximab-haltigen Chemotherapie behandelt worden. Das ORR lag für die einzelnen Lymphomentitäten wie folgt: - Follikulärs Lymphom: 89% - Mantelzell-Lymphom: 37% - Immunozytom : 84% - Diffus-großzelliges B-NHL: 64% Im Median dauerte die Remission für die jeweilige Erkrankung: - Follikulärs-Lymphom: 12,8 Monate - Mantelzell-Lymphom: 8,5 Monate - Immunozytom: 11,6 Monate - Diffus-großzelliges B-NHL : 10,2 Monate Die Ansprechraten lagen dabei für das prognostische ungünstige Mantelzell-Lymphom bei 37%, für die indolenten Lymphomentitäten Immunozytom und follikulären Lymphom bei 84% respektive 89%. Bei den hochmalignen Diffus-großzelligem B-NH Lymphomen konnte eine Remissionsrate von 64% erzielt werden. Die kürzeste Remissionsdauer war beim Mantelzell-Lymphom, die längste war beim follikulären Lymphom. Diese Therapieergabnisse erscheinen verbessert im Vergleich zu den etablierten Chemotherapieresultaten und vergleichbar mit internationalen Literatur publizierten Daten. Bei der Durchführung der Therapien mit Rituximab plus Chemotherpie konnte keine klinische relevante erhöhte Toxizität beobachtet werden. Die Patienten haben die Behandlung mit Antikörper Rituximab gut toleriert. nur 1,4% der Patienten (2 von 141) mussten die Behandlung mit Rituximab abbrechen. Ob die Verbesserung der Ansprechraten, die wir in unserer Studie in der retrospektiven Auswertung beobachtet haben, auch zu einer Verlängerung der Überlebenswahrscheinlichkeit und zu einer Verbesserung der Prognose dieser Krankheitsentitäten führen wird, ist noch nicht abschließend geklärt und muss erst noch in größeren prospektiven Studien geklärt werden.
In der vorliegenden Arbeit wird ein Curriculum zur Beugung vorgestellt, welches sich in ein Kerncurriculum und Erweiterungsmodule gliedert. Das Kerncurriculum geht von einer systematischen Erarbeitung von Erscheinungsreihen aus, zunächst in Form von Freihandversuchen. Dabei werden periodische Strukturen vor das Auge gehalten und durchblickt. Erst in einem zweiten Schritt treten entsprechende komplexere Versuchsaufbauten hinzu. Der Zusammenhang zwischen den durchblickten oder durchleuchteten periodischen Strukturen und den Konfigurationen der Beugungsbilder wird im Konzept optischer Wege beschrieben. Optische Wege werden dazu operational definiert und als geometrische Ordnungselemente eingeführt, die dem Zusammenhang zwischen den jeweils wirksamen räumlichen Bedingungen und den auftretenden Erscheinungen immanent sind. Den methodischen Rahmen des Kerncurriculum bildet damit eine phänomenologische Vorgehensweise - insbesondere, weil die optischen Wege nicht als ein Vorstellungskomplex gefasst werden, den man zur ursächlichen Erklärung eines Phänomens heranziehen kann. In einem Erweiterungsmodul des Curriculums wird im Einzelnen ausgeführt, wie es durch dieses methodische Vorgehen schon bei der Thematisierung der Beugung möglich ist, die holistischen Eigenschaften der Quantentheorie anzulegen und vorzubereiten. Dadurch kann der Übergang von der Beugung zur Quantentheorie in einem einheitlichen methodischen Rahmen erfolgen und eine vertikale Vernetzung der Unterrichtsinhalte unterstützen. Entsprechend dem von ERB und SCHÖN ausgearbeiteten Lichtwegkonzept bekommt auch beim Konzept optischer Wege das FERMAT-Prinzip eine zentrale Stellung. Es wird in der vorliegenden Arbeit räumlich formuliert. Im zentralen Thema des Kerncurriculums, der Beugung am Gitter, reichen in Erweiterung des FERMAT-Prinzips dann zwei Bedingungen aus, die man an die optischen Wege stellen muss, um diese Beugungserscheinungen umfassend zu beschreiben. Auch komplexe Zusammenhänge, wie beispielsweise die Invarianz des Beugungsbildes unter Translationen des Gitters, sind so anschaulich zu erklären. Das Beugungsbild eines Gitters tritt in der Brennebene einer Linse auf. Da es invariant unter Translationen des Gitters ist, darf auch ein Abstand zwischen Gitter und Linse gewählt werden, welcher größer als deren Brennweite ist. Je nach Stellung eines Schirms hinter der Linse erhält man so entweder das Beugungsbild oder das Abbild des Gitters. Eine Darstellung beider Situationen im Konzept optischer Wege lässt den Zusammenhang zwischen Beugungs- und Abbild sehr deutlich hervortreten und macht Experimente zur optischen Filterung unmittelbar verständlich. Die in diesem Rahmen eingeführte kontextuale Abbildung rundet das Kerncurriculum ab und arbeitet die Gesamtheit der wirksamen Bedingungen besonders heraus. Gleichzeitig gelingt es, Eigenschaften der FOURIER-Transformation auf einer elementaren Ebene zu behandeln. In einem der Erweiterungsmodule werden die Beugungsbilder bei Rotationen eines Gitters untersucht. Dabei treten Beugungsbilder in Form von Kegelschnitten auf. Es wird gezeigt, wie die schon im Kerncurriculum in Erweiterung des FERMAT-Prinzips formulierten beiden Bedingungen an die optischen Wege sich weiterhin als tragfähiger Beschreibungsansatz erweisen. Dabei können Elemente der Festkörperphysik anschaulich eingeführt werden – hier sind es die LAUE-Kegel. In einem anderen Erweiterungsmodul schließen sich eine anschauliche Herleitung des reziproken Gitters und der EWALD-Kugel an. Das Erweiterungsmodul, welches den Übergang zur Quantentheorie thematisiert, geht von der Beugung am Doppelspalt aus und sieht dort die Einführung des Zeigerformalismus vor. Der Kontrast zur phänomenologischen Vorgehensweise des Kerncurriculums ermöglicht eine saubere Unterscheidung zwischen den optischen Wegen als immanenten Ordnungselementen und den Zeigern als abstrakten Symbolen, die Wellenfunktionen repräsentieren. Methodendiskussionen werden so unterstützt. Im Zentrum des Moduls steht die Besprechung von Welcher- Weg-Experimenten. Die kontextuale Abbildung im Konzept optischer Wege führt dabei, wie oben bereits erwähnt, ohne methodischen Bruch auf das Superpositionsprinzip der Quantentheorie. Die schulische Erprobung des Kerncurriculums und einiger Erweiterungsmodule ergab schließlich, dass die operationale Definition der optischen Wege und die Formulierung von Kriterien an diese optischen Wege zur Beschreibung der Beugung es ermöglicht, durch tragfähige Begriffe bei den Schülern ein Bewusstsein für Zusammenhänge zwischen Teilinhalten des Unterrichtes zu wecken und die Beugung in eine Fülle optischer Erscheinungen zu integrieren. Der Übergang vom Experiment zu abstrakten Lerninhalten wird dann durch den Unterricht deutlich und generiert ein hohes Methodenbewusstsein.
Die vorliegende Arbeit befaßte sich mit der Untersuchung der Funktion und der Regulation des neuronalen GABA-Transporter 1 der Maus (mGAT1). Der mGAT1 ist ein elektrogener Neurotransmittertransporter, der in Gegenwart von GABA in Abhängigkeit des Membranpotentials und des Na+-Konzentrationsgradienten über der Membran einen sogenannten mGAT1-vermittelten Strom generiert. Der mGAT1 wurde in Oozyten von Xenopus laevis exprimiert und mit elektro-physiologischen Methoden (Two-Electrode Voltage Clamp), mit radioaktiven Auf-nahmemessungen (3H-GABA, 22Na+, 36Cl-) und mit biochemischen Methoden untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte unter Verwendung des Tiagabin –Analogons SKF-89976-A gezeigt werden, daß der mGAT1-vermittelte Strom aus zwei Komponenten besteht, einem Transportstrom und einem Transporter-assoziierten Strom. Dabei wurde die hier gewonnene neue Erkenntnis genutzt, daß SKF-89976-A die Transporter-assoziierte Stromkomponente selektiv blockieren kann. Als Ursache des Transportstroms konnte die in der Literatur angenommene Transportstöchiometrie von 1GABA : 2Na+ : 1Cl- bewiesen werden. Als Ursache des Transporter-assoziierten Stroms konnte eine vom GABA-Transport entkoppelte Na+-spezifische Leitfähigkeit in Gegenwart von GABA identifiziert werden, die drei bis fünfmal größer ist als die Transport-Leitfähigkeit selbst. Transportstrom und Transporter-assoziierter Strom scheinen von zwei unterschiedlichen Konformeren des mGAT1 vermittelt zu werden, die nicht miteinander im Gleichgewicht stehen. In Abwesenheit von GABA ist in der Stromantwort auf einen Spannungspuls ein mit der Zeit abfallender transienter Strom zu beobachten. Hinsichtlich dieses langsamen transienten Stroms des mGAT1 konnte ein Bindungsmodell für Na+ und Cl- in Abwesenheit von GABA entwickelt werden. Nach diesem Modell kommt es vor der Bindung von GABA am Transporter zu einer sequentiellen Bindung zweier Na+-Ionen und eines Cl--Ion. Regulation des mGAT1 konnte durch Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung des mGAT1 mittels PKC und PP2B gezeigt werden. Dabei scheint der mGAT1-vermittelte Strom durch Serin- / Threonin-Phosphorylierung verstärkt zu werden. Durch Koinjektion von mGAT1-cRNA und humaner Hirn-mRNA konnte der mGAT1 zusammen mit unbekannten zytosolischen bzw. Membranproteinen des humanen Hirns koexprimiert werden. Dabei wird die Transportrate des mGAT1 signifikant gesteigert; der mGAT1-vermittelte Strom wird nicht signifikant beeinflußt. Es scheint, daß eines oder mehrere der koexprimierten humanen Proteine die Bildung des Transport-Modus bzw. die Bildung des Kanal-Modus mit beeinflussen.
Der Untersuchungszeitraum von 9 Monaten und die Vergabe der Evaluation der Beratungsstelle der LZKH an die Poliklinik für Zahnerhaltungskunde des ZZMK der Universitätsklinik in Frankfurt (Carolinum) ergeben eine gute Vorraussetzung für eine repräsentative und objektive Beurteilung des bestehenden Services. Der bestehende Service der LZKH stellt eine gute Grundlage dar, was durch die positive Beurteilung der Ratsuchenden bestätigt wird. Diese zeigt, dass die bestehende Beratung die For-derungen des Präsidenten der LZKH nach einer unabhängigen und qualitativ hochwertigen Beratung bereits meist erfüllt. Möchte sich die Beratungsstelle allerdings gegen andere Konkurrenten, und vor allem gegen die geplante Beratungsstelle der Regierung behaupten [6], [25], [38], [57], [58], so muss der Service in einigen Punkten noch verbessert werden. Ein beträchtlicher Mangel stellte die Namensliste der Zahnärzte einer bestimmten Fachrichtung dar, die nur in den wenigsten Fällen mit der Spezialisierung des Zahnarztes übereinstimmte. Es müsste also für jedes Fachgebiet eine neue Liste erstellt werden, und diese in regelmäßigen Abständen aktualisiert werden. Im Bereich „Behandlung unter Anästhesie“ ist dies bereits erfolgt und weitere sind laut Aussage der LZKH geplant. Die Hilfe bei Rechnungsfragen dauerte bei Einsendung der Unterlagen mit bis zu sechs Wochen eindeutig zu lange, denn der Patient muss die Rechnung meist innerhalb von 4 Wochen begleichen. Die Beraterinnen der LZKH können laut eigener Aussage allerdings auf Grund des hohen Arbeitsaufkommens, auch in ihren anderen Tätigkeitsbereichen, die Überprüfung nicht schneller durchführen. Zusätzliche Mitarbeiter/innen wären in diesem Fall die einzige Lösungsmöglichkeit. Um sich in Hessen zu etablieren und für jeden Bürger zur Verfügung stehen zu können, sollte eine wesentlich breit gefächerte in Information in verschiedensten Medien durchgeführt werden. Denn viele Anrufer gaben an, nur durch Zufall auf die Nummer der Hotline gestoßen zu sein. Dieser Zustand entspricht derzeit also nicht einem Service, der allen Bürgern zugänglich ist, wie es das Ministerium für Gesundheit gefordert hat. Des weiteren müsste der Zugriff auf die beratenden Zahnärzte besser organisiert werden, denn es gab einige Fälle, in denen eine Beratung durch einen Zahnarzt nötig gewesen wäre, aber zum Zeitpunkt der Anfrage kein Zahnarzt verfügbar war. Ein Einsatzplan der beratenden Zahnärzte oder ein pensionierter bzw. berufsunfähiger Zahnarzt, der sich jedoch auf dem neusten Stand der Zahnmedizin befindet, sind die Lösungsmöglichkeiten dieses Problems. Eine persönlichen Vorstellung mit eventueller kurzer Befundaufnahme durch einen Zahnarzt wäre absolut wünschenswert, da einige Probleme nur mit einer genauen Diagnose qualitativ hochwertig lösbar sind [18]. Dieser Service müsste jedoch nicht für alle Ratsuchenden zur Verfügung stehen, sondern nur für diejenigen, denen per Telefon keine zufriedenstellende Lösung angeboten werden konnte. Allerdings dürfte der Telefonservice nicht vernachlässigt werden, denn viele Ratsuchenden sehen in dessen schnellen Hilfe den Hauptvorteil, denn hier entfällt die Wartezeit auf einen Termin. Außerdem gibt es einige Patienten, die aus psychischen oder physischen Gründen keinen Arzt aufsuchen können und so die telefonische Beratung oft die einzige Möglichkeit darstellt, um an Informationen zu gelangen [30], [70]. Diese genannten Ergänzungen würden zu einer Optimierung des bestehenden Beratungsser-vices führen, wodurch sich die Beratungsstelle gegenüber anderen Anbietern und vor allem dem Plan der Regierung, weitere Beratungsstellen zu gründen, behaupten könnte. Die Durchführbarkeit ist allerdings eine Kostenfrage, denn die LZKH möchte auch weiterhin dem Patienten ihren Service kostenfrei anbieten. Aus diesem Grund muss der Vorstand der LZKH abwägen, welche Verbesserungsvorschläge mit den vorhandenen finanziellen Mitteln durchgeführt werden können. Die Fortschritte der Veränderungen und eventuell auftretende neue Aspekte sollten regelmäßig durch befragen der Ratsuchenden überprüft werden. Trotz der genannten Mängel, ist die Forderung der Regierung nach einer bundesweiten Beratungsstelle, die dem Patienten gesundheitliche Informationen sowie Beratung und Aufklärung bieten sollen [55], nicht angebracht. Denn diese Forderungen erfüllt der bestehende Service der LZKH bereits. Aber nicht nur in Hessen hat der Patient diese Möglichkeit der Informationsfindung, sondern auch in allen anderen Bundesländern [79]. Der Nachteil anderer Anbieter ist die fragliche fachliche Kompetenz [55], [80], wenn sie keine Berater einsetzen, die aus dem zahnmedizinischen Bereich stammen, bzw. diese nicht auf dem neusten Stand der zahnmedizinischen Entwicklung sind. Wird das Feld durch die Krankenkassen besetzt, so ist hier das Problem die Neutralität, da diese nicht wirtschaftlich unabhängig sind. Außerdem erfolgt hier, im Gegensatz zu den Landeszahnärztekammern, oftmals erst die Beratung, wenn bereits ein Behandlungsfehler erfolgt ist [17]. Die durch die Regierung geplanten Beratungsstellen weisen nicht nur eine fragliche Kompetenz auf, sondern sollen aus Mitteln der Krankenkassen, und somit also durch den Patienten, finanziert werden [50]. Der Präsident der LZKH sieht dies sehr kritisch und betonte in einem Interview gegenüber der Pressereferentin der LZKH, dass in Zeiten knapper Ressourcen im Gesundheitswesen der von Bundesgesundheitsministerin Fischer mit Millionenbeträgen aus Mitteln der GKV geplante Aufbau von Patientenberatungsstellen absolut unnötig und überflüssig ist. Aus diesen Gründen versucht nicht nur die LZKH, sondern auch einige andere Zahnärztekammern, wie zum Beispiel die Landeszahnärztekammer Sachsen [25] und die Landeszahnärztekammer Baden-Württemberg [57], den Versuchen der Krankenkassen, Verbraucherorganisationen und Regierung mit einer besseren Alternative entgegenzutreten. Die Landeszahnärztekammer Hessen hat mit dieser Untersuchung einen wichtigen Schritt in Richtung Qualitätssicherung und Etablierung gegenüber anderer Anbieter unternommen. Voraussetzung ist allerdings, dass zumindest ein Teil der Verbesserungsvorschläge realisiert werden.
Das peroxsimale Enzym Katalase wird durch Blaulichtabsorption der prosthetischen Häm- Gruppe im sichtbaren Licht und in Anwesenheit von Sauerstoff in vitro und in vivo inaktiviert. Unter physiologischen Bedingungen wird das inaktivierte Enzym in vivo durch Neusynthese ersetzt. Ist der Proteinbiosyntheseapparat jedoch durch zusätzliche Stressoren wie z. B. Kälte gehemmt, kommt es zu einem Verlust von Katalaseaktivität im Blatt. Alpenpflanzen sind an ihrem natürlichen Standort sowohl hohen Lichtintensitäten, als auch niedrigen Temperaturen ausgesetzt. Streb et al. (1997) identifizierten in Blättern der Alpenpflanze Homogyne alpina eine lichtstabile Katalase. Nach Isolierung von Katalase-cDNAs der Alpenpflanzen Soldanella alpina und Homogyne alpina, sowie der Flachlandpflanze Secale cereale (durchgeführt und zu Verfügung gestellt von M. Schmidt, Universität Frankfurt) sollten diese heterolog exprimiert und auf Lichtstabilität untersucht werden. In Hefen gelang es jedoch nicht, pflanzliche Katalasen funktionell zu exprimieren. Daher wurde die heterologe Katalase-Expression im Baculovirussystem durchgeführt. Nach Infektion von Spodoptera frugiperda Insektenzellen mit rekombinantem Baculovirus, der die jeweilige Katalase-cDNA-Sequenz enthielt, gelang es, aktive pflanzliche Katalasen zu extrahieren. Die rekombinanten Katalasen von Soldanella alpina und Secale cereale waren, ebenso wie die aus Blättern gereinigten Enzyme, lichtsensibel. Die rekombinante Katalase der Alpenpflanze Homogyne alpina war dagegen lichtstabil. Die Ermittlung der Michaelis- Menten-Kinetiken, der peroxidatischen Aktivitäten und der Empfindlichkeit gegen Inhibitoren der lichtsensiblen und lichtstabilen Katalasen ergaben, dass sich die Katalasen in ihren katalytischen Eigenschaften nicht wesentlich voneinander unterschieden. Lediglich die spezifische Aktivität der rekombinanten lichtstabilen Katalase von Homogyne alpina war signifikant herabgesetzt. Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz der Katalase von Homogyne alpina mit Katalasesequenzen anderer mono- und dikotyler Pflanzen und Rinderleberkatalase zeigte sechs auffällige Aminosäuresubstitutionen in stark konservierten Bereichen: Val124Thr, Leu135Ile, Leu189Trp, Gly206Ser, His225Thr und Lys291Met. An einer computergestützten Darstellung des Modells einer 3dimensionalen Katalaseuntereinheit der lichtstabilen Katalaseuntereinheit von Homogyne alpina ist zu sehen, dass die auffälligen Aminosäuresubstitutionen in einer Region am Eingang eines seitlichen Kanals, der zum Reaktionszentrum führt, lokalisiert sind. Diese Region repräsentiert bei tierischen Katalasen eine NADPH-Bindungsstelle. NADPH schützt Rinderleberkatalase, im Gegensatz zu den rekombinanten pflanzlichen Katalasen von Secale cereale und Homogyne alpina, komplett vor der Inaktivierung durch Superoxid und partiell vor Starklichtinaktivierung. Der NADPH-vermittelte Schutz der Rinderleberkatalase ist auf eine spezifische NADPH-Bindung zurückzuführen. Die in dieser Arbeit untersuchten Katalasen von Secale cereale und Homogyne alpina binden NADPH nicht. Die aus Blättern isolierte lichtsensible Katalase von Secale cereale wird durch Superoxid nicht inaktiviert, die rekombinante lichtstabile Katalase von Homogyne alpina dagegen schon. Daher liegt der oxidativen Photoinaktivierung ein anderer Mechanismus zu Grunde, als der Superoxid-vermittelten Katalaseinaktivierung. Die Aminosäuresequenz von CATA3 von Helianthus annuus zeigte die gleichen auffälligen Aminosäuresubstitutionen wie CAT-1 von Homogyne alpina. Heterologe Expression von CATA3 mit anschließender Lichtinkubation ergab, dass CATA3, ebenso wie CAT-1 von Homogyne alpina, lichtstabil ist. In Blättern von Helianthus annuus sind Katalasen mit erhöhter Lichtstabilität als semikristalline Einschlüsse, sogenannten Cores, organisiert. Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass in den Peroxisomen von Homogyne alpina-Blättern ebenfalls Cores vorhanden sind. Während der Lichtinaktivierung von Katalasen soll die Oxidation von Histidinresten ausgelöst werden. Daher ist die bei den lichtstabilen Katalasen vorkommende Aminosäuresubstitution von His zu Thr (Pos. 225) in einer bei eukaryotischen Katalasen konservierten Region besonders auffällig. Deshalb wurde bei der lichtsensiblen Katalase von Soldanella alpina durch in vitro Mutagenese das His225 durch ein Thr ersetzt. Die mutagenisierte Katalase von Soldanella alpina war noch lichtempfindlicher, als das nichtmutagenisierte rekombinante Emzym. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Region um das His225 eine wichtige Rolle für die Lichtstabilität bzw. –empfindlichkeit von pflanzlichen Katalasen einzunehmen scheint; die His225Thr Substitution ist allerdings nicht alleine für die Lichtstabilität ausreichend.
Die vorliegende Arbeit wurde partiell als Bestandteil eines von der EU geförderten TME-Projektes angefertigt. Das vorrangige Ziel war die Weiterentwicklung der Methodik, die Ring-Testung und die Freiland-Validierung eines offenen und ungestörten terrestrischen Modellökosystems (TMEs). Hierzu wurden die Auswirkungen der Modellchemikalie Carbendazim (fungizider Wirkstoff der Formulierung Derosal®) auf die Enchytraeidenzönose mit TMEs im Labor und in Freiland- Validierungsstudien untersucht. Die Familie Enchytraeidae (Annelida, Oligochaeta) unterlag auf Grund ihrer hohen ökologischen Wertigkeit und einer bekannten Sensitivität gegenüber Carbendazim, im Rahmen dieser Arbeit einer weitergehenden und vertiefenden Auswertung. Im Detail wurde analysiert, welcher der mittels TMEs für die Enchytraeen erhobenen Parameter gegenüber der Exposition von Carbendazim am sensitivsten reagiert und bei der statistischen Auswertung den niedrigsten NOEC- bzw. EC50-Wert liefert. Darüber hinaus wurde die Frage geklärt, welche der in einer TME-Studie generierten ökotoxikologischen Kenngrößen, NOEC oder EC50, am sinnvollsten in der Risikobeurteilung eingesetzt werden sollte. Die Versuche wurden in Amsterdam (Niederland), Bangor (Wales, England), Coimbra (Portugal) und Flörsheim (Deutschland) durchgeführt. An allen Standorten wurde mit dem gleichen Equipment gearbeitet. Die TMEs bestanden aus intakten Bodensäulen (Ø = 17.5 cm, Länge = 40 cm) mit ungestörter Schichtung, indigener Bodenfauna und natürlichem Pflanzenbewuchs. Die Entnahme der TMEs erfolgte auf den Flächen, auf denen auch die entsprechenden Freiland-Validierungsstudien durchgeführt wurden. Es handelte sich dabei um Grünland bzw. in einem Fall (Coimbra) um eine landwirtschaftliche Nutzfläche. Unabhängig von den jeweiligen Bodeneigenschaften konnten an allen Standorten mit den angewandten Methoden intakte Bodensäulen im Freiland entnommen und über eine dreimonatige Versuchsdauer als TMEs im Labor oder im Gewächshaus installiert werden. Zumindest für diesen Versuchszeitraum war die Aufrechterhaltung einer natürlichen Zönose der Enchytraeen in den TMEs unter den beschriebenen Versuchsbedingungen möglich. Untersucht wurden die Parameter Gesamtabundanz, Artenanzahl, Shannon-Wiener Index, Dominanzspektrum, Abundanz der Gattungen Fridericia und Enchytraeus, Anteil der Juvenilen an der Gesamtabundanz sowie die Vertikalverteilung der Enchytraeidae. Mittels einer multivariaten Statistik (PRC, Principal Response Curve) wurden die Auswirkungen auf den Endpunkt Enchytraeidae-Artengemeinschaft bestimmt. An allen Standorten kam es im TME-Vortest, im TME-Ringtest und in der Freiland-Validierungsstudie bei allen Probennahmezeitpunkten zu einer hohen Variabilität der Messwerte, die durch die heterogene räumliche Verteilung der Enchytraeidae bedingt ist. Traten Unterschiede zwischen den Kontrollen der verschiedenen Probennahmezeitpunkte im TME-Vortest und im TME-Ringtest auf, waren sie meist auf eine hohe Variabilität des jeweiligen Endpunktes zurückzuführen. Nur in wenigen Ausnahmefällen kam es zu einer kontinuierlichen Zunahme während der Versuchsdurchführung. In der Freiland-Validierungsstudie nahmen die jeweiligen Messwerte in den Kontrollen während der Versuchsdauer ab. Dies war die Folge der hohen Sommertemperaturen und der dadurch bedingten Austrocknung des Bodens, die in der Freiland-Validierungsstudie, wie alle Umweltbedingungen, nicht zu kontrollieren war. Beim Vergleich TME-Ringtest versus Freiland-Validierungsstudie lagen die Kontrollwerte der einzelnen Parameter in den beiden Studien in vergleichbaren Größenordnungen. Zwischen den Standorten konnten im TME-Vortest, im TME-Ringtest und in der Freiland- Validierungsstudie für alle Parameter keine prinzipiellen Differenzen bezüglich der Entwicklung der Kontrollen über die Probennahmezeitpunkte beobachtetet werden. An allen Standorten zeigten die untersuchten Parameter im TME-Vortest, im TME-Ringtest und in der Freiland-Validierungsstudie eine gute Übereinstimmung mit in der Literatur veröffentlichten Ergebnissen. Insgesamt lässt sich für die Entwicklung der Kontrollen über die Zeit ableiten, dass sich die Enchytraeenzönosen in den TMEs sowie am entsprechenden Freilandstandort hinsichtlich der untersuchten Parameter und ihrer räumlichen Heterogenität unabhängig von den Bodeneigenschaften nicht unterschieden. Aufgrund dieser Tatsache können systembedingte methodische Fehler bei der Erfassung von Chemikalienwirkungen auf die Enchytraeenzönosen unterschiedlicher Standorte mittels TMEs ausgeschlossen werden. Die grundlegenden Voraussetzungen für den Einsatz von TMEs als ökotoxikologisches Testsystem und Instrument in der Ökotoxikologie sind somit gegeben. An den unterschiedlichen Standorten waren die Auswirkungen von Carbendazim auf die untersuchten Parameter an den unterschiedlichen Probennahmezeitpunkten im TME-Ringtest ähnlich wie in der Freiland-Validierungsstudie. Zum Probennahmezeitpunkt w+16 waren die Effekte im TME-Ringtest und in der Freiland-Validierungsstudie vergleichbar denen im TME-Vortest. Die zwischen den Standorten festgestellten Unterschiede hinsichtlich des zeitlichen Verlaufs der Effekte sind auf die unterschiedlichen Bodeneigenschaften und die speziellen Substanzeigenschaften von Carbendazim zurückzuführen. Daher sollten bei der Planung einer TME-Studie neben den Charakteristika der zu testenden Substanz auch die standortspezifischen pedologischen Gegebenheiten berücksichtigt werden. Dabei sollten die Versuchdauer und das Raster der Probennahmen so angelegt sein, dass die maximalen Auswirkungen einer Testsubstanz sowie eine eventuelle Regeneration festgestellt werden können. Zwischen dem TME-Vortest, dem TME-Ringtest und der Freiland-Validierungsstudie sowie zwischen den verschiedenen Standorten konnten bezüglich der Sensitivität der untersuchten Endpunkte keine Unterschiede beobachtet werden. Die niedrigsten NOEC-Werte wurden im TME-Vortest, im TME-Ringtest und in der Freiland-Validierungsstudie am häufigsten mit den Parametern Dominanzspektrum und Enchytraeidae-Artengemeinschaft bestimmt. Die niedrigsten EC50-Werte (inklusive enger 95 % Vertrauensbereiche) wurden für die mit Hilfe der PRC ermittelten sensitivsten Taxa berechnet. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass multivariate statistische Verfahren wie die PRC am besten geeignet sind, um Multispezies-Testsysteme wie die TMEs auszuwerten. Darüber hinaus lassen sich mittels PRC die jeweils empfindlichsten Taxa ermitteln, für welche dann wiederum EC50-Werte mit sehr engen 95 % Vertrauensbereichen berechnet werden können. Eine einfachere Alternative ist die Auswertung des Parameters Dominanzspektrum. Mit diesem Endpunkt lassen sich sowohl NOEC-Werte bestimmen als auch sensitive Taxa ermitteln für die anschließend EC50-Werte zu berechnet werden können. EC50-Werte waren an allen Standorten sowohl im TME-Vortest und im TME-Ringtest als auch in der Freiland-Validierungsstudie häufiger bestimmbar als NOEC-Werte. Die EC50- Werte lagen meist unter den entsprechenden NOEC-Werten. Der Faktor zwischen den an den einzelnen Standorten ermittelten Minimum- bzw. Maximumwerten war für die EC50-Werte niedriger als für die NOEC-Werte. Die im TME-Ringtest ermittelten NOEC- und EC50-Werte entsprachen denen der Freiland-Validierungsstudie. Beim Vergleich der Standorte zeigten die EC50-Werte eine geringere Streuung als die NOEC-Werte. Der Variationskoeffizient der für den TME-Vortest und den TME-Ringtest berechneten EC50- Werte sowie der Faktor zwischen Minimum- und Maximumwert der unterschiedlichen Institute war denen anderer Ringtests, die mit Labormethoden durchgeführt wurden, vergleichbar, obwohl hier unterschiedliche Böden mit unterschiedlichen Enchytraeenzönosen verwendet wurden. Die im TME-Vortest und im TME-Ringtest festgestellten EC50-Werte sind mit den in der Literatur für Enchytraeen und Lumbriciden angegebenen LC/EC50-Werten sehr gut vergleichbar und liegen im unteren Bereich dieser Angaben. Damit konnte im Rahmen dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass die mittels TME generierten Ergebnisse replizierbar und reproduzierbar sind, was eine wichtige Bedingung für die Verwendung als Testsystem in der Ökotoxikologie darstellt. Gleichzeitig wurde mittels der Freiland-Validierungsstudie die ökologische Relevanz der TME-Resultate belegt. TMEs können als sinnvolles Instrument zur Verbesserung der Risikobewertung für das Kompartiment Boden für neue/existierende Chemikalien, Biozide und Pflanzenschutzmittel betrachtet werden. Strukturelle Parameter wie z.B. die Enchytraeidae-Artengemeinschaft oder das Dominanzspektrum sollten in die Auswertung mit einbezogen und multivariate Verfahren wie die PRC verwendet werden. Damit ist es möglich, die sensitivsten Taxa zu identifizieren, Zusammenfasssung 178 für welche EC50-Werte berechnet werden können. Anstelle von NOEC-Werten sollten bei der Auswertung von TME-Studien bevorzugt EC50-Werte als ökotoxikologische Kenngröße in die Risikobewertung eingehen (z.B. zur Berechnung von TER-Werten). Die dabei zu verwendenden Sicherheitsfaktoren sind entsprechend anzupassen. Mit der Kombination Enchytraeidae und TME ist neben der Untersuchung von ökotoxikologischen Effekten zudem eine gute Möglichkeit gegeben, das Bioakkumulationspotential von Chemikalien zu bestimmen. Damit stehen für ökotoxikologische Untersuchungen auf den unterschiedlichsten Ebenen (Labor, Modellökosystem, Freiland, Bioakkumulation) standardisierte Testsysteme mit Enchytraeen zur Bestimmung der Wirkungen und des Verhaltens von Chemikalien zur Verfügung.
Bendamustin ist eine Substanz, die seit über 40 Jahren in den Indikationen Non-Hodgkin Lymphom, CLL, multiples Myelom, Morbus Hodgkin, Mammakarzinom und SCLC eingesetzt wird, die jedoch erst nach der Wiedervereinigung Deutschlands systematisch neu entwickelt wurde. Die Wirksamkeit der Substanz als Monotherapie wurde, mit Ausnahme des Morbus Hodgkin, in allen Indikationen nachgewiesen. Obwohl in der Monotherapie hier keine Ergebnisse von randomisierten Studien vorliegen, ist der Stellenwert von Bendamustin als Einzelsubstanz eindeutig belegt, denn es wird als Monotherapie meist in fortgeschrittenen Therapiestadien eingesetzt, in denen es kaum Standardtherapieempfehlungen gibt. Die Ergebnisse in diesen Therapiesituationen sind insbesondere bei NHL beeindruckend (9, 28) und mit den Ergebnissen von Polychemotherapien in früheren Stadien der Erkrankung zu vergleichen (11). Beim Mammakarzinom wird Bendamustin als Monotherapie hauptsächlich palliativ eingesetzt, (36, 38, 64). Der Vorteil gegenüber anderen vergleichbaren Substanzen liegt in der Tatsache, daß Bendamustin kaum Alopezie und Organtoxizität verursacht, so dass die Patientinnen bezüglich Lebensqualität profitieren. In allen Indikationen sind oben beschriebene verschiedenste Kombinationsschemata geprüft worden. In-vitro konnte gezeigt werden, dass Bendamustin mit dem Purinanalogon Cladribin sowie mit dem monoklonalen Antikörper Rituximab synergistisch wirkt. Die Kombination mit einem Purinanalogon erwies sich klinisch zwar als sehr effektiv, aber durch das überschneidende Toxizitätsprofil ist sie mit schweren Nebenwirkungen verbunden (49). Als besonders günstig erwies sich bei den NHL die Kombination mit dem monoklonalen Antikörper Rituximab (68, 79). Die Kombination ist mit Ansprechraten von über 90% hocheffektiv und die Nebenwirkungen waren selten und nur von geringer Ausprägung. Dieses ist die einzige Bendamustin-Kombination, die systematisch vom Labor bis zur klinischen Prüfung entwickelt wurde. Die Prüfung dieser Kombination in prospektiv randomisierten Studien ist für die Weiterentwicklung der Substanz der logische nächste Schritt. Eine Indikationserweiterung erscheint insbesondere beim multiplen Myelom und bei der CLL sinnvoll. Die Ergebnisse der vorliegenden Studien zeigen, dass Bendamustin auch bei diesen Erkrankungen der B-Zellreihe sehr effektiv ist (2, 29, 59). Beim Mammakarzinom liegt der Stellenwert der Substanz eher in der Monotherapie als palliativer Ansatz (38, 64). Die Ergebnisse der Phase-III Studie in der BMF Kombination werden mit Spannung erwartet, jedoch sind die Therapiestandards in dieser Indikation inzwischen durch neue Substanzen, wie den Taxanen, modifiziert, so dass nur eine Prüfung gegen einen modernen Therapiestandard den Stellenwert des Bendamustins realistisch bestimmen könnte. Die Prüfung des Stellenwertes bei soliden Tumoren wäre insbesondere beim SCLC interessant, sofern gezeigt werden kann, dass die Substanz äquipotent ist und eine bessere Verträglichkeit aufweist. Das Toxizitätsprofil der Substanz ist ausreichend belegt. Die Haupttoxizität ist die Hämatotoxizität im Sinne von Leukozytopenie, Granulozytopenie und Thrombozytopenie. Als nicht-hämatologische Toxizität sind Übelkeit und Erbrechen dominierend. Die Toxizitäten sind in der Regel geringer Ausprägung, gut handhabbar und kontrollierbar. Langzeiteffekte sind bisher nicht bekannt, eine kumulative Thrombozytopenie ist anzunehmen (64), jedoch nicht an großen Patientenzahlen belegt. Bisher sind keine Zweittumoren als Langzeiteffekt dokumentiert worden, dies mag an der zum Teil erst relativ kurzen Nachbeobachtungszeit der in neueren Zeiten systematisch durchgeführten Studien liegen. Als Hauptindikation stellen sich die Non-Hodgkin Lymphome dar. In dieser Indikation dominiert die Zahl der durchgeführten Studien . Die Kombination mit Rituximab könnte eine sinnvolle mögliche Vergleichstherapie zur derzeitigen Standardtherapie darstellen. Ein Stellenwert als Standardtherapie kann der Substanz derzeit allerdings noch nicht zugesprochen werden. Die Substanz scheint insbesondere in der Kombination mit Rituximab bei NHL ein ideales Profil zu erfüllen: hohe Effektivität in Einklang mit einem patientenfreundlichen Toxizitätsprofil.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Entwicklung, Aufbau und Inbetriebnahme eines Funnelsystems zur Zusammenführung zweier Teilchenstrahlen, bestehend aus zwei Injektionssystemen, zwei RFQ-Beschleunigern, Hochfrequenz-Deflektoren und Diagnoseeinheiten. Die Aufgabe des Experiments ist die praktische Umsetzung eines neuartigen Verfahrens zur Strahlstromerhöhung bei im Idealfall gleichbleibender Emittanz und steigender Brillanz. Notwendig wird dies durch die benötigten hohen Strahlströme im niederenergetischen Bereich einiger zukünftiger geplanter Beschleunigeranlagen. Hier kann der Strahlstrom nicht mehr konventionell von einer einzigen Ionenquelle erzeugt werden. Nur durch die Parallelerzeugung mehrerer Teilchenstrahlen sowie mehrfachem Zusammenführen (Funneling) der Teilchenstrahlen ist es möglich, die notwendigen Strahlströme bei der geforderten kleinen Emittanz zur Verfügung zu stellen. Das Frankfurter Funneling-Experiment ist die skalierte erste HIDIF-Funneling-Stufe als Teil eines Fusionstreibers. Hier werden zwei möglichst identische Helium-Teilchenstrahlen von zwei Ionenquellen erzeugt und in zwei RFQ-Beschleunigern beschleunigt. Der Deflektor biegt die Teilchenstrahlen reißverschlussartig auf eine gemeinsame Strahlachse. Am Anfang der Arbeit stand die Optimierung des Betriebs der Beschleunigerkomponeten und die Entwicklung und der Aufbau eines Einzellendeflektors. Erste erfolgreiche Strahlexperimente zur Strahlvereinigung werden im Kapitel 7.5 vorgestellt. Die Phasenraumellipse des zusammengeführten Strahls zeigt starke bananenförmige Deformierungen, die auf eine schlechte Anpassung des RFQ an den Funnel-Deflektor zurückzuführen sind. Das Elektrodendesign des RFQ ist in zwei unabhängige Bereiche unterteilt. Die erste Zone dient der Beschleunigung der Teilchen. In der zweiten Zone soll erstmals ein sogenannter 3D-Fokus der Strahlradien der x- und y-Ebene und einer longitudinaler Fokussierung erreicht werden. Der zweite Abschnitt bestand für erste Strahltests aus zunächst unmodulierten Elektroden. Zur besseren Anpassung des RFQ an den Funneldeflektor wurde dann das letzte Elektrodenteil erneuert. Der Umbau erfolgte zunächst nur bei einem der beiden RFQ-Beschleuniger. Somit war der direkte Vergleich zwischen altem und neuen Elektrodendesign im Strahlbetrieb möglich. Mit diesem neuen Elektrodenendteil wurde eine Reduktion der Strahlradien der x- sowie y-Ebene, eine bessere longitudinalen Fokussierung sowie eine höhere Transmission erreicht (Kapitel 8). Damit ist es erstmals gelungen mit einer speziellen Auslegung der RFQ-Elektroden eine direkte Anpassung an nachfolgende Elemente zu realisieren. Untersuchungen zur Strahlzusammenführungen werden seit einigen Jahren am Institut durchgeführt. Mit der Entwicklung des 3D-matchers wurde ein weiteres der kritischen Probleme gelöst. Der Umbau des zweiten Beschleunigers findet zur Zeit statt. Nach der Inbetriebnahme werden Funneling-Experimente mit dem Einspalt- und einem neuem Vielspaltdeflektor folgen.
Um zu prüfen, ob das individuelle Risiko einer Flugreisethrombose anhand der Entstehung eines der ersten klinischen Symptome, der Ödembildung im Bereich der unteren Extremität abgeschätzt werden kann, nahmen 70 Probanden an einer simulierten 12-stündigen Flugreise teil. Der Versuch fand in einer Unterdruckkammer statt, in der die Probanden unter entsprechenden atmosphärischen und klimatischen Verhältnissen auf einer originalen Flugzeugbestuhlung saßen. Die Luftfeuchtigkeit in der Kammer war technisch limitiert und mit durchschnittlich 52% erheblich über dem angestrebten Sollwert von unter 20%. Die 70 Probanden waren in drei Riskogruppen aufgeteilt. 20 Probanden (28,6%) hatten eine gesicherte APC-Resistenz und hatten eine länger als 12 Monate zurückliegende Thrombose erlitten. 25 Teilnehmer (35,7%) gehörten zu der Gruppe, bei denen eine APC-Resistenz bekannt war, aber keine Thrombose in der Vorgeschichte. Die Kontrollgruppe bestand aus 25 Probanden (35,7%), die weder eine APC-Resistenz noch eine Thrombose in der Anamnese vorwiesen. Es bestand eine gleiche Geschlechts- und der Altersverteilung. Unmittelbar vor und nach dem Versuch wurde eine standardisierte optoelektronische Messung der Unterschenkelvolumina durchgeführt. Es konnte hier eine signifikante Zunahme des gemessenen Volumens ermittelt werden. Dieses Volumen des venösen Ödems betrug durchschnittlich 118ml (3,6%). Zwischen dem Ausmaß des Ödems und den Variablen Alter, Geschlecht, BMI und Trinkmenge bestand kein signifikanter Zusammenhang. Ebenfalls konnte zwischen den drei Risikogruppen „APC mit Thrombose“, „APC ohne Thrombose“ und der „Kontrollgruppe“ kein signifikanter Unterschied in Bezug auf das Unterschenkelödem nachgewiesen werden. Des weiteren konnte entgegen der Erwartungen ein Abfall des Hämatokrits festgestellt werden. Dieses Ergebnis ist jedoch auf Grund der relativ hohen Trinkmenge von 1300ml und der zu hohen Luftfeuchtigkeit während des Versuches von eingeschränkter Bedeutung. Bei keinem der Probanden konnte vor und nach dem Versuch bei der duplexsonographischen Untersuchung der unteren Extremität ein Strömungshindernis beobachtet werden. Im Rahmen dieser Studie kam es bei einem männlichen Probanden mit bekannter APC-Resistenz und einer Thromboseanamnese in beiden Unterschenkeln zu einem Zwischenfall. Ein 62 Jahre alter Teilnehmer entwickelte nach Abschluss der simulierten Flugreise eine Unterschenkelvenenthrombose. An dem später thrombosierten Bein wurde eine um zwei Standardabweichungen größere Ödembildung dokumentiert, was jedoch ebenso bei 7 anderen Probanden aller Risikogruppen beobachtet werden konnte. Schlussfolgerung: Es konnte zwischen den von uns zusammengestellten Risikogruppen und dem Ausmaß des Unterschenkelödems kein signifikanter Zusammenhang nachgewiesen werden. Bei dem Probanden, der eine Thrombose entwickelte, konnte retrospektiv eine um zwei Standardabweichungen größere Volumenzunahme des betroffenen Unterschenkels beobachtet werden. Ein ausgeprägtes Unterschenkelödem sollte als ein absolutes Warnzeichen verstanden werden, ist aber nicht als zuverlässiges Frühzeichen zu werten.
