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Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Wechselwirkung des AD-assoziierten Proteins PS1 mit dem Cytoskelett in verschiedenen biochemischen und immuncytochemischen Modellen zu untersuchen. Auf diese Weise sollten Hinweise für das Verständnis der bisher nur in Grundzügen bekannten physiologischen Funktion von PS1 erhalten werden. Ausgehend vom Nachweis der Anreicherung endoproteolytischer PSI-Fragmente in Cytoskelett-Fraktionen aus Hirngewebe wurde die spezifische Assoziation des Proteins mit Mikrofilamenten, Mikrotubuli und Neurofilamenten untersucht. Alle durchgeführten biochemischen und immuncytochemischen Experimente zeigen übereinstimmend die spezifische Assoziation von PS1 mit Mikrofilamenten. So konnten PSI-Fragmente über zwei Depolymerisations/ Polymerisations-Zyklen zusammen mit Actin aus Rattenhirn aufgereinigt werden. Die spezifische Spaltung von Actin-Filamenten durch Gelsolin in cytoskelettreichen Fraktionen aus Hirngewebe führte zur Freisetzung kürzerer Filamente, die nach Zentrifugation zusammen mit PS1- Fragmenten im Überstand erschienen. In immuncytochemischen Färbungen kolokalisierte PS1 mit Actin-Filamenten in primären Gliazellen und der neuronalen Zelinie NT2. Eine vor kurzem veröffentlichte Arbeit zeigte außerdem die Kolokalisation von PS1 und Mikrofdamenten in primären Hippocampus-Neuronen. Die fehlende Kosedimentation von in-vitro translatiertem PS1 und Deletionskonstrukten von PS1 mit aufgereinigten und in-vitro assemblierten Actin-Filamenten, das Fehlen konservierter Actin-Bindungsmotive in der Aminosäuresequenz von PS1 sowie bekannte Interaktionen von PS1 mit Actin-bindenden Vertretern der Filamin- und Armadillo-Proteinfamilien lassen auf eine indirekte Assoziation von PS1 mit Mikrofdamenten schließen. Die vorliegende Arbeit konnte die Frage, welche Rolle Mikrotuli oder Neurofilamente bei der Cytoskelett-Assoziation von PS1 spielen, nicht abschließend Mären. PS1-Fragemente wurden im ersten, nicht jedoch im zweiten Depolymerisations/Polymerisations-Zyklus zusammen mit Tubulin aus Rattenhirn aufgereinigt. In dem gleichen Versuchsansatz kosedimentierte in-vitro translatiertes PS1 nicht mit Mikrotubuli. Immuncytochemische Färbungen zeigten dagegen die Kolokalisation von PS1 mit Mikrotubuli in primären Hippocampus-Neuronen, die auch von zwei aktuellen Arbeiten in primären Hippocampus-Neuronen und murinen Embryonen bestätigt wurde. Die spezifische Depolymerisation von Mikrotubuli in cytoskelettreichen Fraktionen war unter den in der vorliegenden Arbeit verwendeten Bedingungen nicht erfolgreich, so daß aus diesem Experiment keine Aussagen zur Assoziation von PS1 mit Mikrotubuli abgeleitet werden konnten. Es Iäßt sich die Hypothese aufstellen, daß sehr kleine PSI-haltige Vesikel über andere Proteine als PS1 mit Mikrotubuli verbunden sind, so daß PS1 mit Mikrotubuli scheinbar kolokalisiert ist. Hochauflösenden lichtmikroskopische bzw. elektronenmikroskopische Aufnahmen oder biochemische Versuche, die nicht zur Zerstörung der Vesikel durch Detergens führen, könnten für die Überprüfung dieser Hypothese herangezogen werden. In-vitro translatiertes PS1 sowie Deletionskonstrukte von PS1 kosedimentierten nicht mit aufgereinigten und in-vitro assemblierten Neurofilamenten, und in primären Hippocampus-Neuronen kolokalisierte PS1 nicht mit Neurofilamenten. Es wäre jedoch wünschenswert, die Experimente mit geeigneten Positiv-Kontrollen für die Kosedimentation und geeigneteren Antikörpern, die bei einem besseren Signal/Hintergrund-Verhältnis eine stärkere Vergrößerung der Immunfluoreszenzen erlauben, zu wiederholen. Im transgenen Tiermodell beeinträchtigten pathogene Mutationen von PS1 nicht, zumindest nicht quantitativ, die Fähigkeit von PS1, an Cytoskelett-Elemente zu binden. Es wäre jedoch möglich, daß es Unterschiede in der Cytoskelett-Assoziation von wt PS1 und PS1 mit pathogenen Mutationen gibt, die nur im Gewebe von FAD-Patienten zu detektieren sind, nicht aber im transgenen Tiermodell, da die bisher bekannten AD-Tiermodelle nicht alle Aspekte der Erkrankung reproduzieren. Die vorliegenden Ergebnisse können die Basis bilden für weitergehende Untersuchungen zur Funktion von PS1 und der Bedeutung von PS1-Cytoskelettinteraktionen in der Alzheimer Demenz. Aktuelle Arbeiten fokussieren dabei stark auf die Interaktion von PS1 mit Mikrofilament-bindenden Vertretern der Armadillo-Proteinfamilie, die bei Zell-Zell-Adhäsionsprozessen eine wichtige Rolle spielen. Im Diskussionsteil wurde ausgeführt, daß aber, gerade im Hinblick auf die Neurodegeneration bei der Alzheimer Demenz, ein möglicher Einfluß von PS1 auf den schnellen axonalen Transport ein interessanter Ansatz für weitere Versuche sein kann.
