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In dieser Arbeit wurde der neuronale Glutamattransporter EAAC1 (Excitatory Amino Acid Carrier 1), kloniert aus Rattenretina, in HEK (Human Embryonic Kidney) Zellen transient exprimiert und mit Hilfe der patch clampTechnik elektrophysiologisch untersucht. Der Glutamattransport ist gekoppelt an den Kotransport von drei Natriumionen und einem Proton und den Gegentransport von einem Kaliumion. Damit werden pro Transportzyklus zwei positive Nettoladungen in die Zelle verschoben. Zusätzlich zum Glutamattransport verfügt der EAAC1 über eine Glutamatinduzierte Anionenleitfähigkeit, die nicht thermodynamisch an den Glutamattransport gekoppelt ist und besonders deutlich bei chaotropen Anionen (wie SCN ) in Erscheinung tritt. Eine weitere Funktion des Transporters ist seine Glutamatunabhängige Leckleitfähigkeit. Mit Hilfe von Ganzzellableitungen unter definierten ionalen extra und intrazellulären Bedingungen und bestimmtem Haltepotenzial erfolgte die Charakterisierung des Glutamattransporters von der extrazellulären Seite. Eine hohe Überexpression von EAAC1 in den HEKZellen, mit einer durchschnittlichen Dichte von # 4#10 3 Transporter pro µm 2 Zellmembran, erlaubte zudem die Beschreibung des Transporters von der intrazellulären Seite, durch Messungen am insideout patch. Stationäre Messungen an EAAC1 unter kontrollierten Spannungs und ionalen Bedingungen ließen verschiedene Aussagen zu über 1) die Bindungsreihenfolge von Glutamat und den kotransportierten Ionen an den Transporter, 2) den Anteil der Anionenleitfähigkeit am Glutamatinduzierten Gesamtstrom 3) die Abhängigkeit der Glutamatunabhängigen Leckleitfähigkeit und der Glutamatabhängigen Anionenleitfähigkeit von der Protonen und Natriumkonzentration und 4) die Identifikation des Ladungsträgers beim EAAC1assoziierten Leckstrom. Bei den durchgeführten vorstationären Messungen handelte es sich meist um SubstratsprungExperimente mit Hilfe der LaserpulsPhotolyse von #CNBcaged Glutamat. Damit konnte 1) der geschwindigkeitsbestimmende Schritt im Transportzyklus ermittelt werden, 2) Geschwindigkeitskonstanten verschiedener Teilreaktion im Transportzyklus von EAAC1 abgeschätzt werden und 3) die Spannungsabhängigkeit von Teilreaktionen identifiziert werden. Die Kombination von stationären und vorstationären Messungen mit Hilfe der LaserpulsPhotolyse sowie die Kombination von Ganzzellableitungen und insideout patches ermöglichte damit eine umfassende kinetische Untersuchung der verschiedenen Funktionen von EAAC1 und führten zu dem im folgenden beschriebenen Transportmodell. EAAC1 bindet auf der extrazellulären Seite zunächst ein Natriumion, wobei die Natriumbindungsstelle im elektrischen Feld der Membran liegt (# 25#30 %). Dieser Na beladene Transporterzustand ist assoziiert mit einem Glutamatunabhängigen Leckstrom, der von Anionen getragen ist. Der Na Bindungsreaktion schließt sich eine elektroneutrale Protonenbindung an. Der apparente pKWert des Protonakzeptors in EAAC1 liegt bei # 8, sodass unter physiologischen Bedingungen EAAC1 hauptsächlich in seiner protonierten Form vorliegt. Die nachfolgende Glutamatbindung (KD # 50 µM) ist ebenfalls spannungsunabhängig und erfolgt mit einer Geschwindigkeitskonstanten von # 2#10 7 M #1 s #1 . Sie löst eine elektroneutrale Konformationsänderung aus, die in einem Zeitbereich von 0,5#1 Millisekunde stattfindet und damit langsam ist im Vergleich zu den anschließenden elektrogenen Na Bindungsreaktionen. Der vollständig beladene Transporters transloziert in einem spannungsabhängigen Prozess (# 60#65 % des elektrischen Felds) Glutamat über die Membran mit einer Geschwindigkeitskonstanten von # 800 s #1 bei einem physiologischen Membranpotenzial von #80 mV. Der GlutamatTransportprozess ist mit der Glutamatinduzierten Anionenleitfähigkeit assoziiert, wobei sich beim GlutamatEinwärtstransport ein Verhältnis zwischen Transport und Anionenstrom (von SCN # ) von 1 zu 4 ergab, während es beim GlutamatAuswärtstransport bei 1 zu 1,5 lag. Die Dissoziationsfolge auf der intrazellulären Seite wurde nur für den Protonen-GlutamatKotransport bestimmt und war in umgekehrter Reihenfolge zur extrazellulären Seite. Verschiedene Mechanismen fördern auf der zytosolischen Seite die Dissoziation des Glutamates, bzw. verhindern den GlutamatAuswärtstransport. So führt die Änderung der Zugänglichkeit des Protonakzeptors zur zytosolischen Seite zu einer Verschiebung des apparenten pKWertes zu # 6,5. Damit liegt EAAC1 unter physiologischen Bedingungen auf der intrazellulären Seite hauptsächlich deprotoniert vor, was die Glutamatdissoziation fördert. Ebenso ist die Affinität mit einem 45fach erhöhten K M Wert im Vergleich zur extrazellulären Seite stark herabgesetzt. Die Relokation des Transporters erfolgt nach der Bindung eines Kaliumions und stellt mit einer Geschwindigkeitskonstanten von # 100 s #1 (bei einem Membranpotenzial von #80 mV) den hauptsächlich geschwindigkeitsbestimmenden Schritt im Transportzyklus dar. Bei der Relokation handelt es sich um einen elektrogenen Prozess (# 70#75 % des elektrischen Felds), wobei negative Ladungsträger über die Membran verschoben werden. Daher muss der Transporter über eine Eigenladung von < #1 verfügen. Daraus ergibt sich, dass die zu transportierende Nettoladung von zwei positiven Ladungen pro Transportzyklus auf zwei Reaktionsschritte verteilt ist. Der neuronale Glutamattransporter EAAC1 verfügt damit über verschiedene Mechanismen, den Transportprozess in Richtung Glutamataufnahme in die postsynaptische Nervenzelle zu fördern, entsprechend seiner physiologischen Aufgabe, die Glutamatkonzentration im synaptischen Spalt gering zu halten.
Ein früherer Vorschlag zum Reaktionsmechanismus der DFPase, der eine Wasseraktivierung durch den Rest H287 postulierte, mußte nach neuen experimentellen Daten verworfen werden. Daher lag zu Beginn der hier vorliegenden Arbeit kein Vorschlag für den Mechanismus der DFPase vor, der die experimentellen Daten erklären konnte. Für das längerfristige Ziel, die katalytischen Eigenschaften der DFPase gezielt verändern zu können, war es daher notwendig, zunächst den Mechanismus der Hydrolyse von Verbindungen wie DFP durch die DFPase näher zu untersuchen. Durch computergestützte Modellierung im aktiven Zentrum der DFPase (Docking) wurde die Bindung von DFP und anderen Substraten der DFPase genauer untersucht und mit vorhandenen experimentellen Daten verglichen. Diese Arbeiten führten auch zur theoretischen Untersuchung des Bindungsverhaltens von O,O-Dialkylphosphoroamidaten als potentiellen Inhibitoren der DFPase. Diese den Dialkylfluorophosphaten strukturell sehr ähnlichen Substanzen werden durch die DFPase nicht umgesetzt. Die Ergebnisse der Dockinguntersuchung führten schließlich zu der Synthese von drei Phosphoroamidaten unter der Untersuchung ihres Verhaltens als Inhibitoren der DFPase. DIe Charakterisierung erfolgte dabei über enzymkinetische Methoden sowie NMR-Experimente. Mit dem stärksten Inhibitor O,O-Dicyclopentylphosphoroamidat gelang die Kristallisation eines Komlexes mit der DFPase, der mit der Methode der Röntgenbeugung strukturell bestimmt werden konnte. Dieser Komplex belegt die Bindung der Phosphorylgruppe von Substraten an das katalytisch wirksame Calciumion im aktiven Zentrum der DFPase und zeigt die vorherrschenden Bindungskräfte zwischen Ligand und Protein auf. Eine Reihe von Mutanten der DFPase, bei denen gezielt die koordinierenden Aminosäuren des katalytischen Calciumions verändert wurden, ergänzte die bereits in früheren Arbeiten erzeugten Mutanten. Die katalyischen Eigenschaften dieser Mutanten und ihre Fähigkeit zur Metallbindung gestatten es, diese Metallbindungsstelle genauer zu beschreiben und lassen zusammen mit den Dockingexperimenten und der Struktur des Inhibitor-Enzymkomplexes vermuten, dass der calciumkoordinierende Aminosäurerest D229 als aktives Nukleophil im Reaktionsmechanismus der DFPase fungiert. Diese Vermutung ließ sich mit experimentellen Daten untermauern. Durch 18O-Isotopenmarkierung konnte gezeigt werden, dass ein Sauerstoffatom von D229 auf das entstehende Produkt übertragen wird. Hierdurch konnte die Existenz eines Phosphoenzymintermediats nachgewiesen werden. Des weiteren gelang es, Kristalle der DFPase zu züchten, die für Neutronenbeugungsexperimente geeignet waren. Im Rahmen dieser Experimente gelang die Aufnahme eines vollständigen Datensatzes und die Lösung der Neutronenbeugungsstruktur der DFPase in einer Auflösung von 2,2 Å. Diese Neutronenstruktur, in der Wasserstoffatome im Unterschied zu Röntgenstrukturen gut sichtbar sind, zeigt eindeutig, dass der Rest D229 wie erforderlich deprotoniert und dass das in der Bindungstasche an das Calciumion koordinierende Wassermolekül nicht als Hydroxid vorliegt. Damit ließ sich die direkte Aktivierung von Wasser durch das Metallion ausschließen. Neben wichtigen Informationen über die Bindungstasche der DFPase lieferte die Neutronenstruktur auch detaillierte Einblicke in das Wasserstoffbrückennetzwerk im zentralen, wassergefüllten Tunnel des Proteins. Über die Bestimmung des Wasserstoff/Deuteriumaustausches von Proteinrückgradamiden konnten weitere Aussagen über die Solvenszugänglichkeit von verschiedenen Proteinbereichen gemacht werden. Für die DFPase konnten strukturell und funktionell ähnliche Proteine identifiziert werden. Neben der Paraoxonase 1 waren dies das Calciumbindeprotein Regucalcin aus Agrobacterium thumefaciens sowie das Drug Resistance Protein 35 aus Staphylococcus aureus. Es konnte gezeigt werden, dass diese Proteine eine der katalytischen Calciumbindestelle der DFPase vergleichbare Metallbindestelle aufweisen und verschiedene Enzymaktivitäten dieser Proteine durch einen Mechanismus mit einem zu D229 analogen Nukleophil erklärt werden können. Ein direkter Vergleich zwischen der DFPase und der humanen Paraoxonase gelang durch Untersuchungen mit fluorogenen Organophosphaten als Substrate. Hierbei konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die DFPase in der Lage ist, Substrate mit einer P-O Bindung hydrolytisch zu spalten. Die unterschiedlich gute Umsetzung der verschiedenen Substrate durch die beiden Enzyme konnte auf der Grundlage der Proteinstrukturen erklärt werden, wobei für die Paraoxonase postuliert wurde, dass der calciumbindende Aminosäurerest D269 als zu D229 analoges Nukleophil wirkt. Abschließend gelang es, zusätzlich eine Zusammensetzung für eine Enzympräparation zu finden, die eine Gefriertrocknung der DFPase mit nur geringem Verlust an enzymatischer Aktivität erlaubt. Ein solches lagerstabiles Enzympulver ist ein notwendiger Schritt hin zu einer praktischen Anwendung der DFPase für die technische Dekontamination von hochtoxischen Nervenkampfstoffen.
