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Der metabotrope Glutamatrezeptor Untertyp 4 gehört zusammen mit den Untertypen 6, 7 und 8 zur Gruppe III der metabotropen Glutamatrezeptoren (mGluRs). Diese präsynaptisch lokalisierten Rezeptoren sind an der Regulation der Neurotransmission an glutamatergen und nicht-glutamatergen Synapsen beteiligt. In der vorliegenden Arbeit sollten bisher unbekannte intrazelluläre Interaktionspartner für den metabotropen Glutamatrezeptor Untertyp 4 (mGluR4) identifiziert werden, um neue Erkenntnisse zur Regulation und Funktion dieses Rezeptors zu gewinnen. Dazu wurden Bindungsstudien mit Fusionsprotein aus Glutathion-S-Transferase (GST) und der kompletten C-terminalen Domäne des mGluR4 (mGluR4-C) durchgeführt. Die gebundenen Proteine wurden auf silbergefärbten SDS-Polyacrylamidgelen analysiert und anschließend über MALDI-TOF-Massenspektrometrie und Datenbank-gestützte Computerprogramme identifiziert. Außerdem wurden in Zusammenarbeit mit Dr. John Caldwell Proteine über Tandemmassenspektrometrie identifiziert. Mit diesem Ansatz konnten zwölf potentielle mGluR4-Interaktionspartner identifiziert werden. Die Bindung an mGluR4 konnte für drei dieser Proteine durch Immunoblotanalyse mit spezifischen Antikörpern bestätigt werden: für das Mikrotubuli-assoziierte Protein 1B (MAP1B), das stable tubule-only polypeptide protein (STOP-Protein) und, in geringerem Ausmaß, für die schwere Kette des nicht-muskulären Myosin II-B (MHCIIB). Die Interaktion zwischen mGluR4 und MAP1B wurde im folgenden näher charakterisiert. Bindungsstudien mit GST-Fusionsproteinen zeigten, daß MAP1B auch an die C-terminalen Domänen von mGluR6, mGluR7 und mGluR8 und damit an alle mGluRs der Gruppe III bindet. Für die mGluRs der Gruppe II konnte keine Interaktion mit MAP1B belegt werden. Weitere Bindungsstudien mit Deletionsmutanten konnten die für die MAP1B-Bindung verantwortliche Binderegion auf die 24 bzw. 38 N-terminalen Aminosäuren der C-terminalen Domänen von mGluR7 bzw. mGluR8 eingrenzen. Es wurde gezeigt, daß das Ca2+-abhängig an dieselbe Rezeptorregion bindende Calmodulin mit MAP1B um die Bindung an mGluR4 konkurriert. Immuncytochemische Experimente konnten eine partielle Kolokalisation von MAP1B und mGluR4 in transfizierten Säugetierzellen nachweisen. In kultivierten Primärneuronen konnte eine partielle Kolokalisation von endogenem mGluR4 mit endogenem MAP1B gezeigt werden. Die teilweise Überlappung der Immunreaktivitäten von mGluR4 und MAP1B läßt darauf schließen, daß eine Interaktion der beiden Proteine auch unter physiologischen Bedingungen möglich ist.
In der vorliegenden Arbeit konnte das Subkompartiment der synaptischen aktiven Zone erstmals in der für Proteomstudien erforderlichen Qualität aufgereinigt werden. Nach Präparation des Gesamthirns der Ratte wurden über verschiedene Homogenisations- und Zentrifugationschritte Synaptosomen gewonnen, die durch einen hypoosmotischen Schock zum Platzen gebracht wurden. Der Inhalt, vornehmlich synaptische Vesikel, wurde in einem Saccharosedichtegradienen aufgetrennt. Die Analyse dieses Gradienten bestätigte, dass sich in den unteren, dichteren Fraktionen (Fraktionen 28-34) Elemente synaptischer Vesikel und auch der Plasmamembran befanden. Damit war eine wichtige Grundvoraussetzung für eine nachfolgende Proteomuntersuchung gedockter synaptischer Vesikel erfüllt. Die Analyse dieser Fraktionen durch Western-Blot und mittels Transmissionselektronenmikroskopie zeigte aber auch, dass sie diverse Organellmarker enthielten und insgesamt eine heterogene Zusammensetzung von membranären Strukturen zeigten. Daher folgte als weiterer Aufreinigungsschritt eine immunmagnetische Trennung mit monoklonalen Antikörpern gegen das ubiquitäre integrale Protein synaptischer Vesikel, SV2. Die hohe Reinheit der resultierenden Fraktion gedockter synaptischer Vesikel konnte durch elektronenmikroskopische Analysen und proteinchemische Methoden (2D BAC-/SDS-PAGE und Western Blot) nachgewiesen werden. Die Optimierung der Integrität der verwendeten Proben erlaubte eine funktionelle Zuordnung der durch die hochsensensitiven massenspektrometrischen Analysen identifizierten Proteine. Zur Proteinidentifikation wurden zwei verschiedene Methoden herangezogen: die zweidimensionale BAC-/SDS-PAGE mit anschliessender MALDI-TOF Analyse und die eindimensionale SDS-PAGE mit nachfolgender nanoLC ESI MS/MS. Beide Methoden ergänzten sich; generell wurde über die zweite Methode eine größere Anzahl von Proteinen identifiziert. Durch die Verwendung und Kombination der verschiedenen massenspektrometrischen Methoden und unterstützt durch eine Western Blot Analyse konnten insgesamt 245 Proteine identifiziert werden. Dabei handelte es sich um (i) integrale synaptische Vesikelproteine, (ii) transient mit synaptischen Vesikeln assoziierte Proteine, (iii) Proteine der Plasmamembran und Zelloberfläche, (iv) Signalkaskadenproteine und kleine GTPasen, (v) Proteine des Zytoskeletts, (vi) glykolytische und andere metabolische Enzyme, sowie (vii) Chaperone und (viii) mitochondriale Proteine. Im zweiten Teil der Arbeit wurden ausgewählte Proteine genauer untersucht. Die Analyse der löslichen Proteine WK1 und WK2 zeigten in Genexpressionsstudien eine ubiquitäre Gewebeverteilung. Rekombinante Proteine wurden in Zelllinien exprimiert, um einen Einblick in deren subzelluläre Lokalisierung zu erhalten. Die Expressionsanalyse der integralen Transmembranproteine zeigte für alle Kandidaten eine neuronale Expression der mRNA. Für jeden der Kandidaten wurden individuelle Genexpressionsmuster im Hirn beobachtet. Gegen zwei der Kandidatenproteine konnten funktionelle Antikörper erzeugt werden. Die Immunomarkierung mit anti-Ttyh1-Antikörpern zeigt eine hochspezifische Färbung der Fasertrakte in verschiedenen Hirnarealen sowie eine neuronale Lokalisation in Primärkulturen des Hippokampus und des Neokortex der Ratte. Lingo1-Immunfärbungen markierten selektiv Nervenzellen des limbischen Systems und Mitralzellen des Bulbus olfactorius. Diese Studie führt konsequent die Idee der spezifischen Aufreinigung von Vesikelkompartimenten der Synapse weiter: Mit der Einführung eines hochaffinen immunchemischen Anreicherungsschrittes in dem Aufreinigungsprozess wird dem bisherigen Methodenarsenal zur Spezifizierung der Probe über physiko-chemische Parameter eine neue Dimension hinzugefügt: Die molekulare Identität.
