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Mit Hilfe des Modellorganismus S. cerevisiae konnten alle bisher unbekannten Gene der Gluconeogenese und des Glyoxylat-Zyklus des opportunistisch humanpathogenen Pilzes C. albicans isoliert werden. Erste Hinweise führten zu der Annahme, dass diese Stoffwechselwege möglicherweise essentiell für das vegetative Wachstum sind, so dass sie gute Wirkorte für neu zu entwickelnde Antimycotica darstellen könnten. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass diese Stoffwechselwege ungeeignete Wirkorte für Antimycotica sind, da sie weder essentiell für das vegetative Wachstum sind noch von ihnen Virulenzfaktoren von C. albicans beeinflusst werden (z.B. Hyphenentwicklung). Die Regulation der Gluconeogenese und des Glyoxylat-Zyklus in S. cerevisiae ist gut untersucht und alle Ergebnisse mit C. albicans zeigen, dass die Regulation dieser Stoffwechselwege zwischen diesen beiden Hefen sehr konserviert ist. Es wurde eine Methode für die Identifizierung von essentiellen Genen durch funktionelle Komplementation in S. cerevisiae entwickelt. Diese sogenannte Split-Marker-Selektion basiert auf einer Cre/loxP-vermittelten induzierten Deletion eines essentiellen Gens von S. cerevisiae und der Komplementation des resultierenden letalen Phänotyps durch ein heterolog exprimiertes Gen in einer DNS Genbank. Die Methode ist auch für die Funktionsanalyse von essentiellen Genen in S. cerevisiae geeignet (z.B. Identifizierung von Suppressoren, Analyse finaler Phänotypen). Mit Hilfe der Split-Marker-Selektion wurde das putativ essentielle Gen NEP1 ("nuclear essential protein") von C. albicans identifiziert. Die Funktionsanalyse des homologen Gens in S. cerevisiae ergab, dass das Gen für ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein kodiert, das in allen Eukaryonten existiert. Es erwies sich, dass das menschliche Homolog in S. cerevisiae funktionell ist und den letalen Phänotyp einer NEP1 Deletion in S. cerevisiae überwindet. Es zeigte sich weiterhin, dass das menschliche Homolog in S. cerevisiae nicht an Mikrotubuli assoziiert ist. Dies deutet darauf hin, dass die Mikrotubuli-Assoziation nicht für die essentielle Funktion von Nep1p nötig ist. Das bisher uncharakterisierte Protein Ydl148p wurde als Interaktionspartner von Nep1p gefunden. Desweitern konnte SAM2 als Multicopy-Suppressor des konditional letalen Phänotyps (Temperatursensitivität) eines NEP1 Mutantenallels (nep1-ts1) identifiziert werden. Die Suppression wurde hierbei über die erhöhte Konzentration an S-Adenosylmethionin vermittelt. Dieser Cofaktor ist an Methylierungsreaktionen beteiligt, so besteht die Möglichkeit, dass Nep1p eine Methyltransferase ist oder an Methylierungsreaktionen beteiligt ist.
Die Aggregation von Thrombocyten ist ein wichtiger physiologischer Schutzmechanismus zur primären Blutstillung nach Gefäßverletzungen. Dieser Vorgang kann jedoch unter pathologischen Bedingungen zu Herzinfarkten und Schlaganfällen führen. Der Aggregationsprozeß ist durch Ausbildung sogenannter "Fibrinogenbrücken" zwischen verschiedenen Thrombocyten gekennzeichnet. Dies wird durch Bindung von Fibrinogen an das aktivierte Integrin alphaIIbbeta3 auf der Thrombocytenoberfläche ausgelöst. Das kleine G-Protein Rap1B aus der Ras-Superfamilie reguliert den Aktivitätszustand von Integrinen und besitzt damit eine zentrale Rolle bei der Aggregation von Thrombocyten. Die Aktivierung von Rap1B wird durch eine Vielzahl von Plättchenagonisten innerhalb von wenigen Sekunden ausgelöst. Der von Thrombocyten und Gefäßendothelzellen gebildete Botenstoff Stickstoffmonoxid (NO) kann die Thrombocytenaggregation über den NO/cGMP-Signalweg hemmen. Das Signalmolekül NO aktiviert in Thrombocyten die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (sGC), hierdurch wird die Synthese des sekundären Botenstoffes cGMP angeregt. Das cGMP-Molekül aktiviert nachfolgend die cGMP-abhängige Proteinkinase-Ibeta (cGK-Ibeta), welche die aggregationshemmende NO-Wirkung vermittelt. Die verantwortlichen Zielproteine der cGK-Ibeta wurden bis heute jedoch nicht hinreichend aufgeklärt. In der vorliegenden Arbeit sollten verschiedene Aspekte der NO-induzierten Hemmung der Thrombocytenaggregation untersucht werden. Dabei wurden neue Mechanismen dieser Inhibition identifiziert. Zum einen konnte eine kinetisch schnelle Hemmung der Rap1B-Aktivierung in Thrombocyten nachgewiesen werden. Zum anderen konnten einer cGK-Ibeta-vermittelten, kinetisch langsamen Rap1B-Phosphorylierung hemmende Effekte auf die Membranlokalisation von Rap1B in MDCK-Zellen und auf die Zellausbreitung von Hela-Zellen zugeordnet werden. Weiterhin wurde im Rahmen dieser Arbeit eine neue Proteininteraktion zwischen dem mitochondrialen CGI-51-Protein und Rap1B identifiziert und verifiziert. Zur Aufklärung eines Einflusses des NO/cGMP-Signalweges auf die Aktivierung von Rap1B in Thrombocyten wurde die NO/sGC/cGMP/cGK-Ibeta-Signalkaskade auf verschiedenen Stufen aktiviert oder gehemmt, bevor anschließend die Rap1GTPBildung mit verschiedenen Plättchenagonisten induziert wurde. Das aktive Rap1B wurde unter Verwendung eines Rap1GTP-bindenden Fusionsproteins präzipitiert und nachgewiesen. Durch NO-freisetzende Substanzen konnte eine Hemmung der Rap1BAktivierung erreicht werden. Auch die Aktivierung der sGC mit einem spezifischen Aktivator führte zur Inhibition von Rap1B. Die direkte Aktivierung der cGK-Ibeta konnte Rap1B ebenfalls hemmen, während eine Blockade der cGK-Ibeta die NO-induzierte Hemmung der Rap1-Aktivierung verhinderte. Die genannten Effekte des NO/cGMP-Signalwegs waren unabhängig vom Stimulus, der zur Rap1B-Aktivierung genutzt wurde, sowohl die Aktivierung über verschiedene G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) als auch die Aktivierung über Tyrosin-Kinasen wurden gehemmt. Eine detailliertere Untersuchung ergab, daß cGK-Ibeta die Ca2+-unabhängige Aktivierung von Rap1B hemmen konnte. Die Rolle der cGK-Ibeta wurde abschließend im unabhängigen Zellsystem der Megakaryocyten abgesichert. Die Hemmung der Rap1B-Aktivierung durch den NO/cGMP-Signalweg stellt einen schnellen Regulationsmechanismus zur Inhibition der Thrombocytenaggregation dar. Aus der Literatur ist eine kinetisch langsame Phosphorylierung von Rap1B an Serin-179 durch cGK-Ibeta bekannt. Zur Ermittlung ihrer Funktion wurden mikroskopische Untersuchungen der subzellulären Rap1B-Lokalisation in lebenden MDCK-Zellen durchgeführt. Hierbei konnte gezeigt werden, daß eine nicht-phosphorylierbare Rap1BMutante eine ausgeprägte Membranlokalisation aufweist, während eine phosphomimetische Rap1B-Mutante bevorzugt cytoplasmatisch lokalisiert ist. In einer weiterführenden Studie wurde der Effekt dieser Rap1B-Mutanten auf das Zellausbreitungsverhalten von Hela-Zellen analysiert. Die Expression der nichtphosphorylierbaren Rap1B-Mutante führte dabei zu einer signifikant gesteigerten Zellausbreitung, welche hingegen durch eine phosphomimetische Rap1B-Mutante deutlich abgeschwächt war. Dies impliziert einen zusätzlichen Mechanismus, über den der NO/cGMP-Signalweg die Adhäsion bzw. die Aggregation von Thrombocyten regulieren kann. Zur Identifizierung von neuen Interaktionspartnern, die spezifisch an phosphoryliertes Rap1B binden und dessen subzelluläre Verteilung oder Aktivität regulieren, wurde das Yeast-Two-Hybrid-System eingesetzt. Hierbei konnte das mitochondriale CGI-51-Protein als neuer Bindepartner von Rap1B identifiziert und in Säugerzellen verifiziert werden. Eine phosphospezifische Interaktion konnte allerdings nicht nachgewiesen werden. Das CGI-51-Protein spielt eine wichtige Rolle bei der Proteinsortierung in der äußeren Mitochondrienmembran. Die Funktion der Interaktion von CGI-51-Protein mit Rap1B wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht. Zusammenfassend kann gesagt werden, daß in der vorliegenden Arbeit erstmalig neue Erkenntnisse zur Regulation des kleinen G-Proteins Rap1B durch den NO/cGMP-Signalweg dargestellt sind. Dieser Regelmechanismus besitzt eine physioplogische Bedeutung bei der Inhibition der Thrombocytenaggregation.
