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Bislang sind die strukturellen Voraussetzungen für die Selektivität von Agonisten an den Retinoid Rezeptor Subtypen RXRα, RXRβ und RXRγ kaum erforscht, obwohl RXR-Modulatoren, die eine Subtypen-Präferenz aufweisen, aufgrund der unterschiedlichen Expressionsmuster der Subtypen Gewebe-spezifische Effekte vermitteln und somit Nebenwirkungen verringern könnten. Der Grund dieser Forschungslücke liegt teilweise darin, dass die Entwicklung Subtypen-selektiver RXR-Agonisten aufgrund der enormen strukturellen Ähnlichkeit der Ligandbindestellen in den RXR-Subtypen - alle Aminosäuren, die die Bindungsstellen bilden sind identisch - als unerreichbar angesehen wurde. Die Entdeckung des Naturstoffs Valerensäure als RXR-Agonist mit ausgeprägter Präferenz für den RXRβ-Subtyp hat jedoch gezeigt, dass Subtypen-selektive RXR-Modulation möglich ist249 und SAR-Studien an unterschiedlichen RXR-Ligand-Chemotypen haben in der Folge bestätigt, dass die Entwicklung von RXR-Liganden mit Subtypen-Präferenz erreicht werden kann.
Auf der Basis von Valerensäure und der in früheren Arbeiten entwickelten RXR-Agonisten wurden in dieser Arbeit Strukturmodifikationen identifiziert, die zu einer RXR-Subtypen-Präferenz beitragen. Durch die Verschmelzung dieser Strukturelemente ist es gelungen, einen neuen RXR-Agonist-Chemotyp (A) zu entwerfen, der durch strategische Methylierung und weitere Strukturmodifikationen zur Präferenz für jeden Subtyp optimiert werden konnte.
In einem Adipozyten-Differenzierungsexperiment konnte gezeigt werden, dass RXRα der wichtigste Heterodimer-Partner von PPARγ während der Adipogenese ist. Ferner unterstrich diese biologische Untersuchung das Potenzial von 99, 103 und 105 als Subtyp-präferentielle RXR-Agonisten in vitro Experimenten zu dienen.
Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde eine mögliche Rolle von Acrylsäurepartialstrukturen natürlicher RXR-Liganden basierend auf dem zuvor entwickelten Chemotyp untersucht. Hierzu wurden das α-Methylacrylsäuremotiv des Naturstoffs Valerensäure (18) und das β-Methylacrylsäuremotiv des endogenen RXR-Agonisten 9-cis-Retinsäure in den Chemotyp A integriert (Chemotyp B), um die Rolle dieser Acrylsäuregruppen bei der Vermittlung der RXR-Subtypen-Selektivität zu untersuchen. Die Strukturmodifikationen an B zeigten, dass nur die α-Methyl-substituierte Acrylsäurekette toleriert bzw. von RXRβ präferiert wurde, was die RXR-Präferenz der Valerensäure (18) unterstützte.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass RXR-Liganden mit Subtypen-Präferenz realisierbar sind und durch gezielte Strukturmodifikationen in ihrer Präferenz gesteuert werden können. Die Erkenntnisse zu den Struktur-Wirkungs-Beziehungen der neuen RXR-Agonist-Chemotypen A und B erweitern den Wissenstand über die strukturellen Voraussetzungen von RXR-Liganden für die Subtypen-Präferenz deutlich.
Nikotinische Acetylcholin Rezeptoren (nAChR) sind ligandengesteuerte Ionenkanäle der pentameren Cys-Loop Familie, welche nach Bindung des Neurotransmitters Acetylcholin exzitatorische Signale in Muskeln und Neuronen vermitteln. Während die Funktion der Rezeptoren an der synaptischen Membran relativ gut untersucht wurde, gibt es bis heute kaum Erkenntnisse über die intrazellulären Prozesse und Proteine, die der selektiven Assemblierung von homologen Untereinheiten zu funktionalen Rezeptorpentameren zugrundeliegen.
Das C. elegans Genom kodiert für mehr als 29 nAChR Untereinheiten-Gene und besitzt damit die größte Anzahl bekannter Homologe innerhalb der untersuchten Arten. An der neuromuskulären Synapse (NMJ) des Nematoden sind zwei Typen von nAChR bekannt: der heteromere Levamisolrezeptor (L-AChR) und der homomere Nikotinrezeptor (N-AChR). Innerhalb dieser Arbeit wurde der funktionale Zusammenhang zwischen den nikotinischen Rezeptoren der NMJ von C. elegans und einem neuen rezeptorassoziierten ER-Proteinkomplex der Proteine NRA-2 und NRA-4 untersucht. Ihre vertebraten Homologe Nicalin und Nomo wurden zuerst im ER vom Zebrafisch im Zusammenhang mit dem TGF-β Signalweg beschrieben. Mutation der Proteine hat einen Agonist-spezifischen Einfluss auf die Aktivität von L-AChR und N-AChR. Die subzellulären Lokalisationsstudien demonstrierten, dass die beiden Proteine im ER von Muskelzellen wirken und dort mit Rezeptoruntereinheiten co-lokalisieren. Weiterhin ließ sich nachweisen, dass die relative Menge einzelner L-AChR-Untereinheiten an der synaptischen Oberfläche reduziert bzw. erhöht ist. Da die Rezeptoraktivität in Zusammenhang mit der Untereinheiten Komposition steht, wurde die Rolle von zusätzlichen Untereinheiten wie ACR-8 untersucht. Dies zeigte, dass die zusätzliche Mutation der Untereinheit acr-8 in nra-2 Mutanten den Einfluss der nra-2 Einzelmutation auf die Aktivität des L-AChR revertiert. Basierend auf diesen Ergebnissen lässt sich die Hypothese formulieren, dass der NRA-2/NRA-4 Komplex im ER von C. elegans als Kontrollinstanz fungiert welche dafür sorgt, dass nur die jeweils „korrekten“ Untereinheiten in funktionale Rezeptoren eingebaut bzw. andere vom Einbau in das Pentamer abgehalten werden. Durch Fehlen des aktiven Komplexes in Mutanten können nicht vorgesehene -Untereinheiten (z. B. ACR-8) in funktionale Pentamere mit veränderter Funktionalität eingebaut werden.
In dieser Arbeit soll identifiziert werden, welcher der zahlreichen Vertreter einer Arzneistoffklasse sich letztlich auf dem Markt durchsetzen kann und ob bestimmte pharmakokinetische, pharmakodynamische, klinische oder praktische Substanzeigenschaften retrospektiv für den Markterfolg einer Substanz verantwortlich gemacht werden können. Zudem stellt sich die Frage, ob und in wie fern Analogpräparate einen Nutzen in der Arzneimitteltherapie mit sich bringen, obwohl ihnen zum Zeitpunkt ihrer Markteinführung nur ein geringer Innovationsgrad zugebilligt wurde. Um derartige Rückschlüsse ziehen zu können wurden exemplarisch folgende fünf Arzneistoffklassen untersucht, die sich durch eine Vielzahl an Vertretern auszeichnen: Arsphenamine, Sulfonamide, Benzodiazepine, Glucocorticoide sowie Betablocker. Der Untersuchungszeitraum bemisst sich folglich vom Anfang des 20. Jahrhunderts, als industriell gefertigte, chemisch definierte hochpotente Wirkstoffe die Therapie zu bestimmen begannen, bis etwa zum letzten Drittel des 20. Jahrhunderts als Preise und Kostenerstattungsfragen zusätzlich zu Substanzeigenschaften für den Markterfolg mitbestimmend wurden.
Nukleäre Rezeptoren (NRs) sind ligandengesteuerte Transkriptionsfaktoren, die sich aus einer Superfamilie von 48 humanen Mitgliedern zusammensetzt. Seit vielen Jahrzehnten stellen sie ein attraktives Forschungsgebiet für die Arzneistoffentwicklung dar, da sie eine bedeutende Rolle in zahlreichen Prozessen unseres Körpers spielen. Das Ziel dieser Forschungsarbeit bestand darin, neue innovative Liganden für den Peroxisomen-Proliferator-aktivierter-Rezeptor γ (PPARγ) sowie die Waisenrezeptoren Nervenwachtumsfaktor induzierter Klon B (Nur77) und Neuronen-abgeleiteter Waisenrezeptor (NOR-1) zu identifizieren.
Bei den Rezeptoren Nur77 und NOR-1 handelt es sich um noch unzureichend erforschte NRs der NR4A-Familie. Es fehlt insbesondere an Modulatoren dieser Rezeptoren als Werkzeuge, um ihr zum Teil noch unentdecktes Potential zu erforschen. Um diese Lücke zu schließen, wurde ein in vitro Screening durchgeführt und eine Arzneistoff-Fragment-Bibliothek mit 480 Fragmenten, die aus bekannten strukturellen Motiven zugelassener Arzneimittel stammen, auf ihre modulatorische Aktivität an Nur77 und NOR-1 gescreent. Durch das Screening und weitere Testungen konnten jeweils für Nur77 und für NOR-1 drei Verbindungen als Liganden identifiziert werden. Bei der weiteren Charakterisierung stellte sich insbesondere 41 als besonders vielversprechenden Ausgangspunkt für die Entwicklung von Liganden für Nur77 und NOR-1 heraus, der ein besseres Verständnis für die invers agonistische Aktivität lieferte und die Möglichkeit für eine agonistische Modulation aufzeigte. Zudem konnte durch ein weiteres Screening mit Computer-gestützten Verfahren auf Nur77 der Chemotyp von 41 noch weiter optimiert werden und führte zur Identifizierung von Verbindung 68 (EC50 = 2 ± 1 μM). Diese zeichnete sich durch eine hohe Potenz aus, die zu einer beachtenswerten Aktivierung von Nur77 (169 ± 18% maximale Aktivierung) führte. Die Untersuchung der strukturellen Erweiterung von 43 (IC50 = 47 ± 8 μM) führte zur Verbindung 75, die eine 3,5-fache Steigerung des inversen Agonismus auf NOR-1 zeigte. Die Erkenntnisse dieser Entdeckung ermöglichte den Rückschluss, dass das Einführen von voluminösen Resten, wie Brom oder Phenyl eine invers agonistische Potenz im unteren mikromolaren Bereich bewirkte. Die Identifizierung der Verbindungen 41 und 68 für Nur77 sowie 43 und 76 für NOR-1 könnten dazu beitragen, ein tieferes Verständnis der molekularen Mechanismen hinter der Aktivierung von Nur77 und NOR-1 zu erlangen und einen vielversprechenden chemischen Ausgangspunkt für die Entwicklung von noch wirksameren und selektiveren Liganden bieten.
