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Diese Arbeit beschreibt die Identifizierung, Klonierung und Charakterisierung von zwei neuen humanen S1P-Rezeptoren. Damit wird die Familie der S1P-Rezeptoren um einen hochaffinen und einen niedrig affinen Rezeptor erweitert. Die Untersuchungen der Expressionsprofile aller humanen S1P/LPA-Rezeptoren sowohl in Herz-Kreislauf-relevanten Geweben als auch in Endothelzellen und glatten Muskelzellen erfolgten bisher nicht im Sinne der hier dargestellten familienübergreifenden Betrachtung. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit erstmalig auch der hS1P5-Rezeptor mit eingeschlossen. Wir konnten zeigen, dass zur Beurteilung der S1P- und LPA-Effekte in den untersuchten Gewebe- und Zellarten neben den bisher bekannten sieben Rezeptoren auch der hS1P5-Rezeptor betrachtet werden muss. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da in bisherigen Untersuchungen insbesondere bei der Interpretation der S1P-Wirkungen nur die Rezeptoren S1P1-3 berücksichtigt wurden. In dieser Arbeit wurde außerdem zum ersten Mal eine große Anzahl potentieller Lipidliganden an den S1P-Rezeptoren S1P1-3 und 5 sowie am hGPR63 getestet. Auch wenn hierbei keine neuen Liganden identifiziert werden konnten, grenzen unsere Untersuchungen die Zahl potentieller zusätzlicher Liganden ein. Außerdem konnten wir zeigen, dass Suramin nicht - wie bisher vermutet - ein spezifischer Antagonist des S1P3-Rezeptors ist, sondern auch S1P5-Rezeptor-vermittelte Effekte blockieren kann. Hierdurch kann eine Fehlinterpretation von durch Suramin-hemmbaren Effekten verhindert werden. Ein wichtiger Befund dieser Arbeit, insbesondere für die pharmazeutische Industrie, ist die speziespezifische Expression des S1P5-Rezeptors. Während in der Ratte hauptsächlich eine Verteilung des Rezeptors im ZNS zu beobachten ist, findet sich das humane Homologe hauptsächlich in peripheren und hier insbesondere Herz-Kreislauf-relevanten Geweben. Der Einsatz von Tiermodellen, bei denen es sich in der Regel um Nager handelt, zur Untersuchung der S1P-Effekte muss daher kritisch überdacht werden, da in diesem Fall ein im Menschen potentiell relevanter Rezeptor nicht in den peripheren Geweben der Ratte vorhanden und somit nicht an den S1P-Wirkungen beteiligt ist. Zudem konnten wir auch funktionelle Unterschiede zwischen den beiden Rezeptoren unterschiedlicher Spezies beobachten, was zusätzlich gegen die Verwendung von Tiermodellen zumindest bei Untersuchungen des S1P5-Rezeptors spricht. Neben der erstmaligen Charakterisierung der Signaltransduktionswege des S1P5-Rezeptors konnte im Laufe dieser Arbeiten eine weitere neue Eigenschaft des S1P5-Rezeptors festgestellt werden: Dieser ist in der Lage, ligand-unabhängige Effekte hervorzurufen. Dies ist von Bedeutung, da häufig Rezeptoren, die aufgrund von Mutationen konstitutiv aktiv sind, für die Ausbildung von Krankheiten verantwortlich sind. Wir konnten darüberhinaus zeigen, dass der zweite in dieser Arbeit identifizierte S1P-Rezeptor, der orphan-hGPR63, von relativ hohen Konzentrationen an S1P sowie von doPA angeschaltet wird. Wenngleich die Affinität des hGPR63 zu doPA niedrig ist, ist dies jedoch der erste Rezeptor, der auf dieses Lipid reagiert. Welche physiologische Bedeutung diesem Rezeptor zukommt, ist noch völlig offen, die primäre Expression im Hirn weist jedoch auf eine zumindest partielle zentrale Wirkung hin. Zusätzlich zu den molekularbiologischen Befunden können aus dieser Arbeit wichtige Informationen für das Screenen von GPCRs und hier insbesondere von Lipid-GPCRs abgeleitet werden. Allgemein gilt, dass der Auswahl des richtigen Versuchssytems im Hinblick auf die Fragestellung und das zu untersuchende Protein eine entscheidende Bedeutung zukommt. Während bei Rezeptoren mit einer restriktiven Gewebeverteilung die Suche nach einem geeigneten Zellsystem keine Schwierigkeiten bereitet, stellt dies das Hauptproblem in der Lipidforschung dar. Da es keine Säugerzellen gibt, die nicht auf S1P reagieren, muss jedes Versuchssystem erneut auf Eignung und optimale Zellart untersucht werden. So konnten in transient transfizierten CHO-K1-Zellen hintergrundfreie S1P-Signale im FLIPR-Versuch gemessen werden, während in den MAP-Kinase-Versuchen in CHO-K1-Zellen der hohe endogene Hintergrund das Versuchsfenster auf ein Minimum reduzierte. Während die Messung von LPA-Effekten in CHO-K1-Zellen mit der FLIPR-Technologie aufgrund der endogenen Signale nicht möglich ist, können LPA-Effekte in McARH7777-Zellen ohne störenden Hintergrund gemessen werden. In diesem Zellsystem ist wiederum die Messung von S1P nicht oder nur begrenzt möglich. Auch wenn diese Beispiele spezifisch für Lipidrezeptoren sind, lässt sich doch aus dieser Arbeit die Notwendigkeit ableiten, neben der richtigen Substanz-Bibliothek besonders bei der Suche nach Liganden für orphan-GPCRs das richtige zelluläre System einzusetzen.
Erstes Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines Anzuchtsystems, mit dem ein reproduzierbarer Trockenstreß induziert werden konnte. Mittels dieses Systems erfolgte die Selektion von zwei unterschiedlich trockentoleranten Sorghum bicolor-Kultivaren, die im weiteren Verlauf dieser Arbeit näher charakterisiert wurden. Dabei wurden zunächst Photosynthese, stomatärer Widerstand, Chlorophyll- und Carotinoidgehalt, Fv/Fm-Verhältnis, Blattdruckpotential und Blattschädigungen an allen Blättern von Kontrollpflanzen und gestreßten Pflanzen untersucht. Das jüngste, voll entwickelte Blatt wies die größten Unterschiede zwischen beiden Kultivaren auf, weshalb die weiterführende Untersuchungen nur noch an diesem Blatt durchgeführt wurden. Im Rahmen dieser Untersuchungen erfolgten Gaswechsel- und Chlorophyllfluoreszenz-Messungen unter unterschiedlicher CO2-Versorgung, sowie Messungen der blattflächenbezogenen Aktivität der C4-Enzyme (PEPCase, MDH, NADP-ME, PPDK) und zweier Enzyme des Calvin-Zyklus (Rubisco, FBPase). Darüber hinaus wurde der Gehalt der C4-Metabolite bestimmt und mittels Pigmentanalyse die Kinetik der Xanthophyll-Deepoxidation in Abhängigkeit vom Trockenstreß untersucht. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: Das verwendete Modelsystem erlaubt eine reproduzierbare Induktion des Trockenstresses. Aufgrund der relativ schnellen Änderung des Wasserpotentials des Bodens während der Versuchsdauer muß das Blattdruckpotential als Standard für die Trockenstreßbelastung gemessen werden. Es konnten zwei Sorghum-Kultivare mit unterschiedlicher Trockenstreßresistenz selektiert werden. Die äthiopische Landrasse E 36 zeigt dabei trotz größerer Blattschädigung, insbesondere der älteren Blätter, unter vergleichbarem Blattdruckpotential jeweils höhere Photosyntheseraten der ungeschädigten Bereiche als die amerikanische Zuchtsorte B 35. Trotz hoher Korrelation zwischen Photosyntheserate und stomatärem Widerstand scheint die Photosynthese unter Trockenstreß nicht durch verringerte CO2-Konzentrationen im Interzellularraum limitiert zu werden, worauf auch die Daten der Fluoreszenz- und Gaswechselmessungen unter erhöhtem CO2-Gehalt hinweisen. Gaswechselmessungen unter vermindertem CO2-Gehalt bei gestreßten Pflanzen lassen auf eine geringere Aktivität der CO2-Fixierung durch die PEPCase schließen. Unter optimalen Bedingungen ist keine der in vitro gemessenen Umsatzraten der C4-Enzyme limitierend für die Photosynthese. In vivo könnte die Aktivität der PEPCase jedoch durch einen niedrigeren pH-Wert des Cytosols und Malathemmung zum geschwindigkeitsbestimmenden Schritt werden und die Photosyntheserate limitieren. Die starke Übereinstimmung von PPDK-Aktivität und Photosynthese in den Kontrollpflanzen weist auf eine mögliche Limitierung der Photosynthese durch die PPDK unter Kontrollbedingungen hin. Die starken Veränderungen der C4-Metabolit Gehalte deuten auf eine grundlegende Veränderung des C4- Stoffwechsels unter Trockenstreß hin. Höhere Malat Konzentrationen der Sorte B 35 könnten dabei zu einer frühen Inhibierung der PEPCase in den trockengestreßten Pflanzen als in E 36 führen, wodurch die Photosynthese limitiert wird.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde der Großteil aller nuklearen Proteine annotiert und klassifiziert. Aus Literatur, Proteinsequenz- und Domänendatenbanken wurden bekannte nukleare Domänen ermittelt, ihre Grenzen unter Zuhilfenahme von Tertiärstrukturen oder Sekundärstrukturvorhersagen bestimmt und multiple Sequenzalignments erstellt. Die handgerfertigten Aligments wurden zur Anfertigung von Hidden Markov Models herangezogen und in das Domänenvorhersageprogramm Simple Modular Architecture Research Tool (Schultz et al. 1998, Schultz et al. 2000) (http://smart.embl-heidelberg.de/) implementiert. Hier sind umfassend Informationen über Literatur, phylogentische Verteilung, Anzahl beteiligter Proteine und Funktion für 164 Domänen (118 entstammen dieser Arbeit) mehr als 35000 Proteine abdeckend zusammengefasst. Aufbauend auf der vollständigen Kollektion nuklearer Proteine wurden ausgewählte nukleare und nicht-nukleare Proteine auf der Grundlage homologiebasierender Sequenzanalyseverfahren untersucht. Die Arbeit führte zur Entdeckung von vier biologisch relevanten neuen Domänen: - L27, eine neue Hetero-Dimer bildende Domäne in den Rezeptor-Targeting-Proteins Lin-2 and Lin-7 (Doerks et al. 2000) - GRAM, eine neue Domäne in Glucosyltransferasen, Myotubularinen und anderen Membran-assoziierten Proteinen (Doerks et al. 2000) - DDT, eine neue DNA-bindende Domäne in unterschiedlichen Transkriptionsfaktoren, Chromosom-assoziierten und anderen nuklearen Proteinen (Doerks et al. 2001) - BSD, eine neue putativ DNA-bindende Domäne in Transkriptionsfaktoren, Synapsen-assozierten und anderen hypothetischen Proteinen (Doerks et al. submitted) Abschliessend erfolgte die automatische Analyse von 24000 nuklearen Proteinen, aus denen 550 hypothetisch neue Domänen hervorgingen. Die intensive Aufarbeitung dieser 550 konservierten Sequenzbereiche erbrachte die Entdeckung von 28 neuen nuklearen oder teilweise nuklearen Domänen unterschiedlicher Speziesverbreitung, Funktion und biologischer Relevanz (Doerks et al. accepted).
