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Die Rolle des cAMP/CREB-Signalwegs in der noradrenergen Differenzierung sympathischer Nervenzellen
(2006)
Um die sympathische Differenzierung in Abwesenheit von CREB zu untersuchen, wurden zunächst Embryonen von CREB-Null-Mäusen analysiert. In diesen Mäusen wiesen die sympathischen Ganglien an Embryonaltag E10,5 und E12 keine Unterschiede in der Differenzierung zu heterozygoten und wildtyp-Ganglien auf. Es wurde deshalb vermutet, dass die mit CREB interagierenden Transkriptionsfaktoren CREM und ATF1 den Verlust von CREB im sympathischen Ganglion funktionell kompensieren. Da Mäuse mit einem Knock-out von CREB und CREM bereits vor E10 sterben, konnte die Entwicklung sympathischer Ganglien in diesen Mäusen nicht weiter untersucht werden. Durch Immunfärbung gegen ATF1 in CREB-deletierten Mäusen und in situ-Hybridisierung gegen CREM und ATF1 wurde gezeigt, dass im Rumpf der CREB-KO-Maus keine drastische Hochregulation der Expression beider Gene stattfindet. Eine geringfügige Hochregulation konnte aber nicht ausgeschlossen werden kann. Um die cAMP/CREB-Signaltransduktion in Ganglienvorläuferzellen auszuschalten, und Kompensation durch CREM und ATF1 zu umgehen, wurden die dominant-negative Effektoren ACREB und PKA-R(I)mut verwendet. ACREB blockiert die Funktion von CREB, CREM und ATF1 (Ahn et al., 1998). Durch PKA-R(I)mut sollte die Aktivität von PKA inhibiert werden. Die Funktionalität beider Effektoren wurde in differenzierenden Zellkulturen bestätigt. Um in vivo geeignete Expression der Inhibitoren zu erzielen, wurden verschiedene Methoden des Gentransfers im Huhnembryo erprobt. Durch Infektion der Neuralplatte des Embryos mit Retroviruskonzentrat konnte frühe embryonale Expression der dominant-negativen Effektoren in Neurallleistenzellderivaten erzielt werden. Die Expression von ACREB im Embryo zeigte, dass CREB in der initialen adrenergen Differenzierung bis E4 erforderlich ist, die sympathischen Ganglien wiesen reduzierte adrenerge Genexpression auf. In späteren Embryonalstadien ist dieser Effekt nicht mehr nachzuweisen. Im Gegensatz zur Inhibition von CREB, hatte die Inhibition von PKA durch PKAR(I)mut keine Auswirkungen auf die Ganglienentwicklung in vivo. Durch pharmakologische Inhibition von PKA wurden kleinere Ganglien erzielt, ein selektiver Effekt auf die adrenerge Differenzierung wurde auch in diesem in vivo Experiment nicht beobachtet. Dies widerspricht den Hinweisen aus Zellkultur auf die selektive Funktion von PKA in der adrenergen Differenzierung. Der Befund, dass die Funktion von CREB in vivo auf die initiale adrenerge Differenzierung sympathischer Neurone beschränkt ist, und nicht für den Erhalt adrenerger Differenzierung erforderlich ist, wurde in vitro in differenzierten sympathischen Neuronen des Embryo bestätigt. ACREB und PKA-R(I)mut hatten keine bzw. nur geringe Auswirkungen auf den Anteil TH-positiver Neurone in Kulturen sympathischer Neurone aus Embryonen der Embryonaltage E7 und E12. Somit konnte erstmals in vivo eine physiologische Rolle für CREB in der Differenzierung sympathischer Neurone gezeigt werden: CREB ist für die initiale Expression von TH erforderlich.
In this thesis, I study the phase diagram of dense, locally neutral three-flavor quark matter as a function of the strange quark mass, the quark chemical potential, and the temperature, employing a general nine-parameter ansatz for the gap matrix. At zero temperature and small values of the strange quark mass, the ground state of quark matter corresponds to the color–flavor-locked (CFL) phase. At some critical value of the strange quark mass, this is replaced by the recently proposed gapless CFL (gCFL) phase. I also find several other phases, for instance, a metallic CFL (mCFL) phase, a so-called uSC phase where all colors of up quarks are paired, as well as the standard two-flavor color-superconducting (2SC) phase and the gapless 2SC (g2SC) phase. I also study the phase diagram of dense, locally neutral three-flavor quark matter within the framework of a Nambu–Jona-Lasinio (NJL) model. In the analysis, dynamically generated quark masses are taken into account self-consistently. The phase diagram in the plane of temperature and quark chemical potential is presented. The results for two qualitatively different regimes, intermediate and strong diquark coupling strength, are presented. It is shown that the role of gapless phases diminishes with increasing diquark coupling strength. In addition, I study the effect of neutrino trapping on the phase diagram of dense, locally neutral three-flavor quark matter within the same NJL model. The phase diagrams in the plane of temperature and quark chemical potential, as well as in the plane of temperature and leptonnumber chemical potential are presented. I show that neutrino trapping favors two-flavor color superconductivity and disfavors the color–flavor-locked phase at intermediate densities of matter. At the same time, the location of the critical line separating the two-flavor color-superconducting phase and the normal phase of quark matter is little affected by the presence of neutrinos. The implications of these results for the evolution of protoneutron stars are briefly discussed.
Die Verarbeitung von Informationen im zentralen Nervensystem beruht auf dem Zusammenspiel von erregender und hemmender Neurotransmission. Die Übertragung von Signalen zwischen Neuronen erfolgt chemisch über die Ausschüttung von Neurotransmittern an spezialisierten Kontaktstellen, den Synapsen. Glyzin und gamma-Aminobuttersäure (GABA) sind die bedeutendsten inhibitorischen Neurotransmitter im zentralen Nervensystem von Säugern, welche Rezeptoren vom Glyzin- (GlyR) und GABAA-Typ (GABAAR) aktivieren. Diese ligandengesteuerten Ionenkanäle sind in postsynaptischen Membranen angereichert und mit intrazellulären Proteinen assoziiert. Die Rekrutierung der Rezeptoren in postsynaptischen Domänen ist ein an das zytoplasmatisch lokalisierte Protein Gephyrin gekoppelter Prozess. So bindet Gephyrin spezifisch an die intrazelluläre Domäne der beta-Untereinheit des GlyR (GlyR beta) und bildet für die Verankerung des Rezeptors ein gerüstartiges Netzwerk unterhalb der synaptischen Membran. Die gezielte Inaktivierung des Gephyrin-Gens führt in Mäusen zu einem postnatal letalen Phänotyp und zu dem Verlust der synaptischen Anreicherung des GlyR und bestimmter GABAA-Rezeptoren auf zellulärer Ebene. Gephyrin ist ein 93 kDa großes Protein, das nicht nur im zentralen Nervensystem (ZNS), sondern auch in anderen Organen wie Leber und Niere exprimiert wird, in denen es an der Synthese des Molybdän-Kofaktors von Oxido-Reduktasen beteiligt ist. Das Gephyrin-Protein wird durch 30 Exons codiert, von denen zehn als sogenannte Kassetten alternativ gespleißt werden können. Die bestuntersuchte Spleißvariante besitzt 736 Aminosäuren und ist in eine N- und eine C-terminale Domäne (Aminosäuren 1-181 bzw. 318-736) sowie eine zentrale Linker-Domäne unterteilt. Die N- und die C-terminalen Bereiche von Gephyrin sind den Proteinen MogA und MoeA aus E. coli homolog und werden daher auch als G-Domäne (N-terminal) bzw. E-Domäne (C-terminal) bezeichnet. In kristallographischen Untersuchungen wurde gezeigt, dass die G- und E-Domänen zur Tri- bzw. Dimerisierung befähigt sind. Diese speziellen Oligomerisierungseigenschaften der beiden Gephyrindomänen bilden wahrscheinlich die Grundlage für die Entstehung von Gephyrin-Clustern sowie eines hexagonalen Gephyrin-Gerüstes. Dieses Gerüst stellt den Verknüpfungspunkt zwischen Rezeptoren und dem Zytoskelett dar und ermöglicht somit die effiziente Clusterbildung und die zielgerichtete Anordnung einer großen Anzahl inhibitorischer Rezeptoren. In der vorliegenden Arbeit sollten die Rolle dieser beiden Domänen bei der Bildung membranassoziierter Gephyrinaggregate und die molekularen Mechanismen der Clusterbildung des Gephyrinmoleküls untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden durch zielgerichtete Mutagenese unterschiedliche Gephyrin-Mutanten hergestellt, um die Fähigkeit der Oligomerisierung der G- und E-Domäne gezielt zu modifizieren. Dadurch sollte die Bedeutung der Oligomerisierung hinsichtlich der Aggregat- bzw. Clusterbildung untersucht werden. Außerdem sollten die Wechselwirkungen zwischen Gephyrin und anderen Proteinen und deren Einfluss auf die synaptische Lokalisation analysiert werden. Für diese Untersuchungen wurden auf der Basis von Röntgenstruktur-Daten spezifische Aminosäurereste an den bei der Oligomerisierung beteiligten Kontaktstellen ausgetauscht. In der G-Domäne wurden zu diesem Zweck vier separate Aminosäuren des Trimer-Interface durch Arginin ersetzt (GephRRRR). Analog hierzu wurden in der EDomäne einzelne Aminosäuren durch Arginin bzw. Glutamat substituiert (GephRER), um dadurch eine Dimersierung zu verhindern. Für die Kassette C5’ wird angenommen, dass deren Vorhandensein die Interaktion zwischen Gephyrin und GlyR beeinträchtigt, wodurch GlyR aus GABAergenen Synapsen ausgeschlossen wird. Daher wurde der Einfluss dieser Gephyrin-Spleißvariante (GephC5’), die zu einer Peptidinsertion innerhalb der G-Domäne führt, und einer Gephyrin-Mutante (Gephmut), die den Verlust der Wechselwirkung mit dem GlyR bedingt, auf die Aggregatbildung von Gephyrinoligomeren untersucht. Bei dem Konstrukt Gephmut wurden, basierend auf Daten von Röntgenstrukturuntersuchungen, neun Aminosäuren (713-721) am Cterminalen Ende der E-Domäne durch den homologen Bereich des bakteriellen MoeA Proteins aus E. coli