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Die vorliegende Arbeit umfasst die Rekonstruktion der Körpermasse pleistozäner Cerviden in Java. Zunächst wird ein Rezentmodell erstellt, das den Zusammenhang zwischen Körpermasse und dem jeweiligen Messparameter aufzeigt. Die daraus resultierenden Regressionsgleichungen werden für die Rekonstruktion verwendet. Das fossile dentale und postcraniale Material wird vermessen und die Körpermasse für jedes einzelne Stück rekonstruiert. Die absoluten Werte werden in Körpermassenklassen eingeteilt, um einen Wert unabhängig vom physiologischen Zustand zu erhalten. Die Körpermassen werden, soweit möglich, getrennt nach Gattungen rekonstruiert. Ein Vergleich zeigt, dass es deutliche Unterschiede in der Körpermasse der Gattungen Axis und Muntiacus im Vergleich zu Cervus gibt. Bei der Einteilung in Klassen fällt auf, dass die Klassen 3a (10 kg bis 20 kg) und 3b (20 kg bis 50 kg) ausschließlich von Axis und zu einem kleinen Teil von Muntiacus besetzt werden. Die Klassen 4a und 4b ausschließlich von Cervus. Die einzige von Axis und Cervus besetzte Klasse ist 3c (50 kg bis 100 kg). Anhand dieser aus den Fossilien der Dubois Sammlung gewonnenen Erkenntnisse können nun die Fossilien der von Koenigswald Sammlung beurteilt werden, da diese nicht auf Gattungsniveau bestimmt sind. In beiden Sammlungen liegt der höchste Prozentsatz in der Klasse 3b. Daraus kann man schließen, dass sehr viele Tiere der Gattung Axis vorhanden sind. Die Gattung Cervus hingegen ist nur zu einem recht geringen Prozentsatz vertreten. Diese Verteilung spiegelt sich auch in der Untersuchung der Fundstellen wider. An nur drei der acht untersuchten Fundstellen wurden Tiere der Gattung Cervus gefunden. Ein Vergleich der Körpermassen ergibt keinen signifikanten Unterschied zwischen diesen. Innerhalb der Axis-Hirsche kann man einen Körpermassenunterschied erkennen, der jedoch nicht mit der geographischen Lage der Fundstellen begründet werden kann. Die Untersuchung der Fundstellen aufgrund ihrer Chronologie ergibt keinen signifikanten Unterschied zwischen den Faunenleveln Trinil H.K. und Kedung Brubus. Jedoch ist innerhalb der Faunenlevel eine deutliche Variationsbreite der Körpermasse zu erkennen, welche auf das an den einzelnen Fundstellen herrschende Habitat zurückgeführt werden kann. Die Zuordnung der bisher nicht datierten Fundstellen in die Faunenlevel ist alleine aufgrund der rekonstruierten Körpermassen nicht möglich, jedoch können erste Aussagen über das umgebende Habitat getroffen werden.
Die vorliegende Arbeit umfasst die Rekonstruktion der Körpermasse pleistozäner Rhinocerotidae in Europa und Südost-Asien , hier speziell der Insel Java. Methodisch wird dieses Ziel durch lineare Regressionen nach Janis (1990) verfolgt. Zunächst wird ein Rezentmodell erstellt, das es ermöglicht Körpermasse mit verschiedenen Zahnparametern in Zusammenhang zu bringen. Die aus dem Rezentmodell resultierenden Regressionsgleichungen für jeden Zahn werden dann für die Rekonstruktion fossiler Körpermassen verwendet. Das fossile Zahnmaterial wurde vermessen und die Körpermassen für alle Zahnparameter errechnet. Um einen Vergleich mit veröffentlichten Werten zu ermöglichen, wurde die Körpermasse gleichfalls nach Legendre (1986) ermittelt, welcher eine Formel zur Körpermassenrekonstruktion entwickelte, die heute allgemein Verwendung findet. Um die oftmals sehr großen Schwankungen in der Körpermasse, verursacht durch Ernährungs- und Gesundheitszustand eines Tieres abzufedern, sind die absoluten Werte in Körpermassenklassen eingeteilt. Die ermittelten Körpermassen wurden dann in verschiedenen Zusammenhängen betrachtet und, soweit möglich , Aussagen über Gründe für Veranderungen oder Unterschiede zwischen Messstrecken, Zeiträumen, Habitaten oder auch Spezies genannt.
Die vorliegende Studie dient als Basis einer neuen, zuverlässigen Populationsschätzung von Wildschweinen (Sus scrofa). Nach dem hier entwickelten Feldprotokoll soll Wildschweinkot in ausreichenden Mengen, ausreichend guter Qualität und nicht-invasiv gewonnen werden. Die daraus gewonnen Gewebeproben dienen anschließend als DNS-Quelle für individuelle Erkennung und Markierung der beprobten Tiere. Durch Kenntnis des zum Kot gehörigen Tieres lässt sich ein Fang-Wiederfang-Verfahren simulieren. Ein Sammelverfahren, gegliedert in zwei identische Blöcke zu je sechs Tagen, kombiniert aus Strip-Transekt-Sampling (Buckland 2001) und Adaptive-Sampling (Thompson 1991) führte hierbei zum besten Resultat von 0,48 Funden je abgesuchten Kilometer und 1,04 Funden je aufgewendeter Stunde. Die Untersuchung fand auf einem bewaldeten etwa 40 km2 großen Areal im Pfälzerwald, südlich von Kaiserslautern - südliches Rheinland-Pfalz – statt. Im Rahmen der Untersuchung wurden 1605 km abgesucht und vier verschiedene Transektmodelle getestet. Insgesamt wurden hierbei 268 Kothaufen erfasst, die zusätzlich auf ihre physischen Eigenschaften (Kotgröße, Härtegrad, Konsistenz, Insektenbefall), Lage im Gelände (Verteilung auf Laub-, Nadel- und Mischwälder, sowie auf Geländeneigung, Exposition und Höhenlage) und räumliche Verteilung im Untersuchungsgebiet analysiert wurden. Die Untersuchungen fanden zu verschieden Jahreszeiten (Sommer, Herbst und Winter) statt. Als geeigneter Zeitraum für eine solche Kotsammlung hat sich der Winter herausgestellt, aufgrund der längeren Zersetzungszeit des Kots und der durch den Laubfall bedingten, besseren Sichtverhältnisse. Bei ausreichender Stichprobenzahl des Kots hat es sich zu dem ergeben, dass Rückschlüsse auf die Habitatnutzung des Schwarzwilds anhand der Kotverteilung machbar sind. Eine Interpretation der Populationsstruktur anhand der Kotgröße ist in Ansätzen erkennbar. Ein Vergleich mit den gängigen Bestandesschätzverfahren durch Jagdstrecken und Kotzählungen bestätigt die Tauglichkeit des Feldprotokolls zur Beschaffung von Wildschweinkotmengen, die der Population entsprechen. In zwei von vier Versuchsansätzen konnten entsprechende Kotmengen erfasst werden.