Der STAR Level-3 Trigger
(2002)
Schwerionen-Collider-Experimente, wie das STAR-Experiment am RHIC (BNL) oder das geplante ALICE-Experiment am LHC (CERN) untersuchen Schwerionenkollisionen bei Schwerpunktsenergien von Wurzel aus SNN = 200 GeV (RHIC), bzw. Wurzel aus sNN = 5, 5 TeV (ALICE). In diesen Kollisionen werden mehrere tausend geladene Teilchen produziert, die in STAR und ALICE in großvolumigen TPCs gemessen werden. Das Datenvolumen erreicht dabei bis zu 10 MB (STAR) und 60 MB (ALICE) pro Ereignis. Aufgrund der hohen Luminosität der Collider könnten die Experimente zentrale Schwerionenkollisionen mit einer Rate bis zu 100 Hz bzw. 200 Hz (ALICE) untersuchen. Die dabei entstehenden Datenraten im Bereich mehrerer GB/s sind mit heutiger Technologie jedoch nicht mehr einfach zu speichern. Deshalb kann nur ein Bruchteil der zur Verfügung stehenden Ereignisse aufgezeichnet werden. Aufgrund der exponentiellen Entwicklung der CPU-Leistung wird es jedoch möglich, die Rekonstruktion von Ereignissen während der Datennahme in Echtzeit durchzuführen. Basierend auf den rekonstruierten Spuren in den Detektoren kann die Entscheidung getroffen werden, ob ein Ereignis gespeichert werden soll. Dies bedeutet, dass die begrenzte Speicherbandbreite gezielt mit Ereignissen, die eine interessierende physikalische Observable beinhalten, angereichert werden kann. Ein solches System zur Ereignisselektion wird als Level-3-Trigger oder allgemeiner als High Level Trigger bezeichnet. Am STAR-Experiment wurde erstmals in einem Schwerionenexperiment solch ein Level-3-Triggersystem aufgebaut. Es besteht aus 432 i960-CPUs, auf speziell gefertigten Receiver Boards für die paralelle Clusterrekonstruktion in der STARTPC. 52 Standard-Computer mit ALPHA- bzw. Pentium-CPUs rekonstruieren die Spuren geladener Teilchen und tre.en eine Triggerentscheidung. Dieses System ermöglicht die Echtzeit-Rekonstruktion zentraler Au-plus-Au-Kollisionen mit anschliessender Analyse durch einen Trigger-Algorithmus mit einer Rate von 40-50 Hz. Die Qualität, die mit dieser schnellen Analyse erreicht wird, kann mit der Qualität der STAR-Offline-Rekonstruktion verglichen werden. Der Level-3-Clusterfinder erreicht in Bezug auf Ortsauflösung und Rekonstruktionseffizienz dieselbe Qualität wie der Offline-Clusterfinder. Der Level-3-Trackfinder erreicht bei Rekonstruktionseffizienz und Impulsauflösung 10-20% schlechtere Werte als der Offline- Trackfinder. Die Anwendung eines Level-3-Triggers besteht in der Messung von seltenen Observablen ("rare Probes"), die ohne eine Anreicherung nicht, oder nur schwer, meßbar wären. In den Jahren 2000 und 2001 wurden erste Triggeranwendungen für das STARLevel- 3-System erprobt. In ultraperipheren Au-plus-Au-Kollisionen wurden po-Kandidaten schon im Jahr 2000 selektiert. Während der Strahlzeit des Jahres 2001 wurde das Level-3-System erstmals zum Triggern in zentralen Au-plus-Au-Kollisionen eingesetzt. Die Triggeralgorithmen beinhalteten einen Õ-Trigger, einen 3He-Trigger und einen Algorithmus zur Anreicherung von Spuren hohen Impulses in der Akzeptanz des RICH-Detektors. Das STAR Level-3-System ist in der Lage zehnmal mehr Ereignisse zu analysieren, als gespeichert werden können. Aufgrund der begrenzten Luminosität des RHIC-Beschleunigers, konnten die Level-3 Trigger erst zum Ende der Strahlzeit eingesetzt werden. Den genannten Algorithmen standen zusätzlich zu den 3 · 10 hoch 6 gespeicherten zentralen Ereignissen, 6 · 10 hoch 5 zentrale Ereignisse zur Analyse zur Verfügung. Mit diesem begrenzten Anreicherungsfaktor von 20% blieb das System hinter seinen Möglichkeiten zurück. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass das STAR Level-3-System in der erwarteten Qualität und Stabilität funktioniert.
Der Ein-Elektron Transporter Adrenodoxin spielt in der Steroidhormonbiosynthese eine entscheidende Rolle. Bislang konnte der Elektronentransportmechanismus zwischen der Adrenodoxin-Reduktase und dem Cytochrom P450 mittels Adrenodoxin nicht eindeutig nachgewiesen werden. Um die molekularen Wechselwirkungen besser verstehen zu können wurden in der vorliegenden Arbeit strukturelle Untersuchungen am Rinderadrenodoxin durchgeführt. Nachdem es bereits 1998 gelang die Struktur des oxidierten Zustands des Adrenodoxins aufzuklären [Müller et al. 1998], sollte die Struktur des reduzierten Zustands Aufschluss über mögliche redoxbedingte konformationelle Änderungen geben. Die Strukturaufklärung mittels NMR erfordert hohe Expressionsausbeuten und effektive Aufreinigungsstrategien des rekombinant hergestellten Proteins. Deshalb wurde zunächst eine Steigerung der Expression von löslichem Adrenodoxin in E.coli angestrebt. In Minimalmedium lieferte die Expression unter Zusatz von 2,5g Glycerin und 1g Glucose optimale Ergebnisse. So konnte nach Optimierung der Aufreinigungsabfolge aus einem Liter M9-Medium bis zu 50 mg homogenes Protein isoliert werden. Nach Optimierung der Expressionsbedingungen und der Aufreinigungsstrategie konnte das Adrenodoxin mit den NMR aktiven Isotopen 15N sowie 13C angereichert werden. Die Reduktion des Adrenodoxins erfolgte durch Zusatz von Natriumdithionit unter strikt anaeroben Bedingungen. Die strukturelle Untersuchung mittels NMR setzt eine Zuordnung der Proteinresonanzen voraus. Diese erfolgte unter Verwendung verschiedener Tripleresonanzexperimente. Eine Zuordnung war aufgrund des stark ausgeprägten Paramagnetismus nur für solche Reste möglich, die sich mindestens 8 Å vom [2Fe-2S]-Cluster des Adrenodoxins entfernt befinden. Trotzdem konnten wichtige Regionen, die sich außerhalb des Einflussbereichs des [2Fe-2S]- Clusters befinden, zugeordnet und mit dem oxidierten Zustand verglichen werden. Aus den 15N-NOESY-HSQC und 13C-NOESY-HSQC-Spektren wurden für den reduzierten Zustand unter Zuhilfenahme des Programms NMR2st 1300 effektiv abstandsbeschränkende NOESignale eindeutig zugeordnet. Nach Minimierung der Zielfunktion wurden im letzten Schritt 50 Strukturen mit dem Strukturkalkulationsprogramm DYANA berechnet. Die 20 Strukturen mit den besten Targetfunkionen wurden als Strukturensemble dargestellt. Für das Proteinrückrat beträgt der RMSD 2,34 Å. Anhand der chemischen Verschiebungsänderungen konnten erste Unterschiede zwischen oxidierten und reduzierten Zustand des Adrenodoxins festgestellt werden. Besonders markant sind diese Veränderungen im Bereich des C-Terminus und des Loops 80-86. Änderungen konnten auch im "Chemical Shift Index" und beim Vergleich der NOE-Konnektivitäten beider Redoxzustände beobachtet werden. Gerade für die Aminosäurereste Asp76 und Asp79, die für die Wechselwirkung zu den Redoxpartnern essentiell sind, konnten Veränderungen im Aufspaltungsmuster der "NOE-Pattern" nachgewiesen werden, was auf konformationelle Änderungen im Bereich der Wechselwirkungsdomäne hindeutet. Der Vergleich der beiden Tertiärstrukturen lieferte weitere Indizien dafür, dass der C-Terminus redoxbedingte konformationelle Änderungen erfährt. Während des Erstellens dieser Arbeit konnte eine US-amerikanische Gruppe durch Zufall die Existenz eines Adrenodoxin (oxidiert) Dimers bei physiologisch relevanten Konzentrationen nachweisen [Pikuleva et al. 2000]. Bei der Dimerisierung spielt der C-Terminus eine entscheidende Rolle. Zwei intermolekulare Wasserstoffbrücken bilden sich zwischen CTerminus und Protein des jeweils anderen Partners aus. Redoxbedingte konformationelle Änderungen im Bereich des C-Terminus sollten die Auflösung des Dimers begünstigen. Um diese Vermutung zu bestätigen wurden Cross-Linking Experimente mit dem reduzierten und oxidierten Zustand des Adrenodoxins durchgeführt. Die Ergebnisse bestätigten die Annahme, dass sich das Adrenodoxin Dimer nach Reduktion auflöst. Außerdem konnte anhand der voll funktionsfähigen C-terminal verkürzten Mutante Adx(4-108) die tragende Rolle des CTerminus bei der Dimerbildung bewiesen werden. Aus den experimentell erhaltenen Daten wurde ein neuer Elektronentransportmechanismus postuliert, der sowohl Adrenodoxin Dimere als auch Adrenodoxin Monomere als Elektronentransporter annimmt [Beilke et al. 2002]. Die streng kontrollierte Steroidhormonbiosynthese wird durch den Einsatz von Adrenodoxin Dimeren beschleunigt und durch die redoxbedingte Auflösung der Dimere optimert. Die redoxbedingte Auflösung eines Dimers ist in der Biochemie einzigartig und kann zum Verständnis molekularer Wechselwirkungen beitragen. Für die gesamte Gruppe der vertebraten Ferredoxine sind aufgrund der Struktur- und Sequenzhomologie ähnliche Ergebnisse zu erwarten. Im zweiten Teil der Arbeit sollte die Ferredoxin-NADP -Reduktase (FNR) für strukturelle Untersuchungen mittels NMR zugänglich gemacht werden. Durch Verwendung von bakteriellen Expressionssystemen, insbesondere dem pQE30-Expressionssystem, konnte der Anteil an löslichem Protein im Vergleich zum Ursprungssystem um den Faktor 12 erhöht werden. Dabei führten möglichst niedrige Expressionstemperaturen und IPTG Konzentrationen zu den höchsten Proteinausbeuten. Ein verbessertes Isolationsverfahren wurde etabliert und ermöglicht die Darstellung von bis zu 90 mg FNR aus einem Liter LB-Medium. Eine Verlängerung der Expressionsdauer, hervorgerufen durch das Wachstum in M9-Medium und in D2O, verringerte den Anteil an vollständig intaktem Protein, weshalb auf eine kostspielige Proteinpräparation in dreifach angereicherten Minimalmedium verzichtet wurde.
Rezeptortyrosinkinasen der Familie der epidermalen Wachstumsfaktorrezeptoren (EGFR) sind in vielen Krebsarten dereguliert und ursächlich an der malignen Transformation beteiligt. Da die Aktivierung vom Rezeptor ausgehender Signaltransduktionskaskaden auf spezifischen Protein-Protein-Interaktionen basiert, kann durch gezielte Interferenz mit diesen Interaktionen das proliferative Signal ausgeschaltet und das Tumorwachstum angehalten werden. Für diese gezielte Interferenz wurde in der vorliegenden Arbeit das Peptid-Aptamer-System eingesetzt, mittels dem Peptide, die in ein Gerüstprotein inseriert sind, aufgrund ihrer Affinität zu einem Zielprotein selektiert werden können. Drei Peptid-Aptamere (KDI1, KDI3, KDI4), die spezifisch mit dem EGF-Rezeptor interagieren, konnten isoliert werden. lntrazelluläre Expression von Peptid-Aptamer KDI1 oder Einbringung des bakteriell exprimierten Peptid-Aptamers KDI1 mittels einer Proteintransduktionsdomäne führte zu reduzierter EGF-abhängiger Proliferation und Transformation. Durch Interferenz des Aptamers mit dem EGF-Rezeptor war die EGF-induzierte Phosphorylierung von Tyrosin 845, 1068 und 1148, sowie die Aktivierung von p46 Shc und STAT3 reduziert. Daher wurde gefolgert, dass das Peptid-Aptamer die EGF-abhängige Rekrutierung der zytoplasmatischen Kinase c-Src an den Rezeptor inhibiert. Durch Fusion einer zusätzlichen Domäne wie der SOCS-Box-Domäne konnte den Peptid-Aptameren eine zusätzliche inhibitorische Funktion gegeben werden. Hierbei handelt es sich um eine Domäne, die spezifisch Kontakt mit E3-Ubiquitin-Ligasen aufbauen kann. Es konnte gezeigt werden, dass durch Transduktion eines solchen Peptid-Aptamers der Rezeptor spezifisch ubiquitinyliert und damit degradiert wird. Das Peptid-Aptamer-System eignet sich somit dazu, Inhibitoren für vorgegebene Zielmoleküle zu isolieren, die sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der Tumortherapie Anwendung finden können.