The strong nuclear force is described by Quantum Chromodynamics (QCD), the parallel field theory to Quantum Electrodynamics (QED) that describes the electromagnetic force. It is propagated by gluons analogously to photons in the electromagnetic force, but unlike photons, which do not carry electric charge, gluons carry color, and they can self-interact. However, as individual quarks have never been observed in nature, it is postulated that the color charge itself is confined, and hence all baryons and mesons must be colorless objects. To study nuclear matter under extreme conditions, it is necessary to create hot and dense nuclear matter in the laboratory. In such conditions the confinement between quarks and gluons is cancelled (deconfinement). This state is characterized with a qusi-free behavior of quarks and gluons. The strange (s) and anti-strange (anti-s) quarks are not contained in the colliding nuclei, but are newly produced and show up in the strange hadrons in the final state. It was suggested that strange particle production is enhanced in the QGP with respect to that in a hadron gas. This enhancement is relative to a collision where a transition to a QGP phase does not take place, such as p+p collisions where the system size is very small. Therefore the energy- and system size dependence is studied to receive a picture about the initial state. In this thesis experimental results on the energy- and system size dependence of Xi hyperon production at the CERN SPS is shown. All measurements were performed with the NA49 detector at the CERN SPS. NA49 took central lead-lead collisions from 20 - 158 AGeV, minimus bias lead-lead collisions at 40 and 158 AGeV, and semi-central silicon-silicon colisions at 158 AGeV. The NA49 experiment features a large acceptance in the forward hemisphere allowing for measurements of Xi rapidity spectra. At the SPS accelerator at CERN Pb+Pb collisions are performed with beam energies to 158 AGeV. The analyzed data sets were taken in the period from 1999 to 2002. The NA49 experiment is a large acceptance hadron spectrometer, which measures charged hadrons in a wide acceptance. The main components are the four TPCs (Time Projection Chamber). The centrality of nucleon-nucleon collisions was done by measuring the not in the collision participating (spectator-) nucleons in the VETO-calorimeter. The study of strangeness is motivated by its role as a signature for the Quark Gluon Plasma. Any enhancement in the yield must be with respect to a ’normal’ yield, where a QGP is not formed. This is usually taken to mean suitably scaled p+p collisions, where the volume of the system created is too small for a QGP to occur. The results at SPS and RHIC energies show an enhancement, with the doubly strange Xi? being enhanced more than the Lambda, in accordance with the original prediction. However, the enhancement at SPS energies is higher than at RHIC energies.
Aufgrund der immensen Bedeutung der Prävention von Infektionskrankheiten und nicht-infektionsbedingten Problemen bei jährlich mehreren Millionen in tropische und subtropische Regionen reisenden deutschen Passagieren sowie des derzeit nur fragmentarischen Bildes von der Qualität der reisemedizinischen Beratung in Deutschland widmete sich diese Datenerhebung der Feststellung der Vollständigkeit und in Teilen der Korrektheit der Empfehlungen zu präventiven Maßnahmen. Die Untersuchung hatte zum Ziel, die Inanspruchnahme einer Beratung bei verschiedenen Beratungsstellen zu eruieren und diese mit erfassten Personen- und Reisedatenmerkmalen in Beziehung zu setzen. Weiterhin wurden die reisemedizinische Beratung in Deutschland auf Schwachstellen hin überprüft und die Empfehlungen der Hausärzte mit denen der nicht-hausärztlichen professionellen Berater (Apotheken, Tropeninstitute, Gesundheitsämter und die Flughafenklinik Frankfurt am Main) verglichen. In einem 27 Punkte umfassenden Erhebungsbogen wurden umfangreiche Daten von Passagieren zu fünf repräsentativen Reisezielen (Dominikanische Republik, Kenia, Senegal, Südafrika, Thailand) am Flughafen Frankfurt am Main zur Zeit der Herbstferien 2001 gesammelt. Die Ergebnisse erfuhren in einem weiteren Schritt eine vorwiegend deskriptive Auswertung, Unterschiede zwischen den Beratungsstellen und -gruppen (Hausärzte, nicht-hausärztliche Berater, Laiengruppe) wurden im Rahmen der induktiven Statistik mittels des exakten Fisher-Tests genauer betrachtet. Von 603 Passagieren haben 91% reisemedizinische Informationen in irgendeiner Form eingeholt, wobei die Anteile für die verschiedenen Reiseziele zwischen 89% und 96% variieren. Eine Mehrfachberatung der Reisenden hat bei 77% der Teilnehmer stattgefunden, wobei sich keine Abhängigkeit vom Risikograd eines Bestimmungsortes zeigt. ...
Die Arbeit überprüft die Zusammensetzung der F1FO-ATP-Synthase in Säugetiermitochondrien, dem Enzymkomplex, der das meiste ATP für den Energiebedarf einer Zelle liefert. Es sind zwei neue Proteine identifiziert und als ATP-Synthase assoziiert verifiziert worden, das sog. dapit protein (diabetes-associated protein in insulin-sensitive tissue; Datenbanknummer in NCBI für Rattus norvegicus, gi|19424210) bzw. 6.8 kDa mitochondrial proteolipid (Datenbanknummer in NCBI für Rattus norvegicus, gi|109478763). Bis jetzt sind beide Proteine nicht zusammen mit dem Komplex V detektiert worden, da es sich bei beiden Proteinen um sehr kleine Membranproteine (kleiner 7 kDa) handelt und sie sehr leicht in Gegenwart von Detergenzien verloren gehen. Die etablierte Strategie zur milden Aufreinigung von Komplex V, die eingesetzte gelelektrophoretische Trennung und die gewonnenen Erkenntnisse zur Identifizierung solch kleiner Proteine können sicherlich auch Lösungsansätze für andere ungelöste Problemfälle in der Proteinkomplexanalytik liefern. Da beide neuen Proteine in die Modulation des metabolischen Zellzustandes involviert sein könnten, sind die erarbeiteten Daten für weitere funktionelle und biochemische Untersuchungen der ATP-Synthase äußerst nützlich. Außerdem könnten die Ergebnisse für neurologische und klinische Studien hinsichtlich der Ursachenforschung von Funktionsstörungen in den Mitochondrien von Interesse sein, da eines der zwei neuen Proteine früher schon mit Diabetes in Zusammenhang gebracht worden ist (dapit, diabetesassociated protein in insulin-sensitive tissue). Für ein bakterielles Multihäm c-Typ Cytochrom konnte massenspektrometrisch gezeigt werden, dass es auf eine unkonventionelle Weise Häm bindet. Durch massenspektrometrische Charakterisierung des Proteins konnte erstmals nachgewiesen werden, dass es nicht nur die Häm c-Bindemotive CX2-4CH und CXXCK, sondern auch Häm c-Bindemotive der Form CXnCH in Bakterien gibt. Diese Erkenntnis führt in der Molekularbiologie zu neuen