Reggie-1 (flotillin-2) and reggie-2 (flotillin-1) are membrane microdomain proteins which are associated with the membrane by means of acylation. They influence different cellular signaling processes, such as neuronal, T-cell and insulin signaling. Upon stimulation of the EGF receptor, reggie-1 becomes phosphorylated and undergoes tyrosine 163 dependent translocation from the plasma membrane to endosomal compartments. In addition, reggie-1 was shown to influence actindependent processes. Reggie-2 has been demonstrated to affect caveolin- and clathrin-independent endocytosis. Both proteins form homo- and hetero-oligomers, but the function of these oligomers has remained elusive. Moreover, it has not been clarified if functions of reggie-1 are also influenced by reggie-2 and vice versa. The first aim of the study was to further investigate the interplay and the heterooligomerization of reggie proteins and their functional effects. Both reggie proteins were individually depleted by means of siRNA. In different siRNA systems and various cell lines, reggie-1 depleted cells showed reduced protein amounts of reggie-1 and reggie-2, but reggie-2 knock down cells still expressed reggie-1 protein. The decrease of reggie-2 in reggie-1 depleted cells was only detected at protein but not at mRNA level. Furthermore, reggie-2 expression could be rescued by expression of siRNA resistant wild type reggie-1-EGFP constructs, but not by the soluble myristoylation mutant G2A. This mutant was also not able to associate with endogenous reggie-1 or reggie-2, which demonstrates that membrane association of reggie-1 is necessary for hetero-oligomerization. In addition, fluorescence microscopy studies and membrane fractionations showed that correct localization of overexpressed reggie-2 was dependent on co-overexpressed reggie-1. Thus, hetero-oligomerization is crucial for membrane association of reggie-2 and for its protein stability or protein expression. Moreover, the binding of reggie-2 to reggie-1 required tyrosine 163 of reggie-1 which was previously shown to be important for endosomal translocation of reggie-1. Since reggie-2 was implicated to function in clathrin- and caveolin-independent endocytosis pathways, the effect of reggie-2 depletion on reggie-1 endocytosis was investigated. Indeed, reggie-1 was dependent on reggie-2 for endosomal localization and EGF-induced endocytosis. By FRET-FLIM analysis it could be shown that reggie heterooligomers are dynamic in size or conformation upon EGF stimulation. Thus, it can be concluded that reggie proteins are interdependent in different aspects, such as protein stability or expression, membrane association and subcellular localization. In addition, these results demonstrate that the hetero-oligomers are dynamic and reggie proteins influence each other in terms of function. A further aim was the characterization of reggie-1 and reggie-2 function in actindependent processes, where so far only reggie-1 was known to play a role. Depletion of either of the proteins reduced cell migration, cell spreading and the number of focal adhesions in steady state cells. Thus, also reggie-2 affects actin-dependent processes. Further investigation of the focal adhesions during cell spreading revealed that depletion of reggie-1 displayed different effects as compared to reggie-2 knock down. Reggie-1 depleted cells had elongated cell-matrix-adhesions and showed reduced activation of FAK and ERK2. On the other hand, depletion of reggie-2 resulted in a restricted localization of focal adhesion at the periphery of the cell and decreased ERK2 phosphorylation, but it did not affect FAK autophosphorylation. Hence, reggie proteins influence the regulation of cell-matrix-adhesions differently. A link between reggie proteins and focal adhesions is the actin cross-linking protein -actinin. The interaction of -actinin with reggie-1 could be verified by means of co-immunoprecipitations and FRET-FLIM analysis. Reggie-1 binds -actinin especially in membrane ruffles and in other locations where actin remodeling takes place. Moreover, -actinin showed a different localization pattern during cell spreading in reggie-1 depleted cells, as compared to the control cells. These results provide further insights into the function of both reggie proteins. Their interplay and hetero-oligomerization was shown to be crucial for their role in endocytosis. In addition, both reggie proteins influence actin-dependent processes and differentially affect focal adhesion regulation.
Stressorinduzierte ökotoxikologische Effekte und Genexpressionsveränderungen bei Chironomus riparius
(2008)
Die Effekte von Stressoren auf Chironomus riparius wurden im Lebenszyklustest und auf genomischer Ebene mit dem Ziel untersucht, ein auf einem DNA-Mikroarray („ChiroChip“) basierendes Screeningverfahren zu entwickeln. Die empfindlichsten Endpunkte der Lebenszyklustests waren die Mortalität, der Anteil fruchtbarer Eigelege, der mittlere Schlupfzeitpunkt der Weibchen sowie das Gewicht der Männchen. Temperaturveränderungen um ± 6°C gegenüber einer normalen Hälterungstemperatur von 20°C führten in allen Endpunkten zu hochsignifikanten Effekten. Eine LC10 konnte nur für die Salinität berechnet werden (0,66‰, KI: 0,26 − 1,68‰). Aufgrund der nicht-linearen Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen konnte nur für den mittleren Schlupfzeitpunkt der Weibchen nach einer Exposition gegenüber Cadmium eine EC50 (0,53 mg/kg, KI: 0,29 − 0,97 mg/kg) bestimmt werden. In den Versuchen mit Methyltestosteron, Ethinylöstradiol, Carbamazepin, Fluoxetin, Blei und Tributylzinn (mit denen auch molekularbiologische Untersuchungen durchgeführt wurden) waren die empfindlichsten Endpunkte die Mortalität, der Anteil fruchtbarer Eigelege, der mittlere Schlupfzeitpunkt der Weibchen sowie die Populationswachstumsrate. Carbamazepin (CBZ) wirkte schlupfverzögernd bei den Weibchen. 10 mg CBZ/kg führte zu einer höheren Mortalität, weniger Eigelegen, die vermehrt unfruchtbar waren, sowie zu einer geringeren Populationswachstumsrate. Fluoxetin (FX) wirkte bei beiden Geschlechtern schlupfverzögernd. 