In dieser Arbeit wurde die Kinetik von zwei Ca2-plus-aktivierten Membranproteinen untersucht: zum einen des endogenen Ca2-plus-aktivierten Chloridkanals der Xenopus-Oozytenmembran, zum anderen des heterolog in Oozyten exprimierten Na-plus-Ca2-plus-Austauschers NCX1, kloniert aus dem Meerschweinchen-Herzen. Der Ca2-plus-aktivierte Chloridkanal wird durch intrazelluläres Ca2-plus im submikromolaren Konzentrationsbereich (KD = 0.5 µMCa2-plus) aktiviert und hat eine hohe Permeabilität für Chloridionen. In der ausgereiften Eizelle spielt er eine wichtige Rolle bei der Ausbildung des Fertilisationspotentials und verhindert durch eine Depolarisation der Membran eine Polyspermie. Der Na-plus-Ca2-plus-Austauscher ist in der Herzmuskelzelle für die Ausbildung des Exzitations- Kontraktions-Zyklus von Bedeutung, indem er für die Aufrechterhaltung des Ca2-plus- Gradienten (freies Ca2 intrazellulär ungefähr gleich 100 nm, extrazellulär ungefähr gleich 2 mM) über die Plasmamembran verantwortlich ist. Unter physiologischen Bedingungen transportiert der Na-plus- Ca2-plus-Austauscher ein Ca2-plus-Ion im Austausch gegen drei Na-plus-Ionen aus der Zelle hinaus, und nutzt somit den Na-plus-Gradienten neben dem Membranpotential als treibende Kraft. Als Messmethode wurde die Patch-Clamp-Technik in der inside-out-Makro-Patch- Konfiguration verwendet. Die Patch-Clamp-Technik erlaubt definierte ionale Bedingungen auf beiden Seiten der Membran. Cytoplasmatische Ca2-plus-Konzentrationssprünge wurden zum einen durch Lösungswechsel, insbesondere aber durch die Photolyse von DM-Nitrophen, einem photolabilen Ca2-plus-Chelator, hervorgerufen. Die Photolyse von DM-Nitrophen erlaubte, im Vergleich zum Lösungswechsel, sehr schnelle Ca2-plus- Konzentrationssprünge (Ca2-plus-Freisetzungsrate mindestens 38000 s-1). Die kinetischen Untersuchungen am Ca2-plus-aktivierten Chloridkanal haben neue, über bisherige aus dem Lösungswechselexperiment bekannte hinausgehende, Erkenntnisse ergeben: Nach einem schnellen Ca2-plus-Konzentrationssprung geht dem Signalanstieg auf einen stationären Wert eine deutlich schnellere Verzögerungsphase (lag-phase) voraus. Sowohl der Signalanstieg als auch die Verzögerungsphase zeigen eine starke Ca2-plus-Abhängigkeit, sind aber nur sehr schwach spannungsabhängig. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Signalanstieg den spannungsabhängigen Ca2-plus-Bindungs-/Dissoziationsschritt von mindestens zwei Ca2-plus-Ionen widerspiegelt, während das spannungsunabhängige Kanalöffnen/ -Schließen durch die Verzögerungsphase repräsentiert wird. Bei Spannungssprungexperimenten mit hoher Zeitauflösung konnte eine schnelle Inaktivierung nach einer Depolarisation der Membran gesehen werden, die in Gegenwart von sättigenden intrazellulären Ca2-plus-Konzentrationen zu einer Einwärtsgleichrichtung der Strom-Spannungskennlinie des stationären Stroms führt. Mit diesen Erkenntnissen konnte ein Reaktionsmodell für den Ca2-plus-aktivierten Chloridkanal aufgestellt werden, mit dem sich die experimentellen Daten simulieren ließen. Die heterologe Expression des Na-plus-Ca2-plus-Austauschers in Oozyten hat zu einem deutlich verbesserten Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich zu früheren Messungen am nativen Austauscher in Cardio-Myocyten-Membranen geführt. Mit Hilfe der Photolyse von DM-Nitrophen konnte erstmals eine vollständige Ca2-plus- und Spannungsabhängigkeit des vorstationären Einwärtsstroms, hervorgerufen durch einen cytoplasmatischen Ca2-plus-Konzentrationssprung, durchgeführt werden. Sowohl im Ca2-plus-Ca2-plus- als auch im Na-plus-Ca2-plus- Austauschmodus zeigt sich ein transientes Einwärtsstromsignal (Anstieg messtechnisch nicht auflösbar), das sehr schnell relaxiert. Im Ca2-plus-Ca2-plus-Austauschmodus zeigt sich nur ein transientes Stromsignal (kein Nettoladungstransport im stationären Zustand), während im Na-plus-Ca2-plus-Austausch sich ein stationärer Einwärtsstrom einstellt. Das transiente Stromsignal hat eine deutliche Ca2-plus-Abhängigkeit sowohl für den Spitzenstrom (KM = 30.9 ± 3.0 µM im Na-plus-Ca2-plus-Austausch, KM = 57 ± 10 µM im Ca2-plus- Ca2-plus-Austausch) als auch für die Geschwindigkeitskonstante 1/t des Signalabfalls (KM = 98.5 ± 21.3 µM im Na-plus-Ca2-plus-Austausch, KM = 76 ± 11 µM im Ca2-plus-Ca2-plus-Austausch) gezeigt. Die Relaxation des Stromtransienten erfolgt sowohl im Ca2-plus-Ca2-plus- als auch im Na-plus-Ca2-plus-Austausch mit einer maximalen Geschwindigkeitskonstanten von ungefähr gleich 10000 s -1 nach sättigenden Ca2-plus-Konzentrationssprüngen. Der Signalabfall hat sich über den gesamten untersuchten Ca2-plus-Konzentrationsbereich als spannungsunabhängig herausgestellt, während der Spitzenstrom bei positiven Membranpotentialen deutlich abnimmt. Dies führt zu einer Spannungsabhängigkeit der verschobenen Ladung (Integral des transienten Stromsignals) im Ca2-plus-Ca2-plus-Austausch. Aus diesen Erkenntnissen konnte für den Ca2-plus- Translokationszweig (im Rahmen eines konsekutiven Transportmodells) folgendes Reaktionsschema aufgestellt werden: Einem spannungsunabhängigen, sehr schnellen Ca2-plus- Bindungs/-Dissoziationsschritt (diffusionskontrolliert) auf der intrazellulären Membranseite folgt ein ebenfalls spannungsunabhängiger, aber ratenlimitierender Schritt (intrazellulärer Okklusionsschritt, asymmetrische Raten: 10000 vs. 1000 s-1). Der nachfolgende Ca2-plus-Translokationschritt muss sehr hohe Hin- und Rückraten aufweisen (ungefähr gleich 20000 s-1). Die Ca2-plus-Dissoziation/-Bindung auf der extrazellulären wird als sehr schnell (diffusionskontrolliert) und spannungsunabhängig angenommen. Weitergehende Einblicke haben der Sr2-plus-Ca2-plus- und der Ba2-plus-Ca2-plus-Austausch geliefert. Während der Sr2-plus-Ca2-plus-Austausch nahezu das gleiche Verhalten wie der Ca2-plus-Ca2-plus-Austausch gezeigt hat, konnte nach einem intrazellulären Ca2-plus-Konzentrationssprung im Ba2-plus-Ca2-plus-Austausch erstmals eine zusätzliche langsame Phase im Abklingen des transienten Einwärtsstromsignals beobachtet werden. Das transiente Signal hat im Vergleich zum Ca2-plus-Ca2-plus-Austausch eine signifikant höhere Ladungsverschiebung aufgewiesen. Dies deutet auf einen zusätzlichen elektrogenen Reaktionsschritt hin (extrazelluläre Ca2-plus-Okklusion). Weitere elektrogene Schritte müssen im Na-plus-Translokationszweig (Na-plus-Bindungs- und Na-plus-Translokationsschritt) liegen. Mit den aus diesen Erkenntnissen aufgestellten Reaktionsschemata ließen sich die experimentellen Daten erfolgreich simulieren. Die Gesamttransportrate im Na-plus-Ca2-plus- Austausch liegt demnach bei ungefähr gleich 1000 s-1 bei Raumtemperatur und stimmt damit mit Literaturwerten von mehreren 1000 s-1 bei physiologischer Temperatur überein.
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden eine Superfamilie von plasmamembranständigen Proteinen. Die chemische Vielfalt ihrer Aktivatoren macht sie zu der größten und variantenreichsten Proteinfamilie mehrzelliger Organismen. Moderne Klonierungstechniken sowie der Abschluß der Humangenom-Sequenzierung im Jahr 2001 haben die Existenz von ca. 140 unbekannten GPCR-Sequenzen offengelegt, denen bislang weder ein natürlicher Ligand noch eine physiologische Funktion zugeordnet werden konnte. Sie werden daher als orphan Rezeptoren (engl.: Waisenkind) bezeichnet. Mehr als 30% der auf dem internationalen Pharma-Markt zugelassenen Substanzen sind GPCRWirkstoffe mit einem Jahresumsatz (2000) von 23,5 Mrd. US-$ (Wise et al., 2002). Aufgrund der großen wirtschaftlichen Bedeutung dieser Rezeptorfamilie ist es verständlich, daß die pharmazeutische Forschung mit hohem Aufwand an der Ligandenidentifizierung von orphan GPCRs arbeitet und die Ergebnisse patentrechtlich absichert. Die unter den Begriffen Reverse Pharmakologie und Orphan Rezeptor Strategie zusammengefaßte, praktische Wirkstoffentwicklung an orphan GPCRs vereinigt Techniken aus Bioinformatik, Zell- und Molekularbiologie, Biochemie und Pharmakologie. Im Zentrum dieser Arbeit stehen die humanen orphan Rezeptoren gpr3 (Iismaa et al., 1994), gpr6 (Heiber et al., 1995) und gpr12 (Song et al., 1995). Die Sequenz-Identität beträgt 57-61% auf der Proteinebene, und das deutet auf eine neue GPCR-Subfamilie hin. Aufgrund dominanter Präsenz von gpr3-, 6- und 12-mRNA-Transkripten im ZNS ist bislang ein Ligand mit neuromodulatorischen Eigenschaften vermutet worden. Eggerickx et al., 1995 zeigen, daß gpr3-transfizierte COS-7-Zellen konstitutiv, d.h. Agonist-unabhängig, die Adenylat-Zyklase aktivieren und so zu basal erhöhten cAMP-Spiegeln führen. Die Autoren vermuten die Ursache der Agonist-Unabhängigkeit entweder in einer basalen Aktivierung durch einen ubiquitären Serumfaktor im Kulturmedium oder in einer starken Überexpression im COS-7-Zellmodell. Bioinformatische Analysen im Vorfeld dieser Arbeit (Dr. Gassenhuber, Aventis Pharma, 2000) zeigen große Ähnlichkeiten von gpr3, 6 und 12 zu der Cannabinoid (cb)- und zu der endothelial differentiation gene (edg)-Lipidrezeptorfamilie von 42-44% auf der Proteinebene, und das deutet auf ein Lipid als potentiellen Liganden hin. Die edg-Rezeptoren regulieren über die bioaktiven Lipid-Mediatoren Sphingosin-1-Phosphat (S1P) und Lysophosphatidsäure (LPA) zentrale physiologische Funktionen im Rahmen von Proliferation und Zelldifferenzierung sowie eine Vielzahl kardiovaskulärer Effekte (z.B. Plättchenaktivierung, Schutz des Endothels vor Apoptose, Angiogenese, negative Chronotropie, Entwicklung des Herzens etc.). Aventis Pharma Deutschland GmbH beschäftigt sich u.a. mit der molekularbiologischen und pharmakologischen Charakterisierung dieser kardiovaskulären Effekte. Die zentrale Fragestellung dieser Arbeit besteht darin, zu klären, ob auch die orphan Rezeptoren gpr3, 6 und 12 über bioaktive Lipide und eine zusätzliche Expression in peripheren, Herz-Kreislauf-relevanten Organen eine Rolle spielen. Die Ergebnisse dieser Arbeit identifizieren gpr3, 6 und 12 als eine Familie von konstitutiv aktiven Rezeptoren, wobei die konstitutive Aktivierung unabhängig vom Rezeptor-Subtyp, der Spezies oder dem Zelltyp ist. Die Beobachtung, daß HEK293-Zellen, die mit den potentiellen Lipidrezeptoren gpr3, 6 und 12 transfiziert wurden, in lipidfreiem Medium (Aktivkohle-resorbiertes Serum) reduzierte, basale cAMP-Spiegel zeigen, führt zu der Schlußfolgerung, daß zumindest ein Teil der konstitutiven Aktivität auf ein Lipid des Serums zurückzuführen sein muß. In second messenger-Assays sind die bioaktiven Lipide S1P und Dihydro-S1P (DHS1P) als Modulatoren der konstitutiven gpr3-, 6- und 12-Aktivität identifiziert und funktionell charakterisiert worden. S1P- und DHS1P-Wirkungen an diesen Rezeptoren induzieren in HEK293-Zellen sowohl eine Ca2 -Mobilisierung (EC50 = 50-100nM), eine Stimulation der Adenylat-Zyklase als auch eine funktionelle Internalisierung eines Fusionskonstruktes aus gpr6 mit einem grün fluoreszierenden Protein (GFP). Das im Rahmen dieser Arbeit klonierte gpr3-Homologe der Ratte (Acc.Nr.: AJ427482) läßt sich ebenfalls durch S1P und DHS1P in funktionellen Ca2 - und cAMP-Assays anschalten. Eine Substanz-Bibliothek mit 200 bioaktiven Lipiden bestätigt die Wirksamkeit von S1P und DHS1P und liefert darüber hinaus keinen weiteren Liganden mit agonistischen Eigenschaften an den humanen Rezeptoren gpr3, 6 und 12. Expressionsprofile von gpr3, 6 und 12 sind mittels Nachweismethoden auf mRNA- (RT-PCR, Echtzeit- Taqman-PCR, Northern Blot, RNA-Chip) und Proteinebene (Western Blot) erstellt worden. Sie konnten mit Informationen aus der LifeSpan Bioscience-Datenbank (www.isbio.com) ergänzt werden, die ein immunhistologisches Profil des humanen Rezeptors gpr12 im gesunden und kranken Gewebe zur Verfügung stellt. Der Nachweis von gpr3-, 6- und 12-mRNA-Transkripten und Proteinen in einer Vielzahl humaner peripherer Organe und in isolierten Zellsystemen des Herz-Kreislauf- (Herz, Niere, Endothel- und glatte Gefäßmuskelzellen, Blutplättchen) und Immunsystems (Milz, Thymus, Leukozyten) weist eindeutig auf zusätzliche, periphere Funktionen dieser Rezeptorfamilie hin. Dies untermauert die kardiovaskuläre Relevanz, die bereits aufgrund des Liganden S1P zu vermuten war. In einem endothelialen Funktionsmodell, bei dem der pulsierende Blutstrom im Gefäßlumen simuliert wird (Scherstress), wird der Rezeptor gpr3 um den Faktor 2 auf Proteinebene hochreguliert. Es ist jedoch offen, ob diese Regulation auf eine Schutzfunktion im Endothel oder auf eine funktionelle Gegenregulation zurückzuführen ist. Zur Klärung dieser Frage sind Antisense-Oligonukleotide gegen den Rezeptor gpr3 getestet worden; eine Reduktion des gpr3-Proteinniveaus konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit identifizieren die humanen orphan Rezeptoren gpr3, 6 und 12 als weitere Mitglieder einer kontinuierlich wachsenden Lipidrezeptorfamilie. Es ist ein wesentlicher Schwerpunkt zukünftiger Studien, diesen für die Herz-Kreislauf-Forschung interessanten Rezeptoren eine physiologische bzw. pathophysiologische Funktion zuzuordnen.