Untersuchungen zum Target und Wirkmechanismus der eNOS-Transkriptionsverstärker AVE9488 und AVE3085
(2008)
Die Substanzen AVE9488 und AVE3085 der neuen chemischen Klasse der eNOS-Transkriptionsverstärker führen zu einer signifikanten Aktivierung des eNOSPromotors, die in vitro und in vivo in einer Erhöhung der eNOS-Expression auf mRNAund Proteinebene resultiert. Als Folge davon kommt es zu einer signifikant gesteigerten Synthese von bioverfügbarem Stickstoffmonoxid (NO). Dieser Effekt führt in Kombination mit einer ebenfalls beobachteten Normalisierung der eNOS-Entkopplung zu einer deutlichen antiatherosklerotischen Wirkung in ApoE-Knockout-Mäusen. AVE9488 und AVE3085 wurden initial durch eine phänotypische Reihentestung chemischer Bibliotheken in einer stabilen eNOS-Promotor-Reporter-Endothelzelllinie identifiziert. Daher waren bis zum heutigen Zeitpunkt molekulare Targets und ihre Wirkweise unbekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand daher darin, Targetproteine der eNOS-Transkriptionsverstärker zu identifizieren, zu validieren und Hinweise auf den zugehörigen Wirkmechanismus zu sammeln. Zur Identifizierung potenzieller Zielproteine wurden zwei unterschiedliche Strategien verfolgt. In einem genomischen Ansatz sollten einzelne, für die Aktivierung des eNOSPromotors durch AVE9488 und AVE3085 essentielle Transkriptionsfaktoren identifiziert werden. Eine in silico-Analyse des für die Substanzwirkung notwendigen 300bp-Promotorbereichs vor Transkriptionsstart auf konservierte Transkriptionsfaktor-Bindemotive ergab potenzielle Bindungsstellen für insgesamt 105 Transkriptionsfaktoren. In Gel-Retardierungsexperimenten mit Oligonukleotiden, die aufbauend auf der bioinformatischen Analyse die konservierten cis-Elemente in diesem Sequenzbereich abdeckten, und Kernextrakten aus Endothelzellen, die mit AVE9488 behandelt worden waren, konnte eine Abschwächung der DNA-Protein-Komplexbildung beobachtet werden. Diese Effekte konnten jedoch mit dieser Technologie aufgrund der hohen Anzahl möglicher bindender Transkriptionsfaktoren nicht auf einzelne eingeengt werden. Im Folgenden wurden daher einzelne Transkriptionsfaktoren ausgewählt, die eine nachgewiesene Rolle bei der Regulation der eNOS-Transkription besitzen, und auf ihre Bedeutung bei der Substanz- ermittelten eNOS-Promotoraktivierung untersucht. Nach Ausschaltung durch siRNA von Sp1, GATA-2, Ets-1, MAZ und PATZ1 im eNOS-Transkriptionstest konnten bei Sp1, GATA-2 und MAZ lediglich eine Erniedrigung der basalen eNOS-Promotoraktivitätfestgestellt werden. Da die Substanz-induzierte eNOS-Transkriptionserhöhung bei keinem der untersuchten Transkriptionsfaktoren beeinflusst wurde, scheinen diese Proteine bei diesem Prozess keine Rolle zu spielen. Als zweite Strategie kamen Proteomik-Techniken zur Identifizierung möglicher Targetprot eine durch ihre direkte biochemische Affinität zum Pharmakophor der eNOS-Transkriptionsverstärker zum Einsatz. Durch die chromatographische Anreicherung bindender Proteine aus Endothelzelllysaten an spezifischen Affinitätsmaterialien und der Markierung rekombinanter, humaner Proteine auf Protein-Mikroarrays mit Biotinmarkierten eNOS-Transkriptionsverstärkern konnte eine Gesamtliste mit insgesamt 18 potenziellen Targetkandidaten ermittelt werden. Die weitere zelluläre Validierung dieser Kandidaten erfolgte durch ihre siRNA-vermittelte Ausschaltung im eNOS-Transkriptionstest. Innerhalb aller potenziellen Targets konnte nur nach Ausschalten von Häm-bindenden Protein 1 (HEBP1) der eNOS-Promotor durch AVE3085 nur noch signifikant abgeschwächt gegenüber der Kontrolle aktiviert werden. Dieses Protein stellte somit den einzigen Targetkandidaten dar, der bei der Aktivierung des eNOS-Promotors eine Rolle zu spielen scheint. Nach rekombinanter Expression des humanen HEBP1 konnte die Bindung der eNOS-Transkriptionsverstärker an dieses Protein durch zwei unabhängige biochemische Methoden konfirmiert werden. Bei Messungen der Tryptophanfluoreszenz des HEBP1 konnte der eNOS-Transkriptionsverstärker 9257 den Liganden Hämin, der eine Quenchung der Fluoreszenz bewirkt, aus der Bindung verdrängen. Weiterhin konnte mit Hilfe einer Fluoreszenz-markierten eNOS-Substanz ihre direkte Bindung an das HEBP1 durch Messung der Fluoreszenzpolarisation nachgewiesen und ein KD-Wert von 11,7μM ermittelt werden. Abschließend konnte in ersten Untersuchungen der Hebp1-Expression in einem Herz-Kreislauf-relevanten Tiermodell für chronische Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt die differentielle Hochregulation des Hebp1-Gens um den Faktor 2,5 unter pathologischen Bedingungen nachgewiesen werden, die jedoch nicht durch die Behandlung mit AVE3085 beeinflusst wurde.
Ziel der vorliegenden Dissertation war es, die initialen Bewegungsparameter von Ionen bei matrixunterstützter Laserdesorption zu bestimmen, um mit deren Kenntnis das Verständnis des Desorptions und Ionisationsprozesses bei MALDI zu verbessern. Die Etablierung einer Meßmethode der initialen Geschwindigkeit von Analytionen sowie die Überprüfung verschiedener experimenteller Parameter führten zur Bestimmung einer großen Zahl von Meßwerten der Startgeschwindigkeit von Ionen unterschiedlicher Masse, Ladung und Substanzklasse bei verschiedenen Matrizes und Präparationsbedingungen (siehe Kapitel 5 und 7). Durch Vergleich dieser Meßwerte ist eine Charakterisierung des Desorptions und Ionisationsprozesses bei MALDI möglich. Aufbauend auf diesen Untersuchungen der Startgeschwindigkeit von Ionen wurde ein Desorptions/Ionisationmodell für MALDI entwickelt (siehe Kapitel 6 und 8). Aus der festen Matrix/Analytpräparation werden durch den Laserimpuls oberhalb einer kritischen Laserbestrahlung geladene Bruchstücke ("Cluster") freigesetzt. Aus diesen Clustern resultiert nach Abdampfen von ungeladenenen Teilchen, wie zum Beispiel Matrixmolekülen, die Freisetzung von Ionen in der Gasphase. Hierbei kann das Modell der Clusterbildung sehr gut mit dem Desorptionsmodell nach Zhigilei (siehe Kapitel 2.4.1.5) verknüpft werden [Zhi97]. Die Cluster verschiedener Größe werden in der sich ausdehnenden Teilchenwolke transportiert. Sie bewegen sich mit der initialen Geschwindigkeit der expandierenden Teilchenwolke. Dieser Vorgang kann mit dem "Mitgerissen werden" der Biomoleküle (entrainment) [Bea91] bei MALDI korreliert werden: So wird beispielsweise beobachtet, daß die mittlere initiale Geschwindigkeit v 0 der Analytmoleküle im Mittel nie höher ist als die der Matrixmoleküle. Die Schwellbestrahlungsabhängigkeit der Ionisation kann weiterhin mit der Schwellbestrahlung der Ablation, d.h. der kollektiven Ablation von großen Partikeln aus der Matrix/Analytpräparation, wie sie von Zhigilei in molekulardynamischen Simulationen gefunden wurde, verknüpft werden. Desorption und Ionisation sind somit nicht getrennt voneinander zu betrachten, da während der Desorption die Freisetzung von Ionen erfolgt. Wenn Peptide und Proteine aus Clustern stammen, besitzen die freigesetzten Biomolekülionen die gleiche mittlere Analytionengeschwindigkeit wie die Matrixneutralen [Dre94]. Für kleine Oligosaccharide werden niedrigere Startgeschwindigkeiten detektiert als für Peptide und Proteine. Das kann darauf zurückgeführt werden, daß diese Ionen nicht als vorgeformte Ionen aus Clustern freigesetzt werden. Da die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten neutralen Oligosaccharide kationisiert und (im wesentlichen) nicht protoniert im MALDIMassenspektrum auftreten und bei höheren Verzögerungszeiten eine verstärkte Kationisierung von Oligosacchariden zu beobachten ist, werden diese Teilchen voraussichtlich nach der Desorption in der Gasphase ionisiert (siehe Kapitel 7 und 8). Da Oligosaccharide in die Matrix DHB eingebaut werden, jedoch Kationen zur Ionisation nicht in den Matrixkristallen zur Verfügung stehen, ist anzunehmen, daß neutrale Oligosaccharide aus Clustern mit der gleichen Startgeschwindigkeit wie Peptide und Proteine in der desorbierten Teilchenwolke vorkommen; ihre Ionisation und damit ihre Detektion ist aufgrund der fehlenden Ladung jedoch nicht möglich. Die Ergebnisse der Startgeschwindigkeit von Ionen bei verschiedenen Präparationen verdeutlichen, daß Gasphasenionisation einer der möglichen Wege der Ionisation neben der Freisetzung von Analytionen aus geladenen Clustern ist. Da auch für Peptide und Proteine Kationisierung in der Gasphase auftreten kann, lassen sich auch langsame Molekülionenspezies experimentell feststellen, was mehrere initiale Geschwindigkeits komponenten und damit auch ein Ionensignal mit unterschiedlichen Komponenten der Startgeschwindigkeit zur Folge hat. Weiterhin sollte auch unterhalb der Schwelle des Analytionennachweises (und damit der kollektiven Ablationsschwelle gemäß dem breathing sphereModell) bei MALDI aufgrund von Verdampfung einzelner Moleküle gefolgt von Ionisation in der Gasphase ein Ionensignal feststellbar sein. Die beobachtete mittlere Startgeschwindigkeit von Analytionen wäre somit eine Mischung aus schnellen, aus Clustern stammenden, und aus langsamen, in der Gasphase ionisierten Teilchen. Eine Komponente kann als prompt ionisierte Komponente mit im wesentlichen massenunabhängiger, konstanter (hoher) initialer Geschwindigkeit verstanden werden. Die zweite Komponente kann durch verzögert auftretende Gasphasenionisation innerhalb des expandierenden Materials erklärt werden, wobei die Analytionen eine geringere Startgeschwindigkeit zeigen. Zusammenfassend (siehe Kapitel 8) wird eine kollektive Ablation von Partikeln und vorgeformten Ionen beim MALDIDesorptionsprozeß gefolgt von Sekundärreaktionen innerhalb der dichten Teilchenwolke in der Gasphase in der selvedgeRegion durch Ionen Molekülreaktionen vorgeschlagen, wie es bereits bei dem precursorModell für Sekundärionenmassenspektrometrie formuliert wurde [Sun88], [Pac85], [Ben83]. Bezogen auf die Auswahl potentieller Matrizes besitzt das Modell nach wie vor nur eine geringe "Voraussagekraft": Ob eine Substanz als Matrix geeignet ist oder ob sie einen hohen bzw. geringen Grad an metastabiler Fragmentierung für zum Beispiel Peptide oder Proteine zeigt, kann weiterhin nur experimentell bestimmt werden, wobei jedoch eine Charakterisierung mit Hilfe der Startgeschwindigkeit möglich ist. Der Zusammenhang eines ClusterDesorptions/Ionisationsmodells mit molekulardynamischen Simulationen nach Zhigilei ermöglicht jedoch eine Beschreibung vieler experimenteller Ergebnisse bei MALDI. Weiterführende Experimente sollen die Verifikation des "ClusterModells" der Ionisation zum Ziel haben. Hier ist insbesondere die Untersuchung des Ladungszustandes von Analytmolekülen in festen Matrix/Analytpräparationen von Bedeutung. Weitere Untersuchungen zur Spektrenqualität bei Matrizes, die keinen Einbau der Analytmoleküle in die Matrixkristalle zeigen, sowie eine eingehende Untersuchung der verschiedenen alternativen Präparationstechniken aus Kapitel 7 sind hierbei geplant.