Im anderen Teil dieser Forschungsarbeit stand die Synthese eines selektiven allosterischen PPARγ-Liganden im Fokus, um mit diesem die allosterische Modulation von PPARγ zu charakterisieren. Den Ursprung der Idee lieferte Garcinolsäure, dass in der Lage ist, PPARγ orthosterisch und allosterisch zu binden. Aufgrund der komplexen biologischen Effekte und der geringen synthetischen Zugänglichkeit konnte 37 nicht als Ausgangspunkt für dieses Vorhaben dienen. Auf der Suche nach einer geeigneten Ausgangsverbindung wurde durch ein in vitro Screening mit einer hauseigenen Sammlung von synthetischen PPARγ-Modulatoren, bei dem die orthosterische Bindungsstelle von PPARγ durch den irreversiblen Antagonisten GW9662 blockiert wurde, Verbindung 39 identifiziert. Diese ist wie 37 in der Lage PPARγ ortho- und allosterisch zu binden, weist aber eine bessere synthetische Zugänglichkeit auf. Die Co-Kristallisation von 39 mit der PPARγ-Ligandenbindungsdomäne zeigte, dass die orthosterische Bindungstasche (BT) keinen Platz für eine Verlängerung des Moleküls bietet, die allosterische BT ist dagegen Lösungsmittel exponiert, wodurch eine Verlängerung möglich schien. Daraufhin wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine Verlängerung von 39 eine orthosterische Bindung verhinderte und dadurch eine selektive allosterische Bindung ermöglichen könnte. Aus diesem Grund wurde eine modifizierte Struktur von 39 verwendet, um eine einfache Einbringung eines Linkers in das Molekül zu ermöglichen. Durch verschiedenste Modifikationen und Anpassungen wurde 104 als potenzieller selektiver allosterischer Ligand synthetisiert. Die Testung von 104 im Reportergenassay zeigte eine schwache Aktivierung von PPARγ allein, jedoch offenbarte sich bei der Kombination mit dem orthosterischen Agonisten Pioglitazon eine dosisabhängige Steigerung der Aktivität von PPARγ. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass trotz der Bindung von 104 eine Bindung von 33 in die orthosterische BT immer noch möglich war. Diese Annahme konnte anschließend auch durch zellfreie Experimente (Isotherme Titrationskalorimetrie, MS-basierte-PPARγ-Ligandenbindungs-Assay) bestätigt werden. Der eindeutige Beweis für die selektive allosterische Bindung von 104 lieferte die Co-Kristallisation von 104 mit der PPARγ-LBD. Zusätzlich offenbarte sich, durch den strukturellen Vergleich der Bindungsmodi von anderen PPARγ-Liganden, der außergewöhnliche Bindungsmodus von 104, da 104 im Vergleich zu anderen Liganden selektiv die allosterische BT, ohne Überlappung in die orthosterische BT, besetzte. Weitere Untersuchungen, wie der Einfluss von 104 auf die Rekrutierung von Co-Regulatoren, die Differenzierung von adipozytären Stammzellen und die Genexpression zeigten eine bisher einmalige Modulation von PPARγ, die auf die selektive allosterische Modulation zurückzuführen war. Mit 104 wurde ein innovatives und vielfältig einsetzbares Werkzeug zur Erforschung der allosterischen Modulation von PPARγ entdeckt, dessen Geschichte an diesem Punkt noch nicht zu Ende ist.
Das positions-spezifisch integrierende TRE5-A Retrotransposon besitzt zwei Promotorregionen (A- und C-Modul). Für das C-Modul konnte ein spezifisch bindendes Protein (CbfA) gefunden werden, das vermutlich über die Expression des Minusstrang-Transkripts regulativ in den Transpositionsmechanismus eingreift. Gleichzeitig stellt CbfA in D. discoideum einen kritischen Faktor dar, der sowohl auf das Wachstum als auch auf die Differenzierung Einfluss nimmt.
Es konnte gezeigt werden:
• Der AT-Haken in CbfA ist für die DNA-Bindung essentiell. Die Inaktivierung hat zur Folge, dass keine Differenzierung stattfindet. Es scheint, dass primär der AT-Haken für die DNA-Bindung sorgt und von den Zinkfingern unterstützt wird.
• Die JmjC-Domäne in CbfA ist essentiell. Transformanden mit CbfA ohne aktive JmjC-Domäne zeigen Defekte sowohl in Wachstum als auch Differenzierung.
• CbfA ist ein nukleares Protein. Es konnte zwar keine Kernlokalisationssequenz identifiziert werden, jedoch weisen die Versuche auf zumindest eine Kernlokalisierungssequenz im C-Terminus des cbfA hin.
• Ein C-terminal verkürztes CbfA ist funktionslos: wahrscheinlich aufgrund fehlender Kernlokalisation und somit fehlender DNA-Bindung.
• Ein N-terminal verkürztes CbfA ist teilweise funktionsfähig: die Komplementation in JH.D2-Zellen führt zu einer partiellen Revertierung hin zum Phänotyp der AX2-Zellen.
• Struktur-Homologien der JmjC-Domäne in CbfA zu Mitgliedern aus der Familie der Fe(II)/2OG-Oxygenasen, DNA-bindende Motive und die Lokalisation im Zellkern weisen auf eine Funktion des CbfAs als Chromatin-Remodeller im Zellkern hin.
• In der Transit von Wachstums- zu Entwicklungsphase kann der CbfA-Mangel durch artifizielle Proteinase A-Expression ausgeglichen werden, aber nicht durch Komplementation mit YakA, Adenylat-Zyklase oder cAMP Rezeptor 1.
• CbfA fungiert wahrscheinlich als Regulator der acaA-Transkription auf Ebene der chromosomalen Strukturen.
• cbfB, ein weiteres Gen mit einer JmjC-Domäne wurde in D. discoideum identifiziert, die Gensequenz vervollständigt und vom Dictyostelium Genom-Projekt verifiziert.
Die humane 5-LO ist das Schlüsselenzym in der LT-Biosynthese. LTs sind wichtige Entzündungsmediatoren und sind in einer Vielzahl von Krankheiten involviert, u. a. Asthma, Atherosklerose, rheumatische Arthritis, Sepsis, allergischen Reaktionen und in vielen Krebsarten. Die Struktur der 5-LO besteht aus 673 Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht von 78 kDa. Sie ist in zwei Domänen unterteilt: die kleinere C2-ähnliche regulatorische Domäne (C2ld) und der größeren katalytischen Domäne. Die 5-LO besitzt NIS und NES, die für die zelluläre Lokalisation der 5-LO verantwortlich sind. Außerdem wird die Lokalisation noch von Phosphorylierungsstellen reguliert, die auf der katalytischen Domäne identifiziert werden konnten. 2011 konnten Häfner et al. zeigen, dass die 5-LO in der Lage ist Homodimere zu bilden.
Wie für die meisten anderen humanen Gene konnten auch bei der 5-LO alternative Spleißvarianten identifiziert werden. Schon 1992 konnten die ersten unterschiedlich gesüleißten Transkripte in Hirntumoren und differenzierten HL-60-Zellen gefunden werden. Später konnten weitere Isoformen in verschiedenen Zelllinien entdeckt werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden die alternativen Spleißvarianten 5-LO∆13, 5-LO∆4 und 5-LOp12 untersucht und charakterisiert. Auf mRNA-Ebene wurde die Expression des 5-LO-WT und deren Isoformen sowohl in B- und T-Zelllinien als auch primären B- und T-Zellen, monozytären Zelllinien und primäre Monozyten aus Patientenproben (RA und Sepsis) untersucht. Es wurde festgestellt, dass das Expressionsprofil der 5-LO-Varianten zellspezifisch ist. Im Vergleich zu den T-Zellen konnte in B-Zelllinien ein höheres Expressionslevel detektiert werden. Des Weiteren zeigte sich interessanterweise ein stark erhöhtes Expressionslevel in primären Monozyten von RA- und Sepsis-Patienten.
Untersuchungen der 5-LO-Aktivität ergaben unterschiedliche Ergebnisse, abhängig von der Transfektionsmethode. Als transiente Transfektion diente die Calciumphosphat-Methode. Für die stabile Integration der HEK293T-Zellen wurde die Sleeping Beauty-Methode gewählt. Hierfür wurden Proteine mit einem GFP bzw. mCherry-Tag (GFP-5-LO-WT, mCherry∆13, mCherry∆4, mCherryp12) verwendet, um diese mittels Konfokalmikroskop visualisieren zu können. Nach transienter Transfektion konnte eine Inhibition der 5-LO-Aktivität nach Kotransfektion mit jeweils einer Isoform gemessen werden. Nach stabiler Integration jedoch zeigte sich eine Steigerung der 5-LO-Produktbildung. Mit Hilfe von Western Blots wurden Expressionskontrollen angefertigt und die Menge des 5-LO-WT quantifiziert. In transient transfizierten Zellen wurde eine Erniedrigung der Expression des 5-LO-WT bestimmt, wohingegen in stabil integrierten Zellen ein Anstieg des 5-LO-WT als auch der Isoformen beobachtet werden konnte. Einerseits könnte dies einem Artefakt der Transfektionmethode zugrunde liegen, andererseits könnte es ein Hinweis darauf sein, dass sich die Proteine gegenseitig in ihrer Expression beeinflussen.
Ebenso wurde die Lokalisation der 5-LO und deren Isoformen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die 5-LO überwiegend im Zellkern lokalisiert ist, während alle alternativen Protein-Isoformen im Zytosol zu finden waren. Durch Ionophor-Behandlung wurde eine Translokation des 5-LO-WT an die Kernmembran detektiert, die Isoformen verblieben im Zytosol. Überraschenderweise konnte beobachtet werden, dass die Spleißvariante 5-LO∆13 mit höherer Ionophor-Konzentration ebenso in der Lage ist an die Kernmembran zu translozieren. Um eine mögliche Interaktion der 5-LO mit den Isoformen zu untersuchen, sollten alle Proteine im selben Zellkompartiment lokalisiert sein. Dafür wurden verschiedene Stimuli und Mutationen getestet. Mit der Mutante GFP-5-LO-S271A und dem Stressstimulus Sorbitol und den CaMKII/p38-Inhibotoren KN-93/SB203580 konnte eine Translokation in das Zytosol erreicht werden. Die Ergebnisse der anschließenden Aktivitätsassays zeigten, dass die Isoformen keinen Einfluss auf die Aktivität der 5-LO ausüben.
