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Mit dieser Studie sollten phänomenologische Aspekte von Kindern und Jugendlichen mit einer Zwangskrankheit untersucht werden. Die Inanspruchnahmepopulation setzte sich aus den Kindern und Jugendlichen zusammen, die in den letzten zehn Jahren in der Klinik für Psychiatrie und Psychotherapie des Kindes- und Jugendalters des Universitätsklinikums Frankfurt/Main sowohl ambulant als auch stationär behandelt wurden. Ziel dieser retrospektiven Verlaufsstudie war insbesondere die Untersuchung der Phänomenologie der Zwangssymptomatik und deren Begleiterkrankungen, der sozialen Integration und der Therapie. Des weiteren sollte überprüft werden, ob es Prädiktoren für den Verlauf der Zwangsstörung gibt. 49 ehemalige Patienten, die in den zehn Jahren vor dem November 2000 an der Klinik für Psychiatrie und Psychotherapie des Kindes- und Jugendalters des Universitätsklinikums Frankfurt/Main aufgrund der Erstdiagnose Zwangskrankheit behandelt wurden, erfüllten die Einschlußkriterien. 29 Patienten, 21 männliche und acht weibliche, konnten dazu bewogen werden, an der Studie teilzunehmen. Bei Beginn der Zwangsstörung waren die Patienten der Stichprobe durchschnittlich 11,8 Jahre alt, bei Erstbehandlung 12,9 Jahre. Bei Katamnese betrug das mittlere Alter 19,7 Jahre, die Kinder und Jugendliche wurden durchschnittlich nach einem Katamnesezeitraum von 5,5 Jahren nachuntersucht. Zur Beschreibung der Stichprobe wurden die Krankenakten inklusive der für die vorliegende Arbeit relevanten Bestandteile der Basisdokumentation ausgewertet, es wurden telephonische Interviews geführt. Um eine Vergleichbarkeit mit anderen Studien zu ermöglichen, wurden standardisierte Untersuchungsverfahren und Diagnoseschemata bei der Untersuchung eingesetzt (Yale-Brown Obsessive- Compulsive Scale; Child Behavior Checklist, Hamburger Zwangsinventar). Entsprechend Ergebnissen anderer Verlaufsstudien war die Geschlechtsverteilung der Ausgangsstichprobe annähernd 2:1, bei der Stichprobe verschob sich die Verteilung noch mehr zugunsten der männlichen Patienten (2,6:1). Die meisten ehemaligen Patienten litten sowohl unter Zwangshandlungen als auch –gedanken. Bei der Vorstellung in unserer Kinder- und Jugendpsychiatrie wurden 93% der Patienten mit einer deutlichen oder stark ausgeprägten Problematik vom Untersucher eingeschätzt. Inhaltlich überwogen bei den Zwangsgedanken im Kindes- und Jugendalter suizidale Gedanken, Gedanken mit sexuellen Inhalten sowie solche, die sich auf Ansteckung bzw. Vergiftung beziehen. Bei den Zwangshandlungen hoben sich Wiederholungs-, Kontroll-, Wasch- und Ordnungszwänge in abnehmender Reihenfolge hervor. Bei den komorbiden psychischen Auffälligkeiten bei Aufnahme standen Angststörungen, Depressionen, Kontaktstörungen, aggressive Verhaltensweisen sowie Störungen von Antrieb, Aufmerksamkeit und Impulskontrolle im Vordergrund. Unsere Patienten waren intellektuell durchschnittlich begabt. Im schulischen Bereich waren aber bei über 40% Leistungsdefizite festzustellen. Die Familienverhältnisse erschienen geordnet. Die meisten Patienten gehörten mindestens der unteren Mittelschicht an. Im Vergleich der Teilnehmer mit den Nichtteilnehmern konnte kein signifikant relevanter Unterschied festgestellt werden. Bei näherer Betrachtung fanden sich jedoch Hinweise dafür, daß insgesamt womöglich die „schwierigeren Fälle“ die Teilnahme an der Studie verweigerten. Bei Katamnese litten noch 58,6% der nachuntersuchten Kinder und Jugendlichen unter einer Zwangssymptomatik in leichter bis extremer Ausprägung. Mehr als 27% der Patienten erfüllten zum Katamnesezeitpunkt noch die Kriterien nach ICD-10/DSM IV für eine Zwangserkrankung und wiesen eine chronische Verlaufsform auf. Bei zwei Patienten bestand der Verdacht auf einen Übergang in eine schizoide Psychose bei vorliegender Fluctin-Resistenz, ein dritter Patient litt gleichzeitig unter dem Asperger-Syndrom. Eine Remission war bei 10% der ehemaligen Patienten festzustellen, bei 45% lag die Zwangssymptomatik nur noch in subklinischer Ausprägung vor. Eine episodische Verlaufsform war bei 17% der Probanden zu beobachten. Chronische Verläufe, aber auch eine Remission, traten nur bei männlichen Patienten auf. Eine besondere Stabilität eines spezifischen Zwangssymptoms konnte nicht nachgewiesen werden. Aufgrund der individuellen Behandlung eines jeden Patienten mit eigenem Therapieschema, konnte ein Ziel dieser Untersuchung, nämlich ein einheitliches Behandlungsmuster zu erstellen, nicht erreicht werden. In dieser Untersuchung konnten einige Faktoren gefunden werden, die für den Heilungserfolg bzw. für den Verlauf eine prognostische Rolle spielten. Signifikante Prädiktionskraft hinsichtlich eines negativen Heilungserfolgs bzw. eines schlechten Verlaufs besaßen das Vorliegen komorbider Symptome, eine mit Zwangsstörung belastete Verwandtschaft, ein negativer Behandlungserfolg, der Zeitraum bis zur Erstbehandlung und psychische Auffälligkeiten bis zur Einschulung, tendenziell der Schweregrad der Zwangssymptomatik bei Vorstellung insbesondere die psychosoziale Anpassung/Bedingungen. Eine tendenziell bessere Prognose besaß insgesamt das weibliche Geschlecht. Bei der Nachuntersuchung wurde bei fast 83% der ehemaligen Patienten eine Klinische Störung diagnostiziert. Alle, die zu diesem Zeitpunkt die diagnostischen Kriterien der Zwangsstörung erfüllten, wiesen mindestens eine Klinische Störung auf, aber auch bei denjenigen, die bei Katamnese nicht unter einer Zwangsstörung litten, lag die Häufigkeit der Klinischen Störungen bei 75%. Bei Behandlungsbeginn wurde bei 93% der Patienten eine Klinische Störung festgestellt. Zum Nachuntersuchungszeitpunkt hoben sich Störungen von Antrieb, Aufmerksamkeit und Impulskontrolle hervor, gefolgt von Angststörungen, affektiven, insbesondere depressiven Störungen sowie Störungen der Interaktion. Motorische Tics kamen nur bei männlichen Patienten vor. Ein signifikanter Anstieg der Häufigkeit war bei Items, die die Aufmerksamkeit betrafen, zu verzeichnen und bei motorischen Tics. Wohl aufgrund der hohen Belastung der Stichprobe gestaltete sich die Ablösung vom Elternhaus problematisch. Nur 17% der ehemaligen Patienten wohnten außerhalb irgendwelcher Behütung in einer eigenen Wohnung oder in einer Wohngemeinschaft. Nur 20% gaben an, eine feste Beziehung zu haben, verheiratet war nur eine ehemalige Patientin. Im schulisch-beruflichen Bereich dagegen waren eher geringgradige Beeinträchtigungen bei Katamnese festzustellen. In einer schulisch-beruflichen Ausbildung oder in einem geregelten Arbeitsverhältnis befanden sich 86%. Die Schule wegen der Zwangsstörung abbrechen mußten fünf der acht männlichen Patienten, die zum Katamnesezeitpunkt unter einer Zwangsstörung litten. 10% der ehemaligen Patienten besuchten weder die Schule noch standen sie in einem Arbeitsverhältnis. Insgesamt fiel die psychosoziale Anpassung bei denjenigen, die bei der Nachuntersuchung die Diagnosekriterien einer Zwangsstörung erfüllten, erwartungsgemäß deutlich schlechter aus als bei den ehemaligen Patienten, die keine aktuelle Zwangskrankheit aufwiesen.