0,9 mg FX/kg führte zu einer erhöhten Mortalität, weniger und vermehrt unfruchtbaren Eigelegen und einer geringeren Populationswachstumsrate. In der höchsten Konzentration (5,9 mg/kg) waren die Weibchen leichter als die Kontrolltiere. Tributylzinn (in µg Sn/kg angegeben) bewirkte eine höhere Mortalität und geringere Populationswachstumsrate bei 100 µg Sn/kg und führte zu einer Verzögerung im Schlupfverlauf bei den Weibchen. Bei 160 µg Sn/kg gab es weniger Eigelege, die vermehrt unfruchtbar waren. Die Männchen, die gegenüber Konzentrationen von 120 und 160 µg Sn/kg exponiert wurden, waren leichter als die Kontrolle. Expositionen gegenüber Blei (Pb) in Konzentrationen von 0,65 − 65 mg/kg führten bei 6,5 mg Pb/kg zu einer erhöhten Mortalität und zu mehr unfruchtbaren Gelegen. Bei 0,65 mg Pb/kg waren die Männchen leichter und bei 6,5 mg Pb/kg schwerer. Die Anzahl der fruchtbaren Gelege pro Weibchen war bei 3,25 und 6,5 mg Pb/kg geringer als in der Kontrolle. Die gegenüber 17alpha-Methyltestosteron (MET) exponierten Mücken hatten geringere Mortalitäten als in der Kontrolle und zeigten einen verfrühten Schlupf beider Geschlechter. Ab 27 µg MET/kg gab es weniger unfruchtbare Gelege, leichtere Männchen sowie erhöhte Populationswachstumsraten. 17alpha-Ethinylöstradiol (EE2) führte zu einem verfrühten Schlupf bei beiden Geschlechtern sowie zu erhöhten Populationswachstumsraten. Bei 9 µg EE2/kg gab es weniger unfruchtbare Gelege. Die Exposition von Chironomus-Larven gegenüber Methyltestosteron, Ethinylöstradiol, Fluoxetin, Carbamazepin, Tributylzinn und Blei führte zur differenziellen Expression von neun (Methyltestosteron) bis 49 (Carbamazepin) Genen. Bei der Untersuchung der exprimierten Proteine fällt auf, dass kaum bekannte Stressproteine (z.B. Glutathion-S-Transferase oder Cytochrom P450) differentiell reguliert wurden. Bei der Exposition wurden verschiedene Prozesse durch eine veränderte Genexpression beeinflusst. Eine Exposition gegenüber Methyltestosteron führte zu einer Beeinträchtigung von drei identifizierten biologischen Prozessen, während bei den anderen Substanzen sieben bis acht Prozesse beeinflusst waren. Die am häufigsten beeinflussten Prozesse waren der Protein- und der Energiemetabolismus. Der Sauerstofftransport ist ein Prozess, der bei allen Substanzen beeinflusst wurde, jedoch mit unterschiedlichen Anteilen. Bei einer Exposition gegenüber Methyltestosteron war der Anteil des Sauerstofftransports an den beteiligten Prozessen mit 84,6% am größten und mit 10,5% bei Fluoxetin am geringsten. Die veränderte Genexpression der Globine kann möglicherweise aufgrund der schadstoffspezifischen Veränderungen als Biomarker für das Monitoring von Freilandgewässern angewendet werden. Da Tubulin und Aktin häufig nach einer Exposition gegenüber Stressoren differenziell exprimiert wird (bei Tributylzinn und CBZ in der vorliegenden Arbeit und bei Antidepressiva und Östrogenen in anderen Studien) wären die beiden Proteine möglicherweise ebenfalls als Biomarker für Chemikalienstress geeignet. Vor der Verwendung des ChiroChips als Screeninginstrument für die Chemikalienuntersuchung und das Biomonitoring müssen noch Untersuchungen zur konzentrationsabhängigen Genexpression und zur Expression in unbehandelten Larven und weiteren Lebensstadien erfolgen. Des Weiteren müssen die vorliegenden Daten verifiziert und die Funktion der differentiell regulierten Gene vertieft untersucht werden.
In dieser Arbeit wurden potentielle Mitglieder des Proteinnetzwerks um Ataxin-2 untersucht, um Rückschlüsse auf die bisher unbekannte Funktion von Ataxin-2 machen zu können. Ataxin-2 ist das Krankheitsprotein der Spinozerebellären Ataxie Typ 2, einer Polyglutaminerkrankung, bei der die Expansion eines Polyglutamintraktes zur Degeneration von Purkinje-Neuronen führt. Da die Funktion von Ataxin-2 bisher nicht ermittelt werden konnte, sollte die Charakterisierung seiner Protein-Interaktoren es ermöglichen, Einblicke in seine Funktion zu gewinnen. Dazu wurden die drei Kandidaten „Similar to golgin-like“, TRAP und alpha-Actinin-1 untersucht, die alle drei mit Hilfe von Hefe-2-Hybrid Screens identifiziert worden waren. Im Fall von „Similar to golgin-like“, einem aus Genom und cDNA-Fragmenten hervorgesagten Protein unbewiesener Existenz, konnte eine mutationsabhängige Modulation der Bindungsstärke an Ataxin-2 im Hefe-2-Hybrid-System gezeigt werden, die sich allerdings mit rekombinanten Proteinen in Koimmunpräzipitationen in Säuger-Zellen nicht reproduzieren ließ. Beide Proteine kolokalisierten am ER, unabhängig von der Länge des pathogenen Polyglutamintraktes-2 in Ataxin. Gegen ein SIM-Peptid hergestellte Antikörper zeigten eine exklusive Expression im menschlichen Gehirn und wurden erfolgreich zum Nachweis eines endogenen Komplexes aus Ataxin-2 und SIM-IR im krankheitsrelevanten Gewebe eingesetzt. Allerdings war es nicht möglich, mittels 5’-RACE und 2D-Gel Massenspektrometrie die potentiellen Isoformen von SIM näher zu charakterisieren. Zur funktionellen Analyse von SIM wurden intrazelluläre Transportvorgänge am Golgi-Apparat untersucht, aber ein Einfluss von SIM / Ataxin-2 ließ sich nicht belegen. Im Fall des Interaktions-Kandidaten TRAP wurden Antikörper hergestellt und mit einem bereits publizierten polyklonalen Antikörper, der TRAP in rattus norvegicus erkennt, verglichen. Die Expressionsmuster zeigten eine identische Expression im Hirn und der Testis. Eine Kolokalisations-Studie wies sowohl TRAP als auch Ataxin-2 am ER nach. Allerdings erwiesen sich alle verwendeten Antikörper als ungeeignet für Immunpräzipitationen, so dass die physiologische Existenz des endogenen TRAP-Ataxin-2 Komplexes nicht bewiesen werden kann. Im Fall des Interaktor-Kandidaten alpha-Actinin-1 ließ sich die Interaktion mit Ataxin-2 sowohl für die endogenen Proteine in der zytosolischen Fraktion von Mausgehirnen als auch für die rekombinanten Proteine in Säuger-Zellen belegen. Beide Proteine konnten im Zytosol und zu kleineren Anteilen an der Plasmamembran kolokalisiert werden. Als verantwortliche Subdomänen im Fall von Ataxin-2 wurde der N-terminale Bereich des Proteins in der Nähe der pathogenen Expansion, im Fall von alpha-Actinin-1 die Aktin-bindende Domäne durch GST-pulldown Analysen identifiziert. Darauf aufbauend wurde in Patienten-Fibroblasten das Aktinzytoskelett und die Dynamik von alpha-Actinin-1 in Anwesenheit der Ataxin-2-Polyglutamin-Expansion untersucht, wobei allerdings kein Unterschied zu erkennen war. Anschließend an die Analyse des Zytoskeletts wurde ein möglicher Einfluss von Ataxin-2 und seiner Polyglutamin-Expansion auf die EGF-Rezeptorinternalisierung studiert, da eine Rolle von Ataxin-2 auf die Endozytose in parallelen Analysen der Arbeitsgruppe wahrscheinlich wurde. Hierzu wurden Säuger-Zellen mit alpha-Actinin-1 transfiziert und die Internalisierung mikroskopisch und mittels Analyse der ERK1/2 Aktivierung verfolgt. Ergänzt wurden die Experimente durch Analysen zur ERK1/2 Aktivierung in Patienten- und Kontroll-Fibroblasten. Entgegen den