Stickstoffmonoxid (NO) ist ein gasförmiger Botenstoff, der über die Regulation des Vasotonus, die Hemmung der Thrombocytenaggregation sowie die Stimulation der Angiogenese auf die vaskuläre Homöostase einwirkt. Das wichtigste NO-produzierende Enzym im kardiovaskulären System ist die endotheliale NO-Synthase (eNOS), deren Aktivität durch posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierung und Acylierung, durch Interaktionen mit regulatorischen Proteinen wie Ca2 /Calmodulin und Caveolin sowie durch differentielle subzelluläre Lokalisation reguliert wird. Dabei sind die Faktoren, welche die (Trans-)Lokation der eNOS zwischen subzellulären Kompartimenten wie den Caveolae der Plasmamembran und dem Golgi-Apparat dirigieren, weitgehend unbekannt. Zur Identifizierung neuer Interaktionspartner wurde humane eNOS im "yeast two-hybrid"-System als "Köderprotein" eingesetzt und dabei das Fragment eines neuen humanen Proteins identifiziert, das vorläufig NOSTRIN (für: eNOS traffic inducer) genannt wurde. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit gelang nun die Klonierung der kompletten NOSTRIN-cDNA, der Nachweis einer spezifischen Interaktion von eNOS und NOSTRIN in Säugerzellen sowie die Charakterisierung von NOSTRIN als Modulator der subzellulären Lokalisation und Aktivität von eNOS. Nach der kompletten Klonierung der NOSTRIN-cDNA mit Hilfe einer 5'-RACE resultierte ein offenes Leseraster von 506 Aminosäuren entsprechend einer Größe von ca. 58 kDa für NOSTRIN. Eine Datenbankrecherche zum Vergleich der NOSTRIN-Sequenz mit Sequenzen bekannter Proteinmotive ergab die Vorhersage einer N-terminalen Cdc15-Domäne sowie einer C-terminalen SH3-Domäne. Die direkte Interaktion zwischen eNOS und NOSTRIN konnte durch Copräzipitation in vivo und in vitro bestätigt werden. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass die SH3-Domäne von NOSTRIN essentiell für die Bindung an eNOS ist. Zur Untersuchung des Einflusses von NOSTRIN auf die eNOS-Lokalisation wurden stabil transfizierte CHO-Zellen, die eNOS überexprimierten ("CHO-eNOS") eingesetzt. In der Immunofluoreszenz war eNOS vornehmlich in Assoziation mit der Plasmamembran und dem Golgi-Apparat zu sehen. Mit Hilfe des Semliki-Forest-Virussystems (SFV) wurde nun NOSTRIN transient überexprimiert; dabei zeigte sich für NOSTRIN eine vesikelartige Verteilung im Cytoplasma. Die NOSTRIN-Überexpression führte zu einer drastischen Umverteilung von eNOS, die nun in charakteristischen vesikelartigen Strukturen mit NOSTRIN colokalisierte. Die Verwendung von NOSTRIN-Konstukten, bei denen die SH3- Domäne deletiert war ("NOSTRIN.SH3"), veränderte zwar die typische NOSTRIN-Lokalisation nicht, ließ aber auch die subzelluläre Verteilung von eNOS unverändert, so dass NOSTRIN.SH3 und eNOS in unterschiedlichen zellulären Kompartimenten lokalisiert waren. Mit Hilfe der Immunofluoreszenz konnte ebenfalls eine Colokalisation von NOSTRIN und Caveolin-1, einem inhibitorisch wirkenden Interaktionspartner von eNOS, nachgewiesen werden. Die Analyse von Copräzipitationen mit NOSTRIN bzw. NOSTRIN.SH3 zeigte, dass Caveolin-1 in eNOS-unabhängiger Weise an NOSTRIN bindet, so dass ein ternärer Komplex aus NOSTRIN, eNOS und Caveolin-1 resultiert. Zur Klärung der Frage, ob NOSTRIN neben der subzellulären Lokalisation auch die Aktivität von eNOS beeinflusst, wurde die NO-Freisetzung von CHO-eNOS-Zellen analysiert. Dabei ergab sich, dass die transiente Überexpression von NOSTRIN in CHO-eNOS-Zellen die eNOS-Aktivität um 62 % im Vergleich zu Kontrollzellen reduzierte. In humanen primären Endothelzellen konnte mittels Immunoblotting und Immunofluoreszenzmikroskopie das Vorkommen von endogenem NOSTRIN sowie dessen Colokalisation mit endogener eNOS an der Plasmamembran nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation führen zur Hypothese, dass NOSTRIN als "molekulare Klammer" zwischen eNOS und Caveolin-1 dient, eine dynamische Umverteilung von eNOS innerhalb der Zelle vermittelt und damit das Enzym - direkt und/oder indirekt - inhibiert. Somit dürfte NOSTRIN als Modulator der Aktivität und Lokalisation von eNOS eine wichtige Rolle bei der Regulation der endothelialen NO-Produktion spielen.
Die auf dem ACDM-Modell beruhenden numerischen Simulationen der gravitativen Strukturbildung sind auf Skalen M >> 10 hoch 10 M sehr erfolgreich, insbesondere konvergieren die Verfahren hinsichtlich des vorhergesagten Masseanteils der Halos an der Gesamtmasse von Galaxien. Jedoch konvergieren die Simulationen nicht bezüglich der lokalen Überdichten von CDM in den Halos, vielmehr setzt sich gravitative Strukturbildung auf immer kleinere Skalen fort. Numerisch kann keine Massen-Schwelle berechnet werden, unterhalb derer keine CDM-Strukturen mehr gravitativ gebildet werden. Die Kenntnis der lokalen Überdichten in den CDM-Wolken und die Verteilung der CDM-Wolken ist jedoch für Experimente zum direkten und indirekten Nachweis von CDM-Teilchen essentiell. Aus den lokalen Überdichten folgen für Experimente zum direkten Nachweis die einfallende Stromdichten der CDM-Teilchen und für Experimente zum indirekten Nachweis die Stromdichte der Annihilationsprodukte. Außerdem können die lokalen Überdichten als Gravitationslinsen wirken. In dieser Arbeit werden Massen Schwellen analytisch berechnet, unterhalb derer akustische Störungen in CDM nicht mehr zur gravitativen Strukturbildung beitragen können. Das Massen-Spektrum von lokalen Überdichten ist nach unten durch zwei unterschiedliche Mechanismen beschränkt: (1) Während der kinetischen Entkopplung formieren sich Nichtgleichgewichtsprozesse, die sich kollektiv als Reihungsphänomene konstituieren. Im lineare Regime sind dies die Volumenviskosität, die Scherungsviskosität und die Wärmeleitung. Die dissipativen Prozesse deponieren Energie und Impuls der akustischen Störungen in die Ebene senkrecht zur Ausbreitungsrichtung der Störungen und schmieren diese so aus. (II) Nach dem kinetischen Entkopplungsprozeß strömt CDM frei auf Geodäten. Dies ermöglicht einen Strom von Teilchen von überdichten in unterdichte Regionen, so daß die Amplituden der lokalen Überdichten weiter gedämpft werden. Die lokalen Transportkoeffizienten in (1) werden durch einen legitimen Vergleich von hydrodynamischer und kinetischer Beschreibung schwach dissipativer Prozesse gewonnen. Dissipative Prozesse induzieren eine Dämpfungsmasse Mc ungefähr gleich 10 hoch minus 9 M in SUSY-CDM und beschränken damit das Spektrum akustischer Störungen in SUSY-CDM. Freies Strömen (II) von CDM-Teilchen auf Geodäten induziert eine weitere Dämpfungsmasse M fs ungefähr gleich 10 hoch minus 6 M in SUSY-CDM, wobei das berechnete M d als Anfangswert dient. Die berechneten Schwellen liefern konsistente Schranken für numerische Simulationen, die weit unterhalb des momentanen numerischen Auflösungsvermögens liegen. Weiterhin folgt aus den Schwellen die Masse der ersten rein gravitativ gebundenen CDM-Wolken. Aus diesen bilden sich im Rahmen der hierarchischen Strukturbildung größere Substrukturen bis hin zu den heute vorhandenen CDM-Halos.