Fragen, z. B. welche speziellen Lyasen (cytochrome c haem lyases) letztendlich für das Einfügen der Häm-Gruppe an solche neuen Motive verantwortlich sind. Auch die computerbasierte Vorhersage von c-Typ Cytochromen wird dieses Wissen wohl zukünftig in Suchstrategien umsetzen, um die neuen Häm c-Bindemotive bei der Genomanalyse von Organismen nicht zu übersehen. In dem Feld der Identifizierung und Charakterisierung von Membranproteinen im Allgemeinen konnten grundlegende Erkenntnisse zum Umgang mit alternativen Enzymen und deren Potential für einen zukünftigen Einsatz erarbeitet werden. Schwerpunktmäßig wurden die Enzyme Chymotrypsin, Elastase und Pepsin untersucht. Es konnte für alle drei Kandidaten gezeigt werden, dass sie bevorzugt an einer begrenzten Anzahl von Aminosäuren spalten. Besonders für Elastase ist diese Erkenntnis neu, da sie in der Literatur bisher als unspezifisches Enzym wie Proteinase K geführt wurde. Auch wenn die Spezifität der drei Enzyme nicht zu 100% wie bei Trypsin festgelegt werden kann, sondern es sich nur um eine Bevorzugung gewisser Aminosäuren handelt, sind die enzymatischen Spaltungen reproduzierbar. Selbst eine Auswertung der MS-Spektren mittels Peptide Mass Fingerprint (PMF) ist deshalb auch bei diesen weniger spezifischen Enzymen möglich. Die Intensität der MS-Signale muss aber berücksichtigt werden, was bei bisherigen PMF-Suchen jedoch nicht in der Art und Weise geschieht, wie es für diese Enzyme nötig wäre. An einigen Membranproteinen konnte letztendlich bereits beispielhaft gezeigt werden, dass der Einsatz von weniger spezifischen Enzymen für die Identifizierung des Proteins und der nachfolgenden Charakterisierung (z. B. Identifizierung von posttranslationale Modifikationen) vorteilhaft ist. Für Elastase konnte in diesem Zusammenhang auch demonstriert werden, dass sie problemlos in Lösungsmittelsystemen mit einem hohen organischen Anteil (Acetonitril, Isopropanol, Methanol) einsetzbar ist. 100% Sequenzabdeckung lassen sich aber auch bei weniger spezifischen Enzymen trotz der größeren Anzahl an Schnittmöglichkeiten nur erahnen. Zwei Hauptursachen hierfür sind wahrscheinlich die schlechte Zugänglichkeit des Enzyms zum Membranprotein bzw. die Bevorzugung bestimmter enzymatischer Fragmente in MALDI und ESI. Polyacrylamidgele mit alternativen Quervernetzern, bei denen sich die Geldichte vor dem Verdau verringern lässt, könnten die Zugänglichkeit zum Membranprotein zukünftig vielleicht positiv beeinflussen. Der Einsatz von organischen Lösungsmitteln und bestimmter Detergenzien beim Verdau verbessert ebenfalls die Zugänglichkeit zum Membranprotein. Die Zahl der Tenside, die mit der Massenspektrometrie sehr gut kompatibel sind, ist aber sehr gering, wie Untersuchungen in dieser Arbeit ebenfalls ergeben haben. Außerdem beschränkt sich die Anwendung von diesen Detergenzien ausschließlich auf MALDI. Die zu erwartenden Fortschritte bei der Identifizierung und Charakterisierung von Membranproteinen umschreibt daher besonders gut ein Aphorismus von Christian Morgenstern (deutscher Schriftsteller; 1871 – 1914): „Es gibt nur ein Neues: Die Nuance.“ Einige Nuancen sind in dieser Arbeit enthalten. In der Zukunft werden aber viele weitere solcher Nuancen das Überwinden der Hürde „Membran Proteomics“ immer realistischer werden lassen.
Ziel der vorliegenden Arbeit war der Nachweis der bekannten Tonotopie im auditorischen Cortex der Katze mittels optical recording intrinsischer Signale (ORIS) mit der Frage, ob ORIS eine funktionelle Bildgebung ermöglicht, die den etablierten elektrophysiologischen Ableitungsmethoden an räumlicher und zeitlicher Auflösung ebenbürtig oder sogar überlegen ist. Hierzu wurde ein ORIS- Setup erstellt, dessen Schwankungsbreiten von Beleuchtungseinheit und aufzeichnendem System in Ableitung mit grünem Licht bei einer Größenordnung von 0,03% hinreichend niedrig lagen, um stimulusassoziierte Signale in den von den meisten Autoren berichteten Amplituden sicher ableiten zu können. Es wurden spontane wie durch elektrische und akustische Stimuli evozierte Änderungen in den Reflexionseigenschaften des primären auditorischen Cortex (A1) der Ketamin- und Isofluran- anästhesierten Katze beobachtet. In Ruhe stellten sich bei 540nm in sämtlichen Versuchstieren (n=4) spontane Absorptionsoszillationen mit einer Grundfrequenz von 0,1Hz und einer Amplitude zwischen 1 und 3,5% dar („Mayer-waves“), deren Ursprung (intra- versus extracerebral) jedoch nicht gesichert werden konnte und die sich von den anliegenden Stimuli unbeeinflußt zeigten. Ein der bekannten Tonotopie korrespondierendes Muster aktivierter Areale nach Stimulation konnte lediglich bei ¼ der Versuchstiere nachgewiesen werden (P124, elektrische Reizung, 30 Mittelungsdurchgänge). Die erreichten Absorptionsmaxima nach 12dB überschwelliger elektrischer Reizung des Hörnerven lagen bei etwa 0,5% mit einer Latenz bis zum Signalmaximum von 5,5 sec. Bei P126 war erst nach Mittelung von 18 Durchgängen ein zeitlicher Zusammenhang zwischen optisch erhobenen Daten und Stimulus nachweisbar. Bei P125 stellte sich nach 30 Mittelungsschritten zwar ein caudo-rostraler Shift der optischen Maxima bei Stimulation von 1kHz auf 4kHz dar, was der bekannten cortikalen Frequenzrepräsentation entsprach, doch ließ die darauffolgende Reizung mit 16 kHz keinen weiteren Shift nach rostral erkennen. Das cortikale Gebiet maximaler optischer Aktivität lag gegenüber dem Ort der 4kHz-Repräsentation caudomedial versetzt. Dies widerspricht der bekannten cortikalen Cochleotopie. Es fand sich nach Mittelung über 18 (P126) bzw. 30 (P124 und P125) Durchgänge gleicher Stimulation bei allen Tieren ein fleckiges, stimulusassoziiertes, jedoch nicht tonotop verteiltes Signal in Form einer Absorptionszunahme mit Maximum nach 6-8,5 Sekunden. Es erreichte Amplituden zwischen 1% und 2,5%. Die optischen Aktivitätsmuster zeigten eine erhebliche Varianz unter Durchgängen bei gleichem Stimulus. In einem Experiment (P126) fand ein Vergleich der optisch generierten Ergebnisse mit elektrophysiologischen Multiunit-Messungen statt. Es konnte nur bei einer Stimulationsfrequenz (8kHz) eine schwache Korrelation der lektrophysiologischen Multiunit-Antworten mit den optisch erhobenen Reflexionsänderungen festgestellt werden. Wir schließen daher, dass die Darstellung einer Tonotopie mittels ORIS nur in einem Bruchteil der untersuchten Versuchstiere mit gegenüber elektrophysiologischen Methoden deutlich geringerer Reliabilität, Validität und räumlicher Auflösung machbar ist, möglicherweise, weil ORIS am primären auditorischen Cortex der Katze lediglich ein grobes Signal der Tonotopie liefert, ohne hierbei auf die Lokalisation aktiver Neurone beschränkt zu sein. ORIS ist demnach zum Ersatz der etablierten Elektrophysiologie am A1 der Katze nicht geeignet.
