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PPARs gehören wie die Steroidhormon-Rezeptoren (z. B.Glucocorticoid-, Estrogen- oder Testosteron-Rezeptoren) zur Superfamilie der nukleären Rezeptoren. Es existieren drei PPAR-Subtypen, die als PPARalpha, PPARbeta/delta und PPARgamma bezeichnet werden und von drei verschiedenen Genen kodiert werden. Fibrate sind PPARalpha-Agonisten, welche die Plasma-Triglyceridspiegel reduzieren und gleichzeitig eine moderate Steigerung des HDL-Cholesterols bewirken. Thiazolidindione (Glitazone) sind PPARgamma-Agonisten, die bei Typ-2-Diabetes-mellitus indiziert sind und als Insulinsensitizer wirken. Duale PPARalpha/gamma-Agonisten stellen eine neue Klasse von Arzneistoffen dar, die zukünftig zur Behandlung von Typ-2-Diabetikern mit gestörtem Lipidprofil eingesetzt werden könnten. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde eine Leitstrukturoptimierung des selektiven PPARalpha-Agonisten Pirinixinsäure (WY 14643) durchgeführt. Die pharmakologische In-vitro-Charakterisierung der Substanzen erfolgte mit Hilfe subtypspezifischer Reportergen-Assays. Zusätzlich wurde gezeigt130, dass Chinolinderivate der Pirinixinsäure 5-LOX-inhibierende Eigenschaften in polymorphnukleären Leukozyten zeigen. Zunächst wurde eine geeignete Synthesestrategie zur Darstellung von Pirinixinsäurederivaten etabliert, was zur Charakterisierung und Identifizierung einer Serie von potenten dualen PPARalpha/gamma-Agonisten und 5-LOX-Inhibitoren führte. Die Synthesestrategie zur Darstellung von sowohl im Arylamino-Bereich (W) als auch in alpha- Position (R) modifizierten Derivaten der Pirinixinsäure bestand in einer vierstufigen Reaktionsfolge (I–IV; siehe Abb.). ... Die PPAR-Modulatoren (Carbonsäuren) 4, 8, 14, 32–38, 41 und 42 wurden in-vitropharmakologisch unter Anwendung subtypselektiver Reportergen-Assays (hPPARalpha, beta, gamma) charakterisiert. Die 5-LOX-Modulatoren (Carbonsäureester) 3, 7, 8, 13, 14, 24–29, 31–42 und 50 wurden in-vitro-pharmakologisch unter Anwendung des 5-LOX-Standardassays in intakten PMNL (polymorphnukleäre neutrophile Leukozyten) evaluiert. Die vorliegende Untersuchung deckte auf, dass der Ersatz des 2,3-Dimethylanilin-Strukturelements der Pirinixinsäure durch 6-Aminochinolin zu einem Gesamtverlust des PPARalpha/gamma-Agonismus führt. Durch Strukturmodifikationen im Arylamino-Bereich der Leitstruktur WY 14643 mit für 5-LOX-Non-Redoxinhibitoren typischen Pharmakophorresten, Tetrahydropyran-4-yl (Substanzen 13–14) und Methoxychinolin-2-yl (Substanz 43), konnte eine signifikante Steigerung des 5-LOX-inhibitorischen Potenzials erzielt werden [IC50 7 mikro M (13) bzw. 4 mikro M (43)]. Die alpha-alkylsubstituierten Carbonsäurederivate 33–38 zeigten sowohl am hPPARalpha als auch am hPPARgamma eine mit der aliphatischen Kettenlänge steigende Potenz. Am hPPARalpha erwiesen sich das alpha-Hexyl-Derivat 35 und das alpha-Butyl-Derivat 34 mit EC50-Werten von 1,9 mikro M (35) bzw. 11,5 mikro M (34) entsprechend einer Steigerung der Aktivität gegenüber WY 14643 um den Faktor 20 (35) bzw. den Faktor 4 (34) als besonders potent. Im Falle des hPPARgamma zeigten ebenso das alpha-butylsubstituierte Derivat 34 und der alpha-hexylsubstituierte Ligand 35 die höchste Aktivität mit EC50-Werten von 8,7 mikro M (34) bzw. 5,8 mikro M (35) und einer Steigerung der Aktivität gegenüber WY 14643 von Faktor 6 (35) bzw. Faktor 9 (34). Die Einführung von alpha-Alkylsubstituenten in das Grundgerüst der Pirinixinsäure führt möglicherweise zum Besetzen der linken proximalen Bindungstasche und somit zu einer im Vergleich zur Leitstruktur WY14643 stärkeren Bindung in die Ligandenbindungstasche des Rezeptors. Die Besetzung dieser proximalen Bindungstasche entscheidet jedoch nicht über die PPAR-Selektivität, da diese sowohl von hPPARalpha- als auch von hPPARgamma-Agonisten belegt wird. PPARalpha/gamma-Selektivität kann zum einen durch das Besetzen der linken bzw. rechten distalen Bindungstasche erzielt werden, zum anderen durch die Auswahl verschiedener acider Kopfgruppen. Aufgrund unterschiedlicher Aminosäuresequenzen der Bindungstaschen der einzelnen PPAR-Subtypen ergibt sich für die Kopfgruppen der PPAR-Modulatoren im hPPARalpha und hPPARgamma eine durch den sterischen Einfluss von Carboxyl- bzw. TZD-Kopfgruppen verursachtes unterschiedliches Wasserstoffbrückennetzwerk. Im Vergleich mit Pirinixinsäure konnte nur durch die Einführung der größeren Alkylketten (n-Butyloder n-Hexyl) ein stark erhöhter dualer PPARalpha/gamma-Agonismus erreicht werden. Die Substitution des sekundären Amins der Chinolin-6-ylverbindungen durch einen Ether-Sauerstoff in den Substanzen 41 und 42 sowie die Einführung eines Linkers, genauer einer Methylengruppe, zwischen dem Chinolin-6-ylrest und dem Scaffold (Derivate 29 und 36), führt zu einer verminderten Aktivität sowohl an hPPARalpha als auch an hPPARgamma. Eine mögliche Erklärung hierfür könnte sein, dass an entsprechender Position der Liganden-Bindungstasche eine Wasserstoffbrücken-Akzeptor-Position vorhanden ist, welche zur Erhöhung der Affinität beiträgt. Offensichtlich wird, durch die Ausbildung einer Wasserstoffbrücke zwischen der NH-Funktion und einem Wasserstoffbrücken-Akzeptor innerhalb der LBP im Falle von WY 14643 ein hoher Bindungsbeitrag erreicht. Daten bezüglich der Inhibierung der 5-Lipoxygenase demonstrieren, dass 6-Aminochinolinderivate potente 5-LOX-Inhibitoren sind. Die Einführung eines 3,5-Bis-(2,2,2-trifluor-ethoxy)-phenylrestes in 6-Position des alpha-hexylsubstituierten Scaffolds führt zu Ligand 38. Dieser ist ein potenter dualer PPARalpha/gamma-Agonist mit einem EC50-Wert von 11 mikro M an hPPARalpha bzw. 7,7 mikro M an hPPARgamma und ein stark wirksamer 5-LOX-Inhibitor mit einem IC50-Wert von 1 mikro M im 5-LOX-PMNL-Standardassay. Die Substanz 38 wurde in präklinischen Studien eingesetzt. Vier Stunden nach oraler Administration bei Mäusen (n = 6) wurde einen Plasmaspiegel von 40 mikro M erreicht. Im Hinblick auf eine Steigerung der PPAR-agonistischen Aktivität und der Reduktion der hepatotoxischen Eigenschaften der Leitstruktur Pirinixinsäure wurde eine Leitstrukturoptimierung durch Einführung der größeren Alkylketten in alpha-Position zur pharmakophoren Carboxyl-Funktion durchgeführt. Für die inhibierende Wirkung auf die 5-LOX scheint das Chinolin-Strukturelement verantwortlich zu sein, während die Potenz der Inhibition durch das Substitutionsmuster moduliert wird.
