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The $p$-adic section conjecture predicts that for a smooth, proper, hyperbolic curve $X$ over a $p$-adic field $k$, every section of the map of étale fundamental groups $\pi_1(X) \to G_k$ is induced by a unique $k$-rational point of $X$. While this conjecture is still open, the birational variant in which $X$ is replaced by its generic point is known due to Koenigsmann. Generalising an alternative proof of Pop, we extend this result to certain localisations of $X$ at a set of closed points $S$, an intermediate version in between the full section conjecture and its birational variant. As one application, we prove the section conjecture for $X_S$ whenever $S$ is a countable set of closed points.
Inhibitoren der Apoptose (IAP, inhibitor of apoptosis) Proteine spielen eine wichtige Rolle in Bezug auf Zelltodregulation und es ist anzunehmen, dass eine Dysregulation dieser Proteine zu einer Tumorentwicklung und Tumorprogression beiträgt. Erhöhte Expressionslevel von IAP Proteinen verhindern die Aktivierbarkeit des Zelltodprogrammes von Tumorzellen und eine Reihe von Studien konnte bereits erhöhte IAP Level in Tumorzelllinien sowie in primären Tumorproben nachweisen. Des Weiteren korrelieren erhöhte Expressionslevel von IAPs in Tumoren mit Behandlungsresistenzen und schlechten Prognosen für die Patienten.
Das diffuse großzellige B-Zell Lymphom (DLBCL, diffuse large B-cell lymphoma) zählt zu den häufigsten Subtypen der Non-Hodgkin Lymphome (NHL) mit 40 % aller neu diagnostizierten NHL Fälle. DLBCL ist eine sehr heterogene Erkrankung die in drei verschiedene Gruppen klassifiziert wurde: aktivierter B-Zell Typ (ABC, activated B-cell), Keimzentrum B-Zell Typ (GCB, germinal center B-Cell) und Mediastinaler großzelliger B-Zell Typ (PMBL, primary mediastinal B-cell lymphoma). Erhöhte Expressionslevel von zellulärem IAP1 (cIAP, cellular IAP) und cIAP2 wurden ebenfalls in primären Tumorproben von DLBCL Patienten nachgewiesen. Smac mimetics wurden entwickelt, um IAPs zu antagonisieren und stellen damit eine Behandlungsstrategie für DLBCL Patienten dar, denn ca. 40 % aller DLBCL Patienten entwickeln ein Rezidiv oder erreichen gar keine Remission unter Standardtherapie. Jedoch ist der Effekt von Smac mimetics in einer Einzelbehandlung limitiert, weswegen Kombinationstherapien mit Smac mimetics eine vielversprechende Strategie für ihren klinischen Einsatz darstellen. Aus diesem Grund haben wir in dieser Arbeit den Effekt von Smac mimetic in Kombination mit Proteasom-Inhibitoren analysiert und einen speziellen Fokus auf den molekularen Mechanismus des ausgelösten Zelltodsignalweges gelegt.
Die Kombination verschiedener Konzentrationen des Smac mimetics BV6 mit dem Proteasom-Inhibitor carfilzomib (CFZ) löst in allen drei getesteten DLBCL Subtypen (ABC, GCB und PMBL) Zelltod aus. Die Kalkulation des Kombinationsindexes (CI, combination index) sowie des Bliss Scores, zwei quantitative Parameter zur Bestimmung eines Synergismus, zeigen, dass fast alle getesteten Kombinationen einen Synergismus aufweisen. Dies verdeutlicht, dass eine Co-Behandlung von BV6 und CFZ eine wirksame Kombination ist um Zelltod in DLBCL Zelllinien auszulösen. Außerdem zeigt eine Kombination von BV6 mit anderen Proteasom-Inhibitoren wie ixazomib (IXA) oder oprozomib (OPR), ebenfalls eine synergistische Reduktion der Zellviabilität. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der detektierte Effekt nicht auf eine Substanz limitiert ist, sondern, dass ein genereller Effekt von Smac mimetic und Proteasom-Inhibitoren vorliegt, um Zellviabilität in DLBCL zu reduzieren. BV6 und CFZ induzieren einen apoptotischen Zelltod, da sie die Spaltung und Aktivierung von Initiator- und Effektorcaspasen (Caspasen-3, -7, -8 und -9) initiieren und sich der induzierte Zelltod mit Hilfe des Caspasen-Inhibitors zVAD.fmk verhindern lässt. Die Behandlung mit BV6 und CFZ führt zu einer Akkumulation von NIK, ein Protein welches zur Aktivierung des non-kanonischen NF-kB Signalweges benötigt wird. Weitere Untersuchungen zeigen jedoch, dass NIK nicht an der Zelltodinduktion beteiligt ist, da eine siRNA-basierte Herunterregulierung des NIK Proteins keinen Einfluss auf die Zelltodinduktion nimmt. Ebenfalls ist der Zelltod unabhängig von dem TNFa Signalweg, da weder eine Behandlung mit dem TNFa Inhibitor Enbrel den Zelltod verringern kann noch eine zusätzliche Gabe von TNFa den Zelltod erhöht. Weitere mechanistische Studien zeigen eine kritische Rolle der mitochondrialen Apoptose für den BV6/CFZ-vermittelten Zelltod. Unter Behandlung mit BV6/CFZ wurde eine Aktivierung von BAX und BAK nachgewiesen, welche beide mit verantwortlich für die Porenbildung in der mitochondrialen Membran sind. Eine Herunterregulation dieser beiden Proteine mittels siRNA reduziert signifikant den durch BV6/CFZ-induzierten Zelltod auf ein Minimum. Gleichzeitig löst eine Co-Behandlung mit BV6/CFZ einen Verlust des mitochondrialen Membranpotentials (LOMMP, loss of mitochondrial membrane potential) aus. In Übereinstimmung mit den vorherigen Experimenten, zeigen wir eine Akkumulation von mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS; reactive oxygen species), sowie einen generellen Anstieg des allgemeinen ROS Levels. Eine Behandlung mit BV6/CFZ zeigt eine deutliche Akkumulation des pro-apoptotischen Proteins NOXA. Um dessen funktionelle Relevanz zu überprüfen, wurde die Proteinmenge von NOXA mittels siRNA stark reduziert. Eine Behandlung mit der Kombination aus BV6 und CFZ zeigt daraufhin eine signifikant reduzierte Zelltodinduktion, was die funktionelle Relevanz von NOXA für den BV6/CFZ-vermittelten Zelltod unterstreicht. Immunopräzipitationsstudien zeigen, dass in RIVA und U2932 Zellen NOXA konstitutiv an seinen anti-apoptotischen Bindungspartner MCL-1 gebunden ist, was die Zellen bereits darauf vorbereitet Apoptose zu durchlaufen. Dieses sogenannte „primen“ für Apoptose wird durch die Behandlung mit BV6 und CFZ weiter verstärkt, da es die Bindung zwischen NOXA und MCL-1 weiter erhöht. Dadurch wird die Balance zwischen pro- und anti-apoptotischen Proteinen zu Gunsten der pro-apoptotischen Proteine verschoben und die Induktion von Apoptose begünstigt.
Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass DLBCL Zelllinien sensitiv auf eine Behandlung mit Smac mimetic und Proteasom-Inhibitor reagieren und damit eine mögliche neue Behandlungsstrategie für diese heterogene Tumorerkrankung darstellt.
Alzheimer’s disease (AD) is the major cause of dementia. It is characterized by the accumulation of abnormal proteins (amyloid-β plaque and neurofibrillary tangles) leading to loss of synapses, dendrites, neurons, memory and cognition. Sporadic late-onset AD is the major type of AD characterized by unclear etiology and a lack of disease-modifying therapy. To understand this disease, an alternative AD hypothesis has been proposed: AD may resemble diabetes in the brain or “diabetes type 3”. This hypothesis is supported by the fact that (1) brain glucose hypometabolism precedes AD clinical symptoms and (2) diabetes increases the risk of AD. To test this hypothesis, wild-type rats receiving intracerebroventricular administration of streptozotocin (icv-STZ) were used as a model. Streptozotocin (STZ) is a glucosamine-nitrosourea compound commonly used to induce experimental diabetes by peripheral administration. A similar pathological mechanism to peripheral STZ is then proposed to explain icv-STZ toxicity: insulin receptor signaling impairment results in glucose hypometabolism leading to cognitive deficits.