Das R( )-Enantiomer der rac-a-Liponsäure ist als Coenzym wichtiger Multienzymkomplexe (Pyruvatund a-Ketoglutarat-Dehydrogenase) essentiell für die Zell- und Stoffwechselfunktion. Gerade in den wichtigen Prozessen der Zelle, die Substrate für die Atmungskette bereitstellen (Glykolyse, Citratcyclus), spielt die R( )-a-Liponsäure eine entscheidende Rolle. Zusätzlich besitzt dieser Wirkstoff die Eigenschaft als Chelatkomplex-Bildner, Radikalfänger und Antioxidans zu wirken, und er kann damit den Organismus vor "oxidativem Stress" schützen. Klinische und präklinische Studien geben Hinweise, daß R( )-a- Liponsäure einen positiven Effekt auf die Insulinsensitivität, die Insulin stimulierte Glukoseaufnahme und die Glukoseoxidation hat, weiterhin die Glukoneogenese hemmt und damit eine positive Wirkung auf den Krankheitsverlauf des Typ II - Diabetes hat. Das Ziel dieser Arbeit war es, die in der Literatur beschriebenen lang anhaltenden Wirkungen (Pharmakodynamik) der R( )-a-Liponsäure (12 - 24 h nach Gabe des Wirkstoffes) mit meßbaren Konzentrationen dieser Substanz im Organismus in Zusammenhang zu bringen, um erste Ansätze für die Korrelation zwischen Pharmakokinetik und Pharmakodynamik, also für die Konzentrations-(Dosis)- Wirkungsbeziehung, zu geben. Außerdem sollte geklärt werden, weshalb die Mehrfachgabe zu einer deutlichen Absenkung der nach Einfachgabe wirksamen Dosis führte. Eine wichtige Grundlage dazu ist die genaue Kenntnis der Pharmakokinetik der Wirksubstanz und ihrer wichtigsten Stoffwechselprodukte. Bisher ist nur die Pharmakokinetik der R( )- und S(-)-a-Liponsäure nach Gabe der razemischen a-Liponsäure untersucht worden. Da noch keine Erkenntnisse über die Pharmakokinetik der Metaboliten oder der R( )-a-Liponsäure nach Gabe des reinen R-Enantiomers bestanden, lag der Schwerpunkt der Arbeit auf den Untersuchungen der Pharmakokinetik des R( )- Enantiomers und der Metaboliten nach Gabe von R( )-a-Liponsäure als Trometamolsalz (Dexlipotam) und rac-a-Liponsäure am Tier (Einfach- und Mehrfachgabe) und am Menschen (Einfachgabe). Untersuchungsmodell Ratte: Erster Ausgangspunkt der kinetischen Untersuchungen war das zentrale Kompartiment, abgebildet durch den Blutkreislauf. Die resultierende Plasmakonzentrations-Zeitkurve nach oraler (p.o.), intravenöser (i.v.) oder intraperitonealer (i.p.) Gabe von Dexlipotam konnte mathematisch, basierend auf einem Zwei-Kompartiment-Modell, beschrieben werden. Charakteristisch für die Pharmakokinetik der R( )-a-Liponsäure war die kurze terminale Halbwertszeit (0,6 - 1,6 h) und die hohe, mit dem hepatischen Blutfluß vergleichbare, totale Plasma-Clearance. Diese Eigenschaften führten zu einem schnellen Absinken der Plasmakonzentration auf Werte unterhalb der Nachweisgrenze (6 h nach Gabe des Wirkstoffes). Mit Hilfe der Mikrodialyse wurde nach 1-stündiger Infusion von Dexlipotam die freie ungebundene R( )-a-Liponsäure-Konzentration im Interstitium des Muskels bestimmt. Der zeitliche Verlauf der Gewebekonzentration konnte basierend auf der physiologischen Grundlage eines peripheren Kompartiments (Zwei-Kompartiment-Modell) beschrieben werden. Es zeigte sich, daß nur der freie ungebundene Anteil der im Plasma vorliegenden Konzentration (20 %) für die Distribution in das Gewebe zur Verfügung steht. Die ermittelten Halbwertszeiten der Muttersubstanz im Plasma und im Muskel lagen in vergleichbarer Größenordnung und gaben keinen Hinweis auf eine unterschiedliche Kinetik im Plasma und im Gewebe. Sowohl nach p.o. als auch nach einmal täglicher i.v. Mehrfachgabe über 3 - 4 Wochen konnte keine Anreicherung im Plasma bestimmt werden. Dieser Befund erklärte somit nicht die nach Mehrfachgabe erforderliche Dosisreduktion. Die in weiteren Untersuchungen bestimmten Gewebekonzentrationen in der Leber, in der Niere, im Muskel und im Herzen, die sich aus dem freien ungebundenen und dem reversibel gebundenen Anteil der extrazellulären und intrazellulären Konzentration zusammensetzten, zeigten einen zur Plasmakinetik korrespondierenden Zeitverlauf. Nur einzelne spezifische Geweberegionen zeigten nach p.o. (Aorta) und nach i.v. (Nerven) Mehrfachgabe eine Anreicherung des Wirkstoffes. In in-vitro Testmodellen wurde weiterhin die Pharmakokinetik auf zelluläre Ebene untersucht. Es zeigte sich, daß Hepatozyten in der Lage sind, R( )-a-Liponsäure aufzunehmen und die durch b-Oxidation entstandenen Metaboliten Bisnorliponsäure (BNLA) und Tetranorliponsäure (TNLA) zu bilden und aus der Zelle heraus zu transportieren. Im Hinblick auf die Konzentrations-Wirkungsbeziehung rückten die Metaboliten Tetranorliponsäure und Bisnorliponsäure in das Interesse, da diese Stoffwechselprodukte wie die Muttersubstanz über einen aktiven Dithiolan-Ring verfügen, der möglicherweise das für die Wirkung verantwortliche Strukturelement darstellt. Im Interstitium des Muskels wurde der Metabolit TNLA in vergleichbaren Konzentrationen wie die Muttersubstanz gemessen, der Metabolit BNLA war dort nur in Spuren meßbar. Im Plasma hingegen waren die maximalen TNLA-Konzentrationen um den Faktor 3 geringer als die Muttersubstanz- Konzentrationen. Der Metabolit BNLA war im Plasma nur in geringem Ausmaß, um den Faktor 15 geringer als die Muttersubstanz, meßbar. Untersuchungsmodell Mensch: Im Menschen wurden die Metaboliten TNLA, BNLA, 6,8-Bis(methylmercapto)octansäure (BMOA), 4,6- Bis(methylmercapto)hexansäure (BMHA) und 2,4-Bis(methylmercapto)butansäure (BMBA) im Plasma und im Urin pharmakokinetisch untersucht. Die Metaboliten BMOA, TNLA und BNLA zeigten Halbwertszeiten in vergleichbarer Größenordnung wie die Muttersubstanz (0,5 - 0,9 h). Für die Metaboliten BMBA und BMHA wurden höhere terminale Halbwertszeiten (2 h) ermittelt. Aufgrund der insgesamt kurzen Halbwertszeiten konnte eine Kumulation der Metaboliten nach Mehrfachgabe ausgeschlossen werden. Mit Hilfe eines pharmakokinetischen Modells (Zwei-Kompartiment-Modell) war es möglich, die Bildung der Stoffwechselprodukte BNLA, TNLA, BMOA, BMHA und BMBA im Plasma zeitlich simultan zu beschreiben. Dadurch konnte der Metabolisierungsweg der a-Liponsäure im Organismus genauer erklärt und die resultierenden Konzentrationen der Metaboliten auf Basis der Muttersubstanz-Konzentrationen errechnet werden. Es war nicht möglich, die gemessenen Konzentrationen, weder von der Muttersubstanz noch von den möglichen wirksamen Metaboliten, in den verschiedenen Kompartimenten (Blutkreislauf, Gewebe oder Zelle) mit der lang anhaltenden Wirkung in einen zeitlichen Zusammenhang zu bringen. Weitere Untersuchungen mit empfindlicheren Meßmethoden und weitergehende zusätzliche Konzentrationsbestimmungen in den Kompartimenten in der Zelle (z.B. Mitochondrien) sind erforderlich, um die Korrelation zwischen der Pharmakokinetik und der Pharmakodynamik der R( )-a-Liponsäure oder möglicher wirksamer Metaboliten zu beschreiben.
Das Genom des Archaeons Halobacterium salinarum kodiert vier Proteine der SMC Protein Superfamilie. Zwei Proteine bilden dabei eine neue Gruppe und werden "SMC-artige Proteine von H. salinarum" (Sph1 und Sph2) genannt. Eine Transkriptanalyse ergab, dass sph1 und das 114 bp stromabwärts gelegene hp24 Gen ausschließlich in exponentiell wachsenden Zellen transkribiert werden. In Zellen der stationären Wachstumsphase ist keines der beiden Transkripte nachweisbar. Die Funktion von Sph1 wurde durch Versuche mit Überproduktions- und Depletionsstämmen von H. salinarum untersucht. Die konditionale Überproduktion von Sph1 inhibiert die weitere Zellteilung und führt zu einer Längenzunahme der Zellen. Erstmals wurde durch ein antisense-mRNA-System in einem Archaeon ein Protein, Sph1, depletiert. Die Depletion führt ebenfalls zur Inhibition der weiteren Zellteilungsereignisse. Beide Phänotypen zeigen, dass Sph1 eine essentielle Rolle im Verlauf des Zellzyklusses einnimmt. Um Zellzyklus spezifische Ereignisse zu analysieren wurde eine Synchronisationsprozedur für H. salinarum entwickelt. Dazu wurde der Effekt von sechs eukaryalen Zellzyklusinhibitoren auf den Zellzyklus von H. salinarum untersucht. Bei geeigneter Konzentration verursacht der effizienten DNA Polymerase Inhibitor Aphidicolin eine schnelle und reversible Zellzyklusblockade, während andere zelluläre Prozesse nicht beeinflusst werden. Durch Ermittlung der Zelldichte, der mittleren Zelllänge und des Anteils an Septum bildenden Zellen wurde festgestellt, dass nach Entfernen des Inhibitors ca. 70 % der in der Kultur vorhandenen Zellen den Zellzyklus synchron durchlaufen. Diese Prozedur erlaubt erstmals die Untersuchung der Zellzyklus abhängigen Regulation der Transkription, Proteinakkumulation sowie der intrazellulären DNA-Lokalisation in einem Archaeon. Transkriptionsstudien mit synchron wachsenden H. salinarum-Kulturen ergaben, dass das sph1 Transkript eindeutig Zellzyklus abhängig reguliert ist. Die maximale Transkriptmenge ist dabei zum Zeitpunkt der Septumbildung nachweisbar. Die Expression des hp24 Gens beginnt etwa eine Stunde vor der Expression des sph1 Gens. Bevor die sph1 Transkriptmenge ihr Maximum erreicht, nimmt die hp24 Expression wieder ab. Das cdcH Gen, das für ein Protein der Cdc48 Familie kodiert, ist wie das sph1 Gen um den Zeitpunkt der Septumbildung stark induziert, während ein ftsZ Allel nicht in Zellzyklus abhängiger Weise reguliert ist. Die Transkriptionsmuster zeigen, dass die Transkription verschiedener Gene im Verlauf des haloarchaealen Zellzyklusses präzise reguliert wird. Die Sph1 Proteinmenge ist ebenfalls während des Zellzyklusses reguliert; sie ist erhöht, wenn die Segregation der neuen Chromosomen nahezu abgeschlossen ist. Folglich hat Sph1 vermutlich eine Funktion in der späten Phase der Replikation, z.B. in der DNA-Reparatur wie auch die eukaryalen Rad18 Proteine. Im Gegensatz zum sph1 Transkript ist das Protein während des gesamten Zellzyklusses in H. salinarum nachweisbar. Es ist daher nicht auszuschließen, dass Sph1 eine weitere Funktion ausübt, die eine Präsenz während des gesamten Zellzyklusses benötigt. Ein Färbeprotokoll mit einem DNA spezifischen Fluoreszenzfarbstoff wurde entwickelt, um die intrazelluläre Lokalisation des Nukleoids in H. salinarum zu bestimmen und seine differenzierte Positionierung im Verlauf des Zellzyklusses in synchronisierten Zellen zu verfolgen. Synchronisierte Kulturen wurden mit Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Es zeigte sich, dass das haloarchaeale Nukleoid nach einer anfänglichen Verteilung auf die gesamte Zelle in der Zellteilungsebene kondensiert. Im weiteren Verlauf wird die DNA zügig an die 1/4 und 3/4 Positionen transportiert. Alle DNA-Strukturen wurden auch in unbehandelten Zellen beobachtet, so dass Synchronisationsartefakte ausgeschlossen werden können. Diese Daten beweisen, dass die DNA in Haloarchaea aktiv zu spezifischen intrazellulären Regionen transportiert wird und legen nahe, dass die Replikation in der Zellteilungsebene erfolgt, wie es in den letzten Jahren für einige bakterielle Arten nachgewiesen wurde. Die Untersuchungen bilden die Grundlage für weitere Untersuchungen molekularer Details des archaealen Zellzyklusses.