ersetzt. Zunächst wurden die einzelnen isolierten Domänen mittels Gelfiltration hinsichtlich ihres Oligomerisierungsverhaltens untersucht. Die Mutationen wurden hierzu in verkürzte Proteine eingeführt, bei denen nur die G- bzw. die E-Domäne exprimiert wurden. Diese Konstrukte wurden daher als GRRRR, GC5’ bzw. ERER und Emut bezeichnet. Bei diesen zeigte sich, dass die G-Domäne des Gephyrin-Wildtyps zu trimeren Proteinkomplexen oligomerisiert. Im Gegensatz hierzu war die Mutante GRRRR nicht in der Lage, Trimere zu bilden. Das Einfügen der C5’-Kassette führte ebenfalls zu einer Störung der Trimerisierung. Gelfiltrationsexperimente mit der E-Domäne ergaben, dass die mutierte Domäne ERER, im Gegensatz zum Wildtyp-Konstrukt, keine Dimere ausbildet. Bisherige Studien haben jedoch gezeigt, dass das Emut Polypeptid zur Dimerisierung befähigt ist. Das Oligomerisierungsverhalten des kompletten Gephyrin-Proteins wurde mittels blauer nativer Gelelektrophorese (BN-PAGE) analysiert. Für die hier beschriebenen Untersuchungen mit BN-PAGE wurde rekombinantes Gephyrin in Xenopus laevis Oozyten heterolog exprimiert. Die Analyse ergab, dass Wildtyp Gephyrin nativ als Hexamer vorliegt, welches durch ansteigende Konzentrationen des Detergenzes Natriumdodecylsulfat (SDS) in Trimere, Dimere und Monomere zerfällt. Sowohl GephRRRR und GephC5’ liegen nativ fast ausschließlich als Dimere vor, während GephRER nur trimere Aggregate formt. Die entsprechende Doppelmutante mit Mutationen in Gund E-Domäne war wie erwartet nur noch als Monomer existent. Die als Kontrolle eingesetzte Glyzinrezeptor-Bindungsmutante Gephmut bildete, ebenso wie der Wildtyp, Hexamere aus. Daraus folgt, dass die Oligomere der G- bzw E-Domäne Zwischenprodukte der Hexamerbildung darstellen. Die Analyse der Oligomerisierungseigenschaften der Mutanten wurde nachfolgend in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK 293T) untersucht. Nach heterologer Expression von Wildtyp Gephyrin in HEK 293T-Zellen formen sich große, charakteristische Gephyrinaggregate. Die Oligomerisierungs-Mutanten GephRRRR, GephRER und GephC5’ aggregierten jedoch nicht, sondern waren diffus im Zytoplasma verteilt. Die wiederum als Kontrolle eingesetzte Bindungsmutante Gephmut hingegen wies eine normale Aggregation auf. Diese Ergebnisse bestätigen die grundlegende Rolle der Oligomerisierung von G- und E- Domänen für die Aggregatbildung von Gephyrin. Mittels GST-Pulldown und Kolokalisationsanalysen in HEK Zellen wurde die Wechselwirkung der Gephyrinmutanten mit der GlyR beta, dem Motorkomplexprotein Dynein light chain-1 (Dlc-1) und dem Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor Collybistin (Cb) untersucht. Beide Ansätze weisen darauf hin, dass die Trimerisierung der G-Domäne an der Interaktion von Gephyrin mit Dlc-1 und die Dimerisierung der E-Domäne bei der Bindung an GlyR beta und Cb beteiligt ist. Die Mutante Gephmut zeigte in beiden Fällen einen totalen Verlust der Bindungsfähigkeit sowohl an das GlyR beta Bindungsmotiv als auch an Cb. Der Einbau der C5’ Kassette in Gephyrin scheint jedoch nicht dessen Bindung an den GlyR zu beeinflussen. Für die Analyse der Clusterbildung und des zielgerichteten Transports in Neuronen wurden Wildtyp und mutiertes Gephyrin in hippocampalen und spinalen Primärkulturen der Ratte exprimiert. Zur Überprüfung einer synaptischen Lokalisation wurde Gephyrin gemeinsam mit dem vesikulären inhibitorischen Aminosäure-Transporter (VIAAT), einem präsynaptischen Marker-Protein, detektiert. In beiden Kulturen wies Gephyrin eine punktartige Verteilung in den Neuriten auf und wurde gezielt an Synapsen angereichert. Im Kontrast dazu zeigten alle Oligomerisierungsmutanten, GephRRRR, GephC5’ und GephRER keine Ausbildung von Clustern sondern eine diffuse Verteilung im Zellkörper und in Dendriten. Das Konstrukt Gephmut wies jedoch Clusterbildung und eine punktförmige Verteilung auf. Diese Daten belegen, dass die Oligomerisierung der G- wie auch der E-Domänen für die Clusterbildung und synaptische Lokalisation von Gephyrin unerlässlich ist. Die Wechselwirkung mit dem GlyR und/oder Collybistin ist ebenfalls für die Anreicherung in der Synapse erforderlich, nicht jedoch für die Bildung der Gephyrin-Cluster. Die dargestellten Ergebnisse belegen die Rolle der spezifischen Oligomerisierungseigenschaften der G- und E-Domäne für die Ausbildung des hexagonalen Gephyringerüstes und dessen grundlegende Bedeutung für die spezifische Anreicherung von Gephyrin an inhibitorischen Synapsen in Neuronen.
Im Jahr 1991 trat das Abkommen zur Erhaltung der in Europa und den außereuropäischen Arealstaaten vorkommenden Populationen der Arten der Säugerordnung Chiroptera in Kraft (EUROBATS: The Agreement on the Conservation of Populations of European Bats). Zuvor waren die Säuger allgemein schon in dem „Übereinkommen zur Erhaltung der wandernden wildlebenden Tierarten“ in Anhang II (Oktober 1985) aufgelistet. Auch in der Liste der in Deutschland vorkommenden Arten der Anhänge II, IV und V der FFH-Richtlinie (92/43/EWG) sind alle einheimischen Fledermausarten (Anhang II und IV) erwähnt. Für die Erhaltung der Fledermäuse ist der Schutz wichtiger „Stätten“ (z. B. Zwischenquartiere, Winterschlafquartiere, Wochenstubenquartiere) unumgänglich. Die Erhaltung und der Schutz, sowohl der Quartiere als auch der Futterplätze, vor Beschädigung oder Beunruhigung sind nach diesem Abkommen sicherzustellen. Diese Arbeit über die Stoffwechseldaten soll klarstellen, wie wichtig der Schutz der Fledermausquartiere - vor allem im Winter – ist. Der Energieverbrauch und die Anpassung der einheimischen Arten an Umgebungstemperaturen (Ta) soll mit Messwerten untermauert und mit der tropischen Art Carollia perspicillata verglichen werden. Weiterhin ist es Ziel dieser Arbeit, einen alternativen Versuchsaufbau zu entwickeln, der die Berechnung der Stoffwechselrate (SWR) ohne das Fangen der Tiere ermöglichen soll. Mit Hilfe einer IR-Kamera sollen Bilder von der Körperoberflächentemperaturverteilung und gleichzeitig Stoffwechselmessungen gemacht werden. Da die Körpertemperatur (Tb) und die SWR bei den einheimischen Fledermausarten direkt voneinander abhängig sind (HANUS 1959), könnte diese Methode hier angewandt werden. Nach der Erstellung einer Datenbank (SWR/IR-Bild) kann dann nur durch die IR-Bilder Rückschlüsse auf die SWR gezogen werden. Bei nordamerikanischen Arten konnte bestimmt werden, dass mindestens 75 % der Energiereserven, die eine Fledermaus für den Winterschlaf zur Verfügung hat, während der Aufwachphasen verbraucht werden (THOMAS et al. 1990). Eine Störung im Winterquartier führt zum Erwachen der Tiere. Nach einem Aufwachvorgang sind die Abstände des Wiedererwachens zunächst kürzer. Je kürzer die Fledermäuse im Torpor sind, desto schneller wachen sie auf. Dies verstärkt die Aufwachwahrscheinlichkeit und die damit verbundene Kettenreaktion, je öfter die Störungen auftreten (THOMAS et al. l.c.). Dies führt zu einem zusätzlichen Energieverbrauch. Der Einfluss einer Störung ist noch bis zu 8 h später in einem Winterquartier durch erhöhte Flugaktivität zu bemerken (THOMAS 1995). Dies lässt sich daraus erklären, dass die Tiere, die aufgewacht sind und aktiv sind, andere Fledermäuse durch ihre Aktivität aufwecken (Berührung, Wärme, Reproduktionsverhalten etc.). Dies soll nun auch für einheimische Arten überprüft werden. Aus den vorliegenden Erkenntnissen und den eigenen Messergebnissen sollen dann folgende weitere Fragen beantwortet werden: - Warum besteht die Notwendigkeit die Winterquartiere vor Störungen zu schützen? Welche tatsächliche Bedeutung haben Störungen im Winterquartier auf die Energetik der Fledermäuse? - Wie viel Energie verbrauchen die Fledermäuse im Sommer in Abhängigkeit von der Ta? - Gibt es Unterschiede zwischen der SWR der tropischen Art Carollia perspicillata und den einheimischen Arten? Die Vergleichbarkeit der Ergebnisse ist durch identische Messbedingungen gewährleistet. - Lassen sich aus den SWR unterschiedliche Abhängigkeiten (Körpermasse (bm), Ta etc.) ableiten? - Hat die Nahrung den erwarteten Einfluss auf den RQ-Wert? Die Stoffwechseldaten sind deshalb so wichtig, da man damit zeigen könnte, welch extremer Ressourcenverlust für die Fledermaus mit einer Störung verbunden ist. Die Notwendigkeit des Schutzes der Fledermäuse vor Störungen im Quartier, sowohl der Sommer-, als auch die Winterquartiere, wäre dann mit Messdaten belegt. Die Unterschiede in der Abhängigkeit der SWR von der Ta, der bm, der Ernährungsform und der Tb sowohl im Wachzustand als auch im Torpor, soll für verschiedene Arten geklärt werden.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es festzustellen (im Rahmen einer Doppelblindstudie mit 32 Patienten), ob der Einsatz des neu entwickelten Kontrastmittels Gd-EOB-DTPA in der MRT-Diagnostik im Vergleich zum herkömmlichen Gd-BOPTA gleichwertige Ergebnisse hervorbringt in Bezug auf Detektion und Charakterisierung von fokalen Leberläsionen und in der Gefäß- und Leberparenchymdarstellung. Gd-EOB-DTPA zeigte eine sehr gute Verträglichkeit, die sich in der vorliegenden Studie als gleichwertig zu Gd-BOPTA erwies. Einen Vorteil gegenüber Gd-BOPTA bietet Gd-EOB-DTPA durch eine frühere leberspezifische Phase; auf diese Weise lassen sich dynamische Sequenzen und hepatospezifische Untersuchungen in einem einzigen Untersuchungsdurchgang vornehmen. Insgesamt kann Gd-EOB-DTPA als hochwertiges, Gd-BOPTA gleichgestelltes hepatospezifisches MRT-Kontrastmittel betrachtet werden und ist sicherlich für den breiten klinischen Einsatz gut geeignet.
