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Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) from Phycomyces blakesleeanus was partially purified by protamine sulfate precipitation, ammoniumsulfate precipitation, and diethylamino ethyl cellulose (DEAE) treatment. This preparation was employed for the characterization of the enzyme. The Km values for phosphoenolpyruvate (PEP) and ADP were determined as 1.6 and 0.42 mᴍ. The nucleotid specifity was demonstrated for ADP exclusively. The use of sulfuryl reagents showed the presence of thiol groups sensitive against p-hydroxymercuribenzoate but not effected by N-ethylmaleimide.
The cyanobacterium Synechococcus (Anacystis nidulans strain L 1402-1) was grown at +35 °C in air and in air enriched with 2.2 vol.% CO2. The effect of different oxygen concentrations (0, 2, 20, 50, 75 and 99.97 or 97.8 vol.%) was studied in low (0.03 vol.%) and high (2.2 vol.%) CO2 concentrations at + 35 °C. After exposure to a nitrogen atmosphere and low CO2 content I4C-bicarbonate was mainly incorporated into aspartate and glycine/serine. During oxygenic photosynthetic CO2 fixation label in aspartate decreased and a high degree of radioactivity could be found in 3-phosphoglyceric acid and sugar monophosphates. The Calvin cycle was the main fixing pathway in 2.2 vol.% CO2 during anoxygenic and oxygenic conditions independent on the O2 concentrations during the experiments. No oxygen enhancement of photosynthetic CO2 fixation could be found. Possible mechanism involved in CO2 fixation pathways and glycolate metabolism underlying the effect of oxygen was discussed.
The blue-green alga Anacystis nidulans (strain L 1402-1) was grown at + 37 °C in air (0.03 vol.% CO2 and in air enriched with 3.0 vol.% CO2. The effects of several inhibitors on the activity of aminotransferases, 14CO2 fixation and radioactive photosynthetic products of Anacystis were studied. No serine-pyruvate aminotransferase activity could be found in 10-2 м isonicotinyl hydrazide (INH) ; under the influence of this inhibitor aspartate and alanine aminotransferase were decreased about 49% respectively 17.6%. Serine-pyruvate and alanine aminotransferase activity decreased to more than 50% in 10-3 м glyoxalbisulfite. The obtained inhibitory effect of 10-4 м HPMS on serine-piruvate aminotransferase (35%) was stronger than on the other aminotransferases. DCMU (5 × 10-6 м) inhibition on alanine aminotransferase activity was 83.7%. Under the influence of 10-3 м glyoxalbisulfite no 14C-labelled amino acids could be detected after 5 min photosynthesis; 14C-labelling of phosphoenolpyruvate, malate, phosphoglycolate and glycolic acid increased. Isonicotinyl hydrazide (10-2 м) caused in comparison to the control experiment a lower radioactivity in aspartate, glutamate and phosphoenolpyruvate. The results are discussed with reference to the operation of the glycolate pathway and a carboxylation reaction of phosphoenolpyruvate in the blue-green alga Anacystis nidulans.
The cyanobacterium Synechococcus (Anacystis nidulans strain L 1402-1) was grown at + 37 °C in 3.0 vol.% CO2. The effect of preillumination with white light on the subsequent dark 14CO2 fixation was studied under aerobic conditions at + 30 °C. The radioactive carbon first incoiporated into 3-phosphoglyceric acid was transferred during the later periods of dark 14CO2 fixation to phosphoenolpyruvate and aspartate. No labelling or a very low label in sugar monophosphates could be observed. During the dark/light transients the initial fixation product was mainly aspartate. The pattern of 14C-incorporation into photosynthetic products under steady state conditions (10 min photosynthesis) varied with the temperature during the experiments. The radioactive carbon was firstly incorporated into 3-phosphoglyceric acid. During the later periods of photosynthetic 14CO2 fixation an increased 14C-incorporation into aspartate and glutamate could be observed. Our findings were interpreted with operating of a phosphoenolpyruvate carboxylation besides the Calvin cycle.