Im Rahmen dieser Arbeit wird ein Experiment vorgestellt, mit dem es möglich ist, die Wechselwirkungen zwischen Elektronen in der Gegenwart eines extrem starken Laserfeldes zu untersuchen. Diese resultieren aus der nichtsequentiellen Multiphoton- Doppelionisation von Neon in einem starken elektrischen Feld, das durch einen Hochleistungslaser erzeugt wird. Mit Hilfe der COLTRIMS-Technologie ist es möglich die entstandenen Teilchen nachzuweisen und die Impulskomponenten zu bestimmen. Bei dieser Technologie handelt es sich um ein „Mikroskop“, das atomphysikalische Prozesse vollständig differntiell beobachtet. Die bei der Doppelionisation entstandenen Elektronen und das Rückstossion werden mittels eines schwachen elektrischen Feldes auf orts- und zeitaufgelöste Multichannelplate-Detektoren mit Delaylineauslese geleitet. Zusätzlich wird noch ein magnetisches Feld überlagert. Aus dem Auftreffort und der Flugzeit der Teilchen können die Impulse bestimmt werden. Es ist erstmals möglich die Impulskomponenten der drei Raumrichtungen für alle an der Ionisation beteiligten Teilchen mit hinreichend guter Auflösung zu bestimmen. Es können vollständige differentielle Winkelverteilungen erzielt werden. Damit gelingt es, ein kinematisch vollständiges Experiment zu realisieren. Die Elektronen werden bevorzugt in Richtung des Polarisationsvektors des Laserlichtes emittiert. Aufgrund der guten Impulsauflösung ist es jetzt möglich, die Richtung senkrecht zur Polarisation zu untersuchen und die Erkenntnisse in Bezug zueinander zu bringen. Das der nichtsequentiellen Doppelionisation zu grunde liegende sehr anschauliche Modell ist der „Rescattering-Prozess“: Das Laserfeld koppelt an das Coulombpotential des Atoms und verformt es derart, dass ein Elektron die effektive Potentialbarriere überqueren oder durch diese durchtunneln kann. Dieses zuerst befreite Elektron wird durch das oszillierende elektromagnetische Feld zunächst vom Ursprungsion fortgetrieben. Kehrt aber die Phase des Laserfeldes um, wird es zurück zum Ion beschleunigt, nimmt dabei Energie aus dem Feld auf und kann durch Elektron-Elektron-Stossionisation ein zweites Elektron aus dem Atom ionisieren oder es können kurzzeitige Anregungszustände erzeugt werden, die später feldionisiert werden. Dieses Modell wurde schon durch ein Vielzahl von Experimenten verifiziert. Gleichzeitig wirft es aber auch Fragen auf: Wie sind die Elektron-Elektron-Korrelationen zu erklären? Wie hängt der Longitudinal- mit dem Transversalimpuls zusammen? Welche Ionisationsmechanismen treten wann auf? Zusammenfassend kann man sagen, dass ein Experiment präsentiert wird, das zur Erfoschung von Korrelationseffekten bei Multiphoton-Ionisation beiträgt und sehr detaillierte Einblicke in die Welt der Laseratomphysik gewährt. Die Daten belegen eindeutig, dass eine Messung der korrelierten Impulse mehrerer Teilchen in einem Laserfeld eine Zeitmessung mit einer Auflösung weit unter einer Femtosekunde ermöglicht. Das beobachtete Ein- und Ausschalten der Elektronenabstossung, je nach der über die Longitudinal-Impulskorrelation gemessenen Verzögerungszeit, zeigt die Möglichkeit „Attosekunden Physik ohne Attosekunden-Pulse“ zu betreiben.
Rumination im Alltag : Inhalte, Verlauf, Vorhersage und klinische Aspekte gedanklicher Bewältigung
(2004)
Unerwünschte wiederkehrende Gedanken - gewissermaßen gedankliches Wiederkäuen - werden auch als Rumination bezeichnet. Rumination kann harmlose Selbsterinnerung an noch zu erledigende Aufgaben beinhalten, aber auch bis hin zu klinisch bedeutsamen Symptomen reichen. Entsprechend gilt Rumination je nach theoretischem Ansatz beispielsweise als instrumentell im Dienste der Zielerreichung (Martin & Tesser, 1996a; 1996b) oder als maladaptive Bewältigung von dysphorischer oder depressiver Verstimmung (Nolen-Hoeksema, 1991; 1996). Da in den meisten bislang vorliegenden Studien jedoch entweder indirekte Indikatoren für Rumination oder aber Fragebögen zur Ruminationsneigung verwendet wurden, lagen ökologisch valide Daten zur spontan auftretenden Rumination im Alltag bislang kaum vor. Hierzu haben wir vier Studien durchgeführt. In der ersten Studie wurde das Ruminationsverhalten von N = 46 Studienanfängern mittels der aus Alltagsbewältigungsforschung und Therapie bekannten strukturierten Tagebücher untersucht. Der Anteil ruminativer Strategien an der Bewältigung negativer Alltagsereignisse lag je nach zugrundeliegender Ruminationsdefinition bei 28 bis 33%. Zur Vorhersage aktueller Rumination wurden aus den Ruminationstheorien von Martin und Tesser (1996a; 1996b) sowie Nolen-Hoeksema (1991; 1996) Hypothesenmodelle abgeleitet. Ein von uns vorgeschlagenes drittes Hypothesenmodell berücksichtigte mit Appraisal aus dem Bewältigungsmodell von Lazarus (1991; 1993) auch ein kognitives Element. Hierarchisch lineare Datenanalysen ergaben theoriekonforme Belege für die Bedeutung von Zielen und Dysphorie in der aktuellen, spontanen Rumination. Die beste Varianzerklärung gelang jedoch unter Einbeziehen des Appraisal im dritten Hypothesenmodell. Dieses Modell ließ sich anhand der Daten aus Studie II replizieren. Außerdem wurden bei den N = 72 Studienanfängern der zweiten Studie zusätzlich Dauer, Inhalte und Beurteilung des Nachdenkens erfasst und im Hinblick auf theoretische Grundannahmen diskutiert. In Studie III wurde die Bewältigung bei N = 54 Opfern eines Wohnungseinbruches untersucht. Hierbei zeigte sich nach 4 Wochen erwartungsgemäß ein Nachlassen der Rumination über den Einbruch bei gleichzeitiger Normalisierung des subjektiven Wohlbefindens. Die Befunde dieser drei Studien deuten darauf hin, dass Rumination eine bei gesunden Normalpersonen häufig eingesetzte alltägliche Bewältigungsstrategie ist. Trotz ihrer Zusammenhänge mit Dysphorie lassen sich keine längerfristig maladaptive Folgen der Rumination, wie Nolen-Hoeksema (1991; 1996) sie postuliert, nachweisen. Kognitive Ereignisbeurteilungen haben einen größeren Einfluss auf die Alltagsrumination als die in der Theorie von Martin und Tesser (1996a; 1996b) ins Zentrum gerückten Ziele. Die Angemessenheit der Ruminationsmodelle für die Alltagsrumination wird diskutiert. Studie IV schließlich untersuchte die Rumination von N = 50 stationär behandelten AlkoholEntgiftungspatienten. Hinsichtlich Dauer und Bewertung des Nachdenkens unterschieden sich die Patienten deutlich von den Studenten aus Studie II. Nach einem Katamnesezeitraum von 3 Monaten ließ sich bei den abstinent gebliebenen Patienten eine ähnliche Verringerung von Ruminationsneigung, Depressivität und negativem Befinden nachweisen, wie sie Hoyer, Heidenreich und Fecht (2000) bei langzeittherapierten Alkoholpatienten gefunden hatten. Die später abstinent bleibenden Patienten zeichneten sich zudem - gemessen an den weiter oder wieder Alkohol konsumierenden Patienten - bereits am Ende des Klinikaufenthaltes durch eine „kritischere“ Einstellung zum eigenen Nachdenken aus. Die explorative, prospektive Regressionsanalyse auf das Kriterium Abstinenz ergab, dass von Parametern der Rumination eine fast ebenso hohe Varianzerklärung ausging wie von „harten“ krankheitsbezogenen Daten. Hohe Ruminationsneigung sowie eine positive Einstellung zur aktuellen Rumination sind demnach prognostische Faktoren, die einen fortgesetzten Alkoholkonsum fördern. Die Ergebnisse werden im Hinblick auf therapeutische Implikationen diskutiert.
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung, inwieweit sich die Expression bestimmter Oberflächenmerkmale auf Lymphozyten im peripheren Blut nach einer Transplantation im Rahmen der chronischen Abstoßungsreaktion verändert. Dazu wurde ein etabliertes Modell zur chronischen Abstoßung mit zwei sich genetisch nur gering differierenden Rattenspezies verwendet. Dabei wurden Herzen von Lewis-Ratten heterotop auf Fischer 344-Ratten transplantiert. Die Untersuchung wurde vergleichend unter der immunsuppressiven Behandlung von Cyclosporin A (CsA), Tacrolimus (FK-506) und Mycophenolate mofetil (MMF) sowie einer unbehandelten Gruppe durchgeführt. Über den Zeitraum von 60 Tagen wurden die Oberflächenmerkmale mit durchflusszytometrischen Messungen bestimmt.
Operative Eingriffe am offenen Herzen wie die häufig durchgeführten Bypass- und Herzklappenersatzoperationen bedürfen fast immer der Unterstützung durch die Herz Lungenmaschine bzw. extrakorporale Zirkulation. Durch den Kontakt des Blutes mit nichtorganischen Fremdoberflächen der EKZ kommt es zur Induktion einer transienten Hyperaktivität neutrophiler Granulozyten. Nachdem Herz und Lunge nach Öffnung der Aortenklemme ihre physiologische Funktion wieder aufnehmen und reperfundiert werden, werden aus diesen ischämischen Organen darüber hinaus pathogene Moleküle wie freie Sauerstoffradikale freigesetzt. Von aktivierten Neutrophilen freigesetzte, immmunkompetente Moleküle (z.B. Zytokine) führen zusammen mit diesem oxidativen Stress zu Organdysfunktionen durch Ödembildung in Körpergeweben wie Myokard, Lunge, Gehirn und Gastrointestinaltrakt und dadurch zu typischen Folgeerscheinungen wie z.B. verlängerter postoperativer Beatmungszeit oder (meist transienten) neuropsychologischen Dysfunktionen im Sinne von kognitiven Defiziten. Andere Pathomechanismen wie Mikroembolien durch z.B. Kleinstteilchen und Gasbildungen aus dem OP Gebiet verstärken diese pathogenen Effekte. Resultat ist eine verlängerte Regenerationsdauer und ein verlängerter Krankenhausaufenthalt der operierten Patienten. Zur Minimierung dieser unerwünschten Wirkungen der EKZ wurden in den letzen 20 Jahren diverse Techniken zur Filtration der unterschiedlichen Kreislaufbestandteile innerhalb der EKZ entwickelt. Von besonderem Interesse ist die seit ca. 8 bis 10 Jahren etablierte Filtration aktivierter neutrophiler Granulozyten, die die Hauptverantwortung für das aseptische Entzündungsgeschehen unter Anwendung der EKZ tragen. Entwicklung und Einsatz dieser leukozytenspezifischen Filtersysteme führt zwar zu einer deutlichen Reduktion der zirkulierenden immunaktiven Zellen und zu einer geringgradigen Verringerung der pathogenen EKZ Folgeerscheinungen, die Effektivität der gegenwärtigen Leukozytenfiltration stellt sich allerdings nur in einzelnen Berichten als positiv dar. Die Daten, die einen deutlichen klinischen Vorteil der Leukozytenfiltration zeigen, sind nicht vorhanden. Die unterstützende Anwendung antiinflammatorischer, systemisch angewandter Pharmaka führte zwar bei den meisten Präparaten zu Erfolg versprechenden Ergebnissen im Tierversuch, konnte aber beim operierten Patienten selbst zu keiner deutlichen Verminderung der unerwünschten EKZ Wirkungen beitragen. Unter der Vorstellung, dass gefilterte, aktivierte Leukozyten zum Großteil zwar nicht in den Patientenkreislauf zurückgepumpt werden, jedoch immer noch immunaktive Stoffe von ihnen synthetisiert und sezerniert werden können, liegt es auf der Hand, dass die aktuell zum klinischen Einsatz kommenden Filtersysteme zum Zwecke der Filtrationsoptimierung und konsekutiver Pathogenitätsminimierung durchaus verbesserungsbedürftig sind. Die in Abschnitt 3 angeführten Ergebnisse belegen, dass antikörperbeschichtete Leukozytenfiltermembranen durchaus in der Lage sind, in einem Kreislaufmodell ihre entsprechenden Antigene herauszufiltern und damit zu inaktivieren. Als klinische Anwendung ist dieses Modell allerdings nur unter einem immensem Technik- sowie Kostenaufwand umsetzbar, so dass sich die Frage nach alternativen Lösungsstrategien stellt. Diese Arbeit leistete die theoretische Grundlage zur Entwicklung eines in naher Zukunft möglicherweise klinisch praktikablen Moduls zur Leukozyteninaktivierung. Da anti CD95 IgM in der Lage sind, Apoptose in CD95 Rezeptor tragenden Zellen zu induzieren und diese damit bzgl. ihrer Stoffwechselaktivität zu limitieren bzw. zu inaktivieren, konnte ein ebenfalls in Abschnitt 3 vorgestelltes Modell zeigen, dass in CD 95 Rezeptor tragenden Zellen über ihren Kontakt mit anti CD95 IgM beschichteten Leukozytenfiltermembranen Apoptose induziert werden kann. Ein detailverbessertes, anti CD95 IgM beschichtetes Leukozytenfiltersystem (Leukozyteninhibitionsmodul, „LIM“) zeigte bereits im Schweineversuch eine deutliche Verbesserung der postoperativen Herzfunktion gegenüber der Tiergruppe, die mit herkömmlichem Leukozytenfiltersystem operiert wurde. Außerdem konnte eine deutlich reduzierte Transmigrationsfähigkeit (als Maß des Aktivierungszustandes) der aus dieser EKZ isolierten Neutrophilen nachgewiesen werden, so dass Grund zur Annahme besteht, dass dieses Modell in Zukunft den herkömmlichen Leukozytenfilter ablösen könnte. Mit dieser Arbeit wurde eine Möglichkeit aufgezeigt, wie die Problematik der EKZ induzierten Immunpathogenese grundlegender bekämpft werden kann.
Ein gastroösophagealer Reflux, der keine gastroenterologischen Symptome wie Erbrechen oder saure Regurgitation zeigt, kann im Kindesalter chronische Erkrankungen der Lunge auslösen. Typische Krankheitsbilder sind hierbei zum Beispiel Asthma bronchiale oder rezidivierende Bronchitiden. Die Inzidenz hierfür beträgt 1 : 300 bis 1 : 500. Für die Entstehung eines gastroösophagealen Reflux wird ein multifaktorielles Geschehen diskutiert. So kann zum Beispiel ein verminderter Druck des unteren Ösophagussphinkters, eine verminderte Leistung der Clearancefunktion des Ösophagus, eine pathologische Magensäuresekretion und auch eine verlängerte Entleerung des Magens ursächlich sein. Studien haben einen Zusammenhang zwischen einer pathologischen Magenentleerungszeit und einem symptomatischen gastroösophagealen Reflux beschrieben. Ein primärer Defekt wird hierbei in einer Motilitätsstörung vermutet, da ein signifikanter Zusammenhang zwischen pathologischen Magenentleerungszeiten und Dysrhythmien (abnormen elektrischen Potentialen) des Magens beschrieben ist. Bisher ist kein diagnostisches Verfahren bekannt, dass mit hoher Sensitivität und Spezifität das Vorliegen eines gastroösophagealen Reflux beweist. Vielmehr umfasst die derzeitige Diagnostik lediglich Teilaspekte der Erkrankung und liefert uneinheitliche Bilder. Bei insgesamt 25 Kindern mit Lungenproblemen bedingt durch einen gastroösophagealen Reflux wurde die Magenentleerungszeit, eine 2 Punkt-pH Metrie, eine obere Magendarmpassage sowie eine quantitative Bestimmung von fettbeladenen Alveolarmakrophagen im Rahmen einer Bronchoskopie erhoben. Im Gegensatz zur bisher üblichen Bestimmung der Magenentleerungszeit per Szintigraphie konnten im Rahmen dieser Arbeit die Werte mit einem 13C-Acetat- Atemtest gemessen werden. Eine pathologische Magenentleerungszeit wurde bei ungefähr der Hälfte der Patienten dargestellt. Obwohl ein Zusammenhang zwischen der Magenentleerungszeit und anderen Untersuchungsbefunden vermutet wurde, konnte keine signifikante Korrelation aufgezeigt werde. Alle Testverfahren lieferten unterschiedliche Ergebnisse. Bei keinem Kind mit klinisch gesichertem gastroösophagealen Reflux waren alle erhobenen Parameter pathologisch. Die Verteilung der Ergebnisse erfolgte auch im grenzpathologischen Bereich nicht signifikant. Als Grund hierfür kann vermutet werden, dass der gastroösophageale Reflux bei Kindern unterschiedliche Ursachen hat. So könnte eine pathologische Magenentleerungszeit bei einem Teil der Kinder ursächlich sein oder im Vordergrund stehen, während andere pathologische Korrelate das gleiche Krankheitsbild verursachen. Die Diagnosestellung eines gastroösophagealen Reflux bei Kindern mit pulmonaler Symptomatik kann somit nur mit hinweisenden Untersuchungen erfolgen, bei denen auch Widersprüche geduldet werden müssen.
Die antivirale Funktion der RNA-abhängigen Adenosin-Desaminase bei der angeborenen Immunantwort
(2004)
Die angeborene Immunantwort von Säugetieren ist die erste wirkungsvolle Barriere gegen eindringende Pathogene, die sowohl Infektionen als auch die Entstehung von Neoplasien verhindern kann. Insbesondere wird durch sie die Ausbreitung und Replikation von Viren wirksam bekämpft. Bei RNA-Viren wird die angeborene Immunabwehr in infizierten Zellen von der doppelsträngigen RNA aktiviert, die während der Replikation oder Transkription dieser Viren entsteht. Es kommt zur Sezernierung von Interferon-alpha und -beta (IFN-alpha/beta), die wiederum die Expression einer Reihe von antiviralen Proteinen stimulieren. Eines dieser Proteine ist die IFN-alpha-induzierbare RNA-abhängige Adenosin Desaminase (iADAR-1). Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der iADAR-1 in der Immunabwehr näher zu charakterisieren. Bisher wurde die antivirale Aktivität der iADAR-1 gegen verschiedene Virusstämme, deren Genome Adenosin zu Guanosin (A->G) Hypermutationen aufweisen, nur angenommen, jedoch noch nicht direkt gezeigt [4]. In dieser Arbeit wurde am Beispiel des Glykoproteins (GP) des lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV) untersucht, ob solche A->G Mutationen im viralen Genom tatsächlich durch die iADAR-1 verursacht werden und ob dadurch die Funktion der viralen Proteine und damit die Infektiösität von LCMV reduziert wird. Des Weiteren wurde die Induktion der iADAR-1 durch die Infektion mit LCMV und die Wirkung der iADAR-1 auf die Replikation von LCMV analysiert. Bekannt war nur, dass die iADAR-1 durch IFN-alpha selbst oder durch die Infektion von Makrophagen mit Adenoviren induziert wird. In dieser Arbeit wurde erstmals für Fibroblasten, neuronale Zellen und in vivo in Mäusen nachgewiesen, dass die iADAR-1 direkt durch die Infektion mit LCMV hochreguliert wird. Dies ist ein weiterer Hinweis, dass die iADAR-1 zu den antiviralen Effektormolekülen der angeborenen Immunabwehr zählt. LCMV induzierte die Expression der iADAR-1 sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene. Im Gegensatz zu Vaccinia- und Adenoviren, die die Aktivität der iADAR-1 inhibieren [5, 6], konnte bei der Infektion von SH-SY5Y-Zellen mit LCMV keine reduzierte Aktivität der iADAR-1 festgestellt werden. Ferner konnte das schon in anderen Viren beobachtete A->G Hypermutationsmuster nun auch für LCMV bestätigt werden. Sowohl in vitro in L929-Zellen als auch in vivo in Mäusen wurde eine erhöhte A->G Mutationsfrequenz gefunden, die zwischen 50 und 75 % aller Mutationen in der S-RNA von LCMV ausmacht. Dies zeigte sich vor allem in der späten Phase der Infektion, also zu Beginn der Persistenz. Insgesamt wurden zu diesem Zeitpunkt in L929-Zellen 27 % und in der Maus 15 % nicht funktionelles LCMV-GP synthetisiert. Zudem wurde die Relevanz der A->G Hypermutationen für die beeinträchtigte Funktion des GPs deutlich, da sie 62 % der nicht infektiösen GP-Moleküle verursachen. Die desaminierende Wirkung der iADAR-1 auf das virale Genom von LCMV wurde in 293T-Zellen direkt gezeigt. A->G Mutationen in der S-RNA von LCMV nahmen durch die Überexpression der iADAR-1 in 293T-Zellen um 40 % zu. Ebenso wurde die Replikation bzw. das Assembly von Virionen durch die iADAR-1 reduziert, da im Vergleich zu Kontrollzellen der LCMV-Titer im Überstand von iADAR-1-überexprimierenden Zellen wesentlich niedriger war. Des Weiteren konnte bestätigt werden, dass die A->G Mutationen nicht durch die virale Polymerase induziert werden. Hierfür wurden iADAR-1 „knockout“ murine embryonale Fibroblasten (MEF) isoliert und als stabile Zelllinie etabliert. In diesen Zellen war kein A->G Hypermutationsmuster in der LCMV-RNA zu erkennen. In MEF wt war ebenfalls kein A->G Hypermutationsmuster nachweisbar. Der Grund hierfür könnte die im Vergleich zu L929-Zellen deutlich geringere basale iADAR-1-Expression der nicht völlig ausdifferenzierten MEFs sein.
Bei den Projekten wie der Europäischen und der Amerikanischen Spallationsneutronenquelle aber auch den geplanten aktuellen Großprojekten wie dem Upgrade von CERN oder ISIS werden negative Ionen benötigt. Bei solchen Anlagen werden am Ende des üblichen linearen Beschleunigers Speicherringe eingesetzt, die den Teilchenstrom akkumulieren und danach longitudinal komprimieren. Durch die Verwendung eines Strahls aus negativen Ionen kann die Injektion in den Speicherring wesentlich vereinfacht werden. In der vorliegenden Dissertation wurde die Extraktion und der Transport von negativen Wasserstoffionen für den ersten Abschnitt eines Linearbeschleunigers, bestehend aus Quelle, Extraktion und niederenergetischem Strahltransport (LEBT), sowohl experimentell als auch theoretisch untersucht. In dieser Sektion wird der grundlegende Strahlstrom und die Strahlqualität eines Linearbeschleunigers definiert. Eine komplette Untersuchung dieses Abschnitts lag bis dato für negative Ionen nicht vor. Um die Unterschiede aufzudecken und die einflußnehmenden Größen zu bewerten, mußten alle Experimente sowohl mit positiven als auch mit negativen Ionen durchgeführt werden. In allen Sektionen führen verschiedene Faktoren zu Strahlstromverlusten und Qualitätsverschlechterung, sprich Emittanzvergrößerung. Im Zuge dieser Arbeit wurde eine Quelle für negative Ionen entwickelt und gebaut und eine neue Methode zur Produktionssteigerung von negativen Ionen entwickelt. Die Innenwand der Plasmakammer der Ionenquelle wurde mit dem Edelmetallkatalysator Platin beschichtet. Die Plasmazusammensetzung innerhalb der Quelle verlagerte sich dadurch auf 80–90% H3 , 5-10% H2 und nur noch ein geringer Anteil an Protonen. Dieser hohe molekulare Anteil war über eine große Spanne aller Plasmaparameter stabil und führt zu einer drastischen Produktionssteigerung von angeregtem H2 und H- . Zur Formierung des Ionenstrahls wurde von mir ein sogenannter stromtoleranten Extraktor entwickelt. Trotz einer Veränderung des extrahierten Stroms um den Faktor 5 kommt es mit diesem Extraktor zu keinem nennenswerten Emittanzwachstum. Dieser eignet sich allgemein für die Extraktion gepulster Ionenstrahlen, im Besonderen aber für die Extraktion von negativen Ionen, da hierbei gleichzeitig Elektronen mit extrahiert werden. Dieser meist hohe Strahlanteil aus hochenergetischen Elektronen muß vor dem Einschuß der negativen Ionen in den RFQ durch ein geeignetes System aus dem Strahl ausgelenkt und abgeführt werden. Grundlagen, Entwicklung und Einflüsse dieser sogenannten Dumpingsysteme werden in Kap. 5 beschrieben. Für die Realisierung einer Niederenergietransportstrecke für negative Ionen stehen die beiden Möglichkeiten des magnetischen LEBT (Kap. 6) und des elektrostatischen LEBT (Kap. 7) zu Verfügung. Mit verschiedenen Meßaufbauten werden im anschließenden Kap. 8 die in den vorigen Kapiteln aufgeführten relevanten Größen der Erzeugung, der Extraktion und des Transport experimentell untersucht. Zusätzlich zu den bekannten klassischen Analyseverfahren kommen im Rahmen dieser Arbeit entwickelte optische Meßmethoden zum Einsatz, mit deren Hilfe man Plasmatemperatur und Plasmaverteilung innerhalb der Ionenquelle bestimmen kann. Mit Hilfe der Untersuchungen gelang es, die Unterschiede zwischen der Extraktion von negativen Ionen und von positiven Ionen aufzuzeigen und mit Hilfe der experimentellen Beobachtungen ein neues Modell für die Extraktion von negativen Ionen zu entwickeln. Mit der vorliegenden Arbeit wurde zudem gezeigt: - Der extrahierbare negative Strom ist hauptsächlich abhängig vom Diffusionsprozeß der Teilchen durch einen positiven Potentialwall innerhalb der Ionenquelle. - Durch Kompensation der magnetischen Felder in der Extraktionsregion wird die Emittanz reduziert und der Strom gesteigert. - Der beobachtete planare Plasmameniskus wird maßgeblich durch die rückfließenden Restgasionen beeinflußt. - Der Transport der negativen Ionen mit einer magnetischen LEBT stellt kein wesentliches Problem dar, da eine hinreichende Anzahl an positiven Restgasionen für den raumladungs-kompensierten Transport vorliegt.
Die vorliegende Studie hat die Häufigkeit familiärer Tumorhäufungen in Familien von Patienten mit kolorektalen Karzinomen und klinische Kriterien untersucht, die mit dem vermehrten Auftreten von Tumoren in diesen Familien assoziiert sind. Die Bedeutung von klinischen Diagnosekriterien zur Erfassung familiärer Häufigkeiten von Tumoren wurde analysiert. Dabei zeigte sich, dass die klassischen Diagnosekriterien im Alltag keine Bedeutung haben (die Amsterdam-Kriterien werden kaum erfüllt). Dass sich andererseits familiäre Tumorhäufungen mit einfachen klinischen Kriterien in hohem Ausmaß erfassen lassen, dazu zählt als wichtiges Kriterium: • Ein weiterer betroffener Patient mit Tumorleiden in der Familien im Diagnosealter <= 55 Jahre, • die Vertikale Transmission HNPCC-typischer Tumore Bei Anwendung dieser Kriterien können nahezu 2/3 der Familiären Cluster erkannt werden. Die Kombination von Kriterien, wie etwa „Diagnosealter des Patienten <= 50 Jahre mit Angehörigen mit Karzinom im Diagnosealter <= 50 Jahre“, sowie die Kombination „Diagnosealter des Patienten <= 50 Jahre und die Vertikale Transmission HNPCC-typischer Karzinome“ verbessert die Erkennung von Familien mit Tumorhäufungen nicht. Das Tumorspektrum in den so definierten Familien entspricht dem des HNPCC. Das legt den Schluss nahe, dass es sich um eine abortive Form des HNPCC oder aber um ein molekulargenetisch differentes, aber in der Manifestation mit dem HNPCC überlappendes Syndrom handeln könnte. Ob bei den so definierten Familien eine präventive Diagnostik erfolgreich ist, bedarf weiterer Studien. Solange kein einfaches molekulargenetisches Verfahren leicht und kostengünstig zur Verfügung steht, sind diese Anamnesekriterien für den klinischen Alltag und für die betroffenen Familien von außerordentlicher Bedeutung.
In der vorliegenden Arbeit wird das Wachstums- und Zelltodverhalten von Tumoren des zentralen Nervensystems untersucht. Des Weiteren wird die Expression verschiedener Apoptose-assoziierter Faktoren in den Präparaten analysiert und mit Normalkontrollen verglichen. Es zeigt sich, dass Apoptose von Tumorzellen aller untersuchter Hirntumore und Malignitätsgrade vollzogen werden kann. Die Rate apoptotischer Zellen ist jedoch sehr variabel und korreliert nicht mit dem Malignitätsgrad der Tumore. Auch besteht keine Korrelation zwischen der Apoptose- und der Proliferationsrate. Die Ergebnisse legen insgesamt nahe, dass die Apoptoserate nicht als Marker für die Malignität von Tumoren des zentralen Nervensystems verwendet werden kann. Auch unter Einbeziehung Apoptose-assoziierter Faktoren ist eine Gradifikation der Tumore hinsichtlich der Malignität nicht möglich. So unterscheiden sich z.B. atypische (WHO-II) und anaplastische (WHO-III) Meningiome quantitativ und qualitativ nicht signifikant voneinander. Es können ebenfalls keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Expression der untersuchten Apoptose-assoziierten Faktoren, sowie der Apoptose- und Proliferationsraten zwischen Medulloblastomen und primitiven neuroektodermalen Tumoren (PNETs) festgestellt werden. Dies spricht dafür, dass sich diese Tumore lediglich bezüglich ihrer Lokalisation im zentralen Nervensystem unterscheiden. Die Analyse der Apoptose-assoziierten Faktoren zeigt, dass alle untersuchten Faktoren grundsätzlich in allen untersuchten Tumoren vorkommen, während die Normalkontrollen diese Faktoren nicht exprimieren. Der Vollzug der Apoptose findet jedoch nicht in diesem Maße statt, da die Apoptoserate der Tumore (markiert durch TUNEL) stets wesentlich geringer ist als die Expressionsraten der Apoptose-assoziierten Faktoren. Es ist davon auszugehen, dass entdifferenzierte Tumorzellen entweder nur begrenzt in der Lage sind, ihr apoptotisches „Selbstzerstörungsprogramm“ in Gang zu setzen und zu Ende zu führen, oder, dass apoptosehemmende Mechanismen greifen. Um so interessanter wäre es, durch therapeutische Intervention Apoptose zu initiieren. Die Analyse der einzelnen Apoptose-assoziierten Faktoren liefert Hinweise darauf, an welchen Stellen des apoptotischen Systems eine solche Intervention ansetzen könnte: Die hochmalignen WHO-IV-Tumore zeigen eine signifikante Hochregulation der Effektor-Caspasen-3 und -6. Die physiologischen Aktivierungsmechanismen dieser Caspasen z.B. durch Caspase-2 und TNFalpha scheinen in diesen hochmalignen Tumoren jedoch weniger eine Rolle zu spielen, da diese Faktoren hier nur in geringem Ausmaß exprimiert werden. Jedoch könnten modifizierte, per se aktive Caspase-3- und -6-Moleküle eine interessante therapeutische Option zur Behandlung maligner Tumore des zentralen Nervensystems darstellen. Zu beachten ist aber unter anderem, dass z.B. Glioblastome auch geringe Expressionsraten apoptotischer Faktoren im peritumoralen, mikroskopisch nicht infiltrierten Normalgewebe zeigen. Dies könnte für eine peritumorale Dysfunktion des Hirngewebes sprechen. Welche Rolle dies bei der Behandlung mit Apoptose-stimulierenden Agenzien spielt und wie spezifisch die Anwendung solcher Stimulanzien für Tumorgewebe wären, muss Gegenstand weiterer Studien sein. Die untersuchten WHO-II- und –III-Tumore zeigen eine Hochregulation vor allem von Faktoren des extrinsischen Apoptoseweges (z.B. TNFalpha). Die Expressionsraten von TNFalpha korrelieren signifikant mit dem WHO-Grad der untersuchten Tumore. Interessante therapeutische Optionen könnten hier zum einen die Aktivierung des extrinsischen Apoptoseweges über TNFalpha sein, zum anderen könnte man versuchen, eine direkte Aktivierung über modifizierte Effektor-Caspasen herbeizuführen. Insgesamt existieren verschiedene mögliche Angriffsorte innerhalb des apoptotischen Netzwerkes der Zelle für eine thepeutische Intervention bei Tumoren des zentralen Nervensystems. Die Komplexität des Kaskade-artigen Systems legt nahe, dass eine therapeutische Intervention möglichst an dessen Ende erfolgen sollte, um möglichst viele Stör- und Hemmfaktoren zu umgehen.
Genetisch prädisponierende Faktoren und äußere Einflussfaktoren haben eine wesentliche ätiopathogenetische Bedeutung bei der multiplen Sklerose. Zahlreiche Fall-Kontroll-Studien und eine zunehmende Anzahl von Kohorten-Studien wurden zur Aufdeckung äußerer Risikofaktoren durchgeführt. Dennoch bleibt bis heute die Ätiologie der multiplen Sklerose weiterhin rätselhaft. In der vorliegenden Fall-Kontroll-Studie wurden Daten von 538 MS-Patienten, die im Laufe einer Langzeitstudie zur multiplen Sklerose in Südhessen von 1979 bis 1998 mittels eines ausführlichen Interviews befragt wurden, mit den Daten von 102 ebenfalls durch Interview befragten stationär chirurgischen Kontrollpersonen verglichen. Die Studie bezog sich hauptsächlich auf Einflüsse in der Kindheit und Jugend. Im Jahre 1998 wurden 102 Patienten (68 Frauen, 34 Männer), die in der Mehrzahl zur Durchführung einer Appendektomie, Thyreoidektomie, Herniotomie oder Cholezystektomiein der Chirurgischen Klinik des Evangelischen Krankenhauses Elisabethenstift in Darmstadt stationär behandelt wurden, während ihres stationären Aufenthaltes befragt. Ausgeschlossen waren Patienten mit malignen Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen und multimorbide, schwer kranke Patienten. Alle Kontrollpersonen wurden ausschließlich durch den Autor befragt. Von 1979 bis 1998 wurden insgesamt 538 multiple Sklerose-Patienten des Areals Südhessen, die zwischen 1938 und 1978 geboren wurden, ebenfalls mittels Fragebogen erfasst (364 Frauen, 174 Männer). Die meisten Befragungen erfolgten durch ein und denselben Untersucher (K. Lauer). Erfragt wurden zahlreiche Expositionen im Sinne der Hypothesengenerierung aus folgenden Bereichen: Kindliche Infektionen, ausgewählte internistische Erkrankungen, Traumata, Operationen und Anästhesien, Medikamente, Zahnstatus, Ernährung, Zigarettenkonsum, Wohn- und Sanitärverhältnisse, multiple Sklerose in Familie und Umgebung sowie Sozialstatus. In der bivariaten Auswertung wurden für jede Variable die Odds Ratio (OR) und das 95%- Konfidenzintervall (KI) errechnet und der p-Wert wurde mit dem Chi2-Test bzw. mit dem zweiseitigen Fisher-Test ermittelt. Hierzu wurde das Statistikprogramm Epi Info 6.0 verwendet. Für die multivariate Auswertung wurde eine schrittweise logistische Regressionsanalyse mit jeweiliger Elimination einer Variablen bis zum Signifikanzniveau (p X 0,05) vorgenommen. In die multivariate Analyse gingen alle signifikanten Variablen der bivariaten Auswertung (p X 0,05) sowie Geschlecht und Geburtsjahr ein. Die Variable „Tetanusimpfung“ wurde nicht mit einbezogen. Primäre Nachteile der vorliegenden Fall-Kontroll-Studie sind die unterschiedlichen Befragungszeiträume und Interviewer bei den Fällen und Kontrollen, weiterhin die Tatsache, dass der Fragebogen nur eine Reliabilität für eine eingeschränkte Zahl von Variablen bei den MS-Fällen und eine unbekannte Validität aufweist. Alter und Geschlecht wurden durch die Einbeziehung in die multivariate Auswertung kontrolliert. Bei der bivariaten Auswertung der Daten aller MS-Patienten und Kontrollpersonen waren die Variablen „Masern“, „Masern R 6 Jahre“, „Keuchhusten“, „oft Angina“, „Aether-/Chloroformnarkose“, „Karies“, „Konsum tierischer Fette“, „Hausschlachtung“, „Konsum pflanzlicher Fette“, „MS in der Familie“, „Kohleheizung“, „Kontakt zu Mäusen“ sowie „Kontakt zu Ratten“ mit einem signifikant erhöhten MS-Risiko assoziiert. Für das Vorhandensein von MS im Bekanntenkreis zeigte sich eine grenzwertig signifikante positive Assoziation. Die Variablen „Windpocken“, „Nasennebenhöhlenentzündung“ (Sinusitis), „Darmwürmer“ (Helminthosis), „>5 Zahnfüllungen“, „Polio-Impfung“, „Tetanus-Impfung“, „Diphtherie-Impfung“, „Konsum vieler Eier“ und „Abwasserentsorgung über Klärwerk“ waren signifikant invers mit MS assoziiert; für „Scharlach“, „Hypothyreose“ und „Abwasserentsorgung über ausgebaute Kanalisation“ ergab sich eine grenzwertig signifikante negative Assoziation. Außerdem erfolgten getrennte bivariate Auswertungen für die Subgruppen „weibliche MS-Patienten“, „männliche MS-Patienten“, „MS-Patienten mit schubförmigem Krankheitsbeginn“ und „MS-Patienten mit primär chronisch progredienter Verlaufsform“ mit den jeweiligen Kontrollpersonen. In den multivariaten Auswertungen ergaben sich für die Variablen „pflanzliche Fette“, „tierische Fette“, „Masern“ (bei Frauen), „Mäuse“, „MS in Familie“ (bei MS-Patienten mit schubförmigem Krankheitsbeginn) und „Kohleheizung“ positive Korrelationen zur multiplen Sklerose. Negativ korrelierend waren „Diphtherie-Impfung“, „Sinusitis“ und „viele Eier“ (bei Frauen). Der vermehrte Konsum tierischer Fette bei den MS-Kranken steht in Einklang mit zahlreichen Untersuchungen, während die gefundene Häufung von Pflanzenfett vorerst nicht erklärt ist. Zahlreiche andere Studien bestätigen auch das Vorhandensein einer multiplen Sklerose in der Familie als Risikofaktor. Ein erhöhtes Risiko für Mäusekontakte und Kohleheizung sollte in weiteren Untersuchungen überprüft werden. Für den bei den MS-Kranken gefundenen, selteneren Befall mit Würmern deutet sich eine biologische Plausibilität über die vermehrte TH2-Zellantwort bei Wurmbefall an. Zum Auftreten von Sinusitiden, das in der eigenen Studie seltener bei den Fällen war, liegen kontroverse Befunde bisheriger Untersuchungen vor. Ein protektiver Einfluss der Diphtherieimpfung wurde ebenfalls von anderen Untersuchern gefunden und sollte weiter überprüft werden. Letztendlich ist in der vorliegenden Arbeit eine Selektions-Verzerrung des MS-Risikos durch die ländliche Wohnortgröße, die nicht kontrolliert werden konnte, nicht auszuschließen, so dass eine zunächst vorsichtige Interpretation am Platze ist.
Der T-Zell-Wachstumsfaktor Interleukin-2 (IL-2) wird von Antigen-stimulierten T-Zellen sezerniert und spielt eine wichtige Rolle bei der zellulären Immunantwort. Dabei tragen in aktivierten T-Zellen die MAPK-Signalwege, der Calcineurin/NF-AT-Signalweg und der NF-KB-Signalweg kooperativ zur IL-2-lnduktion bei. In den letzten Jahren wurden mehrere Hinweise gefunden, dass IL-2 möglicherweise bei der HIV- und SIV-Pathogenese eine Rolle spielt. Zwei Publikationen konnten bereits eine verstärkte IL-2-Sekretion HIV-1-infizierter T-Zellen nachweisen, die molekularen Mechanismen dieser IL-2-Induktion sind bisher allerdings kaum untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das apathogene simiane Immundefizienzvirus der Afrikanischen Grünen Meerkatze (SIVagm3) in suboptimal stimulierten PBMC ebenfalls die Interleukin-2-Sekretion verstärken kann. In der humanen T-Zelllinie A3.01 wurde nach Transfektion des Volllängenplasmids des SIVagm3 eine bis zu 38-fach verstärkte transkriptionelle Aktivierung des IL-2-Promotors beobachtet. Die Untersuchung der beteiligten Signalwege zeigte, dass die MAP-Kinasen ERK, JNK/SAPK und p38 für die IL-2-Induktion durch SIVagm3 notwendig sind, während die Inhibition der Calcineurin-Aktivität durch das Immunsuppressivum Cyclosporin A keinen Einfluss hatte. In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis zeigte die Analyse der Transkriptionsfaktorbindungsstellen des IL-2-Promotors keine Aktivierung der NF-AT-kontrollierten Genexpression durch SIVagm3, womit zum ersten Mal ein Calcineurin/NF-AT-unabhängiger Weg der IL-2-Induktion beschrieben wurde. Dagegen erhöhte SIVagm3 die transkriptionelle Aktivität des NF-KB-responsiven Elements und die Aktivität des CD28/AP-1-responsiven Elements, die auch bei der klassischen T-Zellaktivierung eine Rolle spielen. Eine Aktivierung der CD28/AP-1-kontrollierten Genexpression konnte auch durch Expression des viralen Transaktivator-Proteins Tat induziert werden, das in stimulierten Zellen in der Lage war, die IL-2-Expression zu verstärken. Die Beschränkung dieser Tat-Funktion auf stimulierte Zellen konnte aber nicht auf eine Phosphorylierung von SIVagm3-Tat durch die MAP-Kinasen ERK, JNK/SAPK oder p38 zurückgeführt werden. Weitere Analysen zeigten dagegen, dass SIVagm3-Tat durch die Cyclin-abhängige Proteinkinase 9 (CDK9) phosphoryliert wird, die mit Tat koimmunpräzipitiert. Darüberhinaus konnte eine weitere nicht-identifizierte Tat-assoziierte Kinase nachgewiesen werden, die SIVagm3-Tat ebenfalls phosphorylieren kann. Aktuelle Publikationen zeigen, dass das lentivirale Vif-Protein die Degradation von Apobec3G im Proteasom induziert, da dieser zelluläre Faktor die Infektiosität der entstehenden Viruspartikel stark reduziert. Die antivirale Funktion von Apobec3G, die in der Deaminierung der Minusstrang-DNA während der reversen Transkription besteht, ist bereits weitgehend aufgeklärt, aber über die Regulation von Apobec3G ist noch wenig bekannt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung der mitogenen Raf/MEK/ERK-Signalkaskade durch den Phorbolester TPA zu einer verstärkten Apobec3G-Expression führt. Dieser Effekt konnte durch den Proteinkinase C (PKC)-Inhibitor Staurosporin und den MEK-Inhibitor U0126 inhibiert werden, wodurch gezeigt wurde, dass die Aktivität der MAP-Kinase ERK für die Verstärkung der Apobec3G-Expression notwendig ist. Eine Phosphorylierung von Apobec3G durch ERK wurde im Kinase-Assay jedoch nicht beobachtet. Dagegen konnte durch radioaktive in-vivo-Markierung nachgewiesen werden, dass es sich bei Apobec3G nicht um ein Phosphoprotein handelt. Neben den Untersuchungen zur Regulation von Apobec3G, konnten neue Erkenntnisse zu den Apobec3G/Vif-Interaktionen gewonnen werden. Durch Koimmunpräzipitationsstudien wurde die physikalische Interaktion von Vif und Apobec3G nachgewiesen. Zudem konnte gezeigt werden, dass in Gegenwart von Vif der Einbau von Apobec3G in die Viruspartikel gehemmt wird. Damit wurden erste Hinweise gefunden, dass Vif neben der Induktion des proteolytischen Abbaus von Apobec3G weitere Strategien anwendet, um die Inkorporation des antiviralen Faktors zu verhindern.
