Refine
Year of publication
Document Type
- Doctoral Thesis (447) (remove)
Language
- German (447) (remove)
Has Fulltext
- yes (447)
Is part of the Bibliography
- no (447)
Keywords
- Paracoccus denitrificans (7)
- RNS (7)
- Cytochromoxidase (6)
- NMR-Spektroskopie (6)
- Elektronentransfer (4)
- Gentherapie (4)
- HIV (4)
- Organische Synthese (4)
- RNA (4)
- Ubihydrochinon-Cytochrom-c-Reductase (4)
Institute
- Biochemie und Chemie (447) (remove)
Humane hämatopoetische Stammzellen (HSCs) besitzen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und übernehmen die kontinuierliche Neubildung aller zellulären Bestandteile des Blutes. Aufgrund der zunehmenden klinischen Bedeutung der HSCs ist es essentiell die molekularen Mechanismen, die den Prozess der Vermehrung und Differenzierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen steuern, aufzuklären und deren funktionelle Bedeutung zu verstehen. Das Ziel der Arbeit war die Identifizierung, Charakterisierung und gerichtete Modulation funktionell relevanter Signalwege, die am Differenzierungsprozess von HSCs zu myeloiden Effektorzellen beteiligt sind. Für diese Untersuchung wurde ein Expansionsprotokoll für humane HSCs, sowie ein Differenzierungsprotokoll für das humane myeloide DC Differenzierungsmodell entwickelt. In der Arbeit wurden drei wichtige Signalwege der Zelle, die Mitogenen Signalkaskade (MAPK), Protein Kinase C (PKC) gekoppelten Prozessen und dem JAK/STAT Signalweg untersucht. Die vorliegende Arbeit zeigt, daß die Stimulation der HSCs mit GM-CSF und IL-4 zu einer zeitlich begrenzten Aktivierung von MAPK/ERK1/2, PKC delta, JAK2, sowie STAT5 und STAT6 führte. Kommerzielle Inhibitoren von MEK, PKC und Januskinase hemmten selektiv diese Aktivierung und führten zu einer veränderten Hämatopoese. Die Aktivierung dieser Signalwege ist daher für die myeloide Differenzierung von HSCs zu Dendritischen Zellen von entscheidender Bedeutung. Einer der entscheidenden nuklearen Faktoren für die myeloide Differenzierung ist der Ets-Transkriptionsfaktor PU.1, dessen Aktivität durch Phosphorylierung reguliert sein könnte. Obwohl die funktionelle Rolle von PU.1 in der Differenzierung von HSC in der vorliegenden Arbeit nicht vollständig geklärt werden konnte, wurde jedoch erstmals im in vitro Kinase-Assay gezeigt, daß PU.1 durch PKC delta, aber nicht durch MAPK/ERK2 spezifisch phosphoryliert wird. In einem PU.1-spezifischen Luciferasereporter-Assay wurde die transkriptionelle Aktivität von PU.1 durch die Inhibition von PKC delta und MAPK/ERK1/2 deutlich reduziert. Weiterführende Experimente in einem komplexen Differenzierungsmodell von humanen HSCs wiesen darauf hin, daß durch den gezielten Einsatz von Signalweginhibitoren eine Verschiebung der Verhältnisse der gebildeten Blutzellkolonieformen erreicht werden kann. So war die Differenzierung zu Erythrozyten von der Mitogenen Signalkaskade unabhängig, wohingegen die Differenzierung zu Makrophagen eine deutliche Abhängigkeit von der Aktivität der Mitogenen Signalkaskade sowie von der Aktivierung des Protein Kinase C Signalwegs zeigte. Im Gegensatz dazu führte die Inhibition der Januskinasen (JAKs) zu einer Hemmung der Differenzierung in allen Kolonieformen. Insgesamt zeigten die Ergebnisse, daß der MAPK/ERK und PKC delta Signalweg bei der Differenzierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen eine wichtige Rolle spielen und eine gerichtete Steuerung der Differenzierung durch den Einsatz spezifischer Signalweginhibitoren möglich erscheint.
Die vorliegende Arbeit fasst folgende experimentellen Arbeiten zusammen: • Synthese von amorphem, schwarzem, basischem Silicium Si am,schw,ox und amorphem, schwarzem, nicht basischem Silicium Siam,schw durch Reduktionsreaktion von Siliciumtetrachlorid mit Natrium. • Reaktivität des amorphen Siliciums Si am gegenüber verschiedenen Gasen: Cl2, HCl, CH3Cl • Reaktivität von Si am gegenüber Alkoholen bei Raumtemperatur. • Reaktivität von Si am gegenüber Alkoholen und Essigsäure in einem geschlossenen System, nicht katalysiert/katalysiert durch Cu(I)Cl und Cu(I)O. • Reaktivität von Si am,schw,ox und Si am,schw gegenüber Alkoholen und Essigsäure in einem offenen System (Ofen, „slurry phase“-Reaktor), nicht katalysiert/katalysiert durch Cu(I)Cl und Cu(I)O. • Thermische und katalytische Disproportionierungsreaktionen von Methylmethoxysilanen, katalysiert durch Alkalimetalle (Na), salzartige Verbindungen (Ca(OH)2, MgSO4/C, Na2SO4/C und (NH4)2SO4/C) und Lewis-Säuren (AlCl3). • Komproportionierung zwischen Trimethylmethoxysilan und Methyltrimethoxysilan Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag in Untersuchung der chemischen Reaktivität von amorphem Silicium Si am, synthetisiert durch Na-Reduktion von Siliciumtetrachlorid, gegenüber verschiedenen Gasen, wie z. B. Chlorgas, Chlorwasserstoff und Methylchlorid, gegenüber Alkoholen, wie z. B. Methanol, Ethanol und Phenol und gegenüber Essigsaure unter unterschiedlichen Reaktionsbedingungen. Die Reaktion zwischen amorphem Silicium Si am und Cl2-Gas führt bei 240-250°C zu Tetrachlorsilan SiCl4 als einziges Produkt. Die Reaktion mit HCl-Gas liefert im Temperaturbereich zwischen 360-370°C zwei Produkte: 15% Dichlorsilan, H2SiCl2 und 85% Trichlorsilan, HSiCl3. Im Temperaturbereich zwischen 370-420°C entstehen drei Produkte: 36,4% Dichlorsilan H2SiCl2, 58,5% Trichlorsilan HSiCl3 und 5,1% Tetrachlorsilan SiCl4. Über eine Temperaturführung kann die Produktbildung wesentlich beeinflusst und damit auch gesteuert werden. Durch eine Reaktion mit Methylchlorid bei 560°C entstehen zwei Produkte: 79% Methyltrichlorsilan CH3SiCl3 und 21% Dimetyldichlorsilan (CH3)2SiCl2. Basisches Silicium Siam,schw,ox liefert in den Reaktionen mit Alkoholen und Essigsäure unter Rückfluss-Bedingungen (Temperaturen zwischen 20 und 420°C; offene Reaktionssysteme) jeweils ein einziges Produkt und führt mit den korrespondierenden Partnern selektiv zu Tetramethoxy-, Tetraethoxy-, Tetraphenoxy- und Tetraacetoxysilan. Diese Reaktionen werden durch die im eingesetzten Siam/NaCl-Gemisch vorhandene Base (NaOH, Na2Ox; x = 1, 2) katalysiert. Gemischte Alkylalkoxysilane oder Siloxane entstehen unter den vorgegebenen Bedingungen nicht. Silicium setzt sich dabei in den Reaktionen mit Methanol und Ethanol vollständig um. Werden die Bedingungen modifiziert und die Reaktionen in geschlossenen Systemen (Reaktionsampullen) bei 150°C, katalysiert durch 5 Gew. % Cu(I)Cl im Mol-Verhältnis Si am,schw,ox/CH3OH 1:3 und 1:4 durchgeführt, wird Trimethoxysilan in 91% und 84% Ausbeute gewonnen. Der Produktbildungsweg führt offensichtlich über die Katalyse eines Komplexes Na+[Cu(OH)Cl]-, der in situ aus Cu(I)Cl und NaOH gebildet wird. Nicht basisches Silicium, Siam,schw, reagiert mit Methanol bei Raumtemperatur zu Trimethoxysilan HSi(OCH3)3 (16-18%) und zu Tetramethoxysilan Si(OCH3)4 (84-82%). Die Produktbildung kann durch Änderungen Reaktionsbedingungen in Richtung von Trimethoxysilan verschoben werden. So entsteht Trimethoxysilan in einer geschlossenen Ampulle zu 95% als Hauptprodukt der Reaktion zwischen amorphem Silicium und Methanol im Mol-Verhältnis 1:3 in Anwesenheit von NH4HF2 als Aktivator. 84,5% Trimethoxysilan entstehen in einer Ampulle bei 200°C nach 5 Stunden Reaktionszeit, dann wenn Methanol im stöchiometrischen Verhältnis 8:1 eingesetzt wird. Der Umsatz an Silicium ist praktisch vollständig (100%). Wird die Reaktion zwischen Siam,schw und Methanol in einem „slurry phase“-Reaktor durchgeführt, resultiert eine Abhängigkeit der Produktausbeute vor allem vom Lösungsmittel, dann aber auch von den weiteren Bedingungen. In Dodecylbenzol entsteht das Trimethoxysilan bei 230°C und mit Cu(I)O als Katalysator zu 72% in einer 8-stündigen Reaktion. Unter vergleichbaren Bedingungen, aber in Isoparaffinöl bildet sich Trimethoxysilan zu 61%. In einem modifizierten „slurry phase“-Reaktor, in dem die Produkte mit überschüssigem Methanol sofort aus der Reaktion abgeführt werden, entsteht das Trimethoxysilan nicht. Allerdings bilden sich in diesem Fall methylierte Methoxysilane. Der Umsatz an Silicium hängt auch von der Temperatur des Methanol-Dampfes ab. Wird die Temperatur zwischen 150-200°C gehalten, werden 49% des Siliciums umgesetzt. Ansonsten beträgt die Umsatzrate des Siliciums 20-25%. Amorphes, schwarzes, basenfreies Silicium, Si am,schw, reagiert bei 150°C mit Ethanol im Mol-Verhältnis 1:3 zu 91% und bei 200°C (Mol-Verhältnis Si : EtOH 1:8) zu 86% Triethoxysilan, HSi(OEt)3. Die Reaktion zwischen nicht basischem Silicium Si am,schw und Essigsäure liefert in der Siedehitze kein Tetraacethoxasilan, sondern nur Polyacethoxysilane mit einem Polymerisationsgrad von n = 2, 3, in einer Ampulle bildet sich jedoch ein Gemisch aus Tetraacetoxysilan und verschiedenen Acethoxypolysilanen. Die Polysilanbildung verstärkt sich mit zunehmender Reaktionstemperatur und –dauer. Die Reaktion zwischen Si am,schw und Essigsäure in einem offenen System (Ofen) liefert bei 300°C außer Tetraacetoxysilan ein Gemisch von Acethoxypolysilanen mit n=2-6. Versuche zur Bildung von Phenoxsilanen aus Si am,schw. und Phenol schlugen bei Temperaturen zwischen 150-300°C fehl. Das MALDI-TOF-MS-Spektrum einer bei 225-230°C im Vakuum siedenden Fraktion, die aus Reaktion von Si am,schw mit Phenol bei 420°C im Ofen entstanden ist, zeigt Spuren von Tetraphenoxysilan und organische Polymere mit dem Molekulargewichht bis zu 960 Dalton. Während Umsetzungen von amorphem Silicium mit Methanol in geschlossenen Reaktionsampullen Trimethoxysilan und Tetramethoxysilan als Hauptprodukte liefern, bilden sich in einem offenen System methylierte Methoxysilane MenSi(OMe)4-n (n=1, 2) in unterschiedlichen Ausbeuten. Dimethyldimethoxysilan entsteht aus basischem Silicium Siam,schw,ox nicht; selbst durch Katalysatorzusatz entsteht das gewünschte Produkt nur in Spuren. Die Monomethylierung verläuft dagegen erfolgreicher. Die höchste Ausbeute an Methyltrimethoxysilan (33,7%) wird bei 320°C mit 20 Gew. % Cu(I)Cl als Katalysator erzielt. Völlig anders verhält sich nicht basisches Silicium Si am,schw , denn es reagiert mit Methanol in einem offenen System bei 350°C zu 13% Dimethyldimethoxysilan (CH3)2Si(OCH3)2, und 37% Methyltrimethoxysilan CH3Si(OCH3)3. In Reaktionen mit größeren Silicium-Mengen (Si-Gehalt: 39-60 mmol) entstehen in einem nicht gerührten Reaktionsreaktor nach 20’ Minuten Reaktionszeit bei 300°C 26% Dimethyldimethoxysilan (CH3)2Si(OCH3)2 und nach 45’ Minuten Reaktionszeit 49,5% Methyltrimethoxysilan CH3Si(OCH3)3. In einem nicht gerührten Reaktionsrohr entstehen nach 3 Stunden Reaktionszeit 25-30% Dimethyldimethoxysilan bei 300°C und mit 20 Gew. % Kupfer(I)Chlorid als Katalysator. In einem gerührten Reaktionsrohr bilden sich bei 350°C und mit 20 Gew. % Cu(I)Cl nach 3-stündiger Reaktion 23,5% (CH3)2Si(OCH3)2 und 53,3% CH3Si(OCH3)3. Das Vorhandensein des Katalysators erhöht die Ausbeute an methylierten Methoxysilanen in den Reaktionen zwischen nicht basischem Silicium und Methanol. Aus dem Verlauf der Reaktion im Ofen lässt sich schließen, dass die größte Menge des Dimethyldimethoxysilans, (CH3)2Si(OCH3)2, während der ersten 20-40 Minuten entsteht. Danach sinkt der Anteil mit zunehmender Reaktionszeit, es bilden sich verstärkt die festen Dimethyloligosiloxane. Die Ausbeute an Tetramethoxysilan, Si(OCH3)4, wächst mit der Reaktionszeit kontinuierlich. Dagegen bleibt die Ausbeute an Methyltrimethoxysilan, CH3Si(OCH3)3, während 3-stündiger Reaktion relativ konstant. Die Bildung aller drei Produkte wurde zwischen 300° und 350°C detailliert verfolgt. Nur ca. 20% des Siliciums setzen sich zu den flüchtigen Produkten um, rund 80% Silicium bleiben in fester Form als nicht abreagiertes Silicium und als feste Oligodimethylsiloxane erhalten. Eine nicht katalysierte Reaktion zwischen Si am,schw und Ethanol liefert nach 3h Reaktionszeit in einem nicht rührenden Reaktor etwa 23% HSi(OCH3)3 und etwa 72% Si(OEt)4. Etylenethoxysilane oder -siloxsane bilden sich nicht. Zum Weiteren ist es gelungen, Dimethyldimethoxysilan durch Disproportionierungsreaktion aus Methyltrimethoxysilan und Tetramethoxysilan über metallischem Natrium im Mol-Verhältnis 1:1 in einer Ampulle bei 250°C herzustellen. Aus Disproportionierung von Methyltrimethoxysilan sind 12% Dimethyldimethoxysilan zu erhalten. Die Disproportionierung von Tetramethoxysilan führt zu 27% Dimethyldimethoxysilan, (CH3)2Si(OCH3)2, 34% Methyltrimethoxysilan, CH3Si(OCH3)3, und 11% Trimethylmethoxysilan, (CH3)3SiOCH3. Die Menge des eingesetzten Natriums muss in weiteren Arbeiten noch optimiert werden. Eine Komproportionierungsreaktion zwischen Trimethylmethoxysilan, (CH3)3SiOCH3, und Methyltrimethoxysilan, CH3Si(OCH3)3, zu Dimethyldimethoxysilan, (CH3)2Si(OCH3)2, fand unter den in dieser Arbeit beschriebenen Bedingungen nicht statt. Diese Ergebnisse sind ein im Labormaßstab chlorfreies Verfahren zur Herstellung von methylierten Methoxysilanen. Unter der Voranstellung der Aufskalierbarkeit wird damit eine neue Route eines möglicherweise technisches Prozesses (das Q-Verfahren) zu Darstellung von Siliconen zugänglich; diese führt wie folgt aus: Siliciumtetrachlorid → amorphes Silicium → Tetramethoxysilan/Tetraethoxysilan/Tetraacetoxysilan → Methylmethoxysilane → Silicone. Es gilt nun, die Synthesebedingungen nach erfolgreicher Optimierung in den Pilotmaßstab zu überführen. Die Synthese von Trimethoxysilan, HSi(OCH3)3, erscheint bereits jetzt schon den Bedingungen des technisch durchführenden Cromptonprozesses überlegt zu sein. Diese bietet jedoch den Vorteil, von technisch verfügbarem Silicium anzugehen. Eine exakte und vergleichende Prozess-Analyse wird darüber Aufschluss geben, ob die in dieser Arbeit erworbenen Ergebnisse zu einer technischen Umsetzung führen.
Ferrocenbasierte Polymere haben in den vergangenen Jahrzehnten reges Interesse hervorgerufen, welches in ihren einzigartigen optischen und elektronischen Eigenschaften begründet ist. Diese sind auf die Anwesenheit der redoxaktiven Eisenionen sowie auf kooperative Effekte entlang des Polymerstrangs zurück zu führen. Die substanzspezifischen Merkmale hängen dabei nicht nur von der Position der Ferroceneinheiten im Makromolekül ab, sondern auch von der chemischen Natur der verbrückenden Einheiten. Hier bewähren sich solche Atome und Gruppen, die in der Lage sind, Elektronendichte zu übertragen. Ein in dieser Hinsicht besonders viel versprechendes Element ist Bor, da es im sp2-hybridisierten Zustand ein leeres p-Orbital besitzt und dieses für die Übertragung von Ladungsdichte zur Verfügung stellen kann. Vor diesem Hintergrund galt es nun auf der Basis neuartiger Kondensationsreaktionen zunächst Diferrocenylborane zu synthetisieren und anhand ausgewählter Derivate Kenntnisse über charakteristische Eigenschaften dieser Substanzklasse zu gewinnen. Die kurzkettigen Moleküle dienten als Modellverbindungen für Poly(ferrocenylen)e, welche im Mittelpunkt des zweiten Teils dieser Arbeit standen. .... In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass sich das neuartige Polymer [-fc-B(Br)-]n (33) hervorragend als Edukt eignet, um vielfältige borverbrückte Poly(ferrocenylen)-Derivate sowohl mit trigonalen als auch mit tetragonalen Borzentren darzustellen. Die beschriebenen Systeme weisen eindeutige Merkmale von Eisen-Eisen-Wechselwirkungen entlang der Polymerhauptkette auf, wobei sich das Ausmaß dieser Interaktionen über die Wahl der Substituenten an den Boratomen gezielt beeinflussen lässt. Die dargestellten Materialien besitzen somit großes Potential für die Entwicklung „Molekularer Drähte“ auf der Nanoskala.
Bis zur Entfaltung der Wirkung eines Pharmakons laufen zahlreiche komplexe Vorgänge ab, die sich in drei wesentliche Phasen unterteilen lassen. Die pharmazeutische Phase umfasst mit der Applikation und dem Zerfall der Arzneiform sowie dem Auflösen des Wirkstoffes Vorgänge, die im wesentlichen von den galenischen Eigenschaften des Arzneistoffes abhängen. In der pharmakokinetischen Phase erfolgt mit der Resorption die Aufnahme des Wirkstoffes in den Organismus, dem sich die Verteilung in die unterschiedlichen Gewebe über die Blutbahn anschließt. Durch verschiedene Eliminationsprozesse wird der Wirkstoff zuletzt wieder aus dem Körper ausgeschieden. Mit dem Erreichen des Wirkortes beginnt die pharmakodynamische Phase, in der die pharmakologischen Effekte des Arzneistoffes zur erwünschten klinischen Wirkung führen. Der Nachweis des Pharmakons am Wirkort in klinisch-relevanten Konzentrationen ermöglicht somit Rückschlüsse auf die Wirksamkeit des Arzneistoffes, aber unter bestimmten Voraussetzungen auch auf dessen Wirkmechanismus. Während mittlerweile ein Großteil neuer Arzneistoffe mit Hilfe unterschiedlicher Mechanismen durch exaktes Drug Targeting an den Wirkort gesteuert werden, weisen andere Substanzen teilweise ungewollt eine gewebespezifische, dirigierende Komponente auf, die neben der eigentlichen Hauptwirkung weitere unterstützende oder auch unerwünschte Effekte auslösen. Von besonderem Interesse ist diese Gewebespezifität für pflanzliche Arzneistoffe, deren Wirkkomponenten bislang noch nicht eindeutig bestimmt werden konnten. Gemeinsam mit anderen pharmakologischen Befunden kann der analytische Nachweis eines wirksamkeitsmitbestimmenden Inhaltsstoffes am Wirkort in ausreichenden Konzentrationen ein weiterer deutlicher Hinweis auf dessen Wirkbeteiligung sein. Besonders vor dem Hintergrund einer rationalen, evidenz-basierten Pharmakotherapie, deren Anforderungen die pflanzlichen Arzneien mittlerweile ebenso wie die synthetischen Wirkstoffe erfüllen müssen, ist die Erforschung sowohl des Wirkprinzips als auch der Pharmakokinetik des Wirkstoffes von besonderer Bedeutung. Obwohl Johanniskrautextrakte bereits seit dem 17. Jahrhundert gegen die Melancholie und somit als Antidepressivum eingesetzt wurden, sind sowohl der exakte Pathomechanismus der Depression als auch die Wirkkomponente und der Wirkmechanismus der Extrakte aus Hyperici herba noch immer Gegenstand umfassender Forschung. Vor allem wegen der geringen Nebenwirkungsrate sind Johanniskrautpräparate gegenüber synthetischen Antidepressiva eine bevorzugte Alternative für die Therapie leichter bis mittelschwerer Depressionen. Ähnlich den Effekten der synthetischen Antidepressiva sind Johanniskrautextrakte in der Lage, durch eine Wiederaufnahmehemmung der Neurotransmitter Noradrenalin, Serotonin, Dopamin, sowie GABA und L-Glutamat deren Konzentration im synaptischen Spalt zu erhöhen, was zu einer nachfolgenden adaptiven Veränderung der jeweiligen Rezeptoren führt. In mehreren Studien konnten diese Effekte vornehmlich den Phloroglucinolderivaten Hyperforin und Adhyperforin zugeordnet werden. Unterstützt wurden diese in vitro und in vivo Befunde durch die Ergebnisse einer Vielzahl verhaltenspharmakologischer Untersuchungen, die einen deutlichen Zusammenhang zwischen der Wirksamkeit in antidepressiven Modellen und dem Gehalt an Hyperforin in den Extrakten ergeben haben. Zahlreiche klinische Studien belegen darüber hinaus die Wirksamkeit und Verträglichkeit von Johanniskrautextrakten. ...
Glutamat ist der häufigste Neurotransmitter im menschlichen Hirn. Die Konzentration des Glutamats in der extrazellulären Flüssigkeit wird durch Glutamat-Transporter (Sekundärtransporter) kontrolliert. Liegt es in zu hoher Konzentration im synaptischen Spalt vor, kommt es zur Schädigung von Nervenzellen, ein Prozess, der als Exzitotoxizität bezeichnet wird. Eine Fehlfunktion oder fehlerhafte Produktion der Glutamat-Transporter im zentralen Nervensystem wird bei verschiedenen Krankheiten, wie der amyotrophen Lateralsklerose, der Ischämie, der Epilepsie, der Schizophrenie und der Alzheimer-Krankheit vermutet. Ziel dieser Arbeit war die Funktions- und Strukturanalyse der Glutamat-Transporter GLT-1 aus Rattus norvegicus und GltP aus E. coli, um die Familie der Glutamat-Transporter und die Entstehung der mit diesen Transportern in Verbindung gebrachten Krankheiten besser zu verstehen. Um die für diese Analysen gebrauchten Mengen an Protein herzustellen, mussten die Proteine heterolog produziert werden, da sie in natürlichen Geweben nicht in ausreichender Menge vorkommen. In dieser Arbeit wurde Glutamat-Transporter GLT-1 aus Rattus norvegicus funktional mit dem Semliki Forest Virus Expressionssystem überproduziert. Dazu wurden verschiedene Vektorkonstrukte hergestellt. Die routinemäßige Überproduktion des Transporters wurde im 8 l - Maßstab durchgeführt. In Zellen, die für die Produktion von GLT-1 mit rekombinanten, aktiven SF-Viren infiziert wurden, konnte eine sehr hohe Aktivität des Glutamat-Transporters nachgewiesen werden. Die Menge des hergestellten GLT-1 wurde in Bindungsexperimenten mit (2S,4R)-4-Methylglutamat quantifiziert: jede Zelle enthielt 3,5 x 106 Transporter: 61,04 pmol GLT-1/mg Gesamtprotein. Das entspricht einer Ausbeute von etwa 2-3 mg/8 l Zellkultur. Die hier durchgeführte Überproduktion des GLT-1-Glutamat-Transporters ist die erste Überproduktion eines eukaryotischen Sekundärtransporters mit dem Semliki Forest Virus Expressionssystem, bei dem große Mengen an aktivem Protein hergestellt werden konnten. Zudem ist die Ausbeute an funktionalem GLT-1 mit 61 pmol/mg Gesamtprotein verglichen mit den in der Literatur vorliegenden Daten zur Überproduktion eukaryotischer sekundärer Transporter mit anderen Expressionssystemen die höchste, die bis dato erreicht werden konnte. Der größte Anteil des heterolog produzierten GLT-1 war glykosyliert. Die gelelektrophoretische Analyse des aufgereinigten Transporters ergab zwei Banden, die ein apparentes Molekulargewicht von etwa 70-75 kDa und etwa 53-58 kDa hatten. In einer Western-Blot-Analyse konnten beide Banden des GLT-1-Transporters mit einem anti-His-Antikörper und einem anti-GLT-1-Antikörper nachgewiesen werden. Durch Deglykosylierung mit PNGase F und einer Trennung beider Banden durch Lektin-Affinitätschromatographie konnte gezeigt werden, dass es sich bei der 70-75 kDa-Bande um die glykosylierte Form und bei der 53-58 kDa-Bande um die nicht glykosylierte Form des Glutamat-Transporters handelte. Es wurde gezeigt, dass zwischen der Aktivität des GLT-1 und dessen Glykosylierung kein Zusammenhang besteht. Denn beide Formen lagen als vollständige, funktionale Transporter vor und transportierten nach Rekonstitution in Liposomen Glutamat. Der prokaryotische Glutamat-Transporter GltP aus E. coli wurde in dem E. coli-Stamm C43 (DE3) überproduziert. Die Ausbeute war etwa 2 mg pro Liter Kultur. Die Funktionalität des Transporters nach Rekonstitution in Lipidvesikel wurde durch spezifische Aufnahme von Glutamat gezeigt. Für die Solubilisierung beider Transporter aus den Zellmembranen wurden verschiedene Detergentien getestet. GltP ließ sich am besten mit DM oder DDM aus der Membran extrahieren, für die Solubilisierung des GLT-1 wurde mit großer Effizienz DDM oder CYMAL-7 eingesetzt. GltP und GLT-1 wurden mit einer Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie in großer Menge und hoher Reinheit angereichert werden. Die Aufreinigungsprozedur beeinträchtigte nicht die Funktionalität des prokaryotischen GltP. Bei dem eukaryotischen Transporter GLT-1 war nach der Ni2+-NTA-Säule keine Transportaktivität mehr messbar. Durch Zusatz von Asolectin in den Wasch- und Elutionspuffern während der Aufreinigung konnte die Funktionalität des Transporters jedoch erhalten werden. Aufreinigungen mit anderen Lipiden unter anderem in Kombination mit Cholesterin lieferten einen Glutamat-Transporter, der in seiner Konformation stabilisiert, jedoch nach Rekonstitution nicht aktiv war. Eine weitere Steigerung der Ausbeute an aktivem GLT-1 konnte durch den Einsatz von Reduktionsmitteln, wie DTT oder b-Mercaptoethanol, die die Aggregation des Transporters verhinderten, erreicht werden. GltP katalysiert den elektrogenen Transport von Glutamat bzw. Aspartat unter Symport von mindestens zwei Protonen. GLT-1 transportiert ein Molekül Glutamat zusammen mit drei Na+-Ionen und einem Proton im Austausch gegen ein K+-Ion. Durch Transportmessungen konnte der hochspezifische Glutamat-Transport der aufgereinigten Transporter belegt werden. Der Glutamat-Transport des in Liposomen rekonstituierten GltP zeigte eine klare Abhängigkeit von einem anliegenden Protonengradienten. Aufgereinigtes und rekonstituiertes GLT-1 transportierte nur Aspartat bzw. Glutamat, wenn ein Na+ und ein K+-Gradient vorhanden waren. Die Aspartat- bzw. Glutamat-Aufnahme konnte bei beiden Transportern durch den kompetitiven nichttransportablen Inhibitor (2S,4R)-4-Methylglutamat blockiert werden. Der Assoziationsgrad der Glutamat-Transporter GltP und GLT-1 und das Gleichwicht zwischen den verschiedenen oligomeren Zuständen wurde in dieser Arbeit eingehend mit biochemischen Methoden untersucht: 1. „Cross-linking“-Studien, 2. Blaue Nativgelelektrophorese, 3. Analytische Ultrazentrifugation, 4. Laserlichtstreuung, 5. Gelfiltrationschromatographie. Die dabei erhaltenen Ergebnisse bewiesen eine tetramere Assoziierung beider Proteine. Die Gelfiltrationsexperimente zeigten, dass die Transporter in Detergenzlösung in unterschiedlichen Assoziationsgraden vorliegen. Das Gleichgewicht zwischen den oligomeren Formen war reversibel und abhängig von der Art und Konzentration des Detergenz, der Proteinkonzentration und der Temperatur. Zur Untersuchung der Struktur der Glutamat-Transporter wurden vor allem mit GltP zahlreiche 2D-Kristallisationsexperimente durchgeführt. Trotz Variation aller denkbar möglichen Parameter konnten keine Kristalle erhalten werden. Das beste Ergebnis war ein guter Einbau des Proteins in Lipidvesikel (etwa 80%). Da keine Kristalle erhalten wurden, wurde für beide Proteine eine Einzelpartikelanalyse durchgeführt. Dabei wurde nach zweidimensionaler Alignierung und Klassifizierung die „random conical tilt“-Methode angewendet. Die daraus resultierenden dreidimensionalen Dichtekarten des GltP und GLT-1 waren sehr ähnlich und wiesen vier nicht exakt symmetrische Massen in annähernd quadratischer Anordnung auf. Die Auflösung war 26 Å bzw. 36 Å. Die Größe der Einzelpartikel (für GltP: Höhe 37 Å, Breite 75 Å bzw. 86 Å, Länge 100 Å). ihre annähernd quadratische Anordnung und ihre Symmetrie lassen vermuten, dass es sich dabei um Tetramere der Glutamat-Transporter handelt, die aus zwei nicht symmetrischen Dimeren zusammengesetzt sind. Die hier präsentierten Daten sind die ersten zur dreidimensionalen Struktur von Glutamat-Transportern. Schließlich wurde nachgewiesen, dass der in BHK-Zellen heterolog exprimierte Glutamat-Transporter GLT-1 vorwiegend in „lipid rafts“ lokalisiert ist. Die Größe der „rafts“, die anhand der Größe der „Proteininseln“ in Gefrierbrüchen bestimmt wurde, war etwa 200 nm im Durchmesser. Die „GLT-1-Inseln“ bzw. „lipid rafts“ konnten durch das teilweise Entfernen von Cholesterin aus der Membran zerstört werden. Damit ging eine Reduktion der Glutamat-Transporter-Aktivität von etwa 20% einher. Es ist das erste Mal, dass „lipid rafts“ durch die natürliche Assemblierung von Proteinen mit Hilfe von Gefrierbruchanalysen und Elektronenmikroskopie beobachtet wurden.