Die endotheliale NO-Synthase (eNOS) ist im kardiovaskulären System der Hauptproduzent von Stickstoffmonoxid (NO). Studien deuten auf eine Beteiligung der eNOS im Krankheits-verlauf einer Leberzirrhose hin; zirrhotische Tiere zeigen eine reduzierte hepatische eNOS-Aktivität bei unveränderten Proteinmengen. Die reduzierte NO-Menge trägt zu einer Erhöh-ung des intrahepatischen Widerstandes und einer portalen Hypertonie bei. Inhibitoren und posttranslationale Modifikationen der eNOS wurden als auslösende Faktoren postuliert, aber auch am intrazellulären Transport der eNOS beteiligte Proteine könnten eine wichtige Rolle spielen. Ein solches ist das neue Protein NOSTRIN (“eNOS traffic inducer”), das über seine C-terminale SH3-Domäne an eNOS bindet und durch seine N-terminale FCH Domäne an Membranen assoziiert. In vorhergegangenen Studien wurde nur ein translatiertes Protein identifiziert, bezeichnet als NOSTRINalpha. In der vorliegenden Arbeit habe ich eine verkürzte Isoform entdeckt (NOSTRINbeta), die aus einem alternativen Spleißvorgang hervorgeht. Ihr fehlt fast die gesamte FCH Domäne, wodurch keine Membranbindung mehr stattfindet. Diese Isoform konnte nur in pathogenem Lebergewebe nachgewiesen werden. Untersuchun-gen mittels Western Blotting und qRT-PCR mit Proben aus Patienten mit Zirrhose, alkoholischer Hepatitis oder von gesunden Personen, zeigten eine deutliche Erhöhung der Expression beider NOSTRIN-Isoformen von gesundem zu zirrhotischem Gewebe. NOSTRINalpha mRNA-Mengen waren in zirrhotischen vs. gesunden Proben verdoppelt, und in Proben aus Patienten mit zusätzlicher Hepatitis verdreifacht. Dies deutet darauf hin, dass erhöhte Mengen von NOSTRINalpha zu einer Internalisierung und Inaktivierung der eNOS führen könnten. NOSTRINalpha und NOSTRINbeta wurden ebenfalls in Hep3B-Zellen auf Protein und mRNA-Ebene nachgewiesen, ihre Expression war durch Retinsäure zeit- und dosisabhängig stimulierbar. NOSTRINalpha lokalisiert an Plasmamembran und vesikulären Strukturen, NOSTRINbeta hingegen hauptsächlich im Zellkern, eine geringe Fraktion im Zytosol. Über Kartier-ungsstudien wurden zwei nuclear leading sequences (NLS) identifiziert, die den Transport in den Zellkern vermitteln, sowie eine Crm-1-abhängige nuclear export sequence (NES). Im EMSA konnte die Bindung von NOSTRINbeta an die Promotorregion des NOSTRIN-Gens gezeigt werden. Diese Ergebnisse legen eine Funktion von NOSTRINbeta als Transkriptionsfaktor nahe, evtl. innerhalb einer negativen Rückkopplung auf die NOSTRINalpha-Expression. Weiter-führende Studien sollen diesen potentiellen molekularen Mechanismus im Detail klären.
Das Rauchen von Kokain („Crack“) hat sich in den letzten Jahren weltweit verbreitet und Crack hat eine wichtige Stellung in der Gruppe der harten Drogen eingenommen. Der inhalative Konsum unterscheidet sich von den anderen Formen der Kokain-Aufnahme durch seine schnelle und intensive Wirkung sowie durch einen sehr starken, unkontrollierten Drang zum erneuten Konsum. Schwere gesundheitliche Schäden sind die Folge sowie auch soziale Isolierung und zwischenmenschliche Konflikte. Da zur Finanzierung der Crack-Sucht häufig Straftaten begangen werden, sind diese Fälle forensisch von besonderem Interesse. Im Gegensatz zum nasalen oder intravenösen Konsum entsteht ausschließlich beim Rauchen das Pyrolyseprodukt Anhydroecgoninmethylester (AEME), welches deshalb als Marker für einen Crack-Konsum angesehen wird. Die toxikologischen Aspekte dieser Substanz sind nicht ausreichend untersucht, um dessen toxikologisches Potential abschätzen zu können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten analytische Methoden entwickelt und der Metabolismus von AEME untersucht werden, um Daten an authentischen Proben von Kokainkonsumenten erheben zu können.
Die mitochondriale Atmungskette und insbesondere die Cytochrom c Oxidase als deren terminales Enzym sind essentiell für den Energiestoffwechsel eukaryotischer Zellen. Die Assemblierung der mitochondrialen Cytochrom c Oxidase mit ihren bis zu 13 Untereinheiten ist noch nicht bis ins Detail aufgeklärt, aber es handelt sich um einen geordneten, stark regulierten Prozess, und Defekte der Assemblierung sind häufig Ursache für neurodegenerative und myopathische Erkrankungen. In Eukaryoten sind bisher mehr als 30 Proteine identifiziert worden, die an der Biogenese der Cytochrom c Oxidase beteiligt sind, darunter Surf1. Beim Menschen führt der Verlust von Surf1 zu einer letalen neurodegenerativen, als Leigh-Syndrom bezeichneten Krankheit, wobei die genaue Rolle von Surf1 bei der Assemblierung der Cytochrom c Oxidase unklar ist. Das Bodenbakteriums Paracoccus denitrificans kann als Modellorganismus für die mitochondriale Atmungskette dienen, da seine aeroben Atmungskettenkomplexe eine deutliche Homologie zu denen der Mitochondrien auf weisen. P. dentrificans besitzt zwei homologe Gene für Surf1, die in Operons mit terminalen Oxidasen assoziiert sind: surf1c ist im cta-Operon lokalisiert, das für Untereinheiten der aa3-Cytochrom c Oxidase kodiert, und surf1q im qox-Operon, das die Gene für die ba3-Ubichinoloxidase enthält. Vorrangiges Ziel dieser Arbeit war es, diese beiden Gene und ihre Translationsprodukte zu charakterisieren und auf ihre Funktion hin zu untersuchen. Chromosomale Einzel- und Doppeldeletionen beider surf1-Gene führten zu einem spezifischen Aktivitätsverlust der jeweiligen Oxidase in Membranen, wobei surf1c und surf1q unabhängig von einander für ihre korrespondierenden Oxidasen zuständig sind und keine überlappenden Funktionen besitzen. Dies war der erste experimentelle Hinweis, dass ein Surf1-Protein auch bei der Assemblierung einer Chinoloxidase eine Rolle spielt. Untersuchungen an aufgereinigter aa3-Cytochrom c Oxidase ergaben, dass der Hämgehalt im Fall der surf1c-Deletion stark vermindert ist. Diese Ergebnisse bestätigten frühere Vermutungen, dass Surf1 eine Rolle beim Häm-Einbau in UEI spielt. Diese Arbeit untersuchte zum ersten Mal aufgereinigtes Surf1-Protein und lieferte mit der Charakterisierung weitere Hinweise auf seine Rolle beim Häm a-Einbau in terminale Oxidasen. So konnte gezeigt werden, dass sowohl Surf1c und als auch Surf1q Häm a in vivo binden. Mit Hilfe spektroskopischer Methoden und der isothermen Titrationskalorimetrie konnte die Bindung von Häm a an apo-Surf1c und Apo-Surf1q quantifiziert werden. Beide Proteine binden Häm a mit submikromolaren Affinitäten in einer 1:1 Stöchiometrie. Ligandenbindungspektren wiesen weiterhin darauf hin, dass das Eisenatom des Häm a in Surf1 nur über fünf Liganden koordiniert ist. Über gerichtete Mutagenese konnte der konservierte Histidinrest His193 für Surf1c und His202 für Surf1q als möglicher fünfter Ligand des Eisenatoms identifiziert werden. Untersuchungen zur Wechselwirkung mit anderen Proteinen zeigten eine direkte Interaktion zwischen der Häm a Synthase und den beiden Surf1-Proteinen in vivo und in vitro, die zuvor noch für kein anderes Surf1-Homolog beschrieben war. Zusätzlich konnte ein Transfer von Häm von der Häm a Synthase auf Surf1c bzw. Surf1q in vitro erreicht werden. Für Surf1c ließ sich außerdem eine Interaktion mit Untereinheit I der Cytochrom c Oxidase nachweisen. Obwohl die Funktion von Surf1 im Rahmen der Biogenese der Cytochrom c Oxidase noch nicht abschließend geklärt werden konnte, liefern die Ergebnisse dieser Arbeit nichtsdestotrotz klare Hinweise auf eine direkte Beteiligung von Surf1 beim Einbau der Häm a-Kofaktoren, und ein neues Modell für die Funktion von Surf1 konnte erstellt werden.
