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In the crystal of the title compound [systematic name: 2-(3,5-diamino-6-chloropyrazin-2-ylcarbonyl)guanidinium chloride methanol disolvate], C6H9ClN7O+·Cl-·2CH3OH , the components are connected by N—H ... N, N—H ... Cl, N—H ... O, O—H ... Cl and O—H ... O hydrogen bonds into a three-dimensional network. The dihedral angle between the aromatic ring and the guanidine residue is 6.0 (2)°.
The title compound (also know as azorellanone), C20H32O2, is built up from three fused carbocycles, one five-membered ring and two six-membered rings. The five membered-ring has an envelope conformation, whereas the six-membered rings have a distorted half-chair and a twist–boat conformation. In the crystal, molecules are linked by O—H ... O interactions into zigzag chains with graph-set notation C(8) along [010]. The absolute configuration was assigned on the basis of earlier chemical studies.
The title compound, C15H14N2O4, has a trans–gauche [O/C/C/C–O/C/C/C] (TG) conformation. The angle between the planes of aromatic rings is 76.4 (3)°. The crystal structure is stabilized by van der Waals interactions and C—H ... O hydrogen bonds. The crystal used was a non-merohedral twin with a fractional contribution of the minor component of 0.443 (5).
17-Acetoxymulinic acid
(2010)
The title compound, [systematic name: 5a-acetoxymethyl-3-isopropyl-8-methyl-1,2,3,3a,4,5,5a,6,7,10,10a,10b-dodecahydro-7,10-endo-epidioxycyclohepta[e]indene-3a-carboxylic acid], C22H32O6 (I), is closely related to methyl 5a-acetoxymethyl-3-isopropyl-8-methyl-1,2,3,3a,4,5,5a,6,7,10,10a,10b-dodecahydro-7,10-endo-epidioxycyclohepta[e]indene-3a-carboxylate, (II) [Brito et al., (2008 [triangle]). Acta Cryst. E64, o1209]. There are two molecules in the asymmetric unit, which are linked by two strong intramolecular O—H ... O hydrogen bonds with graph-set motif R 2 2(8). In both (I) and (II), the conformation of the three fused rings are almost identical. The five-membered ring has an envelope conformation, the six-membered ring has a chair conformation and the seven-membered ring has a boat conformation. The most obvious differences between the two compounds is the observed disorder of the acetoxymethyl fragments in both molecules of the asymmetric unit of (I). This disorder is not observed in (II). The crystal structure and the molecular conformation is stabilized by intermolecular C—H ... O hydrogen bonds. The ability to form hydrogen bonds is different in the two compounds. The crystal studied was a non-merohedral twin, the ratio of the twin components being 0.28 (1):0.72 (1)
In the title compound, C11H11N3O2, the dihedral angle between the central ethanone fragment and the 4-methoxyphenyl group is 2.9 (2)°, while that between the ethanone fragment and the triazole ring is 83.4 (2)°. The dihedral angle between the planes of the triazole and benzene rings is 81.7 (1)°. The 4-methoxyphenyl group is cis with respect to the ethanone fragment O atom across the exocyclic C—C bond. In the crystal, molecules are linked by C—H ... N interactions into C(9) chains along [001].
The title compound, C8H11FN5 +·Cl-, crystallized with a monoprotonated 1-(4-fluorophenyl)biguanidinium cation and a chloride anion in the asymmetric unit. The biguanidium group is not planar [dihedral angle between the two CN3 groups = 52.0 (1)°] and is rotated with respect to the phenyl group [tau = 54.3 (3)°]. In the crystal, N—H ... N hydrogen-bonded centrosymmetric dimers are connected into ribbons, which are further stabilized by N—H ... Cl interactions, forming a three-dimensional hydrogen-bonded network.
In the title compound, C4H7N3O·C2H6OS, creatinine [2-amino-1-methyl-1H-imidazol-4(5H)one] exists in the amine form. The ring is planar (r.m.s. deviation for all non-H atoms = 0.017 Å). In the crystal, two creatinine molecules form centrosymmetric hydrogen-bonded dimers linked by pairs of N—H[cdots, three dots, centered]N hydrogen bonds. In addition, creatinine is linked to a dimethyl sulfoxide molecule by an N—H[cdots, three dots, centered]O interaction. The packing shows layers parallel to (120).
The title compound. C15H14N2O4, (I), has a gauche–gauche (O/C/C/C—O/C/C/C or GG) conformation and is a positional isomer of propane-1,3-diyl bis(pyridine-3-carboxylate), (II). The molecule of (I) lies on a twofold rotation axis, which passes through the central C atom of the aliphatic chain, giving one half-molecule per asymmetric unit. There is excellent agreement of the geometric parameters of (I) and (II). The most obvious differences between them are the O/C/C/C—O/C/C/C torsion angles [56.6 (2)° in (I) and 174.0 (3)/70.2 (3)° in (II) for GG and TG conformations, respectively] and the dihedral angle between the planes of the aromatic rings [80.3 (10)° in (I) and 76.5 (3)° in (II)]. The crystal structure is stabilized by weak C—H ... N and C—H ... O hydrogen bonding.
Erkrankungen des hämatopoietischen Systems treten oft als Folge balancierter chromosomaler Translokationen auf. Dabei ist das MLL Gen auf Chromosom 11 Bande q23 in zahlreiche reziproke chromosomale Translokationen involviert. Alle diese Veränderungen sind entweder mit einer akuten myeloischen oder lymphatischen Leukämie assoziiert. Translokationen mit Beteiligung des MLL Gens - mit Ausnahme der Translokation t(9;11) - werden aufgrund ihrer schlechten Therapierbarkeit und schlechten Prognose als Hochrisiko- Leukämien eingestuft. Das häufigste Partnergen ist das AF4 Gen (42% aller MLL Translokationen) auf Chromosom 4 Bande q21. Die daraus resultierende Translokation t(4;11) ist mit einer akuten lymphatischen Leukämie (pro-B ALL) assoziiert und tritt gehäuft bei Säuglingen und Kleinkindern auf. Das Resultat der Translokation t(4;11) ist letztendlich die Entstehung zweier reziproker Derivatchromosomen, die die beiden Fusionsgene MLL•AF4 und AF4•MLL kodieren. Welcher Mechanismus die Entstehung der Leukämie hervorruft, konnte bis heute nicht ausreichend geklärt werden. Basierend auf den Daten anderer MLLassoziierter Translokationen, dass ausschließlich das Derivat 11 Fusionsprotein onkogene Effekte vermittelt, wurde das Fusionsprotein MLL•AF4 intensiv erforscht. Erst Ende 2008 gelang es einer amerikanischen Arbeitsgruppe in einem Mll•AF4 knock-in Mausmodell den Krankheitsphänotyp einer AML bzw. einer prä-B ALL auszulösen. Allerdings exprimieren 80% aller t(4;11)-Patienten auch das reziproke AF4•MLL Fusionstranskript und die restlichen 20% tragen komplexe Aberrationen zwischen MLL, AF4 und einem dritten oder sogar einem vierten Partnergen. Deshalb befassen sich die Studien unserer Arbeitsgruppe hauptsächlich mit dem reziproken AF4•MLL Fusionsprotein. Die Ergebnisse dieser Studien zeigen, dass das AF4•MLL Fusionsprotein in den Zellen akkumuliert und dadurch onkogene Ereignisse auslöst, welche letztendlich in der Wachstumstransformation der Zellen resultieren. Aufgrund dieser Daten war davon auszugehen, dass das AF4•MLL Fusionsprotein ebenfalls einen entscheidenden Beitrag bei der Entstehung der Leukämie leistet. Um das leukämogene Potential der beiden Fusionsproteine MLL•AF4 und AF4•MLL in einem Mausmodell weiter zu untersuchen, wurde zunächst ein retrovirales Transduktionssystem in BA/F3-Zellen etabliert. Dabei wurden BA/F3-Zellen sowohl einzeln mit MLL•AF4 oder AF4•MLL als auch mit beiden Fusionsgenen der Translokation t(4;11) cotransduziert. Nachdem die Funktionalität der beiden Expressionskassetten, durch full-length Integration und durch Transkription erfolgreich nachgewiesen werden konnte, erfolgten erste Transduktions-/Transplantationsexperimente in Mäusen. Dafür wurden Lin-/Sca-1+ aufgereinigte Knochenmarkzellen mit retroviralen Überständen von MLL•AF4 und AF4•MLL einzeln- als auch co-transduziert. Mäuse denen MLL•AF4- oder Mock-transduzierte Lin-/Sca-1+-Zellen transplantiert wurden, entwickelten über einen Beobachtungszeitraum von 13 Monaten keinerlei Anzeichen einer leukämischen Erkrankung. Im Gegensatz dazu resultierte die Transplantation von AF4•MLLoder co-transduzierten Lin-/Sca-1+-Zellen in der Entwicklung einer leukämischen Erkrankung innerhalb von 7 Monaten. Anhand pathologischer Parameter, sowie durch histochemische, molekulare als auch durchflusszytometrische Analysen konnten drei verschiedene Immunophänotypen identifiziert werden. Die Expression des Fusionsproteins AF4•MLL resultierte in der Ausprägung des Phänotyps einer pro-B ALL oder einer B/T biphänotypischen akuten Leukämie (B/T BAL). In Anwesenheit beider Fusionsproteine der Translokation t(4;11) entwickelte sich ebenfalls eine B/T BAL oder einer Mixed Lineage Leukemia (MLL). Retransplantationsexperimente mit den primären leukämischen Blasten zeigten, dass die drei verschiedenen Krankheitsphänotypen stabil transplantierbar sind, wobei sich die Latenzzeit erheblich verkürzte. Damit wurde zum ersten Mal der Beweis erbracht, dass das Fusionsprotein AF4•MLL auch allein ohne die Gegenwart des Fusionsproteins MLL•AF4 in der Lage ist eine leukämische Erkrankung auszulösen. Aufgrund dieser Daten, vorausgehenden Studien unserer Arbeitsgruppe sowie den Studien zum Fusionsprotein MLL•AF4 ist davon auszugehen, dass der pathomolekulare Mechanismus der Translokation t(4;11) auf zwei Onkoproteinen basiert.
