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Heute gewinnen pflanzliche Arzneimittel im Zeichen einer verstärkten Hinwendung zu natürlichen, relativ nebenwirkungsarmen Medikamenten zunehmend an Bedeutung, so auch die über Jahrtausende hinweg traditionell angewandte Ginsengwurzel (Panax ginseng) und der Indische Weihrauch (Boswellia serrata). Neben der Struktur- und Extraktanalytik konzentriert sich die Forschung in zunehmenden Maße darauf, die zahlreichen pharmakologisch untersuchten und klinisch beobachteten Wirkungen dieser beiden Arzneipflanzen einzelnen Inhaltsstoffen zuzuordnen. Bei der Ginsengwurzel gestaltet sich dies jedoch besonders schwierig. Dies ist begründet durch die große Anzahl strukturell ähnlicher Ginsenoside sowie durch deren unterschiedlicher Metabolismus. Zwar ist aus In-vitro-Experimenten bekannt, daß die Degradation über die stufenweise Deglukosylierung stattfindet, allerdings ist bislang nicht geklärt, ob intakte Ginsenoside überhaupt resorbiert werden und welche der vielen in vitro ermittelten Degradationsprodukte tatsächlich den systemischen Kreislauf erreichen. Anders als bei Ginseng, kann die therapeutische Wirkung des Indischen Weihrauches wohl definierten Inhaltsstoffen, AKBA und KBA, zugeschrieben werden. Dennoch mangelt es hier an verlässlichen pharmakokinetischen Daten, da bislang keine validierte bioanalytische Methode zur Verfügung stand. Im Rahmen der Bioanalytik von Ginsenosiden und Boswellliasäuren kamen in der vorliegenden Arbeit die Nano-ESI-MS(n)-Technik sowie die HPLC-Analytik zur Anwendung. Bereits bei der Strukturanalyse von Ginsenosiden erwies sich die Kombination der Nano-ESI-Technik mit MS(n)-Experimenten in einer Quadrupol-Ionenfalle als besonders vorteilhaft. Im Vergleich zu konventionellem ESI bietet Nano-ESI nicht nur den Vorzug, mit kleinsten Substanzmengen lange Messungen durchführen zu können, sondern auch den Vorteil einer effektiveren, weniger diskreminierenden Ionisation. Sowohl die hohe Sensitivität der Nano-Elektrosprayionisierung bei der Analyse von glykosidischen Verbindungen als auch die umfangreichen Strukturinformationen infolge mehrerer aufeinanderfolgender stoßinduzierter Fragmentierungen machen diese Technik zu einer attraktiven und effizienten Methode zur Analyse von Ginsenosiden. In MS(n)-Experimenten äußert sich das charakteristische Fragmentierungsverhalten der Ginsenoside in der sequentiellen Abspaltung der Zuckereinheiten in sukkzessiven Fragmentierungsschritten. Mit dieser Methode konnten die Zuckerketten an verschiedenen Positionen des Protopanaxadiol- bzw. Protopanaxatriolaglykons der Ginsenoside identifiziert, die glykosidischen Verknüpfungen innerhalb der einzelnen Zuckereinheiten durch spezifische Ringfragmente bestimmt und die genaue(n) Verknüpfungsposition(en) enzymatisch eingeführter Galaktose(n) lokalisiert werden. Bisher wurden allerdings Nano-ESI-MS/MS bzw. MS(n)-Untersuchungen primär an wässrigen oder organischen Lösungen von isolierten / aufgereinigten Stoffen oder Stoffgemischen durchgeführt. In dieser Arbeit wurde erstmals diese Technik in der Bioanalytik zur Identifizierung von Ginsenosiden und deren Degradationsprodukte in Humanplasma und -urin angewandt. Obwohl die optimale Analytkonzentration für die Nano-Elektrosprayionisierung im allgemeinen bei 10-5M liegt, ist es gelungen, die Ginsenoside anhand ihrer spezifischen Fragmentionen im MS/MS Modus bis zu einer Konzentration von 2 ng/mL (10-8M) in biologischen Matrices nachzuweisen. Auch wenn die Molekülionenpeaks bei diesen geringen Konzentrationen im Rauschen untergehen, können die Ginsenoside durch selektive Isolierung der gewünschten Vorläuferionen und deren anschließende Fragmentierung in der Quadrupol-Ionenfalle auf der Basis der Detektion spezifischer Fragmente identifiziert werden. Da bei der Fragmentierung der gleichen Vorläuferionenmasse in Leerplasma bzw. Urin keine charakteristischen Fragmentionen gebildet werden, handelt es sich somit um einen spezifischen Nachweis der Ginsenoside in biologischen Matrices. Vor dem Hintergrund dieser vielversprechenden Vorversuche wurde eine Pilotstudie zum qualitativen Screening von Ginsenosiden und deren Metaboliten in Humanplasma und –urin durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, daß Protopanaxatriol-Ginsenoside sowohl im Magen hydrolysiert als auch intestinal degradiert werden. Schon in den ersten Stunden nach der einmaligen oralen Einnahme von Ginsana G115 Kapseln wurden die Hydrolyseprodukte G-Rh1 und hydratisiertes G-Rh1 in Humanplasma detektiert. Die schnelle Resorption dieser beiden Verbindungen aus dem oberen Gastrointestinaltrakt deutet auf die Hydrolyse des Ginsenosides Rg1 im Magen hin. Das spätere Auftreten eines weiteren monoglukosylierten Protopanaxatriols, des Degradationsproduktes G-F1, liefert den ersten In-Vivo-Hinweis auf einen intestinalen Metabolismus von Protopanaxatriol-Ginsenoside. Im Gegensatz zu den Protopanaxatriolginsenosiden passieren die Protopanaxadiol-Ginsenoside den Magen unverändert, wie aus der Abwesenheit jeglicher Protopanaxadiol-Degradationsprodukte im Plasma und Urin in den ersten Stunden nach der Applikation geschlossen werden kann. Erst im unteren Gastrointestinaltrakt werden Protopanaxadiol-Ginsenoside durch intestinale Bakterien zu „Compound-K“ abgebaut und anschließend resorbiert. Der Nachweis von Ginsenosid Rb1 im Plasma, sowie weiterer Ginsenoside im Urin eines Probanden zeigt, daß auch Ginsenoside in ihrer intakten Form resorbiert werden können. Dennoch sind weitere Studien hierzu notwendig, um zu klären, ob die Resorption intakter Ginsenoside die Regel oder eher eine Ausnahme darstellt. Mit der Identifizierung des Hydrolyseproduktes G-Rh1, der Degradationsprodukte G-F1 sowie „Compound-K“ in Humanplasma und -urin konnte schließlich die Frage geklärt werden, welche der zahlreichen in vitro bestimmten Degradationsprodukte tatsächlich den systemischen Kreislauf erreichen. Damit ist die Basis für eine spätere Quantifizierung dieser Verbindungen nach ihrer Isolierung bzw. Herstellung und Charakterisierung als Referenzsubstanzen geschaffen. Außerdem können diese neuen Erkenntnisse helfen, pharmakologische Ergebnisse aus In-vitro-Versuchen mit In-vivo-Daten besser zu korrelieren, da sie erste Hinweise geben, welche der in vitro getesteten Substanzen für die in vivo beobachteten Effekte verantwortlich sein könnten. Bisher wurde Nano-ESI-MS(n) in der Bioanalytik pflanzlicher Arzneistoffe nicht eingesetzt. In dieser Arbeit wurde diese Technik erstmals zum Screening von Ginsenosiden und deren Degradationsprodukte in Humanplasma und –urin benutzt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß Nano-ESI-MS(n) auch eine empfindliche und sensitive Methode zur Identifizierung und zum Nachweis anderer medizinisch relevanter glykosidischer Verbindungen in biologischen Matrices darstellt, woraus sich neue Perspektiven für den Einsatz dieser Technik in der Metabolitenforschung sowie in der Bioanalytik pflanzlicher Xenobiotika ergeben. In den letzten Jahren rückte auch der Indische Weihrauch immer mehr in den Mittelpunkt des wissenschaftlichen sowie therapeutischen Interesses. Aufgrund der selektiven Hemmung der 5-Lipoxygenase gewinnen AKBA und KBA, als neue entzündungshemmende Verbindungen, zunehmend an Bedeutung. Während die quantitative Analytik der Boswelliasäuren in Extrakten und in verschiedenen Fertigarzneimitteln erhebliche Fortschritte erzielen konnte, fehlten auf dem Gebiet der Bioanalytik bislang validierte analytische Methoden zur Durchführung pharmakokinetischer Studien. Vor diesem Hintergrund wurde eine HPLC-Methode zur Bestimmung von KBA in Humanplasma entwickelt und validiert. Die Methode ist durch eine einfache Probenvorbereitung gekennzeichnet, die sich auf eine Festphasenextraktion der KBA aus der komplex zusammengesetzten biologischen Matrix beschränkt. Im Anschluß an die chromatographische Trennung auf einer RP-C18 Säule erfolgt die Quantifizierung der KBA mittels UV-Detektion bei 250 nm. Um eine adäquate Bestimmung der KBA in Humanplasma zu gewährleisten, wurde eine umfassende Validierung durchgeführt. Alle ermittelten Validierungsparameter, wie Spezifität, Linearität, Präzision, Richtigkeit, Reproduzierbarkeit, untere Quantifizierungsgrenze und Stabilität lagen innerhalb der vorgegebenen Grenzen. Damit erfüllt die entwickelte HPLC-Methode die allgemein gültigen Anforderungen an die Validierung bioanalytischer Methoden. Mit der Erstellung einer Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve im Rahmen einer ersten Pilotstudie konnte diese Methode zudem ihre praktische Anwendbarkeit unter Beweis stellen. Somit steht für zukünftige pharmakokinetische Studien eine validierte HPLC-Analytik zur Bestimmung von KBA, einer der Hauptwirkstoffe des Indischen Weihrauches, zur Verfügung, die sich durch hohe Spezifität, Reproduzierbarkeit und Präzision auszeichnet. Verlässliche Daten zur Pharmakokinetik am Menschen sind heute von besonderer Bedeutung, da sie helfen, die Dosierung zu optimieren, die biopharmazeutischen Eigenschaften von Präparaten zu verbessern und die Sicherheit bei der Anwendung zu erhöhen. Insbesondere im Hinblick auf bereits festgestellte Interaktionen von pflanzlichen Arzneimitteln mit Medikamenten reicht es nicht mehr aus, wenn sich pflanzliche Arzneimittel, wie beispielsweise Ginseng und Indischer Weihrauch, nur auf ihre langjährigen tradierten Anwendungserfahrungen berufen. So wird auch bei Phytopharmaka in verstärktem Maße eine wissenschaftliche Absicherung durch bioanalytische Forschung erwartet. Mit der Identifizierung der Ginsenoside und deren Degradationsprodukte im Menschen, der erstmaligen Anwendung von Nano-ESI-MS(n) in der Metabolitenforschung und der Entwicklung einer validierten bioanalytischen Methode zur Bestimmung der 11-Keto-Beta-Boswelliasäure in Humanplasma wurde diesen Erfordernissen Rechnung getragen.