Functional and structural characterization of Aquifex aeolicus sulfide:quinone oxidoreductase
(2010)
This work presents the first complete structure of the membrane protein sulfide:quinone oxidoreductase (SQR), obtained by X-ray crystallography. Its description is complemented by the results of biochemical and functional experiments. SQRs are ubiquitous flavoprotein disulfide reductases (FDRs), present in all domains of life, including in humans. Their physiological role extends from sulfide detoxification to sulfide-dependent respiration and photosynthesis (in archaea and bacteria), to heavy metal tolerance (in yeast) and possibly to sulfide signalling (in higher eukaryotes). Until now understanding the function of SQRs was difficult because of the poor level of sequence conservation in this enzyme family, the limited functional characterization available and the absence of any structural data. SQR was identified in the native membranes of the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus by peptide mass fingerprinting (PMF) and by a spectrophotometric activity assay. The protein was solubilized in the detergent dodecyl-beta-D-maltoside (DDM) and purified to homogeneity in a functionally active state. It binds one FAD molecule per protein monomer and FAD is its only cofactor. Its structure was determined in the “as-purified”, substrate-bound and inhibitor-bound forms at resolutions of 2.3, 2.0 and 2.9 Å, respectively. It is composed of two Rossmann-fold domains and of one membrane-attachment region. Despite the overall monomeric architecture being similar to that of FDRs, the structure reveals properties that had not been observed in FDRs until now and that have strong implications for the SQR catalytic mechanism. Surprisingly, A. aeolicus SQR is trimeric in the crystal structure and in solution, as determined by density-matched analytical ultracentrifugation, cross-linking and single particle electron microscopy. The trimer creates an appropriate surface for binding lipids and thus ensures that SQR exclusively reduces hydrophobic quinones. SQR inserts to a depth of about 12 Å into the membrane as an integral monotopic membrane protein. The interaction is mediated by an amphipathic helix-turn-helix tripodal motif and two lipid clamps. A channel in the membrane-binding domain extends towards the si-side of FAD and represents the quinone-binding site. The quinone ring is sandwiched between the conserved amino acids Phe 385 and Ile 346 and is possibly protonated upon reduction via Glu 318, Lys 382 and/or neighboring solvent molecules. Sulfide polymerization occurs on the re-side of FAD, where the highly conserved Cys 156 and Cys 347 appear to be covalently bound to the putative product of the reaction, a polysulfur chain which takes the form of an S8 ring in some monomers. Finally, the structure shows that FAD is covalently connected to the protein in an unprecedented way, via a putative disulfide bridge between the 8-methyl group of the isoalloxazine moiety and Cys 124. The high resolution insight into the protein and all unexpected structural observations presented in this work suggest that the catalytic mechanism of SQRs is significantly different from that of FDRs. In agreement with the structural and functional data, two reaction schemes are proposed for A. aeolicus SQR. They both provide a detailed description of how sulfide and quinones reach and bind the active site, how electrons are transferred from sulfide to quinone via FAD and how the elongating polysulfur product is attached to the polypeptide and is finally released. The two hypotheses differ in defining the structure of the covalent protein-FAD intermediate that forms during the reaction cycle and whose identity still remains experimentally undetermined. Remarkably, the structure of the active site and the FAD-binding mode of A. aeolicus SQR are not conserved in another SQR structure which also became available recently, that of the archaeon Acidianus ambivalens. The variability in SQRs suggests that not all of these enzymes follow the same catalytic mechanism, despite having been considered homologous. Consequently, the currently available but contradictory sequence-based classifications of the SQR family were revised. A structure-based alignment calculated on the increasing number of available sequences allowed to define new SQR groups and their characteristic sequence fingerprints in agreement with the reported structural and functional data. In conclusion, the results obtained in this work offer for the first time a detailed look into the intriguing but complicated reactions catalysed by SQRs and provide a stimulus for further genetic, biochemical and structural investigation.
Experimental results are presented for 180 in silico designed octapeptide sequences and their stabilizing effects on the major histocompatibility class I molecule H-2Kb. Peptide sequence design was accomplished by a combination of an ant colony optimization algorithm with artificial neural network classifiers. Experimental tests yielded nine H-2Kb stabilizing and 171 nonstabilizing peptides. 28 among the nonstabilizing octapeptides contain canonical motif residues known to be favorable for MHC I stabilization. For characterization of the area covered by stabilizing and non-stabilizing octapeptides in sequence space, we visualized the distribution of 100,603 octapeptides using a self-organizing map. The experimental results present evidence that the canonical sequence motives of the SYFPEITHI database on their own are insufficient for predicting MHC I protein stabilization.
