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Im Rahmen der Arbeit wurde eine Methodik zur umfassenden und automatischen Identifizierung von nativen Peptiden aus Extrakten komplexer biologischer Quellen entwickelt und am Beispiel des humanen Hämofiltrats angewendet. Die Firma BioVisioN führt seit der Gründung Forschung auf dem Gebiet der Peptide und kleinen Proteine mit dem Ziel, diagnostisch und therapeutisch relevante Substanzen zu finden, durch. Die Analyse sogenannter Peptidome, der qualitativen und quantitativen Beschreibung aller nativen Peptide und kleinen Proteinen bis ca. 15 kDa, ist als Analogon zur Proteom-Analytik zu verstehen, welche sich umfassend mit Proteinen beschäftigt. Quantitativ wird ein Peptidom über die Kombination chromatographischer Trennung und Fraktionierung mit der massenspektrometrischen „Inventarisierung“ der einzelnen Peptidspezies sowie den relativen Konzentrationen in der Probe erfasst, welches an anderer Stelle ausführlich beschrieben ist. Das Ergebnis einer solchen Peptidomanalyse besteht aus einer Peptidkarte, die die Peptide der Probe repräsentativ abbildet. Die Qualität eines Peptidoms wird über die Massen der Peptide, deren Aminosäuresequenzen und Elutionsverhalten und weitere biologische Informationen beschrieben. Zu diesen Zweck wird der Begriff des Peptide-Inventory eingeführt. Ein Inventory besteht aus allen verfügbaren Informationen nativer Peptide einer Quelle. Zu Beginn der Arbeit standen mit der reproduzierbaren Erstellung von Peptidbanken und deren systematischer Kartierung über MALDI-MS bereits zwei Werkzeuge zur Verfügung, um Daten eines Inventories zu erheben. Lediglich für die Erzeugung der Sequenzdaten wurde mit dem Edman-Abbau zwar eine etablierte, aber viel zu langsame und wenig sensitive Methode eingesetzt. Hier wurde der Ersatz durch eine schnelle und leicht zu automatisierenden Methode angestrebt. Die massenspektrometrische Sequenzierung über MS/MS mit anschließender Datenbanksuche ist ein aus der Proteom-Analytik durchaus bekanntes Verfahren, musste aber für die Analyse der nativen Peptide in einigen Bereichen modifiziert werden. Obwohl die Massenspektrometrie Peptide direkt aus komplexen Mischungen heraus identifizieren kann, stellte sich schnell heraus, dass die vorliegende biologische Beispielprobe (humanes Blutfiltrat) zu komplex war, um sie direkt für die geplante Sequenzierung einzusetzen. Es wurde eine erneute Auftrennung und Feinkartierung der Peptidbank notwendig. Jede dritte Fraktion wurde rechromatographiert und anschließend wiederum kartiert. Die entstandenen 97 Peptidkarten enthalten im Linear Modus ca. 100.000 Signale und im Reflektron Modus ca. 30.000 Signale, so dass nach der Feinkartierung > 10.000 native, im menschlichen Körper zirkulierende Peptide durch diese Methode dargestellt werden können. Zur Automatisierung der Kartierungsmessungen mit MALDI-MS wurde im Laufe dieser Arbeit ein Autosampler für ein MALDI-TOF-MS-System entwickelt und implementiert (DiskJockey). Das System hat eine Kapazität von 20 MALDI-Targets und ist vollständig über die Gerätesoftware steuerbar, so dass MALDI-MS-Messungen vollständig automatisiert über mehrere Tage ablaufen können. Zur Erzeugung der Sequenzdaten wurde eine Kombination aus elektrischer Ionenfalle und Datenbanksuche angewendet. Um zu gewährleisten, dass nur die zuvor kartierten Peptide einer MS/MS-Messung unterzogen werden, wurde das Softwaretool Alcatrap entwickelt. Diese Software übernimmt aus MALDI-MS-Messungen die Werte der monoisotopischen Peaks, überführt sie in mehrfach geladene Spezies und erstellt sowohl eine Methode für das MS-Gerät, als auch eine in die Gerätesoftware importierbare Arbeitsliste. Hierbei wird jeweils die Kollisionsenergie in Abhängigkeit der m/z-Wertes dynamisch gesetzt. Um den Datentransfer vom Fragmentspektrum zur Datenbanksuchmaschine zu gewährleisten, wurde mit „D2M“ eine weitere Softwareschnittstelle entwickelt. Die Erstellung des Inventories aus humanem Hämofiltrat liefert 1.225 verschiedene native, im menschlichen Blut zirkulierende Peptide aus 146 Proteinvorläufern. Darunter befinden sich mehrere Peptide, die neben ihrer physiologischen Bedeutung auch eine potenzielle medizinische Relevanz besitzen. Weiterhin ist auch der dynamische Bereich von acht Größenordnungen, in dem Sequenzen erzeugt wurden, vergleichbar mit dem des menschlichen Blutes. Eine Charakterisierung von Peptidomen ist in diesem Umfang bisher noch nicht durchgeführt worden und stellt eine Neuerung in der Proteomforschung dar. Die Studie ist durchaus vergleichbar mit kürzlich veröffentlichten umfangreichen Proteomstudien aus menschlichem Plasma und Serum und stellt eine Ergänzung dieser für den Bereich der Peptide und kleinen Proteine dar. Limitierungen bei der Identifizierung von Peptiden mit der Ionenfalle wurden analysiert und mit der Adaptierung des Peptide-Inventory Konzepts auf hochauflösende Quadrupol-Time-of-Flight Massenspektrometer zufriedenstellend gelöst. In diesem Rahmen wurde eine Methode entwickelt, die es ermöglicht, native Peptide bis zu einem Molekulargewicht von bis zu 8.500 Da direkt aus der komplexen Mischung zu fragmentieren und über eine Datenbanksuche zu identifizieren. Außerdem konnte exemplarisch gezeigt werden, dass durch die größere Massengenauigkeit und das größere Auflösungsvermögen des QTOF die Datenbanksuche wesentlich effektiver ist und durch die Kombination von Rechromatographie und QTOF-MS/MS nahezu jedes Signal einer Peptidbank der Identifizierung zugänlich gemacht werden kann. Sowohl die integrierte Methodik der Herstellung eines Peptide-Inventories, als auch die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse von nativen Peptiden in humanem Blut stellen wissenschaftliche Neuerungen dar, auf denen eine weitergehende Peptidom-Analytik aufsetzen kann.
Auxiliar-vermittelte Synthese von nicht-natürlichen Aminosäuren als Bausteine für RNA-Liganden
(2005)
In den letzten Jahren wurde deutlich, daß mRNAs regulatorische Elemente aufweisen.Ein Beispiel hierfür ist z. B. die Transkription des Human Immunodeficiency Virus Typ1 (HIV-1). Die Arginin-reiche Domäne des Tat-Proteins interagiert hierbei mit einer Bindungstelle innerhalb der Bulge-Region der TAR-RNA. Das Vorliegen des hochkonservierten Tat-TAR-Komplexes ist die Voraussetzung für die effiziente Transkription viraler Gene. Eine kompetitive Bindung synthetischer Liganden an die Bulge-Region sollte daher den viralen Vermehrungszyklus unterbrechen. Hochspezifische Liganden mit inhibitorischem Potential sind somit von größtem Interesse. Für eine hohe Liganden-Affinität sind neben ionischen Wechselwirkungen und HBrücken-Interaktionen vor allem auch Stapelwechselwirkungen (stacking) von entscheidender Bedeutung. Die Ligandensuche wurde auf Tripeptide fokussiert. Da die Anzahl natürlich vorkommender aromatischer Aminosäuren sehr limitiert ist,erfolgte im Rahmen dieser Arbeit zunächst eine stereoselektive Synthese von neuen,nicht-natürlichen Aminosäuren mit heteroaromatischen Seitenketten. Um den generellen Einsatz dieser Bausteine in kombinatorischen Bibliotheken zu demonstrieren,wurden zunächst Tripeptide des Musters Arg-X-Arg hergestellt. Bereits diese Tripeptide zeigten in einem Fluoreszenz-Assay inhibierende Effekte auf den Tat- TAR-Komplex von HIV-1 mit IC50-Werten von 2 - 80 µM. Diese vielversprechenden Liganden wiesen auch in einem Tat-TAR kontrollierten Reportergen-Assay stark inhibierende Wirkung in den Zellkulturen auf. Am Beispiel eines Peptides ließ sich mittels NMR-Spektroskopie eine Komplexkonformation bestimmen, die der des bekannten TAR-Argininamid-Komplexes entspricht. Durch den Einsatz von nichtnatürlichen und Standard-Aminosäuren in kombinatorischen Tripeptidbibliotheken (split and combine-Methode) konnte die Suche von potentiellen Peptid-Liganden um ein Vielfaches erweitert werden. Über ein on-bead-Screening ließen sich weitere vielversprechende TAR-bindende Tripeptide identifizieren. Die RNA-Ligandensuche wurde desweiteren auf die psi-RNA (HIV-1) und auf die mRNA des onkogenen bcr-abl Proteins ausgeweitet. Auch hier konnten einige RNA-bindende Tripeptide isoliert werden.
Beiträge zur Erweiterung der Hückel'schen Theorie der π-Elektronensysteme [Pi-Elektronensysteme]
(1963)
Beiträge zur Erweiterung der Hückel'schen Theorie der Pi-Elektronensysteme Hückel entwickelte 1931 ein Verfahren zur quantenmechanischen Berechnung zahlreicher Eigenschaften von zr-Elektronensystemen. Obwohl die Theorie halbtheoretisch ist, hat sie einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis solcher Eigenschaften von ungesättigten und aromatischen Verbindungen geliefert, die dem Grundzustand der Moleküle zugeschrieben werden können, so z. B. der Resonanzstabilität und der Reaktivität. Doch ist sie nur in der Lage, die Eigenschaften dieser Verbindungen richtig zu beschreiben, die durch angeregte Zustände der Moleküle mitbestimmt werden, wie z. B. die Spektren, wenn man für das Resononanzintegral einen entsprechenden Wert verwendet, der von dem für den Grundzustand benutzten bedeutend abweichen kan. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wird die Hückel'schen Theorie der Pi-Elektronensysteme diskutiert. Einen nur annähernd vollständigen Überblick über die Beiträge zu dieser Theorie zu geben, würde den Rahmen der Arbeit überschreiten. Daher wurde sich im Wesentlichen darauf beschänkt, die Grundgedanken und die Näherungen des Verfahrens klar darzustellen und kritisch zu betrachten, sowie die Anwendungsmöglicheiten zu beschreiben. Hartmann hat 1960 eine Erweiterung der Hückel 'schen Theorie vorgeschlagen, die auch solche Eigenschaften ungesättigter und aromatischer Verbindunsen richtig erfaßt, die aur der Beteiligung angeregter Zustände beruhen, wie am Beispiel der Spektren gezeigt wurde. Im zweiten Teil dieser Arbeit wird die Hückel-Hartmann'sche Theorie der Pi-Elektronensysteme dargestellt und die Ergebnisse mit denen der Hückel'schen Theorie verglichen. Hartmann selbst hat die Erweiterung nur für gleichatomige Pi-Elektronensysteme und unter zahlreichen Vernachlässigunen durchgeführt. Dieser Umstand und die wenigen zu der Theorie erst vorliegenden Arbeiten ließen es wünschensert erscheinen, die Hückel-Hartmannsche Theorie der Pi-Elektronensysteme systematisch und in möglichst allgemeiner Form zu diskutieren. Im dritten Abschnitt der Arbeit wird daher eine Generalisierung der Hückel-Hartmannt'schen Theorie durchgeführt. Mit Hilfe des entwickelten Verfahrens wird anschließend der Einfluß der Überlappungen auf die Ergebnisse untersucht und eine Erweiterung der Hückel-Hartmann'schen Theorie auf heteroatomare Pi-Elektronensysteme angegeben.
Azulen: Für die Orientierungsfehlordnung im Azulen werden mit Kraftfeld-Methoden sowie mit quantenmechanischen Methoden an einem Satz geordneter Kristallstrukturmodelle Gitterenergieminimierung durchgeführt. Die Modelle zeigen sehr ähnliche Gitterenergien. Keine signifikante Nahordnung ist zu erkennen. Es liegt eine statistische Orientierungsfehlordnung vor. Die Auslenkungsparameter in der experimentellen Kristallstruktur werden durch die Überlagerung der berechneten Atompositionen gut reproduziert.
Perinon-Pigmente P.R. 194, P.O. 43 und V.R. 14: Für das cis-Isomer (P.R. 194), das trans-Isomer (P.O. 43) und den Mischkristall (V.R. 14) der Perinone werden geordnete Kristallstrukturmodelle aufgestellt und Gitterenergieminimierung mit Kraftfeld-Methoden sowie quantenmechanischen Methoden durchgeführt.
In der Orientierungsfehlordnung von P.R. 194 zeigen sich kurze Korrelationsreichweiten für alle Richtungen. Die Lokalstruktur wird über Variationen der exakten Positionen und Orientierungen der Moleküle beschrieben. Die experimentellen Auslenkungsparameter werden durch Überlagerung berechneter Atompositionen reproduziert.