Erfolgreich wurde die biochemische Synthese eines Kernbereiches der spleißosomalen U4/U6-RNA etabliert und die Sekundärstruktur mittels NMR-spektroskopischer Methoden charakterisiert. Die Konformationen von zwei molekularen Regeleinheiten, des auf Gramicidin A basierenden Ionenkanals Minigramicidin sowie einem aus zwei cis-Dekalinen aufgebautenmolekularen Schalters konnten in unterschiedlichen Umgebungen mit Hilfe der NMR-Spektroskopie erfolgreich bestimmt werden. Die Synthese des RNA-Konstruktes u4u6a46phh2 erfolgte durch Transkription von plasmidischer Templat-DNA mit T7-Polymerase und anschließender Aufreinigung mittels Gelelektrophorese und Homogenisierung am 3’-Ende mit Hilfe eines passenden Hammerhead-Ribozyms. u4u6a46phh2-RNA kann als Konstrukt für die Synthese von 13C/15N-gelabelter RNA dienen, da die Schneidreaktion und die daraus resultierende RNA definiert ist und die Integrale der Iminoprotonen für eine einzige Konformation der RNA sprechen. Das von Dr. Hans-Dieter Arndt in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Koert an der Humboldt-Universität zu Berlin hergestellte Minigramicidin ist aus zwei verkürzten Gramicidin A-Einheiten aufgebaut, die in einer Kopf-an-Kopf Anordnung durch einen Bernsteinsäure-Linker kovalent verknüpft sind. In dieser Arbeit wurden die Strukturen von Minigramicidin in zwei unterschiedlichen Umgebungen aufgeklärt: in Benzol/Aceton (10:1, v/v) ohne Zusatz von Kationen und in gesättigter Cäsiumchlorid-Chloroform/Methanol (3:1, v/v)-Lösung. Im ersten Fall findet man ein doppelt helikales linksgängiges Dimer von Minigramicidin mit ca. 5.7 Resten pro Windung. Diese Struktur hat eine Länge von ca. 38 Å und einen Durchmesser von ca. 1.2 Å. Mit Cäsium-Kationen liegt die Verbindung als Monomer vor. Sie bildet eine rechtsgängige pi-Helix mit ca. 6.3 Resten pro Windung. Die Struktur hat eine Länge von 17 Å und einen Durchmesser von ca. 4.5 Å. Es konnte erstmals eine zur ionenkanalaktiven Form des gA ähnliche Konformation eines auf gA basierenden künstlichen Ionenkanals in organischen Lösemitteln nachgewiesen werden. Der von Dr. Michael Karle aus der Arbeitsgruppe von Prof. Koert an der Philipps-Universität Marburg synthetisierte molekulare Schalter besteht aus zwei cis-Dekalineinheiten, die durch einen 14-gliedrigen Bislactam-Ring miteinander gekoppelt sind. Der Schaltprozeß wurde dabei durch die saure Spaltung des Ley-Acetals in 13 ausgelöst. Es wurde für die Verbindung 13 eine all-axial Stellung für den Makrozyklus gefunden. Diese Struktur wird auch durch die gefundenen Kopplungskonstanten gestützt. Nach dem Schaltprozeß wurde die Struktur von 16 ermittelt. Wie erwartet, wurde durch das Lösen der konformativen Klammer ein Doppelringflip im linken Dekalingerüst ausgelöst und durch den Makrozyklus auf das rechte Dekalingerüst übertragen. Die gefundenen ROE-Abstände und Kopplungskonstanten für bestimmte Dekalinprotonen bestätigen die umgeschaltete Struktur.
In der Arbeit wurden neue Komplexbildner für die nasschemische, alkalische Reinigung von Siliciumhalbleiteroberflächen vorgestellt. Dabei handelte es sich neben kommerziell verfügbaren Verbindungen, wie beispielsweise Tiron, um den Chelatbildner Pyrinan und die vielversprechende Gruppe der 3-Hydroxypyridin-4(1H)-on-Komplexbildner („Pyridinone“). Insbesondere Letztere sind als effiziente Eisenkomplexbildner von präklinischen Untersuchungen zur Therapie von Eisenstoffwechselerkrankungen bekannt und haben deshalb großes Interesse hervorgerufen. Die Darstellung von Pyrinan und der Pyridinone war in befriedigenden bis guten Ausbeuten mit herkömmlichen Syntheseschritten möglich. Die Synthese konnte somit die im Abschnitt 1.2.1 erwähnten Anforderungen an die Komplexbildner befriedigen. Hinsichtlich der an die Strukturierung von Halbleitermaterialen geknüpften, jedoch bei der Präparation der Komplexbildner nicht realisierten Reinheitsbedingungen, wiesen diese einen teilweise erheblichen Kontaminationsgrad durch Metalle auf. Demzufolge hätten die Komplexbildner als potentielle Kontaminationsquellen bei der SC1-Reinigung von Siliciumsubstraten wirken können. Letzteres konnte jedoch im Rahmen der zehnminütigen Immersionsdauer in ¼/20 SC1 bei 70 °C weitgehend ausgeschlossen werden. Der Trend bei der nasschemischen Reinigung von Halbleitersubstraten mit immer stärker verdünnten Reinigunslösungen und reduzierten Reinigungsbadtemperaturen zu arbeiten, sollten dieses und die folgend zusammengefassten Ergebnisse noch weiter begünstigen. Es wurden Reinigungsexperimente mit Siliciumsubstraten und mit den Reinigungslösungen absichtlich zugesetzten Kontaminanten durchgeführt, um die Wirkungen der einzelnen Verbindungen besser studieren zu können. Es wurden die Metalle Al, Fe, Zn, Cu, Ni und Cr, die in der Halbleiterproduktion als gängige Kontaminanten auftreten, untersucht. Die Metalle Zn, Ni und Cu spielen in der SC1-Lösung, mit abnehmender Gewichtung in der genannten Reihenfolge, aufgrund deren Amminkomplexbildung keine nennenswerten Rolle als Oberflächenkontaminanten. Cr(III) wird in der SC1-Lösung zu Chromat oxidiert und kontaminiert aus diesem Grund die Oberfläche ebenfalls nicht. Dem gegenüber sind Al und Fe unter den gewählten Bedingungen sehr starke Oberflächenkontaminanten. Prinzipiell eignen sich fast alle untersuchten Komplexbildner, die Siliciumoberfläche vor der Kontamination durch Fe aus SC1 zu schützen. Hinsichtlich ihrer Wirksamkeit gegenüber Al und Zn wurden sie jedoch deutlich diskriminiert. Daraus schlussfolgernd ist der Einsatz mehrerer Komplexbildnern erforderlich, um die Kontaminationsgefahr der Siliciumoberfläche durch alle genannten Metalle gezielt kontrollieren und über einen gewissen Schwellenwert vermeiden zu können. Die Wirkung von Pyrinan und der Pyridinone ist vergleichbar, meistens jedoch deutlich besser, als die herkömmlicher Poly(alpha-aminomethylencarbonsäuren) (z. B. EDTA, Untersuchungen von IMEC). Sie erzielen Oberflächenkonzentrationen kritischer Kontaminanten (z. B. Fe) in der Größenordnung, die für die Prozessierung aktueller und künftiger Generationen von Bauelementen erforderlich sind. Konsequenterweise sind deshalb sowohl Pyrinan als auch die Pyridinonkomplexbildner und deren Verwendungszweck zum Patent angemeldet worden. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Eignung der Komplexbildner bestimmt, hochkonzentrierte, den Halbleiterspezifikationen entsprechende Lösungen von H2O2 stabilisieren zu können. Die Stabilität wurde in Abhängigkeit von drei vorgegebenen Lagerungstemperaturen verfolgt. Sowohl die vorgestellten Verbindungen als auch die als Referenzsubstanz mituntersuchte Verbindung Dequest® 2060s konnten die an einen geeigneten Stabilisator gestellten Bedingungen nicht befriedigen. Lediglich die nicht stabilisierte Lösung von H2O2, die Referenzprobe, besaß eine, über den gesamten Beobachtungszeitraum ausreichende Stabilität. Das mangelhafte Abschneiden der vorgestellten Verbindungen als potentielle Stabilisatoren wird deren partieller bzw. vollständiger Oxidation durch H2O2 zugeordnet und ist am Beispiel von Dequest® 2060s weiter diskutiert worden. Im Zuge der Oxidation werden die intrinsischen Metallkontaminationen der Komplexbildner freigesetzt, wodurch die Kontaminanten in die Lage versetzt werden können, in das Reaktionsgeschehen katalytisch einzugreifen und die Zersetzung der Proben zu beschleunigen. Die Lagerung der Komplexbildner in konzentriertem NH3 stellt die Alternative zur Lagerung in H2O2 dar, wenn man zu einem fertig einsetzbaren, industriellen Produkt für die nasschemische Reinigung von Halbleiteroberflächen gelangen möchte, welches eine einstufige alkalische Reinigung (APM+®) ermöglicht. Hier konnten bis auf die Proben, welche Tiron als Komplexbildner enthielten, keine Besonderheiten festgestellt werden. Die mit Tiron versetzten Proben führen bereits nach sehr kurzer Lagerungsdauer zu einer intensiv rot gefärbten Lösung, die der im Alkalischen und durch Luftsauerstoff erfolgenden Oxidation von Tiron durch Luftsauerstoff zugerechnet wird. Eine, die Reinigungsexperimente ergänzende und wichtige Information, stellt die Stabilität der Komplexbildner und durch diese bedingt die der gesamten Reinigungslösung dar. Letztere wurde durch die titrimetrische Bestimmung der Konzentration von H2O2 ausgesuchter Reinigungslösungen bestimmt. Die Stabilität des Komplexbildners DEHP wurde stellvertretend für die ganze Gruppe (der einfachen Pyridinone) in verschiedenen, in der Halbleiterfertigung üblichen, alkalischen, H2O2 enthaltenden Reinigungslösungen untersucht. Die Stabilitätsbestimmungen von DEHP, ausgedrückt in Form dessen Halbwertszeit der Zersetzung in den Reinigungslösungen, wurden mit Hilfe der UV/Vis-Spektralphotometrie durchgeführt. Im Zuge der Stabilitätsbestimmungen wurde festgestellt, dass der Komplexbildner DEHP die Reinigungslösungen zwischen drei (im Fall von 1,65/1/5 TPM) bis vier (im Fall von ¼/20 SC1 und von 1,65/1/5 NC) Halbwertszeiten zu stabilisieren vermag. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass DEHP die niedrigste Halbwertszeit in Reinigungslösungen mit TMAH als Base und die höchste in solchen mit Cholin besitzt. Die in den ¼/20-SC1-Lösungen, also mit NH3 als Base, nimmt die mittlere Stellung der drei untersuchten Typen von Reinigungslösungen ein. Diese Abstufung der Stabilitäten wird einerseits dem individuellen komplexierenden Potential der einzelnen Basen als auch der von Cholin vermuteten Rolle, in der Reinigungslösung als Opferreduktionsmittel zu wirken und damit die Lebensdauer (Halbwertszeit) des Komplexbildners zu fördern, zugeordnet. Die UV/Vis-Spektralphotometrie hat sich darüber hinaus bei den Untersuchungen als einfach handhabbares und möglicherweise auch leicht automatisierbares Quantifizierungsverfahren zur Implementierung in bereits bestehende Reinigungsanlagen erwiesen.