Acute myeloid/lymphoid leukemia is a fatal hematological malignancy characterized by accumulation of nonfunctional, immature blasts, which interferes with the production of normal blood cells. Activating mutations of receptor tyrosine kinases are common genetic lesions in leukemia. FLT3-ITD is a frequent activating mutation found in AML patients, leading to uncontrolled proliferation of leukemic blasts. FLT3-ITD directly activates STAT5, leading to the induction of STAT5 target gene expression like PIM kinases and SOCS genes. STAT5 and PIM kinases have been shown to play a crucial role in the FLT3-ITD mediated transformation. On the other hand, the role of SOCS proteins in FLT3-ITD mediated transformation has not been studied to date. SOCS proteins are part of a negative feedback mechanism that controls Jak kinases downstream of cytokine receptors. One of the SOCS family members, SOCS1 has been reported to suppress oncogenecity of several activating kinases implicated in hematologic malignancies. In this thesis the role of these SOCS proteins in FLT3-ITD mediated transformation (in vitro) and leukemogenesis (in vivo) is systematically explored. Expression of FLT3-ITD in cell lines of myeloid (32D) and lymphoid (Ba/F3) origin, led to CIS, SOCS1 and SOCS2 expression. FLT3-ITD expression in primary murine bone marrow stem/progenitor cells led to a 59 fold induction of SOCS1 expression. Furthermore, FLT3-ITD positive AML cell lines (MV4-11, MOLM-13) show kinase dependent CIS, SOCS1, and SOCS3 expression. Importantly SOCS1 is highly expressed in AML patients with FLT3-ITD compared to healthy individuals. SOCS1 protein was expressed in FLT3-ITD transduced murine bone marrow stem cells and SOCS1 expression was abolished with kinase inhibition in MOLM-13 cell line. In conclusion, SOCS1 was highly regulated by FLT3-ITD in myeloid, lymphoid cell lines, in bone marrow stem/progenitors and in AML patient samples. SOCS1 co-expression did not affect FLT3-ITD mediated signaling and proliferation, but abolished IL-3 mediated proliferation and protected 32D cells from interferon-α and interferon-γ mediated growth inhibition. FLT3-ITD expressing 32D cells showed diminished STAT1 activation in response to interferons (α and γ). Alone, SOCS1 strongly inhibited cytokine induced colony formation of bone marrow stem and progenitors, but not FLT3-ITD induced colony formation. Most importantly, in the presence of growth inhibitory interferon-γ, SOCS1 co-expression with FLT3-ITD led to increased colony formation compared to FLT3-ITD alone. Taken together, FLT3-ITD induced and exogenously expressed SOCS1, shielded cells from external cytokines, signals, while not affecting FLT3-ITD induced proliferation/signaling. In further experiments the in vivo effects of SOCS1 were studied in a bone marrow transplantation model. SOCS1 bone marrow transplants were unable to engraft/proliferate in mice. FLT3-ITD was shown to induce a myeloproliferative disease. Both control (empty vector), SOCS1 transplanted mice were normal and did not show any disease phenotype. FLT3-ITD alone and SOCS1 co-expressing FLT3-ITD developed either myeloproliferative disease or acute lymphoblastic leukemia with equal distribution. SOCS1 co-expression with FLT3-ITD led to a decreased latency. Mice transplanted with FLT3-ITD alone and SOCS1 co-expressing FLT3-ITD displayed enlarged spleens, liver and hypercellular bone marrow indicating infiltration of leukemic cells. Mice were also anemic and showed decreased platelet counts. Importantly SOCS1 co-expression particularly shortened the latency of myeloproliferative disease but not of acute lymphoblastic leukemia. In summary, in the context of FLT3-ITD, SOCS1 acts as a ‘conditional oncogene’ and cooperates with FLT3-ITD in the development of myeloproliferative disease. With these data we propose the following model: FLT3-ITD induces SOCS gene expression, which shields cells against proliferation and differentiation signals from cytokines, while not affecting FLT3-ITD mediated proliferative signals. This leaves cells under the dictate of FLT3-ITD thereby contributing to leukemogenesis. Similar to FLT3-ITD, BCR/ABL (P190) (an oncogenic fusion kinase often found in acute lymphoblastic leukemia) induces SOCS gene expression in K562 and long-term cultured cells from patients with acute lymphoblastic leukemia. SOCS1 co-expression does not affect BCR/ABL mediated proliferation while abrogating IL-3 mediated proliferation. These findings suggest that SOCS proteins may play a general co-operative role in the context of oncogenes which aberrantly activate STAT3/5 independently of JAK kinases. This study reveals a novel molecular mechanism of FLT3-ITD mediated leukemogenesis and suggests SOCS genes as potential therapeutic targets.