Für trans-Perinon sind keine Hinweise auf eine Fehlordnung zu erkennen.
Im Mischkristall der beiden Isomere (Küpenfarbstoff V.R. 14) liegen eine Positions- und eine Orientierungsfehlordnung vor. Quantenmechanische Gitterenergieoptimierungen zeigen zwei Bandbreiten der Gitterenergie für geordnete Kristallstrukturmodelle, getrennt anhand der Orientierung der Moleküle des trans-Isomers. Die ungewöhnlichen experimentellen Auslenkungsparameter und Positionen der Atome werden ebenfalls durch die Überlagerung berechneter Atompositionen gut reproduziert.
Die Nachbarschaftswahrscheinlichkeiten werden über eine statistische Auswertung der Häufigkeiten einzelner Nachbarschaften genähert beschrieben und zeigen stark anisotrope Präferenzen. Die intermolekularen Wechselwirkungen werden mit Kraftfeldmethoden qualitativ charakterisiert und zeigen eine zu den Nachbarschaftswahrscheinlichkeiten sehr ähnliche Anisotropie.
PTCBI: Im cis-Isomer von PTCBI beobachtet man eine dem P.R. 194 ähnliche Orientierungsfehlordnung. Anhand der Ergebnisse der Gitterenergieminimierungen wird eine statistische Fehlordnung angenommen.
Für das trans-Isomer von PTCBI findet man durch Gitterenergieminimierungen ein theoretisches energetisch ungünstiges Polymorph in der Raumgruppe P 21/c.
Für den PTCBI-Mischkristall wird aus der Auswertung von Röntgenpulverdiagrammen eine zum cis-Isomer isotype Struktur abgeleitet. Für diese Struktur wird eine dem V.R. 14 ähnliche Positions- und Orientierungsfehlordnung untersucht. In der statistischen Auswertung der Gitterenergien zeigen alle Modelle vergleichbare und gleichzeitig sehr niedrige relative Wahrscheinlichkeiten. Für die Lokalstruktur sind keine klaren Präferenzen für bestimmte Motive erkennbar. Im PTCBI-Mischkristall wird eine nahezu statistische Fehlordnung erwartet. Die Wechselwirkungen der geordneten zentralen Kohlenstoffgerüste der Perylen-Tetracarbonsäure bestimmen die Packung in cis-PTCBI und im PTCBI-Mischkristall.
P.R. 170: Die Struktur der β-Phase von Pigment Rot 170 besteht aus geordneten Schichten. Die Komponente des Translationsvektors zwischen den Schichten in b-Richtung beträgt entweder ty = +0,421 oder ty = -0,421. Die Abfolge der Translationsvektoren ist weder periodisch noch völlig zufällig.
Gitterenergieminimierungen an kombinatorisch vollständigen Sätzen geordneter Modelle mit einem maßgeschneiderten Kraftfeld werden durchgeführt. Erhaltene Gitterenergien erlauben die Beschreibung der Lokalstruktur durch bevorzugte Stapelsequenzen. Darin beeinflussen die nächsten und übernächsten Nachbarn die Energie und die Geometrie einer einzelnen Schicht.
Relative Wahrscheinlichkeiten (respektive der Entartungen) für endliche lokale Motive werden mit der Boltzmann-Statistik berechnet. So tritt das Motiv + + − mit einer Wahrscheinlichkeit von ca. 61,4% auf, während das Motiv − + − mit einer Wahrscheinlichkeit von ca. 23,3% wesentlich seltener erscheint. Das Motiv + + + ist mit der Wahrscheinlichkeit von ca. 15,3% am seltensten. Mit diesen relativen Wahrscheinlichkeiten werden Strukturmodelle in Superzellen mit bis zu 100 aufeinanderfolgenden Schichten aufgebaut und zur Simulation der Röntgenbeugungsdaten verwendet. Damit werden Pulver- wie Einkristalldaten gut reproduziert, inklusive der diffusen Streuung.
Septulen: Für Septulen werden Unterschiede in der Konformation der Moleküle zwischen der Gasphase und dem Festkörper beobachtet. Berechnungen der Einzelmolekülenergien sowie Gitterenergieminimierungen werden mit rigiden sowie flexiblen Molekülen für beide Konformationen durchgeführt. Die Konformationsänderung zwischen Gasphase und Festkörper bedeutet einen Verlust an Energie, welcher durch die günstigere Packung und durch den Gewinn an Gitterenergie wettgemacht wird. Ähnlich günstige Gitterenergien wurden für die Gasphasen-Konformation nicht gefunden.
Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung und Verfeinerung der Lösungsstruktur der rekombinanten pI=5,1 Isoform des H-FABPs aus Rinderherz. Dabei wurde von Proben mit einem Fettsäuregemisch ausgegangen und somit die HOLO–Form des Proteins untersucht. Der Einsatz von mehrdimensionaler NMR–Spektroskopie zur Bestimmung von Abstandsrandbedingungen, stereospezi…schen Zuordnungen und Diederwinkeln aus 3J–Kopplungskonstanten ermöglichte die Verwendung von 1877 Abstandsrandbedingungen, 52 stereospezifischen Zuordnungen und 81 Diederwinkelbeschränkungen. Die Struktur basiert im Schnitt auf 15 geometrischen Beschränkungen je Aminosäurerest. Mit einem mittleren globalen RMSD–Wert der Rückgratatome von 1,07+-0,15Å und den relativ niedrigen berechneten Energiewerten sind die Ansprüche an eine hochaufgelöste Struktur erfüllt. Vergleiche mehrerer struktureller Kriterienmit 160 Proteinkristallstrukturen haben ergeben, daß die hier bestimmte Lösungsstruktur in ihrer Güte einer Kristallstruktur mit einer Auflösung von etwa 2,4 Å entspricht. Die Molekulardynamiksimulation der energetisch niedrigsten Lösungsstruktur in einer Wassersimulation führte anfangs zu einer raschen Konformationsänderung der Struktur. Diese war gekennzeichnet durch eine Vergrößerung des als Eingangsportal für den Fettsäureliganden postulierten Bereiches. Zugleich wurden zwei weitere kleine Öffnungen erkennbar, welche als Austrittsöffnungen für Wassermoleküle dienen könnten.
Bestimmung der Lösungsstruktur von Rinder-Adrenodoxin durch Auswertung hochaufgelöster NMR-Spektren
(2001)
Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung der Strukturen von RinderAdrenodoxin im oxidierten und im reduzierten Zustand. Die rekombinante Form dieses Elektronentransportproteins aus 128 Aminosäuren und dem [2Fe2S]EisenSchwefel Cluster mit einer Molmasse von 14,4 kDa wurde in E. coli exprimiert. Die hergestellten Proben wurden entweder mit 15 N oder 15 N, 13 Cangereichert, was den Einsatz einer breiten Palette heteronuklearer NMRExperimente ermöglichte. Nach der Zuordnung individueller Werte der chemischen Verschiebung für die NMRaktiven Kerne konnten durch 15 N und 13 Ceditierte dreidimensionale NOESYExperimente 1800 strukturrelevante Interprotonenabstände qualitativ bestimmt werden. Insgesamt konnten 70 Prozent der Resonanzen der NMR aktiven Kerne der jeweiligen Proteinzustände zugeordnet werden. Bedingt durch den paramagnetischen Einfluß des EisenSchwefelClusters waren durch enorme Linienbreiten und sehr schnelle T 1 Relaxationszeiten 30 Prozent der zu erwartenden Signale des Proteins nicht detektierbar. Zusätzlich konnten durch die Anwendung eines ct( 15 N, 1 H)HSQC Experiments weitere 18 Abstandsparameter von Amidprotonen im Einflußbereich des EisenSchwefelCluster, die aber gerade noch detektiert werden konnten, zu dem jeweiligen näheren Eisenkern gewonnen werden. Für die Strukturrechnung mußte der EisenSchwefelCluster künstlich mit der Aminosäure C46 verbunden werden, da das Programm DYANA keine Eisen Atome erkennt. Anschließend wurde dieser 'künstliche' Aminosäurerest neu benannt (CYSC). Diese neue Aminosäure wurde dann nach Energieminimierung in die DYANA Bausteinbibliothek eingebracht. Es zeigte sich, daß der EisenSchwefelCluster die Struktur wie eine 'Klammer' zusammenhält. Ohne die Einbindung des EisenSchwefelCluster kommt es nach der Strukturrechnung zu keiner Struktur, sondern zu einem ungeordneten 'Knäuel'. Bei der Interpretation der Strukturensembles wurde deutlich, daß Rinder Adrenodoxin ein relativ rigides Protein ist. Scheinbar hohe flexible Bereiche im Protein mußten korreliert werden mit den Bereichen des Proteins, die aufgrund von fehlenden Zuordnungen nicht gut genug definiert werden konnten. Es ist somit nicht definitiv zu bestimmen, woher diese Abweichung in den Strukturen herrührt. Allerdings wurde bei der Betrachtung von Aminosäureresten in der Wechselwirkungsdomäne deutlich, daß an den Positionen der Aminosäurereste D72, E73, D76 und D79 es zu Bewegungen beim Übergang aus dem oxidierten in den reduzierten Zustand kommen muß, da speziell die Aminosäurereste D72 und E73 ihre Position dramatisch verändern. Entsprechende Änderungen der Werte der X1 Diederwinkeleinstellungen wurden beobachtet und lokale Ramachandran Diagramme ergeben sich aus den Rechnungen. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß im reduzierten Zustand S112 mit einer T 1 Relaxationszeit von 62,5 ms im Einflußbereich des EisenSchwefelCluster liegen könnte. Ein Hinweis darauf ist auch die Änderung der Geometrie des C Terminus, da im oxidierten Zustand dieser gerade vom Proteinkörper wegweist, während im reduzierten Zustand das Cterminale Ende sich in Richtung Proteinkörper biegt. Bisher wurde angenommen, daß dem CTerminus keine funktionelle Rolle zukommt. Die Struktur des Adrenodoxins wurde nach der Distanzgeometrierechnung unter Berücksichtigung aller experimenteller Daten erhalten. RinderAdrenodoxin ist klassifiziert als ein (alpha beta)Protein welches 22% betaFaltblatt, 17% alphaHelix und 6% 3 10 Helix besitzt. Für den oxidierten und den reduzierten Zustand konnten jeweils 5 betaFaltblätter und 4 Helices identifiziert werden. Beim oxidierten Zustand erstrecken sich die 5 betaFaltblätter auf die Aminosäurereste 812, 1822, 5759, 8889 und 103106, während beim reduzierten Adrenodoxin sie sich auf die Aminosäurereste 612, 2124, 5758, 8889 und 103106 erstrecken. Die 4 identifizierten Helices erstrecken sich im oxidierten Zustand auf die Reste 2935, 6466, 7229 und 98100. Die 4 Helices für den reduzierten Zustand werden durch die Reste 3336, 6164, 7275 und 98100 charakterisiert. Der EisenSchwefelCluster ist kovalent an die vier CysteinReste 46, 52, 55 und 92 gebunden. Mit einem mittleren globalen RMSDWert der Rückgratatome zur Mittelstruktur für das oxidierte Adrenodoxin von 0,94 Å und für das reduzierte Andrenodoxin von 1,53 Å sind die Anforderungen an relativ gut aufgelöste Strukturen erfüllt. Die hier bestimmten Strukturen entsprechen in ihrer Güte einer Kristallstruktur mit der Auflösung von 2.0 Å (Programm PROCHECK) für den reduzierten und den oxidierten Zustand von RinderAdrenodoxin und sind somit zufriedenstellend aufgelöst.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden konformationelle und strukturelle Eigenschaften Biomolekülen Hilfe NMRspektroskopischen und biochemischen Methoden, sowie Synthese Liganden untersucht. Kapitel wurde das Verhalten beiden Hauptkonformere des Dolastatin Gegenwart Tubulin untersucht. wurden sechs neuartige Dolastatin 10Derivate synthetisiert, welche TubulinPolymerisation unterschiedlich inhibieren. Das Protein Tubulin wurde sowohl die vitroBindungsstudien auch für NMR spektroskopischen Experimente isoliert. Verbindungen 35b repräsentieren jeweils und das transKonformer des Dolastatin 10, wobei erstere einen stärke inhibitorischen Effekt der TubulinPolymerisation das lineare Dolastatin Derivat zeigte. Daraus kann man schließen, cisKonformation Dola statin Inhibition der TubulinPolymerisation verantwortlich ist. Durch diese neue Erkenntnis können Dolastatin 10Derivate, welche dem cisKonformer Dolastatin entsprechen, synthetisiert werden und potentielle Krebstherapeutika Anwendung finden. einem zweiten Ansatz wurde das Nmarkierte lineare Dolastatin 10Derivat heteronuclearen zweidimensionalen NMRExperimenten in Gegenwart von DEAE MAPTubulin untersucht. Durch Bestimmung der Korrelationszeiten Konformer Verbindung Gegenwart DEAE und MAPTubulin den beiden Dimensionen gekoppelten 1 H 15 NHSQCSpektren konnte gezeigt werden, cisKonformer von schnellen Austausch gebundenen Form befindet. Gegenwart DEAETubulin stellt man einen erhöhten cisGehalt von fest, welcher auf eine schwache Bindung des Liganden hindeutet. Falle MAP Tubulins der Anteil cisKonformers von Vergleich freien Verbin dung nahezu unverändert. Durch erhöhte Korrelationszeit des cisKonformers Gegenwart von MAPTubulin kann man eine zusätzliche Wechselwirkung mit MAPs annehmen, welche eventuell Bindung betaUntereinheit des Tubulins verstärkt. Außerdem könnte die Wechselwirkung der MAPs mit dem Tubulin durch den Liganden gestört werden. Bei den entsprechenden Messungen mit Cmarkiertem Colchicin in Gegenwart DEAE und MAPTubulin konnte ebenfalls schneller Austausch Liganden gebundenen Form nachgewiesen werden. Hierbei wurde aber kein unterschiedliches Verhalten bei beiden TubulinSorten festgestellt. Die Bindungsstelle Colchicin betaUntereinheit Tubulins unterscheidet sich der Dola statin (Abb. 2.12). Deshalb kann man zusätzliche Wechselwirkungen MAPs ausschließen. Versuche zum Einsatz Vanadat Übergangszustandanalogon Phosphat Spaltreaktion des Hammerhead Ribozyms wurden in Kapitel beschrieben. Zunächst wurden experimentellen Rahmenbedingungen Komplexbildung Vanadat 1,2cisDiolen der Ribose einfachen Nucleosiden und Nucleotiden getestet. konnte gezeigt werden, daß freie Phosphatgruppen Komplexierung Vanadats dem 1,2cisDiol Ribose verhindern. Allerdings stört die Anwesenheit Phosphosäurediestern nicht gewünschte Komplexbildung. Diese Erkenntnisse wurden bei verschiedenen RNAKonstrukten Hammerhead Ribozyms berück sichtigt. Durch Einführung von desoxyRibose den 3'terminalen Nucleosiden konnte Komplexbildung Vanadat den Fällen beobachtet werden, denen erwarten war, wenn sich das Vanadat anstelle Phosphates nach dem A17 Hammerhead Ribozym befindet. konnte gezeigt werden, daß Vanadat Über gangszustandsanalogon Phosphat bei Spaltung Hammerhead Ribozyms gesetzt werden könnte. Bestimmung dreidimensionalen Struktur des Membranproteins Phospholamban CDCl 3 /CD 3 wurde Kapitel 4 beschrieben. Hierbei wurden homo nuclearen zweidimensionalen Spektren gewonnenen Abstandsinformationen NOE Daten Dihedralwinkel aus Kopplungskonstanten verwendet, die Struktur Phospholambans Lösung zu gewinnen. Phospholamban besteht aus zwei alphahelikalen Regionen (Val4Ser16 und Pro21Val49), die über einen betaturn (Typ verbunden sind. Die turnRegion weist eine hohe Flexibilität auf, welche wichtig seine biolo gische Wirkung sein könnte. So könnte hier Annäherung von Enzymen Proteinkinasen oder der ATPase erleichtert werden.
