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Einführung/Zielsetzung: Die sekundäre Peritonitis stellt nach wie vor ein kompliziertes Krankheitsbild dar, das mit einer Letalität zwischen 20% und 40% einhergeht. Untersuchungen haben gezeigt, dass die Prognose eines Patienten mit einer sekundären Peritonitis von einer adäquaten systemischen und lokalen Immunantwort abhängt. Eine inadäquate Immunantwort kann durch das Auftreten einer Hyperinflammation oder aber einer Immunparalyse charakterisiert sein. Sie trägt erheblich zu den Komplikationen einer sekundären Peritonitis wie zum Beispiel septischer Schock, Multiorganversagen oder Abszessbildung bei. Diese Arbeit wurde durchgeführt, um ein besseres Verständnis über die Rolle der polymorphnukleären Leukozyten (PMNL) in der Peritonitis zu erlangen. Daher konzentrierte sich diese Studie auf die Untersuchung der Phagozytose, der Expression von Fc-Rezeptoren, Komplement-Rezeptoren und Rezeptoren, die an Adhäsionsvorgängen beteiligt sind, bei zirkulierenden und intraabdomiell emigrierten PMNL (zPMNL, ePMNL). Methodik: In der vorliegenden Arbeit wurden Funktionen (Phagozytose, respiratorischer Burst), Stimulierbarkeit sowie die Expression funktionsassoziierter Oberflächenrezeptoren (CD14, CD16, CD18, CD32, CD35, CD54, CD62L, CD64) zirkulierender und intraabdominell emigrierter PMNL mittels FACS-Analyse charakterisiert. Zirkulierende und emigrierte PMNL (zPMNL, ePMNL) wurden von Patienten mit einer diffusen sekundären Peritonitis (n=18) intra- und bis 96 Stunden postoperativ untersucht. Die Kontrollgruppe bestand aus abdominalchirurgisch operierten Patienten ohne Peritonitis (n=8). Um den Einfluss von Anästhesie und abdomineller Operation zu ermitteln, untersuchten wir diese Parameter auch an zirkulierenden PMNL gesunder Probanden (n=9). Ergebnisse: Nach intraabdomineller Emigration wiesen die PMNL deutliche phänotypische Veränderungen im Vergleich zu zPMNL auf. Die Expression des CD62L war bei ePMNL nicht mehr nachweisbar, die Expression des b2-Integrins (CD18) hingegen um ein Mehrfaches erhöht. Die Expression des CD54-Moleküls stieg nur auf ePMNL von Patienten mit Peritonitis in einem nennenswerten Umfang an. Ferner konnte nachgewiesen werden, dass nach intraabdomineller Emigration der Anteil phagozytierender PMNL drastisch reduziert war im Vergleich zu zirkulierenden PMNL, und dass der Anteil phagozytierender ePMNL bei Patienten mit einer sekundären diffusen Peritonitis noch tiefer supprimiert war. Bei Patienten mit Peritonitis und zusätzlichen Komplikationen kam es zu einer noch weiterreichenden Depression der Phagozytose der ePMNL. Die rezeptorabhängige bzw. die rezeptorunabhängige Stimulierbarkeit der CD16- bzw. CD18-Expression bei ePMNL war im Vergleich zu zPMNL herabgesetzt. Die Untersuchungen wurden durch die Bestimmung pround antiinflammatorischer humoraler Mediatoren (IL-8, IL-10, TNF-a, Endotoxin) im Plasma und im Peritonealsekret komplementiert und mit den Ergebnissen der zellulären Untersuchungen korreliert. Es zeigten sich erhöhte TNF-a-Konzentrationen in der Bauchhöhle im Vergleich zu dem Kontrollkollektiv, für IL-10 konnten nur intraoperativ erhöhte Werte gemessen werden. Diskussion: Nicht bei jeder Peritonitis scheint ein Bedarf für eine immunmodulierende Therapie zu bestehen. Patienten mit komplizierter Peritonitis könnten von einer Modulation der PMNL profitieren, wenn diese Therapie in der Lage wäre, überschießend aktivierte zirkulierende PMNL herunterzuregulieren und die supprimierten Funktionen der emigrierten PMNL zu verbessern.
Deferred imitations assess declarative memory in infants. Many cross-sectional and a few longitudinal studies revealed that, with development, infants learn faster,and retain more target actions over longer retention intervals. Longitudinal stabilities are modest and increase through the second year. To date, there are only few multivariate deferred imitation studies pointing to interactions between declarative memory, language and self-development. However, as these studies applied variable-centered data analysis approaches, the individual stance was not taken into account.Therefore, the present dissertation focuses on the explanation of inter-individual differences of deferred imitation through the second year. In the multivariate, longitudinal Frankfurt Memory Study (FRAMES), declarative memory (deferred imitation), non-declarative memory (train task), as well as cognitive, language, motor, social, emotional and body self-awareness development (Developmental Test for 6-month- to 6-year-olds, ET6-6) were assessed on three measurement occasions (12-, 18- and 24-month-olds). From a psychometric perspective, sound tests for the assessment of deferred imitation in the respective age groups were developed (Paper 1 & 2). Reliability analyses (Paper 3) indicated relatively high short-term-stability for the deferred imitation test (12-month-olds). The co-development of declarative and nondeclarative memory in 12- and 18-month-olds provided evidence for discriminative validity (Paper 4). Longitudinally, deferred imitation performance tremendously increased throughout the second year, and performance was moderately stable between 12 and 18 months and stability increased between 18 and 24 months. Using a person-centered analysis approach (relative difference scores; cluster analysis), developmental subgroups were extracted out of the total sample. These groups differed in terms of mean growth and stability. However, between the first and second measurement occasion, the groups did not differ with respect to motor, cognitive and language development (Paper 5). Using the data of three measurement occasions, subgroups were extracted showing significant differences with respect to language, motor and body self-awareness development (Paper 6). The results are discussed against the background of infancy development theories.
Osteochondrosis dissecans des Kniegelenkes: röntgenologische und kernspintomographische Studie
(2007)
Erkennbar wird die Operationsmethode der Wahl vom festgestellten Stadium der Erkrankung bei der ersten Untersuchung der Patienten bestimmt. Bei denjenigen Patienten, die über Schmerzen im Kniegelenk ohne Traumaanamnese klagen, steht meistens nach der klinischen Untersuchung die Röntgendiagnostik an erster Stelle. Die dabei festgestellten Röntgenstadien der OD bestimmen das weitere Vorgehen. Liegt in den angefertigten Röntgenaufnahmen das Röntgenstadium 1 vor, so kann durchaus eine konservative Behandlung oder schlichtes Abwarten angebracht sein. Auch beim Stadium 2 können diese therapeutischen Ansätze in Betracht gezogen werden, im Zweifelsfall sollte jedoch eine weitere Diagnostik – wie MRT oder eine Arthroskopie – zur Abklärung herangezogen werden. Stellt sich dabei der begründete Verdacht einer Knorpelerweichung, so ist eine diagnostische Arthroskopie angezeigt, bei der u.U. schon weitere operative Maßnahmen – wie etwa eine retrograde Stanzung – ergriffen werden können. Im Röntgenstadium 3 ist eine Arthroskopie zu empfehlen. Ab diesem Stadium ist eine weitere MRT-Untersuchung im allgemeinen überflüssig, da im weiteren ohnehin meistens operative Verfahren zur Anwendung kommen werden. Stellt sich dabei in der Arthroskopie die Knorpeloberfläche zwar als erweicht, jedoch vollständig intakt dar, so bietet sich eine retrograde Stanzung als Therapie an. In diesem Erkrankungsstadium kann aber auch immer noch die konservativ abwartende Vorgehensweise mit regelmäßigen Kontrolluntersuchungen in Betracht gezogen werden. Läßt sich allerdings bereits der Knorpel abheben, so sollte er refixiert werden. Hier bietet sich das Verfahren mit resorbierbaren Pins (z.B. Ethipin) an. Auch durch PRIDIE-Bohrungen kann vor der Refixation versucht werden, die Sklerosezone zu durchbrechen, damit das refixierte Dissekat besser einwachsen kann. Ab dem Röntgen-Stadium 4 ist eine Arthroskopie praktisch nicht vermeidbar. Meistens besteht dann nämlich ein ausgeprägter Knorpeldefekt, der eine operative Therapie nach sich ziehen sollte. Ein nur teilweise gelöster OD-Herd sollte nach Möglichkeit refixiert werden, um die Kongruenz der Gelenkflächen wiederherzustellen. Im Stadium 5 ist die Refixierung die Methode der Wahl. Dieses Verfahren sollte zusätzlich durch eine weitere operative Maßnahme – wie Stanzung oder PRIDIE-Bohrungen – flankiert werden. Eine Stanzung kann ggf. sowohl retrograd als auch von anterograd durchgeführt werden. Beim Vorliegen des Röntgenstadiums 6 – dem Stadium eines freien Gelenkkörpers–, wird in den meisten Fällen auch intraoperativ ein freier Gelenkkörper festgestellt, der häufig jedoch so degeneriert und malazisch ist, daß er für eine Refixation nicht mehr in Frage kommt. In diesem Fall sollten alternative Verfahren – z.B. die Knorpel-Knochen-Transplantation wie DBCS (Diamond Bone Cutting System) oder OATS (Osteochondrale Autologes Transplantations System)– in Erwägung gezogen werden, da die bloße Entfernung des OD-Herdes in aller Regel eine vorzeitige Arthrose nach sich zieht. Da die Röntgenaufnahme nur freie Gelenkkörper mit subchondralem Anteil zeigt, häufig aber auch noch knorpelige freie Gelenkkörper vorliegen, sollten diese ggf. möglichst wieder refixiert werden. Die MRT-Diagnostik ist für die Beurteilung des Erkrankungsgrades einer OD mit Sicherheit ein vorzüglich geeignetes Instrument, das zumindest in Zweifelsfällen und bei röntgenologischen Anfangsstadien zur Abklärung herangezogen werden sollte.
Chlamydomonas reinhardtii ist eines der bekanntesten Modellsysteme der Forschung, um photo-, zell- und molekularbiologische Fragestellungen zu untersuchen. Die phototaktischen Reaktionen dieser einzelligen Grünalge werden durch mikrobielle Rhodopsine, sogenannte Photorezeptoren initiiert, deren Chromophor all-trans-Retinal ist. Eines dieser Rhodopsine ist Channelrhodopsin 2 (ChR2). Ein Sequenzvergleich mit anderen mikrobiellen Rhodopsinen aus Archaebakterien, wie z.B. der lichtgetriebenen Protonenpumpe Bakteriorhodopsin, zeigt eine Homologie von bis zu 20 %. Aus diesem Grund kann angenommen werden, dass die hydrophobe N-terminale Hälfte mit circa 300 von 737 Aminosäuren ebenso aus einem Siebentransmembranhelixmotiv besteht, wie dies für Rhodopsinmoleküle typisch ist. Seit der Entdeckung 2003 durch Nagel et al. ist bekannt, dass es sich bei ChR2 um einen lichtgetriebenen, kationenselektiven Ionenkanal handelt, der in dieser Form bisher nicht bekannt war. Diese biophysikalische Charakteristik konnte durch detaillierte elektrophysiologische Daten erhoben werden. Sie lieferten zudem die Erkenntnis, dass ChR2 als „Werkzeug“ in der Neurobiologie verwendet werden kann, da die lichtinduzierte Depolarisation zum Feuern von Aktionspotentialen in ChR2-exprimierenden Neuronen führt. Die vorliegende Arbeit sollte dazu beitragen, die molekularen Mechanismen von ChR2 aufzuklären, indem elektrophysiologische, spektroskopische und biochemische Daten miteinander korreliert wurden. Dazu wurde ChR2 funktionell in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris exprimiert. Ein Glykosylierungstest konnte belegen, dass Pichia pastoris in der Lage ist, die für ChR2 erforderliche N-Glykosylierung durchzuführen. Mit einer 90%igen Expression war es somit möglich, ausreichend Protein für eine Metallchelat-Affinitätschromatographie zu gewinnen. Weiterhin konnte die bestehende Funktionalität nach der Isolierung von ChR2 nachgewiesen werden. Dies erfolgte zum einen über Messungen des charakteristischen Photostroms mittels der BLM-Technik. Zum anderen konnte dies durch spektroskopische Messungen der spezifischen Absorption von ChR2 bei 480 nm bestätigt werden. Die zeitaufgelöste Laserblitzabsorptionsspektroskopie lieferte zudem Differenzspektren des isolierten ChR2, die erstmalig das Vorhandensein eines spektral verschiedenen Intermediats bei 540 nm zeigten. Zusammen mit dem Zeitverlauf aller vier korrespondierenden Intermediate und der Hinzunahme elektrophysiologischer Daten konnte somit ein linearer Photozyklus bestehend aus vier Zuständen erstellt werden (erstellt durch Dr. Christian Bamann). Die ersten drei Intermediate des Photozyklus P1-P3 werden demnach durch die rotverschobene Spezies beschrieben, mit einer Relaxationszeit von unter einer Millisekunde. Dieses rote Intermediat spiegelt die Konformationsänderung des Retinals wider und geht mit dem Öffnen des Kanals einher. Die Zustände P2 und P3 konnten beide als kationenleitende Zustände identifiziert werden. Das Schließen des Kanals wird durch den Übergang von P3 zu P4 (spektral mit dem Grundzustand gleich) vermittelt. Das Zurückkehren in den Grundzustand folgt einem langsamen Prozess im Bereich von mehreren Sekunden. Biochemische, spektroskopische und elektrophysiologische Daten haben damit erfolgreich zur weiteren Aufklärung der molekularen Funktionsweise von ChR2 beigetragen. Mit diesen Ergebnissen ist nun die Erschließung neuer Informationen über die verschiedenen Signaltransduktionswege von Membranproteinen möglich.
In einer prospektiven klinischen Studie wurden 40 Procera-AllCeram-Kronen unter standardisierten Bedingungen bei 18 konsekutiv ausgewählten Patientinnen und Patienten im Front- und Seitenzahnbereich eingegliedert. Als Untersuchungszeitpunkte wurde ein Termin vor der Eingliederung, bei der Eingliederung, sowie nach ein und zwei Jahren Tragedauer festgelegt. Insgesamt 21 Untersuchungskriterien bezogen sich auf die Bewertung der Pfeilerzähne, der Kronen und der Keramik. Weiterhin wurde eine subjektive Beurteilung des Zahnersatzes durch die versorgten Patienten anhand eines Fragenkataloges vorgenommen. Zur Kontrolle der parodontalen Verhältnisse wurden der Approximalraum-Plaqueindex (modifiziert nach LANGE, 1977) und der Sulkus-Blutungsindex (modifiziert nach MÜHLEMANN und SON, 1971) erhoben und die Sondierungstiefen gemessen. Als Kontrollgruppe dienten die entsprechenden kontralateralen Zähne, an denen die gleiche Untersuchung erfolgte. Zusätzlich zu den klinisch erhobenen Daten wurden die Restaurationen zu jedem Untersuchungszeitpunkt fotografisch dokumentiert. Die Untersuchungen nach 24 Monaten Tragedauer ergaben folgende Resultate: Bei keinem der Pfeilerzähne traten ein Vitalitätsverlust, eine Perkussionsempfindlichkeit oder Schmerzen auf. Im Vergleich zu den bei Eingliederung erhobenen Daten (Baseline) verringerte sich die Mobilität der Pfeilerzähne (Veränderung des Anteils der Pfeilerzähne mit Lockerungsgrad 0 von 25,0 % auf 27,5 %, Lockerungsgrad I von 67,5 % auf 70,0 % und Lockerungsgrad II 7,5 % auf 2,5 %). Die Plaqueakkumulation reduzierte sich im Vergleich zu den Daten zum Zeitpunkt der Kroneneingliederung (Baseline) von 12,5 % auf 7,5 %. Eine gingivale Irritation konnte nach zweijähriger Tragedauer bei nur 2,5 % der Pfeilerzähne festgestellt werden, während bei Kroneneingliederung (Baseline) noch 15,0 % betroffen waren. Die Sondierungstiefe blieb an 35 Zähnen konstant oder verbesserte sich um bis zu zwei Millimeter, während bei fünf Pfeilerzähnen eine Erhöhung von einem Millimeter auftrat. Bei keiner Krone konnte die Entstehung einer Sekundärkaries, die Bildung eines sondierbaren Randspaltes oder einer positiven oder negativen Stufe am Kronenrand festgestellt werden. Ebenso kam es bei keiner Restauration zum Verlust der Retention bzw. zur Veränderung der Approximalkontakte. Bezüglich der Keramik lagen bei keiner der eingegliederten Vollkeramikkronen eine Hartkernfraktur, eine partielle Fraktur oder einzelne Frakturlinien vor. Hinsichtlich der Verblendkeramik ließ sich bei keiner Krone eine Verfärbung bzw. ein Glanzverlust feststellen. Die okklusalen Verhältnisse änderten sich im Vergleich zu den bei Eingliederung erhobenen Daten nach Prüfung mit Shimstock- und farbiger Okklusionsfolie nicht. Im Hinblick auf die subjektive funktionelle Bewertung anhand von zehn Fragen durch die versorgten Patient(inn)en resultierte eine positive Bewertung bei allen Personen. Das mittels des Schulnotensystems evaluierte ästhetische Ergebnis ergab bei 17 Patient(inn)en (39 Kronen) die Beurteilung „sehr gut“. Eine Person bewertete das Aussehen der bei Ihr eingegliederten Krone lediglich als „befriedigend“. Unter Berücksichtigung des begrenzten Beobachtungszeitraumes von zwei Jahren kann anhand der vorliegenden Studie festgestellt werden, dass Procera-AllCeram-Vollkeramikkronen eine positiv zu bewertende Behandlungsmethode im Hinblick auf Funktion und Ästhetik darstellen. Bei Gegenüberstellung der ermittelten Ergebnisse zu den in der Literatur vorliegenden Daten von Vollguss- oder Metallkeramikkronen zeigen die eigenen klinischen Resultate, dass das untersuchte vollkeramische System zur Herstellung von konventionell zementierbaren Einzelzahnkronen im Front- und Seitenzahnbereich geeignet erscheint.
Die Lyme-Borreliose, eine durch Zecken übertragene Multisystem-Erkrankung, wird durch die Spirochäte B. burgdorferi s. l. hervorgerufen. Die in vitro-Empfindlichkeit von Borrelien gegenüber einer ganzen Reihe von Substanzen ist bislang nicht oder nur unzureichend bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde daher die in vitro-Empfindlichkeit von B. burgdorferi gegenüber einer Reihe von neu entwickelten Antibiotika im Vergleich zu bekannten Substanzen unter standardisierten Bedingungen untersucht. Im 1. Teil der Arbeit wurde ein neues kolorimetrisches Mikrodilutionstestverfahren in Kombination mit konventioneller Subkultivierung in Flüssigmedium zur Bestimmung der in vitro-Empfindlichkeit von 17 repräsentativ ausgewählten Borrelienstämmen gegenüber dem neu entwickelten Ketolid Cethromycin eingesetzt. Das Verfahren ist standardisiert, gut reproduzierbar und erlaubt es, mehrere Antibiotika bzw. Isolate gleichzeitig effizient zu testen. Die MHK90 für Cethromycin lag für die getesteten Isolate einheitlich bei  0,002 µg/ml. Die MBK90 lag bei 0,75 µg/ml. Im 2. Teil der Arbeit wurden auf der Basis von konventionellen Zellzählungen mittels Dunkelfeldmikroskopie zusätzlich Untersuchungen zur Aktivität von Cethromycin, Sitafloxacin und Gemifloxacin im Vergleich zu Ciprofloxacin und den bekanntermaßen gut gegen Borrelien wirksamen Substanzen Doxycyclin und Ceftriaxon für je ein repräsentatives Isolat der humanpathogenen Genospezies B. burgdorferi s. s., B. garinii und B. afzelii durchgeführt. Von den untersuchten neuen Substanzen zeigten Cethromycin (MHK [Mittelwert]: ≤ 0,002 µg/ml; MBK [Mittelwert]: 0,3 µg/ml) und Gemifloxacin (MHK [Mittelwert]: 0,06 µg/ml; MBK [Mittelwert]: 8 µg/ml) im Vergleich zu den in der Therapie der Lyme-Borreliose bewährten Substanzen Ceftriaxon (MHK [Mittelwert]: 0,016 µg/ml; MBK [Mittelwert]: 1,2 µg/ml) und Doxycyclin (MHK [Mittelwert]: 0,25 µg/ml; MBK: von 24 bis >32 µg/ml) die vielversprechendste Aktivität gegen B. burgdorferi. Diese Ergebnisse konnten in Hinblick auf die Aktivität der getesteten Antibiotika gegenüber Borrelien durch die zusätzlich über 120 h durchgeführten Time-Kill-Experimenten abgesichert werden. Im 3. Teil der Arbeit wurden dann unter Zuhilfenahme eines theoretischen Modells mittels Einbeziehung weiterer pharmakologischer und pharmakokinetischer Daten für alle getesteten Substanzen sogenannte Bakterizidie-Indizes (BIs) auf der Basis der erzielten in vitro-Resultate berechnet. BIs von > 2,8 stehen dabei für eine gute bis sehr gute antimikrobielle Aktivität. Für Cethromycin zeigte sich bei den untersuchten Isolaten ein rascher Anstieg der BIs schon nach einer sehr kurzen Inkubationszeit von 48 h. Dabei lagen die Werte für Cethromycin (BIs 5,0-7,59) nach 120 h sogar über denen von Doxycyclin (BIs 2,81-3,15). Ebenso lagen die errechneten BIs für Gemifloxacin nach 120 h (BIs 3,33-8,05) höher als für Doxycyclin. Ceftriaxon war allerdings die bei weitem am besten wirksame Substanz und zeigte auch die höchsten BIs von 14,96 bis 18,48. Unter Berücksichtigung aller verfügbaren Daten ergab sich aus der vorliegenden Arbeit zusammenfassend folgende Rangordnung für die in vitro-Aktivität der getesteten antibiotischen Substanzen: Ceftriaxon > Cethromycin > Gemifloxacin > Doxycyclin > Sitafloxacin > Ciprofloxacin. Für neu entwickelte Antibiotika stellen in vitro-Untersuchungen einen ersten Schritt für eine Charakterisierung ihrer antimikrobiellen Wirksamkeit gegen Infektionserreger dar. Die Einbeziehung weiterer pharmakologischer Daten in die Interpretation solcher experimentell gewonnenen Ergebnisse ist innovativ, vermittelt zusätzliche Informationen und erlaubt eine vergleichende modellhafte Abschätzung der Aktivität solcher Substanzen unter Berücksichtigung wichtiger pharmakokinetischer und pharmakodynamischer Parameter. Zusammenfassend legen die in der vorliegenden Arbeit herausgearbeiteten Ergebnisse eine vielversprechende Aktivität von zwei neuen Substanzen (Cethromycin und Gemifloxacin) gegen B. burgdorferi nahe und lassen daher eine weitergehende klinische Prüfung dieser Antibiotika für eine mögliche therapeutische Anwendung bei Lyme-Borreliose sinnvoll erscheinen.
This thesis is concerned with various aspects of estimating trend output and growth and discusses and evaluates methods to prepare medium-term GDP growth projections. Furthermore, econometric techniques suited for cross-correlated macroeconomic panel data with a focus on factor models are applied for unit root and cointegration testing as well as panel error correction estimation. Applications involve the identification of growth determinants as well as the modelling of aggregate labor supply in a multi-country framework. The first chapter evaluates a very popular method for potential output estimation and medium-term forecasting---the production function approach---in terms of predictive performance. For this purpose, a particular forecast evaluation framework is developed and an evaluation of the predictions of GDP growth for the three to five years ahead for each individual G7 country is carried out. In chapter two, a new approach for estimating trend growth of advanced economies is proposed. The suggestion combines econometric methods that have been used to test and estimate the implications of the extended Solow growth model in a cross sectional time series setting with an application of multivariate time series filter techniques. The last chapter discusses several panel unit root tests designed to accommodate cross-sectional dependence. These methods are then applied to an OECD country sample of the aggregate labor supply measure "hours worked".
RNA-Interferenz (RNAi) erlangte eine herausragende Bedeutung zum Studium der Genfunktion, nachdem auch in Säugersystemen gezeigt wurde, daß durch Applikation von 21 nt langen siRNAs (small interfering RNAs) eine Sequenz-spezifische Degradierung der mRNA-Transkripte kognitiver Gene erreicht werden konnte. Im Gegensatz zur antisense-Technologie erwies sich die Wirkung von siRNA im Hinblick auf die Hemmung der Genexpression um ein Vielfaches potenter und hoch spezifisch. Für eine längerfristige Unterdrückung von Genen kristallisierte sich die Methode der Plasmid-Vektor-vermittelten intrazellulären Expression von shRNA (short hairpin RNA) heraus, welche transient oder stabil angewendet werden kann. Diese exprimierte shRNA wird intrazellulär enzymatisch zu wirksamer siRNA prozessiert, welche den eigentlichen Enzym-vermittelten RNAi-Mechanismus der Degradierung von mRNA-Transkripten kognitiver Gene auslöst. Die Anwendung von RNA-Polymerase III-abhängigen Promotoren für die stabile konstitutive Expression von shRNA stellte ein großes Problem für behandelte Zellen dar, wenn es sich bei dem zu unterdrückenden Zielgen um ein Gen mit essentiellen Funktionen für die Zelle handelte. Im Falle der Polo-like Kinase 1 (Plk1), einer in vielen Spezies hoch konservierten Serin/Threonin-Kinase mit essentiellen mitotischen Funktionen, bedeutete eine dauerhafte und stringente Unterdrückung einen veränderten Phänotyp beteiligter Zellen, welcher sich durch Defekte bei mitotischen Ereignissen bemerkbar machte. Plk1 ist in zahlreiche mitotische Prozesse, wie den Eintritt der Zellen in die Mitose, die Segregation der Chromosomen und die Aktivierung des APC/C (anaphase promoting complex / cyclosome), eingebunden. Darüber hinaus ist bekannt, daß Plk1 in nahezu allen Tumorarten überexprimiert vorliegt und die Prognose von Tumorwachstum und Metastasierungspotential über den Plk1-Gehalt definiert werden kann. Des weiteren bewirkte eine RNAi-vermittelte Unterdrückung der Plk1-Expression bei Tumorzellen eine Hemmung der Zellproliferation mit Auslösung der Apoptose. Hingegen konnte bei gesunden primären Zellen weder eine signifikante Hemmung der Proliferation noch die Auslösung der Apoptose beobachtet werden, was die große Bedeutung von Plk1 als Ansatzpunkt für eine Krebstherapie hervorhebt. Um die Funktion von Plk1 im Hinblick auf molekularbiologische Zusammenhänge besser studieren zu können, war es notwendig, den intrazellulären Plk1-Gehalt zu variieren. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurden dazu induzierbare RNAi-Elemente entwickelt, mit deren Hilfe die intrazelluläre Plk1-Expression konditionell inhibiert werden konnte. Unter Verwendung des prokaryotischen Tet-Systems wurden auf Basis des RNA-Polymerase abhängigen H1-Promotors durch Insertion von einer oder zwei Operatorsequenzen (TetO) für den Tetrazyklin-Repressor (TetR) an verschiedene Orte innerhalb der Sequenz des H1-Promotors drei induzierbare Promotor-Derivate geschaffen. Die drei entwickelten H1-Promotor-Derivate wurden zur Expression von shRNA gegen Plk1 eingesetzt und in bezug auf die Auslösung der RNAi-Antwort getestet und untereinander verglichen. Zu diesem Zwecke wurde der endogene Plk1-Gehalt von HeLa-Tumorzellen auf Transkript- und auf Proteinebene bestimmt. Die Zellen wurden zuvor mit Plasmid-Vektoren für konstitutive TetR-Expression und jeweils einer der verschiedenen shRNA-Expressions-Kassetten ko-transfiziert. Als Kontrollen dienten dabei Wildtyp-H1-Promotoren, welche zur konstitutiven Expression von shRNA gegen Plk1 und einer unwirksamen Kontroll-shRNA eingesetzt wurden. Mit Hilfe des synthetischen Tetrazyklin-Analogons Doxyzyklin, welches einen potenten Aktivator für TetR darstellt, konnten die hergestellten Promotor-Derivate induziert werden, was durch einen reduzierten intrazellulären Plk1-Gehalt sichtbar wurde. Dabei fiel auf, daß alle drei Promotor-Typen unterschiedliche Eigenschaften im nichtinduzierten Zustand wie auch im induzierten Zustand unter Anwesenheit von Doxyzyklin aufwiesen. Für die Basalaktivität in Abwesenheit von Doxyzyklin (leakiness) war die relative Lage der TetO-Sequenz(en) innerhalb des Promotors verantwortlich. So veränderte die Insertion einer TetO-Sequenz in 3’-Richtung der TATA-Box die Eigenschaften des Wildtyp-H1-Promotors weniger als die Insertion einer TetO-Sequenz in 5’-Richtung der TATA-Box. Zum Studium von Plk1 als Zielgen in der Krebstherapie wurde das Proliferationsverhalten von HeLa-Tumorzellen als Antwort auf die Doxyzyklin-vermittelte Induktion der shRNAExpression unter Kontrolle eines der induzierbaren Promotoren ermittelt. Dabei konnte die Proliferation von Tumorzellen durch einen reduzierten Plk1-Gehalt, welcher durch die Doxyzyklin-induzierte Auslösung der RNAi-Antwort vermittelt wurde, erfolgreich inhibiert werden. Zur Überprüfung der Eignung entwickelter Systeme, Tumorwachstum in vivo inhibieren zu können, wurden die entwickelten RNAi-Kassetten in das Genom von TetRexprimierenden HeLa-Zellen integriert und so stabile Klone geschaffen. Stabile HeLa-Klone zur induzierbaren Expression von Plk1-spezifischer shRNA, wie auch zur induzierbaren Expression von einer Kontroll-shRNA, wurden in die gegenüberliegenden Flanken von immunsupprimierten Nacktmäusen inokuliert, um anhand von Xenograft-Modellen einen direkten Vergleich des Tumorwachstums unter gleichen äußeren Bedingungen zu ermöglichen. Einem Teil der Mäuse wurde Doxyzyklin ins Trinkwasser gegeben, während Kontrollmäuse kein Doxyzyklin verabreicht bekamen. Das Tumorwachstum von Xenograft-Tumoren, welche aus Klonen zur Expression von shRNA gegen Plk1 hervorgingen, konnte in Doxyzyklin-behandelten Mäusen um 53% auf 47% an Tag 51 nach Inokulierung der Zellen inhibiert werden. Tumoren nicht-induzierter Mäuse, sowie Tumoren aus induzierten Mäusen, welche Kontroll-shRNA exprimierten, wuchsen dagegen unverändert in gleichem Maße. Anhand der in dieser Arbeit entwickelten induzierbaren H1-Promotor-Derivate zur konditionellen Auslösung von RNAi wurden wertvolle genetische Werkzeuge geschaffen, welche für das Studium der Genfunktion eingesetzt werden können. Im Falle der Unterdrückung von Plk1 können mit ihrer Hilfe sowohl grundlegende molekularbiologische Zusammenhänge studiert als auch die Bewertung von Plk1 als Zielgen in der Krebstherapie bewertet werden. Im Gegensatz zu kürzlich entwickelten Kinase-Inhibitoren, welche auf Proteinebene gegen Plk1 gerichtet sind und aufgrund ihrer bislang nicht nachgewiesenen Spezifität verwandte Kinasen in ihrer Wirkungsweise beeinflussen könnten, ist eine RNAibasierte Strategie hoch spezifisch und verspricht eine große Relevanz für zukünftige therapeutische Ansätze. Vorraussetzung für erfolgversprechende RNAi-basierte Strategien ist eine hohe Konservierung der Sequenz beteiligter Zielgene. Im Falle von Plk1 konnte eine hohe Konservierung durch Sequenzanalyse der Plk1-Gene von 15 Mamma-Karzinomen, 11 Ovarial-Karzinomen und mehrerer Tumorzellinien bestätigt werden.
Die Prognose für Patienten mit hepatisch metastasierten kolorektalen Karzinomen ist weiterhin sehr heterogen und hängt von Anzahl, Größe und Lokalisation der Metastasen ab. Neben potentiell kurativer Metastasenchirurgie und palliativer Chemotherapie stehen zunehmend lokal ablative Verfahren (LITT/Kryotherapie/RFA) zur Verfügung. Die LITT arbeitet nach dem Prinzip einer hitzebasierten Tumorkoagulation, wobei Laserappliaktoren innerhalb gekühlter Hüllkatheter in bzw. nahe der zu abladierenden Läsion platziert werden und unter Abgabe von Licht im NIR-Bereich eine Gewebeerwärmung induzieren. Die Prozesskontrolle wird durch schnelle T1 gewichtete Gradientenechosequenzen im MRT gewährleistet. Die in vitro und ex vivo Experimente dieser Arbeit konnten den linearen Zusammenhang zwischen Temperatur und MR-Signalintensität in verschiedenen Modellen sowie an unterschiedlichen Geräten demonstrieren. Die zwischen November 1999 und Februar 2001 abladierten 580 Läsionen wurden in 10 verschiedenen Gruppen, abhängig von den resultierenden Nekrosevolumina, eingeteilt. Anschließend wurden die zugehörigen mittleren, minimalen und maximalen Energiemengen sowie die Standardabweichungen ermittelt. Es konnte gezeigt werden, dass keine prädiktiv verwertbare Aussage über die Läsions- beziehungsweise die Nekrosegröße sowie die notwendige Laserenergie erhältlich ist. Die mediane Überlebenszeit im untersuchten Kollektiv betrug 22 Monate, die mittlere Überlebenszeit betrug 29,4 Monate. Mit p<0,05 im Log-Rank-Test ergab sich ein signifikanter Überlebensvorteil für: 1. Patienten, die trotz chirurgisch bestätigter Operabilität die Operation ablehnen 2. Patienten mit maximalen Tumordiametern von bis zu 1 cm Durchmesser Die Lokalrezidivrate im untersuchten Kollektiv betrug 0 %. Auf Grund der bei unterschiedlichen Lokalrezidivraten bei teilweise vergleichbaren Überlebensraten sollten lokal ablative Therapieverfahren einem weitergehenden, studienbasierten Vergleich unterzogen werden.
Die zunehmende Resistenzentwicklung bei der Therapie gegen Herpes Simplex Viren vom Typ-1, besonders bei immundefizienten Patienten, erfordert die Entwicklung von Therapie-Alternativen. In Anlehnung an die Erkenntnisse der Traditionellen Chinesischen Medizin, die sich die Wirksamkeit von Heilpflanzen zu Nutze macht, wurde in dieser Arbeit das antivirale Potential von Extrakten aus Rheum Spezies gegen HSV-1 untersucht. Rheum oder Rhabarber gehört zur Familie der Polygonaceae. Die hier verwendeten Extrakte stammen aus den Wurzeln und Rhizomen von Rheum palmatum L. und Rheum rhaponticum, welche ursprünglich aus Asien stammende Heilpflanzen sind. Rheum ist reich an polyphenolen Inhaltsstoffen der Gruppe der Flavonoide und Tannine, welche Gegenstand der Forschung sind und denen schon vielfache pharmakologische Wirkungen zugesprochen wurden. Die antivirale Wirksamkeit von Rheum wurde bislang nur in der chinesischen Literatur veröffentlicht, wo bestimmte Untersuchungen mit HBV und HSV vorgenommen wurden. Hier wurde in einem Zellkulturmodell mit Vero-Zellen eine antivirale Testung vorgenommen. Die Auswirkungen der Rheum Extrakte auf den durch HSV-1 verursachten zytopathischen Effekt wurden untersucht. Eine Verminderung oder das Fehlen des CPE wurde als antivirale Wirksamkeit gewertet. In zwei Versuchsreihen, einmal mit simultaner Beimpfung der Vero-Zellen mit Virus in einer MOI von 0,01 und Extrakten in Konzentrationen von 500µg/ml bis 4µg/ml und dann mit viraler Vorinkubation von 1, 6 und 24 Stunden wurde das Verhalten der Zellen beobachtet. Unter dem Auflichtmikroskop wurde das Ausmaß des CPE beurteilt und anschließend mit Hilfe des Computerprogramms CalcuSyn die IC50 Werte berechnet. Der Wert der 50% inhibitorischen Konzentration sagt aus, bei welcher Extraktkonzentration 50% der Zellen einen CPE aufweisen und ist somit Maß für die antivirale Wirksamkeit. Weiterhin wurden die Rheum Extrakte mittels MTT-Assay auf ihre Zytotoxizität hin untersucht und der TC50 Wert als Maß der Toxizität berechnet. Der aus IC50 und TC50 berechnete Therapeutische Index setzt Wirksamkeit und Toxizität in Relation und ist ein Wert für die mögliche Validität einer Substanz. Je höher dieser Wert, desto viel versprechender die Substanz. Besonders Extrakte 9, 10 und 17 bedürfen der genaueren Betrachtung, da sie in der vorliegenden Untersuchung Therapeutische Indexe von >12, >9,8 und >17,9 gezeigt haben. Dies deutet auf ein antivirales Potential, bei keiner nachweisbaren Zytotoxizität in verwendeten Konzentrationen, hin. Im Vergleich zeigte Aciclovir einen TI von 22. Mit diesen drei Substanzen wurde der Versuch dann mit viraler Vorinkubation von 1, 6 und 24 Stunden wiederholt. Vor Allem Extrakt Nr. 17 zeigte auch bei Vorinkubation von einer und sechs Stunden mit einem IC50 von 80µg/ml und 95,5 µg/ml eine signifikante Reduktion des CPE. Dies gibt einen Hinweis auf die mögliche Art des Wirkmechanismus, denn Zeichen der Wirksamkeit trotz Vorinkubation sprichen für eine Intervention im späteren Stadium des viralen Replikationszyklus. Problematisch ist die Übertragung der hier ermittelten in vitro Ergebnisse auf in vivo Verhältnisse. Allerdings sind die Ergebnisse vielversprechend und eine weiterführende Untersuchung erscheint lohnenswert. Hier ist vor Allem die genaue Charakterisierung und Isolierung der Inhaltsstoffe der wirksamen Extrakte notwendig. Nachfolgend könnte die Wirksamkeit der ermittelten Polyphenole in einem Tierversuch verifiziert werden.
In Hugo von Hofmannsthals ‚Bewegungs-Texten’ wird das Schweigen zu einem beredten Gestus von (bewegten) Körpern und Bildern. Schweigen nicht als Leerstelle, als Negativ des Sprechens, sondern als sein Urgrund generiert Bedeutungen und dringt durch die Weise, wie es jene vermittelt, auf eine Modifikation der Wahrnehmung. Bewegung wird dabei gleichermaßen zum Konzept der Darstellungsabsicht, die eine Transgression des Textuellen anstrebt, wie zur Metapher der Umstrukturierung von Wahrnehmung und Erfahrung des Menschen in der Moderne. Um die ‚stummen’ Künste wie Pantomime, Tanz und Film in den (Be)Griff zu bekommen, stellt Hofmannsthal - ausgehend von der eigenen Beobachter-Erfahrung - den Zuschauer des Schauspiels in den Mittelpunkt seiner Texte. Stets ist in den Szenarien der medienreflexive Blick des Autors auf Bühne, Leinwand und Zuschauer präsent und wird dabei begleitet von Überlegungen zur spezifischen Medialität von Sprache, Musik und Bild. So bedenken beispielsweise auch zahlreiche Texte Hofmannsthals aus der Sammlung der Erfundenen Gespräche und Briefe, die den Zusammenhang von Wahrnehmung, Körper und Sprache thematisieren, den (beweglichen) Standpunkt des Beobachters als eigentlichen Prüfstein des Medialen. Auf diese Weise wird nicht nur erkennbar, wie Medien je unterschiedlich die Wahrnehmungsweisen des Menschen formen, sondern auch wie sie Selbst- und Weltverhältnisse herstellen, indem sie versuchen Absenz in Präsenz zu überführen. Dementsprechend weit gefasst ist Hofmannsthals Medienbegriff. Ihr grundsätzlich symbolischer Charakter verbindet die einzelnen Medien miteinander. Das Interesse des Dichters, der erkennt, dass er niemals „aus seinem Beruf, Worte zu machen, herausgehen“ können wird, konzentriert sich auf die Interdependenzen und die Austauschverhältnisse verschiedener symbolischer Formen, die nichtsdestotrotz nach je eigenen Gesetzmäßigkeiten funktionieren und diesen auch gerecht werden müssen, um ‚das Leben transponieren’ zu können. In den Szenarien für Pantomime, Tanz und Film spürt Hofmannsthal diesen Funktionsweisen nach. Er erkundet den Zusammenhang von Literatur, Musik und Tanz, entdeckt das Wissen des Körpers, dessen Erinnerungsfähigkeit derjenigen der klassischen Memorialtechnik der Schrift gegenübergestellt wird. Er thematisiert über den tanzenden Körper den Konnex von Mimesis und Identität, von Imagination und Wirklichkeit, Projektion und Abbild. Zudem wird der tanzende Körper als Inbegriff des Anderen, Fremden, (Weiblichen) vorgeführt und darüber sein fragwürdiger Status als ‚Natur’ problematisiert. Die vermeintlichen Antagonismen von Natur und Kultur, Leib und Seele, Sprache und Körper, Individuum und Gesellschaft sowie Freiheit und Determiniertheit geraten in Vermittlung und können dergestalt begreiflich machen, wie komplex verschiedene mediale Verfahren der Verkörperung, Einschreibung und Verbildlichung strukturiert und miteinander verzahnt sind. So können mystische Visionen auf der Bühne als filmische Bilderflucht inszeniert, die Schaulust im Kino zum Wahrnehmungsdispositiv einer Pantomime oder der Akt des Schreibens im Film mit dessen Performativiät und der Prozessualität der filmischen Bilderfolge in Beziehung gesetzt werden.