Rationale und traditionelle Johanniskrautextrakt-Präparate : pharmazeutische Qualität im Vergleich
(2003)
Durch die zunehmende Bedeutung der Selbstmedikation wird die Beratungskompetenz der Apotheker immer wichtiger. Johanniskrautextrakt-Präparate sind in Deutschland nicht nur in der Apotheke, sondern auch in Drogerien und Supermärkten erhältlich. Sie besitzen einen unterschiedlichen Zulassungsstatus und damit verbunden Unterschiede in den qualitativen Anforderungen, die an sie gestellt werden. Nur durch eine kritische Bewertung von Erkenntnismaterial ist es möglich, aus einer sehr inhomogenen Gruppe qualitativ gute Johanniskrautextrakt-Präparate hervorzuheben. Bei den nach AMG zugelassenen und dem aktuellen Wissensstand entsprechenden Johanniskrautextrakt-Präparaten handelt es sich ausschließlich um Monopräparate, die als Wirkstoff Johanniskraut-Trockenextrakt enthalten. Für den Einsatz von gepulverter Droge fehlen bis heute klinische Belege. Auch für die Anwendung von fixen Kombinationen von mehreren pflanzlichen Extrakten steht eine rationelle Begründung bislang aus. Der Trockenextrakt muss durch ein Droge-Extrakt-Verhältnis und durch das verwendete Extraktionsmittel charakterisiert sein. Als Extraktionsmittel zur Herstellung der Extrakte sollte Methanol oder Ethanol verwendet werden. Als therapeutisch wirksame Tagesdosis gelten 2 – 4 g Drogenäquivalente. Die eingangs gestellte Frage, ob sich apothekenpflichtige Johanniskrautextrakt- Präparate von den Johanniskrautprodukten aus dem Drogerie-Segment abgrenzen, kann an Hand der vorliegenden Datenlage beantwortet werden. Untersuchungen hinsichtlich des Inhaltstoffspektrums zeigen, dass die Gehalte an wirksamkeitsmitbestimmenden Inhaltsstoffen, besonders die Hyperforin Werte, bei apothekenpflichtiger Ware deutlich höher sind, als dies bei nicht apothekenpflichtigen Präparaten der Fall ist. Die nicht apothekenpflichtigen Johanniskraut-Präparate sind dadurch charakterisiert, dass die mit der empfohlenen Tagesdosis zugeführte Wirkstoffmenge zum Teil erheblich unter jener liegt, die heute als erforderlich für eine Depressionsbehandlung angesehen wird. Bei den nicht apothekenpflichtigen Präparaten kam es zu erheblichen Schwankungen im Wirkstoffgehalt einzelner Chargen. Im pharmakologischen in vitro Assay schnitten die nicht apothekenpflichtigen Produkte bezüglich ihrer Wirkstärke, die Serotoninwiederaufnahme zu hemmen, deutlich schlechter ab als die apothekenpflichtigen Präparate. Es konnte eine sehr gute Korrelation der erotoninwiederaufnahmehemmung mit den jeweiligen Hyperforin-Gehalten der untersuchten Fertigarzneimittel aufgestellt werden. Die Wirksamkeit von Johanniskrautextrakt-Präparaten bei leichten bis mittelschweren Formen der Depression gilt heute als gesichert, sofern qualitativ hochwertige Extrakte in ausreichend hoher Dosierung eingesetzt werden. Die apothekenpflichtigen Präparate werden dem Anspruch, der an rationale Phytopharmaka gestellt wird, gerecht und sind daher als qualitativ besser einzustufen als nicht apothekenpflichtige Produkte. Die Untersuchung des Freisetzungsverhaltens von Hyperforin aus Jarsin® Präparaten macht deutlich, wie wichtig die Galenik von Johanniskrautextrakt-Präparaten im Hinblick auf die Bioverfügbarkeit der Inhaltstoffe ist. Jarsin®300 zeigt lediglich in 4 von 18 untersuchten Prüflingen eine 90-prozentige Freisetzung. Die Ursache hierfür liefert das Ergebnis der Untersuchungen der Dragee-Kerne. Zu hohe Presskräfte bei der Herstellung und ein Fehlen von Sprengmitteln in der Formulierung führen dazu, dass die Dragees in der vorgeschriebenen Versuchsdauer nicht zerfallen und Hyperforin nur unzureichend freigesetzt wird. Jarsin® 450 Tabletten entsprechen den Anforderungen, die an ein rationales Johanniskrautextrakt-Präparat gestellt werden. Bei dem Präparat Jarsin®750 müsste die Galenik dahingehend verbessert werden, dass die Freisetzung nicht vom Lösen des Überzugs und vom Zerfall der Tablettenkerne abhängig ist. Chargenkonformität ist bei allen untersuchten Jarsin® Präparaten gewährleistet. Untersuchungen zur Löslichkeit und zum Freisetzungsverhalten von Biapigenin aus Johanniskrautextrakt-Präparaten zeigen eine deutliche Abhängigkeit vom erwendeten Freisetzungsmedium. Wie schon für die Inhaltstoffe Hyperforin und Hypericin festgestellt werden konnte, besitzt nur das Medium FeSSIF diskriminierende und zugleich lösungsvermittelnde Eigenschaften. Um eine vollständige Freisetzung aller pharmazeutisch relevanten Inhaltstoffe zu gewährleisten, sollte die Einnahme von Johanniskrautextrakt-Präparaten nur mit einer Mahlzeit erfolgen. Durch den Vergleich der Freisetzungsprofile unterschiedlicher Johanniskrautextrakt-Präparate konnte deutlich gemacht werden, dass sie nicht vergleichbar und damit nicht ohne weiteres austauschbar sind. Für die Entscheidung, ob ein Johanniskrautextrakt-Präparat im Sinne der „aut idem Regelung“ durch ein anderes ausgetauscht werden kann, genügt es nicht, dass beide Produkte dieselbe Menge Extrakt derselben Ausgangsdroge aufweisen. Es muss zunächst sichergestellt werden, dass die beiden Präparate pharmazeutische Äquivalenz aufweisen. Die Untersuchungen von vermeintlich äquivalenten Johanniskrautextrakt-Präparaten zeigten deutlich, dass sie sich sowohl im Gehalt an pharmazeutisch relevanten Inhaltstoffen als auch im Freisetzungsverhalten erheblich unterscheiden. Die „autidem Regelung“ ist für Phytopharmaka somit nicht anwendbar. Die Möglichkeit, zwei Märkte zu beliefern, den apothekenpflichtigen und den nicht apothekenpflichtigen Arzneimittelmarkt, bietet der Industrie die Möglichkeit, sehr ähnliche Produkte mit allerdings erheblich unterschiedlichen Anforderungen anzubieten. Dies stellt für die rationalen Phytopharmaka in sofern eine Gefahr dar, als dass der Laie im Zweifelsfall eher zu den günstigen nicht apothekenpflichtigen Präparaten greift. Zusätzlich wird dem Patienten durch gezielte Werbekampagnen in Bezug auf die nicht apothekenpflichtige Ware gute Qualität durch traditionelle Anwendung suggerieren. Nicht apothekenpflichtige Präparate dürften nach heutigem Kenntnisstand jedoch gar nicht wirksam sein. Rechtlich gesehen erheben sie auch keinen Anspruch auf Wirksamkeit, da sie sich durch Hinweise in der Packungsbeilage von den apothekenpflichtigen Präparaten abgrenzen müssen. Das Problem liegt in der für den Laien fehlenden Transparenz. Nur Fachleuten sind die Unterschiede im Zulassungsstatus und den damit verbundenen Anforderungen an Qualität und Wirksamkeit der Johanniskrautextrakt-Präparate bekannt. Auf europäischer Ebene ist der Phytopharmakamarkt nicht einheitlich geregelt. Phytopharmaka zählen in vielen Ländern zu den Nahrungsergänzungsmitteln. Um zu verhindern, dass auch seriöse Phytopharmaka durch Harmonisierungsverfahren der EU aus dem Arzneimittelsegment herausgenommen werden, ist es notwendig, dass die rationalen Phytopharmaka den Anforderungen die an chemisch synthetische Arzneimittel gestellt werden, gewachsen sind. In diesem Zusammenhang ist die seit diesem Jahr gültige USP Monographie „Powdered St. Johns Wort Extract“ zu begrüßen, da sie hohe Anforderungen bezüglich des Gehaltes an Inhaltstoffen stellt. Nur wenn gesetzlich vorgeschrieben wird, welche Kriterien rationelle Phytopharmaka erfüllen müssen, wird einheitliche Qualität gewährleistet. Auf europäischer Ebene wäre die Einführung einer Johanniskrautextrakt-Monographie mit definierten Anforderungen nach dem Vorbild der USP wünschenswert. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Wirksamkeit von Johanniskrautextrakt-Präparaten bei leichten bis mittelschweren Formen der Depression heute als gesichert gilt. Vorraussetzung ist allerdings, dass qualitativ hochwertige Extrakte mit gleich bleibender Qualität in ausreichend hoher Dosierung eingesetzt werden. Da mit Veränderungen in der Zusammensetzung eines Fertigarzneimittels auch Veränderungen in der Wirksamkeit entstehen können, ist die reproduzierbare Qualität aus pharmazeutischer Sicht eine elementare Forderung. Apothekenpflichtige Arzneimittel sind auf Grund ihrer Überlegenheit bezüglich ihres Gehalts an pharmazeutisch relevanten Inhaltsstoffen, Chargenkonformität sowie ihrer Wirksamkeit im pharmakologischen Sinne, den nicht apothekenpflichtigen Arzneimitteln vorzuziehen. Vor dem Hintergrund, dass die Droge Johanniskraut auf der Indikationsliste nach § 109a Absatz 3 AMG des BfArM lediglich in Form von öligen Zubereitungen aus Johanniskrautflüssigextrakt, äußerlich angewandt, zur Unterstützung der Hautfunktion geführt wird, sollte die Freiverkäuflichkeit von nicht apothekenpflichtigen Johanniskrautextrakt-Präparaten bereits aufgehoben sein. In wirksamer Dosierung handelt es sich bei Johanniskrautextrakt-Präparaten um Arzneimittel, die nicht ohne die kompetente Beratung des Apothekers bzw. des pharmazeutischen Fachpersonals eingenommen werden sollten.
The endothelin B receptor belongs to the rhodopsin-like G-protein coupled receptors family. It plays an important role in vasodilatation and is found in the membranes of the endothelial cells enveloping blood vessels. During the course of this work, the production of recombinant human ETB receptor in yeast, insect and mammalian cells was evaluated. A number of different receptor constructs for production in the yeast P. pastoris was prepared. Various affinity tags were appended to the receptor N-and C-termini to enable receptor detection and purification. The clone pPIC9KFlagHisETBBio, with an expression level of 60 pmol/mg, yielded the highest amount of active receptor (1.2 mg of receptor per liter of shaking culture). The expression level of the same clone in fermentor culture was 17 pmol/mg, and from a 10L fermentor it was possible to obtain 3 kg of cells that contained 20-39 mg of the receptor. For receptor production in insect cells, Sf9 (S. frugiperda) suspension cells were infected with the recombinant baculovirus pVlMelFlagHisETBBio. The peak of receptor production was reached at 66 h post infection, and radioligand binding assays on insect cell membranes showed 30 pmoL of active receptor /mg of membrane protein. Subsequently, the efficiency of different detergents in solubilizing the active receptor was evaluated. N-dodecyl-beta-D-maltoside (LM), lauryl-sucrose and digitonine/cholate performed best, and LM was chosen for further work. The ETB receptor was produced in mammalian cells using the Semliki Forest Virus expression system. Radioligand binding assays on membranes from CHO cells infected with the recombinant virus pSFV3CAPETBHis showed 7 pmol of active receptor /mg of membrane protein. Since the receptor yield from mammalian cells was much lower than in yeast and insect cells, this system was not used for further large-scale receptor production. After production in yeast and insect cells, the ETB receptor was saturated with its ligand, endothelin-1, in order to stabilize its native form. The receptor was subsequently solubilized with n-dodecyl-beta-D-maltoside and subjected to purification on various affinity matrices. Two-step affinity purification via Ni2+-NTA and monomeric avidin proved the most efficient way to purify milligram amounts of the receptor. The purity of the receptor preparation after this procedure was over 95%, as judged from silver stained gels. However, the tendency of the ETB receptor produced in yeast to form aggregates was a constant problem. Attempts were made to stabilize the active, monomeric form of the receptor by testing a variety of different buffer conditions, but further efforts in this direction will be necessary in order to solve the aggregation problem. In contrast to preparations from yeast, the purification of the ETB receptor produced in insect cells yielded homogeneous receptor preparations, as shown by gel filtration analysis. This work has demonstrated that the amounts of receptor expressed in yeast and insect cells and the final yield of receptor, isolated by purification, represent a good basis for beginning 3D and continuing 2D crystallization trials.
Für die Kunst um 1970 lässt sich ein Bedürfnis nach der Konstruktion und Darstellung von Identitäten am Körperbild des Künstlers feststellen. Unter verschiedenen Gesichtspunkten greifen Künstler Themen der Zeit auf, indem sie selbst in die Rolle des Anderen schlüpfen. Sie verwenden hierfür Masken als verfremdende Mittel, die nicht unbedingt auch als solche zu erkennen sein müssen. Wesentlich ist nur, dass eine nachvollziehbare Differenz zwischen der persönlichen Identität des Künstlers und der von ihm thematisierten fremden Identität besteht. Mit Hilfe solcher Verfremdungen gelingt eine Verknüpfung von Gezeigtem – dem veränderten Körperbild des Künstlers – und Gemeintem – der neu angenommenen Identität, die sich aus der Konstruktion ergibt. Unterstützt wird diese offene Auffassung von Rollenspiel durch die eingesetzten Bildmedien, die den Blick auf den Körper des Künstlers für die (spätere) Rezeption zugänglich machen. Performance, Fotografie und (Video)Film verfolgen nicht allein dokumentarische Ziele, sondern greifen in die Maskerade selbst mit ein und unterstützen den performativen Akt der Identitätshinterfragung. Selbst noch so unterschiedlich scheinende künstlerische Ansätze in der Reflexion der Identitätsproblematik innerhalb des untersuchten Spektrums können dennoch auf eine Gemeinsamkeit zusammengeführt werden. Die Beschäftigung mit dem Körperbild als Trägermedium einer Identität geht im untersuchten Bereich über die Reflexion der eigenen Identität des Künstlers und der Beschäftigung mit persönlichen Krisen hinaus. Die eingebrachte Verfremdung der äußeren Erscheinung ermöglicht nicht nur dem Betrachter, zwischen Künstler und Darstellung zu differenzieren. Auch der Künstler selbst wird durch das Tragen der Maske in seiner Selbstwahrnehmung beeinträchtigt und kann deshalb sein Äußeres als etwas von ihm zu Unterscheidendes betrachten. Die Auswahlkriterien Verkleidung und Identitätsreflexion einer bestimmten Zeit grenzen die Vielfalt an Beschäftigungen mit dem Körperbild stark ein. Sie ermöglichen eine klare Trennung zwischen verschiedenen Formen von Darstellungen, anhand derer die Identitätsfrage gestellt werden kann. Für die Bestimmung der Kategorien, in welche sich die künstlerischen Ansätze einordnen, ist die durch die Maskerade gewählte Identität von Bedeutung. Die gewählten Beispiele zeigen unterschiedliche Darstellungen, die sich mit unter auch in ihrer Prägnanz voneinander unterscheiden. Nicht immer fällt die Wahl auf eine Form des medialisierten Körperbildes in die Zeit um 1970. In einigen Fällen ist eine Abweichung vom Schema sinnvoll, sobald ein Rückblick auf die Tradition durch ein prominentes Bild aufmerksam macht, oder ein Blick in die Kunst der Gegenwart die weiterhin bestehende Notwendigkeit mit der Auseinandersetzung thematisiert. Ein Seitenblick auf andere Sparten wie Literatur und Kinofilme zeigt, dass diese Problematik nicht nur für die bildende Kunst relevant ist, sondern auch in anderen Bereichen ihren Niederschlag findet. Innerhalb der unterschiedlichen Kategorien bestimmen nicht nur künstlerische Reflexionen die Frage nach der Identität von Selbst und Körperbild, sondern auch wissenschaftliche Analysen auf den Gebieten der Soziologie, Psychologie und Philosophie. Medientheoretische Ansätze verweisen zusätzlich auf den veränderten Blick auf das Menschenbild in der zweiten Hälfte des 20. Jahrhunderts. Im Kontext der Auseinandersetzung mit dem Stereotypen spielen Überlegungen im Bereich der Individualisierung und der Sozialisation hinein. Fragen nach der Kategorisierung von Mitmenschen anhand der äußeren Erscheinung in der gewählten Kleidung und der spezifischen Körperhaltung geben einen Einblick in den alltäglichen Umgang mit Klischees. Dagegen beschäftigt sich die Nachahmung eines Idols stärker mit der Entwicklungspsychologie und der Vor-Bildfunktion von Idealen. Über die Generalisierung des Vor-Bildes auf wieder erkennbare Merkmale, die einen Bezug zwischen Nachahmer und Objekt der Nachahmung herstellen, und die Aneignung eben dieser Merkmale entsteht ein Konstrukt der Identität, das trotz der Nachahmung individuelle Züge aufweist. Bei der Erörterung der eigenständigen Identität, die sich mit der darstellenden Identität den Körper teilt, spielt dagegen das Phänomen der dissoziativen Identitätsstörung eine zentrale Rolle. Zeitgeschichtliche Bezüge in der Entwicklung der Gesellschaft und die Reaktion und Reflexion in Film und bildender Kunst lassen erkennen, dass die Veränderung der Persönlichkeitsstruktur keine Seltenheit ist. Die Reflexion der Geschlechterproblematik greift Fragen nach den verschiedenen Darstellungsmöglichkeiten auf, anhand derer ein gesellschaftliches Konstrukt über die Zuordnung in die Geschlechtskategorien entscheidet. Mit der Darstellung der eigenen Geschlechtszugehörigkeit und der Aneignung antipodischer Merkmale analysieren Künstler bestehende Rollenklischees und vermeintliche Ideale. Das Ausweichen auf die Androgynie spielt mit der Uneindeutigkeit der Geschlechtsdarstellung und dem Wunsch, eine neue Ordnung zu schaffen. Sämtliche Darstellungsformen der Identitätsfragen neigen dazu, das Körperbild in einen ironisierenden, subversiven Kontext zu bringen, in welchem die Tabus der Zeit gebrochen werden. Mit Hilfe der Überspitzung und Übertreibung können diese Inszenierungen den zeitgenössischen Betrachter provozieren. Nicht alle künstlerischen Ansätze finden Berücksichtigung. So bleibt beispielsweise die spezifische Verkleidung des Künstlerpaares Gilbert & George ausgespart. Sie verfolgen mit der Inszenierung des Körperbildes das Ziel, den Disput um die Trennung von Kunst und Leben zu veranschaulichen. Durch das demonstrative Tragen von Maßanzügen verhelfen sie sich selbst zu einer Unverwechselbarkeit und sorgen gleichzeitig für die subversive Konstruktion eines „Markenzeichens“ in der Kunst. Einen weiteren künstlerischen Ansatz, der zwar sämtliche Kriterien erfüllt, aber dennoch keine Berücksichtigung findet, bietet Adrian Piper in ihrer Maskerade als Mann, mit welcher sie sich im öffentlichen Raum bewegt und die Reaktionen der Mitmenschen auf die von ihr dargestellten Identität dokumentieren lässt. Sie bringt zusätzlich zur Annahme des anderen Geschlechts die Reflexion der ethnischen Identität in die Darstellung mit ein. Als Vertreterin einer Minorität bleibt in der Inszenierung jedoch die Auseinandersetzung mit ihrer persönlichen Identität im Vordergrund. Im Blick auf die Kunst der Gegenwart treten neue Herangehensweisen an die Problematik der Inszenierung von Identitätsfragen auf. Eva & Adele legen zwar noch immer die Maskerade am Körper an, indem sie ihr Äußeres auffällig verändern. Doch greift die sichtbare Veränderung des Körperbildes auch auf die Konstruktion der Biographie über. Sie erteilen keinerlei Auskunft über die sich unter der Maskerade befindende Identität und erscheinen deshalb als vollkommene Kunstfiguren. Mit dieser Form der Inszenierung sind sowohl die Differenzierung zwischen persönlicher und konstruierter Identität als auch die Reflexion von Identitätskrisen nicht mehr möglich. Eine Veränderung des am Körper entstehenden Bildes kann auch durch gezielte und dauerhafte Eingriffe in den Körper vorgenommen werden. Orlan führt dies an ihrem Körper vor, indem sie die Mittel der plastischen Chirurgie nicht zur vordergründigen Ästhetisierung ihrer Erscheinung nutzt, sondern mit deren Hilfe eine neue, hybride Identität schafft. Diese wendet sich zunächst der Idealisierung anhand verschiedener Vorbilder zu, um sich im späteren Verlauf einem neuen Prototypen anzunähern. Der Körper wird dabei zu etwas Künstlichem und unter künstlerischen Gesichtspunkten Formbarem, gleich einer Skulptur. Selbst die Identität verliert ihre Eindeutigkeit, wenn die Aktion der Transformation im Ausstellen neuer Ausweispapiere mit einem neuen Künstlernamen enden soll. Eine Steigerung in der Veränderung von Körperbildern ist – jedenfalls für den Augenblick – nicht mehr denkbar. Nur in der vollständig hybriden Welt der Cyborgs im virtuellen Raum können Körper das an ihnen hergestellte Bild und gleichzeitig die Identitätszuschreibung durch eine entsprechende Umprogrammierung ändern, wobei das vorangegangene Körperbild keinerlei Spuren hinterlässt. Doch dies ist ein anderes Thema.