Die extrazelluläre Matrix (ECM) dient in mehrzelligen Organismen nicht nur als mechanische Stütze, sondern nimmt direkten Einfluss auf eine Vielzahl zellulärer Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und Migration. Die Discoidin-Domain-Rezeptoren (DDR) 1 und 2 sind die bisher einzig bekannten ECM-bindenden Rezeptoren mit einer intrinsischen Kinaseaktivität. Rezeptor- Tyrosinkinasen spielen bei der Signaltransduktion eine wichtige Rolle. Sie nehmen durch Bindung spezifischer Liganden Signale außerhalb der Zelle auf und initiieren eine Signalkaskade, die letzlich zur Transkription oder Repression von Zielgenen führt. Nach Bindung von nativem Kollagen an die Rezeptoren DDR1 und DDR2 kommt es zu einer Homodimerisierung, die zur Autophosphorylierung der Rezeptoren führt. Eine generierte DDR1-Knock-out-Maus zeigt einen Defekt in der Differenzierung der Brustdrüse und ist nicht in der Lage, ihre Jungen zu säugen, die genauen Ursachen hierfür sind jedoch bislang unbekannt. Ebenso sind die Zielgene der aktivierten Rezeptoren und insbesondere die Rolle von DDR1 in der Brustdrüse bislang wenig erforscht. In der vorliegenden Arbeit wurde nach Zielgenen, die durch die Signalkaskade von DDR1 und DDR2 in ihrer Transkription beeinflusst werden, gesucht. Außerdem wurde die Rolle von DDR1 in der Brustdrüse im Detail analysiert. Zur Auffindung von Zielgenen wurden Zelllinien generiert, in denen die Expression von DDR durch Doxycyclin reprimierbar ist und mit Hilfe von Microarrays auf die Deregulation von Matrixgenen sowie Matrix-assoziierten und -modifizierenden Genen untersucht. Agrin und alpha 3-Integrin konnten als gemeinsame, reprimierte Zielgene von DDR1 und 2 identifiziert werden. Der P-Selectin-Ligand PSGL-1 und das Proteoglykan Decorin wurden von beiden Rezeptoren induziert. Weiterhin wurde das Brustdrüsengewebe trächtiger DDR1-Knock-out-Mäuse mit dem Brustdrüsengewebe heterozygoter Mäuse verglichen. Dazu wurden Microarrays verwendet, auf denen 15.000 Gene abgebildet waren. Die Analyse zeigte eine Repression von MDGI (Mammary derived growth inhibitor), Osteopontin und WDNMI in DDR1-Knock-out-Mäusen, während die Transkription des IGF-Bindeprotein IGFBP-5 erhöht war. Die Deregulationen konnten mittels Real-time-PCR verifiziert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Rolle von DDR1 in der nichttransformierten Brustepithelzelllinie HC11 und in primären Brustepithelzellen aus DDR1-Knock-out Mäusen untersucht. Dabei konnte ein Defekt von DDR1-Knock-out Zellen in der terminalen Differenzierung beobachtet werden. Im Gegensatz hierzu differenzierten DDR1 überexprimierende HC11-Zellen schneller als HC11-Wildtyp-Zellen und bildeten größere Mengen des Differenzierungsmarkers beta-Kasein. Die Analyse verschiedener Signalwege, die bei der Differenzierung von Brustepithelzellen angeschaltet werden, zeigte, dass DDR1 eine entscheidende Rolle in der Signaltransduktion von Stat5a/b spielt. Die Prolaktin induzierte Stat5a/b-Phosphorylierung war in DDR1 exprimierenden HC11 Zellen stärker und länger anhaltend als in parentalen HC11 Zellen. Dieser Effekt konnte nach Aktivierung von DDR1 durch Typ I Kollagen noch verstärkt werden. In der vorliegenden Arbeit konnten PSGL-1, Decorin, Agrin und Integrina3 als Zielgene in DDR1 und DDR2 überexprimierenden Zellen identifiziert werden. Ferner wurde im Brustdrüsengewebe von DDR1-Knock-out-Mäusen eine Repression von MDGI, Osteopontin und WDNMI sowie eine Induktion von IGFBP-5 gefunden. Die Analyse DDR1 überexprimierender HC11 Zellen und primärer DDR1-Knock-out-Brustepithelzellen zeigte, dass DDR1 eine essentielle Rolle in der terminalen Differenzierung von Brustepithelzellen hat. Dabei konnte erstmals ein Einfluss von DDR1 auf die Prolaktin-induzierte Aktivierung von Stat5a/b gezeigt werden.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Wechselwirkung des AD-assoziierten Proteins PS1 mit dem Cytoskelett in verschiedenen biochemischen und immuncytochemischen Modellen zu untersuchen. Auf diese Weise sollten Hinweise für das Verständnis der bisher nur in Grundzügen bekannten physiologischen Funktion von PS1 erhalten werden. Ausgehend vom Nachweis der Anreicherung endoproteolytischer PSI-Fragmente in Cytoskelett-Fraktionen aus Hirngewebe wurde die spezifische Assoziation des Proteins mit Mikrofilamenten, Mikrotubuli und Neurofilamenten untersucht. Alle durchgeführten biochemischen und immuncytochemischen Experimente zeigen übereinstimmend die spezifische Assoziation von PS1 mit Mikrofilamenten. So konnten PSI-Fragmente über zwei Depolymerisations/ Polymerisations-Zyklen zusammen mit Actin aus Rattenhirn aufgereinigt werden. Die spezifische Spaltung von Actin-Filamenten durch Gelsolin in cytoskelettreichen Fraktionen aus Hirngewebe führte zur Freisetzung kürzerer Filamente, die nach Zentrifugation zusammen mit PS1- Fragmenten im Überstand erschienen. In immuncytochemischen Färbungen kolokalisierte PS1 mit Actin-Filamenten in primären Gliazellen und der neuronalen Zelinie NT2. Eine vor kurzem veröffentlichte Arbeit zeigte außerdem die Kolokalisation von PS1 und Mikrofdamenten in primären Hippocampus-Neuronen. Die fehlende Kosedimentation von in-vitro translatiertem PS1 und Deletionskonstrukten von PS1 mit aufgereinigten und in-vitro assemblierten Actin-Filamenten, das Fehlen konservierter Actin-Bindungsmotive in der Aminosäuresequenz von PS1 sowie bekannte Interaktionen von PS1 mit Actin-bindenden Vertretern der Filamin- und Armadillo-Proteinfamilien lassen auf eine indirekte Assoziation von PS1 mit Mikrofdamenten schließen. Die vorliegende Arbeit konnte die Frage, welche Rolle Mikrotuli oder Neurofilamente bei der Cytoskelett-Assoziation von PS1 spielen, nicht abschließend Mären. PS1-Fragemente wurden im ersten, nicht jedoch im zweiten Depolymerisations/Polymerisations-Zyklus zusammen mit Tubulin aus Rattenhirn aufgereinigt. In dem gleichen Versuchsansatz kosedimentierte in-vitro translatiertes PS1 nicht mit Mikrotubuli. Immuncytochemische Färbungen zeigten dagegen die Kolokalisation von PS1 mit Mikrotubuli in primären Hippocampus-Neuronen, die auch von zwei aktuellen Arbeiten in primären Hippocampus-Neuronen und murinen Embryonen bestätigt wurde. Die spezifische Depolymerisation von Mikrotubuli in cytoskelettreichen Fraktionen war unter den in der vorliegenden Arbeit verwendeten Bedingungen nicht erfolgreich, so daß aus diesem Experiment keine Aussagen zur Assoziation von PS1 mit Mikrotubuli abgeleitet werden konnten. Es Iäßt sich die Hypothese aufstellen, daß sehr kleine PSI-haltige Vesikel über andere Proteine als PS1 mit Mikrotubuli verbunden sind, so daß PS1 mit Mikrotubuli scheinbar kolokalisiert ist. Hochauflösenden lichtmikroskopische bzw. elektronenmikroskopische Aufnahmen oder biochemische Versuche, die nicht zur Zerstörung der Vesikel durch Detergens führen, könnten für die Überprüfung dieser Hypothese herangezogen werden. In-vitro translatiertes PS1 sowie Deletionskonstrukte von PS1 kosedimentierten nicht mit aufgereinigten und in-vitro assemblierten Neurofilamenten, und in primären Hippocampus-Neuronen kolokalisierte PS1 nicht mit Neurofilamenten. Es wäre jedoch wünschenswert, die Experimente mit geeigneten Positiv-Kontrollen für die Kosedimentation und geeigneteren Antikörpern, die bei einem besseren Signal/Hintergrund-Verhältnis eine stärkere Vergrößerung der Immunfluoreszenzen erlauben, zu wiederholen. Im transgenen Tiermodell beeinträchtigten pathogene Mutationen von PS1 nicht, zumindest nicht quantitativ, die Fähigkeit von PS1, an Cytoskelett-Elemente zu binden. Es wäre jedoch möglich, daß es Unterschiede in der Cytoskelett-Assoziation von wt PS1 und PS1 mit pathogenen Mutationen gibt, die nur im Gewebe von FAD-Patienten zu detektieren sind, nicht aber im transgenen Tiermodell, da die bisher bekannten AD-Tiermodelle nicht alle Aspekte der Erkrankung reproduzieren. Die vorliegenden Ergebnisse können die Basis bilden für weitergehende Untersuchungen zur Funktion von PS1 und der Bedeutung von PS1-Cytoskelettinteraktionen in der Alzheimer Demenz. Aktuelle Arbeiten fokussieren dabei stark auf die Interaktion von PS1 mit Mikrofilament-bindenden Vertretern der Armadillo-Proteinfamilie, die bei Zell-Zell-Adhäsionsprozessen eine wichtige Rolle spielen. Im Diskussionsteil wurde ausgeführt, daß aber, gerade im Hinblick auf die Neurodegeneration bei der Alzheimer Demenz, ein möglicher Einfluß von PS1 auf den schnellen axonalen Transport ein interessanter Ansatz für weitere Versuche sein kann.