The absolute configurations of the diastereomeric 10-hydroxyaloins, which may be regarded as parent structures for other naturally occurring oxanthrone-C-glucosyls, have been established as 10R, 16 R (A) and 10 S, 16 R (B) by an X-ray structure analysis of the A-octaacetyl derivative (C 16 is the anomeric glucosyl carbon atom). The determination was confirmed by CD spectroscopic comparison with the structural analogues aloins A and B, which should prove useful for making future configurational assignments within this class of compounds. A conformational analysis by the use of a molecular modeling method based on force-field calculations reveals the presence of an extra- and an intra-form, the extra-form of which is energetically preferred.
Identifizierung und funktionelle Analyse von Pathogenitätsfaktoren in Bartonella bacilliformis
(2023)
Die Carrión-Krankheit ist eine durch Vektoren übertragene vernachlässigte Tropenkrankheit (neglected tropical disease), die in den südamerikanischen Andentälern auf einer Höhe von 600 3.200 m über dem Meeresspiegel vor allem in Peru, aber auch in Ecuador und Kolumbien endemisch ist. Der Erreger dieser Infektionskrankheit ist Bartonella bacilliformis, ein strikt humanpathogenes, Gram-negatives, fakultativ intrazelluläres Stäbchen der Klasse der Alphaproteobakterien. In der akuten Krankheitsphase, die als "Oroya-Fieber" bezeichnet wird, infizieren die Erreger Erythrozyten und verursachen eine schwere akute hämolytische Anämie, hohes Fieber sowie eine ausgeprägte Immunsuppression. Für diese Phase wurden Sterblichkeitsraten von bis zu 88% beschrieben. Dem Oroya-Fieber folgt meist eine chronische Infektion der vaskulären Endothelzellen, bei der durch vaskulo-endotheliale Proliferationen noduläre, Hämangiom-ähnliche, kutane Gefäßläsionen, die als "Verruga peruana" bezeichnet werden, entstehen. Diese beiden Phasen treten in der Regel nacheinander, manchmal aber auch unabhängig voneinander auf. Die Übertragung auf dem Menschen erfolgt durch den Biss infizierter Sandmücken (Lutzomyia spp.), die in den hochgelegenen Regionen der Anden vorkommen. Klimatische Veränderungen führen jedoch zur Expansion des Vektors auf angrenzende Regionen und begünstigen damit die Ausbreitung von B. bacilliformis-Infektionen.
In der Erforschung der Carrión-Krankheit besteht ein erheblicher Wissensmangel zu zahlreichen Aspekten (z. B. Epidemiologie, Infektionsbiologie, Diagnostik, Therapie), wodurch die Entwicklung von potenziellen Diagnostika, Therapeutika oder Vakzinen verhindert wird. Auch wenn frühere Studien zum Ziel hatten, immundominante Proteine für die Entwicklung serodiagnostischer Verfahren und Impfstoffe zu identifizieren, ist bislang kein validierter serologischer Test bzw. ein Impfstoff verfügbar. Daher sollte im ersten Teil dieser Arbeit ein serologischer Test zum Nachweis von anti-B. bacilliformis-Antikörpern entwickelt werden. Hierzu wurde ein Ansatz aus reverser Vakzinologie in Kombination mit einer Analyse heterologer genomischer Expressionsbibliotheken verfolgt, um geeignete immundominante Proteine zu identifizieren. Insgesamt wurden 21 potenziell immundominante Proteine identifiziert, rekombinant produziert, und auf ihre Reaktivität mit B. bacilliformis Patientenseren mittels Immunoblotting analysiert. Von den 21 Antigenkandidaten erwiesen sich 14 als immunreaktiv, die anschließend in einer Lineblot-Analyse mit 26 Serumproben von peruanischen B. bacilliformis Patienten und 96 Serumproben von gesunden deutschen Blutspendern ohne Reisevorgeschichte in Südamerika auf ihren potenziellen Nutzen für serologische Test untersucht wurden. Drei Antigene (Porin-B, Autotransporter-E und hypothetisches Protein-B) erwiesen sich für die Entwicklung eines diagnostischen ELISA als geeignet und wurden in zwei verschiedenen Antigenkombinationen (ELISA 1: Porin-B, Autotransporter-E, ELISA 2: Porin-B, Autotransporter-E, hypothetisches Protein B) verwendet. Um die Leistungsfähigkeit des B. bacilliformis ELISA zu bewerten, wurde eine Receiver-Operating-Characteristic-Analyse durchgeführt. Für die Kombination aus Porin-B und Autotransporter-E lag die Sensitivität des Tests bei 80,8% und die Spezifität bei 94,8%, wohingegen die Kombination aus Porin-B, Autotransporter-E und dem hypothetischem Protein-B in einer Sensitivität von 76,9% und einer Spezifität von 93,8% resultierte. Dieser neu entwickelte ELISA könnte ein nützliches serodiagnostisches Instrument für künftige epidemiologische Studien über B. bacilliformis in endemischen Gebieten darstellen. Darüber hinaus könnten die hier identifizierten immundominanten Antigene eine erste Grundlage für die zukünftige Entwicklung von Impfstoffen für die Prävention Carrión-Krankheit bilden.