In einer prospektiven Studie wurden in der neonatologischen Abteilung der Universitätskinderklinik Frankfurt am Main zwischen 1996 und 1999 26 Frühgeborene mit einem Geburtsgewicht unter 2000g, die mit einem NAK versorgt waren hinsichtlich der Auswirkung auf die Nieren, der Nierengröße und des Wachstums, sowie der sonstigen Komplikationen untersucht und nachbeobachtet. Weitere 37 Neugeborene, die im gleichen Zeitraum geboren wurden und keinen NAK erhielten, wurden in die Kontrollgruppe aufgenommen, um einen statistischen Zusammenhang zwischen NAK und der Veränderung der Nierengröße festzustellen. Auch die Komplikationen das NAK wurden erfasst und statistisch ausgewertet. Die Nieren wurden mittels Sonographie bezüglich der Größe, der Morphologie und der Volumina kurz nach der Geburt und nach 1 bis 2 Monaten untersucht. Es wurden die Retentionswerte, die arteriellen Mitteldrücke in gleichen Abständen und die Gerinnungswerte am 2. Lebenstag, sowie die Verweildauer des NAK in der Experimentalgruppe ermittelt und verglichen. Die Medikation und die demographischen Daten wurden ebenfalls berücksichtigt. Die Nierenvolumina waren in der Experimentalgruppe anfänglich signifikant kleiner, wobei dieser Unterschied sich im Sinne eines Aufholwachstums der bezüglich des Gestationsalters unreiferen Kinder in diesem Kollektiv bei der Zweituntersuchung nicht mehr nachweisen lies. Somit konnte in unserem Kollektiv kein Zusammenhang zwischen der Behandlung mit einem NAK und der Nierengröße, d.h. des Nierenwachstums nachgewiesen werden. Elf Kinder in der Kontrollgruppe wiesen eine Stagnation des Wachstums mindestens einer Niere auf, bei 9 Kindern der linken Niere. Bei dreien dieser Kinder wurde in einer Drittuntersuchung ein vermehrtes Wachstum im Sinne eines Aufholwachstums nachgewiesen. Einer dieser Patienten mit Stagnation des Nierenwachtumes der linken Niere zeigte passager hypertensive Blutdrücke, ohne dass hierfür fassbare Gründe zu eruieren waren. Die Nierenvolumina der Kinder, die an hypertensiven Blutdrücken in der Kathetergruppe litten, waren bei der Zweituntersuchung signifikant größer in der Experimentalgruppe als bei den Kindern in der Kontrollgruppe. Dies lag an den Nierenvolumina des niereninsuffizienten Patienten der größere Nierenvolumina als die anderen Patienten aufwies. Bei dem anderen Kind in der Experimentalgruppe, welches durch hypertensive Blutdrücke und einen Verschluss der Arteria renalis auffiel, am ehesten NAK induziert, waren die Nierenvolumina im Vergleich unauffällig. Dies ist bedingt durch die sofortige und erfolgreiche Lysetherapie. Insgesamt zeigt sich durch den NAK nach unserer Ansicht kein Einfluss auf die Nierengröße im Sinne der Entwicklung einer Schrumpfniere bei den Patienten die mit passager hypertensiven Blutdrücken auffällig wurden. Die Nierenvolumina des Patienten mit Aortenthrombose waren bei Erst- und bei Zweituntersuchung normalgroß, so dass hier kein Einfluss des NAK auf das Nierenwachstum. Die an einer Sepsis erkrankten Kinder waren im Vergleich hinsichtlich der Inzidenz zwischen der Experimental- und Kontrollgruppe nicht verschieden. Der NAK stellt somit kein Risko für eine Sepsis in unserem Studienkollektiv dar. Die Kreatininwerte waren zwischen Experimental- und Kontrollgruppe statistisch nicht verschieden, so dass ein Einfluss des NAK auf die Kreatininwerte nicht zu ermitteln war. Die Patienten mit hypertensiven Blutdrücken (Verschluss der A.renalis und Niereninsuffizienz) zeigten im Vergleich mit den übrigen Patienten erhöhte, nicht jedoch pathologische Kreatininwerte. Die Kreatininwerte bei dem Patienten mit Niereninsuffizienz bei Erst- und Zweituntersuchung höher als bei den übrigen Patienten als Folge der Niereninsuffizienz. Der Patient mit der Thrombose der A. renalis wies erhöhte Kreatininwerte nur im Rahmen der Zweituntersuchung auf. Ein Einfluss des NAK auf die Kreatininwerte und somit auf die Nierenfunktion ist im Einzellfall der Thrombose der A. renalis wahrscheinlich. Es zeigen sich jedoch keine pathologisch erhöhten Kreatininwerte. Die arteriellen Mitteldrücke waren initial in der Experimentalgruppe signifikant niedriger als in der Kontrollgruppe. Ein Unterschied der sich bis zur Zweituntersuchung normalisiert hatte und als Folge des geringeren Gestationsalters und des geringeren Gewichtes zu sehen ist, so dass sich die Blutdrücke wie auch das Gewicht bis zur Zweituntersuchung angleichen konnten. Statistisch zeigt sich kein Zusammenhang zwischen NAK und erhöhten MADWerten. Die Verweildauer des NAK in der Experimentalgruppe lag zwischen 2 und 19 Tagen bei einem Mittelwert mit 8,81 Tagen +/- 3,77 Tagen. Die Fibrinogenwerte, gleich wie die AT III- Werte am 2. Lebenstag waren in der Experimental- und Kontrollgruppe nicht signifikant verschieden. Gleiches konnte auch bei dem Patienten der einen Aortenthrombus aufwies gezeigt werden. Die AT III- Spiegel waren insgesamt, wie oben erwähnt statistisch nicht auffällig, dennoch wies der Patient der einen Nierenarterienverschluss erlitt den niedrigsten AT III- Spiegel im gesamten Kollektiv auf. Patienten mit arterieller Hypertonie waren in der Kontroll- und der Experimentalgruppe jeweils zwei zu finden. Somit zeigte sich in unserem Kollektiv keine Signifikanz hinsichtlich des Auftretens der arteriellen Hypertonie. Die Genese der erhöhten RR- Werte war in der Experimentalgruppe bei dem Patienten mit dem Verschluss der A. renalis am ehesten NAK induziert. Ein Aortenthrombus konnte zu diesem Zeitpunkt nicht mehr nachgewiesen werden. Bei dem Patienten mit der Niereinsuffizienz spielte der NAK wenn überhaupt nur eine untergeordnete Rolle. Es handelt sich in unserem Studienkollektiv um einen Einzellfall der NAK- induzierten arteriellen Hypertonie, die durch gutes Management und rasche Therapie nur von passagerer Natur war. Ein Patient im Gesamtkollektiv, welcher in die Experimentalgruppe aufgenommen worden war, zeigte einen asymptomatischen Aortenthrombus infolge der Behandlung mit dem NAK. Bei einem Kind in der Experimentalgruppe entwickelte sich eine passagere Niereninsuffizienz im Rahmen eines Multiorganversagens aufgrund einer Rhesusinkompatibilität und einer Sepsis. Dieser Patient wies im Verlauf erhöhte Blutdrücke auf. Ein direkter Zusammenhang mit der Versorgung durch einen NAK konnte wie oben erwähnt, nicht nachgewiesen werden. Ob die hämodynamischen Veränderungen hierbei eine zusätzliche Rolle spielen ist unwahrscheinlich. Das Auftreten einer Sepsis war zwischen Kontroll- und Experimentalgruppe nicht signifikant verschieden. In beiden Kollektiven fanden sich 15 kleine Patienten, die an einer Sepsis erkrankten, so dass in unserem Kollektiv kein Zusammenhang zwischen dem Auftreten einer Sepsis und der Versorgung mit einem NAK aufgezeigt werden konnte. An einer NEC erkrankten 12 Kinder im Gesamtkollektiv. Sieben derer waren in der Experimentalgruppe, wobei sich keine Signifikanz hinsichtlich der Häufigkeit nachweisen lies. Es konnte kein Zusammenhang zwischen der Versorgung mit einem NAK und dem Auftreten einer NEC gesehen werden. Auch was den Verlauf der NEC betrifft fand sich zwischen den Kindern mit und ohne NAK kein Unterschied betreffend der Notwendigkeit des konservativen oder chirurgischen Managements. Insgesamt stellt das Monitoring der arteriellen Blutgase unter Beatmung bei Frühgeborenen die vor der 30 SSW geboren wurden bei sorgfältiger Indikationsstellung und entsprechender Handhabung ein sicheres Verfahren zur besseren Behandlung der Patienten dar, wenn eine kritische Evaluation hinsichtlich der möglichen Komplikationen, insbesondere zur Vermeidung von dauerhaften Schäden erfolgt.
Untersuchungen zur molekularen Kontrolle der Kupferhomöostase in dem Ascomyceten Podospora anserina
(2007)
Das essentielle Spurenelement Kupfer ist Co-Faktor mehrerer Schlüsselenzyme (z B. Cu/Zn-SOD, Cytochrom c Oxidase). Da Kupfer leicht Elektronen aufnehmen und abgeben kann, eignet es sich besonders gut für Redox-Reaktionen. Wenn Kupfer jedoch mit Sauerstoff reagiert, entstehen hoch cytotoxische reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die nach der „freien Radikaltheorie des Alterns“ (nach D. Harman 1956) ursächlich für Alterung und Zelltod sind. Um deren Bildung zu vermeiden, erfolgen alle Aspekte des Kupferstoffwechsels – Aufnahme, Transport und Speicherung - stets proteingebunden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich bis auf drei Ausnahmen die gesamte bislang bekannte Maschinerie der molekularen Kupferhomöostase aus anderen Modellorganismen (z.B. S. cerevisiae oder H. sapiens) auch im Genom des Ascomyceten Podospora anserina mit Homologen bzw. Orthologen wiederfindet. Die drei Ausnahmen betreffen jeweils Proteine, für die in anderen Organismen mehrere Isoformen existieren und P. anserina nur jeweils ein Homolog/Ortholog besitzt. Für mehrere der neu vorhergesagten Gene (PaAtx1, PaCcc2, PaCcs1, PaCox11, PaCox19, PaCox23, PaSco1) konnte eine Expression im Wildstamm nachgewiesen werden. Dazu wurden Standardtechniken (Northern Blot Analyse, RT-PCR) und auch neu etablierte eGFP-Reporterkonstrukte verwendet. In Podospora anserina scheint Kupfer auf zwei verschiedene Arten Einfluss auf die Lebensspanne zu nehmen: Zum einen mittelbar darüber, dass die Verfügbarkeit von Kupfer über die in der mitochondrialen Atmung verwendete Endoxidase entscheidet. Bei Kupfermangel wird eine Eisen-abhängige alternative Oxidase (AOX) induziert. Durch Atmung über die AOX entstehen weniger ROS, was die Lebensspanne verlängert. Anhand einer Vielzahl langlebiger Mutanten konnte dieser Zusammenhang bereits mehrfach demonstriert werden. Zum anderen scheint Kupfer auch eine unmittelbare Rolle in der Seneszenz von P. anserina zu spielen. In früheren Arbeiten konnten mehrere indirekte Hinweise (Transkript- und Aktivitätsanalysen) gesammelt werden, dass im Alter die cytoplasmatische Kupferkonzentration drastisch ansteigt. Durch Messung der Kupferkonzentration mittels einer direkten chemisch-analytische Methode (TXRF) in fraktionierten Zellbestandteilen (Cytoplasma und Mitchondrien) konnten in dieser Arbeit diese Hinweise weiter untermauert werden. Experimente mit in die mitochondriale Matrix geleitetem eGFP brachten zusätzliche Indizien dafür, dass das mitochondriale Kupfer-Reservoir die Quelle des sich in seneszenten Pilzstämmen im Cytoplasma wiederfindenden Kupfers ist. Durch einen Prozess, der