In der vorliegenden Dissertation wurden Antikörperfragmente, um sie zu oligomerisieren, an alpha-Helixbündel rekombinant fusioniert und die Fusionsproteine sowie deren Produktion untersucht. Dabei wurde durch Fusion eines Fv-Antikörperfragmentes an das trimere alpha-Helixbündel "Coil-Ser" das Fusionsprotein "Fv7E2-CS" entwickelt. Wegen der Fusion an Coil-Ser liegt das Ev-Fragment selbst in trimerem Zustand vor und kann auch sein Antigen, eine Cytochrom-c-Oxidase aus Paracoccus denitri/icans, binden und dadurch trimersieren. Antikörper gehören zur Immunabwehr der Wirbeltiere und sind Proteine, die in den Organismus eingedrungene, fremde Moleküle als "Antigene" spezifisch binden. Im momentan stark expandierenden Forschungsgebiet des "Antikörper-Designs" werden Antikörper und ihre Fragmente modifiziert, was besonders für die Entwicklung medizinischer Diagnostiken und Therapien vielversprechend ist. Eines der vielen Ziele ist die Steigerung der Bindungsaffinitäten, was unter anderem über die Vervielfältigung der natürlichen Bindestellen innerhalb eines künstlichen Antikörpermoleküls erreicht werden kann. Weiterhin möchte man Bindestellen gegen unterschiedliche Antigene in einem einzigen Antikörpermolekül vereinen, um dem Antikörper komplexere Funktionsfähigkeiten zu verleihen. Beide Ziele können durch Oligomerisierung der bindenden Antikörperfragmente verwirklicht werden. Zur künstlichen Oligomerisierung von Antikörperfragmenten wurde, neben anderen Strategien, die rekombinante Fusion an alpha-Helixbündel bereits einige Male erfolgreich angewandt. alpha-Helixbündel bestehen aus zwei bis etwa acht alpha-helikalen, längsseitig miteinander oligomerisierenden Peptidketten und können auch in natürlichen Proteinen als Oligomerisierungseinheiten fungieren. In der vorliegenden Dissertation wurden drei Fv-Antikörperfragmente und ein SchwerkettenAntikörperfragment mit drei verschiedenen alpha-Helixbündeln in unterschiedlichen Kombinationen rekombinant fusioniert und anschließend ihre Produktion und Funktion untersucht. Als Helixbündel zum Einsatz kamen das heterotetramere alpha-Helixbündel des neuronalen "SNARE"-Komplexes, die homo- als auch mit "Fos" heterodimerisierende Helix des AP-1-Transkriptionsfaktors ".Jun" und das synthetische, antiparallel homotrimerisierende Peptid "Coil-Ser". Die Expressionsprodukte vieler Fusionen konnten in Zellaufschlüssen mit Western Blots gefunden werden, nur einige aber ließen sich mit Affinitäts-Chromatographie in geringen Mengen (<0,1 mg/L Kultur) anreichern. Andere Produkte, bzw. bei einigen Fv-Fragmenten die Untereinheiten mit Peptid, waren durch die Fusion in ihrer Produktion deutlich gestört bis gar nicht vorhanden. Alle drei an Coil-Ser fusionierten Ev-Fragmente ließen sich in Mengen bis 0,5 mg/L Kultur anreichern. In der Gelfiltration zeigten sie sich mit vollständig assoziierten Untereinheiten, als auch mit vergrößerter, apparenter Molmasse im Vergleich zu den Fv-Fragmenten ohne fusioniertes Peptid. Von zweien der Coil-Ser-Fv-Fragmente konnte Antigenbindung beobachtet werden und davon bei Fv7E2-CS die Entstehung eines Fv-Antigen-Komplexes mit einer gegenüber dem ursprünglichen Antigen-Komplex sehr stark vergrößerten apparenten Molmasse. Mit analytischer Ultrazentrifugation wurde die Oligomerisierungsfähigkeit von Fv7E2-CS näher untersucht und für das ungebundene Fv-Fragment sowie für seinen Antigen-Komplex eine Massenkomponente mit im Vergleich zum jeweiligen Monomer dreifacher Molmasse gefunden. Für die Probe des Fv7E2-CS alleine wurde dabei ein Anteil an Komponenten trimerer Größenordnung von gut 95% ermittelt, also nahezu Homogenität, und in der Probe des Antigen-Komplexes zu 35 - 50 % Komponenten trimerer, sonst monomerer Größenordnung. Die Ursache für den niedrigeren Anteil an trimeren Komponenten in der Probe des Komplexes könnte hauptsächlich das hier vorhandene Detergenz sein, welches für das als Antigen fungierende Membranprotein Cytochrom-c-Oxidase nötig ist. Denn schon für das Fv7E2-CS alleine wurde in Kontrollen mit Detergenz eine Verringerung des Anteils an trimerer Komponente bzw. seiner mittleren Molmasse festgestellt. Das Fv-Fragment Fv7E2 ohne Peptid als auch dessen Antigen-Komplex zeigten in der Ultrazentrifuge keine bzw. nur unbedeutende Anteile an trimeren Massenkomponenten. Die Experimente deuten somit daraufhin, daß durch die Fusion des trimerisierenden Peptides Coil-Ser an Fv7E2 sowohl die Trimerisierung des Fv-Fragmentes, als auch bei Bindung des Antigens dessen Trimerisierung bewirkt wird. Das alpha-Helixbündel Coil-Ser ist folglich potentiell in der Lage, als Oligomerisierungseinheit für Fv-Antikörperfragmente eingesetzt zu werden. Wegen der aus Röntgenstrukturanalysen bekannten und für in Lösung prognostizierten Antiparallelität der Peptide im Coil-Ser-Bündel werden für die drei Fv-Fragmente bzw. die drei Bindestellen im Coil-Ser-Fusionsprotein einander entgegen-gesetzte Orientierungen vermutet, was für spätere Anwendungen von Bedeutung ist.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zunächst ein Vorschlag für eine Direktive zur Anwendung von Monitored Natural Attenuation (MNA) an Grundwasserschadensfällen durch Mineralölprodukte unter Berücksichtigung der in Deutschland geltenden Vorgaben für eine konkrete technische Durchführung erarbeitet. Das darin enthaltene Untersuchungs- und Auswertungsprogramm zum Nachweis von Natural Attenuation (NA) berücksichtigt die gesetzlichen Regelungen des Bundes-Bodenschutzgesetzes (BBodSchG) und der BundesBodenschutz- und Altlastenverordnung (BBodSchV). Das entwickelte Untersuchungs- und Auswertungsprogramm wurde in einem weiteren Schritt an einer laufenden MNA-Maßnahme aus der Praxis überprüft. Hierfür wurde ein Kerosin-kontaminierter Teilbereich am Standort des ehemaligen Militärflughafens Wegberg-Wildenrath in Nordrhein-Westfalen ausgewählt. Im Grundwasser liegt eine Kontamination überwiegend aus aromatischen Kohlenwasserstoffen (BTEX und weitere alkylierte Aromaten) sowie MKW (H18) vor. Anhand des Praxisbeispiels wurde die generelle Verwendbarkeit von bereits im Rahmen der bisherigen Altlastenbearbeitung erhobenen Daten im Sinne des erarbeiteten Untersuchungsprogramms aufgezeigt. Hydrogeologische Untersuchungen belegten eine Abhängigkeit der Konzentration von Schadstoffen im Wasser von einem bis zu /- 1,7 m schwankenden Grundwasserstand, wodurch ein instationäres Fahnenverhalten vorlag. Aufbauend auf den Erkenntnissen der hydrogeologischen Erkundung und der Auswertung von hydrochemischen Daten wurden für den Standort zwei sich ergänzende konzeptionelle Modellvorstellungen (ein hydrochemisches Modell sowie ein hydrodynamisches Modell) bezüglich der Prozesse, die das Fahnenverhalten steuern, entwickelt. Beim hydrochemischen Modell erfolgt durch schwankende Grundwasserstände ein Recycling der Elektronenakzeptoren S042- und Fe3 für den Schadstoffabbau im herdnahen Bereich. Bei hohem Grundwasserstand werden reduzierte Eisenspezies als unlösliche Eisenmonosulfide ausgefällt. Bei niedrigem Grundwasserstand werden diese Eisenmonosulfide in Folge von Belüftung zu löslichen Fe3 /SO42-haltigen Mischkristallen oxidiert. Bei einem erneuten Anstieg des Grundwassers steht dieser Elektronenakzeptorpool für einen weiteren Schadstoffabbau zur Verfügung, was wiederum zur Ausfällung der reduzierten Eisenspezies führt. Beim hydrodynamischen Modell werden die beobachteten Konzentrationsänderungen im Grundwasser hauptsächlich durch Schadstoff-Phasenübergänge und der Größe der dabei zur Verfügung stehenden Grenzflächen hervorgerufen. Der Austausch von Schadstoffen aus der NAPL (non-aqueous phase liquids)-Phase in die Bodenluft bei niedrigen Grundwasserständen ist erheblich größer im Vergleich zum Austausch der NAPL-Phase in die (Grund)wasserphase bei hohen Grundwasserständen. Daraus resultieren höhere Schadstoffgehalte im Schadenszentrum bei niedrigen Grundwasserständen und geringere Gehalte bei hohen Grundwasserständen. Eine wichtige Erkenntnis dieser Arbeit war die Herausarbeitung der Art des Einflusses schwankender Grundwasserstände auf die Fahnendynamik. Anhand der Untersuchung auf aromatische Säuren (Metabolite), die im (my)g/l-Bereich nachzuweisen waren, konnte der direkte Beweis für einen aktiven Bioabbau am Standort erbracht werden. Durch einen Vergleich des Aromatenspektrums mit dem vorgefundenen Metabolitenspektrum wurden Aussagen zum Abbauverhalten von einzelnen aromatischen Schadstoffgruppen ermöglicht. Die Abbauprognose ist aufgrund des instationären Fahnenverhaltens mit größeren Unsicherheiten behaftet. Attenuations- bzw. Abbauraten zwischen 0,0003 * 1/d und 0,001 * 1/d wurden anhand von zwei unterschiedlichen Verfahren ermittelt.