Die Stellung der Breitensportart Rudern als gesundheitsfördernde Sportform ist in der Literatur gleichlautend positiv beschrieben. Im leistungsorientierten Rudersport müssen neben den Verletzungen und Fehlbeanspruchungen der eigentlichen Sportart die unabdingbaren Nebentrainingsformen berücksichtigt werden. In den neunziger Jahren vollzog sich ein trainingsmethodischer Wandel, die Einführung eines erschwinglichen Rudersimulators und eine technische Weiterentwicklung im Boots- und Ruderbau. Einhergehend kam es zu einer geänderten Belastungsphysiologie, so daß neue Untersuchungen sinnvoll erscheinen. Die vorliegende Arbeit erhebt über den retrospektiven Zeitraum von vier Jahren explorativ das Auftreten von Verletzungen und Fehlbeanspruchungen, wobei deren Qualität und Verteilung in den Trainingsformen Wasser-, Ergometer-, Kraft-, Hallen-, Rad-, Lauftraining und die unter dem Punkt "Sonstige" zusammengefaßten übrigen Trainingsformen registriert wurden. Diese Studie beschreibt trainingsformspezifische Fehlbeanspruchungen und Verletzungen sowie deren Auftreten bei den Beobachtungseinheiten Geschlecht, Leistungsgruppe und Gewichtsklasse. Im Rahmen der Diskussion werden Möglichkeiten und Ansätze zur Prävention erörtert und aufgezeigt. Erfaßt wurden bei einer Rücklaufrate von 44% anhand von auf Meisterschaften und Wettkämpfen ausgeteilten sowie an Bundes- und Landestrainer versendeten tabellarischen Fragebögen die Daten von 110 Wettkampfruderern. Als Kriterium der Aufnahme in diese Studie galt die Teilnahme an nationalen Meisterschaften oder ein der Altersklasse angepaßter wöchentlicher Trainingsumfang. Die Zuordnung der Sportler in die jeweilige Beobachtungseinheit der beiden Leistungsgruppen erfolgte aufgrund von Kaderzugehörigkeit, Teilnahme an internationalen Meisterschaften und zeitlichem Umfang des wöchentlich realisierten Trainings. Der Trainingsumfang der Ruderer beläuft sich in dieser Studie im Durchschnitt auf 12,8 Stunden reiner Belastungszeit pro Woche. Korrelierend zu den verschiedenen Jahreszeiten gestaltet sich das Training der Ruderer unterschiedlich. Im sogenannten Sommertraining, das die Wettkampfperiode beinhaltet, liegt der Schwerpunkt auf der eigentlichen Sportart, was anhand der Trainingsgewichtung von über 77% des Gesamttrainingsumfanges bestätigt wird. Einzig das Krafttraining wird in diesem Zeitraum mit 11% des Umfanges noch erwähnenswert häufig betrieben. Während des aus Übergangs- und Vorbereitungsperiode bestehenden Wintertrainings überwiegen die Nebentrainingsformen deutlich. Das Rudern selbst wird nur zu dem geringen Anteil von knapp 30% des Trainingsumfanges betrieben, wobei das für leistungsorientierte Ruderer unabdingbare Krafttraining in diesem Zeitraum mit 27% den zweitgrößten Stellenwert hat. Neben dem ebenfalls mit großen Anteilen betriebenem Ergometer- und Lauftraining ist in Anbetracht der hohen Beschwerderate beim Hallensport noch der Trainingsanteil von 7% zu erwähnen. Bei 249.480 erfaßten Belastungsstunden wurden bei 57% der Sportler Verletzungen und bei jedem Athleten Fehlbeanspruchungen erfaßt. Die dominierenden Verletzungsformen waren muskuläre Prellungen und Zerrungen sowie Schädigungen der Bandstrukturen der Sprunggelenke in Form von Bänderdehnungen und -Rupturen. Traumen größeren Schwergrades wurden, von der einen bei den sonstigen Trainingsformen aufgetretenen Lendenwirbelkörperfraktur abgesehen, in dieser Studie nicht gefunden. Als die mit Abstand verletzungsreichste Sportform mit erheblichen trainingsbegrenzenden Konsequenzen erweist sich der Hallensport, wobei eine für Ballsportarten typische Lokalisationshäufigkeit am Sprunggelenk aufzufinden war. Männliche Athleten und Hochleistungssportler wiesen jeweils höhere Verletzungsraten als ihre Vergleichpartner auf. Beim Rudern fand sich als sportartspezifisches und zugleich geringfügiges Trauma die bei rudertechnischer Unzulänglichkeit entstehenden Hautabschürfungen der Handknöchel. Schädigungen der Bandstrukturen der Sprunggelenke fanden sich in dieser Sportform nicht. Joggen und die nicht näher erfragten "sonstigen" Sportformen zogen bevorzugt Distorsionen der Sprunggelenke nach sich, wohingegen Rad-, Kraft- und Ergometertraining vereinzelt zu Verletzungen in Form von muskulären Zerrungen führten. Im Vordergrund der Beschwerdesymptomatiken der erfaßten Fehlbeanspruchungen fand sich in allen Trainingsformen eine hohe Betroffenenrate von muskulären Verspannungen. Als ruderspezifisch zu bezeichnende Fehlbelastungen lagen bei 89% der Ruderer subepidermale Blasenbildungen im Bereich zwischen distaler Hohlhandbeugefalte, Grundgliederbeugefalten sowie auf den Grund- und Mittelphalangen vor. Weiterhin fanden sich sportartspezifisch hohe Beschwerderaten der Lendenwirbelsäule und der Kniegelenke sowie im etwas geringeren Umfang Überlastungen der Sehnenstrukturen der Handgelenke ("rower's wrist"). Neben der eigentlichen Sportform treten Fehlbeanspruchungen gleicher Symptomatik beim Ergometer- und Krafttraining auf, wobei die Betroffenenraten korrelierend mit dem geringeren Trainingsumfang niedriger liegen. Athletinnen und Schwergewichte weisen beim Ergometertraining eine deutlich erhöhte Beschwerderate auf. Das Lauftraining führte bei Athleten gehäuft zu Beschwerdesymptomatiken der Kniegelenke. Der aus Art und Umfang der Konsequenzen zugewiesene Schweregrad der erfaßten Verletzungen und Fehlbeanspruchungen zeigt zwischen Geschlecht, Leistungsklasse und Gewichtsklasse teils deutliche Differenzen. Bei ähnlicher Verteilung der Schweregrade der Verletzungen beider Geschlechter waren männliche Athleten zu höherem Anteil von Fehlbeanspruchungen leichten und zu kleineren des schweren Typs betroffen. Bei den Leistungsgruppen finden sich nur geringe Unterschiede der Schweregrade von Verletzungen. Bezüglich der Fehlbeanspruchungen fanden sich bei den Hochleistungssportlern signifikant vermehrt mittelschwere Formen, wohingegen Leistungssportler eher leichte und schwere Fehlbelastungsformen erlitten. Schwergewichte waren vermehrt von schweren Verletzungen betroffen, wohingegen Leichtgewichte zu größeren Teilen mittelschwere angaben. Bezogen auf die Fehlbeanspruchungen fanden sich bei den schwergewichtigen Sportlern charakteristisch vermehrt mittelschwere Formen und bei den Leichtgewichten geringfügig vermehrt leichte. Eine Prävention von Verletzungen ist im leistungsorientiertem Rudersport in besonderem Maße durch Überdenken der Struktur des Hallentrainings möglich. Fehlbeanspruchungen und chronische Überlastungsschäden können insbesondere durch Korrektur von Bewegungsabläufen, Reduzierung biomechanisch ungünstiger Belastungen, durchdachter Trainingsmethodik und regelmäßige sportmedizinische Überwachungen vermindert werden.
Die Transkription vieler Gene wird über den Acetylierungsgrad der Histone reguliert. Entsprechend erweiterte die Entdeckung von Histondeacetylase-Inhibitoren das Verständnis um Transkriptions-Repressoren und ihre Rolle in der Pathogenese beträchtlich. Zur Zeit stehen die Modifikationen der Histondeacetylasen (HDACs) sowie die biologischen Rollen der verschiedenen HDAC-Isoenzyme im Zentrum intensiver Forschungsarbeiten.
In der vorliegenden Arbeit wurde anhand verschiedener Zelllinien und mit murinem Primärmaterial nachgewiesen, dass das gut verträgliche Antiepileptikum Valproinsäure (VPA) ein potenter HDAC-Inhibitor ist. Dies zeigt sich daran, dass VPA in vivo die durch HDACs vermittelte transkriptionelle Repression aufhebt und zur Akkumulation hyperacetylierter Histone führt. In vitro Enzymassays weisen darauf hin, dass VPA selbst und nicht ein hypothetischer Metabolit die Histondeacetylasen hemmt. Darüber hinaus wurde mit Bindungs- und Kompetitionsstudien festgestellt, dass eine Interaktion von VPA mit dem katalytischen Zentrum der HDACs stattfindet.
Weitere Analysen zeigten, dass VPA bevorzugt Klasse I HDACs hemmt. Durch dieses Merkmal einer erhöhten Spezifität bei gleichzeitig guter Bioverfügbarkeit definiert VPA eine neue Klasse von HDAC-Inhibitoren. Hieraus ergeben sich Hinweise auf strukturelle Anforderungen, die ein HDAC-Inhibitor erfüllen muß, um spezifischer und weniger toxisch als konventionelle Chemotherapeutika zu wirken. Außerdem eröffnete das neu entdeckte pharmakologische Wirkungsspektrum von VPA auf HDACs Erkenntnisse um zusätzliche therapeutische Einsatzmöglichkeiten dieses etablierten Arzneimittels. Bereits jetzt wird VPA in klinischen Studien an Patienten mit Krebs verabreicht.
HDAC-Inhibitoren gelten als potentielle Medikamente für die Therapie maligner Neoplasien. Deshalb besteht großes Interesse an den molekularen Mechanismen, mit denen Substanzen dieser Wirkstoffklasse das Wachstum transformierter Zellen in vitro und in vivo hemmen. In den humanen Melanomzelllinien SK-Mel-37 und Mz-Mel-19 bewirken klinisch relevante VPA-Dosen eine zeit- und dosisabhängige Akkumulation von Zellzyklusinhibitoren und hyperacetylierten Histonen, morphologische Veränderungen und eine verringerte Proliferationsrate. Die verminderte Proliferation wird von einem veränderten Zellzyklusprofil und Apoptose unter Beteiligung sowohl der extrinsisch als auch der intrinsisch bedingten Caspase-Kaskade begleitet. Dies manifestiert sich in der Spaltung der Caspasen 3, 8 und 9, einer Schädigung der Mitochondrien, der apoptotischen PARP-Spaltung, einem Abbau der genomischen DNA und einer Inaktivierung des GFP-Proteins.
Diese Analysen in Melanomzellen sprechen dafür, dass die weitgehend selektive Wirkung von VPA auf Klasse I HDACs der Mechanismus ist, mit dem diese Substanz das Wachstum bestimmter Tumorzellen hemmt. Durch Genexpressions-Analysen konnten außerdem neue Modelle zum Einfluss von VPA auf solide Tumoren postuliert werden. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Expression und Induzierbarkeit der Zellzyklusregulatoren p21WAF/CIP1 und p27Kip1 und des latent cytoplasmatischen Transkriptionsfaktors Stat1 Biomarker für die Sensitivität von Melanomzellen gegenüber HDAC-Inhibitoren sind. Im Einklang hiermit wird die proapoptotische Wirkung von VPA durch das Cytokin Interferon α und den S-Phase-Inhibitor Hydroxyharnstoff deutlich gesteigert. Diese Ergebnisse sprechen für den Einsatz von VPA in tierexperimentellen und klinischen Studien.