größenabhängig reguliert und in anderen Organismen als „Mitochondrial Permeability Transition – MPT“ zu Beginn der Apoptose bekannt ist, ergiesst sich beim Eintritt in die Seneszenz der Inhalt der mitochondrialen Matrix in das Cytosol. Die Bedeutung dieses Vorgangs und v.a. die Folgen der Umverteilung von Kupfer innerhalb der Zelle bleiben im Detail weiter zu klären. Durch die durchgeführten Arbeiten konnte ein weiterer deutlicher Beweis für das Ablaufen apoptotischer Mechansimen im Alterungsprozeß des Ascomyceten P. anserina erbracht werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Dosierungsgenauigkeit aller jeweils zum Zeitpunkt der Studie am Markt befindlichen Amoxicillin-, Erythromycin und aller Clarithromycintrockensäfte mit der Dosierung 125 mg/ml untersucht. Die Studie zur Dosierungsgenauigkeit und sicheren Handhabung von Amoxicillintrockensäften umfasste weiterhin die Untersuchungen möglicher Herstellungsfehler, der Stabilität über die Laufzeit, die Untersuchung des Sedimentationsverhaltens von Saftpräparaten sowie eine Umfrage in der Patientengruppe. In den drei Studien zur Dosierungsgenauigkeit von Antibiotikatrockensäften lieferten die einzelnen Dosierhilfsmittel sehr unterschiedliche Ergebnisse. Die größten Dosierungsungenauigkeiten wurden mit Dosierlöffeln erzielt. Sowohl bei der Untersuchung von Amoxicillintrockensäften als auch bei Erythromycinpräparaten wichen Dosierungen mit der Viertel- und Halbmesslöffelmarkierung sehr stark vom definierten Wirkstoffgehalt ab. Übereinstimmend war in beiden Gruppen die Dosierungsabweichung nach Ganzlöffeldosierung am geringsten. Die in der Arbeit dargestellten Ergebnisse belegen, dass die Dosierungsgenauigkeit bei der Applikation von Suspensionen mit Dosierlöffeln im Wesentlichen von zwei Faktoren abhängt. Der erste Parameter ist die Grundfläche der Dosierhilfe. Bei breiten bzw. großen eher flachen Löffeln kommt es zu gravierenden Überdosierungen, vor allem bei den kleinen Einheiten ¼- bzw. ½ Löffel. Da die Amoxicillinpräparate mehrheitlich mit solchen breiten, flachen Löffeln, die Erythromycinpräparate hingegen überwiegend mit kleineren kompakteren Dosierlöffeln ausgestattet sind, waren die Ergebnisse der Untersuchung von Amoxicillintrockensäften im Durchschnitt deutlich schlechter. Der zweite wichtige Parameter für die Dosierungsgenauigkeit ist die Saftkonsistenz. Bei hochviskosen Zubereitungen bildet sich beim Dosieren durch die Kohäsionskraft ein deutlicher Überschuss auf dem Löffel. Bei feuchter Löffeloberfläche ist dieser Überschuss weniger stark ausgeprägt. Tatsächlich sind natürlich bei der alltäglichen Anwendung Dosen üblich, die ein Mehrfachbefüllen des Löffels nicht erforderlich machen, das heißt der Patient dosiert in der Regel auf einen trocken Löffel und damit klar über. Aufgrund dieser Oberflächenphänomene war auch bei kleineren, kompakteren Löffeln keine völlig genaue Dosierung möglich. In der Untersuchung an den Amoxicillinpräparaten erwies sich der Messbecher gegenüber den graduierten Löffeln von großem Vorteil. Zum einen ermöglichen Messbecher eine genauere Dosierung (geringere Schwankungen der Arzneimittelmenge um den Sollwert), weiterhin sind sie in der Praxis standfester; der abgebende Apotheker kann das verordnete Volumen überdies mit wasserfestem Stift oder Klebeband markieren. Dies kann vor allem für fremdsprachige oder sehbehinderte Patienten sehr hilfreich sein. Beim Dosieren mit Messbechern besteht allerdings vor allem bei höher viskosen Flüssigkeiten die Gefahr der Unterdosierung. Dies ist darauf zurückzuführen, dass sich die Skalen auf die eingegossene und nicht auf die ausgegossene Flüssigkeitsmenge beziehen. Nach den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit waren die Dosierspritzen mit Abstand die genauesten Dosierhilfen. Die Wirkstoffwiederfindung bei der Untersuchung von Clarithromycintrockensäften schwankte auf sämtlichen Dosierniveaus nur um wenige Prozent. Das Applizieren mit Hilfe einer Dosierspritze ist nicht nur wegen der sehr genauen Dosierbarkeit besonders anwenderfreundlich, sondern die Suspension wird darüber hinaus durch das Kopfüberdosieren gleichzeitig redispergiert. Außerdem kann der Saft, wenn sich der Patient in aufrechter Körperhaltung befindet, aus der Spritze direkt an der Innenseite der Wange entleert werden. Damit kann ein Würge- oder Hustenreiz unterdrückt sowie das sofortige Wiederausspucken bei Kleinkindern unterbunden werden. Besonders erwähnenswert sind Dosierspritzen, die neben einer Volumenskalierung alternativ oder teilweise zusätzlich in kg Körpergewicht graduiert sind. Dies sorgt für zusätzliche Anwendungssicherheit. In letzter Zeit ist zu beobachten, dass die Empfehlung Dosierspritzen zu verwenden, die erstmals bereits in den 70 iger Jahren von der American Academy of Pediatrics ausgesprochen wurde, auch in Deutschland umgesetzt wird. Vor allem Generika, die momentan am Markt platziert werden, verfügen über Dosierspritzen bzw. beides; Dosierspritze und –löffel. Die Studie zu Amoxicillinpräparaten beinhaltete weitere wichtige Parameter, die für die Anwenderfreundlichkeit und die sichere Handhabung dieser Arzneiform Relevanz besitzen. Wie die in den jeweiligen Kapiteln dokumentierten Ergebnisse belegen, sind Trockensäfte Präparate, die bei Abgabe in der Apotheke einer ausführlichen Beratung bedürfen. So zeigten die Versuche zur Bestimmung des korrekten Auffüllvolumens, dass die von Herstellern angegebenen zuzusetzenden Wassermengen nicht unkritisch übernommen werden dürfen. Der Anwender sollte auch bei vorgegebenem Volumen den Saft in zwei bis drei Schritten sukzessive auffüllen und den Stand des Flüssigkeitspegels nach Schaumabsetzen beachten. Ebenso wichtig wie dieser Hinweis ist der Rat, den Saft vor jeder Anwendung sorgfältig zu schütteln. Die Untersuchungen zum Sedimentationsverhalten zeigten auch bei scheinbar stabilen Zubereitungen nach spätestens 24 Stunden eine deutliche Wirkstoffsedimentation. In der Beratung nicht fehlen, darf weiterhin der Hinweis zur korrekten Aufbewahrung der Suspensionen. Clavulansäurehaltige Amoxicillinkombinationspräparate müssen wegen der Thermolabilität des beta-Laktamaseinhibitors zwingend im Kühlschrank gelagert werden. Nach nur 7-tägiger unsachgemäßer Aufbewahrung bei Raumtemperatur war bei der Untersuchung zur in-use Stabilität eine drastische Degradierung der Clavulansäure um ganze 66,3 % zu verzeichnen. Im Gegensatz zu den clavulansäurehaltigen Trockensäften dürfen Clarithromyinsäfte wiederum nicht im Kühlschrank aufbewahrt werden. Bei diesen Präparaten droht bei Temperaturen zwischen 5 – 8 °C die Auskristallisierung des Wirkstoffes und damit die Zerstörung der galenischen Formulierung. Der dadurch hervortretende stark bittere Geschmack ist für Säuglinge und Kleinkinder intolerabel. Neben der oben angesprochenen Umstellung von Dosierlöffeln auf Dosierspritzen gibt es weitere Entwicklungen, die einige der eben hier aufgezeigten Probleme lösen. ....
Humane hämatopoetische Stammzellen (HSCs) besitzen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und übernehmen die kontinuierliche Neubildung aller zellulären Bestandteile des Blutes. Aufgrund der zunehmenden klinischen Bedeutung der HSCs ist es essentiell die molekularen Mechanismen, die den Prozess der Vermehrung und Differenzierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen steuern, aufzuklären und deren funktionelle Bedeutung zu verstehen. Das Ziel der Arbeit war die Identifizierung, Charakterisierung und gerichtete Modulation funktionell relevanter Signalwege, die am Differenzierungsprozess von HSCs zu myeloiden Effektorzellen beteiligt sind. Für diese Untersuchung wurde ein Expansionsprotokoll für humane HSCs, sowie ein Differenzierungsprotokoll für das humane myeloide DC Differenzierungsmodell entwickelt. In der Arbeit wurden drei wichtige Signalwege der Zelle, die Mitogenen Signalkaskade (MAPK), Protein Kinase C (PKC) gekoppelten Prozessen und dem JAK/STAT Signalweg untersucht. Die vorliegende Arbeit zeigt, daß die Stimulation der HSCs mit GM-CSF und IL-4 zu einer zeitlich begrenzten Aktivierung von MAPK/ERK1/2, PKC delta, JAK2, sowie STAT5 und STAT6 führte. Kommerzielle Inhibitoren von MEK, PKC und Januskinase hemmten selektiv diese Aktivierung und führten zu einer veränderten Hämatopoese. Die Aktivierung dieser Signalwege ist daher für die myeloide Differenzierung von HSCs zu Dendritischen Zellen von entscheidender Bedeutung. Einer der entscheidenden nuklearen Faktoren für die myeloide Differenzierung ist der Ets-Transkriptionsfaktor PU.1, dessen Aktivität durch Phosphorylierung reguliert sein könnte. Obwohl die funktionelle Rolle von PU.1 in der Differenzierung von HSC in der vorliegenden Arbeit nicht vollständig geklärt werden konnte, wurde jedoch erstmals im in vitro Kinase-Assay gezeigt, daß PU.1 durch PKC delta, aber nicht durch MAPK/ERK2 spezifisch phosphoryliert wird. In einem PU.1-spezifischen Luciferasereporter-Assay wurde die transkriptionelle Aktivität von PU.1 durch die Inhibition von PKC delta und MAPK/ERK1/2 deutlich reduziert. Weiterführende Experimente in einem komplexen Differenzierungsmodell von humanen HSCs wiesen darauf hin, daß durch den gezielten Einsatz von Signalweginhibitoren eine Verschiebung der Verhältnisse der gebildeten Blutzellkolonieformen erreicht werden kann. So war die Differenzierung zu Erythrozyten von der Mitogenen Signalkaskade unabhängig, wohingegen die Differenzierung zu Makrophagen eine deutliche Abhängigkeit von der Aktivität der Mitogenen Signalkaskade sowie von der Aktivierung des Protein Kinase C Signalwegs zeigte. Im Gegensatz dazu führte die Inhibition der Januskinasen (JAKs) zu einer Hemmung der Differenzierung in allen Kolonieformen. Insgesamt zeigten die Ergebnisse, daß der MAPK/ERK und PKC delta Signalweg bei der Differenzierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen eine wichtige Rolle spielen und eine gerichtete Steuerung der Differenzierung durch den Einsatz spezifischer Signalweginhibitoren möglich erscheint.
Es wird ein effektives Modell zur Berücksichtigung einer Minimalen Länge in der Quantenfeldtheorie vorgestellt. Im Falle der Existenz Großer Extradimensionen kann dies zu überprüfbaren Modifikationen verschiedener Experimente führen. Es werden verschiedene Phänomene wie z.B. der Casimir-Effekt, Neutrino-Nukleon-Reaktionen oder Neutrinooszillationen diskutiert.