Nep1 (Emg1) is a highly conserved nucleolar protein with an essential function in ribosome biogenesis. A mutation in the human Nep1 homolog causes Bowen–Conradi syndrome—a severe developmental disorder. Structures of Nep1 revealed a dimer with a fold similar to the SPOUT-class of RNA-methyltransferases suggesting that Nep1 acts as a methyltransferase in ribosome biogenesis. The target for this putative methyltransferase activity has not been identified yet. We characterized the RNA-binding specificity of Methanocaldococcus jannaschii Nep1 by fluorescence- and NMR-spectroscopy as well as by yeast three-hybrid screening. Nep1 binds with high affinity to short RNA oligonucleotides corresponding to nt 910–921 of M. jannaschii 16S rRNA through a highly conserved basic surface cleft along the dimer interface. Nep1 only methylates RNAs containing a pseudouridine at a position corresponding to a previously identified hypermodified N1-methyl-N3-(3-amino-3-carboxypropyl) pseudouridine (m1acp3-Psi) in eukaryotic 18S rRNAs. Analysis of the methylated nucleoside by MALDI-mass spectrometry, HPLC and NMR shows that the methyl group is transferred to the N1 of the pseudouridine. Thus, Nep1 is the first identified example of an N1-specific pseudouridine methyltransferase. This enzymatic activity is also conserved in human Nep1 suggesting that Nep1 is the methyltransferase in the biosynthesis of m1acp3-Psi in eukaryotic 18S rRNAs.
Small interfering RNAs (siRNAs) are now established as the preferred tool to inhibit gene function in mammalian cells yet trigger unintended gene silencing due to their inherent miRNA-like behavior. Such off-target effects are primarily mediated by the sequence-specific interaction between the siRNA seed regions (position 2–8 of either siRNA strand counting from the 5'-end) and complementary sequences in the 3'UTR of (off-) targets. It was previously shown that chemical modification of siRNAs can reduce off-targeting but only very few modifications have been tested leaving more to be identified. Here we developed a luciferase reporter-based assay suitable to monitor siRNA off-targeting in a high throughput manner using stable cell lines. We investigated the impact of chemically modifying single nucleotide positions within the siRNA seed on siRNA function and off-targeting using 10 different types of chemical modifications, three different target sequences and three siRNA concentrations. We found several differently modified siRNAs to exercise reduced off-targeting yet incorporation of the strongly destabilizing unlocked nucleic acid (UNA) modification into position 7 of the siRNA most potently reduced off-targeting for all tested sequences. Notably, such position-specific destabilization of siRNA–target interactions did not significantly reduce siRNA potency and is therefore well suited for future siRNA designs especially for applications in vivo where siRNA concentrations, expectedly, will be low.
The thermodynamics of base pairing is of fundamental importance. Fluorinated base analogs are valuable tools for investigating pairing interactions. To understand the influence of direct base–base interactions in relation to the role of water, pairing free energies between natural nucleobases and fluorinated analogs are estimated by potential of mean force calculations. Compared to pairing of AU and GC, pairing involving fluorinated analogs is unfavorable by 0.5–1.0 kcal mol -1. Decomposing the pairing free energies into enthalpic and entropic contributions reveals fundamental differences for Watson–Crick pairs compared to pairs involving fluorinated analogs. These differences originate from direct base–base interactions and contributions of water. Pairing free energies of fluorinated base analogs with natural bases are less unfavorable by 0.5–1.0 kcal mol -1 compared to non-fluorinated analogs. This is attributed to stabilizing C–F…H–N dipolar interactions and stronger N…H–C hydrogen bonds, demonstrating direct and indirect influences of fluorine. 7-methyl-7H-purine and its 9-deaza analog (Z) have been suggested as members of a new class of non-fluorinated base analogs. Z is found to be the least destabilizing universal base in the context of RNA known to date. This is the first experimental evidence for nitrogen-containing heterocylces as bioisosteres of aromatic rings bearing fluorine atoms.
Innerhalb der letzten 30 Jahre haben sich photoaktivierbare Verbindungen („caged compounds“) zu einem äußerst wertvollen Werkzeug entwickelt. Seit der erstmals publizierten Anwendung von lichtaktivierbarem ATP im Jahre 1978 durch Hoffman et al. konnten viele neue Erkenntnisse im Bereich der Physiologie, Molekularbiologie und Biochemie mit Hilfe von photoaktivierbaren Verbindungen gewonnen werden. Hierunter versteht man Substanzen, deren biologische Wirksamkeit temporär inaktiviert ist, jedoch durch Bestrahlung mit Licht wiederhergestellt werden kann. Die Inaktivierung wird durch spezielle, lichtreaktive Chromophore erreicht, sogenannten photolabilen Schutzgruppen („cages“). Der Einsatz dieser Technik zur Aktivierung von Nukleinsäuren eröffnet ein weites Feld an Anwendungsmöglichkeiten. So ist auf diese Weise eine orts- und zeitaufgelöste Kontrolle der Aktivität von z.B. Antisense-DNA, siRNA oder Aptameren durch Licht möglich. Während der vorliegenden Doktorarbeit konnten zwei neuartige photolabil geschützte Desoxythymidine als Phosphoramidite zum Einsatz in der automatisierten DNA-Synthese dargestellt werden. Hierfür wurden jeweils NDBF-OH bzw. pHP-OH in O4-Position der Nukleobase eingeführt. Es konnte gezeigt werden, dass sich die beiden Nukleoside nach ihrem Einbau in DNA mittels UV-Licht entschützen lassen. Die photolabilen Schutzgruppen besaßen jedoch nur eine geringe chemische Stabilität unter verschiedenen basischen Abspaltbedingungen und sind deshalb nicht für die automatisierte DNA-Festphasensynthese unter Standardbedingungen geeignet. Durch Homologisierung der NDBF-Gruppe mit einer zusätzlichen Methyleneinheit zu hNDBF-OH wurde eine verbesserte Variante synthetisiert, welche eine ausreichende Basenstabilität und hervorragende photochemische Eigenschaften aufweist. Wie im Arbeitskreis Heckel gezeigt werden konnte, ist mittels in O6-Position hNDBF-modifiziertem Desoxyguanosin sowohl die DNA-Festphasensynthese unter Standardbedingungen möglich, als auch die spätere Photolyse dieser Schutzgruppe bei einer Wellenlänge von 420 nm. Hierdurch eröffnet sich zum ersten Mal die Möglichkeit, bei Verwendung von beispielsweise NPP und hNDBF, photolabil geschützte Bereiche in Nukleinsäuren wellenlängenselektiv durch Licht unterschiedlicher Wellenlänge zu aktivieren. In einem weiteren Projekt wurden erfolgreich photoaktivierbare Varianten des bivalenten Fusionsaptamers HD1-22 getestet. HD1-22 besitzt zwei Aptamerdomänen, HD1 und HD22, welche jeweils an eine der beiden Exosites I bzw. II von Thrombin binden. Im konkreten Fall konnten wir die Blutgerinnungsaktivität von Thrombin unter Verwendung einer photolabil geschützten Aptamersequenz von vollständig aktiv zu komplett inaktiv modulieren: Vor der UV-Bestrahlung war lediglich die Exosite II durch die HD22-Domäne blockiert. Dies erlaubte keinerlei Bindung des natürlichen Antikoagulans Antithrombin III an Thrombin – weder durch Heparin vermittelt noch ohne Beteiligung von Heparin. Der Zugang zur Exosite I war hingegen nicht eingeschränkt, die Blutgerinnungsaktivität des Thrombins somit durch die Rekrutierung von Fibrinogen an die Exosite I vollständig aktiv und nicht durch Antithrombin inhibierbar. Durch lichtvermittelte Entschützung der HD1-Domäne konnte nun eine Inaktivierung der Exosite I erfolgen, welche durch die hohe Bindungsaffinität der HD22-Aptamerdomäne stärker ausfiel als bei der ausschließlichen Verwendung eines HD1 Aptamers. Die koagulative Wirkung des Thrombins wurde somit vollständig aufgehoben. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde der Grundstein für die Entwicklung eines kovalenten, lichtaktivierbaren Thrombin-Thrombinaptamer-Reagenzes gelegt. Dieses könnte zur gezielten Thromboembolisierung bei bestimmten malignen Tumorerkrankungen eingesetzt werden, um das entartete Gewebe von der Blut- und damit Nährstoffversorgung abzuschneiden. Zudem könnte so möglicherweise während einer Tumorexzision die Freisetzung von metastasierenden Krebszellen unterbunden werden. Das Reagenz besteht aus der von Heckel et al. publizierten „ausschaltbaren“ Variante des HD1-Aptamers. Diese besitzt einen photolabil geschützten Gegenstrang. Solange die Schutzgruppe intakt ist, bindet das Aptamer an die Exosite I von Thrombin und verhindert auf diese Weise die Rekrutierung von Fibrinogen. Wird die Sequenz jedoch mit UV-Licht bestrahlt, so erfolgt die Entschützung des Gegenstrangs und durch die folgende Basenpaarung eine Inaktivierung des HD1 Aptamers. Hieraus resultiert die Freisetzung von aktivem Thrombin, welches direkt zur Ausbildung eines Thrombus führt. Durch die – ebenfalls photospaltbare – kovalente Anbindung des „ausschaltbaren“ HD1 an die Proteinoberfläche werden eine vorzeitige Dissoziation des Aptamers und damit eine vorzeitige Wiederherstellung der Proteinaktivität verhindert.
Die Röntgenstrukturanalyse ist eine der wichtigsten analytischen Methoden zur Bestimmung der Kristallstrukturen und zur Aufklärung von Struktur-Eigenschaftsbeziehungen. Voraussetzung für eine Röntgenstrukturanalyse ist ein Einkristall mit einer Größe von ca. 1-10 mikro m. Jedoch gibt es eine Vielzahl an Verbindungen, bei denen es aufgrund ihrer geringen Löslichkeit nicht gelingt, hinreichend große Kristalle zu erzeugen. In dieser Arbeit konnte aufgezeigt werden, dass die Kristallstrukturen solcher schwerlöslichen Verbindungen aus Röntgenpulverdaten bestimmt werden können. Organische Pigmente haben eine geringe Löslichkeit. Sie werden daher im Anwendungsmedium nicht gelöst, sondern fein dispergiert. Die Teilchengrößen liegen typischerweise im Bereich von 50-500 nm. Bedingt durch die Schwerlöslichkeit lassen sich nur selten Einkristalle züchten. Jedoch kann die Kristallinität häufig durch Lösungsmittelbehandlung verbessert werden. Dies ermöglicht die Strukturbestimmung aus den Röntgenpulverdaten. Die untersuchten organischen Pigmente haben allesamt ungewöhnliche Eigenschaften: So zeigen beispielsweise Pigment Yellow 101 und einige seiner Derivate sowie einige mesoionischen Pigmente Fluoreszenz im Festkörper. Die Fluoreszenz-Eigenschaften dieser Verbindungen waren bisher nur begrenzt verstanden. In dieser Arbeit konnten sieben Kristallstrukturen von festkörperfluoreszenten Pigmenten bestimmt und so ein Beitrag zum Verständnis der Festkörper-Fluoreszenz geleistet werden. Pigment Yellow 183 und Pigment Yellow 191 sind gelbe verlackte Azopigmente, die großtechnisch zur Einfärbung von Kunststoffen verwendet werden. Hier konnten erstmals Einkristalle erhalten werden, und drei Kristallstrukturen bestimmt werden. Alle drei Kristallstrukturen weisen ungewöhnliche Strukturmerkmale auf: eine der beiden Sulfonatgruppen koordiniert nicht an das Ca2+-Ion oder an ein Lösungsmittelmolekül, sondern bildet nur intermolekulare van der Waals-Wechselwirkungen. Wodurch elektrostatisch ungünstige Separation von Kation (Ca2+) und Anion (RSO3-) verursacht wird, bleibt unklar. Die Benzimidazolon-Pigmente sind industriell sehr wichtige Azo-Pigmente mit exzellenter Lichtstabilität und hervorragender thermischer Stabilität. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es erstmals, Einkristalle eines Solvates eines kommerziellen Benzimidazolon-Pigmentes zu züchten und die Struktur durch Röntgenstrukturanalyse zu bestimmen. Bei zwei weiteren kommerziellen Benzimidazolon-Pigmenten wurden die Kristallstrukturen aus Röntgenpulverdiagrammen bestimmt, wobei die Strukturlösung mit simulated-annealing-Methoden (Programm DASH) erfolgte. Das Pigment Yellow 213 ist ein neu entwickeltes Pigment für Wasserbasislacke, welches sich durch seine hohe Lichtechtheit auszeichnet. Mithilfe der Kristallstruktur konnten Eigenschaften dieser Verbindungen erklärt werden. Alle kommerziellen Azo-Pigmente liegen im Festkörper nicht in der Azoform, sondern in der hydrazon-tautomeren Form vor. Die Pigmente sind daher, streng genommen, keine Azo-Pigmente, sondern Hydrazon-Pigmente. Es gibt jedoch Ausnahmen: Für zwei p-dialkylamino-substitutierte Azopigmente auf beta-Naphthol-Basis konnte durch Einkristallstrukturanalysen aufgezeigt werden, dass die Azoform im Festkörper überwiegt. Es handelt sich hierbei also um den seltenen Fall „wirklicher Azo-Pigmente“. Die in dieser Arbeit untersuchten Verbindungen Bis-(acetoacetyl)-p-phenylen-diamin (DAEP) und 5-(Acetoacetylamino)benzimidazolon sind Vorprodukte für die Synthesen verschiedener industrieller Azo-Pigmente. Bei beiden Verbindungen gelang es, die Kristallstrukturen aus Röntgenpulverdiagrammen zu lösen. Die Orientierung der endständigen -COCH3-Gruppen lässt sich allerdings nicht mit Sicherheit feststellen (weil ein O-Atom fast die gleiche Streukraft besitzt wie eine CH3-Gruppe). Die Pulverstrukturlösungen wurden daher mit Gitterenergieberechnungen mittels dispersion-korrigierten Dichtefunktionalrechnungen kombiniert. Derartige dispersions-korrigierte DFT-Rechnungen im Festkörper könnten zukünftig auch in anderen Fällen zur Validierung von Kristallstrukturen, die aus Röntgenpulverdaten bestimmt wurden, dienen. Die Verbindungen Omeprazol, Rasagilin und Risedronat sind pharmazeutische Wirkstoffe. An verschiedenen Salzen dieser pharmazeutischen Wirkstoffe wurden Polymorphieuntersuchungen durchgeführt. Dabei wurden für Omeprazol vier, für Rasagilin eine und für Risedronat vier neue Phasen gefunden. Zudem konnten für Rasagilin und Omeprazol jeweils eine und für Risedronat drei Kristallstrukturen bestimmt werden, die es erlauben Eigenschaften wie außergewöhnliche Feuchtigkeitsbeständigkeit oder Bioverfügbarkeiten zu erklären. Für Risedronat wurde ein bisher unbekanntes Solvat gefunden (Essigsäure Disolvat), das patentiert wurde. Auch hier konnte die Kristallstruktur aufgeklärt werden. In dieser Arbeit wird aufzeigt, dass es bei schwerlöslichen Pigmenten, deren Vorprodukten sowie von pharmazeutischen Wirkstoffen in etlichen Fällen möglich ist, Einkristalle zu züchten (wenn auch mit großem Aufwand), sodass man die Kristallstrukturen durch Röntgenstrukturanalyse ermitteln kann. Für die Verbindungen, bei denen keine hinreichend großen Einkristalle erhalten werden konnten, gelang es in den meisten Fällen, die Kristallstrukturen aus Röntgenpulverdiagrammen zu bestimmen, und anschließend Struktur-Eigenschaftsbeziehungen abzuleiten.