Die Hämophile ist eine X-chromosomal vererbbare Blutungserkrankung, die durch einen funktionellen Mangel der Gerinnungsaktoren Faktor VIII oder Faktor IX im Fall der Hämo-philie A oder Hämophilie B hervorgerufen wird. Der niedrige therapeutische Schwellenwert in der Behandlung der Hämophilie (Faktorenspiegel >1%) macht diese Krankheit zu einem idealen Zielobjekt in der Gentherapie. Eine schwerwiegende Komplikation in der Behandlung der Hämophilen besteht in der Entwicklung von neutralisierenden Antikörpern gegen das the-rapeutisch substituierte Protein. Akute Blutungen in solchen Hemmkörper-Patienten werden derzeit durch FVIII- und FIX-unabhängigen Bypass-Agenzien kontrolliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde nach einer erfolgten Optimierung eines nicht-viralen Ansatzes zur Transgenex-pression von FIX in der Leber der Maus dieses Gentransfersystem dazu verwendet, um eine Entwicklung von neuen, auf FIX basierenden, FVIII-Bypass-Strategien in vivo zu ermöglichen. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden Plasmidvektoren und Vektorrückgrat-freie Minicircle-Konstrukte auf ihre Effizienz zur Expression des FIX-Transgens nach hydrodyna-misch basiertem Gentransfer in die Leber der Maus untersucht. Der Gentransfer der Mini-circle führte hierbei zu einer höheren Transgenexpression und einem geringeren Abfall der FIX-Antigen-Spiegel über die Zeit. Darüber hinaus war das FIX-Protein selbst bei den höchs-ten Expressionsleveln (700% des physiologischen Levels) völlig funktional aktiv. Der Abfall der Transgenexpression über die Zeit konnte größtenteils auf den Verlust des Vektors zurück-geführt werden. Ein signifikanter Silencing-Effekt konnte nur in den Plasmidvektor- und nicht in den Minicircle-behandelten Gruppen beobachtet werden. Diesbezüglich wurde nach 100 Tagen Persistenz der nicht-viralen Vektoren in der Mausleber eine signifikante Akkumulation an CpG-Methylierungen in regulatorischen Sequenzen des hAAT-Promoters im Plasmidvek-tor gegenüber den Minicirclen ermittelt. Außerdem konnte ebenfalls eine Demethylierung von Cytosin-Nukleotiden in bakteriellen Dcm-Sequenzmotiven über die Zeit beobachtet werden, die eine signifikant höhere Rate für das Minicircle-Konstrukt im hAAT-Promoter aufwies. Die erprobten nicht-viralen Vektoren versprechen somit eine ausreichende Effizienz, um eine Translation in den Menschen, z. B. über eine spezifische Behandlung von Lebersegmenten, möglich erscheinen zu lassen. Die Methylierungsanalyse von Promoterelementen auf Sequenzebene erbrachte zudem konkrete Ansätze zum Design von nicht-viralen Vektoren mit einer noch stabileren FIX-Expression. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde mit Hilfe eines Screening-Systems zur Aktivitätstestung von rekombinant exprimierten FIX-Varianten die Mutation K265T als die entscheidende Sub-stitution im 99-loop identifiziert, welche die FVIII-unabhängige Aktivität im FIX-Protein unter physiologischen Bedingungen begünstigt. Das Wildtyp- IX-Protein braucht hingegen FVIII um eine 106-fache Steigerung seiner proteolytischen Aktivität zu erreichen. Durch Kombination der Mutation K265T mit V181I und I383V konnte diese spezifische FVIII-Bypass-Aktivität in der resultierenden FIX-Variante (ITV) auf 15,6% (verglichen zu FIX in Anwesenheit von FVIII) gesteigert werden. Durch Inkubation der FIX-Varianten mit Plasma-proben aus Hemmkörper-Patienten konnte die Funktionalität der FIX-Varianten selbst in der Anwesenheit von inhibitorischen FVIII-Antikörpern demonstriert werden. Durch Untersu-chungen des Aktivierungszustands von FIX konnte zudem gezeigt werden, dass die im Rah-men dieser Arbeit generierten FIX-Varianten nicht voraktiviert sind und die messbare FVIII-Bypass-Aktivität FIX spezifisch ist. Darüber hinaus konnte hier erstmals eine hämostatische Effizienz von FIX-Varianten mit einer FVIII-unabhängigen Aktivität in einem relevanten Krankheitsmodel demonstriert werden. Diesbezüglich resultierte der nicht-virale Gentransfer der FIX-Varianten in FVIII-K.O.-Mäusen in einer dosisabhängigen Verkürzung der aPTT-basierenden Gerinnungszeit und in einer Reduktion des Blutverlustes im tail-clip-Assay in An- oder Abwesenheit von inhibitorischen FVIII-Antikörpern. Desweiteren konnte zudem mittels Vakzinierung von FIX-WT-tolerierten Mäusen mit den FIX-Varianten demonstriert werden, dass die hier eingeführten Mutationen keine hoch-immunogenen Epitope des FIX-Proteins betreffen. Schließlich konnte die Expression der FIX-Varianten in hämostatisch normalen Mäusen nicht mit der Entstehung von thromboembolischen Ereignissen selbst in einem intakten Gerinnungssystem assoziiert werden. Die hier beschriebenen FIX-Varianten könnten somit einen sicheren und effizienten Therapieansatz zur Behandlung der Hämophilie A mit inhibitorischen Antikörpern darstellen und hinsichtlich der Halbwertszeit und des möglichen throboembolischen Risikos zu einer wesentlichen Verbesserung der bereits verfügbaren Bypass-Strategien beitragen.
Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung lichtinduzierter Strukturänderungen verschiedener photoschaltbarer Moleküle durch zeitaufgelöste Infrarotspektroskopie. Hierzu war es notwendig, eine komplexe Messapparatur zu konzipieren, aufzubauen und zu optimieren. Das entwickelte Anreg-/Abtast-Experiment ermöglicht die Messung kleinster transienter Absorptionsänderungen (delta A<1E-5) im Spektralbereich von 1000 cm^-1 bis 2500 cm^-1 mit einer Zeitauflösung von etwa 0,3 ps. Es können Anregungspulse im Bereich von 258nm bis über 600nm generiert werden. Über ein computergesteuertes Wellenplättchen kann die Polarisation des Anregungslichtes während der Datenaufnahme variiert werden, was eine Auswertung hinsichtlich der molekularen Anisotropie ermöglicht. Die eingesetzten Probenzellen gestatten die Untersuchung geringster Probenmengen (V <20µL) bei Temperaturen bis zu 50°C. Nitrophenylacetat (NPA) wurde hinsichtlich seiner Photodecarboxylierungsreaktion untersucht. Für alle drei Konstitutionsisomere konnte nachgewiesen werden, dass die Freisetzung von CO2 innerhalb von 1 ns erfolgt. Es zeigen sich signifikante Unterschiede zwischen den Reaktionsverläufen der drei Konstitutionen, wobei die erhaltenen Amplituden der Photoproduktspektren mit den bekannten Decarboxylierungsquantenausbeuten korrelieren. Die globale Analyse ergibt einen multiexponentiellen Aufbau des CO2-Signals. Im Fall von meta- und para-NPA erfolgt die Abspaltung von CO2 über einen dominanten Zerfallskanal mit einer Zeitkonstante von t~200 ps. Quantenchemische Rechnungen legen nahe, dass dieser Hauptreaktionspfad über den Triplettzustand verläuft. Bei ortho- NPA wird dieser Zerfallskanal effektiv gequencht, was mit einer schnellen Deaktivierung des angeregten Singulettzustandes durch einen intramolekularen Protonentransfer erklärt wird. Nach diesen Messungen steht fest, dass meta-Nitrophenylacetat hervorragend als caged compound für CO2 geeignet ist. Die Primärdynamik von solubilisiertem Proteorhodopsin (PR) in D2O wurde im infraroten und sichtbaren Spektralbereich sowohl bei saurem als auch bei alkalischem pD-Wert untersucht. Dies erlaubt den direkten Vergleich der in beiden Spektralbereichen gemessenen Daten. Der primäre Protonenaktzeptor Asp97 liegt dabei entweder protoniert (pD=6,4) oder deprotoniert (pD=9,2) vor. Die transienten vis-Absorptionsspektren ergaben, wie bei PR in H2O, einen biexponentiellen Zerfall des angeregten Zustands und die gleichzeitige Bildung des PRK-Photoproduktes. Die