Erwartungen hatte die Überexpression von alpha-Actinin-1 keinen Einfluss auf die Internalisierung, und bei keinem der Ansätze zeigte sich eine signifikante Veränderung der ERK1/2 Aktivierung. Auch Transkriptombefunde aus SCA2-KO Gewebe, nach denen einzelne Gene des Zytoskeletts oder der Rezeptor-Endozytose ihre Expression ändern, ließen sich nicht mit Konsistenz validieren. Abschließend wurden Experimente zur subzellulären Lokalisation von Ataxin-2 durchgeführt, die eine Lokalisation am ER und nicht wie bisher berichtet am Golgi-Apparat sicherten und Ergebnisse zur Assoziation mit Polyribosomen bekräftigten. Obwohl somit bei allen drei Proteininteraktor-Kandidaten glaubwürdige Befunde für eine Ataxin-2 Bindung sprechen, ist derzeit eine funktionelle Analyse der Assoziationen nicht möglich und eine klare Definition der physiologischen Rolle von Ataxin-2 lässt sich aus diesen Daten nicht ableiten, wenn auch die prominente Lokalisation von Ataxin-2 am rauen endoplasmatischen Retikulum mit einem Einfluss von Ataxin-2 auf die ribosomale Translation und die Sekretion in Cisternen kompatibel ist.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden ausgewählte 5’- und 3’-untranslatierte Regionen (UTRs) von mRNAs aus H. volcanii bestimmt. Dieses Datenset wurde verwendet um (1) haloarchaeale UTRs zu charakterisieren, (2) Konsensuselemente für die Transkrikptionsinitiation und -termination zu verifizieren und (3) den Einfluss haloarchaealer UTRs auf die Initiation und Regulation der Translation zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten Transkripte nichtprozessierte 3’-UTRs mit einer durchschnittlichen Länge von 45 Nukleotiden besitzen. Darüber hinaus konnte ein putatives Transkriptionsterminationssignal bestehend aus einem pentaU-Motiv mit vorausgehender Haarnadelstruktur identifiziert werden. Die Analysen der Regionen stromaufwärts der experimentell bestimmten Transkriptionsstarts führten zur Identifizierung dreier konservierter Promotor Elemente: Der TATA-Box, dem BRE-Element und einem neuen Element an Position -10/-11. Überraschenderweise bestand die TATA-Box nur aus vier konservierten Nukleotiden. Die Untersuchung der UTRs ergab, dass die größte Anteil der haloarchaealen Transkripte keine 5’-UTR besitzt. Falls eine 5’-UTR vorhanden ist, besitzen unerwarteterweise nur 15% der 5’-UTRs aus H. volcanii eine Shine-Dalgarno-Sequenz (SD-Sequenz). Es konnte jedoch gezeigt werden, dass verschiedene native und artifizielle 5’-UTRs ohne SD-Sequenz sehr effizient in vivo translatiert werden. Außerdem hat die Sekundärstruktur der 5’-UTR und die Position struktureller Elemente offenbar einen entscheidenden Einfluss auf die Translatierbarkeit von Transkripten. Die Insertion von Strukturelementen nahe des Startkodons führte zu einer vollkommenen Repression der Translation, während die proximale Insertion des Motivs an das 5’-Ende der 5’-UTR keinen Einfluss auf die Translationsseffizienz hatte. Zusammenfassend kann sowohl der eukaryotische Scanning-Mechanismus als auch die bakterielle Initiation der Translation über die SD-Sequenz für haloarchaeale Transkripte mit 5’-UTR ohne SD-Sequenz ausgeschlossen werden. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen bilden die Grundlage für weitere Untersuchungen zur Identifizierung eines entsprechenden dritten Mechanismus zur Initiation der Translation in H. volcanii. Eine aktuelle Studie zur globalen Analyse der Translationsregulation zeigte, dass der Anteil translational regulierter Gene in H. volcanii genauso hoch ist wie bei Eukaryoten (Lange et al., 2007). Um die Rolle haloarchaealer UTRs bei der Regulation der Translation zu charakterisieren, wurden die UTRs zweier ausgewählter translationsregulierter Gene untersucht. Es stellte sich heraus, dass nur die Anwesenheit beider UTRs, 5’- und 3’-UTR, zu einer Wachstumsphasen-abhängigen Regulation der Translation führt. Dabei hat die 3’-UTR allein keinen Einfluss auf die Translationseffizienz, während die 5’-UTR die Translationseffizienz in beiden Wachstumsphasen reduziert. Es zeigte sich außerdem, dass die 3’-UTR für die „Richtung“ der Regulation auf Translationsebene verantwortlich ist und putative Strukturelemente möglicherweise in den Regulationsmechanismus involviert sind. Zusammengefasst ergibt sich folgendes Modell der Translationsregulation in H. volcanii: Strukturierte 5’-UTRs führen zu einer Herabsetzung der konstitutiven Translationseffizienz. Dies kann differentiell durch regulatorische Faktoren kompensiert werden, welche spezifische Elemente der 3’-UTR binden. Sowohl natürliche als auch artifizielle Aptamere und allosterische Ribozyme stellen effektive Werkzeuge zur exogen kontrollierten Genexpression dar. Daher wurde die Anwendbarkeit eines Tetracyclin-induzierbaren Aptamers und eines konstitutiven Hammerhead-Ribozyms in H. volcanii untersucht. Es stellte sich allerdings heraus, dass das Aptamer bereits ohne Tetracyclin starke inhibitorische Sekundärstrukturen ausbildet. Als Alternative wurden Reportergenfusionen mit einem selbstspaltenden Hammerhead-Ribozym konstruiert. Die selbstspaltende Aktivität des Hammerhead-Ribozyms in H. volcanii konnte erfolgreich in vivo demonstriert werden, was die Grundlage zur Entwicklung konditionaler Expressionssysteme basierend auf dem Hammerhead-Ribozym in H. volcanii bildet.
In a combined NMR/MD study, the temperature-dependent changes in the conformation of two members of the RNA YNMG-tetraloop motif (cUUCGg and uCACGg) have been investigated at temperatures of 298, 317 and 325 K. The two members have considerable different thermal stability and biological functions. In order to address these differences, the combined NMR/MD study was performed. The large temperature range represents a challenge for both, NMR relaxation analysis (consistent choice of effective bond length and CSA parameter) and all-atom MD simulation with explicit solvent (necessity to rescale the temperature). A convincing agreement of experiment and theory is found. Employing a principle component analysis of the MD trajectories, the conformational distribution of both hairpins at various temperatures is investigated. The ground state conformation and dynamics of the two tetraloops are indeed found to be very similar. Furthermore, both systems are initially destabilized by a loss of the stacking interactions between the first and the third nucleobase in the loop region. While the global fold is still preserved, this initiation of unfolding is already observed at 317 K for the uCACGg hairpin but at a significantly higher temperature for the cUUCGg hairpin.