Die Blut-Hirn-Schranke macht das Gehirn zum streng kontrollierten extraterritorialen Raum. Die sensiblen Hirnfunktionen laufen unabhängig und ungestört von den vielfältigen Prozessen der anderen Organe ab. Neben den wichtigen Funktionen dieser Barriere hält sie jedoch auch nötige Medikamente von ihrem Wirkort, dem Gehirn, fern. Die in-vitro-BHS soll Mechanismen aufklären und Tierversuche ersetzen. In den letzten Jahren konnte so das Bild von einem statischen Computer, Gehirn, durch das Bild eines hoch plastischen Arbeitsspeicher-Netzwerkes mit verschiedensten Verbindungen ersetzt werden. Die vorliegende Arbeit ist ein zwei Bereiche gegliedert: 1. Transportstudien von Nanopartikeln und Substanzen im Transwell-System 2. Aufklärung von Transportmechanismen für Nanopartikel an der BHS Die Transportuntersuchungen erfolgten in einem Zwei-Kammer- Transwell-System. Dieses besteht aus zwei Kompartimenten, die zum einen das Blut-Kreislauf-System und zum anderen das Gehirn darstellen sollen. Diese Kompartimente sind durch eine Membran getrennt, auf welche Gehirn-Kapillar-Endothelzellen ausgebracht werden. Membran und ausgebrachte Zellen stellen die BHS dar. Der Transport von Nanopartikeln oder Substanzen wurde durch den Nachweis von Fluoreszenz im Medium der zwei Kompartimente nachgewiesen. Die fluoreszierenden Nanopartikel oder die fluoreszierende Substanz wurden in das obere Donor-Kompartiment gegeben und zu den Zeitpunkten 2, 4, 6 und 24 Stunden wird die Fluoreszenz in Donor- und Akzeptor-Kompartiment gemessen und beurteilt. Bei diesen Transportstudien konnte gezeigt werden, dass dieses System für den Nachweis von Nanopartikel-Transport ungeeignet ist. So benötigen die Nanopartikel zur Überwindung der Membran ohne Zelllayer schon über 24 Stunden. Die Menge der ankommenden Nanopartikel im Akzeptor-Kompartiment war sehr gering. Substanz-Transport und BHS-charakteristische Eigenschaften lassen sich in diesem Modell jedoch gut nachweisen. So konnte die Aktivität der Efflux-Pumpe PgP anhand des Transportes von Rhodamin, einem PgP-Substrat, belegt werden. Während der Transport von Rhodamin nach Zugabe des PgP-Substrates nur eingeschränkt beobachtbar war, konnte der Transport des Rhodamins vom Donor-Kompartiment in das Akzeptor-Kompartiment nach Zugabe des PgP-Hemmers Verapamil innerhalb 4 Stunden nachgewiesen werden. Auch die TEER-erhöhende Wirkung von Hydrokortisol und somit verbesserter Barriereeigenschaften der Zellschicht konnte an diesem Modell nachgewiesen werden. Zur Aufklärung des Mechanismus eines erfolgreichen Nanopartikel-Transports über die Blut-Hirn-Schranke wurde zunächst der rezeptor-vermittelte Transport über den LDL-Rezeptor untersucht. Der LDL-R ist ein Mitglied der LDL-R-Familie welche neben anderen Organen vermehrt in Gehirn und BHS lokalisiert sind. Als Ligand fungiert bei dieser Rezeptorfamilie und insbesondere bei dem LDL-R das ApoE. Mittels ApoE-modifizierter HSA-Nanopartikel sollte eine spezifische Bindung der Transportsysteme über den gebundenen Liganden ApoE an zielspezifische Transport-Mechanismen wie den LDL-R nachgewiesen werden. Über diesen könnten die Nanopartikel endocytiert und der Arzneistoff an seinen Wirkort gebracht werden. Untersuchungen zu diesem Transport-Mechanismus erfolgten in verschiedenen Arbeitsschritten. So wird erst eine Optimierung des LDL-R-Nachweises auf den Zellen durchgeführt. Eine Leberzelllinie wurde auf LDL-R hin untersucht und die Rezeptorkonzentration durch Mehrfachkultivierung der Zellen optimiert. Nach 2-tägiger Kultivierung in lipidfreiem Serum und dem zweimaligen Sorten der Zellen mit einem Antikörper gegen den LDL-Rezeptor konnte ein Nachweis des Rezeptors von 70-90% erreicht werden. Nächster Schritt war die Untersuchung der Bindung von ApoE-modifizierten Nanopartikeln an verschiedenen Zelllinien mit unterschiedlichem LDL-R-Nachweis, gefolgt von Untersuchungen zur Bindungsspezifität. In diesen Untersuchungen sollte die Spezifität dieser Bindung durch Präinkubationen mit einen Antikörper gegen die Liganden-Bindungsstelle und freiem ApoE nachgewiesen werden. Eine Bindung der ApoE-modifierten HSA-Nanopartikel konnte an Endothelzellen des Gehirns nachgewiesen werden. Sowohl die primär isolierten porcinen brain capillary endothelial cells (pBCEC), als auch die Maus-Gehirn-Endothelzelllinie bEnd3 wiesen eine prozentuale Bindung von ApoE-modifizierten Nanopartikeln von über 70% auf. Eine Bindung dieser Partikel an andere getestete Zelllinien mit BHS-Eigenschaften oder einem hohen Nachweis an LDL-R konnte nicht gezeigt werden. Eine Hemmung der Bindung von ApoEmodifizierten Nanopartikeln an Gehirn-Endothelzellen war nicht oder nur geringfügig möglich. So konnte durch eine Präinkubation mit dem Antikörper keine Reduktion der Bindung erreicht werden. Die Präinkubation mit freiem ApoE führte hingegen zu einer sehr geringen Erniedrigung der Bindungsaffinität der ApoE-modifizierten Nanopartikel. Zu beachten war hierbei noch die geringe nachweisbare Bindung von freiem ApoE an die Zellen. In Versuchen zur Bindung von freiem ApoE war eine prozentuale Bindung von freiem ApoE an die Zellen von nur etwa 20% nachweisbar. Bei einer solch geringen Bindung des freien Liganden kann also auch nicht von einer hohen Hemm-Wirkung ausgegangen werden. Es muß nach diesen Untersuchungen davon ausgegangen werden, dass ein ApoE- und Gehirn-Endothelzell-spezifischer Mechansimus am Transport von ApoEmodifizierten Nanopartikeln beteiligt ist. Der untersuchte LDL-R spielt hierbei keine oder nur eine sehr untergeordnete Rolle. Abschließend wurden noch Nanopartikel mit gebundenen ApoE-Mutanten auf ihre Bindung an Zellen getestet. Die modifizierten ApoE-Liganden unterschieden sich in dem Austausch von Aminosäuren in der Ligand-Bindunsdomäne. In Bindungsuntersuchungen konnte bei diesen ApoE-Varianten kein Unterschied in deren Affinität zu Zellen aufgezeigt werden. Dieser Austausch von Aminosäuren in der Liganden-Bindungsstelle hatte keinerlei Auswirkung auf deren Bindung an die Zellen, was wiederum für einen LDL-R unabhängigen Transport-Mechanismus spricht. Am Ende der vorliegenden Arbeit wurde noch ein alternativer Transport-Mechanismus untersucht. Das Heparansulfat-Proteoglykan (HSPG) als alternativer Mechansimus weist Heparin-Bindungsdomänen auf, die der LDL-R Bindungsdomäne sehr ähnlich sind und bekannterweise in der Lage sind, LDL-Partikel zu internalisiseren. Heparinase I kann die anionischen Heparansulfat-Seitenketten entfernen und somit den Internalisierungsmechanismus über das HSPG beeinträchtigen. Untersuchungen zum HSPG und eine Vorinkubation mit verschiedenen Konzentrationen an Heparinase I deuteten auf eine wichtige Rolle des HSPG im Bindungs- und Internalisierungsmechanismus für ApoE-PEG-HSA-NP hin. Die Affinität der ApoE- modifizierten Nanopartikel konnte durch einen Heparinase-Enzymverdau deutlich erniedrigt werden. Auch führte der Einsatz unterschiedlicher Heparinase I-Konzentrationen zu der Annahme, dass es sich um eine konzentrationsabhängige Beeinträchtigung des Mechanimus handelte. So erreichten 10 Units/ml eine weitaus größere Hemmung der ApoE-PEG-HSA-NP-Bindung als Konzentrationen von 2-5 Units/ml. Strukturelle Ähnlichkeiten des ApoEs mit zellpenetrierenden Peptiden sprechen dafür, dass neben dem HSPG noch andere Translokationsmechanismen von Bedeutung sein könnten.