Abweichung der bei PR in D2O ermittelten Werte von den publizierten Zeitkonstanten der H2O-Messung wird als kinetischer Isoptopeneffekt interpretiert. Dieser variiert mit dem pD-Wert, was auf Unterschiede der Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerke in der Retinalumgebung hinweist. Die Signaturen der transienten Infrarotspektren werden den C=C- und C=N-Moden des Retinals sowie der Amid I-Mode des Proteins zugeordnet. Es konnte ebenfalls die Bildung des PRK-Produktes nachgewiesen werden, wobei die Isomerisierungsquantenausbeute des Retinals unabhängig von der Protonierung von Asp97 ist. Die im IR bestimmten Zeitkonstanten sind dabei unabhängig vom pD-Wert und weichen von den im Sichtbaren ermittelten Werten ab. Dieser Befund wird mit dem Einfluss der molekularen Temperatur auf die transienten IR-Spektren und dem Auftreten von Kühlprozessen erklärt. Zusätzlich zum Wildtyp-Protein wurde die PR-D97N-Mutante als Modellsystem für PR im sauren pH-Bereich ebenfalls im vis- und IR-Bereich untersucht. Die dabei erzielten Ergebnisse stehen im Einklang mit den bisherigen Ausführungen. Der geringe kinetische Isotopeneffekt weist auf ein ähnliches Wasserstoffbrückennetzwerk wie beim Wildtyp unter sauren Bedingungen hin. Als letztes wurde ein synthetisches Modellcollagen untersucht. Die Seitenkettenverbrückung der Peptidsequenz mit einem Azobenzol-basierten, künstlichen Photoschalter sollte eine lichtinduzierte Entfaltung der Tertiärstruktur ermöglichen. Der isolierte Photoschalter und die gekoppelte Sequenz wurden zunächst unter Gleichgewichtsbedingungen sowohl im UV/vis- als auch im IR -Bereich umfangreich spektroskopisch charakterisiert. Diese Messdaten lagen zum großen Teil bereits vor und wurden in dieser Arbeit einer detaillierten Auswertung unterzogen. Für den isolierten Schalter konnte im IR-Bereich eine umfassende Bandenzuordnung erstellt werden. Dabei wird im photostationären Gleichgewicht eine reversible trans-> cis-Isomerisierung festgestellt, welche keine Temperaturabhängigkeit aufweist. Darüberhinaus wurden polarisationsabhängige, transiente IR-Spektren des isolierten Azoschalters für die trans->cis- und die cis->trans-Isomerisierungsrichtung aufgenommen. Die instantan auftretenden, markanten Differenzsignale können den Amid I- und Amid II-Moden der im Schalter enthaltenen Peptidbindungen sowie den Phenylmoden zugeordnet werden. Die extrahierten kinetischen Parameter sind für beide Isomere nahezu identisch, was durch einen dominanten Beitrag molekularer Kühlprozesse erklärt werden kann. Aufgrund der geringen Isomerisierungsquantenausbeute (< 10 %) können die Differenzspektren der photostationären Gleichgewichte nicht in den Produktspektren dieser Messungen reproduziert werden. Hinsichtlich der ermittelten Anisotropieparameter ergeben sich kleine Unterschiede zwischen beiden Datensätzen. Zusammen mit theoretischen Modellierungen werden diese in Zukunft genauere Aussagen über die Strukturen der Isomere erlauben. Die UV/vis-Absorptionsspektren des gekoppelten Systems zeigen, dass die Absorptionsbanden des Azoschalters durch die Kopplung an das Collagen nicht signifikant beeinflusst werden. Im IR-Absorptionsspektrum konnten wichtige Amid I-, Amid II- und Amid II0-Banden des Azoschalters und der Peptidsequenz sowie eine große Anzahl weiterer Banden zugeordnet werden. Temperaturabhängige Absolut- und Differenzspektren im UV/vis- und IR-Bereich zeigen eine irreversible thermische Denaturierung der Collagentripelhelix ab etwa 50°C. Das verwendete, deuterierte Lösungsmittelgemisch führt zu einem H/D-Austausch. Anhand der Amid II-Bande der in der tripelhelikalen Struktur geschützten Glycine kann die Existenz der Collagenstruktur und ihre Entfaltung nachgewiesen werden. Die Amplituden der photostationären Differenzspektren sind jedoch kleiner als beim isolierten Schalter, was auf eine verringerte Isomerisierungsquantenausbeute hinweist. Die bei Erwärmung beobachtete Vergrößerung der Differenzsignale wird mit einer effizienteren Isomerisierung nach dem Aufschmelzen der Tripelhelix erklärt. Für die trans->cis-Isomerisierungsrichtung wurden transiente IR-Spektren des Azocollagens bei unterschiedlichen Temperaturen aufgenommen. Alle instantan auftretenden Differenzsignale können auf die Schwingungsmoden des Azoschalters zurückgeführt werden. Bei einer Temperatur von 50°C lässt sich ein Einfluss der Peptidsequenz auf die transienten Spektren nicht nachweisen, was mit einer aufgeschmolzenen Tertiärstruktur im Einklang ist. Hingegen wird bei 20°C das Ausbleichen von Amid I-Schwingungsbanden der Peptidsequenz beobachtet, was eindeutig einen Energietransfer auf diese Moden zeigt. Bei 35°C sind die Bleichsignale des Collagens in diesem Bereich bereits deutlich abgeschwächt. Die transienten Spektren des isolierten Azoschalters besitzen keine derartige Temperaturabhängigkeit.
Um Materie mit Nanometergenauigkeit anzuordnen, ist Selbstorganisation die mächtigste Strategie. DNA (Desoxyribonukleinsäure) ist hierfür ein hervorragendes Baumaterial, da sie ein billiges, programmierbares, biokompatibles und gut verstandenes Polymer ist. Aus diesen Gründen ist DNA zur Basis für ein schnell wachsendes Gebiet geworden: die DNA-Nanotechnologie. Das Ziel dieser Arbeit war es, neue Interaktionsmöglichkeiten für die DNA-Nanotechnologie zu entwickeln und neuartige Strukturen aus DNA-minicircles aufzubauen, einem bislang vernachlässigten Konstruktionselement. ...
Die zellfreie Proteinsynthese hat sich in den letzten Jahren zu einem potenten Werkzeug – auch in der Produktion von Membranproteinen – entwickelt. Da keine lebenden Zellen genutzt werden, kann der Prozess der präparativen Membranproteinproduktion vereinfacht und individuell optimiert werden. Im Gegensatz zu konventionellen zellbasierten Expressionssystemen gewährleistet die zellfreie Proteinsynthese die direkte Zugänglichkeit zum Reaktionsort und damit die Möglichkeit der unmittelbaren Kontrolle. Dies ermöglicht eine genaue Anpassung der Reaktionsbedingungen auf das Zielprotein. Die Verbesserung und Entwicklung neuer Modi der zellfreien Membranproteinsynthese war ein Teil der vorliegenden Arbeit. Setzt man dem Zellfrei-System von Außen keine hydrophobe Umgebung zu, so präzipitiert das neu-synthetisierte Membranprotein im Reaktionsmix (P-CF). Interessanter Weise unterscheiden sich diese Präzipitate von den aus der E.coli zellbasierten Proteinproduktion bekannten Einschlußkörperchen, da sie sich teilweise leicht in mildem Detergenz resolubilisieren lassen. Zudem konnte für verschiedene Transportproteine, die aus Präzpitat resolubilisiert und danach in Liposomen rekonstituiert wurden, spezifische Transportaktivität gezeigt werden (z.B. eukaryotische Ionentransporter, Multi-Drug Resistenzproteine von E.coli). Alternativ können die Membranproteine direkt, durch die Zugabe von Detergenzien in den Reaktionsmix, solubilisiert werden (D-CF). Um die einzelnen Expressionsmodi zu optimieren wurden 24 gebräuchliche Detergenzien auf ihre Eigenschaft hin gestestet, strukturell sehr unterschiedliche Membranproteine zu solubilisieren. Die Familie der langkettigen Polyoxyethylen-alkyl Ether hat sich dabei als sehr geeignet erwiesen um das prokaryotische α-helikale Multi-Drug Resistenzprotein EmrE, den bakteriellen vornehmlich aus ß-sheets bestehenden Transporter Tsx und den eukaryotischen G-Protein gekoppelten Vasopressin Rezeptor V2R direkt im D-CF Modus zu solubilisieren. Zudem konnte eine Abhängigkeit der spezifischen Aktivität