Untersuchungen zur Interaktion zytoplasmatischer Proteine mit dem Serotonintransporter Der plasmamembranständige Serotonintransporter SERT terminiert die Neurotransmission an serotonergen Synapsen durch den schnellen Rücktransport des Neurotransmitters Serotonin (5HT) in die Präsynapse. Neben seinem präsynaptischen Vorkommen wird der SERT auch axonal in Varikositäten immundetektiert. Der Substrattransport selbst unterliegt der Kontrolle des Ca 2 /CaM, des Stickoxid (NO) und des Proteinkinase C (PKC) Signaltransduktionsweges. Letzterer bestimmt die Oberflächenverfügbarkeit des SERT durch dessen Sequestrierung. Die Regulation der Lokalisation und des Substrattransports des SERT sollte durch assoziierte Proteine erzielt werden. Da bislang jedoch keine interagierenden Proteine des SERT bekannt waren, sollten in dieser Arbeit mit Hilfe des HefeZweiHybridSystems zytoplasmatische Interaktionspartner des SERT identifiziert werden. Erste Untersuchungen an heterolog exprimierten Deletionsmutanten der Termini des SERT ergaben, daß diese zytoplasmatischen Domänen für die Funktion des Proteins unabdingbar sind. Im folgenden wurde daher mit dem Carboxyterminus des SERT eine hirnspezifische cDNABibliothek der neugeborenen Ratte durchsucht. Es wurden vier cDNAKlone isoliert, die für putative Interaktionspartner des SERT kodierten. Die Relevanz dieser genetisch nachgewiesenen Interaktionen wurde biochemisch mittels affinitätschromatographischer Studien untersucht, während immunzytochemische Analysen die Interaktionen durch die Umverteilung oder durch die Colokalisation der coexprimierten Proteine in vivo validierte. Pharmakologische Untersuchungen sollten darüberhinaus Aufschluß über den regulatorischen Einfluß der Interaktion auf die Transportfunktion des SERT geben. Nach diesen Aspekten wurden zwei der putativen Interaktionspartner näher untersucht. Der erste untersuchte cDNAKlon kodierte für die ßUntereinheit der intrazellulären Acetylhydrolase des "plateletactivating factor" (ßPAFAH). Affinitätschromatographisch wurde die Interaktion durch die Präzipitation der eukaryotisch überexprimierten ß Untereinheit an einem bakteriell exprimierten Fusionsprotein des SERTCT bestätigt. Die immunzytochemische Analyse zeigte nach der Coexpression der ßPAFAH und dem SERT eine Umlokalisierung des zytoplasmatischen Proteins an Bereiche plasmamembranständiger SERTImmunreaktivität. Durch Wiederaufnahmestudien wurde kein Effekt der ßPAFAH auf die Transportfunktion des SERT ermittelt, weshalb die funktionelle Bedeutung dieser Interaktion vorerst unklar bleibt. Der zweite Klon kodierte für das Rattenspezifische Homolog des myristoylierten Alanin reichen Proteinkinase CSubstrats (MacMARCKS). Der biochemische Nachweis einer Interaktion konnte hier nicht erbracht werden. Dagegen zeigte die immunzytochemische Analyse eine Colokalisation von MacMARCKS und SERT in diskreten Bereichen der Plasmamembran. Hinweise auf die physiologische Bedeutung konnten durch die pharmakologische Analyse gewonnen werden. So induzierte die Coexpression von MacMARCKS und SERT eine Abnahme der maximalen Transportrate (Vmax) um 29,6 ± 18,6 % (n = 3) im Vergleich zu GFPexprimierenden Kontrollzellen. Die Stimulierung der PKC erzielte dagegen kaum eine weitere Reduktion der Vmax im Gegensatz zu den Kontrollzellen, während die Behandlung der Zellen mit einem PKCInhibitor zum Angleich der Vmax der Konrollzellen und der MacMARCKSexprimierenden Zellen führte. Daraus wurde gefolgert, daß MacMARCKS an der Regulation der Transportfunktion des SERT durch dessen Sequestrierung beteiligt ist. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit zwei Interaktionspartner des SERTCT identifiziert, deren mögliche Funktionen in der Regulation der intrazellulären 5HT Konzentration einerseits bzw. der Regulation der Transportfunktion des SERT andererseits liegen könnten.
In dieser Arbeit wurde die Kinetik von zwei Ca2-plus-aktivierten Membranproteinen untersucht: zum einen des endogenen Ca2-plus-aktivierten Chloridkanals der Xenopus-Oozytenmembran, zum anderen des heterolog in Oozyten exprimierten Na-plus-Ca2-plus-Austauschers NCX1, kloniert aus dem Meerschweinchen-Herzen. Der Ca2-plus-aktivierte Chloridkanal wird durch intrazelluläres Ca2-plus im submikromolaren Konzentrationsbereich (KD = 0.5 µMCa2-plus) aktiviert und hat eine hohe Permeabilität für Chloridionen. In der ausgereiften Eizelle spielt er eine wichtige Rolle bei der Ausbildung des Fertilisationspotentials und verhindert durch eine Depolarisation der Membran eine Polyspermie. Der Na-plus-Ca2-plus-Austauscher ist in der Herzmuskelzelle für die Ausbildung des Exzitations- Kontraktions-Zyklus von Bedeutung, indem er für die Aufrechterhaltung des Ca2-plus- Gradienten (freies Ca2 intrazellulär ungefähr gleich 100 nm, extrazellulär ungefähr gleich 2 mM) über die Plasmamembran verantwortlich ist. Unter physiologischen Bedingungen transportiert der Na-plus- Ca2-plus-Austauscher ein Ca2-plus-Ion im Austausch gegen drei Na-plus-Ionen aus der Zelle hinaus, und nutzt somit den Na-plus-Gradienten neben dem Membranpotential als treibende Kraft. Als Messmethode wurde die Patch-Clamp-Technik in der inside-out-Makro-Patch- Konfiguration verwendet. Die Patch-Clamp-Technik erlaubt definierte ionale Bedingungen auf beiden Seiten der Membran. Cytoplasmatische Ca2-plus-Konzentrationssprünge wurden zum einen durch Lösungswechsel, insbesondere aber durch die Photolyse von DM-Nitrophen, einem photolabilen Ca2-plus-Chelator, hervorgerufen. Die Photolyse von DM-Nitrophen erlaubte, im Vergleich zum Lösungswechsel, sehr schnelle Ca2-plus- Konzentrationssprünge (Ca2-plus-Freisetzungsrate mindestens 38000 s-1). Die kinetischen Untersuchungen am Ca2-plus-aktivierten Chloridkanal haben neue, über bisherige aus dem Lösungswechselexperiment bekannte hinausgehende, Erkenntnisse ergeben: Nach einem schnellen Ca2-plus-Konzentrationssprung geht dem Signalanstieg auf einen stationären Wert eine deutlich schnellere Verzögerungsphase (lag-phase) voraus. Sowohl der Signalanstieg als auch die Verzögerungsphase zeigen eine starke Ca2-plus-Abhängigkeit, sind aber nur sehr schwach spannungsabhängig. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Signalanstieg den spannungsabhängigen Ca2-plus-Bindungs-/Dissoziationsschritt von mindestens zwei Ca2-plus-Ionen widerspiegelt, während das spannungsunabhängige Kanalöffnen/ -Schließen durch die Verzögerungsphase repräsentiert wird. Bei Spannungssprungexperimenten mit hoher Zeitauflösung konnte eine schnelle Inaktivierung nach einer Depolarisation der Membran gesehen werden, die in Gegenwart von sättigenden intrazellulären Ca2-plus-Konzentrationen zu einer Einwärtsgleichrichtung der Strom-Spannungskennlinie des stationären Stroms führt. Mit diesen Erkenntnissen konnte ein Reaktionsmodell für den Ca2-plus-aktivierten Chloridkanal aufgestellt werden, mit dem sich die experimentellen Daten simulieren ließen. Die heterologe Expression des Na-plus-Ca2-plus-Austauschers in Oozyten hat zu einem deutlich verbesserten Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich zu früheren Messungen am nativen Austauscher in Cardio-Myocyten-Membranen geführt. Mit Hilfe der Photolyse von DM-Nitrophen konnte erstmals eine vollständige Ca2-plus- und Spannungsabhängigkeit des vorstationären Einwärtsstroms, hervorgerufen durch einen cytoplasmatischen Ca2-plus-Konzentrationssprung, durchgeführt werden. Sowohl im Ca2-plus-Ca2-plus- als auch im Na-plus-Ca2-plus- Austauschmodus zeigt sich ein transientes Einwärtsstromsignal (Anstieg messtechnisch nicht auflösbar), das sehr schnell relaxiert. Im Ca2-plus-Ca2-plus-Austauschmodus zeigt sich nur ein transientes Stromsignal (kein Nettoladungstransport im stationären Zustand), während im Na-plus-Ca2-plus-Austausch sich ein stationärer Einwärtsstrom einstellt. Das transiente Stromsignal hat eine deutliche Ca2-plus-Abhängigkeit sowohl für den Spitzenstrom (KM = 30.9 ± 3.0 µM im Na-plus-Ca2-plus-Austausch, KM = 57 ± 10 µM im Ca2-plus- Ca2-plus-Austausch) als auch für die Geschwindigkeitskonstante 1/t des Signalabfalls (KM = 98.5 ± 21.3 µM im Na-plus-Ca2-plus-Austausch, KM = 76 ± 11 µM im Ca2-plus-Ca2-plus-Austausch) gezeigt. Die Relaxation des Stromtransienten erfolgt sowohl im Ca2-plus-Ca2-plus- als auch im Na-plus-Ca2-plus-Austausch mit einer maximalen Geschwindigkeitskonstanten von ungefähr gleich 10000 s -1 nach sättigenden Ca2-plus-Konzentrationssprüngen. Der Signalabfall hat sich über den gesamten untersuchten Ca2-plus-Konzentrationsbereich als spannungsunabhängig herausgestellt, während der Spitzenstrom bei positiven Membranpotentialen deutlich abnimmt. Dies führt zu einer Spannungsabhängigkeit der verschobenen Ladung (Integral des transienten Stromsignals) im Ca2-plus-Ca2-plus-Austausch. Aus diesen Erkenntnissen konnte für den Ca2-plus- Translokationszweig (im Rahmen eines konsekutiven Transportmodells) folgendes Reaktionsschema aufgestellt werden: Einem spannungsunabhängigen, sehr schnellen Ca2-plus- Bindungs/-Dissoziationsschritt (diffusionskontrolliert) auf der intrazellulären Membranseite folgt ein ebenfalls spannungsunabhängiger, aber ratenlimitierender Schritt (intrazellulärer Okklusionsschritt, asymmetrische Raten: 10000 vs. 1000 s-1). Der nachfolgende Ca2-plus-Translokationschritt muss sehr hohe Hin- und Rückraten aufweisen (ungefähr gleich 20000 s-1). Die Ca2-plus-Dissoziation/-Bindung auf der extrazellulären wird als sehr schnell (diffusionskontrolliert) und spannungsunabhängig angenommen. Weitergehende Einblicke haben der Sr2-plus-Ca2-plus- und der Ba2-plus-Ca2-plus-Austausch geliefert. Während der Sr2-plus-Ca2-plus-Austausch nahezu das gleiche Verhalten wie der Ca2-plus-Ca2-plus-Austausch gezeigt hat, konnte nach einem intrazellulären Ca2-plus-Konzentrationssprung im Ba2-plus-Ca2-plus-Austausch erstmals eine zusätzliche langsame Phase im Abklingen des transienten Einwärtsstromsignals beobachtet werden. Das transiente Signal hat im Vergleich zum Ca2-plus-Ca2-plus-Austausch eine signifikant höhere Ladungsverschiebung aufgewiesen. Dies deutet auf einen zusätzlichen elektrogenen Reaktionsschritt hin (extrazelluläre Ca2-plus-Okklusion). Weitere elektrogene Schritte müssen im Na-plus-Translokationszweig (Na-plus-Bindungs- und Na-plus-Translokationsschritt) liegen. Mit den aus diesen Erkenntnissen aufgestellten Reaktionsschemata ließen sich die experimentellen Daten erfolgreich simulieren. Die Gesamttransportrate im Na-plus-Ca2-plus- Austausch liegt demnach bei ungefähr gleich 1000 s-1 bei Raumtemperatur und stimmt damit mit Literaturwerten von mehreren 1000 s-1 bei physiologischer Temperatur überein.