Ibuprofen gehört zu den am meisten verwendeten nichtsteroidalen Antiphlogistika (NSAIDs) und ist in niedriger Dosierung von 200-400 mg als sogenanntes OTC (over the counter) Analgetikum frei erhältlich. Obwohl es in den meisten Fällen als razemische Mischung aus S- und R-Ibuprofen verabreicht wird, ist mittlerweile auch das reine S-Ibuprofen (Dexibuprofen) als Medikament erhältlich. Während S-Ibuprofen ein potenter COX-Inhibitor ist, zeigt R-Ibuprofen in den klinisch relevanten Konzentrationen keine COX-Hemmung. Seit längerem ist bekannt, dass NSAIDs bei einer kontinuierlichen Einnahme über mehrere Jahre die Initiierung und Proliferation von Tumoren hemmen. Die Hemmung der Cyclooxygenase wird dabei als ein wichtiger Mechanismus für die antikarzinogene Wirkung angesehen, doch für viele NSAIDs sind auch schon COX unabhängige Mechanismen beschrieben worden. In der vorliegenden Arbeit wurde unter Verwendung zweier Tumorzelllinien mit unterschiedlicher COX-2 Expression und dem Einsatz von beiden Ibuprofen Enantiomeren untersucht, inwieweit COX unabhängige Mechanismen für die antikarzinogenen Effekte von S- und R-Ibuprofen verantwortlich sind. Sowohl die COX-2 defizienten HCT-15 als auch die COX-2 exprimierenden HCA-7 Zellen wurden durch Behandlung mit S- oder R-Ibuprofen in ihrer Proliferaton gehemmt. Dabei führte die Behandlung mit S- und R-Ibuprofen für 24 h zu einem G1-Zellzyklusblock und nach 72 h zu einem signifikanten Anstieg von apoptotischen Zellen, was im Western-Blot Assay durch eine verminderte Cyclin A und B Expression, einer erhöhten Expression des Zellzyklusinhibitors p27KIP1 und PARP-Spaltung bestätigt wurde. Dabei zeigten beide Enantiomere in den Tumorzellen eine gleich starke antiproliferative und apoptotische Wirkung. Eine Messung der intrazellulären S- und R-Ibuprofen Konzentrationen ergab außerdem, dass in den verwendeten Tumorzellen keine unidirektionale Konfigurationsinversion von R- zu S-Ibuprofen stattgefunden hat. In den COX-2 exprimierenden HCA-7 Zellen waren die antikarzinogenen Effekte von S- und R-Ibuprofen schwächer ausgeprägt als in den HCT-15 Zellen, was jedoch auf eine niedrigere intrazelluläre S- bzw. R-Ibuprofen Konzentration zurückzuführen war. Diese Ergebnisse zeigen auf jeden Fall, dass COX unabhängige Mechanismen bei der antikarzinogenen Wirkung von S- und R- Ibuprofen eine Rolle spielen. Dass auch COX abhängige Mechanismen an der antikarzinogenen Wirkung von Ibuprofen beteiligt sind, konnte in verschiedenen Studien gezeigt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Abnahme an PGE2 nach S-Ibuprofen Behandlung in den COX-2 exprimierenden Tumorzellen beobachtet. In welchem Ausmaß aber die COX Hemmung an der antikarzinogenen Wirkung von S-Ibuprofen in den COX-2 exprimierenden (Hemmung der PGE2 Synthese) und möglicherweise auch in den COX-2 defizienten Zellen (Anstieg an Arachidonsäure und daraus resultierend an Ceramid) beteiligt war, konnte anhand der Ergebnisse nicht geklärt werden. Es kann jedoch angenommen werden, dass S-Ibuprofen zumindest in den COX exprimierenden HCA-7 Zellen sowohl über COX Hemmung als auch über COX unabhängige Mechanismen antiproliferativ und apoptotisch wirkt. Auch im Tumormodell der Maus wurde bei einer täglichen i.p. Applikation von 15 mg/kg S- oder R-Ibuprofen eine Hemmung des Tumorwachstums beobachtet. Dabei betrug die unidirektionale Inversion von R- zu S-Ibuprofen ca. 54 %. Die Inkubation mit S- bzw. R-Ibuprofen führte in beiden Zelllinien außerdem zu einer Akkumulation des Tumorsuppressors p53, der an der Regulierung von Zellzyklus und Apoptose beteiligt ist. Daher wurde im zweiten Teil der Arbeit untersucht, ob S- und R-Ibuprofen die Induktion von Apoptose und Zellzyklusarrest über die Aktivierung des Transkriptionsfaktors p53 und dessen Zielgene vermitteln. Verwendet wurde eine HCT-116 Zelllinien, in der beide p53 Allele durch homologe Rekombination inaktiviert waren (p53-/-). Im Gegensatz zu den HCT-116 p53wt Zellen führte die Behandlung mit S- bzw. R-Ibuprofen in den p53 defizienten Zellen zu keinem signifikanten G1-Zellzyklusblock und auch die Apoptoserate war in diesen Zellen deutlich geringer als in p53wt Zellen. In vivo zeigte eine tägliche i.p. Injektion von 15 mg/kg S- bzw. R-Ibuprofen bei den Mäusen mit p53-/- Tumoren keine signifikante Wachstumshemmung. Im Vergleich dazu wurde die Proliferation der HCT-116 p53wt Tumore durch die R-Ibuprofen Behandlung signifikant gehemmt, und auch die mit S-Ibuprofen behandelten Tieren zeigten deutlich kleinere Tumore als die Gruppe mit den p53 defizienten Tumoren. Nach der Inkubation mit S- bzw. R-Ibuprofen wurde in beiden HCT-116 Zelllinien eine erhöhte Expression des Membranrezeptors p75NTR beobachtet. Außerdem führte die Behandlung mit S- bzw. R-Ibuprofen in den p53wt Zellen, im Gegensatz zu den p53 defizienten Zellen, zu einer vermehrten Bax Expression und einem Anstieg an Bax Protein in der mitochondrialen Fraktion. Schließlich wurde gezeigt, dass die erhöhte p53 Konzentration in den Zellen zumindest teilweise über den p75NTR Rezeptor reguliert wird, da durch die externe Zugabe des Liganden NGF die Ibuprofen induzierte Akkumulation von p53 in den HCT-116 p53wt Zellen wieder aufgehoben wurde. Da in vitro in den HCA-7 Zellen nicht nur die Behandlung mit S-Ibuprofen, sondern auch die mit R-Ibuprofen zu einer Hemmung der PGE2 Synthese führte, wurde im dritten Teil der Arbeit die Wirkung von S- und R-Ibuprofen auf die Expression der PGE-Synthasen und auf die mPGES-1 Aktivität untersucht. Dabei wurden HeLa Zellen verwendet, deren mPGES-1 Expression durch die Zugabe von IL-1ß und TNF-alpha stimmuliert wurde. Nach gleichzeitiger Inkubation mit S- bzw. R-Ibuprofen wurde keine Inhibierung der mPGES-1, mPGES-2 oder cPGES Expression beobachtet. Auch die Enzymaktivität von mPGES-1 wurde weder durch die Inkubation mit S-Ibuprofen noch mit R-Ibuprofen beeinflußt. Die bei der Inkubation mit R-Ibuprofen auftretende Hemmung der PGE2 Synthese konnte in der vorliegenden Arbeit nicht abschließend erklärt werden und bietet somit einen interessanten Ansatzpunkt für weitere Untersuchungen.
Autoimmune Endokrinopathien entstehen durch die Aktivierung pathogener TLymphozyten, welche in de Lage sind, bestimmte Ziel-Zellen mittels Zytokinen oder anderer Mechanismen zu zerstören. Typ I Diabetes mellitus ist ein durch Insulinmangel bedingter Defekt der Glukoseverwertung, der durch eine autoimmune Zerstörung der pankreatischen Beta-Zellen verursacht wird. Als häufigste chronische Erkrankung Jugendlicher und junger Erwachsener in den Industrienationen stellt sie durch ihre stetig steigende Inzidenz, ihr immer früheres Erkrankungsalter und nicht zuletzt die steigende allgemeine Lebenserwartung eine bedeutende medizinische und ökonomische Herausforderung dar. Die zunehmende Aufklärung der mannigfaltigen Wechselbeziehungen des Immunsystems und der starke Einfluss des Vitamin D auf die Entwicklung und Funktion des Immunsystems führten zu der Überlegung, dass auch der Vitamin D Rezeptor (VDR) in Verbindung mit seinem biologisch aktivsten Liganden 1,25 (OH)2D3 einen Einfluss auf die Entwicklung einer Autoimmunendokrinopathie haben könnte. In Tierexperimenten konnte gezeigt werden, dass 1,25 (OH)2D3 und auch seine Analoga die Produktion des Interleukins IL-12 hemmen, welches eine wichtige Rolle in der Entwicklung der Th1-Helferzellen ausübt, gleichzeitig wird die Produktion des Interleukins IL-10 stimuliert, welches die Entwicklung von Th1-Helferzellen blockiert. Dieser Zelltyp ist bei der Entwicklung eines Typ 1 Diabetes mellitus ursächlich beteiligt. 1,25 (OH)2D3 kann auch die Entwicklung der Th2 Helferzellen inhibieren, welche in der Pathogenese einer Hashimoto Thyreoiditis involviert sind. In betroffenen Geweben, in denen pathogen-wirksame Th1-Zellen die Bildung zytotoxischer T-Zellen und aktivierter Makrophagen bewirken, kann 1,25 (OH)2D3 und seine Analoga die Anzahl der Th1-Zellen herunterregeln. Des weiteren regt Vitamin D die Bildung von CD4+CD25+-regulatorischen T-Zellen und Th2-Zellen an, die ihrerseits wiederum hemmend auf Th1-Zellen wirken. Bisher haben bereits diverse Studien bestätigt, das funktionelle Auswirkungen verschiedener Einzelnukleotid-Polymorphismen in kodierenden und nicht kodierenden Regionen des VDR- Gens in kausalem Zusammenhang mit dem Auftreten eines Typ 1 Diabetes Mellitus stehen. In dieser Arbeit zeigten sich erniedrigte 1,25 (OH)2D3 Spiegel in deutschen Patienten mit Typ 1 Diabetes Mellitus. Eine vergleichbare Studie wurde in der finnischen Bevölkerung durchgeführt und bestätigt unsere Resultate. Dies spiegelt die zentrale Rolle des Vitamin D bei der Entwicklung eines Typ 1 Diabetes Mellitus wieder. Um den kausalen Zusammenhang zwischen molekularen und funktionellen Beziehungen des Vitamin D Rezeptors näher zu definieren, liegt die Frage nahe, inwiefern eine Korrelation der schon bekannten VDR- Polymorphismen und neu etablierten mit Vitamin D Spiegeln in Patienten und Kontrollen besteht, weiterhin, ob auf der Ebene der Genexpression schon ein signifikanter Unterschied bei Patienten mit Typ 1 Diabetes Mellitus zu beschreiben ist. Zusätzlich wurden sieben neue VDR- Polymorphismen in Familien, mit jeweils einem an Typ 1 Diabetes Mellitus erkrankten Kind, untersucht. Bestimmte Transmissionsmuster wurden bereits für die VDR- Polymorphismen ApaI, BsmI, FokI und TaqI bei Typ 1 Diabetes Mellitus beschrieben und eine signifikante Korrelation hergestellt. In dieser Doktorarbeit zeichnet sich eine grenzwertig signifikante Korrelation zwischen dem VDR- Polymorphismus 2238135 und Typ 1 Diabetes Mellitus ab. Das Allel „C“ wurde häufiger auf die erkrankten Kinder transmittiert. Dieses Ergebnis ließ sich ebenfalls in der Gegenüberstellung von Patienten zu Kontrollen nachweisen, in der Allelfrequenzanalyse stellte sich das Allel „C“ ebenfalls als dominant heraus. Für die anderen sechs untersuchten VDR- Polymorphismen konnte keine signifikante Korrelation zu Typ 1 Diabetes Mellitus in der deutschen Population nachgewiesen werden. Jedoch konnten bei vier der sieben VDR- Polymorphismen signifikante Haplotypen beschrieben werden, die den Zusammenhang zu Typ 1 Diabetes Mellitus erneut bestätigen. Dies zeigt, wie die alleinige Analyse eines VDR- Polymorphismus scheinbar keine Assoziation zum Typ 1 Diabetes Mellitus zu haben scheint, aber durch die Bildung von Allelkombinationen sich signifikante Korrelationen für die gleichen Polymorphismen ausbilden können. Die gemeinsame Analyse verleiht den untersuchten VDR-Polymorphismen erst die Signifikanz. Das Gleichgewicht war jedoch deutlich zugunsten der signifikant seltener transmittierten und damit protektiven Haplotypen verschoben. Nur „GCTG“ wurde häufiger transmittiert (62,7% vs. 37,3%, p= 0,0087), während die folgenden 3 Haplotypen „TCTG“, „TCGG“ und „GCGG“ seltener transmittiert wurden und sich als signifikant herausstellten. „TCGG“ stellte sich als grenzwertig signifikanter Haplotyp heraus, während „GCGG“ als signifikante Allelkombination anzusehen ist. Am stärksten jedoch zeigte sich der diabetogen- protekive Effekt beim Screening des „TCTG“ Haplotypen, der fast gar nicht an die erkrankten Nachkommen transmittiert wurde (99,1% vs. 0,9%, p= 0,0006). In der vorliegenden Doktorarbeit bestätigt sich einerseits die molekulare Korrelation zwischen bestimmten Polymorphismen des VDR- Gens und dem Auftreten eines Typ 1 Diabetes Mellitus. Andererseits konnten vier neue Haplotypen bestimmt werden, die im Rahmen des durchgeführten Screenings in der deutschen Bevölkerung das Risiko für die Entstehung eines Diabetes als schützende oder prädisponierende Faktoren mitbestimmen. 1,25(OH)2D3, der stärkste immunregulatorische Vitamin D Metabolit, stellt für die medikamentöse Prävention und Therapie der autoimmunen Erkrankungen auch weiterhin ein interessantes Ziel dar, unter Umständen auch über die Beeinflussung seiner Stoffwechselwege, deren molekulare Korrelation hier weiterführend geklärt wurde.
In der vorliegenden Arbeit sollte das basolaterale Targeting des Transmembranproteins shrew-1 in polarisierten Epithelzellen analysiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die cytoplasmatische Domäne von shrew-1 mehrere spezifische basolaterale Sortingmotive enthält. Die Funktionalität dieser Motive wurde anhand Mutationsanalysen von Schlüsselaminosäuren untersucht. Substitution dieser Aminosäuren führt zu einer apikalen Lokalisation von shrew-1 in polarisierten MDCK Zellen. Durch Analyse der Proteinverteilung von shrew-1 Varianten in polarisierten LLC-PK1 Zellen wurde deutlich, dass das Sorting von shrew-1 in die basolaterale Plasmamembran ein AP-1B-abhängiger Prozess ist. Außerdem konnte mittels Coimmunopräzipitation eine Interaktion zwischen shrew-1 und der Untereinheit my1B aus dem Adapterproteinkomplex AP-1B nachgewiesen werden. Untersuchungen des Targetings von shrew-1 Varianten in polarisierten MDCK und LLCPK1 Zellen mit Hilfe der Transzytoseexperimente zeigten, dass die apikal lokalisierte Mutante shrew-1-NTD5 auf dem Weg zur apikalen Membranregion, trotz fehlender Sortinginformation, die basolaterale Plasmamembran durchquert. Durch Inhibition der Membranfusion mittels Tanninsäure konnte zusätzlich gezeigt werden, dass die Passage der basolateralen Plasmamembran für das Targeting von sowohl shrew-1 als auch von shrew-1-NTD5 essentiell ist. Die Beobachtungen des Turnovers von shrew-1 in der Plasmamembran von lebenden Zellen zeigten, dass shrew-1 aktiv endozytiert wird und dass nachfolgend ein Recycling des Proteins zur Plasmamembran stattfindet. Anhand der durchgeführten Untersuchungen lässt sich zusammenfassend ein Targetingmodell für shrew-1 in polarisierten Epithelzellen aufstellen, das ein postendozytotisches Sorting beschreibt: Dabei wird shrew-1 zunächst in Post-Golgi-Carriern auf unbekanntem Weg zur basolateralen Plasmamembran gebracht, wo seine unmittelbare Internalisierung und ein Weitertransport zum Recyclingendosom stattfinden. Der im Recyclingendosom lokalisierte und am Sorting beteiligte Adapterproteinkomplex AP-1B vermittelt dann den Rücktransport von shrew-1 zur basolateralen Plasmamembran.
The thesis is devoted to the study of the Antarctic polar vortex, mainly by analyzing data collected during APE-GAIA (1999) and ASHOE (1994) campaigns and recorded by the ADEOS satellite (1996-1997), and to improvement of the chromato-graphic processing schemes. A general introduction and overview of the campaigns and instruments relevant to the present work are given in Chapters 1 and 2. A relatively large part of the thesis (Chapters 3-5) is on improvement of the analysis of raw chromatographic data recorded during in-flight measurements of the trace gases. A Gaussian non-straight-base-line method, i.e. the Gaussian processing scheme (Chapter 3), is developed for better evaluation of the chromatographic peak size. Furthermore, a statistical cross-correlation method (Chapter 5) based on statistical behaviour of the whole chromatogram series fNchrg recorded, e.g., during a research flight or laboratory calibration, is developed and applied to measure the low-concentration trace gases. As demonstrated for HAGAR's chromatograms (HAGAR - High Altitude Gas Analyzer), the combination of the Gaussian fitting scheme for individual chromatograms and the statistical cross-correlation method for a series of subsequent chromatograms considerably improves and stabilizes quantitative analysis of in-flight chromatographic data. In this case, the detection accuracy of weak and noisy chromatographic signals can be improved by up to 40 %. A particular attention is paid to the in-flight two-standard calibration method. For this method, a special procedure, that allows to evaluate and effectively remove a weak background chromatographic signal associated with residual molecules in the carrier gas N2, is proposed and coded (Chapter 4). The developed approaches and methods are completely automized and, therefore, can be used for processing of in-flight chromatograms of recent and future field campaigns. The main part of the thesis (Chapters 6-8) deals with a two-dimensional quasi-Lagrangian coordinate system ... , based on a long-lived stratospheric trace gas i, and its systematic use for i = N2O in order to describe the structure of a well-developed Antarctic polar vortex, linearization and compactization of the tracer-tracer correlations in the polar vortex core (i.e. the stratospheric dynamics in this area), and the differential ozone losses in the Antarctic polar vortex area. In the coordinate system ... (...-method, Chapter 6), which refers to a well-developed polar vortex, the mixing ratio Âi is the vertical coordinate and ... = .... i is the reference profile in the vortex core) is the meridional coordinate. The quasi-Lagrangian coordinates ... are much more long-lived comparing with the standard quasi-isentropic coordinates, potential temperature ... and equivalent latitude ..e, do not require explicit reference to geographic space, and therefore well-suited for studying the dynamics of the Antarctic polar vortex and the relevant ozone loss processes. By using the introduced coordinate system ... to analyze the well-developed Antarctic vortex investigated in the APE-GAIA campaign, it is shown, in concurrence with the conclusion of A. M. Lee et al. (2001), that the Antarctic vortex area can be described in terms of the well-mixed and well-isolated vortex core, relatively wide vortex boundary region and adjoining surf zone. In this case, the reference profile ... i , which is compact in a well-developed and isolated polar vortex core [J. B. Greenblatt et al. (2002)], can be found by combining airborne (and/or balloon) data with high-altitude satellite measurements. A criterion, which uses the local in-situ measurements of Âi = Âi(£) and attributes the inner vortex edge to a rapid change (±-step) in the meridional pro¯le of the mixing ratio..., is developed in Chapter 6 to determine the (Antarctic) inner vortex edge. In turn, the outer vortex edge of a well-developed Antarctic vortex is proposed to attribute to the position of a local maximum of ...H2O in the polar vortex area. For a well-developed Antarctic vortex, the ...-parametrization of tracer-tracer correlations allows to distinguish the tracer-tracer inter-relationships in the vortex core, vortex boundary region and surf zone (Chapter 7). This is clearly illustrated by analyzing the tracer-tracer relationships Âi ¡ ÂN2O obtained from the in-situ data of the APE-GAIA campaign for i = CFCl3 (CFC-11), CF2Cl2 (CFC-12), CBrClF2 (H-1211) and SF6. The solitary anomalous points in the ...CFC11 ¡ ÂN2O correlation, observed in the Antarctic vortex core during the APE-GAIA and ASHOE campaigns, are interpreted in terms of small-scale localized differential descent. As detailed in Chapter 8, the quasi-Lagrangian coordinate system fÂN2O; ¢ÂN2Og is an effective tool for evaluation of the differential ozone losses in the polar vortex area. With this purpose, a two-parametric reference function ...O3 = F(...), which characterizes the unperturbed O3 distribution in the early winter polar vortex area, is introduced to separate and quantify in terms of the meridional coordinate ...2O the differential ozone losses in the vortex core and vortex boundary region. The method is applied to analyze the ozone depletion in the Antarctic stratosphere during the austral spring 1999 (APE-GAIA campaign). In Chapter 9, the main results of the thesis are summarized.
Physical soil properties feature high spatial variabilities which are known to affect geophysical measurements. However, these variations are not considered in most cases. The challenging task is to quantify the influence of soil heterogeneities on geophysical data. This question is analysed for DC resistivity and GPR measurements which are frequently used for near-surface explorations. To determine the pattern of electric soil properties in situ with the required high spatial resolution, geophysical measuring techniques are methodically enhanced. High-resolution dipole-dipole resistivity measurements are used to determine the electric conductivity distribution of the topsoil. Due to the small electrode separations, the actual electrode geometry has to be considered and an analytic expression for geometric factors is derived instead of assuming point electrodes. Two methods are used to determine soil permittivity with GPR:(i) the coefficient of reflection at the interface air-soil is measured with an air-launched horn antenna, (ii) the velocity of the groundwave is measured with a new setup using two receiver antennas enhancing the lateral resolution from in the best case 0.5 m for standard techniques to approximately 0.1 m with the new technique. With the optimised measuring techniques, the electric properties of sandy soils are determined in the field. Conductivity and permittivity show high spatial variability with correlation lengths of a few decimetres. Geostatistical simulation techniques are used to generate synthetic random media featuring the same statistical properties as in the field. FD calculations are carried out with this media to provide realistic synthetic data of resistivity and GPR measurements. Conductivity variations as determined in the field generate significant variations of simulated Schlumberger sounding curves resulting in uncertainties of the inverted models. Even in pedologically homogeneous sandy soil, moisture pattern and resulting permittivity variations cause strong GPR diffractions as demonstated by FD calculations. This influences the detectability of small objects such as e.g. landmines or of large reflectors as e.g. the groundwater table. Conductivity variations as typical for soils showed to have a minor effect on GPR measurements than variations of permittivity. In summary, geostatistical analysis and simulation provide a powerful tool to simulate geophysical measurements under field conditions including soil heterogeneity which can be used to quantify the uncertainty of field measurements by geologic noise.
Vor dem Hintergrund der gestiegenen medizinischen und sozioökonomischen Relevanz von Akupunktur und Laserakupunktur werden im Rahmen der vorliegenden Arbeit Anwendungsfelder und Forschungsperspektiven in der präventiven und rehabilitativen Sportmedizin skizziert. Hierzu zählen insbesondere die Therapie von Sportverletzungen und Sportschäden, die Steigerung der körperlichen Leistungsfähigkeit, die Unterstützung und Förderung der Regeneration sowie die Vorbeugung von belastungsinduziertem Asthma. Aufbauend auf den aktuellen Forschungsstand werden eigene Originalarbeiten vorgestellt, die sich mit der Evaluation spezifischer Effekte der Akupunktur und Laserakupunktur befassen.
Für pädiatrische Patienten mit Hochrisikoleukämien ist die Donor-Lymphozyten-Infusion eine etablierte Therapieform, um nach Stammzelltransplantation die Immunrekonstitution zu verbessern oder ein beginnendes Rezidiv abzuwehren. Als schwerwiegende Nebenwirkung kann jedoch eine „Graft-versus-host“-Krankeit (graft-versus-host disease; GVHD) auftreten, bei der die T-Zellen gesundes Gewebe angreifen. In ersten klinischen Studien mit veränderten, Suizidgen tragenden Donor-Lymphozyten konnte durch die rechtzeitige Gabe eines Suizidinduktors die GVHD unterbunden werden. Die genetische Manipulation der T-Zellen führte jedoch zu einem Funktionsverlust, der vermutlich auf die zur Transduktion notwendige Aktivierung zurückzuführen ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Aktivierungsprotokolle mit Beads-gekoppelten oder löslichen Antikörpern hinsichtlich der Expansionsrate und dem Einfluss auf die Funktionalität der T-Zellen näher untersucht. Dazu wurden primäre humane T-Zellen im klinischen oder im Labormaßstab immunomagnetisch über eine CD3 sowie CD4/CD8 Selektion oder mittels der RosetteSep-Prozedur auf > 96% angereichert und anschließend expandiert. Die Transduktion erfolgte an den Tagen 3 und 4 mit einem „GMP-grade“ CD34/HSV-TK Vektor. Zur Aktivierung wurden zum einen lösliche CD3/CD28 Antikörper und zum anderen zellgroße Kügelchen - sogenannte Beads – verwendet. Die Beads wurden mit CD3/CD28 Antikörper und fakultativ mit CD2 beladen. Die beladenen Beads imitieren in der Zellkultur eine Antigen präsentierende Zelle und sollten damit eine möglichst physiologische Situation schaffen. Außerdem wurden unterschiedliche IL-2 Konzentrationen zugesetzt (20-1000 U/ml), um einen potentiellen IL-2 Effekt auf die T-Zellen zu untersuchen. Die Aktivierung mit den löslichen Antikörpern führte zu einer IL-2 abhängigen Proliferation der T-Zellen über 14 Tage mit maximaler Expansionsrate (47fach) bei 1000 U/ml IL-2. Die Expansion mit Beads-gekoppelten Antikörpern war ebenfalls IL-2 abhängig, beschränkte sich jedoch auf die erste Woche und erreichte eine maximale Expansionsrate von 3-4. In der zweiten Woche fiel die Zellzahl ab. Zusammenfassend sind für eine starke Expansion der T-Zellen eine hohe IL-2 Konzentration, aber auch die löslichen Antikörper per se verantwortlich. Gleichzeitig konnte demonstriert werden, dass es große individuelle Unterschiede in der T-Zellexpansion verschiedener Spender gibt. Der Einfluss der Aktivierung auf die Veränderung der T-Zellsubpopulationen wurde mit Hilfe von multiparametrischen Analysen am Durchflusszytometer untersucht. Hohe IL-2 Konzentrationen (100 und 1000 U/ml) sowie die Verwendung löslicher Antikörper führten zu einer starken Zunahme der CD8+ T-Zellen. Der CD4/CD8 Quotient blieb lediglich unter Stimulierung mit den Beads-gekoppelten Antikörpern in Verbindung mit 20 U/ml IL-2 konstant. Mit allen Aktivierungsprotokollen ergab sich für den immunologischen Phänotyp eine Verschiebung vom naiven zum Gedächtniszelltyp. Die Proliferation CMV-spezifischer T-Zellen konnte mit allen Aktivierungsprotokollen erreicht werden und korrelierte mit der Expansionsrate der gesamten CD3+ T-Zellen. Die Zytokinausschüttung war verringert bei den T-Zellen, die mit den löslichen Antikörpern stimuliert wurden. Eine verminderte Zytokinproduktion könnte auf einen Verlust der Funktionalität der T-Zellen hindeuten. Von besonderer Bedeutung ist, dass die Stimulierung über Beads-gekoppelte Antikörper zu einer gleichmäßigen Transduktion von CD4+ und CD8+ T-Zellen führte. Im Gegensatz dazu hatte die Aktivierung mit löslichen Antikörpern zur Folge, dass hauptsächlich CD8+ T-Zellen transduziert wurden. Für eine kompetente Immunantwort im Rahmen einer DLI erscheint jedoch eine physiologische Zusammensetzung der CD4+ und CD8+ T-Zellen äußerst wichtig. Residuale Stammzellen könnten potentiell co-transduziert werden. Um diese Gefahr abschätzen zu können, wurden ficollisierte PBSC analog der T-Zellen expandiert. Unter allen T-Zellaktivierungsprotokollen blieben die CD34+ Stammzellen in den ersten Tagen der Kultur vital und durchflusszytometrisch nachweisbar. Die Stammzellen expandierten sogar geringfügig und waren damit potentiell transduzierbar - mit der Gefahr einer klonalen Entartung durch Insertionsmutagenese. Dies deutet auf die Wichtigkeit einer T-Zellselektion zur Manipulation von DLI hin, um residuale Stammzellen zu entfernen. Die Suizidstrategie ist eine vielversprechende Möglichkeit zur Kontrolle der GVHD im Rahmen einer DLI. Voraussetzung ist aber, dass die infundierten Zellen auch immunologisch kompetent bleiben und einen GvL-Effekt bewirken. Die Aktivierung mit Beads-gekoppelten Antikörpern scheint zum Erhalt der Immunkompetenz den löslichen Antikörpern überlegen zu sein.
Der menschliche Körper ist permanent mechanischen Reizen in Form von Dehnung oder Druck ausgesetzt. Diese Stimuli können vielfältige zelluläre Prozesse induzieren. Dehnungsreize erhöhen die Zellproliferation in allen bisher untersuchten Zellspezies, inklusive Endothel- und Epithelzellen. Im Gegensatz dazu scheinen mechanische Druckbelastungen zu zellulärer Differenzierung zu führen. Die Relevanz dieser mechanischen Reize für die Physiologie und Pathophysiologie ist für viele Organe nachgewiesen worden. Jedoch gibt es bislang keine hinreichenden Untersuchungen, die belegen, dass mechanische Reize ebenso eine Rolle bei der Tumorproliferation spielen könnten. Im Fokus dieser Promotionsarbeit steht die Fragestellung, inwieweit die mechanischen Verhältnisse in Tumoren in einem funktionellen Zusammenhang mit der Tumorgenese stehen. Zur Klärung dieser Fragestellung ist ein Xenograft-Tumormodell etabliert worden, das es erlaubt in vivo-Untersuchungen an humanen epithelialen Tumoren durchzuführen. Um Erfahrungen aus vorherigen in vitro-Versuchen nutzen zu können, wurden humane epitheliale A431-Vulvakarzinom- und humane epitheliale A549-Lungenkarzinomzellen für das Tumormodell verwendet. Mit diesem Modell konnte erstmals in vivo gezeigt werden, dass solide humane Tumore einer permanenten mechanischen Dehnung ausgesetzt sind, die direkten Einfluss auf die Proliferation der Tumorzellen hat. Als zentraler Auslöser für die mechanische Dehnung der Tumorzellen konnte der erhöhte tumorinterstitielle Flüssigkeitsdruck (TIFP) identifiziert werden. Der Einfluss der mechanischen Dehnung auf die Proliferation der Tumorzellen wurde anhand der Phosphorylierung der extracellular regulated kinase 1/2 (ERK1/2) bzw. der Ki-67 Expression gezeigt. Durch die Punktion bzw. Drainage von Tumoren konnte der TIFP experimentell abgesenkt werden und in Folge dessen kam es zu einer reduzierten mechanischen Dehnung der Tumorzellen. In allen Versuchen war die Abnahme der mechanischen Dehnung von einer verringerten Phosphorylierung der ERK1/2 bzw. reduzierten Expression des Proliferationsmarkers Ki-67 begleitet. Der TIFP induziert aber nicht nur mechanische Dehnungsreize, sondern er stellt darüber hinaus eine physikalische Barriere für den effizienten Transport von Therapeutika in den Tumor dar. Der gegenüber dem umliegenden Gewebe erhöhte TIFP behindert den interstitiellen Transport und die Aufnahme von Molekülen aus dem Gefäßsystem in die Tumorzellen. Die Etablierung einer neuen experimentellen Technik zur Senkung des TIFP, durch i.v. Injektion von konzentriertem humanem Serumalbumin, führte zu einer signifikanten Verbesserung der Aufnahme und einer Verlängerung der Verweildauer von Makromolekülen/Therapeutika innerhalb von Tumoren. Des Weiteren konnten immunhistochemische Färbungen gegen lymphspezifische Marker in Gewebeproben von A431 und A549 Tumoren keinen direkten Zusammenhang zwischen Lympharchitektur und TIFP zeigen. Dies bedeutet, dass in den untersuchten Tumoren die Ausbildung des hohen TIFP eher auf eine erhöhte Rigidität der extrazellulären Matrix bzw. die hohe Permeabilität des tumorversorgenden vaskulären Gefäßsystems zurückzuführen ist. Parallel zu den in vivo-Untersuchungen durchgeführte in vitro-Versuche konnten Proteine identifizieren, die an der druckinduzierten p38 Signaltransduktionskaskade beteiligt sind. Diese Ergebnisse untermauern die bisherigen in vitro-Daten bzgl. der differentiellen Reaktionen von Zellen auf mechanische Druckreize. Abschließend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse der in vivo-Versuche die Bedeutung und die klinische Relevanz des biophysikalischen Parameters TIFP hervorgehoben haben. Die Zukunft der Krebstherapie liegt nicht alleine in der Entwicklung neuer hochspezifischer Wirkstoffe, sondern auch in der Lösung des Transports der Wirkstoffe an den Zielort. Die vorgestellten Ergebnisse dieser Promotionsarbeit weisen eine beträchtliche klinische Relevanz auf, denn sie zeigen, dass die experimentelle Absenkung des TIFP zu einer verbesserten Aufnahme von Therapeutika beiträgt. Gleichzeitig wird die Proliferationsrate von Tumorzellen durch die reduzierte mechanische Dehnung signifikant verringert. Dieser Doppeleffekt könnte zu einer effizienteren Krebstherapie führen in Folge derer es zu einer verlängerten Überlebensrate sowie einer Verbesserung der Lebensqualität von Krebspatienten kommen könnte.
Background: False aneurysms at the puncture site develop in up to 8 % after catheter procedures. They can be treated surgically or by ultrasound guided manual compression. A new method is to inject thrombin into the aneurysm under ultrasound guidance. We evaluated safety and efficacy of this approach in a multicenter registry. Methods: In 595 consecutive patients (age: 31-94 years, median 70) a pseudoaneurysm (593 femoral arteries, 2 brachial arteries) was diagnosed 0 to 250 days (median 3 days) after a catheter procedure. The diameter of the aneurysm ranged from 0.5 x 0.5 x 0.5 (L x W x D) to 8x11x16 cm (median 2 x 2 x1.6 cm). 20 U to 4000 U of thrombin solution (median 400 U) were injected percutaneously into the aneurysm under ultrasound guidance. Results: The procedure was technically successful in 587/595 (99%) patients. The aneurysms were thrombosed after the first injection in 531 patients (89 %). Thirty-eight (6%) patients needed a second injection and 8 (1%) patients a third injection because residual flow in the aneurysm was visible at follow-up. In 4 additional patients (0.7%) the thrombosis of the aneurysms was delayed and occurred only after 24 hours to 7 days. 6 (1%) patients surgery was performed after successful closure of the aneurysm to remove the resulting haematoma. The overall technical success rate was 99% (587/595) and clinical success was achieved in 572/595 (96%) patients. Eight (1%) other patients underwent surgery due to thrombin injection failure. Complications occurred in 9 patients (1.5%): Intravascular thrombus formation (n=3), deep venous thrombosis (n=3), pulmonary embolism due to deep venous thrombosis (n=1), transient paresthesia in the leg during injection (n=3). Conclusion: Ultrasound guided thrombin injection is a safe, painless, effective and rapid alternative to treat false aneurysms. Complications and recurrent pseudoaneurysms are very rare. It has become the treatment of choice in our institution.
Für Experimente der Atomphysikgruppe der GSI in Darmstadt wird ein Ionenabbremser gebaut, der niederenergetische, extrem hochgeladene Ionen zur Verfügung stellen wird. Die Planungen zu der soganennten HITRAP (highly charged ion's trap) begannen Anfang der neunziger Jahre. Mit dieser Anlage sollen hochgeladene, schwere Ionen auf sehr niedrige, thermische Geschwindigkeiten in zwei Stufen abgebremst und für hochpräzise Massenspektroskopie, Messungen des g-Faktors des gebundenen Elektrons wasserstoffähnlicher Ionen und andere atomphysikalische Experimente zur Verfügung stehen. Diese Deceleratoranlage soll zunächst im Reinjektionskanal hinter dem ESR aufgebaut werden, mit der Möglichkeit, alle Komponenten später beim Ausbau der GSI im Rahmen des FAIR-Projektes in der neu zu errichtenden Anlage für niederenergetische Antiprotonen und Ionen zu verwenden. Die vorliegende Arbeit behandelt die Entwicklung und den Aufbau eines integrierten RFQ-Debuncher-Abbremsbeschleunigers, der einen Teil der HITRAP-Abbremsstrukturen darstellt. Mit diesem wird der Ionenstrahl, vom IH-Abbremsbeschleuniger mit einer Energie von 5oo keV/u kommend auf 6 keV/u abgebremst. Mit dem integrierten Spiralbuncher kann der Strahl in Energie und Energieabweichung an die nachfolgende Kühlerfalle angepasst werden. Es wurden in dieser Arbeit die Grundlagen der Teilchendynamik in einem RFQ-Beschleuniger zum Abbremsen von Teilchenstrahlen erarbeitet und umgesetzt, die zur Auslegung einer solchen Struktur notwendigen Teilchendynamikrechnungen mit RFQSim durchgeführt, geeignete Hf-Strukturen mit dem Simulationsprogramm Microwave Studio entwickelt und untersucht, sowie die thermische Belastung der Strukturen mit dem finite Elementeprogramm ALGOR untersucht. Ein weiterer zentraler Punkt dieser Arbeit ist der Aufbau und die Hf-Abstimmung der RFQ-Struktur, um eine möglichst homogene Feldverteilung entlang der Elektroden zu erreichen. Messungen der Felder im RFQ wurden mit einem Störkondensator, am Debuncher mit einem Störkörper durchgeführt. Nach erfolgreich durchgeführten Vakuumtests am IAP ist die RFQ-Debuncher-Kombination nun bereit für erste Hochleistungstests an der GSI.