Chloroplast function depends on the translocation of cytosolically synthesized precursor proteins into the organelle. The recognition and transfer of most precursor proteins across the outer membrane depend on a membrane inserted complex. Two receptor components of this complex, Toc34 and Toc159, are GTPases, which can be phosphorylated by kinases present in the hosting membrane. However, the physiological function of phosphorylation is not yet understood in detail. It is demonstrated that both receptors are phosphorylated within their G-domains. In vitro, the phosphorylation of Toc34 disrupts both homo- and heterodimerization of the G-domains as determined using a phospho-mimicking mutant. In endogenous membranes this mutation or phosphorylation of the wild-type receptor disturbs the association of Toc34, but not of Toc159 with the translocation pore. Therefore, phosphorylation serves as an inhibitor for the association of Toc34 with other components of the complex and phosphorylation can now be discussed as a mechanism to exchange different isoforms of Toc34 within this ensemble.
Arabidopsis cell walls contain large amounts of pectins and hemicelluloses, which are predominantly synthesized via the common precursor UDP-glucuronic acid. The major enzyme for the formation of this nucleotide-sugar is UDP-glucose dehydrogenase, catalysing the irreversible oxidation of UDP-glucose into UDP-glucuronic acid. Four functional gene family members and one pseudogene are present in the Arabidopsis genome, and they show distinct tissue-specific expression patterns during plant development. The analyses of reporter gene lines indicate gene expression of UDP-glucose dehydrogenases in growing tissues. The biochemical characterization of the different isoforms shows equal affinities for the cofactor NAD+ (~40 µM) but variable affinities for the substrate UDP-glucose (120–335 µM) and different catalytic constants, suggesting a regulatory role for the different isoforms in carbon partitioning between cell wall formation and sucrose synthesis as the second major UDP-glucose-consuming pathway. UDP-glucose dehydrogenase is feedback inhibited by UDP-xylose. The relatively (compared with a soybean UDP-glucose dehydrogenase) low affinity of the enzymes for the substrate UDP-glucose is paralleled by the weak inhibition of the enzymes by UDP-xylose. The four Arabidopsis UDP-glucose dehydrogenase isoforms oxidize only UDP-glucose as a substrate. Nucleotide-sugars, which are converted by similar enzymes in bacteria, are not accepted as substrates for the Arabidopsis enzymes.
Ribosome biogenesis in eukaryotes requires the participation of a large number of ribosome assembly factors. The highly conserved eukaryotic nucleolar protein Nep1 has an essential but unknown function in 18S rRNA processing and ribosome biogenesis. In Saccharomyces cerevisiae the malfunction of a temperature-sensitive Nep1 protein (nep1-1ts) was suppressed by the addition of S-adenosylmethionine (SAM). This suggests the participation of Nep1 in a methyltransferase reaction during ribosome biogenesis. In addition, yeast Nep1 binds to a 6-nt RNA-binding motif also found in 18S rRNA and facilitates the incorporation of ribosomal protein Rps19 during the formation of pre-ribosomes. Here, we present the X-ray structure of the Nep1 homolog from the archaebacterium Methanocaldococcus jannaschii in its free form (2.2 Å resolution) and bound to the S-adenosylmethionine analog S-adenosylhomocysteine (SAH, 2.15 Å resolution) and the antibiotic and general methyltransferase inhibitor sinefungin (2.25 Å resolution). The structure reveals a fold which is very similar to the conserved core fold of the SPOUT-class methyltransferases but contains a novel extension of this common core fold. SAH and sinefungin bind to Nep1 at a preformed binding site that is topologically equivalent to the cofactor-binding site in other SPOUT-class methyltransferases. Therefore, our structures together with previous genetic data suggest that Nep1 is a genuine rRNA methyltransferase.
We performed a bioinformatical analysis of protein export elements (PEXEL) in the putative proteome of the malaria parasite Plasmodium falciparum. A protein family-specific conservation of physicochemical residue profiles was found for PEXEL-flanking sequence regions. We demonstrate that the family members can be clustered based on the flanking regions only and display characteristic hydrophobicity patterns. This raises the possibility that the flanking regions may contain additional information for a family-specific role of PEXEL. We further show that signal peptide cleavage results in a positional alignment of PEXEL from both proteins with, and without, a signal peptide.
mRNA-Abbau ist ein essentieller Prozess der Genexpression, der den Zellen ermöglicht, die Qualität und die Quantität der mRNA zu kontrollieren. Besonders unter Stressbedingungen könnte der mRNA-Abbau eine bedeutende Rolle neben der Speicherung von mRNAs sowie der Regulation der Proteinhomöostase zum Schutz vor schädigenden Einflüssen spielen. Studien mit Hefen und Säugerzellen zeigten, dass dem 5'-3'mRNA-Abbau ein wichtige Rolle sowohl unter normalen Bedingungen als auch unter Stressbedingungen zukommt und dieser in zytoplasmatischen Processing bodies (P-bodies) stattfindet. Im Rahmen dieser Arbeit sollten Erkenntnisse über den 5'-3'mRNA-Abbau erhalten werden. Im Vordergrund stand die Frage nach der Existenz von P-bodies in Arabidopsis thaliana und die Identifikation und Charakterisierung deren Komponenten. Weiterhin sollten Erkenntnisse über die Rolle der P-bodies unter Stressbedingungen gewonnen werden. Dabei sollten besonders Informationen über die Beziehungen zwischen den P-bodies und RNA Stressgranula (mRNA Speicherkompartimente) und Hitzestressgranula (Regulation der Proteinhomöostase) erhalten werden. Das komplette sequenzierte Genom von Arabidopsis thaliana eignete sich zur Identifikation von mRNA-Abbauproteine kodierender Gene. Unter Verwendung von Aminosäuresequenzen bereits bekannter mRNA-Abbauproteine aus Hefe und Säugerzellen konnten Homologe für die Decappingproteine Dcp1 und Dcp2 sowie für die Proteine LSm1,2,5,8 als Untereinheiten des LSm1-7 Komplexes, welcher an der Regulation der Decappingreaktion beteiligt ist, identifiziert werden. Über Hefe-Zwei-Hybrid Analysen konnten anschließend Protein-Protein-Interaktionen zwischen den untersuchten Proteinen identifiziert werden. Weiterhin konnte unter Einsatz der BIFC-Analyse gezeigt werden, dass die Interaktionen zwischen den untersuchten Proteinen hauptsächlich in zytoplasmatischen Strukturen stattfanden. Aufbauend auf diesen Befunden wurde ein Antikörper gegen Dcp1 als Marker für die zytoplasmatischen Strukturen erstellt. Dieser ermöglichte erstmals die Detektion der endogenen Strukturen in Arabidopsis thaliana. Die weitere Charakterisierung über Immunofluoreszenzanalysen zeigten, dass diese P-bodies sind. Wie die P-bodies anderer Organismen sind sie hochdynamisch und benötigen untranslatierte mRNA für die Assemblierung. Die Größe und Anzahl der P-bodies hängt dabei vom Verhältniss des Zuflusses von mRNA und der mRNA-Abbaurate ab. Weiterhin konnte beobachtet werden, das die P-bodies besonders groß unter Stressbedingungen sind und deuten eine wichtige Funktion des mRNA-Abbaus unter Stress an. Dies führte zu der Frage nach der Beziehung der P-bodies zu RNA Stressgranula, die der Speicherung von mRNA unter Stressbedingungen dienen, sowie zu Hitzestressgranula, die an der Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase beteiligt sind. Durch Kolokalisationsanalysen mit Markern der RNA Stressgranula, der Hitzestressgranula und der P-bodies konnte erstmals gezeigt werden, dass es sich um voneinander unabhängige Mikrokompartimente handelt, und dass unter Stressbedingungen die zellulären Prozesse mRNA-Abbau, mRNA-Speicherung und Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase auf einzelne Mikrkompartimente beschränkt sind. Allerdings konnte zwischen P-bodies und RNA Stressgranula häufig eine räumliche Nähe beobachtet werden. Dies deutet auf einen Austausch von Komponenten zwischen diesen Strukturen hin. Zusammen zeigen die erhaltenen Ergebnisse, dass die identifizierten Proteine Komponenten des 5'-3'mRNA-Abbaus darstellen, und dass der 5'-3'mRNA-Abbau in Pflanzen auch in P-bodies stattfindet. Die Identifizierung und Charakterisierung der pflanzlichen P-bodies bildet eine Grundlage für zukünftige Untersuchungen. Vor allem die massive Bildung von P-bodies unter Stressbedingungen und die Interaktion der P-bodies mit RNA Stressgranula zeigen neue Aspekte der pflanzlichen Hitzestressantwort auf.