In dieser Arbeit sollte die Bindung von Tetrahydromethanopterinderivaten an zwei Enzyme des methanogenen, CO2-reduzierenden Energiestoffwechselweges strukturell charakterisiert werden. In jenem Stoffwechselweg verläuft die schrittweise Reduktion von CO2 über die Bindung an den C1-Carrier Tetrahydromethanopterin (H4MPT), ein Tetrahydrofolat-Analogon, welches unter anderem in methanogenen Archaeen zu finden ist. Die thermophilen bzw. hyperthermophilen Ursprungsorganismen der untersuchten Enzyme, Methanothermobacter marburgensis, Methanocaldococcus jannaschii und Methanopyrus kandleri, sind aufgrund ihrer Anpassung an extreme Habitate durch spezielle genomische, strukturelle und enzymatische Eigenschaften von strukturbiologischem Interesse. Beim ersten in dieser Arbeit untersuchten Enzym handelte es sich um den aus acht Untereinheiten bestehenden membrangebundenen N5-Methyl-H4MPT:Coenzym M-Methyltransferasekomplex (MtrA-H). Dieser katalysiert in einem zweistufigen Mechanismus den Methyltransfer von H4MPT zum Co(I) der prosthetischen Gruppe 5’-Hydroxybenzimidazolylcobamid (Vitamin B12a), um die Methylgruppe dann auf Coenzym M zu übertragen. Gleichzeitig findet ein der Energiekonservierung dienender vektorieller Natriumtransport über die Membran statt. Für den Mtr-Komplex aus M. marburgensis (670 kDa) lag bereits ein Protokoll zur Reinigung unter anaeroben Bedingungen vor. Dieses wurde im Rahmen dieser Arbeit verbessert, für die Isolierung und Reinigung unter aeroben Bedingungen vereinfacht und für die Erfordernisse der zur Strukturbestimmung verwendeten elektronenmikroskopischen Einzelpartikelmessung optimiert. Neben der Präparation des kompletten Komplexes MtrA-H wurde als Alternative die Präparation des Enzymkomplexes MtrA-G unter möglichst vollständiger Abtrennung der hydrophilsten Untereinheit MtrH gewählt. Mit der zu diesem Zweck entwickelten Methode konnte das Abdissoziieren von MtrH besser als im etablierten Protokoll kontrolliert und somit die Homogenität der Probe deutlich verbessert werden. Dies schafft zum einen die Vorraussetzungen für eine Kristallisation zur Röntgenstrukturanalyse, zum anderen war auch in bei der elektronenmikroskopischen Einzelpartikelmessung erkennbar, dass mit dem Mtr-Komplex ohne MtrH bessere Ergebnisse zu erzielen sind. Parallel zu den Untersuchungen am Gesamtkomplex sollten die den Cobamid-Cofaktor bindende Untereinheit MtrA sowie die H4MPT-bindende Untereinheit MtrH in für die Kristallisation und röntgenkristallographische Untersuchung ausreichender Menge und Qualität gereinigt werden. Hierfür wurden MtrA und MtrH aus oben genannten Organismen für die heterologe Expression in E. coli kloniert, die Expressionsbedingungen optimiert und Reinigungsprotokolle etabliert. Anschließend wurden die Untereinheiten umfangreichen Kristallisationsversuchen unterzogen. Die Untereinheit MtrA aus M. jannaschii konnte ohne die C-terminale Transmembranhelix als lösliches Protein in E. coli produziert und als Holoprotein bis zur Homogenität gereinigt werden. Bei M. kandleri MtrA gelang die Herstellung von geringen Mengen teilweise löslichen StrepII-Fusionsproteins ohne C-terminale Transmembranhelix in E. coli. Eine Produktion der Untereinheit MtrH in E. coli als lösliches Protein war bei keiner der in dieser Arbeit getesteten Varianten möglich. Mit dem in Einschlusskörperchen exprimierten Protein aus M. marburgensis wurde eine Reinigung und Rückfaltung versucht. Auch eine Co-Expression der Untereinheiten MtrA und MtrH, durch welche eine bessere Faltung und Löslichkeit erreicht werden sollte, war nur in Einschlusskörperchen möglich. Das zweite in dieser Arbeit untersuchte Enzym, die F420 abhängige N5,N10 Methylen-H4MPT-Dehydrogenase (Mtd), katalysiert den reversiblen, stereospezifischen Hydrid-Transfer zwischen reduziertem F420 (F420H2) und Methenyl-H4MPT+, welches hierbei zu Methylen-H4MPT reduziert wird. Die Reaktion verläuft über einen ternären Komplex bestehend aus Protein, Substrat (Methylen-H4MPT) und Cosubstrat (F420), welcher strukturell charakterisiert werden sollte. Das gereinigte, rekombinante Enzym aus M. kandleri wurde mit verschiedenen H4MPT- und F420-Derivaten co-kristallisiert, die Struktur des ternären Komplexes röntgenkristallographisch bestimmt und die Bindung von H4MPT und F420 analysiert. Methenyl-H4MPT+ und F420H2 sind in der in dieser Arbeit gelösten Kristallstruktur in katalytisch aktiver Konformation gebunden, jedoch kann bei einer Auflösung von 1,8 Å nicht beurteilt werden, ob Methylen-H4MPT und F420 oder Methenyl-H4MPT+ und F420H2 vorlagen. Ein Vergleich mit der Struktur von M. kandleri-Mtd (KMtd) ohne Substrat und Cosubstrat ergab nur äußerst geringe Abweichungen in der Proteinkonformation, sodass sich KMtd überraschenderweise als Beispiel für ein Enzym mit ungewöhnlich starrer, vorgegebener Bindetasche erwies.
Das Steroid-Hormon 17ß-Estradiol ist maßgeblich an der Entstehung und Entwicklung von Brustkrebs beteiligt. Die intrazelluläre Verfügbarkeit des aktiven Estrogens, 17ß-Estradiol, wird durch die 17ßHydroxysteroiddehydrogenase (17ßHSDl) reguliert, die die NADPH-abhängige Reduktion von Estron zu Estradiol katalysiert. Damit stellt die 17ßHSD1 einen interessanten Ansatzpunkt für die Entwicklung neuer Inhibitoren im Hinblick auf potente Wirkstoffe gegen Brustkrebs dar. Die 17ß-Hydroxysteroiddehydrogenase 2 bevorzugt hingegen die oxidative Aktivität und wandelt die biologisch aktiven Hydroxysteroide wie Estradiol in ihre inaktiven Ketoformen um. Ein möglicher Inhibitor der 17ß-HSD1 sollte demnach die Funktion der 17ß-HSD2 nicht beeinträchtigen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Strategien und Methoden entwickelt, die 17ßHSD1 durch heterologe Expression erstmals in E. coli darzustellen. Durch NMR-Spektroskopie in Kombination mit Docking konnten detaillierte Aussagen über die Bindungsepitope der untersuchten Liganden gemacht werden. Diese Informationen sind für eine gerichtete Optimierung von Leitstrukturen von großer Bedeutung.