Maligne Gliome sind die häufigsten Neoplasien des Zentralen Nervensystems. Sie zählen zu den hypoxischsten Tumoren und entwickeln u.a. durch die Adaption an niedrige Sauerstoffbedingungen Apoptose-resistente Phänotypen. Darüber hinaus zeichnen sie sich durch schnelle Proliferation und ein diffuses, infiltratives Wachstum in das umliegende Neuropil aus, was eine vollständige Tumor-Resektion unmöglich macht. Entsprechend liegt die mediane Überlebenszeit nach der Diagnose trotz chirurgischen Eingriffs bei anaplastischen Astrozytomen (WHO Grad III) zwischen 18 und 20 Monaten und bei Glioblastomen (WHO Grad IV) zwischen 12 und 15 Monaten. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurden 17 Gliomzelllinien in einem in vitro-Anoxiemodell auf ihre Hypoxie-Sensitivität hin untersucht. Dabei wurde eine hohe Variabilität hinsichtlich der Hypoxie-Toleranz festgestellt, sowie die Tendenz zu einer ausgeprägter Anpassung an niedrige Sauerstoffverhältnisse, begleitet von der Fähigkeit, das mitochondriale Membranpotential (delta psi m) aufrecht zu erhalten. Der durch Hypoxie induzierte Zelltod wurde als Caspase-unabhängig und Nekrose-ähnlich charakterisiert. Apoptose wurde hingegen auch in den Hypoxie-sensitiven Zelllinien nach 48 stündigem Sauerstoffentzug nur in sehr geringem Ausmaß beobachtet. Funktionelle Analysen mit den synthetischen BH3-Mimetika HA14-1 und BH3I 2’, die selektiv Bcl-2 bzw. Bcl xL/Bcl-2 inhibieren, lassen darauf schließen, dass die für Gliomzellen typische Bcl-2- und Bcl xL-Überexpression eine Blockade des mitochondrialen Signalwegs verursacht und so entscheidend zur Apoptose-Resistenz der Zellen beiträgt. Der Todesligand TRAIL, der selektiv in Tumorzellen Zelltod aktiviert, ist ein vielversprechender Kandidat für neue Apoptose-induzierende Krebstherapien. Da jedoch einige Krebszelltypen einschließlich maligner Gliome weitgehend gegen TRAIL resistent sind, richtet sich das Interesse verstärkt auf kombinatorische Therapieansätze, die Tumorzellen für TRAIL resensitivieren sollen. Nur zwei von sechs untersuchten Gliomzelllinien reagierten auf die Behandlung mit TRAIL, wobei eine Korrelation zwischen Hypoxie- und TRAIL-Resistenz deutlich wurde und die Hypothese einer ausgeprägten Kreuzresistenz stärkt. Ein Zusammenhang zwischen TRAIL-Sensitivität und TRAIL-Todes- bzw. –Decoy-Rezeptor-Expression konnte indes nicht hergestellt werden. Der Vergleich von konventionellen Therapienansätzen (Gamma-Bestrahlung) mit neuartigen Wirkstoffklassen (BH3-Mimetika und Proteasomeninhibitoren) zeigte, dass Gamma-Bestrahlung lediglich in TRAIL-sensitiven Zellen synergistisch mit TRAIL wirkte, während die BH3-Mimetika den TRAIL-induzierten Zelltod sowohl in TRAIL-sensitiven als auch –resistenten Zellen signifikant erhöhten. Diese Befunde legen nahe, dass die hohen Bcl-2- und Bcl xL-Proteinlevel verschiedene Signalwege hemmen, die an den Mitochondrien konvergieren und dadurch die Apoptose- bzw. Therapie-Resistenz maligner Gliome steigern. Der Einsatz der Proteasomeninhibitoren MG132 und Epoxomicin erwies sich vergleichsweise als am effizientesten: Beide Substanzen vervielfachten p53-unabhängig den TRAIL-induzierten Zelltod in TRAIL-sensitiven Gliomzellen und reaktivierten darüber hinaus potent die TRAIL-induzierte Apoptose in den TRAIL-resistenten Zelllinien. Microarray- und semi-quantitative RT-PCR-Analysen ergaben eine potente transkriptionelle Aktivierung des TRAIL-Rezeptors DR5 und der Stress-induzierten Transkriptionsfaktoren CHOP und c-Jun. Weitere Untersuchungen mit Hilfe von chemischen Inhibitoren und RNA-Interferenz zeigten, dass die CHOP-unabhängige, JNK/c-Jun-Signalwegs-vermittelte Aktivierung von DR5 eine maßgebliche Rolle bei der Proteasomeninhibitor-induzierten Sensitivierung von Gliomzellen für TRAIL spielt. Zusammengenommen legen die vorgelegten Befunde nahe, dass neue Ansätze basierend auf TRAIL oder agonistischen TRAIL-Rezeptor-Antikörpern in Kombination mit Proteasomeninhibitoren oder BH3-Mimetika vielversprechende Strategien zur Überwindung der Therapieresistenz maligner Gliome darstellen.
The chemiosmotic theory suggested by Peter Mitchell (Mitchell, 1961, Nature 191:144-148; see Mitchell, 1979, Science 206:1148-1159 for review) postulated that the energy released upon the oxidation of electron donor substrates is transiently stored as electrochemical proton potential, delta-p across energy-transducing membranes, which acts then as the driving force for the ATP synthesis. Membrane protein complexes can both generate and utilise a transmembrane electrochemical proton potential, either by transmembrane proton transfer or by transmembrane electron transfer coupled to protolytic reactions on opposite sides of the membrane. The dihaem-containing membrane protein complex quinol:fumarate reductase (QFR) from the anaerobic epsilon-proteobacterium Wolinella succinogenes apparently combines both of these mechanisms (Haas et al, 2005, Biochemistry 44:13949-13961; Lancaster et al, 2005, PNAS 102:18860–18865; Mileni et al, 2005, Biochemistry 44:16718-16728; Madej et al, 2006, EMBO J 25:4963-4970). QFR is the terminal enzyme of anaerobic fumarate respiration that allows bacteria to use fumarate as the terminal electron acceptor (Kröger, 1978, Biochim Biophys Acta 505:129-45; Lancaster, 2004, In: Respiration in Archaea and Bacteria Volume 1:57-85). QFR couples the two-electron reduction of fumarate to succinate to the two-electron oxidation of quinol to quinone. QFR contains two haem b groups bound by the transmembrane subunit C, which are termed the ‘proximal haem’, bP, and the ‘distal haem’, bD, according to the relative proximity to the hydrophilic subunits A and B (Lancaster et al, 1999, Nature 402:377-85). The two-electron transfer via the two haem groups has been proposed (Lancaster, 2002, Biochimica et Biophysica Acta 1565:215-231) and demonstrated (Madej et al, 2006, EMBO J 25:4963-4970) to be coupled to a compensatory, parallel transfer of two protons via a transmembrane proton transfer pathway. The two most prominent constituents of the proposed pathway were suggested to be the haem bD ring C propionate and the side chain of amino-acid residue Glu C180, after which the proton transfer pathway was named the ‘E-pathway’ (Lancaster, 2002, Biochimica et Biophysica Acta 565:215-231). The essential role of Glu C180 was supported by site-directed mutagenesis and structural and functional characterization of the enzyme E180Q, where the Glu C180 was replaced with a Gln residue (Lancaster et al, 2005, PNAS 102:18860–18865). Moreover, multiconformer continuum electrostatics (MCCE) calculations (Haas and Lancaster 2004, Biophys J 87:4298-4315) and Fouriertransformed infrared (FTIR) spectroscopy experiments (Haas et al, 2005, Biochemistry 44:13949-13961) indicated the Glu C180 side chain to undergo a combination of a conformational change and protonation upon haem reduction. The contribution of haem bD propionate is less clear, however, a combination of 13C labelling of the haem propionates with redox-induced FTIR experiments (Mileni et al, 2005, Biochemistry 44:16718-16728) and MCCE calculations (Haas and Lancaster, 2004, Biophys J 87:4298-4315) support a change in protonation, possibly accompanied by a change in environment upon haem reduction. These experiments and their results strongly support the existence of the ‘E-pathway’ which is transiently open during the reduction of the haem groups and blocked in the oxidized state of the enzyme (Lancaster, 2002b, Biochim Biophys Acta 1565:215-231). All available crystal structures of the QFR, however, are those of the oxidized enzyme. Therefore, it is advantageous to perform simulations of various redox states of the enzyme to determine for instance, how the side-chain of Glu C180 and haem bD ring C propionate behave upon changes of the redox states of the haem groups and why is the ‘E-pathway’ blocked in the oxidized state of the enzyme. Although the distal haem ring C propionate and Glu C180 were identified as the most prominent components of the proton transfer pathway, it was not clear, on the basis of the structure, how proton transfer could occur between them. In addition, two constituents are not enough to span the membrane region and the additional participants in the proton transfer pathway must be identified. Since an atomistic investigation of proton transfer in this system is not yet possible experimentally, I used available theoretical methods such as classical molecular dynamics (MD) simulation (Alder and Wainwright, 1959, J Phys Chem 31:459-466; McCammon et al, 1977, Nature 267:585-590) and Q-HOP molecular dynamics (Q-HOP MD) simulation (Lill and Helms, 2001, J Chem Phys 115:7993-8005) to investigate the postulated mechanism of electron coupled proton transfer in QFR. MD simulations allowed us to move away from static difference pictures obtained from FTIR experiments and MCCE calculations. The advantage of the MD simulations over the experiments and the simulations performed so far is that the time-dependent properties could now be analyzed. The behaviour of various residues and their side-chains and any environmental changes may be directly observed during MD simulations. Although classical MD simulations cannot be used to study proton transfer reactions, they can provide information on formation of configurations that would allow either direct proton transfer between donor and acceptor residues or indirect proton transfer mediated by water molecules. To avoid the static protonation of residues which is inherent in classical MD simulations, Q-HOP MD simulations were performed which explicitly describe proton transfer reactions by allowing the change of the protonation state of residues ‘on the fly’. The structures obtained after classical molecular dynamics simulations ....
Die Erstellung und Auswertung der Frankfurter HIV-Resistenzdatenbank dient der Analyse von Prävalenzen von Primär- und Sekundärmutationen im HIV-Genom für die spezifischen antiretroviralen Medikamente sowie der Untersuchung von Korrelationen von Punktmutationen in der Protease mit klinischen Parametern. Die hier vorgestellte allgemeine Datenbankauswertung bestätigte die in der Literatur beschriebene nur geringe Mutationsprävalenz in der Protease, sowohl im Bereich der Primärmutationen (AS-Pos. 30, 46, 48, 50, 82, 84 und 90) also auch der Sekundärmutationen. Ebenso zeigte sich, dass die Ausbildung von Mutationen unter Selektionsdruck durch eine antiretrovirale Therapie deutlich über der von ART-naiven Patienten liegt. Die Untersuchung von Patienten mit niedriger Virusbeladung (Low-level-Patienten) konnte zeigen, dass auch bei Sequenzierungen mit geringem Virusmaterial aussagefähige Ergebnisse zu erzielen sind. Die Mutationen passten sowohl zu den entsprechenden Vortherapien als auch zu den klinischen Parametern, wie Viruslast und CD4+-Zellzahl. Das Verfahren der Genotypisierung stellt daher auch für Patienten mit einer niedrigen Viruslast (< 1000 Kopien/ml Blut) eine geeignete Methode dar, um Fragestellungen nach Mutationen, Therapieverläufen und Resistenzentwicklungen zu beantworten. Die Analyse von Patientenverläufen aus dem Low-level-Kollektiv bestätigte die reziproke Korrelation zwischen Viruslast und CD4+-Zellzahl. Auch hier spiegelte sich in den Ergebnissen der Genotypisierungen der jeweilige klinische Verlauf wider. Die Auswertung von Mutationsveränderungen unter Therapiewechseln bzw. ARTPausen lässt den Erfolg von Therapiepausen zur Rückbildung von Mutationen kritisch betrachten. Bei dem Frankfurter Kollektiv kam es bei allen Patienten nach erneutem Therapiebeginn zu einer Reselektionierung der ursprünglichen Mutationen und war mit einem erneuten Therapieversagen verbunden. Die STI konnte hier zu keiner langfristigen Reduktion der Resistenzen führen. Ebenso wurde deutlich, dass auch bei einem bereits vielfach mutierten HIV-Genom zusätzliche Mutationen selektioniert werden können. Insgesamt gesehen zeigen die Auswertungen aller hier zugrunde liegenden Daten, dass die Genotypisierung eine unverzichtbare diagnostische Methode darstellt, ohne die für den Patienten eine effiziente und optimale medikamentöse Therapie nicht gewährleistet werden kann.
Seit der Einführung der antiretroviralen Therapie (HAART) ist die Mortalität von HIV-Infizierten in der westlichen Welt zwar deutlich zurückgegangen, die HIV-Infektion ist jedoch bis heute nicht heilbar. Die derzeitige Therapie unterdrückt zwar sehr effektiv die Virusreplikation, kann aber nicht das Virus vollständig eliminieren und somit die Infizierten nicht heilen. Die daher notwendige Langzeitbehandlung wird wiederum durch die relativ hohe Toxizität der Medikamente und durch das Auftreten resistenter Virusvarianten limitiert. Die Suche nach neuen Therapienansätzen und Wirkstoffklassen ist daher immer noch von größter Wichtigkeit. Die HIV-Gentherapie stellt neben der konventionellen antiretroviralen Therapie eine mögliche zusätzliche Behandlungsform dar. Die Arbeitsgruppe von Laer hat am Georg-Speyer-Haus retrovirale Vektoren entwickelt, die membrangebundene (ma) HIV-Eintrittsinhibitoren, sog. C Pepitde, kodieren. Das durch den Prototyp-Vektor M87 kodierte maC36-Peptid zeigte eine moderate Inhibition des Viruseintritts. In einem Optimierungsprozess wurde der Vektor M87o generiert. M87o kodiert im Vergleich zu M87 ein wirksameres maC-Peptid (maC46) und weist auch eine wesentlich höhere Expressionsstärke und dadurch eine stärkere inhibitorische Wirkung als der Prototypvektor auf. Ziel dieser Arbeit war es zunächst, HIV Varianten, die resistent gegenüber dem M87o–Genprodukt maC46 sind, in vitro zu generieren und anschließend den Resistenzmechanismus aufzuklären. In einer Kollaboration mit der Gruppe um M. Dittmar aus Heidelberg war durch Passage des HIV 1 Wildtyp (wt) Ba L-Isolats auf M87-transduzierten Zellen bereits das maC36-resistente Virusisolat Ba L_sel_MD generiert worden. Ba L_sel_MD wies zwei Resistenzmutationen in der gp41-Untereinheit des Hüllproteins auf: I556V (heptad repeat 1 Region) und N634K (heptad repeat 2 Region). Für die Mutation 634K war dabei gezeigt worden, dass sie auch zu einer leichten Reduktion der maC46-Sensibilität führt. In der vorliegenden Arbeit diente Ba L_sel_MD als Ausgang für die Selektion einer Virusvariante mit deutlich verminderter Sensibilität gegenüber maC46. Hierfür wurde Ba L_sel_MD über 149 Tage lang auf Zellen mit steigender maC46 Expressionshöhe passagiert und so das Isolat Ba L_FH1 generiert. Das Hüllprotein des selektierten Isolats war ausreichend, um einen maC46-resesistenten Phänotyp hervorzurufen. Das selektierte Hüllprotein war im Vergleich zu dem Ausgangsisolat ca. fünf- bis zehnfach weniger empfindlich gegenüber maC46. Die Sequenzierung des Ba L_FH1 Hüllproteingens zeigte, dass die Aminosäureausprägung an Position 634 des Ausgangsisolats (BaLsel_MD) konserviert worden war, während die Position 556 zur Wildtypsequenz revertiert war. Darüber hinaus wurden drei Mutationen in der gp120-Untereinheit des Hüllproteins (V2-Region (I187T), V3-Region (N305Y), C3-Region (E352K)), sowie eine Mutation in der heptad repeat 1 Region (A579T) der gp41-Untereinheit identifiziert. Für die reduzierte maC46-Empfindlichkeit waren in erster Linie die Mutation N305Y in der V3 Region und die Rückmutation 556I in Zusammenwirkung mit der bereits vorhandenen Mutation 634K verantwortlich. Die verbleibenden Mutationen hatten allenfalls modulierende Wirkung auf die maC46-Sensibilität. Die Resistenz ist vermutlich auf die beobachtete erhöhte Fusionsgeschwindigkeit des Hüllproteins von Ba L_FH1 im Vergleich zum Ausgangsisolat zurückzuführen, die interessanterweise mit einer reduzierten Corezeptoraffinität verknüpft war. Die erhöhte Fusionsgeschwindigkeit verkürzt das zeitliche Fenster, in welchem maC46 an seine Zielstruktur innerhalb des gp41 binden kann. Es scheinen zwei unterschiedliche Phasen des Eintrittprozesses durch die Mutationen verändert worden zu sein. Die Mutation in der V3-Region (N305Y) der gp120-Untereinheit beschleunigt wohl eine frühe Phase. Vermutlich ermöglicht diese Mutation, dass bestimmte Übergangszustände nach der Corezeptorbindung schneller durchlaufen werden können, indem die gp120/Corezeptorbindung destabilisiert wird. Die Rückmutation 556I beschleunigt wahrscheinlich in Zusammenspiel mit der bereits vorhandenen Mutation 634K die Ausbildung des 6 Helixbündels. Diese beiden Mutationen wirken somit auf eine späte Phase der Fusion. Obwohl bekannt ist, dass natürliche Variationen in gp120 die Sensibilität des HIV-Hüllproteins gegenüber C-Peptiden beeinflussen, konnte in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass solche Mutationen auch in vitro selektiert werden, um eine C-Peptidresistenz herbeizuführen.
Tumormarker dienen im Allgemeinen der Verlaufskontrolle bei der Behandlung von Malignomen, unabhängig, ob die Therapie chirurgischen, radiologischen oder chemotherapeutischen Ursprungs ist. Als Ausnahme wäre das PSA zu nennen, welches auch als Screeningparameter Verwendung findet. Die etablierten Tumormarker, die in der Therapie des Mammakarzinoms Verwendung finden, sind unter anderem MCA und CA 15-3. Hierbei handelt es sich ebenso wie bei dem in der vorliegenden Arbeit untersuchten Tumormarker TAG 12 um ein Glykoprotein. Die diagnostische Sensitivität der beiden etablierten Marker beträgt zwischen 50 und 59%, wobei CA 15-3 nur in Kombination mit CEA, ebenfalls ein Glykoprotein, diesen Wert erreicht. TAG 12 dient der Verlaufskontrolle in der Therapie des Mammakarzinoms, als Untersuchungsmaterial wird Serum verwendet. Mittels eines ELISA-Tests, sowie eines Spektralphotometers, erfolgte die Berechnung der Sensitivität, der Spezifität, der Prävalenz, des positiven prädiktiven Wertes und des negativ prädiktiven Wertes. Im Verlauf der durchgeführten Studie stellte sich heraus, dass verschiedene Lebererkrankungen, maligner und benigner Genese, einen Einfluss auf die Höhe des Markerwertes haben, es zeigte sich falschpositive Werte. Dieses Phänomen ist allerdings bei diversen anderen Tumormarkern ebenfalls zu beobachten. Es konnte bei TAG 12 eine Sensitivität von 67% nachgewiesen werden, womit sich der neue Marker mit den oben genannten bereits etablierten Markern durchaus messen kann.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Gallensäure UDC, CDC und LC auf die Aktivität der ADH untersucht. Dabei wurden einmal die freie ADH und die in Liposomen eingebaute ADH verwendet. Die Liposomen besaßen eine unterschiedliche Lipidzusammensetzung, die sich an der Hepatozytenmembran orientierte. Des Weiteren wurde der Einfluss des bei der Oxidation von Äthanol entstehenden toxischen Produktes Acetaldehyd auf die ADHAktivität untersucht. Die ADH-Aktivität wurde nach Messung des entstehenden NADH im Photometer bei 340 nm berechnet. Es konnte gezeigt werden, dass die Geschwindigkeit der Äthanoloxidation mit der freien ADH bis zu einer Äthanolkonzentration von 20 mM gesteigert werden konnte. Bei 40 mM Äthanol war keine weitere ADH-Aktivitätszunahme mehr zu verzeichnen. Die Enzymmoleküle waren mit Substrat gesättigt. Wurde die ADH jedoch in Liposomen, unabhängig von ihrer Zusammensetzung eingeschlossen, dann konnte eine Aktivitätssteigerung bis 40 mM Äthanol beobachtet werden. Die Ursache des Effektes muss an anderer Stelle geklärt werden. Die Grundaktivität des Enzyms bei einer Äthanolkonzentration von 20 mM schwankte in den einzelnen Versuchen zwischen 20,40 bis 140,60 U · l-1. Die Ursache ist einerseits der unterschiedliche Proteingehalt, andererseits eine mögliche Instabilität des Hefeenzyms an sich. Wird anstelle des Substrates Äthanol das eigentliche Produkt der Oxidationsreaktion Acetaldehyd eingesetzt, dann lässt sich ein NADH-Anstieg im Photometer messen. Die ADH besitzt somit auch eine Aldehyddehydrogenase-Aktivität, die zwar im Gegensatz zu der Alkoholdehydrogenase-Aktivität schwächer ist, aber dennoch das Aldehyd in Gegenwart von NAD+ zu Essigsäure und NADH umsetzt. Auffällig war dies ab 20 mM Acetaldehydkonzentration in den Versuchen mit der freien ADH und bereits ab 5 mM Acetaldehyd mit der liposomal rekonstituierten ADH. Die Reaktion mit steigender Konzentration von Acetaldehyd und Zugabe von 20 mM Äthanol ergab einen Abfall der ADH-Aktivität. Äthanol hemmt Acetaldehyd nicht kompetitiv, so dass Äthanol langsamer umgesetzt wird. Auch eine kompetitive Hemmung von Acetaldehyd gegenüber Äthanol, bei der es zu einer direkten Konkurrenz um das aktive Zentrum des Enzyms kommt, ist denkbar. Eine Beeinflussung der Enzymaktivität durch die hydrophilen Gallensäuren UDC und CDC konnte in den vorliegenden Untersuchungen nicht erbracht werden. Dadurch konnte auch nicht die Wirkung der Gallensäuren auf die als Modellmembranen fungierenden Liposomen gezeigt werden. Allein die hydrophobe Gallensäure LC inhibierte signifikant die Enzymaktivität. Jedoch zeigte sich dabei kein Unterschied zwischen der Reaktion der freien ADH mit Äthanol und LC und der Reaktion der in die Liposomen eingebauten ADH mit Äthanol und LC. Die Inhibierung kann somit nicht auf die Modellmembran zurückgeführt werden. Sie müsste dementsprechend mit der direkten Interaktion der LC mit dem Enzym zusammenhängen. Der Beweis dafür kann mit dieser Arbeit nicht erbracht werden. Der hepatoprotektive Effekt der hydrophilen Gallensäuren, insbesondere der UDC, beeinflusst die toxische Wirkung des Äthanols und der Produkte der Äthanoloxidation nicht in dem Maße, dass eine therapeutische Konsequenz bei Patienten mit alkoholischen Hepatopathien, ähnlich der Gallensäurentherapie bei Patienten mit primär biliärer Zirrhose, gerechtfertigt wäre.
Der Mangel von Faktor VIII (FVIII) führt zur häufigsten Gerinnungsstörung, der Hämophilie A. Die rekombinante Expression von FVIII für gentherapeutische Ansätze oder zur Herstellung von FVIII ist zwei bis drei Größenordnungen niedriger verglichen mit anderen Proteinen vergleichbarer Größe. Die Ursachen für die geringe Expression liegen zum großen Teil an der ineffizienten Transkription und dem ineffizientem intrazellulären Transport. (1) Im Rahmen der Untersuchung der FVIII-Sekretion, konnte durch Verwendung von FVIII-GFP Fusionsproteinen zum ersten Mal gezeigt werden, wie FVIII in lebenden Zellen transportiert wird. Außerdem wurde anhand von vergleichenden Immunfluoreszensfärbungen, FVIII-Messungen und Westernblotanalysen demonstriert, dass weder bei der B-Domäne deletierten noch bei der Volllängenvariante signifikante Unterschiede zwischen den GFP-fusionierten und Wildtyp-FVIII-Varianten messbar waren. Offensichtlich wird die Funktionalität von FVIII durch die C-terminal fusionierte GFP-Domäne nicht eingeschränkt. In ersten Lebendzellanalysen konnte gezeigt werden, dass sich FVIII in primären Zellen und Zelllinien hauptsächlich im ER befindet und eine für lumenale ER-Proteine charakteristischen Mobilität aufweist. Beim frühen sekretorischen Transport zeigte sich bei Temperaturblock-Experimenten eine verlängerte Dauer der Akkumulation in ER-Exit-Sites und eine vergleichsweise niedrige Frequenz von ER-Golgi-Bewegungen. Es konnte zum ersten Mal der Nachweis von FVIII-Transport durch vesikuläre tubuläre Cluster erbracht werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der möglicherweise durch Faltungsprobleme blockierte Austritt aus dem ER das Hauptproblem des ineffizienten FVIII-Transports zu sein scheint und weniger der intrazelluläre Transport an sich. Mittels siRNA-Silencing wurde außerdem die überwiegende Beteiligung von COPI am intrazellulären Transport von FVIII deutlich, dessen Herunterregulierung zu einer 78 prozentigen Reduktion der FVIII-Sekretion im Gegensatz zu 32 Prozent bei COPII führte. Dagegen konnte durch Herunterregulierung der Expression der p24-Cargo-Rezeptor Familienmitglieder p24 und p26 und der Clathrin Adapterproteine µ- und -Adaptin bzw. durch physiologischen Knock-out im Falle von ER-Exit-Rezeptor MCFD2 kein Einfluß auf die FVIII-Sekretion festgestellt werden. (2) Als Alternative zu dem ineffizienten FVIII-Expressionsystem in unphysiologischen Zelllinien, bieten primäre Endothelzellen den Vorteil einer hocheffizienten FVIII-Sekretion. Zur Verwendung bei der rekombinanten Produktion benötigt man allerdings eine kontinuierlich wachsende gut charakterisierte Zelllinie. Zur Immortalisierung wurden aus Nabelschnurblut gewonnene Endothelprogenitorzellen mit der aktiven Untereinheit der humanen Telomerase (hTERT) transduziert. Trotz erfolgreicher Transduktion und langfristiger Expression von hTERT, welche im TRAP-Assay normale Aktivität zeigte, gingen die Zellen nach der natürlichen Teilungsspanne in die Seneszenz über. Möglicherweise wird noch ein weiteres Immortalisierungsgen benötigt oder hTERT ist durch die ektopischen Expression in diesen Endothelzellen nicht funktionell. (3) Der Einsatz hämatopoetischer Stammzellen für gentherapeutische Ansätze zur Expression von humanen FVIII ist bislang aufgrund niedriger Expressionseffizienz der Vektoren limitiert. Es wurden daher die Kombinationen verschiedener transkriptioneller und posttranskriptioneller Elemente in FVIII-Expressionsvektoren ausgetestet. Hierbei zeigte sich, dass die Verwendung einer 5’ untranslatierten Region (5’UTR) des hämatopoetisch exprimierten FXIIIA-Gens die FVIII-Sekretion in verschiedenen Zelllinien und primären Zellen deutlich steigerte. Am stärksten war die Wirkung in primären Monozyten, in denen die FVIII-Expression den 6fachen Wert im Vergleich zum Ursprungsvektor ohne 5’UTR erreichte. Leberzellen stellen weitere attraktive Zielzellen für gentherapeutische Ansätze dar, da Sie den primären physiologischen Ort der FVIII-Synthese darstellen. Die häufig für Gentherapievektoren verwendeten ubiquitär exprimierenden viralen Promotoren bewirken zwar hohe Expression in den transduzierten Zellen, haben allerdings den Nachteil durch ektopische Expression vermehrt Immunantworten auszulösen und durch starke Interaktion mit benachbarten Promotoren der Integrationsstelle im Genom möglicherweise tumorgene Effekte zu verursachen. Bei der Untersuchung verschiedener physiologischer Promotoren im Vergleich zum viralen CMV Promotor in Leberzellen konnte mit dem zum ersten mal getesteten minimalen FVIII-Promoter in einem lentiviralen Vektor der dritten Generation in Leberzelllinien eine vergleichsweise hohe Expression von 0,5 IU/ml FVIII /106 Zellen erzielt werden. Der FVIII-Promoter ist daher geeignet für eine lebergerichtete Expression und minimiert dabei das potentielle Risiko der häufig verwendeten ubiquitären viralen Promotoren.
Kindliche Sarkome sind eine heterogene Gruppe maligner Erkrankungen mesodermalen Ursprungs. Trotz operativer Therapie, Chemotherapie und Bestrahlung versterben noch viele Patienten. Auch gegenüber immunologischen Behandlungsansätzen sind Sarkome relativ resistent. Inhalt dieser Arbeit sind die Mechanismen, die der Resistenz kindlicher Sarkome gegenüber NK-Zellen zugrunde liegen könnten. Hierbei wurde insbesondere die Interaktion von HLA-Klasse-I-Molekülen mit inhibitorischen NK-Zellrezeptoren untersucht. Als einzige Sarkomzelllinie konnte A-673 mit einer Zelllyse von 40% bei einer E : T-Ratio von 20 : 1 als sensitiv eingestuft werden. Schwach sensitiv waren die Zelllinien MHH-ES und HOS-TE mit einer spezifischen Lyse von 25%. Als resistent gegenüber einer Zelllyse durch NK-92 erwiesen sich die Sarkomzelllinien SAOS-2, ZK58 und RD-ES mit einer Lyserate zwischen 10 und 15%. Die HLA-Klasse-I-Expression war bei den untersuchten Zelllinien HOSTE, SAOS-2, ZK58 und RD relativ schwach, bei A-673 und MHH-ES moderat und bei RD-ES stark. Gegenüber der klonalen NK-Zelllinie NK-92 zeigten sie mit Ausnahme von A-673 (40% Lyse) keine Sensitivität gegenüber einer NK-vermittelten Lyse. Dies liegt offenbar nicht an der Inhibition der NK-Zellen durch HLA-Klasse-I-Liganden, wie durch funktionelle Untersuchungen mit Blockierung der korrespondierenden HLA-Liganden gezeigt werden konnte. Auch korreliert die Sensitivität bzw. Resistenz der Sarkomzelllinien nicht mit der Expressionsdichte der HLA-Klasse-I-Moleküle auf den untersuchten Sarkomzelllinien. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten somit darauf hin, dass die Resistenz kindlicher Sarkome gegenüber NK-Zellen möglicherweise nicht auf eine Inhibition, sondern auf eine mangelnde Aktivierung der Immunzellen zurückzuführen ist.
Aims: The purpose of this study was to evaluate the feasibility and short-term efficacy of transcatheter paravalvular leak closure using different occlusion devices. Methods and Results: Twenty one patients underwent transcatheter closure of either aortic or mitral paravalvular leak from June 2002 to February 2006 using the Amplatzer PDA, ASD or VSD occluder. All patients had symptoms and signs of haemolysis and/or cardiac decompensation with dyspnoea. Implantation of a device was technically successful in twenty patients (95 %). Immediate residual leak was found in seventeen patients (85 %). Significant shunting persisted in nine cases during follow up (45 %). Permanent leaflet obstruction was observed in one patient. Severe complications during follow up led to early death in one patient and surgical intervention in three. A successful second catheter treatment was performed in another three patients. The event-free survival from reoperation, death and stroke at the end of the observation period was 80 %. Conclusion: Transcatheter closure of paravalvular leaks is a technically feasible, but demanding procedure. Residual leaks are common and may worsen pre-existing haemolysis. Due to the significant ongoing morbidity in this group of patients and the complexity of follow up individual patient results differ considerably. Nevertheless, it is possible to achieve some symptomatic relief, thus an interventional approach should be discussed as a potential treatment option for those patients with a limited defect and who are not deemed suitable for another operation.
Die Steriltestung der Blutprodukte zur Reduzierung des Übertragungsrisikos von Pathogenen stellt vor allem bei Thrombozytenkonzentraten ein wichtiges wissenschaftliches Interesse in der Transfusionsmedizin dar. In der vorliegenden Arbeit wurde ein synoptischer Vergleich sowohl von Apheresethrombozytenkonzentraten als auch von Pool-Thrombozytenkonzentraten bezüglich bakterieller Kontaminationen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sich beide Thrombozytenprodukte hinsichtlich der bakteriellen Kontaminationsrate nicht unterscheiden und somit im Hinblick auf die Transmission von Bakterien als gleichwertig zu betrachten sind. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Kulturmethoden (BacT/ALERT und Pall eBDS) und eine Schnelltestmethode (Scansystem) miteinander hinsichtlich der analytischen Sensitivtät miteinander verglichen. Der Hauptnachteil der getesteten Schnelltestmethode (ScansystemTM) ist die geringere analytische Sensitivität und v. a. der Umstand, dass die Auswertung der Ergebnisse subjektiv und somit personenabhängig ist. BacT/ALERT überzeugt durch eine hohe analytische Sensitivität, basierend auf einem langen Untersuchungszeitraum von bis zu sieben Tagen. Auch Pall eBDS überzeugte mit einer hohen analytischen Sensitivität, ist aber ein Testsystem, welches ausschließlich für aerobe Bakterien geeignet ist. Dagegen wurden in der Studie überwiegend Anaerobier (>90%) gefunden. ScansystemTM fand aerobe und anaerobe Keime in einer sehr kurzen Testzeit von ca. 70 Minuten, hatte jedoch die niedrigste analytische Sensitivität. In der klinischen Anwendungsbeobachtung konnte kein Zusammenhang zwischen den aufgetretenen Symptomen und der Thrombozytentransfusion festgestellt werden. Da das bakterielle Restinfektionsrisiko bei Thrombozytenkonzentraten das Restrisiko für virale Infektionen übertrifft, wird empfohlen bestehende Testverfahren zu optimieren, bzw. alternative Methoden, wie die der Pathogeninaktivierung zu entwickeln.
Die Rheumatoide Arthritis ist die häufigste entzündliche Gelenkerkrankung in den westlichen Industriestaaten und hat eine Prävalenz zwischen 0,5 und 1%. Frauen sind ungefähr 3mal häufiger betroffen als Männer. Eine genetische Disposition besteht für Träger des HLA-DR 4 Typs. Als Auslöser der RA werden bakterielle und virale Infekte diskutiert. Immer mehr Anhänger findet auch die Theorie, dass es sich bei der rheumatoiden Arthritis um eine Autoimmunerkrankung handeln könnte. Zur Klassifizierung der Krankheit hat das American College of Rheumatology einen Kriterienkatalog entwickelt. Charakteristisch für die rheumatoide Arthritis ist die chronische Gelenkentzündung und die Gelenkdestruktion. Bei 70% der RA Patienten finden sich heterophile Autoantikörper gegen den konstanten Teil humaner Immunglobuline vom IgG Isotyp. Sie werden als Rheumafaktoren bezeichnet und gehen mit einer häufigeren Beteiligung extraartikulärer Systeme einher, die in erster Linie auf einer begleitenden Vaskulitis beruhen. Der entzündliche Prozess der RA beginnt in der Gelenkkapsel. Es kommt zu einer Verbreiterung und Auftreibung der Synovialmembran durch Einwanderung und Organisation von CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten. Durch ein unbekanntes Antigen stimulieren die TLymphozyten synoviale Makrophagen, die dann mit der Produktion proinflammatorischer Zytokine, insbesondere TNF-α und IL-1, weitere Zellsysteme aktivieren und zur Aufrechterhaltung des Entzündungsprozesses beitragen. Resultat dieser tumorähnlichen Proliferation ist der Gelenkpannus, von dem die weitere Destruktion von Knorpel, Knochen und umgehenden Weichteilen ausgeht. Ein weiteres wichtiges Zytokin in der T-Zell- und Makrophagenaktivierung ist Interleukin-18, ein proinflammatorischer Mediator der angeborenen und erworbenen Immunantwort. IL-18 wurde ursprünglich als IFN-γ induzierender Faktor beschrieben und wird von vielen mesenchymalen und epithelialen Zellen exprimiert. Im Zusammenhang mit der RA sind vor allem Makrophagen und dendritische Zellen von Bedeutung. Die Expression von IL-18 ist bei Patienten mit RA im Sinne einer Reduktion in der Peripherie und einer Erhöhung in den entzündeten Synovialgeweben pathologisch verändert und weist auf eine proinflammatorische Rolle von IL-18 bei der RA hin. Das humane IL-18 Gen ist auf dem Chromosom 11q22.2- q22.3 lokalisiert. In der Promotorregion von IL-18 konnten 5 Single Nucleotid Polymorphismen identifiziert werden. Bei SNPs handelt es sich um Basenvariationen der Nukleotidsequenz an bestimmten Genpositionen. Sie können zu unterschiedlichen Konsequenzen im Phänotyp führen. In der vorliegenden Arbeit wurden die SNPs an den Positionen -137 und -607 bei 102 Patienten mit einer nach ACR-Kriterien definierten RA und einer gesunden Kontrollgruppe von 98 Personen untersucht. Anlass für die Untersuchungen war der Gedanke, dass die Ursache für die veränderte Produktion von IL-18 bei der RA auf genregulatorischer Ebene liegen kann. Nach Isolierung mononukleärer Zellen aus dem peripherem Blut erfolgte die DNA-Gewinnung. Mittels allelspezifischer PCR und Enzymverdauung durch Restriktionsendonukleasen wurden die einzelnen Allele an den Positionen -137 und -607 identifiziert und auf Agarosegel sichtbar gemacht. Zur Kontrolle der Ergebnisse wurden zusätzlich Sequenzierungen durchgeführt. An Position -137 sind die beiden Allele C und G möglich, an Position -607 die Allele A und C. Weder an Positon -137 noch an Position -607 zeigten sich signifikante Unterschiede bei der Verteilung der Allelhäufigkeiten zwischen RA Patienten und der gesunden Kontrollgruppe. Da beim Menschen jedes Gen zweimal vorhanden ist liegen auch bei jedem Menschen zwei Allele vor. Liegen zwei verschiedene Allele eines Gens vor wird dieses als heterozygot bezeichnet, während ein homozygoter Organismus zwei Kopien desselben Allels trägt. Bei Betrachtung dieser Diplotypen ergaben sich für die Position -137 erneut keine signifikanten Unterschiede zwischen RA Patienten und Gesunden. An Position -607 hingegen war der Diplotyp -607CC bei den RA Patienten signifikant häufiger vertreten. Die Relevanz dieser Ergebnisse wurde durch das Hardy- Weinberg-Gleichgewicht gestützt. Bei Betrachtung der Genotypen wurde eine signifikante Verknüpfung der Genotypen -607AA und -137CC und der Genotypen -607CC und -137GG miteinander festgestellt. Diese Signifikanz war unabhängig vom Gesundheitsstatus. Zusätzlich war der -607AC Diplotyp häufiger mit den Diplotypen -137CG und -137GG verknüpft, nicht aber mit dem Diplotypen -137CC. Ob das Risiko eine RA zu entwickeln von den einzelnen Positionen -137 und -607 des IL-18 Promotors, deren Kombination oder eventuellen anderen Lokalitäten in einem gewissen Ausmaß anhängig ist bleibt unklar. Fest steht, dass SNPs eine bedeutende Rolle als natürliche Inhibitoren und Aktivatoren auf molekularer Ebene spielen. Ob dies bei der RA zu einer erhöhten IL-18 Expression führen kann und somit signifikante Folgen für die Krankheitsausprägung hat konnte im Rahmen der Untersuchungen nicht geklärt werden und bedarf weiterer Untersuchungen.
Quantum chromodynamics predicts the existence of a phase transition from hadronic to quark-gluon matter when temperature and pressure are sufficiently high. Colliding heavy nuclei at ultra-relativistic speeds allows to deposit large amounts of energy in a small volume of space, and is the only available experimental mean to produce the extreme conditions necessary to obtain the deconfined state. Numerous models and ideas were developed in the last decades to study heavy ion physics and understand the properties of extremely heated and compressed nuclear matter. With the ever increasing energy available in the center of mass frame (and thus number of particles produced) and the development of large acceptance detectors, it has become possible to study the fluctuations of physical quantities on an event-by-event basis, and access thermodynamical properties not present in particle spectra. The characteristics of the highly excited matter produced, e.g. thermalization, effect of resonance decay. . . can be investigated by fluctuation analyses. In fact, fluctuations are good indicators for a phase transition and a plethora of fluctuation probes have been proposed to pin down the existence and the properties of the QGP. We study various fluctuation quantities within the Ultra-relativistic Quantum Molecular Dynamics UrQMD and the quantum Molecular Dynamics qMD models. UrQMD is based on hadron and string degrees of freedom and allows to disentangle purely hadronic effects. In contrast, the qMD model includes an explicit transition from quark to hadronic matter and can serve to test adequate probes of the initial QGP state. We show that the qMD model can reasonably reproduce various experimental particles rapidity distributions and transverse mass spectra in wide energy range. Within the frame of the dynamical recombination procedure used in qMD, we study the enhancement of protons over pions (p/π) ratio in the intermediate pt range (1.5 < pt < 2.5). We show that qMD can reproduce the large p/π ≈ 1 observed experimentally at RHIC energies at hadronization. However, the subsequent decay of resonances makes the ratio fall to values incompatible with experimental data. We thus conclude that resonance decay might have a drastic influence on this observable in the quark recombination picture. Charged particles multiplicity fluctuations measured at SPS by the NA49 collaboration are enhanced in midperipheral events for Pb+Pb collisions at Elab = 160 AGeV. This feature is not reproduce by hadron-string transport approaches, which show a flat centrality dependence, within the proper experimental acceptance and with the proper centrality selection procedure. However, we show that the behavior of multiplicity fluctuations in transport codes is similar to the experimental result in full 4π acceptance. We identify the centrality selection procedure as the reason for the enhanced particle multiplicity fluctuations in midperipheral reactions and argue that it can be used to distinguish between different scenarios of particle productions. We show that experimental data might indicate a strong mixing of projectile and target related production sources. Strangeness over entropy K/π and baryon number over entropy p/π ratio fluctuations have been measured by the NA49 experiment in the SPS energy range, from Elab = 20 AGeV up to Elab = 160 AGeV. We investigate the sensitivity of this observable to kinematical cuts and discuss the influence of resonance decay. We find the dynamical p/π ratio fluctuations to increase with beam energy, in agreement with the measured data points. On the contrary, the dynamical K/π ratio fluctuations are essential flat as a function of centrality and depend only weakly on the kinematical cuts applied. Our results are in line with the simulations performed earlier by the NA49 collaboration in their detector acceptance filter. Finally, we focus on the correlations and fluctuations of conserved charges. It was proposed that these fluctuations are sensitive to the fractional charge carried by the quarks in the initial QGP stage and survive the whole course of heavy ion reactions. A crucial point is the influence of hadronization that may relax the initial QGP fluctuation/correlation signals to their hadronic values. We use the quark Molecular Dynamics qMD model to disentangle the effect of recombination-hadronization on charged particles ratio fluctuations, charge transfer fluctuations, baryon number-strangeness correlation coefficient and various ratios of susceptibilities (i.e. correlations over fluctuations). We find that the dynamical recombination procedure implemented in the qMD model destroys all studied initial QGP fluctuations and correlations and might ex- plain why no signal of a phase transition based on event-by-event fluctuations was found in the experimental data until now.