Aufgrund der Schlüsselrolle der HDACs für die physiologische und aberrante Genexpression ist es wichtig, die Mechanismen ihrer Regulation zu kennen. In der vorliegenden Arbeit wurde anhand zahlreicher kultivierter Zelllinien und mittels eines Mausmodells gezeigt, dass therapeutisch einsetzbare VPA-Dosen neben der Hemmung enzymatischer Aktivität auch zu einer isoenzymspezifischen Verringerung der Klasse I Histondeacetylase HDAC2 führen. Als Ursache hierfür konnten eine verstärkte Poly-Ubiquitinylierung und ein proteasomaler Abbau ermittelt werden. Gleichzeitig wurden die Beteiligung etlicher Proteasen und eine veränderte Synthese oder Prozessierung der HDAC2-mRNA als Mechanismen ausgeschlossen.
Expressionsanalysen identifizierten die E2 Ubiquitinkonjugase Ubc8 als von HDAC-Inhibitoren induziertes Gen. Mittels transienter Überexpression („Gain-of-Function“) und siRNA-Experimenten („Loss-of-Function“) konnte dieses Gen als limitierender Faktor des HDAC2-Umsatzes in vivo erkannt werden. Weiterhin wurde gezeigt, dass die E3 Ubiquitinligase RLIM spezifisch mit HDAC2 interagiert. Die Expression von RLIM beziehungsweise seine enzymatische Funktion beeinflusst die HDAC2-Konzentration in vivo. Hierbei kann VPA klar von dem HDACInhibitor Trichostatin A (TSA) abgegrenzt werden. Dieser hemmt ein breites Spektrum an HDACs und induziert Ubc8, führt aber gleichzeitig zu einem proteasomal vermittelten Abbau des RLIM-Proteins. Analysen mit überexprimiertem RLIM zeigten, dass TSA aufgrund dieses Mechanismus nicht in der Lage ist, den Abbau von HDAC2 zu induzieren. Somit ist im Rahmen dieser Arbeit die Ubiquitinylierungs-Maschinerie für HDAC2 charakterisiert worden. Hierdurch sind neue Aspekte zum Zusammenspiel zwischen dem Ubiquitin-Proteasom-System und der Transkriptionsrepression nachgewiesen worden.
Isoenzymspezifische HDAC-Inhibitoren können zur Aufklärung der Funktion einzelner Histondeacetylasen beitragen, insbesondere wenn Knock-Out-Studien zu aufwendig oder aufgrund embryonaler Letalität nicht durchführbar sind. Die Wichtigkeit dieser Analysen wird gerade bei HDAC2 deutlich, da diese Histondeacetylase in vielen soliden und hämatologischen Tumoren überexprimiert ist, und ihre Deregulation möglicherweise zur Krebsentstehung beiträgt. Die in der vorliegenden Arbeit identifizierte Regulation dieses HDAC-Isoenzyms könnte Hinweise auf den Ablauf eines malignen Transformationsprozesses geben. Darüber hinaus zeigt der nachgewiesene Regulationsmechanismus Erfordernisse und potentielle Zielstrukturen einer pharmakologischen Intervention auf. Schließlich könnten die Selektivität von VPA für Klasse I HDACs zusammen mit der Spezifität für HDAC2 die Gründe für die geringen Nebenwirkungen der VPA-Behandlung bei gleichzeitigem Auftreten antitumoraler Effekte sein.
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Herstellung von codierten Peptidbibliotheken durch kombinatorische Synthese, sowie deren Selektion auf Wechselwirkung mit einer verkürzten Sequenz der TAR-RNA des HI-Viruses.
Die zur Selektion benötigte RNA wurde dazu auf chemischem Wege hergestellt und mit einem Fluoreszensfarbstoff für eine optische Selektion markiert. Ausgehend von dieser RNA wurde ein Anfärbeassay entwickelt. Bei der Anwendung des Assays auf Tri- und Pentapeptide, die auf einem Polymerträger immobilisiert waren, zeigten sich einige intensiv leuchtende Polymerkügelchen. Die hellsten unter ihnen wurden selektiert. Die Synthese der Trimeren und Pentamerenbibliothek erfolgte zuvor an wasserquellbarem, polymerem Trägermaterial. Die Identifizierung der polymergebundenen Verbindungen erfolgte über die Codierung nach W.C. Still, welche im Rahmen dieser Dissertation in der Arbeitsgruppe von Hr. Prof. Göbel erfolgreich etabliert wurde und die einfache Unterscheidung zwischen Enantiomeren ermöglicht. Drei der am häufigsten auftretenden Trimerensequenzen wurden im Nachhinein erneut synthetisiert und Experimenten an Zellen zugeführt. Unabhängig davon, wurde ihre Wechselwirkung mit RNA als auch mit RNA-Peptid Komplexen direkt getestet.
Weiterhin wurde exemplarisch anhand von Aminopyridinen die Möglichkeit getestet, neuartige Synthesemonomere für die automatische Synthese polymergebundener Verbindungen darzustellen.
Die vorliegende Arbeit macht deutlich, dass man durch kombinatorische Synthese im Verbund mit gerichteter Selektion, die Entwicklung von in vitro RNA-Liganden für RNA mit bekannter Struktur vorantreiben kann. Umgekehrt müsste dies auch bald die Selektion von Liganden für strukturell nicht charakterisierte RNA ermöglichen.
Das nächste Ziel sollte, die Entwicklung weiterer Selektionstests sein und die Etablierung von NMR-Methoden, welche die genauen Bindungsmodi der selektierten Verbindungen an RNA aufklären, um somit die gezielte Synthese neuartiger Liganden vorantreiben zu können, da letztendlich das "Wie", für die Weiterentwicklung einer Leitstruktur ausschlaggebend ist.
Weiterhin sollten die Transportmechanismen von körperfremden Substanzen zu dem gewünschten Wirkort studiert werden, damit die vorab in vitro getestete Substanz auch im späteren Entwicklungsstadium in vivo die gewünschten Eigenschaften zeigen kann.
Die Endothelzellmigration ist ein wesentlicher Prozess für die Angiogenese, Neovaskularisierung und Reendothelialisierung. Im ersten Teil der Arbeit wurde der Effekt von Schubspannung auf die Endothelzellmigration, die Beteiligung der Integrine und der Integrin-abhängigen Signaltransduktionswege mittels "scratched wound assay" untersucht. Die Schubspannungs-induzierte Endothelzellmigration war signifikant durch Integrin-blockierende RGD-Peptide oder neutralisierende Antikörper gegen die Integrin-Untereinheiten α5β1 reduziert, wohingegen Antikörper gegen αvβ3 oder α2β1 keinen Effekt hatten. Die Integrin-Expression von α5 und β1 war besonders in der migrierenden Zellfront der Wunde erhöht. Passend zu der wichtigen Rolle der Integrine in der Schubspannungs-induzierten Endothelzellmigration hemmte eine Blockade des Integrin-assoziierten Adapterproteins Shc durch eine dominant negative Mutante die Schubspannungs-induzierte Zellmigration. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die pharmakologische Hemmung der MAP Kinase ERK1/2 oder der PI3K die Schubspannungs-induzierte Endothelzellmigration verhinderte. Im Gegensatz dazu hatte die Hemmung der NO-Synthase keinen Effekt.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde die VEGF-vermittelte Endothelzellmigration untersucht. Im Gegensatz zu den Befunden, dass laminare Schubspannung NO-unabhängig die Endothelzellmigration stimuliert, konnte die VEGF-vermittelte Endothelzellmigration durch NOS-Inhibitoren blockiert werden. Des weiteren wurde die Beteiligung der Akt-mediierten eNOS Phosphorylierung in der VEGF- induzierten Endothelzellmigration ebenfalls mittels "scratched wound assay" untersucht, da bekannt ist, dass Akt die eNOS über eine Phosphorylierung an Serin 1177 aktivieren kann. Die Überexpression einer dominant-negativen Akt-Mutante verhindert die VEGF-induzierte Zellmigration. Im Gegensatz dazu stimulierte die Überexpression einer konstitutiv-aktiven Akt-Mutante die Endothelzellmigration, auch in Abwesenheit von VEGF. Die Überexpression eines phosphomimetischen eNOS-Konstruktes (S1177D) führte ebenfalls zu einer verstärkten Zellmigration, wohingegen die nicht mehr phosphorylierbare und somit nicht mehr aktivierbare eNOS-Mutante (S1177A) die VEGF-induzierte Endothelzellmigration komplett hemmte.
Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass die VEGF- und Schubspannungsinduzierte Endothelzellmigration wesentlich zu der beschleunigten Reendothelialisierung von verletztem Endothel beiträgt, wie es beispielsweise nach einer Ballondilatation der Fall ist. Es konnte gezeigt werden, dass laminarer Blutfluss über die Integrine α5β1 NO-unabhängig die Migration mediiert und dass der Wachstumsfaktor VEGF über die Protein Kinase Akt NO-abhängig die Endothelzellmigration stimuliert.
Die Aussprache fremdländischer Orts- und Eigennamen kann deutschsprachige Rundfunksprecher vor größere Probleme stellen. Denn es gibt in anderen Sprachen Laute, die im Deutschen nicht vorkommen. Auch die Graphem-Phonem-Verbindungen entsprechen oft nicht den deutschen Regeln. Beim Hessischen Rundfunk existiert für die gesamte ARD die so genannte „Aussprache-Datenbank“, bei der Sprecher (in der Regel Nachrichtensprecher) die Aussprache solcher Orts- und Eigennamen erfragen können. In der vorliegenden Dissertation werden phonetisch begründete Regeln erarbeitet, wie – ausgehend von einer Transkription nach IPA in der Originalsprache – Orts- und Eigennamen des Dänischen, Schwedischen und Norwegischen durch deutschsprachige Rundfunksprecher ausgesprochen werden sollten. Dabei werden auch die Graphem-Phonem-Relation sowie die Phonotaktik der Ausgangssprache im Vergleich zum Deutschen berücksichtigt. Damit liegt erstmals ein standardisiertes Verfahren vor, das eine einheitliche und phonetisch begründete Vorgehensweise bei der Erarbeitung eines Aussprachevorschlags für dänische, schwedische und norwegische Orts- und Eigennamen ermöglicht.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Vegetation der Savannenlandschaften der Sahelzone von Burkina Faso analysiert. Diese semiaride bis aride Region, die seit einigen Jahrzehnten von Landdegradation betroffen ist, ist als Untersuchungsgebiet u.a. deshalb besonders interessant, weil sie an einem Nutzungsübergang zwischen sesshafter Landwirtschaft und traditionell nomadischer Viehwirtschaft liegt. Im Vordergrund stand bei der Vegetationsanalyse ihre Klassifikation, die Frage nach der floristischen Struktur sowie dem aktuellen Zustand der Vegetation. Zu Beginn der Feldarbeiten wurde das Untersuchungsgebiet, das einen Niederschlagsgradienten von rund 200 mm umfasst, in geomorphologische Landschaftseinheiten (Inselberge, glacis, Niederungen, mares, Dünenzüge) stratifiziert. Innerhalb dieser Einheiten erfolgte die Vegetationsaufnahme mit Hilfe pflanzensoziologischer Aufnahmen. Die Arten der Gehölz- und Krautschicht wurden getrennt behandelt. Die Vegetationsaufnahmen wurden durch Strukturprofiltransekte in der brousse tigrée und Bodenuntersuchungen ergänzt. Auf verschiedenen Skalenebenen wurden die verschiedenen Vegetationsgesellschaften detailliert beschrieben und zu Standortfaktoren in Beziehung gesetzt. Außerdem wurden Vegetationsprofile zur Veranschaulichung der räumlichen Struktur der Vegetation abgeleitet. Bei der Analyse kamen auch computergestützte Methoden und statistische Verfahren (Tests der absichernden Statistik, Berechnung verschiedener Diversitätsindices, Ordinationsverfahren, numerische Klassifikation) zum Einsatz, um die Interpretation der Vegetationsstruktur zu unterstützen. Rund 320 Gefäßpflanzensippen aus 65 Familien konnten sicher bestimmt werden. Die artenreichste Familie sind die Poaceen. Insgesamt können 20 Gesellschaften der Gehölzschicht sowie 22 Gesellschaften der Krautschicht klassifiziert werden, die zur Mehrzahl weiter in Untereinheiten gegliedert sind. Innerhalb jeder Landschaftseinheit werden die Gesellschaften der Gehölzschicht, anschließend diejenigen der Krautschicht, vorgestellt. In der Regel sind sie in ihrer Verbreitung auf jeweils eine Landschaftseinheit beschränkt. Vor allem die Gesellschaften des glacis und der Niederungen besiedeln auch Habitate in Landschaftseinheiten außerhalb ihres Schwerpunktes. Daraus werden Schlüsse zum Ausbreitungsverhalten gezogen. In keinem Fall sind Einheiten der Krautschicht und der Gehölzschicht ausschließlich miteinander kombiniert; vielmehr sind Einheiten der Krautschicht jeweils mit mehreren Einheiten der Gehölzschicht kombiniert, was ihren selbständigen Charakter betont. Zehn Einheiten der Krautschicht sind überwiegend oder völlig gehölzfrei. Eine floristische Verwandtschaft besteht vor allem zwischen den Landschaftseinheiten glacis und Dünenzügen sowie zwischen mares, Niederungen und Dünenzügen; die Inselberge unterscheiden sich deutlich. Die Gehölzvegetation der Inselberge ist in Abhängigkeit von der menschlichen Nutzung in fünf Gesellschaften gegliedert. Während die Commiphora africana-Gesellschaft für wenig beeinflusste Bereiche typisch ist, hat die Combretum micranthum-Fragmentgesellschaft ihren Verbreitungsschwerpunkt in den intensiv genutzten Bereichen. Die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft ist an den Unterhängen vertreten. Die Krautschicht der Inselberge gliedert sich in sechs, relativ artenreiche Gesellschaften mit Untereinheiten. Sie stellen zum Teil lokale Besonderheiten dar. Das räumliche Muster der Einheiten der Brachiaria lata-Gesellschaft lässt eine Abhängigkeit von der Art der Beweidung erkennen. Die Vegetation der Sandrampen wird oftmals von Einheiten gebildet, die ihren Verbreitungsschwerpunkt auf den Dünenzügen haben. Die Gehölzvegetation des glacis ist in drei relativ artenarme Gesellschaften gegliedert, die in Abhängigkeit der Lage zum lokalen Vorfluter zoniert und auch über das Untersuchungsgebiet hinaus weit verbreitet sind. Weite Bereiche des glacis sind völlig gehölzfrei. Die häufigste Gesellschaft ist die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft. Die Ordination der Daten unterstützt die Klassifikation und zeigt Übergänge zwischen den Einheiten sowie Beziehungen zu den Standortparametern auf. Die Krautvegetation der glacis-Flächen ist relativ einheitlich; es gibt insgesamt nur zwei Gesellschaften. Der