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Molecular dynamics (MD) simulation serves as an important and widely used computational tool to study molecular systems at an atomic resolution. No experimental technique is capable of generating a complete description of the dynamical structure of the biomolecules in their native solution environment. MD simulations allow us to study the dynamics and structure of the system and, moreover, helps in the interpretation of experimental observations. MD simulation was first introduced and applied by Alder and Wainwright in 1957 \cite{Alder57}. However, the first MD simulation of a macromolecule of biological interest was published 28 years ago \cite{McCammon77}. The simulation was concerned with the bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI) protein, which has served as the hydrogen molecule'' of protein dynamics because of its small size, high stability, and relatively accurate X-ray structure available in 1977 \cite{Deisenhofer75}. This method is now widely used to tackle larger and more complex biological systems \cite{Groot01,Roux02} and has been facilitated by the development of fast and efficient methods for treating the long-range electrostatic interactions \cite{Essmann95}, the availability of faster parallel computers, and the continuous development of empirical molecular mechanical force fields \cite{Langley98,Cheatham99,Foloppe00}. It took several years until the first MD simulations of nucleic acid systems were performed \cite{Levitt83,Tidor83,Prabhakaran83,Nilsson86}. These investigations, which were also performed in vacuo, clearly demonstrated the importance of proper handling of electrostatics in a highly charged nucleic acid system, and different approaches, such as reduction of the phosphate charges and addition of hydrated counterions, have been applied to remedy this shortcoming and to maintain stable DNA structures. A few years later, the first MD simulation of a DNA molecule, including explicit water molecules and counterions was published \cite{Seibel85}. Various MD simulations on fully solvated RNA molecules with explicit inclusion of mobile ions indicated the importance of proper treatment of the environment of highly charged nucleic acids \cite{Lee95,Zichi95,Auffinger97,Auffinger99}. Given the central roles of RNA in the life of cells, it is important to understand the mechanism by which RNA forms three dimensional structures endowed with properties such as catalysis, ligand binding, and recognition of proteins. Furthermore, the increasing awareness of the essential role of RNA in controlling viral replication and in bacterial protein synthesis emphazises the potential of ribonucleicacids as targets for developing new antibacterial and new antiviral drugs. Driven by fruitful collaborations in the Sonderforschungsbereich RNA-Ligand interactions" the model RNA systems in this study include various RNA tetraloops and HIV-1 TAR RNA. For the latter system, the binding sites of heteroaromatic compounds have been studied employing automated docking calculations \cite{Goodsell90}. The results show that it is possible to use this tool to dock small rigid ligands to an RNA molecule, while large and flexible molecules are clearly problematic. The main part of this work is focused on MD simulations of RNA tetraloops.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde eine wirksame synthetische und spektroskopische Methode entwickelt, um Abstände in DNA- und RNA-Duplexen mittels Elektronen-Paramagnetische-Resonanz (EPR) zu messen und um in Zukunft die dreidimensionale Struktur biologisch relevanter RNAs bestimmen zu können. Die Synthese von iodierten Nukleotid-Bausteinen für die Oligonukleotidsynthese, an denen mit Hilfe der Palladium katalysierten Sonogashira-Kreuzkupplung sich EPR-aktive Nitroxid-Acetylene einführen lassen, wurde erfolgreich durchgeführt. Diese Phosphoramidite sollten die folgenden Kriterien erfüllen: Alle vier Basen (A, C, G und U) sollten modifiziert werden und das eingeführte Spinlabel 2,2,5,5- Tetramethyl-3-ethinyl-pyrrolin-N-oxyl (TPA) sollte entweder in die