Leukemia inhibitory factor enhances neurogenin's pro-neural effect during mouse cortical development
(2007)
Die Entwicklung von unterschiedlichen Zelltypen waehrend der embryonalen ZNS-Entwicklung ist abhaengig von zellintrinsischen und positionsabhaengigen, aeusseren Einfluessen. Dabei bilden sich die verschiedenen Zellen in nacheinander ablaufenden bzw. sich teilweise ueberlappenden Zeitraeumen. Zuerst entstehen Radiaglia und Neuronen, nachfolgend Astrozyten und zuletzt Oligodendrozyten. Werden neurale Stammzellen/Vorlaeuferzellen (NPCs – neural precursor cells) zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen und ohne den Einfluss von Wachstumsfaktoren kultiviert, so entwickeln sich diese Zellarten in der gleichen Reihenfolge. Die Neurogenese, die bei Mausembryos am Tag E11-12, nach dem Etablieren der Radialglia, beginnt, findet an E14 ihren Hoehepunkt. Zu diesem Zeitpunt werden die Gene Neurogenin1 (Ngn1) und Ngn2 in den neuralen Vorlaeuferzellen der Ventrikularzone des dorsalen Cortexes in hohem Masse exprimiert. Wie aus Untersuchungen von unserm Labor gezeigt wurde, beguenstigt es die Entstehung von Neuronen und blockiert gleichzeitig Pro-Astrozyten-Einfluesse. Zum einen inhibiert Ngn den JAK/STAT Signalweg, dessen Aktivierung fuer die Gliogenese noetig ist, indem es die Phosphoylierung von STAT1/3 auf bisher noch unbekannte Weise blockiert. Ausserdem bindet der Transkriptions-Coaktivator cAMP-response element binding protein (CBP), welches auch von den STATs fuer die Transkription benoetigt wird, bevorzugt an Ngn sobald dieses von den Vorlaeuferzellen exprimiert wird. Mit dem Tag E16 nimmt die Neurogenese in vivo wieder stark ab und es setzt die Gliogenese ein, bei der zunaechst ueberwiegend Astrozyten gebildet werden. Faktoren wie leukemia inhibitory factor (LIF) sowie ciliary neurotrophic factor (CNTF) beguenstigen dabei die Astrozytogenese indem sie den JAK/STAT Signalweg aktivieren. Die Bindung von LIF/CNTF fuehrt zur Phosphorylierung von STAT-Transkriptionsfaktoren, die ihrerseits dann an den CBP/p300 Komplex binden und schliesslich die Expression von Astrozyten-spezifischen Genen aktivieren. Die STAT-Faktoren koennen aber erst nach Abfall des Ngn-Spiegels an den Transkriptions-Coaktivator binden, da sich die Bindungsstellen dieser beiden ueberlappen. Um die Hypothese zu ueberpruefen, dass LIF auch die Neurogenese, oder spezifischer, die Wirkung von Ngn positiv beeinflusst, wurden cortikale NPCs von murinen Embryos entnommen und der Wirkung von LIF via Luciferase Assay untersucht. Dabei wurden die Vorlaeuferzellen mit Ngn und einem Reporter transfiziert, welcher den NeuroD-Promoter beinhaltete. NeuroD-Expression findet in der Regel gegen Mitte/Ende der Neurogenese statt und ist wichtig fuer die Reifung von Neuronen. Der Promoter von NeuroD beinhaltet ein E-box Element, an welches Ngn bindet und die Transkription einleitet. Wie unsere ersten Versuche zeigten, verstaerkt LIF die Transkriptionsaktivitaet von Ngn und somit die Transkription von NeuroD. Wenn aber im selben Versuch ein NeuroD-Reporter transfiziert wurde, dessen E-box mutiert war, wurde keine Transkriptionsaktivitaet gemessen, was wiederum bestaetigte, dass der pro-neurale LIF-Effekt ueber Ngn lief und E-box-Bindung noetig war. Um den Einfluss des pro-neuralen Effekts von LIF auf Proteinebene zu testen, wurden NPCs mit Ngn-Adenovirus infiziert und mit LIF stimuliert. Dabei wurden die Zellen auf die Expression von Neuron-spezifischem class III β-tubulin (TuJ1) untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass LIF bei Zellen, die Ngn exprimierten, die Rate der Neuronen von etwa 5% auf etwa 50% anstiegen liess, waehrend LIF bezueglich der Gliogenese (gezeigt durch die Expression von GFAP) in Ngn-exprimierenden Vorlaeuferzellen kaum Wirkung zeigte. Als naechstes sollte untersucht werden ueber welchen Signalweg LIF Ngn aktivierte. LIF bindet zunaechst an LIF receptor β (LIFRβ), der dann an glycoprotein 130 (gp130) bindet. Diese Bindung fuehrt dann zur Aktivierung mehrerer Signalkaskaden: dem JAK/STAT, dem MAPK, dem Akt/PI3K und dem PLCγ/PKC Signalweg. Da der JAK/STAT Signalweg fuer die Gliogenese wichtig ist, lag unser Fokus auf den anderen Signalwegen. Deren Aktivierung wurde dann mit spezifischen Inhibitoren blockiert und, wie auch in den Vorversuchen, die Wirkung von LIF auf Transkriptionsebene (NeuroD) in neuralen Vorlaeuferzellen bestimmt. Dabei zeigte sich, dass die Blockierung des PLCγ/PKC Signalweges die NeuroD-Promoteraktivitaet am starksten inhibierte, waehrend auch LIF´s pro-neurale Wirkung verloren ging. Dementsprechend zeigte die Western Blot Analyse, dass die Expression von class III β-tubulin (TuJ1) durch die Anwendung der PKC Inhibitoren am staerksten inhibiert wurde, wobei auch hier die Stimulation durch LIF keine erhoehte Neurogenese mit sich zog. In weiteren Versuchen konnten wir dann mit Hilfe von Immunoprezipitation demonstrieren, dass LIF die Bindung von Ngn an CBP verstaerkte (eine Bindung, welche durch PKC Inhibitoren aufgehoben wurde), was wiederum zu einer erhoehten Bindung dieses Transkriptionskomplexes an den NeuroD Promoter fuehrte, wie unsere Chromatin Immunoprezipitation (ChIP) Daten beweisen. Dies wiederum laesst darauf schliessen, dass womoeglich diese erhoehte Ngn-CBP/NeuroD-Promoter Bindung der Grund fuer die erhoehte NeuroD-Transkriptionsaktivitaet ist daher auch fuer die erhoehte neuronale Differenzierung. Interessanterweise konnten wir auch zeigen, dass Brahma-related gene 1 (Brg1), eine katalytische Untereinheit des SWI/SWF Komplexes, an den Ngn/CBP cotranscriptionalen Komplex bindet und dass diese Bindung durch LIF-Stimulation verstaerkt wurde. Dies suggeriert wiederum, dass auch Brg1 eine wichtige Rolle waehrend der murinen, cortikalen Neurogenese spielt. Dennoch, in folgenden Experimenten verblieb der Fokus auf Ngn und CBP. Um unsere Hypothese zu bestaetigen, dass PKCδ ein moeglicher Mediator des LIF-Effekts sein koennte, zeigten wir zunaechst, dass die PKCδ-Expression in cortikalen NPCs waehrend der Neurogenese erhoeht ist. Desweiteren demonstrierten wir, dass die Inhibition von PKCδ einen aehnliche Wirkung zeigte wie die Inhibition von PKC mit einem generellen PKC Inhibitor: weder war nach PKCδ-Inhibition eine LIF-induzierte NeuroD-Transkription erzielbar, noch wurde nach LIF-Stimulation der pro-neurale Marker class III β-tubulin/TuJ1 in Ngn1-infizierten NPCs exprimiert. Um aber mehr spezifisch die PKC- und PKCδ-Aktivitaet/Expression zu blockieren transfizierten wir NPCs mit PLCγ oder PKCδ siRNA. Unsere Daten zeigten hierbei, dass siRNA-transfizierte Zellen kein class III β-tubulin mehr aufweisen, was darauf hindeuted, dass PKCδ der potentielle Mediator des pro-neuralen LIF-Effekts ist. Durch unsere in vivo Daten demonstrierten wir schliesslich, dass LIF auch hierbei fuer die Neurogenese von Bedeutung ist. Verglichen wurden die Cortices von E13 LIF Het (heterozygote) und KO (knock out) Maeusen mit denen von WT (wild type) Maeusen. Durch Immunohistologie von Hirnschnitten konnten dabei keine groesseren Unterschiede bezueglich der Expression neuraler Marker beobachtet werden, waehrend aber mit Hilfe der Western Blot Analyse, eine quantitativere Methode, gezeigt wurde, dass LIF Het und KO Maeuse weniger pro-neurale Marker im Cortex exprimieren wie WT Mause. Um auch zu beweisen, dass dies auf eine verringerte Transkription von NeuroD zurueckzufuehren ist, demonstrierten wir mit Hilfe des ChIP Assay, dass LIF Het und KO Maeuse weniger Ngn1-CBP Bindung an den NeuroD-Promoter aufweisen wie WT Maeuse. Diese Experimente veranschaulichen einen eleganten Regulationsmechanismus, durch welchen ein einzelner, extrazellulaerer Faktor die unterschiedliche Differenzierung einer Zelle verstaerkt, abhaengig von der Anwesenheit oder Abwesenheit eines einzelnenn intrazellulaeren Faktors. Auch koennen durch die erlangten Resultate Strategien entworfen werden, durch die in Zukunft die Produktion bestimmter Neurone zur Heilung von verschiedenen, neurodegenerativen Krankheiten erhoeht wird.
Starke allergische Reaktionen gegen nicht spezifische Lipidtransfer Proteine sind im Mediterranen Raum weit verbreitet. LTPs besitzen als Klasse 1 Nahrungsmittelallergene vermutlich die Fähigkeit über den oralen Weg, durch den Verzehr von Nahrung, eine Sensibilisierung auszulösen. Zu Beginn dieser Arbeit wurde jedoch in der Literatur die Möglichkeit diskutiert, ob auch bei einer LTP-Sensibilisierung eine Pollen-assozierte Nahrungsmittelallergie vorliegen könnte. Untersuchungen zur IgE-Bindungskapazität von Lebensmittel- und Pollen-LTPs zeigten partielle Kreuzreaktivitäten. Eine Aussage über eine einheitliche Tendenz zur stärkeren IgE-Bindungskapazität konnte anhand der derzeitigen Ergebnisse weder für die Lebensmittel- noch für die Pollen-LTP-Gruppe getroffen werden. Dementsprechend lag kein eindeutiger Hinweis zur Korrelation zwischen der Sensibilisierung gegen Pollen- und Nahrungsmittel-LTPs vor, wodurch die Frage zur Fähigkeit der einzelnen LTPs kausal eine Allergie auszulösen weiterhin offen bleibt. Die Untersuchungen dieser Arbeit fokussierten sich auf die Lebensmittelallergene und sollten ihre klinische Bedeutung analysieren und Aufschluss über die Fähigkeit dieser Allergene eine Allergie kausal auszulösen bringen. Hierbei sollte untersucht werden, ob jedes Nahrungsmittel-LTP die Fähigkeit besitzt eine IgE-Sensibilisierung auszulösen oder ob ein LTP als primär sensibilisierendes Agens wirkt und nachfolgend immunologische Kreuzreaktionen zu anderen LTPs auftreten. Aufgrund der großen Häufigkeit von Patienten mit einer Pfirsichallergie im mediterranen Raum mit einer Sensibilisierung gegen das Pfirsich-LTP (Pru p 3), sowie einer schweren Symptomatik, wird vermutet, dass dieses Allergen eine wichtige Rolle spielt und eventuell als primär sensibilisierendes Agens fungieren könnte. Zur Identifizierung eines primär sensibilisierenden Agens sollte das Ausmaß der Antikörper-Kreuzreaktivität, die Aufschluss über die Affinität und Vorkommen gemeinsamer Epitope liefern soll, untersucht werden. Weiterhin sollte die IgE-Prävalenz der einzelnen Allergene, ihre Immunogenität (T-Zell-Kreuzreaktivität und in vivo Antikörperinduktion) und die biologische Potenz untersucht werden. Um der Fragestellung nachzugehen wurden die LTPs aus taxonomisch verwandten (Kirsche, Pru av 3 und Pfirsich, Pru p 3) und nicht verwandten (Haselnuss, Cor a 8 und Salat, Lac s 1) Lebensmitteln in die Studie einbezogen. Für die Untersuchungen standen 51 Seren von spanischen Lebensmittelallergikern zur Verfügung, deren Allergien gegen Pfirsich, Salat, Haselnuss und Kirsche anamnestisch und serologisch erfasst wurden. Die Relevanz der LTPs wurde durch die Schwere der klinischen Symptomatik deutlich. LTPs besitzen eine hohe Stabilität gegenüber thermischer und proteolytischer Prozessierung. Natürliches Pru p 3 zeigte bei einer Erhitzung auf 90°C zum größten Teil eine intakte Sekundärstruktur. Diese Eigenschaften könnten die Aufnahme von intakten Allergenen im gastrointestinalen Trakt begünstigen, wodurch die teilweise starken allergischen Reaktionen erklärt werden können. Bei der Untersuchung zur Relevanz von Pru p 3 im Vergleich zu Lac s 1, Cor a 8 und Pru av 3 wurde die IgE-Prävalenz, IgE-Bindekapazität, IgE-Kreuzreaktivität und biologische Potenz untersucht. Spezifisches IgE gegen Lac s 1 (93%), Pru p 3 (90%), Cor a 8 (88%) und Pru av 3 (85%) wurde mittels ImmunoCAP-FEIA in der jeweiligen Lebensmittelallergikergruppe gefunden und quantitativ bestimmt. Alle untersuchten Lebensmittel-LTPs erwiesen sich als Hauptallergene in der jeweiligen Patientengruppe. Bei Untersuchungen der IgE-Bindekapazität zeigten alle untersuchten Patienten, mit Ausnahme von einem, eine stärkere IgE-Bindungen gegen Pru p 3 im Vergleich zu Cor a 8. Demnach korreliert eine IgE-Sensibilisierung gegen Cor a 8 mit der gegen Pru p 3. Lac s 1 zeigte in einigen Fällen eine stärkere IgE-Bindung im Vergleich zu Pru p 3 und umgekehrt. Mit Ausnahme eines Patienten war eine IgE-Sensibilisierung gegen Lac s 1 immer mit der gegen Pru p 3 assoziiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in Einzelfällen spezies-spezifische Epitope beobachtet wurden, während IgE-Reaktivitäten gegen LTPs, die nicht zu der Familie der Rosengewächse gehören, in seltenen Fällen ohne eine begleitende Sensibilisierung gegen Pru p 3 auftraten. Die IgE-Bindung an Pru p 3 konnte durch Cor a 8 und Lac s 1 maximal bis 60% inhibiert werden, während Pru p 3 eine komplette Inhibition der Cor a 8 und Lac s 1 IgE-Bindung bewirkte. Demnach besitzt Pru p 3 alle IgE-Epitope von Lac s 1 und Cor a 8 und/oder eine stärkere Affinität zu den IgE-Antikörpern. Cor a 8 zeigte, trotz der Fähigkeit schwere Symptome auszulösen, eine relativ geringe biologische Potenz. Lediglich bei einem von fünf untersuchten Patienten zeigte Lac s 1 eine starke maximale Histaminfreisetzung. Pru p 3 und Pru av 3 zeigten die stärkste biologische Potenz bei allen untersuchten Pfirsichallergikern. Ein Salatallergiker ohne Pfirsichallergie zeigte durch die Stimulation mit Pru p 3 eine geringe Mediatorfreisetzung, wodurch dem Allergen Pru p 3 in Einzelfällen ohne klinische Symptomatik gegen das Allergen nicht zwangsläufig die stärkste biologische Potenz zugeschrieben werden kann. Pru p 3 und Pru av 3 zeigten aufgrund einer hohen Sequenzidentität von 85% nahezu identische IgE-Bindekapazitäten, IgE-Kreuzreaktivitäten, sowie eine ähnliche biologische Potenz. Eine Kreuzreaktivität auf T-Zell-Ebene wurde ebenfalls zwischen Pru p 3 und Pru av 3 detektiert, während im murinen System mittels RBL-2H3-Mediatorfreisetzungstest keine Kreuzreaktivität unter allen untersuchten Lebensmittel-LTPs nachweisbar war. Fehlende T-Zell-Kreuzreaktivitäten zwischen Pru p 3/Cor a 8 und Pru p 3/Lac s 1 deuten auf unterschiedliche T-Zell-Epitope der untersuchten Proteine hin. Um eine generelle Aussage über die T-Zell-Kreuzreaktivität treffen zu können, wären weitere systematische T-Zell-Proliferationsstudien erforderlich. Die erhaltenen Ergebnisse verdeutlichen, dass dem Allergen Pru p 3 hinsichtlich IgE-Prävalenz, IgE-Bindekapazität, IgE-Kreuzreaktivität im Inhibitions-ELISA und der biologischen Potenz im Mediatorfreisetzungstest die bedeutendste Rolle unter den untersuchten LTPs zukommt. In Einzelfällen konnten jedoch spezies-spezifische Epitope nachgewiesen werden, wodurch die Annahme verstärkt wird, dass Pru p 3 nicht das alleinige Immunogen sein kann. Weiterhin waren alle untersuchten LTPs im murinen System immunogen, wodurch die Annahme verstärkt wird, dass jedes untersuchte LTP eine Allergie kausal auslösen kann. Unterstützt wird diese Vermutung durch die fehlende Kreuzreaktivtität der murinen IgE-Antikörper. Eine eindeutige Aussage kann aufgrund der erhaltenen Ergebnisse derzeit noch nicht getroffen werden, da weitere systematische T-Zell-Proliferationsstudien und Inhibitions-ELISA der Maus-Immunsera in dieser Arbeit nicht mehr durchgeführt werden konnten.
Es wird ein effektives Modell zur Berücksichtigung einer Minimalen Länge in der Quantenfeldtheorie vorgestellt. Im Falle der Existenz Großer Extradimensionen kann dies zu überprüfbaren Modifikationen verschiedener Experimente führen. Es werden verschiedene Phänomene wie z.B. der Casimir-Effekt, Neutrino-Nukleon-Reaktionen oder Neutrinooszillationen diskutiert.
Humane hämatopoetische Stammzellen (HSCs) besitzen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und übernehmen die kontinuierliche Neubildung aller zellulären Bestandteile des Blutes. Aufgrund der zunehmenden klinischen Bedeutung der HSCs ist es essentiell die molekularen Mechanismen, die den Prozess der Vermehrung und Differenzierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen steuern, aufzuklären und deren funktionelle Bedeutung zu verstehen. Das Ziel der Arbeit war die Identifizierung, Charakterisierung und gerichtete Modulation funktionell relevanter Signalwege, die am Differenzierungsprozess von HSCs zu myeloiden Effektorzellen beteiligt sind. Für diese Untersuchung wurde ein Expansionsprotokoll für humane HSCs, sowie ein Differenzierungsprotokoll für das humane myeloide DC Differenzierungsmodell entwickelt. In der Arbeit wurden drei wichtige Signalwege der Zelle, die Mitogenen Signalkaskade (MAPK), Protein Kinase C (PKC) gekoppelten Prozessen und dem JAK/STAT Signalweg untersucht. Die vorliegende Arbeit zeigt, daß die Stimulation der HSCs mit GM-CSF und IL-4 zu einer zeitlich begrenzten Aktivierung von MAPK/ERK1/2, PKC delta, JAK2, sowie STAT5 und STAT6 führte. Kommerzielle Inhibitoren von MEK, PKC und Januskinase hemmten selektiv diese Aktivierung und führten zu einer veränderten Hämatopoese. Die Aktivierung dieser Signalwege ist daher für die myeloide Differenzierung von HSCs zu Dendritischen Zellen von entscheidender Bedeutung. Einer der entscheidenden nuklearen Faktoren für die myeloide Differenzierung ist der Ets-Transkriptionsfaktor PU.1, dessen Aktivität durch Phosphorylierung reguliert sein könnte. Obwohl die funktionelle Rolle von PU.1 in der Differenzierung von HSC in der vorliegenden Arbeit nicht vollständig geklärt werden konnte, wurde jedoch erstmals im in vitro Kinase-Assay gezeigt, daß PU.1 durch PKC delta, aber nicht durch MAPK/ERK2 spezifisch phosphoryliert wird. In einem PU.1-spezifischen Luciferasereporter-Assay wurde die transkriptionelle Aktivität von PU.1 durch die Inhibition von PKC delta und MAPK/ERK1/2 deutlich reduziert. Weiterführende Experimente in einem komplexen Differenzierungsmodell von humanen HSCs wiesen darauf hin, daß durch den gezielten Einsatz von Signalweginhibitoren eine Verschiebung der Verhältnisse der gebildeten Blutzellkolonieformen erreicht werden kann. So war die Differenzierung zu Erythrozyten von der Mitogenen Signalkaskade unabhängig, wohingegen die Differenzierung zu Makrophagen eine deutliche Abhängigkeit von der Aktivität der Mitogenen Signalkaskade sowie von der Aktivierung des Protein Kinase C Signalwegs zeigte. Im Gegensatz dazu führte die Inhibition der Januskinasen (JAKs) zu einer Hemmung der Differenzierung in allen Kolonieformen. Insgesamt zeigten die Ergebnisse, daß der MAPK/ERK und PKC delta Signalweg bei der Differenzierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen eine wichtige Rolle spielen und eine gerichtete Steuerung der Differenzierung durch den Einsatz spezifischer Signalweginhibitoren möglich erscheint.
In this thesis the three dimensional solution strucutre of the RbfA protein from Thermotoga maritima was solved using multidimensional heteronuclear NMR spectroscopy. The RbfA protein binds to the helix I region of the 16S rRNA. To gain insights into the binding mode of RbfA to its target, a second RbfA construct from Helicobacter pylori was used. Comparison of the RbfA proteins with the published structure of RbfA from Escherichia coli, led to studies concerning the differences between proteins from thermophile and mesophile systems. In the second part of this thesis the native binding motive of the RbfA protein was identified. The RbfA protein binds to an alternate helix fold within the pre-sequence of the immature 16S rRNA.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Dosierungsgenauigkeit aller jeweils zum Zeitpunkt der Studie am Markt befindlichen Amoxicillin-, Erythromycin und aller Clarithromycintrockensäfte mit der Dosierung 125 mg/ml untersucht. Die Studie zur Dosierungsgenauigkeit und sicheren Handhabung von Amoxicillintrockensäften umfasste weiterhin die Untersuchungen möglicher Herstellungsfehler, der Stabilität über die Laufzeit, die Untersuchung des Sedimentationsverhaltens von Saftpräparaten sowie eine Umfrage in der Patientengruppe. In den drei Studien zur Dosierungsgenauigkeit von Antibiotikatrockensäften lieferten die einzelnen Dosierhilfsmittel sehr unterschiedliche Ergebnisse. Die größten Dosierungsungenauigkeiten wurden mit Dosierlöffeln erzielt. Sowohl bei der Untersuchung von Amoxicillintrockensäften als auch bei Erythromycinpräparaten wichen Dosierungen mit der Viertel- und Halbmesslöffelmarkierung sehr stark vom definierten Wirkstoffgehalt ab. Übereinstimmend war in beiden Gruppen die Dosierungsabweichung nach Ganzlöffeldosierung am geringsten. Die in der Arbeit dargestellten Ergebnisse belegen, dass die Dosierungsgenauigkeit bei der Applikation von Suspensionen mit Dosierlöffeln im Wesentlichen von zwei Faktoren abhängt. Der erste Parameter ist die Grundfläche der Dosierhilfe. Bei breiten bzw. großen eher flachen Löffeln kommt es zu gravierenden Überdosierungen, vor allem bei den kleinen Einheiten ¼- bzw. ½ Löffel. Da die Amoxicillinpräparate mehrheitlich mit solchen breiten, flachen Löffeln, die Erythromycinpräparate hingegen überwiegend mit kleineren kompakteren Dosierlöffeln ausgestattet sind, waren die Ergebnisse der Untersuchung von Amoxicillintrockensäften im Durchschnitt deutlich schlechter. Der zweite wichtige Parameter für die Dosierungsgenauigkeit ist die Saftkonsistenz. Bei hochviskosen Zubereitungen bildet sich beim Dosieren durch die Kohäsionskraft ein deutlicher Überschuss auf dem Löffel. Bei feuchter Löffeloberfläche ist dieser Überschuss weniger stark ausgeprägt. Tatsächlich sind natürlich bei der alltäglichen Anwendung Dosen üblich, die ein Mehrfachbefüllen des Löffels nicht erforderlich machen, das heißt der Patient dosiert in der Regel auf einen trocken Löffel und damit klar über. Aufgrund dieser Oberflächenphänomene war auch bei kleineren, kompakteren Löffeln keine völlig genaue Dosierung möglich. In der Untersuchung an den Amoxicillinpräparaten erwies sich der Messbecher gegenüber den graduierten Löffeln von großem Vorteil. Zum einen ermöglichen Messbecher eine genauere Dosierung (geringere Schwankungen der Arzneimittelmenge um den Sollwert), weiterhin sind sie in der Praxis standfester; der abgebende Apotheker kann das verordnete Volumen überdies mit wasserfestem Stift oder Klebeband markieren. Dies kann vor allem für fremdsprachige oder sehbehinderte Patienten sehr hilfreich sein. Beim Dosieren mit Messbechern besteht allerdings vor allem bei höher viskosen Flüssigkeiten die Gefahr der Unterdosierung. Dies ist darauf zurückzuführen, dass sich die Skalen auf die eingegossene und nicht auf die ausgegossene Flüssigkeitsmenge beziehen. Nach den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit waren die Dosierspritzen mit Abstand die genauesten Dosierhilfen. Die Wirkstoffwiederfindung bei der Untersuchung von Clarithromycintrockensäften schwankte auf sämtlichen Dosierniveaus nur um wenige Prozent. Das Applizieren mit Hilfe einer Dosierspritze ist nicht nur wegen der sehr genauen Dosierbarkeit besonders anwenderfreundlich, sondern die Suspension wird darüber hinaus durch das Kopfüberdosieren gleichzeitig redispergiert. Außerdem kann der Saft, wenn sich der Patient in aufrechter Körperhaltung befindet, aus der Spritze direkt an der Innenseite der Wange entleert werden. Damit kann ein Würge- oder Hustenreiz unterdrückt sowie das sofortige Wiederausspucken bei Kleinkindern unterbunden werden. Besonders erwähnenswert sind Dosierspritzen, die neben einer Volumenskalierung alternativ oder teilweise zusätzlich in kg Körpergewicht graduiert sind. Dies sorgt für zusätzliche Anwendungssicherheit. In letzter Zeit ist zu beobachten, dass die Empfehlung Dosierspritzen zu verwenden, die erstmals bereits in den 70 iger Jahren von der American Academy of Pediatrics ausgesprochen wurde, auch in Deutschland umgesetzt wird. Vor allem Generika, die momentan am Markt platziert werden, verfügen über Dosierspritzen bzw. beides; Dosierspritze und –löffel. Die Studie zu Amoxicillinpräparaten beinhaltete weitere wichtige Parameter, die für die Anwenderfreundlichkeit und die sichere Handhabung dieser Arzneiform Relevanz besitzen. Wie die in den jeweiligen Kapiteln dokumentierten Ergebnisse belegen, sind Trockensäfte Präparate, die bei Abgabe in der Apotheke einer ausführlichen Beratung bedürfen. So zeigten die Versuche zur Bestimmung des korrekten Auffüllvolumens, dass die von Herstellern angegebenen zuzusetzenden Wassermengen nicht unkritisch übernommen werden dürfen. Der Anwender sollte auch bei vorgegebenem Volumen den Saft in zwei bis drei Schritten sukzessive auffüllen und den Stand des Flüssigkeitspegels nach Schaumabsetzen beachten. Ebenso wichtig wie dieser Hinweis ist der Rat, den Saft vor jeder Anwendung sorgfältig zu schütteln. Die Untersuchungen zum Sedimentationsverhalten zeigten auch bei scheinbar stabilen Zubereitungen nach spätestens 24 Stunden eine deutliche Wirkstoffsedimentation. In der Beratung nicht fehlen, darf weiterhin der Hinweis zur korrekten Aufbewahrung der Suspensionen. Clavulansäurehaltige Amoxicillinkombinationspräparate müssen wegen der Thermolabilität des beta-Laktamaseinhibitors zwingend im Kühlschrank gelagert werden. Nach nur 7-tägiger unsachgemäßer Aufbewahrung bei Raumtemperatur war bei der Untersuchung zur in-use Stabilität eine drastische Degradierung der Clavulansäure um ganze 66,3 % zu verzeichnen. Im Gegensatz zu den clavulansäurehaltigen Trockensäften dürfen Clarithromyinsäfte wiederum nicht im Kühlschrank aufbewahrt werden. Bei diesen Präparaten droht bei Temperaturen zwischen 5 – 8 °C die Auskristallisierung des Wirkstoffes und damit die Zerstörung der galenischen Formulierung. Der dadurch hervortretende stark bittere Geschmack ist für Säuglinge und Kleinkinder intolerabel. Neben der oben angesprochenen Umstellung von Dosierlöffeln auf Dosierspritzen gibt es weitere Entwicklungen, die einige der eben hier aufgezeigten Probleme lösen. ....
Nicotinic acid has been used in the clinical treatment of elevated blood lipid levels for over 50 years. Although it has a beneficial effect on myocardial infarction and blood lipid profiles, its widespread use has been hampered by side effects such as skin rashes and a burning sensation on the upper body. Since elevated blood lipid levels, especially ones of VLDL and LDL cholesterol are a frequent indication and high risk factor for coronary and cardiac diseases, finding a compound with an enhanced pharmacological profile, still holding the desired effects, but without inconvenient side effects, is a very appealing aim to many pharmaceutical companies. These efforts have already produced two marketed drugs, Acipimox and Acifran, but they have not been able to overcome the restrictions already imposed on the treatment by nicotinic acid. Although proposed long before, in the year 2000 the gene for the nicotinic acid receptor in mouse PUMA-G was cloned, and in 2003 the discovery of the genes HM74 and HM74A followed, which comprise the homologous low and high affinity receptors for nicotinic acid in humans. The discovery of this G Protein-coupled receptor target allowed a more directed approach for the search of alternative compounds. This work is the first report of the heterologous overexpression of the high affinity GPCR gene HM74A in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The protein product, NAR1, was pharmacologically characterized, and displayed a binding affinity of 224.8 nM to its ligand nicotinic acid, showing a similar activity profile compared to those displayed in human tissue, which were determined to be 60 nM to 90 nM. Additionally, inhibitory constants (Ki) for Acifran and Acipimox were determined to be 4.5 µM and 50.5 µM, respectively. Furthermore, the total yield of NAR1 reached 42 pmol/mg membrane protein, which corresponds to 0.4 mg of receptor produced per liter yeast culture, opening up the perspective of large scale protein production to facilitate high throughput screening drug discovery efforts and structural studies. In addition, NAR1 could be solubilized in n-decyl-β-D-maltopyranoside and purified to homogeneity after immobilized metal affinity chromatography and a second affinity chromatography step on immobilized monomeric avidin, yielding a single peak on gel filtration, while the purified receptor was able to bind ligand, as shown in NMR Saturation Transfer Difference (STD) measurements. It could be shown that NAR1 is desensitized by β-arrestin 1 in vivo in confocal microscopy studies on HEK and BHK cells. This finding provides a native binding partner for the stabilization of the receptor upon solubilization and purification. Finally human β-arrestin 1 could be produced as a constitutively active variant, comprising residues 1-382 in Pichia pastoris and Escherichia coli. The purified protein was used for in vitro binding experiments and shown to be capable of interacting with NAR1. Although the interaction and formation of the complex was only possible to a limited extent, it leaves open the perspective of crystallizing NAR1 in its active conformation, bound to nicotinic acid and β-arrestin 1.
Untersuchungen zur molekularen Kontrolle der Kupferhomöostase in dem Ascomyceten Podospora anserina
(2007)
Das essentielle Spurenelement Kupfer ist Co-Faktor mehrerer Schlüsselenzyme (z B. Cu/Zn-SOD, Cytochrom c Oxidase). Da Kupfer leicht Elektronen aufnehmen und abgeben kann, eignet es sich besonders gut für Redox-Reaktionen. Wenn Kupfer jedoch mit Sauerstoff reagiert, entstehen hoch cytotoxische reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die nach der „freien Radikaltheorie des Alterns“ (nach D. Harman 1956) ursächlich für Alterung und Zelltod sind. Um deren Bildung zu vermeiden, erfolgen alle Aspekte des Kupferstoffwechsels – Aufnahme, Transport und Speicherung - stets proteingebunden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich bis auf drei Ausnahmen die gesamte bislang bekannte Maschinerie der molekularen Kupferhomöostase aus anderen Modellorganismen (z.B. S. cerevisiae oder H. sapiens) auch im Genom des Ascomyceten Podospora anserina mit Homologen bzw. Orthologen wiederfindet. Die drei Ausnahmen betreffen jeweils Proteine, für die in anderen Organismen mehrere Isoformen existieren und P. anserina nur jeweils ein Homolog/Ortholog besitzt. Für mehrere der neu vorhergesagten Gene (PaAtx1, PaCcc2, PaCcs1, PaCox11, PaCox19, PaCox23, PaSco1) konnte eine Expression im Wildstamm nachgewiesen werden. Dazu wurden Standardtechniken (Northern Blot Analyse, RT-PCR) und auch neu etablierte eGFP-Reporterkonstrukte verwendet. In Podospora anserina scheint Kupfer auf zwei verschiedene Arten Einfluss auf die Lebensspanne zu nehmen: Zum einen mittelbar darüber, dass die Verfügbarkeit von Kupfer über die in der mitochondrialen Atmung verwendete Endoxidase entscheidet. Bei Kupfermangel wird eine Eisen-abhängige alternative Oxidase (AOX) induziert. Durch Atmung über die AOX entstehen weniger ROS, was die Lebensspanne verlängert. Anhand einer Vielzahl langlebiger Mutanten konnte dieser Zusammenhang bereits mehrfach demonstriert werden. Zum anderen scheint Kupfer auch eine unmittelbare Rolle in der Seneszenz von P. anserina zu spielen. In früheren Arbeiten konnten mehrere indirekte Hinweise (Transkript- und Aktivitätsanalysen) gesammelt werden, dass im Alter die cytoplasmatische Kupferkonzentration drastisch ansteigt. Durch Messung der Kupferkonzentration mittels einer direkten chemisch-analytische Methode (TXRF) in fraktionierten Zellbestandteilen (Cytoplasma und Mitchondrien) konnten in dieser Arbeit diese Hinweise weiter untermauert werden. Experimente mit in die mitochondriale Matrix geleitetem eGFP brachten zusätzliche Indizien dafür, dass das mitochondriale Kupfer-Reservoir die Quelle des sich in seneszenten Pilzstämmen im Cytoplasma wiederfindenden Kupfers ist. Durch einen Prozess, der größenabhängig reguliert und in anderen Organismen als „Mitochondrial Permeability Transition – MPT“ zu Beginn der Apoptose bekannt ist, ergiesst sich beim Eintritt in die Seneszenz der Inhalt der mitochondrialen Matrix in das Cytosol. Die Bedeutung dieses Vorgangs und v.a. die Folgen der Umverteilung von Kupfer innerhalb der Zelle bleiben im Detail weiter zu klären. Durch die durchgeführten Arbeiten konnte ein weiterer deutlicher Beweis für das Ablaufen apoptotischer Mechansimen im Alterungsprozeß des Ascomyceten P. anserina erbracht werden.
In einer prospektiven Studie wurden in der neonatologischen Abteilung der Universitätskinderklinik Frankfurt am Main zwischen 1996 und 1999 26 Frühgeborene mit einem Geburtsgewicht unter 2000g, die mit einem NAK versorgt waren hinsichtlich der Auswirkung auf die Nieren, der Nierengröße und des Wachstums, sowie der sonstigen Komplikationen untersucht und nachbeobachtet. Weitere 37 Neugeborene, die im gleichen Zeitraum geboren wurden und keinen NAK erhielten, wurden in die Kontrollgruppe aufgenommen, um einen statistischen Zusammenhang zwischen NAK und der Veränderung der Nierengröße festzustellen. Auch die Komplikationen das NAK wurden erfasst und statistisch ausgewertet. Die Nieren wurden mittels Sonographie bezüglich der Größe, der Morphologie und der Volumina kurz nach der Geburt und nach 1 bis 2 Monaten untersucht. Es wurden die Retentionswerte, die arteriellen Mitteldrücke in gleichen Abständen und die Gerinnungswerte am 2. Lebenstag, sowie die Verweildauer des NAK in der Experimentalgruppe ermittelt und verglichen. Die Medikation und die demographischen Daten wurden ebenfalls berücksichtigt. Die Nierenvolumina waren in der Experimentalgruppe anfänglich signifikant kleiner, wobei dieser Unterschied sich im Sinne eines Aufholwachstums der bezüglich des Gestationsalters unreiferen Kinder in diesem Kollektiv bei der Zweituntersuchung nicht mehr nachweisen lies. Somit konnte in unserem Kollektiv kein Zusammenhang zwischen der Behandlung mit einem NAK und der Nierengröße, d.h. des Nierenwachstums nachgewiesen werden. Elf Kinder in der Kontrollgruppe wiesen eine Stagnation des Wachstums mindestens einer Niere auf, bei 9 Kindern der linken Niere. Bei dreien dieser Kinder wurde in einer Drittuntersuchung ein vermehrtes Wachstum im Sinne eines Aufholwachstums nachgewiesen. Einer dieser Patienten mit Stagnation des Nierenwachtumes der linken Niere zeigte passager hypertensive Blutdrücke, ohne dass hierfür fassbare Gründe zu eruieren waren. Die Nierenvolumina der Kinder, die an hypertensiven Blutdrücken in der Kathetergruppe litten, waren bei der Zweituntersuchung signifikant größer in der Experimentalgruppe als bei den Kindern in der Kontrollgruppe. Dies lag an den Nierenvolumina des niereninsuffizienten Patienten der größere Nierenvolumina als die anderen Patienten aufwies. Bei dem anderen Kind in der Experimentalgruppe, welches durch hypertensive Blutdrücke und einen Verschluss der Arteria renalis auffiel, am ehesten NAK induziert, waren die Nierenvolumina im Vergleich unauffällig. Dies ist bedingt durch die sofortige und erfolgreiche Lysetherapie. Insgesamt zeigt sich durch den NAK nach unserer Ansicht kein Einfluss auf die Nierengröße im Sinne der Entwicklung einer Schrumpfniere bei den Patienten die mit passager hypertensiven Blutdrücken auffällig wurden. Die Nierenvolumina des Patienten mit Aortenthrombose waren bei Erst- und bei Zweituntersuchung normalgroß, so dass hier kein Einfluss des NAK auf das Nierenwachstum. Die an einer Sepsis erkrankten Kinder waren im Vergleich hinsichtlich der Inzidenz zwischen der Experimental- und Kontrollgruppe nicht verschieden. Der NAK stellt somit kein Risko für eine Sepsis in unserem Studienkollektiv dar. Die Kreatininwerte waren zwischen Experimental- und Kontrollgruppe statistisch nicht verschieden, so dass ein Einfluss des NAK auf die Kreatininwerte nicht zu ermitteln war. Die Patienten mit hypertensiven Blutdrücken (Verschluss der A.renalis und Niereninsuffizienz) zeigten im Vergleich mit den übrigen Patienten erhöhte, nicht jedoch pathologische Kreatininwerte. Die Kreatininwerte bei dem Patienten mit Niereninsuffizienz bei Erst- und Zweituntersuchung höher als bei den übrigen Patienten als Folge der Niereninsuffizienz. Der Patient mit der Thrombose der A. renalis wies erhöhte Kreatininwerte nur im Rahmen der Zweituntersuchung auf. Ein Einfluss des NAK auf die Kreatininwerte und somit auf die Nierenfunktion ist im Einzellfall der Thrombose der A. renalis wahrscheinlich. Es zeigen sich jedoch keine pathologisch erhöhten Kreatininwerte. Die arteriellen Mitteldrücke waren initial in der Experimentalgruppe signifikant niedriger als in der Kontrollgruppe. Ein Unterschied der sich bis zur Zweituntersuchung normalisiert hatte und als Folge des geringeren Gestationsalters und des geringeren Gewichtes zu sehen ist, so dass sich die Blutdrücke wie auch das Gewicht bis zur Zweituntersuchung angleichen konnten. Statistisch zeigt sich kein Zusammenhang zwischen NAK und erhöhten MADWerten. Die Verweildauer des NAK in der Experimentalgruppe lag zwischen 2 und 19 Tagen bei einem Mittelwert mit 8,81 Tagen +/- 3,77 Tagen. Die Fibrinogenwerte, gleich wie die AT III- Werte am 2. Lebenstag waren in der Experimental- und Kontrollgruppe nicht signifikant verschieden. Gleiches konnte auch bei dem Patienten der einen Aortenthrombus aufwies gezeigt werden. Die AT III- Spiegel waren insgesamt, wie oben erwähnt statistisch nicht auffällig, dennoch wies der Patient der einen Nierenarterienverschluss erlitt den niedrigsten AT III- Spiegel im gesamten Kollektiv auf. Patienten mit arterieller Hypertonie waren in der Kontroll- und der Experimentalgruppe jeweils zwei zu finden. Somit zeigte sich in unserem Kollektiv keine Signifikanz hinsichtlich des Auftretens der arteriellen Hypertonie. Die Genese der erhöhten RR- Werte war in der Experimentalgruppe bei dem Patienten mit dem Verschluss der A. renalis am ehesten NAK induziert. Ein Aortenthrombus konnte zu diesem Zeitpunkt nicht mehr nachgewiesen werden. Bei dem Patienten mit der Niereinsuffizienz spielte der NAK wenn überhaupt nur eine untergeordnete Rolle. Es handelt sich in unserem Studienkollektiv um einen Einzellfall der NAK- induzierten arteriellen Hypertonie, die durch gutes Management und rasche Therapie nur von passagerer Natur war. Ein Patient im Gesamtkollektiv, welcher in die Experimentalgruppe aufgenommen worden war, zeigte einen asymptomatischen Aortenthrombus infolge der Behandlung mit dem NAK. Bei einem Kind in der Experimentalgruppe entwickelte sich eine passagere Niereninsuffizienz im Rahmen eines Multiorganversagens aufgrund einer Rhesusinkompatibilität und einer Sepsis. Dieser Patient wies im Verlauf erhöhte Blutdrücke auf. Ein direkter Zusammenhang mit der Versorgung durch einen NAK konnte wie oben erwähnt, nicht nachgewiesen werden. Ob die hämodynamischen Veränderungen hierbei eine zusätzliche Rolle spielen ist unwahrscheinlich. Das Auftreten einer Sepsis war zwischen Kontroll- und Experimentalgruppe nicht signifikant verschieden. In beiden Kollektiven fanden sich 15 kleine Patienten, die an einer Sepsis erkrankten, so dass in unserem Kollektiv kein Zusammenhang zwischen dem Auftreten einer Sepsis und der Versorgung mit einem NAK aufgezeigt werden konnte. An einer NEC erkrankten 12 Kinder im Gesamtkollektiv. Sieben derer waren in der Experimentalgruppe, wobei sich keine Signifikanz hinsichtlich der Häufigkeit nachweisen lies. Es konnte kein Zusammenhang zwischen der Versorgung mit einem NAK und dem Auftreten einer NEC gesehen werden. Auch was den Verlauf der NEC betrifft fand sich zwischen den Kindern mit und ohne NAK kein Unterschied betreffend der Notwendigkeit des konservativen oder chirurgischen Managements. Insgesamt stellt das Monitoring der arteriellen Blutgase unter Beatmung bei Frühgeborenen die vor der 30 SSW geboren wurden bei sorgfältiger Indikationsstellung und entsprechender Handhabung ein sicheres Verfahren zur besseren Behandlung der Patienten dar, wenn eine kritische Evaluation hinsichtlich der möglichen Komplikationen, insbesondere zur Vermeidung von dauerhaften Schäden erfolgt.