Objective: Icv-STZ model seems promising as a toxin-induced, non-transgenic AD model with the possibility to connect AD and diabetes mellitus (DM), one of the risk factors for AD. However, the mechanisms of how icv-STZ induced AD-like symptoms are unclear. Therefore, using microdialysis as the main technique, we tested 2 AD hypotheses in this model: (1) the glucose hypometabolism as an alternative AD hypothesis and (2) the cholinergic deficit as an important characteristic of AD pathology. Hippocampus was chosen because cholinergic function in this region is severely affected in AD. In comparison, the striatum was chosen because it contains cholinergic interneurons and is less affected in AD.
Methods: In this study, we used male Wistar rats of 190-220 g body weight (5 weeks of age). The rats were injected intracerebrally with STZ at a dose of 3 mg/kg (2x1.5 mg/kg; „high dose“) and 0.6 mg/kg („low dose“) with saline as control. After 21 days, samples were collected to investigate cholinergic and metabolic changes using histology, biochemistry, and neurochemistry. Brain injury was confirmed using GFAP staining and Fluoro jade staining in the hippocampus. Mitochondrial toxicity was investigated by measurement of mitochondrial
respiratory function in both hippocampus and striatum. Cholinergic markers such as acetylcholinesterase (AChE) activity, choline acetyltransferase (ChAT) activity, and choline transporter (CHT-1) activity, commonly known as high-affinity choline uptake (HACU), were measured in both hippocampus and striatum using a spectrophotometer and a scintillator.
Microdialysis is the main technique in our study. It was done in awake animals under behavioral or pharmacological stimulation. We used a self-built probe with a semi-permeable membrane (pore size of 30 kDa) that was implanted in either hippocampus or striatum. The probes were then perfused with artificial cerebrospinal fluid (aCSF) supplemented with 0.1 μM neostigmine for extracellular acetylcholine level measurement. During the perfusion, small hydrophilic compounds from brain extracellular space diffuse into the dialysates. Dialysates of 15 minutes intervals were collected for 90 minutes and used for analysis. After collection of dialysates for the first 90 minutes (basal data), rats were moved to an open field box (35x32x20 cm) for behavioral stimulation. After collection of the second 90 minute dialysates, the rats were transferred back to the microdialysis cage and dialysates were collected for another 90 minutes. On day 2, after collection of dialysates under basal conditions, 1 μM scopolamine was added to the perfusion solution for stimulation of acetylcholine release. The dialysates were also collected for 90 min followed by another 90 min of dialysis without scopolamine. The microdialysate samples were then analyzed as follows. ACh level was measured by HPLC-ECD. Glucose metabolites (glucose, lactate, pyruvate) were measured by a CMA-600 microanalyzer. An alternative energy metabolite (beta-hydroxybutyrate/BHB) was measured by GC-MS. Choline and glycerol as membrane breakdown markers were also measured by HPLC-ECD and CMA-600 microanalyzer, respectively. Markers of oxidative stress (isoprostanes) were measured using a commercially available ELISA kit.
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A novel role for mutant mRNA degradation in triggering transcriptional adaptation to mutations
(2020)
Robustness to mutations promotes organisms’ well-being and fitness. The increasing number of mutants in various model organisms, and humans, showing no obvious phenotype (Bouche and Bouchez, 2001; Chen et al., 2016b; Giaever et al., 2002; Kok et al., 2015) has renewed interest into how organisms adapt to gene loss. In the presence of deleterious mutations, genetic compensation by transcriptional upregulation of related gene(s) (also known as transcriptional adaptation) has been reported in numerous systems (El-Brolosy and Stainier, 2017; Rossi et al., 2015; Tondeleir et al., 2012); however, the molecular mechanisms underlying this response remained unclear. To investigate this phenomenon, I develop and study multiple models of transcriptional adaptation in zebrafish and mouse cell lines. I first show that transcriptional adaptation is not caused by loss of protein function, indicating that the trigger lies upstream, and find that the response involves enhanced transcription of the related gene(s). Furthermore, I observe a correlation between levels of mutant mRNA degradation and upregulation of related genes. To investigate the role of mutant mRNA degradation in triggering the response, I generate mutant alleles that do not transcribe the mutated gene and find that they fail to induce a transcriptional response and display stronger phenotypes. Transcriptome analysis of alleles displaying mutant mRNA degradation revealed upregulation of a significant proportion of genes displaying sequence similarity with the mutated gene’s mRNA, suggesting a model whereby mRNA degradation intermediates induce transcriptional adaptation via sequence similarity. Further mechanistic analyses suggested RNA-decay factors-dependent chromatin remodeling, and repression of antisense RNAs to be implicated in the response. These results identify a novel role for mutant mRNA degradation in buffering against mutations. Besides, they hold huge implications on understanding disease-causing mutations and shall help in designing mutations that lead to minimal transcriptional adaptation-induced compensation, facilitating studying gene function in model organisms.
An overexpression of the E3 ubiquitin ligase TRIM25 is implicated in several human cancers and frequently correlates with a poor prognosis and occurrence of therapy resistance in patients. Previous studies of our group have identified the mRNA encoding the pro-apoptotic caspase-2 as a direct target of the ubiquitous RNA binding protein human antigen R (HuR). The constitutive HuR binding observed in colon carcinoma cells negatively interferes with the translation of caspase-2 mainly through binding to the 5' untranslated region (UTR) of caspase-2 and thereby confers an increased survival of tumor cells. The main objective of this thesis was to unravel novel regulatory proteins critically involved in the control of caspase-2 translation and their impact on therapeutic drug resistance of human colon carcinoma cells. By employing RNA affinity chromatography in combination with mass-spectrometry, among several putative caspase-2 mRNA binding proteins, we have identified the tripartite motif-containing protein 25 (TRIM25) as novel caspase-2 translation regulatory protein in colon carcinoma cells. The constitutive TRIM25 binding to caspase-2 mRNA in two different human colorectal carcinoma cell lines was validated by ribonucleoprotein (RNP)-immunoprecipitation (RIP)-RT-PCR assay and by means of biotin-labeled RNA-pull-down assay. Since caspase-2 is a caspase which is particularly involved in the DNA-damage-induced apoptosis, I tested the functional relevance of negative caspase-2 regulation by TRIM25 for chemotherapeutic drug-induced cell death of different adenocarcinoma cells by RNA interference (RNAi)- mediated loss-of-function and gain-of-function approaches. In the first part of the thesis, I could demonstrate that transient silencing of TRIM25 caused a significant increase in caspase-2 protein levels without affecting the amount of corresponding mRNAs. Mechanistically, the TRIM25 silencing-triggered increase in caspase-2 was totally impaired by cycloheximide, indicating that the stimulatory effects on caspase-2 levels depend on protein synthesis. This finding was corroborated by RNP/polysomal fractionation, which revealed that the transient knockdown of TRIM25 caused a significant redistribution of caspase-2 transcripts from the fraction of RNP particles to that from translationally active polyribosomes.
The second part of my thesis aimed at the elucidation of the functional consequences of the negative caspase-2 regulation by TRIM25 for enhanced tumor cell survival. Thereby, I found that the siRNA-mediated knockdown of TRIM25 caused a significant increase in the chemotherapeutic drug-induced cleavage of caspase-3 and to elevations in cytoplasmic cytochrome c levels implicating that TRIM25 depletion did mainly affect the intrinsic apoptotic pathway. Concordantly, the ectopic expression of TRIM25 caused a reduction in caspase-2 protein levels, concomitant with an attenuated sensitivity of tumor cells to doxorubicin.
To test the functional impact of caspase-2 in the TRIM25 depletion-dependent sensitization to drug-induced apoptosis, I employed a siRNA-mediated knockdown of caspase-2. Interestingly, the strong induction of caspase-3 and -7 cleavage after doxorubicin treatment was fully impaired after the additional knockdown of caspase-2, indicating the sensitizing effects by TRIM25 knockdown depend on caspase-2.
Data from this thesis identified the TRIM25 as a novel RNA-binding protein of caspase-2 mRNA, which negatively interferes with the translation of caspase-2 and which functionally contributes to chemotherapeutic drug resistance of colon carcinoma cells. Interfering with the negative TRIM25-caspase-2 axis may represent a promising therapeutic avenue for sensitizing colorectal cancers to conventional anti-tumor therapies.
Bipolar disorder (BD) and major depressive disorder (MDD) are severe mood disorders that belong to the most debilitating diseases worldwide. Differentiating both mood disorders often poses a major clinical challenge, leading to frequent misdiagnoses. Objective biomarkers able to differentiate individuals with BD and MDD therefore represent a psychiatric research field of utmost importance. Recent studies have applied resting-state fMRI paradigms and found promising results differentiating both disorders based on the acquired data. However, most of these studies have focused their efforts on acutely depressed patients. Thus, it remains unclear whether the aberrations remain in a symptomless disease state.