The nicotinamide-adenine-dinucleotide (NADH):ubiquinone oxidoreductase (complex I) from the strictly aerobic yeast Y. lipolytica contains at least 26 “accessory” subunits however the significance of most of them remains unknown. The aim of this study was to characterize the role of three accessory subunits of complex I, recently identified: two mitochondrial acyl carrier proteins, ACPM1 and ACPM2 and a sulfurtransferase (st1) subunit. ACPMs are small (approx. 10 kDa) acidic proteins that are homologous to the corresponding central components of prokaryotic fatty acid synthase complexes. Genomic deletions of the two genes ACPM1 and ACPM2 resulted in strains that were not viable or retained only trace amounts of assembled mitochondrial complex I, respectively, as assessed using two-dimensional blue native/sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (BN/SDS) PAGE. This suggested different functions for the two proteins that despite high similarity could not be complemented by the respective other homolog still expressed in the deletion strains. To test whether complex I was affected by deletion of the ACPM2 gene, its activities in mitochondrial membranes were measured. Consequently, specific inhibitor sensitive dNADH: decylubiquinone (DBQ) oxidoreductase activity was lost completely and a strong decrease in dNADH: hexa-ammine-ruthenium (HAR) oxidoreductase activity was measured. Remarkably, the same phenotypes were observed if just the conserved serine carrying the phosphopantethein moiety was exchanged with alanine. Although this suggested a functional link to the lipid metabolism of mitochondria, using HPLC chromatography no changes in the lipid composition of the organelles were found. Proteomic analysis revealed that both ACPMs were tightly bound to purified mitochondrial complex I. Western blot analysis revealed that the affinity tagged ACPM1 and ACPM2 proteins were exclusively detectable in mitochondrial membranes but not in the mitochondrial matrix as reported for other organisms. Hence it has been concluded that the ACPMs can serve all their possible functions in mitochondrial lipid metabolism and complex I assembly and stabilization as subunits bound to complex I. A protein exhibiting rhodanese (thiosulfate:cyanide sulfurtransferase) activity was found to be associated with homogenous preparation of complex I. From a rhodanese deletion strain, functional complex I that lacked the additional protein but was fully assembled and displayed no functional defects or changes in EPR signature was purified. In contrast to previous suggestions, this indicated that the sulfurtransferase associated with Y. lipolytica complex I is not required for assembly of its iron–sulfur clusters.
Chloridkanäle und -transporter sind an wichtigen physiologischen Prozessen beteiligt [Jentsch et al., 2002; Zifarelli & Pusch, 2007; Jentsch, 2008] und mutationsbedingte Funktionsdefekte können mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht werden [Planells-Cases & Jentsch, 2009]. Trotz der großen physiologischen Relevanz bilden diese Proteine eine unterrepräsentierte Klasse in der pharmakologischen Wirkstoffsuche [Verkman & Galietta, 2009], auch aufgrund fehlender adäquat robuster und Durchsatz-starker Testsysteme. Vor allem die Vertreter der intrazellulären CLC-Proteine, von denen bereits zwei eindeutig relevanten Krankheiten zugeordnet werden konnten (ClC-5 – Dent´sche Krankheit; ClC-7 – Osteopetrose), entziehen sich aufgrund ihrer vesikulären Lokalisation den klassischen elektrophysiologischen Methoden. Aus diesem Grund kam in dieser Arbeit die SSM-Technik [Schulz et al., 2008] zur Charakterisierung des lysosomalen Cl-/H+-Antiporters ClC-7 zum Einsatz. Bei geeigneter Membranpräparation können mit dieser Methode auch vesikuläre Transportprozesse elektrophysiologisch untersucht werden. Neben der grundlegenden biophysikalischen Untersuchung von ClC-7 war es mit Hilfe der SSM-Technik möglich, die Protonen-gekoppelte Antiportaktivität dieses vesikulären CLC-Vertreters nachzuweisen. Außerdem wurde ein robuster Assay etabliert, der auch die pharmakologische Untersuchung von ClC-7 erlaubt. Mit diesem konnte gezeigt werden, dass ClC-7 spezifisch durch die Chloridkanalblocker DIDS und NPPB mit relativ hoher Affinität (DIDS: IC50= 39 µM, NPPB: IC50= 156 µM) zu inhibieren ist. Da ClC-7 auch als potentielles Target in der Osteoporose-Therapie diskutiert wird [Schaller et al., 2005], bietet die SSM-Technik somit eine Plattform für pharmakologische Untersuchungen an diesem Transporter. Neben dem Wildtyp Protein wurde weiterhin die Funktionalität einer physiologisch wichtigen, der Osteopetrose zuzuordnenden Mutante (G215R), untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Mutante noch immer eine signifikante Transportaktivität besitzt, jedoch einen schweren Lokalisationsdefekt aufweist und nicht mehr korrekt in die Lysosomen transportiert wird. Durch Koexpression der funktionalen beta-Untereinheit Ostm1 [Lange et al., 2006] war es möglich, die lysosomale Lokalisation teilweise, jedoch nicht vollständig wiederherzustellen. Dieser Effekt könnte somit ein Grund für den relativ milden Krankheitsverlauf der mit dieser Mutation verbundenen autosomal dominanten Osteopetrose (ADOII, Alberts-Schönberg Krankheit) sein. Da die SSM-Technik bisher ausschließlich zur Untersuchung primär und sekundär aktiver Transporter zum