Mit dieser Studie sollten phänomenologische Aspekte von Kindern und Jugendlichen mit einer Zwangskrankheit untersucht werden. Die Inanspruchnahmepopulation setzte sich aus den Kindern und Jugendlichen zusammen, die in den letzten zehn Jahren in der Klinik für Psychiatrie und Psychotherapie des Kindes- und Jugendalters des Universitätsklinikums Frankfurt/Main sowohl ambulant als auch stationär behandelt wurden. Ziel dieser retrospektiven Verlaufsstudie war insbesondere die Untersuchung der Phänomenologie der Zwangssymptomatik und deren Begleiterkrankungen, der sozialen Integration und der Therapie. Des weiteren sollte überprüft werden, ob es Prädiktoren für den Verlauf der Zwangsstörung gibt. 49 ehemalige Patienten, die in den zehn Jahren vor dem November 2000 an der Klinik für Psychiatrie und Psychotherapie des Kindes- und Jugendalters des Universitätsklinikums Frankfurt/Main aufgrund der Erstdiagnose Zwangskrankheit behandelt wurden, erfüllten die Einschlußkriterien. 29 Patienten, 21 männliche und acht weibliche, konnten dazu bewogen werden, an der Studie teilzunehmen. Bei Beginn der Zwangsstörung waren die Patienten der Stichprobe durchschnittlich 11,8 Jahre alt, bei Erstbehandlung 12,9 Jahre. Bei Katamnese betrug das mittlere Alter 19,7 Jahre, die Kinder und Jugendliche wurden durchschnittlich nach einem Katamnesezeitraum von 5,5 Jahren nachuntersucht. Zur Beschreibung der Stichprobe wurden die Krankenakten inklusive der für die vorliegende Arbeit relevanten Bestandteile der Basisdokumentation ausgewertet, es wurden telephonische Interviews geführt. Um eine Vergleichbarkeit mit anderen Studien zu ermöglichen, wurden standardisierte Untersuchungsverfahren und Diagnoseschemata bei der Untersuchung eingesetzt (Yale-Brown Obsessive- Compulsive Scale; Child Behavior Checklist, Hamburger Zwangsinventar). Entsprechend Ergebnissen anderer Verlaufsstudien war die Geschlechtsverteilung der Ausgangsstichprobe annähernd 2:1, bei der Stichprobe verschob sich die Verteilung noch mehr zugunsten der männlichen Patienten (2,6:1). Die meisten ehemaligen Patienten litten sowohl unter Zwangshandlungen als auch –gedanken. Bei der Vorstellung in unserer Kinder- und Jugendpsychiatrie wurden 93% der Patienten mit einer deutlichen oder stark ausgeprägten Problematik vom Untersucher eingeschätzt. Inhaltlich überwogen bei den Zwangsgedanken im Kindes- und Jugendalter suizidale Gedanken, Gedanken mit sexuellen Inhalten sowie solche, die sich auf Ansteckung bzw. Vergiftung beziehen. Bei den Zwangshandlungen hoben sich Wiederholungs-, Kontroll-, Wasch- und Ordnungszwänge in abnehmender Reihenfolge hervor. Bei den komorbiden psychischen Auffälligkeiten bei Aufnahme standen Angststörungen, Depressionen, Kontaktstörungen, aggressive Verhaltensweisen sowie Störungen von Antrieb, Aufmerksamkeit und Impulskontrolle im Vordergrund. Unsere Patienten waren intellektuell durchschnittlich begabt. Im schulischen Bereich waren aber bei über 40% Leistungsdefizite festzustellen. Die Familienverhältnisse erschienen geordnet. Die meisten Patienten gehörten mindestens der unteren Mittelschicht an. Im Vergleich der Teilnehmer mit den Nichtteilnehmern konnte kein signifikant relevanter Unterschied festgestellt werden. Bei näherer Betrachtung fanden sich jedoch Hinweise dafür, daß insgesamt womöglich die „schwierigeren Fälle“ die Teilnahme an der Studie verweigerten. Bei Katamnese litten noch 58,6% der nachuntersuchten Kinder und Jugendlichen unter einer Zwangssymptomatik in leichter bis extremer Ausprägung. Mehr als 27% der Patienten erfüllten zum Katamnesezeitpunkt noch die Kriterien nach ICD-10/DSM IV für eine Zwangserkrankung und wiesen eine chronische Verlaufsform auf. Bei zwei Patienten bestand der Verdacht auf einen Übergang in eine schizoide Psychose bei vorliegender Fluctin-Resistenz, ein dritter Patient litt gleichzeitig unter dem Asperger-Syndrom. Eine Remission war bei 10% der ehemaligen Patienten festzustellen, bei 45% lag die Zwangssymptomatik nur noch in subklinischer Ausprägung vor. Eine episodische Verlaufsform war bei 17% der Probanden zu beobachten. Chronische Verläufe, aber auch eine Remission, traten nur bei männlichen Patienten auf. Eine besondere Stabilität eines spezifischen Zwangssymptoms konnte nicht nachgewiesen werden. Aufgrund der individuellen Behandlung eines jeden Patienten mit eigenem Therapieschema, konnte ein Ziel dieser Untersuchung, nämlich ein einheitliches Behandlungsmuster zu erstellen, nicht erreicht werden. In dieser Untersuchung konnten einige Faktoren gefunden werden, die für den Heilungserfolg bzw. für den Verlauf eine prognostische Rolle spielten. Signifikante Prädiktionskraft hinsichtlich eines negativen Heilungserfolgs bzw. eines schlechten Verlaufs besaßen das Vorliegen komorbider Symptome, eine mit Zwangsstörung belastete Verwandtschaft, ein negativer Behandlungserfolg, der Zeitraum bis zur Erstbehandlung und psychische Auffälligkeiten bis zur Einschulung, tendenziell der Schweregrad der Zwangssymptomatik bei Vorstellung insbesondere die psychosoziale Anpassung/Bedingungen. Eine tendenziell bessere Prognose besaß insgesamt das weibliche Geschlecht. Bei der Nachuntersuchung wurde bei fast 83% der ehemaligen Patienten eine Klinische Störung diagnostiziert. Alle, die zu diesem Zeitpunkt die diagnostischen Kriterien der Zwangsstörung erfüllten, wiesen mindestens eine Klinische Störung auf, aber auch bei denjenigen, die bei Katamnese nicht unter einer Zwangsstörung litten, lag die Häufigkeit der Klinischen Störungen bei 75%. Bei Behandlungsbeginn wurde bei 93% der Patienten eine Klinische Störung festgestellt. Zum Nachuntersuchungszeitpunkt hoben sich Störungen von Antrieb, Aufmerksamkeit und Impulskontrolle hervor, gefolgt von Angststörungen, affektiven, insbesondere depressiven Störungen sowie Störungen der Interaktion. Motorische Tics kamen nur bei männlichen Patienten vor. Ein signifikanter Anstieg der Häufigkeit war bei Items, die die Aufmerksamkeit betrafen, zu verzeichnen und bei motorischen Tics. Wohl aufgrund der hohen Belastung der Stichprobe gestaltete sich die Ablösung vom Elternhaus problematisch. Nur 17% der ehemaligen Patienten wohnten außerhalb irgendwelcher Behütung in einer eigenen Wohnung oder in einer Wohngemeinschaft. Nur 20% gaben an, eine feste Beziehung zu haben, verheiratet war nur eine ehemalige Patientin. Im schulisch-beruflichen Bereich dagegen waren eher geringgradige Beeinträchtigungen bei Katamnese festzustellen. In einer schulisch-beruflichen Ausbildung oder in einem geregelten Arbeitsverhältnis befanden sich 86%. Die Schule wegen der Zwangsstörung abbrechen mußten fünf der acht männlichen Patienten, die zum Katamnesezeitpunkt unter einer Zwangsstörung litten. 10% der ehemaligen Patienten besuchten weder die Schule noch standen sie in einem Arbeitsverhältnis. Insgesamt fiel die psychosoziale Anpassung bei denjenigen, die bei der Nachuntersuchung die Diagnosekriterien einer Zwangsstörung erfüllten, erwartungsgemäß deutlich schlechter aus als bei den ehemaligen Patienten, die keine aktuelle Zwangskrankheit aufwiesen.
In der onkologischen Therapie gehören Übelkeit und Erbrechen zu den am häufigsten auftretenden Nebenwirkungen. Sowohl in der Chemo- als auch in der Strahlentherapie gilt ihre Prophylaxe und Therapie als Herausforderung an alle behandelnden Personen. Zahlreiche Studien beschäftigen sich mit der Inzidenz und der Prophylaxe dieser Nebenwirkungen, jedoch immer nur bei Einsatz von Chemooder Strahlentherapie. Ziel dieser Arbeit war es, das Auftreten und die Prophylaxe von akuter Nausea und Emesis bei der simultanen Kombination beider Therapieverfahren zu untersuchen. Dabei wurden in einer retrospektiven Studie die Daten von 335 Patienten, die sich im Zeitraum vom 24.11.1995 bis zum 16.07.2005 an der Klinik für Strahlentherapie der Johann-Wolfgang-Goethe Universität einer simultanen Radiochemotherapie unterzogen, erfasst und ausgewertet. In diesem Patientenkollektiv traten akute Nausea und Emesis in 48,1% und 25,4% der Fälle während der Therapie auf. Wir untersuchten das Auftreten von Nausea und Emesis im Patientenkollektiv in Abhängigkeit von verschiedenen patienten- und therapie-assoziierten Faktoren, die für die Chemo- und Strahlentherapie als Risikofaktoren bekannt sind. Bei den patienten-assoziierten Faktoren konnten das weibliche Geschlecht als Risikofaktoren für therapie-induzierte Nausea und Emesis nachgewiesen werden. Bei Frauen trat Nausea in 61,5% der Fälle auf, während bei nur 40,8% der männlichen Patienten Nausea zu beobachten war. Des Weiteren konnte bei jungen Patienten (unter 40 Jahren), mit einer Nausea-Rate von 72,0%, ein statistisch signifikanter Unterschied gegenüber den über 40-jährigen Patienten (46,1%) festgestellt werden. Patienten, die über eine PEG-Sonde ernährt wurden, zeigten ein statistisch signifikant häufigeres Auftreten von Nausea und Emesis (p=0,0334 und p=0,0173). Die Auswertung der einzelnen Patienten sprach jedoch gegen einen kausalen Zusammenhang der Ernährung über eine PEG-Sonde mit dem Auftreten von Nausea und Emesis. Auch das Tumorstadium, der Karnofsky-Index und ein Alkoholabusus in der Anamnese ließen sich nicht als statistisch signifikante Risikofaktoren für ein vermehrtes Auftreten von Nausea und Emesis unter kombinierter Radiochemotherapie nachweisen. Es ließ sich ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen dem Auftreten von Nausea und Emesis und einer Abnahme des Körpergewichts während der Therapie herstellen. Beispielsweise litten Patienten, die mehr als 10% ihres Körpergewichts verloren, in 75% der Fälle unter Nausea, während nur 42% der Patienten, deren Gewichtsveränderung weniger als 5% betrug, Nausea erlebten. Die Höhe des Gewichtsverlustes und die Stärke von Nausea und Emesis ließen sich nicht in Beziehung setzen. Als therapie-assoziierten Risikofaktoren für Nausea und Emesis wurde das emetogene Level der Chemotherapie in Abhängigkeit der zytostatischen Substanz und das emetogene Level der Strahlentherapie in Abhängigkeit vom bestrahlten Zielvolumen und den applizierten Einzeldosen untersucht. Es stellte sich heraus, dass das Auftreten von Nausea und Emesis in diesem Patientenkollektiv hauptsächlich vom emetogenem Potential der Chemotherapie abhing, es waren deutliche Schwankungen im Auftreten von Nausea (45,7%) und Emesis (26,7%) zu beobachten. Die Untersuchung der Einflüsse der Strahlentherapie zeigten keine eindeutig statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den verschiedenen Zielvolumina und täglich applizierten Einzeldosen. Des Weiteren wurde das Auftreten von Nausea und Emesis zu Beginn und am Ende der Radiochemotherapie verglichen. Hier konnte bei der Betrachtung aller Patienten insgesamt keine Zunahme von Nausea und Emesis festgestellt werden. Jedoch erhöhte sich die Wahrscheinlichkeit, in den Folgezyklen der Chemotherapie unter Nausea zu leiden, wenn im ersten Zyklus Nausea erlebt wurde, um 45%. Bei der antiemetischen Prophylaxe stellte sich die Anwendung eines 5-HT3-Antagonisten in Kombination mit Dexamethason bei Patienten mit hoch, beziehungsweise extrem hoch emetogener Chemotherapie als die wirkungsvollste heraus. Im Vergleich unserer Ergebnisse mit veröffentlichten Studien, konnten bei der alleinigen Chemotherapie mit dieser Prophylaxe zum Teil statistisch signifikant niedrigere Raten von Nausea und Emesis erzielt werden, als in unserem Patientenkollektiv bei der kombinierten Radiochemotherapie. Bei Patienten mit niedrig oder moderat emetogener Chemotherapie traten Nebenwirkungen wie Übelkeit und Erbrechen am wenigsten bei Patienten auf, die Dexamethason als antiemetische Prophylaxe erhielten. Hier konnten trotz der zusätzlichen Radiotherapie in unserem Patientenkollektiv größtenteils ähnliche Ergebnisse erzielt werden, wie in der Literatur bei alleiniger Chemotherapie angegeben wurden. Dimenhydrinat und Metoclopramid zeigten bei kombinierter Radiochemotherapie als zusätzliche Medikation, bei fortlaufender antiemetischer Grundtherapie, die besten Ergebnisse in der Therapie von Nausea und Emesis.
Im Gegensatz zur Minimierung von DFAs ist die exakte Minimierung von NFAs oder regulären Ausdrücken nachweislich schwierig, im allgemeinen Fall PSpace-schwer. Wir zeigen, dass selbst schwache Approximationen zur Minimierung von NFAs und regulären Ausdrücken wahrscheinlich nicht effizient möglich sind. Falls als Eingabe ein NFA oder regulärer Ausdruck der Größe n gegeben ist, löst ein Approximationsalgorithmus für das Minimierungsproblem mit Approximationsfaktor o(n) bereits ein PSpace-vollständiges Problem. Wenn wir uns auf NFAs oder reguläre Ausdrücke über einem unären - also einelementigen - Alphabet beschränken, so ist das Problem der exakten Minimierung NP-vollständig. Wir weisen nach, dass effiziente Approximationen für das unäre Minimierungsproblem mit Approximationsfaktor n^(1-delta) für jedes delta>0 nicht möglich sind, sofern P != NP gilt. Liegt die Eingabe als DFA mit n Zuständen vor, kann sie exponentiell größer sein als ein äquivalenter NFA oder regulärer Ausdruck. Dennoch bleibt das Minimierungsproblem PSpace-schwer, wenn die Anzahl der Übergänge oder Zustände in einem äquivalenten NFA oder die Länge eines äquivalenten regulären Ausdrucks zu bestimmen ist. Wir zeigen, dass auch hierfür keine guten Approximationen zu erwarten sind. Unter der Annahme der Existenz von Pseudozufallsfunktionen, die wiederum auf der Annahme basiert, dass Faktorisierung schwierig ist, zeigen wir, dass kein effizienter Algorithmus einen Approximationsfaktor n/(poly(log n)) für die Zahl der Übergänge im NFA oder die Länge des regulären Ausdrucks garantieren kann. Für die Zahl der Zustände im NFA weisen wir nach, dass effiziente Approximationen mit Approximationsfaktor (n^(1/2))/(poly(log n)) ausgeschlossen sind. Wir betrachten dann Lernprobleme für reguläre Sprachen als Konzeptklasse. Mit den entwickelten Methoden, die auf der Annahme der Existenz von Pseudozufallsfunktionen beruhen, zeigen wir auch, dass es für das Problem des minimalen konsistenten DFAs keine effizienten Approximationen mit Approximationsfaktor n/(poly(log n)) gibt. Für den unären Fall hingegen weisen wir nach, dass es einen effizienten Algorithmus gibt, der einen minimalen konsistenten DFA konstruiert und erhalten somit auch einen effizienten PAC-Algorithmus für unäre reguläre Sprachen, die von DFAs mit n Zuständen akzeptiert werden. Für unäre Beispielmengen weisen wir außerdem nach, dass es keine effizienten Algorithmen gibt, die minimale konsistente NFAs konstruieren, falls NP-vollständige Probleme nicht in Zeit (n^(O(log n)) gelöst werden können. Andererseits geben wir einen effizienten Algorithmus an, der zu unären Beispielmengen einen konsistenten NFA mit höchstens O(opt^2) Zuständen konstruiert, wenn ein minimaler konsistenter NFA opt Zustände hat. Abschließend betrachten wir das Lernen von DFAs durch Äquivalenzfragen. Für den nicht-unären Fall ist bekannt, dass exponentiell viele Fragen für DFAs mit n Zuständen benötigt werden. Für unäre zyklische DFAs mit primer Zykluslänge und höchstens n Zuständen zeigen wir, dass Theta((n^2)/(ln n)) Äquivalenzfragen hinreichend und notwendig sind. Erlauben wir größere zyklische DFAs als Hypothesen, kommen wir mit weniger Fragen aus: Um zyklische DFAs mit höchstens n Zuständen durch Äquivalenzfragen mit zyklischen DFAs mit höchstens n^d Zuständen für d <= n als Hypothesen zu lernen, sind O((n^2)/d) Fragen hinreichend und Omega((n^2 ln d)/(d (ln n)^2)) Fragen nötig.
Die vorliegende Arbeit behandelt die Entwicklung und Überprüfung von Modellen zur Berechnung von Schwingungspektren von Peptiden und Proteinen. Solche Modelle verbinden die Konformationsstruktur eines Moleküls mit seinen Schwingungseigenschaften und sind demzufolge wichtig für die Interpretation der Schwingungspektren. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte theoretische Erforschung dieses Gebietes beschränkt sich auf die Betrachtung der Amide-I-Moden, welche aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften sich zur Untersuchung der Peptidkonformationen eignen. Die Arbeit kann prinzipiell in zwei Teile separiert werden. In dem ersten Teil werden Fragen betrachtet, die mit der Entwicklung des Schwingungshamiltonian verbunden sind. Im zweiten Teil wurden die erhaltenen Hamiltonian für die Berechnung der Schwingungspektren verwendet. Bei der Berechnung der Schwingungspektren wurden verschiedene spektroskopische Näherungen verwendet und erforscht. Die Entwicklung des Schwingungshamiltonian beinhaltet zwei Aufgaben. Die ab initio Parametrisierung des Schwingungshamiltonian von Dipeptiden, sowie die Analyse der Entwicklungsmethoden für Schwingungshamiltonian von Polypeptiden. Die Entwicklungsmethoden stützen sich auf ab initio berecheten Schwingungseigenschaften von Dipeptiden und/oder elektrostatische Modelle. Die ab initio Parametrisierung basiert auf einer Geometrieoptimierung und anschließender Berechnung von Normalmoden. Hierbei wurde die Abhängigkeit der Ergebnisse vom theoretischen Niveau und dem verwendeten Basissatz untersucht. Die Transformation der errechneten Normalmoden lieferte die Schwingungseigenschaften der lokale Amide-I-Mode. Die Lokalisierung der Normalmode folgt diversen Kriterien. Sie ist von der Wahl der Lokalmoden und somit implizit auch von der Art der Geometrieoptimierung abhängig. Mit dieser Arbeit konnte die Abhängigkeit der Ergebnisse von der Parameterwahl weitgehend aufgeklärt und eine für das Amide-I-System geeignet Parametrisierung gefunden werden. Im nächsten Arbeitsschritt wurde die Abhängigkeit der Amide-I-Schwingungseigenschaften von den Peptidseitenketten und terminalen Gruppen untersucht. Desweiteren wurden Methoden zur Formulierung der Hamiltonian für Polypeptide konzeptionell entwickelt. Diese Untersuchung ist außerordentlich wichtig, da direkte quantenmechanische Berechnungen von Polypeptiden zu zeitaufwendig sind. Solche Methoden beruhen auf dem sogenannten “Building-Block”-Ansatz und verschiedenen elektrostatischen Modellen. In dieser Arbeit wurden sowohl die einzelnen Methoden als auch ihre Kombination für die Entwicklung des Hamiltonians verwendet. Zur Abschätzung der Genauigkeit der verwendeten Methoden wurden Vergleichsrechnungen durchgeführt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die erhaltenen Schwingungshamiltonian zur Berechnung von Schwingungsspektren diverser gelöster Peptide angewandt. In diesem Zusammenhang konnte die Genauigkeit unterschiedlicher spektroskopischer Approximationen überprüft werden. Auf Grundlage der erhaltenen Ergebnisse können wir sagen, dass eine angemessene Beschreibung der konformationellen Verteilung und eine korrekte Berechnung des dynamischen Absorptionsspektrum gewährleistet ist. Was noch fehlt, ist ein hinreichend genaues quantenchemisches Modell für die Schwingungsfrequenzen eines gelösten Peptids. Diese Aufgabe stellt zur Zeit ein aktives Forschungsgebiet dar. Zuletzt wurde das Schwingungsspektrum eines sogenanten “Photoschaltbaren”-Peptids simuliert. Mit Hilfe des dafür aufgestellten Hamiltonians ist man in der Lage spektroskopische Beobachtungen auf Konformationsänderungen direkt zu übertragen.
Für den mitochondrialen ABC-Transporter MDL1 (multidrug resistance like) aus Saccharomyces cerevisiae wurde eine Funktion als intrazellulärer Peptidexporter vorhergesagt. MDL1 ist wahrscheinlich am Export von Degradationsprodukten der m-AAA (matrixoriented ATPases associated with a variety of cellular activities) Protease in den Intermembranraum beteiligt (Young et al., 2001). Das MDL1-Homodimer besteht aus zwei Transmembrandomänen mit jeweils sechs potentiellen α-Helices und zwei Nukleotidbindedomänen. Eine Überexpression des ABC-Transporters in E. coli und L. lactis ist nicht möglich. Nur im homologen Expressionssystem kann eine bis zu 100-fach gesteigerte MDL1-Konzentration in Anwesenheit des induzierbaren GAL1-Promotors gegenüber dem endogenen Protein erreicht werden. Differentielle Zentrifugation, Immunogold-Markierungen und Proteasezugänglichkeitsexperimente zeigen, dass MDL1 ausschließlich in der mitochondrialen Innenmembran lokalisiert ist und die Nukleotidbindedomänen zur Matrix orientiert vorliegen. Mit Hilfe von Edman Sequenzierung des gereinigten His-getaggten MDL1 wurde eine 59 Aminosäuren lange mitochondriale Leitsequenz identifiziert. Die Deletionsvariante MDL1(60-695) wird ausschließlich in den Membranen des Endoplasmatischen Retikulums exprimiert. Ihre Motordomänen liegen zytosolisch orientiert vor. Beide MDL1-Varianten bilden homooligomere Komplexe vergleichbarer Größe und weisen ähnliche ATPase Aktivitäten auf. Die physiologischen Konsequenzen der Lokalisation in unterschiedlichen Membranen wurden in Zellen näher untersucht, deren mitochondrialer ABC-Transporter ATM1 (ABC transporter of mitochondria) deletiert ist. ATM1 ist von essentieller Bedeutung für die Biogenese zytosolischer Eisen/Schwefel-Proteine (Lill und Kispal, 2000). Der mitochondriale MDL1-Komplex kann zum Teil die ATM1-Funktion übernehmen, wohingegen ER-ständiges MDL1, als auch ATP Binde- und Hydrolyse inaktive Mutanten, den Δatm1 Wachstumsphänotyp nicht komplementieren können. Die physiologische Funktion von MDL1 ist somit eng mit der mitochondrialen Innenmembran und der Funktionalität des Proteins verbunden. Durch in vivo Komplementationsstudien wurden zwei mitochondriale ABC-Transporter ABCB10 und Pa_2_9660 aus H. sapiens bzw. P. anserina als funktionelle MDL1-Homologe identifiziert.
Seit gezeigt wurde, dass die genetischen Informationen in Form von DNA gespeichert wird, ist das Geheimnis der DNA-Struktur gelöst, der Mechanismus der Gen-Expression und die Rolle der RNA verstanden worden. Das Interesse für die Chemie und die Biologie der Nukleinsäuren ist somit kontinuierlich gewachsen. Besonders interessant ist die RNA, die eine Rolle als ein Vermittler der genetischen Informationen (mRNA) spielt, aber auch als Bote von Aminosäuren (tRNA). Sie ist im Ribosom (rRNA) anwesend, arbeitet als Templat in Telomerasen für DNA-Synthese und hat außerdem wichtige Funktionen in der RNA-Spaltung, z.B. bei Ribozymen wie RNAse P inne. Betreffend bestimmter Spaltstellen in RNA hat auch das Phänomen der siRNA beträchtliche Aufmerksamkeit in diesem Prozess erregt. Der sogenannte RISC-Komplex wird programmiert, einzelsträngige RNA mit hoher Sequenz-Spezifität zu schneiden. Die für die RNA-Interferenz verantwortliche zelluläre Maschinerie ist auch an der Bilbung von MikroRNAs beteiligt. RNA-Interferenz ist heute eines der nützlichsten Werkzeuge in functional genomics geworden. Die große Hoffnung ist, dass es auch vielleicht in der Therapie angewandt werden könnte. Das Thema meiner Doktorarbeit trägt den Titel „Synthesis of Site-Specific Artificial Ribonucleases“. Es beschäftigt sich mit der Entwicklung künstlicher bindungsspezifischer Ribonucleasen. Diese künstlichen Katalysatoren sind im Wesentlichen aus drei Gründen bedeutsam: Zum einen liegt eine mögliche Anwendung in der Affinity-Cleavage (Affinitätsspaltung), eine Technik, die Bindungsstellen von RNA-Liganden durch das kovalente Anbringen eines Reagenzes lokalisiert, das zwischen den Nukleinsäuren schneidet. Zum anderen entsteht die Möglichkeit, neue Werkzeuge für eine gezielte Manipulation großer RNA-Moleküle zu schaffen. Die Vorteile des Ansatzes sind, dass man damit beliebige Zielsequenzen anwählen kann. Das Problem dieser Strategie ist die Notwendigkeit, hohe Genauigkeit im Spaltungssschritt zu erreichen, wie zum Beispiel mit natürlichen Ribozymen. Wichtige Ergebnisse wurden auch während meiner Arbeit erhalten, mit einem Fall von genauer Spaltung zwischen zwei Basen. Der dritte Grund ist die potentielle Anwendung als katalytische antisense-Oligonucleotide in der Chemotherapie. Gegenwärtig existieren zwei Ansätze, unspezifische künstliche RNasen relativ kleiner Größe zu schaffen. Der erste basiert auf Metallkomplexen und führt im Allgemeinen zu höheren Raten. Die Idee ist, ein Metall als elektrophiles Zentrum zur Unterstützung der Transesterfikation zu nutzen. Unter diesen Katalysatoren enthalten die effizientesten Lanthanid-Ionen, Cu2+ und Zn2+. Der zweite Ansatz zielt darauf ab, metallfreie künstliche Ribonucleasen zu entwickeln. Die Vorteile dieser Strategie sind, den Katalysator von der Stabilität der Metallkomplexe, die in vivo problematisch sein könnten, unabhängig zu machen. In diesem Ansatz wird die natürliche Katalyse durch Enzyme simuliert. Zweckmäßige Gruppen mit beschränkter katalytischer Aktivität z.B. als Nucleophile, Säuren oder Basen, werden in einer Weise zusammengesetzt, um Kooperation zu ermöglichen. Potente Katalysatoren können so ohne die Notwendigkeit von Metallen als Cofaktoren erzeugt werden. ...
Molecular mechanism of intracellular signal transduction by the angiotensin-converting enzyme
(2007)
The angiotensin converting enzyme (ACE) is an important component of the renin-angiotensin system (RAS) and is crucially involved in the homeostasis of fluid and electrolyte balance and thus in the regulation of blood pressure. The zinc metallopeptidase is involved in the generation of angiotensin II, a potent vasoconstrictor and in the degradation of bradykinin, a potent vasodilator. It is worth noting that ACE more readily hydrolyzes bradykinin than it does angiotensin I thus culminating in the net physiological effect of the production of a vasoconstrictor and the decrease in the availability of a vasodilator. ACE inhibitors have become one of the most successful therapeutic approaches as a first line of therapy in hypertension, and are also widely used in treating heart failure, myocardial infarction, stroke, coronary artery disease and impaired left ventricular function. However, one unexpected clinically relevant finding related to ACE inhibitors is their ability to delay the onset of type II diabetes that was revealed by various large clinical trials. However, the mechanisms underlying these beneficial effects of ACE inhibitor therapy are currently unclear and cannot be explained by the prevention of angiotensin II formation or the attenuated degradation of bradykinin. Thus the potential beneficial effects attributed to ACE inhibitors may occur independent of reductions in blood pressure paving way for new and/or unknown mechanism. Our group has recently redefined ACE as a signal transduction molecule which upon binding to ACE inhibitor turns on a signalling cascade leading to phosphorylation of Ser1270 by CK2, activation of JNK and changes in gene expression in endothelial cells. However the mechanism by which ACE inhibitor initiates the signalling cascade was not clear. It was hypothesized that ACE, which is anchored to the membrane with a single transmembrane domain should dimerize prior to initiating further downstream signalling events in endothelial cells. Therefore, we sought to explore whether or not ACE forms dimers in endothelial cells and whether ACE dimerization is essential for the initiation of ACE signalling in endothelial cells. Using native gel electrophoresis, we found that ACE forms dimers in endothelial cells and that there is an increase in the dimer formation upon treatment of endothelial cells with ACE inhibitors. ACE homodimerization was also demonstrated using the split-ubiquitin system and chemical cross-linking experiments. ACE dimers are also formed in endothelial cells overexpressing the non-phosphorylatable ACE, wherein ACE signalling was abolished indicating that dimerization process is not influenced by the phosphorylation of the serine residue residing in the cytoplasmic tail. Monosaccharides like glucose, galactose and mannitol did not have any influence on ACE-inhibitor induced dimerization. Making use of different monoclonal antibodies directed to the epitopes of N-domain which harbours carbohydrate recognizing domain, also did not affect dimerization. However, inactivation of the C-domain active site by introducing mutation of the key histidine residues in HEMGH consensus sequences, which complexes the zinc ions, abolished enzyme dimerization both in the basal state and in response to ramiprilat. Mutation of the C-domain also resulted in the loss of ACE inhibitor-induced ACE signalling, that is we failed to observe ramiprilat-induced increase in the phosphorylation of the Ser1270 and the subsequent JNK activation. ACE-inhibitor induced dimerization precedes the phosphorylation of Ser1270 and activation of JNK. Thus the ACE-inhibitor induced dimerization via the C-domain of ACE represents the initial step in the ACE signalling pathway which involves the activation of JNK/c-Jun pathway and leading to the changes in the gene expression in endothelial cells. Our group previously identified ACE itself as well as cyclooxygenase-2 (COX-2) as two “ACE signalling-regulated” genes. To screen for additional genes regulated in a similar manner we used DNA microarray technology, to assess ramiprilat-induced changes in the endothelial cell gene expression. 21 genes were identified to be differentially regulated of which, 7 were upregulated and 14 were downregulated by ramiprilat. However, when screened at the protein level, we found no significant differences between the untreated control cells and those treated with ramiprilat. As several other cells and tissues possess a fully functional RAS we screened plasma samples from healthy volunteers as well as from patients with coronary artery disease for the proteins identified in the microarray. We observed that the cellular retinal binding protein-1 (CRBP-1) was detectable at low levels in plasma from patients and that ramipril markedly increased serum levels of this protein. Endothelial cells overexpressing CRBP-1 demonstrated increased RXRE and PPRE activity when stimulated with 9-cis retinoic acid and rosiglitazone respectively suggesting that CRBP-1 might affect gene expression via heterodimerization of PPAR elements with RXR elements by virtue of its function as a transport protein of retinoic acid. Studies aimed at determining the consequences of elevated CRBP-1 expression on endothelial cell homeostasis are ongoing. Although the RAS has been described in many other tissues apart from endothelial cells, ACE signalling has not yet been addressed in tissues such as monocytes/macrophages, which have an increased ACE expression in an atherosclerotic setting. We observed that upon stimulation of cultured ACE expressing monocytes with ramiprilat, JNK is activated suggesting the occurrence of ACE signalling in human monocytes. It is worth noting that ACE inhibitors delay the onset of type II diabetes in spite of moderate decrease in blood pressure. To further elucidate the mechanism underlying this effect, we found that ACE inhibitors increase the PPARgamma levels in the nuclear extracts of ACE expressing monocytes which were also reproduced in human endothelial cells overexpressing human somatic ACE. However, ramiprilat did not have any direct effect on the activity of a luciferase-coupled promoter containing several copies of the PPRE in human endothelial cells. These results contrasted with the actions of the PPARgamma agonist suggesting that ramiprilat enhances PPARgamma levels through an indirect mechanism. We next hypothesized that ramiprilat might increase the levels of 15-deoxy-D12,14-prostaglandin J2 (15dPGJ2) which is a natural ligand for PPARgamma via COX enzymes in monocytes. We observed that ramiprilat was able to decrease the diminution of COX-2 levels upto 48 hours of treatment but the levels of 15dPGJ2 were too low to be detected by ELISA. However ramiprilat enhanced the plasma levels of adiponectin, a downstream target of PPARgamma, which is a anti-atherogenic and anti-inflammatory adipokine, in patients with coronary artery disease. Though adiponectin is a PPARgamma-regulated gene, the observed increase in adiponectin might be attributed to the increase in RXR rather than via PPARgamma. Taken together, the results of this investigation have revealed that ACE inhibitors initiate ACE signalling by eliciting the dimerization of the enzyme, more specifically via its C-domain active centers. The ACE signalling cascade when activated leads to the enhanced expression of ACE, COX-2 and CRBP-1 which in turn favours the heterodimerization of PPARgamma with RXR and thus results in the increased expression of “PPARgamma regulated” genes such as adiponectin. The latter results provide a molecular basis for the observation that ACE inhibitors can delay the onset of type 2 diabetes in as much as it was possible to link ramipril with CRBP-1, RXR activity and the expression of adiponectin, an adipokine associated with improved insulin sensitivity. Further work is however required to elucidate the consequences of ACE inhibitors in monocytes and adipocytes as well as in intact animals.
Gegenstand der Arbeit sind römisch-pagane Ein- und Vorstellungen zu Tod, Jenseitigkeit und Vergänglichkeit im Medium der Grabinschrift. Die Grabinschrift wird als konventionelles, stereotypisiertes, zugleich aber valides und authentisches Vehikel für tod-jenseitige Einstellungen definiert. Umfaßt ist mit Rom, der italischen Halbinsel und der Gallia Narbonensis ein geschlossenes Gebiet. Es war zur Kaiserzeit, aus der der Großteil der analysierten, nicht chronologisch ausdifferenzierten Inschriften stammt, weitgehend romanisiert. Basis der Untersuchung sind die etwa 130.000 Inschriften der lateinischen epigraphischen Datenbank der Universitäten Frankfurt am Main und Eichstätt (EDCS) für den beschriebenen Bereich. Der fragmentarische Charakter der Grabinschrift als Element, das auf die epigraphische Dimension reduziert und vom materiellen und rituell-abstrakten Ursprungszusammenhang isoliert ist, wird diskutiert. Archäologische Quellen und andere nicht epigraphische Dimensionen des sepulkralen Ensembles und ihre Interaktion mit der Inschrift werden dargestellt. Die zum untersuchten Komplex aussagekräftigen paganen Grabtituli werden in 14 Kategorien thematisch ausdifferenziert nach Häufigkeiten erfaßt. Die quantitative Ausrichtung wird durch Beiziehung zahlreicher Einzelinschriften und kleiner thematischer Komplexe ergänzt. Quantitative und qualitative Dimension, Inschriftenmasse und individuelles Zeugnis bedingen, akzentuieren und korrigieren einander. Die Kategorien werden anhand der Forschungsliteratur diskutiert und interpretiert. Ergebnisse: 1. Intention aller grabepigraphisch gespiegelter Botschaften ist die Domestizierung des Todes und des Toten. 2. Wesentliche charakteristische römisch-pagane Strategien sind: Revitalisierung im Medium der ‚sprechenden Grabinschrift’; Fortexistenz in der dinglichen und abstrakten memoria (Grab und Gedächtnis); Fortexistenz in der scripta memoria als abstrahierende Weiterentwicklung des Grabmals als Stellvertreter des Toten; Fortexistenz im Kollektiv der Manes; Konstituierung des personifizierten Schicksals (Fatum) als deskriptiv-markierende, regelimaginierende Chiffre. 3. Mythologische Motive sowie nihilistische Statements sind in Gegensatz zu ihrem Echo in der Forschung extrem rar. 4. Die die Vergänglichkeit thematisierenden tituli bilden einen vergleichsweise großen und aussagekräftigen Komplex. 5. Das als mittelalterlich geltende Vanitasmotiv der ‚Begegnung der Lebenden und der Toten’ wird als genuin paganes Motiv identifiziert und beschrieben 6. Formal verkörpern die Grabinschriften ebenso wie die römischen Grabporträts stereotypisierte, rezipienten-, normen- und rollenorientierte Präsentationen des Toten von leichter Lesbarkeit, hohem Signalcharakter und Wiedererkennungswert („Typen“). 7. Allen Grabtituli inhärente Bestimmungen sind Markieren, Exponieren, Entschädigen – Markieren von Kult- und Gedächtnisort, Exponieren von Bildung, Prestige und Romanitas, Entschädigen und Befrieden des neidischen Toten. 8. Das Setzen der Grabinschrift ist Ausdruck von pietas und als ritueller Akt innerhalb religio und Orthopraxie eine jenseitige Handlung.