Untersuchungen zur ZNS-Bioverfügbarkeit wirksamkeitsbestimmender Inhaltsstoffe von Johanniskraut
(2007)
In der vorliegenden Arbeit wurde die ZNS-Bioverfügbarkeit der Quercetin-Flavone und der Naphthodianthrone aus Hypericum perforatum untersucht. Hierzu wurde jew. eine HPLC-gestütze Methode zur Quantifizierung der genannten Stoffe in ZNS und Plasma erstellt und in enger Anlehnung an internationale Richtlinien (ICH- u. FDAGuidelines) validiert. Mit Hilfe dieser Methoden wurden im Anschluss Rattenfütterungsstudien durchgeführt und ausgewertet. Im Falle der Quercetin-Flavone konnte eindeutig gezeigt werden, dass diese Stoffgruppe ZNS-bioverfügbar ist und bei wiederholter Gabe (1 x tgl.) über den beobachteten Zeitraum von 8 Tagen im ZNS kumuliert. Ferner ist es gelungen, erste ZNS-Spiegelkurven der Quercetin-Flavone nach Einmal- und Mehrfach-Gabe aufzuzeichnen. Im Gegensatz hierzu weisen die Naphthodianthrone, unter Berücksichtigung der analytischen Grenzen, keine ZNS-Bioverfügbarkeit auf. Betrachtet man diese Ergebnisse im Kontext der bisher erschienenen Publikationen zu Johanniskraut, lässt sich sagen, dass durch die vorliegende Arbeit die Rolle der Flavonoide eindeutig an Bedeutung gewinnt und die der Naphthodianthrone eindeutig an Bedeutung verliert. Schaut man auf die bisher untersuchten Inhaltsstoffe von Johanniskraut, wird deutlich, dass den Phloroglucinolen die wohl herausragendste Bedeutung zukommt, was nicht zuletzt durch Keller et al.[137] und Müller et al. [27,59,67] gezeigt werden konnte. Für die klinische Wirksamkeit des Hypericum-Extraktes sind jedoch auch die Flavonoide essentiell, was durch Tierstudien gezeigt und durch diese Arbeit unterstüzt werden konnte[114]. Der Mechanismus, durch den die Flavonoide zur antidepressiven Wirksamkeit beitragen, liegt, im Gegensatz zu dem der Phloroglucinole, jedoch noch im Dunklen. Durch die Präsenz von Quercetin bzw. dessen Metaboliten im ZNS auf der einen und den Ergebnissen von Tierstudien zur antidepressiven Wirksamkeit isolierter Flavonoide mit Hilfe des Porsolt-Tests auf der anderen Seite[33] lässt sich jedoch spekulieren, dass die Flavonoide einen direkten antidepressiven Effekt ausüben und nicht nur indirekt durch Verbesserung, beispielsweise der ZNS-Bioverfügbarkeit der Phloroglucinole o. ä., zu den antidepressiven Eigenschaften des Extraktes beitragen. Durch ihr Unvermögen, die Blut-Hirn-Schranke in nennenswerten Konzentrationen zu überschreiten, treten die Naphthodianthrone, die in der Vergangenheit als für die Wirksamkeit wichtigsten Inhaltsstoffe angesehen wurden, eindeutig in den Hintergrund. Als Beitrag dieser Stoffgruppe zur antidepressiven Wirksamkeit ist demnach erstens ein wie auch immer gearteter indirekter Effekt durch Verbesserung der ZNS-Bioverfügbarkeit der ZNS-gängigen Substanzen, zweitens ein wegen der bestenfalls möglichen, niedrigen Konzentrationen schwacher antidepressiver Effekt im ZNS, drittens ein antidepressiver Effekt durch aktive Metaboliten oder viertens ein antidepressiver Effekt, der sich in der Peripherie beispielsweise durch Beeinflussung der HPA-Achse abspielt, denkbar. Für ersteres existieren bis dato keinerlei Anhaltspunkte, für den zweiten Punkt existieren weder Beweis noch Gegenbeweis noch Spekulationen in der Literatur, dasselbe gilt für den dritten Punkt, der vierte Punkt wird hingegen kontrovers diskutiert[44,97,143]. In Publikationen wurde hierzu festgestellt, dass unter dem Einfluss von Hypericin sich die Blutspiegel an Cortisol und ACTH, die bei Depressiven erhöht bzw. gestört sind, wieder normalisieren. Der Einwand der Kritiker dieses Wirkmodells scheint hierbei aber plausibel, da es sich bei dem mit Hilfe von Hypericin beeinflussbaren, beobachteten Phänomen der Erhöhten Cortisol- und ACTH-Plasmaspiegel auch nur um ein Symptom einer Depression und nicht um einen für die Depression ursächlichen Vorgang handeln kann. Nicht jeder, bei dem erhöhte Cortisol- und veränderte ACTH-Spiegel vorliegen ist zwangsläufig depressiv. Das exakte Zusammenspiel der einzelnen Extrakt-Komponenten, von denen die bisher in den Focus der Untersuchungen geratenen Stoffe nur etwa 10 bis 15% ausmachen, bleibt jedoch auch weiterhin zum größten Teil im Unklaren, wenngleich gerade dieses Zusammenspiel die besonderen Eigenschaften des Extraktes und dessen Wirkung ausmachen. Unverzichtbare Bestandteile sind hierbei Phloroglucinole und Flavonoide, die in angemessenen Konzentrationen im Extrakt repräsentiert sein müssen, um ein klinisch hochwertiges Produkt zu gewährleisten. Inwieweit ein repräsentativer Gehalt an Hypericinen im Extrakt vorhanden sein sollte, ist nicht zuletzt auf Grund der Ergebnisse dieser Arbeit mit einem Fragezeichen zu versehen, wenngleich die Datenlage zur Zeit keinesfalls ausreicht, die Hypericine gänzlich aus dem Extrakt zu verbannen. In wie weit die An- oder Abreicherung einzelner Komponenten zu einer Verbesserung der klinischen Wirksamkeit führt, muss jedoch stets in zusätzlichen Studien eruiert werden. Insgesamt steht aber mit dem Johanniskraut-Extrakt für die erfolgreiche Therapie von milden bis mittelschweren Depressionen ein wichtiges, fast unverzichtbares Werkzeug zur Verfügung, das sich insbesondere durch sein verglichen mit synthetischen Antidepressiva, überaus günstiges Profil an unerwünschten Arzneimittel-Wirkungen auszeichnet. Trotz in jüngster Zeit propagierter Bedenken hinsichtlich der Unbedenklichkeit der Anwendung von Johanniskraut Extraktpräparaten besonders in Kombination mit anderen Arzneistoffen, was jedoch einer genaueren Betrachtung nur schwer standhält[144], stellt der Johanniskraut-Extrakt zur Behandlung milder bis mittelschwerer Depressionen ein unverzichtbares Werkzeug dar.
Tumorspezifische T-Zellen stellen den im Prinzip wirkungsvollsten Mechanismus zur Abstoßung von Tumoren dar. Voraussetzung für die Aktivierung tumorspezifischer zytotoxischer CD8+ T-Zellen (Tc oder CTLs) ist die Präsentation von Tumorantigenen auf MHC-Klasse I Molekülen durch professionelle Antigen-präsentierende Zellen (APCs). Wegen ihrer Schlüsselrolle bei der Aktivierung von T-Zellen werden APCs in der aktiven Krebs-Immuntherapie eingesetzt. Unabhängig von CTLs können auch CD4+ Helfer T-Zellen (Th) eine Reihe effektiver Anti-Tumor Mechanismen einleiten. Die Aktivierung von CD4+ erfordert die Präsentation des Antigens via MHC-Klasse II Molekülen. Bis jetzt konnten jedoch nur einige wenige tumor-spezifische Th-Epitope identifiziert werden, welche auf MHC-Klasse II Molekülen präsentiert werden. Aus diesem Grund benutzen die meisten derzeitigen Vakzinierungsstrategien definierte Tc-Epitope, die in der Lage sind, spezifische Immunantworten gegen das Tumorantigen auszulösen. Diese Vakzine basieren auf tumorspezifischen Peptiden, Proteinen oder Proteinfragmenten, aber auch auf DNA-Konstrukten, welche für ein bestimmtes Tumorantigen kodieren. Um allerdings eine ausreichend starke Immunreaktion auszulösen, ist es notwendig diese normalerweise nur schwach immunogenen Substanzen zusammen mit Adjuvanzien zu verabreichen. Dendritische Zellen (DCs) sind hoch-effiziente APCs. Weil sie in der Lage sind, die primäre Immunantwort einzuleiten werden sie auch als „natürliches Adjuvanz“ bezeichnet. Nicht zuletzt deswegen werden bei der Entwicklung von Vakzinen immer mehr die einzigartigen Eigenschaften von DCs ausgenutzt. Gegenwärtige Studien untersuchen daher die Beladung von DCs mit synthetischen, tumorspezifischen Peptiden oder Tumor-Lysaten, um eine Aufnahme des Tumorantigens sowie dessen anschließende Präsentation auf MHCKlasse I Molekülen zu erreichen. Obgleich einige dieser Vakzinierungs-Ansätze zu vielversprechenden Ergebnissen führten, sind solche Strategien mit der aufwendigen und kostenintensiven ex vivo Aufbereitung primärer Dendritischer Zellen verbunden. Zudem muss gewährleistet sein, dass die ausgewählten T-Zell Epitope auch vom jeweiligen MHC-Haplotyp des Patienten präsentiert werden. Um einige dieser Nachteile auszugleichen, wären „Konstrukte“ wünschenswert, welche in vivo einen zielgerichteten Transport eines oder besser, mehrerer T-Zell Epitope zu den Dendritischen Zellen ermöglicht. Mit der Entwicklung und Optimierung von Systemen, die Tumorantigene gezielt zu und in APCs transportieren, könnte die Effizienz herkömmlicher Vakzinierungen gesteigert und deren Dosierung verringert werden. In dieser Arbeit wird die Herstellung sowie die funktionelle Charakterisierung zweier neuartiger Vakzine beschrieben. Diese Vakzine wurden für die in vivo Vakzinierung gegen das tumorassoziierte Antigen ErbB2 (HER2/neu) entwickelt. ErbB2 wird in einer Reihe von Tumoren wie Brust- und Ovarialkarzinomen oder Adenokarzinomen der Lunge überexprimiert. Andere Tumorenentitäten wie Kolon-, Nieren-, Blasen-, Speicheldrüsen-, Prostata- und Pankreaskarzinome zeigen ebenfalls eine variable Überexpression von ErbB2. Ziel des ersten der beiden Vakzinierungsansätze war eine verbesserte Aufnahme und Präsentation von Tumorantigenen durch APCs zu erreichen. Als Teil eines Fusionsproteins sollte hier die zielgerichtete Bindung einer antigenen Determinante an APC-spezifische Oberflächenmoleküle und deren anschließende Aufnahme und Prozessierung innerhalb von APCs ermöglicht werden. Als mögliche APC-Bindedomäne wurde ein Fragment gewählt, welches sich vom extrazellulären Anteil des B7-Rezeptors CTLA-4 (CTLA-4125) ableitet. B7 ist ein Oberflächenprotein, das speziell auf APCs exprimiert wird. Nach der bakteriellen Expression und Reinigung wurde durch FACS-Analyse gezeigt, dass lösliches humanes CTLA-4125 spezifisch sowohl an murine als auch humane B7 Moleküle bindet und daher als effektive APC-Bindungsdomäne für den zielgerichteten Transport von Tumorantigenen zu APCs verwendet werden kann. Als chimäre Proteinvakzine zur spezifischen Bindung an APCs wurden zwei mit C-ErbB2(N) bzw. C-E-ErbB2(N) bezeichnete Fusionsproteine konstruiert. Diese setzen sich aus CTLA-4125 am N-Terminus für die Bindung an APCs und einem Fragment des extrazellulären Teils des humanen tumorassoziierten ErbB2 Antigens (ErbB2(N), Aminosäuren 1-222) am C-Terminus zusammen. Beim C-E-ErbB2(N) Protein wurde zusätzlich die Translokationsdomäne von Pseudomonas exotoxin A (ETA II) zwischen der APC-Bindungsdomäne und der antigenen Determinante eingefügt. Diese Domäne könnte nach Rezeptor-vermittelter Aufnahme des Fusionsproteins die Freisetzung des Tumorantigens aus dem Endosom ins Zytoplasma verbessern und so die Prozessierung und Präsentation des Antigens via MHC-Klasse I verstärken. Beide chimären CTLA-4-ErbB2 Fusionsproteine wurden in E. coli exprimiert und mittels Metallchelat-Chromatographie aus den bakteriellen Lysaten gereinigt. Die spezifische Bindung der rekombinanten Fusionsproteine an B7 Moleküle auf der Zelloberfläche sowie deren Aufnahme durch B7-exprimierende humane Raji Zellen wurde mittels FACS Analyse und konfokaler Mikroskopie nachgewiesen. In Balb/c Mäusen wurde untersucht, inwieweit die Fusionsproteine eine Immunantwort gegen das Tumorantigen auslösen können. Die Vakzinierung von Balb/c Mäusen mit den CTLA-4 Fusionsproteinen bewirkte die Abstoßung anschließend subkutan injizierter syngener ErbB2-positiver Nierenkarzinomzellen (Renca-lacZ/ErbB2) nach subkutaner Injektion. Dies deutet auf die Erzeugung protektiver Immunität hin. Obgleich beide Fusionsproteine effektiv waren, zeigte das Fusionsprotein C-ErbB2(N), dem die bakterielle Translokationsdomäne fehlt, in mehreren unabhängigen Experimenten eine höhere Wirksamkeit als C-E-ErbB2(N). Vakzinierung mit den CTLA-4 Fusionsproteinen erzeugte keinen Schutz gegen ErbB2-negative Kontroll-Tumorzellen. Dies Experimente zeigt die Antigen-Spezifität der induzierten Immunantwort nach Vakzinierung mit CTLA-4 Fusionsproteinen. T-Zell Depletionsexperimente ergaben, dass die protektiven Effekte eindeutig von CD8+ CTLs abhängig waren. Eine erneute, diesmal intravenöse Applikation von ErbB2+ Tumorzellen in vakzinierte, tumorfreie Mäuse zwei Monate nach der ersten, subkutanen Injektion („Re-challenge“) führte nicht zur Ausbildung von Lungenmetastasen. Dies deutet darauf hin, dass durch die Vakzinierung eine langanhaltende Immunreaktion induziert wurde. In therapeutischen Vakzinierungsexperimenten, die wohl am ehesten eine klinische Situation in Tumorpatienten widerspiegeln, wurden die CTLA-4 Fusionsproteine in die Umgebung bereits etablierter subkutaner Renca-lacZ/ErbB2 Tumoren injiziert. In zwei unabhängigen Experimenten konnte gezeigt werden, dass durch die therapeutische Vakzinierung mit CErbB2(N) 7 von 8 Mäusen geheilt werden konnten, wohingegen die Wirkung von C-EErbB2(N) – von 8 Mäusen wurden 6 geheilt – auch im therapeutischen Einsatz etwas schwächer zu sein schien. Nach einem intravenösen „Re-challenge“ mit Renca-lacZ/ErbB2 Zellen waren bereits geheilte Tiere auch vor der Ausbildung von Lungenmetastasen geschützt. Dies bestätigt eine durch die Vakzinierung hervorgerufene lang-anhaltende Anti-Tumor Immunität. Alternativ zur Produktion rekombinanter Proteinvakzine in Bakterien wurde auch die direkte Injektion von DNA-Konstrukten zur in vivo Expression und Sekretion der CTLA-4 Fusionsproteine getestet (DNA-Vakzinierung). Basierend auf dem Plasmid pSecTag2 wurden Säugerzell-Expressionsvektoren hergestellt, welche unter der Kontrolle eines CMVPromotors die beiden Fusionsproteine C-ErbB2(N) bzw. C-E-ErbB2(N) kodieren. Ein Igk “leader” Signalpeptid ermöglicht hierbei die Sekretion der produzierten Proteine. Nach Transfektion der Plasmide in COS-7 Zellen konnte Sekretion der CTLA-4-Fusionsproteine in den Zellkulturüberstand sowie deren Zellbindungsspezifität für B7, mit Hilfe von Western-Blot und FACS-Analysen nachgewiesen werden. Protektionsexperimente ergaben, dass alle Balb/c Mäuse, die vorher durch intramuskuläre Injektion der CTLA-4-ErbB2 DNA-Vakzine vakziniert wurden, vor dem Anwachsen subkutan injizierter Renca-lacZ/ErbB2 Tumorzellen geschützt waren. Mäuse, die als Kontrolle mit dem leeren pSecTag2 Vektor vakziniert wurden, entwickelten dagegen schnell wachsende Tumoren. In diesem ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass chimäre Proteinvakzine, die in einer einzigen Polypeptidkette eine Zellerkennungsdomäne zur spezifischen Bindung an APCs und ein antigenes Proteinfragment aus dem humanen ErbB2 enthalten, in vivo eine äußerst wirkungsvolle ErbB2-spezifische T-Zell vermittelte Anti-Tumor Immunantwort auslösen. Hierbei konnte sowohl durch die Injektion von rekombinanten, in Bakterien hergestellten Proteinen, wie auch durch DNA-Vakzinierung zur in vivo Produktion dieser chimären Proteinvakzine erreicht werden, dass syngene, ErbB2 exprimierende Tumoren abgestoßen wurden. Die oben beschriebenen chimären Proteinvakzine enthalten ein großes Proteinfragment, abgeleitet aus einem humanen Tumorantigen, welches zu APCs befördert und von ihnen aufgenommen wird. Dieser Ansatz ist nicht unbedingt abhängig von einem bestimmten MHCTyp und möglicherweise besonders dann wirkungsvoll, wenn Immunantworten gegen Antigene erzeugt werden sollen, für die noch keine von MHC-Molekülen präsentierten Peptide identifiziert sind. Für Tumorantigene, aus welchen bereits einzelne Peptide als potentielle Tumorabstoßungs-Antigene definiert sind, wurden in einzelnen Fällen synthetische Derivate solcher Peptide erfolgreich eingesetzt, um hochspezifische T-Zell Antworten zu erzeugen. Aber auch in diesem Fall könnte die Verknüpfung des Antigens mit einem geeigneten „Antigen-Carrier“ eine verbesserte Aufnahme und Präsentation durch APCs und eine Verstärkung der Immunantwort gegen das Antigen zur Folge haben. Aus diesem Grund wurde in einem alternativen Ansatz zur Induktion einer ErbB2-spezifische Anti-Tumor Immunität die in vivo Anwendung von synthetischen Vakzin-Komplexen untersucht, welchen ein liposomaler Träger als Vektor für Peptid-Antigene zugrunde liegt. Diese Peptide sind über einen immunstimulatorischen Lipopeptid-Anker (Pam3CysSerSer) mit der Oberfläche solcher Liposomen verknüpft. Dieser Teil der Arbeit wurde in enger Kollaboration mit Audrey Roth, Dr. Benoit Frisch und Dr. Francis Schuber, Laboratoire de Chimie Bioorganique, Faculté de Pharmacie, Université Louis Pasteur (ULP), Strasbourg ausgearbeitet, die alle in dieser Arbeit verwendeten liposomalen Vakzine konstruierten und für in vivo Untersuchungen bereitstellten. Zwei liposomale Substanzen wurden synthetisiert. Ein Mono-Epitop Konstrukt, als „Tc-ErbB2-liposomes“ bezeichnet, trägt ein Tc-Epitop (TYLPTNASL), welches sich von der Aminosäuresequenz des humanen ErbB2 Moleküls ableitet. Es war bereits vorher gezeigt worden, dass dieses Peptid mit hoher Affinität an das murine H-2Kd MHC-Klasse I Molekül bindet und eine Peptid-spezifische CTL Immunantwort in Balb/c Mäusen auslösen kann. Die zweite liposomale Substanz, als „Tc-ErbB2/Th-liposomes“ bezeichnet, enthält zusätzlich zum ErbB2-Peptid noch ein universelles Th-Epitop, das sich vom Influenza Virus Hämagglutinin (HA 307-319) ableitet und ebenfalls über den adjuvanten Anker mit dem Liposom verbunden ist. Durch das Hinzufügen des Th-Epitops wurde beabsichtigt, zusätzlich CD4+ Helfer TZellen zu rekrutieren und damit die CTL Antwort gegen das Tc-Epitop zu verstärken. Durch ex vivo Restimulation von Milzzellen aus zuvor mit den liposomalen Konstrukten vakzinierten Tieren mit dem ErbB2-Peptid konnte die in vivo Aktivierung Tc-spezifischer CTLs nachgewiesen werden. In dem gleichen immunkompetenten Balb/c Maus-Modell, das auch zur Charakterisierung der CTLA-4-ErbB2 Proteinvakzine verwendet worden war, wurde auch die anti-tumorale Aktivität der liposomalen Komplexe untersucht. Die Vakzinierung von Balb/c Mäusen mit beiden Konstrukten, Tc-ErbB2-liposomes und Tc-ErbB2/Th-liposomes, führte zur Abstoßung anschließend subkutan injizierter ErbB2 exprimierender RencalacZ/ErbB2 Zellen. Eine therapeutische Vakzinierung von Mäusen, die bereits etablierte ErbB2+ Tumoren trugen, führte zu einem verlangsamten Wachstum in einigen und zur kompletten Abstoßung in den übrigen Tieren. In Kontrolltieren, die lediglich mit dem liposomalen Träger vakziniert waren, konnten keinerlei Tumorregression beobachtet werden. Während beide liposomalen Substanzen sowohl bei der protektiven als auch bei der therapeutischen Vakzinierung Anti-Tumor Effekte zeigten, verstärkte das Hinzufügen des Th-Epitops zu den „Tc-ErbB2 liposomes“ sowohl die ErbB2-spezifische Immunantwort als auch die Anti-Tumor Immunität. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung einer synergistischen CD4+ T-Zell Aktivierung als Teil von Anti-Tumor Immunantworten. Unabhängig von ihrer unterschiedlichen Wirkungsweise und chemischen Zusammensetzung stellen beide in dieser Arbeit untersuchten Vakzinkomplexe effektive Tumorvakzine dar, die nach ihrer Anwendung in vivo ErbB2-spezifische, T-Zell vermittelte Anti-Tumor Immunantworten auslösen können. Die chimären Fusionsprotein-Vakzine enthalten ein großes antigenes Proteinfragment. Durch ihre spezifische Zellbindungsdomäne wird der zielgerichtete Transport zu und die Aufnahme des Antigens in APCs, gefolgt von in vivo Prozessierung des Proteins in kleine antigene Peptide, MHC-Präsentation und schließlich Aktivierung tumorspezifischer T-Zellen gewährleist. Dieser Ansatz könnte insbesondere dann nützlich sein, wenn für das jeweilige Tumorantigen noch keine passenden T-Zell Epitope charakterisiert sind. Ein zusätzlicher Vorteil dieser Konstrukte ist, dass in einem einzigen Vakzin mehrere unterschiedliche antigene Determinanten bereitgestellt werden können. Für eine Reihe von Tumorantigenen sind bereits einzelne Peptide als potentielle Tumorabstoßungs-Antigene charakterisiert worden. Die in dieser Arbeit beschriebenen neuartigen liposomalen Träger, welche zusätzlich zum Tc-Epitop einen immunstimulatorischen Anker und ein starkes Th-Epitop tragen, könnten dazu beitragen, die Immunogenität und die anti-tumorale Aktivität synthetischer Peptid-Vakzine zu erhöhen.
Das Genom des anaeroben ε-Proteobakteriums Wolinella succinogenes codiert überraschenderweise für Enzymkomplexe, die typisch für die aerobe Atmung sind. Die entsprechenden Gene werd en unter bekannten Wachstumsbedingungen nicht
exprimiert. Darunter findet sich ein Operon ( sdhABE) für eine putative „Succinat-Dehydrogenase“, die hohe Sequenzhomol ogien zu sog. „nicht-klassischen“ archaealen Succinat-Dehydrogenasen zeigt. In der vorliegenden Arbeit sollte die „Succinat-Dehydro genase“ mit Hilfe des etablierten genetischen Systems zur Modifikation und Produktion der Chinol:Fumarat-Reduktase(QFR) homolog in W. succinogenes produziert und charakterisiert werden. Das genetische System besteht aus der QFR- Deletions-mutante ΔfrdCAB und dem Vektor pFrdcat2, der aufgrund seiner zentralen Bedeutung im Rahmen dieser Arbeit sequenziert wurde.