The here presented study addresses these issues by evaluating the ability to differentiate both disorders from one another by conducting a between-group comparison of functional brain network connectivity (FNC) obtained from resting-state fMRI data. Data were collected from 20 BD, 15 MDD patients and 30 age- and gender-matched healthy controls (HC). Graph theoretical analyses were applied to detect differences in functional network organization between the groups on a global and regional network level.
Network analysis detected frontal, temporal and subcortical nodes in emotion regulation areas such as the limbic system and associated regions exhibiting significant differences in network integration and segregation in BD compared to MDD patients and HC. Participants with MDD and HC only differed in frontal and insular network centrality.
These results indicate that a significantly altered brain network topology in the limbic system might be a trait marker specific to BD. Brain network analysis in these regions may therefore be used to differentiate euthymic BD not only from HC but also from patients with MDD.
Dopaminerge Neurone sind vor allem im Mittelhirn lokalisiert und modulieren die Funktion der Basalganglien, welche eine wichtige Rolle bei motorischem, kognitivem und emotionalem Verhalten spielen. Eine Dysregulation dopaminerger Neurotransmission, speziell die veränderte Belohnungsverarbeitung, spielt eine zentrale Rolle in der Ätiopathogenese der Aufmerksamkeitsdefizit- und Hyperaktivitätsstörung (ADHS), die im Erwachsenenalter häufig durch Komorbiditäten wie affektive Störungen, Angststörungen, Substanzgebrauch-Störungen, Persönlichkeitsstörungen oder Adipositas geprägt ist. Im Rahmen einer Teilstudie eines multizentrischen europäischen Projekts, CoCA (englisch: Comorbid Conditions in ADHD) genannt, soll die Modulation des dopaminergen Belohnungssystems bei gesunden Probanden durch einen pharmakologischen Provokationstest geprüft werden. Die funktionelle Magnetresonanztomographie (MRT) stellt hierbei ein nützliches bildgebendes Verfahren dar, das nicht-invasiv und bei hoher örtlicher Auflösung Veränderungen des sogenannten BOLD-Signals (englisch: blood oxygen level dependent) misst.
Die vorliegende Arbeit untersucht, inwiefern das dopaminerge Belohnungssystem durch einen pharmakologischen Provokationstest mit einem Dopaminagonisten sowie einem Dopaminantagonisten im Vergleich zu Placebo zu modulieren ist. Dazu wurde die BOLD-Antwort mittels funktionellem MRT während eines Gewinnspiels (Monetary Incentive Delay Tasks) mit inbegriffener Antizipations- und Feedback-Phase erforscht. Es wurde zuvor postuliert, dass sich die Aktivität belohnungsabhängiger Strukturen (wie ventrales Striatum, Putamen, Caudatus, anteriore Insula und medialer präfrontaler Kortex) während des Monetary Incentive Delay Tasks in einem pharmakologisch neutralen Haupteffekt reproduzieren lässt. Außerdem wurde ein Unterschied im Aktivitätsniveau des Belohnungssystems unter Pharmaka-Administration versus Placebo erwartet, sodass unter Amisulprid eine Dämpfung, und unter Levodopa eine Aktivitätssteigerung dessen darstellbar werden sollte.
Ein kontrolliert randomisiertes, doppelblindes Cross-over-Studiendesign, umfasste 45 gesunde Probanden, die durchschnittlich circa 23 Jahre alt (SD = 2,71 Jahre) waren. Die Studienteilnehmer absolvierten einen pharmakologischen Provokationstest mit Levodopa (100mg/ 25mg Carbidopa), Amisulprid (200mg) und Placebo sowie anschließender fMRT-Messung in einem 3 Tesla Scanner in randomisierter Reihenfolge. Die Analyse der fMRT-Daten erfolgte anhand von zwei primär definierten Kontrasten: Antizipation Gewinnbedingung > Feedback Gewinnbedingung und Antizipation Gewinnbedingung > Antizipation Kontrollbedingung zur Untersuchung von Belohnungserwartung und Feedback mittels der gemessenen BOLD-Antworten. Das verwendete GewinnspielParadigma, Monetary Incentive Delay Task genannt, erlaubt hierbei eine Beobachtung verschiedener Anteile der Belohnungsverarbeitung.
Im Haupteffekt der beiden Kontraste konnte eine signifikante BOLD-Aktivität in belohnungsabhängigen Gehirnregionen wie Putamen, anteriore Insula und Thalamus dargestellt werden. Unter Amisulprid-Administration konnte ein signifikanter dämpfender Effekt im Vergleich zu Placebo gezeigt werden. Für Levodopa ergab sich wider Erwarten jedoch kein signifikanter Unterschied im Aktivitätsniveau des Belohnungssystems.
Die vorhandenen Ergebnisse der durchgeführten Studie bieten eine Basis, die veränderte Regulation dopaminerger Neurotransmission im Rahmen psychiatrischer Erkrankungen besser zu beurteilen und weiter zu erforschen. Um ADHS mit seinen Komorbiditäten umfänglicher zu erfassen, ist es unvermeidbar, den Pathomechanismus der Dysregulation dopaminerger Neurotransmission, mit der daraus folgenden veränderten Belohnungsverarbeitung, in zukünftigen Studien genauer zu untersuchen.
Investigating the inhibition of anti-apoptotic BCL-2 family proteins in pediatric cancer cells
(2020)
Cancer is amongst the leading causes of death in childhood. Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most frequently occurring soft tissue sarcoma in children and adolescents. It presumably arises from mesenchymal progenitors of skeletal muscle cells and presents with different subtypes that differ both histologically and genetically. Osteosarcoma (OS) and Ewing sarcoma (ES) are the most frequently diagnosed pediatric bone tumors. Even though the prognosis of these cancer entities improved significantly during recent decades, the survival rates are currently stagnating. Especially, dismal prognosis of relapsed and metastasizing cases of these malignancies urgently call for novel treatment options. BCL-2 proteins are vital guardians that control intrinsic apoptosis. Furthermore, it was shown that BCL-2 proteins critically regulate apoptosis in pediatric solid tumors. BH3 mimetics are small molecules that bind and inhibit anti-apoptotic BCL-2 proteins. They have already been investigated as cancer therapeutics for several years and show first encouraging clinical results. Therefore, we hypothesized that targeting BCL-2, MCL-1 and BCL-XL might be a promising approach to treat RMS, OS and ES.
In this study, we aimed to comprehensively evaluate the potential of anti-apoptotic BCL-2 family proteins as therapeutic targets for pediatric solid tumors such as RMS, OS and ES.
Notably, RMS, OS and ES cells largely expressed the most relevant BCL-2 family protein members. However, cells were widely insensitive to single pharmacological inhibition of either BCL-XL, BCL-2 or MCL-1 by A-1331852, ABT-199 and S63845, respectively. This finding was independent of their BCL-2 family protein expression levels. Significantly, co-administration of A-1331852 and S63845 induced cell death in RMS, OS and ES cell lines in a highly synergistic manner. Transient silencing of MCL-1 and/or BCL-XL verified the co-dependency of RMS cells on these proteins for survival. Importantly, A-1331852/S63845 co-treatment was more efficient in causing cell death in RMS, OS and ES cells than either inhibitor combined with ABT-199. Efficacy of A-1331852/S63845 co-treatment could be additionally demonstrated in a primary sample of pediatric malignant epithelioid mesothelioma.
Mechanistically, concomitant A-1331852/S63845 treatment mediated rapid intrinsic apoptosis involving swift loss of the mitochondrial outer membrane potential as well as activation of caspases-3, -8 and -9. An observed caspase dependent loss of MCL-1 might further amplify the A-1331852/S63845 triggered pro-death signaling. Furthermore, we identified BAX and BAK as key mediators of apoptosis caused by dual inhibition of MCL-1 and BCL-XL. A-1331852/S63845 induced cell death was relying on BAX and/or BAK in a cell line dependent manner. Interestingly, treatment with A-1331852 and S63845 liberated BAK from its interaction with MCL-1 and BCL-XL. Moreover, BAX and BAK were activated and interacted with each other to form a pore in the outer mitochondrial membrane. Further, in RD cells BIM and NOXA partially contributed to A-1331852/S63845 mediated cell death. Consistently, in this cell line BIM and NOXA were disrupted from their binding to BCL-XL and MCL-1 by A-1331852 and S63845, respectively. However, BH3 only proteins were not involved in A-1331852/S63845 induced cell death in Kym-1 cells. Therefore, we concluded that BH3 only proteins played only a marginal and cell line dependent role in mediating cell death caused by MCL-1 and BCL-XL co-repression.
