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Trotz der Verfügbarkeit von siRNA, dem aktuellen Goldstandard zur Generierung von RNAInterferenz-vermitteltem Gen-silencing, stellen unerwünschte Immunantworten des Organismus auf doppelsträngige RNA exogenen Ursprungs noch immer ein fundamentales Problem dar, besonders mit Hinblick auf die Entwicklung Oligonukleotid-basierter Wirkstoffe.
Durch das begrenzte Repertoire an Modifikationen, welches durch die Abhängigkeit von zelleigenen Faktoren unter anderem zur Steigerung der intrazellulären Stabilität und zur Reduktion unerwünschter Effekte zur Verfügung steht, konnte bis dato nur einer überschaubaren Anzahl entsprechender Oligonukleotide eine offizielle Zulassung für die therapeutische Anwendung in der Medizin erteilt werden.
Hier bergen künstliche Ribonukleasen, welche die Umesterungsreaktion unabhängig von der zellinternen Maschinerie ebenfalls effizient und sequenzspezifisch bewerkstelligen können, großes Potential als eine Alternative. Während Metall-basierte Systeme in der Regel auf unphysiologisch hohe Konzentrationen zweiwertiger Übergangsmetallionen, wie beispielsweise Lanthanoide oder auch Kupfer, angewiesen sind, könnten metallfreie Katalysatoren dahingehend eine wesentlich flexiblere Option darstellen. Die Optimierung Guanidin-basierter RNA-Spalter für den Einsatz in der Bioanalytik und Medizin stellt seit geraumer Zeit eines der obersten Ziele unseres Arbeitskreises dar. Unter diesen bewährte sich vor allem das Tris(2-aminobenzimidazol), welches in Form von Konjugaten mit Antisense-Oligonukleotiden kurze Modellsubstrate sequenzspezifisch spaltet.
Neben der äußerst mühseligen, vielstufigen Synthese eines konjugierbaren Tris(2-aminobenzimidazol)s waren die untersuchten Systeme mit Halbwertszeiten von teilweise über 20 Stunden jedoch viel zu langsam, um auch potentiell beobachtbare Veränderung des Phänotyps in vivo induzieren zu können. Ein weiterer begrenzender Faktor stellte die Konjugationstrategie des Spalters über Aktivester-Chemie und Aminolinker dar, welche eine Kupplungsausbeute von 0 % bis im besten Fall ca. 30 % lieferte. Um eine Methode zu erhalten, welche routinemäßig zur sequenzspezifischen Spaltung einer Vielzahl verschiedener RNA-Substrate genutzt werden kann, war folglich eine praktikablere Synthesestrategie zur Darstellung der Spalterkonjugate einerseits und zudem eine Erhöhung der Katalysatoraktivität andererseits notwendig, um auch kurzlebige Ziel-RNAs wirkungsvoll ausschalten zu können. In diesem Zusammenhang wurde eine neue Syntheseroute erarbeitet, welche den für die Konjugation funktionalisierten Spalter über wenige Stufen in Mengen von über 10 g lieferte. Daran anschließend konnte die Synthese eines Phosphoramidits realisiert werden, welches in einer manuellen Kupplungsprozedur die Darstellung von 5‘-Konjugaten des Tris(2-aminobenzimidazol)s in exzellenten Ausbeuten und, im Vergleich zur vorherigen Methode, wesentlich kürzeren Kupplungszeiten ermöglichte. Die vollständige Kompatibilität des Phosphoramidits mit der automatisierten Festphasensynthese konnte im Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht erreicht werden. Während die manuelle Prozedur Konjugationsausbeuten von über 90 % lieferte, wurden an einem handelsüblichen Oligonukleotid-Synthesizer auch nach Modifikation der Kupplungsprotokolle und bei erhöhtem Amiditverbrauch lediglich 65 %erzielt. Durch Inkorporation von LNA-Nukleotiden in zwei gegen die PIM1-mRNA gerichtete 15mer DNA-Konjugate ließ sich eine Reduktion der Halbwertszeit von Cy5-markierten 22mer Modellsubstrate auf unter 4 h erreichen, wobei dieses Resultat auch anhand eines 412mer Modellsubstrats und in Gegenwart hoher Phosphatkonzentrationen reproduziert werden konnte. Darüber hinaus wurde die besondere Rolle des closing base pairs, sowohl bezüglich der Selektivität als auch der Kinetik der Spaltung, offensichtlich. Während