Des Weiteren wurden die Phosphorylierungen an S523 und S271 von 5-LO-WT, 5-LO∆13, 5-LO∆4 und 5-LOp12 untersucht. Es wurde herausgefunden, dass die 5-LO-Proteine unterschiedliche Phosphorylierungsmuster aufweisen. Während 5-LO-WT und 5-LO∆4 eine schwache Phosphorylierung an S271 aufzeigen, konnte eine starke Phosphorylierung der 5-LO∆13 und 5-LOp12 detektiert werden. Im Vergleich dazu zeigte lediglich die Isoform 5-LOp12 eine sehr starke Bande an der Phosphorylierungsstelle S523. Bei beiden Phosphorylierungen konnten deutlich stärkere Signale nach Kotransfektion gemessen werden. Durch Klonierung eines P2A-Linkers zwischen 5-LO und des GFP-Tags, konnten die Isoformen vom 5-LO-WT in Western Blots voneinander getrennt werden. Dies zeigte, dass es zu einer Hochregulation der Expression der alternativen 5-LO-Varianten nach Kotransfektion mit dem WT führte, aber auch, dass die stärkere Phosphorylierung nach Kotransfektion unabhängig von der Proteinmenge ist.
Der Natrium-abhängige Kaliumkanal Slack (KNa1.1, Slo2.2, KCNT1) nimmt eine Schlüsselrolle in der Regulation neuronaler Erregbarkeit ein, indem er die Ausbildung und Feuerungsfrequenz von Aktionspotentialen kontrolliert. Sowohl in Mäusen als auch in Menschen wird Slack besonders hoch in nicht-peptidergen C-Faser-Neuronen exprimiert. Wissenschaftliche Erkenntnisse der letzten Jahre konnten die Beteiligung von Slack-Kanälen in der Signalverarbeitung neuropathischer Schmerzen, aber auch in verschiedenen Arten von Pruritus, feststellen. Dabei zeigen Slack-defiziente Mäuse ein verstärktes mechanisches Schmerzverhalten nach einer peripheren Nervenverletzung und ein erhöhtes Kratzverhalten in akuten Juckreiz-Modellen. Das als Slack-Aktivator identifizierte trizyklische Neuroleptikum Loxapin zeigt sowohl analgetische als auch antipruritische Effekte in Mäusen, jedoch ist sein klinischer Einsatz auf Grund schwerwiegender antipsychotischer Nebenwirkungen limitiert. Basierend auf Loxapins Leitstruktur wurden daher in dieser Arbeit neue Slack-Aktivatoren mit einem verbesserten pharmakologischen Profil designed und ihr Potential für die Therapie von Schmerzen sowie akutem und chronischem Pruritus in vivo untersucht.
Auswirkung der Chemisorption von Organothiolaten auf den elektrischen Widerstand dünner Goldfilme
(2018)
Hochgeordnete Monolagen von Organothiolaten auf Goldoberflächen bilden sich bei Kontakt einer Goldoberfläche mit einer Lösung eines Thiols oder Thioacetats spontan aus. Die Adsorption auf dünnen Metallfilmen mit Schichtdicken im Bereich von 25 - 100 nm führt zu einer Änderung des elektrischen Widerstandes des Films, die an Goldfilmen mit Schichtdicken von 25 - 40 nm über eine einfache Zweipunktmessung verfolgt wurde. Die Proportionalität der Widerstandsänderung mit der Menge an adsorbiertem Material konnte für die in dieser Arbeit verwendeten Dünnschichtsensoren bestätigt werden. Zu diesem Zweck wurden gleichzeitig Widerstands- und Oberflächenplasmonenresonanzmessungen an 40 nm starken Goldfilmen durchgeführt. In diesen Experimenten zeigt sich die Widerstandsmessung zur Beobachtung der Adsorptionskinetik als die überlegene Technologie.
Die durch Mikrokontaktdrucken und Freiätzen der gedruckten Strukturen hergestellten Sensoren zeigen eine individuelle Signalintensität. Die Normierung auf die maximale, durch Belegung mit Hexadecanthiol (HDT) oder Dodecanthiol erreichte, Signalstärke ermöglichte den Vergleich der maximalen Signalstärke von Thiolatmonolagen, die durch Belegung mit n-Alkanthiolen (CH_3(CH_2)_(n-1)-SH mit n = 12, 16, 19, 22 und 33, Cn), 11-Mercaptoundecyl-hexaethylenglycol (HSC11EG6OH), Adamantan-1-thiol (AdaSH), Triptycenthiol (TrpSH), Anthracen-2-thiol (Ant-0SH), Anthracen-2-alkanthiolen (Ant-(CH_2)_n-SH mit n = 1 - 5 und 10, Ant-nSH), p-Terphenyl-4-thiol (TP0SH), p-Terphenyl-4-alkanthiolen (TP-(CH_2)_n-SH mit n = 1 - 4, TPnSH) und p-Terphenyl-4-ethanthioacetat (TP2SAc) erzeugt wurden. Die Größe der Widerstandsänderung zeigt eine deutliche Abhängigkeit vom organischen Rest des Oberflächenadsorbats. Für die Verstärkung des Signals wurde die folgende Reihenfolge gefunden: Trp > Ada > Ant-0 > Ant-1 > TP0 > TP1 > Ant-2 > TP2 > Cn (n = 12 - 33) = C11EG6OH = Ant-n (n = 3 - 11) = TPn (n = 3, 4). Bei bekannter Verstärkung des Signals durch ein Adsorbat kann unabhängig von der Oberflächenrauigkeit die Oberflächenbedeckung durch Chemisorbate in einer Güte bestimmt werden, die der durch STM- und TEM-Messungen erreichten vergleichbar ist. Die Methode wurde angewendet, um Schichten von TP2SH und TP2SAc, die bei 20 und 60 °C aus ethanolischer Lösung abgeschieden wurden, zu vergleichen. Die Unterschiede in der Oberflächendichte, die durch eine Erhöhung der Abscheidungstemperatur zu beobachten sind, können durch eine Beschleunigung der Reaktion nach Arrhenius erklärt werden. Auch die Temperaturabhängigkeit der Abscheidungsgeschwindigkeit von HDT aus ethanolischer Lösung an Goldoberflächen, die in einem Bereich von -10 °C bis +30 °C betrachtet wurde, ist mit dem Arrhenius'schen Ansatz konform. Die Aktivierungsenergie der Adsorption von HDT auf Gold wurde auf E_a = 23 +-6 kJ/mol bestimmt.
Die Konzentrationsabhängigkeit der Abscheidung aus ethanolischer Lösung an Goldoberflächen wurde für HDT, AdaSH, TP2SH und TP2SAc untersucht. Um eine Präadsorption der Thiole vor dem eigentlichen Start der Messung zu verhindern, wurde eine Apparatur mit einem Diaphragma aus Aluminium entwickelt, das beim Start der Messung mit dem Sensor durchstoßen wird. Mit Ausnahme von TP2SH zeigen alle Adsorptive ein Adsorptions-Desorptions-Gleichgewicht. Die Adsorptionsisothermen bei 20 °C lassen sich am besten durch die Freundlich-Isotherme beschreiben. Während die Reaktionsordnung im Adsorbat für die Adsorption der Thiole nahe an 1 liegt, hat sie für die Adsorption von TP2SAc einen Wert von ca. 1/4. Damit ergibt sich für die Geschwindigkeitskonstante der Adsorption k_a(HDT) = (2,3 +-0,2) 10^4 L/(mol s), k_a(AdaSH) = (6,1 +-0,2) 10^4 L/(mol s), k_a(TP2SH) = (7,3 +-0,4) 10^3 L/(mol s) und k_a(TP2SAc) = (8 +-3) 10^-2 L^(1/4)/(mol^(1/4) s). Die Adsorptionskurven der Thiole weisen bei Konzentrationen unterhalb von 5 10^-5 mol/L einen linearen Bereich auf, der einer zwischenzeitlichen Diffusionskontrolle zugeordnet wird.
An die aufgenommenen Adsorptionskurven der Thiole wurden literaturbekannte Modelle numerisch angepasst und teilweise weiterentwickelt. Die Anpassung konnte durch die Einführung einer vor der Oberfläche gelagerten Diffusionsgrenzschicht, in welcher der zeitabhängige Verlauf der Analytkonzentration in einem System von 10 Schichten berechnet wurde, deutlich verbessert werden. Von allen getesteten Modellen zeigt nur die Adsorption mit Ausschlussmuster keine Konzentrationsabhängigkeit der Geschwindigkeitskonstante der Desorption. Dieses Modell bezieht den Verlust von Adsorptionsplätzen mit ein, die einem besetzten Adsorptionsplatz benachbart sind und durch das adsorbierte Teilchen verdeckt werden. Der daraus resultierende Zusammenhang zwischen der Konzentration freier Adsorptionsplätze und dem Bedeckungsgrad der Oberfläche Theta_F(Theta) ist abhängig vom Verhältnis der Stoßfrequenz zwischen den Teilchen und der Oberfläche zur Platzwechselfrequenz der Teilchen auf der Oberfläche. Zur Bestimmung von Theta_F(Theta) für die numerische Anpassung der Adsorptionskurven von HDT und TP2SH wurde die Oberflächenbesetzung in einem Monte-Carlo-Verfahren für eine Konzentrationsreihe in Zehnerpotenzschritten simuliert.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der vergleichenden funktionalen Charakterisierung der E.coli Transporter LacY, FucP und XylE und des Glucose-Transporters GlcP aus Staphylococcus epidermidis sowie funktionsrelevanter Mutanten. Sie katalysieren in vivo den PMF-gekoppelten Zuckertransport und repräsentieren die major facilitator superfamily (MFS), einer der größten Transporter-Familien überhaupt. Die Studien wurden mithilfe einer elektrophysiologischen Methode auf Basis Festkörper-unterstützter Membranen (SSM) durchgeführt. Komplementär dazu wurden radioaktive Transportassays, fluorometrische Messungen, kinetische Simulationen und theoretische Berechnungen auf Basis der 3D-Strukturen durchgeführt. Experimentell bestimmte Zucker- und pH-Abhängigkeiten elektrogener steady-state und pre steady-state Reaktionen wurden verwendet, um ein allgemeingültiges kinetisches Modell aufzustellen.
Insgesamt konnten bei allen Transportern zwei elementare elektrogene Reaktionen identifiziert werden. Eine schnelle Zucker-induzierte Konformationsänderung wurde dem induced fit des Zuckermoleküls zugeordnet. Die Elektrogenität im steady-state wird dagegen durch den langsamen Transfer der negativ geladenen Protonenbindestelle bestimmt. Die für den Symport ratenlimitierende Reaktion ist abhängig von den äußeren Bedingungen wie pH-Werten, Zuckerkonzentrationen, Substrat-Spezies und Membranpotential meist die Konformationsänderung des leeren (P) oder des beladenen (PSH) Carriers, welche die Substratbindestellen im Zuge des Alternating Access über die Membran transferieren. Ein Wechsel zwischen hohen Protonenbindungs-pK-Werten und niedrigen Protonenfreisetzungs-pK-Werten durch weitere lokale Konformationsänderungen ist zentraler Bestandteil des Transportmechanismus. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Kopplung zwischen Zucker- und Protonen-Translokation, die sich zwischen E.coli Transportern und GlcP strikt unterscheidet. In E.coli Transportern erfolgt eine kooperative Bindung von Zucker und Proton. Zudem erfolgt keine Konformationsänderung im Zucker-gebundenen, unprotonierten Carrier (PS). In GlcP ist die Kopplung erheblich reduziert. Der Transport-Modus selbst ist abhängig von den äußeren Bedingungen. So katalysiert GlcP abhängig vom pH-Gradienten Uniport, Symport oder Antiport.