Notably, A-1331852/S63845 co-treatment spared non-malignant fibroblasts, myoblasts and peripheral blood mononuclear cells, which suggests a therapeutic window for its application in vivo. Besides, we could demonstrate that sequential BH3 mimetic treatment still significantly induced cell death, albeit to minor extents compared to its dual administration. Importantly, we successfully evaluated concomitant treatment with A-1331852 and S63845 in multicellular RMS spheroids and in an in vivo embryonic chicken model of RMS. These findings stress the high transcriptional relevance of A-1331852/S63845 as an emerging novel cancer regimen.
Collectively, the thesis at hand explored the great potential of co-treatment with A-1331852 and S63845 in pediatric solid tumors and unveiled the underlying molecular mechanisms of cell death in RMS. Together, the current investigations support further preclinical and clinical studies to evaluate the effect of dual MCL-1 and BCL-XL targeting in pediatric solid tumors.
The small photoreceptor Photoactive Yellow Protein (PYP) enters a reversible photocycle after excitation with blue light. The intermediate states are formed on timescales ranging from femtoseconds to seconds including chromophore isomerization and protonation as well as large structural rearrangements. To obtain local dynamic information the vibrational label thiocyanate (SCN) can be inserted site-specifically at any desired position in the protein by cysteine mutation and cyanylation. The label's CN stretch vibration is highly sensitive to polarity, hydrogen bonding interactions and electric fields and is spectrally well separated from the overlapping protein absorptions. During the course of this thesis it was impressively demonstrated that the successful incorporation of the SCN label at selected positions in PYP provides a powerful tool to study structure changes and dynamics during the photocycle and enhance the local information that are obtained by infrared (IR) spectroscopic methods. Hence the SCN-labeled protein mutants were studied under equilibrium (steady-state) and non-equilibrium conditions.
Examination of the SCN absorption by FTIR spectroscopy showed the influence of various local environments on the label for different locations in the dark state. The response of the label under illumination with blue light reveals information about structural changes in the signaling state. Additional information for both states were obtained by the vibrational lifetime of the CN vibration measured via ultrafast IR-pump-IR-probe experiments. This observable is particularly sensitive for solvent exposure of the label. Time-resolved IR spectroscopy proved to be an excellent method to follow the protein dynamics throughout most part of the photocycle on a hundreds of femtoseconds to milliseconds timescale. By close inspection of protein and chromophore dynamics in wildtype-PYP over nine decades in time, new insights into the changes leading to the proposed photocycle intermediates were obtained. The investigation of the SCN label allowed to follow the different transient structure changes with high local resolution. Depending on its position within the protein the response of the label provided additional information on the photocycle transitions.
The insights that are obtained by the different observables in the steady-state and by the reaction of the SCN label to formation of the different intermediate states during the photocycle contribute to an improved understanding of local, light-induced structure changes in the photoreceptor PYP. This comprehensive study demonstrated the potential provided by the application of SCN as IR label for investigation of protein dynamics.
Hofstadter-Hubbard physics
(2020)
The Hofstadter model, besides the Haldane and Kane-Mele models, is the most common tight-binding model which hosts topologically nontrivial states of matter. In its time-reversal-symmetric formulation the model can even describe topological insulators. Experimentally, the Hofstadter model was realized with ultracold quantum gases in optical lattices which is a wellcontrolled way to engineer quantum states of tight-binding Hamiltonians. Another established control parameter in ultracold quantum gases are twoparticle, on-site interactions, also known as Hubbard interactions. This work aims at introducing the reader to the concepts of topological states of matter, a collection of corresponding tight-binding models, and the methodology to treat interacting topological states with dynamical mean-field theory.We present recent results for inhomogeneous, interacting systems, spinimbalanced magnetic systems, propose experimental detection methods, and extensions to three-dimensional topological states.
In der vorliegenden Untersuchung wurde das bovine, Hydroxylapatit-basierte, Knochenersatzmaterial Hypro-Oss® zunächst ex vivo überprüft, anschließend subkutan in den interskapulären Bereich von 12 weiblichen Wistar-Ratten (Testgruppe) eingebracht; bei 12 weiteren Tieren erfolgte eine Sham-Operation ohne Einbringung von Biomaterial (Kontrollgruppe). Anschließend wurde die Gewebereaktion über 30 Tage beobachtet und die Explantate jeweils nach Tag 3, 15 und 30 histologisch und histomorphometrisch untersucht.
Die histologische Analyse zeigte innerhalb des Beobachtungszeitraums von 30 Tagen eine störungsfreie Eingliederung der Hypro-Oss®-Granula in das umliegende Gewebe. Bereits 3 Tage nach Einbringung des Biomaterials waren mononukleäre Zellen erkennbar, die bis Tag 30 weiter zunahmen. Ab diesem Zeitpunkt zeigten sich auch TRAP-positive, CD-68-negative Multinukleäre Zellen, die das Ergebnis einer Fusion von Makrophagen sind und eine Fremdkörperreaktion indizierten. Nach 30 Tagen zeigten sich die Granula histologisch stabil integriert ohne Anzeichen einer immunologischen Abstoßungsreaktion.
Die CD-68-Expression der aufgefundenen Makrophagen und mehrkernigen Riesenzellen bildete ein Kriterium zur Unterscheidung der MNGCs von Osteoklasten, die ebenfalls mehrkernig sind, aber dieses Cluster of Differentiation nicht tragen. Dies charakterisiert die vorgefundenen MNGCs als Fremdkörper-Riesenzellen, da sie ebenso wie die pathologischen Riesenzellen vom Typ Langerhans CD-68 exprimieren.
Dieses Bild bestätigte sich für die Hypro-Oss®-Gruppe in der histomorphometrischen Betrachtung über eine kontinuierliche Zunahme von überwiegend CD-68-positiven Makrophagen bis zum Tag 30, während sie für die Kontrollgruppe über die gesamte Zeit rückläufig waren. Die Multinukleären Zellen erreichten dagegen bereits an Tag 15 ihren Höhepunkt, während in der Kontrollgruppe über den gesamten Beobachtungszeitraum erwartungsgemäß keine MNGCs gefunden wurden.
Der hoch signifikante Anstieg der MNGC-Zahl der Testgruppe bis Tag 15 korreliert positiv mit den Vaskularisationsdaten, was darauf hindeutet, dass die Multinukleären Zellen durch die Einbringung des Biomaterials induziert wurden und über die Sekretion des Signalmoleküls VEGF einen wesentlichen Faktor für die Blutgefäßbildung bilden.
Eine Auffälligkeit hat sich jedoch in Bezug auf das Alleinstellungsmerkmal von Hypro-Oss® gezeigt, welches bei der Aufreinigung nicht erhitzt wird. Diverse Studien haben einen Zusammenhang der Höhe der Sintertemperatur mit der Bildung von MNGCs nachgewiesen, wonach für Hypro-Oss® eine geringe Induzierung von MNGCs zu erwarten gewesen wäre als für vergleichbare, höher erhitzte bovine Knochenersatzmaterialien. Dagegen zeigten die Vaskularisationsdaten unserer Untersuchung für Hypro-Oss® im Vergleich zu 2 anderen bovinen Knochenersatzmaterialien (Bio-Oss® und BEGO OSS®) jedoch signifikant höhere Werte für die Blutgefäßbildung als dies aus der Korrelation von Sintertemperatur mit der Anzahl Multinukleärer Riesenzellen zu erwarten gewesen wäre.
Aufgrund der relativ kurzen Dauer der Beobachtung lassen sich keine belastbaren Ergebnisse in Bezug auf den zu erwartenden Materialabbau und die ossäre Integration von Hypro-Oss® feststellen, welche einer längerfristigen Analyse bedürften als es in dieser Untersuchung möglich war. Es gibt aber klinische Erfahrungsberichte23 hinsichtlich Handling, Heilungsverlauf und Materialintegration von Hypro-Oss® bei Sinusbodenelevation und Guided Bone Regeneration, die auch in der Langfristbetrachtung positive Ergebnisse zeigten. Offen bleibt, ob nicht eine physiologische Wundheilung nur mittels Makrophagen einer pathologischen Wundheilung unter Mitwirkung Multinukleärer Riesenzellen überlegen ist: zumindest robustere Knochenersatzmaterialien wie z.B. das hier untersuchte Hypro-Oss® scheinen dabei weniger sensibel auf Multinukleäre Riesenzellen zu reagieren.