Einsatz kam [Schulz et al., 2008; Ganea & Fendler, 2009], wurde weiterhin die Eignung der Methode zur Charakterisierung passiver Ionenkanäle anhand des ligandengesteuerten P2X2 Rezeptors überprüft. Ein Vergleich der gewonnenen elektrophysiologischen und pharmakologischen Daten lieferte gute Übereinstimmungen mit den Ergebnissen konventioneller elektrophysiologischer Untersuchungen. So konnte gezeigt werden, dass sich die SSM-Technik auch zur Charakterisierung von Ionenkanälen eignet. Da Ströme über Ionenkanäle bei den klassischen Methoden über eine extern angelegte Spannung gesteuert werden, solch eine Kontrolle bei der SSM-Technik jedoch nicht möglich ist, wurde schließlich in dieser Arbeit versucht, mit Hilfe der lichtgesteuerten Protonenpumpe Bakteriorhodopsin (bR) eine Spannungskontrolle zu etablieren. Anhand eines Fusions-basierten Modellsystems [Perozo & Hubbell, 1993] konnte gezeigt werden, dass lichtgesteuerte Ionenpumpen prinzipiell zur Kontrolle von Ionenkanälen an der SSM genutzt werden können. Allerdings eignet sich bR aufgrund seiner geringen Plasmamembranexpression in CHO Zellen nicht zur direkten Koexpression und Steuerung von Vertebraten-Proteinen. Der Einsatz eukaryotischer Ionenpumpen, kombiniert mit Anionendiffusionspotentialen [Perozo & Hubbell, 1993], könnte sich allerdings als erfolgsversprechend erweisen und die SSM-Technik auch für die Charakterisierung von stark spannungsabhängigen Ionenkanälen öffnen.
Poster presentation at 5th German Conference on Cheminformatics: 23. CIC-Workshop Goslar, Germany. 8-10 November 2009 We demonstrate the theoretical and practical application of modern kernel-based machine learning methods to ligand-based virtual screening by successful prospective screening for novel agonists of the peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) [1]. PPARgamma is a nuclear receptor involved in lipid and glucose metabolism, and related to type-2 diabetes and dyslipidemia. Applied methods included a graph kernel designed for molecular similarity analysis [2], kernel principle component analysis [3], multiple kernel learning [4], and, Gaussian process regression [5]. In the machine learning approach to ligand-based virtual screening, one uses the similarity principle [6] to identify potentially active compounds based on their similarity to known reference ligands. Kernel-based machine learning [7] uses the "kernel trick", a systematic approach to the derivation of non-linear versions of linear algorithms like separating hyperplanes and regression. Prerequisites for kernel learning are similarity measures with the mathematical property of positive semidefiniteness (kernels). The iterative similarity optimal assignment graph kernel (ISOAK) [2] is defined directly on the annotated structure graph, and was designed specifically for the comparison of small molecules. In our virtual screening study, its use improved results, e.g., in principle component analysis-based visualization and Gaussian process regression. Following a thorough retrospective validation using a data set of 176 published PPARgamma agonists [8], we screened a vendor library for novel agonists. Subsequent testing of 15 compounds in a cell-based transactivation assay [9] yielded four active compounds. The most interesting hit, a natural product derivative with cyclobutane scaffold, is a full selective PPARgamma agonist (EC50 = 10 ± 0.2 microM, inactive on PPARalpha and PPARbeta/delta at 10 microM). We demonstrate how the interplay of several modern kernel-based machine learning approaches can successfully improve ligand-based virtual screening results.
Poster presentation at 5th German Conference on Cheminformatics: 23. CIC-Workshop Goslar, Germany. 8-10 November 2009 Protein kinases are important targets for drug development. The almost identical protein folding of kinases and the common co-substrate ATP leads to the problem of inhibitor selectivity. Type II inhibitors, targeting the inactive conformation of kinases, occupy a hydrophobic pocket with less conserved surrounding amino acids. Human polo-like kinase 1 (Plk1) represents a promising target for approaches to identify new therapeutic agents. Plk1 belongs to a family of highly conserved serine/threonine kinases, and is a key player in mitosis, where it modulates the spindle checkpoint at metaphase/anaphase transition. Plk1 is over-expressed in all today analyzed human tumors of different origin and serves as a negative prognostic marker in cancer patients. The newly identified inhibitor, SBE13, a vanillin derivative, targets Plk1 in its inactive conformation. This leads to selectivity within the Plk family and towards Aurora A. This selectivity can be explained by docking studies of SBE13 into the binding pocket of homology models of Plk1, Plk2 and Plk3 in their inactive conformation. SBE13 showed anti-proliferative effects in cancer cell lines of different origins with EC50 values between 5 microM and 39 microM and induced apoptosis. Increasing concentrations of SBE13 result in increasing amounts of cells in G2/M phase 13 hours after double thymidin block of HeLa cells. The kinase activity of Plk1 was inhibited with an IC50 of 200 pM. Taken together, we could show that carefully designed structure-based virtual screening is well-suited to identify selective type II kinase inhibitors targeting Plk1 as potential anti-cancer therapeutics.