Heute gewinnen pflanzliche Arzneimittel im Zeichen einer verstärkten Hinwendung zu natürlichen, relativ nebenwirkungsarmen Medikamenten zunehmend an Bedeutung, so auch die über Jahrtausende hinweg traditionell angewandte Ginsengwurzel (Panax ginseng) und der Indische Weihrauch (Boswellia serrata). Neben der Struktur- und Extraktanalytik konzentriert sich die Forschung in zunehmenden Maße darauf, die zahlreichen pharmakologisch untersuchten und klinisch beobachteten Wirkungen dieser beiden Arzneipflanzen einzelnen Inhaltsstoffen zuzuordnen. Bei der Ginsengwurzel gestaltet sich dies jedoch besonders schwierig. Dies ist begründet durch die große Anzahl strukturell ähnlicher Ginsenoside sowie durch deren unterschiedlicher Metabolismus. Zwar ist aus In-vitro-Experimenten bekannt, daß die Degradation über die stufenweise Deglukosylierung stattfindet, allerdings ist bislang nicht geklärt, ob intakte Ginsenoside überhaupt resorbiert werden und welche der vielen in vitro ermittelten Degradationsprodukte tatsächlich den systemischen Kreislauf erreichen. Anders als bei Ginseng, kann die therapeutische Wirkung des Indischen Weihrauches wohl definierten Inhaltsstoffen, AKBA und KBA, zugeschrieben werden. Dennoch mangelt es hier an verlässlichen pharmakokinetischen Daten, da bislang keine validierte bioanalytische Methode zur Verfügung stand. Im Rahmen der Bioanalytik von Ginsenosiden und Boswellliasäuren kamen in der vorliegenden Arbeit die Nano-ESI-MS(n)-Technik sowie die HPLC-Analytik zur Anwendung. Bereits bei der Strukturanalyse von Ginsenosiden erwies sich die Kombination der Nano-ESI-Technik mit MS(n)-Experimenten in einer Quadrupol-Ionenfalle als besonders vorteilhaft. Im Vergleich zu konventionellem ESI bietet Nano-ESI nicht nur den Vorzug, mit kleinsten Substanzmengen lange Messungen durchführen zu können, sondern auch den Vorteil einer effektiveren, weniger diskreminierenden Ionisation. Sowohl die hohe Sensitivität der Nano-Elektrosprayionisierung bei der Analyse von glykosidischen Verbindungen als auch die umfangreichen Strukturinformationen infolge mehrerer aufeinanderfolgender stoßinduzierter Fragmentierungen machen diese Technik zu einer attraktiven und effizienten Methode zur Analyse von Ginsenosiden. In MS(n)-Experimenten äußert sich das charakteristische Fragmentierungsverhalten der Ginsenoside in der sequentiellen Abspaltung der Zuckereinheiten in sukkzessiven Fragmentierungsschritten. Mit dieser Methode konnten die Zuckerketten an verschiedenen Positionen des Protopanaxadiol- bzw. Protopanaxatriolaglykons der Ginsenoside identifiziert, die glykosidischen Verknüpfungen innerhalb der einzelnen Zuckereinheiten durch spezifische Ringfragmente bestimmt und die genaue(n) Verknüpfungsposition(en) enzymatisch eingeführter Galaktose(n) lokalisiert werden. Bisher wurden allerdings Nano-ESI-MS/MS bzw. MS(n)-Untersuchungen primär an wässrigen oder organischen Lösungen von isolierten / aufgereinigten Stoffen oder Stoffgemischen durchgeführt. In dieser Arbeit wurde erstmals diese Technik in der Bioanalytik zur Identifizierung von Ginsenosiden und deren Degradationsprodukte in Humanplasma und -urin angewandt. Obwohl die optimale Analytkonzentration für die Nano-Elektrosprayionisierung im allgemeinen bei 10-5M liegt, ist es gelungen, die Ginsenoside anhand ihrer spezifischen Fragmentionen im MS/MS Modus bis zu einer Konzentration von 2 ng/mL (10-8M) in biologischen Matrices nachzuweisen. Auch wenn die Molekülionenpeaks bei diesen geringen Konzentrationen im Rauschen untergehen, können die Ginsenoside durch selektive Isolierung der gewünschten Vorläuferionen und deren anschließende Fragmentierung in der Quadrupol-Ionenfalle auf der Basis der Detektion spezifischer Fragmente identifiziert werden. Da bei der Fragmentierung der gleichen Vorläuferionenmasse in Leerplasma bzw. Urin keine charakteristischen Fragmentionen gebildet werden, handelt es sich somit um einen spezifischen Nachweis der Ginsenoside in biologischen Matrices. Vor dem Hintergrund dieser vielversprechenden Vorversuche wurde eine Pilotstudie zum qualitativen Screening von Ginsenosiden und deren Metaboliten in Humanplasma und –urin durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, daß Protopanaxatriol-Ginsenoside sowohl im Magen hydrolysiert als auch intestinal degradiert werden. Schon in den ersten Stunden nach der einmaligen oralen Einnahme von Ginsana G115 Kapseln wurden die Hydrolyseprodukte G-Rh1 und hydratisiertes G-Rh1 in Humanplasma detektiert. Die schnelle Resorption dieser beiden Verbindungen aus dem oberen Gastrointestinaltrakt deutet auf die Hydrolyse des Ginsenosides Rg1 im Magen hin. Das spätere Auftreten eines weiteren monoglukosylierten Protopanaxatriols, des Degradationsproduktes G-F1, liefert den ersten In-Vivo-Hinweis auf einen intestinalen Metabolismus von Protopanaxatriol-Ginsenoside. Im Gegensatz zu den Protopanaxatriolginsenosiden passieren die Protopanaxadiol-Ginsenoside den Magen unverändert, wie aus der Abwesenheit jeglicher Protopanaxadiol-Degradationsprodukte im Plasma und Urin in den ersten Stunden nach der Applikation geschlossen werden kann. Erst im unteren Gastrointestinaltrakt werden Protopanaxadiol-Ginsenoside durch intestinale Bakterien zu „Compound-K“ abgebaut und anschließend resorbiert. Der Nachweis von Ginsenosid Rb1 im Plasma, sowie weiterer Ginsenoside im Urin eines Probanden zeigt, daß auch Ginsenoside in ihrer intakten Form resorbiert werden können. Dennoch sind weitere Studien hierzu notwendig, um zu klären, ob die Resorption intakter Ginsenoside die Regel oder eher eine Ausnahme darstellt. Mit der Identifizierung des Hydrolyseproduktes G-Rh1, der Degradationsprodukte G-F1 sowie „Compound-K“ in Humanplasma und -urin konnte schließlich die Frage geklärt werden, welche der zahlreichen in vitro bestimmten Degradationsprodukte tatsächlich den systemischen Kreislauf erreichen. Damit ist die Basis für eine spätere Quantifizierung dieser Verbindungen nach ihrer Isolierung bzw. Herstellung und Charakterisierung als Referenzsubstanzen geschaffen. Außerdem können diese neuen Erkenntnisse helfen, pharmakologische Ergebnisse aus In-vitro-Versuchen mit In-vivo-Daten besser zu korrelieren, da sie erste Hinweise geben, welche der in vitro getesteten Substanzen für die in vivo beobachteten Effekte verantwortlich sein könnten. Bisher wurde Nano-ESI-MS(n) in der Bioanalytik pflanzlicher Arzneistoffe nicht eingesetzt. In dieser Arbeit wurde diese Technik erstmals zum Screening von Ginsenosiden und deren Degradationsprodukte in Humanplasma und –urin benutzt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß Nano-ESI-MS(n) auch eine empfindliche und sensitive Methode zur Identifizierung und zum Nachweis anderer medizinisch relevanter glykosidischer Verbindungen in biologischen Matrices darstellt, woraus sich neue Perspektiven für den Einsatz dieser Technik in der Metabolitenforschung sowie in der Bioanalytik pflanzlicher Xenobiotika ergeben. In den letzten Jahren rückte auch der Indische Weihrauch immer mehr in den Mittelpunkt des wissenschaftlichen sowie therapeutischen Interesses. Aufgrund der selektiven Hemmung der 5-Lipoxygenase gewinnen AKBA und KBA, als neue entzündungshemmende Verbindungen, zunehmend an Bedeutung. Während die quantitative Analytik der Boswelliasäuren in Extrakten und in verschiedenen Fertigarzneimitteln erhebliche Fortschritte erzielen konnte, fehlten auf dem Gebiet der Bioanalytik bislang validierte analytische Methoden zur Durchführung pharmakokinetischer Studien. Vor diesem Hintergrund wurde eine HPLC-Methode zur Bestimmung von KBA in Humanplasma entwickelt und validiert. Die Methode ist durch eine einfache Probenvorbereitung gekennzeichnet, die sich auf eine Festphasenextraktion der KBA aus der komplex zusammengesetzten biologischen Matrix beschränkt. Im Anschluß an die chromatographische Trennung auf einer RP-C18 Säule erfolgt die Quantifizierung der KBA mittels UV-Detektion bei 250 nm. Um eine adäquate Bestimmung der KBA in Humanplasma zu gewährleisten, wurde eine umfassende Validierung durchgeführt. Alle ermittelten Validierungsparameter, wie Spezifität, Linearität, Präzision, Richtigkeit, Reproduzierbarkeit, untere Quantifizierungsgrenze und Stabilität lagen innerhalb der vorgegebenen Grenzen. Damit erfüllt die entwickelte HPLC-Methode die allgemein gültigen Anforderungen an die Validierung bioanalytischer Methoden. Mit der Erstellung einer Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve im Rahmen einer ersten Pilotstudie konnte diese Methode zudem ihre praktische Anwendbarkeit unter Beweis stellen. Somit steht für zukünftige pharmakokinetische Studien eine validierte HPLC-Analytik zur Bestimmung von KBA, einer der Hauptwirkstoffe des Indischen Weihrauches, zur Verfügung, die sich durch hohe Spezifität, Reproduzierbarkeit und Präzision auszeichnet. Verlässliche Daten zur Pharmakokinetik am Menschen sind heute von besonderer Bedeutung, da sie helfen, die Dosierung zu optimieren, die biopharmazeutischen Eigenschaften von Präparaten zu verbessern und die Sicherheit bei der Anwendung zu erhöhen. Insbesondere im Hinblick auf bereits festgestellte Interaktionen von pflanzlichen Arzneimitteln mit Medikamenten reicht es nicht mehr aus, wenn sich pflanzliche Arzneimittel, wie beispielsweise Ginseng und Indischer Weihrauch, nur auf ihre langjährigen tradierten Anwendungserfahrungen berufen. So wird auch bei Phytopharmaka in verstärktem Maße eine wissenschaftliche Absicherung durch bioanalytische Forschung erwartet. Mit der Identifizierung der Ginsenoside und deren Degradationsprodukte im Menschen, der erstmaligen Anwendung von Nano-ESI-MS(n) in der Metabolitenforschung und der Entwicklung einer validierten bioanalytischen Methode zur Bestimmung der 11-Keto-Beta-Boswelliasäure in Humanplasma wurde diesen Erfordernissen Rechnung getragen.