minor oder die major groove hineinragen. Im Falle der Pyrimidine (U und C) war nur die Orientierung in die major groove möglich, da das Iodid nur am C5 eingeführt werden kann. Obwohl 5-Iodo-desoxyuridin- und 5-Iodo-uridin-phosphoramidit käuflich sind, wurden diese Bausteine selber hergestellt, wobei die iodierten Bausteine mit hohen Ausbeuten erhalten wurden. Die Synthese von 5-Iodo-cytidin erfolgte aus Cytidin, insbesondere durch die Iodierung mit Iod, Iodsäure in Essigsäure und Tetrachlorkohlenstoff. Die einzige Möglichkeit, dass das Nitroxid eine Orientierung innerhalb der minor groove annimmt, war die Derivatisierung am C2 der Purine. Der Austausch von Iodo gegen eine Aminofunktion für Guanosin war wegen des Verschwindens einer potentiellen Wasserstoffbrücke ungünstig, im Gegensatz zu Adenosin. Die Synthese von 2-Iodo-adenosin-phosphoramidit wurde durchgeführt, wobei die Amino-Gruppe am C2 eines modifizierten Guanosins durch Iod mittels einer radikalischen Reaktion mit Iod, Iodmethan und Kupferiodid substituiert wurde. Die Synthese von 7-Deaza-adenosin (7-Iodo-tubercidin) und von 7-Deaza-guanosin wurde durch eine Lewissäure katalysierte Vorbrüggen-Glykosylierung zwischen der geschützen Nukleobase und der acetylierten Ribofuranose erzielt. Die Iodierung erfolgte für das geschützte Tubercidin mit N-Iodsuccinimid, während sie für Guanosin trotz zahlreicher Versuche leider scheiterte. Da natürlich vorkommende DNA und RNA nicht paramagnetisch sind, müssen sie durch die Einführung eines Spinlabels EPR-fähig gemacht werden. Dafür wurde das Spinlabel TPA ausgewählt, da es sich mit einer hohen Stabilität und Starrheit auszeichnet. Dafür wurde zuerst die Palladium(II) katalysierte Sonogashira-Kupplung in DNA-Strängen wärend der Oligonukleotidsynthese für 5-Iodo-desoxy-uridin optimiert: Sehr reine Proben mit einem oder zwei Spinlabels in einem Strang konnten hergestellt werden. Diese Methode wurde anschließend erfolgreich auf RNA mit geringfügigen Änderungen für U, C und A übertragen, um die Ausbeute der Kupplung zu verbessern. Die benutzte Chemie hat sich als entscheidend erwiesen, da es zu berücksichtigen gilt, wie sich die Reagenzien, die bei der RNA-Festphasensynthese eingesetzt werden, auf das Spinlabel auswirken. Es wurde festgestellt, dass die Oxidationsstufe des klassischen TBDMS-Festphasenzyklus mit Iod, Pyridin und Wasser für die Reduktion eines beträchtlichen Teils des Nitroxids verantwortlich ist, insbesondere im Falle von 2-Iodo-adenosin. Deshalb wurde beschlossen, die patentierte ACE-Chemie zu verwenden, in der das Phosphor-Atom während des Festphasenzyklus mit tert-Butylperoxid in Toluol oxidiert wird. Die Synthese der geeigneten Bausteine wurde hierfür durchgeführt, 5-Iodo-uridin-phosphoramidit ist bei Dharmacon kommerziell erhältlich. Leider scheiterte die Synthese von 7-Iodo-tubercidin-phosphoramidit auf der Stufe der Einführung des Orthoesters. Auf diese Weise wurden sehr reine doppelgelabelte DNA und RNA Duplexe erhalten, deren Stabilität durch UV-Spektroskopie überprüft wurde. Der Unterschied in den Tm-Werten überstieg nicht 3,2°C für DNA und 5,1°C für RNA im Vergleich zu den unmodifizierten Duplexen. CD-Spektren wurden ebenso aufgenommen und zeigten, dass die B- bzw. A-Form erhalten blieb. In Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis Prisner wurden die Abstände zwischen den zwei Nitroxiden in den synthetisierten fünf DNA- und sechs RNA-Duplexen mit Puls-Elektron-Doppel-Resonanz (PELDOR) gemessen. Diese experimentellen Werte wurden mit den theoretischen Werten verglichen, die mit Molecular Dynamics Simulationen erhalten wurden (Arbeitskreis Stock). Die mit beiden Methoden erhaltenen Ergebnisse stimmen überein. Erfolgreich wurde auch die Synthese von reinen spingelabelten biologisch relevanten RNAs wie TAR-RNA, der vier-Wege Kreuzung IIIa,b,c des Hepatitis C Virus und dem U4-U6 Komplex des Spleißosoms im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt. Die größte synthetisierte RNA betrug 65 Nukleobasen. Leider konnten wegen zu hoher Flexibilität oder nicht richtiger Faltung der RNA keine definierten Abstände gefunden werden.