Weiterentwicklung und Evaluation eines drei-dimensionalen Hautmodelles zur pharmakologischen Testung
(2008)
The moderate halophile Halobacillus halophilus is the paradigm for chloride dependent growth in prokaryotes. Recent experiments shed light on the molecular basis of the chloride dependence that is reviewed here. In the presence of moderate salinities Halobacillus halophilus mainly accumulates glutamine and glutamate to adjust turgor. The transcription of glnA2 (encoding a glutamine synthetase) as well as the glutamine synthetase activity were identified as chloride dependent steps. Halobacillus halophilus switches its osmolyte strategy and produces proline as the main compatible solute at high salinities. Furthermore, Halobacillus halophilus also shifts its osmolyte strategy at the transition from the exponential to the stationary phase where proline is exchanged by ectoine. Glutamate was found as a second messenger" essential for proline production. This observation leads to a new model of sensing salinity by sensing the physico-chemical properties of different anions.
Die Grewioideae sind eine Unterfamilie der Malvaceae sensu Bayer et al. (1999). Sie umfassen mit 25 Gattungen und ca. 700 Arten einen Großteil der früheren Tiliaceae. Diese waren vor allem aufgrund der durchweg dithecischen Antheren und der oft zahlreichen, freien Stamina zu einer Familie zusammengefasst worden, auch wenn die enge Verwandtschaft mit den Sterculiaceae, Bombacaceae und Malvaceae bekannt war und die Abgrenzung dieser Familien untereinander oft als künstlich angesehen wurde. ... Insgesamt 45 Arten aus allen 25 Gattungen der Malvaceae-Grewioideae (sensu Bayer & Kubitzki 2003) wurden hinsichtlich ihrer Morphologie im Blüten-, Frucht- und vegetativen Bereich untersucht. Der Schwerpunkt lag dabei auf einer vergleichenden Bearbeitung der Blütenstruktur, für die neben morphologischen auch ontogenetische und anatomische Untersuchungen durchgeführt wurden. Die Ergebnisse waren Grundlage für eine Datenmatrix mit 55 Merkmalen, die ebenso wie DNA-Sequenzdaten (ndhF) für phylogenetische Analysen verwendet wurden. Die Analysen beider Datensätze ergeben eine Zweiteilung der Grewioideae. Auf der Basis der Ergebnisse wird vorgeschlagen, die Grewioideae in die zwei Triben Apeibeae und Grewieae zu unterteilen. Diese Gliederung widerspricht früheren Klassifikationen, ist aber durch strukturelle Merkmale gut gestützt. Die Apeibeae zeichnen sich durch hornförmige Verlängerungen der Sepalen-Spitze und stachelige Emergenzen auf der Fruchtoberfläche aus, Reduktionsformen sind durch Übergänge nachweisbar (Ausnahme: Glyphaea). Leitbündelstränge innerhalb der Fruchtwand verlaufen einzeln. Bestäubungsbiologisch relevante Nektarien, soweit vorhanden, befinden sich vor den Petalen auf einem Androgynophor. Das Androeceum entwickelt sich zentrifugal in einer unterschiedlichen Zahl einheitlicher Kreise. Den Grewieae fehlen Fortsätze der Sepalen-Spitzen sowie stachelige Emergenzen der Früchte. Sie sind durch Nektarien auf den Petalen charakterisiert (Ausnahme: Mollia). Ihre Fruchtwand weist einen geschlossenen Leitbündelmantel auf. Steinkerne oder dorsal geflügelte Fruchtfächer kommen vor. Das Androeceum entwickelt sich oft ungleichmäßig mit einer Förderung des antesepalen Sektors, bisweilen ausgehend von Komplexprimordien. Innerhalb der Triben lassen sich teils neue, teils früher schon bekannte Gruppen erkennen; andere sind anhand der vorliegenden Daten nicht aufzulösen. Dies gilt insbesondere für die Verwandtschaft von Grewia, bei der die Gattungsgrenzen einer kritischen Revision bedürfen. Die Kartierung der morphologischen Merkmale auf den Konsensusbaum der DNA-Sequenzdaten ergab, dass insbesondere der Androgynophor innerhalb der Grewioideae mehrfach parallel entstanden ist und im Gegensatz zu früheren Klassifikationen nicht als Tribus-Merkmal herangezogen werden kann. Auf der Suche nach einem gemeinsamen Bauplan, der den stark unterschiedlichen Blütenstrukturen der Schwestergruppen Grewioideae und Byttnerioideae zugrunde liegen könnte, wurde insbesondere das Androeceum vergleichend untersucht. Bei beiden Unterfamilien findet man polystemone Androeceen, die bei den Byttnerioideae in staminodiale antesepale und fertile antepetale Sektoren differenziert sind. Dies wird in der Literatur oft als obdiplostemones Arrangement zweier Kreise interpretiert, von denen der fertile antepetale Teil dédoubliert. Bei den Grewioideae findet man keine derartige Differenzierung; sie sind in ihrer androecealen Struktur außerordentlich variabel. Die Befunde der Morphologie, Ontogenie und Anatomie widersprechen sich dabei jeweils dergestalt, dass eine theoretische Gliederung des polystemonen Androeceums in zwei Kreise kaum zu rechtfertigen ist. In diesem Zusammenhang wird die in der Literatur verbreitete Vorstellung einer sekundären Polyandrie kritisch beleuchtet. Für die untersuchte Gruppe wird ein Zusammenhang zwischen Bestäubungsbiologie und Blütenstruktur als nahe liegender angesehen, der zu unterschiedlichen Gruppenbildungen innerhalb polystemoner Androeceen führen kann. Während Petalen und Stamina bei den oft fliegenblütigen Byttnerioideae eine spezielle Funktionseinheit bilden, findet man bei den größtenteils bienenblütigen Grewioideae in Zusammenhang mit den Petalen oft Nektar. Die fertilen Stamina können den gesamten antesepalen und antepetalen Raum einnehmen. So stand an der Basis der Grewioideae möglicherweise der Wechsel der Bestäubergruppe und die Auflösung eines blütenbiologisch fixierten Musters, ein Vorgang, wie er innerhalb der Malvaceae mehrfach auf unterschiedliche Weise erfolgt sein könnte. Auch andere Gruppen weisen Blütenstrukturen mit vorwiegend freien Stamina und verborgenem Nektar in Zusammenhang mit Bienenbestäubung auf. Es mag diese blütenbiologisch bedingte Ähnlichkeit gewesen sein, die zur Vereinigung nicht näher verwandter Gruppen zur früheren Familie Tiliaceae geführt hat.