Anteil an Ruderalarten, Arten mit Pioniercharakter und solchen, die ihren Verbreitungsschwerpunkt auf Dünenzügen haben, ist relativ hoch. Bedeutendste Einheit ist die Tribulus terrestris-Untereinheit der Schoenefeldia gracilis-Gesellschaft, die eine weite ökologische Amplitude besitzt. Vor allem zu den Krautgesellschaften der Niederungen bestehen enge floristische und räumliche Beziehungen. Die krautigen Arten des glacis haben eine weite ökologische Amplitude. Es bestehen floristische Beziehungen zu Vegetationseinheiten der Sahara. Die Vegetation der mares und Niederungen hat die höchste β-Diversität. Die Gehölzvegetation der Niederungen ist in Abhängigkeit der Überflutungsdauer und -höhe zoniert und relativ struktur- und artenreich. In Galeriewäldern kommen sudanische Gehölzarten vor. Während von Viehherden stark frequentierte mares niedrige Gehölzdeckungen aufweisen oder komplett gehölzfrei sind, ist die Gehölzdeckung an den Ufern nur schwach besuchter mares geschlossen. Dies gilt auch für die artenreiche Krautvegetation. Insgesamt ist die Gehölzvegetation der Niederungen und mares in acht Gesellschaften gegliedert; die einzelnen Einheiten zeigen Übergänge miteinander. Die Krautvegetation der Niederungen enthält ebenfalls sudanische Arten. Sie lässt sich in drei Gesellschaften gliedern, die z.T. nur ein kleines Verbreitungsgebiet haben. Einige Uferabschnitte sind stark degradiert und vegetationslos. Die oftmals röhrichtartige Krautvegetation der mares ist ebenfalls in Abhängigkeit der Überflutungshöhe gegliedert, allerdings kommen an den einzelnen mares teilweise unterschiedliche Einheiten vor. Die Melochia corchorifolia-Gesellschaft steht im Mittelpunkt der Krautvegetation der mares, während die Brachiaria mutica-Gesellschaft für die nicht oder nur wenig überfluteten Bereiche typisch ist. Die Gehölzvegetation der Dünenzüge lässt sich im Untersuchungsgebiet in neun Gesellschaften gliedern. Diese gruppieren sich in einem artenreichen Block wenig beeinflusster Bereiche und in einem relativ artenarmen Block intensiv genutzter Dünenabschnitte. Bestände, die zur Pterocarpus lucens-Gesellschaft gestellt werden, bilden auf abgelegenen Dünenzügen kleine Wäldchen. In diese Gesellschaft werden auch die Bestände der brousse tigrée eingegliedert. Es sind in der Region nur noch wenige Flächen mit intakter brousse tigrée vorhanden. Anhand von zwei Strukturprofiltransekten wird ihre floristische und räumliche Struktur mit vier Zonen veranschaulicht. Pterocarpus lucens und Combretum micranthum sind die beiden dominanten Gehölzarten. Im Untersuchungsgebiet ist die Combretum glutinosum-Zentralgesellschaft weit verbreitet. Durch zwei Ordinationsdiagramme wird der ökologische Schwerpunkt wichtiger Dünenarten aufgezeigt. Die numerische Klassifikation lässt sich gut mit der manuellen Klassifikation in Übereinstimmung bringen. Die Krautvegetation der Dünen ist in sieben Gesellschaften mit vielen, z.T. relativ artenarmen Untereinheiten gegliedert, deren ökologische Bindung aufgrund eines starken, nivellierenden Beweidungseinflusses nicht immer geklärt werden kann. Es dominieren annuelle Arten; viele der Arten kommen in anderer Artenkombination auch in der Sudanzone vor. Daneben zeigt sich eine floristische Verwandtschaft zur Sahara. Unter Bäumen wächst die Achyranthes aspera-Gesellschaft. Krauteinheiten, die in anderen Landschaftseinheiten ihren Verbreitungsschwerpunkt haben, sind auf den Dünenzügen ebenfalls vorhanden, z.B. die Enteropogon prieurii-Gesellschaft der Inselberge und die Schoenefeldia gracilis-Gesellschaft des glacis. Es ist keine floristische Differenzierung entlang des Niederschlagsgradienten erkennbar. Hirsefelder sind mit Kulturbaumparks bestanden. Die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft gewinnt auch auf den Dünenzügen an Bedeutung. Die Ergebnisse werden in Beziehung zu den in der Literatur vorhandenen, oftmals auf formationskundlichen Kriterien beruhenden Klassifikationen in Beziehung gesetzt. Je nach verwendetem Verfahren und Distanzmaß liefert die numerische Klassifikation unterschiedliche Ergebnisse, die sich nur zum Teil mit der Klassifikation in Deckung bringen lassen. Durch die Betrachtung der aktuellen Verjüngung, aus den Ergebnissen und ihrer Diskussion werden Aussagen über die aktuelle Vegetationsdynamik abgeleitet. Aktuelle Strukturveränderungen der Vegetation sind mit einem Landnutzungswandel verbunden. In erster Linie handelt es sich um Degradation, für die Beispiele auch aus der Literatur gegeben werden. Auf den Inselbergen gehen artenreiche Bestände zurück, gleichzeitig wandern Arten von den glacis-Flächen her ein. Auf dem glacis sind einerseits eine Artenverarmung, andererseits eine Verbuschung tiefliegender Bereiche sowie eine floristische Homogenisierung vieler Flächen zu beobachten, letzteres gilt auch für die Dünenzüge. An den mares und Niederungen findet ebenfalls eine floristische Verarmung statt, sudanische Arten sterben wie auch auf den Dünenzügen aus. Klimaungunst und vor allem Überbeweidung als mögliche Ursachen für den Vegetationswandel werden diskutiert.
Das Rauchen von Kokain („Crack“) hat sich in den letzten Jahren weltweit verbreitet und Crack hat eine wichtige Stellung in der Gruppe der harten Drogen eingenommen. Der inhalative Konsum unterscheidet sich von den anderen Formen der Kokain-Aufnahme durch seine schnelle und intensive Wirkung sowie durch einen sehr starken, unkontrollierten Drang zum erneuten Konsum. Schwere gesundheitliche Schäden sind die Folge sowie auch soziale Isolierung und zwischenmenschliche Konflikte. Da zur Finanzierung der Crack-Sucht häufig Straftaten begangen werden, sind diese Fälle forensisch von besonderem Interesse. Im Gegensatz zum nasalen oder intravenösen Konsum entsteht ausschließlich beim Rauchen das Pyrolyseprodukt Anhydroecgoninmethylester (AEME), welches deshalb als Marker für einen Crack-Konsum angesehen wird. Die toxikologischen Aspekte dieser Substanz sind nicht ausreichend untersucht, um dessen toxikologisches Potential abschätzen zu können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten analytische Methoden entwickelt und der Metabolismus von AEME untersucht werden, um Daten an authentischen Proben von Kokainkonsumenten erheben zu können.
Fragestellung: Aufgrund der zurückgehaltenen Anwendung von Opioiden im Säuglings- und Kleinkindesalter zählt Paracetamol zu den meist verwendeten, postoperativen Analgetika in dieser Altersstufe. Die Angaben zur Dosierung sind uneinheitlich und schwanken von 10 bis 40 mg pro Kilogramm Körpergewicht. In der postoperativen Analgesie des Erwachsenen nimmt Piritramid als reiner Mikro-Agonist mit günstigem Nebenwirkungsprofil eine Schlüsselstellung ein. In unserer prospektiven, randomisierten Doppelblindstudie untersuchten wir den postoperativen Piritramidbedarf bei Säuglingen und Kleinkindern nach drei verschiedenen Dosierungen von rektalem Paracetamol im Vergleich zu Placebo. Methode: 80 Kleinkinder (ASA I und II), im Alter von 11,3 ± 9,9 Monate und einem Körpergewicht von 8,6 ± 2,8 kg, die sich einer plastischen Lippen-Kiefer-Gaumenspaltenrekonstruktion unterzogen, erhielten nach Narkoseeinleitung 10, 20 oder 40 mg/kgKG Paracetamol (AC) (Gruppen: AC 10, AC 20, AC 40) rektal oder ein Placebosuppositorium (jeweils n = 20). Es bestanden keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen. Postoperativ wurde die Analgetikatherapie anhand einer 5-Items umfassenden Kindlichen Unbehagens- und Schmerz-Skala (KUSS) gesteuert. Bei einem Schmerzscore von >= 4 Punkten und mehr erhielten die Kinder 25 Mikro-g/kgKG Piritramid i.v. (Lock-out time 10 min, maximale Dosis 125 Mikro-g/kgKG in einer Stunde). Die Operationsdauer betrug 127 ± 41,7 min. Die Kinder wurden mindestens 60 min im Aufwachraum überwacht. Die Kinder zeigten postoperativ weder SaO2-Abfälle < 93%, noch Abfälle der Atemfrequenz oder Erbrechen. Im Vergleich zu Placebo zeigten die Paracetamolgruppen in den untersuchten Dosierungen bei den Kindern keine Senkung des postoperativen Piritramidbedarfes. Die kumulativen Piritramidapplikationen der Plazebogruppe betrugen 2,7 ± 1,55. Die Verumgruppen erhielten 3,0 ± 1,25 (AC 10), bzw. 3,2 ± 1,31 (AC 20) und 3,4 ± 1,01 (AC 40). Durch die titrierten Piritramidgaben wurde im Mittel nach 20-25 min. im Aufwachraum eine suffiziente Analgesie erreicht. Die Ergebnisse zeigen, daß der Dosisbereich von 10 bis 40 mg/kgKG Paracetamol bei Säuglingen und Kleinkindern nach Lippen-Kiefer-Gaumen-Rekonstruktionsoperationen zu keiner ausreichenden Analgesie führt, wohingegen vorsichtig titriertes Piritramid eine schnelle und sichere Schmerzlinderung für einen längeren Zeitraum gewährleistet.
Der bc1-Komplex ist eine Komponente der Atmungskette und damit essentiell für den Energiestoffwechsel vieler Organismen, die zum aeroben Wachstum befähigt sind. Im Vergleich zu mitochondrialen bc1-Komplexen, die bis zu elf unterschiedliche Untereinheiten besitzen, ist das Enzym aus Paracoccus denitrificans mit nur drei Untereinheiten einfach aufgebaut. Vergleicht man die Sequenz des P. denitrificans Cytochrom c1 Genproduktes mit denen anderer prokaryotischer und mitochondrialer Cytochrom c1 Untereinheiten, so fällt auf, dass dieses prokaryotische Protein eine für Paracoccus charakteristische zusätzliche N-terminale Domäne von ca. 150 Aminosäuren trägt, die zudem eine sehr auffällige Zusammensetzung besitzt (40% saure Reste, 40% Alanine, keine einzige positiv geladene Aminosäure). Diese saure Domäne wird in anderen Organismen durch zusätzliche Untereinheiten innerhalb des bc1-Komplexes dargestellt, die in direkter Assoziation mit dem Cytochrom c1 vorliegen. Bis dato konnte für Paracoccus jedoch noch kein eindeutiger Beweis für eine Beteiligung dieser sauren Domäne an der Wechselwirkung zwischen bc1 und den Substraten des Komplexes geführt werden. Ziel dieser Arbeit war es zunächst, zwei lösliche Fragmente des Cytochrom c1 aus P. denitrificans zu konstruieren und in E. coli heterolog zu exprimieren. Durch zielgerichtete Mutagenese am Cytochrom c1 und anschließende kinetische Charakterisierung der Produkte sollte die funktionelle Bedeutung einzelner Aminosäurereste dargestellt werden. Es ist im Rahmen dieser Arbeit gelungen, zwei lösliche Fragmente des Cytochrom c1 aus P. denitrificans zu exprimieren. Für das saure Fragment (SF) wurde lediglich der Membrananker deletiert, während das Kernfragment (KF) durch die zusätzliche Deletion der sauren Domäne als eine Art minimalisiertes Cytochrom c1 anzusehen ist. Beide Fragmente konnten nach erfolgreicher Aufreinigung durch pre-steady-state-Kinetiken in ihrer Wechselwirkung mit dem homologen Reaktionspartner Cytochrom c552 sowie mit drei weiteren c-Typ Cytochromen funktionell charakterisiert werden. Des weiteren wurden zahlreiche Mutanten von KF hergestellt und ebenfalls hinsichtlich ihrer Wechselwirkung mit Cytochrom c552 getestet. Die Untersuchungen zur Ionenstärkeabhängigkeit des Cytochrom c1 zeigten, dass das saure Fragment unter den gewählten Versuchsbedingungen im Vergleich zu KF keine erhöhte Spezifität gegenüber Cytochrom c552 besitzt. Es konnte jedoch eindeutig gezeigt werden, dass die Interaktion der beiden untersuchten Elektronentransportpartner von der Wechselwirkung geladener Aminosäureseitenketten auf beiden Proteinen abhängt und somit elektrostatischer Natur ist. Dieser Sachverhalt wird zusätzlich durch die Ergebnisse bestätigt, die mit der Negativkontrolle (Cytochrom c551 aus Ps. aeruginosa) erzielt wurden. Dieses negativ geladene Protein zeigte nur eine schwach affine Wechselwirkung mit dem ebenfalls stark negativ geladenen Cytochrom c1 aus P. denitrificans. Zusätzliche kinetische Untersuchungen mit weiteren Cytochromen im Bereich mittlerer Ionenstärke zeigten, dass die beiden löslichen Fragmente SF und KF keine erhöhte Spezifität gegenüber homologen Elektronenakzeptoren (Cyt c552 und Cyt c550 aus P. denitrificans) im Vergleich zu dem nicht-homologen Reaktionspartner (Pferdeherz Cyt c) besitzen. Bei diesen drei Cytochromen handelt es sich um Proteine, die eine basische Interaktionsfläche aufweisen. In Hinblick auf die Ergebnisse zur Wechselwirkung von KF und SF mit dem löslichen Cytochrom c551 aus Ps. aeruginosa wird jedoch deutlich, dass die Spezifität des Cytochrom c1 gegenüber möglicher Substrate alleinig durch das Kriterium des Oberflächenpotentials bedingt ist. Keine der eingeführten Punktmutationen führte zu einem vollständigen Aktivitätsverlust des Proteins. Vielmehr zeigten die meisten Mutanten eine im Vergleich zum Wildtyp leicht herabgesetzte Geschwindigkeitskonstante der Elektronentransport-Reaktion. Der deutlichste Effekt wurde für die Mutanten E243K (36 % der WT-Aktivität) und E243Q (78 % der WT-Aktivität) bestimmt. Dieser Rest ist am oberen, dem Periplasma zugewandten Rand der Hämspalte positioniert, wodurch eine direkte Interaktion mit dem Cytochrom c552 während der Elektronentransport-Reaktion sehr gut möglich ist. Die im Rahmen dieser Arbeit bestimmten Geschwindigkeitskonstanten der Reaktion zwischen Cytochrom c1 und Cytochrom c552 lassen eindeutig auf einen diffusionskontrollierten Prozess schließen. Ein solches Verhalten schließt eine spezifische Oberflächen-Wechselwirkung der beiden Proteine nicht aus Die Ergebnisse der Mutagenesestudie verdeutlichen jedoch, dass die Substratspezifität nicht primär durch definierte gegensätzliche Ladungspaare auf der Oberfläche von Cytochrom c1 und Cytochrom c552 definiert wird.