Bei steigendem Patienten- (Bevölkerungs-)alter, weiterhin hoher Gonarthroseprävalenz und erweitertem klinisch wie operativem Behandlungsspektrum nimmt die Implantationsrate von Knieendoprothesen kontinuierlich zu. Aufgrund des Anspruchs einer möglichst achsgerechten Implantation, mit dem Ziel dadurch die Prothesenstandzeit weiter zu verlängern, erfreut sich die CT-freie navigierte Implantationsmethode bikondylärer Knieendoprothesen im klinischen Alltag zunehmender Beliebtheit. Bisher existieren zahlreiche Studien, die signifikant bessere postoperative radiologische Ergebnisse für navigationsgestützt implantierte Knieendoprothesen nachweisen konnten. Untersuchungen, die einen klinisch objektivierbaren Therapievorteil durch diese zeit- und kostenaufwändigere Implantationsmethode nachweisen, liegen jedoch noch nicht vor. Die vorliegende Arbeit vergleicht neuromuskuläre Veränderungen (präoperativ und postoperativ) bei Knieendoprothesenimplantation zwischen konventionell und navigiert implantierten Prothesen. Dabei sollten folgende Fragen beantwortet werden: 1. Gibt es neuromuskuläre Unterschiede auf Grund des implantationsverfahrens PFC-Sigma® konventionell versus navigiert implantiert ? 2. Hat die OP-Dauer (Blutsperrenzeit) Einfluß auf die postoperativ gemessenen neuromuskulären Parameter ? 3. Gibt es postoperative Unterschiede im Schmerzempfinden auf Grund des spezifischen Implantationsmodus ? Insgesamt wurden 36 Patienten, die aus klinischer und radiologischer Indikation heraus eine Knieendoprothese erhalten sollten, in die Studie eingeschlossen, und willkürlich den beiden Implantationsgruppen zugeordnet: PFC Sigma® konventionell und PFC Sigma® navigiert implantiert mit Hilfe des CT-freien VectorVision®-Systems der Firma BrainLab. Die Untersuchungen erfolgten sowohl präoperativ (an der gesunden sowie kranken Extremität) als auch 15 Tage postoperativ durch elektromyographische Ableitung der drei oberflächlichen Muskelanteile des M. quadriceps femoris (M. vastus medialis, M. vastus lateralis und M. rectus femoris) durch das Testgerät Ortex 3000. Als Parameter der Kraft wurde das maximale Drehmoment gemessen. Gleichzeitig erfolgte die Ableitung neuromuskulärer Parameter, der elektrischen Aktivität und medianen Frequenz der Quadrizepsmuskulatur unter dynamischen, isometrischen und statischen Belastungen. Zusätzlich wurden die klinischen Größen Schmerz, Funktion, Stabilität und Beweglichkeit, mittels HHS sowie AKS, erhoben. Die wichtigsten Ergebnisse der Untersuchungen sind: 1. Präoperativ zeigten sich in beiden Implantationsgruppen eine mehr oder weniger signifikante Reduktion des maximalen Drehmomentes sowie eine ebenfalls signifikant verminderte elektrische Aktivität der Streckmuskulatur der Gonarthroseerkrankten Extremität. Die postoperativen Untersuchungen zeigten eine signifikante Reduktion des maximalen Drehmomentes und der elektrischen Aktivität im prä- versus postoperativen Vergleich, unabhängig von der Implantationsmethode. 2. Das Implantationsverfahren hatte keinen Einfluß auf das unmittelbare postoperative Schmerzempfinden. 3. Die längere Blutsperrenzeit bei den navigiert implantierten Knieprothesen hatte keinen Einfluß auf die postoperativen neuromuskulären Parameter. 4. In der PFC-Sigma® -Gruppe navigiert implantiert zeigte sich beim statischen Belastungstest und beim dynamischen Extensionstest kein signifikanter Unterschied zwischen der zu operierenden Seite und der Gegenseite. Diese Beobachtung kann auf einen Wiederholungseffekt zurückgeführt werden, wodurch die Patienten bei der zweiten Untersuchung der kranken Seite bessere Werte erzielten. Um eine noch höhere Messgenauigkeit zu erzielen, wären mehrere Messungen über einen längeren Zeitraum zu überlegen.
Am Beispiel des Chirurgen Dr. med. Friedrich Wilhelm Fabricius (1810-1872) im Hospital zum Heiligen Geist in Frankfurt am Main, wird der Weg der Chirurgie vom Handwerk zur Wissenschaft dargestellt. Dr. med. Friedrich Wilhelm Fabricius war bei seinem Dienstantritt im Jahre 1845 der erste Hospitalwundarzt in der 700jährigen Geschichte des Hospitals zum Heiligen Geist in Frankfurt am Main, der an einer Universität Medizin studiert hatte. Seine Vorgänger als Hospitalwundarzt des Hospitals zum Heiligen Geist waren bis dahin alle nicht akademisch ausbebildete Wundärzte gewesen, die eine Ausbildung bei einem Handwerksmeister in der Zunft der Barbiere absolviert hatten. Friedrich Wilhelm Fabricius wurde am 12. November 1810 als Sohn des wohlhabenden Frankfurter Kaufmannes Philipp Julius Fabricius (1775-1849) und Maria Antoinette Franziska Fabricius, geborene Steinhäuser (1786-1859), in Frankfurt am Main geboren. Nach Besuch des Frankfurter Gymnasiums mit dem Abitur als Abschluß studierte er Medizin in Heidelberg und Göttingen. Seine Promotion erfolgte 1831 (Dr. med., chir. et art. obstet.) an der Universität Göttingen bei dem Anatom und Chirurgen Conrad Johann Martin Langenbeck. Das Thema seiner Dissertationsarbeit lautet in deutscher Übersetzung: „Über eine Luxation des Oberschenkelknochens in den Ramus descendens des Sitzbeines“. Nach seiner Rückkehr von einer wissenschaftlichen Reise nach Berlin, Prag, Wien, Paris und London, erhielt er 1832 die Zulassung als praktischer Arzt in Frankfurt am Main. Im Jahre 1834 gründete Fabricius zusammen mit den Ärzten Heinrich Hoffmann („Struwwelpeter-Hoffmann“), Simon Moritz Ponfick, David Eduard Schilling jun., Adolf Schmidt und Johann Georg Varrentrapp jun. die Armenklinik. Nach der Heirat mit Anna Elisabeth Dionysia Heimberger 1835 wurde im Jahre 1839 ein gemeinsamer Sohn geboren, der den Namen seines Großvaters und Taufpaten Philipp Julius bekam. 1841 veröffentlichte Fabricius einen Artikel „Zur Behandlung der Contracturen und Ankylosen des Kniegelenks“ in dem „Archiv für die gesammte Medicin“. Im Jahre 1845 war Fabricius Mitbegründer des „Ärztlichen Vereins“ in Frankfurt, zusammen mit 24 anderen Kollegen, darunter waren auch die Mitbegründer der Armenklinik. Fabricius wurde 1848 zum Vorsitzenden des „Ärztlichen Vereins“ gewählt. Als Ziele des Vereins gibt die Satzung von 1845 gegenseitige wissenschaftliche Belehrung und Förderung des kollegialen Lebens an, später kamen die Förderung der öffentlichen Gesundheitspflege und die Wahrung der Standesinteressen hinzu. Analysiert man die Operationsverfahren, die Fabricius in der Zeit als Hospitalwundarzt im Hospital zum Heiligen Geist von 1845-1872 durchgeführt hat, so zeigt sich, daß von ihm vor allem Amputationen an den Extremitäten (Finger bis Oberarm bzw. Hüfte), inkarzerierte Schenkel- bzw. Leistenhernien und Phimosenoperationen durchgeführt wurden. Fabricius behandelte vor allem Patienten mit septischen Krankheitsbildern, mit Verletzungen, aber auch Patienten mit Bindehautentzündungen. Heute, im Zeitalter der Spezialisierungen, würde man diese Patienten in Spezialabteilungen für septische Chirurgie, Traumatologie und Augenheilkunde behandeln.
Der Rückenschmerz ist eines der am häufigsten geklagten Symptome in der allgemeinmedizinischen und orthopädischen Praxis. Studien zeigen, dass ca. 60% aller Rentenanträge aufgrund von Rückenschmerzen gestellt werden und ca. 20% der Frührenten werden wegen dieser Beschwerden auch gewährt. Damit stellt der Rückenschmerz nicht nur ein medizinisches, sondern auch ein volkswirtschaftliches Problem dar. Somit kommt der Therapie und Vorbeugung von degenerativen Wirbelsäulenerkrankungen eine besondere Bedeutung zu. Die Anwendung von Wärme spielt in dieser Therapie schon lange eine wichtige Rolle. Das vielfältige Wirkprinzip beruht dabei auf einer Erhöhung der Durchblutung und durch die Hyperämie verursachte Steigerung der Stoffwechselaktivität. Durch diese Effekte kommt es direkt relaxierend und durch Erregung der Thermorezeptoren sekundär zu einer Tonusminderung der Skelettmuskulatur. Zudem wird eine Steigerung der Abwehrleistung diskutiert. Das Neue an der wassergefilterten Infrarot-A-Strahlung ist, dass es sich hierbei um eine trockene Wärmeanwendung mit guter Tiefenwirkung und dabei sehr geringer thermischer Oberflächenbelastung handelt. Dies wird erreicht durch die Verwendung eines geeigneten Wasserfilters, welcher die oberflächenerhitzenden Spektralanteile des Infrarot-B und Infrarot-C herausfiltert und so nur die tiefer in das Gewebe eindringende Infrarot-A-Strahlung genutzt werden kann. Um die therapeutische Wirksamkeit dieses Phänomens in der Behandlung der degenerativen Wirbelsäulenerkrankungen zu überprüfen wurde die vorliegende Studie konzipiert und durchgeführt. Zudem sollte die Praktikabilität und der therapeutische Nutzen in Vergleich zu den schon routinemäßig eingesetzten adjuvanten Behandlungsmethoden gesetzt werden.