Dem Nahrungsmittelallergiker bietet sich zum jetzigen Zeitpunkt lediglich eine Möglichkeit für ein symptomfreies Leben, er muss die allergieauslösenden Nahrungsmittel aus seinem Speiseplan eliminieren. Neben der Entwicklung von immuntherapeutischen Maßnahmen wird unabhängig davon auf pflanzentechnologischer Seite die Reduktion der allergenen Potenz pflanzlicher Lebensmittel diskutiert, um die Lebensqualität von Nahrungsmittelallergikern zu verbessern. Die Kooperation zwischen dem Institut für Biochemie der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg und dem Paul-Ehrlich-Institut leistet einen Beitrag zu dieser Diskussion. Mit der Tomate als Modellpflanze wurde die allergene Potenz pflanzlicher Nahrungsmittel mit Hilfe der RNAi-Technologie reduziert. Diese Dissertation befasst sich mit der Identifikation und Charakterisierung der Zielproteine für das RNAi vermittelte „gene silencing“. Im Fokus der Untersuchungen steht das Lipid Transfer Protein der Tomate. Bei der Charakterisierung des Tomaten LTP wurden die IgE-bindenden Epitope sowie die Stabilität bei Pepsinverdau und bei der Verarbeitung zu tomatenhaltigen Produkten untersucht. Das Tomaten LTP besteht aus einer Multigenfamilie. Durch seine zweidimensionale Auftrennung konnten Informationen über das Vorkommen und Expressionsniveau möglicher Isoformen gewonnen werden. Die rekombinante Herstellung von zwei ausgewählten Isoformen ermöglichte einen Vergleich der IgE-Bindungskapazität und der biologischen Potenz. Die in Erlangen erzeugten gentechnisch veränderten Pflanzen wurden dem Paul-Ehrlich-Institut für eine Allergenitätsbewertung zur Verfügung gestellt. Die Gewinnung von Erkenntnissen über die Effizienz der Methode und die Stabilität des „gene silencing“ über mehrere Generationen hinweg standen hier im Mittelpunkt. Die Untersuchungen zur Prävalenz der IgE-Bindung an die drei bekannten Tomatenallergene Profilin (Lyc e 1), Invertase (Lyc e 2) und das LTP der Tomate, erfolgten bei einer Patientengruppe bestehend aus 70 Seren von Tomatenallergikern aus Deutschland (n=36) und Spanien (n=34). Als häufigstes Symptom nach dem Verzehr von Tomate wurde das OAS angegeben. Die Häufigkeit der IgE-Bindung an Lyc e 1 lag bei ca. 36%, für Lyc e 2 bei ca. 56% und für das LTP der Tomate bei ca. 24%. Bei der Unterscheidung der deutschen und spanischen Patientengruppe ergaben sich höhere Prävalenzen der IgE-Bindung an alle drei Allergene bei der spanischen Patientengruppe. Das Tomaten LTP wurde als Minorallergen Lyc e 3 in die IUIS Allergendatenbank aufgenommen. Die Aufreinigung von nLyc e 3 erfolgte durch eine zweistufige Chromatographie aus Tomatenschalenextrakt, die Identifizierung als LTP mittels N-terminaler Sequenzierung sowie die Verifikation der Sekundärstruktur mittels CD-Spektroskopie. Biochemische Untersuchungen zeigten eine hohe Stabilität von Lyc e 3 in Tomatenschalenextrakt nach Pepsinverdau. Auch im Schalenextrakt von gekochten und in getrockneten Tomaten wurde immunreaktives Lyc e 3 identifiziert. Die Konformation des Lyc e 3 ist an der IgE- und IgG-Bindung maßgeblich beteiligt. Natürliche Lyc e 3 Isoformen konnten nicht über die zweidimensionale Gelelektrophorese identifiziert werden. Eine Sequenzierung des Proteins mittels nano-HPLC-nano ESI-MS/MS bestätigte die Präsenz ausschließlich einer dominanten Isoform im Tomatenschalenextrakt. Bei der Klonierung und Expression zweier ausgewählter Lyc e 3 Isoformen (Lyc e 3.1 und Lyc e 3.2) wurden unterschiedliche Strategien verfolgt. Durch Überexpression eines Thioredoxinfusionsproteins im Vektor pET-32a in E.coli Origami und die Abspaltung des Thioredoxinanhangs durch Thrombin konnte ausreichend Protein für die nachfolgenden Untersuchungen produziert werden. Jedoch zeigten die rekombinanten Proteine, vermutlich durch eine an dem Zielprotein verbleibende Anhangssequenz, bei der Messung der CD-Spektren einen Unterschied zu der natürlichen Präparation. Die Herstellung von rekombinanten Isoformen ohne Anhangssequenz mit einer Sekundärstruktur analog der natürlichen Präparation blieb erfolglos. Ein Vergleich der IgE-Bindungskapazität der rekombinanten Proteine, gemessen in der dosisabhängigen ELISA-Inhibition, konnte auf Grund ihrer identischen Sekundärstruktur durchgeführt werden. Da rLyc e 3.2 eine höhere IgE-Bindungskapazität zu besitzen scheint, wurde mit dieser Isoform eine dosisabhängige ELISA-Inhibition mit nLyc e 3 trotz unterschiedlicher Sekundärstruktur durchgeführt. Die IgE-Bindungskapazitäten sind für die herangezogenen Seren sehr individuell. Zur Bestimmung der allergenen Potenz der rekombinanten und natürlichen Präparationen diente der basophile Histamin Freisetzungstest. Die natürliche Präparation besitzt tendenziell die stärkste allergene Potenz. Die allergene Potenz der rekombinanten Isoformen ist jedoch wie die IgE-Bindungskapazität für jeden Patienten sehr spezifisch. Im Rahmen der Analyse der gentechnisch veränderten Pflanzen wurden WT und RNAi-Pflanzen mittels Immunoblot, dosisabhängiger ELISA-Inhibition und im basophilen Histamin Freisetzungstest untersucht. Im Immunoblot konnte keine Bindung von allergenspezifischen Antikörpern bei den RNAi-Pflanzen im Vergleich zum WT festgestellt werden. Bei der dosisabhängigen ELISA-Inhibition mit Lyc e 1 oder Lyc e 3 auf der Festphase war die IgE-Bindungskapaziät der RNAi Pflanzen um ein zehnfaches (Lyc e 1-RNAi) bzw. ein zehn- bis hundertfaches (Lyc e 3-RNAi) reduziert. Eine Bestätigung der Ergebnisse mit den Lyc e 3-RNAi Pflanzen lieferten ein basophiler Histamin Freisetzungstest und ein in vivo Hauttest. Durch die zusätzliche Analyse von Tochtergenerationen wurde deutlich, dass die Reduktion der Allergenexpression stabil war. Im Rahmen dieser Studie konnte gezeigt werden, dass die RNAi-Technologie eine geeignete Methode ist, um die Expression von Allergenen gezielt und stabil zu unterdrücken. Sie könnte eine Möglichkeit darstellen, die allergene Potenz von Nahrungsmitteln zu verringern und die Lebensqualität von Nahrungsmittelallergikern zu verbessern.
Leukämien sind maligne Erkrankungen des hämatopoietischen Systems, die teilweise mit einer sehr schlechten Prognose einhergehen. Die Phänotypen sowie die verursachenden Mutationen in den hämatopoietischen Vorläuferzellen sind vielfältig. 5-10 % aller Akuten Leukämien korrelieren mit genetischen Veränderungen des MLLGens auf Chromosom 11q23. Besonders häufig findet man reziproke, chromosomale Translokationen. Leukämien mit diesen Mutationen zählen fast ausschließlich zu den Hochrisiko-Leukämien, wobei der Partner des MLL-Gens Einfluss auf den Verlauf der Erkrankung hat. Bisher sind 43 Translokationspartner des MLL-Gens bekannt, von denen jedoch in der Routinediagnostik nur die 6 häufigsten, MLLT2, MLLT1, MLLT3, MLLT4, ELL und MLLT10 untersucht werden. Seltene oder unbekannte Partnergene werden von den Analysen ausgenommen. Da das Partnergen aber wichtig für die Risikoeinstufung der Erkrankung ist, ist es notwendig, dieses rasch zu identifizieren, um ein optimales Therapieprotokoll anwenden zu können. Aus diesem Grund wurde eine universelle, PCR-Methode entwickelt und etabliert, die es erlaubt, jede MLL-Translokation, auch ohne vorherige Kenntnis des Partnergens, zu identifizieren. Mit Hilfe dieser Methode ist es möglich, sowohl das Partnergen, als auch den chromosomalen Bruchpunkt basengenau auf DNA-Ebene zu analysieren. Mit dieser Technik sind im Verlauf der Studie 501 Patienten untersucht worden (319 Kinder, 179 Erwachsene, 3 ohne Altersangabe). Bei diesen Analysen wurden 9 neue Partnergene entdeckt: ACACA, SELB, SMAP1, TIRAP, ARHGEF17, BCL9L, KIAA0284, MAML2 und APBB1IP. Für alle positiven Patientenproben sind außer den Partnergenen auch die basengenauen Bruchpunkte kartiert worden. Die Kenntnis des Patienten-spezifischen Bruchpunktes erlaubt eine exakte Quantifizierung der Blastenlast mittels qPCR und ermöglicht somit ein empfindliches Monitoring des Krankheitsverlaufs unter Therapie und die Detektion einer minimalen Resterkrankung (MRD).
Zur erfolgreichen Behandlung von Tumorerkrankungen sind effiziente Therapien notwendig. Oftmals kommt es nach einer klassischen Tumortherapie zum Auftreten von Rezidiven, die aus residuellen Tumorzellen hervorgehen. Grund hierfür können eine bereits erfolgte Metastasierung oder Resistenzmechanismen der Tumorzellen sein. Auf Grund ihrer Fähigkeit Gewebe aktiv zu infiltrieren bietet der Einsatz zytotoxischer Lymphozyten im Rahmen einer zellulären Immuntherapie den Vorteil, auch bereits metastasierte Tumorzellen zu erreichen. Dadurch können auch Tumorzellen eliminiert werden, die Resistenzmechanismen meist im oberen Teil apoptotischer Signalkaskaden aufweisen. Eine spezifische Ausrichtung zytotoxischer Lymphozyten auf Tumorantigene ist grundsätzlich über chimäre Antigenrezeptoren möglich. Dabei bietet die Generierung von Tumor-spezifischen zytotoxischen Effektorzelllinien den Vorteil, Zellklone mit definierter Aktivität und Spezifität bereitstellen zu können. Im Hinblick auf einen klinischen Einsatz scheint hierfür die Natürliche Killerzelllinie NK-92 besonders geeignet. Die Ergebnisse einer klinischen Studie mit parentalen NK-92 Zellen zeigten eine gute Verträglichkeit ohne Nebenwirkungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden NK-92 Zellen genetisch so modifiziert, dass sie chimäre Antigenrezeptoren mit Spezifität für die Tumorantigene CD20, EpCAM, GD2 und CD138 exprimieren. In der Tumortherapie stellen das mit Tumoren der B-Zell-Reihe assoziierte CD20-Molekül und das auf den meisten Tumorzellen epithelialen Ursprungs exprimierte EpCAM-Protein wichtige Zielantigene monoklonaler Antikörper dar. Studien zeigten, dass auch die auf Tumorzellen des Neuroblastoms bzw. Multiplen Myeloms exprimierten Moleküle GD2 bzw. CD138 geeignete Angriffspunkte für immuntherapeutische Ansätze sein könnten. Die chimären Antigenrezeptoren sind aus einem Antigenspezifischen scFv-Antikörperfragment aufgebaut, das über ein Fragment der CD8alpha-Kette mit der CD3zeta-Kette als Signaltransduktionsdomäne verbunden ist. Nach retroviraler Transduktion zeigte sich eine hohe und homogene Oberflächenexpression dieser Rezeptoren auf modifizierten NK-92 Zellen. Auf das Oberflächenprotein CD20 ausgerichtete NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen wiesen gegen CD20- positive Tumorzelllinien und primäre Tumorzellen eine hohe zytotoxische Aktivität auf. Im Vergleich waren parentale NK-92 Zellen gegen diese Tumorzellen nicht oder deutlich weniger aktiv. Dabei war die zytotoxische Aktivität der NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen mit dem monoklonalen anti-CD20 Antikörper Rituximab kompetitierbar. Mit Hilfe der gegen parentale und modifizierte NK-92 Zellen resistenten Zelllinie NIH3T3 wurde gezeigt, dass allein über die stabile Expression des CD20-Proteins in NIH3T3 Zellen die Resistenz gegen modifizierte NK-92 Zellen überwunden werden kann. NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen waren in der Lage, CD20-positive NIH3T3-CD20 Zellen auch bei niedrigen E/T-Verhältnissen effizient abzutöten. In Mischkulturen aus NIH3T3 und NIH3T3-CD20 Zellen war zudem eine selektive zytotoxische Aktivität der NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen ausschließlich gegen Antigen-positive Zellen nachweisbar. Über die Analyse von Zellkonjugaten zwischen zytotoxischen Effektorzellen und ihren Zielzellen, deren Bildung grundsätzliche Voraussetzung für eine Eliminierung ist, wurden Hinweise erhalten, dass der chimäre Antigenrezeptor hierzu keinen Beitrag zu leisten scheint, sondern vor allem die anschließende Aktivierung der modifizierten NK-92 Zellen bewirkt. Mit EpCAM-spezifischen NK-92-scFv(MOC31)-Zeta Zellen war auch bei niedrigen E/T-Verhältnissen eine effiziente Abtötung von unterschiedlichen Tumorzelllinien epithelialen Ursprungs möglich. Eine erfolgreiche Blockierung dieser zytotoxischen Aktivität mit dem monoklonalen Antikörper MOC31 bestätigte, dass diese spezifisch über den chimären Antigenrezeptor vermittelt wurde. Die untersuchten epithelialen Zelllinien erwiesen sich dagegen als vollkommen resistent gegen parentale bzw. mit demleeren Expressionsvektor modifizierte NK-92-Mock Zellen. Weitere Ergebnisse zeigten, dass die zytotoxische Aktivität von NK-92-scFv(MOC31)-Zeta Zellen tatsächlich über Granzym B vermittelt wird. Eine erhöhte FasL-Oberflächenexpression infolge der Cokultur mit Antigen-positiven Zielzellen war dagegen nicht nachweisbar. Anhand dieser Ergebnisse kann eine signifikante Beteiligung von FasL an der zytotoxischen Aktivität der modifizierten NK-92 Zellen ausgeschlossen werden. Weiterhin wurden therapeutische Effekte von NK-92-scFv(MOC31)-Zeta Zellen in einem Xenograftmodell in NOD-scid/scid Mäusen mit einer humanen EpCAM-positiven Tumorzelllinie untersucht. Hier wurde im Vergleich zur Kontrollgruppe durch Behandlung mit EpCAM-spezifischen NK-92 Zellen, unerwarteterweise aber auch mit NK-92-Mock Zellen, ein signifikant längeres Überleben der Tiere beobachtet. Nach der Ableitung CD138-spezifischer NK-92-scFv(B-B4)-Zeta Zellen wurde zwar eine hohe zytotoxische Aktivität gegen CD138-positive Zelllinien erhalten. Es war jedoch keine im Vergleich zu parentalen NK-92 Zellen weiter verstärkte Zytotoxizität nachweisbar. Als Ursache hierfür ist eine mangelnde Funktionalität des scFv-Antikörperfragments im Kontext des chimären Antigenrezeptors denkbar. Da die Bindungseigenschaften von scFv-Fragmenten entscheidend durch die Anordnung ihrer schweren und leichten Antikörperketten zueinander beeinflusst werden können, wurden NK-92 Zellen etabliert, die ein scFv-Fragment mit umgekehrter Orientierung der Antikörperketten in ihrem chimären Antigenrezeptor tragen. Diese werden derzeit im Rahmen einer externen Zusammenarbeit auf ihre Funktionalität hin überprüft. Zur Konstruktion gegen das Disialogangliosid GD2 gerichteter chimärer Antigenrezeptoren wurden parallel zwei scFv-Fragmente des Antikörpers ch14.18 eingesetzt, die sich in der Orientierung der schweren und leichten Antikörperketten zueinander unterscheiden. Mit den Antigenrezeptorkonstrukten modifizierte NK-92 Zellen zeigten eine im Vergleich zu parentalen NK-92 und NK-92-Mock Zellen stark erhöhte Zytotoxizität gegen GD2 exprimierende humane Tumorzelllinien. Dabei wurde weder bei der Expressionsdichte der chimären Antigenrezeptoren noch in der zytotoxischen Aktivität modifizierter NK-92 Zellen mit unterschiedlicher Anordnung der variablen Antikörperdomänen im scFv Antikörperfragment ein signifikanter Unterschied beobachtet. Mit der extrazellulären Domäne von CTLA-4 als Modellprotein wurde der mögliche Einsatz einer zu scFv-Antikörperfragmenten alternativen Antigenbindungsdomäne geprüft. CTLA-4 wird normalerweise auf T-Zellen exprimiert und bindet an CD80 bzw. CD86 auf APCs. CD80- und/oder CD86-positive Zielzellen wurden von NK-92-sCTLA-4-Zeta Zellen im Vergleich zu parentalen NK-92 Zellen spezifisch und mit hoher Effizienz lysiert. In Zytotoxizitätsassays wurde mit Hilfe einer sowohl gegen parentale als auch modifizierte NK-92 Zellen resistenten Tumorzelllinie gezeigt, dass allein die stabile Expression des CD86 Proteins in dieser Zelllinie ausreicht, um die Resistenz gegen NK-92-sCTLA-4-Zeta Zellen aufzuheben. Daraus kann geschlossen werden, dass grundsätzlich auch der Einsatz von zu scFv- Antikörperfragmenten alternativen Antigenbindungsdomänen eine spezifische Ausrichtung und effiziente Aktivierung von NK-92 Zellen gewährleistet. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die genetische Modifikation der Natürlichen Killerzelllinie NK-92 zur Ausrichtung auf Tumor-spezifische Zielstrukturen einen grundsätzlich geeigneten Ansatz zur Behandlung maligner Erkrankungen darstellt. Eine Weiterentwicklung Antigen-spezifischer NK-92 Derivate als mögliche Zelltherpeutika erscheint daher sinnvoll und vielversprechend.
Heute gewinnen pflanzliche Arzneimittel im Zeichen einer verstärkten Hinwendung zu natürlichen, relativ nebenwirkungsarmen Medikamenten zunehmend an Bedeutung, so auch die über Jahrtausende hinweg traditionell angewandte Ginsengwurzel (Panax ginseng) und der Indische Weihrauch (Boswellia serrata). Neben der Struktur- und Extraktanalytik konzentriert sich die Forschung in zunehmenden Maße darauf, die zahlreichen pharmakologisch untersuchten und klinisch beobachteten Wirkungen dieser beiden Arzneipflanzen einzelnen Inhaltsstoffen zuzuordnen. Bei der Ginsengwurzel gestaltet sich dies jedoch besonders schwierig. Dies ist begründet durch die große Anzahl strukturell ähnlicher Ginsenoside sowie durch deren unterschiedlicher Metabolismus. Zwar ist aus In-vitro-Experimenten bekannt, daß die Degradation über die stufenweise Deglukosylierung stattfindet, allerdings ist bislang nicht geklärt, ob intakte Ginsenoside überhaupt resorbiert werden und welche der vielen in vitro ermittelten Degradationsprodukte tatsächlich den systemischen Kreislauf erreichen. Anders als bei Ginseng, kann die therapeutische Wirkung des Indischen Weihrauches wohl definierten Inhaltsstoffen, AKBA und KBA, zugeschrieben werden. Dennoch mangelt es hier an verlässlichen pharmakokinetischen Daten, da bislang keine validierte bioanalytische Methode zur Verfügung stand. Im Rahmen der Bioanalytik von Ginsenosiden und Boswellliasäuren kamen in der vorliegenden Arbeit die Nano-ESI-MS(n)-Technik sowie die HPLC-Analytik zur Anwendung. Bereits bei der Strukturanalyse von Ginsenosiden erwies sich die Kombination der Nano-ESI-Technik mit MS(n)-Experimenten in einer Quadrupol-Ionenfalle als besonders vorteilhaft. Im Vergleich zu konventionellem ESI bietet Nano-ESI nicht nur den Vorzug, mit kleinsten Substanzmengen lange Messungen durchführen zu können, sondern auch den Vorteil einer effektiveren, weniger diskreminierenden Ionisation. Sowohl die hohe Sensitivität der Nano-Elektrosprayionisierung bei der Analyse von glykosidischen Verbindungen als auch die umfangreichen Strukturinformationen infolge mehrerer aufeinanderfolgender stoßinduzierter Fragmentierungen machen diese Technik zu einer attraktiven und effizienten Methode zur Analyse von Ginsenosiden. In MS(n)-Experimenten äußert sich das charakteristische Fragmentierungsverhalten der Ginsenoside in der sequentiellen Abspaltung der Zuckereinheiten in sukkzessiven Fragmentierungsschritten. Mit dieser Methode konnten die Zuckerketten an verschiedenen Positionen des Protopanaxadiol- bzw. Protopanaxatriolaglykons der Ginsenoside identifiziert, die glykosidischen Verknüpfungen innerhalb der einzelnen Zuckereinheiten durch spezifische Ringfragmente bestimmt und die genaue(n) Verknüpfungsposition(en) enzymatisch eingeführter Galaktose(n) lokalisiert werden. Bisher wurden allerdings Nano-ESI-MS/MS bzw. MS(n)-Untersuchungen primär an wässrigen oder organischen Lösungen von isolierten / aufgereinigten Stoffen oder Stoffgemischen durchgeführt. In dieser Arbeit wurde erstmals diese Technik in der Bioanalytik zur Identifizierung von Ginsenosiden und deren Degradationsprodukte in Humanplasma und -urin angewandt. Obwohl die optimale Analytkonzentration für die Nano-Elektrosprayionisierung im allgemeinen bei 10-5M liegt, ist es gelungen, die Ginsenoside anhand ihrer spezifischen Fragmentionen im MS/MS Modus bis zu einer Konzentration von 2 ng/mL (10-8M) in biologischen Matrices nachzuweisen. Auch wenn die Molekülionenpeaks bei diesen geringen Konzentrationen im Rauschen untergehen, können die Ginsenoside durch selektive Isolierung der gewünschten Vorläuferionen und deren anschließende Fragmentierung in der Quadrupol-Ionenfalle auf der Basis der Detektion spezifischer Fragmente identifiziert werden. Da bei der Fragmentierung der gleichen Vorläuferionenmasse in Leerplasma bzw. Urin keine charakteristischen Fragmentionen gebildet werden, handelt es sich somit um einen spezifischen Nachweis der Ginsenoside in biologischen Matrices. Vor dem Hintergrund dieser vielversprechenden Vorversuche wurde eine Pilotstudie zum qualitativen Screening von Ginsenosiden und deren Metaboliten in Humanplasma und –urin durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, daß Protopanaxatriol-Ginsenoside sowohl im Magen hydrolysiert als auch intestinal degradiert werden. Schon in den ersten Stunden nach der einmaligen oralen Einnahme von Ginsana G115 Kapseln wurden die Hydrolyseprodukte G-Rh1 und hydratisiertes G-Rh1 in Humanplasma detektiert. Die schnelle Resorption dieser beiden Verbindungen aus dem oberen Gastrointestinaltrakt deutet auf die Hydrolyse des Ginsenosides Rg1 im Magen hin. Das spätere Auftreten eines weiteren monoglukosylierten Protopanaxatriols, des Degradationsproduktes G-F1, liefert den ersten In-Vivo-Hinweis auf einen intestinalen Metabolismus von Protopanaxatriol-Ginsenoside. Im Gegensatz zu den Protopanaxatriolginsenosiden passieren die Protopanaxadiol-Ginsenoside den Magen unverändert, wie aus der Abwesenheit jeglicher Protopanaxadiol-Degradationsprodukte im Plasma und Urin in den ersten Stunden nach der Applikation geschlossen werden kann. Erst im unteren Gastrointestinaltrakt werden Protopanaxadiol-Ginsenoside durch intestinale Bakterien zu „Compound-K“ abgebaut und anschließend resorbiert. Der Nachweis von Ginsenosid Rb1 im Plasma, sowie weiterer Ginsenoside im Urin eines Probanden zeigt, daß auch Ginsenoside in ihrer intakten Form resorbiert werden können. Dennoch sind weitere Studien hierzu notwendig, um zu klären, ob die Resorption intakter Ginsenoside die Regel oder eher eine Ausnahme darstellt. Mit der Identifizierung des Hydrolyseproduktes G-Rh1, der Degradationsprodukte G-F1 sowie „Compound-K“ in Humanplasma und -urin konnte schließlich die Frage geklärt werden, welche der zahlreichen in vitro bestimmten Degradationsprodukte tatsächlich den systemischen Kreislauf erreichen. Damit ist die Basis für eine spätere Quantifizierung dieser Verbindungen nach ihrer Isolierung bzw. Herstellung und Charakterisierung als Referenzsubstanzen geschaffen. Außerdem können diese neuen Erkenntnisse helfen, pharmakologische Ergebnisse aus In-vitro-Versuchen mit In-vivo-Daten besser zu korrelieren, da sie erste Hinweise geben, welche der in vitro getesteten Substanzen für die in vivo beobachteten Effekte verantwortlich sein könnten. Bisher wurde Nano-ESI-MS(n) in der Bioanalytik pflanzlicher Arzneistoffe nicht eingesetzt. In dieser Arbeit wurde diese Technik erstmals zum Screening von Ginsenosiden und deren Degradationsprodukte in Humanplasma und –urin benutzt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß Nano-ESI-MS(n) auch eine empfindliche und sensitive Methode zur Identifizierung und zum Nachweis anderer medizinisch relevanter glykosidischer Verbindungen in biologischen Matrices darstellt, woraus sich neue Perspektiven für den Einsatz dieser Technik in der Metabolitenforschung sowie in der Bioanalytik pflanzlicher Xenobiotika ergeben. In den letzten Jahren rückte auch der Indische Weihrauch immer mehr in den Mittelpunkt des wissenschaftlichen sowie therapeutischen Interesses. Aufgrund der selektiven Hemmung der 5-Lipoxygenase gewinnen AKBA und KBA, als neue entzündungshemmende Verbindungen, zunehmend an Bedeutung. Während die quantitative Analytik der Boswelliasäuren in Extrakten und in verschiedenen Fertigarzneimitteln erhebliche Fortschritte erzielen konnte, fehlten auf dem Gebiet der Bioanalytik bislang validierte analytische Methoden zur Durchführung pharmakokinetischer Studien. Vor diesem Hintergrund wurde eine HPLC-Methode zur Bestimmung von KBA in Humanplasma entwickelt und validiert. Die Methode ist durch eine einfache Probenvorbereitung gekennzeichnet, die sich auf eine Festphasenextraktion der KBA aus der komplex zusammengesetzten biologischen Matrix beschränkt. Im Anschluß an die chromatographische Trennung auf einer RP-C18 Säule erfolgt die Quantifizierung der KBA mittels UV-Detektion bei 250 nm. Um eine adäquate Bestimmung der KBA in Humanplasma zu gewährleisten, wurde eine umfassende Validierung durchgeführt. Alle ermittelten Validierungsparameter, wie Spezifität, Linearität, Präzision, Richtigkeit, Reproduzierbarkeit, untere Quantifizierungsgrenze und Stabilität lagen innerhalb der vorgegebenen Grenzen. Damit erfüllt die entwickelte HPLC-Methode die allgemein gültigen Anforderungen an die Validierung bioanalytischer Methoden. Mit der Erstellung einer Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve im Rahmen einer ersten Pilotstudie konnte diese Methode zudem ihre praktische Anwendbarkeit unter Beweis stellen. Somit steht für zukünftige pharmakokinetische Studien eine validierte HPLC-Analytik zur Bestimmung von KBA, einer der Hauptwirkstoffe des Indischen Weihrauches, zur Verfügung, die sich durch hohe Spezifität, Reproduzierbarkeit und Präzision auszeichnet. Verlässliche Daten zur Pharmakokinetik am Menschen sind heute von besonderer Bedeutung, da sie helfen, die Dosierung zu optimieren, die biopharmazeutischen Eigenschaften von Präparaten zu verbessern und die Sicherheit bei der Anwendung zu erhöhen. Insbesondere im Hinblick auf bereits festgestellte Interaktionen von pflanzlichen Arzneimitteln mit Medikamenten reicht es nicht mehr aus, wenn sich pflanzliche Arzneimittel, wie beispielsweise Ginseng und Indischer Weihrauch, nur auf ihre langjährigen tradierten Anwendungserfahrungen berufen. So wird auch bei Phytopharmaka in verstärktem Maße eine wissenschaftliche Absicherung durch bioanalytische Forschung erwartet. Mit der Identifizierung der Ginsenoside und deren Degradationsprodukte im Menschen, der erstmaligen Anwendung von Nano-ESI-MS(n) in der Metabolitenforschung und der Entwicklung einer validierten bioanalytischen Methode zur Bestimmung der 11-Keto-Beta-Boswelliasäure in Humanplasma wurde diesen Erfordernissen Rechnung getragen.