Das Ziel dieser Arbeit wurde eingangs über den Begriff der erweiterten Schließung der optischen und mikrophysikalischen Eigenschaften der Partikel definiert. Hierunter versteht man das Zusammenfügen von verschiedenen Messungen zu einem konsistenten Bild der betrachteten Partikeleigenschaften. Darüber hinaus sollen die Messungen auch in anderen Teilgebieten der Aerosolphysik verwendbar sein, um so das konsistente Bild zu erweitern. Dieses so umschriebene Ziel konnte für die mikrophysikalischen und optischen Messergebnisse, die während des LACE 98 Experimentes, einem vom Bundesministerium für Forschung und Bildung (Bmb f) geförderten Schließungsexperiment, in Lindenberg (Brandenburg) rund 50 km südöstlich von Berlin im Juli und August 1998 erfasst wurden, erreicht werden. Die Messungen wurden erfolgreich zu einem konsistenten Datensatz und einem "Bild" der Partikeleigenschaften zusammengefügt. Unter dem Begriff "Bild" subsummiert sich hierbei nicht nur eine Charakterisierung der Variabilität und Abhängigkeit der Partikeleigenschaften, z.B. von der rel. Luftfeuchte, sondern darüber hinaus auch eine Charakterisierung der Beeinflussung verschiedener von den Eigenschaften der Partikel abhängiger Größen. Hierzu zählen Strahlungshaushaltsgrößen (Erwärmungsrate der Luft durch Absorption solarer Strahlung und die Volumenabsorption solarer Strahlung durch Partikel), wolkenphysikalische Größen (maximale Übersättigung der Wolkenluft während der Wolkenentstehung und Anzahlkonzentration der wachsenden Wolkentropfen), die massengewichtete mittlere Sedimentationsgeschwindigkeit von Partikeln und nicht zuletzt gesundheitsrelevante Größen, wie z.B. die vom Menschen beim Atmen aufgenommene und eingelagerte Partikelmasse. Nachfolgende Zusammenstellung soll nochmals die erzielten Ergebnisse zusammenfassen. Für eine detaillierte Darstellung der in den einzelnen Kapiteln erzielten Ergebnisse soll hier nur auf die jeweiligen Zusammenfassungen der einzelnen Kapitel verwiesen werden. . Im Rahmen der direkten Schließung, wurden unterschiedliche Verfahren zur Bestimmung der optischen Eigenschaften der Partikel erfolgreich miteinander verglichen. Beteiligt waren bei diesem Vergleich folgende Methoden: Partikel im trockenen Zustand: -- Aerosolphotometer (alle optischen Eigenschaften, ) -- Nephelometer (Streukoeffizient) -- PSAP (Absorptionskoeffizient) -- IPMethode (Absorptionskoeffizient) -- Telephotometer (Extinktionskoeffizient) Partikel bei Umgebungsfeuchte: -- Telephotometer (Extinktionskoeffizient) -- horizontales Lidar (Extinktionskoeffizient) Es zeigte sich, dass sich das Aerosolphotometer mit seinem schon aus der Theorie des Messverfahrens her begründeten konsistenten Satz aller optischen Eigenschaften als Referenzmethode während LACE 98 bewährte. Mit seiner Hilfe konnte nun auch die Gültigkeit einer empirischen Korrektur des PSAP nach Bond et al. [1999] für natürliche Aerosolpartikel bestätigt werden. Dem Anwender dieses Gerätes, das mit einer hervorragenden zeitlichen Auflösung von wenigen Minuten den Absorptionskoeffizienten bestimmt, stehen somit zwei unabhängig voneinander gewonnene Kalibrierungsfunktionen zur Verfügung, die innerhalb der Fehlergrenzen auch mit einander im Einklang stehen. . Im Rahmen der indirekten Schließung wurde ein Modell entwickelt, mit dem auf Basis eines Kugelschalenmodells der Partikel aus Messungen der mikrophysikalischen Eigenschaften der Partikel den Extinktions, den Streu- und den Absorptionskoeffizienten sowie die Single Scattering Albedo berechnet wurden. Mit Hilfe dieses Modells wurde der Feuchteeffekt der oben genannten optischen Eigenschaften berechnet. Mit diesen Ergebnissen konnten dann die Messwerte des Telephotometers feuchtekorrigiert, und mit den Messungen des Aerosolphotometers verglichen werden, wo bei eine gute Übereinstimmung der Messreihen festgestellt werden konnte. Die beobachteten Unterschiede konnten auf Ernteaktivitäten, die nur die Messungen des Telephotometers beeinflussten, zurückgeführt werden. Ein Vergleich der mit Hilfe des Modells auch direkt berechenbaren optischen Eigenschaften mit den direkten Messwerten der beteiligten Verfahren fiel ebenfalls positiv aus. Anhand aller Modellrechnungen wurde eine physikalisch motivierte Näherungsfunktion für den Feuchteeffekt des Extinktions- und des Streukoeffizienten als Funktion des Aktivierungsparameters bereit gestellt. In Klimamodellen kann mit Hilfe der vorgestellten Näherungsfunktionen der Feuchteeffekt auf einfache Weise parametrisiert werden. Wenn man allerdings konkrete Messergebnisse miteinander vergleichen möchte, ist man auf eine vollständige Erfassung der mikrophysikalischen Eigenschaften der Partikel angewiesen. . Im Teil IV der Arbeit wurden auf der Basis des zuvor vorgestellten Datensatzes und der hierfür entwickelten Verfahren (Algorithmen) weitere Auswertungen zu unterschiedlichen, für die Meteorologie interessanten Themengebieten, vorgestellt und ihre Ergebnisse charakterisiert. . In Kapitel 6.1 wurde mit Hilfe von Auswertegleichungen aus den in dieser Arbeit erstellten Messungen des Sieben-Sensor-Bilanzphotometers und den Messungen des Aerosolphotometers die Volumenabsorptionsrate solarer Strahlung der bodennahen Partikel und die daraus resultierende Erwärmungsrate der Luft berechnet. Die Ergebnisse wurden mit Literaturwerten anderer Messkampagnen verglichen. Insbesondere konnte ein interessantes Ergebnis von Hänel
Die Chemie und der Strahlungshaushalt der Erdatmosphäre werden durch die nur in relativ geringen Konzentrationen vorhandenen Spurengase und Aerosolpartikel beherrscht. Mit den zunehmenden anthropogenen Emissionen von atmosphärischen Spurengasen, verursacht durch die wachsende Weltbevölkerung und die zunehmende Industrialisierung, wurde in den letzten Dekaden ein globaler Wandel bei der Zusammensetzung der Erdatmosphäre festgestellt: Konzentrationen von atmosphärischen Spurenstoffen verändern sich nicht mehr auf vergleichsweise langsamen geologischen Zeitskalen, sondern mit viel höheren Geschwindigkeiten, in einzelnen Fällen von bis zu einem Prozent pro Jahr. Die wohl bekanntesten Folgen dieser Veränderungen sind die globale Erwärmung durch die ansteigenden Emissionen von Treibhausgasen und der mit dem antarktischen 'Ozonloch" entdeckte drastische Ozonverlust in der Stratosphäre durch anthropogene Fluor-Chlor-Kohlenwasserstoffe (FCKW). Die Verteilung der für Ozonchemie und Klima relevanten Spurengase in der Atmosphäre hängt dabei nicht nur von der Verteilung ihrer Quellen und Senken ab, sondern wird maßgeblich durch verschiedene Transportprozesse beeinflußt. Der Austausch zwischen der mit anthropogenen Emissionen belasteten Troposphäre und den höheren Atmosphärenschichten Stratosphäre und Mesosphäre spielt dabei eine zentrale Rolle. Im Rahmen der Dissertation wurde zum besseren Verständnis von Stratosphären-Troposphären-Austauschprozessen die Verteilung von langlebigen Spurengasen in den beiden atmosphärischen Kompartimenten Troposphäre und Stratosphäre untersucht. Dazu wurde bei einer Meßkampagne im Sommer 1998 im Rahmen des von der Europäischen Union geförderten Forschungsprojektes STREAM 98 der flugzeuggetragene Gaschromatograph GhOST (Gas chromatograph for the Observation of Stratospheric Tracers) an Bord einer Cessna Citation II der TU Delft in Höhen bis 13 km eingesetzt. Dabei konnten bei zwanzig Meß- und Transferflügen über Kanada, dem Atlantik und Westeuropa umfangreiche Messungen der langlebigen Spurengase N20, F11 und F12 in der oberen Troposphäre und der Untersten Stratosphäre durchgeführt werden. Unter Flugbedingungen wurde mit GhOST während der Kampagne eine Reproduzierbarkeit (1 o) von besser als 0,6 % und eine absolute Genauigkeit von besser als 2 % für alle nachgewiesenen Spurengase erreicht. Diese hohe Meßpräzision konnte durch zahlreiche Vergleichsmessungen mit anderen Meßgeräten und Meßverfahren - im Flugbetrieb und im Labor sichergestellt werden; die Linearität des Geräts wurde zudem mit Hilfe einer barometrisch hergestellten Verdünnungsreihe untersucht. Die mit GhOST bei STREAM 98 gewonnenen Meßwerte wurden zusammen mit Messungen und Modelldaten der am Projekt beteiligten Arbeitsgruppen zur Untersuchung von Spurengasverteilungen und Stratosphären-Troposphären-Austauschprozessen herangezogen. Untersucht wurden dabei unter anderem die Verteilung und Variabilität von N20, F11 und F12 in der Troposphäre und in der Untersten Stratosphäre der mittleren Breiten, Austausch- und Mischungsprozesse in der Tropopausenregion und die Variabilität von Tracer/Tracer-Korrelationen in der Untersten Stratosphäre. Aufbauend auf den Erfahrungen bei STREAM 98 wurde für das vom BMBF geförderte Projekt SPURT im Rahmen dieser Doktorarbeit der in-situ-Gaschromatograph GhOST II entwickelt. Unter Beibehaltung der gaschromatographischen Komponenten von GhOST wurden zur Messung der Spurengase SF6 und CO zwei zusätzliche Detektoren integriert und zahlreiche technische Verbesserungen durchgeführt. Für die vollautomatische rechnergestützte Elektronik zur Steuerung des neuen Gerätes wurden zusammen mit der institutseigenen Elektronikwerkstatt verschiedene Baugruppen zur Signalführung und -verarbeitung, zur Temperaturmessung und zur Ansteuerung von Leistungskomponenten entwickelt. Während einer Testkampagne im April 2001 wurde GhOST II erfolgreich mechanisch und elektrisch auf einem Learjet 35A integriert und kam bei zwei Meßflügen der Meßkampagne SPURT 1 im November 2001 zum Einsatz.
Das Angiotensin konvertierende Enzym (ACE) ist als eine der zentralen Komponenten des ReninAngiotensin-Systems entscheidend an der Regulation der vaskulären Funktion und Homöostase sowie an der Regulation des Flüssigkeits- und Elektrolythaushaltes beteiligt. Dabei katalysiert die Zinkmetallopeptidase ACE vor allem die Bildung des vasokonstriktorisch wirkenden Angiotensins II und die Degradation des vasodilatorisch wirkenden Bradykinins. Die Hemmung des ACE zur antihypertensiven Therapie ist klinisch weit verbreitet, wobei die zahlreichen protektiven Eigenschaften der eingesetzten, hochpotenten ACE-lnhibitoren nicht allein durch die Beeinflussung des Metabolismus der zwei beschriebenen vasoaktiven Peptide zu erklären sind. Vielmehr wird seit einiger Zeit angenommen, dass ACE beispielsweise durch eine Interaktion mit dem Bradykinin-B2-Rezeptor aktiv an der Regulation intrazellulärer Signaltransduktionsprozesse beteiligt ist. Da ACE als plasmamembranäres Ektoenzym in seiner kurzen cytoplasmatischen Sequenz fünf potentiell phosphorylierbare Serinreste besitzt, deren posttranslationale Modifikation durch Phosphorylierung möglicherweise intrazelluläre Signaltransduktionskaskaden beeinflussen könnte, wurde die potentielle Phosphorylierung von ACE sowie die Assoziation von ACE mit intrazellulären Proteinen analysiert. Mittels 32P-Markierung humaner Endothelzellen und ACE-überexprimierender Schweineaortenendothelzellen konnte erstmals die Phosphorylierung des ACE gezeigt werden, sowie unter Verwendung spezifischer Kinaseinhibitoren und anhand von in vitro Phosphorylierungsexperimenten die Proteinkinase CK2 als ACE-phosphorylierende Kinase identifiziert werden. Dies wurde zudem durch die Assoziation der CK2 sowohl mit ACE, als auch mit einem dem cytoplasmatischen Anteil von ACE entsprechenden Peptid bestätigt. Drei der intrazellulären Serinreste des ACE liegen innerhalb Konsensusse1uenzen bekannter Proteinkinasen, wobei nach Punktmutation der Serinreste Ser1253, Ser1263 oder Ser1270, entsprechend in Konsensussequenzmotiven für die PKC, PKA oder CK2 lokalisiert, der Ser1270-Rest als Hauptphosphorylierungsstelle des ACE identifiziert werden konnte. Die Reduktion der ACE-Phosphorylierung nach Mutation des Ser1270 zu Alanin sowie nach Hemmung der CK2 durch Einsatz des spezifischen lnhibitors 5,6-Dichloro-1-ß-D-ribofuranosylbenzimidazol (DRB) resultierte in einer verstärkten proteolytischen Spaltung des ACE, weiche extrazellulär in der juxtamembranär gelegenen "Stalk"-Region des Enzyms erfolgt, so dass vermehrt sekretiertes lösliches ACE in den Zellkulturüberständen der untersuchten Zellen zu finden war. Neben der CK2 fanden sich auch die schwere Kette nicht-muskulären Myosins (NMMHC), ß-Aktin, Annexin 2, die c-Jun NH2-terminalen Kinase (JNk) und die Proteinphosphatase PP1 assoziiert mit ACE oder einem dem intrazellulären Anteil von ACE entsprechenden Peptid. Da die an ACE gebundenen Proteine mehr oder minder in die Regulation intrazellulärer Signaltransduktionskakaden involviert sind, wurde überprüft, inwiefern die Aktivität oder Phosphorylierung dieser Proteine durch die Hemmung des ACE beeinflusst werden kann. Die Behandlung P-markierter Endothelzellen mit dem ACE-lnhibitor Ramiprilat resultierte deutlich nicht nur in einer transient gesteigerten Phosphorylierung des ACE selbst, sondern auch in einer verstärkten Phosphorylierung des ACE-gebundenen NMMHC. Dabei werden beide Proteine durch die ACE-assoziierte CK2 phosphoryliert, deren Aktivität deutlich nach Hemmung des ACE zunahm. Die Identität des ACE als aktives Signaltransduktionsmoleküi wurde zudem sehr überzeugend durch die Messung der JNK-Aktivität bestätigt, da die Stimulation mit Ramiprilat nur in Wildtyp-ACE exprimierenden Endothelzelien in einer Aktivierun dieser Kinase resultierte, wohingegen nach Mutation der ACE-Phosphorylierungsstelle (Ser1270) keine durch Ramiprilat gesteigerte JNK-Aktivität zu verzeichnen war. Ebenso führte neben der Hemmung des ACE die Stimulation mit dem ACE-Substrat Bradykinin zur lnitiation der beschriebenen Prozesse. Die durch ACE-lnhibitoren induzierte Signaltransduktion scheint auch an der Potenzierung und Reaktivierung der durch Bradykinin vermittelten Zellaktivierung beteiligt zu sein, da nur in ACE-exprimierenden Zellen die Hemmung der CK2 in einer verminderten Bradykinin-induzierten Endothelzellaktivierung resultierte und der ACE-lnhibitor diese Reduktion vollständig umkehrte. Die Entdeckung der posttranslationalen Modifikation des ACE durch Phosphorylierung zur Regulation der Sekretion des Enzyms sowie zur lnitiation intrazellulärer Signalkaskaden eröffnet eine neue molekulare Basis für das Verständnis und die Charakterisierung der zahlreichen protektiven Eigenschaften der ACE-lnhibitoren. Zudem liefert die Identifizierung des ACE als aktives Signaitransduktionsmolekül mit der Fähigkeit zum "Outside-In-Signaling" möglicherweise neue Ansatzpunkte für die Entwicklung antihypertensiver Therapien.