Die vorliegende Arbeit leistet einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des PMF-gekoppelten Zuckertransports und zeigt die Grenzen des für LacY formulierten 6-Zustands-Modells mit nur zwei Konformationsänderungen auf. Ein erweitertes 8-Zustands-Modell mit vier Konformationsänderungen, die unterschiedliche Ratenkonstanten aufweisen können, erklärt sowohl Symport, Antiport als auch Uniport und berücksichtigt zudem die zahlreichen Ergebnisse für LacY aus der Literatur.
Seit einigen Jahren ist bekannt, dass Sphingolipide nicht nur eine strukturgebende Funktion in der Plasmamembran aufweisen, sondern ebenfalls als Botenstoffe intra- und extrazellulär aktiv sind. Sphingosin-1-Phosphat (S1P) bildet dabei einen Schlüssel-Metaboliten, da es verschiedene Zellfunktionen wie Wachstum und Zelltod beeinflusst. Es wird durch zwei Isoformen der Sphingosinkinasen, SK1 und SK2, gebildet. Die SK1 wurde bereits gut untersucht und es konnte gezeigt werden, dass sie eine wichtige Rolle beim Zellwachstum einnimmt und einen entscheidender Regulator bei inflammatorischen Erkrankungen und Krebs darstellt. Über die SK2 ist soweit wenig bekannt und die Ergebnisse sind zum Teil kontrovers. Sowohl pro-proliferative als auch anti-proliferative Funktionen der SK2 wurden beschrieben. Andererseits handelt meine Arbeit von Nierenfibrose, da beschrieben wurde, dass Sphingolipide einen wichtigen Einfluss auf die Entwicklung chronischer Nierenerkrankungen nehmen. Nierenfibrose stellt das Endstadium chronischer Nierenerkrankungen dar und führt zu einer Akkumulation der Extrazellulärmatrix, Organvernarbung und zum Verlust der Nierenfunktion. Die SK1 spielt dabei eine protektive Rolle bei der Entstehung von Nierenfibrose. Deshalb sollte in dieser Arbeit die Rolle der Sk2 bei der Entstehung von Nierenfibrose untersucht werden.
Im ersten Teil meiner Arbeit wurde das Mausmodell der unilateralen Ureterobstruktion (UUO) verwendet, welches zur Entwicklung einer tubulointerstitiellen Nephritits und nachfolgender Fibrose führt. Es konnte dabei gezeigt werden, dass sowohl die Protein-Expression als auch die Aktivität der SK2 im fibrotischen Nierengewebe gesteigert wurden. Allgemein wiesen die SK2-/--Mäuse eine verminderte Fibrose in Folge des UUO auf im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen. Dies wurde bestätigt durch eine reduzierte Kollagenakkumulation, sowie eine verminderte Protein-Expression von Fibronektin-1, Kollagen-1, α-smooth muscle actin, connective tissue growth factor (CTGF) und Plasminogen-Aktivator-Inhibitor1 (PAI-1). Diese Effekte gingen einher mit einer gesteigerten Protein-Expression des inhibitorischen Smad7 und erhöhten Sphingosin-Spiegeln in SK2-/--UUO-Nieren. Auf mechanistischer Ebene vermindern die erhöhten Sphingosin-Spiegel die durch transforming growth factor-β (TGFβ) induzierte Kollagenakkumulation, die PAI-1- und CTGF-Expression, aber induzieren die Smad7-Expression in primären Nierenfibroblasten. In einem komplementären Versuch mit hSK2 tg-Mäusen wurde eine verstärkte Entstehung von Nierenfibrose mit erhöhter Kollagenakkumulation, sowie erhöhte Protein-Expressionen von Fibronektin-1, Kollagen-1, α-smooth muscle actin, CTGF und PAI-1 festgestellt. Die Smad7-Expression dagegen war vermindert.
Im zweiten Teil meiner Arbeit stand der glomeruläre Teil der Niere im Fokus und es wurde untersucht, ob die Überexpression der SK2 zu einer phänotypischen Veränderung der glomerulären Mesangiumzellen führt. Mesangiumzellen wurden dazu aus den hSK2 tg-Mäuse isoliert und charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass hSK2 und mSK2 in den transgenen Zellen hauptsächlich in der zytosolischen Fraktion lokalisiert sind, während S1P ausschließlich im Kern akkumulierte. Weiterhin konnte eine verminderte Proliferation unter normalen Wachstumsbedingungen der hSK2 tg-Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen beobachtet werden. Die Zellen reagierten auch sensitiver auf Stress-induzierte Apoptose. Auf molekularer Ebene konnte dies durch eine reduzierte ERK- und Akt/PKB-Aktivierung erklärt werden. Nach Staurosporin-Behandlung wurde Apoptose durch den intrinsischen, mitochondrialen Apoptosesignalweg induziert. Dabei konnte eine reduzierte anti-apoptotische Bcl-xL-Expression und vermehrte Prozessierung von Caspase-9 und Caspase-3 und PARP beobachtet werden.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine verminderte tubulointerstitielle Fibrose-Entstehung durch die Deletion der SK2, sowie anti-proliferative und Apoptose-induzierende Effekte durch die SK2 in Mesangiumzellen nachgewiesen werden konnten. Somit könnten SK2-Inhibitoren die Entstehung tubulointerstitieller Fibrose und mit Proliferation assoziierte Erkrankungen wie mesangioproliferative Glomerulonephritis positiv beeinflussen.
Die Verwendung von Photoschaltern zur gezielten Kontrolle von Systemen birgt ein hohes Potential hinsichtlich biologischer Fragestellungen, bis hin zu optoelektronischen Anwendungen. Infolge einer Photoanregung kommt es zu Geometrieänderungen, die einen erheblichen Einfluss auf ihr photophysikalisches Verhalten haben. Die Änderungen der photochemischen, wie photophysikalischen Eigenschaften, beruht entweder auf der Isomerisierung von Doppelbindungen oder auf perizyklischen Reaktionen. Durch sorgfältige Modifikationen, wie beispielsweise die Änderung der Konjugation durch unterschiedlich große π-Elektronensysteme, der Molekülgeometrie oder der Veränderung des Dipolmoments, lassen sich intrinsische Funktionen variieren.
Die Kombination dieser Eigenschaften stellt eine komplexe Herausforderung dar, da diese Änderungen einen direkten Einfluss auf wichtige Charakteristika wie die Adressierbarkeit, die Effizienz und die Stabilität der Moleküle haben. Darüber hinaus spielt die thermische Stabilität eine erhebliche Rolle im Hinblick auf die Speicherung von Energie oder Informationen für Anwendungsbereiche in der Energiegewinnung und Datenverarbeitung.
Für die Anwendung solcher photochromen Moleküle ist hinsichtlich der oben genannten Eigenschaften auch das Wissen über den photoinduzierten Reaktionsmechanismus unabdingbar.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss auf die Isomerisierungsdynamik organischer Photoschalter durch unterschiedliche Modifikationen mittels stationärer und zeitaufgelöster Spektroskopie untersucht. Im Bereich der Merocyanine konnte ein Derivat vorgestellt werden, das ausschließlich zwischen zwei MC-Formen (trans/cis) isomerisiert. Die interne Methylierung am Phenolatsauerstoff der Chromeneinheit verhindert die Ringschlussreaktion zum SP und somit seinen zwitterionischen Charakter. Die stabilen Grundzustandsisomere TTT und CCT weisen durch den Methylsubstituenten eine hypsochrome Verschiebung ihrer Absorptionsmaxima auf, während TTT das thermodynamisch stabilste Isomer darstellt. Das MeMC wies eine erstaunlich hohe Effizienz seiner Schaltamplituden, insbesondere der TTT → CCT Photoisomerisierung auf, sowie eine überaus hohe Quantenausbeute.
Das MeMC wies zudem eine signifikante Lösungsmittelabhängigkeit auf, die sich insbesondere in der Photostabilität bemerkbar macht. Während das MeMC in MeCN und EtOH photodegradiert, konnte in EtOH/H2O eine konstante Reliabilität festgestellt werden. Diese Zuverlässigkeit impliziert nicht nur eine Stabilisierung durch das Wasser, sondern auch eine Resistenz gegenüber Hydrolysereaktionen. Darüber hinaus konnten kinetische Studien eine hohe thermische Rückkonversion von CCT zu TTT bei Raumtemperatur nachweisen, womit auf schädliche UV-Bestrahlung verzichtet werden könnte.
Die Untersuchung der Kurzzeitdynamiken beider Grundzustandsisomere gab Aufschluss über die Beteiligung anderer möglicher MC-Intermediate und den Einfluss der Methylgruppe auf das System. Mittels quantenchemischer Berechnungen konnte eine erste Initiierung um die zentrale Doppelbindung beider Isomere bestimmt werden, die jeweils zu einem heißen Grundzustandsintermediat führt, bis nach einer zweiten Isomerisierung der endgültige Grundzustand der Photoprodukte populiert wird. Dies bedeutet, dass die trans/cis-Isomerisierung über TTT-TCT-CCT und die Rückkonversion über CCT-CTT-TTT erfolgt.