The following thesis is concerned with the elucidation of structural changes of RNA molecules during the time course of dynamic processes that are commonly denoted as folding reactions. In contrast to the field of protein folding, the concept of RNA folding comprises not only folding reactions itself but also refolding- or conformational switching- and assembly processes (see chapter III). The method in this thesis to monitor these diverse processes is high resolution liquid-state NMR spectroscopy. To understand the reactions is of considerable interest, because most biological active RNA molecules function by changing their conformation. This can be either an intrinsic property of their respective sequence or may happen in response to a cellular signal such as small molecular ligand binding (like in the aptamer and riboswitch case), protein or metal binding. The first part of the thesis (chapters II & III) provides a general overview over the field of RNA structure and RNA folding. The two chapters aim at introducing the reader into the current status of research in the field. Chapters II is structured such that primary structure is first described then secondary and tertiary structure elements of RNA structure. A special emphasis is given to bistable RNA systems that are functionally important and represent models to understand fundamental questions of RNA conformational switching. RNA folding in vitro as well as in vivo situations is discussed in Chapter III. The following chapters IV and V also belong to the introduction part and review critically the NMR methods that were used to understand the nature and the dynamics of the conformational/structural transitions in RNA. A general overview of NMR methods quantifying dynamics of biomolecules is provided in chapter IV. A detailed discussion of solvent exchange rates and time-resolved NMR, as the two major techniques used, follows. In the final chapter V of the first part the NMR parameters used in structure calculation and structure calculation itself are conferred. The second part of the thesis, which is the cumulative part, encompasses the conducted original work. Chapter VI reviews the general NMR techniques applied and explains their applicability in the field of RNA structural and biochemical studies in several model cases. Chapter VII describes the achievement of a complete resonance assignment of an RNA model molecule (14mer cUUCGg tetral-loop RNA) and introduces a new technique to assign quaternary carbon resonances of the nucleobases. Furthermore, it reports on a conformational analysis of the sugar backbone in this RNA hairpin molecule in conjunction with a parameterization of 1J scalar couplings. Achievements: • Establishment of two new NMR pulse-sequences facilitating the assignment of quaternary carbons in RNA nucleobases • First complete (99.5%) NMR resonance assignment of an RNA molecule (14mer) including 1H, 13C, 15N, 31P resonances • Description of RNA backbone conformation by a complete set of NMR parameters • Description of the backbone conformational dependence in RNA of new NMR parameters (1J scalar couplings) Chapters VII & VIII summarize the real-NMR studies that were conducted to elucidate the conformational switching events of several RNA systems. Chapter VIII gives an overview on the experiments that were accomplished on three different bistable RNAs. These molecules where chosen to be good model systems for RNA refolding reactions and so consequently served as reporters of conformational switching events of RNA secondary structure elements. Achievements: • First kinetic studies of RNA refolding reactions with atomic resolution by NMR • Application of [new] RT-NMR techniques either regarding the photolytic initiation of the reaction or regarding the readout of the reaction • Discovery of different RNA refolding mechanisms for different RNA molecules Deciphering of a general rule for RNA refolding methodology to conformational switching processes of RNA tertiary structure elements. The models for these processes were a) the guanine-dependent riboswitch RNA and b) the minimal hammerhead ribozyme. Achievements: • NMR spectroscopic assignment of imino-resonances of the hypoxanthine bound guanine-dependent riboswitch RNA • Application of RT-NMR techniques to monitor the ligand induced conformational switch of the aptamer domain of the guanine-dependent riboswitch RNA at atomic resolution • Translation of kinetic information into structural information • Deciphering a folding mechanism for the guanine riboswitch aptamer domain • Application of RT-NMR techniques to monitor the reaction of the catalytically active mHHR RNA at atomic resolution In the appendices the new NMR pulse-sequences and the experimental parameters are described, which are not explicitly treated in the respective manuscripts.
Das Ziel des adaptiven Entwurfs von Substanzbibliotheken ist es, die vollständige biologische Testung einer molekularen Screeningbibliothek zu vermeiden. Stattdessen erfolgt, geleitet durch Optimierungsalgorithmen, eine "intelligente" Navigation durch den chemischen Raum, um so bevorzugt Substanzen mit gewünschten Eigenschaften auszuwählen. In einer retrospektiven Studie wurden die Optimierungsalgorithmen "Zufallssuche", "Simulated Annealing", "Evolutionsstrategie" und "Partikelschwarmoptimierung" im Hinblick auf den Entwurf von Bibliotheken von Serinproteaseinhibitoren systematischen verglichen. Die Gesamtzahl verfügbarer Substanztestungen wurde auf 300 beschränkt, um Laborbedingungen zu simulieren. Als Ergebnis zeigten sich besonders die Evolutionsstrategien für einen Einsatz in einer Niedrigdurchsatzscreening-Kampagne geeignet, da diese effizient mit großen Populationen und wenigen Iterationen arbeiteten. Der zweite Teil dieser Arbeit beschreibt den erfolgreichen Entwurf einer fokussierten Bibliothek von RNA-Liganden. In einer hybriden, prospektiven Optimierungsstudie wurden nach dem Vorbild einer iterativen Niedrigdurchsatzscreening-Kampagne vom Computer vorgeschlagene Moleküle im Labor getestet. Die Substanzen wurden auf Inhibition einer spezifischen molekularen Wechselwirkung im Replikationszyklus von HIV getestet (Tat-TAR-Interaktion). In vier Generationen wurden 9 von 170 untersuchten Verbindungen positiv auf Inhibition der Tat-TAR-Interaktion getestet (Trefferquote: 5,3%), wobei lediglich 0,089% der Verbindungen der Screeningbibliothek untersucht wurden. Die zwei potentesten Kandidaten wiesen einen IC50 von 51 uM bzw. 116 uM auf.