Im Rahmen der Arbeit wurden eine Reihe C2-symmetrischer chiraler Amidiniumsalze hergestellt und ihre katalytische Wirkung in einer Diels-Alder-Reaktion (Schlüsselschritt der Quinkert-Dane-Estronsynthese) untersucht. Für die Synthese der Amidiniumsalze war es erforderlich, einen synthetischen Zugang zu verschiedenen chiralen 1,2-Diaminen zu schaffen und diese herzustellen. Zur Herstellung von chiralen 1,2-Diaminen wurden zwei Synthesekonzepte verfolgt. Zum einen wurden kommerziell zugängliche Aldehyde in einer McMurry-Reaktion in die entsprechenden (E)-Olefine überführt und durch nachfolgende Sharpless-Dihydroxylierung enantioselektiv zu den (R,R)- bzw. (S,S)-Diolen umgesetzt. Diese wurden nach Überführung der Hydroxylgruppen in Mesylat zu den entsprechenden Diaziden umgesetzt. Die Hydrierung der Diazide lieferte schließlich die chiralen 1,2-Diamine. Eine andere Synthesestrategie ging von kommerziell zugänglicher chiraler Weinsäure aus. Die Hydroxylgruppen wurden zunächst durch Überführen in das Acetonid geschützt. Nach Reduktion der Carboxylgruppen zu den primären Alkoholen und nach Kupplung dieser mit Benzylchlorid zu dem entsprechenden Bisbenzyloxymethylderivat konnten die Hydroxylgruppen durch Öffnen des Acetonids entschützt werden. Die freien Hydroxylgruppen wurden in Mesylat überführt. Nach Umsetzung zum Diazid und Abspaltung der Benzylethergruppen konnten die Diazide zu den chiralen 1,2-Diaminen hydriert werden. Ein weiteres chirales 1,2-Diamin wurde durch Nichtabspaltung der Benzyletherschutzgruppen erhalten. Zur Herstellung der C2-symmetrischen chiralen Amidiniumsalze Durch Kupplung verschiedener chiraler 1,2-Diamine mit aus 5-tert-Butyl-isophthalsäure hergestelltem 5-tert-Butyl-isophthalodiimidsäurediethylester-hydrochlorid konnten eine Reihe C2-symmetrischer chiraler Amidiniumsalze mit aromatischen und „aliphatischen“ Resten hergestellt werden. Es wurden mit verschiedenen Katalysatoren Enantiomerenüberschüsse von bis zu 31 % bei 5 °C und bis zu 47 % bei -78 °C erzielt. Es wurden Katalysexperimente in verschiedenen Lösungsmitteln durchgeführt, um deren Einfluß auf Enantioselektivität und Ausbeute zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, daß CH2Cl2 in Bezug auf Enantiomerenüberschüsse und Ausbeuten die besten Werte lieferte.
Heterologe Expression des humanen ß-2-adrenergen Rezeptors in Semliki-Forest-Virus-Expressionssystem
(2005)
Der humane ß2-adrenerge Rezeptor besitzt sieben Transmembrandomänen und gehört zur Superfamilie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Der Rezeptor ist an der Zelloberfläche lokalisiert und kann nach Bindung extrazellulärer Signalstoffe intrazelluläre Antworten auslösen. Als physiologische Liganden des ß2-adrenergen Rezeptors dienen hauptsächlich die Katecholamine wie Noradrenalin. Nach der Bindung des Liganden kann der Rezeptor an ein stimulatorisches G-Protein (Gs) koppeln und durch Aktivierung der Adenylatzyklase die intrazelluläre cAMP-Konzentration regulieren. Aufgrund der großen pharmakologischen Bedeutung von GPCRs ist es wichtig, die dreidimensionale Struktur dieser Rezeptoren aufzuklären. Da die GPCRs im nativen Gewebe nur in geringen Mengen vorkommen, müssen sie heterolog überproduziert und zur Strukturaufklärung gereinigt werden. In dieser Arbeit wurde das Semliki Forest Virus (SFV)-Expressionssystem zur Produktion des ß2-adrenergen Rezeptors etabliert und optimiert. Die Optimierung des SFV-Expressionssystems erfolgte zunächst bei der Produktion von rekombinanten Viren. Die in vitro Transkriptionsreaktion wurde zur Verbesserung der RNA-Ausbeute untersucht. Anschließend wurde eine optimale Bedingung für die Elektroporation gefunden. Dabei konnte einen Virustiter von 7,5 × 108 infektiöse Partikel pro ml erreicht werden. Zur Produktion des Rezeptors in Säugerzellen wurden sieben rekombinante Viren hergestellt. Verschiedene N- und C-terminale Fusionen wurden im Hinblick auf einen möglichen Einfluss auf die Rezeptorproduktion untersucht. Für das Gen des Kapsid-Proteins (CAP) des Semliki-Forest-Virusgenoms konnte eine deutliche Steigerung der Rezeptorproduktion gefunden werden. Auch die Kozak-Sequenz und das Hämagglutinin (HA)-Signal-Peptid zeigten einen positiven Einfluss auf die Rezeptorproduktion. Die heterologe Proteinexpression wurde in verschiedenen Zelllinien durchgeführt. Es zeigte sich, daß die BHK-21-Zellen für die Produktion in großen Mengen am besten geeignet sind. Die Expressionsrate des Rezeptors in BHK-21-Zellen stieg mit zunehmender Infektionsmultiplizität (MOI). Durch Zugabe von Liganden Alprenolol ins Kulturmedium konnte eine weitere signifikante Steigerung von Rezeptorproduktion erzielt werden. So konnte in adhärenten BHK-21-Zellen 20 Stunden nach der Infektion bei einer MOI von 150 und 2 µM Alprenolol im Medium eine Produktionsrate von 49,6 pmol Rezeptor pro mg Membranprotein erreicht werden. In Suspensionskultur konnte eine Produktionsrate von 36,0 pmol Rezeptor pro mg Membranprotein erreicht werden. Damit konnten 0,2 mg Rezeptoren aus 1 Liter Suspensionskultur produziert werden. Die Rezeptorproduktion in Suspensionskultur könnte jedoch weiter verbessert werden. Mit Immunogoldmarkierung konnte eine überwiegende Lokalisation des Rezeptors im endoplasmatischen Retikulum festgestellt werden. Ein N-Glykosylierung des Rezeptors konnte nachgewiesen werden. Die Glykosylierung gehört zum mannosereichen Typ. Für den Rezeptor wurde eine Dissoziationskonstante von 2,7 nM konnte für Liganden [3H]-CGP-12177 bestimmt. Durch Messung der intrazellulären cAMP-Konzentration wurde die vollständige Funktionalität des rekombinanten Rezeptors nachgewiesen. Für die Membranpräparation wurde ein Protokoll erarbeitet, womit ca. 120 mg Membranprotein aus 1 Liter Zellkultur gewonnen werden konnten. Bei der anschließenden Solubilisierung des Rezeptors mit 1,5 % n-Dodecyl-ß-D-maltosid bei pH 7,4 und 100 mM NaCl konnte eine Ausbeute von ca. 100% erreicht werden. In dieser Arbeit konnte nach verschiedenen Versuchen gezeigt werden, daß eine Reinigung über Immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie (IMAC) in einem einzigen Schritt nicht möglich war.