Das humane Cytomegalovirus (hCMV) ist ein ubiquitär verbreitetes Pathogen. Die CMV-Infektion ist eine nicht selten lebensbedrohliche Komplikation bei immunsupprimierten Organ- und Knochenmarktransplantat-Empfängern. Bei immunkompetenten Individuen hingegen verläuft eine CMV-Infektion in der Regel asymptomatisch. Wie am Beispiel der murinen CMV (mCMV)-Infektion gezeigt werden konnte, erfolgt die Immunkontrolle durch CD8 T-Zellen. Im Infektionsmodell der BALB/c (H-2d) Maus dominieren CD8 T-Zellen mit Spezifität für zwei antigene Peptide: Ein Ld-restringiertes Peptid aus dem immediate early (IE1)-Protein m123, sowie ein Dd-restringiertes Peptid aus dem early (E)-Protein m164. Der konzertierten Aktion der viralen Immunevasionsproteine von mCMV gelingt es nicht, die Expression dieser beiden Peptide auf der Oberfläche infizierter Zellen zu verhindern. Der ORFm164 wurde 1996 von Rawlinson et al. vorhergesagt und umfasst demnach 1284 Nukleotide, die für ein Protein von 46,6 kDa kodieren. Über die mRNA und das tatsächliche Genprodukt des ORFm164 war zu Beginn dieser Arbeit jedoch nichts bekannt. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Transkriptions- und Translations-Analysen zeigten, dass der eigentliche ORFm164 kürzer ist als vorhergesagt. So konnte mittels 5´/3´ RACE eine ungespleißte, 2004 Nukleotide große mRNA identifiziert werden, die einen 1011 Nukleotide langen ORF, sowie 5´ und 3´ flankierende UTRs umfasst. Das eigentliche Start-AUG der m164-mRNA liegt in einer Kozak-ähnlichen Konsensussequenz, wobei dieses Startcodon nicht dem von Rawlinson vorhergesagten ersten AUG entspricht. Vielmehr startet die Translation am dritten AUG und generiert ein m164 Genprodukt mit einer apparenten molekularen Masse von 38 kDa. Schließlich konnte m164 als Typ-I Membranglykoprotein charakterisiert werden. Das Protein ist ein frühes E-Phase Protein, das bereits ab 2 h p.i. und während der gesamten E-Phase abundant exprimiert wird. Pulse-Chase Experimente wiesen darauf hin, dass m164 relativ instabil ist. Mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz konnte neben einer ER-Lokalisation auch eine Kolokalisation von m164/gp38 mit den Proteinen der inneren Kernmembran Emerin und LaminB2 nachgewiesen werden. Eine direkte Interaktion zwischen diesen Proteinen und m164/gp38 konnte durch Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET)-Experimente allerdings ausgeschlossen werden. FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching)-Analysen haben ergeben, dass m164/gp38 in der äußeren Kernmembran lokalisiert ist. Somit könnte m164/gp38 eine Rolle beim Prozess des Deenvelopments der im Perinuklearraum lokalisierten primären Virionen spielen, indem es die Fusion zwischen primärer Virushülle und äußerer Kernmembran unterstützt und dadurch die Freisetzung der Kapside ins Zytoplasma ermöglicht. Diese Hypothese soll in weiterführenden Arbeiten überprüft werden.
Die Entwicklung künstlicher Ribonucleasen bietet das Potential, Werkzeuge für die Biotechnologie und langfristig neuartige Pharmaka bereitzustellen. 2-Aminobenzimidazole haben sich als metallfreie Katalysatoren zur unspezifischen Spaltung von Ribonucleinsäuren bewährt. In der vorliegenden Arbeit sollte das Konzept von künstlichen Ribonucleasen auf Basis dieser Molekülklasse auf seine Tragfähigkeit gerprüft werden. Außerdem sollten weitere mechanistische Erkenntnisse über die Katalyse der RNA-Hydrolyse durch 2-Aminobenzimidazole gewonnen werden. Hierzu wurden kupplungsfähige 2-Aminobenzimidazol-Derivate hergestellt und anschließend an RNA-Liganden gekuppelt. Diese Konjugate wurden auf ihre Spaltaktivität gegenüber RNA bei physiologischen Bedingungen sowie auf ihre Substrat- und Ortsspezifität getestet. Zunächst wurden Tripeptidkonjugate synthetisiert und untersucht. Hierbei konnte eine gegenüber den unkonjugierten Spezies erhöhte Affinität der Konjugate zum Substrat festgestellt werden. Auch wurde gezeigt, dass 2-Aminobenzimidazole, die in wässriger Lösung zur Aggregation neigen, auch als Einzelmoleküle in der Lage sind, die RNA-Hydrolyse zu katalysieren. Die Substrat- und Ortsspezifität der Tripeptidkonjugate ließ jedoch zu wünschen übrig. Durch die Konjugation von 2-Aminobenzimidazol-Derivaten an Antisense-DNA gelang schließlich die sequenz- und ortsspezifische Affinitätsspaltung von RNA mit beachtlicher Aktivität. Damit war die Tragfähigkeit des Konzepts bewiesen. Ferner konnten durch die weitere Untersuchung der Konjugate starke Indizien gewonnen werden, die das Modell, auf dem die Auswahl der 2-Aminobenzimidazole als katalytische Einheit beruht, stützen.
Klonierung und Charakterisierung eines ecotropen porzinen endogenen Retrovirus der Klasse C (PERV-C)
(2006)
Durch die vertikale Vererbung von endogenen Retroviren, deren Fähigkeit humane Zellen in vitro zu infizieren und ihrer Rekombinationsfähigkeit besteht ein Risikopotential bei der Verwendung porziner Gewebe bzw. Organe im Rahmen der XTx, weshalb ein Screening auf PERV im Genom von Spendertieren und eine immunologische Kontrolle von Xenotransplantatempfängern von Bedeutung ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnten vier native, teilweise unvollständige, provirale Sequenzen aus einer Genbibliothek einer Zelllinie von Minischweinen isoliert werden. Der Molekularklon PERV-C(1312) zeigt die vollständigen Leserahmen für das gag-, pol- und env-Gen, die 5LTR Sequenz beinhaltet einen Repeat mit 39 bp. Das Virus ist in der Lage produktiv porzine ST-IOWA Zellen in vitro zu infizieren und nach Transfektion in humane Nierenzellen in das Genom zu integrieren. Eine Rekombination mit PERV-B(33)/ATG Partikeln konnte nicht gezeigt werden. Nach Transfektion von Deletionsmutanten von PERV-B(33)/ATG in MAX-T Zellen, denen das gag- und pol-Gen fehlte und lediglich der offene Leserahmen für das env-Gen intakt war, konnte keine Rekombination bzw. Inkorporation von Env-B Proteinen in PERV-C Partikeln nachgewiesen werden. Für eine immunologische Detektion des Env-C Proteins wurde ein polyklonales Antiserums in Kaninchen generiert und ein monoklonaler Antikörper hergestellt. Die Epitope für beide Antikörper sind im SU des env-C Gens lokalisiert. Das Env-C Protein kann durch das polyklonale Antiserum durch Western Blot Analyse in Zelllysaten und in immunhistochemischen Analysen in verschiedenen Zelllinien detektiert werden. In PERV-C Partikeln wird das Env-Protein sowohl durch das polyklonale Antiserum als auch durch den monoklonalen Antikörper spezifisch detektiert. Durch den immunologischen Nachweis von PERV-C Proteinen ist es möglich im Hinblick auf eine XTx den Nachweis dieser Proteine in möglichen Rezipienten durchzuführen. Durch die zusätzlich isolierten Flankensequenzen des replikationskompetenten Molekularklons PERV-C(1312) wäre eine Screening Methode, durch die Verwendung einer spezifischen Flankensonde, möglich, um genomische Integrationsorte und somit die Präsenz dieses Provirus in den Zellen des Spendertieres vorab zu überprüfen, um möglichst Spendertiere für eine XTx zu verwenden, die frei von PERV-C(1312) sind. Somit leistet diese Arbeit einen Beitrag zur besseren Evaluierung des Risikopotentials zukünftiger Xenotransplantationen.
In der vorliegenden Arbeit wurden festkörperunterstützte Membranen in Verbindung mit schnellen Lösungswechseln als Methode zur Messung von elektrogenen Transportvorgängen in biologischen Membranen untersucht und charakterisiert. Parallel zu einem manuellen Messsystem wurde eine Technologie auf der Basis eines Pipettierroboters mitentwickelt und charakterisiert, die es erlaubt, automatisierte Messungen mit erhöhtem Durchsatz durchzuführen. Die Sensoren wurden als Sensorarray auf der Basis einer standardisierten 96er Mikrotiterplatte realisiert. Zur Lösungshantierung kam ein Pipettierroboter zum Einsatz, der mit einer selbstentwickelten Injektionseinheit bestückt wurde. In dieser Injektionseinheit ließen sich die verwendeten Lösungen überschichten, wodurch ein Lösungswechsel von einer substratfreien zu einer substrathaltigen Lösung durchgeführt werden konnte. Mit dem beschriebenen System konnten die in dieser Arbeit behandeleten Proteine EAAC1 und NhaA erfolgreich aktiviert und charakterisiert werden. Hinsichtlich der Transportaktivität wurden mit beiden Proteinen vergleichbare Ergebnisse erzielt wie mit dem manuellen Messsystem. Aus kultivierten CHO-Zellen, die den neuronalen Glutamattransporter EAAC1 rekombinant und fuktional exprimierten, wurden EAAC1-haltigen Cytoplasmamembranen in einem Aufreinigungsschritt (Membranpräparation) gewonnen. Die derart vorliegenden Membranfragmente konnten erfolgreich auf der festkörperunterstützten Membran angelagert werden. In der Abwesenheit von Natriumionen war der EAAC1 nicht aktiv, und er konnte durch den spezifischen kompetitiven Inhibitor TBOA inhibiert werden (Inhibitionskonstante Ki = 1µM). Es wurde beobachtet, dass die Transportströme des EAAC1 in der Abwesenheit von Kaliumionen eine andere Kinetik aufwiesen als in der Anwesenheit von Kaliumionen, und die Affinität für L-Glutamat war in der Abwesenheit von Kaliumionen verringert (K0,5 = 144 µM). Analysen der Signalformen ergaben eine reduzierte Relokationsrate, wobei es wahrscheinlich ist, dass der EAAC1 ohne Kaliumionen einen Single-Turnover durchführt. Eine weitere Eigenschaft des EAAC1 ist die Fähigkeit, bestimmte Anionen zu leiten. Diese Anionenleitfähigkeit ist strikt Natriumabhängig und wird durch die Bindung von L-Glutamat getriggert. Wenn bei einem Experiment zusätzlich bestimmte Anionen (z.B. Chlorid oder Thiocyanat) anwesend waren, wies der Transportstrom des EAAC1 in der Abwesenheit von Kaliumionen eine negative Komponente auf. Diese Komponente konnte auf den Einstrom der Anionen entlang des durch den Glutamattransport aufgebauten elektrischen Gradienten zurückgeführt werden. Des Weiteren konnte die Anionenleitfähigkeit mit Anionensprüngen in der Anwesenheit von L-Glutamat und Natriumionen direkt induziert werden. Damit wurden erstmals kanalartige Ionenströme an der festkörperunterstützten Membran nachgewiesen. Der Anionenstrom wies dabei die gleiche Abhängigkeit von der Glutamatkonzentration auf (K0,5 = 31 µM) wie der Transportstrom. Der Übergang in den leitfähigen Zustand und der Transport hängt demnach von dem gleichen L-glutamatgebundenen Zustand des EAAC1 ab. Dies konnte auch unter Verwendung des Inhibitors HIP-B gezeigt werden. HIP-B wurde erstmals an EAAC1 getestet und wies eine Inhibitionswirkung auf den Transportstrom auf, die nicht auf eine kompetitive Bindung zurückzuführen war. Die Anionenleitfähigkeit ließ sich mit HIP-B hingegen nicht inhibieren. Der bakterielle Natrium-Protonen-Austauscher NhaA lag rekonstituiert in Liposomen vor, die auf der festkörperunterstützten Membran angelagert wurden. Bedingt durch die RSO-Orientierung des NhaA, konnte der Natriumtransport entgegen der natürlichen Transportrichtung (extrazelluläre Natriumbindung) untersucht werden. Der Transportstrom wies eine ausgeprägte Abhängigkeit vom pH-Wert auf. Bei neutralen bzw. sauren pH-Werten (pH <= 7) war die Aktivität des NhaA gegenüber dem alkalischen Bereich (7 < pH < 9) erheblich reduziert. Dieses Verhalten entspricht Literaturangaben für die Intrazellulärseite des NhaA. Dennoch war der NhaA bei einem neutralen pH-Wert nicht vollständig inaktiv. Die Affinität für Natriumionen konnte bei einem pH-Wert von 8,5 zu K0,5 = 11 mM und bei pH 7,0 zu K0,5 = 180 mM bestimmt werden. Neben einer Verringerung der Wechselzahl sinkt im neutralen/sauren Bereich also auch die Affinität für Natriumionen. Durch die Verwendung von Liposomen, in denen der NhaA mit verschiedenen Lipid- zu Protein-Verhältnissen rekonstituiert wurde, konnte gezeigt werden, dass die Messströme auf die Aufladung der Liposomen zurückführbar sind. Der Transportstrom konnte mit der amiloridähnlichen Substanz 2-Aminoperimidin inhibiert werden (Ki = 3 µM). Eine Inhibitionswirkung war nur zu beobachten, wenn der pH-Wert kleiner als pH 8 war. Zusammmen mit der ausgeprägten pH-Wertabhängigkeit kann dieses Phänomen auf eine pH-induzierte Konformationsänderung des NhaA zurückgeführt werden.
Zur Vorhersage der Konformationen organischer Moleküle in wässriger Lösung wurde ein explizites Solvatationsmodell (TPA3) für das Kraftfeldprogramm MOMO entwickelt, getestet und erfolgreich angewendet. Für jede zu optimierende Konformation wird eine der räumlichen Ausdehnung entsprechende Solvathülle generiert. Dadurch werden zu große Solvathüllen mit vielen Wassermolekülen vermieden. Diesem ersten Schritt liegt das Aneinanderreihen von Eiselementarzellen und ungeordneten Wasserzellen zugrunde. Überschneidungen oder unrealistisch nahe Orientierungen von Wassermolekülen zu dem solvatisierten Molekül werden ausgeschlossen. Gleichzeitig wird sichergestellt, dass in der Umgebung von Wasserstoffbrücken-Donoren und -Akzeptoren im solvatisierten Molekül Wassermoleküle zu finden sind.
Die Optimierung vereinfachter Wassermoleküle ohne molekularen Zusammenhalt basiert auf vektoriellen Ausgleichsbewegungen, in die die Bewegungsvektoren der minimierten Wassermolekül-Atome eingehen. Dadurch ist es möglich, ein einziges Potential für Coulomb- und vdw-Wechselwirkungen ohne Vernachlässigung der Rotation zu nutzen, was eine deutliche Rechenzeitoptimierung bedeutet. Die besondere Beachtung der Programmstruktur von MOMO und die sich daraus ergebende Interaktion des Solvatationsmodells mit nahezu allen relevanten Programmteilen des Kraftfeldprogramms ermöglicht trotz ihres kontinuierlichen Austauschs eine Unterscheidung von präzise behandelten nahen und vereinfachten fernen Wassermolekülen während der gesamten Minimierung. Gleichzeitig werden von jedem nahen Wassermolekül die Einzelenergiebeiträge der Wechselwirkungen mit dem solvatisierten Molekül direkt in den Potentialen gesammelt und durch Summation die Stabilisierungsenergie Estab bestimmt.
Somit wird ein Nahbereich mit ungeordneten Wassermolekülen um ein solvatisiertes Molekül herum mit der gesamten in MOMO möglichen Präzision behandelt. Hierbei ist die Berechnung von Wasserstoffbrücken zwischen dem solvatisierten Molekül und umgebenden Wassermolekülen für Estab von entscheidender Bedeutung. Hingegen wird der Fernbereich ausgehend und basierend auf der Eisstruktur rechenzeitoptimiert behandelt. Dynamik und Durchmischung mit dem Nahbereich werden durch den auf der Minimierung der isolierten Atome basierenden TPA3-Algorithmus erreicht.
Mit den erreichten Rechenzeitoptimierungen können systematische Konformationsanalysen an Di- und Tripeptiden in Wasser mit bis zu 2500 Konformationen problemlos durchgeführt werden. Mit den statistischen Auswertungsmethoden des Clusterings, der Medianbildung und der Datenrasterung ergaben sich aussagekräftige Energieflächen über Ramachandran-Diagrammen der berechneten Peptide. Die Visualisierung der Trajektorien und der Minimum-Konformationen der Peptide mit deren Wasserstoffbrücken und der daran beteiligten Wassermoleküle sowie die detaillierte Analyse der Energiebeiträge lieferten eine solide Interpretationsbasis der vorhergesagten Strukturen.
Insgesamt wurden Konformationsanalysen im Vakuum und mit dem neu entwickelten TPA3-Solvatationsmodell an zehn Peptiden durchgeführt. Ungeschützte Peptide wurden in unterschiedlich protonierten Formen berechnet. Vergleichende Konformationsanalysen mit AMBER11 und TIP3P-Solvatationsmodell waren nur für die zwitterionische Form möglich.
Bei dem geschützten Alaninpeptid N-Acetyl-L-L-dialanin-N-methylamid zeigte sich eine Begünstigung der PPII-Struktur. Daneben trat ein Minimum im β-Faltblattbereich auf; eine Stabilisierung des αR-helikalen Bereichs wurde ebenfalls beobachtet. Dies entspricht den in der aktuellen Literatur zu findenden spektroskopisch erhaltenen Ergebnissen.
Aufgrund nicht vorhandener Informationen bezüglich der Energiebeiträge durch das explizite TIP3P-Solvatationsmodell war die Auswertung der AMBER11-Konformationsanalysen auf die Verteilung der Konformationen im Ramachandran-Diagramm begrenzt und somit stark eingeschränkt. Bezüglich N-Acetyl-L-L-dialanin-Nmethylamid ergaben sich auch mit AMBER11 Häufungen im PPII- und β-Faltblatt-Bereich und darüber hinaus im αD-helikalen Bereich.
Für Peptide mit negativ geladenen Seitenketten in der zentralen Position wurden Konformationen, die in Turns zu finden sind, als begünstigt berechnet. Bei Tripeptiden mit Aminosäuren, die Donoren D bzw. Akzeptoren A zur Wasserstoffbrückenbildung in ihren Seitenketten besitzen (Ala−Lys−Ala, Ala−Asp−Ala, Cys−Asn−Ser), wurden in allen Fällen zweifache Wasserstoffbrücken über verbrückende Wassermoleküle hinweg (D/A···H2O···D/A) beobachtet. Diese scheinen insbesondere bei Ala−Asp−Ala durch Beteiligung des Aspartatrestes und einem zweimalig negativen Energiebetrag von mehr als 10 kJ/mol Einfluss auf die Konformation zu nehmen und δ-Turn-Konformationen zu stabilisieren. Die AMBER11-Konformationsanalyse mit TIP3P-Modell ergab hingegen eine deutliche Häufung minimierter Konformationen für φ < 120°. Diese Häufung zeigt sich als deutlicher Streifen im Ramachandran-Diagramm bei φ ≈ 60°. Die α-helikalen Konformationen αD und αL sowie die C7 ax-Struktur sind von AMBER11 hier stark begünstigt. Die Konformationsanalyse mit TPA3-Solvatationsmodell an Ala−Lys−Ala zeigte mehrere Minima; die Konformationen im Bereich δR / PPII / C7 eq werden jedoch besonders stabilisiert. Ein verbrückendes Wassermolekül ist auch hier beteiligt.
Bei den Tripeptiden mit sperrigen Seitenketten, wie Ala−Phe−Ala und Gly−Phe−Gly, wird eine sterische Abschirmung durch den Phenylrest deutlich, die zu einer Abschwächung der Begünstigung von PPII-Konformationen führt. Stattdessen sind α-helikale Konformationen favorisiert. Bei Gly−Phe−Gly scheint diese Abschirmung einen weniger starken Einfluss zu haben: im PPII- und β-Faltblattbereich sind wieder Minima vorhanden. Generell sind die Ergebnisse der MOMO/TPA3-Konformationsanalysen im Einklang mit der aktuellen Literatur und sehr plausibel für Peptide, bei denen (noch) keine eindeutigen Literaturergebnisse vorliegen. Die aktuelle Annahme, dass intramolekulare Wasserstoffbrücken in Peptiden Turn-Konformationen in Wasser stabilisieren könnten, wird mit den in dieser Arbeit mehrfach aufgetretenen zweifachen Wasserstoffbrücken über verbrückende Wassermoleküle erweitert.
Mit AMBER11 konnte dagegen kaum Bezug zu experimentellen Literaturergebnissen hergestellt werden. Dies liegt vor allem daran, dass die für eine aussagekräftige Auswertung unverzichtbaren Energiebeiträge der Peptid-Wechselwirkungen mit einzelnen Wassermolekülen mit AMBER11 nicht zur Verfügung standen. AMBER11 eignet sich daher kaum als Referenz für die mit MOMO und dem neu entwickelten TPA3-Solvatationsmodell erhaltenen Ergebnisse.
In allen bislang durchgeführten Experimenten zur Mutagenese von embryonalen Stammzellen war auffällig, dass Gene, die für sekretierte oder membranständige Proteine kodieren, stark unterrepräsentiert waren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Genfallen untersucht, die speziell diese Gene mutieren sollten. Als Selektionskassetten tragen beide Genfallen den 5' Bereich des humanen CD2, der eine kryptische Spleißakzeptorsequenz enthält und für eine Transmembrandomäne kodiert, als Fusion mit der bakteriellen Neomycinphosphotransferase. U3Ceo trägt diese Kassette als klassische retrovirale Genfalle im LTR des Mouse Molony Leukemia Virus, wogegen die ebenfalls retrovirale FlipRosaCeo Genfalle die Selektionskassette im Viruskörper enthält. Diese wird von Rekombinaseerkennungssequenzen flankiert, welche eine konditionale Aktivierung der Mutation für die spätere Analyse in einem Mausmodell ermöglichen. Beide Genfallen zeigten mit ca. 80% aller Integrationen eine hohe Spezifität für Gene, die für sezernierte und membranständige Proteine kodieren. Allerdings war die Frequenz für Insertionen in sogenannte „hot spots“ bei beiden Genfallen aufgrund der geringeren Zahl an Zielgenen höher als bei anderen im GGTC verwendeten Genfallen (z.B. FlipRosabetageo). Innerhalb dieser „hot spots“ zeigte sich die bekannte Präferenz retroviraler Genfallenvektoren, in das 5’ Ende von Genen zu integrieren, wobei hier meist die größten Introns zu finden sind. Ebenso zeigte sich für die in dieser Arbeit untersuchten sekretorischen Genfallen genau wie bei anderen bekannten Genfallen eine bevorzugte Integration in Chromosomen mit einer hohen Gendichte. Die Funktionalität der konditionalen Genfalle konnte in vitro sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten durch Einbringen der Genfalle und der jeweiligen Rekombinasen bestätigt werden. In ES Zellen, die eine X-chomosomale Integration aufwiesen, wurde der Mechanismus durch transiente Expression der Rekombinasen in Klonen überprüft. Hierbei stellte sich heraus, dass das Wildtyptranskript eines mutierten Gens nach der einmaligen Rekombination der FlipRosaCeo wieder exprimiert wird und nicht durch die auf dem Gegenstrang befindliche Genfalle beeinflusst wird. Nach einer weiteren Rekombination mittels FLPe konnte der mutagene Ausgangszustand der Genfalle wieder hergestellt werden. Die Mutagenität der beiden Genfallen wurde durch Überprüfung der Konzentration der restlichen endogenen Transkripts der mutierten Gene per quantitativer PCR an X-chromosomalen Klonen analysiert. Hier konnte bei etwa 80% der untersuchten Klone eine sehr starke Mutation des jeweils getroffenen Gens festgestellt werden. Zur in vivo Überprüfung der U3Ceo Genfalle wurde ein Mausmodell durch Blastozysteninjektion des ES Zellklons M076C04 generiert. Die Integration der Genfalle in das erste Intron des Gens C030019F02Rik sollte eine deutliche Verkürzung des membranständigen Genproduktes bewirken. In Gehirnen von homozygoten Mäusen konnte die Expression des Wildtyptranskripts nicht mehr festgestellt werden, so dass diese Mauslinie eine Nullmutation des Gens trägt. Die in dieser Arbeit untersuchte KO Maus zeigte bisher keinen feststellbaren Phänotyp, obwohl das Genprodukt in vielen Spezies hoch konserviert vorliegt und auch nur in bestimmten Bereichen im Organismus nachweisbar ist, so dass eine wichtige Funktion des Proteins anzunehmen ist. Eine weitere Analyse dieser Mauslinie wird sich dieser Arbeit anschließen.
In dieser Arbeit wurde das Proteom synaptischer Vesikel mit Hilfe vier verschiedener elektrophoretischer Techniken in Kombination mit Massenspektrometrie eingehend charakterisiert. Die bisherigen Proteomansätze resultierten in der Identifizierung einer deutlich geringeren Anzahl von Proteinen. Bis auf wenige Ausnahmen wurden alle in der Literatur beschriebenen Proteine detektiert. Dies zeigt, daß die Verwendung der eingesetzten Techniken die umfassende Charakterisierung der Proteinbestandteile der Vesikel zuläßt. Ferner kann aus den Analysen geschlossen werden, daß zum jetzigen Zeitpunkt die technischen Grenzen für die Charakterisierung nicht weiter subfraktionierter synaptischer Vesikel erreicht sind. Die Anwendung der drei Techniken legt nahe, daß jede Technik ihre Vor- und Nachteile für die Identifizierung bestimmer Proteinklassen besitzt. Dies wurde bisher noch nicht in dieser Form gezeigt und liefert wertvolle Informationen für weitere Proteomanalysen. Zu den in der Summe 238 identifizierten Proteinen gehören neun Proteine, für die weder Lokalisations- noch Funktionsdaten vorliegen. Die zwei ausgewählten Proteine Svap30 und SV35 zeigen eine gliale bzw. neuronale Verteilung. SV35 befindet sich in Subpopulationen von Neuronen, die nach immunhistochemischer Untersuchung als GABAerg und glutamaterg zu werten sind. Welche Funktion dieses Protein in diesen Neuronen ausübt, bleibt zu klären. Analysen mittels RNA-Intereferenz in PC12-Zellen und Untersuchungen zur Änderung der catecholaminergen Transmitterausschüttung könnten erste Indizien liefern. Zudem könnte über Transfektion des Proteins in Oozyten die Identität des putativ transportierten Substrates bestimmt werden. All diese Arbeiten werden in Zukunft zu einer eingehenden Charakterisierung des Proteins beitragen.