Im Bereich der Hydrazon-Photoschalter konnten unterschiedlich substituierte Derivate mittels statischer und zeitaufgelösten UV/Vis-Studien untersucht werden. Da ESIPT Prozesse eine wichtige Funktion bei der Kontrolle von biologischen Systemen spielen, wurden verschiedene Hydrazonderivate hinsichtlich ihrer Reaktionsmechanismen untersucht. Als Rotoreinheit diente zum einen eine Benzothiazolkomponente, die die interne H-Bindung des angeregten Z-Hydrazons schwächen sollte und zum anderen wurde ein Chinolinsubstituent eingesetzt, der als Elektronenakzeptor diente und den H-Transfer begünstigt. Der Einsatz der Benzothiazolkomponente bewirkte die gewünschte Vergrößerung der bathochromen Verschiebung des E-Isomers, sowie eine deutliche Erhöhung der thermischen Stabilität des metastabilen
Zustands. Dies bestätigten die zeitaufgelösten Studien der Z zu E Isomerisierung, bei denen die Isomere im Vergleich zum Chinolinhydrazonderivat, in beiden ausgewählten Lösungsmitteln metastabile Z-Intermediate zeigten und eine Lebenszeit bis in den µs-Zeitbereich aufwiesen. Die Rückreaktion beider Derivate (HCN) und (HBN) hingegen zeigte eine barrierelose Umwandlung in die beteiligten Photoprodukte. Trotz der Verwendung des Chinolinsubstituenten zusammen mit Naphthalin als Rotoreinheit (HCN), konnte kein ESIPT Prozess beobachtet werden. HCB mit einer Kombination aus einem Chinolinrotor und eines Benzothiazolsubstituenten, wies eine Hydrazon-Azobenzol-Tautomerie auf, die ein prototropes Gleichgewicht zwischen dem E-Hydrazon und der E-Azobenzolform (E-AB) ausbildete. Die Reaktionsdynamiken des Z-Hydrazons zum E-AB wiesen eine ultraschnelle Bildung des Photoproduktes auf, während die Rückreaktion über einen ESIPT im sub-ps-Bereich erfolgte. Dieser H-Transfer hat die Bildung des angeregten E-Hydrazons zur Folge. Interessanterweise wurde kein Rückprotonentransfer nachgewiesen, sondern die mögliche Formation eines Z-AB gefunden. Damit unterscheidet sich dieser Reaktionsmechanismus erheblich von den typischen ESIPT Prozessen, die normalerweise zu ihrem Ausgangsmolekül zurückrelaxieren. Des Weiteren konnte ein Pyridinoxid und Benzoylpyridin-substituiertes Hydrazon charakterisiert werden, bei denen die stationären Studien kein Schaltverhalten, sondern Photodegradation aufwiesen. Die zeitaufgelösten Daten ergaben ebenfalls keine Photoproduktbildung, was die These der Photozersetzung unterstützt. Die Verwendung von zusätzlich substituierten Rotoreinheiten, wie beispielsweise Pyridinoxid und Benzoylpyridin, die aufgrund fehlender Protonenakzeptormöglichkeit keine interne H-Bindung ausbilden, erlaubt keine Bildung des Z-Hydrazon Isomers.
Die vorliegende Dissertation gliedert sich in 2 Abschnitte: Im 1. Abschnitt wurden die Auswirkungen des Naturstoffs Phytol auf den Krankheitsverlauf des murinen EAE-Modells charakterisiert, während im 2. Abschnitt die immunmodulierenden Eigenschaften der neuartigen Leitsubstanzen Silvestrol sowie Steroid Substanz 1o untersucht wurden.
Vorarbeiten zeigten einen positiven Einfluss von Phytol auf den Krankheitsverlauf im murinen EAE-Modell für Multiple Sklerose, eine verringerte Proliferationsfähigkeit von Splenozyten sowie eine Regulation der NOX2 mRNA-Expression (Blum et al., 2018b).
In der vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die Gabe von Phytol den Prozess der Demyelinisierung im lumbalen Rückenmark deutlich reduzierte und die Anzahl der Immunzellen in den inguinalen Lymphknoten sowie im lumbalen Rückenmark signifikant verringerte. Weiterhin konnte eine Regulation der spezifischen T-Zell Transkriptionsfaktoren T Bet sowie Foxp3 nachgewiesen werden. Es zeigte sich, dass Phytansäure, nicht jedoch Pristansäure, die beiden Metaboliten von Phytol, die Proliferationsfähigkeit der T-Zellen signifikant verringerte. Beide Metaboliten zeigten zusätzlich unterschiedlichen Einfluss auf die T-Zell Subtypen. Hultqvist et al. konnten eine verstärkte Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) durch Phytol nachweisen (Hultqvist et al., 2006). Vorarbeiten zeigten eine Steigerung der mRNA-Expression des ROS-produzierenden Enzymkomplex NOX2 im Verlauf des EAE-Modells sowie eine Regulation der NOX2-Expression im lumbalen Rückenmark und in den inguinalen Lymphknoten durch Phytol (Blum et al., 2018b). Deshalb wurde die Rolle von NOX2 an den Phytol-vermittelten Effekten weiter charakterisiert. Dabei zeigte sich, dass die gesteigerte NOX2-Expression im lumbalen Rückenmark auf die eingewanderten Immunzellen zurückzuführen war. Die von NOX2 im zentralen Nervensystem (ZNS) gebildeten ROS, welche zur Schädigung der Myelinschicht beitragen können, wurden durch die Gabe von Phytol im lumbalen Rückenmark verringert. Untersuchungen in NOX2KO-Mäusen zeigten, dass die beobachteten ex vivo Effekte von Phytol sowie dessen Metaboliten nur teilweise NOX2-abhängig waren. Im murinen EAE-Modell mit NOX2KO-Mäusen zeigte Phytol weiterhin einen positiven Einfluss auf die klinischen Symptome. Auffällig war dabei, dass NOX2KO-Tiere grundsätzlich weniger klinische Scores zeigten als Wildtyp Tiere. In NOX2-Chimären hatte Phytol keinen signifikanten Einfluss auf den Krankheitsverlauf. Grund dafür könnte eine Beschädigung der Blut-Hirn-Schranke bei der Generierung der Chimären und eine damit verbundene verstärkte Infiltration von Immunzellen in das ZNS gewesen sein. Weiterhin konnte Phytol möglicherweise über die geschädigte Blut-Hirn-Schranke verstärkt in das ZNS eindringen und dort über eine gesteigerte ROS-Produktion zu schädigenden Effekten führen.
Die in vivo Daten weisen auf einen überwiegend NOX2-unabhängigen Wirkmechanismus von Phytol hin. Dennoch scheint NOX2 bei einigen Effekten zumindest beteiligt zu sein. Zusammenfassend zeigte die Gabe von Phytol einen überwiegend positiven Einfluss auf den Krankheitsverlauf im murinen EAE-Modell, dennoch ist die Phytol-vermittelte Induktion von NOX2 und die Bildung von ROS kritisch zu sehen, da diese sowohl positive als auch negative Effekte vermitteln und stark von der Quantität sowie der Lokalisation der Bildung abhängig sind.
Im 2. Teilprojekt wurden die immunmodulierenden Auswirkungen der neuartigen Leitsubstanzen Silvestrol sowie Steroid Substanz 1o charakterisiert. Der anti-viral wirksame Naturstoff Silvestrol zeigte dabei diverse Auswirkungen auf die Differenzierung sowie Polarisierung von humanen Makrophagen. Während der Differenzierung inhibierte Silvestrol das anti-inflammatorische bzw. resolutionsfördernde Potential der Makrophagen durch eine Reduktion der resolutionsfördernden Oberflächenmarker CD206 und TREM2. Weiterhin wurde die Sezernierung der anti-inflammatorischen Zyto- bzw. Chemokine IL-10 und CCL18 verringert. Der pro-inflammatorische Phänotyp von M1-Makrophagen wurde weiterhin durch die vermehrte Bildung von TNF-α unterstützt, während bei M2-Makrophagen der anti-inflammatorische bzw. resolutionsfördernde Phänotyp verstärkt wurde. In Dendritischen Zellen schien Silvestrol sowohl die Differenzierung als auch die Aktivierung zu inhibieren, da zahlreiche Oberflächenmarker und sezernierte Zytokine signifikant verringert wurden. Die Stoffwechselwege der oxidativen Phosphorylierung und der Glykolyse wurden sowohl in Makrophagen als auch in Dendritischen Zellen signifikant reduziert. Demnach ist unklar, ob in der Summe die pro- oder anti-inflammatorischen Aspekte von Silvestrol überwiegen und ob der Einfluss auf den Stoffwechsel die Immunantwort beeinträchtigt.
Der anti-parasitäre Wirkstoff Steroid Substanz 1o zeigte keinen negativen Einfluss auf die Viabilität in primären humanen Immunzellen bis zu einer Konzentration von 50 µM und verstärkte das pro-inflammatorische Profil von M1-Makrophagen. Weiterhin wurde der anti-inflammatorische bzw. resolutionsfördernde Phänotyp von M2-Makrophagen unterdrückt und stattdessen die pro-inflammatorischen Aspekte verstärkt. Diese Beobachtungen der veränderten Oberflächenmarker sowie der sezernierten Zytokine wurden weiterhin durch die Veränderung des zellulären Stoffwechsels gestützt. Dabei steigerte Steroid Substanz 1o die Glykolyse in M2-Makrophagen, welche eigentlich für M1-Makrophagen charakteristisch ist. Dadurch kann die Verschiebung der M2-Makrophagen zu einem M1-Phänotyp erklärt werden. Weiterhin beeinträchtigte Steroid Substanz 1o die Differenzierung und Aktivierung von Dendritischen Zellen. Zusammenfassend verstärkte Steroid Substanz 1o überwiegend die pro-inflammatorischen Aspekte der Immunreaktion durch eine Aktivierung der M1-Makrophagen. Bei der möglichen Anwendung als Therapeutikum für Malaria sowie Schistosomiasis kann somit das Immunsystem bei der initialen Abwehr der Parasiten unterstützt werden.
In den letzten 20 Jahren haben sich zunehmend Schülerlabore an Universitäten und Forschungszentren etabliert, um naturwissenschaftliche Kompetenzen von Schülern/innen aufzubauen und zu fördern. Das wachsende Feld der Schülerlaborforschung zeigt allerdings auf, dass die Eingangsvoraussetzungen, mit denen die Schüler/innen an der naturwissenschaftlichen Lernumgebung teilnehmen, einen starken Einfluss auf die Annahme sowie die Entwicklung von interessens-, selbstkonzept- und motivationsbezogenen Persönlichkeitsmerkmalen haben können. Diese Erkenntnisse lenken den Blick auf die Entwicklungsumwelt der Familien, in der die Eltern von Geburt an auf die kindliche Persönlichkeitsentwicklung und Lernprozesse einwirken. Die Integration des vielversprechenden familiären Kontexts in eine naturwissenschaftliche Lernumgebung wird seit 2008 anhand des Eltern-Kind-Projekts KEMIE® an der Ruhr-Universität Bochum umgesetzt, indem Eltern-Kind-Paare gemeinsam an alltagsnahen naturwissenschaftlichen Phänomenen experimentieren. Seit 2016 wird KEMIE® zudem an der Goethe-Universität Frankfurt am Main im Goethe-Schülerlabor Chemie durchgeführt.
Am Beispiel des Frankfurter KEMIE®-Projekts will die vorliegende Arbeit das Potential von Eltern-Kind-Interaktionen für naturwissenschaftliche Lernprozesse untersuchen. Mithilfe der Grounded-Theory-Methodologie wurde das zentrale Forschungsdesiderat der Eltern-Kind-Interaktion über die Projektjahre 2016/17 und 2017/18 herausgestellt sowie mögliche Erhebungsmethoden pilotiert. Im Projektjahr 2018/19 konnte dieses schließlich in einer Mixed-Methods-Studie multiperspektivisch beforscht werden. Dafür wurden Interviews, Beobachtungen und Pre-Posttest-Daten von 46 teilnehmenden Eltern-Kind-Paaren sowie weitere Kontrollgruppendaten von 202 Frankfurter Familien erhoben.