Der mitochondriale Apoptose-Signalübertragungsweg spielt nicht nur bei der Death Rezeptor-induzierten Apoptose in Typ II-Zellen eine Rolle, sondern z.B. auch bei Bestrahlung und Behandlung mit Chemotherapeutika. Über Cytochrom-c Freisetzung, Apoptosombildung und Caspase-9 Aktivierung kommt es zur Spaltung und Aktivierung der Effektorcaspase-3. Die durch Bindung von dATP und zytosolischem Cyt-c induzierte Konformationsänderung von APAF-1 führt nach anschließender ATP-Hydrolyse zur Oligomerisierung von insgesamt sieben APAF-1-Molekülen unter gleichzeitiger Rekrutierung von Caspase-9 über die in beiden Molekülen vorhandene N-terminale Caspase-Rekrutierungsdomänen (CARD). Es entsteht der so genannte Apoptosomkomplex. Die autoproteolytische Prozessierung und Aktivierung von Caspase-9 mit anschließender Spaltung von Caspase-3 im Apoptosomkomplex führt zum Auslösen der apoptotischen Caspasekaskade und zur Spaltung wichtige zellulärer Substrate. Eine wichtige Rolle bei der Regulation der Apoptosom-vermittelten Caspase-9-Aktivierung spielen u.a. die Mitglieder der Bcl-2 Proteinfamilie, die IAPs und Hitzeschockproteine. Die Blockade des intrinsischen Apoptose-Signalübertragungsweges führt in Tumoren zur Resistenzentwicklung gegenüber Chemo- und Strahlentherapie. Deshalb wurde mit Hilfe des Hefe-Two-Hybrid Systems ein Screen nach neuen regulatorischen Proteinen, die an der Apoptosomkomplex-Bildung beteiligt sind, durchgeführt und dabei ein neuer APAF-1 Interaktionspartner entdeckt, den wir CABY („CED-4 and APAF-1 binding protein found in yeast“) genannt haben. CABY ist ein 160 Aminosäuren großes, pro-apoptotisches Protein, das eine so genannte DUF59 Domäne enthält, für die bisher noch keine Funktion beschrieben wurde. Es konnte nachgewiesen werden, daß CABY ein evolutionär hoch konserviertes Protein darstellt und daß die humane CABY cDNA zwei alternative Translations-Initiationsregionen enthält, die zu der Expression der CABYL bzw. der um 32 Aminosäuren verkürzten CABYS Isoformen führen. Im Rahmen dieser Arbeit sollte darüber hinaus eine detaillierte molekulare und funktionelle Analyse von CABY durchgeführt werden. Als Hilfsmittel für die molekularbiologische Analyse wurden sowohl CABY-spezifische polyklonale Antiseren als auch Hybridoma-Zelllinien hergestellt, die monoklonale anti-CABY Antikörper produzieren. Mit biochemischen Untersuchungen wie in vitro GST Pulldown und in vivo Ko-Immunpräzipitationsexperimenten, sowie durch Ko-Lokalisationsstudien mit überexprimierten und endogenen Proteinmengen konnte die Bindung von CABY an APAF-1 verifiziert werden. Mit Hilfe von APAF-1-Deletionsmutanten wurden die Aminosäuren 412-420 der zentralen Linkerdomäne als verantwortlicher Bereich für die Interaktion mit CABY identifiziert. Interessanterweise bindet CABY in vitro zusätzlich sowohl an die N-terminale CARD Domäne von APAF-1 als auch an Pro-Caspase-9. Ko-Immunpräzipitationsexperimente mit endogenen Proteinen konnten zeigen, daß CABY in gesunden Zellen nicht nur mit dem vollständigen APAF-1 Protein, sondern auch mit der verkürzten 84 kDa großen APAF-1-Isoform in einem Komplex assoziiert vorliegt. Zudem konnte nachgewiesen werden, daß CABY-Proteine homophile Interaktionen eingehen und Dimere ausbilden können. Neben den Untersuchungen zur Interaktion von CABY mit APAF-1 wurden auch funktionelle Analysen mit Hilfe dominant negativer CABY Deletionsmutanten sowie mit siRNA Zellkulturexperimenten durchgeführt, um die Bedeutung von CABY für den intrinsischen mitochondrialen Apoptose Signalübertragungsweg untersuchen zu können. Es wurde festgestellt, daß bei Überexpression von CABY die Zellen für Mitomycin C-induzierte Apoptose sensitisiert werden. Die Überexpression einer C-terminal um 20 Aminosäuren deletierten CABY Mutante wie auch der N-terminal verkürzten CABYS Isoform inhibieren jedoch Mitomycin C-induzierte Apoptose. Die Ergebnisse aus CABY siRNA-Knockdown-Experimenten lassen vermuten, daß CABY-ähnliche funktionell redundante Proteine existieren. In den mit CABY siRNA stabil transfizierten K562- und RKO-Zelllinien konnte festgestellt werden, daß der Verlust endogener CABY-Expression in diesen Zelllinien nur einen geringen Einfluss auf das Apoptoseverhalten ausübt, und zwar unabhängig von der Art des eingesetzten apoptotischen Stimulus. Einen Hinweis auf einen möglichen kompensatorischen Mechanismus liefert die Existenz des ribosomalen Proteins S28e, dessen DUF59-Domäne zu über 90% identisch ist mit der CABY-DUF59-Domäne. S28e könnte potentiell CABY-Funktionen ausüben. Ausgehend von mit der pro-apoptotischen Funktion von CABY wurde nach Tumortypen gesucht, in denen die CABY-Expression im Vergleich zum Normalgewebe signifikant herunterreguliert wird. Die Analyse endogener CABY Expressionsmengen in humanen Tumoren konnte dabei einen Verlust an CABY Expression in GIST-Tumoren nachweisen. Dieses Ergebnis weist auf eine mögliche Rolle von CABY als Tumorsuppressorprotein hin.
In der Abteilung „Medizinische Biotechnologie“ des Paul-Ehrlich-Instituts konnte gezeigt werden, dass ein SIVsmmPBj-abgeleiteter Vektor Vorteile gegenüber HIV-1-abgeleiteten Vektoren aufweist, da auch in der G0-Phase des Zellzyklus arretierte Zelllinien und Fibroblasten sowie primäre humane Monozyten transduziert werden können. Im ersten Teil der hier vorliegenden Arbeit wurden die besonderen Transduktionsfähigkeiten diese SIVsmmPBj Vektors eingehend untersucht. Zunächst wurden die transduzierbaren Monozyten morphologisch und biochemisch genauer charakterisiert; insbesondere wurde gezeigt, dass sich diese Zellen tatsächlich in der G0-Phase des Zellzyklus befinden und auch nach der Transduktion die Fähigkeit aufweisen, sowohl in Makrophagen als auch in Dendritischen Zellen auszudifferenzieren. Bei dem Versuch andere primäre humane Blutzellen zu transduzieren wurde gezeigt, dass SIVsmmPBj Vektoren für die Transduktion unstimulierter CD4+ T-Zellen nicht geeignet sind. Zum besseren Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen die zur Transduktion arretierter Zellen und Monozyten durch SIVsmmPBj-abgeleitete Vektoren führen, wurde der Einfluss der akzessorischen viralen Proteine untersucht. Dazu wurde ein PBj-Knockout- Vektor, bei dem die Expression aller akzessorischen Gene (vif, vpx, vpr und nef) inhibiert war, generiert und zur Transduktion von arretierten Zellen und Monozyten eingesetzt. Keines der akzessorischen Proteine war für die Transduktion der in G0 arretierten Zellen notwendig. Für die Transduktion von Monozyten erwies sich das virale Protein Vpx jedoch als essentiell, da der Knockout-Vektor zur Transduktion von Monozyten nur nach Supplementierung mit diesem Protein in der Lage war. Die Supplementierung von HIV-1 Vektoren mit Vpx des SIVsmmPBj ermöglichte keine Transduktion von Monozyten, was darauf hindeutet, dass weitere Proteine von SIVsmmPBj oder aber auch die Fähigkeit der prinzipiellen Transduktion von Zellen der G0-Phase eine Rolle spielen. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde ein auf SIVsmmPBj basierendes Dreiplasmid-Vektorsystem entwickelt. Für das Verpackungskonstrukt wurde das Verpackungssignal charakterisiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass der Bereich zwischen dem Promotor und dem Spleißdonor gelegene Bereich für eine effiziente Partikelbildung nötig ist und die Deletion der Region zwischen Spleißdonor und gag-Start-ATG zur Inaktivierung des Verpackungssignals ausreicht. Die aus dem Dreiplasmid-System generierten Vektoren erreichten Titer von bis zu 5 x 105 i.E./ml und waren nach Supplementierung mit Vpx dazu in der Lage, primäre humane Monozyten zu transduzieren. Der hier entwickelte, auf SIVsmmPBj basierende Vektor eröffnet neue Möglichkeiten in der Gentherapie. So sind nun auch Monozyten als wichtige Zielzellen der Tumortherapie einem Gentransfer durch lentivirale Vektoren zugänglich.
Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht die Charakterisierung zweier Systeme, bei denen schnelle photoinduzierte Ladungstransferreaktionen auftreten. Mittels Anregungs-Abtast-Spektroskopie im sichtbaren Spektralbereich wurde zum einen die bisher noch nicht charakterisierte Primärreaktion des erst vor wenigen Jahren entdeckten bakteriellen Retinalproteins Proteorhodopsin untersucht. Dieses Protein, das einen signifikanten Beitrag zur Energiebilanz der euphotischen Zone leisten kann, zeigt einen vektoriellen, pH-abhängigen und lichtgetriebenen Protonentransfer über die Zellmembran. Mittels zeitaufgelöster Femtosekundenspektroskopie wurde die Primärdynamik in saurer sowie in alkalischer Umgebung untersucht. Nach Photoanregung von Proteorhodopsin zeigt sich eine konzertierte Schwingung des all-trans-Retinals, die in einer biphasischen Reaktion zu einer Isomerisierung zum 13-cis-Zustand führt. Neben den genauen Zerfallszeiten wird auch das Besetzungsverhältnis des schnellen zum langsamen Zerfallskanal durch den Protonierungszustand des primären Protonenakzeptors gesteuert. In alkalischer Umgebung reagieren mehr Moleküle über den schnellen Reaktionskanal als in saurer Umgebung. Zusätzlich vergrößert sich die Quantenausbeute der Isomerisierungsreaktion vom all-trans- zum 13-cis-Retinal um den Faktor zwei beim Erhöhen des pH-Wertes von 6 auf 9. Durch die Reaktion des Chromophors auf die unterschiedlichen Ladungszustände des primären Protonenakzeptors zeigt sich, dass die Proteinumgebung elementar für die Funktion, speziell auch für die primäre Photodynamik, ist. Eine mögliche Erklärung berücksichtigt die räumliche Nähe der entsprechenden Aminosäure zur C13=C14 Bindung. Durch Deprotonierung an dieser Stelle kommt es zu einer Schwächung der genannten Bindung. Die energetische Barriere für die Isomerisierung wird herabgesetzt und diese Reaktion kann schneller und effizienter ablaufen als bei Gegenwart einer protonierten Aminosäure. Da die Ladung des Akzeptors die Reaktion „steuert“, kann von einer elektrostatischen Kontrolle der Reaktionsdynamik gesprochen werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die photoinduzierte Dynamik von Merocyaninen sowohl frei in Lösung als auch an kolloidale Halbleiter gekoppelt untersucht. Für die freien Farbstoffe lassen sich zwei Deaktivierungskanäle unterscheiden. Nach der Photoanregung kann das Merocyanin an der zentralen konjugierten Polymethinkette isomerisieren. Die Entstehung des daraus resultierenden verdrehten Moleküls konnte innerhalb weniger zehn Pikosekunden beobachtet werden. Die andere Möglichkeit die aufgenommene Energie wieder abzugeben besteht in der Bildung eines angeregten Triplettzustandes. Die Besetzung dieses Zustandes lässt sich innerhalb weniger Pikosekunden beobachten und geht somit signifikant schneller vonstatten als die Isomerisierung. Durch Kopplung der Merocyanine an TiO2-Halbleiterkolloide werden andere Deaktivierungskanäle wichtig. Mit einer Zeitkonstante von wenigen zehn Femtosekunden kommt es zu einem schnellen Ladungstransfer aus dem Farbstoff in den Halbleiter. Parallel zu dieser ultraschnellen Elektroneninjektion bildet sich, wie für das ungekoppelte System auch, der verdrehte Zustand. Die Bindung an den Halbleiter führt jedoch zu einer Beschleunigung der Torsionsbewegung, sodass sich die Geometrieänderung innerhalb weniger Pikosekunden beobachten lässt. Auch aus diesem Zustand kommt es zur Elektroneninjektion aus dem Farbstoff in das Leitungsband des Halbleiters. Die Triplettbildung ist dagegen für das gekoppelte System nicht beobachtbar, was zu einer erhöhten Stabilität führt. Neben der Bildung der ladungsgetrennten Zustände konnte mittels der Femtosekundenspektroskopie auch die partielle Rückreaktion zu neutralen Systemen beobachtet werden. Die Reduktion des Merocyaninkations erfolgt innerhalb weniger 100 ps, ist aber nach einer Nanosekunde noch immer nicht vollständig abgeschlossen, sodass ein signifikanter Teil der Moleküle bzw. Kolloide geladen bleibt. Sämtliche Beobachtungen des Farbstoff-Halbleiter-Systems lassen sich in einem Reaktionsmodell zusammenfassen. Mit diesem lässt sich die Dynamik nach Photoanregung erklären, sowie die energetische Lage der beteiligten Zustände im Verhältnis zueinander betrachten. Ein bereits existierendes Reaktionsmodell des freien Farbstoffes konnte mittels der in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse auf den Bereich unterhalb von einer Nanosekunde erweitert werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse dieser Arbeit zum einen dazu dienen, natürliche Ladungstransferreaktionen zu verstehen. Durch die Aufklärung der Primärdynamik von Proteorhodopsin konnte ein weiterer Baustein zum Verständnis dieses erst kürzlich entdeckten und für die Energiebilanz der Meere wichtigen Proteins hinzugefügt werden. Zum anderen tragen die Resultate dieser Arbeit auch zum Verständnis eines künstlichen Photosynthesesystems (Grätzelzelle) bei und können zur Effizienzsteigerung sowie zur Optimierung genutzt werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Strukturen der Excisionase (Xis) aus dem Bakteriophagen HK022 sowie des Proteinkomplexes zwischen Cytochrom c552 und der CuA-Domäne aus T. thermophilus mittels NMR in wässriger Lösung bestimmt. Im Falle der Excisionase wurde mit Hilfe isotopenmarkierter Proteinproben die vollständige Zuordnung der 1H-, 15N- und 13C-Resonanzen durchgeführt. Hierauf basierend wurden anhand verschiedener zwei- und dreidimensionaler NOESY Spektren insgesamt 902 Abstandsbeschränkungen identifiziert, mit deren Hilfe die räumliche Struktur des Proteins bestimmt werden konnte. Die Strukturrechnungen ergaben letztendlich ein Strukturensemble von 20 Konformeren, die aus 2 alpha-Helices und 5 beta-Faltblattsträngen aufgebaut sind. Die beta-Faltblattstränge bilden 2 antiparalelle beta-Faltblätter, während die beiden alpha-Helices eine L-Formation darstellen. Die letzten 12 Aminosäurereste am C-Terminus zeigten keine NOEs und besaßen folglich auch keine geordnete Struktur. Dennoch ist dieser C-terminale Teil der Sequenz möglicherweise von physiologischem Interesse, da für den Rest 66 eine Asn/IsoAsp- Isomerisierung beobachtet wurde, welche eine Rolle bei der Autoregulation dieses Proteins in vivo spielen könnte. Ein weiteres markantes Strukturelement der Excisionase ist das Triprolinsegment Pro32-Pro33-Pro34, das die beiden beta-Faltblätter miteinander verbindet. Diese drei Prolinreste liegen in einer cis-trans-trans Konformation vor; aufgrund von Ligandenwechselwirkungen verschiedener anderer Proteine, die ein solches Motiv besitzen, liegt die Vermutung nahe, daß diese Region in der spezifischen Protein-Protein-Interaktion, die während der exzisiven Rekombination stattfindet, eine Schlüsselrolle spielen könnte. Zur Untersuchung der Wechselwirkung von Cytochrom c552 mit der CuA-Domäne wurden beide löslichen Fragmente mit dem 15N-Isotop angereichert. Daraufhin konnten für jedes Protein heteronukleare NMR-Experimente durchgeführt werden, die eine vollständige Zuordnung der Amidresonanzen sowohl im reduzierten als auch im paramagnetischen oxidierten Zustand ermöglichte. Basierend auf diesen Resonanzzuordnungen konnten Veränderungen der chemischen Verschiebungswerte aufgrund von Oberflächenkontakten mit dem jeweiligen Redoxpartner mittels 2D [15N, 1H]-TROSY Experimenten in beiden Redoxzuständen ermittelt werden. Die betroffenen Aminosäurereste, welche an der Moleküloberfläche die Kontaktzone definieren, wurden für eine Docking-Rechnung herausgezogen, um letztendlich die räumliche Struktur des Elektronentransferkomplexes zwischen Cytochrom c552 und der ba3-Oxidase zu bestimmen. Interessanterweise traten beim Cytochrom c552 zusätzlich zu den Verschiebungseffekten auf der Moleküloberfläche im reduzierten Zustand auch noch sehr dominante Sekundäreffekte im hinteren Teil der Hämspalte an der Stelle auf, wo das Propionat A über Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Protein verbunden ist. Analog zu dem System aus P. denitrificans befindet sich auch im Cytochrom c552 aus T. thermophilus in dieser Position ein aromatischer Ring, der vermutlich von elektronischen Veränderungen im Hämring beeinflußt wird und diese Effekte durch seinen somit veränderten Ringstrom an die unmittelbare Umgebung weitergibt. Diese experimentellen Daten unterstützen die Elektronendelokalisierungstheorie von Wikström und Mitarbeitern (Johansson et al., 2002a und b), wonach im reduzierten Häm ein Teil der Elektronenladung bis in die Peripherie des Hämrings delokalisiert ist, einschließlich der nichtkonjugierten Propionatreste. Aus vorangegangenen Studien ergab sich bereits, daß der Elektronentransferkomplex in T. thermophilus auf hydrophoben Wechselwirkungen beruht, im Gegensatz zum P. denitrificans System, in dem die Interaktion elektrostatischer Natur ist (Maneg et al., 2003). Tatsächlich weist die in dieser Arbeit bestimmte Struktur des Elektronentranferkomplexes einen hohen Anteil (ca. 40%) an unpolaren Kontaktoberflächen auf. Das Cytochrom c552 bindet dabei an die CuA-Domäne nahe dem CuA-Zentrum, so daß der Abstand zwischen den Metallzentren von Donor und Akzeptor 15,6 Å beträgt. Der Hämring des Cytochrom c552 berührt die CuA-Domäne im Bereich von Phe86 und Phe88, wie bereits von Soulimane et al. (2000) aufgrund der Sequenzhomologie mit dem P. denitrificans System postuliert worden war. Wie jedoch aus dem berechneten Elektronentransferweg hervorgeht, ist die aromatische Seitenkette des Phe88 nicht unbedingt in die Elektronenübertragung einbezogen. Der ca. 19-20 Å lange Weg des Elektrons führt wahrscheinlich vom Häm über das Proteinrückgrat der CuAReste Ala87 und Phe88 zum CuA-Zentralliganden His114 und schließlich zum binuklearen Kupferzentrum. Dies erklärt auch, wieso eine F88L Mutation der CuA-Domäne (Maneg et al., 2003) nur zu einer 50%igen Abnahme der Aktivität geführt hat. Hiermit ist nun für das T. thermophilus System der gesamte Weg der Elektronenübertragung vom Cytochrom c552 über die CuA-Domäne zur Untereinheit I der ba3-Oxidase in den Grundzügen aufgeklärt, da der Elektronentransfer vom CuA- zum CuB-Zentrum bereits zuvor beschrieben worden war (Soulimane et al., 2000).