Ein gen-interner Transkriptionsstart koinzidiert mit einem Rekombinations-Hotspot imhumanen MLL-Gen
(2006)
Chromosomale Veränderungen des humanen MLL-Gens sind für 5-10% der akuten Leu-kämien im Säuglings- und Erwachsenenalter verantwortlich. Davon entstehen wiederum 5-10% der MLL-Aberrationen therapiebedingt. Das auf Bande 11q23 betroffene Gen wird als das Mixed Lineage Leukemia (MLL), Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL-1), Human Homo-log of trithorax (HRX) oder als Human Trithorax 1 (Htrx1) bezeichnet. Mittlerweile sind fast 90 cytogenetische Aberrationen der Bande 11q23 bekannt. Die häufigsten Partnergene des MLL sind AF4 (40%), AF9 (27%), sowie ENL (7%), AF6 (6%), ELL (~5%) und AF10 (4%). Die Bruchpunkte von MLL-Translokationen sind nicht einheitlich über das 92 kb große humane MLL-Gen verteilt, sondern liegen alle in einer ca. 8.3 kb großen Bruchpunkts-clusterregion (bcr). Innerhalb dieser Region sind die Bruchpunkte nicht homogen verteilt. Bruchpunkte von Patienten mit de novo-Leukämien und einem Alter von über einem Jahr sind überwiegend in der 5’-Hälfte der bcr, dem sog. Subcluster I (SCI), lokalisiert. Die Bruchpunkte von Patienten mit therapiebedingten Leukämien sowie Säuglingen (<1 Jahr) liegen dagegen vornehmlich in der 3’-Hälfte der bcr, dem sog. Subcluster II (SCII). Da DNA-Doppelstrangbrüche (DNA-DSB) auf zwei unterschiedlichen Chromosomen eine aus-reichende Voraussetzung für das Entstehen chromosomaler Translokationen sind, stellte sich die Frage, ob aufgrund der inhomogenen Verteilung der Translokationsbruchpunkte innerhalb der MLL bcr, bestimmte Bereiche dieser Region für DNA-DSB besonders anfällig sind. Bisher konnte aufgeklärt werden, dass in SCII, durch Apoptose-auslösende Ereignisse oder cytotoxische Agenzien DNA-DSB sehr leicht induziert werden können. Durch Arbeiten in unserer Gruppe konnte im SCII ein ca. 200 bp großer Bereich um die MLL Intron 11/Exon 12-Grenze lokalisiert werden, in dem sich der größte Teil aller Etoposid-induzierten DNA-Doppelstrangbrüche konzentrierte. Dies galt jedoch nicht für eine perfekte TopoisomeraseII Konsensussequenz im Exon 12, die bisher mit einer Vielzahl Therapie-assoziierter Translokationsbruchpunkte in Verbindung gebracht wurde. Dieser Hotspot kolokalisiert außerdem mit einer scaffold/matrix attachment region (S/MAR), sowie einer DNaseI-hypersensitiven Stelle. Des Weiteren fanden sich in der Literatur Hinweise, dass SCII im Gegensatz zu SCI eine verstärkte Histonacetylierung besitzt. Die potentielle Anwesenheit eines Promotors wurde durch Computeranalysen bestätigt. In einer murinen embryonalen Fibroblasten-Zelllinie, die durch die Insertion einer LacZ/Neo-Kassette in Exon 4 des Mll-Gens einen Transkriptionsstop trug, wurden in anschließenden RT-PCR Experimenten sowohl alle Möglichkeiten des alternativen Spleißens ausge-schlossen, als auch der Start eines Transkripts unmittelbar vor Exon 12 detektiert. Zusätzlich durchgeführte Affymetrix-Chip-Experimente bestätigten die Anwesenheit von Mll-Transkript-signalen in der verwendeten Mll k.o.-Zelllinie. In nachfolgenden Versuchen konnte durch eine weitere Kartierung der Transkriptionsstart auf bis zu +/- 15 bp an der Intron 11/Exon12-Grenze festgelegt werden. Um nun die im Mausmodell gewonnenen Resultate auch im humanen System zu überprüfen, wurden die homologen Regionen des murinen und humanen Mll/MLL-Gens vor ein Luci-ferasereportergen kloniert. Durch RT-PCR konnte der gen-interne Transkriptionsstart im SCII des humanen MLL-Gens ebenfalls lokalisiert werden. Damit wurde gezeigt, dass genetische Instabilität und Transkriptionsinitiation im SCII des humanen MLL-Gens kolokalisieren. Durch die anfangs durchgeführten in silico-Analysen in Maus und Mensch, wurden Deletions-mutanten generiert, mit deren Hilfe die Bedeutung der einzelnen Module dieser Promotor-region ermittelt wurde. Hierbei zeigte sich, dass die Anwesenheit von zwei Retroelementen in der menschlichen Sequenz eine Enhancer-Funktion vermittelt. Dagegen zeigte die homologe murine Sequenz, für die keine erhöhte Anfälligkeit für DNA-DSB bekannt ist, nur schwache Promotoraktivität. Da Histon Modifikationen beim Prozess der Transkription eine entscheidende Rolle spielen, wurde auch die nähere Umgebung des gen-internen Promotors in den murinen k.o.-Zellen untersucht. In der k.o.-Linie zeigte die Region stromaufwärts der putativen Transkriptionsinitiation die Signatur von inaktivem Chromatin (di-methyliertes H3 K9), wohingegen stromabwärts von Mll Exon 12 Chromatinstrukturen nachgewiesen wurden, die aktiv transkribiert werden (tri-methyliertes H3K4), und damit einen weiteren Beweis für die besondere Chromatinstruktur dieser Region lieferten. Durch Western-Blot Experimente wurde das Protein, das durch das Transkript des gen-internen Promotors kodiert wird, nachgewiesen. Das verkürzte murine Mll-Protein wird also, wie sein humanes Pendant, proteolytisch durch die Taspase1 gespalten, so dass sich ein MLL-Mini-Komplex ausbilden kann.
Hintergrund und Fragestellung: Hörbahn und die kortikalen Hörzentren benötigen eine frühzeitige regelmäßige akustische Stimulation für ihre Reifung. Ohne die Reizung in den ersten Lebensjahren gehen ungenutzte neuronale Vernetzungen zugrunde bzw. werden gar nicht erst entwickelt. Deshalb kommt der Einführung eines universellen Neugeborenen-Hörscreenings zur Detektion frühkindlicher Hörstörungen in den letzten Jahren eine große Bedeutung zu. Zur Sicherstellung eines effektiven Screenings muss ein optimales objektives Verfahren gewählt werden, basierend auf OAE- und ABR-Technologien, eingesetzt in Form von Mono- oder Kombinationsverfahren. Voraussetzung für den Einsatz als Screening-Gerät sind höchstmögliche Sensitivität und Spezifität, eine einfache Bedienung sowie Kostengünstigkeit. Desweiteren ist dabei jenen Verfahren der Vorrang zu geben, welche, bei immer kürzer werdenden Liegezeiten der Patientinnen und Zunahme ambulanter Geburten, mit nur einem einzigen Test eine Rate an Testauffälligen von unter 4% erreichen. Patienten und Methode: An 473 Kindern wurden in drei Geburtskliniken monaural Hörscreening-Untersuchungen durchgeführt. Zur Verfügung standen hierbei das Kombinationsgerät echo-screen TA® zur Messung von TEOAE und AABR, sowie das MB11 BERAphon® mit zwei verschiedenen Verfahren zur Messung von AABR, einerseits der Zeitgang-AABR, andererseits einer steady-state-AABR. Ergebnisse: Mit nur einer einzigen Messung erreichten alle Verfahren bis auf die Zeitgang-AABR des MB11 BERAphon® eine Testauffälligen-Rate von 5 % bzw. darunter. Zudem bietet das Kombinationsgerät echo-screen TA® die Möglichkeit, ein mittels TEOAE-Verfahren als auffällig getestetes Kind anschliessend mittels AABR-Verfahren zu überprüfen. Die mittlere Messzeit betreffend zeigte sich das TEOAE-Verfahren des echo-screen TA® erwartungsgemäß schnell. Bei den AABR-Verfahren lieferte das MB11 BERAphon® mit der steady-state-AABR vor dem echo-screen TA® und vor der Zeitgang-AABR ein Ergebnis. Im Vergleich der mittleren Untersuchungszeiten zeigte sich die längste Untersuchungszeit für die kombinierte TEOAE- und AABR-Messung des echo-screen TA®. Betrachtet man jedoch die einzelnen Verfahren untereinander, so zeigte sich auch hier der geringe Zeitaufwand des TEOAE-Verfahrens. Das AABR-Verfahren des echo-screen TA® erwies sich, aufgrund der zu klebenden Elektroden, als zeitaufwendiger als die AABR-Verfahren des MB11-BERAphon®. Die Sensitivität ergab für alle hier verwendeten Verfahren 100%. Alle Verfahren, bis auf die Zeitgang-AABR des MB11 BERAphon® zeigten sehr gute Verfahrensspezifitäten von über 96%. In der Kostenanalyse wurde deutlich, dass die alleinigen TEOAE-Messungen des echo-screen TA® günstiger als die AABR-Messungen waren. Dennoch sind auch die AABR-Verfahren des MB11 BERAphon® aufgrund des eingeschränkten Materialverbrauchs nicht mehr deutlich kostenintensiver. Schlussfolgerung: Unter Berücksichtigung aller zu erfüllenden Kriterien eines Hörscreening-Gerätes sind sowohl die steady-state-AABR das MB11 BERAphon® als auch das Kombinationsverahren des echo-screen TA® für ein universelles Hörscreening geeignet. Kosten und Zeitaufwand des echo-screen TA® sind beim Gebrauch beider Verfahren (TEOAE und AABR) im Vergleich zum Monoverfahren (steady-state-AABR des MB11 BERAphon® ) höher und bedingten in der hier vorgestellten Studie einen leichten Vorteil der steady-state-AABR bei ansonsten nahezu ausgeglichenen Ergebnissen. Die Zeitgang-AABR des MB 11 BERAphon® konnte die gültigen Qualitätskriterien zum Studienzeitpunkt nicht erfüllen, wobei anwenderbedingte Gründe weitestgehend ausgeschlossen werden können.