Das Tau-Protein bildet im Verlauf von zahlreichen Demenzen, mit Morbus Alzheimer als die bekannteste unter ihnen, Aggregate, die sogenannten „neurofibrillären Geflechte“, die aus Fibrillen, den „paired helical filaments“ (PHFs) bestehen. Außerdem ist das Tau-Protein ein essentielles „microtubule-associated protein“, welches für die Aufrechterhaltung des neuronalen Zellmetabolismus notwendig ist. Dies veranlasste uns dazu, das Tau-Protein als Monomer, in der Mikrotubuli-gebundenen Form und als Fibrille zu charakterisieren. Die Technik, die wir hierzu verwendeten war die NMR-Spektroskopie, die als einzige strukturaufklärende Technik mit atomarer Auflösung dazu in der Lage ist, intrinsisch ungeordnete Proteine, wie das Tau-Protein, zu charakterisieren. Zwar war die Signalzuordnung der NMR-Spektren eine große Herausforderung, dennoch war es möglich praktisch alle Rückgratresonanzen sogar für die längste Tau-Isoform htau40 mit 441 Resten erfolgreich eindeutig zu identifizieren. Mit Hilfe der Zuordnung war es möglich das Tau-Protein bezüglich residualer Strukturelemente, Rückgratdynamik und Bindungsverhalten zu untersuchen. Wir konnten zeigen, dass in der C-terminalen Hälfte des Tau-Proteins, in welcher eine charakteristische Domäne vorliegt, die durch vier imperfekte „repeat“-Regionen (Länge ist jeweils ca. 31 Reste) gekennzeichnet ist, partieller beta-Strukturcharakter vorliegt. Ebenfalls weist diese Region eine verhältnismäßig hohe Rigidität auf. Aus diesem Grund betrachten wird diesen sequentiellen Bereich als den Aggregationskeim, was auch durch die Beobachtung verstärkt wird, das genau diese Zone den rigiden Teil der Fibrillen bildet. Diese aggregationsanfällige Region bindet gleichzeit stark an Mikrotubuli, wodurch ihre Pathogenität im gesunden biologischen System blockiert sein sollte. Mutationen oder Instabilität in den Mikrotubuli können jedoch dazu führen, dass immer höhere Mengen an Tau in freier gelöster Form vorliegen, sich Dimere ausbilden, welche dann weiter aggregieren und schließlich PHFs bilden, die eine starke cross-beta-Struktur aufweisen. Die übrigen Bereiche, wie die N-terminale Hälfe oder die äußersten 50 C-terminalen Reste weisen hingegen einen partiellen alpha-helikalen Charakter auf und eine höhere Peptidrückgratflexibilität. Deshalb kann man diese Elemente als aggregationsinhibierend betrachten. Das genauere Zusammenspiel dieser Elemente muss noch aufbauend auf der vorliegenden Dissertation verstärkt im Detail untersucht werden.