Das Philadelphia-Chromosom (Ph) ist das zytogenetische Korrelat der t(9;22). 95% der chronisch myeloischen Leukämien (CML) und 20-25% der akuten lymphatischen Leukämien (ALL) des Erwachsenen sind Ph-positiv (Ph+). Die t(9;22) führt zur Expression des chimären BCR/ABL Fusionsproteins, das für die Pathogenese der Ph+ Leukämien verantwortlich ist. Das ABL-Protein ist eine nicht-Rezeptor Tyrosinkinase. Im BCR/ABL-Fusionsprotein wird die Kinase-Aktivität von ABL, die im Normalfall streng reguliert ist, durch die Fusion mit BCR konstitutiv aktiviert. Die N-terminale BCR-"coiled-coil" Domäne vermittelt die Oligomerisierung des Fusionsproteins und dadurch zur Aktivierung der ABL-Kinase. Dies führt zur malignen Transformation hämopoetischer Zellen. Der ABL-Kinaseinhibitor STI571 ist ein tumorzellspezifisches Therapeutikum für Ph+ Leukämien, das bei der Mehrzahl der Patienten zur hämatologischen Vollremission führt. Insbesondere bei Patienten mit CML-Blastenkrise und Ph+ ALL kommt es durch klonale Selektion STI571-resistenter Zellen zu einem frühen Therapie-refraktären Rezidiv der Krankheit. Ziel dieser Arbeit war es, die Grundlagen für neue, tumorzellspezifische Therapiestrategien für die Behandlung BCR/ABL-positiver Leukämien zu legen. Im ersten Teil der Arbeit sollte geklärt werden, ob sich die "coiled-coil" Domäne als Zielstruktur für einen molekularen Therapieansatz eignet: es wurde untersucht, ob eine Hemmung der Oligomerisierung das Transformationspotential von BCR/ABL negativ beeinflußt. Der Zusammenhang zwischen Oligomerisierung und Transformationspotential von BCR/ABL wurde mit Hilfe verschiedener Fusionskonstrukte untersucht, bei denen die Oligomerisierungsdomänen verschiedener Proteinen, (BCR, PML, PLZF und TEL) mit dem ABL-Teil von BCR/ABL fusioniert wurden (X-ABL). Es konnte gezeigt werden, daß ein direkter Zusammenhang zwischen der Oligomerisierung, Transformationspotential und STI571-Sensitivität besteht: verstärkte Oligomerisierung der X-ABL Konstrukte führte zu einem ein höheren Transformationspotential und einer geringeren STI571-Sensitivität und umgekehrt. Außerdem wurde gezeigt, daß die Inhibierung der Oligomerisierung mit Hilfe eines rekombinanten Peptids das Transformationspotential von BCR/ABL erniedrigt und gleichzeitig die Sensibilität gegenüber STI571 stark erhöht. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Oligomerisierungsdomäne von BCR/ABL einen therapeutischer Angriffspunkt für die Behandlung Ph+ Leukämien darstellt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Tumorzell-spezifische Mechanismus der As2O3-induzierten Apoptose bei Ph+ Zellen untersucht. Kürzlich wurde gezeigt, daß aktiviertes RAS die Expression von endogenem PML hochreguliert. RAS wird durch BCR/ABL konstitutiv aktiviert. Bei der Akuten Promyelozytenleukämie (APL) ist PML im Rahmen der t(15;17) durch die Fusion mit RARa modifiziert. Die Behandlung von Zellen mit As2O3 führt zur Modifikation von PML durch den "small ubiquitin like modifier" (SUMO-1). Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß sich die Gemeinsamkeiten zwischen Ph+ CML und ALL-Blasten und den t(15;17) positiven APL-Blasten in Hinsicht auf die Sensibilität für die As2O3-induzierte Apoptose auf die direkte oder indirekte Modifikation von PML durch die jeweiligen Translokationsprodukte zurückführen lassen. In dieser Arbeit wurde mittels Überexpression von PML und konstitutiv aktiviertem RAS (RASV12) gezeigt, daß BCR/ABL durch Aktivierung des RASSignalweges die PML-Expression modifiziert und die As2O3-induzierte Apoptose Ph+ Zellen somit durch PML vermittelt wird. An einem Mausmodell der Ph- Leukämie wurde die Wirkung von As2O3 auf die normale Hämopoese sowie auf die BCR/ABL-positive Leukämie überprüft. Es konnte gezeigt werden, daß As2O3 die normale Hämopoese nicht stört und bei 25% der behandelten Tiere zu einer Verbesserung des Blutbildes und einem längerem Überleben führt. Sowohl das therapeutische Angreifen an der Oligomerisierungsoberfläche von BCR/ABL als auch das Ausnützen der Modifikation von PML durch BCR/ABL eröffnen neue Möglichkeiten zur Behandlung von Ph+ Leukämien.
Protease-aktivierbare Retroviren bieten die Möglichkeit des gezielten Gentransfers in solche Tumorzellen, die an der Zelloberfläche proteolytisch aktive Proteasen, wie beispielsweise Matrix Metalloproteasen (MMP), exprimieren. Hierfür wird zunächst der Zelleintritt der Retroviren durch eine mit den Hüllproteinen fusionierte Blockierungsdomäne verhindert. Zwischen dieser Blockierungsdomäne und dem Hüllprotein befindet sich ein für eine zelluläre Protease fungierender Substratlinker, worüber die Blockierung entfernt und der natürliche Infektionsmechanismus der Retroviren wieder hergestellt wird. In Bezug auf die Tumortherapie mittels eines solchen Gentransfers ist es jedoch unmöglich vorherzusagen, welches Protease- Substrat für einen bestimmten Tumortyp am besten geeignet ist. Deshalb wurden im Rahmen dieser Arbeit retrovirale Protease-Substrat-Bibliotheken entwickelt, um erstmalig die Substrate der tumorassoziierten MMPs in lebenden Tumorzellen zu selektionieren und damit verbunden MMP-aktivierbare Retroviren mit verbesserten molekularen Eigenschaften für den gezielten Gentransfer zu evolvieren. Hiefür wurden, ausgehend von einem Protease-aktivierbaren Retrovirus, welches als Substratlinker das MMP-Standardsubstrat P-L-G-L-W-A präsentiert, Retroviren erzeugt, in denen dieses Substrat kombinatorisch diversifiziert wurde. In einer ersten retroviralen Protease-Substrat-Bibliothek wurde zunächst an drei Stellen zu P-X-G-L-X-X unter Ausschluss der Aminosäure Arginin diversifiziert, um die Selektion durch Proprotein-Konvertasen wie Furin zu vermeiden. Anschließend erfolgte die Selektion der Virus-Bibliothek in der Modell-Tumorzelllinie HT1080, wofür hier das entsprechende Protokoll etabliert wurde. Die Substratlinker der am häufigsten selektionierten Retroviren enthielten die beiden Konsensusmotive P-QG- L-Y-[Q/K] und P-Q-G-L-Y-[A/S]. Zur Identifizierung der optimalen Aminosäuren an allen sechs Positionen des Substrates wurden in einer zweiten Bibliothek die variierten Positionen auf Grundlage der selektionierten Konsensusmotive fixiert und die zuvor konstanten Positionen zu X-Q-X-X-Y-[Q/A] diversifiziert. Die aus dieser Bibliothek selektionierten Retroviren enthielten das Konsensusmotiv P-Q-G-[L/I/V]-Y-[Q/A], womit die zuvor selektionierten MMP-aktivierbaren Retroviren bestätigt wurden. Die biochemische Charakterisierung von mit den selektionierten Substratlinkern rekonstituierten Retroviren zeigte, dass ihre Substratlinker eine bemerkenswerte Verbesserung der Spaltung durch MMP-2 und eine erhöhte Inkorporation der dazugehörigen Hüllproteine in die Partikel aufwiesen. Außerdem ermöglichten die selektionierten Substratlinker den entsprechenden Retroviren sich schneller innerhalb der Zellpopulation auszubreiten, ohne dabei die Abhängigkeit von der MMP-Aktivierung zu verlieren. Darüber hinaus konnte sowohl die Kinetik des Zelleintritts bis zu 10-fach als auch die Infektiosität bis zu 1000-fach gegenüber dem parentalen Virus, das den Standard-Substratlinker trug, gesteigert werden. Letztendlich waren hierfür nur zwei selektionierte Aminosäureaustausche gegenüber dem MMP-Standardsubstrat verantwortlich, nämlich Glutamin (Q) und Tyrosin (Y), die zu dem Motiv P-Q-G-L-Y-A führten. Ausschlaggebend für die beschriebenen Selektionen waren die mehrfache Abdeckung der kombinatorischen Vielfalt der Substratlinker auf Partikel-Ebene bereits vor Selektion sowie die langsame Erhöhung des angelegten Selektionsdrucks während der Selektion. Dadurch konnte eine Deletion des kodierenden Bereichs der Blockierungsdomäne (EGF) im Virusgenom vermieden werden. Als treibende Kraft der Selektion stellte sich die proteolytische Aktivierung der selektionierten Retroviren an der Zelloberfläche heraus. Die Ergebnissen führen schließlich zu einem Modell der MMP-Aktivierung EGF-blockierter Retroviren. Danach binden die Partikel an die EGF-Rezeptoren der Zelloberfläche und gelangen so in die räumliche Nähe des MMP-Aktivierungskomplexes. Daraufhin werden sie proteolytisch aktiviert und infizieren die Zielzellen. Die hier selektionierten Substratlinker bzw. die entsprechenden Viren sind in Bezug auf die proteolytische Aktivierung optimal an die gewählte Tumorzelllinie angepasst.
Der Einfluss der zellulären mitogenen Signalkaskade auf die Pathogenese einer Infektion mit HIV oder SIV (humanes, simianes Immundefizienzvirus) ist bis heute weitgehend unbekannt, obwohl in mehreren Studien eine Wechselwirkung zwischen HIV und dieser Signalkaskade festgestellt wurde. Unter anderem wurde eine direkte Interaktion von HIV-1-Nef mit c-Raf, einem wichtigen Mitglied der klassischen mitogenen Signalkaskade, beschrieben. In dieser Arbeit sollten daher die physiologischen Konsequenzen dieser Virus-Wirtszell-Interaktion analysiert werden. Für die Untersuchungen ist der akut enteropathische SIV-Stamm PBj ein geeignetes Modellsystem, da PBj im Gegensatz zu anderen Lentiviren in nichtmitogen- stimulierten Zellen repliziert. Außerdem induziert PBj die Proliferation von unstimulierten Zellen, wofür eine Aktivierung mitogener Signale notwendig ist. Weiterhin sind die Ursachen für die ausgeprägte PBj-induzierte akute Erkrankung nur unvollständig aufgeklärt. Für die Untersuchungen wurde ein replikationsfähiger Virusklon von PBj mit zwei Punktmutationen in der Raf-Bindungs-Domäne (RBD) des viralen Nef-Proteins erzeugt. In der erzeugten Virusmutante, PBj-Delta-RBD, wurden im Nef-Protein zwei benachbarte Aspartate zu Glycin verändert. Die erzeugte Virusmutante PBj-Delta-RBD war in der Lage in unstimulierten primären Zellen zu replizieren und zeigte die gleiche Replikationskinetik wie das Wildtypvirus (PBj-wt). Im Gegensatz zu PBj-wt induzierte PBj-Delta-RBD in vitro keine Zellproliferation, ERK1/2-Aktivierung oder IL-2- Sezernierung. Diese Ergebnisse zeigen, dass die RBD für die Fähigkeit, in unstimulierten Zellen zu replizieren, nicht benötigt wird. Dagegen ist die RBD für eine Induktion der ERK-Aktivität, Zellproliferation oder IL-2 Sezernierung notwendig. Die Infektion von Schweinsaffen (Macaca nemestrina) mit PBj-wt induzierte wie erwartet eine akute Enteropathie mit Symptomen wie blutigem Durchfall, Anorexie, Exikose und Tod. In pathologischen Untersuchungen wurden in den mit PBj-wt infizierten Tieren nekrotische Läsionen im gesamten Darmbereich beobachtet. Die Histopathologie des Kolons zeigte, dass die gesamte Mikrovilli-Struktur der Darmschleimhäute zerstört war. Darüber hinaus war eine massive Infiltration von Lymphozyten in die Mikrovilli erkennbar. Im Gegensatz dazu entwickelte keiner der mit PBj-Delta-RBD infizierten Schweinsaffen eines der für SIV-PBj charakteristischen Symptome, trotz einer vergleichbaren Replikationskinetik in vivo. Zusätzlich waren makroskopisch keine Veränderungen des Kolons festzustellen. Die histologische Untersuchung des Kolons der PBj-RBD-infizierten Schweinsaffen zeigte lediglich eine moderate Infiltration von Lymphozyten in die Mikrovilli. Die Analyse der frühen und späten Aktivierungsmarker auf T-Zellen im peripheren Blut und in den lymphatischen Geweben Milz und Lymphknoten zeigte, dass in PBj-wt-infizierten Schweinsaffen ein deutlich erhöhter Anteil aktivierter CD3+-T-Zellen im Vergleich zu PBj-Delta-RBD-infizierten Affen nachweisbar war. Zusammenfassend lassen die Ergebnisse dieser Arbeit den Schluss zu, dass in PBj-infizierten Zellen über eine Interaktion von PBj-Nef mit c-Raf die klassische mitogene Signalkaskade aktiviert wird. Dies induziert wiederum physiologische Aktivitäten wie Zellproliferation, Zellaktivierung und IL-2-Ausschüttung. Die festgestellte Aktivierung von CD8+-T-Zellen führt in vivo zu einer massiven Infiltration von aktivierten CD8+-T-Zellen in die Schleimhäute des Magen-Darm- Trakts. Es ist anzunehmen, dass die aktivierten CD8+-T-Zellen hier Perforin ausschütten und auf diese Weise massive Gewebsveränderungen der Mucosa induzieren. In der Folge kommt es zu den beobachteten Symptomen wie blutigem Durchfall und daraufhin zu Exikose. Ähnliche Mechanismen könnten auch bei der HIV-Enteropathie eine Rolle spielen. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass eine Verhinderung der Nef-Raf-Interaktion das Auftreten einer Enteropathie unterdrücken könnte. Die Nef-Raf-Interaktion ist somit ein potentielles Ziel für einen therapeutischen Ansatz.
In der vorliegenden Arbeit sollten mittels eines Hefe zweihybrid screens neue Interaktionspartner von ARVCF, einem cadherinbindenden armadillo repeat Protein, gefunden werden. Hierbei wurde aus einer cDNA-Bank differenzierender Myoblasten das Cytoskelettprotein Alpha-actinin als Bindungspartner des armadillo repeat Proteins identifiziert. Der Befund aus dem Hefesystem wurde durch Immunofluoreszenzaufahmen, in welchen gezeigt wurde dass die beiden Proteine kolokalisieren, bestätigt. Auch eine Coimmunopräzipitation bestätigte eine Interaktion der beiden Proteine. Weiterhin konnte eine direkte Interaktion von ARVCF mit Alpha-actinin in in vitro Pull-Down assays gezeigt werden, wobei eine Eingrenzung der Bindungsregion von ARVCF für Alpha-actinin jedoch nicht möglich war. Als nächstes wurde ARVCF im Rahmen dieser Arbeit mittels Computeranalysen auf potentielle Phosphorylierungsstellen hin untersucht. In in vitro Kinase assays wurde eine Phosphorylierung des Proteins durch die Proteinkinase C (PKC) festgestellt. Es konnte gezeigt werden, dass sich die subzelluläre Lokalisation von ARVCF nach Behandlung der Zellen mit den PKC stimulierenden Cytokinen TNF-alpha und EGF, sowie mit dem Phorbolester PMA ändert. Hierbei wurde ein Ablösen des Proteins von der Plasmamembran und eine Lokalisation in cytoplasmatischen Aggregaten beobachtet. Dieser Effekt erwies sich als Zelltypunabhängig und Spezies übergreifend. Es konnte gezeigt werden, dass der N-Terminus der Splicevariante 5'alt ARVCF notwendig und ausreichend für den beobachteten Effekt ist. p120(ctn), das dem ARVCF am nächsten verwandte Protein, zeigte bei einer Behandlung von Zellen mit PMA oder den oben genannten Cytokinen keinen Effekt in Bezug auf Lokalisationsänderung. Ebenso wenig konnte eine Änderung der Lokalisation nach Behandlung für die Proteine Beta-catenin sowie E-cadherin beobachtet werden. Der erhaltene Effekt nach Stimulation der Zellen war somit spezifisch für ARVCF und konnte nicht für ein anderes hier untersuchtes Catenin oder Cadherin gezeigt werden. Eine stark abgeschwächte Cadherinbindung von ARVCF nach Inkubation der Zellen mit den Cytokinen oder PMA konnte im MOM-recruitment assay beobachtet werden. Auch dieser Effekt erwies sich als ARVCF spezifisch und konnte nicht mit p120(ctn) gezeigt werden. Weiterhin wurden chimäre Moleküle mit dem N-Terminus von ARVCF und dem Rest von p120(ctn) und vice versus hergestellt. Hierbei konnte die abgeschwächte Cadherinbindung im MOM-recruitment assay durch den N-Terminus von ARVCF auf p120(ctn) übertragen werden. Die chimären Moleküle ARVCF/p120(ctn) fanden sich nach Behandlung von Zellen nicht mehr in Aggregaten wieder, waren aber über das Cytoplasma verteilt. Es konnte kein Effekt auf Stimulation der Zellen mit dem chimären Protein p120(ctn)/ARVCF gezeigt werden. Durch diese Art von "gain of function" Experiment konnte noch einmal die Wichtigkeit und Spezifität des N-Terminus von ARVCF in Bezug auf die Reaktion auf PMA- oder Cytokinstimulation gezeigt werden. Auch die Punktmutante T50A, bei welcher eine potentielle Phosphorylierungsstelle der PKC von Threonin nach Alanin mutiert war, löste sich nach Stimulation der Zellen von den Cadherinen, wie im MOM-recruitment assay gezeigt werden konnte. Allerdings lokalisierte diese Mutante nach Behandlung der Zellen nicht in Aggregaten, sondern, wie zuvor schon das chimäre Protein ARVCF/p120(ctn), über das Cytoplasma verteilt. So konnte gezeigt werden, dass es sich bei der abgeschwächten Cadherinbindung und bei der Aggregatbildung um zwei klar voneinander trennbare Eigenschaften des Moleküls handelt.
Für bestimmte Gentherapiestrategien bieten sich retrovirale Vektoren auf Grund der stabilen Integration der von ihnen übertragenen genetische Information an. Mit bisher vorhandenen retro- und lentiviralen Vektorsystemen kann jedoch kein effizienter Gentransfer in ruhende primäre Zellen wie unstimulierte PBMC oder undifferenzierte Monozyten erreicht werden. Ziel dieser Arbeit war es daher, retrovirale Vektorsysteme zu etablieren, die naive primäre Zellen effizient transduzieren können. Zunächst wurden HIV-1-Vektoren mit den Hüllproteinen (Env) des amphotropen MLV, des MLV-Klons 10A1, des felinen endogenen Retrovirus RD114 und des VSV sowie einem modifizierten GaLV-Env pseudotypisiert, um ihre Eignung für die Transduktion von primären T-Lymphozyten zu untersuchen. Mit diesen Vektoren konnten primäre stimulierte humane T-Lymphozyten mit ähnlichen Transduktionsraten von ca. 20% transduziert werden. Im Gegensatz dazu wurden mit MLV-Vektoren, die mit den gleichen Hüllproteinen pseudotypisiert waren, bei gleichem Transduktionsprotokoll untereinander deutlich unterschiedliche Transduktionsraten zwischen 1 - 45% erreicht. Dieser unerwartete Unterschied ist möglicherweise auf eine längere, dabei untereinander ähnliche Halbwertszeit der HIV- 1-abgeleiteten Vektoren zurückzuführen. Unstimulierte PBMC konnten allerdings unabhängig vom verwendeten Hüllprotein weder von den MLV- noch von den HIV-1-abgeleiteten Vektoren transduziert werden. Demgegenüber hatte sich in meiner vorangegangenen Diplomarbeit die Transduzierbarkeit ruhender humaner Zellen durch Vektoren angedeutet, die von dem akut pathogenen simianen Immundefizienzvirus SIVsmmPBj1.9 abgeleitet waren. In der hier vorgestellten Arbeit zeigten die PBj-Vektoren, die nur im env-Gen eine Deletion aufwiesen, dass sie auch in der G0-Phase des Zellzyklus arretierte GHOST-Indikatorzellen oder diploide Fibroblasten effizient und unabhängig von dem zur Pseudotypisierung verwendeten Hüllprotein transduzieren können. Die korrespondierenden HIV-1-Vektoren waren dazu nicht in der Lage. Auch PBj- und HIV-1-Vektoren, die egfp als Markergen transferieren, zeigten das gleiche Transduktionsverhalten. Die egfp-transferierenden SIVsmmPBj-Vektoren konnten schließlich im Unterschied zu den entsprechenden HIV-1-Vektoren auch frisch isolierte primäre humane Monozyten sehr effizient transduzieren. Mit Nef-deletierten Mutanten wurde schließlich gezeigt, dass die beschriebenen Fähigkeiten PBj-abgeleiteter Vektoren nicht vom viralen Nef-Protein abhängen, obwohl dieses regulatorische Gen die pathogenen Eigenschaften und die Replikationsfähigkeit von SIVsmmPBj-Viren bestimmt. Für alle mit SIVsmmPBj-abgeleiteten Vektoren transduzierten Zellen konnte in der vorliegenden Arbeit ferner die chromosomale Integration des Transfervektors gezeigt werden. Schließlich gelang die Konstruktion eines ersten 3-Plasmid-Vektorsystems, mit dem transduktionsfähige Vektorpartikel generiert werden können. Mit SIVsmmPBj-abgeleiteten Vektoren steht somit ein neues retrovirales Vektorsystem zur Verfügung, mit dem auch ruhende primäre Zellen stabil genetisch modifiziert werden können. Durch die Erschließung dieser wichtigen Zielzellen werden die Perspektiven einer dauerhaften Gentherapie in vitro und in vivo beträchtlich erweitert.
In der Stratosphäre finden eine Reihe von dynamischen und chemischen Prozessen statt, die u.a. den Abbau von Ozon beeinflussen. Um die langfristigen Veränderungen in der Stratosphäre untersuchen zu können müssen die Abhängigkeit dieser Prozesse von Raum und Zeit bekannt sein. In dieser Arbeit wird eine Untersuchung zur Variabilität der Stratosphäre auf der Grundlage der Varianz von Tracern, die in Form der „Equivalent Displacement Height“, kurz: EDH, dargestellt wird, vorgestellt. Die EDH ist tue mit Hilfe des lokalen vertikalen Gradienten normierte lokale Standardabweichung des Mischungsverhältnisses eines Tracers und besitzt die Dimension einer Länge. Durch die Normierung kann die Varianz verschiedener Tracer miteinander verglichen werden. Mit dem Konzept ist allerdings nur die Diagnose der Variabilität möglich und keine Quantifizierung der dafür verantwortlichen Prozesse. Für die Fragestellung werden drei Datensätze ausgewertet. Ein Datensatz ist mit Hilfe eines kryogenen Luftprobensammlers entstanden. Die Berechnungen iii dieser Arbeit zeigen, dass die zeitliche und räumliche Abdeckung dieses Datensatzes zu niedrig ist, um mit ihm eine repräsentative Aussage über die Varianz von Spurengasen in der Stratosphäre treffen zu können. Eine bessere zeitliche und räumliche Abdeckung besitzt der Datensatz des Satellitenexperimentes HA-LOE. Dieser wird dazu verwendet die monatlichen Verteilungen der mittleren EDH von CH4 und O3 in einem Höhenbereich zwischen 19 und 50 km für einen Zeitraum von 1993 bis 2000 zu berechnen. Die mittlere EDH von OH4 besitzt über den Hemisphären jeweils einen unterschiedlichen Jahresgang. Die Diskussion zeigt, dass dieser hemisphärische Unterschied auf die verschiedenen dynamischen Bedingung in der Stratosphäre über den Hemisphären zurückgeführt werden kann, vor allem auf die Existenz eines stabileren und langlebigeren Polarwirbels in der Südhemisphäre. Im Gegensatz dazu zeigt die mittlere EDH von O3 über beiden Hemisphären einen vergleichbaren Jahresgang, mit minimalen Werten der Varianz während der Sommermonate, wenn die Ausbreitung planetarer Wellen in die Stratosphäre durch die vorherrschende Ostwindzirkulation behindert wird. Dieser Jahresgang steht in Verbindung mit den chemischen und dynamischen Prozessen bzw. der Kombination, welche die Verteilung und Varianz von O3 in der Stratosphäre kontrollieren. Eine eindeutige Trennung der einzelnen Effekte ist dabei allerdings nicht möglich. Der Datensatz des Simulationsmodell KASIMA enthält die Verteilung von CH4 und O3 mit der höchsten zeitlichen und räumliche Abdeckung aller drei Datensätze. Ein Vergleich zwischen den daraus berechneten Verteilungen der mittleren EDH beider Spurengase mit den HALOE-Daten soll helfen, die Varianz welche durch das Modell simuliert wird, mit der gemessenen zu vergleichen. Für das O3 wird eine gute Übereinstimmung zwischen der modellierten und gemessenen Varianz gefunden. Diese guten Übereinstimmungen ergeben sich für CH4 nicht. Aufgrund der unterschiedlichen chemischen Eigenschaften der beiden Tracer wird aus den Ergebnissen geschlossen, dass das Modell die chemischen Prozesse besser simuliert als den atmosphärischen Transport. Mit Hilfe von drei Fallstudien werden weitere Möglichkeiten aufgezeigt. die mit dem Konzept und den Datensätze von HALOE und KASIMA noch bestehen. In der ersten Fallstudie werden anhand der Verteilungen der EDH von CH4 aus dem März 1996 und 1997 die Auswirkungen vorm zwei unterschiedlichen meteorologischen Situation diskutiert, wobei ein eindeutiger Zusammenhang festgestellt wird. In einer zweiten Fallstudie wird der Frage nachgegangen, ob die Normierung auf den vertikalen Gradienten bei der Berechnung der EDH sinnvoll ist, da horizontale Transportprozesse in der Stratosphäre dominieren. Es wird daher zum Vergleich die „Equivalent Displacement Length (EDL)“ von CH4 berechnet, bei der eine Normierung der Varianz auf den horizontalen Gradienten erfolgt. In der dritten Fallstudie wird die Verteilung der mittleren EDH von N20, welche ebenfalls mit dem Datensatz von KASIMA berechnet worden ist, mit der von CH4 verglichen.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden auf dem Gebiet reaktiver Silicium-Spezies folgende apparative und experimentelle Forschungsergebnisse erzielt: Zunächst wurde eine Hochtemperatur-Pyrolyse Anlage entworfen, die mit Hilfe von Hochvakuum-Bedingungen (p< 5x10 hoch -9 mbar) Verdünnungseffekte simuliert, um die in der Gasphase erzeugten Moleküle unter solchen Bedingungen zu studieren, bei denen sie keine Folgereaktionen mit weiteren Partnern eingehen können. In die Apparatur integriert wurde ein Ofen (Tmax ungefähr gleich 1200°C) für die Pyrolyse von Stoffgemischen sowie zur Analyse des erzeugten Molekularstrahls ein Quadrupol-Massenspektrometer (0-300 amu, EI-Quelle, SEV). Es wurden Precursoren synthetisiert, die durch Thermolyse infolge intramolekularer Umlagerungen und Abspaltungen definierter Abgangsgruppen Si=X-Doppelbindungen (X= O, S) ausbilden. Diese Precursoren und ihre Pyrolyseprodukte wurden sowohl in der neuen Anlage als auch mittels eines vorhandenen PE-Spektrometers charakterisiert. Parallel zu den Synthesen wurden quantenmechanische Berechnungen an den Produkten der Pyrolysereaktionen durchgeführt, um ihre Eigenschaften, wie z.B. die Orbitalenergien und ihre Strukturparameter, zu bestimmen. Die Ergebnisse sollten die Interpretation der spektroskopischen Untersuchungen (PE und MS) unterstützen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Fragestellungen bearbeitet, die in anderen Teilprojekten der Arbeitsgruppe von essentiellem Interesse sind. Dabei wurden Lösungen zu Fragestellungen der direkten Si-C-Knüpfung und von Silylen-Reaktionen erarbeitet. Eine Versuchsreihe, die durchgeführt wurde, beschäftigte sich mit den Hochtemperaturreaktionen von SiCl4 und SiF4. Die flüchtigen Ausgangssubstanzen wurden im Pyrolyseofen bei ansteigenden Temperaturen mit pulverförmigem elementarem Silicium oder SiO umgesetzt. Hierbei wurden die Bildungsbedingungen von Dihalogensilylenen in der Gasphase optimiert. In einer weiteren Fragestellung wurden die Thermolyseeigenschaften von Si und SiO untersucht. Beide Feststoffe können ab einer Temperatur von ca. 1000°C und einem Druck von 2x10 hoch -6 mbar atomar bzw. molekular in die Gasphase überführt werden. Dort reagieren sie mit Halogensilanen unter Bildung von Silylenen und Chlorsilanen. Weiterhin wurde eine Disproportionierung von SiO zu Silicium und SiO2 unter hohen Temperaturen beobachtet; konsequenterweise wird dabei Sauerstoff freigesetzt. Weiterhin wurde versucht, die Produkte der Halogensilan-Pyrolyse mit Oxidationsmitteln wie Ethylenoxid zur Reaktion zu bringen. Zuletzt wurden Hydrolyse-Versuche mit SiCl4/SiF4 bzw. :SiCl2/:SiF2 und Wasser untersucht.
Die Ergebnisse der vorgelegten Arbeit zeigen die reproduzierbare Induktion assoziativer L TP- und L TD-ähnlicher Plastizität im Motorkortex des Menschen, mit Hilfe eines IPAS-Reizprotokolls (Interventional Paired Associative Stimulation) aus 200 gepaarten Stimuli a 0,25 Hz. Die gepaarten Stimuli bestehen aus einem elektrischen afferenten Reiz des Nervus medianus und einem transkraniellen magnetischen Stimulus über dem Motorkortexareal des Musculus abductor pollicis brevis. Dabei bestätigt sich die Bedeutsamkeit assoziativer (zeitlich gekoppelter) synaptischer Ereignisse zur plastischen Modifikation neuronaler Verbindungen durch den Nachweis signifikanter fazilitatorischer Effekte in Form von vergrößerten elektromyographisch ableitbaren motorisch evozierten Potentialen (MEP) nach Intervention mit zeitgleich an Neuronen im Motorkortex auftretenden afferenten und efferenten Stimuli (Interstimulusintervall= 0 ms). Außerdem konnte mit einem analogen Reizprotokoll, die bisher nur aus tierexperimentellen Simulationsdaten bekannte assoziative LTD-ähnliche Plastizität signifikant reproduziert werden. Hierbei geht der TMS-Stimulus dem afferenten Stimulus um 5 ms voraus (Interstimulusintervall = -5 ms), was zu einer signifikanten Verkleinerung der MEP-Amplituden nach der Intervention führt. Beide Befunde untermauern das bereits bekannte Konzept der STDP (Spike Timing-Dependent Plasticity). Als wichtige Evidenz für die Beteiligung LTP- und LTD-ähnlicher Plastizität beim Erlernen neuer motorischer Fertigkeiten gilt die lediglich aus tierexperimentellen Arbeiten bekannte signifikante Abnahme der Induzierbarkeit LTP-ähnlicher Plastizität gepaart mit der signifikanten Zunahme der Induzierbarkeit LTD-ähnlicher Plastizität nach wiederholtem Training einfacher fein motorischer Bewegungsmuster, als Ausdruck eines konstant gebliebenen "synaptic modification range". Dies konnte hier durch analoge Versuche mit Training von repetitiven ballistischen Daumenabduktionen erstmals auch am Menschen nachgewiesen werden. Neue Erkenntnisse über die plastische Modellierbarkeit des adulten menschlichen Gehirns bereiten den Weg für neue Therapie- und Rehabilitationsverfahren für Schlaganfall- und andere.neurologische Patienten.
Im Rahmen der Arbeit wurde eine Methodik zur umfassenden und automatischen Identifizierung von nativen Peptiden aus Extrakten komplexer biologischer Quellen entwickelt und am Beispiel des humanen Hämofiltrats angewendet. Die Firma BioVisioN führt seit der Gründung Forschung auf dem Gebiet der Peptide und kleinen Proteine mit dem Ziel, diagnostisch und therapeutisch relevante Substanzen zu finden, durch. Die Analyse sogenannter Peptidome, der qualitativen und quantitativen Beschreibung aller nativen Peptide und kleinen Proteinen bis ca. 15 kDa, ist als Analogon zur Proteom-Analytik zu verstehen, welche sich umfassend mit Proteinen beschäftigt. Quantitativ wird ein Peptidom über die Kombination chromatographischer Trennung und Fraktionierung mit der massenspektrometrischen „Inventarisierung“ der einzelnen Peptidspezies sowie den relativen Konzentrationen in der Probe erfasst, welches an anderer Stelle ausführlich beschrieben ist. Das Ergebnis einer solchen Peptidomanalyse besteht aus einer Peptidkarte, die die Peptide der Probe repräsentativ abbildet. Die Qualität eines Peptidoms wird über die Massen der Peptide, deren Aminosäuresequenzen und Elutionsverhalten und weitere biologische Informationen beschrieben. Zu diesen Zweck wird der Begriff des Peptide-Inventory eingeführt. Ein Inventory besteht aus allen verfügbaren Informationen nativer Peptide einer Quelle. Zu Beginn der Arbeit standen mit der reproduzierbaren Erstellung von Peptidbanken und deren systematischer Kartierung über MALDI-MS bereits zwei Werkzeuge zur Verfügung, um Daten eines Inventories zu erheben. Lediglich für die Erzeugung der Sequenzdaten wurde mit dem Edman-Abbau zwar eine etablierte, aber viel zu langsame und wenig sensitive Methode eingesetzt. Hier wurde der Ersatz durch eine schnelle und leicht zu automatisierenden Methode angestrebt. Die massenspektrometrische Sequenzierung über MS/MS mit anschließender Datenbanksuche ist ein aus der Proteom-Analytik durchaus bekanntes Verfahren, musste aber für die Analyse der nativen Peptide in einigen Bereichen modifiziert werden. Obwohl die Massenspektrometrie Peptide direkt aus komplexen Mischungen heraus identifizieren kann, stellte sich schnell heraus, dass die vorliegende biologische Beispielprobe (humanes Blutfiltrat) zu komplex war, um sie direkt für die geplante Sequenzierung einzusetzen. Es wurde eine erneute Auftrennung und Feinkartierung der Peptidbank notwendig. Jede dritte Fraktion wurde rechromatographiert und anschließend wiederum kartiert. Die entstandenen 97 Peptidkarten enthalten im Linear Modus ca. 100.000 Signale und im Reflektron Modus ca. 30.000 Signale, so dass nach der Feinkartierung > 10.000 native, im menschlichen Körper zirkulierende Peptide durch diese Methode dargestellt werden können. Zur Automatisierung der Kartierungsmessungen mit MALDI-MS wurde im Laufe dieser Arbeit ein Autosampler für ein MALDI-TOF-MS-System entwickelt und implementiert (DiskJockey). Das System hat eine Kapazität von 20 MALDI-Targets und ist vollständig über die Gerätesoftware steuerbar, so dass MALDI-MS-Messungen vollständig automatisiert über mehrere Tage ablaufen können. Zur Erzeugung der Sequenzdaten wurde eine Kombination aus elektrischer Ionenfalle und Datenbanksuche angewendet. Um zu gewährleisten, dass nur die zuvor kartierten Peptide einer MS/MS-Messung unterzogen werden, wurde das Softwaretool Alcatrap entwickelt. Diese Software übernimmt aus MALDI-MS-Messungen die Werte der monoisotopischen Peaks, überführt sie in mehrfach geladene Spezies und erstellt sowohl eine Methode für das MS-Gerät, als auch eine in die Gerätesoftware importierbare Arbeitsliste. Hierbei wird jeweils die Kollisionsenergie in Abhängigkeit der m/z-Wertes dynamisch gesetzt. Um den Datentransfer vom Fragmentspektrum zur Datenbanksuchmaschine zu gewährleisten, wurde mit „D2M“ eine weitere Softwareschnittstelle entwickelt. Die Erstellung des Inventories aus humanem Hämofiltrat liefert 1.225 verschiedene native, im menschlichen Blut zirkulierende Peptide aus 146 Proteinvorläufern. Darunter befinden sich mehrere Peptide, die neben ihrer physiologischen Bedeutung auch eine potenzielle medizinische Relevanz besitzen. Weiterhin ist auch der dynamische Bereich von acht Größenordnungen, in dem Sequenzen erzeugt wurden, vergleichbar mit dem des menschlichen Blutes. Eine Charakterisierung von Peptidomen ist in diesem Umfang bisher noch nicht durchgeführt worden und stellt eine Neuerung in der Proteomforschung dar. Die Studie ist durchaus vergleichbar mit kürzlich veröffentlichten umfangreichen Proteomstudien aus menschlichem Plasma und Serum und stellt eine Ergänzung dieser für den Bereich der Peptide und kleinen Proteine dar. Limitierungen bei der Identifizierung von Peptiden mit der Ionenfalle wurden analysiert und mit der Adaptierung des Peptide-Inventory Konzepts auf hochauflösende Quadrupol-Time-of-Flight Massenspektrometer zufriedenstellend gelöst. In diesem Rahmen wurde eine Methode entwickelt, die es ermöglicht, native Peptide bis zu einem Molekulargewicht von bis zu 8.500 Da direkt aus der komplexen Mischung zu fragmentieren und über eine Datenbanksuche zu identifizieren. Außerdem konnte exemplarisch gezeigt werden, dass durch die größere Massengenauigkeit und das größere Auflösungsvermögen des QTOF die Datenbanksuche wesentlich effektiver ist und durch die Kombination von Rechromatographie und QTOF-MS/MS nahezu jedes Signal einer Peptidbank der Identifizierung zugänlich gemacht werden kann. Sowohl die integrierte Methodik der Herstellung eines Peptide-Inventories, als auch die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse von nativen Peptiden in humanem Blut stellen wissenschaftliche Neuerungen dar, auf denen eine weitergehende Peptidom-Analytik aufsetzen kann.
In der vorliegenden Arbeit wird untersucht, wie durch die Tätigkeit des Sprechens Bindung erzeugt wird. Die Kernthese lautet, dass es eine grundlegende Bindung gibt, die aus dem Umstand resultiert, dass vokale Symbole nur durch eine gemeinsame Tätigkeit von Sprecher und Hörer erzeugt werden können. Nur wenn der Hörer Laute als vokale Symbole identifiziert, ist die Äußerung des Sprechers eine sprachliche Äußerung, mit der eine Feststellung gemacht, eine Frage gestellt oder ein Befehl gegeben werden kann. Mit der Terminologie der Sprechakttheorie läßt sich daher sagen, dass auf der Ebene des lokutionären Aktes bereits eine Bindung bestehen muß, damit ein illokutionärer oder perlokutionärer Akt möglich ist. In der vorliegenden Untersuchung wird diese Bindung herausgearbeitet, indem verschiedene, teilweise sehr unterschiedliche Kommunikationsmodelle untersucht werden, die das Problem der kommunikativen Bindung thematisieren. Nach einer einführenden Besprechung von Paul Watzlawicks Annahmen zum Beziehungsaspekt von Kommunikation wird auf einige Aspekte des Zeichenmodells von Charles Sanders Peirce eingegangen. Mit Peirce werden Strukturmerkmale von vokalen Zeichen erarbeitet, die für die weiteren Untersuchungsschritte der Arbeit wegweisend sind. Im nächsten Kapitel wird auf die Konzeption des Symbolischen Interaktionismus von Georg Herbert Mead eingegangen, um ein Modell zu entwickeln, wie aus einfachen Interaktionen vokale Symbole generiert werden. Anschließend wird die Sprechakttheorie von John Langshaw Austin und John Searle behandelt. Dabei steht zunächst die Frage nach der Struktur der "illocutionary force" im Mittelpunkt. Daran schließt sich eine Analyse der These Searles an, dass ein "symbolizing move" als Kern eines Sprechaktes anzunehmen ist. Die Ergebnisse dieser Analyse werden mit den Ergebnissen der Untersuchung des Symbolischen Interaktionismus in ein Modell zusammengeführt, mit dem eine Sprecher und Hörer verbindende "locutionary force" identifiziert werden kann. Diese tritt bei der Konstitution von vokalen Zeichen durch die gemeinsame Aktivität eines Sprechers und eines Hörers auf und ist als eine Voraussetzung der "illocutionary force" anzusehen. Dieses Modell wiederum wird mit der Theorie des kommunikativen Handels von Jürgen Habermas verbunden, um die fragliche Bindungskraft in der lebensweltlichen kommunikativen Alltagspraxis von Sprechern und Hörern zu lokalisieren. Es wird eine Abgrenzung gegenüber der von Habermas angesprochenen Bindungskraft vorgenommen, einer Bindungskraft, die auf der semantischen und nicht auf der semiotischen Ebene von Sprechakten angesiedelt ist. Es zeigt sich zudem, dass die in der vorliegenden Arbeit aufgezeigte Bindung die der Kommunikation eigentümliche Bindung ist, - zumindest dann, wenn man Kommunikation als Akte des Sprechens auffaßt. Abschließend wird anhand einer alltäglichen Gesprächssituation das Auftreten und die Wirkungsweise dieser Bindungskraft beispielhaft erläutert.