Ziel dieser Studie war es, ein eigens erstelltes sonographisches Bewertungssystem der Hand- und Fingergelenke bei Patienten mit rheumatoider Arthritis zur Beurteilung des Gelenkstatus anhand eines Probandenkollektivs zu überprüfen und mit der als Standard angesehenen konventionellen Röntgendiagnostik zu vergleichen. Die konventionelle Röntgendiagnostik galt bisher als der sogenannte Referenzstandard im Nachweis und bei der Quantifizierung des destruierenden Gelenkprozesses. Die Diagnosesicherung anhand der ACR-Kriterien schließt radiologisch nachgewiesene Veränderungen der Gelenke mit ein, und es existieren diverse Scoring-Systeme zur Beurteilung der Krankheitsaktivität. Frühentzündliche Weichteilveränderungen entziehen sich dieser Methode jedoch völlig und kleinere erosive Knochenläsionen auch größtenteils. Daher ist es von großer Bedeutung ein bildgebendes Verfahren in der Diagnosestellung und Verlaufskontrolle der rheumatoiden Arthritis zu etablieren, welches alle Aspekte der Gelenkaffektion einbezieht. Wie in dieser Studie gezeigt werden konnte, eignet sich die Sonographie hervorragend zur Beurteilung des Gelenkbefalls der Hand- und Fingergelenke. Ein eigens erstellter Sonographie-Score, der sowohl weichteilbedingte als auch knöcherne Veränderungen mit einbezieht, wurde an einem Probandenkollektiv im Vergleich zur im rheumatologischen Klinikalltag etablierten Larsen-Klassifikation überprüft. Dabei konnte gezeigt werden, dass mittels sonographischer Untersuchungen an insgesamt 20% mehr Gelenken pathologische Veränderungen nachgewiesen wurden, als mit der konventionellen Röntgendiagnostik. Die meisten diagnostizierten Befunde waren Weichteilaffektionen im Sinne von Gelenkergüssen und Synovialitis, die in der radiologischen Klassifikation nicht festgestellt werden. Auch beim Nachweis erosiver Knochenläsionen bestand sonographisch eine höhere Trefferquote, vor allem wenn es sich um kleine Erosionen handelte. Gemeinsam war beiden Systemen, dass sie sowohl an den Hand-, MCP- und PIP-Gelenken Affektionen nachweisen konnten. Die DIPGelenke waren nie befallen. Die Untersuchungsergebnisse wurden mit dem im klinischen Alltag etablierten Disease-Activity-Score (DAS28) verglichen, der zur Beurteilung der Krankheitsaktivität und zur Verlaufskontrolle herangezogen wird. Dabei wiesen beide Verfahren eine positive gleichsinnige Korrelation mit dem Klassifikationssystem auf. Die Korrelation des eigens für diese Studie erstellten sonographischen Bewertungssytems (Frankfurter Score) lag dabei höher als die klinisch etablierte radiologische Einteilung. Es konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass sich auch bei Patienten mit einer laut DAS-Score als inaktiv eingestuften Krankheitsaktiviät sonographisch Gelenkaffektionen nachweisen ließen. Zusammenfassend handelt es sich bei der Sonographie um ein bildgebendes Untersuchungsverfahren mit einer hohen Sensitivität und Spezifität bezüglich des Auffindens von rheumatisch bedingten Gelenkaffektionen. Sie ermöglicht die dynamische Untersuchung der Gelenke als dreidimensionales Abbildungsverfahren in beliebig vielen Schnittebenen. Darüber hinaus hat die Sonographie bei insgesamt geringen Kosten eine hohe Verfügbarkeit, besitzt keinerlei bekannte Nebenwirkungen, genießt eine hohe Akzeptanz bei den Patienten und eignet sich durch eine uneingeschränkte Wiederholbarkeit sehr gut zur Verlaufskontrolle und zum Therapiemonitoring. Sie kann das Ansprechen des Organismus auf bestimmte Medikamentengruppen bildlich darstellen. Diese Aspekte begründen das Potential des Verfahrens, sich zukünftig als „Bedside-Methode“ zu etablieren. Zudem ist die Untersuchungsmethode den internistischen und orthopädischen Rheumatologen bestens vertraut. Sie ist somit ein wertvolles zusätzliches Diagnostikum neben klinischer und nativradiologischer Untersuchung, für das bisher allerdings kein einheitliches Bewertungssystem zur Verfügung gestanden hat. Das in dieser Studie verwendete Bewertungssystem integriert verschiedene Teilaspekte des Krankheitsbildes. Es berücksichtigt bei der Einteilung der einzelnen Stadien die befallene Gewebeart, die Ausdehnung der Gelenkaffektionen, die Größe des Defekts und die möglichen Therapiemaßnahmen. Damit besitzt es Vorteile gegenüber anderen gültigen Klassifikationsverfahren und rechtfertigt einen eigenen Platz bei der Diagnosestellung und Auswahl der Therapie. Schwierigkeiten der Methode bestehen in der Standardisierung. Von hoher Wichtigkeit ist es für die Sonographie ein einheitliches Bewertungssystem zur Beurteilung des Gelenkstatus bei Patienten mit rheumatoider Arthritis im klinischen Alltag zu etablieren, das als Grundlage für vergleichende Untersuchungen und Einteilungen des Gelenkbefalls dienen kann. Hierbei ist die Optimierung der Patientenversorgung in Bezug auf den möglichst frühen und sensitiven Nachweis pathologischer Veränderungen zu erwarten. Die in dieser Studie nachgewiesenen Vorteile der Sonographie rechtfertigen deren routinemäßigen Einsatz bei der Diagnosestellung der rheumatoiden Arthritis. Die Studie hat gezeigt, dass die Sonographie eher als andere Untersuchungsmethoden in der Lage ist, den frühzeitigen und sicheren Nachweis entzündungsbedingter Gelenkveränderungen zu erbringen und damit den Krankheitsverlauf durch einen frühzeitigen Therapiebeginn günstig zu beeinflussen. Der Sonographie muss daher ein hervorragender Platz bei der Diagnosestellung eingeräumt werden.
Die vorliegende Studie hatte zum Ziel die kognitive und sozial-emotionale Entwicklung von Kindern substanzabhängiger Mütter zu untersuchen. Dies geschah unter Berücksichtigung verschiedener medizinischer und psychosozialer Einflussfaktoren und unter dem speziellen Aspekt unterschiedlicher Betreuungsbedingungen. Die hier untersuchte Stichprobe wurde aus einem retrospektiv erhobenen Datensatz von Ziegler (1998) rekrutiert. Dieser Ausgangsdatensatz umfasste alle Fälle von Neugeborenen, bei denen in den Jahren 1988 – 1995 in der Abteilung für Neonatologie des Universitätsklinikums der Johann Wolfgang Goethe-Universität, Frankfurt am Main, eine pränatale Opiatexposition, d.h. Heroin oder Methadon, festgestellt worden war. Zusätzlich war eine nach Alter der Mutter, Parität und sozioökonomischen Status parallelisierte Kontrollgruppe rekrutiert worden, die auch hinsichtlich der somatischen Risiken (Frühgeburtlichkeit, postnatale Komplikationen) zur Gruppe der pränatal opiatexponierten Kinder vergleichbar war. Von diesen insgesamt 151 Kindern (101 Opiat-, bzw. Experimentalgruppe, 50 Kontrollgruppe) konnte mit insgesamt 57 Kindern der Experimentalgruppe und 21 Kindern der Kontrollgruppe Kontakt aufgenommen werden, von 50 bzw. 18 Kindern sind vollständige Datensätze vorhanden. Unter dem Aspekt der unterschiedlichen Betreuungsbedingungen wurden diese Kinder in insgesamt vier Gruppen aufgeteilt: Die Gruppe EG1 (Eltern) umfasste alle Kinder mit pränataler Opiatexposition, die kontinuierlich bei mindestens einem leiblichen Elternteil lebten oder aktuell leben, die Gruppe EG2 (Fremdbetreuung zu einem frühen Zeitpunkt) umfasste alle Kinder mit pränataler Opiatexposition, die schon früh zu Pflege-/Adoptiveltern oder den Großeltern überstellt wurden, die Gruppe EG3 (Fremdbetreuung zu einem späten Zeitpunkt) beinhaltete alle Kinder mit pränataler Opiatexposition, die erst nach dem ersten Lebensjahr in eine Fremdbetreuung überstellt worden waren, bzw. mehrere Bezugspersonenwechsel erlebt hatten und die Gruppe KG1 (Kontrollgruppe Eltern) umfasste alle Kinder der Kontrollgruppe ohne pränatale Opiatexposition, die bei mindestens einem leiblichen Elternteil aufwachsen. Diese vier Gruppen wurden hinsichtlich der Kriterien Intelligenz (Hamburg-Wechsler-Intelligenz-Test HAWIK-III) und der sozial-emotionalen Entwicklung (Child Behavior Checklist CBCL) und psychosozialem Funktionsniveau (Global Assessment FunctioningScale GAF) miteinander verglichen. Relevante Einflussfaktoren wurden dabei kontrolliert. Als Ergebnisse dieser Gruppenvergleiche kann festgehalten werden: Im HAWIK-III erzielen die Gruppen EG1 und EG3 im Handlungs-IQ und in zwei Subskalen des Handlungsteils, nämlich Figurenlegen und Zahlen-Symbol-Test, signifikant schlechtere Ergebnisse als die KG1. Bei der EG2 besteht ein Trend hinsichtlich eines signifikant schlechteren Abschneidens gegenüber der KG1 in den beiden Subskalen. Vor allem die Ergebnisse des Handlungs-IQ sind in den Gruppen EG1, EG2 und EG3 um durchschnittlich eine Standardabweichung niedriger als es der Norm entspricht. In der CBCL sind die Gruppen EG1 und EG3 am stärksten belastet, in vielen der Skalen sind die Unterschiede zur Gruppe KG1 und teilweise auch zur EG2 signifikant. In fast allen Skalen ist die psychopathologische Auffälligkeit von EG2 und KG1 vergleichbar, eine Ausnahme bilden dabei aber die Skalen Aufmerksamkeitsproblematik und Aggressives Verhalten, in denen die EG2 auch auffälligere Werte als die KG1 zeigt. Im GAF besteht ein Trend hinsichtlich eines signifikant schlechteren psychosozialen Funktionsniveaus der EG3 gegenüber allen anderen Gruppen.Insgesamt können die Ergebnisse im Sinne des transaktionalen Modells interpretiert werden, wonach die pränatale Drogenexposition als ein Risikofaktor innerhalb der Entwicklung gesehen wird, der durch andere Risiko- und Schutzfaktoren beeinflussbar ist. Die Unterschiede in den Gruppen sind durch nachfolgende Umwelteinflüsse maßgeblich determiniert und in der EG1 und EG3, in denen das höchste psychosoziale Risiko besteht, finden sich auch die größten Entwicklungsbeeinträchtigungen. Durch fördernde Umweltbedingungen wie in der EG2 ist die Entwicklung hingegen mit der KG1 vergleichbar. Speziell für die Entwicklung von Aufmerksamkeitsproblemen und aggressivem Verhalten, bzw. bei Anforderungen manuell-visueller Handlungskompetenz, finden sich Hinweise auf eine erhöhte Vulnerabilität bei Kindern mit pränataler Opiatexposition, die auch durch fördernde Umweltbedingungen nicht vollständig kompensiert werden kann. Ob diese spezifische Vulnerabilität in Auswirkungen der Opiate an sich oder in genetischen Einflüssen begründet ist, lässt sich allerdings nicht beantworten. Diese Studie zeichnet ein umfassendes Bild über die Situation von Kindern opiatabhängiger Mütter, einerseits hinsichtlich der Betreuungssituation, andererseits hinsichtlich der kognitiven und sozial-emotionalen Entwicklung. Viele Fragen bleiben aber offen und einefollow-up Untersuchung dieses Kollektivs könnte Erkenntnisse über die Interaktion der relevanten Einflussfaktoren auf die kindliche Entwicklung bringen. Ein Fokus sollte hierbei vor allem auf der Aufmerksamkeit, aggressivem und impulsivem Verhalten sowie auf einer potentiellen Suchtentwicklung der Kinder und Jugendlichen selbst liegen.