Die Zahl der tödlichen Arbeitsunfälle hat im Untersuchungszeitraum von 1991-2004 in absoluten Zahlen kontinuierlich abgenommen. Damit setzt sich ein erfreulicher Trend fort, der auch in Arbeiten aus der Zeit davor festzustellen war und der sich in der vorliegenden Untersuchung genauso wie in der gesamtdeutschen Entwicklung spiegelt. Allerdings stellt sich das Bild etwas anders dar, wenn man diese Zahlen zur ebenfalls stark rückläufigen Zahl der Vollbeschäftigten in den hauptsächlich betroffenen Sparten, d.h. der Baubranche und der gewerblichen Industrie in Beziehung setzt. Vor diesem Hintergrund stellt sich heraus, daß sich ein gewisses Maß an Unfällen wohl trotz verbesserter Arbeitsschutzbedingungen nicht vermeiden läßt und daß die relative Abnahme weit geringer als angenommen ist. Es sind fast ausschließlich Männer, die am Arbeitsplatz tödliche Unfälle erleiden. Allerdings läßt sich die Hypothese, daß dies im männlichen Risikoverhalten begründet sei, nicht erhärten. Vielmehr spiegelt sich darin das Geschlechterverhältnis an unfallgefährdeten Arbeitsplätzen. Der Altersgipfel der Unfallopfer liegt wesentlich höher als dies dem Durchschnitt aller Arbeitnehmer entspräche, so daß von einer deutlich erhöhten Mortalität im höheren Alter ausgegangen werden muß. Die Mortalität ausländischer Arbeitnehmer ist ebenfalls stark erhöht und spiegelt nicht den relativen Anteil von Ausländern an den betroffenen Arbeitsplätzen. Noch mehr zeigt sich dies bei Absturzunfällen, die die größte Gruppe im Hinblick auf den Unfallmechanismus darstellen. Im Jahresverlauf zeigt sich durchweg eine im konstanten Verhältnis zur Zahl der Arbeitnehmer am Arbeitsplatz stehende Anzahl von tödlichen Unfällen. Auch im Verlauf über die Woche kann anhand der vorliegenden Zahlen die früher häufig nachgewiesene erhöhte Montagsmortalität nicht mehr bestätigt werden. Die Mortalität verhält sich proportional zur Zahl der geleisteten Arbeitsstunden. Eine tageszeitliche Schwankung ergibt sich mit einem Gefährdungshöhepunkt zwischen 10:00 und 11:00 Uhr vormittags. Bezüglich der Todesursache zeigte sich, daß besonders Opfer von Absturzunfällen ein stark erhöhtes Risiko haben, an einer Lungenembolie zu versterben, unabhängig von der Sturzhöhe. Sicherheit am Arbeitsplatz ist nach wie vor ein Problem, das es weiter zu verbessern gilt, wenn man die Feststellung berücksichtigt, daß nur in rund einem Viertel aller Unfälle die vorgeschriebenen Sicherheitsmaßnahmen sowohl von Arbeitgeber- wie von Arbeitnehmerseite eingehalten wurden und daß mithin drei Viertel aller Unfälle höchstwahrscheinlich vermeidbar gewesen wären.
This dissertation contains five independent chapters dealing with wage dispersion and unemployment. The first chapter deals with the explanation of international changes in wage inequality and unemployment in the 80s and 90s. Both theoretically and empirically, social benefits and its link to average income are blamed for the different experiences across countries. The second chapter discusses the search framework, to explain residual wage inequality and finds that institutional wage compression has ambiguous effects on employment. In the third chapter, we apply the theory to German data. We show that job-to-job transitions are important in explaining both frictions and career advances. In the fourth chapter, we empirically assess the relationship between wage dispersion and unemployment for homogeneous workers. We find that neither a frictional nor a neo-classical view in explaining this relationship are convincing. Unemployment within cells is not negatively correlated with wage dispersion. Finally, the last chapter builds a theoretical model which treats heterogeneous individuals in a production function framework and a frictional labor market. The model generates both wage dispersion within and between skill groups and both frictional and structural unemployment. In sum, the dissertation stresses the importance of modelling frictions to understand different types of wage inequality and unemployment.
Prostaglandin D2 (PGD2) is involved in a variety of physiological and pathophysiological processes, but its role in fever is poorly understood and the data obtained so far are rather controversial. Here we investigated the effects of central PGD2 delivery and of systemic prostaglandin D synthase (PGDS) or cyclooxygenase (COX) inhibition on core body temperature (TC) and on prostaglandin levels in the cerebrospinal fluid (CSF) of rats. Both PGE2 and PGD2 were detectable in CSF samples from control rats (6.2 ± 1.1 and 17.3 ± 3.1 pg/ml, respectively). Lipopolysaccharide (LPS) injection (50 μg i.p.) induced fever during the 5-hour observation period. Five hours after LPS injection, the levels of PGE2 and PGD2 were increased in the CSF about 90-fold (541.0 ± 47.5 pg/ml) and 5-fold (95.4 ± 23.1 pg/ml), respectively. Administration of PGD2 (50 - 500 ng) into the cisterna magna (i.c.m) evoked a delayed fever response in a dose-dependent manner that was accompanied by increased levels of PGE2 in the CSF. RT-PCR analyses revealed that the increased levels of PGE2 after PGD2 administration were not caused by up-regulation of COX-2 or microsomal prostaglandin E synthase 1 (mPGES-1) in the hypothalamus. Interestingly, i.c.m. pretreatment of animals with PGD2 considerably sustained the pyrogenic effects of i.c.m. administered PGE2. Pretreatment with a novel PGDS inhibitor, EDJ300520 (10 – 40 mg/kg p.o.), 1 h prior to the LPS injection impaired the LPS-induced increase of both PGD2 and PGE2 in the CSF and inhibited the fever response. In contrast, administration of EDJ300520 3 h after LPS injection did not ameliorate the LPS-induced fever. Accordingly, the concentration of PGE2 in the CSF was not decreased after EDJ300520 treatment. However, the CSF levels of PGD2 were reduced after administration of a high dose of EDJ300520 (40 mg/kg). We also investigated the effects of antipyretic drugs on the CSF levels of PGE2 and PGD2 during LPS-induced fever. Four antipyretic drugs with different mechanisms of action were used, including ibuprofen (5 - 20 mg/kg), celecoxib (10 - 50 mg/kg), SC560 5 - 20 mg/kg), and paracetamol (50 - 150 mg/kg). Each drug was used in three different doses and was orally administered 3 h after the LPS injection. All drugs were capable to attenuate the LPS-induced fever. The decrease of TC paralleled the reduction of PGE2 levels in the CSF. Of note, there was a tendency to reduced PGD2 levels in the CSF after treatment with the antipyretic drugs. However, only SC560 and the high dose of celecoxib (50 mg/kg) reduced the PGD2 levels significantly. In summary, our experiments underscore the pivotal role of PGE2 as the principal downstream mediator of fever. Moreover, we demonstrate that PGD2 is also involved in the mechanisms underlying fever. Our data suggest that PGD2 exerts an indirect pyrogenic effect by modulating the availability of PGE2 in the CSF. Additional studies are needed to explore the exact mechanism by
21 Hsfs belonging to classes A, B and C were identified in Arabidopsis following the sequencing of its genome. 1.) Cloning of full length and CTD chimeric constructs followed by transient reporter assays in tobacco protoplast using GUS fusion constructs of the promoters of Hsp17.4-CI, synthetic (HSE9) and APX2 showed Hsfs A1a, A1b, A1d, A1e, A2, A3 and A9 to be active. CTDs of Hsfs A7a, A7b and HsfC1 had activity but they showed poor DNA binding in reporter assays. Hsfs A1a, A1b, A1d, A1e, A2 and A3 were able to induce the expression of endogenous Hsps in tomato protoplasts. Interesting differences in promoter selectivity were observed for several Hsfs. 2.) RT-PCR and microarray analysis showed the Hsfs to be differentially expressed depending on tissue, abiotic and biotic stress, hormone and developmental s ge. Interesting patterns of coexpressed Hsfs were observed under different stresses and developmental stages. 3.) HsfA1b was found to be active on the plasmid borne PHsf:GUS reporters of Hsfs A1d, A2, A4a, A7b and B4 when tested in tobacco mesophyll protoplasts. Hsfs A1d, A2, A4a, A7b and B4 when tested in tobacco mesophyll protplasts. HsfA2 was inactive on PHsfA:GUS. HsfB1 showed repression of endogenous activity on several PHsf:GUS reporter constructs. 4.) The transcriptional regulation under heat stress and promoter organization of HsfA2 and FtSH4 (a metalloprotease gene oriented in a head to head fashion with HsfA2 in the Arabidopsis genome, sharing a common promoter region) was studied. The transcripts of FtSH4 and HsfA2 coaccumulated under heat stress. HsfA1b was active on PHsfA2:GUS and PFtSH4:GUS. Hsf binding sites on the intergenic region were determined using promoter deletion constructs in tobacco and Arabidopsis protoplasts. A bidirectional regulation of HsfA2 and FtSH4 by HsfA1b was observed in tobacco protoplast. 5.) Microarray analysis of a HsfA2 T-DNA insertion line vs. wild type Col-0 under heat stress conditions led to identification of a subset of target genes to be severely affected in the absence of HsfA2. Apart from several Hsps (heat stressproteins) and APX2 (Ascorbate peroxidase 2, oxidative stress scavenger), several other unknown genes are affected. APX2 was the most severely affected among them. HsfA2 was able to induce the transcription from its target gene promoters in fusion to GUS in transient reporter assays in tobacco protoplast. The HSE cluster to which HsfA2 binds on the APX2 promoter was also mapped by the same technique. The direct binding of HsfA2 to the promoter of selected target genes in the Arabidopsis genome was also demonstrated by chromatin immunoprecipitation studies.
This work analyses several granitic bodies of the Variscan Orogen of Central and Western Europe in order to improve our knowledge about different aspects of their evolution, regarding their ascent and emplacement mechanisms, as well as their deformation history. In the Iberian Massif two granitoid bodies, namely the La Bazana pluton and the Nisa-Alburquerque batholith, were studied in order to decipher their ascent and emplacement history. The La Bazana pluton is a small, sub-circular body in map view that intruded into rocks of the Ossa-Morena Zone in the core of a late upright antiform. Its three-dimensional drop-pipe shape, its internal dome foliation pattern and the structure of the host rock suggest that the magma ascended and emplaced diapirically. The Nisa-Alburquerque batholith is a large body that intruded into rocks of the Central Iberian Zone, the Central Unit, and the Ossa-Morena Zone. Its cartographic shape is elongate and parallel to the NW—SE to WNW—ESE Variscan structures. In the light of the available structural data and the gravimetric models, the intrusion is viewed as a continuous lateral magma flow from the eastern root guided towards the west through the southern limb of a kilometre-scale antiform. As mass-transfer mechanisms, a combination of rigid translation of the country rocks, stoping, and possibly ballooning is proposed. In the Bohemian Massif several small granitoid bodies showing a strong solid-state deformation were studied in order to integrate their tectonometamorphic history in the geotectonic framework of the south-western Bohemian Massif, focusing principally on the deformation phase referred to as D3. Four ductile deformation phases are proposed for the study area. D1 produced high-temperature fabrics under upper amphibolite to granulite facies conditions. Its kinematics is unknown. D2 occurred under amphibolite to upper greenschist facies conditions under N—S to NNW—SSE compression. It is responsible for a subvertical NW—SE striking foliation in migmatites developed under dextral simple shear and for the deformation at the Bayerischer Pfahl shear-zone system at its earlier stages. Many granitoid dykes and stocks were found to be affected by sinistral shear along subvertical planes trending ENE to ESE. Since this deformation, which is called D3 in the present work, is not compatible with a N—S to NNW—SSE compression, it is proposed that these sinistral shear zones in granites do not belong to the Bayerischer Pfahl shear-zone system and constitute themselves a separated one, which is called “D3 shear-zone system”. D3 took place under upper greenschist to lower amphibolite facies conditions (~480-550°C). Both the intrusion and the deformation of the granites affected by D3 occurred at deep to intermediate levels of the crust, whereas the deformation took place under NE—SW compression. Datings on two of the deformed granites yielded 324.4 ± 0.8 Ma and 315.0 ± 1.0 Ma: Thus, the age of D3 is most probably ~315 Ma. The intrusion of most of the sheared granitoids was pre-kinematic with respect to D3. After D3 the N—S to NNW—SSE compression which governed D2 was restored, giving way to the next deformation phase D4, which was linked to further deformation at and next to the principal shears of the Bayerischer Pfahl shear-zone system under greenschist facies conditions. The causes for the change of the stress field leading to a NE—SW compression during D3 might be related to (1) global changes in the dynamics of the tectonic plates in late Variscan times, (2) orogenic collapse leading to the sinking of the Teplá-Barrandian and lateral extrusion of the surrounding Moldanubian rocks, (3) distortion of the regional stress field by local intrusion of large stocks, such as the Saldenburg granite of the Fürstenstein Massif, or (4) distortion of the regional stress field due to the existence of ephemeral releasing bends in the Bayerischer Pfahl shear zone during its early evolution.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Entwicklung eines geeigneten Assays (eines standardisierten Reaktionsablaufs) für die Analyse der Funktion und Aktivität der Transporter für organische Kationen (OCT) mit Hilfe der auf einer festkörperunterstützten Membran (SSM) basierenden Elektrophysiologie. Die zweite Kernaufgabe war die Entwicklung der Expressionssysteme für die heterologe OCT-Expression. In den neunzigen Jahren wurden neue Membranproteine, OCT1-3, identifiziert, die eine wichtige Komponente für den Transport der strukturell unterschiedlichen organischen Kationen im menschlichen Organismus darstellen (Gründemann et al., 1994; Koehler et al., 1997; Koepsell et al., 1998; Zhang et al., 1998). Da etwa fünfzig Prozent der in der Klinik gebräuchlichen Medikamente und viele andere exogene Substanzen (Xenobiotika) polare organische Verbindungen sind, die bei einem physiologischen pH-Wert (7,4) überwiegend in protonierter Form als Kationen vorliegen und mittels OCT aus dem Körper ausgeschieden werden, gehören diese Proteine zu den pharmazeutisch bedeutenden Zielmolekülen (Targets) bei der Entwicklung neuer Medikamente. Letztere stellt einen sehr langwierigen Prozess dar, der die Untersuchung zahlreicher Substanzbibliotheken auf ihre Wirkung auf bestimmte Targets voraussetzt. Aufgrund der rasanten technischen Entwicklung in der Laborautomatisierung und der digitalen Mikroskopie können mittlerweile mehrere tausend Wirkstoffkandidaten in Ultra-High-Throughput-Screenings (UHTS) am Tag getestet werden, von denen aber nur ein minimaler Prozentsatz eine erste positive Reaktion (Hit) mit dem Target zeigt. Die Ergebnisse aus dem primären Screening-Prozess werden in einem zweiten Screening-Prozess weiter bearbeitet. In diesen High-Content-Analysen (HCA) werden dabei entgegen den ersten Untersuchungen die Substanzen nicht mehr einzig auf ihre Interaktion mit dem Target getestet. Vielmehr werden möglichst alle Informationen gesammelt und Effekte analysiert. Zurzeit werden folgende Assays dafür eingesetzt (Geibel et al., 2006): 1) radioaktive Assays, wie Ligandbindungsassays, Flux-Assays; 2) Fluoreszenzassays auf Basis von spannungs- oder ionenabhängigen Farbstoffen; 3) Flux-Assays auf Basis von Atom-Absorptions-Spektroskopie (AAS); 4) manuelle patch-clamp-Assays. Allerdings können diese Assays wegen unterschiedlicher Einschränkungen nur begrenzt eingesetzt werden. So treten bei den Fluoreszenzassays aufgrund der Farbstoff-Substanz-Interaktionen oft falsche positive Ergebnisse auf. Methoden mit radioaktiv markierten Substraten sind aus sicherheitstechnischen Gründen mit hohem Aufwand und entsprechenden Kosten verbunden. Das patch-clamp-System verfügt zwar über eine hohe Sensitivität und einen hohen Informationsgehalt, ist jedoch für das Screening wegen des geringen Durchsatzes und erheblicher Kosten nicht effizient. Diese Beispiele zeigen die Notwendigkeit der Entwicklung neuer Techniken für die pharmazeutische Wirkstoffsuche. Die SSM-basierte elektrophysiologische Detektionstechnologie ermöglicht die Untersuchung der Transportproteine in ihren nativen Membranen mit hoher Sensitivität ohne Fluoreszenzmarkierung (Geibel et al., 2006; Kelety et al., 2006). Diese Methode hat besondere Vorteile gegenüber anderen bei der Erforschung von Transporter-Proteinen, die im Gegensatz zu Ionenkanälen relativ wenig Ladung pro Zeiteinheit (1-104 Moleküle s-1) transportieren, und viele Techniken wegen der geringeren Empfindlichkeit für deren Untersuchung nicht geeignet sind.
Untersuchungen zur zerstörungsfreien Emittanzmessung an einem negativen Wasserstoffionenstrahl
(2007)
Die Arbeit beschäftigte sich sowohl theoretisch wie auch praktisch mit einem neuartigen Konzept zur Strahldiagnose — der zerstörungsfreien Emittanzmessung für negative Ionenstrahlen. Bei H¯ Strahlen kann auf mechanische Bauteile verzichtet werden, wenn bei einem kleinen Teil der H¯ Ionen das zusätzliche, nur mit 0,754 eV schwach gebundene Elektron durch Photodetachment abgelöst wird. Die neutralisierten H¯ Ionen können magnetisch oder elektrostatisch von den Elektronen und den verbliebenen H¯ Ionen separiert werden. Insbesonders die Neutralteilchen bieten sich zur Bestimmung der Phasenraumverteilung des Ionenstrahls an, da der Impulsübertrag bei der Photoneutralisation für die vorliegende Anwendung vernachlässigbar ist. Die Detektion des Divergenzwinkels kann durch einen Szintillator mit einer CCD–Kamera erfasst werden. Ein Modell zur Berechnung der Anzahl der neutralisierten Teilchen ist unter der Annahme homogener Dichteverteilungen entwickelt worden, um Aussagen zu den Anforderungen an Lasersystem und Detektor zu machen. Dabei zeigt sich die besondere Eignung des Meßverfahrens für Strahlstöme und Strahlparameter, wie sie typischerweise nach einem RFQ vorliegen. Da im Gegensatz zur Schlitz–Schlitz Emittanzmessung wird hier die Winkeldetektion mit einem ortsauflösenden Szintillator durchgeführt. Daraus ergibt sich als neues Verfahren eine Schlitz–Punkt Abbildung. Im Vergleich zum Schlitz–Schlitz Messprinzip können damit mehr Informationen über die Phasenraumverteilung gewonnen werden. Um diese neue Abbildungsfunktion zu untersuchen, ist eine Methode zur Simulation der Winkeldetektion entwickelt worden. In den Simulationen ist angenommen worden, daß der Schlitz bzw. Laser analog zur Messung einer yy´ Emittanz entlang der y–Achse durch den Ionenstrahl gefahren wird, die ausgeschnittene Teilchenverteilung ist bis zum Ort des Szintillators transportiert worden. Dabei sind etliche Zusammenhänge der Abbildungsfunktion zwischen den 2dim Phasenraumprojektionen yy´ , xx´ und der Verteilung der neutralisierten Ionen auf dem Teilchendetektor aufgezeigt worden. Dabei läßt sich nachweisen, daß die Aberrationen aus der anderen transversalen Ebene (x–Ebene) die Verteilungsfunktion mit beeinflusst. Für die experimentellen Untersuchung der Photodetachment Strahldiagnose wurde eine Beamline aus Ionenquelle mit Dumpingsystem, differentiellem Pumptank und Linsensystem aufgebaut. Dabei wurde bei einer vorhandenen H¯ Quelle der Strom von anfänglich 70 mycroA auf 2,5 mA gesteigert. Das Dumpingsystem erwies sich als sehr effektiv und lenkte bis zur Nachweisgrenze alle zusätzlich extrahierten Elektronen aus dem Strahl aus. Die Komponenten und der gesamte Aufbau zur Photodetachment Strahldiagnose schließen den Dipol bzw. die Konstruktion der Vakuumkammer zur Ladungsseparation, die Auswahl eines geeigneten Szintillators und die Bestimmung der Laserstrahlparameter und dessen Strahlwegs mit ein. Bei den Experimenten zur Photoneutralisation konnte eindeutig das Meßsignal dem Photodetachment zugeordnet werden. Auch die Linearität des Szintillators konnte eindeutig gezeigt werden. Ebenfalls konnte die Beeinflussung der Einzellinsen auf den Ionenstrahl an Hand neutralisierter Teilchen gezeigt werden: Bei Vergrößerung der Brechkraft wurde der zunächst große Strahldruchmesser mit einem Intensitätsmaximum im Strahlkern zu einer hohlstrahlähnlichen Verteilung mit einem Peak in der Strahlmitte und am Strahlrand fokussiert. Bei weiterer Steigerung der Linsenspannung ließ sich die Intensität im Strahlrand wieder reduzieren. Durch die Veränderung der y–Position wurden Winkelprofile mit den zuvor gemessenen Schlitz–Schlitz Emittanzfiguren verglichen. Dabei konnte der Divergenzwinkel und auch die Lage des Strahlkerns im Rahmen der Meßgenauigkeit sehr gut wiedergegeben werden. Andererseits zeigten sich deutliche Unterschiede bei der Auswertung der Intensitäten. Dies ist zum Teil auf die schlechte Wiedergabe eines Holhlstrahls durch eine zweidimensionale Phasenraumprojektion yy´ zu erklären. Außerdem ist der Ionenstrahl durch die kleine Bauhöhe der Magnetkammer kollimiert worden, was den Strahl im Vergleich zu den vorherigen Schlitz–Schlitz Emittanzmessungen nachhaltig beeinflusst hat. Dagegen wiesen im direkten Vergleich, nämlich der zweidimensionalen, „wahren“ Ortsverteilung des Ionenstrahls am Szintillator mit den aufaddierten Neutralteilchen–Verteilungen, beide Verteilungen sehr ähnliche Muster auf. Die Messungen sind fast ausnahmslos an stark aberrationsbehafteten Ionenstrahlen durchgeführt worden. Dabei konnte die in den Simulationen der Abbildungseigenschaften gefundenen geschlossenen, achtförmigen Verteilungen unter Berücksichtigung der begrenzten Nachweisempfindlichkeit des Detektors sehr gut nachvollzogen werden.
The following thesis is concerned with the elucidation of structural changes of RNA molecules during the time course of dynamic processes that are commonly denoted as folding reactions. In contrast to the field of protein folding, the concept of RNA folding comprises not only folding reactions itself but also refolding- or conformational switching- and assembly processes (see chapter III). The method in this thesis to monitor these diverse processes is high resolution liquid-state NMR spectroscopy. To understand the reactions is of considerable interest, because most biological active RNA molecules function by changing their conformation. This can be either an intrinsic property of their respective sequence or may happen in response to a cellular signal such as small molecular ligand binding (like in the aptamer and riboswitch case), protein or metal binding. The first part of the thesis (chapters II & III) provides a general overview over the field of RNA structure and RNA folding. The two chapters aim at introducing the reader into the current status of research in the field. Chapters II is structured such that primary structure is first described then secondary and tertiary structure elements of RNA structure. A special emphasis is given to bistable RNA systems that are functionally important and represent models to understand fundamental questions of RNA conformational switching. RNA folding in vitro as well as in vivo situations is discussed in Chapter III. The following chapters IV and V also belong to the introduction part and review critically the NMR methods that were used to understand the nature and the dynamics of the conformational/structural transitions in RNA. A general overview of NMR methods quantifying dynamics of biomolecules is provided in chapter IV. A detailed discussion of solvent exchange rates and time-resolved NMR, as the two major techniques used, follows. In the final chapter V of the first part the NMR parameters used in structure calculation and structure calculation itself are conferred. The second part of the thesis, which is the cumulative part, encompasses the conducted original work. Chapter VI reviews the general NMR techniques applied and explains their applicability in the field of RNA structural and biochemical studies in several model cases. Chapter VII describes the achievement of a complete resonance assignment of an RNA model molecule (14mer cUUCGg tetral-loop RNA) and introduces a new technique to assign quaternary carbon resonances of the nucleobases. Furthermore, it reports on a conformational analysis of the sugar backbone in this RNA hairpin molecule in conjunction with a parameterization of 1J scalar couplings. Achievements: • Establishment of two new NMR pulse-sequences facilitating the assignment of quaternary carbons in RNA nucleobases • First complete (99.5%) NMR resonance assignment of an RNA molecule (14mer) including 1H, 13C, 15N, 31P resonances • Description of RNA backbone conformation by a complete set of NMR parameters • Description of the backbone conformational dependence in RNA of new NMR parameters (1J scalar couplings) Chapters VII & VIII summarize the real-NMR studies that were conducted to elucidate the conformational switching events of several RNA systems. Chapter VIII gives an overview on the experiments that were accomplished on three different bistable RNAs. These molecules where chosen to be good model systems for RNA refolding reactions and so consequently served as reporters of conformational switching events of RNA secondary structure elements. Achievements: • First kinetic studies of RNA refolding reactions with atomic resolution by NMR • Application of [new] RT-NMR techniques either regarding the photolytic initiation of the reaction or regarding the readout of the reaction • Discovery of different RNA refolding mechanisms for different RNA molecules Deciphering of a general rule for RNA refolding methodology to conformational switching processes of RNA tertiary structure elements. The models for these processes were a) the guanine-dependent riboswitch RNA and b) the minimal hammerhead ribozyme. Achievements: • NMR spectroscopic assignment of imino-resonances of the hypoxanthine bound guanine-dependent riboswitch RNA • Application of RT-NMR techniques to monitor the ligand induced conformational switch of the aptamer domain of the guanine-dependent riboswitch RNA at atomic resolution • Translation of kinetic information into structural information • Deciphering a folding mechanism for the guanine riboswitch aptamer domain • Application of RT-NMR techniques to monitor the reaction of the catalytically active mHHR RNA at atomic resolution In the appendices the new NMR pulse-sequences and the experimental parameters are described, which are not explicitly treated in the respective manuscripts.
Die Zuckertransporterfamilie ist eine Unterfamilie der MFS („major facilitator superfamily“), wobei die MFS wiederum als Überfamilie von Transportproteinen definiert wurde, die sich aus Proteinen mit 12 Transmembran-Domänen zusammensetzt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollte die subzelluläre Lokalisation und physiologische Funktion der uncharakterisierten Mitglieder der Zuckertransporterfamilie Ybr241 und Ygl104 untersucht werden. Mittels Zellfraktionierung durch Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation und Fluoreszenzmikroskopie konnte eine Lokalisation von Ybr241 und Ygl104 in der vakuolären Membran festgestellt werden. Da Plasmamembran-Proteine zur Degradation ubiquitiniert, über Endocytose internalisiert und in der Vakuole abgebaut werden, wurden weitere Lokalisationsstudien sowohl in Endocytose-Mutanten als auch in einer Mutante mit Defekten in der Ubiquitinierung durchgeführt. Diese ergaben, daß die vakuoläre Lokalisation nicht auf Degradation zurückzuführen war. Somit handelt es sich bei Ybr241 und Ygl104 um residente vakuoläre Membranproteine. Lokalisationsstudien in vps-Mutanten erbrachten Hinweise darauf, daß zumindest Ygl104, wie die meisten vakuolären Proteine, über den CPY-Weg zur Vakuole befördert wird. Weder durch Wachstumsanalysen noch mit Hilfe von Phenotype MicroArrays™ (Biolog, Inc.) konnten Phänotypen der Deletionsmutanten von Ybr241 und Ygl104 identifiziert werden. Allerdings zeigte sich im Verlauf der Arbeit, daß die Deletionsmutanten einen Vorteil beim Wachstum mit geringen Glucosekonzentrationen bei 37°C haben. Des weiteren bestanden aufgrund von Datenbankanalysen Anhaltspunkte auf eine Beteiligung am Trehalosestoffwechsel. Durch Hitzeschockexperimente konnte eine essentielle Rolle von Ybr241 und Ygl104 bei der Resistenz von Zellen gegenüber schwerem Hitzestreß identifiziert werden. Die verminderte Thermotoleranz der Deletionsmutanten war aber nicht auf einen geringeren Gehalt der Zellen am Streßschutzmolekül Trehalose zurückzuführen. Zudem deckte ein SGA („synthetic genetic array“) eine synthetisch kranke Interaktion von YBR241C und YGL104C mit dem Gen der Trehalose-6-Phosphat-Synthase TPS1 auf. Diese Interaktion sprach gegen eine Beteiligung der Genprodukte am Trehalosestransport, da tps1-Mutanten keine Trehalose enthalten. tps1-Mutanten haben einen Wachstumsdefekt mit schnell fermentierbaren Kohlenstoffquellen, der höchstwahrscheinlich auf einen Mangel an freiem Phosphat zurückzuführen ist. Somit scheinen die Proteine Ybr241 und Ygl104 die intrazelluläre Phosphatkonzentration zu beeinflussen. Eine Analyse ergab, daß der Phosphat- und Polyphosphatgehalt der Mutanten teilweise stark herabgesetzt war. Der Einfluß könnte direkt durch Phosphatimport in die Vakuole stattfinden oder sekundär über eine Verminderung der Glycerinproduktion, da durch die Synthese von Glycerin wieder Phosphat freigesetzt wird. Somit handelt es sich bei Ybr241 und Ygl104 möglicherweise um vakuoläre Phosphat- oder Glycerintransporter. Ferner konnte gezeigt werden, daß die saure Trehalase Ath1 sekretiert wird und Trehalose extrazellulär in Glucose hydrolysiert. Die Glucosemoleküle werden dann von der Hefezelle aufgenommen und verstoffwechselt. Somit spielt Ath1 eine essentielle Rolle beim Wachstum der Hefe mit Trehalose als Kohlenstoffquelle. Ziel des zweiten Teils dieser Doktorarbeit war die Entwicklung eines genomweiten Screens nach ER-Verpackungschaperonen, durch den bisher unbekannte Verpackungschaperone identifiziert werden sollten. Durch Testen verschiedener Varianten des Screens konnte ein Verfahren entwickelt werden, das prinzipiell funktionierte. Für den Einsatz im genomweiten Maßstab war es jedoch ungeeignet, da mit einer hohen Rate an falsch negativen Ergebnissen zu rechnen gewesen wäre.
Einfluss von Erythropoetin auf die Proliferation und Viabilität humaner Synovialisfibroblasten
(2007)
Das Glykoprotein Erythropoetin (Epo) ist ein wichtiger Regulatur der Erythropoese. Über Bindung an seinen Rezeptor regt Epo die Proliferation, Differenzierung und Ausreifung erythroider Vorläuferzellen im Knochenmark an, fördert die Hämoglobinsynthese und steigert die Erythrozytenproduktion, indem es die Apoptose erythroider Stammzellen verzögert. Rekombinantes humanes Erythropoetin (rHu-Epo) wird seit 1989 in klinischen Studien zur Korrektur der Anämie vom Typ der chronischen Infektion oder Entzündung bei Rheumatoider Arthritis eingesetzt. Hierbei konnte neben einem Anstieg des Hämoglobingehaltes mehrfach eine Reduktion der Entzündungsaktivität rheumatischer Gelenke beobachtet werden. Es fiel vor allem eine Reduktion der Anzahl geschwollener und schmerzhafter Gelenke auf. Eine protektive Wirkung von Epo auf verschiedene Arten von Gewebe ist vielfach vorbeschrieben worden. So besitzt Epo in Tiermodellen die Fähigkeit, Organe wie Gehirn, Niere und Herz vor ischämischen Schädigungen zu schützen. In vorangegangenen Arbeiten zur Epo-induzierten Reduktion der Entzündungsaktivität humaner Synovialisfibroblasten bei Rheumatoider Arthritis wurde die Expression des Epo-Rezeptors und eine Hemmung der induzierten Prostaglandinproduktion gefunden. In der hier vorgelegten Arbeit wurde an diese Erkenntnisse angeknüpft und nach weiteren Möglichkeiten gesucht, über welche Epo seine antientzündliche Wirkung ausüben könnte. Die Vermutung, dass Epo über eine reduzierte Expression von Interleukin-8 in primären Synovialiszellen anti-chemotaktisch wirken könnte, ließ sich jedoch in unserem Versuch mittels ELISA nicht bestätigen. Auch die Überlegung, dass die Expression der Hämoxygenase-1 an dem antientzündlichen Effekt beteiligt sein könnte, mussten wir verwerfen, nachdem sich im Western Blot kein Hinweis darauf fand. Da in der Literatur mehrfach sowohl eine zytoprotektive Wirkung von Epo durch Hemmung der natürlichen Apoptose als auch proliferationsfördernde Eigenschaften in extramedullären Geweben beschrieben worden ist, wurde in dieser Arbeit auch der Einfluss von Epo auf Proliferation und Viabilität in humanen Synovialisfibroblasten untersucht. Hierbei konnten wir mit Hilfe eines MTS-Assay eine gewisse durch Epo induzierte Zunahme der Anzahl humaner Synovialisfibroblasten nachweisen. Mittels Durchflusszytometrie nach Propidiumiodid-Färbung der Zellen konnte außerdem gezeigt werden, dass Epo protektiv gegen den TNF-induzierten Zelltod wirkt. Hinweise für eine proliferationsfördernde Epo-Wirkung fanden wir im Gegensatz dazu nicht. Zusammenfassend konnten wir eine zytoprotektive Wirkung von rHu-Epo auch in synovialen Zellen finden. Über den molekularen Mechanismus der gesuchten anti-entzündlichen Wirkung können wir keine Aussage treffen.
Background The purpose of the trial was to evaluate the safety and performance of the new Protégé stent in the treatment of common and/or internal carotid artery stenoses. Methods The Protégé® GPS stent is a self-expanding Nitinol stent system. It is mounted on a 6 Fr 0.018” (6-9mm stent) or 7 Fr, 0.035” (10mm stent) over-the-wire-delivery system and includes a new stent release system which allows exact placement of the stent. Seventyseven patients were enrolled in the trial. Study patient assessments were conducted clinically and by duplex scan at baseline, peri-procedure, discharge, one and six months post procedure. Results Seventyseven lesions were treated. Thirtyone lesions were symptomatic, 46 lesions were asymptomatic. The procedure was technically successful in 76 (99%) lesions. The percentage of stenosis was reduced from 86 ± 7 % to 16 ± 8 %. One procedure failed because the embolic protection device could not be retrieved and the patient was sent to surgery. Within 30 days there were 4 (5.2%) Major Adverse Neurological Events (MANEs). Three of the MANEs were major strokes (3.9%), one a minor stroke. The fifth MANE occurred prior to the six month follow-up visit; this patient had a major stroke 75 days after the procedure and died 36 days later. One additional death occurred due to urosepsis. Conclusions The trial shows that the Protégé stent satisfies safety and performance criteria for the treatment of carotid artery stenosis. The complication rate was comparable to the incidence of these events in other recent carotid stent and endarterectomy studies.
Ziel dieser Arbeit war es, zentrale Wirkungen von Statinen näher zu untersuchen. Hierbei sollten zum einen die Statin-Effekte auf die zerebrale und membranäre Cholesterinhomöostase näher untersucht werden, zum anderen sollten Effekte von Statinen auf die APP-Prozessierung sowie auf apoptotische Regulatoren im Gehirn in vivo analysiert werden. Einfluss unterschiedlicher Applikationsformen auf zentrale Statin-Effekte Bislang ist noch nicht vollständig aufgeklärt, ob und inwieweit Statine die zerebrale Cholesterin- oder Isoprenoidsynthese beeinflussen. Statine werden in tierexperimentellen in vivo-Studien bei oraler Wirkstoffapplikation über unterschiedliche Applikationsformen verabreicht wie Schlundsondierung, über das Trinkwasser oder das Futter – der Einfluss der unterschiedlichen Applikationsformen auf die zentralen Statineffekte ist allerdings nicht bekannt. Die zerebralen Statinkonzentrationen wurden bislang nur nach Applikation per Schlundsonde im Tiermodell bestimmt. Für alle anderen oralen Applikationsformen liegen keine Konzentrations-Zeit-Profile der zerebralen Statinspiegel vor. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten über einen direkten Vergleich der Applikation von Lovastatin und Pravastatin über das Futter und per Schlundsonde zeigen, dass zentrale Statin-Effekte insbesondere auf membranärer Ebene entscheidend durch die Wahl der Applikationsform beeinflusst werden. Effekte von Simvastatin auf die zerebrale Cholesterinhomöostase – Vergleich Maus – Meerschweinchen In der vorliegenden Arbeit wurden die Effekte von Simvastatin auf die zentrale und periphere Cholesterinhomöostase in zwei verschiedenen in vivo-Modellen, Mäusen und Meerschweinchen, untersucht. Sowohl Mäuse wie auch Meerschweinchen stellen etablierte Tiermodelle für Untersuchungen des Cholesterin- und Lipoprotein-Metabolismus dar. Allerdings weisen Meerschweinchen eine grössere Ähnlichkeit zum Menschen im Bezug auf den Lipidstoffwechsel auf als die Maus. Die auffälligste Übereinstimmung zwischen Mensch und Meerschweinchen ist, dass auch bei Meerschweinchen die Mehrheit des Cholesterins in LDL transportiert wird. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass insgesamt eine subchronische Simvastatin-Behandlung in Mäusen und Meerschweinchen nicht die gleichen Effekte auf die periphere und zentrale Cholesterinhomöostase hat. Allerdings belegen die Ergebnisse an beiden Tiermodellen, dass generell eine subchronische Simvastatin-Gabe die zerebrale Cholesterinhomöostase nicht negativ beeinflusst. Allerdings werden insbesondere die Serumcholesterinspiegel, die Cholesterinkonzentration in synaptosomalen Plasmamembranen und die DPH-Anisotropie in den beiden Tiermodellen vermutlich aufgrund von Speziesunterschieden im Lipidstoffwechsel in unterschiedlichem Ausmaß beeinflusst, so dass Speziesunterschiede bei der Interpretation tierexperimentellen Statin-Studien immer beachtet werden sollten. Effekte von Simvastatin auf die APP-Prozessierung in vivo Es ist bekannt, dass Statine einen unmittelbaren Einfluss auf die membranäre Cholesterinhomöostase ausüben und dabei vermutlich über eine Veränderung von Raft-Strukturen die APP-Prozessierung modulieren. In der vorliegenden Arbeit wurde der Effekt einer subchronischen Simvastatin-Gabe auf die APP-Prozessierung in einem transgenen AD-Mausmodell (APP751SL-Mäuse) untersucht. Durch die Simvastatin-Behandlung wird eine Umverteilung des Cholesterins aus dem cytofacialen Membranblatt ins exofaciale Membranblatt in synaptosomalen Plasmamembranen induziert und die Proteinexpression des Raft-Markers Flotillin wird signifikant reduziert. Diese Veränderungen innerhalb der synaptosomalen Plasmamembranen sind mit einer Zunahme der Spiegel von unlöslichem Abeta im Gehirn der APP751SL-Mäuse assoziiert. Vermutlich war die Cholesterinsenkung in der Membran nicht stark genug, um die an der APP-Prozessierung beteiligten Sekretasen per se zu inaktivieren. Es scheint vielmehr zu einer Dislokalisation der Rafts zu kommen, die über eine räumliche Annäherung von APP und β-Sekretase/γ-Sekretase letztendlich zu einer erhöhten APP-Prozessierung führt. Darüberhinaus ist in unserer Studie eine Abnahme der Konzentration an löslichem Abeta1-40 im Gehirn der Simvastatin behandelten APP751SL-Mäuse nachweisbar sowie eine gleichzeitige Erhöhung der Konzentration an löslichem Abeta1-40 im Plasma. Dieser Befund deutet darauf hin, dass die Clearance von zerebralem löslichem Abeta1-40 ins Blut durch Simvastatin erhöht wurde. Neuroprotektive Effekte von Simvastatin Es gibt vermehrt Hinweise darauf, dass Statine neben ihrer cholesterinsenkenden Wirkung zentrale protektive Effekte im Rahmen neurologischer Erkrankungen wie Alzheimer Demenz (AD) oder ischämischem Schlaganfall vermitteln. In einer vorangehenden Studie an Mäusen konnten wir zeigen, dass eine subchronische Simvastatin-Gabe eine erhöhte Genexpression des antiapoptotischen Proteins Bcl-2 induziert. In der vorliegenden Arbeit kann dieser Befund im Gehirn von Meerschweinchen bestätigt werden und darüberhinaus kann nachgewiesen werden, dass Simvastatin eine Reduktion der Proteinexpression des proapoptotischen Proteins Bax im Gehirn der behandelten Meerschweinchen induziert. An dissoziierten Hirnzellen wurde anschließend untersucht, ob die signifikante Reduktion der Ratio Bax/Bcl-2 durch Simvastatin-Gabe im Gehirn von Meerschweinchen auf mitochondrialer Ebene protektiv wirkt gegen oxidativen und nitrosativen Stress sowie gegen den Bcl-2 Antagonisten HA 14-1. An dissoziierten Hirnzellen der behandelten Meerschweinchen wirkt Simvastatin über eine Senkung der Ratio Bax/Bcl-2, nachfolgende Hemmung der Caspase-Aktivierung und eine Stabilisierung des mitochondrialen Membranpotentials protektiv. Diese protektiven Wirkungen von Simvastatin sind im Rahmen neurologischer Erkrankungen wie der AD und dem ischämischem Schlaganfall von großer Bedeutung, da bei diesen Erkrankungen Apoptose und mitochondriale Dysfunktion eine Schlüsselrolle in neurodegenerativen Prozessen spielt.