Protein-Protein Interaktionen der NADH: Ubichinon-Oxidoreduktase (Komplex I) aus Yarrowia lipolytica
(2010)
Protein-Protein Interaktionen der NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase (Kolmplex I) aus Y. lipolytica In der inneren Mitochondrienmembran sind die Atmungskettenkomplexe I bis IV und die ATP-Synthase lokalisiert. Parallel zum Elektronentransport werden Protonen von der NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase (Komplex I), der bihydrochinon:Cytochrom c-Oxidoreduktase (Komplex III) und der Cytochrom c-Oxidase (Komplex IV) über die Membran in den Intermembranraum gepumpt. Der resultierende chemiosmotische Gradient wird von der ATPase verwendet um ATP zu generieren. Die NADH:Ubichinon- xidoreduktase ist der Startpunkt des Elektronentransfers. Der Komplex I wurde in verschiedenen Organismen in Interaktion mit Komplex III und IV beobachtet. Diese funktionellen Einheiten werden als Respirasomen oder Superkomplexe bezeichnet (Pfeiffer und Schägger, 2000). Der Komplex I in prokaryotischen Zellen stellt die kleinstmögliche Variante dieses Enzyms dar. Da er in der Lage ist, alle bioenergetischen Reaktionen durchzuführen, werden die beteiligten 14 Untereinheiten als zentrale Untereinheiten bezeichnet (Fearnley et al. 1992). In den Eukaryoten findet sich ein Enzym, das je nach Organismus bis zu 31 weitere, sogenannte akzessorische Untereinheiten aufweist. Da diese Untereinheiten keine Homologie mit bakteriellen Proteinen aufweisen, wird davon ausgegangen, dass sie eher eine Funktion im Assemblierungsprozess ausüben als am Elektronentransfer oder der Translokation der Protonen beteiligt zu sein. Ziel dieser Arbeit war es daher mögliche Interaktionspartner des Komplex I oder weitere Untereinheiten zu finden. Für die Detektion möglicher Interakteure sollten neben einem Two-Hybrid-Screen noch weitere Methoden etabliert werden. Als Modellsystem wurde Yarrowia lipolytica verwendet. Unter Verwendung des BacterioMatchII® Systems konnte die mitochondriale Malat-Dehydrogenase, ein Enzym des Citrat-Zyklus, als ein Interaktionspartner des Komplex I gefunden werden. Bei der Reaktion entsteht NADH, das Energieäquivalent, welches dem Komplex I Elektronen liefert. Im Kontext des Substratchannelings deutet die Interaktion der mitochondrialen Malat- ehydrogenase auf hochgeordnete Stukturen im Matrixraum hin, die einen Transfermechanismus oder eine zielgerichtete Diffusion des NADH gewährleisten könnten. Durch die Kombination der Methoden Immunpräzipitation, Gelelektrophorese und MALDI-MS konnten erstmals Hinweise auf Superkomplexe in Y. lipolytica gefunden werden, was dann durch mehrdimensionale Gelelektrophorese bestätigt werden konnte. In dieser Arbeit konnten die Superkomplexe I1III2 ,I1III2IV1 und I1III2IV2 identifiziert werden. Ein vollständiges Respirasom mit einer Stöchiometrie von I1III2IV4 konnte nicht gezeigt werden. Desweiteren konnte die Anwesenheit eines Komplex I-Dimers nachgewiesen werden. In dem bisher postulierten Modell der respiratory strings werden die Superkomplexe durch tetramere Komplex IV-Module zu hochmolekularen Strukturen verknüpft (Wittig et al., 2006). Die detektierten Komplex I-Dimere lassen vermuten, dass sie zusammen mit dem tetrameren Komplex IV als Linker-Moleküle die Superkomplexe zu einem zweidimensionalen respiratory patch verbinden. Zudem konnte eine neue Untereinheit des Komplex I, genannt NEBM, durch das Zusammenspiel von LILBID- und MALDI-Massenspektrometrie und Gelelektophorese identifiziert werden. Durch MALDI-Massenspektrometrie wurde diese Untereinheit de novo sequenziert. Die Charakteristik des identifizierten Proteins entspricht den sogenannten single-transmembrane domain Untereinheiten (Brandt et al., 2005; Brandt 2006), die eventuell eine Funktion in der Assemblierung des Komplex I einnehmen könnten. Weder bei den Messungen der NADH:HAR- noch der dNADH:DBQ-Aktivität zeigte der Deletionsstamm enzymatisch aktiven Komplex I. Weder in blau-nativer Elektrophorese noch in silbergefärbten 2D SDS-Gelen war ein Komplex I noch ein Subkomplex sichtbar und auch In-Gel-Aktivitäts-Tests verliefen für die Detektion von Komplex I im Deletionsstamm negativ. Erst durch eine Western Blot Analyse konnte ein Subkomplex mit einer Größe von ca. 300kDa detektiert werden. Unter Berücksichtigung der für den Rinderkomplex vorgeschlagenen Einteilung des Komplex I in die Subkomplexe Iα und Iβ (Brandt et al. 2006) könnte der detektierte Subkomplex Iβ zugeordnet werden, da er zwei Untereinheiten beinhaltet, die diesem Komplex zuzuordnen sind. Die NEBM Untereinheit könnte also an der Assemblierung der NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase beteiligt sein. Erstmals konnten Superkomplexe in Y. lipolytica Mitochondrien nachgewiesen werden. Die Identifizierung der neuen NEBM Untereinheit vervollständigt die Kenntnisse über die Untereinheitenzusammensetzung. Das Wechselspiel mit anderen Proteinen und die Zusammensetzung des Komplexes können für die Strukturaufklärung und zur Analyse des Reaktionsmechanismus wichtig sein. Somit leisten diese Ergebnisse einen wichtigen Beitrag zur Charakterisierung der NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase aus Y. lipolytica.