Die sekretorischen Phospholipasen A2 (sPLA2) sind eine Familie von Enzymen, die die Fähigkeit besitzen, die Hydrolyse der mittleren (sn-2) Esterbindung aus Phospholipiden zu katalysieren. Die Produkte dieser Hydrolyse, freie Fettsäuren und Lysophospholipide, sind nicht nur Bausteine für die Synthese von Lipiden, sondern sie haben wichtige Funktionen als Lipid „second-messenger“ in zellulären Signaltransduktionsprozessen. In der Klasse der sekretorischen PLA2 wurden in Säugern bisher 10 Isoenzyme identifiziert, wobei die sPLA2-IIC beim Menschen nur als Pseudogen vorkommt. In der murinen Epidermis scheinen eines oder mehrere dieser Enzyme eine Rolle bei der Bildung der epidermalen Permeabilitätsbarriere zu spielen. Darüber hinaus kontrollieren sie die Freisetzung von Arachidonsäure für die Produktion von Eicosanoiden, die sowohl für die Proliferation der Keratinozyten als auch für inflammatorische Prozesse und die Entstehung von Tumoren in der Haut von entscheidender Bedeutung sind. Da bislang weder das detaillierte Expressionsmuster der einzelnen sPLA2-Enzyme noch deren spezifische Funktionen in muriner Epidermis bekannt war, wurde in der vorliegenden Arbeit eine umfassende Analyse an Schnitten von neonataler Maushaut und an murinen Papillomschnitten durchgeführt. Zusätzlich zum Nachweis der sPLA2-Expression in vivo wurden primäre murine Keratinozyten in vitro verwendet, um die Auswirkungen der Differenzierung der Keratinozyten auf die Expression der verschiedenen sPLA2-Enzyme zu untersuchen. Die Tumorzellinie HEL30 wurde zur Durchführung funktioneller Studien und für Kolokalisationsstudien verwendet. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass in den Keratinozyten der neonatalen Maushaut in vivo sowie in isolierten primären murinen Keratinozyten alle bisher bekannten sPLA2 Enzyme exprimiert sind. Für die sPLA2-IB, -IIE, -IIF, -V und -XII konnte sowohl in den Keratinozyten der neonatalen Maushaut als auch in den primären Keratinozyten eine Expression vor allem in den differenzierten Zellen nachgewiesen werden. Dass diese Enzyme somit wahrscheinlich mit Differenzierungsprozessen gekoppelt sind, zeigte sich am Beispiel der sPLA2-V, die im murinen Papillom, welches vorwiegend aus proliferierenden Keratinozyten steht, nicht exprimiert war. Hingegen waren sPLA2 -IIA, -IID, und -X fast ausschließlich in Keratinozyten der Basalzellschicht der Epidermis und in den proliferierenden primären Keratinozyten exprimiert. Dies läßt vermuten, dass diese Enzyme eventuell eine Rolle bei der (Hyper-)Proliferation von Keratinozyten spielen. Darüber hinaus sind diese Enzyme auch in der Lage, Arachidonsäure freizusetzen, und sind somit eventuell an der Eicosanois-Homöostase beteiligt. Um eine eventuelle Beteiligung der basal exprimierten sPLA2 Enzyme an der Eicosanoidbiosynthese nachzuweisen, wurden Immunfluoreszenzstudien an neonataler Maushaut und an murinen Hautpapillomen des 2-Stufen-Tumorpromotionsmodells durchgeführt. Wie zuvor beschrieben waren alle drei Enzyme in der Basalzellschicht der neonatalen Maushaut exprimiert. Im Gegensatz dazu war die sPLA2-IIA im murinen Papillom nur am äußersten, nicht mehr hochproliferativen, Papillomrand zu detektieren. Die sPLA2-X dagegen zeigte eine starke Expression in den hochproliferativen basalen Keratinozyten dieses Gewebes. Für die sPLA2-IID konnte im Papillom ein Expressionsmuster festgestellt werden, das bis in die suprabasalen Schichten reicht. Betrachtet man die Expression der phospho-cPLA2, so konnte dieses Enzym in der neonatalen Maushaut vor allem in der Basalzellschicht, aber auch suprabasal im Stratum spinosum detektiert werden. Im Papillom zeigt dieses Enzym dagegen eine sehr starke Expression im gesamten Gewebe. Wie erwartet konnte COX-2 in der neonatalen Maushaut nicht detektiert werden, während das Expressionsmuster dieses Enzymes im Papillom mit dem der sPLA2-IID und phospho-cPLA2 korreliert Um Hinweise über die Expression und Funktion von sPLA2 –IID, -X und cP LA2 im Karzinom zu bekommen, wurde als Modellsystem die murine Karzinomzelllinie HEL30 verwendet. Diese Zellen produzieren bereits konstitutiv eine hohe Menge an PGE2. Eine TPA Stimulation dieser Zellen induziert eine zusätzlich stark erhöhte PGE2 Produktion. Anhand der Ergebnisse aus den Western Blot Analysen konnte gezeigt werden , dass sPLA2-IID und -X in den HEL30-Zellen auf Proteinebene exprimiert sind, jedoch konnte keine Veränderung der Proteinexpression dieser beiden Enzyme nach TPA-Behandlung der HEL30 Zellen detektiert werden. Dies führte zu der Annahme, dass diese Enzyme eventuell, wie die cPLA2, über ihre Enzymaktivität oder eine zelluläre Translokation reguliert werden. Durch den Einsatz des sPLA2-Inhibitors Me-Indoxam konnte jedoch weder die konstitutive noch die TPA-stimulierte PGE2 Produktion gehemmt werden, was vermutlich, wie die anschließenden siRNA Studien zeigen, auch an der Eigenschaft dieses Inhibitors liegen könnte nicht membrangängig zu sein. Weiterhin konnte durch den Einsatz des COX-2-spezifische Inhibitors Celecoxib und des COX-1-präferierende Inhibitor Indomethazin gezeigt werden, dass COX-2 vor allem an der TPA induzierte PGE2-Freisetzung, und COX-1 sowohl an der konstitutiven als auch an der der TPA induzierten PGE2-Freisetzung aus HEL30 Zellen beteiligt sind. Die Ergebnisse der Untersuchungen mit dem cPLA2-Inhibitor Pyrrolidin-1 lassen vermuten, dass in diesen Zellen die cPLA2 vor allem an der TPA induzierten PGEs-Synthese beteiligt ist, aber nicht an der konstitutiven Freisetzung. Während in unbehandelten HEL30 Zellen die sPLA2-IID im Cytosol exprimiert ist und eine schwache Kolokalisation mit COX-2 zeigt, verlagert sich dieses Enzym nach 20 minütiger TPA Stimulation, in Richtung Kernmembran und zeigt nun eine sehr starke Kolokalisation mit COX-2. Nach Inkubation der HEL30 Zellen mit einer siRNA, die die Expression der sPLA2-IID ausschalten sollte, war sowohl die konstitutive als auch die TPA-induzierte PGE2-Biosynthese signifikant reduziert. Gleichzeitig konnte durch den Einsatz der siRNA eine Reduktion des sPLA2-IID-Proteins beobachtet werden. Dies deutet an, dass die sPLA2-IID mit beiden Cyclooxygenasen gekoppelt sein könnte und ihr Substrat je nach Stimulation und Änderung der Lokalisation dem einen oder dem anderen Enzym zur Verfügung stellt. Somit konnte in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass die sPLA2-IID intrazellulär katalytisch aktiv ist und signifikant zur PGE2-Biosynthese beiträgt. Um genauere Aussagen über die Bedeutung dieser sehr interressanten Ergebnisse machen zu können, sind weitere Untersuchungen nötig, um herrauszufinden, ob die Herunterregulierung der sPLA2-IID - z.B. in Form einer sPLA2-IID-knockout-Maus - Konsequenzen für die Hyperproliferation derKeratinozyten hat, und somit einen Einfluß auf die Progression der Tumorpromotion ausüben könnte. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit ein spezifisches Expressionsmuster für die Gruppen I, II, V, X und XII sPLA2 in der murinen Haut beschrieben werden, welches mit der Regulation von Wachstum und Differenzierung verbunden ist. Hieraus läßt sich schließen, dass die einzelnen sPLA2 Enzyme unterschiedliche Funktionen in der epidermalen Homöostase sowohl unter normalen als auch pathologischen Bedingungen ausüben.
Ziel der vorliegenden Arbeit sind Strukturuntersuchungen an geplant gezüchteten Einkristallen elektronenreicher Iod- und Schwefel-Verbindungen, ergänzt durch zugehörige Dichtefunktionaltheorie-Berechnungen. Besonderes Augenmerk gilt insbesondere Molekülen mit Thiophenyl-Substituenten R-S-(C6H5) und ihren isovalenzelektronischen Derivaten vom Typ R-NH-(C6H5) sowie den bisher unbekannten Donator/Akzeptor-Komplexen des Iodanils. Durch optimierte Auswahl jeweils geeigneter Lösungsmittel und Kristallisationsbedingungen gelingt es, zahlreiche unterschiedliche Typen kristalliner Nichtmetall-Verbindungen zu züchten. Die Strukturen der isolierten Einkristalle werden durch Vergleich mit bereits literaturbekannten sowie anhand quantenchemischer Berechnungen diskutiert und vertiefen das Verständnis der experimentellen Befunde wesentlich. ... Insgesamt belegen die in der Dissertation detalliert beschriebenen Ergebnisse, daß Kombinationen von gezielter Kristallzüchtung, anschließender Strukturbestimmung und quantenchemische Berechnungen zahlreiche Informationen über Wechselwirkungen in Kristallen liefern. So verdeutlicht die anschauliche Betrachtung der I2-Komplexe durch zugehörige Einkristallstrukturen sowie quantenchemische Modellrechnungen, daß auch geringe Wechselwirkungen teils beträchtliche Einflüsse auf Stöchiometrien und Strukturparameter in Kristallen ausüben. Das Schlußbeispiel Tris(thiophenyl)methan-Dimer belegt durch alle notwendigen Messungen wie Kristallstrukturanalyse, quantenchemische hochkorrelierte Berechnungen und massenspektrokopische Messungen, wie sich durch das Zusammenwirken moderner Methoden unerwartete Ergebnisse für einen neuartigen Verbindungstyp festigen lassen. Die lohnenden Ergebnisse der Untersuchungen erweitern die Kenntnisse statischer Aspekte bei Selbstorganisations-Phänomenen.
Pflanzliche Arzneimittel erfreuen sich nach wie vor einer großen Beliebtheit. Da sie sich in enger Konkurrenz zu den auf Wirksamkeit und Unbedenklichkeit untersuchten chemisch definierten Arzneistoffen befinden, reicht es heute häufig nicht mehr aus, wenn Phytopharmaka sich nur auf ihre tradierte und dokumentierte Verwendung berufen. „Rationale“ Phytopharmaka müssen dieselben Anforderungen erfüllen, wie synthetische Arzneimittel. Das führt dazu, dass sich die Forschung neben der Aufklärung der chemischen Strukturen und Zusammensetzung der Pflanzenzubereitung, darüber hinaus auch der in-vitro und in-vivo Wirkung von Phytopharmaka widmet. Bei einigen dieser Untersuchungen konnte nicht nur die Wirkung des untersuchten Phytopharmakons aufgeklärt, sondern ebenso neue Indikationsgebiete eröffnet werden. So führte die Aufklärung des Wirkmechanismus des traditionell in der indischen Volksmedizin als Antirheumamittel angewandten Boswellia serrata-Extraktes dazu, dass Weihrauchzubereitungen heute in klinischen Studien auf Ihre Wirksamkeit bei der Behandlung des peritumoralen Hirnödems geprüft werden. In vorausgegangenen Tierstudien und klinischen Pilotstudien mit Glioblastom-Patienten konnte nämlich eine Reduktion des Hirnödems unter Weihrauchtherapie beobachtet werden. Die antiinflammatorischen, zytostatischen wie auch antiödematösen Effekte werden den im Weihrauch enthalten Boswelliasäuren zugeschrieben. Vor allem die ketylierten Boswelliasäuren KBA und AKBA zeigen in in-vitro Untersuchungen eine sehr hohe Wirksamkeit und gelten deshalb auch als Leitsubstanzen in der Monographie Boswellia serrata des DAC. Während einige Daten zur Bioverfügbarkeit von KBA bereits vorliegen, reichen die bisher zur Verfügung stehenden analytischen Methoden nicht aus, um die wesentlich geringere AKBA-Konzentration im Plasma zu bestimmen. Des Weiteren fehlte bisher der Nachweis, ob die Keto-Boswelliasäuren die Blut-Hirnschranke in der Tat überwinden können, um im ZNS zu wirken. Für die parallele Bestimmung von KBA und AKBA aus Plasma und Hirnmatrix wurde deshalb in dieser Arbeit eine sensitive analytische Methode entwickelt und gemäß internationalen Richtlinien validiert. Diese Methode ist charakterisiert durch eine sehr einfache Probenaufarbeitung mittels sorbensgestützter Flüssig-Flüssig-Extraktion auf Kieselgurbasis, gefolgt von einer chromatographischen Trennung auf einer RP-18-Säule und einer massenspektrometrischen Detektion anhand der Übergänge m/z 471,2 --> 95,1 für KBA und m/z 513,4 --> 91,1 für AKBA im positiven MRM-Modus. Die Quantifizierung erfolgte über die pentazyklische Triterpensäure „Asiatische Säure“, die als interner Standard eingesetzt wurde. Bei der anschließenden Validierung konnte die Spezifität der Methode nachgewiesen, sowie die international anerkannten Grenzen für die Linearität, die Nachweisgrenze sowie die inter- und intraday Präzision und Richtigkeit eingehalten werden. Die Stabilität der Plasma- und Hirnproben konnte bei T=-20°C für fünf Monate, bei Raumtemperatur für 24 Stunden und nach mehreren Einfrier-Auftauzyklen belegt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die entwickelte analytische Methode zur Aufnahme von Plasma-Spiegel-Kurven von KBA und AKBA nach oraler Administration von Weihrauchzubereitungen eingesetzt werden kann. Gegenüber den bereits beschriebenen HPLC-UV- und GC-MS-Methoden besitzt die neu entwickelte Methode den Vorteil, dass mit der Nachweisgrenze von 5 ng/ml für KBA und AKBA, auch die Plasmakonzentrationen von AKBA erstmals valide erfasst werden konnten. Da sie darüber hinaus eine einfache Probenaufarbeitung mit einer kurzen Analysenzeit von 6 Minuten verbindet, ist sie für die Durchführung von Pharmakokinetikstudien gut geeignet. Wie wichtig derartige pharmakokinetische Studien für die Etablierung von Weihrauch als rationales Phytopharmakon sind, erbrachte der Vergleich der Bioverfügbarkeit von H15™-Ayurmedica mit einem Referenzpräparat. Hierbei wurde deutlich, dass für die Resorption von KBA und AKBA neben der Extraktzusammensetzung auch die Arzneiform eine entscheidende Rolle spielt. Für die Zukunft stellt daher die Erhöhung der Bioverfügbarkeit von KBA und AKBA z.B. durch eine verbesserte technologische Formulierung einer der wichtigsten Meilensteine im Sinne einer verbesserten Therapie mit Weihrauchextrakt dar. Im Hinblick auf die potentielle Indikation von Boswellia serrata Extrakt für die Therapie des tumor-assoziierten Hirnödems wurde darüber hinaus untersucht, ob die beiden Keto-Boswelliasäuren die Blut-Hirn-Schranke überwinden und in das Hirn gelangen können. Dazu wurden die Konzentrationen von KBA und AKBA im Hirn nach einem Fütterungsversuch an neun gesunden Ratten bestimmt. Es konnten Spiegel von 99 ng/g für KBA und 95 ng/g für AKBA drei Stunden nach Gabe von 240 mg/kg Körpergewicht H15™-Ayurmedica detektiert werden. Bei gliominplantierten Ratten konnte mit der 3-mal täglichen Gabe dieses Präparates in dieser Dosierung eine Reduktion des Ödemvolumens, eine Zunahme von apoptotischen Zellen und eine Verlängerung der Überlebenszeit beobachtet werden. Interessant ist deshalb auch die Frage, wie es sich mit den Konzentrationen der Keto-Boswelliasäuren in Tumorgeweben verhält. Zur Klärung dieses Aspektes könnte die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte LC-MS/MS-Methode beitragen. Häufig können die Chemotherapeutika in den Tumorzellen nicht die Spiegel des gesunden Gewebes erreichen. Dies kann in vielen Fällen in Verbindung mit der Effluxpumpe P-Glycoprotein (Pgp) gebracht werden. Dieses membranständige Transportprotein hindert Arzneistoffe daran in das Cytoplasma zu gelangen. Inwieweit eine Pgp vermittelte Resistenz bei den Glioblastomen eine Rolle spielt, ist derzeit noch nicht vollständig geklärt. Pgp ist darüber hinaus in seiner physiologischen Funktion an der schnellen Ausscheidung von Fremdstoffen und am Schutz spezieller Kompartimente, wie dem Gehirn, beteiligt. Eine Interaktion von Arzneistoffen mit Pgp kann deshalb auch die Pharmakokinetik dieser Substanzen empfindlich beeinflussen. Unter diesen Gesichtspunkten wurden in dieser Arbeit auch die pharmakologisch wichtigen Inhaltsstoffe des Weihrauchextraktes auf eine mögliche Modulation der Pgp-Funktion untersucht. Dieser Test erfolgte mittels zellbasierten Calcein-AM-Assays in Schweinehirnendothel-Zellen (PBCEC-Zellen) und in einer Pgp-expremierenden humanen Leukämiezelllinie (VLB-Zellen). In beiden Zellsystemen erwies sich Weihrauchextrakt (84Mikrogramm/ml H15™-Ayurmedica) als ein Modulator der Transportfunktion von Pgp. Bei der Untersuchung der einzelnen Boswelliasäuren, stellte sich heraus, dass die im Extrakt am häufigsten vorkommenden Beta-Boswelliasäuren und Acetyl-Beta-Boswelliasäuren für diesen Effekt nicht verantwortlich sind. Auch die Alpha-Boswelliasäure und Acetyl-Alpha-Boswelliasäure beeinflussen ebenfalls die Transportaktivität nicht. Eine Interaktion mit dem Transportprotein konnte dagegen bei den Keto-Boswelliasäuren KBA (10 MikroM) und AKBA (3 MikroM) in den Schweinehirnendothelzellen beobachtet werden. In der Leukämiezelllinie konnte bei beiden Keto-Boswelliasäuren ebenfalls einen Einfluss auf die Transportaktivität des Pgp festgestellt werden, der allerdings nur bei AKBA (3 MikroM) signifikant war. Um zu verifizieren, ob die 11-Ketogruppe für die modulierende Wirkung der Boswelliasäuren verantwortlich ist, wurde Glycyrrhetinsäure, eine pentazyklische Triterpensäure, die wie KBA und AKBA eine Ketofunktion an Position 11 besitzt, getestet. Da im Calcein-AMAssay bei dieser Substanz ein mit AKBA vergleichbarer Effekt auftrat, scheint für eine Wechselwirkung des P-Glycoproteins mit Boswelliasäuren die 11-Ketogruppe essentiell zu sein. In dieser Arbeit wurde ein erster Hinweis auf eine Wechselwirkung zwischen Keto-Boswelliasäuren und Pgp erbracht. Inwiefern diese in-vitro-Daten auch auf in-vivo klinische Relevanz besitzen, muss noch in weiteren Studien mit Weihrauch geklärt werden. Gerade für die Behandlung des peritumoralen Hirnödems von Glioblastom-Patienten wäre es wichtig, den Mechanismus der Wechselwirkung von KBA und AKBA mit P-Glycoprotein näher zu untersuchen. Da Weihrauchextrakt häufig in der Co-Medikation verwendet wird, sollte auch im Hinblick auf die Arzneimittelsicherheit geprüft werden, ob es zu Arzneimittelinteraktionen auf Pgp-Ebene mit Weihrauchextrakt kommen kann.
Die Aufrechterhaltung des physiologischen Gleichgewichtes in einem mehrzelligen Organismus erfordert Mechanismen, welche die Balance zwischen der Toleranz gegenüber Selbst-Antigenen und der Auslösung einer Immunantwort ermöglichen. Diese Mechanismen werden unter dem Begriff periphere Toleranz zusammengefasst. Regulatorische T-Zellen (Treg) sind eine T-Zell-Subpopulation, die für periphere Toleranz und Homöostase des Immunsystems von großer Bedeutung sind (Powrie et al., 2003). Durch ihre suppressiven Eigenschaften sind Treg in der Lage, die Proliferation von konventionellen T-Zellen (Tcon) sowohl in vivo als auch in vitro zu hemmen und so eine Immunantwort von autoreaktiven TZellen einzudämmen. Für die Hemmung von Tcon in vitro wird der direkte Zellkontakt zwischen Treg und Tcon benötigt (Thornton und Shevach, 1998). Der molekulare Mechanismus humaner Treg ist bislang jedoch nur unzureichend geklärt. In der hier vorgestellten Forschungsarbeit wurden TZR-abhängige Signaltransduktionskaskaden analysiert, um den molekularen Mechanismus humaner Treg sowohl auf Ebene der Treg als auch auf Ebene der gehemmten Tcon zu entschlüsseln. Hierzu wurden im Rahmen der hier beschriebenen Experimente in unserer Abteilung die ex vivo Isolation und die in vitro Expansion humaner Treg etabliert. Mit Hilfe sensitiver Analysemethoden der TZR-abhängigen Signaltransduktionskaskaden konnte für humane Treg gezeigt werden, dass sie nach Stimulation über ihren TZR einen geringeren Ca2+-Einstrom im Vergleich zu dem in Tcon aufweisen. Ein weiteres Ergebnis der hier vorliegenden Arbeit ist, dass Treg im Zuge ihrer Aktivierung eine geringere Phosphorylierung einiger, für die TZR-induzierte-Signalkaskade relevante Signalmoleküle wie ERK1/2 und p38MAPK aufweisen. Für gehemmte Tcon aus der Kokultur mit humanen Treg wurde in dieser Forschungsarbeit ein zu Kontroll-Tcon vergleichbarer Ca2+-Einstrom detektiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen außerdem, dass Tcon aus der Kokultur mit Treg eine verringerte Phosphorylierung der Signalmoleküle ERK1/2 und p38MAPK aufweisen. Die hier veröffentlichten Ergebnisse ermöglichen einen ersten Einblick in die molekulare Signaltransduktion von humanen Treg und zum ersten Mal auch in die von gehemmten Tcon. Dieses Verständnis stellt eine Grundlage für weitere Experimente dar und ermöglicht einen Schritt in Richtung der vollständigen Entschlüsselung des molekularen Mechanismus humaner Treg, die eine Voraussetzung für den therapeutischen Einsatz dieser Zellen ist. Eine weitere Zielsetzung dieser Arbeit war es, den Einfluss apoptotischer Zellen auf die Immunantwort zu untersuchen. Für die Gewebehomöostase mehrzelliger Organismen ist die effiziente und immunologisch unauffällige Eliminierung apoptotischer Zellen unabdingbar (Fadok et al., 1998; Lauber et al., 2004; Skoberne et al., 2005; Steinman und Nussenzweig, 2002). Im Rahmen der hier erläuterten Experimente wurden in vitro Studien durchgeführt, die einen inhibierenden Effekt apoptotischer Zellen auf die Reifung humaner dendritischer Zellen zeigen. Es konnte bestätigt werden, dass dendritische Zellen nach Phagozytose apoptotischer Zellen weniger proinflammatorische Moleküle sekretieren und eine geringere Oberflächenexpression kostimulatorischer Moleküle aufweisen. Nach Etablierung zweier in vitro Modellsysteme wurde in weiteren Experimenten gezeigt, dass T-Zellen durch dendritische Zellen, die zuvor apoptotische Zellen aufgenommen haben, eine geringere Stimulation erfahren. Diese Ergebnisse deuten auf einen anti-stimulatorischen Effekt dendritischer Zellen, die zuvor apoptotische Zellen aufgenommen haben hin, und sie bilden die Basis für eine anschließende in vitro Analyse der molekularen Auswirkungen auf dendritische Zellen und T-Zellen.
Adenosintriphosphat (ATP) als universelles Energieäquivalent der Zelle wird durch die oxidative Phosphorylierung synthetisiert, bei der Elektronen entlang des elektrochemischen Gefälles der Atmungskette über verschiedene Redoxkomplexe transferiert und durch die chemiosmotische Kopplung Protonen über die Membran gepumpt werden. Der Protonengradient wird dann von der ATP-Synthase genutzt, um ADP zu ATP zu phosphorylieren. Zentraler Redoxkomplex der Atmungskette vieler Pro- und Eukaryonten ist der bc1-Komplex, der Elektronen von Ubichinol auf Cytochrom c überträgt, von wo sie nachfolgend auf die Cytochrom c-Oxidase transferiert werden. Das mesophile Bodenbakterium Paracoccus denitrificans wird als Modellsystem für den mitochondrialen Elektronentransfer (ET) verwendet, da es eine aerobe Atmungskette exprimiert, die der mitochondrialen homolog ist, allerdings einen wesentlich einfacheren Aufbau der einzelnen Redoxkomplexe aufweist. Auch Thermus thermophilus als extrem thermophiles Bakterium bildet eine vergleichbare aerobe Atmungskette aus, wobei deren Proteine allerdings eine hohe Thermostabilität aufweisen, wodurch sie in das Interesse der Forschung gerückt sind. Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung des ET zwischen Komplex III und IV der Atmungsketten von P. denitrificans und T. thermophilus, die aufgrund ihrer mesophilen und thermophilen Eigenschaften unterschiedliche Mechanismen in der Wechselwirkung ihrer Redoxproteine aufweisen. Es wurden lösliche Redoxfragmente verwendet, um anhand von Mutagenesestudien, Stopped-Flow (SF)- und Laserflash-Kinetiken (LF) unter pre-steady state-Bedingungen sowie FRET-Experimenten den ET zu untersuchen. Für die LF-Experimente wurde eine photoaktive Rutheniumverbindung kovalent an Cyt c552 gekoppelt, durch die bei Laseranregung das Häm photooxidiert und dadurch der ET von einem reduzierten Redoxpartner induziert werden kann. Die Strukturdaten des bc1/Cyt c-Cokomplexes aus Hefe zeigen, dass direkte Kontakte zwischen Cyt c1 und Cyt c durch unpolare Wechselwirkungen und eine zentrale Kation-p-Interaktion vermittelt werden. Daher wurden anhand von Sequenz- und Struktur-alignments äquivalente Aminosäurepositionen im Paracoccus Cyt c1 identifiziert, die an der Wechselwirkung zu Cyt c552 beteiligt sein könnten. Diese wurden durch gerichtete Mutagenese in ihrem Raumvolumen, ihrer Polarität oder Ladung variiert und in kinetischen Studien untersucht. Für die LF-Kinetiken sowie für die FRET-Experimente wurden Oberflächen-Cysteinmutanten des Cyt c1 bzw. c552 generiert, über deren SH-Gruppen kovalent der Rutheniumkomplex bzw. Fluorophore gekoppelt werden konnten. Die ET-Reaktion zeigt zwei Phasen in Abhängigkeit von der Ionenstärke. Bei niedrigen Ionenstärken ergeben sich Geschwindigkeitskonstanten von 109 M -1s-1 und eine geringe Ionenstärkeabhängigkeit (etwa eine effektive Ladung), wohingegen bei Ionenstärken ab 35 mM 2-3 effektive Ladungen pro Redoxpartner beteiligt sind und bimolekulare Geschwindigkeitskonstanten von 107 bis 109 M-1s-1 erhalten werden. Diese Ergebnisse deuten auf die Bildung eines Encounter-Komplexes bei niedrigen Ionenstärken hin, der ein Ensemble verschiedener Distanzen und relativer Orientierungen der Redoxpartner zueinander darstellt. Diese Annahme wurde ebenfalls durch FRET-Experimente bestätigt, durch die selbst bei niedrigen Ionenstärken keine definierten Abstände erhalten werden konnten. Die Geschwindigkeitskonstanten der bimolekularen Reaktion weisen auf einen diffusionskontrollierten Prozess hin, an dem 2 bis 3 effektive Ladungen an der elektrostatischen Annäherung der beiden Redoxpartner beteiligt sind. Diese Ergebnisse werden durch vorherige kinetische Untersuchungen und EPR-Studien des ET von Cyt c552 zum CuA-Fragment der aa3-Oxidase bekräftigt, für den die gleiche Anzahl effektiver Ladungen und die Bildung eines Encounter-Komplex gefunden wurden. Lediglich c1-Mutanten, deren variierte Aminosäuren sich direkt oberhalb der Hämspalte und in der Sequenz um bzw. innerhalb des Hämbindemotivs befinden, bewirken eine Verlangsamung der Gesamtreaktion und ein leicht verändertes Ionenstärkeverhalten, das auf eine leicht verschobene Interaktionsfläche hindeutet. Es wurde durch Sequenz- und Strukturalignments kein aromatischer Rest in direkter Nähe der entsprechenden Position im Paracoccus Cyt c1 gefunden, der wie im Hefekomplex eine stabilisierende Kation-p-Interaktion zwischen den Redoxpartnern vermittelt. Zur Untersuchung des ET zwischen Komplex III und Komplex IV aus T. thermophilus wurde die hydrophile Cytochrom c-Domäne der caa3-Oxidase in Analogie zum Paracoccus-System als lösliches Redoxfragment kloniert, heterolog exprimiert und charakterisiert. Dieses Fragment wurde in SF-Studien eingesetzt, um den ET zu seinen potentiellen Redoxpartnern Cyt cbc des bc-Komplexes und Cyt c552 zu charakterisieren. Es konnte gezeigt werden, dass das ccaa3-Fragment Elektronen von beiden Redoxpartnern empfängt, wobei die ET-Reaktion mit Cyt c552 so schnell verläuft, dass sie durch SF-Techniken nur schlecht aufgelöst und lediglich eine Größenordnung der Geschwindigkeitskonstanten abgeschätzt werden kann (kon ~ 1010 M-1s-1). Die Reaktion mit Cyt cbc verläuft auch noch schnell (kon = 108-109 M-1s-1) und ist nahezu unabhängig von der Ionenstärke, was eine hydrophobe Wechselwirkung zwischen beiden Redoxpartnern bestätigt. Die Ergebnisse deuten erstmals darauf hin, dass ein ET direkt zwischen zwei Redoxproteinkomplexen (bc-Komplex und caa3-Oxidase) stattfindet, ohne dass ein Elektronenüberträger (wie z. B. Cyt c552) zwischengeschaltet ist. Um die Übertragbarkeit der Erkenntnisse, die hier über den ET an löslichen Redoxfragmenten gewonnen wurden, in einem Proteinkomplex zu verifizieren, wurde ein bc1-Komplex verwendet, in dem die für P. denitrificans einzigartige saure Cyt c1-Domäne deletiert ist. Der Komplex wurde für eine erleichterte Aufreinigung mit einem His-tag versehen, homolog exprimiert und erste Aufreinigungs- und Charakterisierungsschritte unternommen. Er soll zukünftig eingesetzt werden, um die Mutationen des löslichen c1-Fragmentes in den Komplex zu überführen und die Mutanten kinetisch mittels pre-steady state- und steady state-Techniken im Vergleich zum bc1WT-Komplex zu untersuchen, ohne dass die Effekte der Punktmutationen durch die hohe negative Ladungsdichte der sauren Domäne überlagert werden.