Erythrozyten-Invasion und Hämolyse sind wahrscheinlich die wichtigsten Schritte in der Pathogenese der Carrión-Krankheit und verantwortlich für die hohe Sterblichkeitsrate beim Menschen. Genaue mechanistische Kenntnis dieses Prozesses sind entscheidend für die Entwicklung therapeutischer Arzneimittel. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollten die in der Hämolyse involvierten Pathogenitätsfaktoren von B. bacilliformis identifiziert werden. Hierzu wurde eine Tn5-Transposonmutagenese in den beiden B. bacilliformis Stämmen KC583 und KC584 durchgeführt. Ein screening nach Hämolyse-defizienten Mutanten führte zur Identifizierung von zwei Pathogenitätsfaktoren: einem Porin (Porin-A) und einer α/β-Hydrolase. Ihre vermutete Funktion im Prozess der Hämolyse wurde durch eine zielgerichtete markerlose Deletion sowie durch genetische Komplementationen in vitro funktionell bestätigt. Dabei zeigte sich, dass Porin-A und die α/β Hydrolase jeweils essenzielle Faktoren für die Hämolyse darstellen. Durch eine in silico-Charakterisierung konnte konservierte biologische Funktionen identifiziert sowie die dreidimensionale Struktur der Proteine vorhergesagt werden. Diese Versuche bilden eine experimentelle Basis, um die Rolle von Porin-A und der α/β-Hydrolase näher untersuchen zu können und um potenzielle (Porin-A und α/β-Hydrolase) Inhibitoren mit anti-hämolytischer und damit therapeutische Wirkung testen zu können.
The tremendous body of knowledge about genetics, cell biology, and metabolism of Saccharomyces cerevisiae, as well as its long history and robustness in industrial fermentations, have made this yeast one of the most popular microbial cell factories. Novel genetic tools have enabled the rapid construction of strains producing various platform chemicals, fuels, or pharmaceuticals. The relevance of synthetic biology approaches, such as the construction of fully synthetic genomes and artificial cellular compartments are not only relevant for biotechnological applications but can also lead to new insight into basic principles of life.
Eine überlebenswichtige Eigenschaft von Mensch und Tier ist es, sich bei Gefahr durch eine Schreckreaktion in Sicherheit zu bringen. Doch woran erkennt ein Organismus, in welcher Situation es „sinnvoll“ wäre, sich zu erschrecken und welche Eigenschaften sensorischer Stimuli tragen zu dem Gefahreneindruck bei? Bei plötzlich eintretenden, lauten auditorischen Reizen kann es zur Auslösung der akustischen Schreckreaktion kommen. Dies führt bei Menschen, aber auch bei kleineren Säugetieren zu einer reflexartigen Kontraktion der Nacken-, Gesichts- und Skelettmuskulatur. Die Erforschung der akustisch evozierten Schreckreaktion (ASR) dient dem besseren Verständnis der neurobiologischen Grundlagen sensorischer Verarbeitung. Modulationen der ASR mithilfe von Präpulsen (Präpulsinhibition) ermöglichen Einblicke in die Funktion der Kochlea, des Hörnervs, der Hirnstammstrukturen und anderer beteiligter Gehirnregionen.