Enzyme der Cytochrom P450 (CYP) 2C Familie werden extrahepatisch vor allem in Endothelzellen exprimiert und liefern durch Metabolisierung der Arachidonsäure zu Epoxyeicosatriensäuren (EET) einen den Gefäßtonus modulierenden Faktor, den sogenannten endothelialen hyperpolarisierenden Faktor (EDHF), der zur Relaxation des glatten Gefäßmuskels führt. Neben dieser wichtigen Funktion als EDHF-Synthase beeinflussen diese Enzyme (CYP-Epoxygenasen) weitere zentrale Signalwege der Endothelzellen und tragen so zur vaskulären Homöostase bei. So wurde beschrieben, dass EET u.a. antiinflammatorische und fibrinolytische Eigenschaften besitzen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung weiterer Funktionen der CYP Epoxygenasen in Endothelzellen. Zunächst wurden physiologisch und pharmakologisch relevante Einflüsse auf die Expression der endothelialen CYP 2C lsoformen untersucht. Im Gegensatz zu der deutlichen CYP 2C Expression in nativen Endothelzellen, ist die Expression in kultivierten Endothelzellen drastisch reduziert. Es wurde gezeigt, dass kultivierte Endothelzellen, die einer kontinuierlichen, rhythmischen Dehnung (18 Stunden) ausgesetzt waren, eine signifikant höhere CYP 2C Expression verglichen mit unter statischen Bedingungen kultivierten Endothelzellen aufweisen. Ebenso bewirkte zyklische Dehnung (sechs Stunden) von endothelintakten Koronarsegmenten eine Induktion der endothelialen CYP 2C Expression. Diese Befunde zeigen, dass pulsatile Dehnung von Endothelzellen, ein kontinuierlicher hämodynamischer Stimulus in vivo, wesentlich zu dem physiologischen Expressionsniveau von CYP Epoxygenasen beiträgt. Auch eine Reihe kardiovaskulärer Pharmaka beeinflussen die Expression von CYP Epoxygenasen. Inkubation kultivierter Endothelzellen bzw. endothelintakter Gefäßsegmente mit dem lnsulinsensitizer Troglitazon und den Statinen Cerivastatin und Fluvastatin ergab eine deutliche Expressionserhöhung der endothelialen CYP 2C Isoformen. Die physiologische Bedeutung der verstärkten Expression konnte mit der einhergehenden, verbesserten EDHF-vermittelten glattmuskulären Relaxation demonstriert werden. Der Effekt endothelialer CYP 2C9 Expression auf die Proliferation wurde in weiteren Experimenten untersucht. Hierzu wurden kultivierte Endothelzellen eingesetzt, die mit CYP 2C9 Expressionsvektoren (adenovirale Infektion bzw. liposomale Transfektion) transfiziert wurden. In diesen CYP 2C9 überexprimierenden Endothelzellen konnte der proliferative Effekt des Enzyms demonstriert werden, da sie sowohl eine verstärkte DNA-Synthese als auch eine erhöhte Zellzahl im Vergleich zu Kontrollvektor-behandelten Zellen zeigten. Als weiteren Marker einer Proliferation ließ sich eine erhöhte Expression des zellzyklusregulierenden Proteins Cyclin Dl nachweisen. Eine verstärkte Phosphorylierung und Aktivierung des EGF Rezeptors in CYP 2C9 überexprimierenden bzw. EET behandelten Zellen gab einen deutlichen Hinweis auf die Beteiligung des EGF Rezeptor-Signalweges an diesem proliferativen Prozess. Diese Hypothese wurde durch den Befund belegt, dass lnkubation mit dem EGF Rezeptor lnhibitor AG 1478 zur Hemmung der CYP 2C9-induzierten Proliferation führte. Die Aktivierung des EGF Rezeptors bewirkte des weiteren die verstärkte Phosphorylierung der Proteinkinase B/Akt. Neben dem proliferativen Effekt konnte sowohl für CYP 2C9 als auch für EET ein angiogenetischer Effekt demonstriert werden. Im in vitro Angiogenese-Assay führten CYP 2C9-Uberexpression und exogene Stimulation mit 11,12-EET zur Ausbildung kapillarartiger Strukturen, die bei Kontrollzellen nicht zu finden waren. Ebenso bewirkten 11,12-EET in vivo (chick chorioallantoic membrane-assay) eine signifikant verstärkte Gefäßneubildung, die sich, wie die induzierte Endothelzellproliferation, als EGF Rezeptor-vermittelt erwies. In weiteren Experimenten wurde die Rolle des CYP 2C9 als endotheliale Quelle physiologisch relevanter Mengen reaktiver Sauerstoffspezies analysiert. Mit unterschiedlichen Methoden konnte in kultivierten Endothelzellen sowie in endothelintakten Koronarsegmenten gezeigt werden, dass CYP 2C9 nicht nur EET, sondern auch Sauerstoffradikale bildet. Diese Erhöhung des oxidativen Stress führte in Endothelzellen zur Aktivierung des redoxsensitiven Transkriptionsfaktors NF-KB und zur verstärkten Expression des Adhäsionsmoleküls VCAM-1. Zusammengefasst konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die Expression von CYP 2C9 in Endothelzellen relevante, physiologische Funktionen wie Induktion von Proliferation und Angiogenese sowie Modulation der Aktivität von Transkriptionsfaktoren bedingt. Da EET über die Hemmung der NF-KB Aktivierung antiinflammatorische Effekte ausüben, die CYP 2C9-abhängige Bildung von O2- durch Aktivierung von NF-KB jedoch proinflammatorisch wirkt, sind grundsätzlich gegenläufige, CYP 2C9-induzierte Effekte möglich. Unter welchen Bedingungen EET oder Sauerstoffradikale eine funktionelle Dominanz ausüben, müssen weitere Studien klären.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluß der Variation des Oxidationspotentials und der Elektronenkonfiguration ( * gegen n *) auf die zur Löschung von angeregten Triplettzuständen durch O2 führenden Prozesse untersucht. Bei ausreichender Triplettenergie werden neben dem Grundzustand des ursprünglich angeregten Sensibilisators in Konkurrenz O2(1 g ) und O2(1 g) Singulettsauerstoff sowie O2(3 g -) Grundzustandssauerstoff gebildet. Frühere Untersuchungen in diesem Arbeitskreis hatten gezeigt, daß es für * Triplettzustände zwei Desaktivierungskanäle gibt, die beide zu O2(1 g ), O2(1 g) und O2(3 g -) führen. Der eine geht von den bei der Löschung zunächst gebildeten 1,3(T1 3 ) Encounter Komplexen ohne Charge Transfer Stabilisierung aus (nCT). Diese befinden sich in einem vollständig eingestellten spinstatistischen Gleichgewicht, aus dem durch innere Konversion in niedrigere Komplexzustände die Desaktivierung erfolgt. Ein gemeinsames Energielückengesetzt f( E) und damit letztlich die Triplettenergie des Sensibilisators bestimmt die Größe der Geschwindigkeitskonstanten der zu O2(1 g ), O2(1 g) und O2(3 g -) führenden Prozesse in diesem nCT Kanal. Für Sensibilisatoren mit hohem Oxidationspotential und vernachlässigbaren Charge Transfer Wechselwirkungen ist dies der einzige Desaktivierungsprozeß. Mit zunehmender Charge Transfer Wechselwirkung, also mit abnehmendem Oxidationspotential und/oder zunehmender Triplettenergie, wird ein zweiter Desaktivierungskanal geöffnet, der über 1,3(T1 3 ) Komplexe mit Charge Transfer Stabilisierung (pCT) also über Exciplexe führt. Die Exciplexbildung ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt im pCT Kanal. Zur Verbreitung der Datenbasis den T1( *) Sensibilisatoren wurde in dieser Arbeit eine Reihe von mit elektronenziehenden bzw. elektronenschiebenden Gruppen substituierten Fluorenen studiert, bei denen im wesentlichen nur das Oxidationspotential variiert, während die Triplettenergien weitgehend konstant bleiben. Die mit den Fluorenen erhaltener Ergebnisse bestätigen das bisher erarbeitet Zweikanal-Desaktivierungsmodell. Insbesondere wird auch das spinstatistische Gewicht von 1:3 für die Bildung von Singulett zu Triplettsauerstoff im Exciplex Kanal gefunden, das nur mit einem relativ langsamen 1(T1 3 ) 3(T1 3 ) isc Gleichgewicht konsistent ist. Dieses Ergebnis widerspricht der früheren Annahme, wonach ein effizientes isc Gleichgewicht nur zwischen 1,3(T1 3 ) Exciplexen, nicht aber zwischen 1,3(T1 3 ) Encounter Komplexen existieren soll. In der vorliegenden Arbeit wird ein Modell für die 1(T1 3 ) 3(T1 3 ) angeregten Komplexe vorgeschlagen, das in einfacher Weise erklärt, warum das isc zwischen Encounter Komplexen von Sensibilisator und O2 schneller ist, als das zwischen den entsprechenden Exciplexen. Die weitere Analyse der Fluoren Daten zeigt, daß neben dem Oxidationspotential und der Triplettenergie des Sensibilisators auch dessen Struktur die Geschwindigkeitskonstanten beeinflussen kann, allerdings weitaus schwächer als die beiden ersten Einflußgrößen. Mit den Messungen der Geschwindigkeitskonstanten kT 1 , kT 1 und für kT 3 der zu O2(1 g ), O2(1 g) und O2(3 g -) führenden Prozesse für die unterschiedlich substituierten Benzophenonderivate wurde erstmals eine quantitative Untersuchung der Löschung von n * angeregten Triplettzuständen durch O2 durchgeführt. Obwohl für die Benzophenone eine stärkere Variation des Oxidationspotentials bei nahezu konstanter Triplettenergie erreicht werden konnte, wurde im Vergleich zu den * Triplettsensibilisatoren eine wesentlich schwächere Variation von kT 1 , kT 1 und für kT 3 beobachtet. Gleichzeitig liegen die Werte von kT 1 , kT 1 und für kT 3 der Benzophenone mit vernachlässigbarer Charge Transfer Wechselwirkung weit von der für * Triplettsensibilisatoren gefundenen Energielückenbeziehung f( E). Offenbar gilt für n * Triplettsensibilisatoren eine andere Energielückenbeziehung f( E), die viel schwächer von E abhängt. Es konnte gezeigt werden, daß die schwächere Überschußenergieabhängigkeit mit der unterschiedlichen Struktur der 1,3(T1.3 ) Komplexe zusammenhängt. Für 1,3(T1(n *) 3 ) ist eine Vierzentren Struktur, bei der die beiden Sauerstoffatome des O2 Moleküls parallel und benachbart zu den beiden Atomen der angeregten Carbonyl Gruppe liegen, sehr wahrscheinlich. Bei der Desaktivierung der Carbonyleinheit ändern sich die Bindungslängen der Vierzentrenstruktur stark, was einem Übergang zwischen versetzten Potentialkurven mit schwacher Energieabhängigkeit der Franck-Condon Faktoren entspricht. Für 1,3(T1( *) 3 ) Komplexe ist eine supra-supra Struktur anzunehmen, bei der die beiden Sauerstoffatome des O2 Moleküls mit gegenüberliegenden Kohlenstoffatomen eines angeregten aromatischen Rings wechselwirken. Bei der Desaktivierung des aromatischen Rings ändern sich die Bindungslängen nur wenig, so daß man von einem Übergang zwischen übereinander liegenden Potentialkurven mit stärkerer Energieabhängigkeit der Franck-Condon Faktoren sprechen kann. Dies ist der eigentliche Grund für die verschiedenen Energielückenbeziehungen f( E) und f( E) bei der Löschung von * und n * Triplettsensibilsatoren durch O2. Die Variation des Oxidationspotentials und damit der Stärke der Charge Transfer Wechselwirkungen in den 1,3(T1 3 ) Komplexen wird durch unterschiedliche Substitution von aromatischen Ringen mit elektronenziehenden oder elektronenschiebenden Gruppen bewirkt. Da die aromatischen Ringe bei den n * Triplettsensibilisatoren im Gegensatz zu den * Triplettsensibilisatoren nicht Bestandteil des elektronisch angeregten Zentrum sind, fallen die Charge Transfer Effekte bei den n * Triplettsensibilisatoren deutlich schwächer aus als bei den * Triplettsensibilisatoren. Damit konnte in der vorliegende Arbeit erstmals eine konsistente Begründung für das unterschiedliche Verhalten von n * und * Triplettsensibilisatoren bei der Löschung durch O2 gegeben werden.