stärker hybridisierende GC-Basenpaare generell eine hohe Präzision gewährleisteten, trat im Falle von AT-Basenpaaren fraying auf, d. h. es konnte auch innerhalb des vermeintlichen Duplex Spaltung beobachtet werden. Genauere Studien zur Positionierung von LNA-Nukleotiden ergaben bei unmittelbarer Lokalisation am 5‘-Terminus von AT-closing base pairs zwar einen selektivitätssteigernden Effekt, überraschenderweise konnte in diesem Fall jedoch auch eine Inhibierung der Spaltungskinetik festgestellt werden. Durch Verschiebung in die vorletzte Position konnte die Aktivität des Konjugats ohne Präzisionsverlust jedoch wiederhergestellt werden. Erste Experimente zur intrazellulären Stabilität der Spalterkonjugate ergaben quantitative, stufenweise Zersetzung, sowohl des DNA- als auch der Mixmer-Konjugate nach wenigen Stunden, was die Notwendigkeit weiterer stabilitätssteigernder Modifikationen zur Vorbereitung auf in vivo-Experimente impliziert. Auf der Suche nach neuen Spaltern stellte sich vor allem das 2-Aminoimidazol als einer der aussichtsreichsten Kandidaten für genauere Untersuchungen heraus. Das korrespondierende Tris(2-aminoimidazol) konnte über eine Marckwald-Synthese in wenigen Stufen dargestellt werden. Erste Spaltexperimente ergaben vor allem in niedrigen Konzentrationen (10 μM) eine im Vergleich zum Benzimidazol-Analogon vielfach höhere Aktivität. Obwohl die Synthese eines funktionalisierten Bisimidazol-benzimidazols gelang, steht dessen Konjugation mit Oligonukleotiden und deren Aktivitätsbestimmung noch aus.
Antibiotic treatment of tuberculosis (TB) is complex, lengthy, and can be associated with various adverse effects. As a result, patient compliance often is poor, thus further enhancing the risk of selecting multi-drug resistant bacteria. Macrophage mannose receptor (MMR)-positive alveolar macrophages (AM) constitute a niche in which Mycobacterium tuberculosis replicates and survives. Therefore, we encapsulated levofloxacin in lipid nanocarriers functionalized with fucosyl residues that interact with the MMR. Indeed, such nanocarriers preferentially targeted
MMR-positive myeloid cells, and in particular, AM. Intracellularly, fucosylated lipid nanocarriers favorably delivered their payload into endosomal compartments, where mycobacteria reside. In an in vitro setting using infected human primary macrophages as well as dendritic cells, the encapsulated antibiotic cleared the pathogen more efficiently than free levofloxacin. In conclusion, our results point towards carbohydrate-functionalized nanocarriers as a promising tool for improving TB treatment by targeted delivery of antibiotics.
Studies over the past decade have revealed that metabolism profoundly influences immune responses. In particular, metabolism causes epigenetic regulation of gene expression, as a growing number of metabolic intermediates are substrates for histone post-translational modifications altering chromatin structure. One of these substrates is acetyl-coenzyme A (CoA), which donates an acetyl group for histone acetylation. Cytosolic acetyl-CoA is also a critical substrate for de novo synthesis of fatty acids and sterols necessary for rapid cellular growth. One of the main enzymes catalyzing cytosolic acetyl-CoA formation is ATP-citrate lyase (ACLY). In addition to its classical function in the provision of acetyl-CoA for de novo lipogenesis, ACLY contributes to epigenetic regulation through histone acetylation, which is increasingly appreciated. In this review we explore the current knowledge of ACLY and acetyl-CoA in mediating innate and adaptive immune responses. We focus on the role of ACLY in supporting de novo lipogenesis in immune cells as well as on its impact on epigenetic alterations. Moreover, we summarize alternative sources of acetyl-CoA and their contribution to metabolic and epigenetic regulation in cells of the immune system.