In dieser Arbeit werden Projekte beschrieben, in denen das Adsorptionsverhalten von Proteinen und Bakterien an verschiedene Materialoberflächen manipuliert wird.
Durch die Reaktion verschiedener oxidischer Oberflächen mit Glycidol konnten biorepulsive Polyglycerolschichten erzeugt werden. Für die Herstellung dieser Polyglycerolschichten wurden zwei unterschiedliche Verfahren entwickelt und untersucht. Die erste Methode beruht auf der Bildung einer aminoterminierten Monolage auf Silicium-Oberflächen, an der in einem zweiten Schritt die Polymerisation von Glycidol durchgeführt wird. Die Dicke der angebundenen Polyglycerolschicht ist abhängig von der Beschichtungsdauer, wobei die dicksten Schichten bis zu 98% der Bakterienadhäsion unterdrücken können. Das zweite Verfahren ist die direkte Anbindung von stabilen Polyglycerol-Beschichtungen an Silicium-, Aluminium- oder Stahl-Oberflächen. Je größer die abgeschiedene Polyglycerolmenge ist, desto höher ist die Biorepulsivität der Schicht, was durch Adsorptionstests mit Proteinen und ermittelt wurde.
Polyglycerolschichten eignen sich besonders gut für die nachträgliche Modifizierung. So konnten beispielsweise mittels Elektronenstrahlen laterale Strukturierungen der Polyglycerol-beschichteten Oberflächen erfolgreich durchgeführt werden. Sensorisch aktive Moleküle wie Ethylendiamintetraessigsäure oder Biotin konnten im Rahmen dieser Arbeit nachträglich an Polyglycerolschichten angebunden werden. Die Aktivität der Bindungsstellen nach der Anbindung an die Oberfläche konnte dabei durch spezifische Erkennungsereignisse nachgewiesen werden.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden selbstanordnende Monoschichten mit Oligoethylenglycol (OEG)-Kopfgruppen und Thiolat-Ankergruppen verwendet, um lateral strukturierbare, biorepulsive Schichten auf Gold zu erzeugen. Es wurde untersucht, ob derartige OEG-Monolagen kontrolliert durch langwelliges UV-Licht (390 nm) abgebaut werden können, um proteinbindende und proteinrepulsive Bereiche auf einer Substrat-Oberfläche zu generieren. Die Bestrahlung mit UV-Licht bewirkte die Oxidation und Abspaltung der Ethylenglycol-Einheiten, wodurch die unspezifische Adsorption von Proteinen erfolgen kann. Zusätzlich konnten Photooxidations-Reaktionen an der Thiolat-Ankergruppe nachgewiesen werden, welche die Ablösung des SAM-Bausteins zur Folge haben.
Für den Einsatz von Lithographie-Techniken in mikrofluidischen Anlagen wurde das Abbauverhalten der biorepulsiven Monolage bei der Bestrahlung unter Wasser untersucht. In Abwesenheit von molekularem Sauerstoff kommt es hier lediglich zur Spaltung der Etherbindung zwischen den Ethylenglycol-Einheiten. Die Beobachtung, dass die An- bzw. Abwesenheit von molekularem Sauerstoff zu zwei unterschiedlichen Abbaumechanismen führt, kann für die Feinabstimmung der Oberflächenbeschaffenheit und somit der Proteinanlagerung genutzt werden.
Biorepulsive OEG-Monolagen können auch dazu verwendet werden, um gezielt bestimmte Biomoleküle anzulagern. Dazu können die Monolagen mit Erkennungsstellen ausgestattet werden, welche die spezifische Anbindung einer Biomolekül-Spezies ermöglichen. Gerade bei der Detektion von großen Biomolekülen oder Mikroorganismen spielt jedoch nicht nur die chemische Zusammensetzung, sondern auch die Ausrichtung der Bindungsstelle eine entscheidende Rolle. Für die Untersuchung des Orientierungseinflusses wurden Moleküle verwendet, die neben einer Mannose-Einheit als Bindungsstelle für Bakterien auch eine Azobenzol-Gruppe, welche die strahlungsinduzierte reversible Schaltung der Konformation ermöglicht, tragen. Bakterien-Adhäsionstests zeigten, dass sich die Orientierung der Mannose-Einheit auf die Anbindung der Bakterien auswirkt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden neuartige Methoden zur Herstellung, Charakterisierung und Strukturierung biorepulsiver und biosensorischer Schichten entwickelt. Die dadurch gewonnenen Erkenntnisse sind von bedeutender wissenschaftlicher Relevanz und ermöglichen die potentielle industrielle Anwendung der entwickelten Methoden im Kontext der Material- und Biotechnologie sowie der Nanofabrikation.
Die Replikation und Pathogenese von HIV ist in hohem Maße von zellulären Faktoren abhängig. Das Virus muss einerseits die protektiven und antiviralen Abwehrmechanismen der Wirtszelle umgehen können und gleichzeitig ist seine Replikation an die Nutzung zellulärer Faktoren adaptiert. Neben der Interaktion mit konstitutionell exprimierten zellulären Proteinen bewirkt das HI-Virus auch eine transkriptionelle Regulation zellulärer Gene, um sich einen für seine Replikation vorteilhaften Funktionszustand der Wirtszelle zu schaffen. Durch eine HIV-Infektion differentiell exprimierte Gene stellen daher potentielle Kandidatengene zur Identifizierung essentieller Wirtsfaktoren oder zellulärer Restriktionsfaktoren der HIV-Replikation dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die durch HIV-Infektion differentiell regulierten Gene LEREPO4, GLiPR, SCC-112 und Moesin auf eine mögliche Funktion bei der HIV-Replikation analysiert. Dabei wurden diese durch RNA Interferenz (RNAi) im Kontext einer HIV-Infektion reprimiert. Als zelluläres Modellsystem wurden P4-CCR5-Zellen verwendet, bei denen eine Infektion mit dem Virusstamm HIV-1Bru eine Induktion der Gene LEREPO4, GLiPR und Moesin sowie eine Repression von SCC-112 bewirkte. Die RNA-Interferenz vermittelte Suppression dieser Gene erfolgte durch Applikation von synthetischen siRNA Oligonukleotiden oder durch intrazelluläre Expression von short hairpin RNAs (shRNA). Durch den Einsatz von shRNAs konnte jedoch unter den vorliegenden Versuchsbedingungen nur eine unzureichende Gensuppression erreicht werden. Aus diesem Grund wurden synthetische siRNA Oligonukleotide verwendet. Es konnte eine deutliche Reduktion der jeweiligen Zielgene bewirkt werden, ohne dass nennenswerte Effekte auf den Phänotyp und die Viabilität der Zellen beobachtet wurden. Der Einfluss der siRNA-vermittelten Gensuppression auf die HIV-Replikation wurde durch Infektion der Zellen ermittelt. Hierbei zeigte sich, dass die Depletion von GLiPR und LEREPO4 eine deutliche Inhibition der HIV-Replikation bewirkte. Das Ausmaß der Inhibition war ähnlich ausgeprägt, wie durch Verwendung einer bereits publizierten, gegen das virale Gen p24 gerichteten siRNA. Die Depletion von SCC-112 hatte im Gegensatz hierzu keine eindeutige Wirkung auf die HIV-Replikation, so dass nicht ausgeschlossen werden kann, dass seine Repression während einer HIV-Infektion ein unspezifischer bzw. sekundärer Effekt ist. Die siRNA-vermittelte Suppression von Moesin führte zu einem unerwarteten Ergebnis, da eine deutliche Steigerung der HIV-Replikation im Vergleich zur Kontrolle festgestellt wurde. Damit konnte erstmals belegt werden, dass Moesin nicht für die HIV-Replikation benötigt wird, wie es durch andere Arbeiten postuliert wurde. Diese Annahme begründete sich auf der Beobachtung, dass Moesin in Viruspartikel inkorporiert wird. Daher wurde eine Beteiligung an der Zusammenlagerung oder Abschnürung viraler Partikel vermutet. Die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse lassen vermuten, dass LEREPO4 und GLiPR notwendige Faktoren der HIV-Replikation sind, wohingegen Moesin einen negativen Effekt zu vermitteln scheint. Die zugrunde liegenden Mechanismen dieser Wirkung auf die HIVReplikation sind jedoch weitgehend unklar. Da die Proteine LEREPO4, SCC-112 und GLiPR nicht oder nur unzureichend charakterisiert sind, war ein weiteres Ziel dieser Arbeit zelluläre Funktionen dieser Proteine zu ermitteln, um Rückschlüsse auf ihre Funktion bei der HIV-Replikation zu gewinnen. Es konnten polyklonale Antikörper gegen LEREPO4 generiert werden, mit denen eine Bestimmung der zellulären Lokalisation möglich war. Mittels Co-Immunopräzipitation wurde die Interaktion von LEREPO4 und TRAF-2 nachgewiesen. Die Bestimmung des Einflusses von LEREPO4 auf die NF-κB-Aktivierung lässt vermuten, dass LEREPO4 an der TRAF-vermittelten Signaltransduktion beteiligt ist. Untersuchungen zur Funktion von GLiPR zeigten, dass es sich möglicherweise um ein sekretorisches Protein handeln könnte, wie durch den fluoreszenzmikroskopischen Nachweis eines GLiPR-EGFP-Fusionsproteins in HeLa-Zellen ermittelt wurde. Weiterhin konnte mittels Annexin-V-Färbung und TUNEL-Assay belegt werden, dass eine exogene Expression des GLiPRs in HeLa Zellen zu einem deutlichen Anstieg der Apoptoserate führte. Zusätzlich wurden für jedes Protein Genexpressionsprofile nach siRNA vermittelter Repression mittels Microarray-Analyse erstellt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass LEREPO4 und GLiPR mögliche Kofaktoren der HIV-Replikation darstellen. Im Gegensatz hierzu scheint Moesin einen negativen Effekt zu vermitteln. Auf Grundlage der in dieser Arbeit ermittelten Daten können weiterführende Untersuchungen durchgeführt werden, um die genaue Funktion der oben genannten Proteine bei der HIV-Replikation zu klären.