Starke allergische Reaktionen gegen nicht spezifische Lipidtransfer Proteine sind im Mediterranen Raum weit verbreitet. LTPs besitzen als Klasse 1 Nahrungsmittelallergene vermutlich die Fähigkeit über den oralen Weg, durch den Verzehr von Nahrung, eine Sensibilisierung auszulösen. Zu Beginn dieser Arbeit wurde jedoch in der Literatur die Möglichkeit diskutiert, ob auch bei einer LTP-Sensibilisierung eine Pollen-assozierte Nahrungsmittelallergie vorliegen könnte. Untersuchungen zur IgE-Bindungskapazität von Lebensmittel- und Pollen-LTPs zeigten partielle Kreuzreaktivitäten. Eine Aussage über eine einheitliche Tendenz zur stärkeren IgE-Bindungskapazität konnte anhand der derzeitigen Ergebnisse weder für die Lebensmittel- noch für die Pollen-LTP-Gruppe getroffen werden. Dementsprechend lag kein eindeutiger Hinweis zur Korrelation zwischen der Sensibilisierung gegen Pollen- und Nahrungsmittel-LTPs vor, wodurch die Frage zur Fähigkeit der einzelnen LTPs kausal eine Allergie auszulösen weiterhin offen bleibt. Die Untersuchungen dieser Arbeit fokussierten sich auf die Lebensmittelallergene und sollten ihre klinische Bedeutung analysieren und Aufschluss über die Fähigkeit dieser Allergene eine Allergie kausal auszulösen bringen. Hierbei sollte untersucht werden, ob jedes Nahrungsmittel-LTP die Fähigkeit besitzt eine IgE-Sensibilisierung auszulösen oder ob ein LTP als primär sensibilisierendes Agens wirkt und nachfolgend immunologische Kreuzreaktionen zu anderen LTPs auftreten. Aufgrund der großen Häufigkeit von Patienten mit einer Pfirsichallergie im mediterranen Raum mit einer Sensibilisierung gegen das Pfirsich-LTP (Pru p 3), sowie einer schweren Symptomatik, wird vermutet, dass dieses Allergen eine wichtige Rolle spielt und eventuell als primär sensibilisierendes Agens fungieren könnte. Zur Identifizierung eines primär sensibilisierenden Agens sollte das Ausmaß der Antikörper-Kreuzreaktivität, die Aufschluss über die Affinität und Vorkommen gemeinsamer Epitope liefern soll, untersucht werden. Weiterhin sollte die IgE-Prävalenz der einzelnen Allergene, ihre Immunogenität (T-Zell-Kreuzreaktivität und in vivo Antikörperinduktion) und die biologische Potenz untersucht werden. Um der Fragestellung nachzugehen wurden die LTPs aus taxonomisch verwandten (Kirsche, Pru av 3 und Pfirsich, Pru p 3) und nicht verwandten (Haselnuss, Cor a 8 und Salat, Lac s 1) Lebensmitteln in die Studie einbezogen. Für die Untersuchungen standen 51 Seren von spanischen Lebensmittelallergikern zur Verfügung, deren Allergien gegen Pfirsich, Salat, Haselnuss und Kirsche anamnestisch und serologisch erfasst wurden. Die Relevanz der LTPs wurde durch die Schwere der klinischen Symptomatik deutlich. LTPs besitzen eine hohe Stabilität gegenüber thermischer und proteolytischer Prozessierung. Natürliches Pru p 3 zeigte bei einer Erhitzung auf 90°C zum größten Teil eine intakte Sekundärstruktur. Diese Eigenschaften könnten die Aufnahme von intakten Allergenen im gastrointestinalen Trakt begünstigen, wodurch die teilweise starken allergischen Reaktionen erklärt werden können. Bei der Untersuchung zur Relevanz von Pru p 3 im Vergleich zu Lac s 1, Cor a 8 und Pru av 3 wurde die IgE-Prävalenz, IgE-Bindekapazität, IgE-Kreuzreaktivität und biologische Potenz untersucht. Spezifisches IgE gegen Lac s 1 (93%), Pru p 3 (90%), Cor a 8 (88%) und Pru av 3 (85%) wurde mittels ImmunoCAP-FEIA in der jeweiligen Lebensmittelallergikergruppe gefunden und quantitativ bestimmt. Alle untersuchten Lebensmittel-LTPs erwiesen sich als Hauptallergene in der jeweiligen Patientengruppe. Bei Untersuchungen der IgE-Bindekapazität zeigten alle untersuchten Patienten, mit Ausnahme von einem, eine stärkere IgE-Bindungen gegen Pru p 3 im Vergleich zu Cor a 8. Demnach korreliert eine IgE-Sensibilisierung gegen Cor a 8 mit der gegen Pru p 3. Lac s 1 zeigte in einigen Fällen eine stärkere IgE-Bindung im Vergleich zu Pru p 3 und umgekehrt. Mit Ausnahme eines Patienten war eine IgE-Sensibilisierung gegen Lac s 1 immer mit der gegen Pru p 3 assoziiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in Einzelfällen spezies-spezifische Epitope beobachtet wurden, während IgE-Reaktivitäten gegen LTPs, die nicht zu der Familie der Rosengewächse gehören, in seltenen Fällen ohne eine begleitende Sensibilisierung gegen Pru p 3 auftraten. Die IgE-Bindung an Pru p 3 konnte durch Cor a 8 und Lac s 1 maximal bis 60% inhibiert werden, während Pru p 3 eine komplette Inhibition der Cor a 8 und Lac s 1 IgE-Bindung bewirkte. Demnach besitzt Pru p 3 alle IgE-Epitope von Lac s 1 und Cor a 8 und/oder eine stärkere Affinität zu den IgE-Antikörpern. Cor a 8 zeigte, trotz der Fähigkeit schwere Symptome auszulösen, eine relativ geringe biologische Potenz. Lediglich bei einem von fünf untersuchten Patienten zeigte Lac s 1 eine starke maximale Histaminfreisetzung. Pru p 3 und Pru av 3 zeigten die stärkste biologische Potenz bei allen untersuchten Pfirsichallergikern. Ein Salatallergiker ohne Pfirsichallergie zeigte durch die Stimulation mit Pru p 3 eine geringe Mediatorfreisetzung, wodurch dem Allergen Pru p 3 in Einzelfällen ohne klinische Symptomatik gegen das Allergen nicht zwangsläufig die stärkste biologische Potenz zugeschrieben werden kann. Pru p 3 und Pru av 3 zeigten aufgrund einer hohen Sequenzidentität von 85% nahezu identische IgE-Bindekapazitäten, IgE-Kreuzreaktivitäten, sowie eine ähnliche biologische Potenz. Eine Kreuzreaktivität auf T-Zell-Ebene wurde ebenfalls zwischen Pru p 3 und Pru av 3 detektiert, während im murinen System mittels RBL-2H3-Mediatorfreisetzungstest keine Kreuzreaktivität unter allen untersuchten Lebensmittel-LTPs nachweisbar war. Fehlende T-Zell-Kreuzreaktivitäten zwischen Pru p 3/Cor a 8 und Pru p 3/Lac s 1 deuten auf unterschiedliche T-Zell-Epitope der untersuchten Proteine hin. Um eine generelle Aussage über die T-Zell-Kreuzreaktivität treffen zu können, wären weitere systematische T-Zell-Proliferationsstudien erforderlich. Die erhaltenen Ergebnisse verdeutlichen, dass dem Allergen Pru p 3 hinsichtlich IgE-Prävalenz, IgE-Bindekapazität, IgE-Kreuzreaktivität im Inhibitions-ELISA und der biologischen Potenz im Mediatorfreisetzungstest die bedeutendste Rolle unter den untersuchten LTPs zukommt. In Einzelfällen konnten jedoch spezies-spezifische Epitope nachgewiesen werden, wodurch die Annahme verstärkt wird, dass Pru p 3 nicht das alleinige Immunogen sein kann. Weiterhin waren alle untersuchten LTPs im murinen System immunogen, wodurch die Annahme verstärkt wird, dass jedes untersuchte LTP eine Allergie kausal auslösen kann. Unterstützt wird diese Vermutung durch die fehlende Kreuzreaktivtität der murinen IgE-Antikörper. Eine eindeutige Aussage kann aufgrund der erhaltenen Ergebnisse derzeit noch nicht getroffen werden, da weitere systematische T-Zell-Proliferationsstudien und Inhibitions-ELISA der Maus-Immunsera in dieser Arbeit nicht mehr durchgeführt werden konnten.
Die Rheumatoide Arthritis ist die häufigste entzündliche Gelenkerkrankung in den westlichen Industriestaaten und hat eine Prävalenz zwischen 0,5 und 1%. Frauen sind ungefähr 3mal häufiger betroffen als Männer. Eine genetische Disposition besteht für Träger des HLA-DR 4 Typs. Als Auslöser der RA werden bakterielle und virale Infekte diskutiert. Immer mehr Anhänger findet auch die Theorie, dass es sich bei der rheumatoiden Arthritis um eine Autoimmunerkrankung handeln könnte. Zur Klassifizierung der Krankheit hat das American College of Rheumatology einen Kriterienkatalog entwickelt. Charakteristisch für die rheumatoide Arthritis ist die chronische Gelenkentzündung und die Gelenkdestruktion. Bei 70% der RA Patienten finden sich heterophile Autoantikörper gegen den konstanten Teil humaner Immunglobuline vom IgG Isotyp. Sie werden als Rheumafaktoren bezeichnet und gehen mit einer häufigeren Beteiligung extraartikulärer Systeme einher, die in erster Linie auf einer begleitenden Vaskulitis beruhen. Der entzündliche Prozess der RA beginnt in der Gelenkkapsel. Es kommt zu einer Verbreiterung und Auftreibung der Synovialmembran durch Einwanderung und Organisation von CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten. Durch ein unbekanntes Antigen stimulieren die TLymphozyten synoviale Makrophagen, die dann mit der Produktion proinflammatorischer Zytokine, insbesondere TNF-α und IL-1, weitere Zellsysteme aktivieren und zur Aufrechterhaltung des Entzündungsprozesses beitragen. Resultat dieser tumorähnlichen Proliferation ist der Gelenkpannus, von dem die weitere Destruktion von Knorpel, Knochen und umgehenden Weichteilen ausgeht. Ein weiteres wichtiges Zytokin in der T-Zell- und Makrophagenaktivierung ist Interleukin-18, ein proinflammatorischer Mediator der angeborenen und erworbenen Immunantwort. IL-18 wurde ursprünglich als IFN-γ induzierender Faktor beschrieben und wird von vielen mesenchymalen und epithelialen Zellen exprimiert. Im Zusammenhang mit der RA sind vor allem Makrophagen und dendritische Zellen von Bedeutung. Die Expression von IL-18 ist bei Patienten mit RA im Sinne einer Reduktion in der Peripherie und einer Erhöhung in den entzündeten Synovialgeweben pathologisch verändert und weist auf eine proinflammatorische Rolle von IL-18 bei der RA hin. Das humane IL-18 Gen ist auf dem Chromosom 11q22.2- q22.3 lokalisiert. In der Promotorregion von IL-18 konnten 5 Single Nucleotid Polymorphismen identifiziert werden. Bei SNPs handelt es sich um Basenvariationen der Nukleotidsequenz an bestimmten Genpositionen. Sie können zu unterschiedlichen Konsequenzen im Phänotyp führen. In der vorliegenden Arbeit wurden die SNPs an den Positionen -137 und -607 bei 102 Patienten mit einer nach ACR-Kriterien definierten RA und einer gesunden Kontrollgruppe von 98 Personen untersucht. Anlass für die Untersuchungen war der Gedanke, dass die Ursache für die veränderte Produktion von IL-18 bei der RA auf genregulatorischer Ebene liegen kann. Nach Isolierung mononukleärer Zellen aus dem peripherem Blut erfolgte die DNA-Gewinnung. Mittels allelspezifischer PCR und Enzymverdauung durch Restriktionsendonukleasen wurden die einzelnen Allele an den Positionen -137 und -607 identifiziert und auf Agarosegel sichtbar gemacht. Zur Kontrolle der Ergebnisse wurden zusätzlich Sequenzierungen durchgeführt. An Position -137 sind die beiden Allele C und G möglich, an Position -607 die Allele A und C. Weder an Positon -137 noch an Position -607 zeigten sich signifikante Unterschiede bei der Verteilung der Allelhäufigkeiten zwischen RA Patienten und der gesunden Kontrollgruppe. Da beim Menschen jedes Gen zweimal vorhanden ist liegen auch bei jedem Menschen zwei Allele vor. Liegen zwei verschiedene Allele eines Gens vor wird dieses als heterozygot bezeichnet, während ein homozygoter Organismus zwei Kopien desselben Allels trägt. Bei Betrachtung dieser Diplotypen ergaben sich für die Position -137 erneut keine signifikanten Unterschiede zwischen RA Patienten und Gesunden. An Position -607 hingegen war der Diplotyp -607CC bei den RA Patienten signifikant häufiger vertreten. Die Relevanz dieser Ergebnisse wurde durch das Hardy- Weinberg-Gleichgewicht gestützt. Bei Betrachtung der Genotypen wurde eine signifikante Verknüpfung der Genotypen -607AA und -137CC und der Genotypen -607CC und -137GG miteinander festgestellt. Diese Signifikanz war unabhängig vom Gesundheitsstatus. Zusätzlich war der -607AC Diplotyp häufiger mit den Diplotypen -137CG und -137GG verknüpft, nicht aber mit dem Diplotypen -137CC. Ob das Risiko eine RA zu entwickeln von den einzelnen Positionen -137 und -607 des IL-18 Promotors, deren Kombination oder eventuellen anderen Lokalitäten in einem gewissen Ausmaß anhängig ist bleibt unklar. Fest steht, dass SNPs eine bedeutende Rolle als natürliche Inhibitoren und Aktivatoren auf molekularer Ebene spielen. Ob dies bei der RA zu einer erhöhten IL-18 Expression führen kann und somit signifikante Folgen für die Krankheitsausprägung hat konnte im Rahmen der Untersuchungen nicht geklärt werden und bedarf weiterer Untersuchungen.