Um zunächst die naturwissenschaftliche Lernumgebung zu beschreiben, wurden die vorherrschenden Einflussfaktoren identifiziert, die zugehörigen Phänomene beschrieben sowie die prozess- und personenbezogenen Verhaltensmuster herausgestellt. Über letztere können die Eltern-Kind-Interaktionen in das SELE-Modell elterlicher Unterstützungsmaßnahmen eingeordnet werden, wobei sich das Ermöglichen von Selbsttätigkeit als herausragendes Merkmal für die naturwissenschaftliche Lernumgebung manifestiert. Zudem zeigt sich, dass das Projekt positive Effekte auf naturwissenschaftsbezogene Werteorientierungen der Kinder sowie deren Interesse an den Naturwissenschaften hat.
Anhand der Entwicklung eines induktiven Beobachtungsschemas, konnten die Familien schließlich über die Verhaltensmerkmale der Eltern-Kind-Interaktion gruppiert und Zusammenhänge zu sowohl den Vorbedingungen als auch den Konsequenzen für die psychischen Dispositionen der Kinder aufgedeckt werden. Erste Erkenntnisse dieser explorativen Erhebung zeigen, dass das akademische Selbstkonzept und die naturwissenschaftsbezogenen Werteorientierungen der Eltern und Kinder die Verhaltensmuster in der naturwissenschaftlichen Umgebung determinieren. Auf der anderen Seite können die Kinder gerade hinsichtlich dieser beiden Faktoren am meisten profitieren. Dabei können diese positiven Effekte auf eine Regulation seitens der Eltern, das gemeinsame Ausführen von Tätigkeiten sowie den Einbezug in die Gestaltung der Lernumgebung zurückgeführt werden.
Adaptormoleküle zur Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren oder miRNAs an nicht native Bindestellen
(2020)
Die Kontrolle der Genexpression ist eines der großen Ziele der chemischen Biologie. Gemäß dem klassischen Dogma der Molekularbiologe verläuft der Fluss der genetischen Information über die Transkription von DNA zur messenger RNA (mRNA) und durch die Translation von mRNA zu Proteinen. Auch wenn der ursprünglichen Formulierung dieses Dogmas verschiedene Aspekte hinzugefügt wurden, bleibt die Kernaussage unverändert. Eine Störung der Genexpression ist in vielen Fällen die Ursache für schwerwiegende Erkrankungen. Klassische Therapeutika, die im Allgemeinen aus kleinen Molekülen bestehen, können pathogene Proteine spezifisch binden und inhibieren. Allerdings greifen diese Wirkstoffe am Ende der Produktionskette ein und nicht alle Proteine können adressiert werden. Im Gegensatz dazu könnte ein Eingriff auf der Ebene der Transkription oder Translation die Expression der pathogenen Proteine auf ein normales Maß senken oder ganz verhindern. Als entscheidende Regulatoren der Genexpression stellen Transkriptionsfaktoren (TFs) einen interessanten Angriffspunkt zur Kontrolle der Transkription dar. TFs können über den Kontakt zu weiteren Proteinen die RNA Polymerase II rekrutieren und so die Transkription starten. Für die Translation ist die Halbwertszeit der mRNA ein entscheidender Faktor. Die Lebensdauer wird durch eine Vielzahl an Proteinen und micro RNAs (miRNAs) reguliert. MiRNAs sind kurze Oligonukleotide, die in Argonautproteine eingebaut werden können. Die daraus resultierenden RNA-induced silencing complexes (RISCs) sind in der Lage, den Abbau der mRNA einzuleiten. Sowohl TFs als auch RISCs besitzen dabei Nukleinsäure-bindende Untereinheiten, die mit spezifische Sequenzen assoziieren. In gewisser Weise ist die molekulare Erkennung der Nukleinsäuren vergleichbar mit einer Postsendung, die aufgrund der Adresse korrekt zugestellt wird. Um in diesem Bild des täglichen Lebens zu bleiben: Bei einem Wechsel des Wohnorts ist es üblich, einen Nachsendeauftrag zu stellen. Dabei wird die alte Anschrift auf den Postsendungen mit einem neuen Adressetikett überklebt und die Zustellung erfolgt an den neuen Wohnort. Das zentrale Thema dieser Dissertation ist, dieses „Umetikettieren“ auch auf TFs und RISCs zu übertragen. Hierbei ist es notwendig, die Nukleinsäure-bindenden Untereinheiten der Komplexe, also die „alte Adresse“, vollständig zu blockieren und gleichzeitig eine hohe Affinität zu einer neuen Sequenz zu erzeugen. Hierzu könnten bifunktionale Adaptormoleküle verwendet werden.
Die Adaptoren für die Rekrutierung von TFs müssen in der Lage sein, sowohl die doppelsträngige DNA (dsDNA) als auch einen TF zu binden (Abbildung I). Dabei sollte eine Selbstbindung des Adaptors vermieden werden. In dieser Arbeit wurde der TF Sp1 als Ziel gewählt, da er an GC-reiche dsDNAs bindet. Dies ermöglicht die Wahl einer AT- oder GA reichen DNA-Sequenz als Ziel der Umleitung, wodurch eine Selbstbindung des Adaptors minimiert werden sollte. Zur Erkennung der DNA war geplant, Pyrrol-Imidazol-Polyamide (PIPs), triplexbildende Oligonukleotide (TFOs) oder pseudokomplementäre PNAs einzusetzen. Für Letztere war es möglich, eine neue Syntheseroute zu einem Fmoc geschützten Thiouracil-Monomer zu entwerfen. Dabei konnte eine selektive Alkylierung an der N1-Position des Thiouracils durchgeführt werden. Auf Basis der PIPs und der TFOs wurden jeweils verschiedene Adaptoren entworfen, deren Bindung zu ihren Zielen mit Band-Shift-Experimenten und im Fall der PIPs zusätzlich mit fluoreszenzbasierten Pulldown-Experimenten gezeigt wurde. Im Rahmen dieser Versuche zeigte sich, dass die PIP-basierten Systeme deutlich besser an die Zielsequenzen banden als die TFO-basierten Adaptoren. Das Konjugat K5a besaß hierbei die besten Eigenschaften. Weiterhin konnte mit diesem Adaptor in Pulldown-Experimenten gezeigt werden, dass Sp1 auf eine nicht kanonische AT-reiche Bindestelle umgeleitet wurde. Im Anschluss konnte das Sp1 in Western-Blots detektiert werden. Des Weiteren ließ sich zeigen, dass K5a in einem HeLa Lysat über mehrere Stunden stabil war und somit eine Anwendung in Zellkulturexperimenten möglich sein sollte.
Für die Rekrutierung der RISCs war lediglich eine Erkennung zweier einzelsträngiger RNA-Abschnitte notwendig. Hierzu wurden zwei LNAs oder LNA/DNA-Mixmere verwendet, die über einen Linker verknüpft waren (Abbildung I). Als Folge dieses Aufbaus mussten die beiden Adaptorhälften orthogonal sein, da eine Selbstbindung des Adaptors leichter als bei den TF-Adaptoren auftreten konnte. Diese Adaptoren wurden mit Band-Shift- und fluoreszenzbasierten Pulldown-Experimenten auf ihre Fähigkeit, eine Cy5-gelabelte miRNA auf eine Ziel-RNA umzuleiten, überprüft. Es konnte beobachtet werden, dass all-LNA Adaptoren sehr viele off-target-Effekt aufwiesen, welche die Umleitung von miRNAs verhinderte. Im Gegensatz dazu konnten mit DNA/LNA-Mixmeren eine vollständige Umleitung von miRNA-Modellen beobachtet werden. Es war ebenfalls möglich, spezifische RISCs aus HeLa-Lysaten mit unterschiedlichen Adaptoren in Pulldown-Experimenten zu isolieren und in nachfolgenden Western-Blots zu detektieren. Nachdem gezeigt war, dass eine Umleitung in vitro gelang, sollte die Funktion der Adaptoren in Zellkulturexperimenten geprüft werden. Allerdings konnten in diesen Versuchen keine eindeutigen Ergebnisse erhalten werden, sodass die biologische Relevanz der RISC-Umleitung bislang noch nicht bestätigt werden konnte.
Hintergrund: Die Komplexität einer medikamentösen Behandlung steigt mit der Anzahl der Medikamente, der Einzeldosen und der Darreichungsformen und bedroht dadurch die Adhärenz der Patienten. Patienten mit Multimorbidität benötigen oft flexible, individualisierte Behandlungsschemata. Häufige Medikationsänderungen im Verlauf der Behandlung können jedoch die Komplexität einer Therapie weiter erhöhen.
Ziel: Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, Medikationsveränderungen bei älteren Patienten mit Multimorbidität und Multimedikation in der hausärztlichen Praxis zu beschreiben und deren Abhängigkeit von soziodemographischen und weiteren Merkmalen zu untersuchen. Zudem sollten die Medikationsveränderungen in den Daten der cluster-randomisierten kontrollierten PRIMUM-Studie (Priorisierung der MUltimedication in Multimorbidity) analysiert werden, um Effekte der komplexen PRIMUM-Intervention zu untersuchen und damit einen Beitrag zur Prozessevaluation zu leisten.
Methoden: In der vorliegenden Arbeit wurden Daten der PRIMUM-Studie, die in 72 Allgemeinpraxen durchgeführt wurde, retrospektiv analysiert. Dazu wurde ein Algorithmus entwickelt, der die Wirkstoffe, die Wirkstärke, die Dosierung und die Darreichungsform zur Beurteilung von Änderungen an der von Ärzten berichteten Medikationsdaten während zweier Intervalle (Basiswert bis sechs Monate: Δ1; sechs bis neun Monate: Δ2) untersucht. Diese Veränderungen wurden auf Verordnungs- und Patientenebene deskriptiv sowie auf die Assoziation zu soziodemographischen und Versorgungsmerkmalen uni- und multivariat analysiert und auf Interventionswirkungen überprüft.