CSDH gehören zu den häufigen Krankheitsbildern in der Neurochirurgie, vor allem bei Patienten mit hohem Lebensalter. Ebenfalls weit verbreitet ist die Einnahme von hämostaseologisch wirksamen Substanzen. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss davon auf die Revisionsoperationsrate und das Outcome von Patienten mit CSDH, sowohl funktionell als auch in der QoL, zu untersuchen. Medizinische Daten von 144 Patienten, mit besonderer Berücksichtigung von hämostaseologischen Risikofaktoren und präoperativer Medikation, wurden zusammen mit der mRS, dem Barthel Index, der SA-SIP 30, einer Selbsteinschätzung und der Revisionsoperationsrate erfasst. Diese Daten wurden in uni- und multivariaten Tests analysiert. Die präoperative Einnahme von hämostaseologisch wirksamen Medikamenten hat keinen signifikanten Einfluss auf das Outcome oder die Revisionsoperationsrate von Patienten mit CSDH. Mussten Patienten mit Gerinnungsfaktoren substituiert werden, hatten sie jedoch ein signifikant schlechteres Ergebnis in der mRS, allerdings ohne einem erhöhten Rezidivrisiko zu unterliegen. Patienten mit einer Revisionsoperation weisen ein signifikant schlechteres Ergebnis in der QoL und der Selbsteinschätzung auf als die Patienten ohne. Die multivariate Untersuchung der Revisionsoperationen zeigt ein signifikant erhöhtes Rezidivrisiko bei einer frischen Einblutung in das CSDH. Außerdem sind mRS, Barthel Index und QoL signifikant schlechter bei Patienten mit einer anamnestisch erhöhten eigenen Blutungsneigung. Eine solche Blutungsneigung ist zudem von Signifikanz für ein schlechteres Ergebnis beim Barthel Index in der multivariaten Analyse. Für ein ungünstiges Ergebnis in der mRS sind ein hoher INR und eine niedrige AT-Aktivität signifikante Parameter in den multivariaten Tests. Patienten mit einem erinnerlichen zweiten Trauma geben ein signifikant schlechteres Outcome in der QoL und der Selbsteinschätzung an. Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass die Art der operativen Therapie keinen statistisch signifikanten Einfluss auf das Outcome oder die Rezidivrate ausübt. Von besonderem Interesse waren die Ergebnisse in den multivariaten Tests und bei der QoL, da diese Aspekte bisher von keinem Autor berücksichtigt worden waren. Außerdem wäre es wünschenswert, wenn in Zukunft einheitliche Definitionen von Rezidiv, Koagulopathie und Outcome gebraucht würden, um einen internationalen Vergleich zu erleichtern.
Präklinische Untersuchungen zur Gentherapie der HIV-Infektion mit dem retroviralen Vektor M87o
(2007)
Mit der Einführung der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) 1995 wandelte sich die HIV-Infektion in den Industrieländern von einer akut lebensbedrohlichen zu einer chronisch verlaufenden und scheinbar gut kontrollierten Erkrankung. Das Virus wird allerdings nie vollständig aus dem Körper eliminiert, sodass die Betroffenen zeitlebens Medikamente einnehmen müssen. Die Langzeit-Medikation wird häufig von schweren Nebenwirkungen begleitet, führt zur Selektion resistenter Viren und muss häufig umgestellt werden. Gentherapeutische Verfahren, die die CD4+ Zielzellen durch die Expression antiviraler Gene vor der Infektion durch HIV schützen („intrazelluläre Immunisierung“), stellen viel versprechende Therapiealternativen dar. Der in der Arbeitsgruppe von Laer entwickelte retrovirale Vektor M87o (EGELHOFER et al. 2004, EGELHOFER 2004) exprimiert das 46 Aminosäuren lange membran-verankerte Peptid C46, das in der Lage ist, die gp41-vermittelte Fusion von Virus- und Zellmembran zu inhibieren. In Zelllinien und primären Lymphozyten konnte gezeigt werden, dass M87o die Infektion durch unterschiedliche HIV-Isolate sehr effektiv verhindert. Im Rahmen vorklinischer Untersuchungen konnte in vitro gezeigt werden, dass die retrovirale Transduktion mit M87o das Transformationsrisiko und damit das Risiko der Entstehung von Neoplasien nicht steigert. An primären peripheren T-Zellen konnte zeigt werden, dass M87o die Zielzellen weder phänotypische noch funktionelle verändert. Für die Untersuchung der retroviralen Gentherapie im Rhesusaffenmodell wurde zunächst ein Gentransferprotokoll für periphere Affenlymphozyten entwickelt, mit dem in Vorversuchen Gentransferraten von ca. 50% erreicht werden konnten. Das Transduktionsprotokoll wurde anschließend im Rahmen einer präklinischen Studie zur Toxizität und Immunogenität der M87o-Gentherapie, bei der Herstellung zweier Studientransplantate angewandt. Beide Zellpräparate wurden den Versuchstieren transplantiert. Während des Eingriffs traten keine akuttoxischen Reaktionen auf. M87o+-Zellen konnten bis 140 Tage nach der Transplantation mittels PCR nachgewiesen werden. Immunologische Untersuchungen (Cytokinfärbung, Proliferationsassay, ELISPOT) ergaben keine Hinweise auf zelluläre oder humorale Immunreaktionen. M87o-spezifische Antikörper waren im Serum nicht nachweisbar. Für die Durchführung einer klinischen Studie zur Toxizität und Wirksamkeit (Phase I/II) an HIV-infizierten Probanden wurde ein Protokoll zur Produktion M87o-modifizierter T-Zellen (mindestens 5 × 108 M87o+ CD4-T-Zellen pro Spender) entwickelt. In die klinische Prüfung wurden Patienten aufgenommen, die nach multiplem Therapieversagen durch das Auftreten multiresistenter HIV eine CD4-Zellzahl von 50 bis 200 µl-1 Blut, sowie eine Viruslast von >5.000 Kopien ml-1 Blut aufwiesen. Im Versuchsmaßstab konnte ein Transduktionsprotokoll erarbeitet werden, mit dem im Mittel 46% der CD4+ T-Zellen mit M87o transduziert werden konnten. Innerhalb von 10 Tagen expandierte die Zellzahl im Mittel um den Faktor 153, wobei die HIV-Replikation vollständig inhibiert wurde. Das Protokoll wurde erfolgreich vom Versuchsmaßstab in den klinisch relevanten Produktionsmaßstab übersetzt. In drei Versuchsläufen wurde im Mittel eine Transduktionsrate von 29% erreicht und die Zellzahl um den Faktor 44 vermehrt. Der Anteil an CD3+/CD4+ Zellen an der Gesamtpopulation lag im Mittel bei 91%. Insgesamt konnten mit dem etablierten Protokoll durchschnittlich 2,3 × 109 CD3+/CD4+/M87o+ Zellen, bei gleichzeitig vollständiger Inhibition der HIV-Replikation, generiert werden. Im Rahmen einer klinischen Studie zur Toxizität und Wirksamkeit der M87o-Gentherapie wurden 10 Studientransplantate gemäß dem im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Protokoll hergestellt. Alle Transplantate wurden am Universitäts-Krankenhaus Eppendorf in Hamburg transfundiert und von den Patienten sehr gut vertragen.