Das Spektrum der Einfachionisation von Helium unterhalb der Doppelionisationsschwelle bei 79 eV ist reich an komplexen Strukturen. Eine Vielzahl von Resonanzen tritt dort auf. Diese Resonanzen sind unmittelbar verbunden mit doppelt angeregten Zuständen von Helium. Unterhalb einer Photonenenergie von ca. 77 eV liegen diese Resonanzen geordnet vor, und sie können dort mit Hilfe weniger Quantenzahlen klassifiziert werden. Das trifft aber nicht auf den Bereich dicht unterhalb der Doppelionisationsschwelle zu, d.h. zwischen ca. 78,2 eV und 79 eV. Hier verlieren die bis dahin verwendeten Quantenzahlen ihre Gültigkeit. Dieses Gebiet ist sowohl theoretisch als auch experimentell nahezu unerforscht. Traditionelle experimentelle Methoden stoßen hier auf Hindernisse, die auch in den kommenden Jahren höchstwahrscheinlich nicht überwunden werden können. Das größte Problem hierbei sind die sehr geringen Reaktionsraten. Aus diesem Grund wurde im Rahmen dieser Arbeit ein neuer Weg gewählt, der diese Probleme weitgehend hinter sich läßt und Untersuchungen in dieser äußerst schwer zugänglichen Region ermöglicht. Die neue Technik weist gegenüber bisherigen Methoden eine um mehrere Größenordnungen gesteigerte Nachweiseffizienz auf, wodurch Messungen in diesem Energiebereich innerhalb eines vernünftigen Zeitrahmens praktisch erst ermöglicht werden. Erreicht wird dies durch ein Spektrometer, das zu allen Raumrichtungen hin sensitiv ist und die Impulse und Flugrichtungen der emittierten Elektronen individuell für jede einzelne Reaktion nachweisen kann. Die Elektronen werden zusammen mit dem jeweiligen He+-Ion in Koinzidenz nachgewiesen, wodurch eine sehr effiziente Unterdrückung von Untergrundereignissen realisiert wird. Die vorgestellte Meßmethode basiert auf der sogenannten Coltrims-Technik, die seit einigen Jahren im Bereich der Atom- und Molekülphysik äußerst erfolgreich eingesetzt wird. Ihre Anwendung auf niederenergetische Elektronen mit kinetischen Energien im Bereich zwischen 0 eV und 0,5 eV war bisher jedoch nur sehr eingeschränkt möglich und mit großen Unsicherheiten verbunden, da in diesem Fall die Einflüsse verschiedener Störquellen wie beispielsweise das Erdmagnetfeld berücksichtigt werden müssen. Diese Probleme konnten gelöst werden, so daß nun auch winkelaufgelöste Messungen an Elektronen mit weniger als 100 meV kinetischer Energie möglich sind. Die Apparatur wurde im Rahmen einer Messung am Berliner Synchrotron BESSY II erfolgreich eingesetzt. Untersucht wurden die partiellen Wirkungsquerschnitte sN(E) der verschiedenen Ausgangskanäle der Reaktion g(E) + He -> He** -> e- + He+(N), wobei E die Photonenenergie und N die Hauptquantenzahl des erzeugten Heliumions ist. Zusätzlich wurde zu jedem dieser Reaktionskanäle die Winkelverteilung bN(E) der emittierten Elektronen bestimmt. Ziel der Messung war es, zunächst einen Bereich des Energiespektrums abzudecken, für den theoretische Vorhersagen existieren. Im weiteren Verlauf der Messung wurde dieser Bereich ausgedehnt bis hin zur Doppelionisationsschwelle. Die Ergebnisse werden verschiedenen theoretischen Vorhersagen gegenübergestellt und diskutiert. Die aufgenommenen Daten umfassen auch Bereiche des Energiespektrums, für die noch keine theoretischen Ergebnisse vorliegen (78,3 eV<E<78,9 eV). Die hier beobachteten Verhaltensweisen insbesondere der Winkelverteilungen der emittierten Elektronen werden mit veröffentlichten Daten verglichen, die bei einer Photonenenergie von E=80,1 eV aufgenommen wurden, d.h. dicht oberhalb der Doppelionisationsschwelle. Die beobachteten Parallelen können innerhalb eines klassischen Modells interpretiert werden.
Das Projekt zum Thema - literarisch-essayistische Reisen zu Beginn der 70er Jahre bei Rolf Dieter Brinkmann, Rom, Blicke und Bernward Vesper, Die Reise stellt ein Experiment dar. Es geht um die wissenschaftliche Bestandsaufnahme des Phänomens 1968 und um das Motiv "Resignation". Die Annäherung erfolgt im Teil A auf wissenschaftlicher Basis, die sich im Teil B in eine literarische Herangehensweise wandelt.
Im Herzen kommen ATP-sensitive Kalium-Kanäle (KATP-Kanäle) in drei verschiedenen Strukturen vor: in der sarkolemmalen Zellmembran der Myozyten, in den glatten Muskelzellen der Koronargefäße und in der inneren Mitochondrienmembran von Herzmuskelzellen. Charakterisierung von Inhibitoren des sarkolemmalen KATP-Kanals: Die Aktivierung von sarkolemmalen KATP-Kanälen unter Ischämie führt durch die Erhöhung der K+-Permeabilität zu einer Verkürzung der Aktionspotentialdauer und somit zu einer Heterogenität der Aktionspotentialdauer zwischen normoxischen und ischämischen Gebieten, wodurch kreisende elektrische Erregungen und somit Kammerflimmern entstehen können. Daher stellen Inhibitoren des sarkolemmalen KATP-Kanals ein neues therapeutisches Prinzip gegen den plötzlichen Herztod dar. Diese Inhibitoren sollen möglichst selektiv sein und weder den pankreatischen KATP-Kanal beeinflussen noch die oben beschriebenen KATP-Kanäle in glatten Gefäßmuskelzellen und in Mitochondrien. In dieser Arbeit wurde das Modell des isolierten, perfundierten Herzens nach Langendorff so optimiert, dass Inhibitoren des sarkolemmalen KATP-Kanals unter ischämischen Bedingungen untersucht werden konnten. Hierzu wurden durch eine Verminderung des Koronarflusses und des Sauerstoffs ischämische Bedingungen geschaffen, die zur Verkürzung der Dauer des monophasischen Aktionspotentials (MAPD) führten. In Gegenwart von Inhibitoren des sarkolemmalen KATP-Kanals war diese MAPD-Verkürzung reduziert. Außerdem wurde der Koronarfluss in separaten Experimenten durch Hypoxie erhöht (Vasodilatation). Es wurde untersucht, ob die Inhibitoren des sarkolemmalen KATP-Kanals als Nebenwirkung den Koronarfluss beeinträchtigen. Ausgehend vom bereits therapeutisch eingesetzten Antidiabetikum Glibenclamid wurden verschiedene Strukturvarianten untersucht, um eine Selektivität für sarkolemmale KATP-Kanäle des Myokards zu finden. Die wichtigsten Struktur-Wirkungs-Beziehungen sind folgende: · Der Sulfonylharnstoff Glibenclamid sowie die Benzoesäurederivate Meglitinid und Repaglinid sind unselektive Hemmstoffe der sarkolemmalen und vaskulären KATP-Kanäle. · Eine Schwefelsubstitution im Sulfonylharnstoff zum Sulfonylthioharnstoff (S 94 1638 und HMR 1098) bewirkt eine Verstärkung der Aktivität auf den sarkolemmalen KATP-Kanal sowie eine Verringerung der Effektivität auf den Koronarfluss. · Die meta- statt para-Positionierung der Sulfonylthioharnstoffgruppe führt ohne Beeinflussung des Gefäßtonus zu einer weiteren Verbesserung des Wirkprofils mit einer guten Wirksamkeit auf die ischämische Aktionspotentialverkürzung (HMR 1402 und HMR 1098). · Substitution der Benzamidfunktion von HMR 1402 durch eine Zimtsäuregruppe (S 0000 405) bewirkt eine zur Verringerung der Selektivität. Dies zeigt, dass neben der Sulfonylthioharnstoffgruppe auch die Benzamidfunktion die selektive Wirkung auf sarkolemmale KATP-Kanäle im Herzen beeinflusst. Untersuchung von Aktivatoren des mitochondrialen KATP-Kanals: Öffner des mitochondrialen KATP-Kanals können den endogenen Schutzmechanismus der ischämischen Präkonditionierung nachahmen. Um den neuen mitochondrialen KATP-Öffner S1526 zu untersuchen, wurde an isolierten, perfundierten Rattenherzen eine Globalischämie mit Reperfusion durchgeführt und die Infarktgröße bestimmt. Es konnte nachgewiesen werden, dass Vorbehandlung mit S1526 zu einer signifikanten Reduktion der Infarktgröße führt. Diese Protektion wurde durch den mitochondrialen KATP-Kanalblocker Natrium-5-hydroxydecanoat, nicht aber durch den selektiven sarkolemmalen KATP-Kanal-Blocker HMR 1098 aufgehoben. S1526 hat gegenüber Diazoxid, einem bekannten Öffner des mitochondrialen KATP-Kanals, den Vorteil einer nur geringfügigen Beeinflussung vaskulärer KATP-Kanäle. Daher könnte S1526 als Ausgangspunkt für eine Entwicklung von Arzneistoffen, die eine Verringerung von Ischämieschäden im Herzen bewirken, betrachtet werden.
NMDA-Rezeptoren sind als ionotrope Glutamatrezeptoren (iGluRs) an der Signalübertragung durch den wichtigen Neurotransmitter L-Glutamat beteiligt. Vor allem aufgrund ihrer Bedeutung für das Phänomen der neuronalen Plastizität sind NMDA-Rezeptoren außerordentlich gründlich untersucht worden. Dennoch sind auch heute noch zentrale Fragen zu ihrer Funktionsweise ungeklärt, darunter auch diejenige, wie auf molekularer Ebene die Umsetzung der Glutamatbindung in die Öffnung des Ionenkanals erfolgt. Publizierte Kristallstrukturen der Liganden-bindungsdomänen zweier iGluRs haben die Grundlage für ein Modell der ligandeninduzierten und der Kanalöffnung vorausgehenden Vorgänge in der Bindungsdomäne geschaffen. Diesem zufolge schließt sich die aus zwei Teildomänen bestehende Bindungsdomäne venusfliegenfallenartig um den Liganden und die dabei entstehende mechanische Spannung führt zur Öffnung des Ionenkanals. Dieses Modell wurde in der vorliegenden Arbeit überprüft. Hierzu wurden verschiedene in der Ligandenbindungsdomäne punktmutierte NR1/NR2A-Rezeptoren heterolog in Säugerzellen exprimiert und durch Glutamat hervorgerufene Gesamtzellströme elektrophysiologisch gemessen. Mittels kinetischer Auswertung wurden dann Aminosäurereste in der Bindungsdomäne identifiziert, die einen Beitrag zur Kanalöffnung leisten. Die notwendige Schnelligkeit der Ligandenzugabe wurde dabei durch dessen photochemische Freisetzung aus einer maskierten und dadurch inaktiven Vorstufe (caged compound) erreicht. Die Ergebnisse bestätigen das Modell der Kopplung der Kanalöffnung an das Schließen der Bindungsdomäne und erweitern das Verständnis der genauen zeitlichen Abfolge der ligandeninduzierten Konformationsänderungen in der Bindungsdomäne. Intramolekulare Wechselwirkungen zwischen den Teildomänen S1 und S2 spielen demnach erst relativ spät im Aktivierungsprozeß eine Rolle und dienen vor allem der Stabilisierung des geschlossenen Zustandes der Bindungsdomäne und damit des offenen Ionenkanals.
Das humane Zytomegalievirus (HCMV) gehört zur Familie der beta-Herpesviridae. Bis zu 80% menschlichen Bevölkerung sind weltweit mit dem Virus infiziert. Nach einer meist asymptotischen Erstinfektion persistiert HCMV lebenslang in seinem Wirtsorganismus. Im Laufe der Evolution wurden von einigen Herpesviren verschiedene Strategien entwickelt, um der Antigenprozessierung und damit der zellulären Immunantwort zu entgehen. Das HCMV-Protein US6 blockiert die Antigenpräsentation via MHC I. US6 ist ein ER-ständiges Typ I Transmembranglykoprotein bestehend aus einer Signalsequenz, einer ER-luminalen Domäne, einer Transmembranhelix und einem kurzen zytoplasmatischen C-Terminus. US6 inhibiert den TAP-abhängigen Peptidtransport aus dem Zytoplasma in das ER-Lumen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die ER-luminale Domäne von US6 bestehend aus der Primärsequenz 20-146 heterolog in E. coli exprimiert und aus inclusion bodies rückgefaltet. Das rückgefaltete Protein erwies sich als Monomer (15,6 kDa). Die in der ER-luminalen Domäne befindlichen acht Cysteine bilden ein intramolekulares Netzwerk aus vier Disulfidbrücken. Zur Aufklärung des molekularen Inhibitionsmechanismus von US6(20-146) wurden verschiedene in vitro TAP-Funktions-Assays angewendet. Die Bindung von US6 an die ER-luminalen Bereiche von TAP blockiert die ATP-Bindung in den zytoplasmatischen NBD des Transporters. Die Peptid- und ADP-Bindung von TAP ist nicht beeinflusst, durch die Inhibition der ATP-Bindung wird jedoch die Peptid-induzierte ATP-Hydrolyse unterbunden. Für die Inhibitionsreaktion konnte ein halbmaximaler Inhibitionskoeffizient (IC50) von 1 µM ermittelt werden. Für die inhibitorische Aktivität von US6 sind die C-terminalen Aminosäuren 126-139 der ER-luminalen Domäne von US6 verantwortlich. Die innerhalb dieser Region befindlichen Aminosäuren Cys127, Cys129, D130, W134 und R138 wurden gegen Serin bzw. Alanin ersetzt. Dies hatte keine Auswirkung auf die Aktivität von US6(20-146). Auch ist der N-Terminus von US6 nicht essentiell für die Aktivität.
Die Tätigkeit des Forschens, denke ich, hat immer etwas mit Neugier auf die Welt zu tun; eine Welt, in der wir leben, und eine, in der wir leben könnten. Sie ist verknüpft mit dem Wunsch, Unbekanntes zu erfahren, erkennbar und vielleicht auch nutzbar zu machen. Wenn wir forschen, greifen wir nach Möglichkeiten und nach Zukünftigem, was wir gleichzeitig durch unsere Vorstellungen antizipieren und mit wissenschaftlichen Begriffen umrahmen. Die kulturanthropologische Forschung untersucht Fremdes gewöhnlich in einer anderen Gemeinschaft. Diese Gemeinschaft wird dann zumeist aufgesucht, um zu erfahren, welche Möglichkeiten und welche Probleme für Kulturanthropologen in solchen Kulturkontakten in Erscheinung treten. Die vorliegende Arbeit nun ist eine Forschung über die Forschung. Die Neugier, die mich dazu bewegt hat, sie zu schreiben, bestand in der Frage, wie Möglichkeiten menschlicher Kreativität von Leuten, die dafür Technologien entwickeln, fruchtbar gemacht werden. Die Technologiegestalter suchen eben diese Neugier zu befriedigen, indem sie menschliches Verhalten in künstlich hergestellten Kontexten erproben und Modelle entwerfen, die in die gesellschaftliche Welt einwandern und ausstrahlen sollen. ...
Die bei der Photosynthese verwendete Lichtenergie wird zu einem großen Anteil von Lichtsammlersystemen bereitgestellt. In der pflanzlichen Photosynthese wird unterschieden zwischen Lichtsammlersytem I (light harvesting complex I, LHC-I), assoziiert mit Photosystem I (PS-I) und Lichtsammlersystem II (light harvesting complex II, LHC-II), assoziiert mit Photosystem II (PS-II). LHC-II ist der häufigste Protein-Pigment Komplex der Chloroplasten und bindet bis zu 50% aller Chlorophylle in der Thylakoidmembran. Der Protein-Pigment Komplex LHC-II hat vier, teils miteinander verwandte Funktionen in der Photosynthese. I) Die Sammlung und Weiterleitung von Lichtenergie, II) Stabilisierung der Granastapel, III) Ausgleich der Anregungsenergie von PS-I und PS-II, IV) Schutz der Photosynthese vor Überanregung mittels nichtphotochemischer Eliminierung von Anregungsenergie (NPQ). In der Pflanze bildet LHC-II Trimere in verschiedenen Kombinationen dreier Isoformen (Lhcb1, Lhcb2 und Lhcb3), wobei Lhcb1 mit 70-90% den Hauptteil des LHC-II stellt. Jedes Monomer bindet 8 verschiedene Co-Faktoren in unterschiedlichen Mengen, die ca. 30% seiner Masse ausmachen. Die drei Isoformen des LHC-II sind in allen Pflanzen stark konserviert. Die funktionelle Bedeutung der Isoformen ist jedoch weitestgehend unklar. Dies liegt vor allem an der schwierigen Isolierung reiner Isoformen aus Pflanzenmaterial. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden deshalb alle drei Isoformen rekombinant hergestellt und mit getrennt isolierten Lipiden und photosynthetischen Pigmenten in ihre native Form gefaltet. Die anschließende biochemische und spektroskopische Charakterisierung zeigte einen hohen Grad an Homologie zwischen den drei Isoformen, wobei Lhcb3 die größten Unterschiede aufwies (Standfuss und Kühlbrandt 2004). Die wahrscheinlichsten Funktionen für Lhcb1 und Lhcb2 ist die Anpassung der Photosynthese an variierende Lichtbedingungen. LHC-II Heterotrimere mit Lhcb3 Anteil könnten an der Weiterleitung von Lichtenergie von der Haupt Lhcb1/Lhcb2 Antenne zum PS-II Reaktionszentrum beteiligt sein. Für die Erforschung des LHC-II war das mittels Cryo-Elektronenmikroskopie an 2D Kristallen erstellte atomare Modell des Komplexes von enormer Bedeutung. Ein tiefes Verständnis der Funktionen des LHC-II benötigt jedoch eine Struktur von höherer Auflösung, welche mit 2D Kristallen nur schwer zu erreichen ist. Im Verlauf der Arbeit wurden deshalb mehr als 100000 3D Kristallisationsexperimente durchgeführt, wodurch die Kristallisation von aus Erbsenblättern isoliertem und in vitro gefaltetem LHC-II gelang. Die 3D Kristalle aus nativem Material zeigten einen für die röntgenkristallographische Strukturaufklärung ausreichenden Ordnungsgrad und führten zu einer Struktur des LHC-II bei 2.5 Å Auflösung (Standfuss et al., eingereicht). Die Struktur zeigt 223 der 232 Aminosäuren und die Position und Orientierung von 4 Carotinoiden (2 Luteine, 1 Neoxanthin und 1 Violaxanthin), 14 Chlorophyllen (8 Chl a und 6 Chl b) und zwei Lipiden (PG und DGDG) pro Monomer. Diese Informationen sind essentiell für das Verständnis des Energietransfers innerhalb des LHC-II und zu den Photoreaktionszentren und sollten zusammen mit der großen Anzahl von spektroskopischen Untersuchungen eine zukünftige detaillierte Modellierung dieser ultraschnellen und extrem effizienten Energietransfer Prozesse ermöglichen. Auf Basis der Ladungsverteilung der stromalen Seite des Komplexes konnte ein Modell für die Beteiligung des LHC-II an der Stapelung von Grana in Chloroplasten erstellt werden. Dieses liefert außerdem eine plausible Erklärung für den mittels Phosphorylierung des N-Terminus gesteuerten Ausgleich von Anregungsenergie zwischen PS-I und PS-II. Die 2.5 Å Struktur des LHC-II zeigt schließlich einen einfachen aber effektiven Mechanismus zur Optimierung und Schutz des Photosyntheseapparates mittels NPQ. Dieser benötigt keine Strukturänderungen des LHC-II oder der restlichen Lichtsammelantenne und beruht auf der reversiblen Bindung der Xanthophylle Violaxanthin und Zeaxanthin an LHC-II. Diese Arbeit liefert damit Beiträge zu allen Funktionen des LHC-II Komplexes und hilft damit grundlegende Regulationsmechanismen und die Bereitstellung von solarer Energie für die pflanzliche Photosynthese zu verstehen.
Therapeutische Konzepte der Radioiodtherapie bei der Autoimmunhyperthyreose vom Typ Morbus Basedow
(2004)
In der vorliegenden Arbeit wurden retrospektiv Ergebnisse einer Radioiodtherapie bei 126 konsekutiven Patienten (19 Männer; 107 Frauen, Alter 50,9±14,6, Median 51,5 Jahre) analysiert, die im Zeitraum von 1992 bis 2001 wegen einer Autoimmuthyreopathie vom Typ M. Basedow in der Klinik für Nuklearmedizin der Gutenberg Universität Mainz behandelt wurden. Ziel der Arbeit war es, die Effektivität unterschiedlicher Therapieansätze zu vergleichen sowie Faktoren, welche einen Einfluss auf die Therapieergebnisse haben könnten, zu ermitteln, wobei Anamnese, Schilddrüsenvolumen, Stoffwechsellage und Thyreostase zum Zeitpunkt der Therapie besondere Berücksichtigung fanden. Bei 47 Patienten erfolgte die Radioiodtherapie nach einem funktionsoptimierten Konzept mit dem Ziel (150 Gy), eine Euthyreose zu erreichen. 79 Patienten wurden nach ablativem Konzept mit dem Ziel einer posttherapeutischen Hypothyreose behandelt. Die Dosis in dieser Gruppe betrug bei 19 Patienten 200 Gy; bei 29 Patienten 250 Gy; bei 15 Patienten 275 Gy und bei 16 Patienten 300 Gy. In 21% aller Fälle erfolgte die Therapie bei Erstmanifestation, bei 15% nach dem 1. Rezidiv und bei 64 % nach dem 2. Rezidiv. Bezüglich der Thyreostase, der Stoffwechsellage und des prätherapeutischen Radioiod-Uptakes waren die Gruppen nicht signifikant unterschiedlich. Entsprechend den Therapiekonzepten wurde bei funktionsorientiertem Konzept im Median 372 MBq als Aktivität errechnet und 400 MBq appliziert (14,3 MBq/ml). Für Patienten mit ablativem Therapiekonzept wurden im Median 514 MBq errechnet und 600 MBq appliziert (28,6 MBq/ml). Erreicht wurden in der ersten Gruppe Organdosen zwischen 80 und 380 Gy (Median 180 Gy). Bei 7 Patienten (14%) wurde dabei der angestrebte Bereich nicht erreicht, bei 27 Patienten (57%) erreicht und bei 13 Patienten (29%) überschritten. Der Variationskoeffizient lag bei 52%. In der Gruppe mit ablativem Ziel erreichten die Organdosen 56-685 Gy (Median 275 Gy). Bei 67 der 79 Patienten (85%) lag die erreichte Dosis wie geplant oder höher, bei 12 Patienten (15%) wurde die angestrebte Dosis nicht erreicht. Nur bei 3 der 47 Patienten (6%) wurde eine Euthyreose erreicht. Eine Hyperthyreose lag dagegen bei 22 Patienten (47%) vor. 22 Patienten (47%) wiesen posttherapeutisch eine Hypothyreose auf. Dagegen waren in der Gruppe mit ablativer Therapie 61 Patienten (77%) wie erwünscht hypothyreot und 18 (23%) hatten eine Resthyperthyreose. Patienten, die nach der ablativen Radioiodtherapie eine erwünschte Hypothyreose erreichten, hatten eine kürzere eff. HWZ und einen höherer Radioiod-Uptake (4,7 Tage; 52%) als Therapieversager (5,4 Tage; 49%) sowie ein geringeres Schilddrüsenvolumen nach der Behandlung (7,2±4,7 vs. 21,5±13,3 ml). Zehn Patienten nach ablativer Therapie (n=10) hatten trotz erreichter Dosis >250 Gy eine Resthyperthyreose. Das Schilddrüsenvolumen lag bei diesen Patienten zwischen 14 und 70 ml (Mittelwert: 29,5 ml). Die posttherapeutische Volumenreduktion war bei funktionsorientierter Therapie geringer als bei ablativem Konzept (um 55% vs. 65%). Die TRAK und anti-TPO-AK-Titer waren in beiden Gruppen gegenüber dem Ausgangswert angestiegen. Dabei waren die posttherapeutischen Konzentrationen bei funktionsoptimiertem Konzept höher als nach ablativer Therapie. Die Radioiodtherapie wurde in beiden Gruppen gut toleriert. Beschwerden durch eine strahleninduzierte Thyreoiditis zeigten sich bei 13 Patienten (10%), die mit Eiskrawatte und nichtsteroidale Antiphlogistika behandelt wurden. Unter Cortisonprophylaxe (n=29) wurde nur bei einem Patienten eine Verschlechterung der vorbestehenden EO beobachtet. Das Schilddrüsenvolumen wurde als wesentlicher, den Therapieerfolg bestimmender Parameter bei ablativem Konzept in der multivariaten Analyse identifiziert. So hatten Patienten mit einem Schilddrüsenvolumen ab 25 ml ein 10-fach höheres Risiko für ein Versagen der Radioiodtherapie in Relation zu Patienten, die eine Schilddrüse <25 ml hatten. Die Radioiodtherapie mit ablativen Dosen erweist sich in einem Iodmangelgebiet gegenüber der funktionsorientierten Behandlung als eine effektivere Therapie. Dieses Konzept geht mit niedrigerem Risiko der Verschlechterung einer vorbestehenden EO (unter Cortisonprophylaxe) einher. Es stellt sich bei diesem Konzept heraus, dass die Thyreostase in niedriger Dosierung keinen bedeutenden Einfluss auf den Therapieerfolg hatte. Die Auswertung der Daten bestätigt, dass die aktuell verwendete individuelle Dosisplanung mittels Radioiodtest eine präzise Abschätzung der notwendigen Aktivität erlaubt. Ausgehend von Ergebnissen diese Studie erscheint bei ablativem Konzept eine volumenadaptierte Korrektur der Zieldosis sinnvoll: während bei Schilddrüsenvolumina zwischen 25-40 ml eine Dosis von 250 Gy (entsprechend aktuellen Empfehlungen der Leitlinie der DGN) optimal ist, sollten bei Volumina > 40 ml höhere Zieldosen gewählt werden. Bei Patienten mit Schilddrüsenvolumina < 20 ml ist eine Dosis von 200 Gy ausreichend.
Interleukin-18-Bindungsprotein (IL-18BP) ist ein erst kürzlich entdeckter Gegenspieler von Interleukin-18 (IL-18). Aufgrund der Eigenschaft von IL-18BP mit hoher Affinität an IL-18 zu binden, wird IL-18 neutralisiert und seine biologischen Wirkungen durch IL-18BP inhibiert. Das Zytokin IL-18 ist ein multifunktioneller Botenstoff des Immunsystems, dessen Aktivität bei der Entstehung von Entzündungen, der Abwehr von Infektionen und der Rückbildung von Tumoren beteiligt sein kann. Eine der bedeutendsten Wirkungen von IL-18 ist insbesondere seine Fähigkeit die Produktion und Freisetzung von Interferon-gamma durch T-Helfer Typ 1 (Th1) Zellen, Natürliche Killer (NK) Zellen und CD8+ zytotoxische Zellen auszulösen. Bislang war lediglich bekannt, dass es sich bei IL-18BP um ein konstitutiv exprimiertes und sezerniertes Protein handelt. Die Zielsetzung dieser Promotionsarbeit war es zu untersuchen, ob eine Regulation der Genexpression von IL-18BP in Nicht-Immunzellen stattfindet. Dazu wurde im ersten Schritt eine semiquantitative RT-PCR Methode etabliert, mit Hilfe derer eine schwache konstitutive Expression der IL-18BP mRNA in Zellkulturen von humanen renalen Mesangiumzellen, epithelialen DLD-1 Kolonkarzinomzellen und Fibroblasten nachgewiesen wurde. Im Folgenden konnte als wesentliches Ergebnis festgestellt werden, dass eine Induktion der Genexpression von IL-18BP durch Interferon-gamma erfolgt. Mit RNase Protection Assays wurden nach Interferon-gamma Exposition 20 – 30fache relative Steigerungen der IL-18BP mRNA detektiert. In humanen Mesangiumzellen führte außerdem bakterielles Lipopolysaccharid zum Anstieg der IL-18BP Genexpression. Im zweiten Teil der Untersuchungen ließ sich unter Verwendung eines eigens hergestellten polyklonalen Antiserums nachweisen, dass durch Interferon-gamma auch eine starke Vervielfachung der Freisetzung bzw. Sekretion von IL-18BP stattfindet. Weiterhin wurden Kokulturen von IL-12/IL18 aktivierten humanen mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut (PBMCs) mit entweder Mesangiumzellen oder DLD-1 Zellen durchgeführt. In diesen Kokulturen bewirkte die mittels ELISA gemessene Freisetzung von endogenem Interferon-gamma durch die PBMCs ebenfalls eine Induktion der Genexpression von IL-18BP in den Mesangiumzellen und DLD-1 Zellen. Darüber hinaus wurde in anderen Experimenten untersucht, ob die Regulation von IL-18BP gleichzeitig von Änderungen im Gehalt an IL-18 begleitet wird. Während in den humanen Mesangiumzellen kein IL-18 exprimiert wurde, konnte in den DLD-1 Zellen konstitutives proIL-18 detektiert werden. Jedoch hatte Interferon-gamma in DLD-1 Zellen keinen Einfluss auf die IL-18 Expression. Die hier zusammengetragenen Resultate belegen zum ersten Mal, dass es sich bei IL-18BP nicht nur um ein konstitutiv exprimiertes Protein, sondern vielmehr um einen spezifisch regulierten Immunmodulator handelt. Die Induktion der Freisetzung von IL-18BP durch Interferon-gamma stellt den entscheidenden Schritt eines bislang unbekannten negativen Rückkopplungsmechanismus zwischen Immunzellen und ortsständigen Nicht-Immunzellen dar: Nach der Freisetzung von IL-18 bei Entzündungen, Infektionen und Tumorerkrankungen führt das von Th1-, NK- und CD8+-Zellen produzierte Interferon-gamma zu einer Sekretion von IL-18BP durch Nicht-Immunzellen. Infolgedessen kommt es konsekutiv zur Limitierung der Aktivität von IL-18 mit Reduzierung seiner proinflammatorischen Wirkungen. Da ein Übermaß an IL-18 bei der Pathogenese von chronisch entzündlichen Erkrankungen wie beispielsweise der Rheumatoiden Arthritis und dem M. Chron eine Rolle zu spielen scheint, ist von besonderem Interesse welche natürlichen Wege für die Blockierung von IL-18 existieren. Die therapeutische Applikation von IL-18BP könnte sich in Zukunft als eine neue Strategie zur erfolgreichen Behandlung dieser Krankheiten erweisen.
In der vorliegenden Langzeitstudie wurden kleinvolumige Ankylos-Implantate mit progressiver Gewindegeometrie hinsichtlich ihrer Langzeitstabilität bei zahnlosen und teilbezahnten Patienten und solchen mit Einzelzahnersatz überprüft. Bei insgesamt 662 Patienten (264 Männer (37%) und 398 Frauen (63%)) im Alter von 54,37 ± 25,54 Jahren wurden 1458 schmale Ankylos-Implantate mit einem Durchmesser von 3.5 mm (A) und Länge von 8 bis 11 mm im Unterkiefer (49%) und Oberkiefer (51 %) eingesetzt. Nach einer Einheilphase von 3 - 6 Monaten wurden die integrierten Implantate mit 357 Einzelkronen (24,5%), mit 213 (14,6%) abnehmbaren und 888 (60,9%) festsitzenden Rekonstruktionen versorgt. Danach wurden die Implantate bei einer mittleren Belastungsdauer von 5 Jahren jährlich nachdokumentiert. Hier wurden die Daten zum Zeitpunkt der Eingliederung der prothetischen Versorgung (T0) und zum Zeitpunkt der letzten Nachuntersuchung nach 5 Jahren (T1) miteinander verglichen, um die Progredienz aller beobachteten Veränderungen abzuschätzen. Außerdem wurde die kumulative Erfolgsrate für Implantat-Untergruppen unterteilt nach Implantatlänge und Art der prothetischen Versorgung (unverblockt und primär oder sekundär verblockt) bestimmt. Die ossäre Integ'ration der Implantate wurde mit Hilfe von klinischen und radiologischen Parametern beurteilt. Bei den meisten Einzelimplantaten war während der Belastungsphase kein oder nur minimaler horizontaler (91,6%) und vertikaler Knochenabbau (88,24%) festzustellen. Die meisten verblockten Implantate zeigten auch keinen oder nur geringen horizontalen (83,74%) und vertikalen Knochenabbau (86,55%). Daraus kann man folgern, dass keines der hier untersuchten Implantate durch die verwendete prothetische Suprakonstruktion überbelastet war. Die Befunde des Periotests sprechen für eine günstigere Langzeitprognose der Implantate im Unterkiefer gegenüber denjenigen im Oberkiefer. Die Meßwerte der Sondierungstiefen lagen für alle untersuchten Implantate im Norrnbereich. Ebenso waren während der Belastungsphase keine auffaIligen Befunde zum modifizierten Plaqueindex und Blutungsindex festzustellen. Aufgrund von Kontrolluntersuchungen waren 85% der Einzelimplantate und 76% der verblockten Implantate in der Belastungsphase von einer keratinisierten Mukosa umgeben. Ebenso war der Großteil der Implantate (61 % der Einzelimplantate und 68% der verblockten Implantate) von einer Gingiva propria zwischen 1 - 4 mm umgeben. 24 (1,64%) von 1458 insertierten Implantaten gingen verloren (davon 9 Einzelimplantate (2 Implantate A9,5 und 7 Implantate A11) und 15 primär verblockte Implantate (A11)). Ungefahr die Hälfte der Verluste ereignete sich während der Einheilphase, der Rest im ersten bis vierten Jahr nach funktioneller Belastung. Unabhängig von der Implantatlänge und der prothetischen Versorgung ist die kumulative Fünfjahres-Erfolgsrate aller Implantate mit 98,4% als sehr hoch einzustufen.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der elektrochemischen und spektroskopischen Eigenschaften der bc1-Komplexe aus dem Bodenbakterium Paracoccus denitrificans und der Hefe Saccharomyces cerevisiae im sichtbaren und infraroten Spektralbereich. Das redoxaktive Protein ist Bestandteil der Atmungskette und trägt entscheidend zum Aufbau eines Protonengradienten bei, der zur Bildung des universellen Energieträgers ATP genutzt wird. Der bakterielle P. denitrificans-Komplex besteht aus den drei katalytischen Untereinheiten Cytochrom b, Cytochrom c1 und Rieske-Protein. Der mitochondriale Hefe-bc1-Komplex besitzt neben diesen drei noch acht weitere Untereinheiten, die anscheinend für die Stabilität des Enzyms bedeutsam sind. Um Konformationsänderungen des Proteins infolge von Elektronen- und daran gekoppelten Protonentransferreaktionen zu dokumentieren, wurde der Komplex elektrochemisch in definierte Redoxzustände versetzt. Aus den in diesen Zuständen aufgenommenen Absorptionsspektren berechnen sich Differenzspektren, deren Banden auf die Redoxreaktion zurückzuführende Veränderungen im Protein widerspiegeln. Durch Vergleiche mit Modellspektren isolierter Proteinbestandteile, Spektren ähnlicher Proteine und Informationen aus Kristallstrukturen konnten Beiträge der verschiedenen Kofaktoren, des Proteinrückgrates und einzelner Aminosäuren zu diesen Banden zugeordnet werden. Die elektrochemisch induzierten FTIR-Differenzspektren des P. denitrificans-bc1-Komplexes zeigten vor allem Beiträge der im Komplex gebundenen Chinone, die durch den Vergleich mit Differenzspektren isolierter Chinone identifiziert werden konnten. Ein wichtiges Ergebnis war die Abschätzung der Chinonkonzentration im Protein anhand einer charakteristische Bande bei 1262 cm-1 resultierend aus Schwingungen der Chinon-Methoxygruppen. Das Ergebnis von durchschnittlich 3 Molekülen Chinon pro Protein-Monomer unterstützt das zur Zeit für die Qo-Bindestelle diskutierte double-occupancy-Modell. Interessanterweise konnte die Protonierung einer Glu/Asp-Aminosäureseitenkette in Abhängigkeit vom Chinongehalt beobachtet und daraus abgeleitet Signale eines an der Qo-Bindestelle gebundenen Chinons differenziert werden. Die Beiträge der Cytochrom b und c-Untereinheiten relativ zum Gesamtspektrum des P. denitrificans-bc1-Komplexes wurden mittels Differenzspektren der einzelnen Kofaktoren unterschieden. Anhand ihrer Mittelpunktpotentiale, die zuvor durch Potentialtitrationen im sichtbaren Spektralbereich bestimmt wurden (Häm bL: Em7=-292 mV vs. Ag/AgCl, Häm bH: -144 mV, Häm c1: 89 mV), konnten die Differenzsignale des jeweiligen Kofaktors und seiner durch die Redoxreaktion beeinflußten Umgebung durch Wahl geeigneter Potentialschritte separiert werden. Die Zuordnungen der Signale des Cytochrom c1 und des Rieske-Proteins, die spektroskopisch nicht getrennt werden können, wurden durch Messungen an wasserlöslichen Fragmenten dieser Untereinheiten abgesichert. In allen Spektren konnten typische Beiträge des Proteingrundgerüstes, Schwingungen der Häme und ihrer Substituenten sowie einzelner Aminosäuren vorläufig zugeordnet werden. Die Bindung von Inhibitoren führte zu deutlichen Veränderungen im FTIR-Differenzspektrum. Der Qi-Inhibitor Antimycin A zeigt eigene Differenzsignale im Bereich oberhalb 1734 cm-1, an denen die Bindung des Inhibitors im Protein nachvollzogen werden konnte. Sie führte zur Abnahme der Signalintensität einer Bande, die die Beeinflussung eines protonierten Hämpropionates oder Arginin-bzw. Asparaginseitenketten vermuten lassen. Die Bindung des Qo-Inhibitors Stigmatellin, der selbst redoxaktiv ist, äußerte sich in Veränderungen im Amid I-Bereich des Differenzspektrums. Die Deprotonierung einer Glu/Asp-Seitenkette infolge der Stigmatellinbindung wurde diskutiert. Die FTIR-Differenzspektren des S. cervisiae-bc1-Komplexes gleichen denen des bakteriellen Komplexes in Bezug auf die Bandenpositionen weitestgehend. Die Signalintensitäten sowie die Größenverhältnisse der Banden zueinander unterscheiden sich jedoch. Dies wird durch den geringeren Chinongehalt des Hefeproteins nach der Präparation bedingt. Der Einfluß fünf verschiedener Inhibitoren der Qi- und Qo-Bindestelle auf die Differenzspektren wurde untersucht. Dabei standen von zwei Substanzen isotopenmarkierte Varianten zur Verfügung, die tieferen Einblick in die genaue Wechselwirkung bei der Inhibitorbindung bringen sollte. Die Bindung der Inhibitoren führte zu Veränderungen in den Spektren. Sie wurden vor dem Hintergrund der Kristallstruktur betrachtet, die aufgrund ihrer Auflösung keine exakten Aussagen über den Protonierungszustand einzelner Proteinbestandteile liefern kann. Der Schwerpunkt der Studien lag auf den Vergleich der Qo- Inhibitoren Stigmatellin und HHDBT. Die Bindung von Stigmatellin führte wie im P. denitrificans-Komplex zur Deprotonierung einer Glu/Asp-Seitenkette. Die Inhibierung mit HHDBT resultierte in der Protonierung vermutlich der gleichen Glu/Asp-Seitenkette. Die Auswirkungen des unterschiedlichen Protonierungszustandes der Aminosäure in Anwesenheit dieser beiden Inhibitoren wurde im Kontext eines vermuteten Chinoloxidations-Mechanismus beleuchtet.
Der Einbau von Übergangsmetallionen in Polymerketten kann zu Materialien mit vielversprechenden optischen, elektronischen oder magnetischen Eigenschaften führen, wie sie auf der Basis konventioneller organischer Polymere nicht zu erzielen sind. Die für metallorganische Makromoleküle charakteristischen Eigenschaften resultieren vor allem aus der Vielfalt der Strukturtypen, die für Metallkomplexe auftreten, und in vielen Fällen aus kooperativen Effekten zwischen den Übergangsmetallzentren eines Polymerstranges. Gezieltes Materialdesign setzt daher neben einem grundlegenden Verständnis der Interaktion zwischen den Metallkomplexfragmenten die Fähigkeit voraus, diese durch geeignete Verknüpfungseinheiten so miteinander zu verbinden, dass Wechselwirkungen zwischen ihnen auftreten. Kooperative Phänomene lassen sich häufig bereits an kurzkettigen Oligomeren beobachten, die daher als Modellsysteme für die entsprechenden Polymere dienen. Vor diesem Hintergrund lag der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit auf der Synthese und Charakterisierung di- und trinuclearer Metallkomplexe. Darüber hinaus wurden aber auch entscheidende Fortschritte in Bezug auf die Synthese metallhaltiger Polymere auf der Basis ausgewählter Ferrocenderivate erzielt. Zur Darstellung der Zielverbindungen wurden sowohl etablierte Verknüpfungs-Konzepte genutzt als auch neue Syntheserouten entwickelt. Als wichtige Startverbindungen wurden die Ferrocenylborane FcBR2 und 1,1‘-fc(BR2)2 [Fc = (C5H5)Fe(C5H4), fc = Fe(C5H4)2, R = Br, H, CR‘3] eingesetzt, da sich deren Borylsubstituenten in vielfältiger Weise zur Verknüpfung der metallorganischen Bausteine nutzen lassen. Aufgrund der Lewis-sauren Eigenschaften der Borylsubstituenten können Ferrocenylborane mit difunktionellen organischen Lewis-Basen wie 4,4‘-Bipyridin oder Pyrazin zu Polymeren verknüpft werden. Um die Anzahl der Metallatome innerhalb derartiger Makromoleküle zu erhöhen, wurden im Rahmen dieser Arbeit erstmals metallorganische Lewis-Basen als Verknüpfungseinheiten eingesetzt. In dieser Hinsicht bieten sich 3,4-Dimethyl-1-phosphaferrocen und 3,3‘,4,4‘-Tetramethyl-1,1‘-diphosphaferrocen sowie Ferrocenyllithium und 1,1‘-Dilithioferrocen an, da in diesen Verbindungen das Lewis-basische Zentrum Bestandteil des Cyclopentadienylrings ist. Im Gegensatz zu Phosphaferrocenen bilden die starken Lewis-Basen Ferrocenyllithium und 1,1‘-Dilithioferrocen mit dem Ferrocenylboran FcBMe2 selbst in Lösung stabile Addukte (z. B. Fc2BMe2Li). Polymerisationsversuche mit den Edukten 1,1‘-(fcBMe2)2 und 1,1‘-Dilithioferrocen führen entgegen den Erwartungen jedoch nicht zu polymerem Material, sondern ergeben das borverbrückte [1.1]Ferrocenophan [{Fe-(C5H4)2}2{BMe2}2]Li2. Die Struktur von [{Fe-(C5H4)2}2{BMe2}2]Li2 im festen Zustand weist als hervorstechendstes Merkmal ein nacktes Lithium-Ion auf, das sich im Zentrum des Käfigs befindet. Dieses supramolekulare Aggregat ist auch in Lösung beständig. Werden jedoch beide Ferroceneinheiten oxidiert, verlässt das Li+-Ion den Makrozyklus, um nach vollständiger Reduktion von [{Fe-(C5H4)2}2{BMe2}2] wieder an seinen ursprünglichen Platz zurückzukehren. Komplementär zum Verknüpfungskonzept über dative Bor-Stickstoff-, Bor-Phosphor- und Bor-Kohlenstoff-Bindungen wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Kondensationsreaktion erarbeitet, die auf einfachem Wege zu kovalent verknüpften di- und oligonuclearen Ferrocenkomplexen führt. Bei der Umsetzung von FcBBr2 mit HSiEt3 beobachtet man eine Dimerisierungsreaktion, die unter Bildung von Fc2BBr verläuft. Einer entsprechenden Reaktion lässt sich auch 1,1‘-fc(BBr2)2 unterziehen, womit sich ein Weg zu Poly(ferrocenylenen) eröffnet, in denen die Ferroceneinheiten über dreifach koordiniertes Bar verknüpft sind ([-fcB(R)-]n, R = Br). Weitere Wege zu ferrocenhaltigen Polymeren mit Bar im Polymerrückgrat wurden durch die erfolgreiche Synthese der Ferrocenylborane FcBH2 und 1,1‘-fc(BH2)2 eröffnet, die in Form ihrer Lewis-Säure-Base-Addukte mit Dimethylethylamin [FcBH2 . NMe2Et; 1,1‘-fc(BH2 . NMe2Et)2] oder Dimethylsulfid [FcBH2 . SMe2; 1,1‘-fc(BH2.SMe2)2] isoliert werden konnten. FcBH2 . NMe2Et und FcBH2 . SMe2 erwiesen sich als aktive und selektive Hydroborierungsreagenzien. Durch Umsetzung mit aromatischen Dialkinen werden dadurch konjugierte Polymere zugänglich, welche mit Polyolefinen verwandt sind, in denen einige der Kohlenstoffatome durch Boratome ersetzt wurden. Diese Materialien zeichnen sich durch ausgeprägt pi-Delokalisation aus, die sich über das Bor hinweg erstreckt, und weckten unser Interesse, da Oxidation der Ferrocenyl-Seitenketten eine elektrochemische Modifizierung der Ladungsdichte an den Borzentren erlauben sollte. Gleichzeitig ließen sich auf diese Weise paramagnetische Fe(III)-Ionen in unmittelbarer Nachbarschaft zu einem elektrisch leitfähigen Polymer generieren. Überdies erhält man Polymere des Typs [-fcB(R)-]n nicht nur über die Reaktion von 1,1‘-fc(BBr2)2 mit HSiEt3 (R = Br) sondern auch über die Kondensationsreaktion von 1,1‘-fc(BH2)2, die unter Abspaltung von BH3 verläuft (R = H).