Acute lymphoblastic leukemia (ALL), a neoplastic disorder of blood cells of the lymphoid lineage, is the most frequent childhood cancer. In spite of increasing survival rates, the outcome for adults, infants or relapsed patients is still less favorable, highlighting the need for novel treatment options. Reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules that are involved in a variety of cellular pathways. As high ROS levels lead to oxidative stress and irreversible oxidation of cellular macromolecules, the production and elimination of ROS is tightly controlled. Therefore, cells express several antioxidant molecules and enzymes, including glutathione, catalase and the thioredoxin (Trx) system, to balance ROS levels. As cancer cells were found to have increased ROS levels that could contribute to tumor progression and metastasis, they rely strongly on these antioxidant systems to prevent oxidative damage, making cancer cells especially vulnerable to ROS-inducing treatments. ROS and oxidative stress have been shown to induce programmed cell death via different pathways, however the exact mechanisms that couples oxidative signaling and cell death is not completely understood.
As a disturbance of the cellular redox homeostasis was reported during leukemia development and progression, we wanted to determine the potential of Trx inhibitors for ALL therapy. Additionally, we aimed to further understand the role of ROS and subsequent protein oxidation in the induction and execution of programmed cell death.
First, we demonstrated that the Trx1 inhibitor PX-12 induced cell death in three ALL cell lines. Further analysis of the events leading to PX-12-induced cell death in FADD-deficient (FD) Jurkat cells revealed an increase in ROS levels and oxidation-mediated dimer formation of peroxiredoxin 3 (PRDX3). Interestingly cell death was inhibited by the thiol-containing antioxidant N-acetylcysteine (NAC), but not by non-thiol-containing ROS scavengers. PX-12 treatment further induced cleavage of caspase-9 and -3 and activation of the pro-apoptotic BCL-2 protein BAK, leading us to the conclusion that mitochondria-dependent apoptosis was induced. Interestingly, we could demonstrate an important role for the BH3-only protein NOXA in the mediation of PX-12-induced apoptosis as knock-down of NOXA prevented cell death induction and BAK activation. Our findings give novel insights into the mechanism of PX-12-induced cell death in ALL cell lines and underscores the potential of PX-12 for the treatment of ALL.
To further understand the processes leading to cell death upon inhibition of the Trx system, we analyzed global protein oxidation in Jurkat FD cells upon treatment with the Trx reductase inhibitor Auranofin. In line with previous results, Auranofin induced intrinsic apoptosis that was dependent on BAK and accompanied by increased ROS levels. Using a BIAM Switch Assay followed by mass spectrometry, we demonstrated that Auranofin treatment induced oxidation of over 200 proteins. We identified several proteins whose oxidation upon Auranofin treatment was expected, like Trx1, Trx2 and several peroxiredoxins. Additionally, we verified oxidation of APAF1-interacting protein (APIP) and protein arginine N-methyltransferase (PRMT1) that are both implicated in the regulation of apoptosis. With this analysis we were able to demonstrate that Auranofin treatment leads to changes in global protein oxidation. Whether oxidation of the determined proteins changes their functionality and contributes to apoptosis induction remains to be elucidated.
As we identified BAK as an important player in PX-12- and Auranofin-induced cell death in the previous parts of this study, we wanted to further understand its involvement in ROS-mediated cell death. First analyses in wild-type (WT) and BAK-/- murine embryonic fibroblasts (MEFs) revealed that BAK was essential for Auranofin-induced cell death and that this cell death was caspase-independent in MEFs. Interestingly, BAK oxidation was induced upon treatment with Auranofin, but not upon stimulation with the apoptosis-inducing compound Etoposide. Expression of mutated BAK, with either one or both oxidation-sensitive cysteines mutated to oxidation-insensitive serines, revealed that mutating already one cysteine protected cells from Auranofin , but not Etoposide-induced cell death. Of note, mutation of the BAK BH3 domain rescued MEFs from both, Auranofin- and Etoposide-mediated cell death. The presence of cysteine residues also altered BAK interactions as observed by a mass spectrometric analysis of Auranofin-treated MEFs expressing either WT or cysteine-less BAK. We identified interactions of WT BAK with proteins involved in mitochondrial fission and vesicle transport upon Auranofin treatment. Of note, interaction with proteins involved in apoptosis, like BAX or BCL-XL, was not changed between WT and cysteine-less BAK. Our results demonstrate a critical role for BAK oxidation in Auranofin-induced cell death. Furthermore, we identified novel oxidation-dependent BAK interaction partners.
To conclude, this study highlights the potential of ROS-inducing treatments for ALL therapy and provides novel insights into the redox regulation of programmed cell death.
Aufgrund der starken Heterogenität und Komplexität der akuten myeloischen Leukämie ist diese bis heute nicht zufriedenstellend zu behandeln. Die bestmögliche Therapie wird mittlerweile zunehmend auf die Erkrankung des Einzelnen angepasst. Vermehrt gewinnen Tyrosinkinase-Inhibitoren in der Therapie an Bedeutung. Diese Inhibitoren hemmen Proteine auf zellulärer Ebene.
Bei etwa 30% der AML-Patienten lassen sich Mutationen des FLT3-Gens nachweisen. Das Gen kodiert für die fms like tyrosine kinase 3, eine Rezeptor-Tyrosinkinase an der Zelloberfläche von unreifen Blutzellen des Knochenmarks. Durch Mutationen des FLT3 Gens erhalten diese Zellen einen Proliferationsvorteil gegenüber den physiologischen Blutzellen.
Am häufigsten kommt es zu in frame-Insertionen des FLT3-Gens, vor allem im Bereich der juxtamembranen Domäne: sogenannte interne Tandemduplikationen (ITD). Weiterhin kommen zu einem geringeren Teil Punktmutationen einzelner Codons, zum Beispiel im Bereich des activation loops oder im Bereich des gatekeepers vor. Durch das Auftreten der Punktmutationen, die entweder bereits zum Zeitpunkt der Diagnose vorliegen oder erst während einer Therapie mit einem Tyrosinkinase-Inhibitor entstehen können, verändert sich das Bindungsverhalten vieler solcher gegen FLT3 gerichteten Inhibitoren. Durch Letzteres kann ein mögliches Therapieversagen beispielsweise während der Behandlung mit AC220 (Quizartinib) erklärt werden (Smith et al.).
In der vorliegenden Dissertationsschrift sind Unterschiede der Signalwege zwischen FLT3-ITD und FLT3-ITD mit der zusätzlichen gatekeeper-Punktmutation F691L herausgearbeitet. Dafür wurden die beiden FLT3-Mutationen in den Vektor pMy-IRES-GFP eingebracht und retroviral in Ba/F3-Zellen transduziert. Nach Überprüfung der Expression von FLT3 ITD und dem Wachstumsverhalten unter Zugabe von AC220 (Quizartinib), wurden verschiedene Signalkaskaden von FLT3 mittels Western Blot untersucht. Hierbei zeigten sich sowohl Unterschiede für die Expression von phosphoryliertem ERK als auch von phosphoryliertem STAT5.
Durch verschieden starke Expressionen der FLT3130kDa- und FLT3160kDA-Varianten wurde eine unterschiedliche Lokalisation von FLT3-ITD in Zellen mit und ohne die Mutation F691L postuliert. Allerdings ließ sich diese experimentell mittels Immunfluoreszenz nicht belegen, da die Methode für die verwendeten Suspensionszellen nicht ausreichend geeignet war.
In den durchgeführten Versuchen zum Wachstumsverhalten der Zellen bei der Verwendung von Kinaseinhibitoren konnte bei der Verwendung des SYK-Inhibitors R406 eine dosisabhängige Proliferationshemmung der FLT3-ITD-mutierten Ba/F3- und 32D-Zellen beobachtet werden. Die Hemmung von FLT3 durch R406 wurde in der Literatur bereits beschrieben (Braselmann et al.).
Die abschließenden Experimente der Massenspektrometrie mit SILAC Markierung lassen mit der Detektion von mehreren hundert signifikant regulierten phosphorylierten Proteinen in den beiden FLT3-ITD-exprimierenden Populationen auf die Aktivierung unterschiedlicher Signalwege schließen. Durch das Vergleichen einzelner Teilexperimente ergaben sich Proteine, deren Phosphorylierung mehrfach in die gleiche Richtung reguliert war. Für Zellen, die zusätzlich zur ITD-Mutation die Mutation F691L besaßen, konnten insgesamt sieben hoch-regulierte, phosphorylierte Proteine ermittelt werden, bei denen ein zellulärer Effekt durch die Phosphorylierung der entsprechenden Aminosäurereste in der Literatur beschrieben ist.