Im Vergleich zu der Vielzahl von Einzeluntersuchungen liegen nur für wenige Insektenarten (z.B. Manduca sexta: SHIELDS & HILDEBRANDT 1999 a, b; Drosophila: SHANBHAG et al. 1999, 2000) detaillierte Befunde zur Feinstruktur, Zahl und Topographie antennaler Sensillen vor. Die jetzt an Liris niger gewonnenen Daten bilden, zusammen mit solchen früherer Untersuchungen (GNATZY 1996, 2001; ANTON & GNATZY 1998; GNATZY & FERBER 1999) die Basis für derzeit laufende immuncytochemische und elektrophysiologische Arbeiten insbesondere am olfaktorischen System dieser solitären Grabwespenart. Dabei gilt unser Interesse dem ausgeprägten Sexualdimorphismus im antennalen Sensilleninventar, wie er im Verlauf dieser Untersuchungen nachgewiesen werden konnte.
Anti-T-Lymphozyten-Globuline (ATG) sind Immunglobuline zur Anwendung am Menschen. Sie werden aus den Seren von Kaninchen oder Pferden gewonnen, die zuvor mit humanen Thymozyten oder einer etablierten humanen T-Zell-Linie immunisiert wurden. ATG besitzen ein sehr starkes immunsuppressives Potenzial. In der klinischen Anwendung werden sie überwiegend bei Organtransplantationen, Knochenmarktransplantationen und zur Behandlung einzelner Autoimmunerkrankungen, wie z. B. der aplastischen Anämie, eingesetzt. Wissenschaftliches Ziel der Arbeit war, einen umfangreichen Beitrag zur immunologischen Charakterisierung und Spezifizierung unterschiedlicher ATG-Präparate zu erbringen. Dies ist eine wesentliche Voraussetzung für die Entwicklung und Validierung experimenteller Methoden, sodass die bisher verwendeten Praktiken der Wirksamkeitsprüfung von ATG entsprechend dem Stand der Wissenschaft abgelöst und der Tierversuch (Affenhaut-Transplantationstest; Balner H et al., 1968) ersetzt werden können. Darüber hinaus wurde in diesem Zusammenhang der Entwurf einer Arzneibuch-Monografie für ATG vorgelegt. Der immunsuppressive Wirkmechanismus von ATG ist selbst nach 40 Jahren klinischer Erfahrung nicht eindeutig geklärt. Ihre Wirksamkeit vermitteln sie über ihre spezifische Bindung an Lymphozyten, woraus sich modellhaft vier Effekte unterscheiden lassen: Die Reihe der Fc-abhängigen zytotoxischen Mechanismen, eine von ATG ausgelöste Aktivierung, eine über Todesrezeptoren (z.B. Fas/Apo-1) von ATG direkt induzierte Apoptose sowie die Maskierung von Rezeptoren. Die zytotoxische Wirkung von ATG und die Induktion des programmierten Zelltodes (Apoptose) wurde am Durchflusszytometer (FACS) nach Färbung der toten Zellen bzw. durch den Nachweis von DNA-Fragmentierung analysiert. Der Einfluss von ATG auf die Lymphozyten-Aktivierung in vitro sowie auf die gemischte Lymphozyten-Reaktion (mixed lymphocyte reaction, MLR) wurde durch Messung der Lymphozyten-Proliferation anhand des Einbaus von radioaktiv markiertem Thymidin bestimmt. Biochemisch wurden die in ATG enthaltenen anti-Lymphozyten-Antikörper durch den sog. Kinase-Assay charakterisiert. In einer nicht radioaktiven Methode wurden Zelloberflächenmoleküle zunächst biotinyliert. Nach Lyse der Zellen wurden die Proteine mit ATG präzipitiert, gelelektrophoretisch aufgetrennt sowie mittels Streptavidin und Chemilumineszenz im Westernblot nachgewiesen. Für das Verständnis der klinischen Wirksamkeit von ATG ist die Aufklärung der molekularen Mechanismen der komplement-unabhängigen, zytotoxischen Wirkung von erheblicher Bedeutung, da die enorme zytolytische, aber auch die breite immunsuppressive Wirkung von ATG nicht allein durch die Fc-abhängige Zytotoxizität erklärt werden kann. ATG können bei bestimmten Zielzellen Fas-abhängige Apoptose auslösen; darüber hinaus sind ATG aber auch in der Lage, einen komplement-unabhängigen Zelltod in Fas-resistenten Zell-Linien und T-Zell-Klonen, die resistent gegenüber aktivierungsinduziertem Zelltod (AICD) sind, auszulösen. In Kompetitionsversuchen konnte gezeigt werden, dass ATG entsprechende Antikörper-Spezifitäten gegen das Molekül CD95 (Fas/Apo-1) enthalten. Ferner konnten wir nachweisen, dass die durch ATG initiierte Fas-abhängige Apoptose und/oder der AICD durch Fas-neutralisierende Antikörper inhibiert werden können, was auch von anderen Arbeitsgruppen gezeigt wurde (Genestier L et al., 1998). Die DNA-Fragmentierung, als Nachweis von Apoptose, lässt sich nach der ATG-Inkubation von Fas-sensitiven Zielzellen durch Inhibitoren der Caspase-1 (Z-VAD-FMK) komplett sowie durch Inhibitoren der Caspase-3 (Ac-DMQD-CHO) und -6 (Ac-VEID-CHO) teilweise inhibieren. Die zytotoxische Wirkung von ATG lässt sich jedoch nicht in gleichem Maße durch Inhibitoren der Caspase-1 reduzieren, wie bei einem Apoptose induzierenden mAk gegen Fas. Es wird deutlich, dass ATG eine breit gefächerte zytotoxische Wirkung auf verschiedene Zellpopulationen ausüben, die alle mehr oder weniger eine Rolle in der klinischen Wirksamkeit von ATG spielen können. ATG sind in der Lage, periphere blutmononukleäre Zellen (PBMC) zu aktivieren, wobei der Proliferationsindex in etwa dem eines Standardmitogens, wie z. B. Phytohämagglutinin (PHA), entspricht. Isolierte T-Lymphozyten werden ebenfalls aktiviert, zeigen jedoch eine geringere Proliferationsrate. In PHA-Blasten lassen sich