Ergebnisse: Von 502 Patienten (im Durchschnitt 72 Jahre, 52% weiblich) beendeten 464 die Studie. Medikationsveränderungen traten bei 98,6% der Patienten auf. Die maximale Anzahl an Medikationsänderungen pro Patient betrug 21 in Δ1 und 20 in Δ2. Die Gesamtzahl der Medikamente pro Patient blieb dabei weitgehend konstant und betrug im Median zu allen drei Messzeitpunkten 8 (IQR an T0 und IQR an T1: 6-9 und IQR an T2: 6-10). Änderungen bezogen auf den Wirkstoff während Δ1 und Δ2 traten bei 414 (82,5%) und 338 (67,3%) Patienten auf, Dosierungsänderungen bei 372 (74,1%) und 296 (59,2%) und in der Wirkstärke bei 158 (31,5%) bzw. 138 (27,5%). Die Darreichungsform wurde bei 79 (16%) der Patienten sowohl in Δ1 als auch in Δ2 geändert. Simvastatin, Ramipril, Metformin und Aspirin waren am häufigsten von Veränderungen betroffen. Am häufigsten verordnet waren ASS, Metoprolol und Bisoprolol sowie Simvastatin. Medikationsänderungen traten häufiger nach vorhergehenden Aufenthalten im Krankenhaus auf und Dosisreduktion war bei männlichen Patienten häufiger zu verzeichnen. In der Interventionsgruppe waren Medikationsänderungen um 19% wahrscheinlicher. Insbesondere waren Dosisreduktionen und das Ansetzen von neuen Medikamenten in der Interventionsgruppe signifikant häufiger.
Schlussfolgerungen: Bei älteren Patienten mit Multimedikation und Multimorbidität wurden die Therapiepläne häufig geändert. Auf Verordnungsebene ist dies hauptsächlich auf Absetzen und Dosisanpassungen zurückzuführen, gefolgt von Ansetzen und Wiederansetzen von Medikamenten. Dies kann die (longitudinale) Komplexität der Medikation für Patienten erhöhen und ggf. nachteilige Folgen für Therapieadhärenz und Arzneimitteltherapiesicherheit haben. Zudem wird deutlich, dass die medikamentöse Verordnungsqualität in querschnittlichen Erhebungen nicht zuverlässig beurteilt werden kann. In der PRIMUM-Studie wurden häufiger Änderungen in der Interventions- gegenüber der Kontrollgruppe vorgenommen - hauptsächlich das Ansetzen neuer Medikamente und Dosisreduktion. Damit konnten Effekte der komplexen Intervention gezeigt werden, die im Einklang mit den Zielen der Intervention zur Optimierung von Multimedikation steht.
Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind die Untersuchungen lichtgesteuerter Reaktionen der zwei Retinalproteine Channelrhodopsin-2 (ChR-2) und Proteorhodopsin (PR) mit Hilfe zeitaufgelöster Laserspektroskopie.
Da der Mechanismus der Kanalöffnung des ChR-2 bis heute nicht vollständig aufgeklärt werden konnte, beschäftigt sich diese Arbeit insbesondere mit den Prozessen, die direkt nach der Photoanregung des Retinals stattfinden und die Kanalöffnung vorbereiten. Es wurde dabei gezielt auf für die Funktion des Proteins wichtige Faktoren wie strukturelle Besonderheiten des Chromophors und seiner Umgebung eingegangen und deren Auswirkung auf die Dynamik der Photoreaktionen sowie die Veränderungen im Protein nach der Anregung untersucht.
Zunächst wurden die Ergebnisse der vis-pump-IR-probe-Experimente an ChR-2 im Bereich der Carbonylschwingungsbanden protonierter Glutamat- und Aspartat-Reste dargestellt. Dabei wurde insbesondere die Bildungsdynamik der Differenzbanden in diesem Spektralbereich untersucht und in Anlehnung an die vorhandene Literatur eine Bandenzuordnung der für die Funktion des Proteins wichtigen Aminosäurereste vorgenommen. Aus den Messergebnissen konnte geschlossen werden, dass die mit der Kanalöffnung einhergehenden Konformationsänderungen in ChR-2 durch eine effektive Aufnahme der Überschussenergie durch das Protein auf einer sub-Pikosekunden-Zeitskala vorbereitet werden.
Des Weiteren wurden spektroskopische Untersuchungen an der R120H-Mutante des ChR-2 vorgestellt. Da diese Mutante bei elektrophysiologischen Messungen keine Kanalaktivität zeigte, sollte zunächst geklärt werden, ob die Mutation einen Einfluss auf die Retinalisomerisierung und den nachfolgenden Photozyklus hat. Dabei stellte sich heraus, dass die Retinalisomerisierung bei der R120H-Mutante zwar im Vergleich zum Wildtyp etwas verzögert stattfindet, der Einfluss der Punktmutation auf den weiteren Photozyklus jedoch insgesamt gering ist. Mit Hilfe der Kurzzeit-IR-Spektroskopie im Bereich der Amid I-Schwingung des Proteinrückgrats konnten für die Mutante allerdings signifikante Veränderungen der Bildungsdynamik sowie eine deutliche Abnahme der Amplitude des Amid I-Signals detektiert werden. Anhand weiterer Experimente an den Mutanten E123T und D253N in diesem Spektralbereich konnte anschließend ein Zusammenhang zwischen der Intensität der Amid I-Bande und der Kanalaktivität von ChR-2 festgestellt werden. Diese Ergebnisse ließen somit die Schlussfolgerung zu, dass die Aminosäurereste R120 und D253 eine entscheidende Rolle beim schnellen Transfer der Überschussenergie an das Protein nach der Retinalanregung und der so initiierten Kanalöffnung spielen.
Zusätzlich wurde der Frage nachgegangen, inwieweit Veränderungen am Chromophor die Isomerisierungsreaktion, den nachfolgenden Photozyklus sowie die Funktion des ChR-2 als Ionenkanal beeinflussen können. Zu diesem Zweck wurden spektroskopische Untersuchungen an einem mit 9-12-Phenylretinal (PheRet) rekonstituierten ChR-2 vorgestellt. Es konnte gezeigt werden, dass die Isomerisierung des PheRet zu seiner 13-cis-Form in ChR-2 stark verlangsamt ist und verglichen mit dem nicht modifizierten Chromophor deutlich ineffizienter abläuft. Es wurde außerdem festgestellt, dass die Veränderungen am Retinal zu deutlichen Beeinträchtigungen des Photozyklus führen. Zum einen wurde ein sehr schneller Zerfall des ersten Photoprodukts sowie die Bildung eines zusätzlichen, blauverschobenen Px-Zustands detektiert. Außerdem wurde festgestellt, dass nach der Deprotonierung des isomerisierten PheRet der Großteil der modifizierten Retinale in den Ausgangszustand zurückkehrt und der P3-Zustand nur in geringen Mengen gebildet wird. Die Messergebnisse führten somit zu der Schlussfolgerung, dass die all-trans-Konformation des PheRet in ChR-2 deutlich bevorzugt wird. Da elektrophysiologische Untersuchungen des Retinal-Analogons jodach keine signifikanten Verminderungen der Photoströme im Vergleich zum ATR in ChR-2 zeigten, ließ sich schließlich festhalten, dass die vorgenommenen Veränderungen am Chromophor, die zu einer deutlichen Hemmung der Isomerisierungsreaktion führen und einen starken Einfluss auf den nachfolgenden Photozyklus haben, nicht ausreichend sind, um die Kanalaktivität von ChR-2 komplett zu blockieren, solange noch ein kleiner Anteil der Retinale isomerisieren kann.
Der abschließende Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Absorption des UV-Lichts durch das Retinal mit deprotonierter Schiff-Base im grünabsorbierenden Proteorhodopsin, welches in einem alkalischen Medium im Dunkelzustand akkumuliert werden kann. Die Untersuchungen der Primärreaktion zeigten einen langsamen biexponentiellen Zerfall des angeregten Zustands der UV-absorbierenden Spezies mit anschließender Bildung des 13-cis-Photoprodukts. Aufgrund dieser Ergebnisse konnte ein Reaktionsmodell für die ersten Prozesse nach der UV-Anregung des Retinals im GPR aufgestellt werden, welches möglicherweise für weitere UV-Rezeptoren genutzt werden kann.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Inhibitoren der bakteriellen Resistenzproteine New Delhi Metallo-β-Lactamase 1 (NDM-1), die beiden Mutanten der Verona-Integron Encoded Metallo-β-Lactamase 1 und 2 (VIM-1, bzw. -2), sowie die Imipenemase 7 (IMP-7) entwickelt.
Auf Grund natürlicher Selektion, aber vor allem auch bedingt durch den unüberlegten und verschwenderischen Einsatz von β-Lactam-Antibiotika, ist eine weltweite Zunahme an multiresistenten Erregern zu beobachten. Einer der Hauptgründe dieser Resistenzen sind die Metallo- β-Lactamsen (MBL), welche vor allem in Gramnegativen Bakterien vertreten sind und für die Hydrolyse und damit der Desaktivierung der β-Lactam-Wirkstoffe verantwortlich sind. Neben der Suche nach anderweitig wirkenden Antibiotika, ist die Entwicklung von Inhibitoren der MBLs von vordringlicher Bedeutung.
Basierend auf der Grundstruktur des ACE-Hemmers Captopril, wurden trotz synthetischer Herausforderungen erfolgreich mehrere Strukturen mit inhibitorischer Aktivität gegenüber den MBLs synthetisiert. Der Prolinring von Captopril wurde in einer neuen Variante der Captopril-Synthese durch verschiedene Ring- und nicht cyclische Teilstrukturen ersetzt. Durch die Entwicklung einer Schutzgruppenstrategie, konnte die Ringstruktur durch einen Piperazin-Rest ersetzt werden. Dies erlaubt es, die Molekülstruktur auf dieser Seite zu erweitern. Des Weiteren wurde eine neue Syntheseroute etabliert, welche es auf elegante Weise ermöglicht, weitere Derivatisierungen an der Methylgruppe des Captoprils durchzuführen.
In einem proteinbasierten Testsystem wurden die synthetisierten Substanzen auf ihr inhibitorisches Potential hin untersucht. Dabei wurden IC50-Werte im niedrig einstelligen mikromolaren, für drei Verbindungen sogar im sub-mikromolaren Bereich ermittelt. Die erhaltenen Ergebnisse wurden für die drei aktivsten Inhibitoren durch eine Erhöhung des Schmelzpunktes in einem TSA-Testsystem erfolgreich verifiziert. Mittels ITC-Untersuchungen konnte die unterschiedlichen Gewichtungen der entropischen und enthalpischen Beiträge zur Bindung der Inhibitoren an die untersuchten MBLs aufgezeigt werden. Hierdurch konnten die scheinbar widersprüchlichen Ergebnisse der ermittelten IC50-Werte und Schmelzpunktverschiebungen für die Verbindung DBDK48 bezüglich der NDM-1 aufgeklärt werden.
Die Strukturen DB320 konnte erfolgreich mit VIM-2 co-kristallisiert werden. Dies ermöglicht eine genauere Untersuchung und qualifizierte Aussagen über die Bindungsverhältnisse zwischen Protein und Ligand.
Für zwei der synthetisierten Inhibitoren sollte untersucht werden, ob deren Aktivität in vitro auch in Bakterien erhalten bleibt. Dazu wurden pathogene klinische Isolate und Laborstämme, welche mit dem Resistenzplasmid transfiziert wurden, und gegen Imipenem resistent sind, herangezogen. Durch die Zugabe der Inhibitoren konnte die Wirksamkeit von Imipenem wiederhergestellt werden.