Die Steriltestung der Blutprodukte zur Reduzierung des Übertragungsrisikos von Pathogenen stellt vor allem bei Thrombozytenkonzentraten ein wichtiges wissenschaftliches Interesse in der Transfusionsmedizin dar. In der vorliegenden Arbeit wurde ein synoptischer Vergleich sowohl von Apheresethrombozytenkonzentraten als auch von Pool-Thrombozytenkonzentraten bezüglich bakterieller Kontaminationen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sich beide Thrombozytenprodukte hinsichtlich der bakteriellen Kontaminationsrate nicht unterscheiden und somit im Hinblick auf die Transmission von Bakterien als gleichwertig zu betrachten sind. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Kulturmethoden (BacT/ALERT und Pall eBDS) und eine Schnelltestmethode (Scansystem) miteinander hinsichtlich der analytischen Sensitivtät miteinander verglichen. Der Hauptnachteil der getesteten Schnelltestmethode (ScansystemTM) ist die geringere analytische Sensitivität und v. a. der Umstand, dass die Auswertung der Ergebnisse subjektiv und somit personenabhängig ist. BacT/ALERT überzeugt durch eine hohe analytische Sensitivität, basierend auf einem langen Untersuchungszeitraum von bis zu sieben Tagen. Auch Pall eBDS überzeugte mit einer hohen analytischen Sensitivität, ist aber ein Testsystem, welches ausschließlich für aerobe Bakterien geeignet ist. Dagegen wurden in der Studie überwiegend Anaerobier (>90%) gefunden. ScansystemTM fand aerobe und anaerobe Keime in einer sehr kurzen Testzeit von ca. 70 Minuten, hatte jedoch die niedrigste analytische Sensitivität. In der klinischen Anwendungsbeobachtung konnte kein Zusammenhang zwischen den aufgetretenen Symptomen und der Thrombozytentransfusion festgestellt werden. Da das bakterielle Restinfektionsrisiko bei Thrombozytenkonzentraten das Restrisiko für virale Infektionen übertrifft, wird empfohlen bestehende Testverfahren zu optimieren, bzw. alternative Methoden, wie die der Pathogeninaktivierung zu entwickeln.
Kindliche Sarkome sind eine heterogene Gruppe maligner Erkrankungen mesodermalen Ursprungs. Trotz operativer Therapie, Chemotherapie und Bestrahlung versterben noch viele Patienten. Auch gegenüber immunologischen Behandlungsansätzen sind Sarkome relativ resistent. Inhalt dieser Arbeit sind die Mechanismen, die der Resistenz kindlicher Sarkome gegenüber NK-Zellen zugrunde liegen könnten. Hierbei wurde insbesondere die Interaktion von HLA-Klasse-I-Molekülen mit inhibitorischen NK-Zellrezeptoren untersucht. Als einzige Sarkomzelllinie konnte A-673 mit einer Zelllyse von 40% bei einer E : T-Ratio von 20 : 1 als sensitiv eingestuft werden. Schwach sensitiv waren die Zelllinien MHH-ES und HOS-TE mit einer spezifischen Lyse von 25%. Als resistent gegenüber einer Zelllyse durch NK-92 erwiesen sich die Sarkomzelllinien SAOS-2, ZK58 und RD-ES mit einer Lyserate zwischen 10 und 15%. Die HLA-Klasse-I-Expression war bei den untersuchten Zelllinien HOSTE, SAOS-2, ZK58 und RD relativ schwach, bei A-673 und MHH-ES moderat und bei RD-ES stark. Gegenüber der klonalen NK-Zelllinie NK-92 zeigten sie mit Ausnahme von A-673 (40% Lyse) keine Sensitivität gegenüber einer NK-vermittelten Lyse. Dies liegt offenbar nicht an der Inhibition der NK-Zellen durch HLA-Klasse-I-Liganden, wie durch funktionelle Untersuchungen mit Blockierung der korrespondierenden HLA-Liganden gezeigt werden konnte. Auch korreliert die Sensitivität bzw. Resistenz der Sarkomzelllinien nicht mit der Expressionsdichte der HLA-Klasse-I-Moleküle auf den untersuchten Sarkomzelllinien. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten somit darauf hin, dass die Resistenz kindlicher Sarkome gegenüber NK-Zellen möglicherweise nicht auf eine Inhibition, sondern auf eine mangelnde Aktivierung der Immunzellen zurückzuführen ist.
Der Mangel von Faktor VIII (FVIII) führt zur häufigsten Gerinnungsstörung, der Hämophilie A. Die rekombinante Expression von FVIII für gentherapeutische Ansätze oder zur Herstellung von FVIII ist zwei bis drei Größenordnungen niedriger verglichen mit anderen Proteinen vergleichbarer Größe. Die Ursachen für die geringe Expression liegen zum großen Teil an der ineffizienten Transkription und dem ineffizientem intrazellulären Transport. (1) Im Rahmen der Untersuchung der FVIII-Sekretion, konnte durch Verwendung von FVIII-GFP Fusionsproteinen zum ersten Mal gezeigt werden, wie FVIII in lebenden Zellen transportiert wird. Außerdem wurde anhand von vergleichenden Immunfluoreszensfärbungen, FVIII-Messungen und Westernblotanalysen demonstriert, dass weder bei der B-Domäne deletierten noch bei der Volllängenvariante signifikante Unterschiede zwischen den GFP-fusionierten und Wildtyp-FVIII-Varianten messbar waren. Offensichtlich wird die Funktionalität von FVIII durch die C-terminal fusionierte GFP-Domäne nicht eingeschränkt. In ersten Lebendzellanalysen konnte gezeigt werden, dass sich FVIII in primären Zellen und Zelllinien hauptsächlich im ER befindet und eine für lumenale ER-Proteine charakteristischen Mobilität aufweist. Beim frühen sekretorischen Transport zeigte sich bei Temperaturblock-Experimenten eine verlängerte Dauer der Akkumulation in ER-Exit-Sites und eine vergleichsweise niedrige Frequenz von ER-Golgi-Bewegungen. Es konnte zum ersten Mal der Nachweis von FVIII-Transport durch vesikuläre tubuläre Cluster erbracht werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der möglicherweise durch Faltungsprobleme blockierte Austritt aus dem ER das Hauptproblem des ineffizienten FVIII-Transports zu sein scheint und weniger der intrazelluläre Transport an sich. Mittels siRNA-Silencing wurde außerdem die überwiegende Beteiligung von COPI am intrazellulären Transport von FVIII deutlich, dessen Herunterregulierung zu einer 78 prozentigen Reduktion der FVIII-Sekretion im Gegensatz zu 32 Prozent bei COPII führte. Dagegen konnte durch Herunterregulierung der Expression der p24-Cargo-Rezeptor Familienmitglieder p24 und p26 und der Clathrin Adapterproteine µ- und -Adaptin bzw. durch physiologischen Knock-out im Falle von ER-Exit-Rezeptor MCFD2 kein Einfluß auf die FVIII-Sekretion festgestellt werden. (2) Als Alternative zu dem ineffizienten FVIII-Expressionsystem in unphysiologischen Zelllinien, bieten primäre Endothelzellen den Vorteil einer hocheffizienten FVIII-Sekretion. Zur Verwendung bei der rekombinanten Produktion benötigt man allerdings eine kontinuierlich wachsende gut charakterisierte Zelllinie. Zur Immortalisierung wurden aus Nabelschnurblut gewonnene Endothelprogenitorzellen mit der aktiven Untereinheit der humanen Telomerase (hTERT) transduziert. Trotz erfolgreicher Transduktion und langfristiger Expression von hTERT, welche im TRAP-Assay normale Aktivität zeigte, gingen die Zellen nach der natürlichen Teilungsspanne in die Seneszenz über. Möglicherweise wird noch ein weiteres Immortalisierungsgen benötigt oder hTERT ist durch die ektopischen Expression in diesen Endothelzellen nicht funktionell. (3) Der Einsatz hämatopoetischer Stammzellen für gentherapeutische Ansätze zur Expression von humanen FVIII ist bislang aufgrund niedriger Expressionseffizienz der Vektoren limitiert. Es wurden daher die Kombinationen verschiedener transkriptioneller und posttranskriptioneller Elemente in FVIII-Expressionsvektoren ausgetestet. Hierbei zeigte sich, dass die Verwendung einer 5’ untranslatierten Region (5’UTR) des hämatopoetisch exprimierten FXIIIA-Gens die FVIII-Sekretion in verschiedenen Zelllinien und primären Zellen deutlich steigerte. Am stärksten war die Wirkung in primären Monozyten, in denen die FVIII-Expression den 6fachen Wert im Vergleich zum Ursprungsvektor ohne 5’UTR erreichte. Leberzellen stellen weitere attraktive Zielzellen für gentherapeutische Ansätze dar, da Sie den primären physiologischen Ort der FVIII-Synthese darstellen. Die häufig für Gentherapievektoren verwendeten ubiquitär exprimierenden viralen Promotoren bewirken zwar hohe Expression in den transduzierten Zellen, haben allerdings den Nachteil durch ektopische Expression vermehrt Immunantworten auszulösen und durch starke Interaktion mit benachbarten Promotoren der Integrationsstelle im Genom möglicherweise tumorgene Effekte zu verursachen. Bei der Untersuchung verschiedener physiologischer Promotoren im Vergleich zum viralen CMV Promotor in Leberzellen konnte mit dem zum ersten mal getesteten minimalen FVIII-Promoter in einem lentiviralen Vektor der dritten Generation in Leberzelllinien eine vergleichsweise hohe Expression von 0,5 IU/ml FVIII /106 Zellen erzielt werden. Der FVIII-Promoter ist daher geeignet für eine lebergerichtete Expression und minimiert dabei das potentielle Risiko der häufig verwendeten ubiquitären viralen Promotoren.