Nuclear receptors (NRs) activate transcription of target genes in response to binding of ligands to their ligand-binding domains (LBDs). Typically, in vitro assays use either gene expression or the recruitment of coactivators to the isolated LBD of the NR of interest to measure NR activation. However, this approach ignores that NRs function as homo- as well as heterodimers and that the LBD harbors the main dimerization interface. Cofactor recruitment is thereby interconnected with oligomerization status as well as ligand occupation of the partnering LBD through allosteric cross talk. Here we present a modular set of homogeneous time-resolved FRET–based assays through which we investigated the activation of PPARγ in response to ligands and the formation of heterodimers with its obligatory partner RXRα. We introduced mutations into the RXRα LBD that prevent coactivator binding but do not interfere with LBD dimerization or ligand binding. This enabled us to specifically detect PPARγ coactivator recruitment to PPARγ:RXRα heterodimers. We found that the RXRα agonist SR11237 destabilized the RXRα homodimer but promoted formation of the PPARγ:RXRα heterodimer, while being inactive on PPARγ itself. Of interest, incorporation of PPARγ into the heterodimer resulted in a substantial gain in affinity for coactivator CBP-1, even in the absence of ligands. Consequently, SR11237 indirectly promoted coactivator binding to PPARγ by shifting the oligomerization preference of RXRα toward PPARγ:RXRα heterodimer formation. These results emphasize that investigation of ligand-dependent NR activation should take NR dimerization into account. We envision these assays as the necessary assay tool kit for investigating NRs that partner with RXRα.
The authors regret that there is an error present in the units displayed in the sentence “The dissociation constant of docking domains or modules connected by docking domains was found to be KD 70–130 mM (ref. 35) and KD 1–2 mM (ref. 59), respectively.” within Section 3.1. Module–module exchanges. The corrected version of this sentence is as follows:
The dissociation constant of docking domains or modules connected by docking domains was found to be KD 70–130 μM (ref. 35) and KD 1–2 mM (ref. 59), respectively.
The Royal Society of Chemistry apologises for these errors and any consequent inconvenience to authors and readers.
The p63 gene encodes a master regulator of epidermal commitment, development, and differentiation. Heterozygous mutations in the DNA binding domain cause Ectrodactyly, Ectodermal Dysplasia, characterized by limb deformation, cleft lip/palate, and ectodermal dysplasia while mutations in in the C-terminal domain of the α-isoform cause Ankyloblepharon-Ectodermal defects-Cleft lip/palate (AEC) syndrome, a life-threatening disorder characterized by skin fragility, severe, long-lasting skin erosions, and cleft lip/palate. The molecular disease mechanisms of these syndromes have recently become elucidated and have enhanced our understanding of the role of p63 in epidermal development. Here we review the molecular cause and functional consequences of these p63-mutations for skin development and discuss the consequences of p63 mutations for female fertility.
Wir untersuchen eine neuartige Gruppe von Polarisationsmitteln – gemischtvalente Verbindungen – mittels theoretischer und experimenteller Methoden und demonstrieren ihre Leistungsfähigkeit in NMR-Experimenten mit Hochfeld-DNP (DNP=Dynamic Nuclear Polarization, dynamische Kernpolarisation) im festen Zustand. Diese gemischtvalenten Verbindungen stellen eine Gruppe von Molekülen dar, bei denen die molekulare Mobilität auch in Festkörpern erhalten bleibt. Folglich können solche Polarisationsmittel unter günstigen Bedingungen für die dynamische Kernpolarisationsbildung bei ultrahohen Magnetfeldern verwendet werden, um Overhauser-DNP-Experimente im Festkörper durchzuführen.