Die vorliegende Arbeit befaßte sich mit der Untersuchung der Protonenbewegung während des O-E Schrittes im katalytischen Zyklus der Cytochrom-c-Oxidase von P. denitrificans. Die Zuordnung der Protonenbewegung zu den einzelnen Schritten des katalytischen Zyklus der Cytochrom-c-Oxidase ist immer noch ein Gegenstand zahlreicher Kontroversen. Obwohl von Ruitenberg et al. (2000) durch Spannungsmessungen gezeigt wurde, daß die Reduktion von Häm a während des ersten Elektrontransfers in das oxidierte Enzyme eine schnelle Protonenaufnahme von der gegenüberliegenden Seite der Membran bewirkt, wurden diese Ergebnisse angezweifelt. Daher sollte mit einer unabhängigen und direkten Methode herausgefunden werden, ob Protonen bereits während des ersten Schrittes des katalytischen Zyklus aufgenommen werden. Dazu wurde ns-zeitaufgelöste Blitzlicht-Absorptionsspektroskopie in Kombination mit pH-sensitiven Farbstoffen genutzt, und zwar sowohl mit Fluorescein kovalent an der Proteinoberfläche gebunden als auch mit Phenolrot löslich im Medium vorliegend. Zur kovalenten Kopplung von thiolreaktiven Farbstoffen mußten zuerst die nötigen Voraussetzungen geschaffen werden. Dazu wurde in dieser Arbeit ein Mutagenesesystems für sowohl Untereinheit I als auch Untereinheit II etabliert und eine oberflächencysteinfreie Variante und elf Einzelcystein-Varianten hergestellt, exprimiert und aufgereinigt sowie die Enzymaktivitäten überprüft. Danach wurde ein Protokoll zur Kopplung der Einzelcysteinvarianten mit Iodoacetamidfluoresein ausgearbeitet und die Varianten Fluorescein-markiert. Dabei zeigte es sich, daß nur sieben Varianten erfolgreich mit IAF reagierten. Mittels dieser AF-markierten Varianten konnte die Pufferkapazität an der Oberfläche der Cytochrom-c-Oxidase bestimmt werden. Es zeigte sich, daß die Pufferkapazität des Enzyms in Lösung im Vergleich zu Bakteriorhodopsin dreimal so groß ist, an der Oberfläche sogar 10-15mal so groß. Dies deutet auf eine hohe Anzahl protonierbarer Gruppen um die für die Markierung ausgewählten Aminosäuren im Bereich der Eintrittsstellen der Protonen hin. Die gezielte Übertragung eines Elektrons auf die Cytochrom-c-Oxidase erfolgte durch Licht anregbare Rutheniumkomplexe. In unserem Meßsystem war die Elektronentransfereffizienz von [Ruthenium(2,2‘-bipyridin)2]2quarterpyridin am höchsten. Nach einer sorgfältigen Optimierung der Meßbedingungen wie pH-Wert, Ionenstärke und Energie des Lasers konnte eine 10-15 %ige Reduktion von Häm a mit einer Zeitkonstanten von t = 13,7 ± 2,4 µs nachgewiesen werden. Die Protonenkonzentrationsänderungen im Medium konnten durch Phenolrot verfolgt werden. Durch den Vergleich von Funktionsvarianten, bei denen jeweils einer oder beide Protoneneingangswege blockiert sind, konnte ein Modell für die Protonenaufnahme und -abgabe während der Einelektronen-Reduktion der Cytochrom-c-Oxidase entwickelt werden. Dies konnte durch Messungen an in Liposomen inkorporierter wt Cytochrom-c-Oxidase verifiziert werden. Die Nettoprotonenaufnahme von der N-Seite der Cytochrom-c-Oxidase beträgt somit 0,3 H+ für das im O-E Schritt aufgenommene Elektron. Die Variante CS-I302C-AF wurde dazu genutzt, die Oberflächenladungsdichte an der N-Seite der Cytochrom-c-Oxidase zu bestimmen. Die Oberflächenladungsdichte auf der N-Seite des Enzyms in der Nähe zum Eingang des K-Wegs ist negativ und beträgt 0,5 e-/1000 Å2.
In dieser Arbeit wurden die neuronalen Glutamattransporter EAAT4 (Excitatory Amino Acid Transporter) und EAAT3 in einem HEK (Human Embryonic Kidney) Zellsystem untersucht, in dem die Transporter transient exprimiert wurden. Diese Proteine katalysieren den Transport von Glutamat entgegen des Konzentrationsgradienten aus dem Extrazellulärraum in das Zytosol. Die Energie des Transports, stammt aus dem Kotransport von Natriumionen und Protonen und dem Gegentransport von Kaliumionen. Für EAAT3 ist bekannt, dass das Verhältnis 3 Na+:1 H+:1 Glutamat:1 K+ beträgt, wodurch 2 positive Ladungen pro Transportzyklus verschoben werden. Das führt zu einem messbaren positiven Einwärtststrom. Dieser Strom ist für EAAT4 wesentlich schwächer und die Stöchiometrie ist unbekannt. Beide Proteine besitzen eine Anionenkanaleigenschaft, die bei der Bindung von Na+ und der Bindung von Glutamat voll aktiviert wird. Diese Eigenschaft ist bei EAAT4 besonders ausgeprägt. Die Transporter wurden in Abhängigkeit von verschiedenen intra- und extrazellulären Ionen- und Substratkompositionen, sowie bestimmter Potentialen und der Temperatur elektrophysiologisch charakterisiert. Die Charakterisierung der stationären Eigenschaften des wenig bekannten Transporters EAAT4 brachten Erkenntnisse zu Tage, die 1) Klarheit über die apparenteAffinitäten der Substrate, insbesondere Glutamat und Na+ bringen 2) neu in Bezug auf die Spannungsabhängigkeit der apparenten Affinität von Glutamat sind. Die Untersuchung der vorstationären Ableitungen waren fruchtbar in Bezug auf a) die Ähnlichkeit des Transports, der durch EAAT4 katalysiert wird, zu anderen Glutamattransporter b) spezifische Parameter des Transports, wie den Unterschied in der Transportgeschwindigkeit c) die neuartige Kinetik der Anionenleitfähigkeit. Aus den Daten ergibt sich folgendes Bild über den Mechanismus des Transports. Die Substrate binden an EAAT4, im Vergleich zu den anderen Transportern, mit wesentlich höheren Km [ (0,6 ± 0,1)µM für Glutamat und (42,3 ± 5,2)mM für Na+]. Die Bindung von Glutamat, die schnell verläuft, ist, wie bei EAAT3, stark Na+ abhängig, genau wie die Leckleitfähigkeit, die ebenfalls durch Na+ aktiviert wird. Die folgenden glutamatabhängigen, vorstationären Reaktionen, inklusive der Translokation der Substrate verläuft wesentlich langsamer, als in anderen Transportersubtypen. Die Folge ist eine geringe Umsatzrate (<3 1/s) und daher ein geringer Transportstrom [(-3,6 ± 2,8)pA]. Die Daten zeigen, dass EAAT4 trotzallem denselben prinzipiellen Mechanismus, wie die anderen Subtypen folgt. Das Verhalten der Anionenleitfähigkeit zeigt allerdings erhebliche Unterschiede zu anderen Subtypen, da die Anionenleitfähigkeit durch negative Membranpotentiale inhibiert wird. Dies wird durch die Inhibierung der K+-Relokationsreaktion des Transporters erklärt. Zusammengenommen spricht die geringe Umsatzrate und die hohe apparente Affinität für Glutamat dafür, dass EAAT4 ein hochspezialisierter Transporter für die schnelle Pufferung von Glutamat und den langfristigen Transport von Glutamat bei niedrigen Konzentrationen ist. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Temperaturabhängigkeit des Glutamattransports durch EAAT3 untersucht. Die Temperaturabhängigkeit des Transports unter stationären Bedingungen zeigte interessante neue Ergebnisse. Die Ergebnisse lassen Aussagen zu bezüglich 1) der Thermodynamik der Bindung der Substrate und 2) der molekularen Natur bestimmter Teilreaktionen im Zyklus Die Bindung eines nicht-transportierbaren Glutamatanalogons zeigt, dass die Inhibitorbindung exotherm ist (H = 30,0 ± 3,3)kJ/mol. Die Bindung von Na+ an den unbeladenen Transporter ist im Gegensatz dazu nicht signifikant von der Temperatur abhängig mit H = (20,8 ± 21,5)kJ/mol. Es ist ebenfalls interessant, dass die Freie Enthalpie des Gesamtzyklus beiEAAT4 signifikant grösser ist als bei EAAT3, was in Übereinstimmung mit der höheren, apparenten Glutamataffinität ist [GEAAT4 = (35 ± 1)kJ/mol vs. .GEAAT3 = (30 ±1)kJ/mol]. Die Temperaturabhängigkeit der vorstationären Kinetik von EAAT3 enthüllt gleichfalls neue Ergebnisse. Zum einen ist die Bindung des Na+ Ions and den unbeladenen Transporter mit einer Konformationsänderung begleitet. Im Gegensatz dazu hat die Reaktion, die der Glutamatbindung zugeordnet wurde, nur eine moderate Aktivierungsenthalpie [H‡ = (39 ± 23 )kJ/mol], wie für eine diffusionskontrollierte Reaktion erwartet wird. Die nachfolgenden zwei langsameren Phasen des Transportstroms, die in der Literatur der Aktivierung der Anionenleitfähigkeit und der Glutamattranslokation zugeordnet wurden, sind mit hohen Aktivierungsenthalpien verbunden [H‡ = (121 ± 12)kJ/mol bzw. (94 ± 4)kJ/mol]. Dies bedeutet zum einen, dass zur Öffnung des Anionenkanals und der Translokation von Glutamat eine grössere Umstrukturierung des Transporters notwendig ist. Durch die hier gefundenen, neuen Daten für die Translokationsgeschwindigkeit bei physiologischen Temperaturen kann die Hypothese in Frage gestellt werden, die besagt, dass Glutamattransporter nicht schnell genug seien, um zur schnellen Entfernung des Glutamats nach der synaptischen Transmission beizutragen. Es scheint vielmehr so, dass bei physiologischen Temperaturen und Membranpotentialen, die Translokation von Glutamat hinreichend schnell verläuft.
In der vorliegenden Arbeit wurden Sekundärmetabolite aus marinen Wirbellosen der Nordsee, arktischen und antarktischen Gewässern untersucht. Ausgehend von Untersuchungen zur marinen chemischen Ökologie von Haliclona viscosa und physiologischen Effekten auf die Kieme der Krabbe Carcinus maenas wurden verschiedene Alkaloide und Cholesterole isoliert (siehe Abbildung 25). Vier unbekannte Alkaloide konnten erstmalig aus Haliclona viscosa isoliert werden. Sie leiten sich von 3-Alkylpyridin-Alkaloiden ab, die für Schwämme der Gattung Haliclona charakteristisch sind. Die Strukturaufklärung erfolgte durch den Einsatz von NMRSpektroskopie und Massenspektrometrie. Die symmetrischen bzw. pseudo-symmetrischen Eigenschaften erschwerten im besonderen Maße die Strukturaufklärung. Die Isolation von Haliclamin C und D sowie Viscosalin ermöglichte es, daß für sie ökologische Funktionen nachgewiesen werden konnten [33, 34], die dem Schwamm Haliclona viscosa in seinem Habitat Vorteile im Kampf um das Überleben bringen. Viscosamin ist das erste natürlich vorkommende zyklische Trimer eines 3-Alkylpyridin-Alkaloids, daß aus einer marinen Umgebung stammt. Es schließt eine Lücke zwischen monomeren, dimeren und polymeren 3-Alkylpyridin-Alkaloiden. Aus dem bisher noch nicht chemisch untersuchten Borstenwurm Laetmonice producta, konnte Homarin isoliert werden [81-84]. Homarin zeigte einen bisher unbekannten physiologischen Effekt auf die Kieme eines potentiellen Räubers [35]. Ob Homarin aufgrund seiner physiologischen Wirkung den Borstenwurm vor z.B. räuberischen Krebstieren schützen kann, muß noch mit weiteren Versuchen geklärt werden. Enthält 3 Art. aus versch. Zeitschr.: 1 Christian A. Volk and Matthias Köck: Viscosamine: The First Naturally Occuring Trimeric 3-Alkyl Pyridinium Alkaloid ; 2 Christian A. Volk, Heike Lippert, Ellen Lichte, and Matthias Köck: Two New Haliclamines from the Arctic Sponge Haliclona viscosa, European Journal of Organic Chemistry 2004, im Druck ; 3 Christian A. Volk and Matthias Köck: Viscosaline: New 3-Alkyl Pyridinium Alkaloid from the Artic Sponge Haliclona viscosa, Organic & Biomolecular Chemistry 2004, im Druck
Die Cytochrom c Oxidase von Paracoccus denitrificans katalysiert die Reduktion von Sauerstoff zu Wasser und „pumpt“ zusätzlich vier Protonen von der cytoplasmatischen Seite auf die periplasmatische Seite der Cytoplasmamembran. Die Spaltung des molekularen Sauerstoffes im binuklearen Zentrum erfolgt im katalytischen Zyklus des Enzyms bei der Umwandlung des Intermediates A, in welchem molekularer Sauerstoff an das Häm a3 Eisen gebunden ist, in das Intermediat PM durch spontane elektronische Umorganisation. Drei der dazu benötigten vier Elektronen werden von den Metallzentren geliefert. Das vierte Elektron wird sehr wahrscheinlich von einer Aminosäure in der Nähe des binuklearen Zentrums durch Bildung eines Aminosäureradikals beigesteuert. Dieses Radikal sollte in den Intermediaten PM und F• des katalytischen Zyklus der Cytochrom c Oxidase vorhanden sein. Durch Reaktion von stöchiometrischen Mengen an Wasserstoffperoxid mit dem vollständig oxidierten Enzym lassen sich PM; F• und F-Intermediate künstlich erzeugen und durch ihre Maxima in Absorptionsdifferenzspektren charakterisieren. Mit paramagnetischer Elektronenresonanzspektroskopie (EPR-Spektroskopie) können Struktur und Dynamik paramagnetischer Zentren in Proteinmolekülen untersucht werden. Mit dieser Methode konnte in mit Wasserstoffperoxid generierten PM und F•-Intermediaten ein Tyrosinradikal nachgewiesen werden. Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Identifikation dieses Tyrosins mittels einer Mutagenesestudie. Dazu wurden Tyrosinvarianten (Y35F, Y167F, Y267F, Y280H, Y328F und Y414F) aus Untereinheit I, die einen maximalen Abstand von 25 Angström vom binuklearen Zentrum aufweisen, mit Hilfe von Absorptions- und EPR-Spektroskopie charakterisiert. Auf diese Weise konnte nachgewiesen werden, dass Tyrosin 167 eindeutig der Ursprungsort des Tyrosinradikals ist, das bei der Generierung von PM- und F•-Intermediaten der Cytochrom c Oxidase mit Wasserstoffperoxid entsteht. Da die Variante Y167F jedoch eine hohe katalytische Aktivität aufwies und in der Lage war, die Oxoferrylintermediate PM; F• und F zu bilden, konnte gleichzeitig gezeigt werden, dass dieses Tyrosin nicht der primäre Donor des vierten Elektrons sein kann, das im katalytischen Zyklus des Enzyms für die Spaltung der Sauerstoffbindung benötigt wird. Diese Ergebnisse wurden dahingehend interpretiert, dass Tyrosin 167 eine thermodynamische Senke darstellt, in die das von einem unbekannten kurzlebigen Elektronendonor bei der Wasserstoffperoxidreaktion gebildete Radikal verschoben wird. Als Donor des vierten Elektrons für die Sauerstoffspaltung kommt auch Tryptophan 272 infrage. Daher wurde auch die Variante W272M spektroskopisch charakterisiert. Diese Variante war katalytisch inaktiv und nicht in der Lage in Reaktion mit Wasserstoffperoxid die Intermediate PM, F• und F zu bilden. Es ließen sich weder das Tyrosin-167-Radikal noch ein anderes Radikal nachweisen. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass Tryptophan 272 möglicherweise der ursprüngliche Donor des vierten Elektrons für die Sauerstoffspaltung im katalytischen Zyklus der Cytochrom c Oxidase sein könnte. Während des PM zu F-Übergangs im katalytischen Zyklus der Cytochrom c Oxidase werden zwei Protonen gepumpt. Diese können vom Enzym entweder über den D-Weg oder den K-Weg aufgenommen werden. Eine Untersuchung des PM zu F-Übergangs von D-Weg- und K-Weg-Varianten der Cytochrom c Oxidase kann Aufschluss über die Beteiligung der beiden Protonenaufnahmewege des Enzyms an diesem Schritt des katalytischen Zyklus geben. Daher wurde die Reaktion der D-Weg Varianten D124N, N131D, Y35F und E278Q und der K-Weg Variante K354M mit Wasserstoffperoxid absorptionsspektroskopisch untersucht. Durch diese Experimente konnte die zentrale Bedeutung des D-Weges für die Protonentranslokation im PM zu F-Übergangs bestätigt, aber auch ein gewisser Einfluss des K-Weges nicht ausgeschlossen werden. Außerdem wurde der PM zu F-Übergang der Variante R437N, die eventuell Teil des noch nicht konkret identifizierten Protonenaustrittsweg der Cytochrom c Oxidase ist, untersucht.
Für das Verständnis der Proteinfaltung ist es von Interesse, die phi,psi-Torsionswinkelverteilung und deren Abhängigkeiten innerhalb einer Polypeptidkette zu kennen. Mit der in dieser Arbeit verwendeten Kombination aus MD-Simulation und NMR-Spektroskopie wird die Abhängigkeit der Konformationsverteilung kurzer alaninbasierter Modellpeptide mit einer Genauigkeit von 5 % bestimmt. Die Berechnung der thermischen Populationen der einzelnen Konformationen beruht auf einer Minimierung der Differenz aus experimentellen und berechneten skalaren Kopplungskonstanten. Trialanin populiert überwiegend den Bereich der Polyprolin Typ II Helix (~ 90 %) und daneben den beta-Faltblattbereich mit ca. 10%, jedoch nicht den alphaR-helicalen Bereich. Diese Konformationsverteilung ändert sich nicht signifikant mit zunehmender Kettenlänge in der Peptidreihe Ala3 bis Ala7. Das in der Seitenkette verzweigte Trivalin populiert dagegen alle drei Konformationsbereiche signifikant. Aufgrund der Periodizität der Torsionswinkel populiert Triglycin einen zusammenhängenden Bereich, der sich an den vier Ecken des Ramachandran-Diagramms befindet. Zudem befindet es sich in einem langsamen konformationellen Gleichgewicht zwischen der cis- und trans-Konformation der Peptidbindung. Die Temperaturabhängigkeit der Konformationsverteilung wird am Beispiel von Trialanin untersucht. Die 3J(HN,Ha) Kopplungskonstanten nehmen linear mit der Temperatur zu. Dies ist auf eine Zunahme des beta-Faltblattanteils zurückzuführen und kann theoretisch beschrieben werden. Die Konformationsverteilung der Trialaninsequenz innerhalb einer heteropolymeren Aminosäuresequenz ist von der Kettenlänge der an dem N- und C-Terminus angefügten heteropolymeren Aminosäuresequenz abhängig. Dies wird an zwei Peptiden, abgeleitet von der Sequenz des Proteins Lysozym aus Hühnereiweiß, gezeigt. Das kürzere Peptid hat an beiden Enden jeweils drei Aminosäurereste angefügt, das längere jeweils acht Aminosäurereste. Die Konformationsverteilung der Trialanisequenz des kürzeren Peptids entspricht nahezu der in der Peptidreihe Ala3 bis Ala7. Die Verteilung des längeren Peptids ist dagegen deutlich verschieden (~ 35% alphaR-helicaler Anteil). Die 1HN und 15N chemischen Verschiebungen der Trialaninsequenz des längeren Peptids sind mit denen des entfalteten Lysozym-Proteins identisch und demzufolge aller wahrscheinlichkeit nach auch die Konformationsverteilung. Kurze homopolymere Peptide eignen sich deshalb nicht als Modell für Aminosäuresequenzen in längeren heteropolymeren Peptiden.
Die Na,K-Pumpe ist ein integrales Membranenzym und gehört zur Gattung der P-Typ-ATPasen. Das Enzym setzt bei der Hydrolyse von ATP die resultierende freie Energie in aktiven Transport zur Errichtung eines Na+/K+-Konzentrationsgradienten über der jeweiligen Plasmamembran um. Diese Funktion wird mit einer strukturellen Alternierung zwischen zwei Hauptkonformationen E1 und E2 des Enzyms in Verbindung gebracht. In der vorliegenden Arbeit erfolgte eine Charakterisierung von Sekundärstruktur- und Proteinmikroumgebungsänderungen bei Teilreaktionen der Na,K-ATPase mittels reaktionsinduzierter und zeitaufgelöster FTIR-Differenzspektroskopie. Die hier verwendete IR-Durchlichttechnik setzt voraus, daß das zu untersuchende Enzym in hochreiner, hochkonzentrierter (1 mM) und aktiver Form in einen Proteinfilm in Gegenwart eines geschützten, photolytisch spaltbaren ATP-Derivats (caged ATP) überführt werden kann. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal eine umfassende IR-spektroskopische Beschreibung von einzelnen Teilreaktionen innerhalb des E1/E2-Reaktionsmodells der Na,K-ATPase durchgeführt. Die Untersuchung des Enzyms in Form eines Proteinfilms mit einer Schichtdicke von etwa 5 µm ist aufgrund der hohen Hintergrundabsorption des Wassers und der geringen Extinktionskoeffizienten der Proteinschwingungsmoden erforderlich. Der überwiegende Teil der Messungen wurde mit (1-(2-nitrophenyl)ethyl)-caged ATP und Schweinenierenenzym bei 5° und 15°C durchgeführt. Nach Abspaltung der Schutzgruppe mittels eines UV-Blitzes und somit der Freisetzung von ATP wurden zeitabhängig (Millisekunden bis Sekunden) die Differenzspektren verschiedener Teilreaktionen im Bereich von 2000 bis 950 cm-1 ermittelt. Der große Vorteil dieser Technik besteht in der Möglichkeit der Registrierung von Zustandsänderungen einzelner Aminosäuren des Proteins, in Bezug auf die Sekundärstruktur, Phosphorylierung, Protonierung und Kationenkoordination. Besonders gut können Änderungen an den Seitenketten der Aminosäuren Aspartat und Glutamat detektiert werden. Die enzymatische ATP-Hydrolyseaktivität der Na,K-ATPase wurde in den Proteinfilmen IR-spektroskopisch anhand der V as (PO2-) bei 1246 cm-1 bestimmt. Die Messungen der spezifischen Aktivität von Schweinenierenenzym ergab bei 15°C einen Wert von 34 nmol Pi mg-1 min-1. Vergleichsmessungen, die mit einem Standardaktivitätstest in Annäherung an die Protein-filmbedingungen durchgeführt wurden, ergaben Ergebnisse von der gleichen Größenordnung. In Abhängigkeit von der Zusammensetzung des kationischen Mediums konnten nach der photochemischen Freisetzung von ATP IR-Differenzspektren von drei verschiedenen Teilreaktionen untersucht werden: (1) ATP-Bindung, (2) Bildung des Phosphoenzyms E1P, (3) Bildung des Phosphoenzyms E2P. Des weiteren wurden Differenzspektren der AMPPNP-Bindung, der ADP-Bindung und der Ammoniumbindung, die mit der K+-Bindung vergleichbar ist, ermittelt. Alle Teilreaktionen führten zu unterschiedlichen Differenzspektren, die charakteristisch für die jeweiligen Zustandsänderungen sind. Durch geeignete Differenzbildung konnten ebenfalls die Differenzspektren der Phosphorylierung (EATP -> E1P) und der Phosphoenzym-Konversion (E1P -> E2P) berechnet werden. Sekundärstrukturänderungen können bei der IR-Spektroskopie innerhalb des Amid I-Bereichs zwischen 1700 und 1610 cm-1 detektiert werden. Die Ergebnisse der IR-Differenzspektroskopie zeigen, daß die Sekundärstruktur der Na,K-ATPase bei allen untersuchten Teilreak-tionen weitgehend konserviert bleibt. Unter den ermittelten Differenzspektren der Teilreaktionen resultiert die größte Netto-Sekundärstrukturänderung in einer Größenordnung von etwa 0,2 % (~3 Aminosäuren/Protomer) bei der E2P-Bildung. Als Folge der Bindung von ATP und ADP an das Enzym gibt es Evidenzen für die Beteiligung von Arginin. Die Bindung von AMPPNP an die Na,K-ATPase hingegen zeichnet sich klar durch andere molekulare Wechselwirkungen unter Beteiligung von Asp und/oder Glu aus. Die Phosphorylierung der Na,K-ATPase in Gegenwart von 1,2 M Na+ (E1P-Bildung) kann anhand von zwei Signalen der V (C=O) bei 1739 und 1709 cm-1, wobei eines der phosphorylierten Seitenkette Asp 369 zugeordnet wird, detektiert werden. Das zweite Signal wird der Protonierung eines Seitenkettenrestes Asp oder Glu zugerechnet, welches in Verbindung mit der Na+-Okklusion bei der E1P-Bildung stehen dürfte. Weitere Signale, die in Zusammenhang mit den molekularen Vorgängen bei der Phosphorylierung und Na+-Koordination stehen, können in der spektralen Region um 1550 cm-1 (V as(COO-)) und 1400 cm-1 (V s(COO-)) detektiert werden. Das Differenzspektrum der Phosphorylierung der Na,K-ATPase in Gegenwart von 130 mM Na+ (E2P-Bildung) enthält keine Beiträge der Kationenokklusion oder -deokklusion. Dennoch enthält das Differenzspektrum der E2P-Bildung die Information über die Transformation der Kationenbindungsstellen von E1 -> E2. Während E1 den Na+-affinen Zustand darstellt, repräsentiert E2 den K+-affinen Zustand der Na,K-ATPase. Das Signalprofil der Differenzspektren der E2P-Bildung unterscheidet sich stark von dem der E1P-Bildung. Neben der Phosphorylierung an Asp 369, die auch hier oberhalb von 1700 cm-1 anhand eines V (C=O)-Signals detektiert wird, können weitere positive und negative Signale sowohl oberhalb von 1700 cm-1 als auch im Bereich um 1550 cm-1 (V as(COO-)) und 1400 cm-1 (V s(COO-)) nachgewiesen werden. Bei der Transformation der Kationenbindungsstellen von E1 -> E2 können somit starke Änderungen an den Seitenketten von Asp und/oder Glu detektiert werden, die auf eine Neuorganisation der Kationenbindungsstellen der Na,K-ATPase schließen lassen. An dieser Neuorganisation sind sowohl Ände-rungen des Protonierungszustandes als auch Änderungen in der Koordinationssphäre der kationenkoordinierenden Gruppen Asp und/oder Glu beteiligt. Da von der Na,K-ATPase keine hochauflösenden Kristallstrukturen existieren, wurden die Kristallstrukturen der Ca-ATPase des sarkoplasmatischen Retikulums, ebenfalls eine P-Typ-ATPase, zur Erläuterung des Mechanismus der Kationenbindung herangezogen (Toyoshima et al., 2004b). Zur Ca-ATPase existieren bereits analoge IR-Differenzuntersuchungen. Dies bot die Möglich-keit des direkten Vergleichs gleicher Teilreaktionen innerhalb des gemeinsamen E1/E2-Reaktionsmodells. Dieser Vergleich zeigt, daß die Sekundärstrukturen beider Enzyme bei den jeweiligen Teilreaktionen weitgehend konserviert bleiben. Bei der Ca-ATPase können die größten Netto-Sekundärstrukturänderungen von etwa 0,3 % des Enzyms (~3 Aminosäuren/Enzym) als Folge der ATP-Bindung beobachtet werden (Barth et al., 1996). Bei dieser Teilreaktion werden bei der Na,K-ATPase die kleinsten Sekundärstrukturänderungen detektiert. Beim Vergleich der Signalprofile beider Enzyme weist der sekundärstrukturrelevante Amid I-Bereich bei der Phosphoenzym-Konversion auf konträre Strukturrelaxationen hin. Die Differenzspektren der Ca-ATPase im Vergleich zur Na,K-ATPase deuten auf eine sich unterscheidende Kationenkoordination hin. Durch eine Kombination der Resultate von IR-Differenz- und Fluoreszenzspektroskopie der FITC-Na,K-ATPase zur Charakterisierung von Enzymzuständen, konnte ein Modell zum Mechanismus der Inhibierung der Na,K-ATPase durch das Herzglucosid Ouabain postuliert werden. Durch Fluoreszenzmessungen an der FITC-Na,K-ATPase konnte gezeigt werden, daß Ouabain in Gegenwart von 20 mM Na+ an das Enzym bindet, was bei 130 mM Na+ nicht mehr der Fall ist. Aufgrund von IR-Differenzsignalen der E2P-Bildung, aufgenommen bei 20 mM Na+, ist es möglich, oberhalb von 1700 cm-1 (ν(C=O)), bei 1554 cm-1 (V as(COO-)) und bei 1408 cm-1 (V s(COO-)) zwischen der an Asp 369 phosphorylierten und unphosphorylierten Na,K-ATPase zu unterscheiden. Nach Ouabain-Zugabe hingegen konnten diese Signale nicht mehr detektiert werden. Bezüglich der Inaktivierung des Enzyms im Standardaktivitätstest, für dessen Ablauf Na+-Konzentrationen von um die 130 mM eingesetzt werden, kann gefolgert werden, daß Ouabain nicht an das freie, sondern an das phosphorylierte Enzym bindet und somit die Inaktivierung der Na,K-ATPase nach sich zieht.