Pflanzliche Arzneimittel erfreuen sich nach wie vor einer großen Beliebtheit. Da sie sich in enger Konkurrenz zu den auf Wirksamkeit und Unbedenklichkeit untersuchten chemisch definierten Arzneistoffen befinden, reicht es heute häufig nicht mehr aus, wenn Phytopharmaka sich nur auf ihre tradierte und dokumentierte Verwendung berufen. „Rationale“ Phytopharmaka müssen dieselben Anforderungen erfüllen, wie synthetische Arzneimittel. Das führt dazu, dass sich die Forschung neben der Aufklärung der chemischen Strukturen und Zusammensetzung der Pflanzenzubereitung, darüber hinaus auch der in-vitro und in-vivo Wirkung von Phytopharmaka widmet. Bei einigen dieser Untersuchungen konnte nicht nur die Wirkung des untersuchten Phytopharmakons aufgeklärt, sondern ebenso neue Indikationsgebiete eröffnet werden. So führte die Aufklärung des Wirkmechanismus des traditionell in der indischen Volksmedizin als Antirheumamittel angewandten Boswellia serrata-Extraktes dazu, dass Weihrauchzubereitungen heute in klinischen Studien auf Ihre Wirksamkeit bei der Behandlung des peritumoralen Hirnödems geprüft werden. In vorausgegangenen Tierstudien und klinischen Pilotstudien mit Glioblastom-Patienten konnte nämlich eine Reduktion des Hirnödems unter Weihrauchtherapie beobachtet werden. Die antiinflammatorischen, zytostatischen wie auch antiödematösen Effekte werden den im Weihrauch enthalten Boswelliasäuren zugeschrieben. Vor allem die ketylierten Boswelliasäuren KBA und AKBA zeigen in in-vitro Untersuchungen eine sehr hohe Wirksamkeit und gelten deshalb auch als Leitsubstanzen in der Monographie Boswellia serrata des DAC. Während einige Daten zur Bioverfügbarkeit von KBA bereits vorliegen, reichen die bisher zur Verfügung stehenden analytischen Methoden nicht aus, um die wesentlich geringere AKBA-Konzentration im Plasma zu bestimmen. Des Weiteren fehlte bisher der Nachweis, ob die Keto-Boswelliasäuren die Blut-Hirnschranke in der Tat überwinden können, um im ZNS zu wirken. Für die parallele Bestimmung von KBA und AKBA aus Plasma und Hirnmatrix wurde deshalb in dieser Arbeit eine sensitive analytische Methode entwickelt und gemäß internationalen Richtlinien validiert. Diese Methode ist charakterisiert durch eine sehr einfache Probenaufarbeitung mittels sorbensgestützter Flüssig-Flüssig-Extraktion auf Kieselgurbasis, gefolgt von einer chromatographischen Trennung auf einer RP-18-Säule und einer massenspektrometrischen Detektion anhand der Übergänge m/z 471,2 --> 95,1 für KBA und m/z 513,4 --> 91,1 für AKBA im positiven MRM-Modus. Die Quantifizierung erfolgte über die pentazyklische Triterpensäure „Asiatische Säure“, die als interner Standard eingesetzt wurde. Bei der anschließenden Validierung konnte die Spezifität der Methode nachgewiesen, sowie die international anerkannten Grenzen für die Linearität, die Nachweisgrenze sowie die inter- und intraday Präzision und Richtigkeit eingehalten werden. Die Stabilität der Plasma- und Hirnproben konnte bei T=-20°C für fünf Monate, bei Raumtemperatur für 24 Stunden und nach mehreren Einfrier-Auftauzyklen belegt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die entwickelte analytische Methode zur Aufnahme von Plasma-Spiegel-Kurven von KBA und AKBA nach oraler Administration von Weihrauchzubereitungen eingesetzt werden kann. Gegenüber den bereits beschriebenen HPLC-UV- und GC-MS-Methoden besitzt die neu entwickelte Methode den Vorteil, dass mit der Nachweisgrenze von 5 ng/ml für KBA und AKBA, auch die Plasmakonzentrationen von AKBA erstmals valide erfasst werden konnten. Da sie darüber hinaus eine einfache Probenaufarbeitung mit einer kurzen Analysenzeit von 6 Minuten verbindet, ist sie für die Durchführung von Pharmakokinetikstudien gut geeignet. Wie wichtig derartige pharmakokinetische Studien für die Etablierung von Weihrauch als rationales Phytopharmakon sind, erbrachte der Vergleich der Bioverfügbarkeit von H15™-Ayurmedica mit einem Referenzpräparat. Hierbei wurde deutlich, dass für die Resorption von KBA und AKBA neben der Extraktzusammensetzung auch die Arzneiform eine entscheidende Rolle spielt. Für die Zukunft stellt daher die Erhöhung der Bioverfügbarkeit von KBA und AKBA z.B. durch eine verbesserte technologische Formulierung einer der wichtigsten Meilensteine im Sinne einer verbesserten Therapie mit Weihrauchextrakt dar. Im Hinblick auf die potentielle Indikation von Boswellia serrata Extrakt für die Therapie des tumor-assoziierten Hirnödems wurde darüber hinaus untersucht, ob die beiden Keto-Boswelliasäuren die Blut-Hirn-Schranke überwinden und in das Hirn gelangen können. Dazu wurden die Konzentrationen von KBA und AKBA im Hirn nach einem Fütterungsversuch an neun gesunden Ratten bestimmt. Es konnten Spiegel von 99 ng/g für KBA und 95 ng/g für AKBA drei Stunden nach Gabe von 240 mg/kg Körpergewicht H15™-Ayurmedica detektiert werden. Bei gliominplantierten Ratten konnte mit der 3-mal täglichen Gabe dieses Präparates in dieser Dosierung eine Reduktion des Ödemvolumens, eine Zunahme von apoptotischen Zellen und eine Verlängerung der Überlebenszeit beobachtet werden. Interessant ist deshalb auch die Frage, wie es sich mit den Konzentrationen der Keto-Boswelliasäuren in Tumorgeweben verhält. Zur Klärung dieses Aspektes könnte die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte LC-MS/MS-Methode beitragen. Häufig können die Chemotherapeutika in den Tumorzellen nicht die Spiegel des gesunden Gewebes erreichen. Dies kann in vielen Fällen in Verbindung mit der Effluxpumpe P-Glycoprotein (Pgp) gebracht werden. Dieses membranständige Transportprotein hindert Arzneistoffe daran in das Cytoplasma zu gelangen. Inwieweit eine Pgp vermittelte Resistenz bei den Glioblastomen eine Rolle spielt, ist derzeit noch nicht vollständig geklärt. Pgp ist darüber hinaus in seiner physiologischen Funktion an der schnellen Ausscheidung von Fremdstoffen und am Schutz spezieller Kompartimente, wie dem Gehirn, beteiligt. Eine Interaktion von Arzneistoffen mit Pgp kann deshalb auch die Pharmakokinetik dieser Substanzen empfindlich beeinflussen. Unter diesen Gesichtspunkten wurden in dieser Arbeit auch die pharmakologisch wichtigen Inhaltsstoffe des Weihrauchextraktes auf eine mögliche Modulation der Pgp-Funktion untersucht. Dieser Test erfolgte mittels zellbasierten Calcein-AM-Assays in Schweinehirnendothel-Zellen (PBCEC-Zellen) und in einer Pgp-expremierenden humanen Leukämiezelllinie (VLB-Zellen). In beiden Zellsystemen erwies sich Weihrauchextrakt (84Mikrogramm/ml H15™-Ayurmedica) als ein Modulator der Transportfunktion von Pgp. Bei der Untersuchung der einzelnen Boswelliasäuren, stellte sich heraus, dass die im Extrakt am häufigsten vorkommenden Beta-Boswelliasäuren und Acetyl-Beta-Boswelliasäuren für diesen Effekt nicht verantwortlich sind. Auch die Alpha-Boswelliasäure und Acetyl-Alpha-Boswelliasäure beeinflussen ebenfalls die Transportaktivität nicht. Eine Interaktion mit dem Transportprotein konnte dagegen bei den Keto-Boswelliasäuren KBA (10 MikroM) und AKBA (3 MikroM) in den Schweinehirnendothelzellen beobachtet werden. In der Leukämiezelllinie konnte bei beiden Keto-Boswelliasäuren ebenfalls einen Einfluss auf die Transportaktivität des Pgp festgestellt werden, der allerdings nur bei AKBA (3 MikroM) signifikant war. Um zu verifizieren, ob die 11-Ketogruppe für die modulierende Wirkung der Boswelliasäuren verantwortlich ist, wurde Glycyrrhetinsäure, eine pentazyklische Triterpensäure, die wie KBA und AKBA eine Ketofunktion an Position 11 besitzt, getestet. Da im Calcein-AMAssay bei dieser Substanz ein mit AKBA vergleichbarer Effekt auftrat, scheint für eine Wechselwirkung des P-Glycoproteins mit Boswelliasäuren die 11-Ketogruppe essentiell zu sein. In dieser Arbeit wurde ein erster Hinweis auf eine Wechselwirkung zwischen Keto-Boswelliasäuren und Pgp erbracht. Inwiefern diese in-vitro-Daten auch auf in-vivo klinische Relevanz besitzen, muss noch in weiteren Studien mit Weihrauch geklärt werden. Gerade für die Behandlung des peritumoralen Hirnödems von Glioblastom-Patienten wäre es wichtig, den Mechanismus der Wechselwirkung von KBA und AKBA mit P-Glycoprotein näher zu untersuchen. Da Weihrauchextrakt häufig in der Co-Medikation verwendet wird, sollte auch im Hinblick auf die Arzneimittelsicherheit geprüft werden, ob es zu Arzneimittelinteraktionen auf Pgp-Ebene mit Weihrauchextrakt kommen kann.
Biochemical and functional analysis of the ubiquitin binding properties of the NF-κB regulator NEMO
(2012)
Posttranslationale Modifikationen regulieren wesentliche Eigenschaften von Proteinen, wie z. B. Lokalisation, Konformation, Aktivität, Stabilität und Interaktionsfähigkeit. Eine besondere Form der Proteinmodifikation ist die Ubiquitylierung, bei der das kleine Protein Ubiquitin mit seinem C-Terminus kovalent an ein Substratprotein gebunden wird.
Die am besten untersuchte Funktion der Ubiquitylierung ist die Markierung eines Substrates für den Abbau durch das Proteasom. In den letzten Jahren wurde jedoch entdeckt, dass Ubiquitylierung in vielen Bereichen der Zelle eine wichtige Rolle spielt. Dazu gehören der Transport von Vesikeln, die Reparatur von DNA-Schäden und zelluläre Signalübertragung. Ubiquitin kann verschieden-artige Ketten bilden, indem ein Ubiquitin an eines der sieben Lysine (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63) oder den N-Terminus eines anderen gebunden wird. Diese unterschiedlichen Kettentypen regulieren verschiedene Prozesse. Z. B. dienen K48-verknüpfte Ubiquitinketten als Signal für den proteasomalen Abbau, wohingegen über K63 verknüpfte Ketten hauptsächlich eine Rolle bei Signalübertragungen spielen.
Die meisten Funktionen die durch Ubiquitylierung reguliert werden, werden durch Ubiquitinrezeptoren vermittelt, die eine Ubiquitinbindedomäne (UBD) besitzen. Manche UBDs binden selektiv nur einen Ubiquitinkettentyp und sind somit in der Lage gezielt Prozesse regulieren zu können, indem sie nur durch diesen speziellen Kettentyp aktiviert werden.
Das Protein NEMO ist ein Ubiquitinrezeptor, dessen UBD UBAN selektiv bestimmte Ubiquitinketten bindet. NEMO spielt eine zentrale Rolle bei der Aktivierung der Transkriptionsfaktorfamilie NF-κB, indem es den IKK-Kinasekomplex reguliert. Dieser Kinasekomplex sorgt durch die Phosphorylierung des NF-κB-Inhibitors IκBα für dessen proteasomalen Abbau, wodurch schließlich NF-κB aktiviert wird. Die NF-κB-Aktivierung kann u. a. durch den TNF-Rezeptor (TNFR) induziert werden. Am aktivierten TNFR werden viele Proteine durch verschiedene Ubiquitinketten modifiziert. Bisher wurde angenommen, dass die spezifische Bindung von NEMO an K63-verknüpfte Ubiquitinketten ausschlaggebend für die Aktivierung von IKK ist. Jedoch spielen lineare Ubiquitinketten, die über den N-Terminus verknüpft sind, auch eine wichtige Rolle bei der Aktivierung von NF-κB und die UBAN von NEMO hat eine sehr hohe Affinität zu linearen Ubiquitinketten.
Um die genauen Vorgänge zu verstehen, die zur Aktivierung von NF-κB am TNFR führen, ist es nötig, zu analysieren, welche Proteine mit welchen Ubiquitinketten modifiziert werden und welche Ubiquitinrezeptoren daran binden.
In dieser Studie sollte detailliert untersucht werden, mit welchen Ubiquitin-ketten NEMO bevorzugt interagiert. Dazu wurden in vitro-Bindungsstudien mit bakteriell aufgereinigtem NEMO und verschiedenen Ubiquitinketten durchgeführt. Des Weiteren sollte geprüft werden, wie die Bindung von NEMO an bestimmte Ubiquitinketten die Aktivierung von NF-κB reguliert.
Dabei ergab sich, dass sowohl NEMO in voller Länge, als auch die UBAN, bevorzugt mit linearen Ubiquitinketten interagieren, wohingegen die Interaktion von NEMO mit anderen Ubiquitinketten relativ schwach ist. Ausgehend von einer Kristallstruktur eines Komplexes aus der NEMO-UBAN und linearem di-Ubiquitin, wurden NEMO-Mutanten generiert, die seletkiv die Bindung von NEMO an lineare Ubiquitinketten verhindern, während die schwache Bindung von NEMO an längere K63-verknüpfte Ketten erhalten blieb. Um die Relevanz der Interaktion von NEMO mit linearen Ubiquitinketten für die Aktivierung von NF κB zu überprüfen, wurden diese NEMO-Mutanten dann verwendet um Zellen die kein NEMO exprimieren zu rekonstituieren. Nach Stimulation dieser Zellen mit TNFα wurde NF-κB kaum aktiviert, womit gezeigt werden konnte, dass NEMO gezielt an lineare Ubiquitinketten binden muss, um NF-κB zu aktivieren. Zusätzlich zu seiner Rolle bei der Aktivierung von NF-κB ist NEMO ein wichtiger Inhibitor der durch den TNFR induzierten Apoptose. In dieser Studie wurde gezeigt, dass diese Apoptoseinhibierung abhängig von der Bindung von NEMO an lineare Ubiquitinketten ist, da die Zellen die NEMO-Mutanten exprimierten, die keine linearen Ketten binden können, durch Apoptose starben, währen Wildtyp-Zellen überlebten.
Zusammenfassend konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass NEMO bevorzugt und mit vergleichsweise hoher Affinität an lineare Ubiquitinketten bindet und dass diese spezifische Bindung wichtig für die Inhibierung von TNFR-induzierter Apoptose sowie für die Aktivierung von NF-κB ist.