Synthesis, crystal structure and structure–property relations of strontium orthocarbonate, Sr2CO4
(2021)
Carbonates containing CO4 groups as building blocks have recently been discovered. A new orthocarbonate, Sr2CO4 is synthesized at 92 GPa and at a temperature of 2500 K. Its crystal structure was determined by in situ synchrotron single-crystal X-ray diffraction, selecting a grain from a polycrystalline sample. Strontium orthocarbonate crystallizes in the orthorhombic crystal system (space group Pnma) with CO4, SrO9 and SrO11 polyhedra as the main building blocks. It is isostructural to Ca2CO4. DFT calculations reproduce the experimental findings very well and have, therefore, been used to predict the equation of state, Raman and IR spectra, and to assist in the discussion of bonding in this compound.
First crystal structure of a Pigment Red 52 compound: DMSO solvate hydrate of the monosodium salt
(2021)
Pigment Red 52, Na2[C18H11ClN2O6S], is an industrially produced hydrazone-laked pigment. It serves as an intermediate in the synthesis of the corresponding Ca2+ and Mn2+ salts, which are used commercially for printing inks and lacquers. Hitherto, no crystal structure of any salt of Pigment Red 52 is known. Now, single crystals have been obtained of a dimethyl sulfoxide solvate hydrate of the monosodium salt of Pigment Red 52, namely, monosodium 2-[2-(3-carboxy-2-oxo-1,2-dihydronaphthalen-1-ylidene)hydrazin-1-yl]-5-chloro-4-methylbenzenesulfonate dimethyl sulfoxide monosolvate monohydrate, Na+·C18H12ClN2O6S−·H2O·C2H6OS, obtained from in-house synthesized Pigment Red 52. The crystal structure was determined by single-crystal X-ray diffraction at 173 K. In this monosodium salt, the SO3− group is deprotonated, whereas the COOH group is protonated. The residues form chains via ionic interactions and hydrogen bonds. The chains are arranged in polar/non-polar double layers.
Ubiquitin fold modifier 1 (UFM1) is a member of the ubiquitin-like protein family. UFM1 undergoes a cascade of enzymatic reactions including activation by UBA5 (E1), transfer to UFC1 (E2) and selective conjugation to a number of target proteins via UFL1 (E3) enzymes. Despite the importance of ufmylation in a variety of cellular processes and its role in the pathogenicity of many human diseases, the molecular mechanisms of the ufmylation cascade remains unclear. In this study we focused on the biophysical and biochemical characterization of the interaction between UBA5 and UFC1. We explored the hypothesis that the unstructured C-terminal region of UBA5 serves as a regulatory region, controlling cellular localization of the elements of the ufmylation cascade and effective interaction between them. We found that the last 20 residues in UBA5 are pivotal for binding to UFC1 and can accelerate the transfer of UFM1 to UFC1. We solved the structure of a complex of UFC1 and a peptide spanning the last 20 residues of UBA5 by NMR spectroscopy. This structure in combination with additional NMR titration and isothermal titration calorimetry experiments revealed the mechanism of interaction and confirmed the importance of the C-terminal unstructured region in UBA5 for the ufmylation cascade.
The development of super-resolution microscopy (SRM) has widened our understanding of biomolecular structure and function in biological materials. Imaging multiple targets within a single area would elucidate their spatial localization relative to the cell matrix and neighboring biomolecules, revealing multi-protein macromolecular structures and their functional co-dependencies. SRM methods are, however, limited to the number of suitable fluorophores that can be imaged during a single acquisition as well as the loss of antigens during antibody washing and restaining for organic dye multiplexing. We report the visualization of multiple protein targets within the pre- and postsynapse in 350-400 nm thick neuronal tissue sections using DNA-assisted single-molecule localization microscopy. Using antibodies labeled with short DNA oligonucleotides, multiple targets are visualized successively by sequential exchange of fluorophore-labeled complementary oligonucleotides present in the imaging buffer. The structural integrity of the tissue is maintained owing to only a single labelling step during sample preparation. Multiple targets are imaged using a single laser wavelength, minimizing chromatic aberration. This method proved robust for multi-target imaging in semi-thin tissue sections, paving the way towards structural cell biology with single-molecule super-resolution microscopy.