von Tsx vom verwendeten Expressionsmodus bzw. des verwendeten Detergenz mit Hilfe der Black Lipid Membrane´ Methode gezeigt werden. Die Expression eines repäsentativen Teils von 134 Zielproteinen des inneren Membranproteoms von E.coli wurde in drei verschiedenen Zellfrei-Expressionsmodi getestet. Ein an jedes Zielprotein des Membranroteoms C-terminal fusioniertes GFP diente der Konzentrationsbestimmung im D-CF Expressionsmodus. Die Faltung von GFP ist in Anwesenheit von Detergenz signifikant reduziert. Zunächst wurden alle Zielproteine in einem batch´ System im D-CF Modus im Mikrotiterplatten Maßstab mit Hilfe eines Roboters hergestellt. Die Etablierung einer robotergestützten Plattform, welche das Pipettieren, Inkubieren und Detektieren kombiniert, diente als Grundlage für den Herstellungsprozess des Membranroteoms von E.coli in einem Medium-Durchsatz Verfahren in batch´ Konfiguration. In dieser ersten Stufe des Screens im D-CF Modus konnten 84 Zielproteine (63%) aufgrund der detektierten GFP-Fluoreszens in Mengen von 1 bis 60μg pro mL Reaktion als erfolgreich produziert identifiziert werden. Zudem wurde das Membranproteom in dem effektiveren continous exchange (CE) Verfahren im P-CF, wie auch im D-CF Modus wiederholt exprimiert. Im Vergleich zur batch´ Konfiguration konnten im CE D-CF Modus deutlich mehr Zielproteine (75%) als positiv identifiziert werden. 16 Zielproteine wurden dabei bereits in Expressionsmengen von mehr als 100μg solubilisierte Membranproteinfusion pro mL Reaktionsmix gewonnen. 99 Zielproteine (74%) konnten als positiv identifiziert werden, nachdem die unlösliche Fraktion der CE P-CF Reaktion elektrophoretisch getrennt und angefärbt wurde. Für 66 Kandidaten (49%) stellt das produzierte Protein nach Coomassie-Färbung eine dominante Bande, und damit (semi-)präparative Proteinmengen, dar. Der Erhalt von Detergenz-solubilisierten Membranproteinproben von hoher Qualität ist ein wichtiger Schritt zur Gewinnung struktureller sowie biochemischer Daten. Das E.coli α-helikale Multi- Drug Resistenz Protein SugE konnte im CE P-CF Verfahren in präparativen Mengen von mehr als 2mg Protein pro mL des Reaktionsansatzes gewonnen werden. Durchgeführte analytische Größenausschlusschromatographie zeigte, dass der Transporter unter optimierten Reaktionsbedingungen in einem homogenen, schlanken Peak eluiert. Mittels elektronenmikroskopischer Gefrierbruchanalysen konnte eine effiziente und homogene Rekonstitution von SugE in E.coli Liposomen gezeigt werden. Bindungsstudien unter der Verwendung fluoreszensbasierter Anisotropie-Messungen haben gezeigt dass Proflavin – im Gegenteil zu Ethidium – ein Substrat von SugE ist. YedZ ist ein 24kDa leucinreiches Membranprotein mit sechs putativen Transmembransegmenten und enthält zwei Kofaktoren, ein Häm b und ein Flavin-mononukleotid (FMN). Im P-CF Modus exprimiertes YedZ kann effizient in den Detergenzien LMPG, LPPG, SDS und DPC resolubilisiert werden. Analytische Größenausschlusschromatographie zeigte einen symmetrischen Elutionspeak der apo-Form. Mittels CD-Spektroskopie des gereinigten apo-YedZ in 0.02% DDM wurde ein α-helikaler Sekundärstrukturanteil von 55% ermittelt. Zur Gewinnung von holo-YedZ wurde anstatt Hämb das chemisch verwandte Hemin eingesetzt. Die aufgenommenen UV/Vis Spektren der zellfrei produzierten holo-YedZ Proteinprobe in ihrer oxydierten und reduzierten Form, zeigen zu einer in vivo exprimierten Vergleichsprobe identische Absorptionsmaxima. Für sechs G-Protein gekoppelten Rezeptoren konnte die zellfreie Expression in präparativen Mengen gezeigt werden. Das Steroid-Derivat Digitonin, sowie einzelne Mitglieder der Detergenzfamilie der langkettigen Polyoxyethylen-alkyl Ether, wurden als am geeignetsten für die lösliche Expression der GPCRs im CE D-CF Verfahren ermittelt. Löslich in Anwesenheit von Brij78 produzierter GPCR Proben, zeigten nach Negativfärbung in elektronenmikroskopischen Einzelpartikelanalysen eine homogene Probenpräparation und geben Hinweis auf eine strukturelle Dimerisierug der Rezeptoren. Detergenzsolubilisierte Rezeptoren konnten in Liposomen, basierend auf E.coli Lipid-Mischungen, rekonstituiert werden. Elektronen-mikroskopische Gefrierbruchanalysen zeigten eine homogene Rekonstitution, welche auf eine funktionelle Faltung der Rezeptoren schließen lässt.
Die Röntgenstrukturanalyse ist eine der wichtigsten analytischen Methoden zur Bestimmung der Kristallstrukturen und zur Aufklärung von Struktur-Eigenschaftsbeziehungen. Voraussetzung für eine Röntgenstrukturanalyse ist ein Einkristall mit einer Größe von ca. 1-10 mikro m. Jedoch gibt es eine Vielzahl an Verbindungen, bei denen es aufgrund ihrer geringen Löslichkeit nicht gelingt, hinreichend große Kristalle zu erzeugen. In dieser Arbeit konnte aufgezeigt werden, dass die Kristallstrukturen solcher schwerlöslichen Verbindungen aus Röntgenpulverdaten bestimmt werden können. Organische Pigmente haben eine geringe Löslichkeit. Sie werden daher im Anwendungsmedium nicht gelöst, sondern fein dispergiert. Die Teilchengrößen liegen typischerweise im Bereich von 50-500 nm. Bedingt durch die Schwerlöslichkeit lassen sich nur selten Einkristalle züchten. Jedoch kann die Kristallinität häufig durch Lösungsmittelbehandlung verbessert werden. Dies ermöglicht die Strukturbestimmung aus den Röntgenpulverdaten. Die untersuchten organischen Pigmente haben allesamt ungewöhnliche Eigenschaften: So zeigen beispielsweise Pigment Yellow 101 und einige seiner Derivate sowie einige mesoionischen Pigmente Fluoreszenz im Festkörper. Die Fluoreszenz-Eigenschaften dieser Verbindungen waren bisher nur begrenzt verstanden. In dieser Arbeit konnten sieben Kristallstrukturen von festkörperfluoreszenten Pigmenten bestimmt und so ein Beitrag zum Verständnis der Festkörper-Fluoreszenz geleistet werden. Pigment Yellow 183 und Pigment Yellow 191 sind gelbe verlackte Azopigmente, die großtechnisch zur Einfärbung von Kunststoffen verwendet werden. Hier konnten erstmals Einkristalle erhalten werden, und drei Kristallstrukturen bestimmt werden. Alle drei Kristallstrukturen weisen ungewöhnliche Strukturmerkmale auf: eine der beiden Sulfonatgruppen koordiniert nicht an das Ca2+-Ion oder an ein Lösungsmittelmolekül, sondern bildet nur intermolekulare van der Waals-Wechselwirkungen. Wodurch elektrostatisch ungünstige Separation von Kation (Ca2+) und Anion (RSO3-) verursacht wird, bleibt unklar. Die Benzimidazolon-Pigmente sind industriell sehr wichtige Azo-Pigmente mit exzellenter Lichtstabilität und hervorragender thermischer Stabilität. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es erstmals, Einkristalle eines Solvates eines kommerziellen Benzimidazolon-Pigmentes zu züchten und die Struktur durch Röntgenstrukturanalyse zu bestimmen. Bei zwei weiteren kommerziellen Benzimidazolon-Pigmenten wurden die Kristallstrukturen aus Röntgenpulverdiagrammen bestimmt, wobei die Strukturlösung mit simulated-annealing-Methoden (Programm DASH) erfolgte. Das Pigment Yellow 213 ist ein neu entwickeltes Pigment für Wasserbasislacke, welches sich durch seine hohe Lichtechtheit auszeichnet. Mithilfe der Kristallstruktur konnten Eigenschaften dieser Verbindungen erklärt werden. Alle kommerziellen Azo-Pigmente liegen im Festkörper nicht in der Azoform, sondern in der hydrazon-tautomeren Form vor. Die Pigmente sind daher, streng genommen, keine Azo-Pigmente, sondern Hydrazon-Pigmente. Es gibt jedoch Ausnahmen: Für zwei p-dialkylamino-substitutierte Azopigmente auf beta-Naphthol-Basis konnte durch Einkristallstrukturanalysen aufgezeigt werden, dass die Azoform im Festkörper überwiegt. Es handelt sich hierbei also um den seltenen Fall „wirklicher Azo-Pigmente“. Die in dieser Arbeit untersuchten Verbindungen Bis-(acetoacetyl)-p-phenylen-diamin (DAEP) und 5-(Acetoacetylamino)benzimidazolon sind Vorprodukte für die Synthesen verschiedener industrieller Azo-Pigmente. Bei beiden Verbindungen gelang es, die Kristallstrukturen aus Röntgenpulverdiagrammen zu lösen. Die Orientierung der endständigen -COCH3-Gruppen lässt sich allerdings nicht mit Sicherheit feststellen (weil ein O-Atom fast die gleiche Streukraft besitzt wie eine CH3-Gruppe). Die Pulverstrukturlösungen wurden daher mit Gitterenergieberechnungen mittels dispersion-korrigierten Dichtefunktionalrechnungen kombiniert. Derartige dispersions-korrigierte DFT-Rechnungen im Festkörper könnten zukünftig auch in anderen Fällen zur Validierung von Kristallstrukturen, die aus Röntgenpulverdaten bestimmt wurden, dienen. Die Verbindungen Omeprazol, Rasagilin und Risedronat sind pharmazeutische Wirkstoffe. An verschiedenen Salzen dieser pharmazeutischen Wirkstoffe wurden Polymorphieuntersuchungen durchgeführt. Dabei wurden für Omeprazol vier, für Rasagilin eine und für Risedronat vier neue Phasen gefunden. Zudem konnten für Rasagilin und Omeprazol jeweils eine und für Risedronat drei Kristallstrukturen bestimmt werden, die es erlauben Eigenschaften wie außergewöhnliche Feuchtigkeitsbeständigkeit oder Bioverfügbarkeiten zu erklären. Für Risedronat wurde ein bisher unbekanntes Solvat gefunden (Essigsäure Disolvat), das patentiert wurde. Auch hier konnte die Kristallstruktur aufgeklärt werden. In dieser Arbeit wird aufzeigt, dass es bei schwerlöslichen Pigmenten, deren Vorprodukten sowie von pharmazeutischen Wirkstoffen in etlichen Fällen möglich ist, Einkristalle zu züchten (wenn auch mit großem Aufwand), sodass man die Kristallstrukturen durch Röntgenstrukturanalyse ermitteln kann. Für die Verbindungen, bei denen keine hinreichend großen Einkristalle erhalten werden konnten, gelang es in den meisten Fällen, die Kristallstrukturen aus Röntgenpulverdiagrammen zu bestimmen, und anschließend Struktur-Eigenschaftsbeziehungen abzuleiten.
In dieser Arbeit wurden Methoden entwickelt, mit denen das Auflösungsverhalten schwer wasserlöslicher schwacher Säuren verbessert werden kann. Als Modellwirkstoffe wurden drei Vertreter der Sulfonylharnstoff-Gruppe (Glibenclamid, Glipizid und Glimepirid) gewählt. Diese Wirkstoffe, werden zur oralen Standardtherapie des Typ 2 Diabetes eingesetzt. Die Ergebnisse aus den Löslichkeits- und Freisetzungsuntersuchungen der reinen Arzneistoffe bildeten in dieser Arbeit den Ausgangspunkt der Entwicklungsarbeit. Um den Einfluss der galenischen Methoden auf das Freisetzungsverhalten der entwickelten Formulierungen besser zu beurteilen, wurden ebenfalls entsprechende Handelspräparate (Euglucon N 3,5 mg, Luditec 5 mg und Amaryl 4 mg) untersucht. Zunächst wurden mit Glibenclamid und dem natürlichen ?-CD sowie verschieden Cyclodextrin-Derivaten (M-?-CD und HP-?-CD) binäre Komplexe im molaren Verhältnis von 1:2 (Glibenclamid:CD) hergestellt und charakterisiert. Anschließend wurden feste Lösungen aus Glibenclamid und Kollicoat(r) IR bzw. PVP K30 entwickelt. Bei den nachfolgenden Freisetzungsuntersuchungen zeichnete sich im Falle der binären Cyclodextrin-Komplexe ab, dass der Glibenclamid-HP-?-CD-Komplex das beste Freisetzungsverhalten von Glibenclamid in den untersuchten Medien erreichte. Bei den festen Lösungen von Glibenclamid gab es zwischen den beiden untersuchten Polymeren keine signifikanten Unterschiede im Ausmaß der Glibenclamidfreisetzung. Im nächsten Schritt wurden ternäre Komplexe (Glibenclamid-HP-?-CD-Polymer) entwickelt, eine Kombination aus binären CD- Komplexen und festen Lösungen. Als dritte Komponente wurden Kollicoat(r) IR, PVP K30 und PEG 6000 in unterschiedlichen Zusätzen, 5, 10 und 20% bezogen auf den zugrunde liegenden binären Glibenclamid-HP-?-CD-Komplex eingearbeitet. Die Charakterisierung der verschiedenen ternären Komplexe ergab, dass das beste Freisetzungsverhalten bei den Komplexen, welche einen 10%igen Kollicoat(r) IR- bzw. 20%igen PVP K30-Zusatz enthielten, generiert werden konnte. Bei den drei verwendeten Methoden (binäre-, ternäre Komplexe und feste Lösungen) erhielt man während der Freisetzungsuntersuchungen in den Medien mit einem pH-Wert unterhalb des pKs-Wertes von Glibenclamid (5,4) eine übersättigte Wirkstofflösung, was zum Teil innerhalb kürzester Zeit zum Präzipitieren des Wirkstoffes führte. Initiale DSC-Untersuchungen hatten gezeigt, dass Glibenclamid in den beschriebenen Präformulierungen in amorpher Form vorlag, was der Grund für die rasche Freisetzung war. Anschließend wurde versucht, das Präzipitieren zu verlangsamen und im besten Fall zu verhindern. Hierfür wurde HPMC in verschiedenen Formen verwendet. Das einfache Hinzumischen von HPMC in eine Gelatine-Kapsel zu der Glibenclamid-Formulierung führte aufgrund von Agglomeratbildungen zu einer deutlichen Verzögerung der Wirkstofffreisetzung. Pankreatin als Zusatz zum Freisetzungsmedium konnte die Bildung eines Agglomerates nicht verhindern, was darauf schließen ließ, dass dieses nicht durch sogenanntes "Cross-linking" der Gelatine entstanden war. In einem nächsten Schritt wurden HPMC-Kapseln eingesetzt. Die Glibenclamidfreisetzung konnte durch einfaches Austauschen der Gelatine-Kapseln gegen Vcaps(r) Plus-Kapseln in allen untersuchten Medien deutlich gesteigert werden, was auf die durch die Anwesenheit von HPMC verzögerte Präzipitation des Wirkstoffes im Freisetzungsmedium zurückzuführen war. Im nächsten Schritt wurde, die Formulierungsmethode von Glibenclamid, auf Glipizid übertragen. Es wurde analog zu Glibenclamid ein binärer Glipizid-HP-?-CD-Komplex im molaren Verhältnis von 1:2 (Glipizid:HP-?-CD) hergestellt. Dieser Komplex führte zu einer deutlichen Verbesserung des Auflösungsverhaltens von Glipizid, was zu einer annähernd 100%igen Wirkstofffreisetzung in allen untersuchten Medien führte. Weiterhin wurden die mit Glibenclamid entwickelten Methoden auch auf Glimepirid übertragen. Die Formulierung von Glimepirid zu einem binären Glimepirid-HP-?-CD-Komplex führte zu einer höheren Wirkstofffreisetzung, verglichen mit der kristallinen Reinsubstanz und des Handelspräparates. Durch die Verarbeitung von Glimepirid in ternären Komplexen erhöhte sich das Ausmaß der Wirkstofffreisetzung deutlich. Mit Kollicoat(r) IR konnte eine Wirkstofffreisetzung von ca. 60% der Dosis und mit PVP K30 als dritter Komponente sogar ca. 85% Wirkstofffreisetzung in Blank FeSSIF erzielt werden. Das Präzipitieren des Wirkstoffes nach initialer Wirkstofffreisetzung in Blank FeSSIF konnte durch den Einsatz von Vcaps(r) Plus-Kapseln deutlich reduziert werden. Stabilitätsuntersuchungen, welche mit den in dieser Arbeit verwendeten Präformulierungen durchgeführt wurden zeigten, dass der jeweilige Wirkstoff auch nach einem Jahr der Lagerung bei Raumtemperatur und < 30% rel. Luftfeuchte, in amorpher Form in den entsprechenden Präformulierungen vorlag. All diese Untersuchungen zeigten eindrucksvoll, dass sich Cyclodextrin-Derivate in Kombination mit hydrophilen Polymeren, dazu eigneten, die Verfügbarkeit schwer löslicher Wirkstoffe im Dünndarm für deren Resorption zu verbessern. Es wurde gezeigt, dass die Herstellungsmethodik der Cyclodextrin-Komplexe einen wesentlichen Einfluss auf die Wirkstofffreisetzung hatte.