In dieser Arbeit wurde die Verteilung von Glykolyseenzymen in Kulturzellen unter normalen und die Glykolyse stimulierenden und hemmenden Bedingungen untersucht. Die Hauptfunktion, die der Strukturbindung und -Bildung von Glykolyseenzymen zugeschrieben wird, ist das so genannte metabolite-channelling bzw. substratechannelling, also die effiziente, lokale Bereitstellung von ATP. Im Mittelpunkt dieser Untersuchungen stand Aldolase (EC 4.1.2.13). Unter allen Bedingungen liegt Aldolase, wie die meisten anderen Glykolyseenzyme gleichzeitig sowohl in strukturgebundener, als auch in gelöster Form im Cytoplasma vor. Unter normalen Kulturbedingungen wurde die strukturgebunde Aldolase an Stressfasern sowie dem fibrillären Aktin-Netzwerk des Zellkortex vorgefunden. Diese Beobachtungen wurden an fixierten Zellen gemacht; an lebenden Zellen konnte die Bindung an Stressfasern durch Mikroinjektion fluorochromierter Aldolase direkt nachgewiesen werden. Ferner wurde beobachtet, dass Aldolase selbst, unabhängig vom Vorhandensein von Aktin in der Zelle netzwerkartige Strukturen bilden kann. Das Hinzufügen von Aldolase zu in vitro polymerisierten Aktinfilamenten führte zu einer Bündelung der Aktinfilamente, die wahrscheinlich auf eine quervernetzende Wirkung dieses Enzyms zurückzuführen ist. Durch Injektionen mit Gemischen unterschiedlich markierter Glykolyseenzyme konnte gezeigt werden, dass diese Enzyme auch in gelöster Form nicht völlig homogen in den Zellen verteilt sind. In Gegenwart hoher Substratkonzentrationen wurde entdeckt, dass Aldolase in großem Ausmaß an Intermediärfilamente gebunden wird. Da dieses Verhalten zwar unabhängig von der Präparationsmethode auftrat, in vitro durch Kosedimentation aber nicht bestätigt werden konnte, ist anzunehmen, dass neben dem Substrat weitere Faktoren bei diesem Phänomen eine Rolle spielen. Die Applikation von Insulin führte zu keinerlei mikroskopisch beobachtbaren Änderungen im Bindungsverhalten der Aldolase. Dennoch konnte eine geringe Steigerung der Aktivität in der unlöslichen Fraktion des Zellproteins nachgewiesen werden. Die Mikroinjektion unphysiologisch hoher Mengen von Aldolase führte zu einem drastischen Abbau von Aktinfilamenten und Stressfasern in den injizierten Zellen. Andere Glykolyseenzyme (GAPDH, PGM, LDH und TIM) zeigten dagegen keinerlei Wirkung. Der selbe Effekt ist bereits für PFK beschrieben worden, wo er durch eine starke Assoziation der PFK mit Gelsolin hervorgerufen wird. Der Wirkungsmechanismus bei der Aldolase ist dagegen bislang nicht bekannt. Durch die Inkubation fixierter Zellen mit fluorochromierter Aldolase wurden eine große Zahl freier Bindungsstellen an Mikrotubuli entdeckt. Allerdings konnten keine Bedingungen ermittelt werden, unter denen die intrazelluläre Aldolase an Mikrotubuli bindet. Weiterhin wurde ein Experiment entworfen, um die lokale Bereitstellung von Energie in Form von ATP und metabolite-channelling nachzuweisen. Dazu wurden Monolayerkulturen durch Hemmung von Atmung und Glykolyse ATP-entleert und durch Permeabilisierung alle löslichen Bestandteile freigesetzt. Die Gabe verschiedener ATP-Konzentrationen führte in diesem Fall zu einer Kontraktion der verbleibenden Zellbestandteile, wobei die Kontraktionsgeschwindigkeit abhängig von der gegebenen ATPKonzentration war. Durch die Gabe von FBP und ADP konnte diese Kontraktion ebenfalls ausgelöst werden, was für die Konversion von ADP zu ATP wodurch ein von FBP und den strukturgebundenen Enzymen unterhaltener glykolytischen FluSS und somit metabolite-channelling nachgewiesen wurde.
Pharmazeutische Proteomics
(2006)
Die vorliegende Arbeit setzt sich mit der Implementierung, Validierung und Anwendung der 2-dimensionalen Gelelektrophorese und der MALDI-TOF Massenspektrometrie unter pharmazeutischen Gesichtspunkten auseinander. Es wurde ein breites Spektrum aus dem Bereich der Pharmazeutischen Proteomics bearbeitet, beginnend mit einer detaillierten Methodenentwicklung für 2-DE, um die Methode zu optimieren, ihre Robustheit zu evaluieren und die Grenzen der Methode kennen zu lernen. Daran schließt sich eine Validierung für 2-DE / Silberfärbung an. Der Validierungsansatz orientiert sich an den üblicherweise in der pharmazeutischen Industrie bei der Validierung analytischer Methoden untersuchten Parametern. Hierzu zählen Präzision, Linearität, Richtigkeit und Spezifität. Ferner wurden Untersuchungen angestellt, inwiefern Daten aus unterschiedlichen Labors zusammengefasst werden können. Zur Dokumentation wurde ein auf MS Access® basierendes Laborinformationssystem erstellt. Hiermit können die von verschiedenen Mitarbeitern erzeugten Daten einheitlich und nachvollziehbar erfasst werden. Nach der Etablierung der methodischen Grundlagen wurden unterschiedliche, pharmazeutisch relevante Fragestellungen mittels 2-DE und MALDI-TOF-MS bearbeitet. Proben unterschiedlicher Komplexität wurden untersucht, die Milch eines transgenen Kaninchens, welches bovines FSH exprimiert, wurde analysiert. Über diese Versuche wurde der Einstieg in die Analytik rekombinanter Arzneistoffe geschaffen. Die 2-DE eignet sich sehr gut um die bei posttranslational modifizierten rekombinanten Proteinen auftretende Mikroheterogenität abzubilden. 2-DE und MALD-TOF MS sind alternative Methoden zu denen, die im europäischen Arzneibuch für die Analytik rekombinanter Arzneistoffe beschriebenen werden. Erythropoietin, einer der weltweit umsatzstärksten rekombinanten Arzneistoffe, zu dem auch eine Monographie im EuAB existiert, wurde näher untersucht. Bei diesem Protein wurden die Zuckerseitenketten selektiv abgespalten und es wurde untersucht, welche Auswirkung die Zucker auf das eletrophoretische Verhalten des Erythropoietins haben. Eine MALDI-TOF-MS Analytik von Erythropoietin war auch erst nach Abspaltung der Zuckerseitenketten möglich. Die Sequenzabdeckung konnte durch Verdau mit unterschiedlichen Enzymen gesteigert werden. Eine Technologie zur Sequenzierung von Proteinen mittels MALDI-TOF-MS wurde mit CAFTM für rekombinantes Chicken Annexin V etabliert. Weitere rekombinante Proteine, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurden, sind Interferon-alfa-2a, Interferon-alf-2b, rh-HCG, Trastuzumab und Rituximab. Das anti-apoptotischen Bcl-xL ist ein Zielprotein für den Einsatz von Antisense Oligonucleotiden in der Tumortherapie. Für dieses Protein wurde eine 2-DE / Western blot-Methode entwickelt, die als in vitro Testsystem für das Screening von Oligonucleotiden genutzt werden kann. Aus dem Bereich der klinischen Proteomics wurden Serum, CSF und Urinproben von Patienten mit Bence Jones Proteinämie untersucht und mit den üblicherweise in der Klinik verwendeten CE-Analysen verglichen. In einzelnen Fällen konnten in vermeintlich Bence Jones negativen Proben mittels 2-DE doch noch Bence Jones Proteine nachgewiesen werden. Zusammenfassend kann man sagen, dass 2-DE und MALDI-TOF-MS vielseitig in der Pharmazie angewendet werden können. Die Komplexität eines jeden Proteoms und die physikochemische Heterogenität von Proteinen muss beachtet werden. In komplexen Proteinmischungen sind aufgrund sehr unterschiedlicher Konzentrationen, Löslichkeiten und der Heterogenität durch posttranslationale Modifikationen viele Proteine einem globalen 2-DE Ansatz nicht zugänglich, nichtsdestotrotz ist die 2-DE derzeit eine der leistungsfähigsten Methoden in der Proteomanalytik.