Bioactive lipid mediators play a major role in regulating inflammatory processes. Herein, early pro-inflammatory phases are characterized and regulated by prostanoids and leukotrienes, whereas specialized pro-resolving mediators (SPM), including lipoxins, resolvins, protectins, and maresins, dominate during the resolution phase. While pro-inflammatory properties of prostanoids have been studied extensively, their impact on later phases of the inflammatory process has been attributed mainly to their ability to initiate the lipid-mediator class switch towards SPM. Yet, there is accumulating evidence that prostanoids directly contribute to the resolution of inflammation and return to homeostasis. In this mini review, we summarize the current knowledge of the resolution-regulatory properties of prostanoids and discuss potential implications for anti-inflammatory, prostanoid-targeted therapeutic interventions.
Es ist bekannt, dass die Aktivierung von S1P-Rezeptoren die Expression von profibrotischen Mediatoren, wie dem Bindegewebswachstumsfaktor CTGF, induzieren und deshalb auch eine Rolle bei der Entstehung der Nierenfibrose spielen kann. In diesem Kontext konnte unsere Arbeitsgruppe zeigen, dass die Aktivierung von S1P5 zur TGF-β2-induzierten CTGF-Expression in humanen glomerulären Mesangiumzellen beiträgt (Wünsche et al. 2015). Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde deshalb die Rolle von S1P5 in einem in vivo-Modell zur Nierenfibrose untersucht. Männliche S1P5-/--Mäuse und Wildtypmäuse mit C57BL/6J-Hintergrund wurden mit einer adeninreichen Diät für jeweils 7 und 14 Tage gefüttert, um eine tubulointerstitielle Fibrose hervorzurufen. Die Nieren von unbehandelten Mäusen des jeweiligen Genotyps dienten als Kontrolle. Die Ergebnisse zeigen, dass S1P5-/--Mäuse geringere Kreatininplasmaspiegel und weniger Schäden im Nierengewebe gegenüber Wildtypen zeigten. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die mRNA-Expression von mehreren Fibrosemarkern und proinflammatorischen Zytokinen in den S1P5-/--Mäusen schwächer war als in den Wildtypen. Die Auswertung von histochemischen Färbungen und Western Blots bestätigte diese Beobachtung. Zusammengefasst kann festgehalten werden, dass S1P5 eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Adenin-induzierter Entzündung in der Niere und nachfolgender Pathogenese wie Gewebeschäden und Fibrose spielt.
Ceramide sind ein Bestandteil der Lipiddoppelschicht, in allen eukaryotischen Zellen vorhanden und zentrale Moleküle des Sphingolipidstoffwechsels. Die Synthese und der Abbau der Ceramide werden von vielen verschiedenen Enzymen reguliert. Neben ihrer Aufgabe als strukturelle Elemente der Zellmembranen wurde herausgefunden, dass Ceramide auch in verschiedenen Signalwegen involviert sind, die auch bei Nierenerkrankungen eine Rolle spielen. In Bezug auf die Kettenlänge der angehängten Fettsäure können so genannte kurz- und langkettige Ceramide Apoptose induzieren, wohingegen sehr langkettige Ceramide Zellproliferation fördern. In mehreren Studien wurden bereits Konzentrationsänderungen von kettenlängenspezifischen Ceramiden im Plasma und Serum von Patienten gemessen, die zu diesem Zeitpunkt an einer Nierenerkrankung litten. In dieser Arbeit wurde daher untersucht, ob solche Konzentrationsänderungen auch im Nierengewebe von Patienten und Mäusen mit einer Nierenfibrose, dem Kennzeichen nahezu aller chronischen Nierenerkrankungen, zu sehen sind. Zu diesem Zwecke wurden Biopsien der Nierenrinde und des Nierenmarks von fibrotischen Nieren aus Patienten, die an Hydronephrose und/oder Pyelonephritis litten, und von gesunden Gewebeproben untersucht. Letztere wurden durch Nephrektomien zur Behandlung von