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Gallensäure UDC, CDC und LC auf die Aktivität der ADH untersucht. Dabei wurden einmal die freie ADH und die in Liposomen eingebaute ADH verwendet. Die Liposomen besaßen eine unterschiedliche Lipidzusammensetzung, die sich an der Hepatozytenmembran orientierte. Des Weiteren wurde der Einfluss des bei der Oxidation von Äthanol entstehenden toxischen Produktes Acetaldehyd auf die ADHAktivität untersucht. Die ADH-Aktivität wurde nach Messung des entstehenden NADH im Photometer bei 340 nm berechnet. Es konnte gezeigt werden, dass die Geschwindigkeit der Äthanoloxidation mit der freien ADH bis zu einer Äthanolkonzentration von 20 mM gesteigert werden konnte. Bei 40 mM Äthanol war keine weitere ADH-Aktivitätszunahme mehr zu verzeichnen. Die Enzymmoleküle waren mit Substrat gesättigt. Wurde die ADH jedoch in Liposomen, unabhängig von ihrer Zusammensetzung eingeschlossen, dann konnte eine Aktivitätssteigerung bis 40 mM Äthanol beobachtet werden. Die Ursache des Effektes muss an anderer Stelle geklärt werden. Die Grundaktivität des Enzyms bei einer Äthanolkonzentration von 20 mM schwankte in den einzelnen Versuchen zwischen 20,40 bis 140,60 U · l-1. Die Ursache ist einerseits der unterschiedliche Proteingehalt, andererseits eine mögliche Instabilität des Hefeenzyms an sich. Wird anstelle des Substrates Äthanol das eigentliche Produkt der Oxidationsreaktion Acetaldehyd eingesetzt, dann lässt sich ein NADH-Anstieg im Photometer messen. Die ADH besitzt somit auch eine Aldehyddehydrogenase-Aktivität, die zwar im Gegensatz zu der Alkoholdehydrogenase-Aktivität schwächer ist, aber dennoch das Aldehyd in Gegenwart von NAD+ zu Essigsäure und NADH umsetzt. Auffällig war dies ab 20 mM Acetaldehydkonzentration in den Versuchen mit der freien ADH und bereits ab 5 mM Acetaldehyd mit der liposomal rekonstituierten ADH. Die Reaktion mit steigender Konzentration von Acetaldehyd und Zugabe von 20 mM Äthanol ergab einen Abfall der ADH-Aktivität. Äthanol hemmt Acetaldehyd nicht kompetitiv, so dass Äthanol langsamer umgesetzt wird. Auch eine kompetitive Hemmung von Acetaldehyd gegenüber Äthanol, bei der es zu einer direkten Konkurrenz um das aktive Zentrum des Enzyms kommt, ist denkbar. Eine Beeinflussung der Enzymaktivität durch die hydrophilen Gallensäuren UDC und CDC konnte in den vorliegenden Untersuchungen nicht erbracht werden. Dadurch konnte auch nicht die Wirkung der Gallensäuren auf die als Modellmembranen fungierenden Liposomen gezeigt werden. Allein die hydrophobe Gallensäure LC inhibierte signifikant die Enzymaktivität. Jedoch zeigte sich dabei kein Unterschied zwischen der Reaktion der freien ADH mit Äthanol und LC und der Reaktion der in die Liposomen eingebauten ADH mit Äthanol und LC. Die Inhibierung kann somit nicht auf die Modellmembran zurückgeführt werden. Sie müsste dementsprechend mit der direkten Interaktion der LC mit dem Enzym zusammenhängen. Der Beweis dafür kann mit dieser Arbeit nicht erbracht werden. Der hepatoprotektive Effekt der hydrophilen Gallensäuren, insbesondere der UDC, beeinflusst die toxische Wirkung des Äthanols und der Produkte der Äthanoloxidation nicht in dem Maße, dass eine therapeutische Konsequenz bei Patienten mit alkoholischen Hepatopathien, ähnlich der Gallensäurentherapie bei Patienten mit primär biliärer Zirrhose, gerechtfertigt wäre.
Tumormarker dienen im Allgemeinen der Verlaufskontrolle bei der Behandlung von Malignomen, unabhängig, ob die Therapie chirurgischen, radiologischen oder chemotherapeutischen Ursprungs ist. Als Ausnahme wäre das PSA zu nennen, welches auch als Screeningparameter Verwendung findet. Die etablierten Tumormarker, die in der Therapie des Mammakarzinoms Verwendung finden, sind unter anderem MCA und CA 15-3. Hierbei handelt es sich ebenso wie bei dem in der vorliegenden Arbeit untersuchten Tumormarker TAG 12 um ein Glykoprotein. Die diagnostische Sensitivität der beiden etablierten Marker beträgt zwischen 50 und 59%, wobei CA 15-3 nur in Kombination mit CEA, ebenfalls ein Glykoprotein, diesen Wert erreicht. TAG 12 dient der Verlaufskontrolle in der Therapie des Mammakarzinoms, als Untersuchungsmaterial wird Serum verwendet. Mittels eines ELISA-Tests, sowie eines Spektralphotometers, erfolgte die Berechnung der Sensitivität, der Spezifität, der Prävalenz, des positiven prädiktiven Wertes und des negativ prädiktiven Wertes. Im Verlauf der durchgeführten Studie stellte sich heraus, dass verschiedene Lebererkrankungen, maligner und benigner Genese, einen Einfluss auf die Höhe des Markerwertes haben, es zeigte sich falschpositive Werte. Dieses Phänomen ist allerdings bei diversen anderen Tumormarkern ebenfalls zu beobachten. Es konnte bei TAG 12 eine Sensitivität von 67% nachgewiesen werden, womit sich der neue Marker mit den oben genannten bereits etablierten Markern durchaus messen kann.
Seit der Einführung der antiretroviralen Therapie (HAART) ist die Mortalität von HIV-Infizierten in der westlichen Welt zwar deutlich zurückgegangen, die HIV-Infektion ist jedoch bis heute nicht heilbar. Die derzeitige Therapie unterdrückt zwar sehr effektiv die Virusreplikation, kann aber nicht das Virus vollständig eliminieren und somit die Infizierten nicht heilen. Die daher notwendige Langzeitbehandlung wird wiederum durch die relativ hohe Toxizität der Medikamente und durch das Auftreten resistenter Virusvarianten limitiert. Die Suche nach neuen Therapienansätzen und Wirkstoffklassen ist daher immer noch von größter Wichtigkeit. Die HIV-Gentherapie stellt neben der konventionellen antiretroviralen Therapie eine mögliche zusätzliche Behandlungsform dar. Die Arbeitsgruppe von Laer hat am Georg-Speyer-Haus retrovirale Vektoren entwickelt, die membrangebundene (ma) HIV-Eintrittsinhibitoren, sog. C Pepitde, kodieren. Das durch den Prototyp-Vektor M87 kodierte maC36-Peptid zeigte eine moderate Inhibition des Viruseintritts. In einem Optimierungsprozess wurde der Vektor M87o generiert. M87o kodiert im Vergleich zu M87 ein wirksameres maC-Peptid (maC46) und weist auch eine wesentlich höhere Expressionsstärke und dadurch eine stärkere inhibitorische Wirkung als der Prototypvektor auf. Ziel dieser Arbeit war es zunächst, HIV Varianten, die resistent gegenüber dem M87o–Genprodukt maC46 sind, in vitro zu generieren und anschließend den Resistenzmechanismus aufzuklären. In einer Kollaboration mit der Gruppe um M. Dittmar aus Heidelberg war durch Passage des HIV 1 Wildtyp (wt) Ba L-Isolats auf M87-transduzierten Zellen bereits das maC36-resistente Virusisolat Ba L_sel_MD generiert worden. Ba L_sel_MD wies zwei Resistenzmutationen in der gp41-Untereinheit des Hüllproteins auf: I556V (heptad repeat 1 Region) und N634K (heptad repeat 2 Region). Für die Mutation 634K war dabei gezeigt worden, dass sie auch zu einer leichten Reduktion der maC46-Sensibilität führt. In der vorliegenden Arbeit diente Ba L_sel_MD als Ausgang für die Selektion einer Virusvariante mit deutlich verminderter Sensibilität gegenüber maC46. Hierfür wurde Ba L_sel_MD über 149 Tage lang auf Zellen mit steigender maC46 Expressionshöhe passagiert und so das Isolat Ba L_FH1 generiert. Das Hüllprotein des selektierten Isolats war ausreichend, um einen maC46-resesistenten Phänotyp hervorzurufen. Das selektierte Hüllprotein war im Vergleich zu dem Ausgangsisolat ca. fünf- bis zehnfach weniger empfindlich gegenüber maC46. Die Sequenzierung des Ba L_FH1 Hüllproteingens zeigte, dass die Aminosäureausprägung an Position 634 des Ausgangsisolats (BaLsel_MD) konserviert worden war, während die Position 556 zur Wildtypsequenz revertiert war. Darüber hinaus wurden drei Mutationen in der gp120-Untereinheit des Hüllproteins (V2-Region (I187T), V3-Region (N305Y), C3-Region (E352K)), sowie eine Mutation in der heptad repeat 1 Region (A579T) der gp41-Untereinheit identifiziert. Für die reduzierte maC46-Empfindlichkeit waren in erster Linie die Mutation N305Y in der V3 Region und die Rückmutation 556I in Zusammenwirkung mit der bereits vorhandenen Mutation 634K verantwortlich. Die verbleibenden Mutationen hatten allenfalls modulierende Wirkung auf die maC46-Sensibilität. Die Resistenz ist vermutlich auf die beobachtete erhöhte Fusionsgeschwindigkeit des Hüllproteins von Ba L_FH1 im Vergleich zum Ausgangsisolat zurückzuführen, die interessanterweise mit einer reduzierten Corezeptoraffinität verknüpft war. Die erhöhte Fusionsgeschwindigkeit verkürzt das zeitliche Fenster, in welchem maC46 an seine Zielstruktur innerhalb des gp41 binden kann. Es scheinen zwei unterschiedliche Phasen des Eintrittprozesses durch die Mutationen verändert worden zu sein. Die Mutation in der V3-Region (N305Y) der gp120-Untereinheit beschleunigt wohl eine frühe Phase. Vermutlich ermöglicht diese Mutation, dass bestimmte Übergangszustände nach der Corezeptorbindung schneller durchlaufen werden können, indem die gp120/Corezeptorbindung destabilisiert wird. Die Rückmutation 556I beschleunigt wahrscheinlich in Zusammenspiel mit der bereits vorhandenen Mutation 634K die Ausbildung des 6 Helixbündels. Diese beiden Mutationen wirken somit auf eine späte Phase der Fusion. Obwohl bekannt ist, dass natürliche Variationen in gp120 die Sensibilität des HIV-Hüllproteins gegenüber C-Peptiden beeinflussen, konnte in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass solche Mutationen auch in vitro selektiert werden, um eine C-Peptidresistenz herbeizuführen.