Die zellfreie Proteinsynthese hat sich in den letzten Jahren zu einem potenten Werkzeug – auch in der Produktion von Membranproteinen – entwickelt. Da keine lebenden Zellen genutzt werden, kann der Prozess der präparativen Membranproteinproduktion vereinfacht und individuell optimiert werden. Im Gegensatz zu konventionellen zellbasierten Expressionssystemen gewährleistet die zellfreie Proteinsynthese die direkte Zugänglichkeit zum Reaktionsort und damit die Möglichkeit der unmittelbaren Kontrolle. Dies ermöglicht eine genaue Anpassung der Reaktionsbedingungen auf das Zielprotein. Die Verbesserung und Entwicklung neuer Modi der zellfreien Membranproteinsynthese war ein Teil der vorliegenden Arbeit. Setzt man dem Zellfrei-System von Außen keine hydrophobe Umgebung zu, so präzipitiert das neu-synthetisierte Membranprotein im Reaktionsmix (P-CF). Interessanter Weise unterscheiden sich diese Präzipitate von den aus der E.coli zellbasierten Proteinproduktion bekannten Einschlußkörperchen, da sie sich teilweise leicht in mildem Detergenz resolubilisieren lassen. Zudem konnte für verschiedene Transportproteine, die aus Präzpitat resolubilisiert und danach in Liposomen rekonstituiert wurden, spezifische Transportaktivität gezeigt werden (z.B. eukaryotische Ionentransporter, Multi-Drug Resistenzproteine von E.coli). Alternativ können die Membranproteine direkt, durch die Zugabe von Detergenzien in den Reaktionsmix, solubilisiert werden (D-CF). Um die einzelnen Expressionsmodi zu optimieren wurden 24 gebräuchliche Detergenzien auf ihre Eigenschaft hin gestestet, strukturell sehr unterschiedliche Membranproteine zu solubilisieren. Die Familie der langkettigen Polyoxyethylen-alkyl Ether hat sich dabei als sehr geeignet erwiesen um das prokaryotische α-helikale Multi-Drug Resistenzprotein EmrE, den bakteriellen vornehmlich aus ß-sheets bestehenden Transporter Tsx und den eukaryotischen G-Protein gekoppelten Vasopressin Rezeptor V2R direkt im D-CF Modus zu solubilisieren. Zudem konnte eine Abhängigkeit der spezifischen Aktivität von Tsx vom verwendeten Expressionsmodus bzw. des verwendeten Detergenz mit Hilfe der Black Lipid Membrane´ Methode gezeigt werden. Die Expression eines repäsentativen Teils von 134 Zielproteinen des inneren Membranproteoms von E.coli wurde in drei verschiedenen Zellfrei-Expressionsmodi getestet. Ein an jedes Zielprotein des Membranroteoms C-terminal fusioniertes GFP diente der Konzentrationsbestimmung im D-CF Expressionsmodus. Die Faltung von GFP ist in Anwesenheit von Detergenz signifikant reduziert. Zunächst wurden alle Zielproteine in einem batch´ System im D-CF Modus im Mikrotiterplatten Maßstab mit Hilfe eines Roboters hergestellt. Die Etablierung einer robotergestützten Plattform, welche das Pipettieren, Inkubieren und Detektieren kombiniert, diente als Grundlage für den Herstellungsprozess des Membranroteoms von E.coli in einem Medium-Durchsatz Verfahren in batch´ Konfiguration. In dieser ersten Stufe des Screens im D-CF Modus konnten 84 Zielproteine (63%) aufgrund der detektierten GFP-Fluoreszens in Mengen von 1 bis 60μg pro mL Reaktion als erfolgreich produziert identifiziert werden. Zudem wurde das Membranproteom in dem effektiveren continous exchange (CE) Verfahren im P-CF, wie auch im D-CF Modus wiederholt exprimiert. Im Vergleich zur batch´ Konfiguration konnten im CE D-CF Modus deutlich mehr Zielproteine (75%) als positiv identifiziert werden. 16 Zielproteine wurden dabei bereits in Expressionsmengen von mehr als 100μg solubilisierte Membranproteinfusion pro mL Reaktionsmix gewonnen. 99 Zielproteine (74%) konnten als positiv identifiziert werden, nachdem die unlösliche Fraktion der CE P-CF Reaktion elektrophoretisch getrennt und angefärbt wurde. Für 66 Kandidaten (49%) stellt das produzierte Protein nach Coomassie-Färbung eine dominante Bande, und damit (semi-)präparative Proteinmengen, dar. Der Erhalt von Detergenz-solubilisierten Membranproteinproben von hoher Qualität ist ein wichtiger Schritt zur Gewinnung struktureller sowie biochemischer Daten. Das E.coli α-helikale Multi- Drug Resistenz Protein SugE konnte im CE P-CF Verfahren in präparativen Mengen von mehr als 2mg Protein pro mL des Reaktionsansatzes gewonnen werden. Durchgeführte analytische Größenausschlusschromatographie zeigte, dass der Transporter unter optimierten Reaktionsbedingungen in einem homogenen, schlanken Peak eluiert. Mittels elektronenmikroskopischer Gefrierbruchanalysen konnte eine effiziente und homogene Rekonstitution von SugE in E.coli Liposomen gezeigt werden. Bindungsstudien unter der Verwendung fluoreszensbasierter Anisotropie-Messungen haben gezeigt dass Proflavin – im Gegenteil zu Ethidium – ein Substrat von SugE ist. YedZ ist ein 24kDa leucinreiches Membranprotein mit sechs putativen Transmembransegmenten und enthält zwei Kofaktoren, ein Häm b und ein Flavin-mononukleotid (FMN). Im P-CF Modus exprimiertes YedZ kann effizient in den Detergenzien LMPG, LPPG, SDS und DPC resolubilisiert werden. Analytische Größenausschlusschromatographie zeigte einen symmetrischen Elutionspeak der apo-Form. Mittels CD-Spektroskopie des gereinigten apo-YedZ in 0.02% DDM wurde ein α-helikaler Sekundärstrukturanteil von 55% ermittelt. Zur Gewinnung von holo-YedZ wurde anstatt Hämb das chemisch verwandte Hemin eingesetzt. Die aufgenommenen UV/Vis Spektren der zellfrei produzierten holo-YedZ Proteinprobe in ihrer oxydierten und reduzierten Form, zeigen zu einer in vivo exprimierten Vergleichsprobe identische Absorptionsmaxima. Für sechs G-Protein gekoppelten Rezeptoren konnte die zellfreie Expression in präparativen Mengen gezeigt werden. Das Steroid-Derivat Digitonin, sowie einzelne Mitglieder der Detergenzfamilie der langkettigen Polyoxyethylen-alkyl Ether, wurden als am geeignetsten für die lösliche Expression der GPCRs im CE D-CF Verfahren ermittelt. Löslich in Anwesenheit von Brij78 produzierter GPCR Proben, zeigten nach Negativfärbung in elektronenmikroskopischen Einzelpartikelanalysen eine homogene Probenpräparation und geben Hinweis auf eine strukturelle Dimerisierug der Rezeptoren. Detergenzsolubilisierte Rezeptoren konnten in Liposomen, basierend auf E.coli Lipid-Mischungen, rekonstituiert werden. Elektronen-mikroskopische Gefrierbruchanalysen zeigten eine homogene Rekonstitution, welche auf eine funktionelle Faltung der Rezeptoren schließen lässt.
The transcription factor p63 is expressed as at least six different isoforms, of which two have been assigned critical biological roles within ectodermal development and skin stem cell biology on the one hand and supervision of the genetic stability of oocytes on the other hand. These two isoforms contain a C-terminal inhibitory domain that negatively regulates their transcriptional activity. This inhibitory domain contains two individual components: one that uses an internal binding mechanism to interact with and mask the transactivation domain and one that is based on sumoylation. We have carried out an extensive alanine scanning study to identify critical regions within the inhibitory domain. These experiments show that a stretch of ~13 amino acids is crucial for the binding function. Further, investigation of transcriptional activity and the intracellular level of mutants that cannot be sumoylated suggests that sumoylation reduces the concentration of p63. We therefore propose that the inhibitory function of the C-terminal domain is in part due to direct inhibition of the transcriptional activity of the protein and in part due to indirect inhibition by controlling the concentration of p63. Keywords: p63, transcriptional regulation, auto-inhibition, sumoylation