schwache Veränderungen im Muster der Protein-Tyrosin-Phosphorylierung erkennen, wobei eine gewisse Ähnlichkeit im Bandenmuster sowie in der Intensität zwischen der Stimulation mit ATG und dem anti-CD2 mAk zu erkennen ist. Im Unterschied zu publizierten Studien konnte in dieser Arbeit kein spezifisch hemmender Effekt der ATG auf die MLR nachgewiesen werden. Aus den Untersuchungen zur Charakterisierung der ATG hat sich der komplement-abhängige Zytotoxizitätstest, gemessen am Durchflusszytometer, als die Methode herausgestellt, die, bezogen auf den Wirkmechanismus der ATG und im Hinblick auf eine Routineanwendung in der Chargenprüfung, am besten geeignet ist. Eine Evaluierung der Methode wurde im Rahmen eines Ringversuches, an dem sich sieben verschiedene Labore beteiligten, durchgeführt. Die mittlerweile gültige Arzneibuch-Monografie für ATG (Ph. Eur.: 1928) sieht diese in vitro Methode zur Wirksamkeitsprüfung von ATG vor, womit die Voraussetzungen zur Abschaffung des Affenhaut-Transplantationstests geschaffen wurden. Neben einer zellulären Charakterisierung der ATG konnte gezeigt werden, dass sich insbesondere biochemische Methoden, wie z. B. der Kinase-assay oder die Biotinylierung von Zelloberflächenmolekülen, sehr gut zur Identitätsprüfung von ATG eignen. Mit beiden Methoden ließen sich produktspezifische Bande nachweisen. Im Rahmen der Entwicklung von ATG sind diese Methoden geeignet, die Konsistenz der Chargenproduktion zu überprüfen, sodass auch hier Alternativen zum Tierversuch vorhanden sind.
Identifizierung und Charakterisierung von Liganden für Faktor VIII neutralisierende Antikörper
(2008)
Das Fehlen von funktionellem Blutgerinnungsfaktor VIII (FVIII) in Hämophilie A- (HA-) Patienten wird durch Substitution mit FVIII-Präparaten therapiert. Die wesentlichste gegenwärtige Komplikation der FVIII-Ersatz-Therapie besteht in dem Auftreten von FVIII neutralisierenden Antikörpern (Inhibitoren) gegenüber exogenem FVIII. Diese können mittels verschiedener, kostenintensiver Therapien zur Induktion einer Immuntoleranz (ITI) mit unterschiedlichem Erfolg eliminiert werden. Für Patienten mit persistierenden Inhibitoren bedeuten diese nicht nur eine drastische Verminderung der Lebensqualität sondern ein lebensbedrohliches Szenario. Eine Liganden-vermittelte Blockierung von neutralisierenden anti-FVIII Antikörpern sowie die zielgerichtete Ansteuerung des Rezeptors FVIII-spezifischer Gedächtnis-B-Zellen stellen mögliche Ansätze zur Verwirklichung antigenspezifischer ITI-Strategien für eine dauerhafte, vollständige Eliminierung von FVIII-Inhibitoren dar. Zu diesem Zweck wurden in dieser Arbeit durch Screening von phagenpräsentierten, randomisierten Peptidbibliotheken mit Inhibitor-positiven Patientenplasmen Peptidliganden selektioniert. Diese wiesen eine spezifische Bindung von anti-FVIII Antikörpern in den verwendten Plasmen auf. Durch den Einsatz entsprechender Software konnten AS-Konsensusmotive der Peptidsequenzen möglichen, konformationellen, funktionellen Inhibitorepitopen in der A2- sowie C2-Domäne von FVIII zugeordnet werden. Die von in silico-Analysen vorgegebene Domänenspezifität der anti-FVIII Antikörper wurde in Bindungsstudien mit rekombinant exprimierten FVIII-Domänen verfiziert. Die korrespondierenden, synthetischen Peptidliganden blockierten die IgG-Bindung an FVIII und regenerierten partiell dessen Aktivität im Plasma. Die Peptide stellten funktionelle Mimotope der möglichen Inhibitorepitope in der A2- und C2-Domäne dar. Da FVIII neutralisierende Antikörper zumeist Epitope in beiden Domänen erkennen, wurden die Mimotope kombiniert, was in einer noch effektiveren Blockierung von FVIII-Inhibitoren resultierte. Weiterhin wiesen Mimotopkombinationen Kreuzreaktivität mit anti-FVIII IgG in heterologen Patientenplasmen auf. Durch Fusion der Peptide an die Multimerisierungsdomäne der alpha-Kette des humanen C4-Bindeproteins konnten in Zellkultur heptamere Proteine generiert werden. Gegenüber den synthetischen Peptiden wiesen die Multimere aufgrund ihrer Multivalenz sowie der strukturellen Integrität eine deutlich verbesserte Blockierung von anti-FVIII IgG auf. Das Multimerisierungskonzept erlaubte ferner die Kombination unterschiedlicher Peptidliganden in einem Heteromultimer, was anhand der selektierten, funktionellen Mimotope für mögliche A2- und C2-Epitope getestet wurde. Weiterhin zeichneten sich die Inhibitor-spezifischen Multimere gegenüber den synthetischen Peptiden durch deutlich verlängerte Halbwerstzeiten aus. In Präparationen peripherer mononuklearer Zellen (PBMCs) von Patienten färbten synthetische Peptide sowie Fluoreszenz-markierter FVIII B-Zellsubpopulationen mit einem Gedächntis-B-Zell Phänotyp (CD19+IgG+). Gedächtnis-B-Zellen in PBMCs wurden polyklonal stimuliert. Im ELISPOT-Verfahren konnten Tetanusspezifische, jedoch keine FVIII-spezifischen Zellen, detektiert werden. Im Gegensatz zu den verwandten Kontrollen bewirkte eine Präinkubation der Zellen mit dem Peptid 12C6, welches an das toxische D-AS-Peptid (KLAKLAK)2 gekoppelt war, allerdings eine Reduktion von anti-FVIII IgG in den Überständen stimulierter Zellen.