Um die Biodiversität Burkina Fasos darzustellen und auszuwerten, wurden umfangreiche Diversitätsdaten aus Sammlungsbelegen, Vegetationsaufnahmen und Literatur zusammengestellt. Die eigene Datenerhebung während dreier Feldaufenthalte hat mit > 300 Vegetationsaufnahmen (einschließlich der Biodiversitätsobservatorien) und > 1200 Herbarbelegen dazu beigetragen. Die Verwendung von relationalen Datenbanken (Microsoft Access) und GIS ermöglichte eine umfassende Analyse dieser enormen Datenmengen (> 100 000 Verbreitungspunkte) unter Einbeziehung von weiteren Art- oder ortsgebundenen Informationen. Datenbankstrukturen und Prozeduren wurden zu einem großen Teil selbst entwickelt. Unregelmäßigkeiten in den Primärdaten konnten durch Artverbreitungsmodelle ausgeglichen werden, die rasterbasierte Umweltdaten verwenden, insbesondere Satellitenbilder, Klima- und Höhendaten. Für die zusammenfassenden Analysen (Artenreichtum nach Familie, Lebensform, Photosynthesetyp; turnover) mussten wiederum eigene Prozeduren entwickelt werden. Räumliche Muster der Biodiversität wurden im landesweiten Rahmen, wie auch lokal für die Regionen Oudalan und Gourma, dargestellt. Die Zusammenfassung der Flora nach taxonomischen und ökologischen Gruppen gewährt dabei Einblicke in ökologische Zusammenhänge und die Eignung einzelner Gruppen als Indikatoren. Deutlich zeigen sich die Veränderungen des Lebensformspektrums und des Artenreichtums sowohl auf Landesebene im Zusammenhang mit dem Makroklima als auch in einer detaillierten Analyse des Oudalan – wo der Einfluss von Boden und Relief deutlich wird. Die großräumigen Muster der Artenvielfalt sind hauptsächlich durch klimatische Faktoren geprägt, auch der menschliche Einfluss ist in Form verschiedener Nutzungsformen vom Klima abhängig und schwer davon zu trennen. Umso deutlicher werden die Folgen intensiver Landnutzung aber in den Detailstudien der nordsudanischen Biodiversitätsobservatorien und des sahelischen Wiederbegrünungsprojektes. Über die in diesem Rahmen dargestellten Ergebnisse hinaus ergeben sich insbesondere aus der umfassenden Datenbasis und der interdisziplinären Zusammenarbeit mit Fernerkundung und Ethnobotanik weitere vielversprechende Möglichkeiten. Unter anderem wird auf der Grundlage der Datenbanken und ergänzender Literaturrecherchen eine aktualisierte Checklist der Gefäßpflanzen Burkina Fasos erstellt und eine Revision der phytogeographischen Zonen für Burkina Faso ist geplant.
LC-MS/MS-Systeme haben sich in den vergangenen Jahren trotz der hohen Anschaffungskosten von mehreren hunderttausend Euro zu einer Standardmethode in analytischen Laboratorien entwickelt und bieten im Vergleich zu herkömmlicher HPLC mit UV- und Fluoreszenz-Detektoren eine höhere Sensitivität und bessere Selektivität. Aufgrund dieser Vorteile war es das Ziel dieser Arbeit, verschiedene LC-MS/MS-Methoden zu entwickeln, mit der Eicosanoide sensitiv und selektiv in verschiedenen biologischen Flüssigkeiten quantifiziert werden können und diese Assays dann in biologischen Fragestellungen einzusetzen. Ein Problem der Eicosanoidanalytik mittels LC-MS/MS besteht in der Strukturähnlichkeit vieler Prostaglandine, die große Schwierigkeiten während einer Methodenentwicklung verursachen. Zwei sehr wichtige Prostaglandine, PGE2 und PGD2, besitzen das gleiche Fragmentspektrum und können nicht über das Selektionsprinzip des Tandem-Massenspektrometers quantifiziert werden, sondern müssen vor der Detektion chromatographisch getrennt werden. Die chromatographischen Bedingungen, die für eine Trennung von PGE2 und PGD2 nötig sind, gehen allerdings mit einem erheblichen Empfindlichkeitsverlust des Massenspektrometers einher. Die beste Empfindlichkeit wurde mit einem neu entwickelten Säulenmaterial, Synergi Hydro-RP, erreicht, was in allen entwickelten Methoden verwendet wurde. Zur Quantifizierung von PGE2 und PGD2 in Mikrodialysaten (max. Volumen 75 µl) musste eine Empfindlichkeit von mindestens 40 pg/ml PGE2 erreicht werden. Nach der Validierung des Systems konnte eine Quantifizierungsgrenze von PGE2 und PGD2 von 25 pg/ml bzw. 50 pg/ml erreicht werden. Bei Formalin-behandelten Ratten stieg PGE2 innerhalb von 15 Minuten auf 380 pg/ml an, womit frühere Ergebnisse, die auf der Verwendung von Immunoassays basieren, bestätigt werden konnten. Für PGD2 konnte kein Unterschied zu Kontroll-Ratten festgestellt werden und ist deswegen im Gegensatz zu PGE2 nicht an der Nozizeption im untersuchten Modell beteiligt. Mit Hilfe des mPGES-1-Enzym-Assays wurde mPGES-1 als ein weiteres Target für die drei COX-Inhibitoren Celecoxib, R- und S-Flurbiprofen identifiziert. Da mit Celecoxib ab einer Konzentration von 100 µM keine weitere Hemmung der mPGES-1 erreicht werden kann, hemmt Celecoxib die mPGES-1 wohl nicht kompetitiv und bindet nicht im katalytischen Zentrum der mPGES-1. Für Rofecoxib und Paracetamol konnte keine Hemmung der mPGES-1 festgestellt werden. Während der Methodenentwicklung wurde ein Störpeak zwischen PGE2 und PGD2 beobachtet, der in den Versuchen immer im gleichen Verhältnis zu PGE2 gebildet wurde. Mit Hilfe eines Fingerprints wurde dieser Störpeak als 5-trans-PGE2 identifiziert, welches ein bisher nicht beschriebenes Nebenprodukt der mPGES-1 zu sein scheint. In der letzten Methode sollte eine Methode entwickelt werden, mit der PGE2, PGD2, PGF2alpha, 6-keto-PGF1alpha und TXB2 in Humanplasma bestimmt werden können. Im direkten Vergleich war die validierte LC-MS/MS-Methode einem handelsüblichen Immunoassay überlegen. Zum einem waren die Standardabweichungen der LC-MS/MS-Methode wesentlich niedriger und zum anderen waren die Basalwerte des Immunoassays unphysiologisch hoch. In einer Studie wurde der Einfluss einer Mutation (-765G -> C) im Promotor der COX-2 auf die COX-2-Aktivität untersucht, für die eine reduzierte COX-2-Expression um den Faktor 2 in Monozyten beschrieben wurde. Zwischen den 2 Gruppen konnten weder in den Prostaglandin-Konzentrationen, der COX-2-mRNA-Expression noch in der COX-2-Protein-Expression statistische Unterschiede festgestellt werden und stehen damit im Widerspruch zu bisherigen Veröffentlichungen. Die entwickelten LC-MS/MS-Methoden ermöglichen eine bessere Sensitivität und schnellere Analysenzeiten im Vergleich zur HPLC und durch ihre gute Sensitivität kann der Einsatz von problematischen Immunoassays vermieden werden. Im Falle der Mikrodialysemethode, wo PGE2 in einer relativ einfachen Matrix bestimmt werden sollte (ACSF), liefert die LC-MS/MS-Methode die gleichen Ergebnisse. Im Falle von Humanplasma ist der Immunoassay allerdings unbrauchbar. Ein weiterer Vorteil der LC-MS/MS-Methoden gegenüber Immunoassays besteht darin, dass mehrere Prostaglandine in einer einzigen Probe bestimmt werden können. Gegenüber GC-MS und GC-MS/MS-Methoden fehlt den LC-MS/MS-Methoden zwar einiges an Empfindlichkeit, allerdings wird hierfür keine Derivatisierung benötigt.