Sequenz-spezifische DNA-Rekombination (SSR) bewirkende Systeme aus niederen Organismen, wie z.B. das Cre/loxP-System aus dem P1-Phagen oder das Flp/FRT-System aus Hefe, sind in den letzten Jahren als wichtige und weitverbreitete Werkzeuge zur Modifikation des Säugergenoms etabliert worden. Dies hängt unter anderem mit der Vielfalt an Reaktionen zusammen, welche diese Systeme in der Lage sind durchzuführen. Dazu zählen Exzisions/Deletions-, Integrations-, Inversions- und Translokationsreaktionen. Die hier vorgestellte Arbeit fokussiert auf die Integrationsreaktion, welche aus thermodynamischen Gründen bisher keine breite Anwendung finden konnte, und ihren Einsatz bei der Etablierung allelischer Serien in embryonalen Stammzellen (ES Zellen) oder frühen Embryonen der Maus. Eine solche Methodik wäre ideal für Fragestellungen zu Funktionen von Genen in vivo (Functional Genomics) geeignet. Zur Anwendung kam ein als „Rekombinase vermittelter Kassettenaustausch“ (recombinase-mediated cassette exchange, RMCE) bezeichnetes Verfahren. RMCE ist ein Zwei-Schritt-Verfahren: Zuerst wird der interessierende Genort durch homologe Rekombination derart verändert, daß 5’ und 3’ des Genlocus SSR-Erkennungsstellen eingeführt werden. Durch das Einbringen eines die gleichen Erkennungsstellen tragenden Austauschplasmides und die Bereitstellung der entsprechenden Rekombinase kann die im Genom residierende gegen die eingebrachte Kassette (von Erkennungsstellen flankiertes DNA-Segment) ausgetauscht werden. In dieser Arbeit werden zwei verschiedene Ansätze für RMCE vorgestellt: Der erste Ansatz basiert auf der Verwendung heterospezifischer lox-Sequenzen, welche sich in einer Base unterscheiden (lox511/loxP). Diese Mutation sollte eine effektive Integration durch Verhinderung der Exzision gewährleisten. Es konnte hier gezeigt werden, daß RMCE unter Verwendung einer solchen Methodologie in ES Zellen und frühen Mausembryonen effizient möglich ist, daß das Produkt der Integration jedoch instabil ist und nachfolgender Exzision unterliegt. Diese Deletionsreaktionen sind durch promiskuitive Rekombination der verwendeten lox511 und loxP bedingt. Aus diesen Erkenntnissen wurde ein zweiter Ansatz entwickelt, welcher auf dem simultanen Einsatz des Cre/lox- und des Flp/FRT-Systems basiert. Diese Methodik umgeht die Nachteile promiskuitiver Erkennungssequenzen und ihre Anwendbarkeit, Funktionsfähigkeit und Effizienz in ES Zellen konnten demonstriert werden. Ein solches Verfahren, welches sowohl in Zellkultur als auch in frühen Mausembryonen zum Einsatz kommen könnte, bietet insbesondere im Hinblick auf zukünftige Bedürfnisse in der Functional Genomics viele Optionen.
In den letzten Jahren hat eine rasante Entwicklung der Gerätetechnik sowohl der CT als auch der MRT stattgefunden und eine Änderung der Untersuchungsverfahren im Bereich der Schnittbildtechnik ausgelöst. Parallel dazu sind durch die Einführung von MRT-Kontrastmitteln neuartige Untersuchungsprotokolle entstanden. Deshalb muß eine ständige Reevaluierung der einzelnen Untersuchungsverfahren erfolgen. Organ- bzw. gewebespezifische Kontrastmittel sind den extrazellulären nicht-spezifi-schen MRT-Kontrastmitteln nicht gleichzusetzen. Mit dem neu entwickelten Kontrast-mittel Gd-EOB-DTPA steht für die MRT ein neues leberspezifisches KM zur Verfü-gung, welches in Kürze in routinemäßige Untersuchungen übergehen wird. Es ermöglicht die sichere Unterscheidung von lebereigenem bzw. hepatozyten-reichem Gewebe durch eine direkte Aufnahme des Kontrastmittels in die Leberzelle selbst. Maligne Lebertumoren, wie z. B. Metastasen, die keine Hepatozyten besitzen, zeigen keine Speicherung der hepatobiliären, leberspezifischen Substanz. Bis zum heutigen Tage sind die Erfahrungen mit diesem neuen Kontrastmittel gering. Aus diesem Grund sollten im Rahmen einer prospektiven Zulassungsstudie Erfahrungen mit der neuartigen Substanz gesammelt werden. Insgesamt wurden 60 Patienten in die beschriebene Studie eingeschlossen. Bei allen Patienten wurde eine nicht-kontrastverstärkte MRT, eine kontrastverstärkte MRT mit Gd-EOB-DTPA als auch eine Spiral-CT der Leber erstellt. In der vorliegenden Studie wurde sowohl die Detektion als auch die Charakterisierung in Korrelation mit einem genau definierten Referenzstandard evaluiert. Die Ergebnisse der vorgestellten Studie indizieren, daß es sich bei Gd-EOB-DTPA um ein sicheres, nebenwirkungarmes Kontrastmittel für die MRT handelt. Das besondere an diesem neuartigen Kontrastmittel ist, daß mit einer intravenösen Appli-kation unterschiedliche Perfusionsphasen dargestellt werden können. Im einzelnen handelt es sich um die intravasale Phase zur Darstellung der Vaskularität, die Parenchym- oder hepatobiliären Phase zur Detektion und Charakterisierung, sowie die Ausscheidungsphase zur Darstellung der Gallengänge. Die sichere intravenöse Bolusgabe des hepatobiliären Kontrastmittels ermöglicht zum einen dynamische Perfusionsbildgebung, zum anderen aber auch statische leberspezifische Hepa-tozytenbildgebung und damit funktionelle Leberbildgebung. Die MRT unter Verwendung des neuen Kontrastmittels Gd-EOB-DTPA stellt eine adäquate diagnostische Methode für die Detektion, Lokalisierung, exakte Abgren-zung und Charakterisierung von fokalen Leberläsionen dar, die der nicht-kontrast-verstärkten MRT und der Spiral-CT überlegen ist. Die Detektionsrate ist verbessert gegenüber der biphasischen Spiral-CT mit einer gering höheren Rate von detektierten kleinen Läsionen. Zusätzliche Informationen bezüglich der Ätiologie werden sowohl durch dynamische als auch statische MRT-Bildgebung für die Klassifizierung von malignen versus benignen Leberläsionen als auch für die Charakterisierung nach Läsionstyp erhoben. Anhand der durchgeführten Untersuchungen konnte ein Verhaltensmuster der unterschiedlichen Pathologien für dieses neue Kontrastmittel dargestellt werden. Metastasen weisen je nach ihrem Vaskularisationsgrad eine unterschiedliche An-reicherung in der Perfusionsphase auf, während sie in der hepatobiliären Phase als Kontrastmittelaussparung zur Darstellung kommen. Lebereigene Läsionen wie die FNH besitzen Hepatozyten, nehmen das leberspezifische Kontrastmittel auf, sind vergleichbar mit normalen Lebergewebe und lassen sich gut von leberfremden Ge-webe abgrenzen. Die hepatozellulären Karzinome zeigen in Frühphase eine deut-liche meist in der Peripherie gelegene Hyperperfusion. In der hepatobiliären Phase ist die KM-Aufnahme abhängig vom Differenzierungsgrad. Undifferenzierte HCCs verhalten sich wie leberfremdes Gewebe und nehmen kein KM auf, während beim gut differenzierten HCC eine diskrete Aufnahme gefunden werden kann. Die hohe Sensitivität bezüglich Detektion aber auch eine hervorragende Klassifi-zierung und Charakterisierung ermöglichen eine gezielte und genaue weitere Pla-nung der Therapie der Patienten. Mittels EOB-MRT ist eine präzise Diagnose des Leberparenchyms mit Hepatozytenfunktion als auch Perfusionsstudien in einem Untersuchungsgang möglich. Die Bildgebung der Hepatozytenphase kann 20 Minuten nach Injektion des hepatobiliären Kontrastmittels erstellt werden und ermöglicht damit eine Zeitersparnis und Kostenreduzierung im Vergleich zu den anderen hepatobiliären Kontrastmitteln. In der täglichen Routine, das prätherapeutischen Management von Patienten bei fokalen Leberläsionen betreffend, sollte nach den vorliegenden Ergebnissen eine leberspezifische MRT durchgeführt werden.
Die vorliegende Dissertation stellt Ludwig Edinger (1855-1918) erstmals im Kontext der Entwicklung dar, die das von ihm begründete Neurologische Institut nach seinem Tode genommen hat. Die aufgeworfene Problemstellung konzentriert sich auf die Rekonstruktion dessen, was Edinger in seinem Neurologischen Institut verwirklichen wollte. Mit dieser Institutions- und Ideengeschichte sind menschliche Schicksale unauflösbar verbunden. Die Ergebnisse der Untersuchung sollen abschließend kurz zusammengefasst werden: 1.) Die kritische Diskussion des bisherigen Rezeptionsstandes, dessen geschichtliche Etappen rekonstruiert wurden, demonstrierte detailliert die bis in die Gegenwart reichenden Verkürzungen im Verständnis von Leben und Werk Ludwig Edingers. Für eine angemessene Erinnerung an die Bedeutung dieses deutschen Juden erwies sich der Nationalsozialismus als entscheidende Zäsur. Ein fast vollständiges Tabu über der Institutsgeschichte zwischen dem Beginn des Ersten und dem Ende des Zweiten Weltkrieges war die wirkungsgeschichtliche Folge (Kapitel I). 2.) Demgegenüber galt es zunächst, den Zusammenhang zwischen Edingers deutsch-jüdischer Lebensgeschichte und der inneren Einheit seines wissenschaftlichen Werkes in den Blick zu rücken (Kapitel II). 3.) Ludwig Edinger ist nun nicht mehr nur als vergleichend-neuroanatomischer Grundlagenforscher, sondern auch als praktischer und theoretisierender Nervenarzt erkennbar (Kapitel III und IV). 4.) Rekonstruiert wurde das interdisziplinäre Forschungsprogramm, das Ludwig Edinger in seinem Neurologischen Instituts verwirklichen wollte (Kapitel IV). 5.) Ein Produkt dieses neurowissenschaftlichen Projekts war die von Kurt Goldstein (1878-1965) begründete Neuropsychologie (Kapitel IV, V und VI). 6.) Einen weiteren Zweig bildete die ebenfalls in den zwanziger Jahren begründete Paläoneurologie Tilly Edingers (1897-1967), die familiengeschichtlich, kulturell und wissenschaftlich an Leben und Werk ihres Vater anknüpfte (Kapitel VII). 7.) Dargestellt wurde schließlich die mehrschichtige Bedeutung Johann Wolfgang von Goethes für deutsch-jüdischen Neurowissenschaftler aus Frankfurt am Main, die bis ins US-amerikanische Exil hineinreichte (Kapitel VIII). Über die Erforschung der genannten Problembereiche hinaus versteht sich die skizzierte Zusammenführung von deutsch-jüdischer Akkulturations- und Emigrationsgeschichte mit der Wissenschaftsgeschichte einer medizinisch-naturwissenschaftlichen Disziplin als die eigentliche historiographische Innovation der vorliegenden Dissertation. Die Geschichte des Neurologischen Instituts nach dem Zweiten Weltkrieg wäre Gegenstand einer eigenen Arbeit, die auch zu diskutieren hätte, welche Aspekte an Ludwig Edingers Vermächtnis aktualisiert wurden. Ein erster Überblick hierzu liegt vor.
Die vorliegende Arbeit untersucht die Systematik und phylogenetischen Beziehungen der Familie der Bromeliaceae auf der Basis chloroplastidärer DNA-Sequenzdaten des trnT-trnL-Intergenischen Spacers (33 untersuchte Arten aus 28 Gattungen), des trnL-Introns (129 untersuchte Arten aus 48 Gattungen) und des trnL-trnF-Intergenischen Spacers (120 Arten aus 48 Gattungen). Untersucht wurden Vertreter aller Untergattungen der artenreichsten Gattungen Aechmea (Bromelioideae) und Tillandsia (Tillandsioideae). Mit den editierten Alignments der drei Sequenzdatensätze wurden Analysen zu den Verwandtschaftsverhältnissen durchgeführt. Alle drei untersuchten Marker lieferten phylogenetisch informative Signale. Die Pitcairnioideae erwiesen sich als polyphyletisch. Ayensua und Brocchinia sind nah verwandt und nehmen innerhalb der Familie eine basale Position ein. Hechtia und Navia stellen jeweils eigene Gruppen dar, aber ohne ausreichende Auflösung ihrer Beziehungen zu den übrigen Bromeliaceae. Fosterella und Puya sind gut gestützte Gruppen mit möglicher Schwestergruppenbeziehung zu den Bromelioideae. Die Gattungen Pitcairnia/Pepinia und Deuterocohnia/Dyckia bilden als Pitcairnioideae s.str. einen gut gestützten Ast. Die Tillandsioideae sind monophyletisch, nur die einzige untersuchte Akzession der Gattung Mezobromelia liegt außerhalb dieses statistisch gut gestützten Astes. Innerhalb der Tillandsioideae nehmen Catopsis, Glomeropitcairnia erectiflora und Alcantarea regina/Vriesea racinae basale Positionen ein. Die Gattungen Guzmania, Racinaea, Tillandsia und Vriesea sind keine natürlichen Gruppen. Für die Bromelioideae liegt die Sequenzdivergenz bei 0,1 bis max. 2%. Die beste Auflösung erreichte hier die kombinierte Analyse des trnL-Introns und des trnL-trnF Intergenischen Spacers bei Polarisierung der Daten mit den Tillandsioideae als Außengruppe. Bromelia, Deinacanthon, Greigia, Fascicularia-Ochagavia-Fernseea und eine wenig aufgelöste Kerngruppe der übrigen Bromelioideae bilden eine basale Polytomie. Mit höheren Wiederfindungswahrscheinlichkeiten gestützt sind Ananas, Greigia und von der Gruppe Fascicularia-Ochagavia-Fernseea die Gattung Fascicularia und die kontinentale Ochagavia litoralis. Die Gattungen Fascicularia-Ochagavia-Greigia (Bromelioideae) und Abromeitiella- Deuterocohnia (Pitcairnioideae) wurden mit Fragmentanalysen (AFLPs, RAPDs) untersucht. Analysen der RAPD- und AFLP-Daten mit UPGMA (Unweigthed pair group method using arithmetic averages) und NJ (Neighbor-Joining) stützen die Fassung der Gattung Fascicularia als eine Art (Fascicularia bicolor) mit zwei Unterarten (F. bicolor ssp. bicolor und F. bicolor ssp. canaliculata). F. bicolor ssp. canaliculata weist 28 Fragmente auf, die in keiner untersuchten Akzession von F. bicolor ssp. bicolor vorkommen. Die 5 untersuchten Akzessionen von F. bicolor ssp. bicolor sind durch 13 Fragmente charakterisiert, die in den 4 untersuchten Akzessionen von F. bicolor ssp. canaliculata fehlen. Die AFLP-Analysen der Gattungen Abromeitiella- Deuterocohnia stützen die Vereinigung der Gattungen Abromeitiella und Deuterocohnia in der älteren Deuterocohnia. Alle untersuchten Akzessionen der Artengruppe Abromeitiella-Deuterocohnia besitzen 11 gemeinsame charakteristische Banden, die Arten der Gattung Abromeitiella und Deuterocohnia für sich alleine genommen jedoch keine. Die größten genetischen Unterschiede bestehen zwischen der in Chile isoliert vorkommenden Deuterocohnia chrysantha und allen übrigen Arten der Gruppe. Der Informationsgehalt der analysierten chloroplastidären Sequenzen erwies sich für eine Auflösung der phylogenetischen Beziehungen von offenbar schnell evolvierenden Gattungsgruppen der Bromelioideae und Tillandsioideae als unzureichend. Fragmentanalysen, besonders AFLPs, zeigten auf der taxonomischen Ebene nah verwandter Gattungen eine gute Auflösung.