Das Ziel dieser Arbeit war die Evaluierung der Einsatzmöglichkeiten eines mikrostrukturierten Reaktorsystems in der heterogenen Katalyse. Hierzu wurde eine Reaktion herangezogen, welche typische Problemstellungen der heterogenen Katalyse abbildet. Zu diesen Problemen gehören Temperaturkontrolle, sichere Handhabung von explosiven Gasgemischen und das Erzielen von zufriedenstellenden Selektivitäten. Die Reaktion sollte außerdem bereits gut untersucht worden und die Prozessparameter aus der Literatur bekannt sein. Aus diesem Grund wurde die Partialoxidation von Ethen zu Ethenoxid an Silberkatalysatoren gewählt. Es konnte gezeigt werden, dass die Reaktion in einem Mikrostrukturreaktorsystem sicher durchführbar ist. Vor allem wurde an einer ganzen Reihe von Beispielen veranschaulicht, dass eine herausragende Eigenschaft des Mikrostrukturreaktors seine inhärente Explosionssicherheit ist. Gasgemische, welche sich mitten im explosiven Gemischbereich befanden, konnten bei Drücken von 2 bis 20 bar und Temperaturen von 230 bis 310 °C sicher gehandhabt werden. So konnte gezeigt werden, dass der Mikrostrukturreaktor sich dazu eignet Reaktionen mit explosiven Gasgemischen durchzuführen. Die Verwendung von Mikrostrukturreaktoren in der heterogenen Katalyse befindet sich noch im Anfangsstadium. Um Probleme bei der Übertragung von Katalysatorsystemen auf ein System mit Mikrostruktur zu vermeiden, erfolgte zunächst der Einsatz von Vollsilberkatalysatoren. Die Mikrostruktur wurde deshalb aus dem katalytisch aktiven Material selbst hergestellt. Die Herstellung wurde auf drei unterschiedliche Weisen (LIGA-, Ätz- und Sägeverfahren) durchgeführt. So konnte gezeigt werden, dass eine Kostenreduzierung bei der Darstellung von Mikrostrukturen möglich ist. Der Nachteil der Nutzung von Vollsilber war, dass sich deutlich schlechtere Selektivitäten bei der Partialoxidation von Ethen ergaben. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass mit dem Mikrostrukturreaktor die Selektivitäten für Vollsilber im Schnitt 10 % über denen für Rohrreaktorexperimenten bei gleichen Umsätzen lagen. Die effektive Wärmeabführung und die homogene Verteilung der Wärme über den Mikrostrukturreaktor scheinen eine Verbesserung der Selektivität zu erbringen. Kinetische Untersuchungen zeigten, dass sowohl durch Anheben des Partialdrucks von Ethen als auch von Sauerstoff eine Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit erzielt werden kann. Dabei wurde für Ethen eine formale Reaktionsordnung bei der Bildung von Ethenoxid von 0,53 gefunden, während sie für Sauerstoff 0,78 betrug. Mit diesen Untersuchungen wurde verdeutlicht, dass ein Erhöhen des Sauerstoffpartialdrucks einen positiven Einfluss auf die Selektivität hat. So konnte durch Anheben der Sauerstoffkonzentration von 5 %, wie es in industriellen Prozessen aus Sicherheitsgründen notwendig ist, auf bis zu 95 % eine Verbesserung der Selektivität von bis zu 15 % erzielt werden. Über diesen Sachverhalt wurde zwar bereits in der Literatur (16) berichtet, jedoch erfolgten die Untersuchungen hierfür unter Hochvakuumbedingungen. Der Mikrostrukturreaktor ermöglichte einen Nachweis dieses Phänomens auch unter Hochdruckbedingungen, wie sie für industrielle Reaktoren üblich sind. Damit konnte ein in der heterogenen Katalyse bekanntes Problem, nämlich die Übertragung von Erkenntnissen aus Ultrahochvakuumexperimenten auf Hochdruckbedingungen (pressure-gap), untersucht werden. Eine wissenschaftliche Prüfung, ob dem Ergebnis die gleichen Ursachen sowohl im Ultrahochvakuum als auch bei Hochdruckbedingungen zugrunde liegen, muss noch erfolgen. Es zeigte sich aber auch, dass durch eine Verweilzeiterhöhung keine weitere Verbesserung der Raum-Zeit-Ausbeute möglich ist. Vielmehr wurde klar, dass Reaktionsgeschwindigkeit und Selektivität mit längeren Verweilzeiten abnehmen. Als Grund hierfür konnte die Bildung von elementarem Kohlenstoff an der Silberoberfläche festgestellt werden. Aufgrund der Limitierung bei der Verweilzeit wurden maximale Umsätze von 24 % erzielt. Der Einsatz von 1,2-Dichlorethan als Oxidationsinhibitor für Vollsilber wurde ebenfalls untersucht. Dabei konnte die Selektivität auf bis zu 69 % gesteigert werden. Es erfolgte jedoch eine Einbuße an Aktivität von etwa 42 %. Es ist bekannt, dass die Oberflächenmorphologie von Silberkatalysatoren unter Reaktionsbedingungen starke Veränderungen erfährt. (68) Es wurde aufgezeigt, dass dies für die Oberfläche von mikrostrukturierten Silberfolien ebenfalls festzustellen ist. Dabei wurde gleichzeitig festgestellt, dass die Katalysatoren trotz unterschiedlicher Herstellungsmethoden und den daraus resultierenden unterschiedlichen Oberflächenmorphologien vergleichbare Aktivitäten aufweisen. Industriell verwendete Katalysatoren basieren auf alpha-Aluminiumoxid als Trägermaterial. Dabei wurde bereits seit vielen Jahren an Optimierungen des Katalysators gearbeitet. Durch das Einstellen der spezifischen Oberfläche und Partikelgröße des Silbers und den Einsatz von Alkali- und Erdalkalimetallen als Promotoren werden so Katalysatoren hergestellt, welche eine Selektivität von 80 % besitzen. Die Übertragung dieser Erkenntnisse auf ein Mikrostrukturreaktorsystem kann nicht ohne weiteres vorgenommen werden. Es wurden verschiedene Darstellungsmöglichkeiten für eine alpha-Aluminiumoxidschicht in einem Mikrostrukturreaktor untersucht. Dabei zeigte sich, dass nur die direkte Darstellung von alpha- Aluminiumoxid ohne Phasenumwandlung aus anderen Modifikationen erfolgversprechend ist. Eine Darstellung der Aluminiumoxidschicht durch Sol-Gel- oder CVD-Prozesse war nicht erfolgreich, da die für die Phasenumwandlung von gamma-Aluminiumoxid nach alpha-Aluminiumoxid notwendige Temperatur von 1100 °C die Ausbildung einer Eisenoxidschicht an der Oberfläche der mikrostrukturierten Edelstahlfolien zur Folge hatte. Diese eignete sich nicht als Träger. Alternativ wurde erfolgreich der Einsatz von aluminiumhaltigen Edelstählen untersucht. Diese bilden beim Ausheizen bei 1100 °C eine alpha-Aluminiumoxidschicht an der Oberfläche aus, welche mittels Sputtern mit Silber geträgert wurde. Katalytische Untersuchungen zeigten, dass mit dem Einsatz von alpha-Aluminiumoxidträgern eine Verbesserung der Selektivität im Vergleich zu Vollsilber von 17 % erreicht werden kann. Gleichzeitig konnte anhand eines Gegenüberstellens von katalytischen Daten mit TEM-Aufnahmen der Sputterschichten festgestellt werden, dass eine geschlossene Silberschicht an der Oberfläche notwendig ist, um eine zufriedenstellende Aktivität und Selektivität zu erzielen. Während bei Schichtdicken von 1 nm noch einzelne Silberinseln an der Oberfläche zu finden sind, liegt bei einer Schichtdicke von 5 nm eine fast geschlossene Silberschicht vor. Ein Anheben der Schichtdicke ergab keine weitere Verbesserung der Aktivität oder Selektivität. Dagegen ergab der Einsatz von 1,2-Dichlorethan eine weitere Steigerung der Selektivität auf 77 %. Industriell eingesetzte Rohrbündelreaktoren erreichen im Sauerstoffverfahren eine Selektivität von 80 %. Die hier erzielten 77 % Selektivität bei vergleichbaren Umsätzen zeigt, dass der Einsatz eines Mikrostrukturreaktors für die Synthese von Ethenoxid möglich ist, vor allem unter dem Gesichtspunkt, dass Potenzial für die Optimierung von Reaktoren und die Katalysatorpräparation besteht. Die Nutzung von Reaktionsbedingungen, wie Ethen in reinem Sauerstoff, und der daraus resultierenden Verbesserung für Aktivität und Selektivität, ermöglichen Raum-Zeit-Ausbeuten, die über denen von Industriereaktoren liegen. Ob Mikrostrukturreaktoren in industriellen Prozessen jemals eingesetzt werden, hängt allein von ökonomischen Faktoren ab. Dazu müsste die Selektivität über die bestehenden 80 % angehoben werden. Zur Zeit entfallen 80 % der Produktionskosten von Ethenoxid auf den Rohstoff Ethen, so dass jeder Prozentpunkt, um den die Selektivität angehoben werden könnte, eine deutliche Kosteneinsparung mit sich brächte und darüber entschiede, ob ein neuer Prozess eingeführt wird. Hierzu wäre es auch notwendig, die Kosten für die Produktion der Mikrostrukturreaktoren pro Volumeneinheit um mehrere Größenordnungen zu reduzieren. Außerdem müssten Lösungen entwickelt werden, welche die Peripherie des Reaktors betreffen, vor allem die Heizung und die Gasversorgung. Im Rahmen dieser Arbeit sollte überprüft werden, welche Leistungsfähigkeit ein Mikrostrukturreaktorprozess im Vergleich zu einem bestehenden Prozess besitzt. Es konnte dargestellt werden, dass Raum-Zeit-Ausbeuten über denen eines Industriereaktors erzielt werden können bei vergleichbareren Selektivitäten. Außerdem konnte gezeigt werden, dass der Mikrostrukturreaktor ein geeignetes Werkzeug ist, welches helfen kann, Reaktionen unter bisher nicht einfach zugänglichen Bedingungen durchzuführen.
Die vorliegende Arbeit geht der Frage nach veränderten Kommunikationsverhalten am Beispiel der Auswirkungen der Mobilfunknutzung auf soziale Beziehungen nach und vergleicht die sozialwissenschaftlichen Erkenntnisse mit dem herkömmlichen Festnetztelefon sowie der Face-to-face Gesprächssituation. Dazu wurden soziologische Texte, aktuelle Umfrageergebnisse sowie eine eigens durchgeführte Stichprobenanalyse ausgewertet. Der Forschungsschwerpunkt behandelt daher nicht demographische Untersuchungen der Mobilfunkanwender oder Nutzungsprofile sondern konkrete Fragestellungen, ob und wie das Mobiltelefon hilft, soziale Beziehungen aufrechtzuerhalten oder zu vertiefen. Als Einführung wurde die Geschichte des Mobiltelefons anhand von technischen, politischen und wirtschaftlichen Gesichtspunkten erläutert. Dabei sticht die schnelle zeitliche Durchdringung des Mobiltelefons in weite Teile der Bevölkerung hervor (mehr als 70 Prozent in 2002). Diese Entwicklung wurde einerseits möglich durch wirtschaftspolitische Weichenstellungen zur Deregulierung und technischem Fortschritt, andererseits aber vor allem durch eine schnelle gesellschaftliche Akzeptanz. Diese breite Akzeptanz, deren Grundvoraussetzung die Adoption ist, wurde als Hinführung zum Forschungsschwerpunkt in Kapitel 2 ausführlich untersucht. Neben der Diskussion des gesellschaftlichen Wandels in der modernen Gesellschaft stand vor allem das Verhältnis von Technik und Gesellschaft sowie der Adoptionsprozess und die gesellschaftliche Annahme des Mobiltelefons im Mittelpunkt. Nach Erläuterung der relevanten soziologischen Konzepte und Definition der wichtigsten Begriffe sowie der methodischen Vorgehensweise wurde der Forschungsschwerpunkt in drei Kapitel gegliedert. - Der erste Abschnitt untersucht soziale Beziehungen und hinterfragt nach der Steigerung beziehungsweise Verringerung sowie der Intensität der sozialen Kontakte bei Mobilfunknutzung. Letzerer Frage schließt sich eine abwägende Diskussion zwischen Erreichbarkeit und Verfügbarkeit an. - Die Ausführungen zu steigender Mobilität in der modernen Gesellschaft sowie dem Einfluss des Mobiltelefon auf die Mobilität und Flexibilität der Individuen folgt im zweiten Abschnitt inklusive der Fragestellung, ob das Nutzen des Mobiltelefons die Grenzen zwischen Privatheit und Beruf verschiebt. - Im dritten Abschnitt werden die Auswirkungen der Mobilfunknutzung in sozialen Räumen im Sinne des Gegensatzes Privatheit und Öffentlichkeit behandelt. Dazu gehören die Unterpunkte Intimität und Selbstinszenierung, Einflussnahme auf die Umwelt und Konflikte im öffentlichen Raum. Die Untersuchungen führen zu folgenden Haupterkenntnissen: - Das Nutzen des Mobiltelefons erleichtert die Kontaktaufnahme und führt daher zu einer Zunahme medial vermittelter Sozialkontakte. Trotz Substitutionseffekten mit dem Festnetztelefon vor allem im Ortsbereich handelt es sich um ein Ergänzungsmedium, dass für häufigere Kommunikation sorgt, da das Telekommunikationsaufkommen (gemessen in Gesprächsminuten) stark ansteigend ist. - Trotz häufigerer Sozialkontakte ist die Intensität der Gespräche bei der Mobilfunknutzung reduziert. Intensität ist hierbei definiert anhand von Gesprächslänge, -themen, -partner und -anlass, nicht als subjektive Empfindung eines Mobiltelefonates. Diese verminderte Intensität kann im Extremfall den Fortbestand von sozialen Beziehungen gefährden, falls ausschließlich mit Mobiltelefonen kommuniziert wird. Im Einklang mit allgemeinen Tendenzen des sozialen Wandels erlaubt das Mobiltelefon eine schnelle Kommunikation, bei der überwiegend knappe Inhalte übermittelt werden. Dies wird einerseits belegt beim Vergleich der Kommunikationsminuten von Festnetz und Mobiltelefon, als auch in der Stichprobenuntersuchung durch die durchschnittliche Gesprächslänge, welche ungefähr vier- bis sechsmal kürzer ausfällt. Die Wahl der Gesprächsthemen scheint zu sachlicheren Themen fokussiert zu sein. - Das Mobiltelefon ist personifiziert anstelle des herkömmlichen ortsgebundenen Telefons. Der Vorteil der möglichen Erreichbarkeit wird schnell zur Verpflichtung der permanenten Verfügbarkeit. Bisher ungekannte Kontrollmöglichkeiten und Druck nach Rechtfertigung entstehen. - Der intuitiv verstandende Gewinn an Mobilität führt zur einer höheren Flexibilität des Mobilfunknutzers. Aufgrund dieser findet die Loslösung der Kommunikation von lokalen Sozialkontakten statt. Damit steht das Mobiltelefon im Einklang mit dem gesellschaftlichen Wandel zur steigenden Mobilität, wie die Jahresberichte des Statistischen Bundesamtes belegen. - Die gewonnene Mobilität und Flexibilität können durch die permanente Erreichbarkeit ein Verschieben der Grenze zwischen Beruf und Privatheit bewirken und somit teilweise diese Zunahme wieder einschränken. Durch das Nutzen eines Mobiltelefons ist es daher nicht mehr einfach möglich, die eigenen sozialen Räumen zu verlassen. - Der öffentliche Gebrauch eines Mobiltelefons steht im Konflikt zwischen dem intimen Charakter eines Privatgespräches und der Aufmerksamkeit der Öffentlichkeit, welche zur Selbstinszenierung führen kann. Als Folge dessen entstehen Regelverletzungen, besonders da bei Entgegennahme eines Mobilfunkgespräches die Aufmerksamkeit von örtlich Anwesenden zum "virtuellen" Gesprächspartner überwechselt. - Besagte Konflikte im öffentlichen Raum durch gleichzeitige Anwesenheit des Mobilfunknutzers in konkurrierenden sozialen Räumen werden einerseits durch das Entstehen von Gebrauchsregeln für das Mobiltelefon wie dem Mobiltelefonverbot am Steuer, andererseits durch das Gewöhnen der Gesellschaft an das öffentliche Nutzen des Mobiltelefons entschärft. Die vorliegende Arbeit kommt damit zu Erkenntnissen, die mit den Ergebnissen anderer Autoren verglichen werden können: - Auch bei anderen Autoren, die sich aktuell mit dem soziologischen Auswirkungen der Mobiltelefonie beschäftigen, ist unbestritten, dass das Mobiltelefon die Kommunikation fördert und somit zu mehr sozialen Kontakten beiträgt. Dies wird zum Beispiel von Geser und Haddon festgestellt. Über die Intensität im Sinne von Gesprächslänge, -thema, -partner und –anlasses ist hingegen nur ansatzweise in der vorliegenden Literatur diskutiert worden. - Neben der allgemeinen Überzeugung des Gewinns an Flexibilität und Mobilität durch das Mobiltelefon und der damit verbunden Möglichkeit zur Kommunikation in Unkenntnis des Aufenthaltortes sind verschiedene kritische Stimmen zur Frage der Vermischung zwischen Privatheit und Beruf und nach der durch Erreichbarkeitsverpflichtung entstehenden Kontrolle vorhanden. Dies wird besonders bei Geser erörtert. - Übereinstimmend werden auch die besondere Problematik der Mobilfunknutzung in der Öffentlichkeit und dem damit verbundenen Konfliktpotential erkannt. Neben oben genannten Autoren diskutiert Ling dieses Thema ausführlich. In der abschließenden Tabelle sind die sozialwissenschaftlichen Erkenntnisse dieser Arbeit, ihre Begründungen und Schlussfolgerungen sowie einige Kernbeispiele als Kurzzusammenfassung aufgeführt.
Inhibition des Stat3-Signalweges durch Peptid-Aptamere : ein neuer Ansatzpunkt für die Tumortherapie
(2004)
In der vorliegenden Arbeit konnten durch den Einsatz modifizierter Hefe-zwei-Hybrid-Screens erstmals Peptid-Aptamere isoliert werden, die spezifisch mit verschiedenen funktionellen Domänen von Stat3 interagieren und dadurch den Stat3-Signalweg auf unterschiedlichen Ebenen inhibieren. Als Zieldomänen im Hefe-zwei-Hybrid-System wurden die Dimerisierungs- bzw. die DNA-Bindedomäne von Stat3 verwendet. Nach der erfolgreichen Identifikation von Peptid-Aptameren im modifizierten Hefe-zwei-Hybrid-System war es zunächst notwendig, die spezifische Interaktion der isolierten Peptid-Aptamere mit Stat3 zu demonstrieren. Die in vitro Interaktion der isolierten Peptid-Aptamere mit dem gesamten Stat3-Molekül wurde in Ko-Immunopräzipitationsexperimenten gezeigt. Im Folgenden bestätigte sich die spezifische Interaktion der isolierten Peptid-Aptamere mit ihren jeweiligen funktionellen Domänen von Stat3 in Hefen mittels Mating-Experimenten. In den nächsten Schritten sollte die Bioaktivität der isolierten Peptid-Aptamere bei der Inhibition des Stat3-Signalweges in verschiedenen Zellsystemen validiert werden. Zunächst konnten in Herc-Zellen, die den Stat3-Signalweg nach exogenem Stimulus (EGF) aktivieren, die molekularen Wirkungs-mechanismen, die der Inhibition des Stat3-Signalweges durch die Peptid-Aptamere zugrunde liegen, aufgeklärt werden. Durch den Einsatz eines biochemisch-molekularbiologischen Methodenrepertoires (Western Blot Analysen, Reportergen-Analysen, und Gelretardierungsexperimente) zeigte sich, dass die verschiedenen selektionierten Peptid-Aptamere mit dem Aktivierungsszenario des Stat3-Signalweges auf zwei unterschiedlichen Ebenen, der Phosphorylierung bzw. der DNA-Bindung von Stat3, interferieren. Um die mögliche Anwendung der isolierten Peptid-Aptamere als potentielle Stat3-Inhibitoren in Tumorerkrankungen zu analysieren, wurden die Untersuchungen auf Tumorzelllinien mit konstitutiv-aktivem Stat3 (murine Melanomazelllinie B16 und humane Myelomazelllinie U266) ausgeweitet. Durch die zelluläre Applikation der für die isolierten Peptid-Aptamere codierenden DNA mittels Transfektion ergaben sich erste Einblicke über den Einfluss der isolierten Peptid-Aptamere auf die transkriptionelle Aktivität von Stat3. In weiteren Untersuchungen konnte eindrucksvoll gezeigt werden, dass durch die transiente Expression eines Peptid-Aptamers (DBD-1) Apoptose in murinen Melanomazellen induziert wird. Die biologische Aktivität des DBD-1 Peptid-Aptamers wurde dann mit Hilfe einer innovativen Methode zur zellulären Applikation von potentiell wirksamen Bio-Molekülen in eukaryotische Zellen studiert. Dabei konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Methode der Proteintransduktion für die Applikation von Peptid-Aptameren etabliert werden. Durch den Einsatz der Proteintransduktion ließ sich die Funktionalität des isolierten DBD-Peptid-Aptamers nicht nur in murinen, sondern auch in humanen Stat3-abhängigen Tumorzellen verifizieren. Dabei konnte auch eine Dosis-Wirkungsbeziehung zwischen der Überlebensrate von Stat3-abhängigen Tumorzellen und der Menge an applizierten Peptid-Aptamer hergestellt werden. Darüber hinaus demonstrieren weitere Ergebnisse, dass das DBD-1 Peptid-Aptamer keinen Einfluss auf die Überlebensrate von nicht-Stat3-abhängigen Tumorzellen hat, wodurch die hohe Spezifität des DBD-1 Peptid-Aptamers bestätigt wird. Zusätzlich zu diesen funktionellen Analysen konnte der durch das Peptid-Aptamer induzierte Signalweg, der die Einleitung des programmierten Selbstmordes der Stat3-abhängigen Tumorzellen auslöst, charakterisiert werden. Die vorliegenden Daten zeigen zudem die Funktionalität der rekombinant exprimierten Peptid-Aptamere fusioniert mit einer Proteintransduktionsdomäne in einem in vivo Tumormodell in der Maus. Für diesen tierexperimentellen Ansatz fanden B16-Tumorzellen Verwendung, die nach subkutaner Injektion in Mäusen lokale Tumore bilden. In diesem Tumormodell wurde mittels intratumorale Injektion des transduzierbaren DBD-Peptid-Aptamers ein viel versprechender, wachstumshemmender Effekt auf Tumorzellen erzielt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen, dass Stat3 ein ideales Zielprotein für die Entwicklung neuer Tumortherapeutika ist. Dabei stellt nicht nur die Dimerisierungsdomäne, sondern auch die DNA-Bindungsdomäne ein attraktives Ziel für die Inhibition des Transkriptionsfaktors Stat3 dar. Die viel versprechenden Daten sowohl an Tumorzellen als auch im Gesamtorganismus des Maustumormodells, verbunden mit der hier herausgearbeiteten innovativen Applikationstechnik, lassen auf einen Einsatz der isolierten Peptid-Aptamere in der Tumortherapie hoffen. Zudem eröffnen die Daten zur Protein-transduktion von Peptid-Aptameren neue Perspektiven für die Applikation von Bio-Molekülen mittels „Protein-Therapie“ in der molekularen Bio-Medizin.
Das Ziel dieser Studie war es, den Diodenlaser (980nm) in Bezug auf die Epithelentfernung am Tiermodell (subgingivale Kürettage) zu untersuchen und mit herkömmlichen Methoden zu vergleichen. Es wurden zehn Unterkiefer von frisch geschlachteten erwachsenen Schweinen mit vorhandenen parodontalem Weichgewebe und Entzündungen im Sinne von Taschenbildungen verwendet. Die bukkalen Seitenzähne (P2-P4, M1-M3) wurden von drei verschiedenen Behandlern mit konventionellen Küretten bearbeitet (Kontrollgruppe). Die lingualen Taschen wurden ausschließlich mit einem Diodenlaser (980nm) (Fa. Biolitec, Jena, Deutschland) kürettiert (Testgruppe). Der Laser wurde im kontinuierlichen Modus mit zwei unterschiedlichen Leistungseinstellungen (2 und 4 Watt) verwendet, wobei die Glasfaserstärke 360 µm betrug (Leistungsdichte: 1.96-3.93 x 105 W/cm2). Beide Gruppen wurden auf jeder Seite für 15 sec. bearbeitet. Diese Behandlungszeit hat sich Anhand unserer klinischen Erfahrung als effizient erwiesen. Alle drei Behandler hatten wie folgt unterschiedliche Erfahrungen im Bereich der Parodontalchirurgie: Level 1: Ein Zahnarzt im Weiterbildungsbereich Oralchirurgie Level 2: Ein Zahnarzt mit der Zusatzbezeichnung "Oralchirurgie" Level 3: Ein Zahnarzt mit der Zusatzbezeichnung "Oralchirurgie" und dreijähriger Weiterbildung in Parodontologie. Unmittelbar nach der Behandlung wurden bukkale und linguale Weichgewebebiopsien mit einem Skalpell exzidiert und histologisch bearbeitet. In den mit Laser behandelten Präparaten wurden keine Epithelreste gefunden. Der Laser mit einer geringeren Leistungseinstellung (2 Watt), war unabhängig vom Erfahrunggrad des Behandlers dazu befähigt, das dünne Taschenepithel zu entfernen. Bei Verwendung einer höheren Leistungseinstellung (4 Watt) konnte man Beschädigungen des Bindegewebes und Weichgewebsnekrosen erkennen, welche temperaturbedingt durch den Laser verursacht wurden. Unabhängig vom parodontalchirurgischen Erfahrungsgrad der Behandler, wurden in allen mit Handinstrumenten bearbeiteten Präparaten lineare Epithelreste gefunden. Allerdings wiesen die Präparate von Behandler 3 im Vergleich zur Gruppe der nicht behandelten Präparate bedeutend weniger Epithelreste auf, als die von Behandler 1. Kollagenfasern und extrazelluläre Matrix zeigten eine normale Form ohne Gewebeschäden. Die in dieser In vitro-Studie präsentierten histologischen Ergebnisse zeigen, daß die Behandlung des parodontalen Weichgewebes mit dem Diodenlaser (980nm), im Vergleich zu konventionellen Methoden mit Handinstrumenten, zu einer vollständigen Epithelentfernung in der Tasche führt. Unabhängig vom parodontalchirurgischen Erfahrungsgrad war jeder Behandler mit dem Laser dazu befähigt, das Epithel effizient zu entfernen. Es ist von klinischer Bedeutung, daß der Laser ein charakteristisch leichtes Handling im Vergleich zur Weichgewebskürettage mit konventionellen Methoden hat. Um das Risiko von Kollateralschäden im angrenzenden gesunden Bindegewebe zu minimieren, muß die Leistungeinstellung der Lasereinheit relativ gering sein. Der zusätzliche antibakterielle Effekt des Diodenlasers hat einen signifikanten Vorteil in Bezug auf die Regeneration des zerstörten parodontalen Gewebes. Dieses Verfahren erlangt durch die zusätzliche Instrumentierung der Wurzeloberfläche mittels koventionellen Techniken entscheidende klinische Relevanz. Der Laser erlaubt eine adäquate Koagulation, die das gesunde benachbarte Gewebe nicht beschädigt. Gleichzeitig stimuliert er, wenn er in richtiger Weise angewendet wird, neues Knochenwachstum. Dies wurde durch zahlreiche Studien beobachtet. Weiterhin sind klinische Studien an Tier und Mensch erforderlich, damit dieses Verfahren in der täglichen Praxis angewendet werden kann. Gleichzeitig sind Training in der Laserchirurgie und spezielle Operationstechniken von großer Wichtigkeit, um dem Kliniker das notwendige Know-how für den klinischen Gebrauch zu vermitteln und mögliche Komplikationen zu vermeiden.
Für Hepatitis-Viren sind für Westeuropa im allgemeinen und Deutschland im besonderen niedrige bis sehr niedrige Belastungen dokumentiert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Prävalenz der serologischen Marker der verschiedenen Erreger in Proben, die dem Institut für Medizinische Virologie der Universitätsklinik Frankfurt am Main vorgelegt wurden, untersucht. Aus den Jahren 1995 - 2002 wurden 220.468 Tests auf Hepatitis-Virus-Antikörper sowie HBs-Antigen und HGV-RNA in die Analysen einbezogen. Dabei ließ sich ein starker Rückgang der jährlichen Testzahlen vom Höchststand in 1996 mit 30.566 auf nur noch 20.435 in 2002 (-33%) belegen. Außerdem wurden die Präferenzen bei den einzelnen Erregern deutlich: 98% aller Untersuchungen entfielen auf die Hepatitis-Viren A-C und ganze 4.114 Tests auf die Viren D-G. Bei der Hepatitis-A-Infektion, die fast immer folgenlos ausheilt und eine lebenslange Immunität hinterlässt, spiegelten die Antikörper-Prävalenzen die kumulative Wahrscheinlichkeit für den Erregerkontakt mit einem altersabhängig hohen Gesamtdurchschnitt (48,02%) wider. Der Nachweis von viralem Antigen bzw. Genom zeigte die aktuelle Infektionslage (für HBV mit 3,9% und HGV mit 6,06%). Bei Erkrankungen, die zu einem komplizierten Verlauf neigen und/oder keine langfristige Immunität hinterlassen, standen unterschiedliche Antikörper-Prävalenzen für das jeweilige Risiko (im Mittel HBV 19,15%, HCV 11,51%, HDV 6,55%, HEV 3,98%). Diese Zahlen liegen über den in anderen Untersuchungen für die deutsche Gesamtbevölkerung angegebenen Werten. Das ist insofern nicht verwunderlich, als hier kein Normalkollektiv untersucht wurde, sondern belastete Probanden, bei denen bereits eine Infektion vermutet wurde oder die einer erhöhten Infektionsgefahr ausgesetzt waren. Die Auswertung der Daten für spezifische Risikogruppen belegte die höhere Belastung von HIV-Positiven und i.v. -Drogenabhängigen für fast alle Hepatitis-Viren, während sich für Empfänger von Organen, Blut- und Blutprodukten vielfach eine unterdurchschnittliche oder zumindest eine gegenüber früheren Untersuchungen gesunkene Belastung als Bestätigung für vorgeschriebene Screening-Methoden zeigte. Ein ähnliches Bild bot das medizinische Personal, das lediglich bei den akuten HBV-Erkrankungen über dem Durchschnitt lag. Die Aufnahme der Hepatitis-B-Impfung in den Impfkalender der STIKO (Ständige Impfkommission am Robert-Koch-Institut) zeigte schon in den ersten acht Jahren einen beachtlichen Erfolg: bereits in dieser kurzen Zeit stieg die Anti-HBs-Prävalenz bei den Unter-10-Jährigen von anfangs 21,53% auf 82,50%. Dabei hatten in 1995 lediglich 40% die Antikörper durch eine Immunisierung, folglich 60% aufgrund einer Infektion entwickelt. Bis zum Jahr 2002 verschob sich dieses Verhältnis auf 96,49% vs. 3,51% zu Gunsten der Impfung.
Vergleichende enzymatische Untersuchungen an Schlangengiften von Bothrops asper und Crotalus atrox
(2004)
An 36 Schlangengiften der Vipernarten Crotalus atrox und Bothrops asper wurden jeweils acht Enzymbestimmungen durchgeführt: Argininester-Hydrolase, Casein- und Hide-Powder-Azure-Hydrolyse, Fibrinogen-Koagulase, Humanplasma-Koagulase, L-Aminosäureoxidase, Phosphodiesterase und Phospholipase A2. 14 Schlangengifte von Bothrops asper wurden zudem mittels Anionenaustausch-Chromatographie fraktioniert und die einzelnen Fraktionen auf ihre proteolytische Aktivität und die Fähigkeit, Humanplasma zu koagulieren, untersucht. Es zeigten sich trotz ähnlicher Lebensumstände der Tiere sowie des standardisierten Umgangs mit den Schlangengiften auch innerhalb einer Art erhebliche Variationen in den Enzymaktivitäten. Bei nur zwei Giften von Bothrops asper gelang es, das Enzym mit Casein-Hydrolyse-Aktivität in jeweils einer einzigen Fraktion anzureichern. Alle anderen fraktionierten Lanzenottern- Gifte wiesen diese Enzymaktivität gleich in mehreren oder allen Fraktionen auf. Humanplasma-Koagulase-Aktivität war ausnahmslos in jeder einzelnen Fraktion der untersuchten Gifte nachweisbar. Wahrscheinlich bewirkt ein komplexes Zusammenspiel gleich mehrer Faktoren oder Enzyme im Gift die Blutgerinnung. Fraktionen mit hoher proteolytischer Aktivität für Casein zeigten nicht zwangsweise hohe prokoagulatorische Aktivität. Die Enzyme mit Casein- Hydrolyse-Aktivität scheinen also nicht für die thrombinähnlichen Eigenschaften der Gifte verantwortlich zu sein. Die hier erneut bestätigte Heterogenität in der Zusammensetzung von Schlangengiften führt zu folgendem Schluss: Vor der Immunisierung eines Vesuchstieres zur Gewinnung eines Antiserums sollten die verwendeten Gifte auf ihre Enzym- sowie biologischen Aktivitäten untersucht werden.
Das complexe Prostata-spezifische Antigen (cPSA) in der Routinediagnostik des Prostatakarzinoms
(2004)
Die Aktivierung der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) spielt eine Schlüsselrolle in der Vermittlung proliferativer Effekte sowohl von Rezeptoren vom Tyrosinkinase-Typ (RTK) wie dem epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), als auch von G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR). Die MAPK-Aktivierungsmechanismen durch GPCR sind im Gegensatz zum EGFR unzureichend verstanden und stark von Rezeptor- und Zelltyp abhängig. Ziel dieser Arbeit war die nähere Charakterisierung der Signaltransduktion des GPCR-zugehörigen Cholezystokinin (CCK)-Rezeptors bezüglich der Aktivierung der MAPK durch Western-Blot-Analysen in der Pankreasazinus-Karzinomzelllinie AR42J der Ratte. Die Ergebnisse zeigen eine Beteiligung des EGFR im Mechanismus der CCK-induzierten MAPK-Aktivierung mittels einer EGFR-Transaktivierung. Diese ist mit einer Tyrosinphosphorylierung des EGFR und von Shc sowie einer Komplexbildung der Adapterproteine Shc und Grb2 mit dem EGFR verbunden. Diese Vorgänge sind von der intrinsischen Tyrosinkinaseaktivität des EGFR abhängig. Neben dem EGFR konnte durch weitere Untersuchungen eine Aktivierung und Beteiligung von Tyrosinkinasen der Src-Familie (SFTK) an der CCK-induzierten MAPK-Aktivierung gezeigt werden. Dabei stellte sich heraus, dass die CCK-induzierte Shc-Tyrosinphosphorylierung und die EGFR-Shc-Grb2-Komplexbildung im Rahmen der EGFR-Transaktivierung SFTK-abhängig sind. Im Gegensatz dazu ist die EGFR-Tyrosinphosphorylierung SFTK-unabhängig. Diese Daten zeigen, dass die CCK-induzierte Signalvermittlung des EGFR die gemeinsame Aktivierung von SFTK und EGFR benötigt. Neben der EGFR-Transaktivierung konnte im Rahmen der CCK-induzierten MAPK-Aktivierung ein weiterer Signaltransduktionsweg charakterisiert werden, welcher die Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) beinhaltet. Es konnte gezeigt werden, dass CCK in AR42J-Zellen eine Aktivierung der PKC-Isoformen alpha, delta und eta induziert. Eine Hemmung aller drei PKC-Isoformen führte zur Hemmung des MAPK-Signals, während die isolierte Hem-mung von PKC alpha und delta keine Effekte verursachte. Diese Resultate deuten darauf hin, dass PKCeta an der CCK-induzierten MAPK-Aktivierung beteiligt ist. Eine Beteiligung der PKC an der EGFR-Transaktivierung konnte nicht nachgewiesen werden. Demnach scheint der PKC-abhängige MAPK-Aktivierungsmechanismus parallel zum EGFR zu verlaufen und erst distal des EGFR mit dem EGFR/SFTK-abhängigen Signaltransduktionsweg zu konvergieren.
Isolierung und Charakterisierung der Atmungsketten-Superkomplexe aus Paracoccus denitrificans
(2004)
Isolierung von Atmungsketten-Superkomplexen aus Paracoccus denitrificans: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Reinigungsprotokoll zur Präparation der Atmungskettenkomplexe I, III und IV des Gram-negativen, fakultativ anaeroben Bodenbakteriums Paracoccus denitrificans in Form eines NADH Oxidase Komplexes erstellt. Bisher konnten stabile Superkomplexe bakterielle Atmungskettenkomplexe nur in Gestalt einer Chinol Oxidase, bestehend aus den Komplexen III (Ubichinol:Cytochrom c Oxidoreduktase) und IV (Cytochrom c Oxidase), isoliert werden (Berry, et al., 1985). Jedoch enthielten diese Assemblierungen keinen Komplex I (NADH: Ubichinon Oxidoreduktase). Dies ist die erste chromatographische Isolierung eines kompletten "Respirasoms" aus Paracoccus denitrificans. Unter der Verwendung des milden Detergenz Digitonin zur Solubilisierung von Paracoccus denitrificans Membranen gefolgt von zwei chromatographischen Reinigungsschritten, der Hydroxylapatit-Chromatographie und der Gelfiltration, konnte eine NADH Oxidase, bestehend aus den Komplexen I, III und IV in einer 1:4:4 Stöchiometrie isoliert werden. Neben der Isolierung der NADH Oxidase konnten weitere kleine Superkomplexe identifiziert werden, die aus vier Komplex III und vier Komplex IV (III4IV4) sowie vier Komplex III und zwei Komplex IV (III4IV2) assoziiert waren. Charakterisierung der Superkomplexe aus Paracoccus denitrificans: Die isolierten Atmungskettenkomplexe wurden zur Charakterisierung bezüglich ihrer Funktion, enzymatischen Aktivität, Stöchiometrie und Untereinheiten-Zusammensetzung aus Paracoccus denitrificans Wildtyp-Membranen analysiert. Proben aller Präparationsstufen wurden parallel zur BN-Gelelektrophorese und für enzymatische Einzel- und kombinierte Aktivitäten der Komplexe I-IV eingesetzt. Mittels BN-Gelelektrophorese konnten die apparenten Massen der Komplexe bestimmt werden. Im folgenden denaturierenden SDS-Gel wurde die Untereinheiten-Zusammensetzung der Superkomplexe durch Immunodetektion mit Antikörpern gegen die Komplexe I, III, IV und Cytochrom c552 analysiert. Abschließend konnte nach der Gelfiltration festgestellt werden, das Komplex II eindeutig nicht Teil des Superkomplexes (I1III4IV4) war. Die Stöchiometrie des Superkomplexes a wurde mit Hilfe der fluorimetrischen Bestimmung von FMN (Flavin) als Marker für Komplex I und mittels Pyridin Hämochromogen Spektren für Häm a, b und c bestimmt. Da Komplex III physiologisch als Dimer vorliegt (Mayer et al. 2002), müsste die Stöchiometrie der funktionellen Einheit des Superkomplex a folgendermaßen lauten: I1 (III2)2 IV4. In diesem Fall diente der Vergleich der Wechselzahl einzelner Präparationsstufen als Maß der Verunreinigung der ergab, dass Fremdkomplexe mit Flavin und Cytochrom b im Ausgangsmaterial der Präparation vorhanden waren. Nur die Wechselzahl des Komplexes IV blieb während der Präparation konstant. Um den Gehalt an Komplex I und die Qualität der Präparation abzuschätzen, wurde das Verhältnis der HAR zu dNADH:DBQ Oxidoreduktase Aktivität in Membranen und isoliertem Superkomplex a bestimmt. Es war während der Präparation konstant. Die Bestimmung des Phospholipidgehalts aus isoliertem Superkomplex a im Vergleich zu P. denitrificans Membranen ergab eine Abnahme von 980 ± 80 nmol PL / mg Protein in Membranen auf 290 ± 10 nmol / mg Protein in isoliertem Superkomplex a, wohingegen der Ubichinongehalt von 2,7 ± 0,3 nmol / mg auf 6,7 ± 0,8 nmol / mg in isolierter Oxidase anstieg. Katalytische Aktivitäten von P. denitrificans Membranen des Parentalstamms und verschiedener Mutantenstämme zeigten, dass die Inaktivierung des Gens für fest gebundenes Cytochrom c552 die Bildung eines Superkomplexes nicht verhindern konnte, was ein Hinweis dafür ist, dass dieses Elektronen Carrier Protein nicht essentiell für die strukturelle Verbindung zwischen den Komplexen III und KIV ist. Komplex I Aktivität wurde ebenfalls in Membranen von Mutanten-Stämmen, denen Komplex III oder Komplex IV fehlte, gefunden. Jedoch enthielten diese Stämme keinen assemblierten Komplex I, sondern nur dissoziierte Untereinheiten des Komplexes. Trotz der Verwendung der selben Protokolle für die elektrophoretische Trennung und chromatographische Isolierung wie für Superkomplexe aus dem Wildtyp-Stamm, führte die Isolierung aus Mutantenstämmen, denen Komplex III oder IV fehlte, zum vollständigen Verlust der NADH:DBQ Oxidoreduktaseaktivität. Dies weist darauf hin, dass Paracoccus denitrificans Komplex I durch die Assemblierung in Form eines NADH Oxidase Superkomplex stabilisiert wird. Zusätzlich zum Substrat Channeling scheint die strukturelle Stabilisierung von Membran Protein Komplexen die Hauptaufgabe von respiratorischen Superkomplexen zu sein.