This thesis describes the structural characterization of interactions between biological relevant ribonucleic acid biomacromolecules (RNAs) and selected ligands to optimize the methodologies for the design of pharmacological lead compounds. To achieve this aim, not only the structures of the RNA, the ligand and their complexes need to be known, but also information about the inherent dynamics, especially of the target RNA, are necessary. To determine the structure and dynamics of these molecules and their complexes, liquid state nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) is a suitable and powerful method. The necessity for these investigations arises from the lack of knowledge in RNA-ligand interactions, e.g. for the development of new medicinal drugs targeting crucial RNA sequences. In the first chapters of this thesis (Chapters II to IV), an introduction into RNA research is given with a focus on RNA structural features (Chapter II), into the interacting molecules, the biology of the specific RNA targets and the further development of their ligands (Chapter III) and into the NMR theory and methodologies used within this thesis (Chapter IV). Chapter II begins with a description of RNA characteristics and functions, placing the focus on the increasing attention that these biomacromolecules have attracted in recent years due to their diverse biological functionalities. This is followed by a detailed description of general structural features of RNA molecules. The biological functions of the RNAs investigated in this thesis (Human immunodeficiency virus PSI- and TAR-RNA and Coxsackievirus B3 Stemloop D in the 5’-cloverleaf element), together with their known structural characteristics are introduced in Chapter III. Furthermore, a description of the investigated ligands is given, focusing on the methods how their affinity and specificity were determined. The introduction is completed in Chapter IV, where the relevant NMR theory and methodologies are explained. First, kinetics and thermodynamics of ligand binding are summarized from an NMR point of view. Subsequently, a detailed description of the resonance assignment procedures for RNAs and peptidic ligands is given. This procedure mainly concentrates on the assignment of the proton resonances, which are essential for the later structure calculation from NMR restraints. The procedure for NMR structure calculation of RNA and its complexes follows with a short introduction into the programs ARIA and HADDOCK. The final part of this chapter explains the relaxation theory and the methodology to extract dynamic information from autocorrelated relaxation rates via the model-free formalism. In the Chapters V to VII of this thesis, the original publications are included and grouped into three topics. Chapter V comprehends the publications on the investigations of HIV PSI-RNA and its hexapeptidic ligand. These three publications[1-3] focus on the characterization of the ligand and its binding properties, its structure and the optimization of its composition aiming to improve its usage for further spectroscopic investigations.
We present here a set of 13C-direct detected NMR experiments to facilitate the resonance assignment of RNA oligonucleotides. Three experiments have been developed: (1) the (H)CC-TOCSY-experiment utilizing a virtual decoupling scheme to assign the intraresidual ribose 13C-spins, (2) the (H)CPC-experiment that correlates each phosphorus with the C40 nuclei of adjacent nucleotides via J(C,P) couplings and (3) the (H)CPC-CCH-TOCSY-experiment that correlates the phosphorus nuclei with the respective C10,H10 ribose signals. The experiments were applied to two RNA hairpin structures. The current set of 13C-direct detected experiments allows direct and unambiguous assignment of the majority of the hetero nuclei and the identification of the individual ribose moieties following their sequential assignment. Thus, 13C-direct detected NMR methods constitute useful complements to the conventional 1H-detected approach for the resonance assignment of oligonucleotides that is often hindered by the limited chemical shift dispersion. The developed methods can also be applied to large deuterated RNAs. Keywords: NMR spectroscopy , Direct carbon , detection , RNA
Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen an GXG Modellpeptiden konnten eindeutig zeigen, dass diese Peptide, auch ohne das Vorhandensein von langreichweitigen Wechselwirkungen, bestimmte Sekundärstrukturen präferieren. Ein Teil der beobachteten, auftretenden Strukturmotive lässt sich hierbei über den sterischen Anspruch der Seitenkette erklären, ein anderer Teil über die Ladung der Seitenkette. In Kombination mit anderen Spektroskopischen Methoden konnten zehn dieser Peptide genauestens untersucht werden. Hierbei zeigte sich, dass diese Peptide nicht nur die favorisierten Regionen des Ramachandran-Diagramms besetzen. Ein Vergleich mit dem Vorkommen bestimmter Aminosäuren, beispielsweise in loop Regionen von Proteinen, zeigt dass die Sequenz dieser loops nicht zufällig ist. Tatsächlich besitzt ein Teil der Aminosäuren, die besonders häufig an bestimmten loop Positionen vorkommen, bereits die intrinsische Vorliebe, die notwendige Konformation einzunehmen. Diese Aminosäuren und die umgebenden loops sind somit eventuell nicht nur das simple Verbindungsglied zwischen zwei Sekundärstrukturen, sondern kommen selbst als Ausgangspunkte für Peptid- bzw. Proteinfaltung in Frage.