In dieser Arbeit wurden kurzzeitige Änderungen von Frequenz oder Intensität des akustischen Hintergrundes als neuartige Präpulse untersucht. Die Bedeutung verschiedener Reizparameter dieser Präpulse wurde in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal systematisch erforscht. Um zu prüfen, welche Präpulsstimulationen eine Inhibition der ASR auslösen können, wurde eine Reihe von Parametern umfassend getestet. In einem weiteren Schritt wurde analysiert, ob es mithilfe von gezielten Änderungen von Frequenz oder Intensität möglich sein könnte, Unterscheidungsschwellen, oder gar Hörschwellen von Versuchstieren zu bestimmen.
Die Experimente zur Modulation der ASR wurden mit weiblichen Sprague Dawley-Ratten durchgeführt. Dabei wurde eine Vielzahl von Verhaltensparadigmen untersucht. Dazu zählten Präpulse mit unterschiedlichem Frequenzgehalt und variabler Dauer. Zusätzlich wurden neuartige Paradigmen etabliert, um die Fähigkeit zur Frequenz- und Intensitätsdiskriminierung zu untersuchen. Hierbei wurde der Frequenzgehalt oder die Intensität einer kontinuierlichen Hintergrundstimulation verändert, um eine Präpulswirkung zu erzeugen. Um die Möglichkeiten der Bestimmung von Hörschwellen mittels der Präpulsinhibition (PPI) zu ergründen, wurde die Intensität von Präpulsen systematisch verändert. Die so generierten Schwellenwerte wurden durch die Messung früher akustisch evozierter Hirnstammpotenziale verifiziert. Schließlich sollten, unter Zuhilfenahme der Signaldetektionstheorie, aus den erhobenen Daten diverse Schwellen bestimmt werden: Für die Intensitätsänderungen der Präpulse in Stille wurden Hörschwellen bestimmt, während bei Änderungen der Frequenz und Intensität Unterscheidungsschwellen bestimmt werden sollten.
Mit steigender Größe eines Frequenzsprungs in einer kontinuierlichen Hintergrundstimulation war eine stärkere Inhibition der ASR feststellbar; ein Effekt, der stark von der Hintergrundfrequenz abhängig war. Bei einer Stimulation mit 8 kHz konnten signifikant höhere Inhibitionswerte erzielt werden als mit 16 kHz. Bei der Untersuchung des Zeitablaufs der Stimulation ergab sich, dass eine abgesetzte Stimulation mit einer Abweichung von 80 ms Dauer bis 50 ms vor dem Schreckreiz für die höchsten Inhibitionen sorgte.
Die durch eine Intensitätsänderung einer kontinuierlichen Hintergrundstimulation ausgelöste PPI hing primär von der Größe und Richtung des Intensitätssprungs ab. Mit zunehmender Sprunggröße stiegen die Inhibitionswerte an. Eine Erhöhung der Hintergrundintensität um 10 dB hatte einen signifikanten Einfluss auf die Inhibitionswerte. Auch hier zeigte sich eine höhere Sensitivität in Form von höheren Inhibitionen für Stimuli mit einer Hintergrundfrequenz von 8 kHz als für alle anderen getesteten Hintergrundfrequenzen.
Die Bestimmung von Hörschwellen mittels intensitätsabhängiger PPI wies im Vergleich mit den elektrophysiologisch bestimmten Hörschwellen ein heterogenes Bild mit starken individuellen Schwankungen auf: Bei etwa der Hälfte der Tiere waren die Hörschwellen beider Messungen sehr vergleichbar, bei den übrigen Tieren konnten mittels PPI für eine oder mehrere Frequenzen keine aussagekräftigen Hörschwellen erzielt werden. Die elektrophysiologisch bestimmten Hörschwellen waren am sensitivsten, während PPI-Stimulationen signifikant höher waren. Außerdem bewirkten PPI-Stimulationen mit Reintönen signifikant sensitivere Hörschwellen im Vergleich zu einem Schmalbandrauschen.
Für die Bestimmung der Unterscheidungsschwellen von Frequenzänderungen konnte beobachtet werden, dass die Tiere auf Frequenzsprünge hin zu niedrigeren Frequenzen signifikant sensibler reagierten, als hin zu Aufwärtssprüngen (-1.2 bzw. +4.5%). Bei der Intensitätsunterscheidung hingegen konnte beobachtet werden, dass die Tiere signifikant sensitiver auf Intensitätserhöhungen als auf Erniedrigungen reagierten (-5.9 bzw. +2.7 dB).
Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit festgestellt werden, dass die PPI zur Bestimmung von absoluten Hörschwellen starken Schwankungen unterlag, sodass diese Methode nur eingeschränkt als Alternative zu operanter Konditionierung oder elektrophysiologischen Ableitungen in Frage kommt. Des Weiteren erzeugten bereits kleine Änderungen des Frequenzgehalts oder der Intensität einer Hintergrundstimulation eine robuste PPI. Somit können reflexbasierte Messungen mit überschwelligen Stimuli genutzt werden, um Unterscheidungsschwellen in Versuchstieren zu bestimmen. Diese Herangehensweise stellt also eine vielversprechende Methode dar, um Hörstörungen zu untersuchen, die nach einem Schalltrauma auftreten können. In einem nächsten Schritt könnte sie zur weiteren Charakterisierung von verstecktem Hörverlust beitragen.
Der erste Teil der vorliegenden Arbeit beinhaltet die funktionelle Analyse von fünf Oberflächenproteinen von B. recurrentis die die Fähigkeit besitzen, die Aktivierung von humanen Komplement zu inhibieren und Borrelien vor Bakteriolyse zu schützen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden zwei immunologische Testverfahren mit hoher Sensitivität sowie Spezifität entwickelt und mit zahlreichen Patientenseren evaluiert. Die entwickelten Tests könnten in Zukunft als zuverlässige Instrumente für eine gesicherte Diagnose von LRF eingesetzt werden.
Eine Sequenzanalyse führte zur Identifizierung eines neuen Proteinclusters, welches die fünf untersuchten Komplement-inhibierenden Proteine als „Cluster of Complement-targeting and Host-interacting Proteins“ oder „Chi-Gencluster“, zusammenfasst. Diese Oberflächenproteine wurden als ChiA, ChiB, ChiC, ChiD und ChiE bezeichnet. Weiterführende Sequenzanalysen ergaben, dass das Chi-Gencluster extrem hoch konserviert ist und sowohl in den ersten B. recurrentis-Isolaten aus den 1990er Jahren als auch in B. recurrentis-Stämmen nachgewiesen werden konnte, die 2015 aus Patienten isoliert wurden.
Durch funktionelle Analysen konnte gezeigt werden, dass alle fünf Chi-Proteine in der Lage sind den alternativen und terminalen Komplementweg zu inhibieren. Ebenfalls konnte für die Proteine ChiB, ChiD sowie ChiE nachgewiesen werden, dass die Interaktion mit der Komplementkomponente C5 dosisabhängig verläuft.
Die strukturelle Aufklärung des Proteins ChiB ermöglichte es Aminosäuren zu identifizieren, von denen angenommen wurde, dass sie für die Interaktion mit Komplement eine Rolle spielen könnten. Durch in vitro Mutagenese konnten insgesamt fünf verschiedene Varianten von ChiB generiert werden, die jedoch keine Veränderungen in ihrem Komplement-inhibierenden Potential gegenüber dem unveränderten ChiB-Protein aufwiesen. Weder in der Inhibition des alternativen oder des terminalen Komplementweges, noch in der Interaktion mit den untersuchten Komplementkomponenten C3b, C5 und C9.
Weiter konnte gezeigt werden, dass die lytische Aktivität von Humanserum durch Vorinkubation mit ChiB, ChiC, ChiD und ChiE drastisch reduziert werden konnte, sodass Serum-sensible Borrelienzellen in Gegenwart von Komplement überlebten. „Gain-of-function“ B. garinii-Transformanten, welche mit dem entsprechendem Chi-kodierenden Gen transformiert wurden, bestätigten die mit den gereinigten Proteinen erhobenen Ergebnisse.So konnte nachgewiesen werden, dass ChiB-, ChiC- oder ChiD-produzierende „Gain-of-function“ B. garinii Transformanten, nicht jedoch ChiE- produzierende Zellen, in der Lage waren einen Serum-resistenten Phänotypen auszubilden. Für Transformanten, die zwei-, drei- oder vier Chi-Proteine in verschiedenen Kombinationen gleichzeitig produzierten, konnte allerdings die Fähigkeit in Gegenwart von Humanserum zu überleben nicht bestätigt werden.