Die Erstellung und Auswertung der Frankfurter HIV-Resistenzdatenbank dient der Analyse von Prävalenzen von Primär- und Sekundärmutationen im HIV-Genom für die spezifischen antiretroviralen Medikamente sowie der Untersuchung von Korrelationen von Punktmutationen in der Protease mit klinischen Parametern. Die hier vorgestellte allgemeine Datenbankauswertung bestätigte die in der Literatur beschriebene nur geringe Mutationsprävalenz in der Protease, sowohl im Bereich der Primärmutationen (AS-Pos. 30, 46, 48, 50, 82, 84 und 90) also auch der Sekundärmutationen. Ebenso zeigte sich, dass die Ausbildung von Mutationen unter Selektionsdruck durch eine antiretrovirale Therapie deutlich über der von ART-naiven Patienten liegt. Die Untersuchung von Patienten mit niedriger Virusbeladung (Low-level-Patienten) konnte zeigen, dass auch bei Sequenzierungen mit geringem Virusmaterial aussagefähige Ergebnisse zu erzielen sind. Die Mutationen passten sowohl zu den entsprechenden Vortherapien als auch zu den klinischen Parametern, wie Viruslast und CD4+-Zellzahl. Das Verfahren der Genotypisierung stellt daher auch für Patienten mit einer niedrigen Viruslast (< 1000 Kopien/ml Blut) eine geeignete Methode dar, um Fragestellungen nach Mutationen, Therapieverläufen und Resistenzentwicklungen zu beantworten. Die Analyse von Patientenverläufen aus dem Low-level-Kollektiv bestätigte die reziproke Korrelation zwischen Viruslast und CD4+-Zellzahl. Auch hier spiegelte sich in den Ergebnissen der Genotypisierungen der jeweilige klinische Verlauf wider. Die Auswertung von Mutationsveränderungen unter Therapiewechseln bzw. ARTPausen lässt den Erfolg von Therapiepausen zur Rückbildung von Mutationen kritisch betrachten. Bei dem Frankfurter Kollektiv kam es bei allen Patienten nach erneutem Therapiebeginn zu einer Reselektionierung der ursprünglichen Mutationen und war mit einem erneuten Therapieversagen verbunden. Die STI konnte hier zu keiner langfristigen Reduktion der Resistenzen führen. Ebenso wurde deutlich, dass auch bei einem bereits vielfach mutierten HIV-Genom zusätzliche Mutationen selektioniert werden können. Insgesamt gesehen zeigen die Auswertungen aller hier zugrunde liegenden Daten, dass die Genotypisierung eine unverzichtbare diagnostische Methode darstellt, ohne die für den Patienten eine effiziente und optimale medikamentöse Therapie nicht gewährleistet werden kann.
Maligne Gliome sind die häufigsten Neoplasien des Zentralen Nervensystems. Sie zählen zu den hypoxischsten Tumoren und entwickeln u.a. durch die Adaption an niedrige Sauerstoffbedingungen Apoptose-resistente Phänotypen. Darüber hinaus zeichnen sie sich durch schnelle Proliferation und ein diffuses, infiltratives Wachstum in das umliegende Neuropil aus, was eine vollständige Tumor-Resektion unmöglich macht. Entsprechend liegt die mediane Überlebenszeit nach der Diagnose trotz chirurgischen Eingriffs bei anaplastischen Astrozytomen (WHO Grad III) zwischen 18 und 20 Monaten und bei Glioblastomen (WHO Grad IV) zwischen 12 und 15 Monaten. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurden 17 Gliomzelllinien in einem in vitro-Anoxiemodell auf ihre Hypoxie-Sensitivität hin untersucht. Dabei wurde eine hohe Variabilität hinsichtlich der Hypoxie-Toleranz festgestellt, sowie die Tendenz zu einer ausgeprägter Anpassung an niedrige Sauerstoffverhältnisse, begleitet von der Fähigkeit, das mitochondriale Membranpotential (delta psi m) aufrecht zu erhalten. Der durch Hypoxie induzierte Zelltod wurde als Caspase-unabhängig und Nekrose-ähnlich charakterisiert. Apoptose wurde hingegen auch in den Hypoxie-sensitiven Zelllinien nach 48 stündigem Sauerstoffentzug nur in sehr geringem Ausmaß beobachtet. Funktionelle Analysen mit den synthetischen BH3-Mimetika HA14-1 und BH3I 2’, die selektiv Bcl-2 bzw. Bcl xL/Bcl-2 inhibieren, lassen darauf schließen, dass die für Gliomzellen typische Bcl-2- und Bcl xL-Überexpression eine Blockade des mitochondrialen Signalwegs verursacht und so entscheidend zur Apoptose-Resistenz der Zellen beiträgt. Der Todesligand TRAIL, der selektiv in Tumorzellen Zelltod aktiviert, ist ein vielversprechender Kandidat für neue Apoptose-induzierende Krebstherapien. Da jedoch einige Krebszelltypen einschließlich maligner Gliome weitgehend gegen TRAIL resistent sind, richtet sich das Interesse verstärkt auf kombinatorische Therapieansätze, die Tumorzellen für TRAIL resensitivieren sollen. Nur zwei von sechs untersuchten Gliomzelllinien reagierten auf die Behandlung mit TRAIL, wobei eine Korrelation zwischen Hypoxie- und TRAIL-Resistenz deutlich wurde und die Hypothese einer ausgeprägten Kreuzresistenz stärkt. Ein Zusammenhang zwischen TRAIL-Sensitivität und TRAIL-Todes- bzw. –Decoy-Rezeptor-Expression konnte indes nicht hergestellt werden. Der Vergleich von konventionellen Therapienansätzen (Gamma-Bestrahlung) mit neuartigen Wirkstoffklassen (BH3-Mimetika und Proteasomeninhibitoren) zeigte, dass Gamma-Bestrahlung lediglich in TRAIL-sensitiven Zellen synergistisch mit TRAIL wirkte, während die BH3-Mimetika den TRAIL-induzierten Zelltod sowohl in TRAIL-sensitiven als auch –resistenten Zellen signifikant erhöhten. Diese Befunde legen nahe, dass die hohen Bcl-2- und Bcl xL-Proteinlevel verschiedene Signalwege hemmen, die an den Mitochondrien konvergieren und dadurch die Apoptose- bzw. Therapie-Resistenz maligner Gliome steigern. Der Einsatz der Proteasomeninhibitoren MG132 und Epoxomicin erwies sich vergleichsweise als am effizientesten: Beide Substanzen vervielfachten p53-unabhängig den TRAIL-induzierten Zelltod in TRAIL-sensitiven Gliomzellen und reaktivierten darüber hinaus potent die TRAIL-induzierte Apoptose in den TRAIL-resistenten Zelllinien. Microarray- und semi-quantitative RT-PCR-Analysen ergaben eine potente transkriptionelle Aktivierung des TRAIL-Rezeptors DR5 und der Stress-induzierten Transkriptionsfaktoren CHOP und c-Jun. Weitere Untersuchungen mit Hilfe von chemischen Inhibitoren und RNA-Interferenz zeigten, dass die CHOP-unabhängige, JNK/c-Jun-Signalwegs-vermittelte Aktivierung von DR5 eine maßgebliche Rolle bei der Proteasomeninhibitor-induzierten Sensitivierung von Gliomzellen für TRAIL spielt. Zusammengenommen legen die vorgelegten Befunde nahe, dass neue Ansätze basierend auf TRAIL oder agonistischen TRAIL-Rezeptor-Antikörpern in Kombination mit Proteasomeninhibitoren oder BH3-Mimetika vielversprechende Strategien zur Überwindung der Therapieresistenz maligner Gliome darstellen.
Für Experimente der Atomphysikgruppe der GSI in Darmstadt wird ein Ionenabbremser gebaut, der niederenergetische, extrem hochgeladene Ionen zur Verfügung stellen wird. Die Planungen zu der soganennten HITRAP (highly charged ion's trap) begannen Anfang der neunziger Jahre. Mit dieser Anlage sollen hochgeladene, schwere Ionen auf sehr niedrige, thermische Geschwindigkeiten in zwei Stufen abgebremst und für hochpräzise Massenspektroskopie, Messungen des g-Faktors des gebundenen Elektrons wasserstoffähnlicher Ionen und andere atomphysikalische Experimente zur Verfügung stehen. Diese Deceleratoranlage soll zunächst im Reinjektionskanal hinter dem ESR aufgebaut werden, mit der Möglichkeit, alle Komponenten später beim Ausbau der GSI im Rahmen des FAIR-Projektes in der neu zu errichtenden Anlage für niederenergetische Antiprotonen und Ionen zu verwenden. Die vorliegende Arbeit behandelt die Entwicklung und den Aufbau eines integrierten RFQ-Debuncher-Abbremsbeschleunigers, der einen Teil der HITRAP-Abbremsstrukturen darstellt. Mit diesem wird der Ionenstrahl, vom IH-Abbremsbeschleuniger mit einer Energie von 5oo keV/u kommend auf 6 keV/u abgebremst. Mit dem integrierten Spiralbuncher kann der Strahl in Energie und Energieabweichung an die nachfolgende Kühlerfalle angepasst werden. Es wurden in dieser Arbeit die Grundlagen der Teilchendynamik in einem RFQ-Beschleuniger zum Abbremsen von Teilchenstrahlen erarbeitet und umgesetzt, die zur Auslegung einer solchen Struktur notwendigen Teilchendynamikrechnungen mit RFQSim durchgeführt, geeignete Hf-Strukturen mit dem Simulationsprogramm Microwave Studio entwickelt und untersucht, sowie die thermische Belastung der Strukturen mit dem finite Elementeprogramm ALGOR untersucht. Ein weiterer zentraler Punkt dieser Arbeit ist der Aufbau und die Hf-Abstimmung der RFQ-Struktur, um eine möglichst homogene Feldverteilung entlang der Elektroden zu erreichen. Messungen der Felder im RFQ wurden mit einem Störkondensator, am Debuncher mit einem Störkörper durchgeführt. Nach erfolgreich durchgeführten Vakuumtests am IAP ist die RFQ-Debuncher-Kombination nun bereit für erste Hochleistungstests an der GSI.