Apoptose ist für grundlegende Prozesse des Lebens wie die Embryonalentwicklung und die Infektabwehr unentbehrlich. Defekte im Apoptoseprozess haben ernste Erkrankungen wie z.B. Krebs zur Folge. Ein charakteristisches Kennzeichen von Krebszellen ist deren Apoptoseresistenz, die verhindert, dass Krebszellen auf natürlichem Wege vernichtet werden. Die Tumorzellen reagieren im allgemeine nicht mehr auf Zelltod-Signale, die z. B. bei Nähr- und Sauerstoffmangel oder einem Angriff durch Effektorzellen des Immnunsystems empfangen werden. Ein wesentlicher Grund dafür sind Mutationen im Signalweg der Apoptose. Häufig wird in Tumoren die Überaktivierung von antiapoptotischen Proteinen beobachtet. Die Aufklärung der Apoptose-Signalwege und die Charakterisierung der ihnen zu Grunde liegenden molekularen Interaktionsmechanismen sind wichtig für die Erklärung der Pathogenesse vieler Erkrankungen. Daher ist es von großem Interesse, neue anti-apoptotische Proteine zu identifizieren, die als Targets zur Entwicklung alternativer therapeutischer Strategien benutzt werden können. Ein wichtiger Bestandteil des Apoptoseweges ist das Mitochondrium. Ausgangspunkt für den mitochondrialen oder intrinsischen Apoptose-Signalübertragungsweg ist die Freisetzung von Cytochrom c (Cyt c) und anderen apoptogenen Faktoren aus dem Mitochondrien. Zytoplasmatisches Cytochrom c bindet zusammen mit ATP oder dATP an das Adaptorprotein Apaf-1 und induziert daraufhin eine Konformationsänderung sowie die Oligomerisation von Apaf-1. Die Selbstassoziation von Apaf-1 führt zur zusätzlichen Rekrutierung von Caspase-9, die in diesem des sogenannten Apoptosomskomplexes durch die Erhöhung ihrer lokalen Konzentration autokatalytisch aktiviert wird. Aktive Caspase-9 wiederum spaltet und aktiviert Effektorcaspasen wie Caspase-3, die zelluläre Targetproteine spalten und damit den Zelltod verursachen. Viele apoptotische Stimuli aktivieren den mitochondrialen Apoptoseweg. Defekte im intrinsischen Signalweg finden sich häufig im Tumoren und sind oft mit Resistenzen gegen apoptoseauslösende Krebstherapien assoziert. Anti-apoptotische Proteine, die mit dem apoptotischen Programm an dieser Stelle interferieren und in Tumoren überexprimiert werden, stellen attraktive Targets für Tumortherapien dar. In der Arbeitsgruppe von Dr. Martin Zörnig am Georg-Speyer-Haus wurde ein S. pombe Hefesystem etabliert, um in einem funktionellen „Survival-Screen“ neue anti-apoptotische Säugergene aus Tumor-cDNA-Banken zu identifizieren. Hefen können durch die Expression bestimmter pro-apoptotischer Säugerproteine abgetötet werden. Dieser Hefezelltod weist äusserliche Gemeinsamkeiten mit apoptotischen Zellen multizelluläre Organismen auf. Frühere Studien haben gezeigt, dass es möglich ist, mit Hilfe dieses Screens tatsächlich anti-apoptosische Säugerproteine zu identifizieren, die den induzierten Hefezelltod inhibieren können. In einem Screen, bei dem das Apaf-1 Homolog in C.elegans, CED-4, als Killerprotein verwendet wurde, konnte unter anderem das Gen Aven isoliert werden, das nicht nur CED-4-induzierten Zelltod in Hefe, sondern auch Apaf-1/Casp-9-vermittelte Apoptose in Säugerzellen inhibiert. Dabei wurde ein unvollständiges ΔAven-cDNA-Plasmid isoliert, dem das 5´-Ende fehlte. Diese Verkürzung ist vermutlich auf ein vorzeitiges Abbrechen der cDNA-Synthese durch die Reverse Transkriptase zurückzuführen. Die vollständige humane Aven cDNA wurde im Rahmen einer Kooperation von Prof. J. M. Hardwick (J. Hopkins University, Baltimore USA) bereitgestellt, zusammen mit zwei polyklonalen anti-Aven Antiseren. Die Antisera erkennen die N-terminalen Aminosäuren 98-112 (anti-Aven A) sowie am C-terminus aa 256-268 (anti-Aven B). In der AG Zörnig wurde ein zusätzliches Antiserum (anti-Aven C) gegen ein Peptid generiert, das die letzten 17 Aminosäuren des humanen und des Maus-Aven-Proteins erkennt. Aven wurde in der Gruppe von M. Hardwick als anti-apoptotisches Protein beschrieben, das an das anti-apoptotische Bcl-2 Familienmitglied Bcl-xL und Apaf-1 bindet (Chau et al., 2000). Aven wurde mit Hilfe eines „Hefe-2-Hybrid Screens“ mit Bcl-xL als Köder („bait“) isoliert. Es wurde publiziert, dass Aven die Apaf-1 Selbstassoziation (und damit Caspase-9-Aktivierung) verhindert. Das humane Aven Gen kodiert für insgesamt 362 Aminosäuren. Die Sequenz ist in zahlreichen Spezies hoch konserviert. Aven mRNA Expression wurde in vielen Geweben (Herz, Nieren, Pankreas, Testis und Skelet-Muskulatur) und in mehreren Zelllinien gefunden. Dies deutet auf eine ubiquitäre Expression hin. In der Zelle ist Aven hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert. Immunfluoreszenzanalysen der Arbeitsgruppe Hardwick zeigten zusätzlich eine schwache Expression des Proteins im Nukleus. In der Arbeitsgruppe Zörnig konnte gezeigt werden, dass die isolierte Deletionsmutante ΔAven (aa 180-362) CED-4-induzierten Zelltod in Hefen inhibiert (Doktorarbeit M.L. Brezniceanu, unpublizierte Daten). Eine anti-apoptotische Wirkung konnte für ΔAven zusätzlich im Säugersystem verifiziert werden. Durch Überexpressionsstudien eines ΔAven- GFP-Fusionskonstruktes wurde Apaf-1/Caspase-9-induzierte Apoptose in der humanen Kolonkarzinomzelllinie RKO inhibiert. Weitere Experimente zeigten, dass sich in Tumoren des Kolons, der Niere und der Schilddrüse erhöhte Aven mRNA-Mengen nachweisen lassen und dass Aven auf mRNA-Ebene während der Entwicklung der Brustdrüse reguliert wird (unpublizierte Daten). Im Rahmen dieser Arbeit wurde Aven biochemisch und genetisch näher charakterisiert. Dabei wurden sowohl das volle-Länge-Aven sowie die artifizielle ΔAven Deletionsmutante untersucht. Zunächst wurde ein Teil der publizierten Daten verifiziert. Beschrieben ist eine Bindung zwischen Aven und Bcl-xL, die durch die N-terminale Domäne von Aven (Aminosäure 74-108) vermittelt wird. ΔAven, das den N-Terminus nicht enthält, sollte daher nicht an Bcl-xL binden können. In einem Immunpräzipitations-Experiment mit dem anti-Aven B Antiserum wurde entsprechend einer Interaktion mit Bcl-xL nur für das volle-Länge-Aven-Protein, nicht aber für ΔAven nachgewiesen. Den Publizierten Daten zufolge bindet Aven mit den Aminosäuren 180 bis 300 an Apaf-1, und diese Interaktion konnte in einem weiteren Ko-Immunpräzipitations-Experiment bestätigt werden. Ein Ziel dieser Arbeit bestand darin, den Einfluß von Aven auf die Bildung des Apoptosoms zu untersuchen. Dafür wurden Apoptosom-Immunpräzipitations-Experimente mit 293T Zelllysaten etabliert, in denen man endogene Apaf-1/Caspase-9-Komplexe nachweisen konnte. Durch Zugabe von Cytochrom c und dATP direkt zu den Zelllysaten wurde die Bildung des Apoptosoms induziert, das anschließend mit einem monoklonalen anti-Caspase-9 Antiköper immunpräzipitiert werden konnte. Bei gleichzeitiger Überexpression von ΔAven wurde weniger Apaf-1 mit Caspase-9 ko-immunpräzipitiert, ein Hinweis darauf, dass die Apoptosombildung unterdrückt wurde. Das Ergebnis wurde durch die Beobachtung bestätigt, dass Caspase-9-Spaltung und -Aktivierung durch ΔAven vermindert wurde. Interessanterweise konnte eine Überexpression des volle-Längen Aven-Proteins die Bildung des Apoptosoms nicht verhindert. Apaf-1 wurde wie bei den Lysaten nichttransfizierter Zellen mit Caspase-9 Ko-immunopräzipitiert, und die Caspase-9 Spaltprodukte p35 und p37, die bei Aktivierung des Apoptosoms entstehen, wurden unverändert detektiert. Bei den beschriebenen Ko-Immunpräzipitationsexperimenten konnte auch eine Bindung von Aven und ΔAven an Caspase-9 (und nicht nur an Apaf-1) nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass der C-Terminus von Aven für die Bindung an Caspase-9 wichtig ist. Interessanterweise nahm die Bindung von ΔAven an Caspase-9 nach Apoptosominduktion ab, während kein Unterschied in der Bindung des vollständigen Aven-Proteins an Caspase-9 vor oder nach Apoptosominduktion beobachtet werden konnte. Wegen der Bindung von Aven und ΔAven an Caspase-9 konnte mit diesen Experimenten nicht festgestellt werden, ob Aven bzw. ΔAven Teil des gebildeten Apoptosomkomplexes sind, d. h. ob sie auch nach Apoptosombildung an Apaf-1 binden. Eine Hemmung der Apoptosomsbildung führt zur Inhibierung der Caspase-Aktivierungskaskade und damit zu verringerter Caspase-3 Aktivität. Entsprechend wurde die Caspase-3-Aktivität nach in vitro Apoptosominduktion bei Überexpression von ΔAven inhibiert, während das volle-Länge Aven keinen Einfluß auf die Caspase-3-Aktivität hatte. In weiteren Verlauf des Projektes wurden funktionelle Apoptoseexperimente mit transfizierten RKO-Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten eine Protektion durch Aven und ΔAven nach Staurosporin- und UV- Behandlungen. Dabei zeigte ΔAven einen stärkeren anti-apoptotischen Effekt als das volle-Länge-Aven in vivo. Die Tatsache, dass ΔAven ein höheres anti-apoptotisches Potential als das volle-Länge-Aven-Protein aufweist, deutet auf eine mögliche Spaltung oder Konformationsänderung von Aven in vivo hin, die zur Entstehung eines aktiven anti-apoptotischen C-terminalen Proteins führt. Um dies nachzuweisen, wurden einzel- und doppel-getaggte Fusionskonstrukte kloniert. Western Blot Analysen mit dem anti-Aven B Antiserum zeigten zusätzlich zu der volle-Längen-Aven- Bande (50 kDa) eine kleinere immunreaktive Bande mit einer Größe von ca. 35 kDa. Nach Apoptoseinduktion nahm die relative Menge dieser kleineren Bande zu. Das 35 kDa Aven-Spaltprodukt wurde nicht nur nach Überexpression, sondern auch auf endogener Proteinebene detektiert. Es konnte gezeigt werden, dass diese Spaltung Caspasen-abhängig ist. Eine Behandlung der Aven-überexprimierenden Zellen vor Apoptoseinduktion mit dem Caspase-Inhibitor z-VAD-fmk blockierte die Spaltung von Aven vollständig. Gleiche Ergebnisse konnten mit dem endogenen Protein gezeigt werden. Obwohl die Aven-Sequenz keine in silico vorausgesagten Spaltstellen für Caspasen enthält, zeigten in vitro Experimente mit rekombinanter Caspase-3, dass Aven von Caspase-3 direkt prozessiert wird. In vivo Experimente mit Wildtyp-MCF-7-Zellen, die keine endogene Caspase-3 exprimieren, sowie mit transfizierten MCF-7-Zellen, die Caspase-3 stabil exprimieren, bestätigten dies. Aven wurde nur in den mit Caspase-3 transfizierten MCF-7-Zellen nach Staurosporin-Behandlung in das 35 kDa Fragment gespalten. Western Blot Analysen mit Antikörpern, die das N-terminale Ende von Aven erkennen (anti-Flag oder anti-Aven A) zeigten eine zusätzliche kleinere Bande. Dieses Spaltprodukt ist ungefähr 30 kDa groß, und im Vergleich mit dem 35 kDa Aven-Peptid veränderte sich seine Expression kaum unter apoptotischen Bedingungen. Dieses Aven-Fragment ist jedoch nicht das Ergebnis einer Caspase-Spaltung, weil seine Entstehung nicht durch z-VAD-fmk inhibiert wurde. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass auch Serin-Proteasen nicht für diese Spaltung verantwortlich sind. Western Blot Analysen mit Antikörpern, die gegen den C-Terminus von Aven gerichtet sind, zeigten erstaunlicherweise kein zusätzlichen Aven-Spaltprodukte, sondern nur das volle Länge-Aven-Protein. Offensichtlich ist das entstehende C-terminale Fragment nach Spaltung durch Caspase-3 instabil und kann nicht nachgewiesen werden. Zusätzliche, nicht näher identifizierte 40 und 45 kDa große Aven Spaltprodukte wurden in MCF7-Zellen detektiert, die jedoch nicht in RKO-, HeLa-, oder 293T-Zellen beobachtet wurden. Mit Hilfe einer frei verfügbaren Software (GrabCas; ein Programm, das auch Granzyme Bund Caspase-Spaltstellen voraussagt, die sich von den Konsensusspaltsequenzen unterscheiden) sowie mit Western Blot Analysen von verschiedenen Aven-Deletionsmutante sollten potenzielle Schnittstellen näher charakterisiert werden. Dabei wurde die Spaltung durch Caspase-3 bei D293 (oder D287) bestätigt. Außerdem wurden zusätzliche mögliche Spaltstellen bei aa 240 oder zwischen aa 142-175 in Aven gefunden. Eine Spaltung zwischen den Aminosäuren 142 und 175 würde zu einem ähnlichen C-terminalen Aven-Peptid führen wie das artifizielle ΔAven und sollte von daher potente anti-apoptotische Eigenschaften aufweisen. Eine weitere Spaltstelle wurde ungefähr bei aa 100 kartiert. Die Isolierung von Aven Spaltprodukten aus eindimensionalen SDS-PA Gelen für eine nachfolgende massenspektrometische Analyse war aus technischen Gründe leider nicht erfolgreich. Die vorausgesagte Aven-Prozessierungsstellen sowie die in Western Blot Analysen beobachteten Aven-Fragmente lassen die Schlussfolgerung zu, dass Aven nach proteolytischer Aktivierung (d. h. nach Abspaltung inhibierender N-terminaler Sequenzen) anti-apoptotische Eigenschaften annimmt. Das generierte C-terminale Peptid wird dann möglicherweise durch Caspase-3-Spaltung bei D293 inaktiviert, wenn ein starker apoptotischer Stimulus auftritt. Zu Aufklärung der physiologischen Funktion von Aven in Normalgewebe und um zu untersuchen, ob Aven bei der Tumorentstehung eine Rolle spielt, wurden verschiedene Mausmodelle etabliert. Dazu wurde die humane Aven-cDNA zum einen unter der Kontrolle eines Hühner-ß-Aktin-Promotors und eines CMV-Enhancers kloniert. Diese Kombination regulatorischer Elemente sollte zu einer hohen und ubiquitären Expression des Transgens führen. Zusätzlich wurde die humane Aven-cDNA in den Vektor p1017 unter die Kontrolle des proximalen lck-Promotors kloniert, der eine Expression in unreifen T Zellen erlaubt. Die Etablierung der Mauslinien wurde in Kollaboration mit dem GSF-Institut für Experimentelle Genetik (AG Prof. M. Hrabé de Angelis) in München durchgeführt. Bei einer Untersuchung der Organe zeigte sich, dass in der ß-Aktin Aven-transgenen Maus eine starke Überexpression von Aven nur im Herz nachgewiesen wurde. Diese transgenen Mäuse werden zurzeit in Kollaboration mit Dr. S. Barrère-Lemaire (Institut of Functional Genomics, Montpellier, Frankreich) analysiert. Des Weiteren wurde im Rahmen dieser Arbeit auch eine lck Aven-Maus Linie untersucht. Western Blot Analyse zeigten eine starke Proteinexpression des Transgens im Thymus und auch in reifen T-Zellen (Milz). Mit Hilfe des anti-Aven C Antiserums konnte im Western Blot ein weiteres, vorher nicht beobachtetes Aven-Spaltprodukt in Thymozyten und aufgereinigten periphären T-Zellen nachgewiesen werden. Diese Überexpression von Aven in Thymozyten und gereinigten T-Zellen hatte jedoch keine messbare Inhibition von Apoptose zur Folge. Dagegen wurde eine Inhibition der aktivierungsinduzierten Proliferation von T-Zellen in transgenen Aven-Mäuse beobachtet. Bemerkenswerterweise zeigten die transgenen Aven-Mäuse keine spontane Tumorentwicklung obwohl eine Korrelation zwischen Aven-Expression und einer schlechten Prognose in Kinderleukämien publiziert worden ist. Um zu untersuchen, ob Aven in Kombination mit anderen Onkogenen in Tumorentstehung oder Progression kooperieren kann, sollen transgene Aven-Mäuse mit anderen transonkogenen Mausstämmen (z.B. p53-/- Mäusen) gekreuzt werden.