Molekulare Analysen mit verschiedenen RF-Borrelienstämmen führten zum Nachweis, dass die fünf Chi-kodierenden Gene bei allen Isolaten vorhanden sind und unter in vitro Bedingungen exprimiert werden. Im Gegensatz zu B. recurrentis PAbJ, ließ sich das HcpA kodierende Gen in B. duttonii LAI nicht nachweisen, jedoch alle dem Chi-Cluster zugehörigen Gene. Bei B. duttoni V fehlte das gesamte Chi-Cluster sowie die für CihC- und HcpA-kodierenden Gene. Durch eine Western Blot-Analyse konnte mit spezifischen Antikörpern bestätigt werden, dass die Proteine CihC, HcpA und ChiB in B. recurrentis A17 unter in vitro Bedingungen produziert wurden.
Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden durch die Analyse der IgM- und IgG-Immunreaktivitäten der LRF-Patientenseren zwei Proteine identifiziert, CihC und GlpQ, die als potenzielle Antigene für die Serodiagnostik des LRF evaluiert wurden. Eine initiale Evaluierung des IgM Lineblot-Immmunoassays zeigte jedoch nur eine geringe Sensitivität für die beiden Antigene, während der IgG Lineblot-Immunoassay eine sehr hohe Sensitivität aufwies. Der ELISA hingegen zeigte bei einer Kombination beider Antigene sehr gute Sensitivitäten und Spezifitäten. Um die starke Hintergrundfärbung bei den Lineblot-Immunoassays, welche eine korrekte Bewertung der Reaktivitäten gegenüber CihC erheblich erschwerten, zu minimieren, wurde ein „Epitop-Mapping“ durchgeführt, um immunogene Regionen innerhalb des CihC-Proteins zu lokalisieren. Eine zweite Evaluierung mit dem immunreaktiven N-terminalen CihC-Fragment CihC-N führte zu einer deutlichen Verbesserung der IgG Lineblot-Immunoassays mit einer Sensitivität von 100 % und einer starken Reduktion der Hintergrundfärbung. Zusätzlich konnte die Sensitivität der IgM-ELISA deutlich verbessert werden. Die Verwendung von CihC-N führte beim IgG-ELISA zur Herabsetzung des Cut-off-Wertes und zu einer besseren Unterscheidung zwischen den positiven LRF-Seren und den verwendeten Kontrollseren. Im Rahmen dieser Arbeit konnten somit zwei serologische in vitro Diagnostika entwickelt werden, die als zuverlässige Point-of-Care-Diagnostik in klinischen Studien eingesetzt werden könnten. Zur Steigerung der Sensitivität des IgM-Lineblot-Immunoassays sollten allerdings weiterführende Untersuchungen mit weiteren immunreaktiven Antigenen, wie z.B. den Vmp-Proteinen von B. recurrentis, angestrebt werden.
Fluorescense spectra of lactate dehydrogenase * (E.C. 1.1.1.27) were investigated in the presence of the coenzyme fragments dihydronicotinamide mononucleotide and dihydronicotinamide-ribose-5'-pyrophospho- (P2) -5“-ribose. The reduced mononucleotide is enzymatically less active as a hydrogen donor. However, formation of a complex with the enzyme was not observed under the conditions used. All the other substances: dihydronicotinamide-ribose-5'-pyrophospho- (P2) -5“-ribose, dihydronicotinamide- benzimidazole-dinucleotide, dihydronicotinamide-3-desazapurine-dinucleotide and dihydronicotinamide-6-mercaptopurine-dinucleotide form more or less stable complexes with lactate dehydrogenase. The complexes do not markedly differ from the complex formed with the natural cofactor. In all cases spectra indicate change in conformation of the coenzyme by forming the coenzyme-enzyme-complex which has been proposed by VELICK 1 too. The cysteine residues of the lactate dehydrogenase are not essential for binding the coenzyme to the active center; this was shown with mercury blocked enzyme.