In Eukaryonten findet der Prozess des Spleißens im Spleißosom, einer sich permanent reorganisierenden, molekularen Maschine, statt. In diesem Prozess werden die kodierenden Sequenzen, die Exons, von den nicht kodierenden Sequenzen, den Introns, getrennt und zusammengefügt. Durch die permanente Reorganisation des Spleißosoms war es bisher nicht möglich, die dreidimensionale Struktur der unterschiedlichen Komplexe in einer hohen Auflösung zu bestimmen. Tuschl et al. haben ein Ribozym entwickelt. Dieses bildet über den Angriff einer 2'-Hydroxylgruppe eines Adenosins auf das Phosphatrückgrat eines Guanosins ein Lariat. Diese Reaktion ist vergleichbar dem ersten Schritt der Spleißreaktion. In dieser Arbeit wurde das Ribozym vor der Ausbildung der Lariatstruktur charakterisiert. Eine Voraussetzung zur Strukturaufklärung mit NMR ist die Zuordnung der Resonanzen. Die Zuordnung zeigte, dass ein Teil der linearen Form des Ribozyms in zwei Konformationen vorliegt. Hier findet ein langsamer konformationeller Austausch statt, der die Resonanzüberlagerung erhöht und damit die Zuordnung der Signale erschwert. Aus diesem Grund wurden unterschiedliche Isotopen markierte Proben für die Zuordnung verwendet. Zur Verifizierung der Sekundärstruktur wurden neben NMR-Experimenten Mutationsstudien am Ribozym eingesetzt. Das Ribozym bildet zwischen g1-c12 und g17-c27 eine Helix. Die Helix weist neben kanonischen Basenpaarungen auch nicht kanonische Basenpaarungen auf. Die Adenosine am Anfang der Helix interagieren mit Nukleotiden in 3'-Position des branchpoint Adenosins. Dadurch befindet sich das branchpoint Adenosin a48 nahe dem g1. Zwischen diesen beiden Nukleotiden findet die Umesterung statt, in der das Lariat gebildet wird. Nach der Lariatbildung sind in den NMR Spektren nur noch die Resonanzen der kurzen Helices P1 und P2 zu beobachten. Die anderen Resonanzen unterliegen einem konformationellen Austausch. Die Struktur des Ribozyms verändert sich also nach der Lariatbildung beträchtlich. In der Spleißreaktion, aber auch in anderen katalytischen Prozessen besitzt die 2'-Hydroxylgruppe der RNA eine essentielle Funktion. Auch die wesentlichen strukturellen Unterschiede zwischen der RNA und DNA sind auf die 2'-Hydroxylgruppe zurückzuführen. Bislang liegen jedoch nur moleküldynamische Berechnungen und NMR-spektroskopische Untersuchungen an einzelnen Nukleotiden vor, die sich mit der Konformation der 2'-Hydroxylgruppe beschäftigen. In dieser Arbeit wurden erstmals die Konformationen der 2'-Hydroxylgruppen einer dreißig Nukleotide umfassenden RNA, der TAR-RNA, mit Hilfe von 3J-Kopplungen und NOEs bei niedrigen Temperaturen in Lösung ermittelt. Die Konformationsanalyse ergibt, dass die 2'-Hydroxylgruppen der unteren Helix der TAR-RNA in einem konformationellen Gleichgewicht zwischen der O3'- und der Basendomäne vorliegen. In beiden Orientierungen können sich die 2'-Hydroxylgruppen am Aufbau eines Netzwerks aus Wassermolekülen beteiligen, in dem zwei Wassermoleküle die große Furche der RNA Helix überspannen. Durch den Wechsel der 2'-Hydroxylgruppen zwischen der O3'- und Basen-Domäne unterliegt das Netzwerk einer stetigen Reorganisation.
Im Jahr 2000 wurde am Soreq Nuclear Research Center in Yavne bei Tel Aviv, Israel, der Neubau der Forschungsanlage SARAF (Soreq Applied Research Accelerator Facility) begonnen. Mit dem Bau der Anlage sollen neue Forschungsfelder erschlossen, sowie die vorhandenen Experimente erweitert werden, der Forschungsreaktor IRR1 und die vorhandenen Beschleunigeranlagen werden damit abgelöst. Kernstück der Anlage ist der Linearbeschleuniger aus EZR-Ionenquelle, LEBT, RFQ, MEBT und 46 supraleitenden HWRs, damit soll ein 5 mA Deuteronen CW-Strahl der Teilchenenergie 40 MeV erzeugt werden.
Das Steroid-Hormon 17ß-Estradiol ist maßgeblich an der Entstehung und Entwicklung von Brustkrebs beteiligt. Die intrazelluläre Verfügbarkeit des aktiven Estrogens, 17ß-Estradiol, wird durch die 17ßHydroxysteroiddehydrogenase (17ßHSDl) reguliert, die die NADPH-abhängige Reduktion von Estron zu Estradiol katalysiert. Damit stellt die 17ßHSD1 einen interessanten Ansatzpunkt für die Entwicklung neuer Inhibitoren im Hinblick auf potente Wirkstoffe gegen Brustkrebs dar. Die 17ß-Hydroxysteroiddehydrogenase 2 bevorzugt hingegen die oxidative Aktivität und wandelt die biologisch aktiven Hydroxysteroide wie Estradiol in ihre inaktiven Ketoformen um. Ein möglicher Inhibitor der 17ß-HSD1 sollte demnach die Funktion der 17ß-HSD2 nicht beeinträchtigen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Strategien und Methoden entwickelt, die 17ßHSD1 durch heterologe Expression erstmals in E. coli darzustellen. Durch NMR-Spektroskopie in Kombination mit Docking konnten detaillierte Aussagen über die Bindungsepitope der untersuchten Liganden gemacht werden. Diese Informationen sind für eine gerichtete Optimierung von Leitstrukturen von großer Bedeutung.
Die vorliegende monozentrische, prospektive, randomisierte Studie untersuchte 238 Koronarangioplastien mittels neuer und resterilisierter Ballonkatheter hinsichtlich eines Unterschiedes des prozeduralen Erfolges und der Restenoserate bei verschiedenen Stenosemorphologien unterschiedlichen Alters und bei Koronarangioplastien mit und ohne Stentimplantation. Bei 124 Patienten wurde eine PTCA mittels eines neuen Ballonkatheters und bei 114 Patienten eine PTCA mittels eines resterilisierten Ballonkatheters durchgeführt. Es zeigte sich, dass die neuen Ballonkatheter eine signifikant höhere Erfolgsrate aufwiesen als die wiederaufgearbeiteten Katheter (p = 0,01). Desweiteren war die Anzahl der insgesamt verwendeten Ballonkatheter bei den Koronarangioplastien mittels resterilisierter Ballonkatheter signifikant höher als bei den Dilatationen, die mittels neuer Ballonkatheter durchgeführt wurden (p = 0,03). Bei der Nachangiographie im Intervall von durchschnittlich vier Monaten war nach Verwendung von wiederaufgearbeiteten Ballonkathetern signifikant häufiger eine erneute PTCA notwendig als nach PTCA mittels neuer Katheter (p = 0,01). Dies betrifft vorwiegend Koronarangioplastien, die allein mit Ballondilatation ohne Stenteinlage durchgeführt wurden. Was die Komplikationsrate angeht, so war diese bei Dilatationen mittels resterilisierter Ballonkatheter signifikant höher als bei denen mittels neuer Ballonkatheter (p = 0,02). Hinsichtlich der Untersuchungsdauer, der Strahlenbelastung, der Durchleuchtungszeit, des Kontrastmittelverbrauchs und der Dauer des stationären Aufenthaltes war kein signifikanter Unterschied nachzuweisen. Es zeigte sich jedoch der Trend, dass es bei den wiederaufgearbeiteten Kathetern zu einer länger Untersuchungsdauer und damit auch zu einer größeren Strahlenbelastung, längeren Durchleuchtungszeit, höheren Kontrastmittelverbrauch und auch zu einem längeren stationären Aufenthalt kommt.
Einleitung Das zentrale Nervensystem ist aufgrund seiner geringen Ischämietoleranz ein besonders gefährdetes Organsystem des Körpers während herzchirurgischer Eingriffe. Die vorliegende Dissertation überprüft anhand eines Schweinemodells, ob ein Zusammenhang zwischen retinaler und zerebaler Blutströmungsgeschwindigkeit, repräsentiert durch die SLDF gemessene Blutströmung in der Retina und durch den transkraniellen Doppler (TCD) gemessenen Fluss über die Arteria cerebri media vor, während und nach extrakorporaler Zirkulation (EKZ) besteht und somit der SLDF als Überwachungsmethode der zerebralen Durchblutung eingesetzt werden kann. Das Ziel dieser Untersuchung ist eine erste Validierung des SLDF als eine Messmethode der zerebralen Blutströmung während herzchirurgischer Eingriffe in einem Tiermodell. Materialien und Methoden Nach der Genehmigung durch die zuständige Tierschutzkommision wurden 6 Hausschweine (Yorkshire Duroc, männlich und weiblich) mit einem mittleren Gewicht von 37,3 ± 9,4 kg in diese Untersuchung aufgenommen. Eine transkranielle Dopplersonde (EME Nicolet Pioneer TC 4040) wurde über der rechten Arteria cerebri media fixiert. Zur Erhebung der retinalen Blutströmungsgeschwindigkeit wurde über dem rechten Auge die Scanning Laser Doppler Flowmetrie (SLDF) platziert. Die Messungen wurden vor (T1=nach 30 minütiger Anästhesie; T2=nach 30 minütiger Anästhesie vor der EKZ unter 100%iger Ligatur der Vena cava inferior), während (T3=10 Minuten nach Beginn der EKZ; T4=Ende der zweistündigen EKZ) und nach (T5=60 Minuten nach Beendigung der EKZ; T6=60 Minuten nach Beendigung der EKZ unter 100%iger Ligatur der Vena cava inferior) einer ACVB-Operation unter extrakorporaler Zirkulation (EKZ) durchgeführt. Ergebnisse Signifikante Korrelationen in der Spearman-Rang Korrelation und in der Regressionsanalyse zwischen der retinalen Blutströmung (detektiert durch den SLDF) und der Blutströmung in der A. cerebri media (detektiert durch den TCD) sind vor (T1, T2), während (T3) und nach der EKZ (T5, T6) vorhanden. Lediglich zum Messzeitpunkt T4 konnte keine Korrelation nachgewiesen werden. Schlussfolgerung Diese Untersuchung zeigt, dass sich vor, während und nach der EKZ die retinale Blutströmung und die Blutströmung in der A. cerebri media gleichwertig verhalten. Die fehlende Korrelation zwischen der Blutströmung in der A. cerebri media detektiert durch den TCD zur retinalen Blutströmung kurz vor Ende der EKZ während des Zeitpunktes T4, ist auf die sich ändernden Durchmessern der Kapillaren in der Retina bei nahezu unveränderter Durchmesser an den großen Gefäßen, wie der A. cerebri media zurückzuführen. Da die Regulation der Durchblutung überwiegend in den Kapillaren stattfindet, stellt sich die Frage, ob die SLDF nicht doch eine exaktere Aussage bezüglich der retinalen und somit der zerebralen Blutströmung zulässt. Die Messung des TCD über die A. cerebri media und deren Aussagekraft über die zerebrale Durchblutung wird seit Jahren von einigen Autoren angezweifelt und in diversen Studien als ungenau bezeichnet. Durch den Einblick in die kapillaren Systeme der Retina ist die Möglichkeit gegeben, in die Regulationsvorgänge der Gefässe einzusehen, um daraus auf die Durchblutung z.B. des Zerebrums Rückschlüsse zu erhalten. Welche dieser Messmethoden, die bisher etablierten Methoden TCD oder doch die neue Messmethode SLDF die Erfassung der zerebralen Durchblutung besser wiedergibt, muss in weiteren Studien evaluiert werden. Auch müssen untere Grenzwerte für die retinalen Blutströmung definiert werden, bevor diese Methode Einzug in den klinischen Alltag finden kann.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Modellierung von Kundenorientierung und Kundenzufriedenheit und ihren Antezedenzen. Gerade in diesem Forschungsbereich gibt es eine unüberschaubare Zahl an Veröffentlichungen, doch wurden bestimmte Aspekte stets vernachlässigt, wie die Unterscheidung zwischen personaler und organisationaler Kundenorientierung. Aus der Unterscheidung ergibt sich, dass für beide Aspekte der Kundenorientierung unterschiedliche Antezedenzen anzunehmen sind. Die empirische Prüfung der unterschiedlichen Antezedenzen erfolgt in der Literatur zumeist nur für eine der beiden Formen der Kundenorientierung. Weiterhin ist die verwendete Methode bei der Untersuchung der Zusammenhänge von Kundenorientierung und Kundenzufriedenheit zu kritisieren: Fast immer werden Gruppen von Kunden zusammengefasst, ihre Werte gemittelt und mit Gruppen von Mitarbeitern verglichen. Die Rolle der Vorgesetzten wird zwar theoretisch angenommen und betont, jedoch keiner empirischen Prüfung unterzogen. In der vorliegenden Doktorarbeit werden verschiedene theoretische Modelle und Befunde zur Kundenorientierung und Kundenzufriedenheit integriert, um daraus ein umfassenderes Modell der Antezedenzen der Kundenorientierung und der Deszendenz (Kundenzufriedenheit) zu bilden. Integration soll dahingehend erreicht werden, dass organisationale und personale Antezedenzen in einem einzigen Modell zusammengeführt werden, anstatt diese in getrennten Theorien zu betrachten. Des Weiteren wird zwischen organisationaler und personaler Kundenorientierung unterschieden. Personale Kundenorientierung wird als positive Einstellung von Mitarbeitern ihren Kunden und der Arbeit mit Kunden gegenüber aufgefasst. Persönliche Kundenorientierung beinhaltet aber auch die Intention, diese Einstellung in kundenorientierte Performanz umzusetzen (Kundenorientierte Verhaltensintention) und wird demnach nicht im Sinne eines Traits verstanden. Organisationale Kundenorientierung wird aus der Sicht der Mitarbeiter als wahrgenommene Servicequalität der Organisation konzipiert. Der Vergleich der persönlichen Kundenorientierung von Mitarbeitern und der Kundenzufriedenheit erfolgt auf individueller Ebene: Die Aussagen einer Gruppe von Kunden wurden ihrem Servicemitarbeiter zugeordnet. Die Stichprobe dieser Arbeit wurde im medizinisch-therapeutischen Umfeld erhoben- ein (existentiell bedeutsamer) Dienstleistungssektor, der sich zunehmenden Interesses und steigender wirtschaftlicher Bedeutung erfreut. Es wurden insgesamt Daten von n = 851 Probanden mittels Querschnitt erhoben (n = 685 Kunden und n = 166 Dienstleister). Die aufgestellten Hypothesen wurden überwiegend bestätigt. Es konnten verschiedene Antezedenzen der personalen und der organisationalen Kundenorientierung belegt werden: Arbeitsbedingungen, Merkmale des sozialen Systems der Organisation sowie Merkmale des Vorgesetzten beeinflussen organisationale Kundenorientierung. Antezedenzen der persönlichen Kundenorientierung von Mitarbeitern sind Persönlichkeitsmerkmale, Einstellungen gegenüber der Organisation und soziale Kompetenzen. Die direkte Wirkung der Kundenorientierung auf Kundenzufriedenheit konnte nachgewiesen werden, aber auch mediierte Effekte. Demnach verstärken Antezedenzen der Kundenorientierung die personale bzw. organisationale Kundenorientierung und beeinflussen dadurch die Kundenzufriedenheit. Direkte Effekte ergeben sich für organisationale Kundenorientierung und Kundenzufriedenheit, wohingegen persönliche Kundenorientierung nur teilweise mit Kundenzufriedenheit korreliert. Die Rolle des Vorgesetzten wurde in ihrer Bedeutsamkeit belegt, insbesondere dadurch, dass eine Wirkung auf organisationale Kundenorientierung aufgezeigt werden konnte, die wiederum die Kundenzufriedenheit stark beeinflusst. Insgesamt hat sich gezeigt, dass sich Kundenorientierung differenziert betrachten lässt und dadurch empirisch verschiedene Zusammenhänge nachgewiesen werden können.
We consider the theory of high temperature superconductivity from the viewpoint of a strongly correlated electron system. In particular, we discuss Gutzwiller projected wave functions, which incorporate strong correlations by prohibiting double occupancy in orbitals with strong on-site repulsion. After a general overview on high temperature superconductivity, we discuss Anderson’s resonating valence bond (RVB) picture and its implementation by renormalized mean field theory (RMFT) and variational Monte Carlo (VMC) techniques. In the following, we present a detailed review on RMFT and VMC results with emphasis on our recent contributions. Especially, we are interested in spectral features of Gutzwiller-Bogoliubov quasiparticles obtained by extending VMC and RMFT techniques to excited states. We explicitly illustrate this method to determine the quasiparticle weight and provide a comparison with angle resolved photoemission spectroscopy (ARPES) and scanning tunneling microscopy (STM). We conclude by summarizing recent successes and by discussing open questions, which must be solved for a thorough understanding of high temperature superconductivity by Gutzwiller projected wave functions.
Dynamische Aspekte im Kaufverhalten : die Determinanten von Kaufzeitpunkt, Marken- und Mengenwahl
(2007)
Die vorliegende Arbeit untersucht das Wahlverhalten von Konsumenten in differenzierten Produktkategorien des Konsumgütermarktes. Ausgangspunkt ist die Beobachtung, dass ein Marketing-Mix nicht nur die aktuellen Reaktionen der Konsumenten, sondern auch die resultierenden Konsequenzen für die Zukunft berücksichtigen muss. So führen insbesondere Preispromotions, welche den größten Anteil des Marketing-Budgets bei Konsumgütern in Anspruch nehmen, oft lediglich zu einer Vorverlagerung der Käufe statt zu einem Mehrabsatz durch Markenwechsel und sind daher durchaus kritisch zu bewerten. Anhand von Haushaltspaneldaten zweier Produktkategorien wird der Einfluss dynamischer Aspekte im Rahmen der Konsumentenentscheidungen hinsichtlich Kaufzeitpunkt, Marken- und Mengenwahl untersucht. Auf Grund kontroverser Diskussionen in der Marketing-Forschung bezüglich der korrekten Modellierung der drei Entscheidungen, steht diese neben der expliziten Spezifikation der Dynamiken im Fokus der Betrachtungen. Die empirischen Analysen sowie die anschließenden Simulationen von Marktszenarien zeigen zunächst die Überlegenheit einer getrennten gegenüber einer gemeinsamen Nutzenfunktion bei der Modellierung der drei Entscheidungen auf. Des Weiteren findet sich in einer Produktkategorie die Abhängigkeit der Preissensitivität der Konsumenten von der in der Vergangenheit beobachteten Häufigkeit von Preispromotions. Die Preissensitivität in der Mengenwahl ist dabei von dieser Häufigkeit wesentlich stärker betroffen als die der Markenwahl, was als Erklärungsansatz für die empirisch beobachtete Vorverlagerung von Käufen gewertet werden kann.
Das humane Cytomegalovirus (hCMV) ist ein ubiquitär verbreitetes Pathogen. Die CMV-Infektion ist eine nicht selten lebensbedrohliche Komplikation bei immunsupprimierten Organ- und Knochenmarktransplantat-Empfängern. Bei immunkompetenten Individuen hingegen verläuft eine CMV-Infektion in der Regel asymptomatisch. Wie am Beispiel der murinen CMV (mCMV)-Infektion gezeigt werden konnte, erfolgt die Immunkontrolle durch CD8 T-Zellen. Im Infektionsmodell der BALB/c (H-2d) Maus dominieren CD8 T-Zellen mit Spezifität für zwei antigene Peptide: Ein Ld-restringiertes Peptid aus dem immediate early (IE1)-Protein m123, sowie ein Dd-restringiertes Peptid aus dem early (E)-Protein m164. Der konzertierten Aktion der viralen Immunevasionsproteine von mCMV gelingt es nicht, die Expression dieser beiden Peptide auf der Oberfläche infizierter Zellen zu verhindern. Der ORFm164 wurde 1996 von Rawlinson et al. vorhergesagt und umfasst demnach 1284 Nukleotide, die für ein Protein von 46,6 kDa kodieren. Über die mRNA und das tatsächliche Genprodukt des ORFm164 war zu Beginn dieser Arbeit jedoch nichts bekannt. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Transkriptions- und Translations-Analysen zeigten, dass der eigentliche ORFm164 kürzer ist als vorhergesagt. So konnte mittels 5´/3´ RACE eine ungespleißte, 2004 Nukleotide große mRNA identifiziert werden, die einen 1011 Nukleotide langen ORF, sowie 5´ und 3´ flankierende UTRs umfasst. Das eigentliche Start-AUG der m164-mRNA liegt in einer Kozak-ähnlichen Konsensussequenz, wobei dieses Startcodon nicht dem von Rawlinson vorhergesagten ersten AUG entspricht. Vielmehr startet die Translation am dritten AUG und generiert ein m164 Genprodukt mit einer apparenten molekularen Masse von 38 kDa. Schließlich konnte m164 als Typ-I Membranglykoprotein charakterisiert werden. Das Protein ist ein frühes E-Phase Protein, das bereits ab 2 h p.i. und während der gesamten E-Phase abundant exprimiert wird. Pulse-Chase Experimente wiesen darauf hin, dass m164 relativ instabil ist. Mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz konnte neben einer ER-Lokalisation auch eine Kolokalisation von m164/gp38 mit den Proteinen der inneren Kernmembran Emerin und LaminB2 nachgewiesen werden. Eine direkte Interaktion zwischen diesen Proteinen und m164/gp38 konnte durch Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET)-Experimente allerdings ausgeschlossen werden. FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching)-Analysen haben ergeben, dass m164/gp38 in der äußeren Kernmembran lokalisiert ist. Somit könnte m164/gp38 eine Rolle beim Prozess des Deenvelopments der im Perinuklearraum lokalisierten primären Virionen spielen, indem es die Fusion zwischen primärer Virushülle und äußerer Kernmembran unterstützt und dadurch die Freisetzung der Kapside ins Zytoplasma ermöglicht. Diese Hypothese soll in weiterführenden Arbeiten überprüft werden.
P2X-Rezeptoren sind ligandengesteuerte Kationenkanäle, die durch extrazelluläres ATP aktiviert werden. Bisher wurden sieben Isoformen kloniert (P2X1-P2X7), die eine gemeinsame Topologie besitzen, bestehend aus intrazellulären N- und C-Termini, zwei Transmembranregionen und einer großen Ektodomäne. Um funktionelle Ionenkanäle ausbilden zu können, müssen P2X-Untereinheiten in Homo- oder Heterotrimere assemblieren. Das übergeordnete Ziel der vorliegenden Arbeit war das Identifizieren von Proteindomänen, die zu der Trimerisierung von P2X-Untereinheiten beitragen. Hierzu diente in erster Linie die humane P2X5- (hP2X5-) Untereinheit, der durch Herausspleißen von Exon 10 eine Region fehlt, die in der Literatur als eventuell wichtig für die Assemblierung beschrieben wird. Exon 10 kodiert 22 Aminosäuren, die in der distalen Ektodomäne und der äußeren Hälfte der zweiten Transmembranregion liegen. Das Fehlen dieser Aminosäuren führt zu Untereinheiten, die nicht in der Lage sind, zu trimerisieren und funktionelle Ionenkanäle auszubilden. Durch das schrittweise Einsetzen der von Exon 10 kodierten Aminosäuren in die hP2X5-Untereinheit sowie die Expression verschiedener Alanin-Mutanten mit nachfolgender Analyse durch Blaue-Native-PAGE konnte gezeigt werden, dass das fehlerhafte Assemblierungsverhalten der hP2X5-Untereinheit in erster Linie durch das Fehlen der äußeren Hälfte der zweiten Transmembranregion bewirkt wird. Zusätzliche gezielte Mutationen und die Konstruktion von Deletionsmutanten ergaben weiterhin, dass die zweite Transmembranregion vornehmlich als hydrophober Membrananker dient, um die korrekte Topologie und Positionierung von Assemblierungsdomänen zu gewährleisten. Die wichtigsten Assemblierungs-informationen scheinen in der Ektodomäne zu liegen. Die einzige Aminosäure in der zweiten Transmembranregion, die einen spezifischen Einfluss auf die Trimerisierung von hP2X5-Untereinheiten hatte, war 355D. Einzelmutationen in dieser Position zeigten, dass nur Aminosäuren, deren Seitenketten in der Membran interhelikale Wasserstoffbrücken ausbilden können, eine effiziente Trimerisierung ermöglichen. Dieses Ergebnis legte den Schluss nahe, dass 355D die Assemblierung unterstützt, indem es die Interaktion zwischen den Untereinheiten über eine Wasserstoffbrückenbildung stabilisiert. Die Suche nach einem potentiellen Interaktionspartner von 355D in der ersten Transmembranregion durch Einzelmutationen und Cystein-Crosslinking war allerdings nicht erfolgreich. Dies könnte bedeuten, dass die beiden Transmembranregionen jeweils benachbarter Untereinheiten nicht, wie für P2X2-Untereinheiten gezeigt, in einer „head to tail“-Orientierung angeordnet sind, sondern nur die zweiten Transmembranregionen miteinander in Kontakt stehen. Limitierte Proteolyse von hP2X5-Rezeptormutanten ergab einen engen Zusammenhang zwischen der Trimerisierung und der Resistenz gegenüber einer Proteolyse durch Trypsin. Daraus folgt, dass trimerisierungsfähige P2X-Mutanten korrekt gefaltet sind, während ein Verlust der Trimerisierungsfähigkeit eine Fehlfaltung anzeigt. Neben dem hP2X5-Rezeptor wurden auch Ratten-P2X1- (rP2X1-) Rezeptoren untersucht. rP2X1-Konstrukte, die lediglich aus der Ektodomäne sowie einem abspaltbaren Signalpeptid bestanden, konnten zwar partiell multimerisieren, aber keine definierten Trimere bilden. Die Analyse weiterer Konstrukte zeigte, dass beide Transmembranregionen für die Trimerisierung wichtig sind, auch wenn sie keine spezifischen Assemblierungsinformationen enthalten. Ein systematisches Alanin-Scanning der gesamten Ektodomäne der rP2X1-Untereinheit ergab, dass die Ektodomäne multiple Sequenzmotive enthält, die zu der Trimerisierung beitragen. Die genaue Rolle der identifizierten Sequenzmotive muss in weiteren Experimenten geklärt werden. Zusätzlich wurden Chimären aus rP2X1- und Ratten-P2X6- (rP2X6-) Untereinheiten untersucht. Da rP2X6-Untereinheiten nicht in der Lage sind zu trimerisieren, könnten sie in Kombination mit Sequenzelementen aus rP2X1-Untereinheiten ermöglichen, trimerisierungsrelevante Proteindomänen zu identifizieren. Es zeigte sich, dass eine Chimäre, die die Ektodomäne der rP2X1-Untereinheit und die Transmembranregionen und zytosolischen Domänen der rP2X6-Untereinheit enthielt, trimerisieren konnte, während die umgekehrte Chimäre dies nicht vermochte. Dies war ein weiterer Hinweis darauf, dass die Motive, die für die Trimerisierung von P2X-Untereinheiten essentiell sind, in der Ektodomäne liegen. Zusammenfassend belegen diese Ergebnisse, dass die Transmembranregionen bei der Assemblierung im Wesentlichen eine Funktion als hydrophobe Membrananker haben, die die korrekte Topologie und Positionierung der extrazellulären Assemblierungsdomänen ermöglichen. Die initiale Assemblierung wird durch die Ausbildung einer interhelikalen Wasserstoffbrücke über 355D stabilisiert. Somit können die wichtigsten Assemblierungsdomänen in Kontakt treten, die in der Ektodomäne lokalisiert sind.
Optimierung Apolipoprotein-modifizierter Albumin-Nanopartikel zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke
(2007)
Das Gehirn höherer Säugetiere ist durch die Blut-Hirn-Schranke vor dem Eindringen toxischer und schädlicher Substanzen geschützt. Allerdings bildet diese Barriere auch ein Hindernis für die gezielte medikamentöse Therapie von Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie zum Beispiel Alzheimer, Gehirntumore oder Parkinson. Leider sind nur wenige potentielle Arzneistoffe für die Therapie dieser Krankheiten in der Lage die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden. Somit stellt die Blut-Hirn-Schranke einen limitierenden Faktor für die Arzneimitteltherapie dar. Diese Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Herstellung, Charakterisierung, in vitro und in vivo Testung Liganden-modifizierter Nanopartikel auf Proteinbasis zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke. Als Ligand wurde das Apolipoprotein E, ein Bestandteil von physiologisch vorkommenden HDL, VLDL und LDL-Partikel, verwendet, welches sich in vorangegangenen Untersuchungen als potentieller Ligand zum Transport von Nanopartikeln ins Gehirn erwiesen hat. Diese so mit Apolipoprotein modifizierten Nanopartikel wurden mit dem Modellarzneistoff Loperamid, einem nicht gehirngängigen Opioid, beladen. Diese Zubereitung wurde Mäusen injiziert und der analgetische Effekt mittels des Tail-Flick-Tests bestimmt. Um auch eine therapeutische Anwendung zu erzielen, wurden Apolipoprotein modifizierte Partikel beladen mit dem Zytostatikum Doxorubicin entwickelt und die chemotherapeutische Effizienz an Gehirntumor tragenden Ratten getestet.
Die Montagne Noire am Südrand des französischen Zentralmassivs gehört in das Vorland der französischen Varisziden. Es handelt sich um einen metamorphen Kemkomplex mit einem Kern ("Axialzone") aus Graniten sowie teilweise migmatisierten Ortho- und Paragesteinen. Die Axialzone wird im Norden ("Nordflügel") und Süden ("Südflügel") von paläozoischen Sedimenten umrahmt. Der Nordflügel wird in die "westlichen Monts de Lacaune" (im Westen) und die "Nördliche Schuppenzone" (im Osten) unterteilt und besteht aus Gesteinen mit kambrischem bis silurischem Alter. Der Südflügel wird von einem Stapel aus mehreren Deckeneinheiten aufgebaut, deren stratigraphisches Alter vom Kambrium bis ins Karbon reicht. Die Deckeneinheiten heißen (von oben nach unten im Stapel): Pardailhan-Decke, Minervois-Decke, Mont Peyroux-Decke, Faugeres-Decke und Parautochthon. Die Montagne Noire repräsentiert den seltenen Fall eines "heißen" metamorphen Kernkomplexes, ist aber auch ein ideales Gebiet für vergleichende methodische Studien der sehr niedriggradigen Metamorphose: unterschiedliche Gesteinstypen (Sand- und Siltsteine, Tonschiefer, verschiedene Karbonate) lassen sich quer zur Metamorphosezonierung vom Bereich der Diagenese bis in die Grünschieferfazies verfolgen. In der vorliegenden Arbeit wurde die tektono-metamorphe Entwicklung der niedriggradigen paläozoischen Sedimente untersucht. Dazu wurde eine flächenhafte Studie der Schichtsilikatentwicklung in den Peliten durchgeführt. Es wurden folgende Methoden angewandt: Kubier Index ("Illitkristallinität"), Arkai-Index ("Chloritkristallinität"), "bo-Index" (zur Bestimmung des geothermischen Gradienten), Polytypie-Untersuchungen, sowie an ausgesuchten Proben Mikrosondenanalytik und Röntgenfluoreszenzanalyse. Femer wurden von K. Wemmer (Göttingen) an einigen Proben K-Ar-Datierungen der Feinfraktionen (<2 mikro m und <0,2 mikro m) durchgeführt, um die Entwicklung auch zeitlich zu erfassen. Die petrologischen und geochronologische Daten wurden zur Deformation in Bezug gesetzt. Dabei wurden sowohl Literaturdaten als auch eigene strukturgeologische Befunde verwendet. Es konnten drei tektono-metamorphe Hauptphasen nachgewiesen werden: Die erste Phase (D1 entspricht dem variszischen Deckenbau. Dabei wurde eine M1-Metamorphose angelegt, die durch den bo-Index als Mitteldruck-Metamorphose charakterisiert werden kann. Das Strukturinventar belegt einen etwa südgerichteten tektonischen Transport während D1. Diese Phase ist in der Nördlichen Schuppenzone sowie im W-Teil der Pardailhan-Decke erhalten. Das Alter dieser Phase konnte in kambro-ordovizischen Gesteinen mit der K-Ar-Methode auf 340 bis 330 Ma datiert werden. Diese Alter zeigen eine gute Übereinstimmung mit Ar/Ar-Datierungen aus den im N angrenzenden grünschieferfaziellen Decken des Albigeois. In den tieferen Decken des Südflügels, die ursprünglich weiter im Süden gelegen haben, kann die D1-Deformation erst nach Ende der Flyschsedimentation an der Grenze Vise/Namur (<320 Ma) stattgefunden haben. Die zweite Phase (D2) entspricht dem Aufstieg des metamorphen Kemkomplexes. Im Kontakt mit dem aufsteigenden, heißen Kern ist der größere Teil der paläozoischen Hüllschichten kinematisch und thermisch geprägt wurden. Dabei sind Strukturen und Mineralbestand von D1 und M1 ganz oder teilweise gelöscht worden. Die Extensions-bedingte penetrative S2-Schieferung ist im größten Teil des Südflügels das dominante Flächensystem: dies gilt für das Parautochthon, die gesamte Faugeres-Decke. den westlichen Teil der Mont Peyroux-Decke, den östlichen Teil der Pardailhan- Decke und wahrscheinlich auch die Minervois-Decke. Der Grad der Mz-Metamorphose, die auch in den westlichen Monts de Lacaune (Nordflügel) die prägende Metamorphose ist, nimmt generell mit zunehmender Entfernung von der Axialzone ab. Der bo-Index belegt Niederdruck-metamorphe Bedingungen. K-Ar-Datierungen aus verschiedenen Decken des Südflügels ergeben für D2/M2 Werte zwischen 310 und 300 Ma. Dieses Altersspektrum entspricht Ar/Ar-Datierungen (etwa 311 bis 303 Ma; synkinematischer Biotit und Muskovit; Maluski et al.1991) aus Scherzonen am S-Rand der Axialzone, die während der Exhumierung angelegt wurden. Die K-Ar-Alter der paläozoischen Decken passen auch sehr gut zu U/Pb-Altem aus Paragneisen (308 Ma, Monazit; Gebauer et al. 1988), Graniten (308 Ma, Monazit) und migmatischen Gneisen (313 Ma; beide Krause et al. 2004) der Axialzone, die eine starke thermische Aktivität zu dieser Zeit belegen. Das dritte metamorphe Ereignis (M3) ist unter Anderem im Stephanbecken von Graissessac, nachgewiesen, das im Zuge der Extensionstektonik (D2) am ENE-Ende der Axialzone entstanden ist. Nach dem bisherigen Kenntnisstand ist diese Metamorphose statisch. Der bo-Index belegt - wie auch bei M2 - eine LP-Metamorphose. Sie wurde vermutlich durch magmatische Instrusionen hervorgerufen. M3 muss jünger sein als das U-Pb-Alter eines Tuffes im tiefen Teil der Stefan-Abfolge (c. 295 Ma). Dazu passen Rb-Sr Mineralisochronen von 292 bis 277 Ma aus zwei benachbarten Granitplutonen. Ähnliche Alter treten auch in Pegmatiten der Axialzone auf. Nicht alle der untersuchten Bereiche können eindeutig einer der drei tektono-metamorphen Hauptphasen zugeordnet werden (St. Gervais-Einheit im NE der Axialzone, östlicher Teil der Mont Peyroux-Decke). Dies liegt vielfach an einer unzureichenden strukturgeologischen Datenlage. Teilweise haben aber auch Alterationsprozesse stattgefunden, welche die K-Ar-Alter verjüngt haben, oder der regionale Metamorphosegrad ist sehr niedrig. Schließlich ist in schwach anchimetamorphen oder nur diagenetisch beeinflussten Gesteinen die bo-Index-Methode nicht anwendbar. Insgesamt bestätigen die regionalen Untersuchungen das Bild eines heißen Gneiskerns, der während seines Extensions-bedingten Aufstieges seine Hüllschichten syntektonisch aufheizt. Zusätzlich zur geodynamischen Fragestellung wurden in dieser Arbeit auch methodische Aspekte verfolgt. Der Schwerpunkt lag hierbei auf der Untersuchung der K-Na-Verteilung in den Illiten bzw. Muskoviten. Es hat sich gezeigt, dass einige Proben Paragonit und/oder K/Na-Illit rührten. Diese Minerale stören die Bestimmung der Illitkristallinität im Röntgendiffraktogramm, da sich ihre Peaks mit denen des Illit überlagern. Es wurden daher verschiedene "Peak-Fittings" durchgeführt, bei denen sich zum einen zeigte, dass der 10 A-Peak besser für das Fitting von Illit und diskretem Paragonit geeignet ist als der 5 A-Peak. Es wurde zudem festgestellt, dass es nur schwer oder gar nicht möglich ist, Illit und eine K/Na-Phase mit einer zufriedenstellenden Qualität zu fitten. da die Peakmaxima zu nahe beieinander liegen. Eine Mikrosondenanalyse (teilweise auch Mikrosonden- Mapping) der betreffenden Proben zeigte, wie unterschiedlich die K-Na-Verteilung in den Illiten im anchimetamorphen Bereich sein kann. Es wurden diskrete Mineralphasen, eine domänenartige Verteilung und auch relativ homogene Mischkristalle beobachtet.
Typ-I-Diabetes, Morbus Basedow und Hashimoto-Thyreoiditis zählen zu den multifaktoriellen Autoimmunerkrankungen, bei deren Entstehung genetische, immunologische sowie Umwelt- und psychosoziale Faktoren beteiligt sind. Die immunologischen und genetischen Komponenten werden durch die HLA-Genregion dominiert. Diese ist Teil des Haupthistokompatilitäts-Systems (major histocompatibility complex, MHC) auf dem kurzen Arm von Chromosom 6 und beinhaltet die wichtigsten prädisponierenden Gene für Typ-I-Diabetes und anderer Autoimmunerkrankungen. Innerhalb dieser Genregion befindet sich die DQ-LTR3. In ersten Teil der vorliegenden Arbeit wird ein möglicher Einfluss der endogenen retroviralen LTR-Sequenzen (ERV9 LTR3), die im HLA-DQ/DR-Gen lokalisiert sind, auf Morbus Basedow untersucht. Frequenzanalysen bei Morbus Basedow und Kontrollkollektiven sowie deren möglicher Zusammenhang mit den Risiko-Haplotypen DQA1*0501, DQB1*0201 zeigen keine signifikanten Unterschiede. Ein zweiter Teil dieser Arbeit befasst sich mit dem Polymorphismus des CTLA4-Gens. Dieses auf Chromosom 2q33 liegende Gen zählt zu den „prädisponierenden Gen-Loci“ und weist drei SNPs (single nucleotide polymorphisms) auf. Es wirkt als Repressor der T-Zell-Proliferation. In dieser Arbeit wird die Substitution von Cytosin an Position 318 der Promoterregion des CTLA4-Gens durch Thymin untersucht. In der geschlechtspezifischen Verteilung des CTLA4-Promoterpolymorphismus zeigt sich kein signifikanter Unterschied. Im Rahmen einer Verteilungsanalyse konnte eine Korrelation des CTLA4 Promoterpolymorphismus und der Risikoallele DQ8, DQ2, DQA1*0501/DQA1*0301 und DQB1*0201/DQB1*0302 nicht bestätigt werden. Assoziationsstudien in Familien mit Typ-I-Diabetes, Morbus Basedow oder Hashimoto-Thyreoiditis zeigen keine direkten Korrelationen zu der Vererbung untersuchter Polymorphismen. In Familien mit einem am Morbus Basedow erkrankten Kind dagegen kann ein deutlicher Unterschied bei der parentalen Transmission des CTLA4-Promoterpolymorphismus beobachtet werden. Bei maternaler Transmission gab es keine signifikanten Unterschiede. Haplotypen mit dem Cytosin-Allel an Position 318 werden deutlich häufiger von Vätern an die Patienten vererbt. Sollte sich dies in weiteren Studien mit höherer Anzahl untersuchter Familien bestätigen, so wäre dies ein Indiz für eine parentale Prägung von prädisponierenden Allelen bezüglich Morbus Basedow. Abschließend konnte in dieser Arbeit die Substitution von Cytosin zu Thymin an Position 318 der CTLA4-Promoterregion bei Familien mit Morbus Basedow oder mit Typ-I-Diabetes nicht als ein unabhängiger Risikomarker bestätigt werden. Die unmittelbare Nachbarschaft der drei Polymorphismen lässt allerdings eine Kopplung der einzelnen Polymorphismen vermuten, was in weiteren Arbeiten näher untersucht werden sollte.