Retrovirale Gen-Therapie-Vektoren haben die ethisch problematische Eigenschaft, ungerichtet in das Genom der therapierten Zellen zu integrieren und somit die Zelle gegebenenfalls durch Insertions-Mutagenese zu schädigen. Diese Problematik könnte gelöst werden, indem das zugrunde liegende Prinzip spezifisch integrierender, mobiler genetischer Elemente (Transposons) aufgeklärt und in die Retrovirus-basierten Gen-Therapie-Vektoren mit einbezogen werden könnte. Das Genom des zellulären Schleimpilzes Dictyostelium discoideum enthält eine Reihe von Non-LTR-Retrotransposons, die ausnahmslos Positions- und Orientierungs-spezifisch in die genetisch unproblematischen Regionen vor oder hinter tRNAGene integrieren (tRNA-Gen-assoziierte Retroelemente oder kurz TRE). Zur Untersuchung des Mechanismusses der Positions- und Orientierungs-spezifischen Integration von TRE-Retrotransposons wurde in D. discoideum ein in vivo Retrotranspositions-Testsystem etabliert, mit welchem de novo auftretende Retrotranspositions-Ereignisse endogener TRE-Retrotransposons auf methodisch einfache Weise festgestellt und analysiert werden konnten. Das in vivo Testsystem beruht auf der positiven Selektion derjenigen Zellen eines D. discoideum-Reporterstammes, in denen eines der selten auftretenden Retrotranspositions-Ereignisse stattgefunden hat. Die Herstellung des D. discoideum- Reporterstammes erfolgte durch die Veränderung des UMP-Synthase-Gens (pyr5-6), in welches artifiziell ein Intron (cbfAint) inklusive eines „Köder“-tRNA-Gens (valUAC) integriert wurde. Aufgrund der Integration eines TRE-Retrotransposons in die Nähe des „Köder“-tRNA-Gens kann das Intron nicht mehr korrekt aus der UMP-Synthase-Vorläufer-mRNA gespleißt werden, die Zellen konvertieren dadurch bedingt vom ura+- zum ura--Phänotyp und können deshalb mit dem für ura+-Zellen toxischen Zytostatikum 5-Fluoro-orotat (5-FO) positiv selektiert werden. Durch die detaillierte Analyse zahlreicher 5-FO-resistenter Klone konnte gezeigt werden, daß in modernen D. discoideum-Stämmen ausschließlich die oberhalb von tRNA-Genen integrierenden TRE5-Retrotransposons vom Subtyp A.1 und A.2 gleichermaßen aktiv sind und daß ein beliebiges „Köder“-tRNA-Gen in einer artifiziellen genomischen Umgebung als Integrations-Ziel für TRE5-A-Retrotransposons dienen kann. Die TRE5-A-Retrotransposons zeigten entsprechend den genomischen Kopien eine Positions-Spezifität von ca. 48 (±3) bp oberhalb des tRNA-Gens und Ziel-Sequenz-Verdopplungen von 12 – 15 bp. Alle de novo integrierten TRE5- A.1-Retrotransposons waren 5’-verkürzt, während 64% der TRE5-A.2-Retrotransposons ein intaktes 5’-Ende aufwiesen. Das nukleäre D. discoideum-Protein CMBF (C-Modul-bindender Faktor) bindet Sequenzspezifisch an das C-Modul von TRE5-A-Retrotransposons und könnte deshalb an der Regulation der Transkription und/oder Mobilisierung der TRE5-A-Retrotransposons beteiligt sein. Zur Untersuchung des Einflusses von CMBF auf die TRE5-A-Retrotranspositions-Frequenz wurde das in vivo Retrotranspositions-Testsystem im D. discoideum-Stamm JH.D2 etabliert, welcher mit ca. 5% des Wildtyp-Niveaus CMBF stark unterexprimiert. Die Herstellung von JH.D2 erfolgte durch Einführung eines amber-Translationsstop-Codons in das cbfA-Gen des Wildtyp-Stamms AX2 sowie Expression einer amber-Suppressor-tRNA. Durch die Herstellung eines murinen monoklonalen Anti-CMBF-Antikörpers konnte bewiesen werden, daß die CMBF-Unterexpression auf eine partielle Suppression des cbfA(amber)-Stop-Codons zurückzuführen ist. Die Unterexpression von CMBF führte zu einer Erniedrigung der zellulären Menge an Sense- und Antisense-Transkripten der TRE5-A-Retrotransposons und im in vivo Testsystem zu einer maßgeblichen Reduktion der Retrotranspositions-Frequenz. Das Protein CMBF zeigt in der JumonjiC-Domäne (JmjC) Homologie zu einer Vielzahl von Proteinen prokaryontischer und eukaryontischer Organismen und könnte daher neben der Regulation der TRE5-A-Retrotransposition noch weitere biologische Funktionen in D. discoideum erfüllen. Die eingehende Untersuchung des Phänotyps der CMBFunterexprimierenden Mutante JH.D2 zeigte ein verlangsamtes Wachstum sowie einen um ca. 24 Stunden verzögerter Beginn der Entwicklung aufgrund der Inhibition des cAMP-Signalsystems. Durch die homologe Expression von CMBF und N-terminal verkürzter CMBF-Derivate konnte der Entwicklungs-Phänotyp von JH.D2 revertiert und somit der zelluläre CMBF-Mangel als alleinige Ursache für die phänotypische Veränderung von JH.D2 verantwortlich gemacht werden. Aufgrund von Zweifeln an der Richtigkeit des bislang angenommenen CMBF-kodierenden Gens (cbfA-Gen) wurde der Transkriptionsstart des cbfA-Locus mittels der 5’-RACE-Methode bestimmt und somit der Beginn des cbfA-Gens korrekt definiert. Das cbfA-Gen umfaßt demnach 3412 bp inklusive eines Introns von 409 bp und kodiert somit für ein 1000 Aminosäuren langes Protein mit einem rechnerischen Molekulargewicht von 114 198 kDa. Durch die Etablierung des in vivo Retrotranspositions-Testsystems in Dictyostelium discoideum sind die Voraussetzung für eine detaillierte Untersuchung der spezifischen Retrotransposition der TRE5-Retrotransposons gegeben. Die Herstellung der CMBF-unterexprimierenden D. discoideum-Mutante JH.D2 bietet die Möglichkeit einer eingehenden Funktions-Analyse der charakteristischen Domänen von CMBF.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Transport von PBCA-Nanopartikeln über die Blut-Hirn-Schranke und deren Einsatz als Arzneiform bei verschiedenen Erkrankungen des ZNS. Die Untersuchung des Einfluß von Nanopartikeln auf die Barriere-Eigenschaften postkonfluenter Endothelzellen und des Transportmechanismus von Nanopartikeln über einen Endothelzelllayer erfolgte in einem komplexen in vitro-BHS-Zellkulturmodell. Der Ausgangspunkt für diese Untersuchung war die Erkenntnis, daß PS80-überzogene PBCA-Nanopartikel von Endothelzellen in vitro aufgenommen werden und das nach Applikation von Doxorubicin-beladenen Nanopartikeln in Ratten erhöhte Wirkstoffspiegel im ZNS festgestellt werden konnten. Als in vitro-Zellkulturmodell der BHS wurden primäre bovine Endothelzellen verwendet. An diesen Modellen wurden die Transportmechanismen für PBCA-Nanopartikel untersucht. Dabei zeigte sich, daß PS80-überzogene PBCA-Nanopartikel bevorzugt über einen konfluenten Endothelzellayer transportiert wurden. Die Zugabe verschiedener Nanopartikelzubereitungen zu postkonfluenten Endothelzellmonolayern führte zu einer deutlichen und konzentrationsabhängigen Erhöhung der Permeabilität für Ionen und Makromoleküle. Der zugrundeliegende Aufnahme- bzw. Transportmechanismus ist jedoch noch nicht aufgeklärt. Die Effizienz der wirkstoffbeladenen Zubereitungen wurde in einem intrakranialen Gehirntumor-Modellsystem untersucht. Dabei zeigten Doxorubicin-beladene PBCA-Nanopartikel mit PS 80 die längste und ausgeprägteste antitumorale Wirkung. Der Effekt, der mit nicht-überzogenen Partikeln und mit Doxorubicin-Lösung erzielt wurde, war dagegen nicht so ausgeprägt. Die Überlebenszeit der Tiere liess sich durch die Chemotherapie deutlich verlängern. Dieses Ergebnis ist überaus bemerkenswert, da es in einem solchem Modell mit einer vergleichbaren Arzneiform noch nicht erreicht werden konnte. Es zeigte sich außerdem keine Neurotoxizität der überzogenen partikulären Zubereitungen. Auch dieses Ergebnis ist wichtig, da wiederholt von einer neurotoxischen Wirkung des Wirkstoffes Doxorubicin berichtet worden war. In einem murinen Trypanosomen-Modellsystem liess sich mit den Wirkstoffen CGP 40215, Trybizin und Diminazen der Erfolg, welcher im Gehirntumormodell durch die Bindung von Doxorubicin an Nanopartikel erzielt wurde, nicht wiederholen. Die partikulären Zubereitungen waren gegen die Trypanosomen nicht wirksamer als die reinen Substanzlösungen. Es liess sich keine Lebensverlängerung der Tiere erreichen. Ebenso konnte kein Tier geheilt werden. Das ist wahrscheinlich auf die mangelnde Bindung des Wirkstoffes an die Nanopartikelzubereitungen zurückzuführen. Ebenso kann die geringe Aktivität der Erreger im ZNS und die damit verbundene mangelnde Wirksamkeit der Enzyminhibitoren eine Rolle spielen. Zusammenfassend lässt sich sagen, daß P80-überzogene PBCANanopartikel über die BHS transportiert werden, und für Gehirntumore eine neue, innovative Arzneiform darstellen, welche den herkömmlichen Zubereitungen in Hinblick auf Lebensverlängerung im Tierversuch überlegen ist. Bei konsequenter Weiterentwicklung ist ein Einsatz dieser modernen Arzneiform im Menschen denkbar und möglich.
In der vorliegenden Arbeit wurden zeitaufgelöste optische und magneto-optische Untersuchungen an den halb-metallischen gemischtvalenten Manganatverbindungen La0.67Ca0.33MnO3 und Nd0.7Sr0.3MnO3 durchgeführt, die wichtige Informationen über die nach der optischen Anregung ablaufenden Relaxationsprozesse lieferten. Dabei wird das zu untersuchende Material mittels eines intensitätsstarken ultrakurzen Lichtpuls angeregt. Die dadurch erzeugten Änderungen in der komplexen dielektrischen Funktion der Probe tastet man mittels eines zweiten intensitätsschwächeren ultrakurzen Lichtpuls ab. Durch eine variable Weglängendifferenz zwischen den optischen Wegen des Anregeund des Abtastpulses erzeugt man eine variable Zeitverzögerung und kann damit die Änderungen in der dielektrischen Funktion zeitaufgelöst untersuchen....