Während der letzten Jahrzehnte hat sich die Totalreflexions-Röntgenfluoreszenzanalyse (TXRF) als eine tragende Methode in der Elementanalytik etabliert. Sie ist eine universelle, auf vielen Gebieten einsetzbare, ökonomische Multielementmethode zur Mikro- und Spurenanalyse. Die Vorteile der TXRF mit ihrer hohenEmpfindlichkeit kombiniert mit einer einfachen Quantifizierung und einem geringen Probenverbrauch prädestinieren sie für Elementbestimmungen in verschiedenen biologischen Matrices - besonders auf dem Gebiet der Protein- und Enzymanalytik. Das Potential der TXRF für die Bestimmung von Übergangsmetallen in diesenMatrices wurde schon in der Literatur beschrieben. Eine bedeutende Rolle kommt hier auch der Analyse leichter Elemente zu, insbesondere der des Schwefels. Als Bestandteil der beiden Aminosäuren Cystein und Methionin erlaubt die quantitative Bestimmung des Schwefelgehaltes eine zur Metall-Cofaktoren-Bestimmung einfache und simultane Bestimmung der Enzym- oder Proteinkonzentration. Die Evaluation dieses Verfahrens mit seinen Möglichkeiten und Grenzen für die TXRF, sowie die Weiterentwicklung von Anwendungsgebieten auf diesem Gebiet waren die vorrangigen Ziele dieser Arbeit. Zuvor erfolgte eine Überprüfung der für die quantitative Auswertung notwendigen und wichtigen relativen Empfindlichkeitsfaktoren (Kalibrierfaktoren). Für die beiden untersuchten leichteren Elemente Schwefel und Phosphor ließen sich im Gegensatz zu den höheren Elementen Abweichungen von > ± 10 % zu den in der Spektrometer-Software bereits vorinstallierten Faktoren feststellen. Die Betrachtung der Matrix- und Konzentrationsabhängigkeit des relativen Empfindlichkeitsfaktors von Schwefel zeigte eine starke Matrixabhängigkeit des Faktors bei höheren Konzentrationen. Hier spielen vorrangig Absorptionseffekte der induzierten Fluoreszenzstrahlung des Schwefels in den unterschiedlich massiven Rückständen der untersuchten Verbindungen Al2(SO4)3, MgSO4 und Na2SO4 eine entscheidende Rolle. Im Zuge der Probenvorbereitung für die Analyse der Protein- und Enzymproben erwies sich die Trocknung an Luft bei Raumtemperatur als eine gut geeignete Methode im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren (Trocknung unter Wärmezufuhr). Bei letzterem Verfahren besteht die Gefahr möglicher Elementverluste von flüchtigen Verbindungen z. B. beim Vorhandensein sulfidischer Bestandteile. Der Einfluss der Matrixbestandteile (Puffer/bio-organische Matrix der Enzyme selbst) und ihre systematischen Zusammenhänge auf die ausgebildeten Trocknungsrückstände zeigten sich deutlich in den zur Evaluation der Schwefelbestimmung durchgeführten Konzentrationsreihen mit schwefelhaltigen anorganischen Standardlösungen. Bei den beiden untersuchten Enzymen Diisopropylfluorophosphatase (DFPase) undCytochrom c Oxidase wurden über die durchgeführten Konzentrationsbereiche sehr gute Wiederfindungen dokumentiert. Bei der Cytochrom c Oxidase trägt vor allem der im Vergleich zur DFPase deutlich höhere Anteil an Pufferkomponenten zur Ausbildung massiverer Trocknungsrückstände (max. 5 μm Dicke) bei. Dennoch traten erst bei der NADH:Q Oxidoreduktase (Komplex I) deutliche, reproduzierbare Minderbefunde bei der Schwefelbestimmung im Verlauf der Konzentrationsreihe auf. Anhand der topologischen Untersuchungen ließen sich hier für die Minderbefunde Schichtdickeneinflüsse und eine damit verbundene Absorption der emittierten Fluoreszenzstrahlung verantwortlich machen. Der Einsatz von sogenannten Filmbildnern zur Minimierung der Schichtdicken von Trocknungsrückständen und der damit verbundenen besseren Elementwiederfindungen brachte dagegen keine deutlichen und reproduzierbaren Verbesserungen, insbesondere nicht für den Schwefel. Eine Erhöhung der Anregungseffizienz durch die Verwendung einer Cr-Kα-Strahlung zeigte in den untersuchten Proben (wässrige Matrix/Enzymmatrix: DFPase) keine deutlichen Vorteile in der Bestimmung des leichten Elementes. Die beiden, in herkömmlichen Spektrometern zur Verfügung stehenden, AnregungsmodenW-Lα und Mo-Kα, sind für die Anlayse von Enzymproben und einer vergleichenden Bestimmung der Enzymkonzentration gut geeignet. Dies zeigten auch Vergleiche mit den biochemisch bestimmten Protein- bzw. Enzymkonzentrationen. Kritische Schichtdicken im Rahmen von Schwefel-Bestimmungen wurden für die verwendeten Anregungsmoden auf etwa 20 μm (Mo-Kα), 3 μm (W-Lα) und rund 2 μm (Cr-Kα) kalkuliert. Eine Beeinträchtigung der Zuverlässigkeit der TXRF-Messungen für die höheren Elemente durch die Matrixbestandteile konnte nicht festgestellt werden. Somit wird in den meisten Fällen die einfache Probenpräparation auf hydrophoben oder hydrophilen (siliconisierten/unsiliconisierten) Probenträgern, ohne die Notwendigkeit eines Verfahrens zur vorherigen Matrixabtrennung, möglich sein. Jedoch muss bei allen künftig zu untersuchenden Protein- oder Enzymproben mit hohen Matrixanteilen mit dem Auftreten von Schichtdickeneffekten und damit verbundenen Absorptionseffekten von leichten Elementen (Schwefel, Phosphor) gerechnet werden. Die in der Arbeit vorgestellten, unterschiedlichen Projekte zeigen deutlich das Potential der TXRF als eine Standardmethode auf diesem Anwendungsgebiet.
Der erste Teil der Arbeit beschäftigt sich mit dem Vergleich der Charge Transfer induzierten Prozesse bei der Löschung von Triplett angeregten Sensibilisatoren durch Sauerstoff mit den Charge Transfer induzierten Prozessen bei der Löschung von Singulettsauerstoff durch die gleichen Sensibilisatoren im Grundzustand. Dazu wurden die Geschwindigkeitskonstanten für beide Prozesse in verschiedenen Lösungsmitteln unterschiedlicher Polarität sowie notwendige photophysikalische Parameter wie Triplettenergien und Triplettquantenausbeuten bestimmt. Für eine Reihe von Naphthalin- und Biphenylderivaten kann erstmals gezeigt werden, daß die Geschwindigkeitskonstanten für beide Charge Transfer Prozesse eindeutig durch eine gemeinsame Marcus Abhängigkeit von der Freien Enthalpie für die Bildung eines Ionenpaares beschrieben werden können. Weiterhin wird am Beispiel der Naphthalinderivate gezeigt, daß die Dipolmomente der Übergangszustände der Reaktion von aus Aromat und Sauerstoff gebildeten Encounter-Komplexen zu Charge Transfer-Komplexen bei beiden Prozessen den gleichen Wert besitzen. Diese Ergebnisse werden durch einen gemeinsamen Desaktivierungskanal erklärt: beide Prozesse verlaufen über angeregte Komplexe mit der gleichen supra-supra Struktur. Dabei ergibt sich ein konsistentes Bild. Es wird gezeigt, daß der Charge Transfer Charakter für beide Prozesse im Einklang mit den Erwartungen mit steigernder Lösungsmittelpolarität ansteigt und wesentlich größer ist als bisher in der Literatur vermutet. Die Reorganisationsenergie wird für beide Prozesse in einen lösungsmittelunabhängigen intramolekularen und einen lösungsmittelabhängigen Beitrag aufgeteilt. Dabei stellt sich heraus, daß die leicht höheren Werte für die Naphthalinderivate durch höhere intramolekulare Reorganisationsenergien verursacht werden. Dies wird durch eine größere Delokalisation der aromatischen Elektronen erklärt. Ganz anders verhalten sich Benzophenonderivate. Zwar ist die Abhängigkeit der Geschwindigkeitskonstanten der Charge Transfer induzierten Löschung von O2(1Δg) durch die Benzophenonderivate im Grundzustand nahezu identisch mit der Abhängigkeit der Naphthalin- und Biphenylderivate. Jedoch weichen die Geschwindigkeitskonstanten der Charge Transfer induzierten Desaktivierung der Triplettzustände der Benzophenonderivate durch O2 enorm von der für ππ* Sensibilisatoren gefundenen gemeinsamen Korrelation ab. Hauptsächlich im endergonischen Bereich liegen die Werte um mehrere Größenordnungen höher. Andererseits wird ein wesentlich geringerer Charge Transfer Beitrag zur Geschwindigkeitskonstante festgestellt. Relativ große intramolekulare Reorganisationsenergien zeigen, daß bei der Desaktivierung der Komplexe von Triplett angeregtem Benzophenon und Sauerstoff große Änderungen der Bindungslängen stattfinden. Dies führt zu einer Verschiebung der Potentialkurve des angeregten Komplexes, verglichen mit der des Grundzustandskomplexes, und somit zu großen Franck-Condon Faktoren und zu hohen Geschwindigkeitskonstanten für die Desaktivierung in die Grundzustände im Bereich hoher Triplettenergien. Es wird gezeigt, daß die räumliche Struktur der angeregten Komplexe aus Keton und Sauerstoff für dieses Verhalten verantwortlich ist. Diese Ergebnisse führen zu einem plausiblen Mechanismus, der die niedrigen Effizienzen der Bildung von Singulettsauerstoff bei der Löschung von nπ* angeregten Ketonen erstmals zwanglos erklärt. Im zweiten Teil der Arbeit wird die Abhängigkeit der Geschwindigkeitskonstanten der Bildung von O2(1Σg+), O2(1Δg) und O2(3Σg-) bei der Löschung von ππ* angeregten Triplettzuatänden durch Sauerstoff von der Freien Enthalpie ΔGCET für die Bildung eines Ionenpaares und von der Überschußenergie ΔE für die Bildung des jeweiligen Zustands von O2 untersucht. Zur Bestimmung dieser Geschwindigkeitskonstanten wird ein Aufbau zur zeitgleichen Detektion der O2(1Σg+ 􀂤 1Δg) Fluoreszenz, der O2(1Σg+ 􀂤 3Σg-) Phosphoreszenz und der O2(1Δg 􀂤 3Σg-) Phosphoreszenz erstellt. Mit diesem Aufbau wird eine Reihe von Sensibilisatoren mit sehr unterschiedlichen Oxidationspotentialen, Triplettenergien und Strukturen in Tetrachlorkohlenstoff untersucht. Es wird gezeigt, daß die Geschwindigkeitskonstanten kT 1Σ, kT 1Δ und kT 3Σ der Bildung von O2(1Σg+), O2(1Δg) und O2(3Σg-) zusammen mit den Werten für alle bisher mit der gleichen Methode untersuchten Sensibilisatoren durch eine gemeinsame Abhängigkeit von ΔGCET und ΔE beschrieben werden können. Dies bedeutet, daß kT 1Σ, kT 1Δ und kT 3Σ hauptsächlich durch die Triplettenergie und das Oxidationspotential des Sensibilisators bestimmt werden, und daß die Variation der molekularen Struktur nur eine untergeordnete Rolle spielt. Damit wird es zum ersten Mal möglich, die Geschwindigkeitskonstanten der Bildung von O2(1Σg+), O2(1Δg) und O2(3Σg-) bei der Löschung von ππ* Triplettzuständen durch Sauerstoff in Tetrachlorkohlenstoff für beliebige Sensibilisatoren mit hinreichender Genauigkeit vorauszusagen.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Struktur und die Dynamik von Oligosacchariden und DNAs untersucht. Bezogen auf Oligosaccharide wurde die Struktur von Raffinose und Saccharose mittels dipolarer Kopplungen präzisiert. Des weiteren wurde ein N–Glykan isoliert und chemisch modifiziert. An diesem N–Glykan wurde eine chemische Modifikation mit einer Tyrosin–Boc–Schutzgruppe durchgeführt, so dass das Glykan keine Mutarotation mehr zeigt, wodurch es möglich wurde, dipolare Kopplungen zu messen, die für Strukturrechnungen eingesetzt werden können; verschiedene Orientierungsmedien wurden ausprobiert. Des weiteren wurde das N–Glykan über einen Biphenyllinker an einen paramagnetischen Tag gekoppelt, wodurch ebenfalls eine Vorzugsorientierung im Magnetfeld erreicht wird. Bezogen auf die DNAs wurden vor allem Rhodamin–markierte DNA–Duplexe untersucht. Die verwendeten Farbstoffe sind Tetramethylrodamin und Rhodamin 6G. Die Modifikation befand sich stets am 5’–Ende. Hierbei wurde gefunden, dass der Farbstoff haupsächlich als quasi weiteres Basenpaar auf der DNA aufliegt. Für diesen gestackten Farbstoff wurden, abhängig von der Sequenz, entweder zwei oder vier mögliche Konformationen gefunden. Bei den Sequenzen, bei denen der Farbstoff nur in zwei Konformation vorliegt, wurden Strukturrechnungen durchgeführt. Zudem zeigte sich in den NMR–Spektren aller Sequenzen eine deutliche Dimerisierung, die temperatur-, farbstoff– und sequenzabhängig ist. Weiterhin wurde eine konzentrationsabhängige Dynamik gefunden. Die aus den NMR–Messungen erhaltenen Ergebnisse wurden mit Resultaten aus Fluoreszenzmessungen verglichen, wobei sich eine hervorragende Übereinstimmung zeigte. Des weiteren wurde die Struktur von DNA–Duplexen untersucht, die mit dem Fluoreszenzfarbstoff 9–Amino–6–chloro–2–methoxyacridin (ACMA) modifiziert worden sind. Hierbei handelt es sich nicht um eine endständige Modifikation, sondern um eine interne Modifikation. Auch hier wurden verschiedene Sequenzen untersucht. Bei allen Sequenzen interkalierte das ACMA. Mit einer Sequenz wurde eine Strukturrechnung durchgeführt. Als Gegenbase zum ACMA wurde in allen betrachteten Sequenzen ein Adenin gewählt. Strukturell wurde gefunden, dass die Gegenbase durch die Interkalation des ACMAs mit der DNA eine extrahelikale Position einnimmt. Es wurde auch versucht, dipolare Kopplungen zu messen. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Orientierungsmedien ausprobiert. Ebenfalls probiert wurde, dipolare Kopplungen durch das Autoalignment der DNA im Magnetfeld zu erhalten. Auch im Falle der mit ACMA markierten DNA wurden die NMR–spektroskopischen Ergebnisse mit den Ergebnissen aus Fluoreszenzmessungen verglichen, wobei sich ebenfalls eine gute Übereinstimmung zeigte. Ferner wurden NMR–spektroskopische Untersuchungen an mit nichtnatürlichen Nukleinsäuren modifizierten DNAs durchgeführt. Als nichtnatürliche Nukleinsäuren wurden Inosin, 2–Aminopurin, Deazaadenin, Deazaguanin sowie Bromoguanin verwendet. Die NMR–spektroskopischen Messungen wurden erfolgreich durchgeführt. Um die erhaltenen Daten abschließend interpretieren zu können, sind noch DFT–Rechnungen erforderlich, die im Rahmen einer anderen Dissertation durchgeführt werden.
Als Ergebnisse der vorliegenden Arbeit kann man folgendes festhalten: • Die zuverlässige Bestimmung der leichten Elemente Phosphor und Schwefel mit TXRF ist im Konzentrationsbereich 30 mg/l bis 0,1 mg/l (600 ng bis 2 ng) grundsätzlich möglich. • Die Bestimmung von Schwefel in Proben, die dazu tendieren dicke, dichte Probenrückstände zu bilden (z.B. Alkalimetallsulfate) erfordert eine spezielle Probenpräparation. Hier können durch den Einsatz von geeigneten Glättungsmitteln gute Ergebnisse erzielt werden. • Für die Detektion von Phosphor ist die Verwendung von Saphirprobenträgern notwendig, da die Lage der Absorptionskante von Silizium, als Hauptbestandteil der üblicherweise verwendeten Quarzglasprobenträger, diese negativ beeinflußt. • Für Schwefelkonzentrationen ≤ 0,5 mg/l (≤ 10 ng) sollte mit dem dünnen Filter (Filter 1) gemessen werden. • Die berechneten Erfassungsgrenzen liegen für Schwefel, je nach Zusammensetzung der Probe, bei 0,29 bis 0,76 ng. Für Phosphor erhält man in anorganischen Proben auf Saphirträgern 0,34 ng und bei biologischen Proben 0,70 ng. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen klar, daß die zuverlässige Bestimmung der Elemente Phosphor und Schwefel mit TXRF möglich ist. Die Möglichkeit diese leichten Elemente zu bestimmen, eröffnet der TXRF verschiedene neue Forschungsgebiete, wie beispielsweise Biologie und Biochemie. Durch den großen Vorteil der TXRF, der geringen Probenverbrauch kombiniert mit niedrigen Nachweisgrenzen, sind Screening von Proteinen, Enzymen oder auch von anderen Makromolekülen die Phosphor und Schwefel enthalten, möglich. Hier können Strukturfragen oder Mutagenese Schritte in Proteinen, Enzymen und Nucleinsäuren geklärt werden. Eine weitere Anwendung der TXRF ist die quantitative Proteinbestimmung. Die genaue Schwefelbestimmung macht es möglich ältere Methoden wie beispielsweise die Bestimmung nach Lowry zu ersetzen. Durch Kombination der TXRF mit weiteren analytischen Methoden (z.B. AAS) und oberflächenabbildenden Methoden (z.B. REM oder AFM) kann die Probenvorbereitung verbessert werden und somit die TXRF für weitere Gebiete der Elementanalytik in Zukunft als zuverlässige Standardmethode etabliert werden.
Identifizierung neuer Bindungspartner von Gephyrin, einem Strukturprotein inhibitorischer Synapsen
(2002)
Synapsen sind spezialisierte Zellkontakte, die der Kommunikation von Nervenzellen dienen. Für eine effiziente Signalübertragung ist es erforderlich, daß an diesem Prozeß beteiligte Proteine präzise und in hoher Dichte an der Synapse angereichert vorliegen. Die selektive Akkumulation von Glyzinrezeptoren sowie der verbreitetesten GABAARezeptoren an inhibitorischen Synapsen wird durch das periphere Membranprotein Gephyrin vermittelt. Gephyrin bindet direkt an die β-Untereinheit des Glyzinrezeptors und kann diesen vermittels seiner Affinität zu polymerisiertem Tubulin am Zytoskelett verankern. Um mehr über die Rolle dieses Proteins in der Entwicklung und Funktion von inhibitorischen Synapsen zu erfahren, sollten in der vorliegenden Arbeit neue Interaktionspartner von Gephyrin identifiziert werden. Hierzu wurde das Zwei-Hybrid-System in Saccharomyces cerevisiae zur Analyse einer cDNA-Bank aus dem Gehirn von Ratten verwendet. Dies resultierte in der Sequenzaufklärung von 24 potentiellen Gephyrin-bindenden Proteinen. Von diesen erwiesen sich vier in einem weiteren Bindungsexperiment als positiv und kommen daher als hochaffine Interaktionspartner in Frage. Es handelte sich um die eng verwandten Dynein light chains-1 und -2 (Dlc-1/-2), den Natrium-Kalzium-Austauscher NCX2 und ein Fragment eines bisher unbekannten Proteins, das nicht weiter untersucht wurde. Im Einklang mit einer möglichen Interaktion zwischen NCX2 und Gephyrin gelang es zu zeigen, daß NCX2 sowie das verwandte Protein NCX3 in neuronalen Primärkulturen an inhibitorischen Synapsen mit Gephyrin-Immunreaktivität kolokalisierten. Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag in der Untersuchung der Interaktion zwischen Gephyrin und Dlc-1/-2. Die Bindedomäne von Gephyrin für Dlc-1/-2 konnte auf den Bereich von Aminosäuren 181-243 eingegrenzt werden, und eine Gephyrinmutante ohne dieses Bindemotiv wies keine Affinität zu Dlc-1/-2 auf. Sowohl endogenes als auch rekombinant exprimiertes Dlc-Protein kolokalisierte mit aus der Überexpression in HEK-Zellen resultierenden zytosolischen Gephyrinaggregaten. Weiter gelang die Coimmunpräzipitation von Komplexen aus Gephyrin und Dlc-1/-2 aus transfizierten HEK-Zellen, und bakteriell exprimierte GST-Fusionsproteine von Dlc-1 bzw. Gephyrin reicherten den jeweils anderen Bindungspartner aus Hirnextrakt an. In neuronalen Primärkulturen waren Dlc-Proteine zu großen Anteilen zytoplasmatisch lokalisiert, darüberhinaus jedoch in Abhängigkeit von der Zelldichte an inhibitorischen Synapsen angereichert. Dlc-1/-2 sind Komponenten der Motorproteinkomplexe Dynein und Myosin-Va, in welchen sie möglicherweise als Adapter für zu transportierende Lasten dienen. Es ist daher denkbar, daß Gephyrin über Dlc-1/-2 mit einem aktiven Transportprozess verbunden wird. Zur Untersuchung dieser Frage wurden EGFP-epitopmarkierte Gephyrinproteine in hippokampalen Neuronen exprimiert und auf ihre subzelluläre Lokalisation untersucht. Sowohl EGFP-Gephyrin als auch die Deletionsmutante ohne Dlc-Bindemotiv waren zuverlässig an inhibitorischen Synapsen angereichert, ein Lokalisationsdefekt aufgrund fehlender Dlc-Bindung wurde nicht beobachtet. Dieses Ergebnis spricht gegen eine essentielle Rolle von Dlc-1/-2 und möglicherweise assoziierten Motorproteinen im Transport von Gephyrin zur Synapse. Aktiver Transport kann jedoch andere Funktionen im Zusammenhang mit der subzellulären Lokalisation von Gephyrin haben, wie etwa im retrograden Transport zum Zellkörper des Neurons. Diese Frage wird in weiteren Experimenten zu untersuchen sein.