Ziel dieser retrospektiven Studie war es, bei Patienten mit peripherer arterieller Verschlusskrankheit die Langzeitergebnisse nach PTA und anschließendem Stenting der Arteria femoralis superficialis (AFS) mit Nitinolstents zu untersuchen und die Offenheitsrate mit derer von Stahlstents zu vergleichen. Ausgewertet wurden die Krankenakten von 128 Patienten (mittleres Alter: 66 Jahre; Intervall 45 – 89 Jahre; 88 Männer und 40 Frauen), die sich im Zeitraum von März 1999 bis Dezember 2002 einer PTA mit anschließender Stentimplantation der Arteria femoralis superficialis unterzogen. Insgesamt wurden 144 Beine mit 145 Stahlstents und 110 Nitinolstents behandelt. 14 Patienten (9,7%) befanden sich zum Zeitpunkt der Intervention im Stadium IIa nach Fontaine, 111 (77,1%) im Stadium IIb, 6 (4,2%) im Stadium III und 13 (9,0%) im Stadium IV. Bei den Läsionen handelte es sich um 93 Okklusionen (64,6%) und 51 Stenosen (35,4%). Die mittlere Dauer des Follow-up betrug 446 Tage (Intervall: 0 – 1612 Tage). Die Kontrolluntersuchungen, bestehend aus Gehstrecken- und ABI-Bestimmung sowie der duplexsonographischen Darstellung des behandelten Gefäßabschnittes erfolgten während des stationären Aufenthaltes, nach 1, 3, 6 und 12 Monaten sowie anschließend im Jahresabstand. Weitere Kontrollen ergaben sich aus der klinischen Situation. Die technische Erfolgsrate betrug in der Nitinolgruppe 98,5%, in der Gruppe der mit Stahlstent versorgten Läsionen 98,7%. Der ABI stieg von durchschnittlich 0,57 auf 0,84 bei den Nitinolstents und von durchschnittlich 0,56 auf 0,78 bei den Stahlstents. In der Nitinolgruppe ergaben sich 21 Komplikationen (31,8%), in der Stahlgruppe 26 (33,3%), darunter eine Amputation. Die primären Offenheitsraten nach 6, 12, 24 und 36 Monaten lagen bei 92%, 72%, 58% und 52% nach Implantation von Nitinolstents gegenüber 78%, 61%, 51% und 49% nach Implantation von Stahlstents. Die sekundären Offenheitsraten betrugen 100%, 98%, 91% und 88% bzw. 100%, 94%, 91% und 88%. Aufgrund dieser Ergebnisse verspricht der Einsatz von Nitinolstents nach perkutaner transluminaler Angioplastie im Bereich der Arteria femoralis superficialis eine nur geringe Verbesserung der Langzeitergebnisse gegenüber den Stahlstents. Ausgezeichnet durch einen hohen technischen und klinischen Erfolg stellt die Implantation von Nitinolstents dennoch eine komplikationsarme Alternative zur gefäßchirurgischen Therapie dar.
The ABC protein ABCE1, also called HP68 or RNase L inhibitor (RLI), is one of the most conserved proteins in evolution. It is universally expressed in eukaryotes and archaea, where ABCE1 is essential for life. ABCE1 plays a crucial role in translation initiation and ribosome biogenesis, however, the molecular mechanism of ABCE1 remains unclear. In addition to two ABC ATPase domains, ABCE1 contains a unique N-terminal region with eight conserved cysteines predicted to coordinate iron-sulfur (Fe-S) clusters. To analyze the function of ABCE1, the hyperthermophilic crenarchaeote Sulfolobus solfataricus was chosen as a model system. S. solfataricus ABCE1 was overexpressed homologously in S. solfataricus and heterologously in E. coli. Noteworthy, for tagged-protein production in S. solfataricus a novel expression system based on a virus shuttle vector was established. This is the first example for a successful overexpression and purification of isolated full-length ABCE1. For the first time it was shown that ABCE1 indeed bears biochemical properties of an ABC protein even though it has unique features. Remarkably, the nucleotide binding domains (NBDs) of ABCE1 bound ATP and AMP, but were functionally non-equivalent in ATP hydrolysis. Mutations of conserved residues in the second NBD led to a hyperactive ATPase, which implies an intramolecular mechanism of dimer formation. Truncation of the Fe-S cluster domains did not influence ATPase activity. The Fe-S clusters of ABCE1 were analyzed by biophysical and biochemical methods. As presented in this study, ABCE1 harbors two essential diamagnetic [4Fe-4S]2+ clusters, one ferredoxin-like cluster formed by cysteines at position 4/5/6/7 and one unique ABCE1 cluster formed by cysteines at position 1/2/3/8. ABCE1 was found to be associated with RNA after purification from S. solfataricus and bound ribosomal RNA in vitro. In addition, ABCE1 showed homo-oligomerization and appeared to form a hexameric complex of ~440 kDa, which was RNase sensitive. Archaeal ABCE1 associated with ribosomes, however, the unique Fe-S clusters of ABCE1 were not required for this interaction. Although archaeal ABCE1 assembled with ribosomes and ribosomal RNA, ABCE1 proved not to be essential for translation in S. solfataricus and did not interact with archaeal initiation factors. Nevertheless, the ABCE1 gene is one of the few genes conserved between archaea and eukaryotes and fulfills a universal task, which needs further characterization.
Worum geht es in dieser Arbeit? Dies ist eine Arbeit über Websites. Darüber, wie sie gelesen und geschrieben werden und wie man das lernen kann. Da es in dieser Arbeit um Lesen, Schreiben und Lernen geht, fließen in sie sowohl Aspekte der Sprachwissenschaft als auch der Sprachdidaktik ein. Was will diese Arbeit? Diese Arbeit hat zwei Ziele, ein sprachwissenschaftliches und ein sprachdidaktisches. In sprachwissenschaftlicher Hinsicht sollen, auf der Grundlage einer gründlichen Analyse seiner Eigenschaften, die Besonderheiten des Lesens und Schreibens im World Wide Web herausgearbeitet werden. Aufbauend auf dieser Analyse sollen im sprachdidaktischen Teil der Arbeit die Kompetenzen ermittelt und in Beziehung zueinander gesetzt werden, die zur Erstellung von Websites notwendig sind. Das so entstehende Kompetenzmodell bildet die Basis für eine zielgerichtete, effektive und evaluierbare Umsetzung der Gestaltung von Websites in der Schule und die Grundlage für weiterführende empirische Arbeiten. Wie ist die Arbeit aufgebaut? Im ersten Kapitel der Arbeit wird die Entwicklung der technischen und strukturellen Formate geschildert, welche die Grundlage des Websiteformats bilden. Darauf aufbauend werden seine wichtigsten Eigenschaften beschrieben. Im zweiten Kapitel wird das Websiteformat von anderen kommunikativen Formaten abgegrenzt und mit Hilfe der besonderen Charakteristika, die es besitzt, sein überwältigender Erfolg erklärt. Im dritten Kapitel wird unter Rückgriff auf Ergebnisse der Leseforschung und empirische Untersuchungen zum Lesen im World Wide Web erarbeitet, welchen Einfluss das Websiteformat auf das Lesen von Texten hat und welche Unterschiede es zum Lesen von Texten in anderen kommunikativen Formaten gibt. Auf dieser Grundlage wird ein Bewertungs- und Analyseraster für die Lesbarkeit von Texten im Websiteformat entwickelt. Im vierten Kapitel wird auf der Grundlage verschiedener Modelle des Schreibprozesses dargestellt, was das Schreiben für das Websiteformat vom Schreiben für andere Formate unterscheidet, was dabei besonders beachtet werden muss und welche Entwicklungen für die Zukunft zu erwarten sind. Dabei werden, unter Berücksichtigung des in Kapitel drei erarbeiteten Bewertungs- und Analyserasters, Hinweise für eine sinnvolle Vorgehensweise bei der Gestaltung von Websites gegeben. Im fünften Kapitel wird vor dem Hintergrund der aktuellen bildungspolitischen Diskussion ein Kompetenzmodell für die Gestaltung von Websites entwickelt, das als Basis für die Festlegung von Bildungsstandards und die Beschreibung der Rahmenbedingungen dient, unter denen diese in der Schule verwirklicht werden können. In einer abschließenden Diskussion werden die wichtigsten Ergebnisse nochmals herausgearbeitet und es wird auf Perspektiven für zukünftige sprachwissenschaftliche und sprachdidaktische Forschungsvorhaben hingewiesen.
NP25 wurde im Jahre 1994 als ein in allen Bereichen des zentralen Nervensystems Neuron-spezifisch exprimiertes Gen in der adulten Ratte identifiziert (Ren et al., 1994). Durch eigene Vorarbeiten konnte diese selektive neuronale Expression im Huhnembryo bestätigt werden, wobei die Expression von NP25 im Neuralrohr, den sympathischen paravertebralen Ganglien und sensorischen Hinterwurzelganglien vor der terminalen Differenzierung und Scg10-Expresison beginnt (M.Pape, Diplomarbeit, 2003). In dieser Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass NP25 in diesen Geweben nach den proneuralen Faktoren Ascl1 und Ngn2 exprimiert wird, zu einem Zeitpunkt an dem die Vorläuferzellen mit der Differenzierung beginnen. Im Neuralrohr beginnt die Expression von NP25 zeitgleich mit der Expression von NeuroM, einem der frühesten Marker für junge, postmitotische differenzierende Neurone (Roztocil et al., 1997). NP25 stellt somit einen der frühesten panneuronalen Marker für differenzierende Neurone dar. Das NP25-Protein ist in den Zellkörpern und Fortsätzen der Neurone im Neuralrohr und den untersuchten peripheren Ganglien lokalisiert, wobei die Fasern der Motoneurone, im Gegensatz zu deren Zellkörpern, NP25-negativ sind. Mit voranschreitender Differenzierung nimmt die NP25- Proteinkonzentration ähnlich wie die Expression auf mRNA-Ebene ab, wobei in den peripheren Ganglien NP25 über einen längeren Zeitraum hinweg auf hohem Niveau exprimiert wird. Kultivierte Neurone aus sensorischen Hinterwurzelganglien und sympathische Neurone der paravertebralen Ganglien zeigen eine Lokalisation des NP25-Proteins im Zytoplasma der Zellkörper und Fortsätze, wobei NP25 in den sympathischen Neuronen wesentlich stärker exprimiert wird. Dieser Befund konnte durch die Analyse der Proteinkonzentration mit Hilfe der Western Blot Methode bestätigt werden. Die Überexpression von NP25 in verschiedenen Zelltypen führte zu verstärktem oder reduzierten Neuritenauswachsen, wobei die Effekte mit dem NP25-Niveau korrelieren. Zellen mit einem geringen endogenen NP25-Expressionsniveau, wie sensorische Neurone aus fünf Tage alten Huhnembryonen und PC12-Zellen, reagieren auf die Erhöhung des NP25-Gehalts mit verstärktem Längenwachstum der Neuriten, während sympathische Neurone aus sieben Tage alten Huhnembryonen, die ein hohes endogenes Expressionsniveau aufweisen, reduziertes Längenwachstum und reduzierte Verzweigungskapazität zeigen. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass maximales Neuritenwachstum eine optimale NP25-Konzentration erfordert, wobei im Falle der Überexpression von NP25 in den sympathischen Neuronen das Optimum überschritten wird und dadurch Neuritenauswachsen und Verzweigung inhibiert werden. Die Effekte auf das Längenwachstum der Neuriten in den primären Neuronen konnten durch RNAi Experimente bestätigt werden. Neben dem Längenwachstum war auch das initiale Auswachsen von Fortsätzen durch die Veränderung des NP25-Expressionsniveaus betroffen. Im Falle der PC12-Zellen induzierte die NP25-Überexpression nicht nur Längenwachstum der Neuriten, sondern auch die Zahl der Fortsätze pro Zelle wurde erhöht. In den sympathischen Neuronen, in denen durch NP25- Überexpression das Längenwachstum und die Verzweigungskapazität negativ reguliert werden, nimmt die Anzahl der Neuriten pro Zellen nach Erniedrigung des NP25-Expressionsniveaus ebenfalls ab. Dies kann dadurch erklärt werden, dass Längenwachstum und initiales Auswachsen von Neuriten durch unterschiedliche Mechanismen reguliert werden (Glebova and Ginty, 2005; Luo, 2002), was hier möglicherweise dazu führt, dass Längenwachstum negativ und initiales Auswachsen positiv durch NP25 beeinflusst wird. In den sensorischen Neurone führte weder die Erhöhung noch die Erniedrigung des NP25-Expressionsniveaus zu einer Veränderung des initialen Auswachsens, was eine differentielle Regulation der Prozesse bestätigt. Da viele Mitglieder der CaP-Proteinfamilie mit F-Aktin interagieren (Gimona et al., 2002) wurde untersucht, ob NP25 und F-Aktin in kultivierten sympathischen und sensorischen Neuronen und in PC12-Zellen kolokalisieren. In den primären Neuronen wurde im Gegensatz zu der Situation in den PC12-Zellen keine Kolokalisation beobachtet, wobei NP25 und F-Aktin in den PC12-Zellen nur in kleinen Bereichen an den distalen Enden filopodienartiger Fortsätze kolokalisieren. Auch eine Interaktion von NP25 und G-Aktin konnte in den PC-Zellen ausgeschlossen werden. Durch die Identifikation zweier RhoGAP-Proteine (NIRGAP1 und 2) als potentielle Interaktionpartner (M.Geissen, nicht publiziert) könnte NP25 Neuritenauswachsen durch indirekte Beeinflussung des Aktinzytoskeletts über Rho-Signalwege regulieren. Die identifizierten RhoGAPs konnten durch in situ Hybridisierung im Rückenmark, in den Hinterwurzelganglien und den sympathischen paravertebralen Ganglien im Rattenembryo nachgewiesen werden. Sie gehören zu keiner bekannten Familie und unterscheiden sich auch strukturell von den meisten bisher beschriebenen RhoGAPs, da sie mehr als eine (drei) GAP-Domänen enthalten. Durch diesen Befund ergeben sich neue Ansätze für die weiteren Untersuchungen zur Regulation des Neuritenwachstums durch NP25. Da im adulten Nervensystem für NP25 eine Funktion in der Dynamik der Dendriten angenommen wird, sind Untersuchungen der Dendritenausbildung in vitro ebenfalls nahe liegend.
The work presented in this thesis addresses a key issue of the CBM experiment at FAIR, which aims to study charm production in heavy ion collisions at energies ranging from 10 to 40 AGeV . For the first time in this kinematical range, open charm mesons will be used as a probe of the nuclear fireball. Despite of their short decay length, which is typically in the order of few 100 µm in the laboratory frame, those mesons will be identified by reconstructing their decay vertex.
Zur Rolle der Typ-I-Interferone in der Abwehr von viralen Infektionen des zentralen Nervensystems
(2007)
Das zentrale Nervensystem (ZNS) bildet eine einzigartige Umgebung für Immunantworten, da Neuronen eine essentielle und in weiten Teilen nicht-erneuerbare Zellpopulation bilden. Virale Infektionen des ZNS und lokale anti-virale Immunantworten können zu dem Verlust von Neuronen und somit zu katastrophalen Erkrankungen führen. Unter normalen Bedingungen ist das ZNS weitgehend von der Kontrolle durch das Immunsystem ausgeschlossen. In diesem Zusammenhang wurde das ZNS oft auch als „immunprivilegiert“ bezeichnet. Dieses Konzept musste in den letzten Jahren revidiert werden, da es sich gezeigt hat, dass das ZNS nicht völlig vom Immungeschehen isoliert ist. Wichtige Mediatoren antiviraler Immunantworten sind die Typ I Interferone (IFN). Die verschiedenen Typ I IFN binden an einen gemeinsamen Rezeptor, den Typ I Interferon-rezeptor (IFNAR). Die Bedeutung von Typ I IFN Antworten für die Kontrolle viraler Infektionen wurde besonders eindrucksvoll mit IFNAR-defizienten Mäusen (IFNAR-/-) gezeigt. Nach Infektion mit dem neurotropen Vesikulären Stomatitis Virus (VSV) führt das Fehlen des IFNAR zu einer stark erhöhten Empfänglichkeit für tödlich verlaufende Infektionen. In allen Organen und besonders im ZNS von VSV infizierten IFNAR-/- Tieren fanden sich stark erhöhte Virusmengen. Um zu untersuchen, ob die VSV-Infektion des zentralen Nervensystems in IFNAR-/- Mäusen in erster Linie auf ein Versagen der peripheren Immunität oder des IFN Systems innerhalb des ZNS zurückzuführen ist, wurden mittels der Cre loxP Tech-nologie Mäuse hergestellt, die auf allen peripheren Zellen IFNAR exprimieren, während die Neuronen des ZNS IFNAR defizient sind (NesCre+/-IFNARflox/flox). Nach intranasaler VSV Infektion zeigten NesCre+/-IFNARflox/flox Mäuse zunächst keine Krankheitssymptome. Nach 5 bis 6 Tagen traten aber aufsteigende und halbseitige Lähmungen auf, so dass die infizierten Tiere verstärkt im Kreis liefen und schließlich verstarben. Im Vergleich dazu verstarben IFNAR-/- Mäuse bereits nach 2 bis 3 Tagen während normale C57BL/6 Tiere nach Infektion keine Symptome zeigten und überlebten. Der beobachtete Krankheitsverlauf lässt in den IFNAR-/- Mäuse auf ein Multiorganversagen als Todesursache schließen. 3 und 6 Tage nach Infektion konnte in den Organen von C57BL/6 Tieren kein Virus reisoliert werden. In den NesCre+/ IFNARflox/flox Tieren fanden sich zum Todeszeitpunkt nur im Gehirn Viruspar-tikel, während alle anderen Organe virusfrei waren. Die Virustiter im Hirn waren im Vergleich zu den IFNAR-/- Mäusen 10- bis 100-fach erhöht. In den anderen Organen und im Blut sind keine Viruspartikel nachweisbar. Dieser Befund deutete gemeinsam mit den beobachteten Krankheitsverläufen auf eine neuropathologische Symptomatik hin, bei der es wahrscheinlich zu einer VSV-Infektion des Hirnstammes kam. Die Analyse einzelner Regionen des ZNS zeigte in IFNAR-/- Tieren, dass 2 Tage nach Infektion in allen Regionen des ZNS signifikante Virusmengen zu finden waren. In den NesCre+/-IFNARflox/flox und den C57BL/6 Tieren fanden sich zu diesem Zeitpunkt nur im Riechhirn (Bulbus olfactorius) signifikante Virustiter. In den C57BL/6 Tieren blieb das Virus auf diese Region beschränkt und wurde dort innerhalb von 6 Tagen eliminiert. In den NesCre+/-IFNARflox/flox Tieren kam es in den folgenden Tagen jedoch zu einer fortschreitenden Infektion des ZNS, und auch das Großhirn, das Kleinhirn, der Hirn-stamm und das Rückenmark zeigten hohe Virustiter. In der Induktion peripherer Immunantworten unterschieden sich NesCre+/-IFNARflox/flox und C57BL/6 Mäuse nicht. In den WT Tieren kam es im Gegensatz zu den NesCre+/ IFNARflox/flox und IFNAR-/- Tieren innerhalb von 48 Stunden nach Infektion im Riechhirn zu einer Typ I IFN abhängigen Phosphorylierung von STAT-1, einer Komponente des IFNAR-Signaltransduktionsweges. Alles deutet darauf hin, dass die Induktion geringer Mengen Typ I IFN innerhalb des Riechhirns notwendig ist, um Im-munantworten zu aktivieren, die ein Übergreifen der Virusinfektion auf andere Regio-nen des ZNS verhindern. Eine funktionierende Immunität in der Peripherie und die Blut-Hirn-Schranke scheinen nicht ausreichend zu sein, um eine Infektion des ZNS mit VSV zu verhindern. Stattdessen muss es zur Aktivierung von IFN-abhängigen Mechanismen innerhalb des Riechhirns kommen, die ein Übergreifen der VSV Infektion auf andere Hirnregionen verhindert und zur Elimination von VSV im Riechhirn beiträgt.
M6G hat eine viel längere Transferhalbwertzeit zwischen Plasma und zentralnervösem Wirkort als Morphin. Dies wurde experimentell sowohl für die miotischen als auch für die analgetischen Effekte bestimmt. Außerdem werden hohe Mengen systemischen M6Gs benötigt, um die gleichen Effekte wie Morphin zu produzieren. Dies deutet darauf hin, dass M6G bei Nierengesunden nicht zu den akuten zentralnervösen Opioideffekten von Morphin beiträgt. Bei Applikation sehr hoher Dosen von M6G, welche die gleichen Effekte wie klinisch relevante Dosen von Morphin erzeugen, versursachte M6G auch die gleichen Nebenwirkungen wie Morphin. Eine in der Literatur diskutierte bessere Tolerabilität von M6G im Vergleich zu Morphin konnten wir also nicht beobachten. Die Ergebnisse aus den kontrollierten Studien mit gesunden freiwilligen Probanden deuten auf eine Modulation klinischer Wirkungen von M6G und auch von Morphin durch den 118A>GPolymorphismus des OPPM1-Gens hin und könnten damit klinisch relevante Konsequenzen für die Opioidtherapie bei nicht unbedeutend großen Gruppen von Patienten haben. Die pupillenkonstriktorischen Wirkungen von M6G und teilweise auch Morphin (unter analgetischen Dosierungen) als typischer Opioideffekt war bei Trägern des mutierten 118G-Allels weniger stark ausgeprägt als bei Nichtträgern der Variante. Die Anwesenheit des mutierten 118G-Allels reduzierte signifikant die Potenz von M6G unter subanalgetischen Dosierungen (Studie 1) und von Morphin und M6G unter analgetischen Dosierungen (Studie 2). Obwohl die Träger des mutierten 118G-Allels höhere Opioiddosen zur Erlangung einer den Nichtträgern vergleichbaren Analgesie benötigten, kam Erbrechen bei den Mutationsträgern unter analgetischer Opioiddosierung seltener vor. Die Untersuchungen unterstützten damit die Erwartung einer pharmakogenetisch basierten personalisierten Schmerztherapie.
Es galt, im Rahmen eines Vergleiches von prae- und bis zu zehn Jahren postoperativ ermittelten Befunddaten den langzeitigen Effekt einer systematischen Parodontitisbehandlung auf den oralen Gesundheitszustand zu ermitteln. Dazu wurden 76 an der Poliklinik für Parodontologie in Frankfurt behandelten und mehrfach nachuntersuchten Patienten (davon 46 Frauen und 30 Männer) im Alter von 36 bis 79 Jahren die jeweiligen Befunddaten (Plaquebelastung, Zahnfleischbluten, Sondiertiefe, Zahnlockerungen, Zahnverlust, Rezessionen und sondierbare Furkationen) im Sinne der Fragestellung ausgewertet. Es ergab sich in der Tat ein jeweils positiver Effekt der Behandlung, am ausgeprägtesten sechs Wochen bis sechs Monate postoperativ festgestellt, danach sich langsam verschlechternd, aber nicht wieder zum Ausgangsbefund zurückfallend. Schlüsselte man die Patienten noch danach auf, ob sie sich nach Therapieende zu regelmäßigen Nachuntersuchungsterminen vorgestellt hatten oder nicht, dann ergab sich ein zwar nur geringgradiger aber dennoch eindeutiger Effekt zugunsten der „Compliance“-übenden Patienten. Allerdings konnte in keinem einzigen Fall eine komplette Wiederherstellung der vollkommenen parodontalen Gesundheit konstatiert werden. Alle Patienten wiesen nach wie vor, wenn auch geringgradige, pathologische Veränderungen der parodontalen Parameter auf, die eine gewisse Nachbehandlung angeraten erscheinen ließen, um späteren Zahnverlust vorzubeugen. Damit wird einmal mehr deutlich, dass die schon eingangs aus der Literatur zitierte Behauptung, bei der Parodontitis handele es sich um eine chronische Erkrankung mit fortlaufender Behandlungsnotwendigkeit, sich auf klinische Erkenntnisse stützen kann.
Während die Charakterisierung des Verhältnisses zwischen Christentum und Naturwissenschaft als konkurrierend oder feindselig vor allem mit den ältesten Auseinandersetzungen der Frühen Neuzeit assoziiert wird – die Verurteilung Galileo Galileis durch die römische Inquisition (1633) fungiert gleichsam als Symbol des kirchlich-wissenschaftlichen Gegensatzes –, scheinen die jüngsten schulpolitischen Gefechte in den USA eine ungebrochene Aktualität des Konflikts bis in die Gegenwart säkularisierter Gesellschaften zu belegen. Nachdem elf Familien gegen den Beschluss der Schulbehörde von Dover (Pennsylvania) geklagt hatten, im Biologieunterricht neben der darwinschen Evolutionstheorie die Idee des "Intelligent Design" (ID) als gleichberechtigtes Alternativmodell zu präsentieren, fällte der zuständige Bezirksrichter John Jones am 20. Dezember 2005 ein Urteil, welches "Intelligent Design" als religiöse Weltanschauung klassifiziert, dessen Anspruch auf Wissenschaftlichkeit zurückweist und unter Berufung auf die verfassungsmäßige Verankerung der Trennung von Kirche und Staat, welche den Religionsunterricht an staatlichen Schulen verbietet, aus dem Lehrplan verbannt. Seit Januar 2005 waren Biologielehrer der dortigen Highschool zur Verlesung einer Erklärung am Beginn der neunten Klasse verpflichtet, welche die Lückenhaftigkeit der Evolutionslehre betont, "Intelligent Design" als alternative Erklärung über den Ursprung des Lebens vorstellt und schließlich dazu motiviert, sich mit Hilfe der Schulbibliothek über dessen Konzept zu informieren. ...
O programa de ajustamento estrutural na república da Guiné-Bissau : Uma avaliação política e ética
(2007)
Os guineenses assumiram o desenvolvimento como uma das metas a atingir e a estabilização e o ajustamento foi-lhes imposta como solução para os problemas estruturais existentes. No entanto, a forma como têm vindo a ser concebidos pelo Banco Mundial e pelo Fundo Monetário Internacional, direccionada sobretudo para a área económica, acabou por limitar o papel dos Programas de Ajustamento Estrutural (PAE) tidos como indutores do desenvolvimento, tornando-os num agregado de premissas austeras, com resultados não esperados. As propostas do FMI e do BM, tendendo para a liberalização económica e estímulo dos mercados em detrimento da intervenção estatal, traduzem-se em medidas de redução de taxas de utilização dos serviços públicos, supressão de subsídios, redimensionamento da administração pública, cortes, congelamentos salariais e privatizações. Os resultados destas reformas foram catastróficos, porquanto não só não melhoraram o défice orçamental, como os efeitos negativos das restrições orçamentais sobre o bem-estar, geraram um ambiente de promiscuidade social e o agravamento do sector informal como estratégia de sobrevivência Tendo em conta o objecto em estudo, isto é, a relação de forças que encontrámos entre o relacionamento entre os actores políticos guineenses e as Instituições Financeiras Internacionais, notámos que a ausência de comportamentos éticos também influiu nos resultados. Por um lado, o BM e o FMI, perante um Estado fragilizado, apresentaram condicionalismos à obtenção de empréstimos e ajudas, por outro lado, os actores guineenses, mesmo perante este dilema, não se coibiram do exercício da corrupção, do clientelismo e do neo-patrimonialismo, como estratégia para o enriquecimento fácil. Palavras-chave: Programas de Ajustamento Estrutural; Desenvolvimento; Boa governação; Ética e Moral.
Anti-T-Lymphozyten-Globuline (ATG) sind Immunglobuline zur Anwendung am Menschen. Sie werden aus den Seren von Kaninchen oder Pferden gewonnen, die zuvor mit humanen Thymozyten oder einer etablierten humanen T-Zell-Linie immunisiert wurden. ATG besitzen ein sehr starkes immunsuppressives Potenzial. In der klinischen Anwendung werden sie überwiegend bei Organtransplantationen, Knochenmarktransplantationen und zur Behandlung einzelner Autoimmunerkrankungen, wie z. B. der aplastischen Anämie, eingesetzt. Wissenschaftliches Ziel der Arbeit war, einen umfangreichen Beitrag zur immunologischen Charakterisierung und Spezifizierung unterschiedlicher ATG-Präparate zu erbringen. Dies ist eine wesentliche Voraussetzung für die Entwicklung und Validierung experimenteller Methoden, sodass die bisher verwendeten Praktiken der Wirksamkeitsprüfung von ATG entsprechend dem Stand der Wissenschaft abgelöst und der Tierversuch (Affenhaut-Transplantationstest; Balner H et al., 1968) ersetzt werden können. Darüber hinaus wurde in diesem Zusammenhang der Entwurf einer Arzneibuch-Monografie für ATG vorgelegt. Der immunsuppressive Wirkmechanismus von ATG ist selbst nach 40 Jahren klinischer Erfahrung nicht eindeutig geklärt. Ihre Wirksamkeit vermitteln sie über ihre spezifische Bindung an Lymphozyten, woraus sich modellhaft vier Effekte unterscheiden lassen: Die Reihe der Fc-abhängigen zytotoxischen Mechanismen, eine von ATG ausgelöste Aktivierung, eine über Todesrezeptoren (z.B. Fas/Apo-1) von ATG direkt induzierte Apoptose sowie die Maskierung von Rezeptoren. Die zytotoxische Wirkung von ATG und die Induktion des programmierten Zelltodes (Apoptose) wurde am Durchflusszytometer (FACS) nach Färbung der toten Zellen bzw. durch den Nachweis von DNA-Fragmentierung analysiert. Der Einfluss von ATG auf die Lymphozyten-Aktivierung in vitro sowie auf die gemischte Lymphozyten-Reaktion (mixed lymphocyte reaction, MLR) wurde durch Messung der Lymphozyten-Proliferation anhand des Einbaus von radioaktiv markiertem Thymidin bestimmt. Biochemisch wurden die in ATG enthaltenen anti-Lymphozyten-Antikörper durch den sog. Kinase-Assay charakterisiert. In einer nicht radioaktiven Methode wurden Zelloberflächenmoleküle zunächst biotinyliert. Nach Lyse der Zellen wurden die Proteine mit ATG präzipitiert, gelelektrophoretisch aufgetrennt sowie mittels Streptavidin und Chemilumineszenz im Westernblot nachgewiesen. Für das Verständnis der klinischen Wirksamkeit von ATG ist die Aufklärung der molekularen Mechanismen der komplement-unabhängigen, zytotoxischen Wirkung von erheblicher Bedeutung, da die enorme zytolytische, aber auch die breite immunsuppressive Wirkung von ATG nicht allein durch die Fc-abhängige Zytotoxizität erklärt werden kann. ATG können bei bestimmten Zielzellen Fas-abhängige Apoptose auslösen; darüber hinaus sind ATG aber auch in der Lage, einen komplement-unabhängigen Zelltod in Fas-resistenten Zell-Linien und T-Zell-Klonen, die resistent gegenüber aktivierungsinduziertem Zelltod (AICD) sind, auszulösen. In Kompetitionsversuchen konnte gezeigt werden, dass ATG entsprechende Antikörper-Spezifitäten gegen das Molekül CD95 (Fas/Apo-1) enthalten. Ferner konnten wir nachweisen, dass die durch ATG initiierte Fas-abhängige Apoptose und/oder der AICD durch Fas-neutralisierende Antikörper inhibiert werden können, was auch von anderen Arbeitsgruppen gezeigt wurde (Genestier L et al., 1998). Die DNA-Fragmentierung, als Nachweis von Apoptose, lässt sich nach der ATG-Inkubation von Fas-sensitiven Zielzellen durch Inhibitoren der Caspase-1 (Z-VAD-FMK) komplett sowie durch Inhibitoren der Caspase-3 (Ac-DMQD-CHO) und -6 (Ac-VEID-CHO) teilweise inhibieren. Die zytotoxische Wirkung von ATG lässt sich jedoch nicht in gleichem Maße durch Inhibitoren der Caspase-1 reduzieren, wie bei einem Apoptose induzierenden mAk gegen Fas. Es wird deutlich, dass ATG eine breit gefächerte zytotoxische Wirkung auf verschiedene Zellpopulationen ausüben, die alle mehr oder weniger eine Rolle in der klinischen Wirksamkeit von ATG spielen können. ATG sind in der Lage, periphere blutmononukleäre Zellen (PBMC) zu aktivieren, wobei der Proliferationsindex in etwa dem eines Standardmitogens, wie z. B. Phytohämagglutinin (PHA), entspricht. Isolierte T-Lymphozyten werden ebenfalls aktiviert, zeigen jedoch eine geringere Proliferationsrate. In PHA-Blasten lassen sich schwache Veränderungen im Muster der Protein-Tyrosin-Phosphorylierung erkennen, wobei eine gewisse Ähnlichkeit im Bandenmuster sowie in der Intensität zwischen der Stimulation mit ATG und dem anti-CD2 mAk zu erkennen ist. Im Unterschied zu publizierten Studien konnte in dieser Arbeit kein spezifisch hemmender Effekt der ATG auf die MLR nachgewiesen werden. Aus den Untersuchungen zur Charakterisierung der ATG hat sich der komplement-abhängige Zytotoxizitätstest, gemessen am Durchflusszytometer, als die Methode herausgestellt, die, bezogen auf den Wirkmechanismus der ATG und im Hinblick auf eine Routineanwendung in der Chargenprüfung, am besten geeignet ist. Eine Evaluierung der Methode wurde im Rahmen eines Ringversuches, an dem sich sieben verschiedene Labore beteiligten, durchgeführt. Die mittlerweile gültige Arzneibuch-Monografie für ATG (Ph. Eur.: 1928) sieht diese in vitro Methode zur Wirksamkeitsprüfung von ATG vor, womit die Voraussetzungen zur Abschaffung des Affenhaut-Transplantationstests geschaffen wurden. Neben einer zellulären Charakterisierung der ATG konnte gezeigt werden, dass sich insbesondere biochemische Methoden, wie z. B. der Kinase-assay oder die Biotinylierung von Zelloberflächenmolekülen, sehr gut zur Identitätsprüfung von ATG eignen. Mit beiden Methoden ließen sich produktspezifische Bande nachweisen. Im Rahmen der Entwicklung von ATG sind diese Methoden geeignet, die Konsistenz der Chargenproduktion zu überprüfen, sodass auch hier Alternativen zum Tierversuch vorhanden sind.
Die vorliegende Arbeit untersuchte die CIN- Inzidenz und die HPV- Prävalenz bei Frauen mit einer HIV- Infektion, die aus dem Patientinnenkollektiv der Universitäts-frauenklinik Frankfurt am Main, rekrutiert wurden. Die Daten von 305 Frauen wurden in die Studie eingebracht. Dieses Kollektiv wur-de einer HIV- negativen Kontrollgruppe gegenübergestellt. Die wichtigsten Ergebnisse der Untersuchung waren: - die CIN- Inzidenz in dem HIV-positiven Kollektiv lag bei 27% (n=83 von 305) - die CIN- Inzidenz in der HIV- negativen Kontrollgruppe lag bei 31% (n=14 von 45) - HIV- positive Frauen mit CIN 1-3 hatten eine signifikant höhere HPV- Prävalenz (78%) als HIV- positive Frauen mit CIN 0 (27%) - die CIN- Inzidenz bei HIV- und HPV- positiven Frauen war mit 52 % (n=65 von 126) signifikant höher als die CIN- Inzidenz bei HIV- positi-ven aber HPV- negativen Frauen, die bei 10% (n=18 von179) lag - die CIN- Inzidenz bei HIV- negativen und HPV- positiven Frauen mit 88% (n=14 von 18) signifikant erhöht war, während HIV- und HPV- negative Frauen eine CIN- Inzidenz von 0 % hatten (n=0 von 29) - die CIN- Inzidenz bei HIV- und HPV- positiven Frauen unabhängig von der CD4 Zellzahl war - die CIN- Inzidenz bei HIV- positiven und HPV- negativen Frauen ab-hängig von der CD4 Zellzahl ist und bei Zellzahlen unter 200/ul signifkant erhöht ist (39% versus 7%, p< 0,01) - eine antiretrovirale Therapie beeinflusst die CIN- Inzidenz anscheinend nicht - der Infektionsweg der betroffenen Frauen (Drogenabusus, heterose-xuelle Kontakte, Abstammung aus Hochprävalenzländern) keinen signifikanten Unterschied bezüglich der CIN- Inzidenz ausmacht - Frauen mit Nikotinkonsum in der Anamnese haben eine signifikant erhöhte CIN- Inzidenz (38%,n=63 von 163) als Frauen ohne Nikotin-konsum (14%, n=20 von 143) Insgesamt reihen sich die Untersuchungergebnisse in die umfangreiche Datenlage der aktuellen Literatur weitgehend ein. Zudem ist das hier untersuchte Kollektiv zahlenmäßig, sicherlich eines der größten im deutschen und internationalen Ver-gleich. Schlussfolgern lässt sich eine erhöhtes CIN- Risiko bei HIV- positiven Frauen. Die hier erhobenen Daten erhärten einmal mehr, die Forderung eines intensivierten Screeningprogramms für die betroffenen Frauen.
Das Non-LTR-Retrotransposon TRE5 A.1 aus Dictyostelium discoideum integriert positionsspezifisch 48 ± 2 bp oberhalb von tRNA Genen. Es konnte gezeigt werden, dass TRE5 A.1 Wechselwirkungen zwischen ORF1p und dem RNA Polymerase III spezifischen Transkriptionsfaktor DdTFIIIB nutzt, um seinen Integrationsort zu identifizieren. Damit wurden in dieser Arbeit erstmals direkte Proteininteraktionen zwischen einem Non-LTR-Retrotransposon und Komponenten des Chromatins zur Definition des Integrationsortes nachgewiesen. DdTFIIIB wurde durch Blastp Suchen in silico identifiziert. Wie auch in S. cerevisiae wird innerhalb des D. discoideum TFIIIB Komplexes eine stabile Interaktion zwischen der N terminal gelegenen Helix H2 von DdTBP und dem C Terminus von DdBrf1 gebildet. Es konnte sowohl mittels bakterieller Zweihybrid Versuche als auch durch biochemische Pulldown Experimente gezeigt werden, dass TRE5 A kodiertes ORF1 Protein (ORF1p) mit allen drei Untereinheiten von DdTFIIIB in Wechselwirkung tritt. Am ausgeprägtesten war diese mit DdTBP. Durch Mutations und Deletionsanalysen wurden die Kontaktflächen auf DdTBP und ORF1p näher charakterisiert. Demnach interagiert ORF1p über seinen N Terminus (AS 112 158) mit DdTBP, während die C terminalen 40 Aminosäuren sowohl von DdBrf1 als auch von ORF1p beansprucht werden und beide Proteine vermutlich um diese Bindestelle konkurrieren. DdTBP bindet hauptsächlich mit der C terminalen  Helix H2’ an ORF1p. Eine wichtige Position für diese Interaktion ist Ser195 auf DdTBP. Obwohl HsTBP selbst nicht mit ORF1p interagiert, kann die Einführung der Helix H2’ aus DdTBP in das humane Protein die Interaktion mit ORF1p wiederherstellen. Interaktionen zwischen DdTFIIIB und TRE5 A ORF2p wurden nicht detektiert, allerdings konnte ein vermutliches Dimerisationsmotiv in ENp entdeckt werden. Für weiterführende Versuche, die die Relevanz der hier gefundenen Proteininteraktionen für die Target Identifizierung in D. discoideum Zellen untersuchen soll, wurden in dieser Arbeit zwei monoklonale Antikörper gegen DdTBP und einen zufällig entdeckten „Epitop Tag“ isoliert und charakterisiert. Die genaue Rolle von ORF1p während der Retrotransposition von TRE5 A.1 ist noch ungeklärt. Erste grundlegende Einblicke weisen darauf hin, dass ORF1p Teil des Präintegrationskomplexes von TRE5 A sein muss.