Ein weiteres Augenmerk der Arbeit lag auf der Messung von skalaren und dipolaren Kopplungen an isotopenmarkierter RNA. Es wurden vier Pulssequenzen entwickelt, die es ermöglichen, 1J skalare bzw. dipolare Kopplungen in der Zuckerregion von 13C- markierter RNA mit hoher Präzision zu messen. Die entwickelten J-modulierten Experimente ermöglichen die Messung von 1J(H2’C2’), 1J(C1’C2’) sowie 1J(C2’C3’) Kopplungen selbst für größere RNA Moleküle. Die Detektion erfolgt hierbei auf den C1’H1’ Signalen, die Zuordnung der Kerne, deren Kopplung gemessen wird, ist nicht einmal erforderlich. Die Anwendbarkeit konnte für verschiedene Systeme mit 14 bis 70 Nukleotiden demonstriert werden. Die erreichte Präzision ermöglichte es außerdem auch sehr kleine Effekte, wie beispielsweise die Ausrichtung von RNA im Magnetfeld zu detektieren.
Diese Arbeit zeigt außerdem zwei Beispiele für die gezielte Modifikation, um Lanthanid Bindungsstellen einführen zu können. Auf chemischen und biochemischen Weg konnte isotopenmarkierte, in vitro transkribierte RNA modifiziert werden. Die Ergebnisse zeigen eindeutig eine Bindung von Lanthanid-Ionen an die modifizierte RNA. Die auftretenden, eher kleinen Effekte, sind vermutlich auf die noch zu hohe Flexibilität der eingeführten Modifikationen. Vor allem bei der chemischen Modifikation besteht hier noch Potential zur Optimierung, nachdem die generelle Anwendbarkeit der Methode demonstriert wurde.
Der letzte Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Analyse von Kopplungsmustern zur Analyse und zum Vergleichen von Naturstoffen. Hier konnten aus einer Reihe von Derivaten eindeutig die identifiziert werden, die verglichen mit der Ausgangsstruktur, die gleiche Konformation besitzen. Die gewonnenen Ergebnisse decken sich hier mit durchgeführten biologischen Tests, die ebenfalls dasselbe Derivat als aktiv identifizieren konnten, was klar für eine Struktur-Aktivitäts-Beziehung spricht.
In der vorliegenden Arbeit werden Methoden und Anwendungen gezeigt, um skalare und dipolare Kopplungen im Bereich von Peptiden, Nukleinsäuren und kleinen Molekülen zu nutzen. Die durchgeführten Arbeiten reichen dabei von der speziellen Probenpräparation zur Messung von dipolaren Kopplungen bis hin zur Entwicklung neuer NMR-spektroskopischer Methoden zur Messung von Kopplungen mit höherer Präzision und an größeren Systemen als bisher.
Nach der Entdeckung und strukturellen Aufklärung des Ribosoms war bekannt, dass neben den Proteinen auch regulatorische RNA Sequenzen für die Steuerung biologischer Prozesse im Organismus verantwortlich sind. Dazu zählt unter anderem das trans-activation responsive element (TAR) aus HIV-1, welches am terminalen 5' Bereich (1-59) aller HIV-1 mRNAs eine identische bulge-loop Struktur ausbildet. Die basale Trans-kription des integrierten HIV Promotors ist in Abwesenheit des viralen trans-activator of transcription (Tat) sehr gering (und abhängig von zellulären Transkriptionsfaktoren). Sobald Tat exprimiert wird, bindet es zusammen mit dem humanen positive trancription elongation factor b (p-TEFb) spezifisch an TAR und aktiviert die Transkriptionsrate des viralen Genoms und die Bildung von volllängen Transkripten drastisch. Die Notwendigkeit der Tat-vermittelten Aktivierung als Grundlage einer funktionierenden HIV Replikation macht dieses System zu einem hoch interessanten Target für eine antivirale HIV Therapie. Basierend auf der Hemmung des Tat/TAR Komplexes wurde in den vergangen Jahren eine Reihe von Verbindungen identifiziert, die zwar in-vitro eine inhibierende Wirkung zeigten, aber keine von ihnen konnte bis jetzt als Therapeutikum Verwendung finden. So wäre die noch ausstehende Entdeckung eines effizienten Tat Antagonisten, der ohne die zelleigene Transkription zu beeinträchtigen eine Reduzierung der Virusreplikation von 80 - 90 % akut infizierter Zellen bewirkt, ein bedeutender Durchbruch in der HIV Forschung. Durch eine längere Behandlung von chronisch infizierten Zellen könnte so die Transkription des viralen Genoms abgeschaltet und dadurch eine Eliminierung latenter HIV Reservoirs ermöglichen werden.
Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung neuartiger TAR Liganden, zunächst auf Grundlage eines nicht auf Strukturmodellen beruhenden Ligandenscreenings, gefolgt von einem strukturbasierten Ligandendesign. Bei der Suche nach potentiellen Wirkstoffen, beschränkte man die Auswahl der untersuchten Verbindungen auf Guanidin- und Amidinanaloga. Dazu zählten einfache Guanidinderivate mit unterschiedlichen aromatischen Resten sowie heterocyclische Verbindungen, wie Isochinoline, Chinazoline, Perimidine und Phenanthridine. Die Bindungsaffinitäten dieser Wirkstoffkandidaten in Bezug zu TAR wurden über einen FRET Assay nach Matsumoto[1] bestimmt. Eine Auswahl an Verbindungen wurde zudem über eine NMR Titration charakterisiert (AK Schwalbe). Dadurch konnte beobachtet werden, an welcher Position die Liganden mit der TAR RNA in Wechselwirkung treten. Bei diesen Untersuchungen zählten 1,7-
Diaminochinolin (IC50 = 150 µM), 2,4,6-Triaminochinazolin (IC50 = 40 µM) sowie 6,8-Diaminophenanthridin (IC50 = 15 µM) zu den aktivsten Verbindungen.
Um eine Aussage über die Bindungsposen treffen zu können, wurde mittels HF-docking Methoden die Komplexgeometrie energetisch optimiert. Ausgehend von diesen Bindungsmodellen entwickelte man eine Leitstruktur, die als Grundlage eines strukturbasierten Ligandendesigns diente. Im Fokus stand hierbei die Entwicklung einer GC-Basenpaar erkennenden Untereinheit. Mit 3,5-Diamino-9-methyl-3,4,9,10-tetrahydro-1H-pyrrolo[3,4-b]phenanthridin-8(2H)-on (IC50 = 45 µM) konnte ein Ligand identifiziert werden, der im NMR Titrationsexperiment ausschließlich am Basenpaar G26/C39 von TAR eine Verschiebung der Iminoprotonen induzierte. In einem weiteren Projekt versuchte man eine Selektivitätssteigerung durch simultane Adressierung zweier Bindungsstellen zu erreichen. Nachdem im NMR Experiment gezeigt werden konnte, dass 2,4,6-Triaminochinazolin mit hoher Affinität an zwei verschiedenen Bereichen der RNA bindet, wurden eine Reihe dimerer 2,4,6-Triaminochinazolinderivate mit unterschiedlich langen Linkern hergestellt. Mit diesem Ansatz gelang es den hoch affinen Liganden N6,N6'-(1,4-phenylenbis(methylen))bis(chinazolin-2,4,6-triamin) (IC50 = 150 nM) zu identifizieren.
The full-length translation-regulating add adenine riboswitch (Asw) from Vibrio vulnificus has a more complex conformational space than its isolated aptamer domain. In addition to the predicted apo (apoA) and holo conformation that feature the conserved three-way junctional purine riboswitch aptamer, it adopts a second apo (apoB) conformation with a fundamentally different secondary structure. Here, we characterized the ligand-dependent conformational dynamics of the full-length add Asw by NMR and by single-molecule FRET (smFRET) spectroscopy. Both methods revealed an adenine-induced secondary structure switch from the apoB-form to the apoA-form that involves no tertiary structural interactions between aptamer and expression platform. This strongly suggests that the add Asw triggers translation by capturing the apoA-form secondary structure in the holo state. Intriguingly, NMR indicated a homogenous, docked aptamer kissing loop fold for apoA and holo, while smFRET showed persistent aptamer kissing loop docking dynamics between comparably stable, undocked and docked substates of the apoA and the holo conformation. Unraveling the folding of large junctional riboswitches thus requires the integration of complementary solution structural techniques such as NMR and smFRET.