Die Studie evaluierte die Dimensionsgenauigkeit und -stabilität sowie das Rückstellverhalten von acht verschiedenen handelsüblichen Abformmaterialien für die Einphasenabformung. Bei zwei Produkten handelte es sich um Polyether-Abformmaterialien, sechs Abformmaterialien stammten aus der Gruppe der additionsvernetzenden Silikone. Zur Bestimmung der oben genannten Parameter erfolgte eine direkte zweidimensionale Vermessung der Abformungen ohne Einbeziehung eines Modellwerkstoffs. Als Grundlage für die Vermessung der elastomeren Abformmaterialien diente eine speziell entwickelte Präzisionsform, die sich aus einem individuell hergestellten Metallmodell mit vier stilisierten Pfeilern und einer speziell entwickelten Abformküvette zusammensetzte. Die Rotationsachsen der stilisierten Pfeiler 14, 17, 25 und 27 wurden im okklusalen Bereich durch eine Zentrierbohrung markiert. Zusätzlich wurde der stilisierte Pfeiler 17 mit vier Markierungspunkten, die sich mesial, distal, palatinal und vestibulär auf Höhe der Präparationsgrenze befanden, versehen. Die Markierungspunkte der Pfeiler wurden unter einem Stereomikroskop bei einer Temperatur von 23,0 ± 1,0°C mit einem Präzisions-Linearverstellerund drehtisch angefahren. Die Vermessung erfolgte nach dem vom Hersteller angegebenen frühest möglichen Zeitpunkt für die Modellherstellung, sowie 90 Minuten, 24 Stunden und 48 Stunden nach Entformung. Die statistische Datenauswertung wurde mit Hilfe von Varianzanalysen durchgeführt. Die Abformmaterialien unterschieden sich bezüglich der okklusalen Messstrecken zum Teil vom Urmodell. Unterschiede ließen sich bezüglich der Messstrecke A (1417) (Impregum Penta Soft), der Strecke B (14-25) (Impregum Penta, Honigum MixStar) und der Strecke D (14-17) (Impregum Penta Soft, Impregum Penta, Honigum MixStar, Flexitime Monophase, President System 75) nachweisen. Über die vier Messzeitpunkte wurden meist keine signifikanten Veränderungen bei den acht untersuchten Abformmaterialien festgestellt. Ausnahmen bildeten Aquasil Monophase bezüglich Strecke C (25-27) und Impregum Penta bezüglich Messstrecke D (14-17). Bei den Messstrecken auf Höhe der Präparationsgrenze unterschieden sich die Materialien zum Teil vom Urmodell. Unterschiede ließen sich nachweisen bezüglich der Messstrecken a (Impregum Penta Soft), b (Aquasil Monophase) und c (Aquasil Monophase). Einige wenige signifikante Veränderungen wurden über die vier Messzeitpunkte bei den Abformmaterialien festgestellt, und zwar bei den Materialien Impregum Penta, Aquasil Monophase, President System 75 und Provil novo Monophase bezüglich der Strecken a (mesialvestibulär), sowie bei den Materialien Impregum Penta und President System 75 bezüglich der Strecken c (distal-vestibulär). Die Materialien Monopren transfer und Provil novo Monophase zeigten bei den okklusalen und auf der Präparationsgrenze befindlichen Messstrecken die geringsten Unterschiede zum Urmodell bezüglich der Dimensionsgenauigkeit und des Rückstellverhaltens bei Verformung. Weiterhin ist festzuhalten, dass die Abformmaterialien innerhalb der Zeitspanne von bis zu 48 Stunden im Rahmen der Lagerung bei Raumtemperatur eine hohe Dimensionsstabilität aufwiesen.
Many tax-codes around the world allow for special taxable treatment of savings in retirement accounts. In particular, profits in retirement accounts are usually tax exempt which allow investors to increase an asset's return by holding it in such a retirement account. While the existing literature on asset location shows that risk-free bonds are usually the preferred asset to hold in a retirement account, we explain how the tax exemption of profits in retirement accounts affects private investors' asset allocation. We show that total final wealth can be decomposed into what the investor would have earned in a taxable account and what is due to the tax exemption of profits in the retirement account. The tax exemption of profits can thus be considered a tax-gift which is similar to an implicit bond holding. As this tax-gift's impact on total final wealth decreases over time, so does the investor's equity exposure. JEL Classification Codes: G11, H24
Das Bakterium Thermus thermophilus hat sich in den letzten Jahren zu einem Modell für thermophile Organismen entwickelt. Die maximale Wachstumstemperatur liegt bei bis zu 85°C, so dass auch Proteine und die gesamte Zellstruktur an diese hohen Temperaturen adaptiert sein müssen. Aufgrund der allgemein erhöhten Stabilität werden diese Proteine zunehmend für biotechnologische Prozesse und zur Strukturbestimmung verwendet. Im Energiehaushalt der Zelle ist der Elektronentransfer von NADH zu molekularem Sauerstoff ein wesentlicher Bestandteil und wird durch transmembrane Enzymkomplexe vermittelt. In dieser Arbeit konnten vier direkt aufeinanderfolgende Gene (fbcC, fbcX, fbcF, fbcB) identifiziert werden, die in einem 3,1 kb großen Operon mit einem GC-Gehalt von 69% organisiert sind und für die Untereinheiten eines putativen Thermus bc-Komplexes kodieren. Die in silico translatierte DNA-Information konnte für ausführliche Sequenzvergleiche und eine erste Charakterisierung der bc-Untereinheiten genutzt werden. Während Cytochrom b und das Rieske-Protein typische Eigenschaften zu anderen prokaryotischen Untereinheiten aufweisen, unterscheidet sich die Cytochrom c-Untereinheit hinsichtlich Topologie und Verwandtschaft von klassischen c1-Komponenten. Darüber hinaus wurde eine zusätzliche Untereinheit FbcX identifiziert, die keine Entsprechung in bisher bekannten bc-Komplexen hat. Das gesamte Operon mit vorangestellter d70 Promotorregion wurde amplifiziert, in einen Thermus/E.coli-Shuttlevektor mit hitzeoptimierter Kanamycinresistenz eingefügt und so plasmidkodiert für die Überexpression in T. thermophilus HB27 genutzt. Der membranständige Gesamtkomplex wurde nach Solubilisierung mit ß-D-Decyl-Maltosid stabil in Lösung gebracht und anschließend über eine Metallaffinitätssäule stöchiometrisch als vier-Untereinheiten Komplex aufgereinigt. Der Gesamtkomplex sowie seine Einzelkomponenten und deren Cofaktoren waren somit für eine nähere Charakterisierung verfügbar. Alle vier Genprodukte konnten als Untereinheiten des bc-Komplexes in T. thermophilus über N-terminale Sequenzierung und MALDI-MS/MS eindeutig identifiziert werden. Der in vitro Aktivitätstest zeigte keine Hemmbarkeit des aufgereinigten Thermus Komplexes durch klassische bc-Inhibitoren, was auf eine deutlich abweichende Substratbindung dieses Menachinol-oxidierenden Komplexes hinweist. Durch Optimierung des Thermus/E.coli-Shuttlevektors wurde auch die homologe Überexpression weiterer Thermus-Membranproteine ermöglicht. Dazu gehört neben der ba3-Oxidase auch ein MDL-ähnlicher ABC-Transporter. Weiterhin wurde gezeigt, dass die thermostabilen Eigenschaften sowohl des bc-Komplexes als auch des ABC-Transporters in Detergenzumgebung erhalten bleiben. Dieser Nachweis konnte darüber hinaus auch für den heterolog exprimierten und aus E. coli aufgereinigten ABC-Transporter erbracht werden, der im isolierten Zustand die gleiche Aktivität wie das aus Thermus aufgereinigte Äquivalent aufweist. Neben dem bc-Gesamtkomplex, der ba3-Oxidase und Cytochrom c552 wurden in dieser Arbeit weitere Komponenten der thermophilen Atmungskette in löslicher Form oder mit Membrananker, zum Teil auch heterolog in E. coli exprimiert und unter Erhalt der Redox-Cofaktoren aufgereinigt. Mit der Identifizierung und Charakterisierung eines intakten Cytochrom bc-Komplexes konnte die Lücke im Verständnis der thermophilen Atmungskette von T. thermophilus geschlossen und die Grundlage für weitere Struktur- und Funktionsanalysen dieses membranintegralen Enzymkomplexes geschaffen werden.