Nierenkarzinomen gewonnen und dienten als nichtfibrotische Kontrolle. Zum Vergleich mit fibrotischen Nieren aus Mäusen wurden männliche Mäuse der Linie C57BL/6J mit einer adeninreichen Diät für 14 Tage gefüttert. Die Konzentrationen der Sphingolipide wurden mittels Massenspektrometrie gemessen und die Level der fibrotischen Marker wurden mit Hilfe von RT-qPCR und histologischen Färbungen analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die sehr langkettigen Ceramide Cer d18:1/24:0 und Cer d18:1/24:1 sowohl in fibrotischen Nierenrindenproben der Patienten als auch in fibrotischen Nieren der Mäuse im Vergleich zu den jeweiligen Kontrollproben signifikant geringer konzentriert waren. Diese Effekte korrelieren mit der Hochregulation der Fibrosemarker COL1α1, COL3α1 und αSMA in den fibrotischen Nieren. Es konnte gezeigt werden, dass nur bestimmte Ceramide in fibrotischem Nierengewebe in ihrer Konzentration verändert sind, was interessante Fragen hinsichtlich der Ursache dieser Veränderungen, ihrer funktionellen Aufgabe und zu möglichen Effekten einer Manipulation des Ceramidstoffwechsels mit dem Ziel der Behandlung der Nierenfibrose oder der Entdeckung neuer Biomarker aufwirft. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen zudem die Eignung von in vivo-Mausmodellen als translationalen Ansatz für das Verständnis der Beteiligung von Ceramiden in menschlichen Nierenerkrankungen.
Die in vitro-Untersuchungen zu der Rolle des S1P-Transporters Spns2 haben gezeigt, dass Spns2 die Expression von CTGF nach Stimulation von Mausmesangiumzellen mit TFG-β2 verstärkt. 24 Stunden nach Stimulation war im Zellkulturüberstand von Spns2-/--mMC im Gegensatz zu Spns2+/+-mMC keine Akkumulation des pro-fibrotischen Zytokins CTGF gegenüber der unstimulierten Kontrolle detektierbar. Nach 48 Stunden Stimulation mit TFG-β2 war die Menge an CTGF im Zelllysat als auch im Zellkulturüberstand von Spns2-/--mMC genauso hoch wie in der unstimulierten Kontrolle. Im Zelllysat und im Überstand der Spns2-/--mMC war die Expression von CTGF weiterhin deutlich höher im Vergleich zu den Proben der unstimulierten Zellen. Die basale und TFG-β2-induzierte Genexpression von S1P-synthetisierenden und S1P-degradierenden Enzymen, sowie die Konzentrationen an S1P und Sphingosin in den Zellen unterschieden sich zwischen Spns2-/--mMC und Spns2+/+-mMC nicht.
As cryo-EM approaches the physical resolution limits imposed by electron optics and radiation damage, it becomes increasingly urgent to address the issues that impede high-resolution structure determination of biological specimens. One of the persistent problems has been beam-induced movement, which occurs when the specimen is irradiated with high-energy electrons. Beam-induced movement results in image blurring and loss of high-resolution information. It is particularly severe for biological samples in unsupported thin films of vitreous water. By controlled devitrification of conventionally plunge-frozen samples, the suspended film of vitrified water was converted into cubic ice, a polycrystalline, mechanically stable solid. It is shown that compared with vitrified samples, devitrification reduces beam-induced movement in the first 5 e Å−2 of an exposure by a factor of ∼4, substantially enhancing the contribution of the initial, minimally damaged frames to a structure. A 3D apoferritin map reconstructed from the first frames of 20 000 particle images of devitrified samples resolved undamaged side chains. Devitrification of frozen-hydrated specimens helps to overcome beam-induced specimen motion in single-particle cryo-EM, as a further step towards realizing the full potential of cryo-EM for high-resolution structure determination.