G-protein coupled receptors (GPCRs) are the key players in signal perception and transduction and one of the currently most important class of drug targets. An example of high pharmacological relevance is the human endothelin (ET) system comprising two rhodopsin-like GPCRs, the endothelin A (ETA) and the endothelin B (ETB) receptor. Both receptors are major modulators in cardiovascular regulation and show striking diversities in biological responses affecting vasoconstriction and blood pressure regulation as well as many other physiological processes. Numerous disorders are associated with ET dysfunction and ET antagonism is considered an efficient treatment of diseases like heart failure, hypertension, diabetes, artherosclerosis and even cancer. This study exemplifies strategies and approaches for the preparative scale synthesis of GPCRs in individual cell-free (CF) systems based on E. coli, a newly emerging and promising technique for the production of even very difficult membrane proteins. The preparation of high quality samples in sufficient amounts is still a major bottleneck for the structural determination of the ET receptors. Heterologous overexpression has been a challenge now for decades but extensive studies with conventional cell-based systems had only limited success. A central milestone of this study was the development of efficient preparative scale expression protocols of the ETA receptor in qualities sufficient for structural analysis by using individual CF systems. Newly designed optimization strategies, the implementation of a variety of CF expression modes and the development of specific quality control assays finally resulted in the production of several milligrams of ETA receptor per one millilitre of reaction mixture. The versatility of CF expression was extensively used to modulate GPCR sample quality by modification of the solubilization environment with detergents and lipids in a variety of combinations at different stages of the production process. Downstream processing procedures of CF synthesized GPCRs were systematically optimized and sample properties were analysed with respect to homogeneity, protein stability and receptor ligand binding competence. Evaluation was accomplished by an array of complementary and specifically modified techniques. Depending on its hydrophobic environment, CF production of the ETA receptor resulted in non-aggregated, monodisperse forms with sufficient long-term stability and high degrees of secondary structure thermostability. The obtained results document the CF production of the ETA receptor in two different modes as an example of a class A GPCR in ligand-binding competent and non-aggregated form in quantities sufficient for structural approaches. The presented strategy could serve as basic guideline for the production of related receptors in similar systems.
Der L-Carnitin/gamma-Butyrobetain Antiporter CaiT ist ein Mitglied der Betain/Carnitin/Cholin Transporter (BCCT) Familie. Sekundärtransporter der BCCT Familie transportieren Substrate, die eine positiv-geladene quartäre Ammoniumgruppe besitzen. CaiT besteht aus 504 Amiosäuren und besitzt ein moleculares Gewicht von etwa 56 kDa. In Enterobakterien wie Escherichia coli, Proteus mirabilis und Salmonella typhimurium wird die Expression des caiTABCDE Operons unter anaeroben Bedingungen induziert. Unter diesen Bedinungen ist CaiT der Haupttransporter des Betain-Derivates L-Carnitin. In Enterobakterien wird L-Carnitin unter anaeroben Bedingungen aufgenommen und dehydratisiert wobei Crotonobetain ensteht. Crotonobetain wird anschließend zum Endprodukt gamma-Butyrobetain reduziert. Gamma-Butyrobetain ist das Gegensubstrat, das aus der Zelle hinaustransportiert wird, wenn L-Carnitin in die Zelle aufgenommen wird. Der Austauschmechanismus von LCarnitin gegen gamma-Butyrobetain geschieht ohne das Vorhandensein eines elektrochemischen Gradients, d.h. CaiT ist sowohl H+- als auch Na+-unabhängig. Ein Ziel dieser Arbeit war es die drei-dimensionale (3D) Struktur von CaiT mittels Röntgenstrukturanalyse zu lösen. Weiterhin sollten mit Hilfe der 3D-Struktur und funktionellen Studien detailiertere Erkenntnisse über den kationenunabhängigen Antiportmechanismus von CaiT ermittelt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die 3D-Röntgenkristallstrukturen von drei CaiT-Homologen der Enterobakterien P. mirabilis (PmCaiT), E. coli (EcCaiT) und S. typhimurium (StCaiT) mittels molekularem Ersatz (engl.: molecular replacement, MR) mit einem Alanin-Model des CaiT verwandten Na+/Glycinbetain Symporters BetP gelöst. PmCaiT konnte mit einer Auflösung von 2.3 Å gelöst werden. Das Protein kristallisierte in der Kristallraumgruppe H3, mit drei Molekülen in der asymmetrischen Einheit (engl.: asymmetric unit, AU). Die drei PmCaiT-Moleküle ordneten sich innerhalb der AU um eine kristallographische dreifach Symmetrieachse an. EcCaiT wurde mittels MR mit einem Alanin-Model von PmCaiT bei einer Auflösung von 3.5 Å gelöst. EcCaiT kristallisierte in der Kristallraumgruppe P32, ebenfalls mit drei Molekülen in der AU, jedoch ohne kristallographische Symmetry. Während der Verfeinerung des EcCaiT-Models wurde eine strenge dreifache nichtkristallographische Symmetry (engl.: non-crystallographic symmetry, NCS) angewandt. StCaiT, das ebenfalls mittels MR mit einem Alanin-Model von PmCaiT, aber bei einer Auflösung von 4.0 Å gelöst wurde, kristallisierte in der Kristallraumgruppe P65, ebenfalls mit drei StCaiT-Molekülen in der AU, ohne kristallographische Symmetry. Bei der Verfeinerung des StCaiT-Modells wurde wie bei EcCaiT eine strenge NCS angewandt. Da die Auflösung von 4.0 Å bei StCaiT zu niedrig ist um detailierte moleculare Erkenntnisse zu gewinnen, wurden Protein- sowie Substratinteraktionen nur an den Strukturen von PmCaiT und EcCaiT analysiert. Alle drei CaiT-Homologe weisen jedoch einen ähnlichen strukturellen Aufbau auf. In der Röntgenkristallstruktur bildet CaiT ein symmetrisches Trimer, das über ionische und polare Wechselwirkungen zwischen den Protomeren stabilisiert wird. Der trimere Oligomerisierungszustand von CaiT in Detergenzlösung sowie in zweidimensionalen Lipidmembrankristallen wurde bereits in früheren Arbeiten gezeigt. Jedes der drei CaiT-Protomere besteht aus zwölf Transmembranhelices (TMH), die N- und C-terminalen Domänen des Proteins befinden sich auf der cytoplasmatischen Seite. Zehn der TMH bilden zwei invertierte Wiederholungseinheiten aus jeweils fünf TMH. Die erste Einheit besteht aus den TMH 3 – 7, die invertierte zweite Einheit besteht aus den TMH 8 – 12. Beide Wiederholungseinheiten sind strukturell nahezu identisch und lassen sich fast vollständig übereinanderlegen, jedoch weisen die Aminosäuren der beiden Einheiten keine signifikante Sequenzidentität auf. Die ersten beiden Helices der Wiederholungseinheiten, die TMH 3 – 4 und die TMH 8 – 9, bilden ein antiparalleles vier-Helix-Bündel, in dem in CaiT zwei Substratbindestellen lokalisiert sind. Eine derartige Transporterarchitektur wurde erstmals in der Struktur des Na+/Alanin Symporters LeuTAa des