Imatinib (GleevecTM; GlivecTM; formerly STI571), a specific inhibitor of Abl tyrosine kinase, is efficacious in treating Philadelphiachromosomepositive (Ph+) leukaemias such as chronic myeloid leukaemia (CML) and Ph+ acute lymphoblastic leukaemia (ALL) (Ottmann, Druker et al. 2002). Within a few years of its introduction to the clinic, Imatinib had dramatically altered the firstline therapy for CML, because it was found that most newly diagnosed CML patients in the chronic phase achieve durable responses when treated with Imatinib (Goldman and Melo 2003). However, a small percentage of these patients, as well as most advancedphase CML and Ph+ ALL patients, relapse on Imatinib therapy (Yokota, Kimura et al. 2006). Several mechanisms of refractoriness and relapse have been reported. These include point mutations within the Abl kinase domain, overexpression of BcrAbl mRNA (Hofmann, Jones et al. 2002), decreased intracellular drug levels mediated by Pglycoprotein (Pgp) (Hegedus, Orfi et al. 2002), and nonBcrAbl dependent mechanisms (activation of the SFKs) (Donato, Wu et al. 2003). In this research work, a possible means of overcoming resistance to Imatinib by the use of the specific dual Src/Abl kinase inhibitor AZD0530 has been investigated. The efficacy of AZD0530 in the treatment of Ph+ leukaemias, sensitive to or resistant to Imatinib, has been tested on cell lines, primary patient material and in vivo in transduction/transplantation mouse model of Imatinib sensitive or resistant BcrAbl dependent CML-like disease. Data with AZD0530 has been compared to cells treated with Imatinib. The potential of inhibiting both Src and Abl kinases while inducing growth arrest and apoptosis has been analysed. AZD0530 specifically inhibited the growth of CML and Ph+ ALL cells in a dosedependent manner, but has shown a marginal effect on Ph- ALL cells. Treatment of p185BcrAbl expressing Ba/F3 cells with AZD0530 has led to apoptosis induction and growth inhibition in these cells, while the untransformed Ba/F3 cells have remained unaffected. Resistance to Imatinib due to mutation in the Ba/F3MutY253F cells has been overcomed by this compound. The growth inhibitory effect of AZD0530 correlates with its induction of apoptosis. Combination of AZD0530 and Imatinib at low concentrations has shown an additive effect on the inhibition of proliferation of BV173 cells. The growth inhibition and apoptosis induction by AZD0530 have shown to be uncoupled to major changes in cell cycle. An exception is the CML blast crisis cell line BV173 which has shown a considerable G0/G1 arrest in the presence of AZD0530 and Imatinib as single agents. Immunoblotting of whole cell lysates from Imatinib or AZD0530 treated BV173, Ba/F3 expressing p185(BcrAbl) MutT253F cells and the WTSupB15 cells, for Src and BcrAbl clearly demonstrates that there is an ongoing transphosphorylation taking place between the SFKs and BcrAbl. This transphosphorylation synergizes and influences the aggressive nature of CML blast crisis and Ph+ ALL. Investigations have been carried out on downstream signaling events to determine how Src family members contribute to BcrAbl signaling. Specifically, Stat, Erk and PI3K/ Akt activation status have been characterised in Imatinib sensitive and resistant Ph+ cells. AZD0530 has significantly downregulated the activation of survival signaling pathways as shown by it’s inhibition of Stat5, Akt and Erk kinases in Ph+ cells, resistant or sensitive to Imatinib. The only exception to this has been the Imatinib resistant cell line RTSupB15, in which activated Akt kinase level has remained unaffected. AZD0530 has shown to be efficient in the treatment of cells isolated from three Ph+ leukaemic patients (resistant or sensitive to Imatinib), and has led to an induction of apoptosis. Equally, in the same patients, growth and survival pathways have been inhibited in vitro in the presence of AZD0530. An overall therapeutic effect of AZD0530 in vivo has been studied in mouse model of Imatinib sensitive and Imatinib resistant, BcrAbldependent desease. Mice with a BcrAbllike disease responded to Imatinib treatment but not to AZD0530. Using the CFU assay, an influence on the differentiation status of primary leukaemic blast stem cells have been tested. The in vivo studies as well as the CFU results have shown discrepancies to the effects of AZD0530 tested so far in this research work. These discrepancies have paralleled with the upregulation of BcrAbl in most AZD0530 treated cells. These are to be further analysed. These data elucidate the role of Src kinases in BcrAbl leukaemogenesis. Results gotten from this research work has shown that AZD0530 targets both Src and BcrAbl kinase activity and reduces the transforming potential of BcrAbl. It also shows that there is an ongoing transphosphorylation between SFKs and BcrAbl kinase. AZD0530 has proven effective in CML cell lines, Ph+ ALL cell lines and patient cells resistant to Imatinib. These have demonstrated that AZD0530 is a potential drug target which can be used to overcome Imatinib resistance.
I investigate some of the inert phases in three-flavor, spin-zero color-superconducting quark matter: the CFL phase (the analogue of the B phase in superfluid 3He), the A and A* phases, and the 2SC and sSC phases. I compute the pressure of these phases with and without the neutrality condition. Without the neutrality condition, after the CFL phase the sSC phase is the dominant phase. However, including the neutrality condition, the CFL phase is again the energetically favored phase except for a small region of intermediate densities where the 2SC/A* phase is favored. It is shown that the 2SC phase is identical to the A* phase up to a color rotation. In addition, I calculate the self-energies and the spectral densities of longitudinal and transverse gluons at zero temperature in color-superconducting quark matter in the CFL phase. I find a collective excitation, a plasmon, at energies smaller than two times the gap parameter and momenta smaller than about eight times the gap. The dispersion relation of this mode exhibits a minimum at some nonzero value of momentum, indicating a van Hove singularity.
Transport of proteins into or across cellular membranes is mediated by the conserved and ubiquitous Sec-machinery. The Sec-homologue in the inner membrane of Escherichia coli is SecYEG. Sec-mediated insertion of numerous membrane proteins is aided by YidC, another protein integral to the inner membrane of Escherichia coli. YidC fulfils in addition the integration of a variety of membrane proteins Sec-independently. It belongs to a conserved but structurally uncharacterised family of proteins important for membrane protein biogenesis and comprises homologues in mitochondria and chloroplasts. By modification of a former crystallisation protocol two-dimensional crystals of SecYEG were grown in presence of the signal sequence peptide of LamB. Recording of structural data by electron cryo-microscopy and calculation of a difference structure comparing a former SecYEG projection structure with the one of SecYEG crystallised in presence of the substrate revealed several new and vacant densities. These hint to signal peptide binding close to the translocation pore and to significant rearrangements in proximity to the lateral exit site for transmembrane domains in SecYEG. The difference structure suggests that dimeric SecYEG is an asymmetric molecule consisting of one active and one inactive SecYEG monomer. Detergent removal from a mixture of purified YidC and lipids produced two-dimensional crystals that were highly dependent on the ionic strength and lipid composition for their growth. Electron cryo-microscopy on the frozen-hydrated crystals and image processing visualised structural details at about 10 Å resolution. Averaging two alternative projection structures in p2 and p121_a symmetry, respectively, yielded essentially the same features. Four YidC monomers form one unit cell (dimensions 82 x 71 Å, included angle 85 ° and 90 °, respectively) and seem to be arranged as two sets of dimers integrated in an anti-parallel fashion into the membrane. An area of low density in the centre of each YidC monomer resembles possibly a constriction of the membrane, which could have particular relevance for the integration of substrate proteins into the lipid bilayer.