Decades of work have demonstrated that messenger RNAs (mRNAs) are localized and translated within neuronal dendrites and axons to provide proteins for remodeling and maintaining growth cones or synapses. It remains unknown, however, whether specific forms of plasticity differentially regulate the dynamics and translation of individual mRNA species. To address this, we targeted three individual synaptically localized mRNAs, CamkIIa, β-actin, Psd95, and used molecular beacons to track endogenous mRNA movements. We used reporters and CRISPR/Cas9 gene editing to track mRNA translation in cultured neurons. We found alterations in mRNA dynamic properties occurred during two forms of synaptic plasticity, long-term potentiation (cLTP) and depression (mGluR-LTD). Changes in mRNA dynamics following either form of plasticity resulted in an enrichment of mRNA in the vicinity of dendritic spines. Both the reporters and tagging of endogenous proteins revealed the transcript-specific stimulation of protein synthesis following cLTP or mGluR-LTD. As such, the plasticity-induced enrichment of mRNA near synapses could be uncoupled from its translational status. The enrichment of mRNA in the proximity of spines allows for localized signaling pathways to decode plasticity milieus and stimulate a specific translational profile, resulting in a customized remodeling of the synaptic proteome.
A simple and sustainable one-step strategy for the preparation of electron-deficient aryl trifluoromethyl ethers (ArOCF3) from the corresponding phenols by electrochemical synthesis is presented. Anodic oxidation of trifluoromethane sulfinate (Langlois reagent) leads to direct O-trifluoromethylation of phenol-derivatives bearing fluorine, chlorine, bromine and nitrile substituents under mild conditions in yields up to 75% and in gram-scale. This electrochemical protocol provides an economic and green synthesis for an otherwise inaccessible class of molecules without the need for expensive or toxic reagents, oxidants or metal catalysts.
A single model system for integrative studies on multiple facets of antigen presentation is lacking. PAKC is a novel panel of ten cell lines knocked out for individual components of the HLA class I antigen presentation pathway. PAKC will accelerate HLA-I research in the fields of oncology, infectiology, and autoimmunity.
Oncogenic transformation of lung epithelial cells is a multi-step process, frequently starting with the inactivation of tumor suppressors and subsequent activating mutations in proto-oncogenes, such as members of the PI3K or MAPK family. Cells undergoing transformation have to adjust to changes, such as metabolic requirements. This is achieved, in part, by modulating the protein abundance of transcription factors, which manifest these adjustments. Here, we report that the deubiquitylase USP28 enables oncogenic reprogramming by regulating the protein abundance of proto-oncogenes, such as c-JUN, c-MYC, NOTCH and ΔNP63, at early stages of malignant transformation. USP28 is increased in cancer compared to normal cells due to a feed-forward loop, driven by increased amounts of oncogenic transcription factors, such as c-MYC and c-JUN. Irrespective of oncogenic driver, interference with USP28 abundance or activity suppresses growth and survival of transformed lung cells. Furthermore, inhibition of USP28 via a small molecule inhibitor reset the proteome of transformed cells towards a ‘pre-malignant’ state, and its inhibition cooperated with clinically established compounds used to target EGFRL858R, BRAFV600E or PI3KH1047R driven tumor cells. Targeting USP28 protein abundance already at an early stage via inhibition of its activity therefore is a feasible strategy for the treatment of early stage lung tumours and the observed synergism with current standard of care inhibitors holds the potential for improved targeting of established tumors.
DNA points accumulation for imaging in nanoscale topography (DNA-PAINT) is a super-resolution technique with relatively easy-to-implement multi-target imaging. However, image acquisition is slow as sufficient statistical data has to be generated from spatio-temporally isolated single emitters. Here, we trained the neural network (NN) DeepSTORM to predict fluorophore positions from high emitter density DNA-PAINT data. This achieves image acquisition in one minute. We demonstrate multi-color super-resolution imaging of structure-conserved semi-thin neuronal tissue and imaging of large samples. This improvement can be integrated into any single-molecule microscope and enables fast single-molecule super-resolution microscopy.