Anthropogene Landnutzung in ariden Savannen verändert die strukturelle Diversität der Vegetation und bedroht damit die Artenvielfalt der Flora und Fauna von etwa 20% der Landoberfläche der Erde. Ziel meiner Dissertation war es, den Einfluss von Landnutzung auf die Abundanz und Diversität von Kleinkarnivoren und ihrer Beutetiere zu untersuchen. Dabei sollten Bioindikatoren identifiziert werden, die eine Einschätzung der Diversität im Farmmosaik der südlichen Kalahari ermöglichen. Entlang eines Weideintensitätsgradienten analysierte ich mit Hilfe freilandökologischer Methoden die komplexen Zusammenhänge zwischen Beweidungsintensität, struktureller Diversität der Vegetation, Beuteverfügbarkeit und Diversität von Kleinkarnivoren. Nach den Ergebnissen dieser Studie in der südlichen Kalahari kann ich folgende Aussagen über die anthropogene Störung der Integrität von ariden Savannensystemen durch Beweidung treffen: 1. Eine Steigerung der Bestockungsdichten von Weidetieren führte zu drastischen Veränderungen der Zusammensetzung und strukturellen Diversität der Vegetation. Dabei sank mit zunehmendem Beweidungsdruck der Anteil an Gräsern an der Vegetationsbedeckung bei gleichzeitigem Anstieg der Strauchvegetation. Die Heterogenität des Habitats, gemessen in Anzahl von Strauchpatches (ø>4m) pro Hektar, zeigte einen unimodalen Verlauf bei steigender Strauchbedeckung und damit bei steigender Weideintensität. Maximale Habitatheterogenität wurde bei einer Strauchbedeckung von ca. 20% festgestellt. 2. Die beobachteten Veränderungen der Vegetation wirkten sich sowohl auf Tierarten aus, die sich direkt von pflanzlicher Kost ernähren als auch auf solche am Ende einer Nahrungskette: Die Effekte zunehmender Strauchbedeckung (und damit steigender Beweidungsintensität) auf die relative Häufigkeit der wichtigsten Beutetiere von Kleinkarnivoren unterschieden sich zwischen den einzelnen Gruppen. Es bestand eine lineare negative Korrelation für Orthopteren, während unimodale Antwortmuster für Käfer mit maximaler Abundanz bei einer Strauchbedeckung von ca. 15% und für Nagetiere bei ca. 12,5% festgestellt wurden, wohingegen keine Korrelation für Termiten ermittelt werden konnte. 3. Am Beispiel der Nagetiergemeinschaft konnte die wesentliche Bedeutung der räumlichen Skala für das Auflösungsvermögen von Abundanz- und Diversitätsmuster gezeigt werden. Ihre Muster und damit die Auswirkungen von Beweidung wurden ausschließlich auf einer großen räumlichen Skala (250ha) identifiziert, nicht jedoch auf der Skala des mittleren Aktionsraums (1ha). Ein wichtiges Fazit dieser Ergebnisse ist, dass zuerst diejenige räumliche Skala identifiziert werden muss, auf der ein Organismus mit Habitatstrukturen (Z.B. geeigneten Nahrungsplätzen) interagiert, um die Effekte von Veränderungen der strukturellen Zusammensetzung von Habitaten verstehen zu können. Dabei führte steigende Grasbedeckung zu einer exponentiellen Sättigung der Gesamtabundanz sowie der Diversität der Nagetiere. Dagegen wurde bei Zunahme der Strauchbedeckung ein unimodales Muster für Gesamtabundanz und Diversität festgestellt. 4. Obwohl ein hoher Strauchanteil sich durchgehend negativ auf die Beuteverfügbarkeit auswirkte, haben Sträucher eine besondere Bedeutung für die Artenvielfalt in diesem Lebensraum, da sie als Schutz- und Nistplatz wichtige Funktionen erfüllen. Am Beispiel von Fuchsmangusten (Cynictis penicillata) konnte ich exemplarisch die zentralen Funktionen von Sträuchern und ihren Einfluss auf den Reproduktionserfolg dieser Art zeigen. Interessanterweise waren die Auswirkungen von Sträuchern inkonsistent für unterschiedliche räumliche Skalen. Im Mikrohabitat haben Strauchstrukturen positive Eigenschaften (Schutzfunktionen). Fuchsmangusten legten ihre Bauten meistens unter Sträuchern an, um ein Einstürzen durch Huftrampeln zu verhindern und ihr Prädationsrisiko durch Greifvögel zu reduzieren. Für die Anlage ihrer Reproduktionsbauten wählten sie Strauchstrukturen mit einem Durchmesser von mindestens sechs Metern (bevorzugt der Art Acacia hebeclada) und außerdem, wenn sich im Umkreis von 10 Metern kein weiterer Strauchpatch befand. Auf einer größeren räumlichen Skala (im Umfeld von einem Hektar um Reproduktionsbauten) wurden Flächen mit einer Strauchbedeckung präferiert, die geringer war, als zufällige Flächen im Habitat. Dabei wirkte sich zunehmende Strauchbedeckung auch negativ auf die Gruppengröße und den Reproduktionserfolg dieser Art aus. Für eine erfolgreiche Reproduktion bei Fuchsmangusten scheint die Strauchbedeckung im Umfeld von einem Hektar um die Reproduktionsbauten einen Schwellenwert zwischen 10 und 15% nicht überschreiten zu dürfen. Dies ist mit der sinkenden Beuteverfügbarkeit (Nagetiere und Arthropoden) bei zunehmender Strauchbedeckung zu begründen. 5. Aufgrund der dramatischen Auswirkungen von Verbuschung auf die Beuteverfügbarkeit von Kleinkarnivoren unterschieden sich die Abundanzen der einzelnen Kleinkarnivoren deutlich zwischen diesen Farmen. Die Abundanz der jeweiligen Einzelarten konnte über Regressionsmodelle mit Vegetationsparameter oder Beutetierverfügbarkeit erklärt werden. Im Gegensatz dazu war die Strauchbedeckung die beste erklärende Variable für Gesamtabundanz und Diversität der Gilde. Sie integriert habitatspezifische Eigenschaften, wie die Verfügbarkeit von vier Beutetiergruppen, die Konnektivität von Nahrungspatches mit hoher Qualität, das Prädationsrisiko durch Greifvögel sowie das Nistplatzangebot. Dabei sank mit zunehmender Strauchbedeckung die Gesamtabundanz, während für die Diversität ein unimodales Muster mit maximaler Diversität bei einer Strauchbedeckung von ca. 12,5% festgestellt wurde. Für eine Einschätzung der Diversität von Kleinkarnivoren eignet sich die Ginsterkatze (Genetta genetta) als Indikatorart. Interessanterweise war die Strauchbedeckung ein noch besserer Bioindikator für die Einschätzung der Diversität von Kleinkarnivoren. 6. Die Schlussfolgerung meiner Ergebnisse ist, dass die Diversität der Kleinkarnivoren einen Großteil der Biodiversität der Untersuchungsflächen in der südlichen Kalahari widerspiegelt. Dabei integriert die Kleinkarnivorengilde als Indikatorvariable neben der zoologischen Diversität (i) auch die strukturelle Diversität der Vegetation (ii) sowie die strukturelle Organisation im Nahrungsnetz (iii). Kleinkarnivoren erhalten dadurch einen Status einer Indikatorgilde und eignen sich damit sehr gut zur Beurteilung der südlichen Kalahari oder einer anderen Weidelandschaft arider Savannen. 7. Das für den Naturschutz wichtigste Ergebnis meiner Arbeit ist, dass höchste Diversität aller Untersuchungsorganismen bei einer Strauchbedeckung zwischen 10 und 15%, also einer mittleren Beweidungsintensität von ca. 3,5 LSU/ l00ha, festgestellt wurde. Daher wirken sich mäßige Bestockungsdichten durchaus positiv auf die Diversität aus, während eine Überbeweidung einen dramatischen Rückgang der Artenvielfalt in diesem Lebensraum verursacht.
Angiotensin II (ANG II), das physiologisch aktivste Produkt des Renin-Angiotensin-Systems (RAS), ist als ein Vasokonstriktor maßgeblich an der Modulation des Blutdrucks beteiligt. Darüber hinaus spielt das Octapeptid eine wichtige Rolle in der Freisetzung von Vasopressin und Hypophysenhormonen und reguliert den Flüssigkeits- und Salzhaushalt. Die Modulation des Blutdrucks sowie die Stimulation der Vasopressinfreisetzung werden über seine AT1-Rezeptoren vermittelt. Viele dieser physiologischen Funktionen zeigen eine klare Tag/Nacht-Variation. Der Nucleus suprachiasmaticus des Hypothalamus (SCN) repräsentiert den zentralen Schrittmacher der circadianen Uhr der Säugertiere und reguliert mitunter den Schlaf/Wach-Zyklus und den circadianen Rhythmus des Blutdrucks. Mit der Entwicklung eines transgen-hypertensiven Rattenstammes [TGR(mREN2)27], der über eine der Herzfrequenz und Aktivität entgegengesetzt phasenverschobene circadiane Rhythmik des Blutdrucks verfügt, konnte eine enge physiologische Beziehung zwischen ANG II und dem SCN aufgezeigt werden. Diese Hypertonie wird durch das zusätzliche und zudem noch übermäßig exprimierte Mäuse-Renin2-Gen im Zirkulations-RAS dieser Ratten verursacht. Die hieraus folgende übermäßige Bereitstellung von Renin im Blutkreislauf führt zu einer erhöhten Konzentration von ANG II im systemischen Kreislauf. Die Funktionswege, die zur phasenverschobenen circadianen Rhythmik des Blutdrucks bei TGR führen sowie die Rolle, die das Octapeptid ANG II generell in der Blutdruckmodulation bei normotensiven und transgen-hypertensiven Tieren spielt, sind noch weitgehend unbekannt. Es wird angenommen, dass das Gehirn-RAS über eine autonome ANG II-Synthese Einfluss auf die Modulation des Blutdrucks ausübt. Ob dieser Einfluss des Gehirn-RAS direkt am zentralen Schrittmacher der circadianen Rhythmik ansetzt und ob und wie sich dieser Einfluss durch das Transgen der TGR verändert, ist ebenfalls nicht bekannt. Um die Wirkung des im Blutkreislauf übermäßig vorhandenen ANG II auf Komponenten des Gehirn-RAS in Hirnarealen vor und hinter der funktionellen Blut/Hirn-Schranke auf zuzeigen, wurden im Verlauf dieser Arbeit der SCN sowie zwei Zirkumventrikularorgane von normotensiven Sprague-Dawley (SDR) und transgen-hypertensiven TGR(mREN2)27 (TGR) Ratten auf die Dichte und Verteilung ihrer AT1-Rezeptoren hin überprüft. Da die physiologische Rolle von ANG II im SCN selbst auch ungeklärt ist und ultrastrukturelle Befunde zur Lokalisation des Octapeptids und seiner AT1-Rezeptoren im SCN bisher nicht verfügbar sind, wurde in dieser Dissertationsarbeit eine immunhistologische Technik entwickelt, mit deren Hilfe sich Immunreaktionen gegen das Octapeptid ANG II und seine AT1-Rezeptoren auf licht- und elektronenmikroskopischer Ebene darstellen lassen. Die hier beschriebenen Befunde machen den Einfluss des Transgens - vermittelt durch die erhöhte ANG II-Konzentration im Blutkreislauf von TGR - auf Veränderungen in Dichte und Verteilung der AT1-Rezeptoren in Hirnarealen vor und hinter der funktionellen Blut/Hirn-Schranke deutlich. AT1-Rezeptoren erscheinen in Hirnarealen mit offenem Kapillarsystem reduziert, im SCN dagegen unverändert und in anderen Regionen mit funktioneller Blut/Hirn-Schranke teilweise erhöht. Lokal begrenzte Veränderungen in der Bereitstellung der AT1-Rezeptoren innerhalb einzelner Kerngebiete hängen maßgeblich von deren topographischer Organisation ab, die bei bisherigen autoradiographischen- und Ligand-Bindungs-Studien jedoch keine Berücksichtigung fand. Die hier vorliegende Arbeit demonstriert erstmalig, dass ANG II im SCN als ein Neurotransmitter und -Modulator fungiert, dessen Effekte über seinen AT1-Rezeptor vermittelt werden. Der Rezeptor vermittelt des Weiteren auch den aktiven - vermutlich bidirektionalen - Transport von ANG II durch die Kapillarendothelien des SCN und ist an der Aufnahme von ANG II (Endozytose) und dessen intrazellulären Transport in einem Hormon/Rezeptor-Komplex in Neuronen, Glia- und Endothelzellen im SCN beteiligt. Die Befunde machen darüber hinaus eine Synthese von ANG II in distinkten Neuronen des SCN wahrscheinlich und deuten an, dass autonom produziertes ANG II im SCN an der Regulation des Blutdrucks und der Freisetzung von Vasopressin beteiligt ist.
Der CD95 Ligand (CD95L, FasL) ist ein Mitglied der Tumor-Nekrose-Faktor(TNF)- Superfamilie und ist in der Lage, Apoptose oder -unter bestimmten Bedingungen- Proliferation in CD95 Rezeptor-positiven Zellen auszulösen. Zusätzlich überträgt der CD95 Ligand aber auch als Rezeptor Signale in die ligandentragende Zelle, ein Phänomen, das auch bei anderen TNF-Familienmitgliedern beobachtet und als "reverse signalling" bezeichnet wird. Diese reverse Signalübertragung bewirkt in T-Zellen ein costimulatorisches Signal, welches zur vollständigen Aktivierung nach Antigen-Erkennung durch den T-Zellrezeptor (TZR) benötigt wird und über bisher unbekannte Adaptorproteine stattfindet, die vermutlich an den intrazellulären Anteil des CD95L binden. Die zytoplasmatische CD95L-Domäne ist auf Primärsequenzebene stark konserviert und besitzt eine prolinreiche Proteininteraktionsdomäne sowie eine Casein Kinase I Phosphorylierungsstelle, welche sich auch im intrazellulären Bereich des membrangebundenen TNFalpha findet und bei diesem Protein für die reverse Signalübertragung essentiell ist. Eine weitere Funktion des CD95L ist der Transport des Liganden zu einem speziellen Typ von Lysosomen in NK- und zytotoxischen T-Zellen. Hierfür ist die prolinreiche Region in der CD95L-intrazellulären Domäne wichtig. In diesen sekretorischen Lysosomen wird der CD95L gespeichert, bis er nach einem TZR-vermittelten Signal an die Zelloberfläche transportiert wird und dort mit dem CD95 Rezeptor der Ziel- Zellen interagieren kann. In der vorliegenden Arbeit wurde zur Aufklärung der oben beschriebenen Funktionen des CD95 Liganden ein Hefe-2-Hybrid Screen mit der intrazellulären CD95L-Domäne als Köder durchgeführt. Mit dieser Methode war es möglich, mehrere potentielle Interaktionspartner zu identifizieren. Eines dieser Proteine, FBP11, wurde schon zuvor als "human fas ligand associated factor" in der Datenbank veröffentlicht. Der HMG-Box-Transkriptionsfaktor Lef- 1, das Formin-bindende Protein FBP11, das thymozytenspezifische Protein TARPP und das Adaptorprotein PSTPIP ("proline serine threonin phosphatase interacting protein")/ CD2BP1 ("CD2 binding protein") interagierten in vitro in einem GST-Pulldown-Experiment mit der intrazellulären Domäne des CD95 Liganden. Mit Hilfe von Co- Immunpräzipitationsstudien und Co-Lokalisierungsexperimenten konnte die Interaktion von überexprimiertem CD95L und PSTPIP auch in vivo bestätigt werden. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass diese Interaktion über eine nicht näher eingegrenzte Aminosäuresequenz in der prolinreichen Region des CD95L mit der SH3-Domäne des PSTPIP-Proteins realisiert wird. Die Phosphatase PTP-PEST bindet an einen Bereich der PSTPIP-Coiled-coil-Domäne, und es besteht die Möglichkeit, dass CD95L, PSTPIP und PTPPEST in der Zelle als ternärer Komplex vorliegen, in welchem der Phosphorylierungsstatus von PSTPIP und CD95L durch PTP-PEST reguliert wird. Wie die gleichzeitige Expression von PSTPIP die Oberflächenexpression von CD95L beeinflusst, war ein weiterer Untersuchungsgegenstand dieser Arbeit. Es konnte festgestellt werden, dass bei Überexpression von PSTPIP weniger CD95L auf der Oberfläche nachgewiesen wird. Interessanterweise wurde auch weniger Apoptose durch den CD95L ausgelöst, sobald PSTPIP überexprimiert wurde. Neben den Untersuchungen zur Interaktion von CD95L und PSTPIP (sowie PTP-PEST) wurden auch funktionelle Studien zur reversen Signalübertragung des CD95L durchgeführt. Sowohl in CD4- als auch in CD8-einzelpositiven frisch isolierten Maus-T-Zellen wurde ein co-stimulatorisches Signal nach suboptimaler TZR-Stimulation über CD95L beobachtet, was sich in verstärkter Proliferation und erhöhter Expression von Aktivierungsmarkern wie CD25 äußerte. Außerdem führt die Stimulation des CD95 Liganden zu einer transienten p42/p44-MAPK-Phosphorylierung, die durch Co-Expression von PSTPIP jedoch nicht beeinflusst wird. Die MAPK-Signalkaskade führt zur Zellproliferation und könnte daher eine wichtige Rolle in der CD95L-vermittelten Co- Stimulation spielen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte auch zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Lokalisation des CD95L in Lipid Rafts (Mikrodomänen der Zellmembran) wichtig für dessen apoptoseauslösendes Potential ist, da die Behandlung CD95L-positiver Zellen mit Substanzen, die Cholesterol entfernen und so Rafts zerstören, zur Inhibition der Apoptoseinduktion führt. Die Lokalisation sowohl des CD95 Rezeptors als auch des CD95 Liganden in unterschiedlichen Kompartimenten der Zellmembran könnte beide Moleküle voneinander abschirmen und so autokrine Apoptosemechanismen verhindern. Dadurch wird eine weitere Möglichkeit der Regulation der durch CD95L induzierten Apoptose realisiert.
Tunikaten produzieren eine Vielzahl an cytotoxischen und antimikrobiellen Verbindungen, die ihnen in ihrem Ökosystem zu überlebenswichtigen Vorteilen verhelfen. Wegen ihrer strukturellen Diversität und ihrer spezifischen Eigenschaften haben bislang einige dieser Sekundärstoffe Eingang in die pharmazeutische Industrie gefunden. Ziel der vorliegenden Arbeit war eine umfassende Untersuchung des chemischen Potentials benthischer Ascidien der Nordsee. Die Eigenschaften der organischen Ascidienextrakte wurden anhand von vier Bioassays beschrieben. Die Assays fungierten gleichzeitig als Wegweiser zur Isolierung der aktiven Sekundärmetaboliten, der sich eine Strukturaufklärung mit spektroskopischen Methoden (NMR, MS, IR) anschloss. Es wurden Tests auf bewuchshemmende, antimikrobielle, cytotoxische und enzymhemmende Eigenschaften durchgeführt. Eingesetzt wurden organische Extrakte von 13 solitären und koloniebildenden Ascidienarten der nördlichen und südlichen Nordsee. In allen vier Assays zeigten mehrere oder alle Ascidienarten Aktivität. Es ließen sich keine Hinweise auf eine mit der Wuchsform der Arten korrelierte biologische Aktivität sammeln. In einem Freilandversuch zur Untersuchung der besiedlungshemmenden Wirkung der Extrakte konnte gezeigt werden, dass einige Ascidien eine chemische Abwehr von Algensporen oder Epibionten aufweisen, die artspezifisch unterschiedlich stark ausgeprägt ist. Alle Ascidienarten bewiesen antimikrobielle Aktivität, es ergaben sich aber sowohl in der Hemmhofbreite als auch in der Anzahl der gehemmten Bakterienstämme große artspezifische Unterschiede. Auffallend war, dass deutlich mehr Gram-positive sowie marine Bakterienstämme als Gram-negative bzw. nicht-marine Bakterienstämme inhibiert wurden. Im Gegensatz zur antimikrobiellen Aktivität wurden in den Assays zur Cytotoxizität und zur spezifischen Enzymhemmung lediglich bei jeweils vier Ascidienarten positive Effekte festgestellt. Durch die spezifische Anfärbung von Zellorganellen konnten morphologische Veränderungen, die durch die Ascidienmetaboliten in den Mausfibroblasten induziert wurden, sichtbar gemacht und der Einfluß der Extrakte auf das Cytoskelett und spezifische Zellfunktionen dokumentiert werden. Im Protein-Tyrosin-Kinase-Assay führte eine Bioassay-guided Fractionation von Extrakten der Ascidie Dendrodoa grossularia zur Isolierung der aktiven Substanz. Über spektroskopische Methoden sowie den Vergleich mit Literaturdaten konnte der enzymhemmende Metabolit als das Guanidinostyren Tubastrin identifiziert werden. Tubastrin wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals in Tunikaten nachgewiesen. Der Metabolit zeigte als Reinsubstanz nur geringe cytotoxische Effekte und keine antimikrobiellen Eigenschaften. Als weitere Metaboliten der Ascidien Dendrodoa grossularia und Ascidiella aspersa wurden Homarin, Betain, Adenosin und Inosin identifiziert. Keiner dieser Substanzen konnte in der vorliegenden Arbeit eine biologische Aktivität zugeordnet werden. Während Betain, Adenosin und Inosin Funktionen innerhalb des Primärmetabolismus besitzen oder als Zwischenprodukte in Synthesewege eingebunden sein können, stellt Homarin einen Sekundärmetaboliten dar, der in einer Vielzahl von marinen Organismen unterschiedliche Funktionen erfüllt. Seine Aufgabe in Tunikaten muss durch weitere Untersuchungen geklärt werden. Dass antimikrobielle Aktivität bei allen Ascidienarten gefunden wird, lässt auf eine grundlegende Bedeutung prokaryontischer Abwehr schließen. Die Unterschiede in der Stärke der Effekte aller Bioassays legen nahe, dass jede Ascidienart eine eigene Gesamtstrategie zur Verteidigung gegen Bewuchs und Fraßfeinde ausgebildet hat. Die aus den Laborversuchen erhaltenen Daten verdeutlichen eine weitreichende biologisch-chemische Aktivität von Aplidium punctum, Dendrodoa grossularia und Didemnum candidum, die neben der antimikrobiellen auch starke cytotoxische und/oder enzymhemmende Wirkung gezeigt haben. Die Lokalisation der aktiven Substanzen im Tier sowie eingehendere Versuche zur molekularen Wirkungsweise sind notwendig, die beobachteten Aktivitäten umfassend zu deuten und ihre Nutzbarkeit unter pharmakologischen Gesichtspunkten zu evaluieren.
Die in vivo MR-Protonenspektroskopie (1H-MRS) ist ein nichtinvasives Verfahren, das die Untersuchung biochemischer Substanzen beim Lebenden ermöglicht. In einer prospektiven Studie wurden Patienten, die an einer Demenz vom Alzheimer-Typ (DAT) litten, und altersentsprechende Probanden mit der 1H-MRS untersucht. Im Hirngewebe wurden Konzentrationen von Molekülen bestimmt, die Aussagen über die zelluläre Zusammensetzung ermöglichen. Das Hauptinteresse galt der Untersuchung von Glutamat und Glutamin, da ein Überangebot des Neurotransmitters Glutamat im synaptischen Spalt möglicherweise für die Neurodegeneration beim M. Alzheimer mitverantwortlich ist. Bei 29 Patienten mit einer DAT sowie 19 Probanden wurden zwei Volumina in Kortex und Marklager des Parietallappens bei 1,5 Tesla Magnetfeldstärke mit einer PRESS-Sequenz (TE = 22 ms, TR = 3 s) untersucht. Die Patienten waren kognitiv leicht bis mittelschwer beeinträchtigt (Mini Mental State Examination, MMSE, 11-27 Punkte). Die quantitative Auswertung der Spektren erfolgte nach der "phantom replacement method" mit dem Softwareprogramm LCModel. Als Kriterium für die Zuverlässigkeit der Konzentrationsangaben diente die vom Programm als %SD-Wert angegebene Auswertegenauigkeit der Einzelmessungen. Neben dem Glutamat- und Glutamingehalt wurden der Liquorgehalt im kortikalen Messvolumen und die Konzentrationen der Moleküle N-Acetyl-Aspartat und N-Acetyl-Aspartyl- Glutamat (tNAA), myo-Inositol (mI), Kreatin und Kreatinphosphat (tCr) sowie der cholinhaltigen Substanzen (tCh) bestimmt. Bei den Patienten konnten 25 aussagekräftige Spektren aus der Rindenregion und 19 aus dem Marklager des Parietallappens gemessen werden, bei den Probanden 17 Kortex- und 13 Marklager-Spektren. Glutamat und Glutamin können mit der in vivo-Spektroskopie wegen ihrer sich überlappenden Resonanzen nicht separat bestimmt werden und wurden deshalb als „Glx“ zusammengefasst. Der Glx-Gehalt betrug in der Rindenregion bei den Patienten im Durchschnitt 15,48 ± 5,15 mmol/l, bei den Probanden 13,98 ± 3,14 mmol/l. Die um 11% höhere Konzentration bei den Patienten war nicht signifikant. Die Glx-Konzentrationen im Marklager betrugen 8,16 ± 3,79 mmol/l bei den Patienten und 8,14 ± 3,71 mmol/l bei den Probanden. Nach dem Kriterium der %SD war die Zuverlässigkeit der Konzentrationsbestimmung von Glutamat und Glutamin eingeschränkt, was auf die protonenspektroskopischen Eigenschaften von Glutamat und Glutamin zurückzuführen ist. Sie erzeugen wegen ihrer gekoppelten Resonanzen breite und mehrgipflige Protonensignale, die wegen der resultierenden niedrigen Signalamplitude für LCModel von Makromolekülresonanzen oder von Artefakten, die durch ungenügende Wasserunterdrückung entstehen, schwierig abzugrenzen sind. Die %SD-Werte der Einzelmessungen von tNAA, mI, tCr und tCh waren gering, die Messergebnisse können daher als zuverlässig angesehen werden. Die tNAA-Konzentrationen in beiden Gruppen unterschieden sich weder in der grauen noch in der weißen Substanz signifikant voneinander. Im Hirnrindenvolumen zeigte sich bei den Patienten jedoch eine positive Korrelation von tNAA und MMSE-Ergebnis, also eine Reduktion von tNAA mit zunehmenden kognitiven Einbußen. Dies spricht für eine Abnahme des neuronalen Volumenanteils mit fortschreitender Erkrankung. Der durchschnittliche myo-Inositolgehalt im Marklagervolumen lag in der Patientengruppe um 20% höher als bei den Probanden. Der Unterschied erreichte jedoch kein Signifikanzniveau (p = 0,09). Im Rindenvolumen war die mittlere myo-Inositolkonzentration bei den Patienten um 7% höher als in der Kontrollgruppe, auch hier war der Unterschied nicht signifikant. Der nichtsignifikante myo-Inositolanstieg lässt sich als mäßige entzündliche oder reaktive Gliaproliferation interpretieren. Die tCr-Konzentrationen in beiden Gruppen unterschieden sich nicht, jedoch bestand bei den DAT-Patienten eine positive Korrelation des tCr-Gehalts mit der MMSE-Punktzahl in der grauen Substanz des Parietallappens, die Konzentration nahm also mit zunehmendem Schweregrad der Demenz ab. Bei der durchschnittlichen tCh-Konzentration bestanden keine Gruppenunterschiede in den untersuchten Regionen. Die Patienten wiesen eine signifikante Zunahme des mittleren Liquoranteils um 16% im kortikalen Volumen auf. Dies ist als kortikale Hirngewebeatrophie in frühen und mittleren Stadien der DAT zu werten. Während die in vivo-Konzentrationen von tNAA, mI, tCr und tCh zuverlässig bestimmt werden konnten, war die Messung von Glutamat und Glutamin bei 1,5 T mit technischen Schwierigkeiten verbunden. Wegen der hohen Standardabweichungen konnte aus dieser Untersuchung keine gesicherte Aussage zu einer möglichen Konzentrationsänderung dieser Aminosäuren bei der DAT abgeleitet werden. Es ist zu erwarten, dass hier durch MR-Geräte mit 3 T Feldstärke sowie durch den Einsatz der parallelen Bildgebung ein erheblich höheres Signal/Rausch-Verhältnis und damit genauere Ergebnisse erzielt werden können.
In der vorliegenden Arbeit beschäftigen wir uns mit der Verallgemeinerung des Satzes von Belyi [B]. Dieser besagt, dass eine Riemannsche Fläche Y genau dann als algebraische Kurve über einem Zahlkörper definiert ist, wenn es auf Y eine nicht-konstante holomorphe Funktion gibt, die über höchstens drei Punkten verzweigt. Die Arbeit gliedert sich in zwei Teile. Wir untersuchen darin jeweils die Verallgemeinerung einer der beiden Implikationen aus dem Satz von Belyi auf Varietäten der Dimension zwei und höher. Im ersten Teil der Arbeit zeigen wir, dass eine n-dimensionale projektive komplex algebraische Varietät über einem Zahlkörper definiert ist, falls sie den Pn (oder eine beliebige projektive über Q definierte Varietät) endlich und höchstens über einem rationalen Divisor verzweigt überlagert. Dazu beschreiben wir im ersten Kapitel den Zusammenhang zwischen Varietäten und komplex analytischen Räumen. Wir zeigen, dass die Kategorie der endlichen algebraischen Überlagerungen einer projektiven komplexen Varietät äquivalent zur Kategorie der endlichen verzweigten analytischen Überlagerungen des assoziierten komplex analytischen Raumes ist. Außerdem erläutern wir den Zusammenhang zwischen topologisch unverzweigten Überlagerungen und deren Algebraisierung, den étalen Morphismen zwischen Varietäten. Im zweiten Kapitel führen wir Definitionskörper und Modulkörper von Varietäten ein. Anschließend untersuchen wir die Operation von Körperautomorphismen s E Aut (C/Q) auf komplexen Varietäten. Im dritten Kapitel zeigen wir zunächst, dass der Modulkörper einer endlichen Überlagerung eines geeigneten Grundraumes ein Zahlkörper ist. Danach stellen wir das Resultat von Derome [D] vor, nachdem es einen Definitionskörper im algebraischen Abschluss des Modulkörpers gibt. Daraus folgern wir die Verallgemeinerung dieser Richtung des Satzes von Belyi. Im zweiten Teil beschäftigen wir uns mit der Frage, wie der Verzweigungsdivisor D im Pn aussehen sollte, damit jede über Q definierte Varietät ein Modell besitzt, dass Pn endlich und nur über D verzweigt überlagert. Im vierten Kapitel stellen eine Heuristik zur Korrespondenz zwischen topologischen Überlagerungen und Körpererweiterungen von Q vor. Daraus leitet sich folgende Vermutung ab: Zu jeder über einem Zahlkörper definierten n-dimensionalen Varietät Y gibt es eine birational äquivalente normale Varietät Y und einen Morphismus f : Y -> Pn, der nur über dem Komplement von M0,n+3 verzweigt. Die Vermutung steht im Einklang mit dem eindimensionalen Satz von Belyi. Alle Modulräume erfüllen die Voraussetzung für die im dritten Kapitel bewiesene Umkehrung. Im letzten Kapitel beschäftigen wir uns mit komplex algebraischen Flächen. Wir zeigen, dass die Vermutung aus dem vierten Kapitel für abelsche Flächen richtig ist. Dieses Ergebnis haben wir gemeinsam mit Horst Hammer (Karlsruhe) erzielt. Anschließend geben wir einen Überblick über weitere Resultate in dieser Richtung. Schließlich beschreiben wir die topologischen Überlagerungen von M0,5 und stellen eine Verallgemeinerung der Dessins d'Enfants vor.
Die thrombotisch thrombozytopenische Purpura (TTP) ist ein schweres, heterogenes Syndrom, bei welchem es zu einer lebensbedrohlichen, disseminierten Mikrothrombosierung in den arteriellen Kapillaren kommt. Bei Patienten mit TTP wurde 1997 erstmalig ein Mangel an der Von Willebrand Faktor (VWF)-spaltenden Protease entdeckt. Diese Protease wurde 2001 als ein neues Mitglied der "a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs"-Familie identifiziert und als ADAMTS-13 bezeichnet. Der ADAMTS-13-Mangel soll eine Anreicherung großer VWF-Multimere verursachen, welche für die pathologische Thrombenbildung bei Patienten mit TTP verantwortlich gemacht wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zunächst ein neuartiges Verfahren zur Bestimmung der ADAMTS-13-Aktivität entwickelt. Mittels des neuen Verfahrens wurde die Bedeutung von ADAMTS-13 in der Pathophysiologie der erworbenen TTP und in der Genese anderer Erkrankungen untersucht. Bei der hier entwickelten Methode wird eine beliebige Testprobe mit einem ADAMTS-13-freien VWF-Substrat versetzt und nach entsprechender Inkubation die ADAMTS-13-Aktivität ermittelt, indem der Abfall der VWF-vermittelten Aggregation von Thrombozyten gemessen wird. Das neuartige Verfahren zeigt eine gute Reproduzierbarkeit und wurde durch extensiven Vergleich mit der herkömmlichen Immunoblotting-Methode validiert. Zudem wurde die Richtigkeit der Methode durch erfolgreiche Teilnahme an einer internationalen Multicenterstudie bestätigt. Die neue Methode ist im Gegensatz zu den herkömmlichen Verfahren im klinisch-diagnostischen Routinelabor anwendbar, da das Verfahren auf der Verwendung eines routineerprobten, automatisierten Testes zur Bestimmung der VWF:Ristocetin-Kofaktor-Aktivität beruht. Der Test ist bei hohem Probendurchsatz schnell und einfach durchführbar und benötigt keine spezielle Laborausrüstung oder besondere Expertise. In den untersuchten Patientenkollektiven war der schwere ADAMTS-13-Mangel mit einer Spezifität von 100% und einer Sensitivität von 89% mit einer akuten TTP korreliert. Bei 85% der Plasmaproben mit hochgradig erniedrigter ADAMTS-13-Aktivität konnte in vitro eine inhibitorische Aktivität gegen ADAMTS-13 detektiert werden. Die Plasmapherese-Therapie (PP-Therapie) führte in 75% der untersuchten TTP-Episoden zu einer letztendlichen Eliminierung des Inhibitors mit einer korrespondierenden Erhöhung der ADAMTS-13-Aktivität. Der Anstieg der ADAMTS-13-Aktivität war in diesen Fällen eng mit dem Anstieg der Thrombozyten assoziert. In 15% der untersuchten Episoden führte die PP-Therapie zu einer Erniedrigung des Inhibitortiters ohne messbare Rekonstitution der ADAMTS-13-Aktivität. Bei 10% der untersuchten Episoden kam es unter PP-Therapie zu einem permanenten Anstieg des Inhibitortiters. Trotz fehlender Rekonstitution der ADAMTS-13-Aktivität in den letztgenannten Fällen induzierte die PP-Therapie eine klinische Remission. Zwei Patienten zeigten nach Splenektomie bzw. Rituximab-Gabe ohne nachweisbare Rekonstitution der ADAMTS-13-Aktivität ebenfalls eine konsistente, klinische Remission. Die Ergebnisse zeigen, dass die in vitro gemessene ADAMTS-13-Aktivität die pathophysiologisch wirksamen Prozesse der akuten TTP nicht immer eindeutig erklären. Dies weist auf bislang unentdeckte pathogene Mechanismen hin. Zudem könnten die derzeit gängigen Methoden zur Bestimmung der ADAMTS-13-Aktivität (einschließlich des hier entwickelten Verfahrens) die tatsächliche in vivo VWF-Proteolyse durch ADAMTS-13 nicht ausreichend widerspiegeln. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass ein ADAMTS-13-Mangel als ein Risikofaktor, und nicht als der alleinige Auslöser, für die akute TTP betrachtet werden sollte. Die Bestimmung der ADAMTS-13-Aktivität bei den unterschiedlichsten hämatologischen Erkrankungen offenbarte eine moderat erniedrigte ADAMTS-13-Aktivität in einer Vielzahl von schweren, zumeist intensivpflichtigen Erkrankungen. Bei einigen Patienten konnte nachgewiesen werden, dass sich die ADAMTS-13-Aktivität in Remission normalisiert. Daraus lässt sich möglicherweise vermuten, dass sich die ADAMTS-13-Aktivität generell bei einer Akut-Phasen-Reaktion erniedrigt. Die Untersuchungen der ADAMTS-13-Aktivität bei Patienten mit malignen Erkrankungen zeigte bei 21% der getesteten Patienten einen milden ADAMTS-13 Mangel. Bei den untersuchten Patienten mit Hirn- und Prostatatumoren konnte, im Gegensatz zu vorhergehenden Studien mit anderen Tumortypen, keine Korrelation zwischen erniedrigter ADAMTS-13-Aktivität und dem Grad der Malignität bzw. der Dissemination des Tumors gefunden werden. Die Bestimmung der ADAMTS-13-Aktivität bei einem umfangreichen Patientenkollektiv mit thromboembolischen Erkrankungen zeigte, dass der ADAMTS-13 Mangel kein häufig vorkommender Risikofaktor für das Auftreten von arteriellen oder venösen Thrombosen darstellt. In der vorliegenden Studie wurde jedoch der weltweit erste Fall eines milden, congenitalen ADAMTS-13 Mangels bei einer Patientin mit familiären, rezidivierenden, ischämischen Schlaganfällen gefunden. Zusammenfassend wurde in der vorliegenden Arbeit ein neuartiges Verfahren zur Bestimmung der VWF-spaltenden Proteaseaktivität von ADAMTS-13 entwickelt, welchem durch seine klinische Anwendbarkeit in Zukunft eine weitreichende Bedeutung zufallen könnte. Die klinischen Studien dieser Arbeit belegen zum einen den Zusammenhang zwischen ADAMTS-13 und TTP und weisen zum anderen auf andere bislang nicht identifizierte Mechanismen hin, welche das klinische Bild der TTP determinieren. Des weiteren konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass ADAMTS-13 neben einer Beteiligung an der Akut-Phasen-Reaktion, eine möglicherweise sehr bedeutsame Rolle bei malignen und thromboembolischen Erkrankungen spielt. Dies sollte in zukünftigen Studien, insbesondere im Hinblick auf neuartige therapeutische Möglichkeiten durch die Gabe von ADAMTS-13, näher untersucht werden.