Das im Western Blot nachgewiesene, in Zellen mit der Mutation F691L stärker phosphorylierte STAT5 ist aller Voraussicht nach Ursache der nachgewiesenen verstärkten Phosphorylierung von RPS6 im Experiment der globalen Phosphorylierung. Die PIM-Kinasen als Substrate einer STAT5-induzierten Transkription phosphorylieren RPS6 an Serin 235. Dies führt seinerseits zu einer verstärkten Translation von mRNA weiterer Gene. Die genauen Zusammenhänge der hier ermittelten Unterschiede müssen jedoch weiter untersucht werden.
In Zukunft könnte zudem die Untersuchung der beiden Proteine SHP 1 oder HSP90 weitere Aufschlüsse über die unterschiedlichen Signalwege geben. Für beide Proteine wurden Phosphorylierungen detektiert, die in den untersuchten Zellen mit FLT3-ITD bzw. der zusätzlichen Punktmutation F691L unterschiedlich reguliert sind.
Even one century after Santiago Ramón y Cajal’s groundbreaking contribu- tions to neuroscience, one of the most fundamental questions in the field is still largely open, namely understanding how the shape of a dendrite is adapted to its specific biological function. A systematic investigation of this problem is challenging both technically and conceptually because neurons have diverse genetic, molecular, morphological, connectional and functional properties.
In the light of the preceding, dendritic arborisation (da) neurons of the Drosophila melanogaster larva PNS have proven to be an excellent model system for the study of such growth and patterning processes. Structure and function in these cell classes are intimately intertwined, as class type-specific dendritic arbour differentiation processes are required to satisfy a given phys- iological need. Also, there is a remarkable genetic toolkit that enables one to selectively and reproducibly label, image and manipulate each one of these sensory neuron classes. In this thesis, I address the aforementioned open problem by linking single-cell patterning, information processing and wiring optimisation in sensory da neurons to behaviour in Drosophila larva.
In particular, I study Class I ventral peripherical dendritic arborisation (c1vpda) neurons. These are a class of proprioceptive neurons that relay information on the position of the larva’s body back to the CNS during crawling behaviour to assure proper locomotion. Their stereotypical comb- like shaped dendritic branches spread along the body-wall, and they get noticeably deformed during crawling behaviour. The bending of the den- dritic branches is hypothesised to be a possible mechanism to transduce the mechanosensory inputs arising from cuticle folding. Interestingly, c1vpda neurons do not necessarily satisfy optimal wiring constraints since they are required to pattern into a specific shape to fulfil their function. Therefore, I considered the da system to study how the specific functional requirements may be combined with optimal wiring constraints during development.
Although the molecular machinery of dendrite patterning in c1vpda neurons is well studied, the precise elaboration of the comb-like shaped dendrites of these cells remains elusive. Moreover, even though a lot of work has been put into the description and quantification of growth processes of the nervous system, there are still few solid and standardised models of arbour staging and patterning. Importantly, the defining parameters that determine the dendrite elaboration program that in turn is responsible for creating the final arbour morphology are still unknown. As a result, unraveling possible universal stages of dendrite elaboration shared between different model systems and cell types is challenging.
Thus, in order to understand the development of the fine regulation of branch outgrowth that leads to the observed terminal arbour morphology in the mature cell, I collected in vivo, long-term, non-invasive high temporal res- olution time-lapse recordings of dendritic trees during the differentiation process in the embryo and its maturation phase in the larva. For further analysis, I developed new algorithms that quantified the structural changes in dendrite morphology in the time-lapse videos. My approach provides a framework to analyse such developmental data, or any dataset comprising continuous morphological dynamical processes in an unbiased way. Using these newly developed methods, I examined the development of a sample of c1vpda cells and identified five stages of differentiation in these data: initial stem polarization, extension, pruning, stabilization, and isometric stretching during larval stages.
The beginning of the growth process is marked by the polarisation of the main stem. Subsequently, during the extension phase, branches emerge interstitially from the existing main stem. Later, higher-order branches sprout from pre-existing lateral branches, increasing arbour complexity. This is followed by a pruning stage where developmental intermediate dendritic branches are removed. This step leads to a spatial rearrangement of the dendritic tree. The end of the pruning step is followed by a stabilisation period where arbour morphology remains virtually unaltered in the embryo. After hatching, c1vpda dendrites experience an isometric scaling, with their branching complexity and pattern being invariant across all larval stages.
After dissecting the c1vpda dendrites spatiotemporal differentiation process, I established a link between dendritic shape and behaviour. I measured intra- cellular Ca++ activity in the dendrite branches of l1 larvae during forward locomotion, while simultaneously recording branch deformation using a dual genetic line. I reported that post-embryonic c1vpda dendrites Ca++ responses increased in freely crawling larvae. Furthermore, I showed strong correlations between Ca++ signal and deformation of the comb-like dendritic ranches during body-wall contractions.
Then, using a geometrical model, I provided evidence that the pruning stage could reorganise the dendrite morphology to maximise mechanosensory re- sponses during body wall contraction. I showed that the angle orientation of each side branch correlates with the bending curvature and thus with the me- chanical displacement of the cell membrane during locomotion. During the pruning phase, I observed a preferential reduction of less efficient branches with low bending curvature, influencing the mechanisms of dendritic sig- nal integration of c1vpda sensory neurons. I proceeded to quantify branch dynamics at single tip resolution during pruning, providing evidence that a simple random pruning mechanism is sufficient to remodel the tree structure compatible with the observed way.
I used these time-lapse data to constrain a new computational noisy growth model with random pruning based on optimal wiring principles. This model is able to generate highly realistic synthetic c1vpda morphologies. The model furthermore requires few parameters to generate highly accurate temporal development trajectories and morphologies at single-cell level. Utilising this data and model enabled me to investigate upon the hypothesis that a noisy dendrite growth and random pruning mechanism synergise to achieve den- dritic trees efficient in terms of both wiring and function. My findings show how single neurons can create functionally specialised dendrites while min- imising wiring costs, elucidating how general principles of self-organisation may be involved in the generation of these structures.
Hintergrund. Die Achtung der individuellen Autonomie ist eines von vier medizinethischen Prinzipien, das im Kontext von Medizin und Forschung insbesondere in Bezug auf die informierte Einwilligung einer Person thematisiert wird. Menschen mit Demenz können aufgrund innerer oder äußerer Faktoren in ihrer Einwilligungsfähigkeit beeinträchtigt sein, was zu einer Einschränkung ihres Rechts auf Selbstbestimmung führen kann. Im diesbezüglichen Spannungsfeld zwischen Fürsorge und Autonomie soll Entscheidungsassistenz zur Ermöglichung selbstbestimmter Entscheidungen beitragen.
Zielrichtung der Arbeit. Ziel der vorliegenden Dissertation ist die Definition, Implementierung und Evaluation von Entscheidungsassistenzmaßnahmen für Menschen mit Demenz, um deren Autonomie in Entscheidungsprozessen zu unterstützen. Drei Teilprojekte umfassen die Ermittlung des internationalen Forschungsstands zu Entscheidungsassistenz bei Demenz, die Definition und Pilotierung von Unterstützungstools in der Praxis und die Analyse des individuellen Erlebens der vereinfachten Aufklärungsgespräche durch Menschen mit Demenz.
Methode. Im ersten Teilprojekt wurde eine am PRISMA-Standard orientierte systematische Literaturrecherche in Medline und PsycINFO durchgeführt. Die extrahierten relevanten Informationen wurden inhaltlich systematisiert. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurden im zweiten Teilprojekt konkrete Unterstützungstools definiert und in reale Aufklärungsgespräche (Lumbalpunktion) implementiert. Die Tools wurden in der Pilotierung in der Praxis sowie in einem iterativen Diskussionsprozess mit Experten weiterentwickelt. Im dritten Teilprojekt wurde das individuelle Erleben der Teilnehmer der vereinfachten Aufklärungsgespräche mittels problemzentrierter Interviews untersucht und die Daten einer qualitativen Inhaltsanalyse unterzogen.