Der menschliche Körper ist permanent mechanischen Reizen in Form von Dehnung oder Druck ausgesetzt. Diese Stimuli können vielfältige zelluläre Prozesse induzieren. Dehnungsreize erhöhen die Zellproliferation in allen bisher untersuchten Zellspezies, inklusive Endothel- und Epithelzellen. Im Gegensatz dazu scheinen mechanische Druckbelastungen zu zellulärer Differenzierung zu führen. Die Relevanz dieser mechanischen Reize für die Physiologie und Pathophysiologie ist für viele Organe nachgewiesen worden. Jedoch gibt es bislang keine hinreichenden Untersuchungen, die belegen, dass mechanische Reize ebenso eine Rolle bei der Tumorproliferation spielen könnten. Im Fokus dieser Promotionsarbeit steht die Fragestellung, inwieweit die mechanischen Verhältnisse in Tumoren in einem funktionellen Zusammenhang mit der Tumorgenese stehen. Zur Klärung dieser Fragestellung ist ein Xenograft-Tumormodell etabliert worden, das es erlaubt in vivo-Untersuchungen an humanen epithelialen Tumoren durchzuführen. Um Erfahrungen aus vorherigen in vitro-Versuchen nutzen zu können, wurden humane epitheliale A431-Vulvakarzinom- und humane epitheliale A549-Lungenkarzinomzellen für das Tumormodell verwendet. Mit diesem Modell konnte erstmals in vivo gezeigt werden, dass solide humane Tumore einer permanenten mechanischen Dehnung ausgesetzt sind, die direkten Einfluss auf die Proliferation der Tumorzellen hat. Als zentraler Auslöser für die mechanische Dehnung der Tumorzellen konnte der erhöhte tumorinterstitielle Flüssigkeitsdruck (TIFP) identifiziert werden. Der Einfluss der mechanischen Dehnung auf die Proliferation der Tumorzellen wurde anhand der Phosphorylierung der extracellular regulated kinase 1/2 (ERK1/2) bzw. der Ki-67 Expression gezeigt. Durch die Punktion bzw. Drainage von Tumoren konnte der TIFP experimentell abgesenkt werden und in Folge dessen kam es zu einer reduzierten mechanischen Dehnung der Tumorzellen. In allen Versuchen war die Abnahme der mechanischen Dehnung von einer verringerten Phosphorylierung der ERK1/2 bzw. reduzierten Expression des Proliferationsmarkers Ki-67 begleitet. Der TIFP induziert aber nicht nur mechanische Dehnungsreize, sondern er stellt darüber hinaus eine physikalische Barriere für den effizienten Transport von Therapeutika in den Tumor dar. Der gegenüber dem umliegenden Gewebe erhöhte TIFP behindert den interstitiellen Transport und die Aufnahme von Molekülen aus dem Gefäßsystem in die Tumorzellen. Die Etablierung einer neuen experimentellen Technik zur Senkung des TIFP, durch i.v. Injektion von konzentriertem humanem Serumalbumin, führte zu einer signifikanten Verbesserung der Aufnahme und einer Verlängerung der Verweildauer von Makromolekülen/Therapeutika innerhalb von Tumoren. Des Weiteren konnten immunhistochemische Färbungen gegen lymphspezifische Marker in Gewebeproben von A431 und A549 Tumoren keinen direkten Zusammenhang zwischen Lympharchitektur und TIFP zeigen. Dies bedeutet, dass in den untersuchten Tumoren die Ausbildung des hohen TIFP eher auf eine erhöhte Rigidität der extrazellulären Matrix bzw. die hohe Permeabilität des tumorversorgenden vaskulären Gefäßsystems zurückzuführen ist. Parallel zu den in vivo-Untersuchungen durchgeführte in vitro-Versuche konnten Proteine identifizieren, die an der druckinduzierten p38 Signaltransduktionskaskade beteiligt sind. Diese Ergebnisse untermauern die bisherigen in vitro-Daten bzgl. der differentiellen Reaktionen von Zellen auf mechanische Druckreize. Abschließend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse der in vivo-Versuche die Bedeutung und die klinische Relevanz des biophysikalischen Parameters TIFP hervorgehoben haben. Die Zukunft der Krebstherapie liegt nicht alleine in der Entwicklung neuer hochspezifischer Wirkstoffe, sondern auch in der Lösung des Transports der Wirkstoffe an den Zielort. Die vorgestellten Ergebnisse dieser Promotionsarbeit weisen eine beträchtliche klinische Relevanz auf, denn sie zeigen, dass die experimentelle Absenkung des TIFP zu einer verbesserten Aufnahme von Therapeutika beiträgt. Gleichzeitig wird die Proliferationsrate von Tumorzellen durch die reduzierte mechanische Dehnung signifikant verringert. Dieser Doppeleffekt könnte zu einer effizienteren Krebstherapie führen in Folge derer es zu einer verlängerten Überlebensrate sowie einer Verbesserung der Lebensqualität von Krebspatienten kommen könnte.
Für pädiatrische Patienten mit Hochrisikoleukämien ist die Donor-Lymphozyten-Infusion eine etablierte Therapieform, um nach Stammzelltransplantation die Immunrekonstitution zu verbessern oder ein beginnendes Rezidiv abzuwehren. Als schwerwiegende Nebenwirkung kann jedoch eine „Graft-versus-host“-Krankeit (graft-versus-host disease; GVHD) auftreten, bei der die T-Zellen gesundes Gewebe angreifen. In ersten klinischen Studien mit veränderten, Suizidgen tragenden Donor-Lymphozyten konnte durch die rechtzeitige Gabe eines Suizidinduktors die GVHD unterbunden werden. Die genetische Manipulation der T-Zellen führte jedoch zu einem Funktionsverlust, der vermutlich auf die zur Transduktion notwendige Aktivierung zurückzuführen ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Aktivierungsprotokolle mit Beads-gekoppelten oder löslichen Antikörpern hinsichtlich der Expansionsrate und dem Einfluss auf die Funktionalität der T-Zellen näher untersucht. Dazu wurden primäre humane T-Zellen im klinischen oder im Labormaßstab immunomagnetisch über eine CD3 sowie CD4/CD8 Selektion oder mittels der RosetteSep-Prozedur auf > 96% angereichert und anschließend expandiert. Die Transduktion erfolgte an den Tagen 3 und 4 mit einem „GMP-grade“ CD34/HSV-TK Vektor. Zur Aktivierung wurden zum einen lösliche CD3/CD28 Antikörper und zum anderen zellgroße Kügelchen - sogenannte Beads – verwendet. Die Beads wurden mit CD3/CD28 Antikörper und fakultativ mit CD2 beladen. Die beladenen Beads imitieren in der Zellkultur eine Antigen präsentierende Zelle und sollten damit eine möglichst physiologische Situation schaffen. Außerdem wurden unterschiedliche IL-2 Konzentrationen zugesetzt (20-1000 U/ml), um einen potentiellen IL-2 Effekt auf die T-Zellen zu untersuchen. Die Aktivierung mit den löslichen Antikörpern führte zu einer IL-2 abhängigen Proliferation der T-Zellen über 14 Tage mit maximaler Expansionsrate (47fach) bei 1000 U/ml IL-2. Die Expansion mit Beads-gekoppelten Antikörpern war ebenfalls IL-2 abhängig, beschränkte sich jedoch auf die erste Woche und erreichte eine maximale Expansionsrate von 3-4. In der zweiten Woche fiel die Zellzahl ab. Zusammenfassend sind für eine starke Expansion der T-Zellen eine hohe IL-2 Konzentration, aber auch die löslichen Antikörper per se verantwortlich. Gleichzeitig konnte demonstriert werden, dass es große individuelle Unterschiede in der T-Zellexpansion verschiedener Spender gibt. Der Einfluss der Aktivierung auf die Veränderung der T-Zellsubpopulationen wurde mit Hilfe von multiparametrischen Analysen am Durchflusszytometer untersucht. Hohe IL-2 Konzentrationen (100 und 1000 U/ml) sowie die Verwendung löslicher Antikörper führten zu einer starken Zunahme der CD8+ T-Zellen. Der CD4/CD8 Quotient blieb lediglich unter Stimulierung mit den Beads-gekoppelten Antikörpern in Verbindung mit 20 U/ml IL-2 konstant. Mit allen Aktivierungsprotokollen ergab sich für den immunologischen Phänotyp eine Verschiebung vom naiven zum Gedächtniszelltyp. Die Proliferation CMV-spezifischer T-Zellen konnte mit allen Aktivierungsprotokollen erreicht werden und korrelierte mit der Expansionsrate der gesamten CD3+ T-Zellen. Die Zytokinausschüttung war verringert bei den T-Zellen, die mit den löslichen Antikörpern stimuliert wurden. Eine verminderte Zytokinproduktion könnte auf einen Verlust der Funktionalität der T-Zellen hindeuten. Von besonderer Bedeutung ist, dass die Stimulierung über Beads-gekoppelte Antikörper zu einer gleichmäßigen Transduktion von CD4+ und CD8+ T-Zellen führte. Im Gegensatz dazu hatte die Aktivierung mit löslichen Antikörpern zur Folge, dass hauptsächlich CD8+ T-Zellen transduziert wurden. Für eine kompetente Immunantwort im Rahmen einer DLI erscheint jedoch eine physiologische Zusammensetzung der CD4+ und CD8+ T-Zellen äußerst wichtig. Residuale Stammzellen könnten potentiell co-transduziert werden. Um diese Gefahr abschätzen zu können, wurden ficollisierte PBSC analog der T-Zellen expandiert. Unter allen T-Zellaktivierungsprotokollen blieben die CD34+ Stammzellen in den ersten Tagen der Kultur vital und durchflusszytometrisch nachweisbar. Die Stammzellen expandierten sogar geringfügig und waren damit potentiell transduzierbar - mit der Gefahr einer klonalen Entartung durch Insertionsmutagenese. Dies deutet auf die Wichtigkeit einer T-Zellselektion zur Manipulation von DLI hin, um residuale Stammzellen zu entfernen. Die Suizidstrategie ist eine vielversprechende Möglichkeit zur Kontrolle der GVHD im Rahmen einer DLI. Voraussetzung ist aber, dass die infundierten Zellen auch immunologisch kompetent bleiben und einen GvL-Effekt bewirken. Die Aktivierung mit Beads-gekoppelten Antikörpern scheint zum Erhalt der Immunkompetenz den löslichen Antikörpern überlegen zu sein.