Erhöhte Faktorenaktivitäten der Gerinnungsfaktoren VIII und IX standen seit längerer Zeit in dem Verdacht, unabhängige thrombophile Risikofaktoren darzustellen. Die Studienlage hierzu ist bzgl. der Wahl der untersuchten Kollektive, der Messmethoden, sowie der berücksichtigten Einflussgrößen uneinheitlich. Daher wurde die vorliegende Studie durchgeführt, um zum einen in einem Normalkollektiv die die Faktorenaktivität möglicherweise beeinflussenden Störgrössen wie Body Mass Index (BMI) oder ein steigendes Lebensalter zu definieren, und um andererseits die Häufigkeit erhöhter Faktor VIII und IX Aktivitäten bei Patienten mit venösen Thrombosen unter Berücksichtigung dieser Störgrössen im Vergleich zum Normalkollektiv exakt zu analysieren. Es wurden 500 Blutspender konsekutiv als Normalkollektiv eingeschlossen. Diesem wurde ein Patientenkollektiv von 374 konsekutiven Patienten mit venösen Thrombosen gegenübergestellt. Beide Kollektive wurden an Hand eines einheitlichen, standardisierten Fragebogens bezüglich ihrer Eigen- und Familienanamnese befragt. Darüber hinaus erfolgte eine Blutentnahme unter standardisierten Bedingungen. Als Messmethode für die Faktorenaktivität von Faktor VIII und IX wurde ein Einstufengerinnungstest verwendet, hierbei wird die Aktivität eines einzelnen Gerinnungsfaktors gemessen. Alle zu untersuchenden Plasmen wurden auf Lupusantikoagulantien getestet, um Probanden und Patienten mit positiven Lupusantikoagulantien von den weiteren Berechnungen ausschließen zu können, da Lupusantikoagulantien die Faktorenmessergebnisse verfälschen können. Dies wurde in den bisherigen Veröffentlichungen nicht berücksichtigt. Mit Hilfe des Normalkollektives wurde die 90% Perzentile als Cut Off für erhöhte Faktorenwerte definiert (FVIII = 158%; FIX = 151%). Bei Analyse des Faktors VIII konnten mit Hilfe einer linearen Regressionsanalyse folgende Störgrössen als relevant für die Faktorenaktivität innerhalb des Normalkollektives beschrieben werden: Raucher wiesen signifikant niedrigere Faktor VIII – Aktivitäten als Nichtraucher auf, während ein steigender BMI und ein steigendes Lebensalter zu signifikant höheren Faktor VIII -Aktivitäten führten. Ein Einfluss des Geschlechtes, sowie ein signifikanter Einfluss oraler Kontrazeptiva auf die Faktor VIII - Aktivitäten konnte nicht nachgewiesen werden. Die Aktivitäten des Faktor IX zeigten im Normalkollektiv ebenfalls eine Abhängigkeit von steigendem Lebensalter, höheren BMI Werten sowie im Gegensatz zur Faktor VIII – Aktivität auch von der Einnahme oraler Kontrazeptiva, wobei alle diese Zustände zu signifikant höheren Faktor IX Aktivitäten führten. Ein Vergleich der Höhe der Faktor VIII – Aktivitäten der Patienten mit venösen Thrombosen zum Normalkollektiv konnte leider nicht durchgeführt werden, da festgestellt wurde, dass eine unterschiedlich lange Lagerzeit der tiefgefrorenen Plasmaproben der Patienten zu einem Absinken von erhöhten Faktor VIII – Aktivitäten führen kann. Dies wurde in der Literatur bisher nicht beschrieben und war daher zu Beginn der Studie nicht bekannt. Im Gegensatz hierzu blieben die erhöht gemessenen Faktor IX – Aktivitäten auch nach einer längeren Lagerzeit stabil, so dass hier eine Risikoberechnung für erhöhte Faktor IX – Aktivitäten in Bezug auf das Auftreten venöser Thrombosen mit einer korrigierten Odds – Ratio erfolgen konnte. Die für BMI, Alter und Geschlecht korrigierte Odds Ratio betrugt 3,98 mit einem 95% Konfidenzintervall von 2,5 – 6,3. Es ist somit von einem ca. 4 fach erhöhten relativen Risiko für venöse Thrombosen bei erhöhten Faktor IX – Aktivitäten auszugehen, so dass diese einen neuen thrombophilen Risikofaktor für venöse Thrombosen darstellen.
Leukämien sind maligne Erkrankungen des hämatopoietischen Systems, die teilweise mit einer sehr schlechten Prognose einhergehen. Die Phänotypen sowie die verursachenden Mutationen in den hämatopoietischen Vorläuferzellen sind vielfältig. 5-10 % aller Akuten Leukämien korrelieren mit genetischen Veränderungen des MLLGens auf Chromosom 11q23. Besonders häufig findet man reziproke, chromosomale Translokationen. Leukämien mit diesen Mutationen zählen fast ausschließlich zu den Hochrisiko-Leukämien, wobei der Partner des MLL-Gens Einfluss auf den Verlauf der Erkrankung hat. Bisher sind 43 Translokationspartner des MLL-Gens bekannt, von denen jedoch in der Routinediagnostik nur die 6 häufigsten, MLLT2, MLLT1, MLLT3, MLLT4, ELL und MLLT10 untersucht werden. Seltene oder unbekannte Partnergene werden von den Analysen ausgenommen. Da das Partnergen aber wichtig für die Risikoeinstufung der Erkrankung ist, ist es notwendig, dieses rasch zu identifizieren, um ein optimales Therapieprotokoll anwenden zu können. Aus diesem Grund wurde eine universelle, PCR-Methode entwickelt und etabliert, die es erlaubt, jede MLL-Translokation, auch ohne vorherige Kenntnis des Partnergens, zu identifizieren. Mit Hilfe dieser Methode ist es möglich, sowohl das Partnergen, als auch den chromosomalen Bruchpunkt basengenau auf DNA-Ebene zu analysieren. Mit dieser Technik sind im Verlauf der Studie 501 Patienten untersucht worden (319 Kinder, 179 Erwachsene, 3 ohne Altersangabe). Bei diesen Analysen wurden 9 neue Partnergene entdeckt: ACACA, SELB, SMAP1, TIRAP, ARHGEF17, BCL9L, KIAA0284, MAML2 und APBB1IP. Für alle positiven Patientenproben sind außer den Partnergenen auch die basengenauen Bruchpunkte kartiert worden. Die Kenntnis des Patienten-spezifischen Bruchpunktes erlaubt eine exakte Quantifizierung der Blastenlast mittels qPCR und ermöglicht somit ein empfindliches Monitoring des Krankheitsverlaufs unter Therapie und die Detektion einer minimalen Resterkrankung (MRD).
It is commonly agreed that cortical information processing is based on the electric discharges (spikes') of nerve cells. Evidence is accumulating which suggests that the temporal interaction among a large number of neurons can take place with high precision, indicating that the efficiency of cortical processing may depend crucially on the precise spike timing of many cells. This work focuses on two temporal properties of parallel spike trains that attracted growing interest in the recent years: In the first place, specific delays (phase offsets') between the firing times of two spike trains are investigated. In particular, it is studied whether small phase offsets can be identified with confidence between two spike trains that have the tendency to fire almost simultaneously. Second, the temporal relations between multiple spike trains are investigated on the basis of such small offsets between pairs of processes. Since the analysis of all delays among the firing activity of n neurons is extremely complex, a method is required with which this highly dimensional information can be collapsed in a straightforward manner such that the temporal interaction among a large number of neurons can be represented consistently in a single temporal map. Finally, a stochastic model is presented that provides a framework to integrate and explain the observed temporal relations that result from the previous analyses.
5-LO is the key enzyme in the biosynthesis of proinflammatory leukotrienes, converting arachidonic acid to 5-HPETE, and in a second step 5-HPETE to leukotriene A4. Although the 5-LO promoter possesses characteristics of so called housekeeping genes, such as lack of TATA/CCAAT boxes and existence of several Sp1 binding sites, the 5 -LO gene is tissue specifically expressed in primarily immune competent cells of myeloid origin including granulocytes, monocytes, macrophages, mast cells and B-lymphocytes. 5-LO gene expression in MM6 and HL-60 cells is strongly induced after differentiation of the cells with TGF-beta and 1,25(OH)2D3. In some monocytic cancer cell lines, such as HL-60 TB and U937, TGF-beta and 1,25(OH)2D3 treatment are not able to activate 5-LO gene transcription. It was demonstrated, that in these cell lines the 5-LO core promoter is heavily methylated and that only demethylation by the DNA methyltransferase inhibitor 5-aza-2 deoxycytidine (Adc) upregulated the 5-LO mRNA levels. It was also shown that the histone deacetylase inhibitor TsA could induce 5-LO mRNA levels, but only in 1,25(OH)2D3/TGF-beta inducible MM6 cells. Interestingly the 1,25(OH)2D3/TGF-beta effect on 5-LO expression is reduced, when combined with TsA. Reporter gene assays revealed that 5-LO promoter activity is strongly induced after 24 h treatment with 330 nM TsA (construct N10 up to 35 fold in HeLa cells). The effect is dependent on the presence of the proximal Sp1 binding site GC4 (-53 bp to –48 bp in relation to the major TIS) in both HeLa and MM6 cells. In vitro binding of the transcription factor Sp1 to this site has been demonstrated in gel shift assays and DNase I footprints. Mutation of the binding site resulted in a loss of basal promoter activity in both 5-LO negative HeLa cells and in 5-LO positive MM6 cells, as well as in the loss of TsA inducibility. The mutational study of different Sp1 binding sites in a larger promoter context revealed the interaction or respectively the additive effect of the multiple Sp1 binding sites of the 5-LO promoter on basal as well as on TsA upregulated promoter activity. However, GC4 seems to be of special relevance for both the basal promoter activity, possibly recruiting the basal transcription machinery, as well as for the TsA induced upregulation of 5-LO promoter activity. TsA does not alter the protein expression levels of Sp1 and Sp3 as investigated in Western blot analysis, neither in HeLa nor in MM6 cells. DNA affinity purification assays revealed that TsA had no effect on the DNA affinity of Sp1 or Sp3. In vitro binding of both Sp1 and Sp3 to the 5-fold GC box, GC4 and GC5 was demonstrated by DAPA analysis, but histone deacetylase inhibition did not change the associated protein amounts. Finally, in vivo binding of Sp1 and Sp3 was investigated in chromatin immunoprecipitation assay (ChIP) in MM6 cells. TsA clearly induced the association of both proteins to the promoter area surrounding the TIS. Upon TsA treatment also RNA polymerase II binding to the area surrounding the TIS (-318 to +52 bp) was increased and even initiated in the more distal promoter parts –1049 to –292 bp, which are negatively regulated in reporter gene assays. Interestingly histone H4 is already highly acetylated without TsA treatment and the acetylation status of H4 remains unchanged after histone deacetylase inhibition, indicating an open chromatin structure of the 5-LO gene in MM6 cells. In a cotransfection study with Sp1 and Sp3, the transactivating potential of factors was investigated and in accordance with the ChIP data, Sp1 and Sp3 increased the promoter activity, but only after TsA treatment. In gel shift assays, the influence of DNA methylation on Sp1 binding was investigated. The results indicate different roles for the three proximal promoter sites. Whereas Sp1 binding to the 5-fold GC box and GC4 is impaired by DNA methylation, binding to GC5 is even increased. A cotransfection study with methylated 5-LO promoter constructs and the murine methyl-CpG binding proteins suggest MBD1 involvement in the regulation of the 5-LO promoter. Since in gel shifts Sp1 binding is inhibited by DNA methylation, at least to the 5-fold GC box and the activating element GC4, and similarly the mutation/deletion of the same sites strongly reduces or inhibits promoter activity, it is likely to assume, that the loss of promoter activity after in vitro methylation is in the first place due to impaired Sp1/Sp3 binding. Together the data underline the importance and complexity of Sp1/Sp3 binding to the GC rich sites in the regulation of 5-LO promoter activity in response to the histone deacetylase inhibitor TsA as well as in respect to DNA methylation.