Dem Nahrungsmittelallergiker bietet sich zum jetzigen Zeitpunkt lediglich eine Möglichkeit für ein symptomfreies Leben, er muss die allergieauslösenden Nahrungsmittel aus seinem Speiseplan eliminieren. Neben der Entwicklung von immuntherapeutischen Maßnahmen wird unabhängig davon auf pflanzentechnologischer Seite die Reduktion der allergenen Potenz pflanzlicher Lebensmittel diskutiert, um die Lebensqualität von Nahrungsmittelallergikern zu verbessern. Die Kooperation zwischen dem Institut für Biochemie der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg und dem Paul-Ehrlich-Institut leistet einen Beitrag zu dieser Diskussion. Mit der Tomate als Modellpflanze wurde die allergene Potenz pflanzlicher Nahrungsmittel mit Hilfe der RNAi-Technologie reduziert. Diese Dissertation befasst sich mit der Identifikation und Charakterisierung der Zielproteine für das RNAi vermittelte „gene silencing“. Im Fokus der Untersuchungen steht das Lipid Transfer Protein der Tomate. Bei der Charakterisierung des Tomaten LTP wurden die IgE-bindenden Epitope sowie die Stabilität bei Pepsinverdau und bei der Verarbeitung zu tomatenhaltigen Produkten untersucht. Das Tomaten LTP besteht aus einer Multigenfamilie. Durch seine zweidimensionale Auftrennung konnten Informationen über das Vorkommen und Expressionsniveau möglicher Isoformen gewonnen werden. Die rekombinante Herstellung von zwei ausgewählten Isoformen ermöglichte einen Vergleich der IgE-Bindungskapazität und der biologischen Potenz. Die in Erlangen erzeugten gentechnisch veränderten Pflanzen wurden dem Paul-Ehrlich-Institut für eine Allergenitätsbewertung zur Verfügung gestellt. Die Gewinnung von Erkenntnissen über die Effizienz der Methode und die Stabilität des „gene silencing“ über mehrere Generationen hinweg standen hier im Mittelpunkt. Die Untersuchungen zur Prävalenz der IgE-Bindung an die drei bekannten Tomatenallergene Profilin (Lyc e 1), Invertase (Lyc e 2) und das LTP der Tomate, erfolgten bei einer Patientengruppe bestehend aus 70 Seren von Tomatenallergikern aus Deutschland (n=36) und Spanien (n=34). Als häufigstes Symptom nach dem Verzehr von Tomate wurde das OAS angegeben. Die Häufigkeit der IgE-Bindung an Lyc e 1 lag bei ca. 36%, für Lyc e 2 bei ca. 56% und für das LTP der Tomate bei ca. 24%. Bei der Unterscheidung der deutschen und spanischen Patientengruppe ergaben sich höhere Prävalenzen der IgE-Bindung an alle drei Allergene bei der spanischen Patientengruppe. Das Tomaten LTP wurde als Minorallergen Lyc e 3 in die IUIS Allergendatenbank aufgenommen. Die Aufreinigung von nLyc e 3 erfolgte durch eine zweistufige Chromatographie aus Tomatenschalenextrakt, die Identifizierung als LTP mittels N-terminaler Sequenzierung sowie die Verifikation der Sekundärstruktur mittels CD-Spektroskopie. Biochemische Untersuchungen zeigten eine hohe Stabilität von Lyc e 3 in Tomatenschalenextrakt nach Pepsinverdau. Auch im Schalenextrakt von gekochten und in getrockneten Tomaten wurde immunreaktives Lyc e 3 identifiziert. Die Konformation des Lyc e 3 ist an der IgE- und IgG-Bindung maßgeblich beteiligt. Natürliche Lyc e 3 Isoformen konnten nicht über die zweidimensionale Gelelektrophorese identifiziert werden. Eine Sequenzierung des Proteins mittels nano-HPLC-nano ESI-MS/MS bestätigte die Präsenz ausschließlich einer dominanten Isoform im Tomatenschalenextrakt. Bei der Klonierung und Expression zweier ausgewählter Lyc e 3 Isoformen (Lyc e 3.1 und Lyc e 3.2) wurden unterschiedliche Strategien verfolgt. Durch Überexpression eines Thioredoxinfusionsproteins im Vektor pET-32a in E.coli Origami und die Abspaltung des Thioredoxinanhangs durch Thrombin konnte ausreichend Protein für die nachfolgenden Untersuchungen produziert werden. Jedoch zeigten die rekombinanten Proteine, vermutlich durch eine an dem Zielprotein verbleibende Anhangssequenz, bei der Messung der CD-Spektren einen Unterschied zu der natürlichen Präparation. Die Herstellung von rekombinanten Isoformen ohne Anhangssequenz mit einer Sekundärstruktur analog der natürlichen Präparation blieb erfolglos. Ein Vergleich der IgE-Bindungskapazität der rekombinanten Proteine, gemessen in der dosisabhängigen ELISA-Inhibition, konnte auf Grund ihrer identischen Sekundärstruktur durchgeführt werden. Da rLyc e 3.2 eine höhere IgE-Bindungskapazität zu besitzen scheint, wurde mit dieser Isoform eine dosisabhängige ELISA-Inhibition mit nLyc e 3 trotz unterschiedlicher Sekundärstruktur durchgeführt. Die IgE-Bindungskapazitäten sind für die herangezogenen Seren sehr individuell. Zur Bestimmung der allergenen Potenz der rekombinanten und natürlichen Präparationen diente der basophile Histamin Freisetzungstest. Die natürliche Präparation besitzt tendenziell die stärkste allergene Potenz. Die allergene Potenz der rekombinanten Isoformen ist jedoch wie die IgE-Bindungskapazität für jeden Patienten sehr spezifisch. Im Rahmen der Analyse der gentechnisch veränderten Pflanzen wurden WT und RNAi-Pflanzen mittels Immunoblot, dosisabhängiger ELISA-Inhibition und im basophilen Histamin Freisetzungstest untersucht. Im Immunoblot konnte keine Bindung von allergenspezifischen Antikörpern bei den RNAi-Pflanzen im Vergleich zum WT festgestellt werden. Bei der dosisabhängigen ELISA-Inhibition mit Lyc e 1 oder Lyc e 3 auf der Festphase war die IgE-Bindungskapaziät der RNAi Pflanzen um ein zehnfaches (Lyc e 1-RNAi) bzw. ein zehn- bis hundertfaches (Lyc e 3-RNAi) reduziert. Eine Bestätigung der Ergebnisse mit den Lyc e 3-RNAi Pflanzen lieferten ein basophiler Histamin Freisetzungstest und ein in vivo Hauttest. Durch die zusätzliche Analyse von Tochtergenerationen wurde deutlich, dass die Reduktion der Allergenexpression stabil war. Im Rahmen dieser Studie konnte gezeigt werden, dass die RNAi-Technologie eine geeignete Methode ist, um die Expression von Allergenen gezielt und stabil zu unterdrücken. Sie könnte eine Möglichkeit darstellen, die allergene Potenz von Nahrungsmitteln zu verringern und die Lebensqualität von Nahrungsmittelallergikern zu verbessern.