In einer Vielzahl von Tumoren begründet sich die maligne Transformation der Zellen in einer Überexpression der ErbB2-Rezeptortyrosinkinase. Aufgrund der erhöhten ErbB2-Rezeptordichte auf der Zelloberfläche wird durch die Aktivierung des Rezeptors eine starke Proliferation der Zellen ausgelöst, welche invasiv in gesundes Gewebe eindringen. Dieses starke Wachstum wird über die Aktivierung ErbB2-vermittelter Angiogenese sichergestellt und lässt sich durch die Verwendung von Chemotherapeutika nicht aufhalten. Auf diese Weise können sich diese malignen Zellen durch Metastasierung im ganzen Körper verteilen, was sich in einer 5 Jahres-Überlebensrate der Patienten von 5 % widerspiegelt. Die Inhibition der ErbB2-Rezeptor-Tyrosinkinase stellt somit durch ihre Rolle in der Tumorprogression, ein relevantes Ziel der modernen Tumormedizin dar. In der vorliegenden Arbeit wurde die ErbB2-Tyrosinkinasedomäne in einem Hefe Zwei-Hybrid System verwendet, um spezifische Interaktionspartner zu isolieren, die mit der Funktion der Kinase interferieren. Bei den potentiellen Inhibitoren handelt es sich um Peptid-Aptamere. Dies sind randomisierte Peptide aus 12 bis 42 Aminosäuren, die in einer konstringierten Konformation in ein Gerüstprotein eingebaut sind. Als Gerüstprotein wurde das intrazelluläre Protein Thioredoxin verwendet, dessen aktives Zentrum als Schleife aus der Proteinstruktur ragt. In dieses aktive Zentrum wurden die randomisierten Peptide inseriert und für die Interaktion mit der Tyrosinkinase präsentiert. Durch die Klonierung einer optimierten PeptidAptamer Bibliothek gelang es einen Pool von 2 x 108 unterschiedlichen Peptiden zu konstruieren. Aus dieser Bibliothek konnten durch das Hefe Zwei-Hybrid System Peptid-Aptamere isoliert werden, die spezifisch mit dem ErbB2-Rezeptor interagierten. Diese in der Hefe gezeigte Interaktion wurde in vitro in GST-Pulldown und in vitro Co-IP Experimenten bestätigt. Damit die Funktion der Aptamere in Krebszellen analysiert werden konnte, wurden die Peptid-Aptamere über die lentivirale Transduktion und Proteintransduktion effizient in Zielzellen eingebracht. Mit Hilfe der Aptamer-Transduktion konnte die Rezeptor-Aptamer Interaktion durch Co-IP und Co-Lokalisationsuntersuchungen auch in ErbB2-exprimierende Zellen, wie SKBr3 und NIH#3.7, bestätigt werden. Zur Funktionsanalyse wurden die Aptamere ferner in MCF7 Zellen eingebracht und dort durch HRG die Aktivierung von ErbB2/ErbB3-Heterodimeren induziert. Diese Heterodimere übertragen über den PKB/AKT-Signalweg ein anti-apoptotischen Signal in die Zelle, welches zur Chemoresistenz-Entwicklung dieser Zellen beiträgt. Die ErbB2-induzierte Aktivierung des PKB/AKT-Signalweges konnte durch die Aptamer-Applikation verhindert werden. Im Folgenden wurden die Aptamere in MCF7 her2 Zellen transduziert. Bei MCF7 her2 Zellen handelt es sich um MCF7 Zellen, die stabil mit ErbB2 transfiziert wurden. Die daraus resultierende Überexpression des ErbB2 Rezeptors führt über die Induktion des AKT-Signalweges zur Resistenz der Zellen gegenüber Chemotherapeutika-Behandlung, wie Taxol. Durch Applikation der Aptamer wurden MCF7 her2 Zellen für die Taxol-Behandlung resensitiviert. Auf diese Weise wurden in der vorliegenden Arbeit Peptid-Aptamere isoliert, die mit der ErbB2-induzierter Chemoresistenz interferierten und damit in Kombination mit einer Taxol-Behandlung eine alternative Therapiemöglichkeit bieten.
In den letzten zwei Dekaden wurde die Rolle der RNA in biologischen Prozessen intensiv untersucht. Man erkannte immer deutlicher, dass ihre Funktion über die einfache Vermittlung von Information von der DNA hin zum Protein weit hinausgeht. So spielt sie eine entscheidende Rolle bei der Genexpression und besitzt darüber hinaus auch katalytische Eigenschaften. Die Entdeckung der reversen Transcriptase beim HI-Virus konnte zeigen, dass genetische Informationen nicht nur in Richtung von DNA zu RNA, sondern auch in Entgegengesetzter Richtung übertragen werden kann. Diese Schlüsselrolle in vielen wichtigen biochemischen Prozessen macht die RNA zu einem viel versprechenden Ziel für die Entwicklung neuer Wirkstoffe, um in diese Prozesse eingreifen zu können. RNA bildet eine Vielzahl von stabilen Sekundär- und Tertiärstrukturen aus, die es Proteinen und Antibiotika ermöglicht, sie zu adressieren. Die bis heute wohl mit Ausnahme des Ribosoms und der tRNAs am besten aufgeklärte Struktur einer RNA ist die der HIV TAR-RNA (transaktivierende Region). Ein essentieller Bestandteil für die virale Genexpression ist die so genannte TAR-RNA. Diese befindet sich am 5-Ende aller viraler Transcripte und bildet eine aus 59 Basen bestehende stem-bulge-loop hairpin Struktur. Diese tritt in Wechselwirkung mit dem tat-Protein. Die Grundlage für die Erkennung des hierbei entstehenden Komplexes ist eine Wechselwirkung von tat mit der bulge- und loop-Region von TAR. Durch Interaktion mit der loop- Region kommt es zur Ausbildung eines CyclinT1/tat Komplexes, der im weiteren dafür verantwortlich ist, dass sich die Rate der Transkription um das mehrere hundertfache erhöht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Liganden zu synthetisieren, die spezifische Bindungen mit der TAR-RNA aus HIV-1 eingehen. Durch eine solche Bindung ist es möglich, den viralen Replikationszyklus zu unterbrechen. Ausgehend von einem relativ rudimentären Design, basierend auf dem Arginin-Fork-Model von Frankel, gelang es, mit Triaminopyrazol und verschiedenen seiner Derivaten dieses Ziel zu erreichen. Nach erfolgreicher Synthese der Zielstrukturen wurden diese in einem FRET-Assay im Hinblick auf ihre Affinität zu der TAR-RNA getestet. 3,4,5-Triaminopyrazol übertraf trotz seiner geringen Größe und Ladung mit einem IC50-Wert von 30 µM die Werte vieler tetrakationischer Tripeptide (FRET). Nach erfolgreicher Bestimmung der TAR-Affinität von Triaminopyrazol wurde seine Wirkung auf HIV-infizierte Hela P4-Zellen untersucht, die ein Tat-TAR-kontrolliertes Reportergen exprimierten. Dabei zeigte Triaminopyrazol eine Inhibierung mit IC50 = 50 µM. Bis zu einer Konzentration von 500 µM traten hierbei keine toxischen Effekte auf. Dies legt die Vermutung nahe, dass es sich bei Triaminopyrazol tatsächlich um einen tat- Antagonisten handelt. Ebenso konnte gezeigt werden, dass die Wirkung von Triaminopyrazol nicht die eines Entryinhibitors ist, sondern dass die Verbindung in der Lage ist, die Zellmembran zu durchdringen.
Metalle, die mit kubisch innenzentrierter Struktur oder in dichtesten Kugelpackungen kristallisieren, wandeln sich in guter Näherung ohne Volumenänderung ineinander um. Dieser bereits von Pearson 1972 beschriebene Sachverhalt wird hier als Volumenregel formuliert. Elemente in den genannten Strukturen haben die gleiche Dichte. Mit der für die Abhängigkeit des Bindungsgrades s vom Atomabstand r von Pauling 1947 angegebenen Funktion s(r) = exp((R1 - r)/b) wird aus den Kristallstrukturen der festen Elemente das Atomvolumen berechnet, das das jeweilige Element bei gleicher Bindungswertigkeit in einer dieser Strukturen hat. Dabei werden Strukturen mit höherer Dichte als die kubisch innenzentrierte Struktur oder die dichtesten Kugelpackungen nicht gefunden. Diese und einige weitere Strukturen gleicher Dichte (+- 1%) werden hier als dichte Strukturen bezeichnet. Außer den Edelgasen sind alle Elemente, die mit dichten Strukturen kristallisieren, Metalle, doch haben eine Reihe von Metallen (Mangan, Zink, Cadmium, Quecksilber, Gallium und Zinn) nichtdichte Strukturen. Für diese und für die nichtmetallischen Elemente wird das Atomvolumen ihrer dichten Formen berechnet, d.h. das Volumen, das sie unter Normalbedingungen im dichten (metallischen) Zustand einehmen würden. Ist für ein Element der Bindungsgrad für eine Bindungslänge bekannt, so kann aus diesem das Atomvolumen im dichten Zustand abgeschätzt werden. Aus verschiedenen Strukturen von Nichtmetallen (Phosphor und Schwefel etc.) berechnet sich jeweils in guter Näherung das gleiche Atomvolumen für den dichten Zustand VD. Dies bestätigt die Gültigkeit der Pauling-Funktion. Eine weitere Bestätigung liegt darin, dass für Mangan, Kupfer und Technetium in verschiedenen Strukturen quantenmechanisch berechnete Volumenverhältnisse nach den hier abgeleiteten Beziehungen ebenfalls erhalten werden. Der dichte Zustand der Elemente erscheint hier als ein von der Kristallstruktur unabhängiger Grenzzustand der kondensierten Materie. Bei bekannter Bindungswertigkeit eines Elements können die Parameter R1 und b der Paulingfunktion (Bindungsgrad-Parameter) und damit die Abstandsabhängigkeit des Bindungsgrades berechnet werden. Dies wird für alle s-, p- und d-Elemente durchgeführt. Dabei ergeben sich für die Länge der Einfachbindung R1 Werte, die zum Teil erheblich von den Literaturdaten abweichen. Der Parameter b ist im Gegensatz zu den Literaturangaben nicht konstant, sondern der dritten Wurzel aus VD proportional. Aufgrund derBindungsgrad-Parameter kann derBeitrag vonMetall-Metall-Bindungen zur Wertigkeit in Verbindungen bestimmt werden. Die Volumenverhältnisse von intermetallischen Phasen sowie Hochdruckformen der Elemente werden aufgrund der hier abgeleiteten Beziehungen diskutiert.