thermophilen Bakteriums Aquifex aeolicus gezeigt. Bislang wurden, inklusive CaiT, sieben Sekundärtransporterstrukturen gelöst, die diese LeuT-Transporterarchitektur aufweisen. Ungewöhnlich dabei ist, dass diese sieben Sekundärtransporter fünf verschiedenen Transporterfamilien angehören und eine Verwandschaft auf Basis der Aminosäuren nicht zu finden ist. Da jedoch die tertiäre Struktur dieser Tansporter konserviert ist, kann davon ausgegangen werden, dass sie alle von einem Urprotein entstanden sind, welches zunächst aus fünf TMH bestanden haben muss. Im Laufe der Evolution hat sich das Urgen des Urproteins zunächst dupliziert und die weitere Evolution hat zwar die Aminosäuresequenz verändert und den Umweltbedingungen angepasst, jedoch ist die tertiäre Struktur erhalten geblieben. Da sich die tertiäre Struktur der sieben Sekundärtransporter so stark ähnelt, ist zu vermuten, dass auch der Transportmechanismus ähnlich, jedoch nicht identisch ist. Nach dem strukturellen Aufbau der Transporter, der Lage der Substratbindestellen in den jeweiligen Transportern und der Tatsache, dass es sich bei diesen Proteinen um Membranproteine handelt, wurde ein Transportmechanismus aufgestellt, in dem die Bindestelle des zu transportierende Substrats alternierend zu beiden Seiten der Membran zugänglich ist, ohne jedoch jemals den Substratweg innerhalb des Proteins vollständig zu öffnen. Dieser Mechanismus wurde als “alternating access mechanism” beschrieben. Anhand der unterschiedlichen Zustände, in denen einige der Transporter kristallisierten, kann abgeleitet werden, welche Konformationsänderungen erforderlich sind um das Substrat von einer Seiter der Membran auf die andere zu transportieren. Bisher kristallisierten einzelne der sechs Transporter in der nach außen gerichteten offenen Form, der nach außen gerichteten Form, in der die Substratbindestelle jedoch nicht mehr zugänglich ist, in einer Form, die keine Öffnungspräferenz der Substratbindestelle zu einer Seite der Membran hat und in der nach innen gerichteten Form, in der die Substratbindestelle jedoch nicht geöffnet ist. CaiT kristallisierte in der noch fehlenden Konformation, der nach innen gerichteten Form, in der die Substratbindestelle zugänglich ist. Mit dieser noch fehlenend Konformation kann der Transportzyklus des “alternating access mechanism” vollständig beschrieben werden. Alle drei CaiT-Homologe kristallisierten in der nach innen gerichteten, offenen Konformation. Im Gegensatz zur EcCaiT-Struktur kristallisierte PmCaiT in der substratungebundenen Form. In der StCaiT-Struktur konnte aufgrund der niedrigen Auflösung kein Substrat nachgewiesen werden. In der EcCaiT-Struktur sind zwei gamma-Butyrobetain-Moleküle gebunden. Das erste Molekül wurde in der zentralen Substratbindestelle, der sogenannten Tryptophan-Box bestehend aus vier Tryptophanen, im Zentrum des Protein lokalisiert. Das zweite gamma-Butyrobetain-Molekül wurde in einer Vertiefung an der extrazellulären Proteinoberfläche gefunden. Beide Substrate werden hauptsächlich über Kation-Pi-Interaktionen zwischen der positiv geladenen quatären Ammoniumgruppe des Substrats und des Pi-Elektronensystems der Tryptophane in den jeweiligen Bindestellen gebunden. Eine besondere Eigenschaft von CaiT ist der H+- bzw. Na+-unabhängige Substrattransport. Die CaiT-Struktur erklärt warum kein zusätzliches Kation benötigt wird um Substrat zu binden oder zu transportieren. In der EcCaiT-Struktur ist eine wichtige polare nicht-bindende Interaktion zwischen der Carboxylgruppe des gamma-Butyrobetains und dem Schwefelatom eines Methionins in der zentrale Bindestelle zu erkennen. Dieses Methionin ist konserviert in den prokaryotischen CaiTs und in den Na+-unabhängigen eukaryotischen L-Carnitin Transportern (OCTN), jedoch ist es nicht konserviert im Na+-abhängigen verwandten Glycinbetain Transporter BetP. In BetP ist diese Position des Methionins durch ein Valin ersetzt. Die Mutation des Methionins in CaiT zu Valin ermöglicht zwar immernoch die H+- bzw. Na+-unabhängige Bindung des Substrates durch die Tryptophan-Box, jedoch ist der Substrattransport nahezu vollständig zerstört. Eine derart wichtige Substratkoordinierende Funktion des Schwefelatoms eines Methionins wurde bisher nicht beschrieben. Eine weitere Stelle, die in H+- bzw. Na+-abhängigen Transporter mit H+ bzw. Na+ besetzt ist, ist in CaiT von einem positiv geladenen Arginin eingenommen. Eine positive Ladung an dieser Stelle stabilisiert den Bereich im Protein in der Nähe der zentralen Substratbindestelle. Die Mutation des Arginins zu Glutamat in CaiT erzielt eine vollständige Inaktivierung des Substrattansports. Durch Zugabe von Na+ im Transportansatz kann die Substrattransportaktivität der Glutamat-Mutante jedoch teilweise zurückerlangt werden. Diese eben beschriebenen Aminosäurereste in den beiden Stellen des Proteins erklären die Kationenunabhängigkeit von CaiT. Die Aktivierung des Antiportmechanismus in CaiT wurde mit Hilfe von Bindungsstudien an rekonstituiertem Protein ermittelt. Diese Messungen ergaben für das Wildtypprotein ein sigmoidales Substratbindungsverhalten, was auf ein positiv-kooperatives Bindungsverhalten hindeutet. Die beiden Substratbindestellen im Protein sowie die beiden unterschiedlichen Substrate, L-Carnitin und gamma-Butyrobetain, lassen auf einen heterotropen positiv-kooperativen Bindungs- und einen allosterisch regulierten Transportmechanismus schließen. Bei diesem Mechanismus erhöht die Bindung eines Substrats in der regulatorischen Bindestelle durch induzierte Konformationsänderungen die Affinität eines anderen Substrats in einer weiteren Substratbindestelle. Die regulatorische Bindestelle in CaiT befindet sich an der extrazellulären Proteinoberfläche. Eine Schwächung der Substrataffinität in dieser Bindestelle durch Einführung einer Mutation, verstärkt das sigmoidale Substratbindungsverhalten und hat einen negativen Einfluss auf den Substrattransport. Durch die in dieser Arbeit gelösten 3D-Röntgenkristallstrukturen der zwei CaiT-Homologen, PmCaiT und EcCaiT, sowie den durchgeführten funktionellen Studien sowohl an Wildtypprotein wie auch an Mutanten konnte ein L-Carnitin/gamma-Butyrobetain Antiport-Mechanismus für CaiT vorzuschlagen werden.
Obwohl zahlreiche zelluläre Funktionen von RNAs in direktem Zusammenhang mit Proteinen stehen, wurde auch eine Vielzahl von, unter anderem regulatorischen, RNA-Motiven identifiziert, die ihre Funktion ohne eine initiale Beteiligung von Proteinen ausüben. Das detaillierte Verständnis der zu Grunde liegenden Regulationsmechanismen beinhaltet die Charakterisierung von beteiligten RNA-Architekturen und deren funktionaler Stabilitäten, von dynamischen Aspekten der RNA-Faltungsprozesse sowie die Korrelation dieser Charakteristika mit zellulären Funktionen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden strukturelle, thermodynamische und kinetische Aspekte der Ligand-bindenden Guanin Riboswitch-RNA Aptamerdomäne des xpt-pbuX Operons aus B. subtilis und eines Cofaktor-abhängigen katalytischen RNA-Motivs, des 'Adenin-abhängigen Hairpin Ribozyms', untersucht. ...