Ergebnisse. Die Datenbankrecherche ergab initial 2348 Treffer. Nach Screenings der Titel, Abstracts und Volltexte konnten 11 Artikel eingeschlossen werden. Vier der eingeschlossenen Studien sind Interventionsstudien, die übrigen sieben qualitative Interviewstudien. Die identifizierten Unterstützungsmaßnahmen wurden zunächst den beiden Kategorien Interventionen und Strategien und anschließend unter Zuhilfenahme des Konzepts des Contextual Consents fünf komplexitätssteigernden Dimensionen einer Entscheidungssituation zugeordnet (individuelle, soziale, medizinische, informationelle und Folgendimension). Darauf aufbauend wurden im zweiten Teilprojekt acht Entscheidungsassistenzmaßnahmen abgeleitet: (1) Gesprächsstruktur, (2) Elaborierte klare Sprache, (3) Ambiente / Raumgestaltung, (4) Stichwortlisten, (5) Prioritätenkarten, (6) Visualisierung, (7) Vereinfachte schriftliche Einverständniserklärung sowie (8) Personenzentrierte Haltung des Entscheidungsassistenten (1-7: Tools, 8: Grundeinstellung). Die Tools zielen überwiegend auf eine Komplexitätsreduktion in der informationellen Dimension unter Berücksichtigung der fähigkeitsbezogenen und der bedürfnisbezogenen individuellen Dimension ab. Durch Anpassungen der Informationsdarbietung oder der kommunikativen Interaktion im Gespräch dienen sie mehrheitlich der Förderung des (Informations-) Verständnisses. Die Analyse der qualitativen Daten im dritten Teilprojekt zeigt, dass die Erfahrung der vereinfachten Aufklärungsgespräche durch drei übergreifende Themen gekennzeichnet ist. Die Kategorie Formalität versus Informationsgewinn illustriert die individuelle Bedeutung des Aufklärungsgesprächs für die Teilnehmer und deren Bewertung des Prozesses der informierten Einwilligung. Die Kategorie Wahrnehmung der Unterstützung skizziert die Bewertungen der angewandten Unterstützungstools durch die Teilnehmer. Die Kategorie Der Wahrheit ins Auge sehen müssen stellt dar, dass die erlebte Situation des vereinfachten Aufklärungsgesprächs wesentlich durch die Verdachtsdiagnose Demenz bestimmt ist, die im Rahmen aller Aufklärungsgespräche besprochen wurde.
Fazit. Bislang gibt es wenig empirische Forschung zu Entscheidungsassistenz für Menschen mit Demenz und Unterstützungsmaßnahmen werden überwiegend unsystematisch entwickelt und angewendet. Die Wirksamkeit einzelner Unterstützungsmaßnahmen kann aufgrund fehlender Interventionsstudien selten beurteilt werden. Unterstützungsmaßnahmen zielen überwiegend auf eine Komplexitätsreduktion in der Informationsdarbietung und im kommunikativen Interaktionsprozess ab, wobei sie kognitive Beeinträchtigungen und Interaktions-/ Entscheidungsbedürfnisse von Menschen mit Demenz berücksichtigen. Die definierten Tools können als erste konkret handhabbare Werkzeuge verstanden werden, die das strukturierte Leisten von Entscheidungsassistenz für Menschen mit Demenz erleichtern sollen. Sie sind übertragbar auf verschiedene Entscheidungssituationen. Eine Bewertung der Wirksamkeit der definierten Tools sollte in weiteren Entscheidungssituationen und mit größeren Stichproben weiteruntersucht werden. Die Ergebnisse der Evaluation liefern jedoch erste Hinweise darauf, dass einige Teilnehmer sich von einzelnen Tools unterstützt gefühlt haben und die anvisierte Komplexitätsreduktion in der informationellen Dimension in einigen Fällen erfolgreich war. Eine wesentliche Komplexitätssteigerung in der untersuchten Entscheidungssituation entstand durch die negative Emotionen auslösende Vermittlung einer potentiellen Demenzdiagnose (Folgendimension). Dieses Ergebnis impliziert, dass die definierte „verständnisfördernde Toolbox“ um Unterstützungsmaßnahmen zur emotionalen Entlastung von Menschen mit Demenz erweitert werden muss, da davon ausgegangen werden kann, dass vielfältige Entscheidungssituationen für Menschen mit Demenz emotional hoch belastend sind.
Hintergrund
Obwohl Feedback ein wichtiges und gut untersuchtes Element der medizinischen Ausbildung darstellt, wird es trotz eines großen Bedarfs der Studierenden sowohl im Unterricht als auch in Prüfungssituationen nur selten angewendet. Die Frankfurter Medizinstudierenden beklagen besonders, dass sie zu ihren Objective Structured Clinical Examinations (OSCEs) als Abschlussprüfung im Fach Chirurgie bisher kein detailliertes Feedback erhalten. Auch die Prüfenden beklagen häufig, dass sie die Studierenden weder für herausragende Leistungen loben noch über auftretende Fehler informieren können.
Ziel dieser Arbeit ist deshalb die Erstellung und Implementierung eines strukturierten schriftlichen Feedbacks in eine bestehende OSCE-Prüfung im Fach Chirurgie, das an den Bedürfnissen sowohl der Studierenden als auch der Prüfenden orientiert ist.
Material und Methoden
Das Studiendesign war prospektiv. Im ersten Schritt wurde eine Befragung erfahrener OSCE-Prüfender durchgeführt, um zu erheben, welches Feedback sie gerne an Studierende weitergeben würden. Basierend hierauf wurde ein erster Feedbackbogen erstellt. Dieser umfasste neben vorformulierten Aussagen auch die Möglichkeit Freitextkommentare zu geben und wurde von den Prüfenden für jeden Studierenden in der Wechselzeit zwischen den OSCE-Stationen ausgefüllt. Die Feedbackbögen wurden anschließend eingescannt und per E- Mail an die Studierenden geschickt. Im Anschluss hieran erfolgte eine webbasierte Befragung der Studierenden und der OSCE-Prüfenden, sowie eine tiefergehende Befragung der Studierenden in Form von Fokusgruppen- Interviews.
Basierend auf den Ergebnissen der Umfragen und der Fokusgruppen wurden die Feedbackbögen nochmals grundlegend überarbeitet und im folgenden OSCE erneut angewendet. Die Zufriedenheit der Prüfenden und Studierenden wurde analog zur ersten Befragung erhoben.
Ergebnisse
Insgesamt nahmen 351 Studierende und 51 Prüfende in beiden OSCEs an der Studie teil. In der abschließenden Online-Evaluation gaben 87,5% der Studierenden und 91,6% der Prüfenden an, dass sie zustimmen oder eher zustimmen, dass das schriftliche Feedback in zukünftigen OSCE-Prüfungen weiterhin angewendet werden soll. Mehr als 50% der Studierenden gaben jedoch an, dass das Feedback noch nicht konkret genug sei.
Mehr als ein Viertel der Prüfenden gab an, dass das Ausfüllen der Feedbackbögen zeitlich herausfordernd sei. In allen Fokusgruppen wurde das schriftliche Feedback durch die Studierenden befürwortet.
Schlussfolgerung
Die Implementierung eines strukturierten schriftlichen Feedbacks in einen OSCE ist problemlos möglich. Das schriftliche Feedback wird sowohl von den Prüfenden als auch von den Studierenden als nützlich empfunden.