Die Atmungskette ist für aerob lebende Organismen die wichtigste Quelle zur Erzeugung von Energie. Der Cytochrom c Oxidase (COX) kommt hierbei als letztem Enzym innerhalb der Elektronentransportkette eine besondere Bedeutung zu. Im mitochondrialen Fall besteht die Oxidase aus bis zu 13 Untereinheiten, deren Assemblierung in einem gerichteten und strikt regulierten Prozess von statten geht. Defekte innerhalb des Assemblierungsprozesses führen zu schweren respiratorischen Defiziten, die die Ursache für neurodegenerative und myopathische Erkrankungen sind. Der Assemblierungsprozess wird bei der Hefe von mehr als 30 verschiedenen Proteinfaktoren begleitet, die sich letztlich nicht als Untereinheiten im COX Holoenzym finden. Die Cytochrom c Oxidase des Bodenbakteriums Paracoccus denitrificans weist nicht nur eine hohe strukturelle Ähnlichkeit zu den Haupt-Untereinheiten I-III der mitochondrialen Oxidase auf, sondern das Bakterium kodiert ebenfalls für eine Reihe von Assemblierungsfaktoren, die am Einbau der Häm a- und Kupfer-Kofaktoren beteiligt sind. Beispiele hierfür sind die Biogenesefaktoren Häm a Synthase (CtaA) und die Surf1-Proteine (Surf1c und Surf1q), deren biochemische Charakterisierung das vorrangige Ziel dieser Arbeit war.
In diesem Sinne wurden für CtaA Expressions- und Aufreinigungsprotokolle entwickelt, die es erlaubten, das Enzym in drei spektroskopisch unterscheidbaren, mit verschiedenen Häm-Typen beladenen Formen zu isolieren. Mit Hilfe einer Mutationsstudie konnten sowohl für Surf1c als auch für Surf1q an einer Häm a-Bindung beteiligte Aminosäurereste identifiziert werden. Hierbei erlaubte insbesondere die Charakterisierung eines konservierten Tryptophanrestes die Entwicklung eines Bindungsmodells von Häm a an Surf1. Die Etablierung eines in vitro Häm-Transfer Assays wies zum ersten Mal eine direkte Interaktion zwischen CtaA und Surf1 nach, in deren Verlauf spezifisch Häm a von CtaA auf Surf1 übertragen wird. Expressionsstudien von CtaA in Paracoccus zeigten zweifelsfrei, dass die Synthese von Häm a auf Ebene des Vorläufermoleküls Häm b reguliert ist und eine Synthese des Kofaktors an eine Abgabe an Untereinheit I im Rahmen der COX-Biogenese gekoppelt ist. Eine nähere Charakterisierung der durch Deletion von surf1c hervorgerufenen Defekte der COX erwies, dass die Oxidase neben einer bereits beschriebenen Reduktion des Häm a-Gehalts überraschenderweise auch in Form von Häm b einen unphysiologischen Häm-Typ bindet.
Zusammengenommen erhärten die gewonnen Erkenntnisse die These, dass Surf1 direkt an der Inkorporation der Häm a-Kofaktoren in die Untereinheit I der Oxidase beteiligt ist. Dabei wirkt das Protein möglicherweise als molekularer Filter, der für den Einbau des physiologisch bedeutsamen Häm-Typs (Häm a) verantwortlich ist. Darüber hinaus stabilisiert es als vermittelnder Faktor die Interaktion von CtaA und Untereinheit I und sorgt somit für einen erleichterten und koordinierten Einbau des Häms in die Oxidase. Die in dieser Arbeit am bakteriellen Modellsystem gewonnen Erkenntnisse sollten aufgrund der hohen Ähnlichkeit sowohl der Cytochrom c Oxidase als auch der beteiligten Biogenesefaktoren direkte Rückschlüsse auf die Geschehnisse im humanen System erlauben.
Der Cytochrom b6f Komplex vermittelt den Elektronentransport zwischen Photosystem II und Photosystem I und nimmt damit eine zentrale Rolle in der Photosynthese ein. Das im Rahmen dieser Arbeit erstellte Protokoll für die Präparation des Cytochrom b6f Komplexes aus Spinat ermöglichte eine reproduzierbare Reinigung von hochaktivem Enzym. Die spektroskopischen Daten stimmen mit den publizierten Daten für den Komplex überein. SDS-PAGE zeigte alle vier großen Untereinheiten sowie eine Bande der kleinen 4 kDa Untereinheiten. Die Präparation ist mit 450 ± 60 Elektronen pro Sekunde 10 - 15 mal aktiver als in bisherigen Veröffentlichungen für Präparationen aus Pflanzenblättern beschrieben und fast doppelt so aktiv wie die besten Präparationen aus Chlamydomonas reinhardtii. Die Zuverlässigkeit des Aktivitätstests konnte durch den Wechsel des Lösungsmittels für den Elektronendonor von Ethanol zu Dimethylsulfoxid erheblich verbessert werden. Die hohe Effizienz der Proteinreinigung und die hohe Aktivität des Komplexes stellen ideale Voraussetzungen für biophysikalische und strukturelle Studien dar. Versuche zur zweidimensionalen Kristallisation des Cytochrom b6f Komplexes erbrachten Kristalle mit verschiedenen Morphologien, die unterschiedlich gut geordnet waren. Eine Projektionsdichtekarte bis zu einer Auflösung von 20 Å von mehrschichtigen Kristallen zeigte strukturelle Übereinstimmungen, aber auch Unterschiede zu dem verwandten Komplex aus der einzelligen Alge C.reinhardtii. H -ATPase Plasmamembran H -ATPasen wandeln chemische Energie (in Form von ATP) in einen elektrochemischen Gradienten um, der als Energielieferant von sekundären Transportproteinen dient. Es ist gelungen, zweidimensionale Kristalle der heterolog exprimierten und mit einem His-tag ausgestatteten Plasmamembran H -ATPase AHA2 aus Arabidopsis thaliana zu erzeugen. Zwei verschiedene Methoden wurden dabei angewandt. Zum einen wurde das Protein wurde in Proteoliposomen rekonstituiert, und die so gewonnenen Vesikelkristalle resultierten in einer Projektionsdichtekarte mit einer Auflösung von 8 Å. In einer zweiten Methode wurde eine Technik, basierend auf dem Einsatz neu entwickelter, partiell fluorierter und funktionalisierter Lipide, angewandt. Einzelschichten dieser fluorierten Lipide auf der Oberfläche eines Tropfens erwiesen sich auch in Anwesenheit von Detergenz als stabil. Die funktionalisierte Ni2 -NTA-Kopfgruppe der fluorierten Lipide ermöglichte eine Bindung des Proteins über den His-tag. Nach Detergenzentzug bildeten sich in einer Lipiddoppelmembran eingebettete 2D-Kristalle mit einem Durchmesser von bis zu 10 (m, die für die Erstellung einer Projektionsdichtekarte bis 9 Å genutzt wurden. Die beiden elektronenkristallographisch erstellten Projektionskarten waren sehr ähnlich. Sie zeigten drei voneinander abgegrenzte Domänen, die in Zusammenhang mit einer vorliegenden Struktur der verwandten Ca2 -ATPase interpretiert werden konnten. Die Technik der Oberflächenkristallisation eröffnet neue Möglichkeiten für die Kristallisation von Membranproteinen. Kristallisationsexperimente können bei Proteinkonzentrationen von nur 50-150 (g/ml durchgeführt werden und sind für alle Membranproteine, die mit einem His-tag exprimiert werden können, anwendbar. Es wurde ein Homologiemodell der Plasmamembran H -ATPase aus Neurospora crassa in Anlehnung an die atomare Struktur der verwandten Ca2 -ATPase SERCA1 erstellt. Beide Enzyme liegen in unterschiedlichen Konformationen vor, die sie während des Reaktionszyklus durchlaufen. Es konnte gezeigt werden, dass es sich dabei offenbar um die Bewegung ganzer Domänen handelt. Dabei wurde klar, dass in einem solchen Fall schon 3D-Strukturen bei einer mittleren Auflösung von ca. 8 Å, wie sie mit Hilfe der Elektronenkristallographie verhältnismäßig einfach erreicht werden können, viel zum Verstehen von Reaktionszyklen beitragen können, die große Konformationsänderungen beinhalten.
In dieser Arbeit wurde das Protein OR1 ausführlich charakterisiert und die Grundlage für weitere Studien an diesem Protein gelegt. Die Zielsetzung dieser Arbeit bestand primär in der biophysikalischen Analyse eines eukaryotischen Proteorhodopsins, da bislang keine Daten zu diesen vorlagen. Dieser Ansatz ist vergleichbar mit der Studie am BR ähnlichen Rhodopsin aus dem Pilz Leptosphaeria maculans (Waschuk et al. 2005). Auch wenn man aus den Eigenschaften von OR1 keine Signatur für eukaryotische PRs herausfiltern kann, so weist OR1 eine Reihe von Charakteristika auf, die es wert sind weiterbearbeitet zu werden. Zu den hervorzuhebenden Ergebnissen dieser Arbeit zählen:
(1) OR1 zeigte in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris ein hohes Expressionsniveau weit über der gewohnten Ausbeute bei Membranproteinen.
(2) OR1 offenbarte sich als Proteorhodopsin mit BR ähnlichen Eigenschaften wie dem niedrigen pKs-Wert des Protonenakzeptors und damit guten Protonenpumpeigenschaften über einen großen pH-Bereich. Auch bindet OR1 keinen zweiten Chromophor, was die nahen Verwandten GR und XR hingegen tun.
(3) OR1 demonstriert, dass die Konfiguration des komplexen Gegenions von Proteorhodopsinen stark variiert und sich anscheinend flexibel den physiologischen Erfordernissen des jeweiligen Organismus anpasst. In diesem Zusammenhang spielt auch das konservierte Histidin eine Rolle, da es den primären Protonenakzeptor beeinflusst. Bei OR1 stellte sich heraus, dass das Histidin den pKs Wert der D100 Position nicht signifikant beeinflusst.
(4) OR1 wurde mit 13C und 15N Atomen erfolgreich markiert und das entwickelte Protokoll für die Rekonstitution bewährte sich. Die Proteoliposomen des Wildtyps gaben sehr gut aufgelöste Festkörper-NMR Spektren. In Zukunft sind somit ausführliche NMR Studien an OR1 möglich.