Die Alzheimer-Demenz (AD) ist gekennzeichnet durch extrazelluläre Ablagerungen des Amyloid-beta-Peptids (Aß), durch neurofibrilläre Bündel bestehend aus dem Tau-Protein, massiven Neuronenverlust und synaptische Dysfunktion. Weiterhin ist bekannt, dass mitochondriale Dysfunktion sowie ein gestörter NO-Stoffwechsel eine entscheidende Rolle bei der AD spielen. Um genauere Informationen über die Ursache der mitochondrialen Dysfunktion zu erhalten, wurden akute, chronische und dosisabhängige Effekte von Aß auf die NO-Produktion und die mitochondriale Funktion untersucht. Als Zellkulturmodelle standen PC12- und HEK-Zellen zur Verfügung, die entweder mit humanem Wildtyp-APP (APPwt) oder mit der schwedischen Doppelmutation im APP-Gen (APPsw) stabil transfiziert waren. APPsw-PC12-Zellen wiesen Aß-Spiegel im pikomolaren Bereich auf. Im Vergleich dazu hatten APPsw-HEK-Zellen ca. 20fach erhöhte Aß-Spiegel im niedrig-nanomolaren Bereich. Interessanterweise wiesen sowohl APPsw-PC12- als auch APPsw-HEK-Zellen im Vergleich zu den jeweiligen Kontrollzellen signifikant erhöhte NO-Spiegel auf. Dies ging in beiden Zellsystemen mit signifikant erniedrigten ATP-Spiegeln einher. Die Inkubation untransfizierter Zellen mit extrazellulärem Aß1-42 führte nur zu einem schwachen Anstieg der NO-Spiegel und zu einem leichten Abfall der ATP-Spiegel. Dies weist darauf hin, dass in erster Linie intrazelluläre Aß-Effekte den NO-Anstieg und die ATP-Reduktion bewirken. Die 48-stündige Inkubation mit dem gamma-Sekretasehemmstoff DAPT führte zur beinahe vollständigen Normalisierung der NO- und ATP-Spiegel in APP-transfizierten PC12- und HEK-Zellen. Das stützt die Hypothese, dass der gestörte NO-Stoffwechsel und die mitochondriale Dysfunktion durch Aß-Anreicherungen hervorgerufen werden und nicht durch eine Überexpression von APP. Passend zu den reduzierten ATP-Spiegeln zeigten APPsw-PC12-Zellen eine signifikant erniedrigte Cytochrom-C-Oxidase-Aktivität. Des Weiteren konnte APP in Mitochondrien von APPsw-PC12-Zellen nachgewiesen werden. Die Reduktion der ATP-Spiegel und die verminderte Cytochrom-C-Oxidase-Aktivität können also zum einen durch die Aß-bedingten erhöhten NO-Spiegel und zum anderen durch die Anwesenheit von APP bzw. Aß im Mitochondrium hervorgerufen werden. Auf der Ebene des mitochondrialen Membranpotentials wiesen die beiden Zelllinien stark unterschiedliche Ergebnisse auf. APPsw-PC12-Zellen zeigten unter basalen Verhältnissen ein leicht hyperpolarisiertes mitochondriales Membranpotential, was auf einen Gegenregulationsmechanismus hinweist. APPsw-HEK-Zellen wiesen bereits basal ein signifikant erniedrigtes mitochondriales Membranpotential auf. Nach Inkubation mit dem gamma-Sekretasehemmstoff DAPT normalisierte sich sowohl die Hyperpolarisation des mitochondrialen Membranpotentials in APPsw-PC12-Zellen als auch die Depolarisation in APPsw-HEK-Zellen. Anhand der in dieser Arbeit gewonnenen Daten konnte ein Modell sowohl für die sporadische als auch für die familiäre AD entwickelt werden. APPsw-PC12-Zellen spiegeln hierbei die pathogenen Mechanismen in Patienten mit sporadischer AD wider, wohingegen APPsw-HEK-Zellen die initialen Veränderungen bei Patienten mit familiärer AD aufzeigen. Mitochondriale Fehlfunktion und ein gestörter NO-Stoffwechsel stellen entscheidende initiale Pathomechanismen bei AD dar. Innerhalb der Gruppe der Antidementiva konnte gezeigt werden, dass sowohl Ginkgo-biloba-Extrakt als auch Piracetam schützende Effekte auf die mitochondriale Funktion ausüben. Aufgrund der wichtigen Rolle von mitochondrialer Fehlfunktion in der Pathogenese der Alzheimer Demenz stellen Ginkgo-biloba-Extrakt und Piracetam zwei sehr interessante Präventions- und Therapieoptionen bei Patienten mit leichten kognitiven Störungen bzw. bei Patienten mit AD dar.