Es konnte eine HPLC-Methode etabliert werden, welche eine Abschätzung der Polaritäten in Abhängigkeit der Retentionszeiten erlaubt. Dadurch konnte ein direkter Zusammenhang zwischen der Polarität der Verbindungen und dem Grad der Wirksamkeit im MIC-Testsystem aufgezeigt werden.
Durch die Untersuchung der Inhibitoren auf die Proteine ACE und LTA4H, konnten zwei Ziel-Proteine der Captopril-Grundstruktur als unerwünschte Nebenziele ausgeschlossen werden. Des Weiteren führte die Behandlung von U937-Zellen, selbst bei einer hohen Konzentration von 100 µM, weder zu Auffälligkeiten in einem WST-1 Assay, noch zu einer erhöhten Freisetzung von LDH. Daher kann davon ausgegangen werden, dass die Verbindungen über keine zytotoxischen Eigenschaften verfügen.
Zur Behandlung von chronisch entzündlichen Erkrankungen besteht nach wie vor ein dringendes medizinisches Bedürfnis, da die bisher eingesetzten Medikamente gerade in der Langzeittherapie zu schwerwiegenden Nebenwirkungen führen können. Um chronisch entzündliche Erkrankungen in Zukunft adäquat therapieren zu können, sind bereits verschiedene neuartige Ansätze in klinischer bzw. präklinischer Entwicklung. Ein möglicher Ansatz besteht in einer dualen Hemmung der mikrosomalen Prostaglandin E2 Synthase-1 (mPGES-1) und der 5-Lipoxygenase (5-LO). Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SAR) von zwei verschiedenen Leitstrukturen an der 5 LO und der mPGES 1 untersucht. Die erste Leitstruktur entstammt aus den Arbeiten von Waltenberger et al. und besitzt im Grundgerüst eine Sulfonamidstruktur. In dieser Arbeit ist es gelungen, durch eine gezielte Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehungen, die Leitstruktur I an der 5 LO und der mPGES-1 in ihrer Potenz zu optimieren. Die Leitstruktur (IC50: 5-LO (zellfrei) = 5.7 µM, IC50: 5 LO (PMNL) = 3.7 µM, IC50: mPGES-1 = 4.5 µM) konnte durch Variation in allen drei Positionen modifiziert werden, so dass die optimierte Struktur 170 (IC50: 5-LO (zellfrei) = 2.3 µM, IC50: 5-LO (PMNL) = 0.4 µM, IC50: mPGES-1 = 0.7 µM) entstanden ist. Für die Verbindung 170 wurden die pharmakokinetischen Eigenschaften, wie Löslichkeit und metabolische Stabilität, sowie der Wirkmechanismus auf molekularer Ebene bestimmt. Ebenso konnte für Verbindung 170 auch in vivo anti-entzündliche Eigenschaften festgestellt werden.
Die zweite Leitstruktur stammt ebenfalls aus den Arbeiten von Waltenberger et al. und besitzt im Grundgerüst eine Mercaptobenzothiazol-Grundstruktur. Aufgrund der Ähnlichkeit zu den bekannten Pirinixinsäurederivaten wurde auch hier für die Untersuchung der Struktur-Wirkungs-Beziehungen zunächst eine Kettenverlängerung an der Alkylkette vorgenommen. Es ließ sich auch hier durch eine gezielte SAR, die Leitstruktur bis hin zum submikromolaren Bereich in Verbindung 219 optimieren. Gleichzeitig ist es gelungen in Verbindung 219 einer der am potentesten dual ausgeglichensten dualen 5 LO/mPGES-1 Inhibitoren zu identifizieren.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in dieser Arbeit es gelungen ist durch gezielte Untersuchungen der Struktur-Wirkungs-Beziehungen zwei verschiedene Substanzklassen zu dualen 5-LO/mPGES-1 Inhibitoren zu optimieren. Ebenso konnte für Substanz 170 auch in vivo anti-entzündliche Eigenschaften festgestellt werden. Diese Arbeit soll dazu beitragen, das therapeutische Potential von dualen 5-LO/mPGES-1 Inhibitoren als anti-entzündliche Wirkstoffe in Zukunft besser einschätzen zu können.
Die chemischen und physikalischen Eigenschaften eines Festkörpers sind vom inneren Aufbau des Festkörpers abhängig. Die Methode der Wahl zur Bestimmung von Kristallstrukturen sind Beugungsexperimente. Fehlordnungen in den Kristallstrukturen werden mit Beugungsexperimenten häufig nur unzureichend ausgewertet oder ignoriert. In dieser Arbeit wurden die (möglichen) Stapelfehlordnungen der Aminosäuren DL-Norleucin und DL-Methionin, sowie von Chloro (phthalocyaninato)aluminium(III) untersucht. Dazu wurden Gitterenergieminimierungen mit Kraftfeld- und quantenchemischen Methoden an einem Satz geordneter Modellstrukturen durchgeführt.
In den Kristallstrukturen der α- und β-Phasen von DL-Norleucin ordnen sich die Moleküle in Doppelschichten an und bilden jeweils eine Schichtstruktur mit unterschiedlicher Stapelsequenz. Röntgenbeugungsexperimente an Kristallen dieser Verbindung zeigen charakteristische diffuse Streuung. Die durchgeführten Gitterenergieminimierungen reproduzieren die experimentelle Stabilitätenreihenfolge der beiden Polymorphe von DL-Norleucin. Die berechneten Gitterenergien zeigen, dass es für DL-Norleucin bevorzugte Stapelsequenzen gibt. Die Gitterenergien und Molekülstrukturen einer einzelnen Doppelschicht sind dabei von der Anordnung benachbarter Doppelschichten abhängig. Zudem wurden Strukturmodelle mit Stapelsequenzen aufgebaut, die aus kristallographischer Sicht möglich sind, jedoch experimentell nicht beobachtet wurden, und deren Gitterenergie berechnet. Diese Stapelsequenzen liefern im Vergleich zu den energetisch günstigsten Stapelsequenzen einen signifikanten Energieverlust und treten daher selten auf. Ausgehend von den Ergebnissen der Gitterenergieminimierungen mit DFT-D-Methoden wurden Stapelwahrscheinlichkeiten mit Hilfe der Boltzmann-Statistik berechnet. Es wurde ein großes geordnetes Modell mit einer Stapelsequenz gemäß der Stapelwahrscheinlichkeiten aufgebaut. Dieses Modell wurde verwendet, um Beugungsexperimente zu simulieren und mit experimentellen Daten zu vergleichen. Die theoretischen und experimentellen Beugungsdaten waren in guter Übereinstimmung.
Die Moleküle in den Kristallstrukturen der α- und β-Phasen von DL-Methionin bilden Doppelschichten. Die beiden Phasen unterscheiden sich in der Stapelung der Doppelschichten und der Molekülkonformation. Es wurden Gitterenergieminimierungen sowohl mit Kraftfeld-Methoden als auch mit DFT-DMethoden an geordneten Modellen mit unterschiedlichen Stapelsequenzendurchgeführt. Die experimentell bestimmte Stabilitätenreihenfolge der Polymorphe von DL-Methionin bei tiefen Temperaturen wurde durch die Ergebnisse der kraftfeldbasierten Rechnungen reproduziert. Die Modellstrukturen wurden während den Rechnungen moderat verzerrt. Die Bandbreite der relativen Energien aller Modelle ist relativ gering, sodass eine Stapelfehlordnung aus thermodynamischer Sicht nicht ausgeschlossen werden kann. In der Regel liefern Gitterenergieminimierungen mit DFT-D Methoden genauere Ergebnisse. Die Modellstrukturen wurden während den Rechnungen nur leicht verzerrt. Allerdings unterscheidet sich das Energieranking zwischen den Kraftfeld- und DFT-D-Methoden deutlich. Die experimentell bestimmte Stabilitätenreihenfolge der Polymorphe von DL-Methionin wurde mit DFT-D-Methoden nicht reproduziert. Die Energieunterschiede zwischen den beiden Polymorphen (ΔE = 1,60 kJ∙mol−1 (DFT-D2) bzw. ΔE = 0,83 kJ∙mol−1 (DFT-D3)) sind relativ gering und liegen im Fehlerbereich der Methode. Die Bandbreite der relativen Energien aller Strukturmodelle beträgt nur etwa 1,8 kJ∙mol−1. Auf dieser Grundlage ist eine Stapelfehlordnung in den Kristallstrukturen von DL-Methionin möglich, jedoch nicht experimentell beobachtet. Nicht nur die Kraftfeld-,sondern auch die DFT-D-Methoden scheinen für die Berechnung der Gitterenergien für das System DL-Methionin nicht genügend genau zu sein. Die erhaltenen relativen Energien sollten daher mit Vorsicht betrachtet werden.
Chloro(phthalocyaninato)aluminium(III) (AlPcCl) bildet eine Schichtstruktur, in der sich die Moleküle zu Doppelschichten zusammenlagern. Die 1984 durchgeführte Kristallstrukturbestimmung [98] lieferte auf Grund der schlechten Datenqualität nur eine ungenaue Kristallstruktur. Die asymmetrische Einheit enthält zwei Moleküle, von denen das eine Molekül geordnet, das andere fehlgeordnet ist. Die Kristallstruktur von AlPcCl ist fehlgeordnet, weil eine einzelne Doppelschicht von Molekülen eine tetragonale P4/n-Symmetrie aufweist, die vier symmetrieäquivalente Möglichkeiten bietet, eine zweite Doppelschicht auf einer ersten Doppelschicht zu platzieren. Mit Hilfe der OD-Theorie wurde ein Satz geordneter Modelle mit verschiedenen Stapelsequenzen aufgestellt und die Gitterenergie zunächst mit Kraftfeld-Methoden und anschließend mit DFT-DMethoden berechnet. Auf Grund unzureichender Parametrisierung, musste das Kraftfeld an das System AlPcCl angepasst werden. Die Modellstrukturen werden während den Kraftfeld-Rechnungen nur leicht verzerrt. Die berechneten Gitterenergien hängen allerdings stark von der verwendeten Parametrisierung und den Atomladungen ab und sollten daher mit Vorsicht betrachtet werden. Genauere Ergebnisse erzielten Gitterenergieminimierungen mit DFT-D-Methoden. Die verschiedenen Stapelsequenzen haben eine ähnliche Energie, was die Stapelfehlordnung in der Kristallstruktur von AlPcCl erklärt. Die Überlagerung der vier energetisch günstigsten geordneten Stapelsequenzen führt zu einer gemittelten Struktur, die sehr gut die fehlgeordnete experimentelle Kristallstruktur von AlPcCl erklärt.