Die vorliegende Arbeit befasste sich in erster Linie mit der Regulation des P2X2 Rezeptors (P2X2R) durch Phosphoinositide (PI). P2X Rezeptoren sind durch extrazelluläres ATP aktivierte Kationenkanäle, die ubiquitär unter Vertebraten, v. a. im zentralen wie peripheren Nervensystem exprimiert werden. Bis heute sind 7 verschiedene Untereinheiten dieser Rezeptorfamilie bekannt, die nach homo- oder heterotrimerer Assemblierung unterschiedliche funktionelle Phänotypen ausbilden. Die P2X Rezeptoren sind an einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen beteiligt. Für ihre Beteiligung am zellulären Signalgeschehen wurde in der Vergangenheit der Begriff der purinergen Signaltransduktion geprägt. PI4,5P2 ist ein zelluläres, an der Innenseite der Plasmamembran verankertes Phospholipid, dem zahlreiche, essentielle Funktionen zukommen. Dass es auch Signalfunktion besitzen kann, wurde erst spät (1980) bekannt; dass es darüber hinaus zudem membranäre Transportsysteme reguliert, konnte erst in den letzten Jahren gezeigt werden. Die ersten Kanäle, für die eine Phosphoniositid (PI)-Beeinflussung nachgewiesen wurde, waren die einwärts gleichrichtenden K+-Kanäle. 2006 wurden die ersten vorläufigen Hinweise publiziert, dass auch die Kanalfunktion der P2X Rezeptoren durch Phosphoinositide beeinflusst werden kann. Darauf aufbauend wurde in der vorliegenden Arbeit der P2X2R nach Expression in Xenopus Oozyten elektrophysiologisch auf eine mögliche Regulation durch PIPns untersucht. Um die in der Oozyte vorliegenden PI-Level gezielt während der Messung ändern zu können, wurde die spannungsgesteuerte Phosphoinositid-Phosphatase Ci-VSP coexprimiert. Ci-VSP, die der PTEN-Phosphatase strukturell sehr ähnlich ist, wurde 2005 aus der Schlauchascidie Ciona intestinalis kloniert. In der veröffentlichten Klonierungsarbeit wurde bereits gezeigt, dass Ci-VSP in der Lage ist, bekannte PI4,5P2-sensitive Membrankanäle, wie z. B. bestimmte K+-Kanäle, spannungsabhängig zu inhibieren. Es konnte in TEVC-Experimenten gezeigt werden, dass die durch Depolarisation induzierte Aktivierung dieser Phosphatase den P2X2 Rezeptorstrom in seiner Desensibilisierung sowohl beschleunigt als auch verstärkt. Dieser Effekt war spannungsabhängig und nahm mit höherer Depolarisation zu. Die ermittelte Spannungsabhängigkeit stimmte dabei mit dem sensitiven Potentialbereich der spannungsgesteuerten Ci-VSP-Domäne, gemessen an ihren gating-Strömen, überein. Der „Ci-VSP-Effekt“ auf den P2X Rezeptor konnte nur in Anwesenheit von ATP, d.h. bei aktiviertem Rezeptor, beobachtet werden. Wurden die Oozyten mit Wortmannin, einem PI4-Kinase(PI4K)-Inhibitor, behandelt, zeigte sich eine vergleichbare Veränderung des Rezeptorstroms. Eine PI4K-Inhibition zielt demnach offensichtlich auf die gleichen Regulationsmechanismen wie die Ci-VSP-Aktivierung. In weiterführenden zellfreien Patch Clamp-Messungen an Oozytenmembranen wurden sowohl Einzelkanal- als auch makroskopische Ströme des P2X2R unter Einfluss verschiedener, intrazellulär verabreichter PIs und PI-beeinflussender Enzyme untersucht. Einzig die Zugabe von PI4,5P2 hatte einen deutlich aktivierenden Einfluss auf den makroskopischen Rezeptorstrom, andere getestete PIs (wie auch PI3-Kinase und PTEN-Phosphatase) zeigten keinerlei Wirkung. Vergleichbare Ergebnisse konnten in vorläufigen Einzelkanal-Messungen an diesem Rezeptor Subtyp beobachtet werden. Da die PI4-Kinase offensichtlich an der beobachteten Beeinflussung der P2X2R Desensibilisierung beteiligt ist, wurde die P2X2-Rezeptorsequenz auf potentielle - über sogenannte SH3-Epitope vermittelte - PI4K-Interaktionsbereiche hin untersucht. Diese SH3-Epitope kommen in vielen zellulären Proteinen vor, um Protein-Protein-Interaktionen zu vermitteln. Nach Sequenzanalyse des maßgeblich am Desensibilisierungsgeschehen beteiligten C-Terminus des P2X2R konnte im distalen Teil ein SH3-Bindungsmotiv lokalisiert werden, das daraufhin durch gerichtete Mutagenese (P2X2-P451A/P454A) unwirksam gemacht wurde. Dieser mutierte Rezeptor verhielt sich in seiner Desensibilisierung wie der Wildtyp nach Wortmannin-Behandlung, zeigte also eine intrinsisch verstärkte Desensibilisierung. Eine Wortmannin-Behandlung der Oozyten, die den mutierten Rezeptor exprimierten, führte hingegen zu keiner weiteren Beeinflussung des Rezeptorstroms. Somit konnte letztlich der Schluss gezogen werden, dass die PI4K, und das mit ihr in direkter Verbindung stehende PI4,5P2, einen maßgeblichen Einfluss auf das Desensibilisierungsverhalten des P2X2R hat. Auf Basis der erarbeiteten Befunde wurde ein kinetisches Reaktionsmodell des P2X2R erstellt, das bisher aufgestellte Modelle mit den Ergebnissen dieser Arbeit vereint, aber auch in teilweisem Gegensatz zu dem von FUJIWARA & KUBO [2006] steht. Des Weiteren wurde im Verlauf dieser Arbeit die reversible Inhibition des P2X2R durch eine Reihe von Aminoglykosid-Antibiotika untersucht. Durch Analyse der Dosis-Wirkungs-Beziehungen, der Spannungs- sowie wie ATP-Konzentrations-Abhängigkeit der Inhibition konnte gezeigt werden, dass es sich dabei um einen nicht-kompetitiven open pore block handelte. Durch weiterführende Untersuchungen an einer nicht-desensibilisierenden P2X2/1 Rezeptorchimäre wurde gezeigt, dass eine Aminoglykosid-Inhibition die ATP-Dissoziation von der Rezeptorbindungsstelle signifikant verlangsamte. Dieser Befund deutet auf eine im Vergleich zum geschlossenen Zustand erhöhte Affinität des offenen Zustands für ATP hin. Neben den hier untersuchten Aminglykosiden sind bislang keine weiteren Substanzklassen bekannt, die den P2X2R durch einen derartigen Mechanismus hemmen.
Der Typ I Interferonrezeptor, der aus den Transmembranproteinen ifnar1 und ifnar2 besteht, nimmt eine wichtige Rolle bei der angeborenen und erworbenen Immunantwort ein. Durch Bindung von Typ I Interferonen werden antivirale, antiproliferative und immunmodulatorische Aktivitäten in der Zelle induziert. Die Wirkung der Interferone wird bereits bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten eingesetzt. Es ist bislang nicht bekannt, wie die verschiedenen Typ I Interferone nach Bindung an einen gemeinsamen Rezeptor, unterschiedliche Zellantworten induzieren. So unterscheiden die Typ I Interferone sich nicht hinsichtlich ihrer Bindungsstelle oder der Stöchiometrie der Bindung an ifnar1 bzw. ifnar2. Sie weisen jedoch unterschiedliche Affinitäten zu den Rezeptoruntereinheiten auf, wobei ihnen eine niedrigere Affinität zu ifnar1 gemeinsam ist. Bislang konnte keine Interaktion zwischen den Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen werden. Es wird angenommen, dass bei der Rezeptorassemblierung das Interferon zunächst an ifnar2 bindet und anschließend ifnar1 rekrutiert. Es wird postuliert, dass die unterschiedlichen Zellantworten für verschiedene Typ I Interferone auf Unterschieden in der Stabilität der ternären Komplexe beruhen könnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die Struktur und Dynamik des Interferonrezeptors in vitro für die Typ I Interferone IFNa2 und IFNb charakterisiert. Die Struktur des ternären Komplexes aus den extrazellulären Domänen von ifnar1 und ifnar2 mit IFNa2 wurde mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Über Einzelpartikelanalyse aufgereinigter Komplexe von IFN mit den extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) konnte ein Strukturmodell des ternären Komplexes erstellt werden. Dieses zeigte eine Verschiebung der membranproximalen Domänen von ifnar1-EC und ifnar2-EC wie sie bereits für den Rezeptor für Erythropoietin und den Wachstumsfaktor beobachtet wurden, welche zu den Typ I Zytokinrezeptoren gehören. Die Struktur des ternären Komplexes ermöglicht als erste Struktur eines Typ II Zytokinrezeptors einen Einblick in die Architektur des Komplexes und mögliche Aktivierungsmechanismen. Die Strukturen der Komplexe für die verschiedenen Typ I Interferone IFNa2 und IFNb wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf, was auf einen gemeinsamen Aktivierungsmechanismus hinweist. Temperatur-abhängige Messungen von Bindungskinetik und –affinität ergaben sehr unterschiedliche Energiehyperflächen für die Ligandenbindung an ifnar1- und ifnar2-EC, und wiesen auf einen mehrstufigen Prozess und mögliche Konformationsänderungen bei der Bindung an ifnar1-EC hin. Zur Analyse der Dynamik von ifnar1-EC wurden daher verschiedene fluoreszenzbasierte Assays etabliert. Eine besondere Herausforderung bestand darin, das Protein ortsspezifisch und stöchiometrisch mit zwei verschiedenen Fluorophoren zu koppeln. Ifnar1-EC wurde an verschiedenen Stellen kovalent mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Es wurde gezeigt, dass nach Bindung eines geeigneten tris-NTA-Fluorophor-Konjugats an den C-terminalen His-Tag die Fluoreszenz abstandsabhägig durch Förster-Resonanz-Energie-Transfer gelöscht wurde. Für ifnar1-EC wurde eine ligandeninduzierte Abstandsänderung detektiert. Die detaillierte Analyse ergab nach Bindung von IFNa2 eine Abstandszunahme von 13 A vom N- zum C-Terminus. Durch die Interferonbindung nimmt demnach ifnar1-EC eine gestrecktere Konformation ein. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in Anwesenheit von ifnar2-EC und für IFNb erhalten. Die Einzelmolekülanalysen mittels Fluoreszenz Korrelationsspektroskopie (FCS) zeigten sowohl einen Verlust der Flexibilität von ifnar1-EC nach Ligandenbindung als auch ein ligandeninduziertes Rearangement der Ig-ähnlichen Domänen. Die Änderung der Flexibilität wurde durch Messungen der Fluoreszenzlebensdauer bestätigt. Untersuchungen der Kinetik der Ligand-induzierten Konformationsänderung mittels Stopped-Flow Messungen bestätigten eine mehrstufige Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen nach Ligandenbindung. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass sich nach Ligandenbindung die Zugänglichkeit des Tryptophans in der membranproximalen Domäne von ifnar1-EC ändert. Da die membranproximale Domäne nicht bei der Ligandenbindung beteiligt ist, deutet dieser Effekt auf eine Propagation der Ligand-induzierten Konformationsänderung in diese Domäne hin. Das Tryptophan könnte mit der Membran interagieren, was auf eine wichtige Rolle der membranproximalen Domäne für die korrekte Orientierung von ifnar1 in der Membran hindeut. Die Stopped-Flow Analyse zeigte, dass es sich hierbei um einen einstufigen Prozess handelt, der mit der Interferonbindung korreliert. Die Ergebnisse wiesen insgesamt auf eine Ligand-induzierte Flexibilitätsänderung und Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen bei ifnar1-EC hin. Vermutlich wird nach Ligandenbindung das Signal in die membranproximale Domäne von ifnar1-EC propagiert. Die Strukturen der ternären Komplexe mit den verschiedenen Typ I Interferonen wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf. Auch die Ergebnisse der fluoreszenzbasierten Assays zeigten keine Unterschiede für IFNa2 und IFNb, was die Hypothese stützt, dass die differentielle Aktivität der Interferone nicht auf grundsätzlichen Unterschieden in der Architektur des ternären Komplexes beruht, sondern in der unterschiedlichen Dynamik der Komplexe codiert sein könnte.