Analyse der Genauigkeit des neurochirurgischen Operationsroboters Robotic Surgery Assistant (ROSA)
(2020)
In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob der Roboter ROSA bei der Durchführung von intrakraniellen Biopsien oder Elektrodenimplantationen eine Alternative zur klassischen, rahmenbasierten Stereotaxie darstellt. Dazu sollte die mechanische und die Anwendungsgenauigkeit des Systems ermittelt werden. Zur Bestimmung der mechanischen Genauigkeit wurde eine experimentelle Phantomstudie durchgeführt. Hier wurden durch den Roboter wiederholt zehn Trajektorien an einem Stereotaxiephantom angefahren. Der Abstand der robotischen Nadel zum Zielpunkt im Phantom wurde anhand von Röntgenbildern bestimmt. Die Wiederholung des Versuchsaufbaus unter Variation der Planungsbildgebung erlaubte den Vergleich verschiedener Schichtdicken sowie zwischen low-dose und normal-dose Verfahren. Die Anwendungsgenauigkeit sollte durch die Analyse operativer Ergebnisse der ROSA erfasst werden. Dazu wurde anhand von postoperativen Bildern die Genauigkeit anhand des Abstands zwischen geplanter und tatsächlicher Lage von Stereoelektroenzephalographie-Elektroden ermittelt. Es wurden verschiedene Referenzierungstechniken, die der Orientierung des Roboters dienen und bei denen eine präoperative Planungsbildgebung (CT oder MRT) mit einem Abbild des OP-Gebietes (durch Oberflächenerkennung oder durch einen Stereotaxierahmen) referenziert wird, verglichen, nämlich CT-Laser; CT-Leksell-Rahmen und MRT-Laser. Die Ergebnisse wurden einer statistischen Analyse unterzogen. Dabei zeigte sich, dass der ROSA-Roboter eine sehr hohe mechanische Genauigkeit im Submillimeterbereich erreicht. Genauigkeitseinbußen bei einer größeren Schichtdicke der zur Planung verwendeten Computertomographie sind messbar, aber gering. Ein signifikanter Einfluss bei der Verwendung eines low-dose-Protokolls konnte nicht festgestellt werden. Dennoch zeigte sich, dass der entscheidende Teil der Ungenauigkeiten in der klinischen Anwendung entsteht und dabei insbesondere durch die Referenzierungstechnik bestimmt wird. Referenzierungen, die auf einer Computertomographie basierten, erwiesen sich als zufriedenstellend genau und als konkurrenzfähig zur konventionellen Methode. Der Unterschied zwischen dem rahmenbasierten und dem auf Oberflächenerkennung basierenden Verfahren war dabei so gering, dass letzteres sich angesichts seiner Vorteile in der Anwendung als besonders günstiges Verfahren hervortut. Im Gegensatz dazu stand das MRT-Laser-Verfahren, welches bei relativ hohen Abweichungen nur eingeschränkt anwendbar scheint und sich damit eher für Anwendungsbereiche mit geringeren Genauigkeitsanforderungen eignet, wie bspw. Biopsien. Weiterhin kann der Verlauf der Trajektorie an den höheren Sicherheitsabstand angepassten werden. Bei der Einordnung der ermittelten Genauigkeiten ist zu beachten, dass es viele weitere, von der Referenzierungs- und Bildgebungsmethode unabhängige Einflussfaktoren gibt. In dieser Arbeit war der Einfluss der erfassten externen Paramter zwar limitiert, bei anderen Autoren zeigte sich jedoch ein signifikanter Effekt. Dennoch deckt sich die Gesamtgenauigkeit mit den Ergebnissen anderer Arbeiten.
In Zusammenschau der Ergebnisse weist die vom ROSA-Assistenzsystem assistierte Stereotaxie eine verbesserte Prozessqualität auf, unter anderem durch die erhebliche Zeitersparnis, ggf. der Wegfall des Transports des narkotisierten Patienten, die Adaptionsmöglichkeiten der Prozessteilschritte an den Patienten, sowie eine hohe Nutzerfreundlichkeit. Entscheidend ist jedoch, dass es sich um ein sehr sicheres Verfahren handelt: Durch die hohe Genauigkeit wird das Operationsrisiko minimiert, gleichzeitig erlauben Laser-gestützte Registrierungsverfahren eine Reduktion der Strahlenexposition. Zur Konsolidierung der in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse sind weitere klinische Daten notwendig.
Computational estimation is an important skill in everyday life as well as in educational contexts. In the last decades, research has found that children use several strategies in computational estimation and that children’s strategy use depends on different parameters. Still, little is known about the underlying cognitive processes. In the present work, we addressed this issue by investigating (1) the influence of individual differences in children’s executive functions on their strategy use and (2) the influence of varying specific task and problem characteristics that are discussed to involve different cognitive processes.
In four studies, we asked third and fourth graders to solve computational estimation tasks by rounding the summands. Study 1 addressed the influence of working memory updating. The study found that efficient updating contributed to children’s strategy use and moderated relations with problem characteristics. A deliberate feature of Study 1 was to restrict participants’ strategy choice to the rounding-down and rounding-up strategies. Study 2 in turn investigated children’s strategy use when mixed-rounding was allowed. Results indicated that children did not consider unit digits of both operands jointly. Also, no influence of executive functions could be found. Consequently, in Study 3, children’s strategy selection when they could choose between three versus only two strategies was contrasted and the role of working memory updating was investigated. Indeed, children chose the best available strategy more often when three strategies were available. Importantly, relative strategy selection performance differed with children’s updating capacities.
Finally, Study 4 addressed another task variation that is important in everyday life and educational contexts. That is, presentation duration and modality were varied. Data showed that a permanent, written format was most beneficial for children’s strategy use and that children’s updating moderated presentation effects.
In sum, the results of the present work could shed some light onto cognitive processes in children’s strategy use in computational estimation. Specifically working memory updating
seems to contribute to third and fourth graders strategy use. Interpreting interactions with different task variations, updating most likely influences associative processes, long term memory consolidation and retrieval as well as encoding and calculation processes.
The growing number of infections with multi-resistant bacteria or the current COVID-19 pandemic put compounds with therapeutic properties into the public focus. Non-ribosomal peptides (NRPs) are natural products that are already marketed as antibiotics, cytotoxic agents or immunosuppressants. Their biological activities rely on the structural diversity including non-proteinogenic amino acids (AAs), heterocycles or modifications like methylation or acylation.
The biosynthesis of NRPs is carried out by non-ribosomal peptide synthetases (NRPSs). These multifunctional megaenzymes show a modular architecture like in an assembly-line. Each module is thereby responsible for the incorporation and modification of one AA and therefore contains different catalytic domains. The adenylation (A) domain recognizes and activates its specific substrate in an ATP-dependent manner which is transferred to a 4’-phosphopantetheine cofactor post-translationally attached to the thiolation (T) domain. Peptide bond formation between two T domain bound substrates catalysed by the condensation (C) domain transfers the growing peptide chain to the following module. Such a C-A-T module can be extended with optional domains to integrate structural diversity and a terminal thioesterase (TE) domain usually releases the peptide via hydrolysis or intramolecular attack of nucleophiles. Inspired by the modular architecture, NRPS engineering deals with the modification of NRPs in order to increase biological activities, circumvent bacterial resistances or create de novo peptides. This can be achieved by mutasynthesis or modification of the substrate binding pocket as well as single and multiple domain substitution. However, the few successful approaches led to impaired enzymes and did not establish a general applicable guideline. In the first publication as part of this work, the development of such a guideline comprising three rules is addressed. First, the A-T-C tridomain named exchange unit (XU) is seen as a catalytic unit instead of a module. When using them as building blocks, the C domain’s specificity for the AA of the following XU has to be considered as second rule. Third, a conserved WNATE motif within the C-A linker depicts the fusion point of the XUs. Upon heterologous expression of the cloned plasmids in E. coli and high performance liquid chromatography coupled mass spectrometry-based analysis of the extracts, the ambactin-producing NRPS from Xenorhabdus was reprogrammed with one and two XUs. This only leads to a moderate loss of production titre or an even higher one when the AA configuration was changed by introducing a dual condensation/epimerization (C/E) domain. The pentamodular GameXPeptide-producing NRPS was reconstructed using up to five XUs of four different NRPSs and even completely de novo synthetases were created. The second publication describes the exchange unit condensation domain (XUC) concept and relies on a fusion point between the two subdomains (N-terminal CDsub and C-terminal CAsub) of the C domain’s V-shaped pseudodimeric structure which generates A-T didomains with flanking CAsub and CDsub. These hybrid C domain-forming building blocks depict an improvement to the XU concept by avoiding the drawback of C domain specificity. This allows a more flexible NRPS engineering that can e.g. enable peptide library design. Furthermore, beside a combination of both concepts within one NRPS and a transfer to Bacillus NRPSs, the use of XUC with relaxed A domain specificity allowed further peptide modifications by introducing non-natural AAs. The third publication deals with aldehyde and alcohol-generating reductase (R) domains which depict an alternative for peptide release in NRPSs. A promoter exchange in X. indica identified a pyrazine-producing NRPS with a minimal architecture of an A, T and R domain and was therefore termed ATRed. R domains were additionally used in engineered NRPSs to produce pyrazinones and derivatives thereof by XU substitution although most constructs failed to show production. Beyond that, an R domain has been shown to replace a TE domain in wild type synthetases leading to slightly modified NRPs and the postulated biosynthesis was incidentally revised. Furthermore, an NRPS with terminal R domain was engineered to produce a free peptide aldehyde, which are known to be potent proteasome inhibitors. For the above mentioned ATReds, the presence of up to three coding regions was further identified in 20 different Xenorhabdus strains but only six of them were verified to produce pyrazines. All ATReds share variable sequence similarities among each other and were subsequently divided into three subtypes. One subtype is supposed to perform the pyrazine biosynthesis via a non-canonical catalytic triad.