The volume changes of lithium and sodium under pressure are discussed with respect to the packing density of the atoms and their valence. In densely packed Li I (bcc), Li II (fcc), and Li III (alpha-Hg ype), valence increases from 1 at ~ 5 GPa to ~ 2.5 at 40 GPa. The maximum valence 3 is attained in Li IV (body-centered cubic, 16 atoms per cell, packing density q = 0.965) at 47 GPa. In densely packed Na I (bcc) a linear increase of valence from 1 at ~ 10 GPa to 2.9 at 65 GPa is found which continues in Na II (fcc) up to 4.1 at 103 GPa.
Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung und Verfeinerung der Lösungsstruktur der rekombinanten pI=5,1 Isoform des H-FABPs aus Rinderherz. Dabei wurde von Proben mit einem Fettsäuregemisch ausgegangen und somit die HOLO–Form des Proteins untersucht. Der Einsatz von mehrdimensionaler NMR–Spektroskopie zur Bestimmung von Abstandsrandbedingungen, stereospezi…schen Zuordnungen und Diederwinkeln aus 3J–Kopplungskonstanten ermöglichte die Verwendung von 1877 Abstandsrandbedingungen, 52 stereospezifischen Zuordnungen und 81 Diederwinkelbeschränkungen. Die Struktur basiert im Schnitt auf 15 geometrischen Beschränkungen je Aminosäurerest. Mit einem mittleren globalen RMSD–Wert der Rückgratatome von 1,07+-0,15Å und den relativ niedrigen berechneten Energiewerten sind die Ansprüche an eine hochaufgelöste Struktur erfüllt. Vergleiche mehrerer struktureller Kriterienmit 160 Proteinkristallstrukturen haben ergeben, daß die hier bestimmte Lösungsstruktur in ihrer Güte einer Kristallstruktur mit einer Auflösung von etwa 2,4 Å entspricht. Die Molekulardynamiksimulation der energetisch niedrigsten Lösungsstruktur in einer Wassersimulation führte anfangs zu einer raschen Konformationsänderung der Struktur. Diese war gekennzeichnet durch eine Vergrößerung des als Eingangsportal für den Fettsäureliganden postulierten Bereiches. Zugleich wurden zwei weitere kleine Öffnungen erkennbar, welche als Austrittsöffnungen für Wassermoleküle dienen könnten.
In dieser Arbeit wurde eine Geometrieuntersuchung am FABP-Molekülmodell durchgeführt. Um 3J-Kopplungsinformation für die Diederwinkelanalyse zu bestimmen, wurden J-modulierte [15N,1H]-COSY-Experimente durchgeführt. Mit Hilfe numerischer Anpassungsroutinen wurden die Signalintensitäten quantitativ ausgewertet, um sehr genaue 3JHN,H-alpha-Kopplungskonstanten zu erhalten. Diese Kopplungskonstanten wurden in Kraftfeldrechnungen als experimentelle Randbedingungen für die Phi-Diederwinkel des Proteinrückgrates berücksichtigt. Dadurch ist eine Aussage über die Winkelverteilung und über die zeitlich gemittelten Kopplungseffekte im Proteinmodell möglich. Die aus der Molekulardynamiksimulation bestimmten 3JHN,H-alpha-Kopplungskonstanten wurden mit den experimentellen verglichen. Die Analyse ergab, daß die den beta-Faltblättern zugewandten Ränder der alpha-Helixbereiche sowie zwei der zehn beta-Faltblattbereiche sehr flexible Teilabschnitte aufweisen. Diese Arbeit konnte somit die Überlegungen stützen, die vor allem den flexiblen Teilabschnitt zwischen der alpha-II-Helix und dem beta-B-Faltblattbereich für die Funktion des Proteins verantwortlich machen.
MDMA oder Ecstasy, wie diese Droge, die 1913 erstmalig zufällig synthetisiert wurde, auch heißt, ist inzwischen fester Bestandteil der Jugendkultur in Amerika und Europa. Eine Literaturrecherche zu diesem Thema kann sich natürlich nicht nur auf Wirkungsweise, Struktur, Synthese und neurotoxische Gefahren beschränken, auch wenn das der Schwerpunkt der Recherche und auch der Ausführungen ist. Dennoch werden in dieser Arbeit auch die Probleme mit dem Umgang dieser Droge, der historische Werdegang und die wichtigen Hinweise zum Umgang mit MDMA beleuchtet, um so einen insgesamt ansatzweise vollständigen Überblick über ein sehr komplexes und umfassendes Thema zu geben. Der rechtliche Aspekt von MDMA wird nur sehr knapp behandelt. Nicht näher wird auf soziologische und gesellschaftliche Überlegungen im Zusammenhang mit der Benutzung von Ecstasy eingegangen, da dieses den Rahmen der Ausführungen sprengen würde und thematisch auch sehr fern ist. Stellvertretend sei hier auf eine Arbeit von Jens Rottmann (Drogenkonsum und Sucht bei Jugendlichen – Ursachen – Verbreitung – Handlungsalternativen ) [1] verwiesen, die diese Aspekte sehr eingehend behandelt. Die Ausführungen konzentrieren sich selbstredend auf die chemischen Grundlagen und biochemischen Abläufe im Zusammenhang mit MDMA. Im dritten Kapitel werden ausführlich biochemische Grundsätze zur Informationsweitergabe in unserem Körper erörtert, da die Ausführungen der Arbeit auf diesen Kenntnissen beruhen.
In der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, hinreichend ebene Goldoberflächen als Substrate für Self-assembled Monolayers durch Aufdampfen auf Glimmer herzustellen und herauszuarbeiten, unter welchen Bedingungen sich die Struktur dieser Goldschichten für die Aufbringung der Monolagen verbessern lässt. Hervorzuheben ist hierbei, dass das Erhitzen des Glimmers während des Aufdampfvorgangs die Rauigkeit der Goldoberfläche reduziert. Vier unverzweigte Alkanthiole (HS-C10H20-CH3, HS-C15H30-CH3, HS-C17H34-CH3 und HS-C10H20-COOH) wurden in vier verschiedenen Konzentrationen in Ethanol gelöst und auf das Substrat aufgebracht. Die Thiole unterschieden sich in Kettenlänge (11, 16 und 18 C-Atome) sowie in der Kopfgruppe (CH3 und COOH). Die entstandenen Filme wurden ebenso wie die verwendeten Goldoberflächen mit dem Rasterkraftmikroskop im Tappingmode, im Contactmode und zum Teil im Frictionmode sowie unter Ethanol vermessen. Zwei Spitzen des Rasterkraftmikroskops wurden durch das Aufbringen einer Monolage (HS-C15H30-CH3 und HS-C10H20-COOH) funktionalisiert. Alle Monolagen wurden mit diesen Spitzen vermessen. Die gewonnenen Abbildungen lassen bis zu einem gewissen Punkt Rückschlüsse über die Beschaffenheit der Self-assembled Monolayers und ihre Eigenschaften zu, dies gilt vor allem für die Messungen im Frictionmode und die Abbildungen, die mit funktionalisierten Spitzen erzielt wurden. Da die Monolagen offensichtlich ohne sichtbare Fehlstellen ausgebildet wurden, fällt es schwer, die Abbildung der Filme von denen der Goldoberflächen eindeutig zu unterscheiden, auch wenn die ausgewerteten Linienprofile zeigen, dass die Rauigkeit der Oberfläche durch die Aufbringung von Monolagen verringert wird. Für zukünftige Messungen sollten die Monolagen vor der Vermessung durch Micro-Printing strukturiert werden. Zwischen Monolagen und funktionalisierten Spitzen wurden Kraft-Abstandskurven und Force-Volume-Abbildungen unter Laborbedingungen aufgezeichnet. Die ermittelten Werte liegen um Größenordnungen über den Werten aus der Literatur, was sich durch den auf den Monolagen unterschiedlich starken Wasserfilm, und den daraus resultierend, wirkenden Kapilarkräften bei der Messung erklären lässt. Diese Messungen sollten unter Flüssigkeit wiederholt werden, um aussagekräftige Ergebnisse zu erzielen. Es gelang dennoch durch diese Messungen, die Existenz der Monolagen auf Substrat und Spitze eindeutig nachzuweisen.