Tumorspezifische T-Zellen stellen den im Prinzip wirkungsvollsten Mechanismus zur Abstoßung von Tumoren dar. Voraussetzung für die Aktivierung tumorspezifischer zytotoxischer CD8+ T-Zellen (Tc oder CTLs) ist die Präsentation von Tumorantigenen auf MHC-Klasse I Molekülen durch professionelle Antigen-präsentierende Zellen (APCs). Wegen ihrer Schlüsselrolle bei der Aktivierung von T-Zellen werden APCs in der aktiven Krebs-Immuntherapie eingesetzt. Unabhängig von CTLs können auch CD4+ Helfer T-Zellen (Th) eine Reihe effektiver Anti-Tumor Mechanismen einleiten. Die Aktivierung von CD4+ erfordert die Präsentation des Antigens via MHC-Klasse II Molekülen. Bis jetzt konnten jedoch nur einige wenige tumor-spezifische Th-Epitope identifiziert werden, welche auf MHC-Klasse II Molekülen präsentiert werden. Aus diesem Grund benutzen die meisten derzeitigen Vakzinierungsstrategien definierte Tc-Epitope, die in der Lage sind, spezifische Immunantworten gegen das Tumorantigen auszulösen. Diese Vakzine basieren auf tumorspezifischen Peptiden, Proteinen oder Proteinfragmenten, aber auch auf DNA-Konstrukten, welche für ein bestimmtes Tumorantigen kodieren. Um allerdings eine ausreichend starke Immunreaktion auszulösen, ist es notwendig diese normalerweise nur schwach immunogenen Substanzen zusammen mit Adjuvanzien zu verabreichen. Dendritische Zellen (DCs) sind hoch-effiziente APCs. Weil sie in der Lage sind, die primäre Immunantwort einzuleiten werden sie auch als „natürliches Adjuvanz“ bezeichnet. Nicht zuletzt deswegen werden bei der Entwicklung von Vakzinen immer mehr die einzigartigen Eigenschaften von DCs ausgenutzt. Gegenwärtige Studien untersuchen daher die Beladung von DCs mit synthetischen, tumorspezifischen Peptiden oder Tumor-Lysaten, um eine Aufnahme des Tumorantigens sowie dessen anschließende Präsentation auf MHCKlasse I Molekülen zu erreichen. Obgleich einige dieser Vakzinierungs-Ansätze zu vielversprechenden Ergebnissen führten, sind solche Strategien mit der aufwendigen und kostenintensiven ex vivo Aufbereitung primärer Dendritischer Zellen verbunden. Zudem muss gewährleistet sein, dass die ausgewählten T-Zell Epitope auch vom jeweiligen MHC-Haplotyp des Patienten präsentiert werden. Um einige dieser Nachteile auszugleichen, wären „Konstrukte“ wünschenswert, welche in vivo einen zielgerichteten Transport eines oder besser, mehrerer T-Zell Epitope zu den Dendritischen Zellen ermöglicht. Mit der Entwicklung und Optimierung von Systemen, die Tumorantigene gezielt zu und in APCs transportieren, könnte die Effizienz herkömmlicher Vakzinierungen gesteigert und deren Dosierung verringert werden. In dieser Arbeit wird die Herstellung sowie die funktionelle Charakterisierung zweier neuartiger Vakzine beschrieben. Diese Vakzine wurden für die in vivo Vakzinierung gegen das tumorassoziierte Antigen ErbB2 (HER2/neu) entwickelt. ErbB2 wird in einer Reihe von Tumoren wie Brust- und Ovarialkarzinomen oder Adenokarzinomen der Lunge überexprimiert. Andere Tumorenentitäten wie Kolon-, Nieren-, Blasen-, Speicheldrüsen-, Prostata- und Pankreaskarzinome zeigen ebenfalls eine variable Überexpression von ErbB2. Ziel des ersten der beiden Vakzinierungsansätze war eine verbesserte Aufnahme und Präsentation von Tumorantigenen durch APCs zu erreichen. Als Teil eines Fusionsproteins sollte hier die zielgerichtete Bindung einer antigenen Determinante an APC-spezifische Oberflächenmoleküle und deren anschließende Aufnahme und Prozessierung innerhalb von APCs ermöglicht werden. Als mögliche APC-Bindedomäne wurde ein Fragment gewählt, welches sich vom extrazellulären Anteil des B7-Rezeptors CTLA-4 (CTLA-4125) ableitet. B7 ist ein Oberflächenprotein, das speziell auf APCs exprimiert wird. Nach der bakteriellen Expression und Reinigung wurde durch FACS-Analyse gezeigt, dass lösliches humanes CTLA-4125 spezifisch sowohl an murine als auch humane B7 Moleküle bindet und daher als effektive APC-Bindungsdomäne für den zielgerichteten Transport von Tumorantigenen zu APCs verwendet werden kann. Als chimäre Proteinvakzine zur spezifischen Bindung an APCs wurden zwei mit C-ErbB2(N) bzw. C-E-ErbB2(N) bezeichnete Fusionsproteine konstruiert. Diese setzen sich aus CTLA-4125 am N-Terminus für die Bindung an APCs und einem Fragment des extrazellulären Teils des humanen tumorassoziierten ErbB2 Antigens (ErbB2(N), Aminosäuren 1-222) am C-Terminus zusammen. Beim C-E-ErbB2(N) Protein wurde zusätzlich die Translokationsdomäne von Pseudomonas exotoxin A (ETA II) zwischen der APC-Bindungsdomäne und der antigenen Determinante eingefügt. Diese Domäne könnte nach Rezeptor-vermittelter Aufnahme des Fusionsproteins die Freisetzung des Tumorantigens aus dem Endosom ins Zytoplasma verbessern und so die Prozessierung und Präsentation des Antigens via MHC-Klasse I verstärken. Beide chimären CTLA-4-ErbB2 Fusionsproteine wurden in E. coli exprimiert und mittels Metallchelat-Chromatographie aus den bakteriellen Lysaten gereinigt. Die spezifische Bindung der rekombinanten Fusionsproteine an B7 Moleküle auf der Zelloberfläche sowie deren Aufnahme durch B7-exprimierende humane Raji Zellen wurde mittels FACS Analyse und konfokaler Mikroskopie nachgewiesen. In Balb/c Mäusen wurde untersucht, inwieweit die Fusionsproteine eine Immunantwort gegen das Tumorantigen auslösen können. Die Vakzinierung von Balb/c Mäusen mit den CTLA-4 Fusionsproteinen bewirkte die Abstoßung anschließend subkutan injizierter syngener ErbB2-positiver Nierenkarzinomzellen (Renca-lacZ/ErbB2) nach subkutaner Injektion. Dies deutet auf die Erzeugung protektiver Immunität hin. Obgleich beide Fusionsproteine effektiv waren, zeigte das Fusionsprotein C-ErbB2(N), dem die bakterielle Translokationsdomäne fehlt, in mehreren unabhängigen Experimenten eine höhere Wirksamkeit als C-E-ErbB2(N). Vakzinierung mit den CTLA-4 Fusionsproteinen erzeugte keinen Schutz gegen ErbB2-negative Kontroll-Tumorzellen. Dies Experimente zeigt die Antigen-Spezifität der induzierten Immunantwort nach Vakzinierung mit CTLA-4 Fusionsproteinen. T-Zell Depletionsexperimente ergaben, dass die protektiven Effekte eindeutig von CD8+ CTLs abhängig waren. Eine erneute, diesmal intravenöse Applikation von ErbB2+ Tumorzellen in vakzinierte, tumorfreie Mäuse zwei Monate nach der ersten, subkutanen Injektion („Re-challenge“) führte nicht zur Ausbildung von Lungenmetastasen. Dies deutet darauf hin, dass durch die Vakzinierung eine langanhaltende Immunreaktion induziert wurde. In therapeutischen Vakzinierungsexperimenten, die wohl am ehesten eine klinische Situation in Tumorpatienten widerspiegeln, wurden die CTLA-4 Fusionsproteine in die Umgebung bereits etablierter subkutaner Renca-lacZ/ErbB2 Tumoren injiziert. In zwei unabhängigen Experimenten konnte gezeigt werden, dass durch die therapeutische Vakzinierung mit CErbB2(N) 7 von 8 Mäusen geheilt werden konnten, wohingegen die Wirkung von C-EErbB2(N) – von 8 Mäusen wurden 6 geheilt – auch im therapeutischen Einsatz etwas schwächer zu sein schien. Nach einem intravenösen „Re-challenge“ mit Renca-lacZ/ErbB2 Zellen waren bereits geheilte Tiere auch vor der Ausbildung von Lungenmetastasen geschützt. Dies bestätigt eine durch die Vakzinierung hervorgerufene lang-anhaltende Anti-Tumor Immunität. Alternativ zur Produktion rekombinanter Proteinvakzine in Bakterien wurde auch die direkte Injektion von DNA-Konstrukten zur in vivo Expression und Sekretion der CTLA-4 Fusionsproteine getestet (DNA-Vakzinierung). Basierend auf dem Plasmid pSecTag2 wurden Säugerzell-Expressionsvektoren hergestellt, welche unter der Kontrolle eines CMVPromotors die beiden Fusionsproteine C-ErbB2(N) bzw. C-E-ErbB2(N) kodieren. Ein Igk “leader” Signalpeptid ermöglicht hierbei die Sekretion der produzierten Proteine. Nach Transfektion der Plasmide in COS-7 Zellen konnte Sekretion der CTLA-4-Fusionsproteine in den Zellkulturüberstand sowie deren Zellbindungsspezifität für B7, mit Hilfe von Western-Blot und FACS-Analysen nachgewiesen werden. Protektionsexperimente ergaben, dass alle Balb/c Mäuse, die vorher durch intramuskuläre Injektion der CTLA-4-ErbB2 DNA-Vakzine vakziniert wurden, vor dem Anwachsen subkutan injizierter Renca-lacZ/ErbB2 Tumorzellen geschützt waren. Mäuse, die als Kontrolle mit dem leeren pSecTag2 Vektor vakziniert wurden, entwickelten dagegen schnell wachsende Tumoren. In diesem ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass chimäre Proteinvakzine, die in einer einzigen Polypeptidkette eine Zellerkennungsdomäne zur spezifischen Bindung an APCs und ein antigenes Proteinfragment aus dem humanen ErbB2 enthalten, in vivo eine äußerst wirkungsvolle ErbB2-spezifische T-Zell vermittelte Anti-Tumor Immunantwort auslösen. Hierbei konnte sowohl durch die Injektion von rekombinanten, in Bakterien hergestellten Proteinen, wie auch durch DNA-Vakzinierung zur in vivo Produktion dieser chimären Proteinvakzine erreicht werden, dass syngene, ErbB2 exprimierende Tumoren abgestoßen wurden. Die oben beschriebenen chimären Proteinvakzine enthalten ein großes Proteinfragment, abgeleitet aus einem humanen Tumorantigen, welches zu APCs befördert und von ihnen aufgenommen wird. Dieser Ansatz ist nicht unbedingt abhängig von einem bestimmten MHCTyp und möglicherweise besonders dann wirkungsvoll, wenn Immunantworten gegen Antigene erzeugt werden sollen, für die noch keine von MHC-Molekülen präsentierten Peptide identifiziert sind. Für Tumorantigene, aus welchen bereits einzelne Peptide als potentielle Tumorabstoßungs-Antigene definiert sind, wurden in einzelnen Fällen synthetische Derivate solcher Peptide erfolgreich eingesetzt, um hochspezifische T-Zell Antworten zu erzeugen. Aber auch in diesem Fall könnte die Verknüpfung des Antigens mit einem geeigneten „Antigen-Carrier“ eine verbesserte Aufnahme und Präsentation durch APCs und eine Verstärkung der Immunantwort gegen das Antigen zur Folge haben. Aus diesem Grund wurde in einem alternativen Ansatz zur Induktion einer ErbB2-spezifische Anti-Tumor Immunität die in vivo Anwendung von synthetischen Vakzin-Komplexen untersucht, welchen ein liposomaler Träger als Vektor für Peptid-Antigene zugrunde liegt. Diese Peptide sind über einen immunstimulatorischen Lipopeptid-Anker (Pam3CysSerSer) mit der Oberfläche solcher Liposomen verknüpft. Dieser Teil der Arbeit wurde in enger Kollaboration mit Audrey Roth, Dr. Benoit Frisch und Dr. Francis Schuber, Laboratoire de Chimie Bioorganique, Faculté de Pharmacie, Université Louis Pasteur (ULP), Strasbourg ausgearbeitet, die alle in dieser Arbeit verwendeten liposomalen Vakzine konstruierten und für in vivo Untersuchungen bereitstellten. Zwei liposomale Substanzen wurden synthetisiert. Ein Mono-Epitop Konstrukt, als „Tc-ErbB2-liposomes“ bezeichnet, trägt ein Tc-Epitop (TYLPTNASL), welches sich von der Aminosäuresequenz des humanen ErbB2 Moleküls ableitet. Es war bereits vorher gezeigt worden, dass dieses Peptid mit hoher Affinität an das murine H-2Kd MHC-Klasse I Molekül bindet und eine Peptid-spezifische CTL Immunantwort in Balb/c Mäusen auslösen kann. Die zweite liposomale Substanz, als „Tc-ErbB2/Th-liposomes“ bezeichnet, enthält zusätzlich zum ErbB2-Peptid noch ein universelles Th-Epitop, das sich vom Influenza Virus Hämagglutinin (HA 307-319) ableitet und ebenfalls über den adjuvanten Anker mit dem Liposom verbunden ist. Durch das Hinzufügen des Th-Epitops wurde beabsichtigt, zusätzlich CD4+ Helfer TZellen zu rekrutieren und damit die CTL Antwort gegen das Tc-Epitop zu verstärken. Durch ex vivo Restimulation von Milzzellen aus zuvor mit den liposomalen Konstrukten vakzinierten Tieren mit dem ErbB2-Peptid konnte die in vivo Aktivierung Tc-spezifischer CTLs nachgewiesen werden. In dem gleichen immunkompetenten Balb/c Maus-Modell, das auch zur Charakterisierung der CTLA-4-ErbB2 Proteinvakzine verwendet worden war, wurde auch die anti-tumorale Aktivität der liposomalen Komplexe untersucht. Die Vakzinierung von Balb/c Mäusen mit beiden Konstrukten, Tc-ErbB2-liposomes und Tc-ErbB2/Th-liposomes, führte zur Abstoßung anschließend subkutan injizierter ErbB2 exprimierender RencalacZ/ErbB2 Zellen. Eine therapeutische Vakzinierung von Mäusen, die bereits etablierte ErbB2+ Tumoren trugen, führte zu einem verlangsamten Wachstum in einigen und zur kompletten Abstoßung in den übrigen Tieren. In Kontrolltieren, die lediglich mit dem liposomalen Träger vakziniert waren, konnten keinerlei Tumorregression beobachtet werden. Während beide liposomalen Substanzen sowohl bei der protektiven als auch bei der therapeutischen Vakzinierung Anti-Tumor Effekte zeigten, verstärkte das Hinzufügen des Th-Epitops zu den „Tc-ErbB2 liposomes“ sowohl die ErbB2-spezifische Immunantwort als auch die Anti-Tumor Immunität. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung einer synergistischen CD4+ T-Zell Aktivierung als Teil von Anti-Tumor Immunantworten. Unabhängig von ihrer unterschiedlichen Wirkungsweise und chemischen Zusammensetzung stellen beide in dieser Arbeit untersuchten Vakzinkomplexe effektive Tumorvakzine dar, die nach ihrer Anwendung in vivo ErbB2-spezifische, T-Zell vermittelte Anti-Tumor Immunantworten auslösen können. Die chimären Fusionsprotein-Vakzine enthalten ein großes antigenes Proteinfragment. Durch ihre spezifische Zellbindungsdomäne wird der zielgerichtete Transport zu und die Aufnahme des Antigens in APCs, gefolgt von in vivo Prozessierung des Proteins in kleine antigene Peptide, MHC-Präsentation und schließlich Aktivierung tumorspezifischer T-Zellen gewährleist. Dieser Ansatz könnte insbesondere dann nützlich sein, wenn für das jeweilige Tumorantigen noch keine passenden T-Zell Epitope charakterisiert sind. Ein zusätzlicher Vorteil dieser Konstrukte ist, dass in einem einzigen Vakzin mehrere unterschiedliche antigene Determinanten bereitgestellt werden können. Für eine Reihe von Tumorantigenen sind bereits einzelne Peptide als potentielle Tumorabstoßungs-Antigene charakterisiert worden. Die in dieser Arbeit beschriebenen neuartigen liposomalen Träger, welche zusätzlich zum Tc-Epitop einen immunstimulatorischen Anker und ein starkes Th-Epitop tragen, könnten dazu beitragen, die Immunogenität und die anti-tumorale Aktivität synthetischer Peptid-Vakzine zu erhöhen.