Na «arte de procurar soluções», as populações locais na Guiné-Bissau respondem através de modelos variados de participação no sector da educação. As escolas populares, as escolas públicas com iniciativa de associações manjacas, as escolas de autogestão e as escolas comunitárias reflectem a diversidade de respostas das comunidades face às carências educativas não supridas pelo Estado. Os modelos de desenvolvimento participativo apresentados encontram fonte de aprendizagem no período colonial, em particular durante a luta pela independência. As decisões políticas assumidas no Congresso de Cassacá, em 1964, constituem os alicerces de experiências educativas baseadas em modelos de organização e participação da sociedade guineense, que voltarão a ser experimentadas com variáveis no período pós-independente até aos nossos dias. Na região de Bafatá, a participação das comunidades manifesta-se em 156 das 252 escolas existentes em 2006. O envolvimento da população contribui para minorar os efeitos negativos da pobreza e consequentemente para que se alcance a Educação Para Todos até 2015 cujo compromisso foi assinado pela Guiné-Bissau, na Conferência de Dacar. Na luta contra a pobreza, os factores políticos, históricos e sócio-culturais determinam a participação das populações na promoção da educação na Guiné-Bissau. A mobilização da população deve-se à ausência de resposta às suas necessidades, mas também ao aumento de prestígio que experiências educativas bem sucedidas têm granjeado quer em tabancas vizinhas quer junto de entidades externas. Este estudo pretende analisar o papel das populações no desenvolvimento da educação com destaque para as escolas comunitárias da região de Bafatá, no período de 2004 a 2006. Palavras-chave: Desenvolvimento, Desenvolvimento Participativo, Educação, Escolas Comunitárias
Untersuchung der Interaktion zwischen NCoA-Koaktivator-Proteinen in der Transkriptionsregulation
(2007)
Die Mitglieder der NCoA-Koaktivator-Familie fungieren als Koaktivatoren für verschiedene Transkriptionsfaktoren, wie z.B. nukleäre Hormonrezeptoren und STAT-Proteine. NCoA-Proteine rekrutieren sekundäre Koaktivatoren, die durch die Modifikation des Chromatins die Transkriptionsaktivierung ermöglichen. Vorhergehende Studien postulierten die Dimerisierung von NCoA-Proteinen über die aminoterminalen bHLH/PAS-Domänen und die Rekrutierung von Paaren von NCoA-Proteinen, konnten jedoch eine direkte Interaktion nicht nachweisen. In unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass die PAS-B-Domäne von NCoA-1 ein LXXLL-Motiv in der Transaktivierungsdomäne von STAT6 binden kann. Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob eine Interaktion von Mitgliedern der NCoA-Proteinfamilie über die PAS-B-Domäne und eigene LXXLL-Motive vermittelt werden kann und welche physiologische Bedeutung die Interaktion von NCoA-Proteinen hat. Die Interaktion endogener NCoA-Proteine konnte in zwei verschiedenen Zelllinien nachgewiesen werden. Es konnte gezeigt werden, dass die PAS-B-Domänen aller drei NCoA-Familienmitglieder mit allen Volllängen-NCoA-Proteinen interagieren können und für eine solche Interaktion ausreichend sind. Dabei interagieren die PAS-B-Domänen spezifisch mit einer Region in der CBP-Interaktions-Domäne (CID/AD1) von NCoA-1, die zwei LXXLL-Motive und den vollständigen Bereich, der die Interaktion mit CBP vermittelt, enthält. Es zeigte sich, dass sich die Bindungsmotivspezifität der NCoA-1-PAS-B-Domäne von den Bindungsmotivspezifitäten der PAS-B-Domänen von NCoA-2 und NCoA-3 unterscheidet. Ebenso zeigten sich unterschiedliche Bindungsmotivspezifitäten für die Interaktion mit der CID/AD1 von NCoA-3, die nur mit der PAS-B-Domäne von NCoA-1 interagierte. Eine physiologische Bedeutung der charakterisierten PAS-B/CID/AD1-Interaktion auf die Bildung und Rekrutierung von Koaktivator-Komplexen wurde mittels Überexpressions-Experimenten untersucht, in denen dominant negative Effekte erwartet wurden. So führte die Überexpression der PAS-B-Domäne bzw. die Kompetition mit der CID/AD1 zur Inhibition der Interaktion von NCoA-1 mit dem Koaktivator CBP und dem Transkriptionsfaktor STAT6. Außerdem führte die stabile Überexpression der PAS-B-Domänen von NCoA-1 und NCoA-3 zu einer veränderten Expression des natürlichen endogenen Androgen-Rezeptor-Zielgenes PSA. Die in dieser Arbeit identifizierte Interaktion von NCoA-Proteinen stellt einen neuen und, zu den bisher bekannten Modellen der Koaktivator-Rekrutierung, ergänzenden Mechanismus dar. Dies gilt sowohl für eine postulierte inter- und intramolekulare Interaktion von NCoA-1 bei der STAT6-vermittelten Transkriptionsaktivierung, als auch für die durch nukleäre Hormonrezeptoren geforderte Rekrutierung von Paaren von NCoA-Proteinen. Zusammenfassend können die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse dabei helfen, das Verständnis der dynamischen Rekrutierung von Koaktivatoren bzw. Koaktivator-Komplexen und damit der Regulation der Genexpression, weiter zu verbessern.
The main subject of the thesis is the investigation of low-temperature-grown (LTG) GaAs-based photoconductive switches used in the generation of continuous-wave (CW) and pulsed terahertz (THz) radiation. The use of photoconductive switches based on low-temperature-grown GaAs proved to be a viable option in generating electromagnetic transients on a subpicosecond time-scale, corresponding to frequencies of ~1012 Hz (between microwave and far-infrared). The most appealing property of LTG-GaAs is the ultra-short carrier lifetime obtained by incorporation of a large number of As defects when GaAs is grown at low temperatures. However, the reason for poor THz emission efficiency (low CW-THz power lrvrls) is still up to this date not fully understood. The various reasons are to be found in both, optoelectronic properties of the active layer (photoconducting material) as well as in the device characteristics. The thesis focuses primarily on the limitation imposed to the performance of the THz emitters by the material of choice for the active layer (LTG-GaAs) and secondarily, on the impact of a particular emitter design on the THz radiation efficiency. In the beginning of the thesis one finds an ample overview on the electrical and optical properties of the LTG-GaAs material. A special chapter deals with the main features of current-voltage and CW-THz emission characteristics measured from a photoconductive antenna employed as photomixer. We observed deviations from the theoretical predictions of photomixing theory which were explained by considering the high-field electrons effects (velocity overshoot and elongation of the carrier trapping time). With the scope to provide a better understanding of the correlation between device and material properties when the LTG-GaAs material is integrated with a planar antenna (photoswitch), a special THz double-pulse technique (THz-pump and -probe) was implemented. The experimental results assisted by modeling of the double-pulse THz data provide a gainful insight into the ultrafast dynamics of the electrical field and photogenerated carriers. The outcome of the double-pulse experiments is the evidence for long-living carriers in the LTG-GaAs-based photoconductive antenna under applied bias, with a deleterious impact upon the emitter performance (especially for the CW case). Additionally, by measuring the THz transients generated by a constant laser pulse with and without a CW laser background illumination, we obtained further evidence of strong field-screening effects. This phenomenon was also attributed to the existence of long-living space-charge effects. For both cases (pulsed as well as CW) we derived the de-screening time constant. The principal conclusion of the present study is that, besides shortcomings imposed by the THz-circuitry, photomixers based on materials with traps (defects) exhibit great “affinity” for space-charge screening effects with cumulative and therefore long-lived deleterious impact upon device’s performance. An alternative would be the usage of a transient-time limited device where the response time is given by the carrier collection time, possibly with only one type of carrier responsible for THz signal generation.