In bacteria, the regulation of gene expression by cis-acting transcriptional riboswitches located in the 5'-untranslated regions of messenger RNA requires the temporal synchronization of RNA synthesis and ligand binding-dependent conformational refolding. Ligand binding to the aptamer domain of the riboswitch induces premature termination of the mRNA synthesis of ligand-associated genes due to the coupled formation of 3'-structural elements acting as terminators. To date, there has been no high resolution structural description of the concerted process of synthesis and ligand-induced restructuring of the regulatory RNA element. Here, we show that for the guanine-sensing xpt-pbuX riboswitch from Bacillus subtilis, the conformation of the full-length transcripts is static: it exclusively populates the functional off-state but cannot switch to the on-state, regardless of the presence or absence of ligand. We show that only the combined matching of transcription rates and ligand binding enables transcription intermediates to undergo ligand-dependent conformational refolding.
The combination of high-throughput sequencing and in vivo crosslinking approaches leads to the progressive uncovering of the complex interdependence between cellular transcriptome and proteome. Yet, the molecular determinants governing interactions in protein-RNA networks are not well understood. Here we investigated the relationship between the structure of an RNA and its ability to interact with proteins. Analysing in silico, in vitro and in vivo experiments, we find that the amount of double-stranded regions in an RNA correlates with the number of protein contacts. This relationship —which we call structure-driven protein interactivity— allows classification of RNA types, plays a role in gene regulation and could have implications for the formation of phase-separated ribonucleoprotein assemblies. We validate our hypothesis by showing that a highly structured RNA can rearrange the composition of a protein aggregate. We report that the tendency of proteins to phase-separate is reduced by interactions with specific RNAs.
NMR spectroscopy is a potent method for the structural and biophysical characterization of RNAs. The application of NMR spectroscopy is restricted in RNA size and most often requires isotope‐labeled or even selectively labeled RNAs. Additionally, new NMR pulse sequences, such as the heteronuclear‐detected NMR experiments, are introduced. We herein provide detailed protocols for the preparation of isotope‐labeled RNA for NMR spectroscopy via in vitro transcription. This protocol covers all steps, from the preparation of DNA template to the transcription of milligram RNA quantities. Moreover, we present a protocol for a chemo‐enzymatic approach to introduce a single modified nucleotide at any position of any RNA. Regarding NMR methodology, we share protocols for the implementation of a suite of heteronuclear‐detected NMR experiments including 13C‐detected experiments for ribose assignment and amino groups, the CN‐spin filter heteronuclear single quantum coherence (HSQC) for imino groups and the 15N‐detected band‐selective excitation short transient transverse‐relaxation‐optimized spectroscopy (BEST‐TROSY) experiment.
Basic Protocol 1: Preparation of isotope‐labeled RNA samples with in vitro transcription using T7 RNAP, DEAE chromatography, and RP‐HPLC purification
Alternate Protocol 1: Purification of isotope‐labeled RNA from in vitro transcription with preparative PAGE
Alternate Protocol 2: Purification of isotope‐labeled RNA samples from in vitro transcription via centrifugal concentration
Support Protocol 1: Preparation of DNA template from plasmid
Support Protocol 2: Preparation of PCR DNA as template
Support Protocol 3: Preparation of T7 RNA Polymerase (T7 RNAP)
Support Protocol 4: Preparation of yeast inorganic pyrophosphatase (YIPP)
Basic Protocol 2: Preparation of site‐specific labeled RNAs using a chemo‐enzymatic synthesis
Support Protocol 5: Synthesis of modified nucleoside 3′,5′‐bisphosphates
Support Protocol 6: Preparation of T4 RNA Ligase 2
Support Protocol 7: Setup of NMR spectrometer for heteronuclear‐detected NMR experiments
Support Protocol 8: IPAP and DIPAP for homonuclear decoupling
Basic Protocol 3: 13C‐detected 3D (H)CC‐TOCSY, (H)CPC, and (H)CPC‐CCH‐TOCSY experiments for ribose assignment
Basic Protocol 4: 13C‐detected 2D CN‐spin filter HSQC experiment
Basic Protocol 5: 13C‐detected C(N)H‐HDQC experiment for the detection of amino groups
Support Protocol 9: 13C‐detected CN‐HSQC experiment for amino groups
Basic Protocol 6: 13C‐detected “amino”‐NOESY experiment
Basic Protocol 7: 15N‐detected BEST‐TROSY experiment
We present the rapid biophysical characterization of six previously reported putative G‐quadruplex‐forming RNAs from the 5′‐untranslated region (5′‐UTR) of silvestrol‐sensitive transcripts for investigation of their secondary structures. By NMR and CD spectroscopic analysis, we found that only a single sequence—[AGG]2[CGG]2C—folds into a single well‐defined G‐quadruplex structure. Sequences with longer poly‐G strands form unspecific aggregates, whereas CGG‐repeat‐containing sequences exhibit a temperature‐dependent equilibrium between a hairpin and a G‐quadruplex structure. The applied experimental strategy is fast and provides robust readout for G‐quadruplex‐forming capacities of RNA oligomers.