Katheterverschluß des Vorhofseptumdefektes unter besonderer Berücksichtigung der Langzeitergebnisse
(2004)
Zwischen 5/93 und 12/1999 wurde bei 166 Patienten mit einem ASD vom Sekundum-Typ und bei 178 Patienten mit persistierendem Foramen Ovale versucht, den intreratrialen Defekt transfemoral zu verschließen. Dies gelang bei 156 Patienten mit ASD (Erfolgsquote 94%) und bei allen Patienten mit PFO. Dabei wurden ASDOS-, Buttoned Device-, Angelwing-, CardioSeal- , Amplatzer- , Starflex-, und Helex-Okkluder verwendet. In dieser Arbeit sollen die Akutergebnisse und insbesondere der Langzeitverlauf nach diesen Verschlüssen dokumentiert werden. Das Alter der 115 weiblichen und 51 männlichen Patienten mit ASD betrug im Mittel 47,1 ± 17 (13 – 77) Jahre, das der 97 weiblichen und 91 männlichen Patienten mit PFO 46 ± 13 (17 – 75) Jahre. Die Defektgröße der ASD im transösophagealen Echokardiogramm betrugen 14,1 ± 6,7 (3,4 - 29,4) mm (n=117). Mittels Ballonpassage gemessen betrugen sie 20,6 ± 5,3 (6 – 35) mm (n=150), der Stretched diameter betrug 17,6 ± 4,7 (7 – 29) mm (n=97). Die Defektgröße der PFO betrug 12,3 ± 3,3 (4 – 24) mm (Ballonpassage n=173) bzw. 8,9 ± 3,1 (3 – 20) mm (Stretched diameter n=122). Bei 130 Patienten (78,3%) mit ASD gelang der Verschluß im ersten Versuch. Bei 9 (5,4%) waren mehrere Versuche in einer Sitzung nötig, bei 6 (3,6%) führte erst eine zweite Sitzung zum Erfolg. Bei 6 (4,6%) wurde ein zweiter Okkluder implantiert. Insgesamt konnten 156 Patienten (94%) erfolgreich transfemoral behandelt werden. Bei 10 Patienten (6 %) gelang der transfemorale Verschluß nicht. Der Verschluß des PFO war bei allen Patienten erfolgreich. Bei 179 der 188 Patienten (95,2%) gelang der Verschluß im ersten Versuch. Bei 4 Patienten (2,1%) waren mehrere Versuche in einer Sitzung nötig, bei 2 Patienten (1,1%) führte erst die zweite Sitzung zum Erfolg. Bei 2 Patienten (1,1%) wurde aufgrund von Restshunt ein zweiter Okkluder implantiert. Der Nachbeobachtungszeitraum betrug im Mittel bei den ASD-Patienten 23,7 und bei den PFO-Patienten 21,3 Monate. Bei den 101 ASD-Patienten, bei denen sowohl vor, als auch nach dem Eingriff das Shuntvolumen bestimmt wurde, sank das Verhältnis von Qp/Qs signifikant von 2 ± 0,5 auf 1,1 ± 0,3 (p<0,001). Im TEE war 6 Monate nach dem Defektverschluß (n=121) bei 77,7% der Patienten kein Shunt mehr feststellbar, bei 8,3% war ein sehr kleiner Shunt (<2 mm) und bei 14,1% ein Shunt >2 mm vorhanden. Jedoch hatten 51,9% der Patienten, bei denen ein Restshunt vorlag, mehr als einen Defekt. Es traten in den ersten 6 Monaten folgende Komplikationen auf: Embolie bei Vorhofflimmern (n=1), Dislokation des Okkluders (mit operativer Entfernung) (n=1), Perforation des Vorhofs durch den Schirm (n=1), retroperitoneale Blutung (n=1), Synkopen bei älterer Patientin (n=1). Die Komplikationsrate betrug 7,7%. Im Langzeitverlauf gab es folgende Komplikationen: Mitralinsuffizienz (n=1), Dislokation des Okkluders (n=2), Hirnstamminsult bei intaktem Okkluder ohne Restshunt (n=1), Hörsturz (n=1), Thrombus (n=1). Die Komplikationsrate betrug 1,6% pro Jahr. Bei den Patienten mit PFO ereigneten sich in den ersten 6 Monaten an Komplikationen Rezidivinsulte (n=3), davon 1 mit Dislokation des Okkluders und Infektionen (n=1). Die Rate an Komplikationen betrug in dieser Zeit 4,3% pro Jahr. Die Rate an Rezidiven betrug 3,2%. Im Langzeitverlauf zeigten sich an Komplikationen Rezidivinsulte bei intaktem Okkluder ohne Restshunt (n=2) und Blutungen (n=1). Die Rezidivrate betrug im gesamten postinterventionellen Verlauf 1,5% pro Jahr.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob eine Zellzyklusabhängigkeit der CD95- vermittelten Apoptose besteht. Dazu wurde ein ecdysoninduzierbares Genexpressionsystem für die induzierte Überexpression der CDK-Inhibitoren p21 und p27 in RKO-Zellen (Kolonkarzinomzellen) zur Herbeiführung eines Zellzyklusarrests in der G1-Phase benutzt. Nach Induktion mit dem Ecdysonhomolog Muristeron wurde durch Zugabe von rekombinanten hCD95-Liganden Apoptose ausgelöst und anschließend untersucht. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass der Induktor Muristeron an sich und nicht die p21- bzw. p27-Überexpression die anti-apoptotische Akt-Kinase aktiviert, die Expression des anti-apoptotischen Bcl-xL erhöht, die Caspase-8-Aktivierung (entweder am CD95-DISC oder durch "Feedback"-Aktivierung durch Caspase-3) und die darauf folgenden Ereignisse verhindert und somit die hCD95L-induzierte Apoptose blockiert. Zusätzlich beeinflusst der Induktor auch das Genexpressionsmuster der behandelten Zellen, was ebenfalls für die Hemmung der Apoptose mit verantwortlich sein könnte. Somit ist das ecdysoninduzierbare Genexpressionsystem zur Apoptoseuntersuchung in RKO-Zellen nicht verwendbar. Mit der Untersuchung des Apoptoseverhaltens proliferierender RKO-Zellen konnte gezeigt werden, dass überlebende Zellen nach hCD95L-Behandlung vermehrt in der G0/G1-Zellzyklusphase nachweisbar sind, während apoptotische (Caspase-3-positive) Zellen aus der G2/M-Phase heraus sterben. Allerdings weisen die apoptotischen Zellen kaum Cyclin B1 auf, ein für die G2-Phase wichtiges und typisches Cyclin. Somit bleibt die genaue Verknüpfung von Zellzyklusregulation und Apoptose auch nach diesen Analysen ungeklärt. In einem dritten Ansatz - Zellzyklusarrest durch Dichtearretierung - konnte eine Hemmung der CD95- vermittelten Apoptose in der arretierten Zellpopulation nachgewiesen werden. Allerdings sekretieren RKO-Zellen einen anti-apoptotischen Faktor in ihr Medium, dessen Konzentration und Wirkung mit größerer Zelldichte zunimmt und somit für die Protektion, unabhängig von Zellzyklusarrest oder Proliferation, verantwortlich ist. Konfluente und auch mit konditioniertem Medium behandelte RKO-Zellen zeigen im Vergleich zu dünn ausgesäten RKO-Zellen Veränderungen, die denen sehr ähnlich sind die beim Übergang einer epithelverankerten Zelle zu einer migrierenden Einzelzelle (EMT) auftreten. Beispielsweise verändert sich die Zusammensetzung des Zytoskeletts, die Zellen verlieren den Zell-Zell-Kontakt und lösen sich ab, bleiben aber am Leben. Zusätzlich steigt die Sekretion von Zytokinen an, die Angiogenese, Migration und Invasion positiv beeinflussen. Sowohl konfluente als auch mit konditioniertem Medium behandelte sub-konfluente Zellen sind apoptoseresistent (hCD95L, TRAIL, UV, Staurosporin), woran u.a. die Kinasen PKC und PI3K, aber auch das anti-apoptotische Bcl-xL beteiligt sind. Die Zellen sterben interessanterweise, wenn ein agonistischer anti-CD95-Antikörper statt des rekombinanten CD95-Liganden verwendet wird, was vermuten lässt, dass eine mangelhafte Vernetzung der einzelnen DISC-Komplexe zur Apoptosehemmung führt, welche durch den Antikörper dann aber erzwungen wird. Zwar handelt es sich hierbei um ein reines Zellkulturmodell, dennoch könnte es bedeuten, dass die Umgebung in einer dichten RKO-Zellkultur vergleichbar ist mit der in größeren soliden Tumoren. Die Zellen brauchen Nährstoffe, versuchen über eine Neovaskularisierung Anschluss an ein Blutsystem zu finden und sekretieren Lockstoffe, Wachstumsfaktoren sowie Proteasen, um die Metastasierung zu erleichtern. PI3K, cPKCs und Bcl-xL tragen dabei zu einer Apoptoseresistenz bei, welche die Zellen zum einen resistent gegenüber Anoikis, Nährstoffmangel, aber auch gegen angreifende zytotoxische T-Zellen macht. Eine weitere Aufklärung der hier ablaufenden Prozesse würde es erleichtern, Möglichkeiten zu finden, in diese Signalwege einzugreifen, um die Apoptosesensitivität wieder herzustellen und die Metastasierung zu verhindern. Insbesondere ist die Identifizierung des für die Apoptoseprotektion verantwortlichen Zytokins das nächste wichtige Ziel bei der Fortsetzung dieser Arbeiten.
Mit der nichtenzymatischen templatgesteuerten Oligomerisierung von RNA zu Selektionsexperimenten
(2004)
Die vorliegende Dissertation beruht auf der Nichtenzymatischen Templatgesteuerten Oligomerisierung von RNA. Dazu inkubiert man einen farbstoffmarkierten Primer mit komplementären Templaten und aktivierten Monomeren, den 2-Methyl-Phosphorimidazoliden. Die Verlängerung des Primers wurde durch Gelelektrophorese mit anschließender Detektion des Fluoreszenzfarbstoffs nachgewiesen. Eine erfolgreiche Primerverlängerung ist an viele Vorraussetzungen gebunden. Wichtig ist, dass der Duplex in der A-Konformation vorliegt. Deshalb ist es nötig, dass wenigstens der Primer oder das Templat aus RNA besteht. Von großem Vorteil ist, wenn die Basenpaare drei Wasserstoffbrücken ausbilden können. Auch die Stapelwechselwirkung ist ebenso wichtig für eine effiziente Kettenverlängerung, der Einbau von Purinen verläuft besser als der Einbau von Pyrimidinen. In der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Durchführung eines nichtenzymatischen PCR-artigen Experiments möglich ist. Das Verlängerungsprodukt der Hin-Reaktion wurde durch eine präparative Polyacrylamid Gelelektrophorese isoliert. Dieses diente dann als Templat für die Rückreaktion. Das Experiment aus Hin- und Rückreaktion bildete die Grundlage für ein Selektionsexperiment. Die Template wurden dafür um Zufallspositionen erweitert, die zwischen die Primerbindestellen eingefügt wurden. Nach mehrmaligem Durchlaufen des Zyklus aus Hin- und Rückreaktion sollte es sich zeigen, ob sich bestimmte Nucleotide in den Sequenzen angereichert haben. Zur Analyse wurde eine Methode basierend auf einer RP-HPLC entwickelt. Die vollverlängerten Produkte wurden mittels Gelelektrophorese isoliert und durch basische Hydrolyse in Monomere gespalten. Nach anschließender enzymatischer Dephosphorylierung konnte der Anteil der Nucleoside durch RP-HPLC bestimmt werden. Die erste erfolgreiche Anwendung fand diese Methode in der Analyse des Einbaus gegenüber T (U). Hier konkurrieren nämlich D (A) durch Watson/Crick-Paarung und G durch Wobble-Paarung um die Bindestelle. Aus diesem Grund bildeten sich bei Templaten aus C und T und der Inkubation nur mit G-Imidazolid allein die vollverlängerten Produkte zu einem hohen Anteil. Bei Reaktionen mit den Imidazoliden G und D konnte gezeigt werden, dass gegenüber T der Watson/Crick Partner D etwa dreimal häufiger eingebaut wurde als G. Eine weitere wichtige Grundlage für ein Selektionsexperiment bildete die Untersuchung, ob sich gegenüber Zufallspositionen überhaupt eine Kettenverlängerung feststellen lässt. Dazu wurde die Verlängerung unterschiedlicher Primer mit Templaten untersucht, die an einer oder mehreren Stellen Positionen aus [C/T] oder [A/C/G/T] enthielten. Es war deutlich zu sehen, dass die Verlängerung an solchen random-Sequenzen möglich ist. Die besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn man entweder nur mit 2-MeImpG allein oder mit 2-MeImpG und 2-MeImpD inkubierte. Die Verwendung aller vier Imidazolide aus C, D, G und U führte zwar auch zu vollverlängerten Produkten, ihr Anteil war aber deutlich geringer. Eine andere wichtige Aufgabe dieser Dissertation war die Aufklärung der Ursache für die kritische Länge der Template. Es konnte gezeigt werden, dass die Bildung von G-Quadrupelsträngen nicht der Grund ist, der den reibungslosen Einbau an längeren "homoC" Templaten verhindert. Zusätze von NaCl oder LiCl beeinflussten die Effizienz dieser Reaktionen kaum. Gute Resultate wurden bei der Verlängerung an Homopyrimidin-Templaten, die aus C und T bestanden, erzielt. Das vollverlängerte Produkt bildete sich bei der Verwendung von 2-MeImpG und 2-MeImpD in hohen Ausbeuten. Interessante Resultate ergaben sich im Fall des Einbaus von C an "homoG" Templaten. Die besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn völlig auf Na+-Ionen verzichtet wurde. Die Verwendung von Li-Imidazoliden, die auch in höherer Konzentration eingesetzt werden konnten, steigerte die Effizienz dieser Reaktionen deutlich. Durch das reduzierte stacking liefen alle Reaktionen allerdings langsamer und unvollständiger ab als beim Einbau von G an "homoC" Templaten. Die Stabilisierung des Duplexes durch stacking ist also entscheidend für erfolgreiche Primerverlängerungen. Überraschend schlechte Ergebnisse waren zu beobachten, wenn die Template gleichzeitig aus G und C aufgebaut waren. Die vollständig verlängerten Produkte wurden zu einem sehr geringen Anteil gebildet. Zusätzlich zum geringeren stacking der Pyrimidine, wurden Unregelmäßigkeiten in der Doppelhelixstruktur, die durch das abwechselnde Auftreten von Purinen und Pyrimidinen verursacht worden sind, als Ursache ausgemacht. Als neue Vorrausetzung für eine effiziente Kettenverlängerung hat sich also das Vorliegen einer regelmäßigen Doppelhelixstruktur herausgestellt.
Indigene Kulturen und indigene Kunst unterliegen in der Betrachtung von "Weltkunst" vielen Klischees. Vor allem die Bezeichnungen "primitiv" als Attribut für Werke außerhalb der europäischen Kunstgeschichte und "naiv" (wie das englische Wort native vom Lateinischen nativus, 'angeboren, natürlich, ungekünstelt' abgeleitet) erschweren unvoreingenommene Denkweisen. Faszination gegenüber der Ästhetik des "exotischen" Objekts überlagerte oft die Wahrnehmung der Komplexität indigener Kunst, Künstlerpersönlichkeiten verschwanden in einer anonymen Vergangenheit. Mit dem politischen Umbruch nach dem zweiten Weltkrieg und den nachfolgenden gesellschaftlichen Veränderungen in vielen Kontinenten erfolgte auch im indigenen Nordamerika ein Wandel im Bewusstsein gegenüber der eigenen Kultur (R. Hill, Gesprächsprotokoll 2002). Nicht länger waren es nur Wissenschaftler euroamerikanischer Herkunft, die forschende Betrachtungen von außen vornahmen. Indigene Positionierungen entwickelten sich im internen Diskurs mit stammeseigenen Medien und Kultureinrichtungen. Identitätsstiftende Traditionen wurden reanimiert oder neu gebildet, um kulturelle Kontinuität zu wahren; künstlerische und wissenschaftliche Ausbildung erweiterte die Lebensperspektiven der jungen Generationen. Im Kontakt mit Studenten anderer Nationen und Kulturen entwickelte sich so eine eigenständige indigene Kunst, die mit verschiedenen Genres, Formen und Inhalten westlicher Kunstauffassung korreliert und im soziokulturellen Umfeld der spezifischen Bevölkerungsgruppen zu betrachten ist. ...
In dieser klinischen Phase I-Studie an 39 gesunden, männlichen Probanden im Alter zwischen 18 und 45 Jahren wurde die Fragestellung untersucht, wie ein Übergang von intravenöser Blutgerinnungshemmung mit dem direkten Thrombinhemmer Argatroban und den oralen Antikoagulantien Phenprocoumon und Acenocoumarol in der klinischen Praxis zu kontrollieren ist. Bei den bisher verwendeten Laboruntersuchungen, wie der aPTT existieren Interaktionen zwischen Argatroban und oraler Antikoagulation, welche nicht notwendigerweise die wirkliche in vivo Situation reflektieren, was durch eine ex vivo-in vitro-Interferenz des Gerinnungsassays verursacht wird. APTT Reagenzien aktivieren die intrinsische Gerinnungskaskade zu einem sehr frühen Zeitpunkt (gleich zu Beginn derselben bei Faktor XI). Dadurch werden die Interaktionen zwischen der oralen Antikoagulation und den Rückkopplungsmechanismen zwischen beiden Gerinnungswegen, welche durch die orale Antikoagulation teilweise erschöpft sind, begreifbar. Ebenso wurde die Interaktion zwischen anderen direkten Thrombinhemmern und der oralen Antikoagulation am Beispiel Napsagatran mit Warfarin beschrieben 35: Die Gabe von Napsagatran alleine führte zur Erhöhung von aPTT und Prothrombinzeit (PT), die zusätzliche Einmaldosis Warfarin erhöhte die AUEC (Fläche unter der Effekt-Kurve) für die PT zusätzlich um das vierfache und für die aPTT um 45%. Obwohl die PT unter dem Einfluss direkter Thrombinhemmer verlängert ist, wird sie nicht als Parameter des Monitorings der Wirkung therapeutischer Dosierungen von Argatroban und anderen direkten Thrombinhemmern bei der Thrombosephrophylaxe und Behandlung tiefer Beinvenethrombosen empfohlen 39. Die aPTT wird hingegen, neben ihrem Einsatz zur Überwachung der klinischen Therapie direkter Thrombinhemmer 40,41, auch als pharmakodynamischer Schlüsselparameter in Phase-I-Studien derselben eingesetzt 42,43. Da jedoch höhere Konzentrationen der Thrombinhemmer die aPTT-Werte für die Kalibrierung verändern und darüber hinaus verschiedene aPTT-Reagenzien mit unterschiedlicher Empfindlichkeit gegenüber den Thrombinhemmern angeboten werden, ist die aPTT nicht der ideale Parameter zur Überwachung der Wirkung direkter Thrombinhemmer. Die ECT ist hierfür wesentlich spezifischer 40,41. Dennoch werden validierte ECT-Assays nicht kommerziell vertrieben, was deren Einsatz in der Klinik bisher unmöglich macht. Insofern ist es notwendig geworden, eine Empfehlung für den Übergang von intravenöser auf orale Antikoagulation mit dem bisherigen Instrument der INR zu finden. Auch wenn dies aus den o.g. Gründen nicht optimal ist, mag es zulässig sein, die Nomogramme für Acenocoumarol und Phenprocoumon in einfache Regeln zu übersetzen, ohne daß ein Sicherheitsproblem in der Klinik entsteht. Vorausgesetzt, ein Vorhersagefehler von <± 0,6 wird als annehmbar akzeptiert, 35 so erlaubt das Nomogramm für Phenprocoumon und Acenocoumarol eine valide Vorhersage der realen Gerinnungsverhältnisse bis zu einer Dosis von 2,0 µg/kg/min unter Verwendung eines ISI von 1-2. Derzeitige Richtlinien für die Hepariniserung nach tiefer Beinvenenthrombose 47 erlauben den Stopp der Infusionstherapie mit niedermolekularen Heparinen (bei gleichzeitiger Gabe einer oralen Antikoagluation), wenn der INR wenigstens 2,0 erreicht hat. Um den Übergang von Argatroban zu einer oralen Antikoagulation zu vereinfachen, wird eine Regel für die Berechnung der "wahren" INR während der Übergangsperiode vorgeschlagen: 1. Die Argatrobaninfusion kann eingestellt werden, wenn unter gleichzeitiger oraler Antikoagulation die INR für einen angemessenen Zeitraum der Komedikation bei 4,0 angekommen ist. Das gilt für einen ISI des PT-Reagens von 1-2. Die reale INR befindet sich dann im therapeutischen Bereich zwischen 2,2 und 3,7. 2. aPTT-Ergebnisse unter Argatroban und beginnender oraler Antikoagulation müssen um 5-15 Sekunden verkürzt abgelesen werden. Die Verlängerung der aPTT während des Übergangs von Argatroban auf die oraler Antikoagulation sollten nicht zu einer Unterbrechung bzw. Dosiserniedrigung der Argatroban-Infusion während dieses Zeitraums führen. Prinzipiell sollte die Dosis von Argatroban während der Übergangszeit auf die orale Antikoagulation bei 1-2 µg/kg/min fixiert werden. Genauso wie bei Hirudin 48 sollte die ECT, wenn klinisch angezeigt, zur Überwachung der direkten Argatroban-Effekte auf die Gerinnung benutzt und hierbei der aPTT als Alternative vorgezogen werden. Das gilt sowohl für die Anwendung von Argatroban alleine als auch die Kombination mit oralen Antikoagulanzien. Wie bereits oben erwähnt steht die ECT als validierte Messmethode für die Klinik bisher jedoch nicht zur Verfügung. Die Blutungszeit war in dieser Untersuchung in der Periode der Umstellung von Argatroban auf orale Antikoagulation nicht wesentlich verlängert, so daß für Patienten keine zusätzliche Blutungsgefahr entstanden ist. Einschränkend ist dennoch zu bemerken, daß obwohl in den erwähnten Phase-I-Untersuchungen an gesunden Probanden keine größeren Blutungsereignisse aufgetreten sind, bei Patienten durchaus ein erhöhte Blutungsgefährdung bei einer INR von > 3,0 bestehen kann. Dies ist in der Praxis aufmerksam zu kontrollieren. Argatroban ist also für HIT Typ II-Patienten, die unter klinischen Bedingungen antikoaguliert werden müssen, eine gut steuerbare Alternative, bei welcher auch die anschließende Umstellung auf orale Antikoagulation kontrolliert sicher handhabbar ist.
Die Familie der ubiquitären ATP binding cassette (ABC)-Membranproteine katalysiert unter Hydrolyse von ATP die Translokation von Substraten über biologische Membranen. In der hier vorliegenden Arbeit wurde die Struktur und Funktion des osmoprotectant uptake (Opu) Systems A aus B. subtilis untersucht, das aus drei Untereinheiten, der ATPase OpuAA, dem integralen Membranprotein OpuAB und dem Substrat-Bindeprotein OpuAC, besteht und unter hyperosmolaren Bedingungen die kompatiblen Solute Glycin-Betain (GB) und Prolin-Betain (PB) in die Zelle importiert, um eine Plasmolyse zu verhindern. Sämtliche Untereinheiten wurden getrennt oder als OpuAA/AB Komplex in E. coli überproduziert und bis zur Homogenität isoliert. OpuAA zeigte ein dynamisches Monomer-Dimer Gleichgewicht (KD= 6 µM), das durch Nukleotide beeinflusst wurde. Unter Bedingungen hoher Ionenstärke konnten Monomer und Dimer getrennt isoliert und analysiert werden. Die Affinitäten und Stöchiometrien der OpuAA/Nukleotid Komplexe wurden unter Verwendung des fluoreszierenden TNP-ATP bzw. einer Nukleotid-sensitiven Trp-Mutante des OpuAA untersucht. Das Monomer hatte ein Molekül TNP-ATP gebunden, während zwei Moleküle TNP-ATP in dimerem OpuAA detektiert wurden. Die Affinität von Nukleotiden zu OpuAA nahm in folgender Reihe zu: ATP<ATP/Mg2+<ADP/Mg2+. Eine Erhöhung der Ionenstärke bewirkte nicht nur eine Erniedrigung der KD-Werte von OpuAA/Nukleotid Komplexen, sondern auch eine Steigerung der ATPase Aktivität. In 1 M NaCl zeigte das Monomer basale ATPase Aktivität, während das Dimer nur sehr geringe Aktivität hatte, jedoch durch Zugabe von OpuAB und OpuAC aktiviert wurde. K+ wurde als ein Modulator der ATPase Aktivität von OpuAA identifiziert. Die Zugabe von TNP-ADP/Mg2+ induzierte in dimeren OpuAA einen konformellen Wechsel, der zu einem Zerfall des Dimers führte. Monomer und Dimer hatten gegenüber Nukleotiden unterschiedliche Affinitäten, was eine unterschiedliche Architektur der Nukleotid-Bindetasche implizierte. Die Architektur des OpuAA Dimers wurde mittels FRET untersucht. Dazu wurde OpuAA ortspezifisch mit Fluorophoren markiert und ein Verfahren etabliert, in dem die intermolekularen Distanzen des Dimers bestimmt werden konnten. Ein Vergleich der Distanzen mit anderen NBD Dimeren zeigte, dass OpuAA eine zu BtuD oder MalKE. coli vergleichbare Dimer Architektur mit einer head-to-tail Orientierung hat. Die Struktur des OpuAC/GB und OpuAC/PB Komplexes wurde durch Röntgenstrukturanalyse mit einer Auflösung von 2,7 Å bzw. 2,8 Å aufgeklärt und zeigte zwei globuläre Domänen, die über zwei Peptidsegmente miteinander verbunden waren. Die delokalisierte positive Ladung des Liganden war von einem cluster aus drei Trp-Resten, dem sog. "Tryptophan-Prisma", über kationische-p-Interaktion komplexiert. Nach Ligandenbindung wurden beide Domänen durch eine Wasserstoffbrücke zwischen den konservierten Asp22 und Trp178 überbrückt. Dieser molekulare Schalter wurde von OpuAC genutzt, um Affinitäten von GB und PB zu regulieren.
Charakterisierung der alternativen NADH-Ubichinon-Oxidoreduktase (NDH2) aus Yarrowia lipolytica
(2004)
Neben dem protonenpumpenden Komplex I (NDH-1) der Atmungskette besitzt die obligat aerobe Hefe Yarrowia lipolytica eine alternative NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (NDH-2). Diese Enzyme, die in den Atmungsketten von Pflanzen, Pilzen und Bakterien vorkommen, bestehen aus nur einer Untereinheit, führen jedoch dieselbe Reaktion aus wie Komplex I, nämlich die Elektronenübertragung von NADH auf Ubichinon, wobei allerdings keine Protonen über die Membran transloziert werden. Nur peripher mit der Membran assoziiert, können alternative Dehydrogenasen entweder zur cytosolischen Seite (extern) oder zur Matrixseite (intern) orientiert sein. Y. lipolytica besitzt im Gegensatz zu anderen Ascomyceten nur eine einzige extern orientierte alternative Dehydrogenase mit einer vorhergesagten Masse von ca. 60 kD und einem nicht kovalent gebundenem Molekül FAD als Cofaktor. Durch Fusion des Leserasters mit der Präsequenz der 75 kD Untereinheit von Komplex I war die interne Expression des Enzyms (NDH2i) gelungen, die das Überleben von Komplex I Deletionsmutanten ermöglichte. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die alternative Dehydrogenase von Y. lipolytica innerhalb ihrer natürlichen Membranumgebung charakterisiert. Das Enzym reagierte mit verschiedenen Chinonanaloga, wobei mit dem hydrophilen Q1 eine höhere katalytische Rate erzielt wurde als mit DBQ, das dem natürlich vorkommenden Q9 am ähnlichsten ist. Da hydrophobe Substrate fast ausschließlich in der Lipidphase der Membranen gelöst vorliegen, musste bei der Bestimmung von kinetischen Parametern (ebenso wie bei Komplex I) auf eine gleichbleibend große Membranphase im Messvolumen geachtet werden. Mit dem standardmäßig benutzten Substrat DBQ reagierte YLNDH2 nach einem Ping-Pong Reaktionsmechanismus. Dieser beschreibt eine abwechselnde Bindung der beiden Substrate, wobei das Enzym die Elektronen von NADH aufnimmt (E-FADH2) und an Ubichinon weitergibt (E-FAD); es existiert kein ternärer Enzym-Substrat Komplex. Gestützt durch Kristallstrukturen des analogen Enzyms QR1 mit NADPH bzw. mit Durochinon, liegt die Vermutung nahe, dass beide Substrate in ähnlicher Weise und sehr wahrscheinlich in der gleichen Bindungstasche binden. Ein Ping-Pong Reaktionsmechanismus wurde bereits für die NADH:DCPIP Oxidoreduktase Aktivität von zwei weiteren alternativen Enzymen postuliert, jedoch noch nie für ein physiologisches Substrat. Als bislang wirksamster Inhibitor für alternative Dehydrogenasen wurde 1-hydroxy-2-dodecyl-4(1H)chinolon (HDQ) entdeckt. HDQ hemmte NDH2 in Membranen aus Y. lipolytica mit einer I50 von 200 nM, was der 500fachen Hemmwirkung des gängig verwendeten Flavon auf das isolierte Enzym NDI1 von S. cerevisiae entspricht. Allerdings hemmte HDQ auch Komplex I mit einer I50 von 2 µM, ähnlich wie es bei Platanetin in Pflanzenmitochondrien der Fall war [Roberts et al., 1996]. Mit dem Ziel, ein polyklonales Antiserum gegen die native YLNDH2 zu generieren, wurde das Enzym in E. coli heterolog exprimiert. Die Expression führte zur Bildung von Einschlusskörpern, aus denen das rekombinante Enzym unter denaturierenden Bedingungen gereinigt und zur Immunisierung eines Kaninchens verwendet werden konnte. Das Antiserum kreuzreagierte mit der nativen und der internen Version von YLNDH2 und zeigte nur wenige unspezifische Bindungen. Es wurde gezeigt, dass Y. lipolytica Stämme ohne NDH2 und Komplex I mit NDH2i als einziger Dehydrogenase erzeugt werden konnten. In N. crassa war der Versuch, NDE2 und Komplex I gleichzeitig zu deletieren, gescheitert, was zu der Schlussfolgerung führte, dass sich die beiden Enzyme in diesem Organismus möglicherweise kompensieren könnten. Dies war in Y. lipolytica ausgeschlossen worden, da wahrscheinlich kein (oder nur unzureichender) Austausch zwischen matrixständigem und cytosolischem NADH stattfindet. Die zielgerichtete Mutagenese hochkonservierter Bereiche im offenen Leserahmen von YLNDH2 lieferte das eindeutige Ergebnis, dass die zweite der beiden beta-alpha-beta-Bindungsdomänen NADH binden muß, da sich der KM Wert für NADH bei Mutation des essentiellen sauren Restes E320 dratisch erhöhte. Alle Mutationen, die die Dinukleotid Bindungsdomäne I betrafen, die danach folgerichtig den Cofaktor FAD binden muß, führten zu einem vollständigen Verlust von NDH2. Dieselbe Zuordnung der Bindungsstellen war bereits von Björklöf et al. [2000] vorgeschlagen worden. Eine Chinonbindungstelle konnte durch Mutagenese der beiden apolar/aromatischen Bereiche der Sequenz nicht identifiziert werden. Die Modifikation des C-Terminus von NDH2i führte zu nicht mehr messbarer Aktivität und stark verringerter Expression des Enzyms in mitochondrialen Membranen (siehe Anhang 7.5.1.1). Es kann daher vermutet werden, dass der C-Terminus für die korrekte Faltung eine wichtige Rolle spielt, möglicherweise sogar bei der Membranassoziation, wie bei Rasmusson [1999] vorgeschlagen wurde. Interessant war in diesem Zusammenhang, dass die C-terminal modifizierte NDH2i trotzdem das Überleben von Komplex I Deletionsmutanten bzw. das Wachstum auf DQA ermöglichte. In Membranen, die einen unterschiedlichen Gehalt an NDH2, jedoch die gleiche Gesamtmenge an Protein enthielten, wurde eine unerwartete lineare Abhängigkeit zwischen KM und Vmax Werten beobachtet. Dieses Phänomen wurde mit dem Modell der externen Diffusionslimitierung beschrieben, die in ähnlicher Weise auch bei immobilisierten Enzymen auftritt. Danach wird die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion von YLNDH2 sowohl durch die kinetisch kontrollierte Rate, als auch durch die Transportrate des Ubichinons bestimmt, das aus der Membran heraus in die wässrige Umgebung des katalytischen Zentrums gelangen muss. Aus diesem Grund ist nicht nur die Maximalgeschwindigkeit, sondern auch die Michaelis Menten Konstante KM abhängig vom Gehalt des Enzyms in Membranen. Dies führte bei niedrig exprimierten mutanten Enzymen zur gleichzeitigen Abnahme von KM und Vmax. Eine externe Diffusionskontrolle der enzymatischen Reaktion wurde auch für Komplex I, dessen Reaktionszentrum im peripheren Arm vermutet werden kann, aber nicht für Komplex III aus S. cerevisiae, dessen Chinonbindungsstellen sich definitiv in hydrophober Umgebung befinden, beobachtet.
Die frühe Entwicklung und Differenzierung der sympathischen Ganglien wird durch ein Netzwerk von proneuralen (Mash1/Cash1) und autonomen (Phox2a/b, dHand) Transkriptionsfaktoren kontrolliert. Diese Transkriptionsfaktoren induzieren direkt oder indirekt die Expression neuronaler (SCG10) und subtypspezifischer noradrenerger (TH, DBH) oder cholinerger (ChAT, VAChT) Gene. Die Analyse der frühen Genexpression im Ciliarganglion zeigte ein bemerkenswert ähnliches zeitliches Expressionsschema. Zwei bedeutende Unterschiede sind einerseits die nur transiente Expression noradrenerger Gene und andererseits die Abwesenheit des bHLH-Transkriptionsfaktors dHand, der selektiv in den sympathischen Ganglien exprimiert ist. Das Netzwerk der Transkriptionsfaktoren in den sympathischen Ganglien ist abhängig von einem BMP-Signal aus der dorsalen Aorta. BMPs sind notwendig und ausreichend für die Expression der genannten Transkriptionsfaktoren und damit für die Bildung der sympathischen Ganglien. Diese Arbeit zeigt, daß BMPs auch für die Entwicklung des Ciliarganglions notwendig und ausreichend sind. Fehlen BMPs, differenzieren die Vorläuferzellen nicht, wird BMP4 überexprimiert, differenzieren sie, anders als sympathische Vorläuferzellen im Brachialnerv, zu Zellen mit parasympathischem Phänotyp. Die vorliegenden Ergebnisse weisen auf eine Präspezifizierung von Ciliarvorläuferzellen und sympathischen Vorläuferzellen hin. Der bHLH-Transkriptionsfaktor dHand ist differentiell in sympathischen Vorläuferzellen exprimiert. Seine Expression ist notwendig für die noradrenerge Differenzierung, und die Überexpression im Ciliarganglion reicht aus, um in den Ciliarneuronen die Expression von TH/DBH zu erhalten. Verschiedene Arbeiten schlagen als möglichen Wirkmechanismus eine synergistische Interaktion von dHand und Phox2-Transkriptionsfaktoren vor. Ektopische BMP4-Expression induziert in einem Teil der generierten Neuronen die Expression von dHand. Interessanterweise reicht diese, durch BMP4 induzierte, dHand-Expression nicht aus, den relativen Anteil noradrenerger Neuronen innerhalb der ektopischen und der Ciliarneuronen zu erhöhen. Diese scheinbare Diskrepanz kann erklärt werden, wenn man annimmt, daß ein bestimmter Schwellenwert in der dHand-Funktion erreicht werden muß. Dieser Schwellenwert könnte durch unterschiedliche dHand-Expression, induziert durch BMPs, durch posttranskriptionelle Kontrolle der dHand-Funktion, oder durch unterschiedliche Expression von Cofaktoren in unterschiedlich präspezifizierten Vorläuferzellen reguliert werden. In Zellen, in denen die Konzentration an aktivem dHand einen gewissen Schwellenwert übersteigt, würde dann gemeinsam mit Phox2a/b die noradrenerge Genexpression induziert oder erhalten werden.
Monoklonale Antikörper und rekombinante Antikörperfragmente gegen sekundäre Arzneipflanzenmetabolite
(2004)
Monoklonale Antikörper sind seit vielen Jahren aus den biochemischen und molekularbiologischen Laboratorien nicht mehr wegzudenken. Sowohl in der Grundlagenforschung, als auch in der angewandten medizinischen Diagnostik und der Therapie spielen sie eine immer wichtigere Rolle. Dennoch konnten sich monoklonale Antikörper als Hilfsmittel im Bereich der Naturstoffanalytik bisher noch nicht durchsetzen. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand daher die Frage, inwieweit sich monoklonale Antikörper und rekombinante Antikörperfragmente für die Analytik komplexer Naturstoffgemische eignen. Eine der Zielstrukturen, gegen die monoklonale Antikörper generiert werden sollten, ist das pentazyklische Triterpen Oleanolsäure. Oleanolsäure ist als Aglykon in zahlreichen verschiedenen Triterpensaponinen enthalten. Triterpensaponine bzw. Triterpensaponin-haltige Arzneipflanzen spielen aufgrund ihres breiten Wirkungsspektrums in der Phytotherapie eine wichtige Rolle. Sie zeichnen sich nachweislich durch venentonisierende, antiödematöse, antiphlogistische, diuretische, expektorierende und broncholytische Eigenschaften aus. Da es sich bei den Triterpensaponinen um eine sehr heterogene Stoffgruppe handelt, ist ihre Analytik sehr aufwendig. Monoklonale Antikörper könnten daher bei der Analytik von komplexen Saponingemischen sehr nützlich sein. In Zusammenarbeit mit Frau Dr. Kerstin Brand aus dem Arbeitskreis von PD Dr. Werner Knöss (Universität Bonn) konnten verschiedene monoklonale Antikörper gegen Oleanolsäure etabliert werden. Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Bindungseigenschaften dieser Antikörper eingehend charakterisiert. In kompetitiven ELISAs konnten die Molekülepitope, an die die verschiedenen Antikörper binden, bestimmt werden. Außerdem wurden die Immunglobuline auf Kreuzreaktivitäten gegenüber 72 unterschiedlichen sekundären Arzneipflanzenmetaboliten untersucht. Die monoklonalen Antikörper zeigten dabei keine Interaktion mit Steroiden, Phytosterolen und Herzglykosiden – Substanzen die zwar in die Gruppe der Triterpene eingeordnet werden können, sich aber in ihrer Struktur und Stereochemie deutlich von der Oleanolsäure unterscheiden. Gegenüber zahlreichen pentazyklischen Triterpenen, die strukturelle Ähnlichkeiten mit der Oleanolsäure besitzen, zeigten hingegen alle untersuchten Immunglobuline eine ausgeprägte Kreuzreaktivität. Daher eignen sie sich für die Analytik von komplex zusammengesetzten Triterpengemischen, z.B. von Arzneipflanzenextrakten. Dies konnte durch verschiedene direkte und indirekte Kompetitionsversuche mit unterschiedlichen Arzneipflanzenextrakten im Rahmen dieser Arbeit und der Dissertation von Frau Dr. Kerstin Brand gezeigt werden. Mit Hilfe eines kompetitiven ELISAs ist z.B. ein Screening von unbekannten Arzneipflanzen auf Triterpensaponine möglich. Auch eine Wertbestimmung von Arzneipflanzen oder Arzneipflanzenextrakten mit Hilfe der monoklonalen Antikörper ist denkbar, sofern eine Referenz zur Verfügung steht, auf den die Kompetitionsergebnisse bezogen werden können. Der Einsatz der hier vorgestellten Antikörper wird allerdings dadurch eingeschränkt, dass die Immunglobuline eine unvorhersehbare Polyspezifität gegenüber den polyphenolischen Sekundärmetaboliten Quercetin und Ellagsäure zeigten. Bei einem Einsatz der Antikörper im Rahmen der Naturstoffanalytik sind daher Vorversuche erforderlich, um diese Substanzen zu identifizieren und wenn möglich zu entfernen. Einer der untersuchten monoklonalen Antikörper, der Antikörper der Zelllinie 10F10, zeigte eine Kreuzreaktivität gegenüber verschiedenen ß-Boswelliasäuren. Boswelliasäuren sind in der Lage, das Enzym 5-Lipoxygenase zu hemmen und dadurch die Synthese von entzündungsfördernden Leukotrienen zu inhibieren. Daher scheinen Boswelliasäuren viel versprechende Arzneistoffe bei der Therapie der unterschiedlichsten inflammatorischen Erkrankungen, wie z.B. Colitis ulcerosa, Morbus Crohn, Asthma bronchiale oder rheumatoider Arthritis zu sein. Der Antikörper der Zelllinie 10F10 soll im Arbeitskreis von Prof. Dieter Steinhilber am Institut für Pharmazeutische Chemie der Universität Frankfurt unter anderem für eine Immobilisierung der Boswelliasäuren an Immunaffinitätssäulen eingesetzt werden. In diesem Arbeitskreis wird der Einfluss von ß-Boswelliasäuren auf die 5-Lipoxygenase intensiv erforscht. In einem zweiten Projekt wurden rekombinante scFv-Antikörperfragmente gegen das Triterpen Oleanolsäure und gegen das Pyrrolizidinalkaloid Retrorsin generiert. Pyrrolizidinalkaloide sind hepatotoxische Sekundärmetabolite, die in zahlreichen Nutzpflanzen und traditionellen Arzneipflanzen enthalten sind. Insgesamt wurden vier verschiedene scFv-Fragmente konstruiert. Zwei Anti- Oleanolsäure-Antikörperfragmente konnten in E. coli erfolgreich periplasmatisch exprimiert und ihre Funktionalität in verschiedenen Antigenbindungsstudien nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde eine Phagen-Display- und Phagen- Panning-Methode etabliert, mit deren Hilfe es möglich ist, gezielt nach funktionellen Antikörperfragmenten zu suchen. Mit dieser Methode sollte es möglich sein, nach erfolgter Mutation der verschiedenen scFv-Fragmente, Proteine mit neuen Bindungseigenschaften zu identifizieren. Interessant wären dabei z.B. scFv- Fragmente, die mit Pyrrolizidin-N-oxiden interagieren. Gegen diese Substanzen konnten im Arbeitskreis Dingermann mit Hilfe der konventionellen Hybridoma- Technologie bisher noch keine monoklonalen Antikörper generiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass es sich bei monoklonalen Antikörpern und rekombinanten Antikörperfragmenten um interessante Hilfsstoffe für die Naturstoffanalytik handelt, deren Bedeutung für dieses Anwendungsgebiet aber bisher noch deutlich unterbewertet ist. Es wäre daher sehr interessant, die hier vorgestellten Projekte fortzuführen und die Arbeitsmethoden weiter zu optimieren. Mit den im Rahmen dieser Arbeit charakterisierten Anti-Oleanolsäure-Antikörpern stehen bereits drei Immunglobuline für die Arzneipflanzenanalytik zur Verfügung. Von allen drei Antikörpern liegen inzwischen auch scFv-Fragmente vor. Diese Fragmente könnten modifiziert und mit Hilfe der hier vorgestellten Phagen-Display-Methode nach Proteinen mit modifizierten Bindungseigenschaften gesucht werden. Letztendlich wäre auf diese Weise die Generierung eines großen Sortiments von Antikörpern und Antikörperfragmenten für die Analytik der unterschiedlichsten Substanzklassen möglich.
Die Arbeit untersucht die für den Online-Journalismus typischen, kurzen Ankündungstexte auf den Startseiten ausgewählter, deutschen Online-Zeitungen. Außerdem wird die Ankündigung als mediales Prinzip untersucht, der Teaser in seinen Funktionen beschrieben. Schließlich wird ein Korpus von Teasern unter syntaktischen und stilistischen Aspekten untersucht. Im Ergebnis wird die Textsorte als ausgereift und variantenreich bewertet. Die verschiedenen Textfunktionen wie Orientierung, Information, Lesemotivation werden sprach- stilistisch gezielt unterstützt: lexikalisch z.B durch Eigennamen oder Augenblickskomposita. Syntaktisch konnten interessante Einzelphänomene wie die Steigerung der Satz-Rhythmik durch Ellipsen oder die Ausgliederung von Satzteilen beobachtet werden.
Hydroxyethylstärke (HES) ist ein kolloidales Volumenersatzmittel, das zur Volumenbehandlung bei Trauma und bei Schock und zur Verbesserung der Rheologie bei Durchblutungsstörungen angewendet wird. Amylopektin, die Grundlage von HES, wird zur Veränderung der physikalischen Eigenschaften substituiert, um eine für die Infusion geeignete Lösung herstellen zu können. Ein wichtiger Begleiteffekt dieser Substitution ist, dass durch die dadurch erzeugten Störstellen der enzymatische Abbau der Volumenersatzmittel durch Serumglykosidasen minimiert wird. Die molekularen Eigenschaften der HES können anhand der Molekulargewichtsverteilung, beschrieben durch den Gewichtsmittelwert der Molmassen Mw, den Zahlenmittelwert der Molmassen Mn und die Molmasse im Peakmaximum Mp, sowie nach dem Ausmaß der Substitution beschrieben werden. Im Handel befindliche HES-Lösungen werden anhand des Gewichtsmittelwertes der Molmassen (Mw) und der molaren Substitution (MS) gekennzeichnet. Nach bisherigen Erkenntnissen zur Speicherung der HES in Organen stellten sich die Fragen, ob die Hypothese, dass HES durch lysosomale Enzyme abgebaut wird untermauert werden kann und ob es möglich ist, die Sicherheit der HES für die Anwendung am Patienten durch gezielte Verwendung bestimmter HES-Fraktionen zu verbessern. Ziel dieser Arbeit war daher, erstmals die Molekulargewichtsverteilung der nach Infusion von HES in Milz und Leber gespeicherten HES mittels Ausschluss-Chromatographie gekoppelt mit Mehrwinkel-Laser-Streulicht-Detektion zu bestimmen. Untersucht wurden drei handelsübliche HES-Präparate mit unterschiedlichem Mw und unterschiedlicher Substitution (die Bezeichnung schließt Mw (kDa) und MS ein): HES 130/0,4 und HES 200/0,5 sowie HES 450/0,7. Je acht Wistar-Ratten pro Versuchsgruppe erhielten 18 ml HES infundiert. Die Organe wurden für die Molmassenbestimmung bis zu fünfzig Tagen nach Infusion entnommen. Die Hämoglobinkonzentrationen und Hämatokritwerte bei den Blutabnahmen in den ersten 48 Stunden wurden ermittelt und gaben Aufschluss über die Hämodilution. Als wichtigstes Ergebnis wurde eine unterschiedliche Molmassenverteilung der HES aus Milz und Leber festgestellt. In der Leber werden vorwiegend niedermolekulare Anteile gespeichert. Das Mw der HES in der Leber lag direkt nach Infusion bei 89.606±8.570 (HES 450/0,7), 20.038±1.600 (HES 200/0,5) und 23.769±2.489 (HES 130/0,4). Im Verlauf der Untersuchungen stieg das Mw in der Leber bis maximal Tag 5 (HES 450/0,7) nach Infusion zwar an, fiel dann aber bei den weiteren Bestimmungen nach mehr als 5 Tagen wieder ab. Das Peakmaximum der Molmassenverteilung der HES in der Leber blieb dabei größtenteils konstant (HES 450/0,7: ~60 kDa; HES 200/0,5: ~30 kDa; HES 130/0,4: ~30 kDa). Die Molmassenverteilung der Milz wies hingegen hochmolekulare HES auf, wobei die Molmassen im Verlauf der Zeit noch zunahmen. Das Mw nach Infusion von HES 450/0,7 stieg dabei von 148.220 Da auf 229.617 Da im Mittel an. Möglicherweise erfolgt in der Milz vor allem eine Speicherung schwer zu spaltender HES. In der Leber konnte nach Infusion aller HES-Präparate und bereits unmittelbar nach Infusion HES gefunden werden. In der Milz war nur nach Infusion der hochmolekularen, hochsubstituierten HES 450/0,7 und der mittelmolekularen, mittelsubstituierten HES 200/0,5 gespeicherte HES nachzuweisen. Nach Infusion der HES 200/0,5 war dabei nur vereinzelt und erst ab einem Tag HES in der Milz auszumachen. In der Leber war die Speicherung der HES 450/0,7 ebenfalls am längsten festzustellen, während bei HES 130/0,4 die Speicherung in der Leber nur bis 3 Tage nach Infusion bestand. Der Verlauf der Molmassenverteilung in der Leber deutet auf einen intrazellulären Abbau der HES durch lysosomale Enzyme hin, während in der Milz über einen langen Zeitraum nicht gespaltene hochmolekulare HES angereichert wird. Die niedermolekulare, niedrigsubstituierte HES ist hinsichtlich der vorhersehbaren Dauer der Speicherung als besonders günstig anzusehen. In der Leber werden jedoch bei allen HES-Präparaten niedermolekulare Anteile in Konkurrenz zur renalen Elimination aufgenommen. Daher ist die wiederholte, hochdosierte Anwendung von HES bei dekompensierter Niereninsuffizienz aufgrund der Gefahr einer mechanischen Beeinträchtigung der Leber durch dort kumulierte HES stets kritisch zu betrachten.