Die Familie der ubiquitären ATP binding cassette (ABC)-Membranproteine katalysiert unter Hydrolyse von ATP die Translokation von Substraten über biologische Membranen. In der hier vorliegenden Arbeit wurde die Struktur und Funktion des osmoprotectant uptake (Opu) Systems A aus B. subtilis untersucht, das aus drei Untereinheiten, der ATPase OpuAA, dem integralen Membranprotein OpuAB und dem Substrat-Bindeprotein OpuAC, besteht und unter hyperosmolaren Bedingungen die kompatiblen Solute Glycin-Betain (GB) und Prolin-Betain (PB) in die Zelle importiert, um eine Plasmolyse zu verhindern. Sämtliche Untereinheiten wurden getrennt oder als OpuAA/AB Komplex in E. coli überproduziert und bis zur Homogenität isoliert. OpuAA zeigte ein dynamisches Monomer-Dimer Gleichgewicht (KD= 6 µM), das durch Nukleotide beeinflusst wurde. Unter Bedingungen hoher Ionenstärke konnten Monomer und Dimer getrennt isoliert und analysiert werden. Die Affinitäten und Stöchiometrien der OpuAA/Nukleotid Komplexe wurden unter Verwendung des fluoreszierenden TNP-ATP bzw. einer Nukleotid-sensitiven Trp-Mutante des OpuAA untersucht. Das Monomer hatte ein Molekül TNP-ATP gebunden, während zwei Moleküle TNP-ATP in dimerem OpuAA detektiert wurden. Die Affinität von Nukleotiden zu OpuAA nahm in folgender Reihe zu: ATP<ATP/Mg2+<ADP/Mg2+. Eine Erhöhung der Ionenstärke bewirkte nicht nur eine Erniedrigung der KD-Werte von OpuAA/Nukleotid Komplexen, sondern auch eine Steigerung der ATPase Aktivität. In 1 M NaCl zeigte das Monomer basale ATPase Aktivität, während das Dimer nur sehr geringe Aktivität hatte, jedoch durch Zugabe von OpuAB und OpuAC aktiviert wurde. K+ wurde als ein Modulator der ATPase Aktivität von OpuAA identifiziert. Die Zugabe von TNP-ADP/Mg2+ induzierte in dimeren OpuAA einen konformellen Wechsel, der zu einem Zerfall des Dimers führte. Monomer und Dimer hatten gegenüber Nukleotiden unterschiedliche Affinitäten, was eine unterschiedliche Architektur der Nukleotid-Bindetasche implizierte. Die Architektur des OpuAA Dimers wurde mittels FRET untersucht. Dazu wurde OpuAA ortspezifisch mit Fluorophoren markiert und ein Verfahren etabliert, in dem die intermolekularen Distanzen des Dimers bestimmt werden konnten. Ein Vergleich der Distanzen mit anderen NBD Dimeren zeigte, dass OpuAA eine zu BtuD oder MalKE. coli vergleichbare Dimer Architektur mit einer head-to-tail Orientierung hat. Die Struktur des OpuAC/GB und OpuAC/PB Komplexes wurde durch Röntgenstrukturanalyse mit einer Auflösung von 2,7 Å bzw. 2,8 Å aufgeklärt und zeigte zwei globuläre Domänen, die über zwei Peptidsegmente miteinander verbunden waren. Die delokalisierte positive Ladung des Liganden war von einem cluster aus drei Trp-Resten, dem sog. "Tryptophan-Prisma", über kationische-p-Interaktion komplexiert. Nach Ligandenbindung wurden beide Domänen durch eine Wasserstoffbrücke zwischen den konservierten Asp22 und Trp178 überbrückt. Dieser molekulare Schalter wurde von OpuAC genutzt, um Affinitäten von GB und PB zu regulieren.
Bispezifische transmembrane Antikörperfragmente zur Inhibierung von ErbB-Wachstumsfaktor-Rezeptoren
(2014)
Der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) und das ErbB2 Molekül sind Mitglieder der ErbB-Rezeptortyrosinkinase-Familie. Die Bindung von Peptidliganden an die extrazelluläre Domäne (ECD) von EGFR führt zu einer Konformationsänderung, die den Dimerisierungs-kompetenten Zustand des Rezeptors stabilisiert und eine Homodimerisierung oder Heterodimerisierung mit anderen ErbB-Rezeptoren erlaubt. ErbB2 liegt dagegen ohne Ligandenbindung dauerhaft in einer Dimerisierungskompetenten Konformation vor. Die Rezeptordimerisierung stimuliert die intrazelluläre Kinaseaktivität, was zu einer Autophosphorylierung distinkter Tyrosine im C-terminalen Schwanz der Rezeptoren führt. Diese Phosphotyrosine dienen als Bindungsstellen unterschiedlicher intrazellulärer Substrate und Adaptorproteine, die Zellwachstums-, Migrations- und Überlebens-fördernde Signalkaskaden auslösen. Eine Über- oder Fehlfunktion dieser Rezeptoren wurde in vielen Karzinomen epithelialen Ursprungs sowie in Glioblastomen beschrieben und mit einem aggressiven Krankheitsverlauf in Verbindung gebracht.
Der therapeutische Antikörper Cetuximab inhibiert das Tumorwachstum, indem er an die ECD von EGFR bindet und dabei die Ligandenbindung und Rezeptoraktivierung unterbindet. Dieselben Eigenschaften weist das single chain fragment variable (scFv) 225 auf, das die gleiche Antigenbindungsdomäne besitzt. Ein weiteres scFv-Antikörperfragment, scFv(30), wurde in vorangegangenen Arbeiten der Gruppe aus einer scFv-Bibliothek isoliert und bindet als zytoplasmatisch stabil exprimierbares Molekül an die intrazelluläre Domäne (ICD) des EGFR.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde das bislang unbekannte Epitop des scFv(30) Antikörperfragments mittels Peptid-Spotting Experimenten bestimmt. Die Bindungsstelle des scFv(30) Proteins wurde dabei am C-terminalen Ende der EGFR Sequenz lokalisiert und umfasst die Aminosäuresequenz GIFKGSTAE (AS 1161-1169 des reifen EGFR Proteins).
Die Expression von Antikörperfragmenten als sogenannte Intrabodies in Tumorzellen stellt einen wirkungsvollen Ansatz zur selektiven Interferenz mit wichtigen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen dar. Im zweiten Teil der vorgelegten Arbeit wurde das EGFR-ECD-spezifische Antikörperfragment scFv(225) über eine Transmembrandomäne und eine flexible Gelenkregion mit dem EGFR-ICD-spezifischen scFv(30) Molekül zu einem neuartigen bispezifischen Antikörper verbunden. Die konstitutive Expression dieses 225.TM.30 Intrabodies und der monospezifischen Variante 225.TM nach lentiviraler Transduktion von EGFR-überexprimierenden MDA MB468 und A431 Tumorzellen resultierte in einer substanziellen Reduktion der EGFR-Oberflächenexpression und einer Blockierung der Liganden-induzierten EGFR-Autophosphorylierung, begleitet von einer deutlichen Inhibition des Zellwachstums. Eine weitere Analyse der 225.TM.30-induzierten molekularen Prozesse in diesen Tumorzellen im Vergleich zu den beiden monospezifischen Varianten 225.TM und TM.30 erfolgte mittels eines Tetracyclin-induzierbaren Expressionssystems. Dazu wurden A431, MDA-MB468 und EGFR-negative MDA-MB453 Zellen zunächst mit retroviralen Vektorpartikeln transduziert, die für den optimierten reversen Tetracyclin-kontrollierten Transaktivator (M2) kodieren. Anschließend erfolgte die Tansduktion mit retroviralen transmembranen Antikörperkonstrukten, kontrolliert von einem Tetracyclin-induzierbaren Promoter (T6). Die Doxycyclin (Dox)-induzierte Expression von 225.TM.30 und 225.TM bestätigte die im konstitutiven Expressionssystem beobachteten Ergebnisse. TM.30-exprimierende Zellen zeigten dagegen keinen Unterschied in der Oberflächenexpression oder Aktivierbarkeit von EGFR zu parentalen Zellen, wiesen aber dennoch eine deutliche Inhibition des Wachstums auf. Konfokale Laserscanning Mikroskopie Studien zeigten eine Co-Lokalisation von 225.TM und EGFR hauptsächlich an der Zelloberfläche, während 225.TM.30 und TM.30 im endoplasmatischen Retikulum detektiert wurden und EGFR in diesem Kompartiment festhielten. Die TM.30/EGFR-Komplexe im ER könnten eine ER-Stress-Antwort auslösen und damit das reduzierte Wachstum TM.30-exprimierender Zellen erklären. Tatsächlich wurden in MDA MB468/M2/iTM.30 und A431/M2/iTM.30 Zellen erhöhte Proteindisulfidisomerase (PDI) und teilweise GRP78/BiP Proteinmengen detektiert, die auf eine ER-Stress-Antwort hindeuten. Das bispezifische 225.TM.30 Molekül vereinte die Eigenschaften der monospezifischen Antikörpervarianten. Es hielt wie TM.30 Anteile des EGFR im ER zurück und war wie 225.TM in der Lage, die EGFR-Oberflächenexpression zu reduzieren und die EGFR-Autophosphorylierung zu inhibieren.
Die Expression der drei transmembranen Antikörper in EGFR-negativen MDA-MB453/M2 Zellen hatte dagegen keinen Einfluss auf das Wachstum dieser Zellen, was die EGFR-Spezifität der vorgestellten Moleküle unterstreicht.
Im letzten Teil der vorgelegten Arbeit wurde die scFv(225) Domäne in 225.TM.30 gegen das ErbB2-ECD-spezifische scFv(FRP5) Molekül ausgetauscht, und somit ein ErbB2-ECD- und EGFR-ICD-spezifischer Intrabody generiert (5.TM.30). Nach der Dox-induzierten Expression des 5.TM.30 Moleküls in EGFR- und/oder ErbB2-exprimierenden Tumorzellen wurde die Funktionalität beider Bindungsdomänen verifiziert. Die 5.TM.30 Expression resultierte dabei in ErbB2-positiven Tumorzellen in einer verringerten Oberflächen- und Gesamtexpression von ErbB2 und in EGFR-positiven Zellen in einer Reduktion der EGFR-Gesamtproteinmenge. Dies lässt auf eine erhöhte, 5.TM.30-induzierte Degradation der beiden Rezeptoren schließen. Die Expression des 5.TM.30 Proteins führte zudem zu einer Inhibition des Wachstums EGFR- und/oder ErbB2-positiver Zellen. Weiterhin wurde auch in 5.TM.30-exprimierenden MDA-MB468/M2 Zellen, wie für 225.TM.30 und TM.30 beschrieben, eine Co-Lokalisation des transmembranen Antikörperfragments mit EGFR im ER gezeigt.
Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse weisen erstmals die Funktionalität von membranverankerten mono- und bispezifischen Antikörpermolekülen als Intrabodies nach, und zeigen ihr Potenzial zur gerichteten Interferenz mit der Wachstumsfaktor-abhängigen Signaltransduktion. Durch den Austausch der extra- und intrazellulären Antikörperdomänen könnte diese Strategie ebenso zur Analyse oder Blockade weiterer Signalmoleküle und Signalkomplexe eingesetzt werden.
Ferrocenbasierte Polymere haben in den vergangenen Jahrzehnten reges Interesse hervorgerufen, welches in ihren einzigartigen optischen und elektronischen Eigenschaften begründet ist. Diese sind auf die Anwesenheit der redoxaktiven Eisenionen sowie auf kooperative Effekte entlang des Polymerstrangs zurück zu führen. Die substanzspezifischen Merkmale hängen dabei nicht nur von der Position der Ferroceneinheiten im Makromolekül ab, sondern auch von der chemischen Natur der verbrückenden Einheiten. Hier bewähren sich solche Atome und Gruppen, die in der Lage sind, Elektronendichte zu übertragen. Ein in dieser Hinsicht besonders viel versprechendes Element ist Bor, da es im sp2-hybridisierten Zustand ein leeres p-Orbital besitzt und dieses für die Übertragung von Ladungsdichte zur Verfügung stellen kann. Vor diesem Hintergrund galt es nun auf der Basis neuartiger Kondensationsreaktionen zunächst Diferrocenylborane zu synthetisieren und anhand ausgewählter Derivate Kenntnisse über charakteristische Eigenschaften dieser Substanzklasse zu gewinnen. Die kurzkettigen Moleküle dienten als Modellverbindungen für Poly(ferrocenylen)e, welche im Mittelpunkt des zweiten Teils dieser Arbeit standen. .... In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass sich das neuartige Polymer [-fc-B(Br)-]n (33) hervorragend als Edukt eignet, um vielfältige borverbrückte Poly(ferrocenylen)-Derivate sowohl mit trigonalen als auch mit tetragonalen Borzentren darzustellen. Die beschriebenen Systeme weisen eindeutige Merkmale von Eisen-Eisen-Wechselwirkungen entlang der Polymerhauptkette auf, wobei sich das Ausmaß dieser Interaktionen über die Wahl der Substituenten an den Boratomen gezielt beeinflussen lässt. Die dargestellten Materialien besitzen somit großes Potential für die Entwicklung „Molekularer Drähte“ auf der Nanoskala.
In dieser Arbeit wurden zwei Themenblöcke bearbeitet. Zum einen der Aufbau und die Charakterisierung des Kerr-Schalters, einer Anlage zur Messung von Fluoreszenz mit einer Zeitauflösung im Femtosekundenbereich. Zum anderen die Charakterisierung von pyrenmodifizierten Nukleobasen, sowie deren Anwendung in einem neomycinbindenden Aptamer.