Der Typ I Interferonrezeptor, der aus den Transmembranproteinen ifnar1 und ifnar2 besteht, nimmt eine wichtige Rolle bei der angeborenen und erworbenen Immunantwort ein. Durch Bindung von Typ I Interferonen werden antivirale, antiproliferative und immunmodulatorische Aktivitäten in der Zelle induziert. Die Wirkung der Interferone wird bereits bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten eingesetzt. Es ist bislang nicht bekannt, wie die verschiedenen Typ I Interferone nach Bindung an einen gemeinsamen Rezeptor, unterschiedliche Zellantworten induzieren. So unterscheiden die Typ I Interferone sich nicht hinsichtlich ihrer Bindungsstelle oder der Stöchiometrie der Bindung an ifnar1 bzw. ifnar2. Sie weisen jedoch unterschiedliche Affinitäten zu den Rezeptoruntereinheiten auf, wobei ihnen eine niedrigere Affinität zu ifnar1 gemeinsam ist. Bislang konnte keine Interaktion zwischen den Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen werden. Es wird angenommen, dass bei der Rezeptorassemblierung das Interferon zunächst an ifnar2 bindet und anschließend ifnar1 rekrutiert. Es wird postuliert, dass die unterschiedlichen Zellantworten für verschiedene Typ I Interferone auf Unterschieden in der Stabilität der ternären Komplexe beruhen könnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die Struktur und Dynamik des Interferonrezeptors in vitro für die Typ I Interferone IFNa2 und IFNb charakterisiert. Die Struktur des ternären Komplexes aus den extrazellulären Domänen von ifnar1 und ifnar2 mit IFNa2 wurde mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Über Einzelpartikelanalyse aufgereinigter Komplexe von IFN mit den extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) konnte ein Strukturmodell des ternären Komplexes erstellt werden. Dieses zeigte eine Verschiebung der membranproximalen Domänen von ifnar1-EC und ifnar2-EC wie sie bereits für den Rezeptor für Erythropoietin und den Wachstumsfaktor beobachtet wurden, welche zu den Typ I Zytokinrezeptoren gehören. Die Struktur des ternären Komplexes ermöglicht als erste Struktur eines Typ II Zytokinrezeptors einen Einblick in die Architektur des Komplexes und mögliche Aktivierungsmechanismen. Die Strukturen der Komplexe für die verschiedenen Typ I Interferone IFNa2 und IFNb wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf, was auf einen gemeinsamen Aktivierungsmechanismus hinweist. Temperatur-abhängige Messungen von Bindungskinetik und –affinität ergaben sehr unterschiedliche Energiehyperflächen für die Ligandenbindung an ifnar1- und ifnar2-EC, und wiesen auf einen mehrstufigen Prozess und mögliche Konformationsänderungen bei der Bindung an ifnar1-EC hin. Zur Analyse der Dynamik von ifnar1-EC wurden daher verschiedene fluoreszenzbasierte Assays etabliert. Eine besondere Herausforderung bestand darin, das Protein ortsspezifisch und stöchiometrisch mit zwei verschiedenen Fluorophoren zu koppeln. Ifnar1-EC wurde an verschiedenen Stellen kovalent mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Es wurde gezeigt, dass nach Bindung eines geeigneten tris-NTA-Fluorophor-Konjugats an den C-terminalen His-Tag die Fluoreszenz abstandsabhägig durch Förster-Resonanz-Energie-Transfer gelöscht wurde. Für ifnar1-EC wurde eine ligandeninduzierte Abstandsänderung detektiert. Die detaillierte Analyse ergab nach Bindung von IFNa2 eine Abstandszunahme von 13 A vom N- zum C-Terminus. Durch die Interferonbindung nimmt demnach ifnar1-EC eine gestrecktere Konformation ein. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in Anwesenheit von ifnar2-EC und für IFNb erhalten. Die Einzelmolekülanalysen mittels Fluoreszenz Korrelationsspektroskopie (FCS) zeigten sowohl einen Verlust der Flexibilität von ifnar1-EC nach Ligandenbindung als auch ein ligandeninduziertes Rearangement der Ig-ähnlichen Domänen. Die Änderung der Flexibilität wurde durch Messungen der Fluoreszenzlebensdauer bestätigt. Untersuchungen der Kinetik der Ligand-induzierten Konformationsänderung mittels Stopped-Flow Messungen bestätigten eine mehrstufige Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen nach Ligandenbindung. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass sich nach Ligandenbindung die Zugänglichkeit des Tryptophans in der membranproximalen Domäne von ifnar1-EC ändert. Da die membranproximale Domäne nicht bei der Ligandenbindung beteiligt ist, deutet dieser Effekt auf eine Propagation der Ligand-induzierten Konformationsänderung in diese Domäne hin. Das Tryptophan könnte mit der Membran interagieren, was auf eine wichtige Rolle der membranproximalen Domäne für die korrekte Orientierung von ifnar1 in der Membran hindeut. Die Stopped-Flow Analyse zeigte, dass es sich hierbei um einen einstufigen Prozess handelt, der mit der Interferonbindung korreliert. Die Ergebnisse wiesen insgesamt auf eine Ligand-induzierte Flexibilitätsänderung und Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen bei ifnar1-EC hin. Vermutlich wird nach Ligandenbindung das Signal in die membranproximale Domäne von ifnar1-EC propagiert. Die Strukturen der ternären Komplexe mit den verschiedenen Typ I Interferonen wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf. Auch die Ergebnisse der fluoreszenzbasierten Assays zeigten keine Unterschiede für IFNa2 und IFNb, was die Hypothese stützt, dass die differentielle Aktivität der Interferone nicht auf grundsätzlichen Unterschieden in der Architektur des ternären Komplexes beruht, sondern in der unterschiedlichen Dynamik der Komplexe codiert sein könnte.
Bis zur Entfaltung der Wirkung eines Pharmakons laufen zahlreiche komplexe Vorgänge ab, die sich in drei wesentliche Phasen unterteilen lassen. Die pharmazeutische Phase umfasst mit der Applikation und dem Zerfall der Arzneiform sowie dem Auflösen des Wirkstoffes Vorgänge, die im wesentlichen von den galenischen Eigenschaften des Arzneistoffes abhängen. In der pharmakokinetischen Phase erfolgt mit der Resorption die Aufnahme des Wirkstoffes in den Organismus, dem sich die Verteilung in die unterschiedlichen Gewebe über die Blutbahn anschließt. Durch verschiedene Eliminationsprozesse wird der Wirkstoff zuletzt wieder aus dem Körper ausgeschieden. Mit dem Erreichen des Wirkortes beginnt die pharmakodynamische Phase, in der die pharmakologischen Effekte des Arzneistoffes zur erwünschten klinischen Wirkung führen. Der Nachweis des Pharmakons am Wirkort in klinisch-relevanten Konzentrationen ermöglicht somit Rückschlüsse auf die Wirksamkeit des Arzneistoffes, aber unter bestimmten Voraussetzungen auch auf dessen Wirkmechanismus. Während mittlerweile ein Großteil neuer Arzneistoffe mit Hilfe unterschiedlicher Mechanismen durch exaktes Drug Targeting an den Wirkort gesteuert werden, weisen andere Substanzen teilweise ungewollt eine gewebespezifische, dirigierende Komponente auf, die neben der eigentlichen Hauptwirkung weitere unterstützende oder auch unerwünschte Effekte auslösen. Von besonderem Interesse ist diese Gewebespezifität für pflanzliche Arzneistoffe, deren Wirkkomponenten bislang noch nicht eindeutig bestimmt werden konnten. Gemeinsam mit anderen pharmakologischen Befunden kann der analytische Nachweis eines wirksamkeitsmitbestimmenden Inhaltsstoffes am Wirkort in ausreichenden Konzentrationen ein weiterer deutlicher Hinweis auf dessen Wirkbeteiligung sein. Besonders vor dem Hintergrund einer rationalen, evidenz-basierten Pharmakotherapie, deren Anforderungen die pflanzlichen Arzneien mittlerweile ebenso wie die synthetischen Wirkstoffe erfüllen müssen, ist die Erforschung sowohl des Wirkprinzips als auch der Pharmakokinetik des Wirkstoffes von besonderer Bedeutung. Obwohl Johanniskrautextrakte bereits seit dem 17. Jahrhundert gegen die Melancholie und somit als Antidepressivum eingesetzt wurden, sind sowohl der exakte Pathomechanismus der Depression als auch die Wirkkomponente und der Wirkmechanismus der Extrakte aus Hyperici herba noch immer Gegenstand umfassender Forschung. Vor allem wegen der geringen Nebenwirkungsrate sind Johanniskrautpräparate gegenüber synthetischen Antidepressiva eine bevorzugte Alternative für die Therapie leichter bis mittelschwerer Depressionen. Ähnlich den Effekten der synthetischen Antidepressiva sind Johanniskrautextrakte in der Lage, durch eine Wiederaufnahmehemmung der Neurotransmitter Noradrenalin, Serotonin, Dopamin, sowie GABA und L-Glutamat deren Konzentration im synaptischen Spalt zu erhöhen, was zu einer nachfolgenden adaptiven Veränderung der jeweiligen Rezeptoren führt. In mehreren Studien konnten diese Effekte vornehmlich den Phloroglucinolderivaten Hyperforin und Adhyperforin zugeordnet werden. Unterstützt wurden diese in vitro und in vivo Befunde durch die Ergebnisse einer Vielzahl verhaltenspharmakologischer Untersuchungen, die einen deutlichen Zusammenhang zwischen der Wirksamkeit in antidepressiven Modellen und dem Gehalt an Hyperforin in den Extrakten ergeben haben. Zahlreiche klinische Studien belegen darüber hinaus die Wirksamkeit und Verträglichkeit von Johanniskrautextrakten. ...