Die Thrombozytenaktivierung, die PLA-Bildung via CD62, die Leukozytenaktivierung und die entzündliche Aktivität am Endothel nehmen in der heutigen pathophysiologischen Vorstellung der peripheren Atherosklerose und ihrer Entstehung eine zentrale Rolle ein. In dieser Querschnittstudie wurden die PLA-Bildung und Marker der Plättchen-, Leukozyten- und Endothelaktivierung (PAC-1, CD62, Mac-1 und sICAM-1) bei 44 Patienten mit peripherer arterieller Verschlusskrankheit unter Therapie mit ASS (n=17), Clopidogrel (n=12), ihrer Kombination (n=8) oder ohne Therapie (n=7) und bei einer Kontrollgruppe, bestehend aus gesunden Probanden (n=9), untersucht. Die Messungen wurden mittels Flowzytometrie im Vollblut ohne (baseline) und nach in vitro Stimulation mit ADP oder TRAP und eines Immunoassays durchgeführt. Die CD62-Expression zeigte sich bei unbehandelten und mit ASS behandelten Patienten ohne und nach Stimulation signifikant höher als bei mit Clopidogrel oder mit einer Kombination aus ASS und Clopidogrel behandelten Patienten. Gleiches galt für die PLA-Bildung (Monozyten-Leukozyten-Aggregate). Die Mac-1-Expression zeigte sich in den mit TRAP oder ADP stimulierten Proben unter einer Kombina-tionstherapie aus ASS und Clopidogrel gegenüber Patienten ohne oder mit ASS Monotherapie signifikant reduziert. Die sICAM-1-Plasmakonzentrationen waren bei gesunden Probanden und bei antiaggregatorische behandelten Patienten signifikant niedriger als bei unbehandelten Patienten. Die Werte unterschieden sich dabei zwischen den verschiedenen antiaggregatorischen Therapien nur unwesentlich. Dies ist die erste Studie, die zeigt, dass die PLA-Bildung bei Patienten mit pAVK vermehrt ist und unter einer Therapie mit Clopidogrel gemindert wird.
Die 2-DE-Technik wurde in der Mitte der 70er Jahre von O` Farrelle und Klose vorgestellt, die schon damals die Inhalte ganzer Zellen unter denaturierenden Bedingungen in hunderte bzw. tausende Proteinspots auftrennen konnten. Mangelnde Reproduzierbarkeit und fehlende Auswertungsmöglichkeiten verhinderten jedoch zu diesem Zeitpunkt eine breite Anwendung und damit größeres Interesse an der Methode. In den 80er Jahren erreichte die Methode mit der Einführung immobilisierter pH-Gradienten und der MALDI-Massenspektrometrie einen entscheidenden Wendepunkt. Seit dem Ende der 80er Jahren wird die Methode aufgrund der Möglichkeit der gleichzeitigen Proteinidentifizierung und Quantifizierung auch zunehmend in der Krebsforschung in der Suche nach neuen Markerproteinen eingesetzt. Das Uterusgewebe ist ein Organ, das während der reproduktiven Phase im Leben einer Frau ständig zyklisch verlaufenden physiologischen Änderungen unterworfen ist. Das Leiomyom, ein gutartiger monoklonaler Tumor aus den glatten Muskelzellen des menschlichen Uterus, ist eine der häufigsten gynäkologischen Erkrankung in der westlichen Welt, über deren Ursachen trotz intensiver Forschung nach wie vor fast nichts bekannt ist. Die 2-DE-Technik eignet sich in hervorragender Weise zur Untersuchung derartiger Abweichungen in der Proteinexpression während eines Krankheitsprozesses. Bezüglich der Methodenetablierung und ihrer Reproduzierbarkeit im speziellen Fall des Uterusgewebes bildet der Zellaufschluss der Probe, insbesondre aus harten Geweben, einen zentralen Punkt in der Erarbeitung der Methodik der 2-DE, da ein hohes Risiko besteht, einen großen Teil der Proteine schon während der ersten Probenbearbeitung zu verlieren. In der vorliegenden Arbeit wurde eine neue Aufschlussmethode für die Aufarbeitung des zähen Muskelgewebes ohne größere Proteinverluste entwickelt, indem das Uterusgewebe zunächst mechanisch (Ultra-Turrax) und anschließend mit Ultraschall homogenisiert wird. Die Solubilisierung der Proteinprobe bildet den zweiten wichtigen Punkt der 2-DE-Methodik. Die Solubilisierung während der Proteinextraktion und des Eintritts der Proteinprobe in die fokussierende Gel-Matrix, die aufgetragene Proteinmenge, die Fokussierungsparameter und die zweite Dimension wurde so optimiert, dass die Proteinauflösung eine konstant hohe Qualität auf den Gelen erreichte und damit eine semiquantitative Auswertbarkeit gesichert wurde. Bezüglich der Reproduzierbarkeit der Methode wurden die methodeninhärenten Probleme wie Gelfärbung, Probenpräparation und Auswertungsverfahren untersucht. Die Methodenvalidierung bezüglich der Gelfärbung zeigte, inwieweit die Auswertung, insbesondre bei schwachen Spots, beeinflusst werden kann. Im allgemeinen wurde die angewendete 2-DE-Technik für die Proteinanalyse des Uterus für gut reproduzierbar gefunden. Die Bestimmung der HKP lieferte die Grundlage einer gewebetypischen Proteindatenbank und erlaubt es außerdem, über die Gele ein Koordinationssystem zu legen, mit dem nachfolgende Proteinidentifizierungen erleichtert werden können. In dieser Arbeit konnten 48 Spots als HKP identifiziert werden. Als thematischer Schwerpunkt der Dissertation wurden die Abweichungen der Proteinexpression im Fall des Uterus myomatosus im Vergleich zu einem Kollektiv ohne muskuläre Pathologie des Uterus untersucht. Die Analyse der 2-DE von Patientenproben ergab gegenüber einer schwachen Expression bei den Vergleichsproben eine Überexpression von Prohibitin (PHB1), alpha-2-Aktin und human Growth Hormon Rezeptorprotein (hGhRP) im Endometrium bzw. im darunter liegenden subendometrialen Myometrium und eine hohe Expression im Tumorgewebe (Myomgewebe). Weiteres zeigte die 2-DE-Analyse bei Patientenproben eine Downregulation von zwei Proteinen (beta-4-Proteasom und Fibrinogen) im Gegensatz zur Expression bei den Gesunden. Die analytischen Ergebnisse aus Tumorgeweben verglichen mit den SE-und SS-Geweben derselben Patientinnen zeigten eine deutliche Expression von einigen Proteinen (Desmin, F-Actin, Transaldolase, Thioredoxin-Peroxidase und mutative Glutathion-Transferase), deren Expression in den morphologisch unauffälligen Geweben aller Schichten des Uterus nicht zu beobachten war.
In der vorliegenden Studie sollte untersucht werden, ob es möglich sei, die Stimmung eines Menschen nur anhand der Stimme einzuschätzen und ob daraus ein neues diagnostisches Mittel resultieren könne. Dazu wurden die Stimmen von 20 ambulanten und stationären Patienten und 4 gesunden Probanden in verschiedenen Stimmungslagen aufgezeichnet und mittels CD 91 Zuhörern (Ratern) präsentiert. Anhand der Stimme sollten die Zuhörer ihre Beurteilung über die Stimmung der Testpersonen auf eine Visuelle- Analog- Skala (VAS) eintragen. Diese Einschätzung wurden mit den Ergebnissen der standardisierten Befindlichkeitsmessungen des Hamilton - Scores ( Fragebogen zur Untersuchung von Depressivität ), der Hell-Dunkel-Skala (Optische Darstellung der Gemütslage) und dem Befindlichkeitstests nach v. Zerrsen (Selbstbeobachtungsfragebogen zur Befindlichkeit ) verglichen. Zusammenfassend kann gesagt werden, daß: • anhand der Stimme depressive Menschen von gesunden Menschen unterschieden werden können, aber eine Einteilung der Schwere der Depressivität in der Mehrzahl der Fälle nicht gelingt. Menschen, deren Stimmungslage „nur“ gedrückt ist, werden meist zu depressiv bewertet. Die Korrelationsergebnisse zwischen Stimmeinschätzung und standardisierter Befindlichkeitsmessung lagen unter den Ergebnissen, die sich aus dem Vergleich zwischen den standardisierten Testverfahren ergaben. • Zwischen den Berufsgruppen ergaben sich keine signifikanten Unterschiede. In der Gruppe der medizinischen Berufe zeigte sich die Tendenz, daß Psychiater, sowie Ärzte ohne psychiatrische Ausbildung und Krankenpfleger, die in der Psychiatrie tätig sind insgesamt am besten bewerteten. Personen ohne medizinische Erfahrung mit Abitur bewerten jedoch besser als die eben genannten Berufsgruppen. • Einfluß auf den Erfolg der Stimmeinschätzung : haben die individuelle Begabung und das Bildungsniveau des Raters. Weniger Einfluß als erwartet nimmt die Erfahrung auf dem medizinisch – psychiatrischen Gebiet. Die Fähigkeit der richtigen Stimmeinschätzung sinkt mit der Anzahl der Stimmproben. Die Grenze liegt bei 3 Aufnahmen. • Keinen Einfluß auf den Erfolg der Stimmeinschätzung : nahm Geschlecht, Alter und Selbsteinschätzung der eigenen psychiatrisch – psychologischen Erfahrungen der Rater. Diagnose, Hamd-Score und das Kennen der einzuschätzenden Patienten nahmen ebenfalls keinen Einfluß. Die allgemeine Anwendung der subjektiven Stimmeinschätzung im klinischen Alltag ist nur eingeschränkt anwendbar und führt zu individuell unterschiedlichen Erfolgen. Sie kann als Ergänzung angesehen werden, wird aber sicherlich keine der standardisierten Befindlichkeitsmessungen ersetzen können. Letztendlich konnte die Frage nach der Einflußgröße für eine gute Einschätzung der Befindlichkeit anhand der Stimme nicht geklärt werden, welche in weiteren Studien zu untersuchen wäre.
Ziel der Arbeit: Angiogenese ist ein grundlegender Prozess für das Wachstum und die Progression von Tumoren. Sie wird vermittelt durch das Wachstum von Gefäßen stimulierende und hemmende Angiogenesefaktoren. In der vorliegenden Arbeit wurde die angiogene Aktivität des Serums von Patienten mit Transtionalzellkarzinomen der Harnblase untersucht. Weiterhin wurden die Serumkonzentrationen zweier Angiogenesefaktoren, des Vascular Endothelial Cell Growth Factor (VEGF) und des basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), quantifiziert. Anschließend wurden die Ergebnisse mit dem klinischen Verlauf der Patienten korreliert. Methoden: In der vorliegenden Arbeit wurden Serumproben von 81 Patienten mit Transitionalzellkarzinomen der Harnblase und von 53 Kontrollpatienten untersucht. Alle Serumproben wurden in einem 72 – Stunden Endothelzellproliferationsassay getestet. Darüber hinaus wurden die Serumkonzentrationen der Angiogenesestimulatoren Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) und basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) in einem standardisierten ELISA Assay bestimmt. Ergebnisse: Die Seren der Patienten mit Transitionalzellkarzinom bewirkten eine mediane Stimulation der Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) von 223,78 % (Range 111,27 – 435,64 %) bezüglich der Standardkontrolle (100 %). Die Seren der Kontrollpatienten zeigten eine mediane Stimulation von 204,86 % (Range 101,66 – 263,56 %) (p > 0,05). Interessanterweise zeigten die Seren der Patienten mit oberflächlichen Transitionalzellkarzinomen (pTa) eine signifikant erhöhte angiogene Serumaktivität (239,09 %) (Range 161,18 – 435,64 %) gegenüber Patienten mit invasiven Blasenkarzinomen (pT2 – pT4) (198,19 %) (Range 111,27 – 377,24 %) (p = 0,0032). Weiterhin wurde bei Patienten mit gut differenzierten Tumoren (G1) eine signifikant erhöhte angiogene Serumaktivität von 285,19 % (Range 161,18 – 435,64 %) gegenüber Patienten mit mäßig bis schlecht differenzierten Tumoren (G2 – G4) mit einer Serumaktivität von 213,19 % (Range 111,27 – 377,24 %) (p = 0,037) gefunden. Serumkonzentrationen von VEGF korrelierten mit den Ergebnissen des Endothelzellproliferationsassay, was bei den bFGF Serumkonzentrationen nicht der Fall war. Schlussfolgerung: Patienten mit oberflächlichen und gut differenzierten Blasenkarzinomen zeigten eine signifikant höhere angiogene Serumaktivität als Patienten mit invasiven und schlecht differenzierten Transitionalzellkarzinomen. Verlaufskontrollen der Patienten ergaben, dass Blasentumorpatienten mit einer sehr niedrigen angiogenen Serumaktivität ein hohes Risiko für eine rasche Progression von Tumormetastasen haben.
Das Prostate-apoptosis-response-gene-4 (Par-4) sensibilisiert neoplastische Lymphozy-ten, deren Malignität durch eine Hemmung der Apoptosefähigkeit gekennnzeichnet ist, für apoptotische Stimuli. Vorhergehende Studien konnten zeigen, daß eine Überexpres-sion von Par-4 bei der Apoptoseinduktion durch Chemotherapeutika zu einer Downregulation von Bcl-2, einer Aktivierung von Caspase-3, einem verstärkten Abfall des Mi-tochondrialen Membranpotentials (MMP), sowie einer verstärkten PARP-Spaltung und dadurch zum programmierten Zelltod führt. Im Rahmen dieser Arbeit konnten weitere molekulare Mechanismen aufgezeigt werden, über die die apoptosesensibilisierende Wirkung von Par-4 vermittelt wird. Es konnte gezeigt werden, daß bei Behandlung mit Doxorubicin die Par 4 Überexpression außer zur stärkeren Aktivierung von Caspase-3 auch zur stärkeren Aktivierung von Caspase-8 und -9 führt. Außerdem kann eine Caspase 3 Inhibition bei Par-4 Überexpression durch eine alternative Aktivierung der Caspasen-6,-7,-8 und -9 umgangen werden. Dieses veränderte Caspasenaktivitätsmuster läßt sich mit einer Downregulation von Mitgliedern der Inhibitors of Apoptosis Proteins (IAPs) erklären. So konnte gezeigt werden, daß es bei Apoptoseinduktion unter Überexpression von Par-4 zur Downregulation von XIAP, cIAP1 und Survivin kommt. Diese Downregulation bleibt auch unter Caspase-3 Inhibition, sowie von XIAP und Survivin sogar unter allgemeiner Caspaseninhibition bestehen, das heißt sie ist nicht Caspase-3-, bzw. überhaupt nicht Caspasen-vermittelt. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß es bei Überexpression von Par-4 unter Apoptoseinduktion mit Doxorubicin außer zum Abfall des MMPs auch zur verstärkten Ausschüttung von Cytochrom c und des Apoptosis In-ducing Factors (AIF) ins Cytosol kommt. Cytochrom c führt im Cytosol unter Bildung des Apoptosoms zur Aktivierung von Caspase-9, einem weiteren Mechanismus, der zur verstärkten Caspasenaktivität unter Par-4 Überexpression beiträgt. Die vermehrte Ausschüttung von Cytochrom c ist bedingt durch eine Translokation von tBid an die Mito-chondrienmembran. So ergaben die Untersuchungen, daß eine Par 4 Überexpression in neoplastischen T-Lymphozyten bei Behandlung mit Doxorubicin zur stärkeren Spaltung von Bid, einem Mitglied der proapoptotischen Bcl-2 Familie, sowie zur stärkeren Translokation des Bid Spaltproduktes (tBid) an die Mitochondrienmembran führt. Mit Hilfe der Immunfluoreszens konnte dargestellt werden, daß Bid in Par-4 überexprimierenden Zellen ein verändertes Verteilungsmuster im Cytosol aufweist und auf einen apoptotischen Reiz hin, verglichen mit den Par-4-negativen Zellen, vermehrt an die Mitochondrienmembran transloziert wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß Bak und Bad, zwei weitere proapoptotische Mitgliederr der Bcl-2 Familie, durch Par 4 Überexpression Caspasen unabhängig verstärkt aktiviert werden. Bak wird durch das Bid-Spaltprodukt tBid aktiviert und führt ebenfalls zu einer verstärkten Cytochrom c Freisetzung ins Cytosol, wohingegen Bad seine proapoptotische Wirkung durch Bindung an antiapoptotische Mitglieder der Bcl-2 Familie entfaltet. Darüber hinaus konnte demonstriert werden, daß die Par-4 Überexpression in neoplastischen Lymphozyten bei Behandlung mit Doxorubicin zu einer Downregulation von Ras, welches zu den GTPasen zählt, führt. Diese Downregulation ist Caspasen-, jedoch nicht Caspase-3-abhängig. Hierbei besteht kein Zusammenhang zwischen der Expression von Ras und dem Tumorsupressorgen P53. Das heißt Par-4 entfaltet seine proapoptotische Wirkung über einen P53-unabhängigen Weg. Weiterhin konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, daß Par 4 Überexpression in neoplastischen Lymphozyten zu einer verstärkten Sensibilität des Fas-Rezeptors führt, das heißt, es konnte bewiesen werden, daß der pro-apoptotische Effekt von Par 4 sowohl durch Chemotherapeutika, als auch über direkte Rezeptorstimulation ausgelöst werden kann. Insgesamt legt diese Arbeit die wesentlichen molekularen Mechanismen der pro-apoptotischen Wirkung von Par-4 in neoplastischen Lymphozyten dar.
In der vorliegenden Studie, an der 100 männliche Patienten mit manifester koronarer Herzerkrankung bzw. nach kardiochirurgischer Operation teilnahmen, wurden erstmalig randomisiert die kurz- und mittelfristigen Effekte einer ambulanten/teilstationären mit denen einer vollstationären kardialen Rehabilitation verglichen. Die körperliche Leistungsfähigkeit konnte nach kardialer Rehabilitation in beiden Gruppen signifikant gesteigert werden. Auch in der Nachbeobachtungsphase nach 6 Monaten und 12 Monaten war ein unverändert hohes Leistungsniveau nachweisbar. Zwischen den beiden Rehabilitationsformen konnten keine signifikanten Unterschiede erfasst werden. Auch auf die Verbesserung der Lipidparameter (Gesamt-Cholesterinwert, LDL-Cholesterinwert, HDL-Cholesterinwert) hatte die Rehabilitationsform keinen entscheidenden Einfluss. Während des gesamten Untersuchungszeitraumes wurden zwischen der ambulanten/teilstationären Gruppe und der vollstationären Gruppe keine signifikanten Unterschiede festgestellt. Der LDL-Cholesterinwert konnte in der vollstationären Gruppe signifikant und in der ambulanten/teilstationären Gruppe deutlich jedoch nicht signifikant nach kardialer Rehabilitation gesenkt werden, der Interventionserfolg konnte allerdings langfristig nicht stabilisiert werden. Im Gegensatz hierzu, konnte in der Nachbeobachtungsphase in beiden Gruppen ein signifikanter Anstieg des HDL-Serumcholesterinwertes beobachtet werden. Die Triglyceridwerte lagen zu Beginn und am Ende der Rehabilitation in der ambulanten / teilstationären Gruppe signifikant höher als in der vollstationären Gruppe. In der Nachbeobachtungsphase nach 6 Monaten und 12 Monaten wurden keine signifikanten Unterschiede im Vergleich beider Gruppen registriert. Bezüglich des Rauchverhaltens und der Gewichtsreduktion wurden ebenfalls zwischen den beiden Versorgungsformen keine signifikanten Unterschiede nachgewiesen. Beim Vergleich der Blutdruckwerte zeigten sich zunächst ebenfalls keine signifikanten Unterschiede. Lediglich die Gegenüberstellung der Blutdruckwerte zum Zeitpunkt der Entlassung zeigte in der ambulanten/ teilstationären Gruppe ein signifikant höheres Blutdruckniveau. Die berufliche Reintegrationsrate lag in der vorliegenden Studie im Vergleich zu den bisherigen Untersuchungen mit durchschnittlich 60 % relativ hoch, obwohl die Patienten beider Kollektive in der Regel schwere körperliche Arbeiten ausüben. Die Rehabilitationsform hatte auf die berufliche Reintegrationsrate keinen Einfluss, signifikante Unterschiede zwischen den beiden untersuchten Patientenkollektiven ließen sich nicht aufzeigen. Als zentrales Ergebnis der vorliegenden Studie zeigte sich somit, dass hinsichtlich der Ergebnisqualität zwischen den beiden Versorgungsformen keine eindeutigen Wirksamkeitsunterschiede nachgewiesen werden konnten. In beiden Rehabilitationsformen konnten bezüglich der Modifikation der Risikofaktoren, der Steigerung der körperlichen Leistungsfähigkeit sowie der beruflichen Reintegration die Effektivität der kardialen Rehabilitation belegt werden. Langfristig betrachtet können die erreichten Erfolge nur teilweise verstetigt werden. Ferner zeigte sich, dass nur wenige Patienten die ambulante/teilstationäre Rehabilitation präferierten. Bei gleichem Rehabilitationserfolg sollte vor einem mit hohen Investitionskosten verbundenem flächendeckenden Ausbau von neuen ambulanten Strukturen in weiteren Studien der Bedarf für die ambulant/teilstationäre Rehabilitation ermittelt werden.
Kardiovaskuläre Erkrankungen nehmen einen großen Sektor des gegenwärtigen Krankheitsspektrums ein. Die Entdeckung von Stammzellen, die sich zu Gefäßen oder Herzmuskelzellen entwickeln können, bietet neben bereits etablierten Behandlungen völlig neue therapeutische Ansatzpunkte zur kardialen Regeneration dieser Patienten. Neben embryonalen oder adulten Stammzellen kommen auch leicht aus dem peripheren Blut zu gewinnende endotheliale Vorläuferzellen für mögliche Therapien in Frage. Um den Ansatz der Differenzierung von Stamm- oder Vorläuferzellen in Herzmuskelzellen in vitro zu untersuchen, wurde ein bereits bekanntes Modell der Ko-Kultur von neonatalen Rattenkardiomyozyten mit verschiedenen Populationen von Stamm- oder Vorläuferzellen genutzt. Anlehnend an dieses Modell wurden in dieser Arbeit EPCs für sechs Tage zusammen mit neonatalen Kardiomyozyten der Ratte kultiviert. Es zeigt sich, dass EPCs nach sechs Tagen Ko-Kultur mit neonatalen Rattenkardiomyozyten in der Lage sind, zu Kardiomyozyten zu differenzieren und typische kardiomyozytäre Eigenschaften aufweisen, zu denen beispielsweise die Expression kardiospezifischer Proteine gehören sowie die Integration mit umliegenden Kardiomyozyten. Nach Etablierung dieses Versuchsansatzes wurde die Differenzierungskapazität der EPCs KHK erkrankter Patienten untersucht, sowie der Einfluß von Statineinnahme der Patienten, da eine prinzipielle Wirkung der Statine auf EPCs bereits vielfach beschrieben wurde. Es zeigt sich, dass auch EPCs von KHK-Patienten in der Lage sind, zu Kardiomyozyten zu differenzieren, wobei eine verringerte Differenzierungsrate zu beobachten ist. Durch Behandlung der Patienten mit Statinen lässt sich diese verringerte Kapazität verbessern, wie sich nicht nur in einer Querschnittsuntersuchung, sondern auch im prospektiven Verlauf gezeigt hat. Der Mechanismus, über den Statine eine Verbesserung der EPC-Differenzierung erreichen, ist nicht geklärt. Interessanterweise sind Statine in vitro nicht in der Lage, die EPCDifferenzierung zu Kardiomyozyten zu verbessern. Der vielversprechende Ansatz der Regeneration von Gewebe durch Stammzellen wird durch die vergleichsweise geringe Ausbeute an differenzierten Zellen limitiert. Aus diesem Grunde wurden verschiedene Versuche durchgeführt, die Differenzierungsrate in vitro anzuheben. Leider zeigen VEGF (beschrieben ist beispielsweise ein positiver Effekt auf Überleben und Migration), 5’-Azacytidine (Erhöhung der Differenzierungsrate embryonaler Stammzellen) oder hypoxisch-konditioniertes Medium (Erhöhung der Differenzierung von Stammzellen in neurales Gewebe) keinen positiven Effekt auf die EPC-Differenzierungsrate zu Kardiomyozyten. Von grundlegender Bedeutung ist es, die Mechanismen der Differenzierung von Stamm- oder Vorläuferzellen aufzuklären. Erschwert wird diese Aufgabe durch die Möglichkeit, dass in verschiedenen Geweben verschiedene Mechanismen (Zellfusion auf der einen und Transdifferenzierung auf der andere Seite) für die Stammzellintegration verantwortlich sein könnten. Mithilfe einer Ko-Kultur der EPCs mit fixierten Kardiomyozyten konnte gezeigt werden, dass die Differenzierung der EPCs zu Kardiomyozyten den direkten Kontakt zu anderen Kardiomyozyten benötigt, jedoch nicht zwingend auf einer Zellfusion basiert. Um den Differenzierungsprozess weiter zu untersuchen, wurden die für die Zell-Zell- oder Zell-Matrix- Interaktion wichtigen Proteine untersucht. In einem Blockierungsversuch der für die Zell-Matrix- Interaktion wichtigen Integrine, ließ sich kein Nachweis für eine Rolle der Integrine für den Differenzierungsprozess erbringen. Für die Zell-Zell- Interaktion stellen die kalziumabhängigen Cadherine eine wichtige Gruppe dar. In einer Ko-Kultur, die in einem kalziumfreien Medium durchgeführt wurde, ließ sich eine signifikante Reduktion des Überlebens der EPCs feststellen. Ein weiterer Versuch, der mit einer Mischung verschiedener Cadherin-blockierender Antikörper durchgeführt wurde, zeigt eine signifikante Reduktion der Differenzierung der EPCs in Kardiomyozyten. Die Untersuchung, welches Cadherin für den Differenzierungsprozess eine besondere Bedeutung spielt, ist Gegenstand gegenwärtiger Untersuchungen. Diese Doktorarbeit zeigt, dass EPCs prinzipiell in der Lage sind, in Kardiomyozyten zu differenzieren. Ebenso sind EPCs KHK-erkrankter Patienten in der Lage in Kardiomyozyten zu differenzieren, jedoch zu einem geringeren Prozentsatz. Statinbehandlung steigert den Prozentsatz der EPC-Differenzierung bei KHK-erkrankten Patienten. Mit medikamentöser Behandlung (beispielsweise Statineinnahme) könnte der Stammzelltherapieansatz bei KHK-erkrankten Patienten unterstützt werden. Erste Hinweise für den komplexen Prozess der Progenitorzelldifferenzierung weisen auf einen kalziumabhängigen, Cadherin-vermittelten Mechanismus hin.
Der Dritte Bericht des Zwischenstaatlichen Ausschusses für Klimawandel (IPCC, 2001a, b) bestätigt den Einfluss des Menschen auf das globale Klima und warnt vor einem Temperaturanstieg und vor Niederschlagsveränderungen in den nächsten 100 Jahren, die gesellschaftlichen Wohlstand und Umwelt nachhaltig beeinträchtigen können. Dabei werden weitreichende Folgen des Klimawandels angenommen, vom Anstieg des Meeresspiegels und einer möglichen Degradation von Landflächen bis hin zum Verlust von Tier- und Pflanzenarten, der Verknappung von Wasserressourcen, einer Zunahme von natürlichen Katastrophen wie Überschwemmungen und Dürren, der Ausbreitung von Krankheiten sowie negativer Auswirkungen auf die Nahrungsversorgung der Bevölkerung. Klimawandel ist dabei nur ein Aspekt des weiter gefassten ‘Globalen Wandels’, der eine Vielzahl von anthropogen verursachten Veränderungen der Umwelt einschließt. So wird zum Beispiel erwartet, dass auch demographische und sozioökonomische Entwicklungen sowie vom Menschen verursachte Landnutzungsänderungen eine erhebliche Auswirkung auf den zukünftigen Zustand der globalen Umwelt haben werden. Zu den gravierendsten Folgen des Globalen Wandels gehört die Veränderung der räumlichen und zeitlichen Verteilung der lokalen und regionalen Wasserressourcen. Es müssen daher Strategien entwickelt werden, um sowohl die Bevölkerung als auch die Umwelt vor den möglichen negativen Auswirkungen von erhöhten oder erniedrigten Pegelständen in Fließgewässern zu schützen, oder sie auf eine Veränderung der verfügbaren Wassermengen vorzubereiten. Zur Entwicklung dieser Strategien wiederum werden wissenschaftliche Szenarien und Modellberechnungen benötigt, mit deren Hilfe sich zukünftige hydrologische Verhältnisse abschätzen lassen. Zahlreiche derartige Szenarienanalysen wurden bereits durchgeführt, um den Einfluss des Klima- und Globalen Wandels auf das Wasserdargebot und auf das hydrologische Abflussregime zu untersuchen. Da Flusseinzugsgebiete eine natürliche und angemessene Betrachtungseinheit für dieses Problem darstellen, konzentrieren sich die meisten dieser Studien auf mittlere bis große Einzugsgebiete oder auf bestimmte Regionen zusammenhängender Flussgebiete. In Europa gibt es dazu Beispiele aus den frühen neunziger Jahren, als die Resultate der ersten Klimamodelle verfügbar wurden (z.B. Ott et al., 1991: für die Mosel; Kwadijk und van Deursen, 1993: Rhein; Vehviläinen und Huttunen, 1994: Vuoksi; Broadhurst und Naden, 1996: Severn; Bergström, 1996: Einzugsgebiet der Ostsee). Für diese Studien wurden hydrologische Modelle des jeweiligen Einzugsgebiets entwickelt und der Einfluss des Klimawandels auf den Abfluss bestimmt. Krahe und Grabs (1996) haben ein Wasserbilanzmodell mit einer Auflösung von 0.5° x 0.5° für den gesamten mitteleuropäischen Raum entwickelt und es anhandder Abflussdaten des Rheins, der Weser, der Ems, der Elbe und des deutschen Teils der Donau validiert. Arnell (1994, 1999), bzw. Arnell et al. (2000) untersuchten die Auswirkung des Klimawandels auf europäische Wasserressourcen ebenfalls mithilfe rasterbasierter Modellansätze. Schließlich zeigten Stanners und Bourdeau (1995), EEA (1999), Parry (2000), oder auf globaler Ebene WBGU (1999) und IPCC (1992, 2001a, b), in allgemeineren und politisch orientierten Untersuchungen den gegenwärtigen Zustand sowie mögliche zukünftige Entwicklungen der Umwelt in Europa und weltweit auf, einschließlich verschiedener Aspekte der kontinentalen Wasserressourcen und der Hydrologie. Im Vergleich zu den zahlreichen einzugsgebietsorientierten Analysen und ihrem stetig steigenden wissenschaftlichen Anspruch bis hin zu äußerst detaillierten Fragestellungen sind die regionalen oder globalen Ansätze jedoch eher selten und bleiben meist relativ unspezifisch in ihren Schlussfolgerungen. Darüber hinaus wird die Auswirkung der Wassernutzung, die erheblich zur Veränderung der zukünftigen Wasserressourcen und Abflussmengen beitragen kann, in den meisten Fällen aufgrund des Fehlens entsprechender Daten nicht berücksichtigt. In Anbetracht dieser Mängel wurde 1999 am Wissenschaftlichen Zentrum für Umweltsystemforschung an der Universität Kassel das EuroWasser-Projekt initiiert, auf dessen Durchführung die vorliegenden Dissertation beruht. In einem integrierten Modellansatz wurden in EuroWasser die Folgen von Klimawandel und sozioökonomischen Veränderungen auf die natürliche Wasserverfügbarkeit und die Wassernutzung auf gesamteuropäischer Ebene untersucht (siehe Abschlussbericht, Lehner et al., 2001). Das EuroWasser-Projekt versucht dabei drei aus Sicht von Gesellschaft, Ökonomie und Umwelt kritische Fragen zu beantworten: (1) Wie hoch ist der gegenwärtige Wasserstress in verschiedenen Regionen Europas, und welche zukünftigen Veränderungen sind zu erwarten? (2) Wie wird sich der Globale Wandel auf das europäische Wasserkraftpotenzial auswirken? Und (3) In welchen "kritischen Gebieten" Europas muss, basierend auf den Ergebnissen verschiedener Szenarien des Globalen Wandels, damit gerechnet werden, dass die Hochwasser- und Dürregefahr in Zukunft zunimmt, und von welcher Größenordnung sind diese Veränderungen? ...
Untersuchungen zur Rolle von 14-3-3-Proteinen beim Wachstum von Neuriten in neuronalen Kulturen
(2004)
In dieser Arbeit konnte per Western-Blot-Analyse gezeigt werden, dass 14-3-3-Proteine ein primär überlappendes Expressionsmuster in den Organen der Ratte Herz, Leber, Niere, Pankreas, Lunge, Milz, Groß- und Kleinhirn, zeigen. 14-3-3 zeta wird in Großhirnhomogenaten wesentlich stärker exprimiert als in allen anderen Organen, auch dem Kleinhirn, was für eine wichtige Rolle bei höheren neurologischen Funktionen sprechen könnte. Daher wurde auf eine isoformspezifische Funktion von 14-3-3 zeta in Nervenzellen spekuliert. Es wurden Deletionsmutanten von 14-3-3 zeta per PCR hergestellt und in den Expressionsvektor pcDNA3.1 kloniert. HEK-Zellen wurden mit diesem Plasmid und pEGFP-C-Aktin, einem Vektor, der die Gene für F-Aktin und grünes Fluoreszenzprotein aneinander gekoppelt enthält, kotransfiziert. Die Konstrukte 14-3-3 zeta-C-Terminus und -Helix 5/6 sollten in den Zellen so reichlich exprimiert werden, dass sie dominant-negativ wirken, indem sie die Funktion des endognen, intakten Proteins unterdrücken. Der generelle Transfektionserfolg zeigte sich durch eine kräftige grüne Anfärbung des neu synthetisierten Aktins in einem Großteil der Zellen. Die Zellen waren sämtlich, egal mit welchem 14-3-3-Konstrukt sie transfiziert waren, zu einer bedarfsgerechten Umlagerung ihres Aktins in wachsenden und sich teilenden Zellen in der Lage und zeigten einen normalen Aktinkortex. Auch morphologische Auffälligkeiten ergaben sich nicht. Die Methode der Aktinfärbung mittels pEGFP-C-Aktin-Transfektion konnte etabliert und mit der Darstellung des Aktins durch fluoreszenzmarkiertes Phalloidin verglichen werden. Ferner konnten durch die Proteinbestimmung in sich differenzierenden PC12-Zellen die unterschiedlichen Expressionsmuster der einzelnen 14-3-3 Isoformen während der Neurogenese und die frühe und drastische Induktion von 14-3-3 epsilon zum Zeitpunkt der Neuritenanlage gezeigt werden. Schließlich wurde die subzelluläre Kompartimentierung der verschiedenen 14-3-3-Isoformen durch Doppelimmunfluoreszenzfärbung gezeigt. Sie haben untereinander sehr ähnliche Expressionsmuster und halten sich überwiegen im Zytoplasma und der perinukleären Region auf. Den Nukleus sparen 14-3-3-Proteine in diesen Zellen im wesentlichen aus und gelangen auch nicht direkt an die Plasmamembran. Die Vesikelpopulation, die mit dem Vesikelmarker Synaptophysin angefärbt wurde, befindet sich in denselben Zellkompartimenten wie 14-3-3, innerhalb derer die beiden Proteine aber räumlich voneinander getrennt bleiben und nicht kolokalisieren.
This study aims primarily at exploring the images of Swahili women as depicted in taarab songs in Zanzibar and factors that shape these images at different epochs or points in time. The corpus used in this study was collected in Zanzibar from Sep- tember to November 1999. A secondary concern of the present study is to highlight the history of taarab songs in Zanzibar and to identify the relationship between this art of songs and the Egyptian song. The study has adopted a holistic approach with more concentration on sung lyrics. The analysis is des- criptive and utilizes perspectives of literary theories of orature as well as insights from gender, cultural, structural and functional theories. The present study argues that Swahili taarab songs belong to the realm of oral literature, though in this case not in the sense of “classical oral literature”which excludes the notion of literacy. In taarab, the songs combine together features of both oral and written literature. They reflect comprehensively the Swahili culture and are thus con- sidered by the Swahili themselves as an indigenous genre of music despite its Arabian and other foreign roots. The study highlights the cultural milieu of taarab songs in Zanzibar and explores metaphors, symbols referring to women, and the sources of imagery used in these songs. Taarab songs have stylistically developed through their history. The study identifies two categories of classical taarab songs each of which has its own distinctive characteristics. The first category concerns those songs sung for the first time before 1945, and the second one those sung afterwards. Taarab lyrics have distinctive features, which they have acquired over time through efforts of the Swahili creative artists. They adhere
strictly to the conditions and conventions of Swahili traditio nal poetic structure. The lyrics have enriched the Swahili language with a lot of expressions, which came in use firstly through taarab lyrics. The various facets of the taarab com- plex, including prominent features of taarab performance- and the salient linguistic aspects of taarab lyrics, have also
been discussed.
Bis zur Entfaltung der Wirkung eines Pharmakons laufen zahlreiche komplexe Vorgänge ab, die sich in drei wesentliche Phasen unterteilen lassen. Die pharmazeutische Phase umfasst mit der Applikation und dem Zerfall der Arzneiform sowie dem Auflösen des Wirkstoffes Vorgänge, die im wesentlichen von den galenischen Eigenschaften des Arzneistoffes abhängen. In der pharmakokinetischen Phase erfolgt mit der Resorption die Aufnahme des Wirkstoffes in den Organismus, dem sich die Verteilung in die unterschiedlichen Gewebe über die Blutbahn anschließt. Durch verschiedene Eliminationsprozesse wird der Wirkstoff zuletzt wieder aus dem Körper ausgeschieden. Mit dem Erreichen des Wirkortes beginnt die pharmakodynamische Phase, in der die pharmakologischen Effekte des Arzneistoffes zur erwünschten klinischen Wirkung führen. Der Nachweis des Pharmakons am Wirkort in klinisch-relevanten Konzentrationen ermöglicht somit Rückschlüsse auf die Wirksamkeit des Arzneistoffes, aber unter bestimmten Voraussetzungen auch auf dessen Wirkmechanismus. Während mittlerweile ein Großteil neuer Arzneistoffe mit Hilfe unterschiedlicher Mechanismen durch exaktes Drug Targeting an den Wirkort gesteuert werden, weisen andere Substanzen teilweise ungewollt eine gewebespezifische, dirigierende Komponente auf, die neben der eigentlichen Hauptwirkung weitere unterstützende oder auch unerwünschte Effekte auslösen. Von besonderem Interesse ist diese Gewebespezifität für pflanzliche Arzneistoffe, deren Wirkkomponenten bislang noch nicht eindeutig bestimmt werden konnten. Gemeinsam mit anderen pharmakologischen Befunden kann der analytische Nachweis eines wirksamkeitsmitbestimmenden Inhaltsstoffes am Wirkort in ausreichenden Konzentrationen ein weiterer deutlicher Hinweis auf dessen Wirkbeteiligung sein. Besonders vor dem Hintergrund einer rationalen, evidenz-basierten Pharmakotherapie, deren Anforderungen die pflanzlichen Arzneien mittlerweile ebenso wie die synthetischen Wirkstoffe erfüllen müssen, ist die Erforschung sowohl des Wirkprinzips als auch der Pharmakokinetik des Wirkstoffes von besonderer Bedeutung. Obwohl Johanniskrautextrakte bereits seit dem 17. Jahrhundert gegen die Melancholie und somit als Antidepressivum eingesetzt wurden, sind sowohl der exakte Pathomechanismus der Depression als auch die Wirkkomponente und der Wirkmechanismus der Extrakte aus Hyperici herba noch immer Gegenstand umfassender Forschung. Vor allem wegen der geringen Nebenwirkungsrate sind Johanniskrautpräparate gegenüber synthetischen Antidepressiva eine bevorzugte Alternative für die Therapie leichter bis mittelschwerer Depressionen. Ähnlich den Effekten der synthetischen Antidepressiva sind Johanniskrautextrakte in der Lage, durch eine Wiederaufnahmehemmung der Neurotransmitter Noradrenalin, Serotonin, Dopamin, sowie GABA und L-Glutamat deren Konzentration im synaptischen Spalt zu erhöhen, was zu einer nachfolgenden adaptiven Veränderung der jeweiligen Rezeptoren führt. In mehreren Studien konnten diese Effekte vornehmlich den Phloroglucinolderivaten Hyperforin und Adhyperforin zugeordnet werden. Unterstützt wurden diese in vitro und in vivo Befunde durch die Ergebnisse einer Vielzahl verhaltenspharmakologischer Untersuchungen, die einen deutlichen Zusammenhang zwischen der Wirksamkeit in antidepressiven Modellen und dem Gehalt an Hyperforin in den Extrakten ergeben haben. Zahlreiche klinische Studien belegen darüber hinaus die Wirksamkeit und Verträglichkeit von Johanniskrautextrakten. ...