This cumulative thesis discusses the development of optimized force field parameters for Magnesium and resulting improved simulations of Magnesium-RNA interactions, including the in silico exploration of binding sites. This thesis is based on four publications as well as unpublished data. A fifth publication that was written during the time of the Ph.D. is discussed in the Appendix. This publication analyzes monovalent ion-specific effects at mica surfaces.
Nucleic acids in general and RNA in particular are fundamental to life itself. Especially in the folding and function of RNA, metal cations are crucial to screen the negatively charged nucleic acid backbones to allow for complex functional structures. They stabilize the tertiary structure of RNA and even drive its folding. Furthermore, similarly to proteins, RNAs can catalyze multiple reactions, rather than consisting of the 20 amino acids of a protein, RNA constitues of only four different building blocks. Metal cations play an important role here as additional cofactors. One essential ion is Magnesium (Mg2+), commonly referred to as the most important cofactor for nucleic acids. Mg2+ carries two positive charges. Its comparably small size and high charge result in a high charge density that has strong polarizing effects on its surroundings. Furthermore, Mg2+ forms a sharply defined first hydration shell with an integer number of coordinating water molecules. As a result, an exclusion zone exists around the ion within which no water molecules are observed. Moreover, Mg2+ displays a high solvation free energy and a low exchange rate of waters from its first hydration shell. Finally, it contains a strong preference towards oxygens . Together, this makes Mg2+ a particularly well suited interaction partner for the charged non-bridging phosphate oxygens on nucleic acid backbones and explains its crucial biological role.
The immense number of physiological and technological functions and applications indicates the significant scientific attention Mg2+ received. In experimental studies, however, severe difficulties arise for multiple reasons: Mg2+ is spectroscopically silent and cannot be detected directly by resonance techniques like NMR or EPR. Indirect observation is possible, either by detecting changes in the overall RNA structure with and without bound Mg2+, or by replacing the Mg2+ ion with another spectroscopically visible ion. In the latter, however, it cannot be guaranteed that the altered ion does not also alter the interaction site or even the whole structure. Another detection method is X-ray crystallography, but here challenges arise from Mg2+ being almost indistinguish- able from other ions as well as from water if not for very high resolutions and precise stereochemical considerations.
Alternatively, molecular dynamics (MD) simulations can be performed, with the power of adding atomistic insight to the interplay of metal cations and nucleic acids. MD simulations, however, are only as accurate as their underlying interaction models and the development of accurate models for the description of Mg2+ faces challenges especially in describing three properties:
(i) Polarizability. Commonly used simple models like the 12-6 type Lennard-Jones model typically fail to reproduce simultaneously thermodynamic and structural properties of a single ion in water. Alternative strategies include the use of a 12-6-4 type Lennard-Jones potential as proposed by Li and Merz, where the additional r−4 term explicitly accounts for polarization effects. The resulting Lennard-Jones potential is thereby more attractive and more long-ranged than for typical models of the 12-6 type.
(ii) Kinetics. Most Mg2+ models either fully ignore considerations about the timescales on which water exchanges from the first hydration shell of the ion or use inappropriate methodology to calculate the underlying kinetics. A realistic characterization of the involved timescales is imperative to be able to describe a seemingly simple process like the transition from inner-to-outer sphere binding and vice versa. This transition governs most biochemical reactions involving Mg2+ and therefore subsequent processes can only by as fast as the transition itself. However, already the previous step – the exchange of a water from the first hydration shell of the ion – is described my current Mg2+ models up to four orders of magnitude too slowly, which makes the observation of such events on the timescale of a typical simulation difficult or even impossible. Alln ́er et al. [48] as well as Lemkul and MacKerell explicitly considered the exchange rate into their parameter optimization procedure. To compute the rate, both studies applied Transition State Theory along a single reaction coordinate – the distance towards one of the exchanging waters. However, it could be shown that the water exchange from the first hydration shell requires at least the consideration of both exchanging water molecules in order to be able to realistically record the underlying rate using Transition State Theory. Furthermore, the model of Alln ́er et al. significantly underestimates the free energy of solvation of the ion.
(iii) Interactions between Mg2+ and nucleic acids. Typically, ionic force field parame- terization concentrates on the optimization of solution properties. The trans- ferability of these solution optimized parameters towards interactions with biomolecules, however, often fails.