Mit der fortschreitenden Verkleinerung von Prozessoren und Speicherbausteinen in der Mikroelektronik ist der Einsatz neuer Materialien oft unumgänglich. Zur Zeit steht Siliciumdioxid, das als Dielektrikum in Transistoren eingesetzt wird, im Blickfeld des Interesses. Die kleiner werdenden Strukturen führen hier zu dünneren SiO2-Schichten, was bei Schichtdicken unter 2 nm einen Anstieg der Tunnelströme im SiO2 zur Folge hat. Dies stellt für die Bauelemente ein erhöhtes (Kurzschluss-) Risiko dar. Seit geraumer Zeit finden spezielle Speicherzellen große Aufmerksamkeit, in denen Perowskite für die Gate-Oxidschichten zum Einsatz kommen. Sie sind charakterisiert durch hohe Dielektrizitätskonstanten (ε > 20, SiO2 ~ 4 ) oder weisen ferroelektrische Eigenschaften auf. Als interessante Kanditaten für das Dielektrikum gelten zur Zeit BST (Barium-Strontium-Titanat), SBT (Strontium-Bismut-Tantalat) oder PZT (Blei-Zirkonium-Titanat). Die Einführung neuer Materialien in die Chip-Technologie ist immer mit einem Risiko verbunden. Einer der Hauptfaktoren für die Ausbeutelimitierung bei der Produktion von Halbleiterbauelementen ist die Metallkontamination auf Silicium-Oberflächen. Aufgrund ihrer Eigenschaften können Metallverunreinigungen die elektrischen Eigenschaften von Halbleiterbauelementen schädigen. Bisherige Untersuchungen an oben genannten Schichten konzentrierten sich auf das elektrische und physikalische Verhalten. Wenig war bislang bekannt über das Kontaminationsverhalten und dadurch bedingte Auswirkungen/Risiken auf die Bauelemente. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Kontaminationsaspekte, insbesondere während Hochtemperaturprozessen, einiger Metalle auf Silicium (100)-Oberflächen näher untersucht. Das Hauptaugenmerk lag hierbei neben dem Adsorptions- und Desorptionsverhalten auf der Diffusion folgender Elemente: Barium, Strontium, Bismut, Iridium und Platin. Erkenntnisse über die Reaktivität der Metalle bei unterschiedlichen Reaktionsbedingungen sollten mögliche Risikofaktoren des Einsatzes neuer obiger Dielektrikum-Schichten aufzeigen. Die Ergebnisse für die untersuchten Elemente der II. Hauptgruppe, Barium und Strontium sprechen für ein träges Reaktionsverhalten während der Temperprozesse. Unter den vorliegenden Bedingungen wurden die Metalle im nativen oder thermischen Oxid eingelagert (gute Oxidbildner) und ließen sich mittels einer Oxid-Ätzung vollständig von der Si-Oberfläche entfernen. Unabhängig von der Atmosphäre (N2, O2) und der Si-Oberfläche (hydrophil, hydrophob) waren keine Quer-Kontaminationen durch Desorption zu beobachten. Angesichts der starken Tendenz zur Oxid-Bildung bzw. Einlagerung ließ sich keine nennenswerte Diffusion ins Si-Substrat erkennen. Ferner war ein Einfluss auf die Oxidationsrate und Oberflächenrauhigkeit nicht zu beobachten. Mit Blick auf den Einsatz in der CMOS-Technologie stellen Barium und Strontium, wegen ihres geringen Diffusionsvermögens, keine Gefahr für die Si-Substrateigenschaften dar. Sie können jedoch als Verunreinigungen Si-Oxid zu einer Anreicherung an zusätzlichen positiven Ladungen führen und sich negativ auf die Qualität des Oxids auswirken. Bismut präsentierte sich auf hydrophilen Si-Substraten insbesondere unter N2-Atmosphäre als sehr volatil. Dieses Verhalten, höchstwahrscheinlich flüchtiger Bi-Oxide, kann durch Gasphasentransport zu Quer-Kontaminationen benachbarter Si-Substrate führen. Unabhängig von der Temperatmosphäre lassen sich Quer-Kontaminationen ausschließlich auf oxidierten Si-Substraten beobachten, was auf die Notwendigkeit eines bereits vorhandenen dünnen Siliciumoxids als Voraussetzung für eine Quer-Kontamination hindeutet. Eine mögliche Erklärung wäre in der Bildung von weniger flüchtigen Bi-Silikaten zu finden. Die enormen Verluste an Bismut auf hydrophoben Oberflächen finden eine Begründung in dem hohen Abdampfverhalten des vermutlich reduktiv abgeschiedenen Bismuts auf dem Silicium Ähnlich wie Barium und Strontium bevorzugt Bismut den Verbleib im Oxid während Oxidationsprozessen (Bildung von Oxiden und mgl. Bi-Silikaten). Auch hier wiesen die Verunreinigungen keinen Einfluss auf das Oxidwachstum sowie dessen Oberflächenrauhigkeit auf und ließen sich mit einer Oxid-Ätzung von der Si-Oberfläche entfernen. Tiefenprofil- und ELYMAT-Untersuchungen ließen keine Diffusion und schädliche Einflüsse auf die Eigenschaften des Siliciums beobachten. Prozesstechnisch gesehen ist die Bildung möglicher Bi-Silikate unerwünscht, da sie wegen der unterschiedlichen Dichte des SiO2 zu Stress-Regionen auf dem Wafer führen können [21]. Weiterhin besteht gerade in der hohen Flüchtigkeit und Quer-Kontamination ein hohes Kontaminationsrisiko für die Prozess-Apparaturen, andere Wafer und somit der „Verschleppung“ in andere Technologien. Von einer anderen Seite zeigten sich die untersuchten Metalle der Platingruppe, Iridium und Platin. Verunreinigungen an Iridium diffundieren, unabhängig von den RTPBedingungen, ins Si-Substrat und führen zu einer eindeutigen Verringerung der Ladungsträgerlebensdauer („Liftime-Killer“ [45]). Hier zeigten in O2 behandelte Substrate niedrigere Eindringtiefen, was auf eine stärkere Desorption flüchtiger Oxidverbindungen und denkbaren Ir-O-Si-Verbindungen im SiO2 [174] zurückgeht. Parallel hierzu waren Quer-Kontaminationen zu beobachten die durch die Flüchtigkeit von IrO3 erklärt werden können. Ferner führen Verunreinigungen an Iridium zu einem geringeren Oxidwachstum. AFM-Untersuchungen unterstützen die Vermutung einer Ir-Silicidierung an der SiO2/Si-Grenzfläche unter N2-Atmosphäre und forcieren die Bildung von diffusionseinschränkenden Ir-Verbindungen unter O2. Das in der Halbleiter-Technologie bereits eingesetzte Platin ist ausreichend untersucht worden [45] und begleitete die Untersuchungen als Referenzelement. Aus der Literatur bereits bekannt, zeigt Platin ein ausgeprägtes Diffusionsvermögen in das Si-Substrat, unabhängig von dem Temperaturprozess. Dort wirkt es als Generations-/ Rekombinationszentrum und reduziert die Lebensdauer der Ladungsträger. Quer-Kontaminationen waren generell nicht zu beobachten, da unter den vorliegenden Versuchsbedingungen keine flüchtigen Pt-Verbindungen gebildet werden. Dem Iridium ähnlich zeigte Platin bei 1000°C unter O2 im Vergleich eine etwas niedrigere Oxiddicke, was ebenfalls in der Bildung einer Diffusionsbarriere bzw. Pt-O-Si-Bereichen [174] einen möglichen Interpretationsansatz findet. Hinsichtlich des Einsatzes in der Halbleitertechnologie stellen Iridium und Platin wegen ihrer Eigenschaften (hohe Mobilität sowohl im SiO2 und Si, Gasphasentransfer (Ir unter O2), Reduktion der Ladungsträgerlebensdauer) ein enormes Risiko- und Störpotential dar. Während bei Bismut ebenso die Gefahr der Quer-Kontamination besteht, sind die Metalle Barium und Strontium dagegen als weniger kritisch einzustufen.
In dieser Arbeit wurden zwei unterschiedliche Ansätze zur Korrektur/Eliminierung von Punktmutationen in Nukleinsäuren untersucht. Im ersten Ansatz wurden chimäre RNA/DNA-Hybride zur Korrektur von einer Punktmutation im p22phox-Gen ausgetestet, während im zweiten Ansatz ein „Hammerhead“-Ribozym zur Eliminierung von mutierter N-ras-RNA untersucht wurde.
Sauerstoff wird in vielen prokaryotischen und eukaryotischen Atmungsketten von der Cytochrom c Oxidase zu Wasser reduziert. Dieses Enzym besteht in Paracoccus denitrificans aus vier Untereinheiten, von denen aber nur die ersten zwei für die Funktion essentiell sind. Elektronen werden von einem membrangebundenen Cytochrom c552 zunächst auf das CuA-Zentrum der Untereinheit II der Oxidase übertragen und gelangen von dort zum low-spin Häm a der Untereinheit I. Am binukleären Zentrum, das aus dem high-spin Häm a3 und dem CuB-Atom besteht, erfolgt schließlich die Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasser. Hauptziel dieser Arbeit war es, die Bindungsstelle für Cytochrom c durch das gezielte Einführen oder Entfernen negativer Ladungen auf der Oxidase-Oberfläche zu bestimmen. Die Charakterisierung dieser Mutanten erfolgte hauptsächlich durch spektroskopische Analyse der kinetischen Parameter unter Umsatzbedingungen. Zusätzlich wurde der Teilschritt der Susbtratbindung durch die Aufnahme von Assoziationskinetiken untersucht. Als Substrat diente das reduzierte mitochondriale Cytochrom c oder ein lösliches Fragment des Paracoccus-Cytochrom c552. Die eingeführten Mutationen beeinflußten in unterschiedlicher Weise die Bindung der beiden verwendeten Substrate. Hierbei ist der negativ geladene Bereich der Oberfläche von Untereinheit II der Oxidase, der zur Bindung des Paracoccus-eigenen Substrats beiträgt, größer als der für die Wechselwirkung mit dem mitochondrialen Cytochrom c. Erstmals kann somit ein Modell für die Bindung des nativen Substrats an die Paracoccus-Oxidase aufgestellt werden. Die aa3-Oxidase aus Paracoccus zeigte keine Elektronentransfereaktion mit dem Cytochrom c552 aus Thermus thermophilus, da dessen Oberfläche nicht die hierfür erforderlichen Ladungen trägt. Durch Erhöhung der Hydrophobizität auf der Untereinheit II der Paracoccus-Oxidase wurde deren Oberfläche so verändert, dass sie nunmehr auch durch dieses „hydrophobe“ Cytochrom c reduziert werden konnte. Der Aminosäurerest W121 auf der Oberfläche der Untereinheit II wurde in der Vergangenheit als ein möglicher Elektroneneintrittsort in die Cytochrom c Oxidase beschrieben. Die in der vorliegenden Arbeit an dieser Position hergestellten Mutanten zeigten zwar drastische Einbußen in den maximalen Wechselzahlen, aber eine weitgehend unveränderte Affinität zum Cytochrom c. Die exakte Positionierung der Seitengruppe des Tryptophans spielt hierbei gegenüber der Aromatizität die entscheidende Rolle. An benachbarten Positionen eingeführte Mutationen ergaben keine Hinweise auf alternative Elektroneneintrittsorte. Durch ortsspezifische Mutagenese auf dem löslichen Cytochrom c552-Fragment wurden die Lysine auf der Oberfläche entfernt, um zu klären, ob die Wechselwirkung zwischen Cytochrom c und Oxidase auf Ladungspaaren beruht oder über das Gesamtpotential der Bindungsstellen bestimmt wird. Die Lysin-Mutanten zeigten alle im gleichen Maße eine reduzierte Affinität zur Oxidase. Die vorliegenden Ergebnisse lassen den Schluß zu, dass die Wechselwirkung zwischen Oxidase und Cytochrom c552 über das Gesamt-Oberflächenpotential vermittelt wird. Steady-state-Kinetiken unter Verwendung von Pferdeherz-Cytochrom c oder Paracoccus Cytochrom c552 weichen von den klassichen Michaelis-Menten-Verhalten ab, da zwei separate Phasen für die Kinetik beobachtet werden. Dieses Phänomen bisher wurde mit der Anwesenheit einer zweiten Bindungsstelle oder einer redoxgekoppelten Konformationsänderung der Oxidase erklärt. Durch Untersuchungen von Oxidase-Präparationen mit unterschiedlicher Untereinheiten-Zusammensetzung oder gebundenem Antikörper konnte gezeigt werden, dass die Biphasizität der Oxidase-Kinetik ! nicht auf der Anwesenheit der Untereinheiten III und IV beruht, ! durch die spezifische Bindung von Antikörpern zu niedrigeren Ionenstärken verschoben wird bei gleichzeitiger Verringerung der Affinität zum Substrat, ! eine intrinsische Eigenschaft aller untersuchten Mutanten ist. Im Rahmen dieser Untersuchungen konnten keine Hinweise auf eine zweite Cytochrom c Bindungsstelle gefunden werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Expression, Reinigung und Charakterisierung des homologe, membrangebundenen Cytochrom c552 aus P. denitrificans. Das Protein wurde mit einem Histidin-Tag versehen und heterolog in E. coli in guter Ausbeute exprimiert und gereinigt. Seine Charakterisierung über steady-state-Messungen ergab ein deutlich verschobenes pH-Optimum mit höherer Affinität zur Oxidase im Vergleich zu seinen verkürzten löslichen Fragmenten.
Das humane MLL-Gen (Mixed Lineage Leukemia) ist in chromosomale Translokationen mit mehr als 50 verschiedenen Partnergenen involviert. Alle diese Rearrangements sind mit akuter lymphatischer oder akuter myeloischer Leukämie assoziiert. Die reziproke Translokation t(4;11) ist ursächlich für die Entstehung einer akuten lymphatischen Leukämie, die gehäuft bei Kleinkindern auftritt. Die Prognose dieser aggressiven Leukämie ist sehr schlecht, da die leukämischen Blasten nahezu Therapie-resistent sind. Für einige MLL-Rearrangements konnte in Transduktions/Transplantations-Experimenten gezeigt werden, dass das MLL-Fusionsgen akute myeloische Leukämien in Mäusen induzieren kann. Aus diesem Grund steht immer noch das jeweilige MLL-Fusionsprotein im Mittelpunkt der Suche nach einem zugrunde liegenden Pathomechanismus. Die Versuche, ein Tiermodell mit dem MLL/AF4- Fusionsprodukt zu etablieren, blieben lange Zeit erfolglos. Erst Anfang dieses Jahres gelang es, durch eine knock-in Strategie, transgene Mäuse zu generieren, die das MLL/AF4 Translokationsprodukt tragen. Diese Mäuse entwickeln nach einer sehr langen Latenzzeit von bis zu 540 Tagen diffuse B-Zell-Lymphome. An der t(4;11) sind die Gene MLL auf Chromosom 11q23 und AF4 auf Chromosom 4q21 beteiligt. Die reziproke Translokation führt zur Entstehung von zwei Fusionsgenen (MLL/AF4 und AF4/MLL) mit intaktem Leserahmen. Wir nehmen an, dass beide Fusionsgene notwendig sind, um die Entartung der Zellen zu bewirken. Zum Einen ist der beschriebene Phänotyp der transgenen MLL/AF4 positiven Mäuse mit dem aggressiven Verlauf der t(4;11) Leukämie nicht vergleichbar, und zum Anderen findet man bei der Mehrzahl der Patienten mit einer t(4;11) beide Fusionstranskripte in den leukämischen Blasten. Um die Eigenschaften der Fusionsproteine AF4/MLL und MLL/AF4 zu untersuchen, wurden stabil transfizierte murine embryonale Fibroblasten-Linien etabliert, die entweder eines oder beide Fusionsgene regulierbar exprimierten. Mit Hilfe dieses in vitro Modells konnte man erstmals die Auswirkungen der gleichzeitigen Expression beider Fusionsgene auf das Verhalten der Zellen analysieren. Die Untersuchungen der Proliferation und der Apoptoseraten der verschiedenen transfizierten Zelllinien ergab, dass das AF4/MLL Fusionsprotein in den Zellen zu Wachstumstransformation führt, aber gleichzeitig die Zellen für den Zelltod durch bislang unbekannte Apoptosemechanismen sensitiviert. Das MLL/AF4 Translokationsprodukt war nicht in der Lage, eine Wachstumstransformation auszulösen. Vielmehr wurde deutlich, dass die Expression von MLL/AF4 die Proliferation der Zellen hemmt. Die Untersuchung der spezifischen Apoptoserate in den MLL/AF4 positiven Zellen ergab, dass die Zellen sowohl unter normalen Bedingungen als auch unter Stress-Konditionen Apoptose-resistent waren. Damit besitzen beide Fusionsproteine onkogene Eigenschaften. Da nur die mit AF4/MLL und MLL/AF4 transfizierten Zellen eine stark erhöhte Proliferation aufwiesen, im Wachstum transformiert waren und eine erhöhte Apoptoseresistenz zeigten, wurde deutlich, dass die Eigenschaften beider Fusionsproteine notwendig sind, um den vollständig transformierten Phänotyp auszulösen. Um die Veränderungen in den Zellen auf molekularer Ebene zu untersuchen, wurde mittels quantitativer PCR die Expression verschiedener Zellzyklus- und Apoptose-regulierender Gene untersucht. Dabei wurde deutlich, dass die Expression Zellzyklus- und Apoptose-regulierender Gene in allen drei Zellen verändert war. Genexpressionsprofil-Studien der Zellen ergaben schließlich, dass der Transkriptionsfaktor Nanog in den doppelt-transfizierten Zellen verstärkt exprimiert wurde. Nanog ist in die Aufrechterhaltung der Pluripotenz und des Selbsterneuerungspotenzials von embryonalen Stammzellen involviert. In dieser Arbeit konnte erstmals der Phänotyp einer Zelllinie beschrieben werden, die beide Fusionskonstrukte, AF4/MLL und MLL/AF4, stabil exprimierte. Dabei wurde deutlich, dass nur durch die Expression beider Fusionsgene ein Phänotyp erzeugt wird, der den Leukämoblasten sehr ähnlich ist. Die Expression von Nanog in diesen Zellen erklärt den Stammzell-Charakter der leukämischen Zellen.
Natrium/Protonen-Austauscher sind integrale Proteine biologischer Membranen und aufgrund ihrer funktionalen Abhängigkeit von einem elektrochemischen Gradienten der Klasse der Sekundärtransporter zugeordnet. Sie spielen eine essentielle Rolle sowohl in der Adaption von Bakterien an eine saline, alkalische Umgebung, als auch in der Regulation des intrazellulären pH- und Natriumhaushalts in Eukaryonten. Aufgrund der medizinischen Relevanz, unter anderem im Rahmen in der Behandlung des Herzinfarkts, besteht großes Interesse an der Struktur und den biochemischen Charakteristika des im Menschen ubiquitär vorkommenden Natrium/Protonen-Austauschers NHE1. Die heterologe und funktional aktive Produktion eukaryontischer Membranproteine stellt jedoch immer noch eine enorme Herausforderung dar, bei der sich das auf dem Semliki Forest Virus basierende Expressionssystem als gut geeignet erwiesen hat. Da die Überexpression von NHE1 mittels verschiedener eukaryontischer Expressionssysteme bisher kein kristallisationsfähiges Material liefern konnte, sollte in dieser Arbeit die heterologe Gewinnung von NHE1 mit dem Semliki Forest Virus Expressionssystem ermöglicht werden. Das Semliki Forest Virus Expressionssystem wurde auf Basis eines Vektorkonstrukts mit GFP zur späteren Übertragung der Parameter auf die Produktion von NHE1 etabliert. Konstrukte von NHE1 mit N- und C-terminalem Affinitäts-Tag wurden erfolgreich kloniert und zur Infektion von BHK-21 Zellkulturen eingesetzt. Dabei konnte beobachtet werden, dass der N-Terminus abgespalten wird und wahrscheinlich als Signalpeptid zum Einbau in die Membran dient. Das Protein wurde im Endoplasmatischen Retikulum lokalisiert, wo die Glykosylierung zum Transport in die Plasmamembran unterbleibt, was auf eine Interferenz mit der Virusinfektion zurückgeführt wurde. Eine Infektion der Zellen mit dem Semliki Forest Virus hat neben einem bereits bekannten massiven Anstieg des intrazellulären Natriumgehalts eine starke Alkalinisierung des Zytoplasma zur Folge. Ähnliches ist bisher über die Infektion von Zellen mit dem Poliovirus bekannt und stellt dort ein Schlüsselelement in der Sicherstellung der viralen Replikation dar, was auch für das Semliki Forest Virus zu gelten scheint. Die Expression von NHE1 konnte im 8 Liter-Maßstab optimiert und sowohl die Präparation als auch die Solubilisierung mit verschiedenen Detergenzien erfolgreich eingeführt werden. NHE1 erfährt jedoch bereits in vivo einen erheblichen proteolytischen Abbau, der sich während der Membranpräparation und Aufreinigung fortsetzt und zu einer Fragmentierung führt, die trotz des Einsatzes unterschiedlicher Kultivierungszeiten, Detergenzien, Additive oder Proteaseinhibitoren in vivo als auch in vitro nicht in einem Maße reduziert werden konnte, welches zur Gewinnung von kristallisationsfähigem Material erforderlich gewesen wäre. Es muss empfohlen werden einen in vivo Ansatz zu etablieren, um die proteolytische Degradation zu unterdrücken. Da die Virusreplikation nicht erforderlich ist, wäre Bafilomycin als Inhibitor der V-Typ ATPase geeignet, um die intrazelluläre Alkalinisierung und somit wahrscheinlich den Abbau von NHE1 zu verhindern. Ebenso erscheint der Einsatz von MG-132 zur spezifischen Inhibierung des Proteasoms Erfolg versprechend, was aber wegen hoher Kosten praktisch kaum in Frage kommt. Da man trotz individuell gelagerter Unterschiede zwischen den einzelnen Natrium/Protonen-Austauschern von einem ähnlichen Prinzip in Regulation und Transport ausgeht, wurden Strukturuntersuchungen mit Hilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie am bakteriellen Natrium/Protonen-Antiporter NhaA aus Escherichia coli durchgeführt, um die strukturelle Basis der pH-Wahrnehmung und die Translokation von Natrium in das Periplasma besser zu verstehen. Die vorliegende Röntgen- und EM-Struktur repräsentieren den inaktiven Zustand, weshalb der eigentliche Ablauf des Transportvorgangs bisher biochemisch herzuleiten war, da bislang keine Kristalle im aktiven Zustand gezüchtet werden konnten. Durch die in situ Inkubation von 2D-Kristallen konnten aktive Zustände des Proteins direkt auf dem EM-Netz induziert und kryo-elektronenmikroskopisch festgehalten werden. Einzelne Datensätzen wiesen Reflexe bis zu 5 Å auf. Aus den angefertigten Projektionsdichte- und Differenzkarten ergaben sich pH- und Natrium-abhängige Konformationsänderungen. Die Röntgenstruktur wurde mit Hilfe des Molekularen Ersatzes in die EM-Struktur eingepasst und diente der Zuordnung und Interpretation der beobachteten Zustände als Basis. Die pH-abhängige Konformationsänderung wurde einem mit der funktional wichtigen Helix 9 assoziierten Bereich zugeordnet, welcher durch die Röntgenstruktur nicht definiert ist und wahrscheinlich die fehlenden Aminosäuren des regulatorisch relevanten N-Terminus enthält. Die beobachtete Konformationsänderung stellt das Entstehen einer besser geordneten Struktur dar und geht mit der pH-regulierten Aktivierung von NhaA zwischen pH 6 und 7 einher, weshalb dieser Bereich des Proteins zumindest als Bestandteil des sogenannten pH-Sensors betrachtet werden kann. Nach der vollständigen Aktivierung durch den pH-Wert, welche der folgenden Natrium-abhängigen Konformationsänderung vorauslaufen muss, konnte beobachtet werden, dass die Präsenz von Natrium im Rahmen der Ionentranslokation eine Bewegung des periplasmatischen Teils von Helix 4 induziert. Es wäre interessant, eine tiefergehende und genauere Charakterisierung der beobachteten Konformationsänderungen durch die Erstellung einer dreidimensionalen EM-Dichtekarte zu ermöglichen. Des Weiteren hat die eingehendere Untersuchung des röntgenkristallographischen Monomers nach der Einpassung in das physiologisch vorliegende Dimer der EM-Struktur sowohl eine für Membranproteine neuartige „Joint β-Sheet“ Dimerisierungsdomäne im Periplasma, als auch eine Verzahnung von Helix 7 und 9 an der Monomer-Monomer-Grenze aufgezeigt. Diesen Charakteristika kommt wahrscheinlich eine tragende Rolle in der Dimerisierung von NhaA zu, was durch weitere Untersuchungen im Rahmen einer Mutagenesestudie unter Einbeziehung der periplasmatischen β-Haarnadelstrukturen überprüft werden sollte.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Wechselwirkung des AD-assoziierten Proteins PS1 mit dem Cytoskelett in verschiedenen biochemischen und immuncytochemischen Modellen zu untersuchen. Auf diese Weise sollten Hinweise für das Verständnis der bisher nur in Grundzügen bekannten physiologischen Funktion von PS1 erhalten werden. Ausgehend vom Nachweis der Anreicherung endoproteolytischer PSI-Fragmente in Cytoskelett-Fraktionen aus Hirngewebe wurde die spezifische Assoziation des Proteins mit Mikrofilamenten, Mikrotubuli und Neurofilamenten untersucht. Alle durchgeführten biochemischen und immuncytochemischen Experimente zeigen übereinstimmend die spezifische Assoziation von PS1 mit Mikrofilamenten. So konnten PSI-Fragmente über zwei Depolymerisations/ Polymerisations-Zyklen zusammen mit Actin aus Rattenhirn aufgereinigt werden. Die spezifische Spaltung von Actin-Filamenten durch Gelsolin in cytoskelettreichen Fraktionen aus Hirngewebe führte zur Freisetzung kürzerer Filamente, die nach Zentrifugation zusammen mit PS1- Fragmenten im Überstand erschienen. In immuncytochemischen Färbungen kolokalisierte PS1 mit Actin-Filamenten in primären Gliazellen und der neuronalen Zelinie NT2. Eine vor kurzem veröffentlichte Arbeit zeigte außerdem die Kolokalisation von PS1 und Mikrofdamenten in primären Hippocampus-Neuronen. Die fehlende Kosedimentation von in-vitro translatiertem PS1 und Deletionskonstrukten von PS1 mit aufgereinigten und in-vitro assemblierten Actin-Filamenten, das Fehlen konservierter Actin-Bindungsmotive in der Aminosäuresequenz von PS1 sowie bekannte Interaktionen von PS1 mit Actin-bindenden Vertretern der Filamin- und Armadillo-Proteinfamilien lassen auf eine indirekte Assoziation von PS1 mit Mikrofdamenten schließen. Die vorliegende Arbeit konnte die Frage, welche Rolle Mikrotuli oder Neurofilamente bei der Cytoskelett-Assoziation von PS1 spielen, nicht abschließend Mären. PS1-Fragemente wurden im ersten, nicht jedoch im zweiten Depolymerisations/Polymerisations-Zyklus zusammen mit Tubulin aus Rattenhirn aufgereinigt. In dem gleichen Versuchsansatz kosedimentierte in-vitro translatiertes PS1 nicht mit Mikrotubuli. Immuncytochemische Färbungen zeigten dagegen die Kolokalisation von PS1 mit Mikrotubuli in primären Hippocampus-Neuronen, die auch von zwei aktuellen Arbeiten in primären Hippocampus-Neuronen und murinen Embryonen bestätigt wurde. Die spezifische Depolymerisation von Mikrotubuli in cytoskelettreichen Fraktionen war unter den in der vorliegenden Arbeit verwendeten Bedingungen nicht erfolgreich, so daß aus diesem Experiment keine Aussagen zur Assoziation von PS1 mit Mikrotubuli abgeleitet werden konnten. Es Iäßt sich die Hypothese aufstellen, daß sehr kleine PSI-haltige Vesikel über andere Proteine als PS1 mit Mikrotubuli verbunden sind, so daß PS1 mit Mikrotubuli scheinbar kolokalisiert ist. Hochauflösenden lichtmikroskopische bzw. elektronenmikroskopische Aufnahmen oder biochemische Versuche, die nicht zur Zerstörung der Vesikel durch Detergens führen, könnten für die Überprüfung dieser Hypothese herangezogen werden. In-vitro translatiertes PS1 sowie Deletionskonstrukte von PS1 kosedimentierten nicht mit aufgereinigten und in-vitro assemblierten Neurofilamenten, und in primären Hippocampus-Neuronen kolokalisierte PS1 nicht mit Neurofilamenten. Es wäre jedoch wünschenswert, die Experimente mit geeigneten Positiv-Kontrollen für die Kosedimentation und geeigneteren Antikörpern, die bei einem besseren Signal/Hintergrund-Verhältnis eine stärkere Vergrößerung der Immunfluoreszenzen erlauben, zu wiederholen. Im transgenen Tiermodell beeinträchtigten pathogene Mutationen von PS1 nicht, zumindest nicht quantitativ, die Fähigkeit von PS1, an Cytoskelett-Elemente zu binden. Es wäre jedoch möglich, daß es Unterschiede in der Cytoskelett-Assoziation von wt PS1 und PS1 mit pathogenen Mutationen gibt, die nur im Gewebe von FAD-Patienten zu detektieren sind, nicht aber im transgenen Tiermodell, da die bisher bekannten AD-Tiermodelle nicht alle Aspekte der Erkrankung reproduzieren. Die vorliegenden Ergebnisse können die Basis bilden für weitergehende Untersuchungen zur Funktion von PS1 und der Bedeutung von PS1-Cytoskelettinteraktionen in der Alzheimer Demenz. Aktuelle Arbeiten fokussieren dabei stark auf die Interaktion von PS1 mit Mikrofilament-bindenden Vertretern der Armadillo-Proteinfamilie, die bei Zell-Zell-Adhäsionsprozessen eine wichtige Rolle spielen. Im Diskussionsteil wurde ausgeführt, daß aber, gerade im Hinblick auf die Neurodegeneration bei der Alzheimer Demenz, ein möglicher Einfluß von PS1 auf den schnellen axonalen Transport ein interessanter Ansatz für weitere Versuche sein kann.
An den Folgen von AIDS sind bisher fast 20 Millionen Menschen gestorben. Mit der Einführung der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) konnte erstmals die Viruslast bei gleichzeitiger Erhöhung der CD4-Lymphozytenzahl effizient erniedrigt werden. Dadurch konnte zwar eine Kontrolle der Virusreplikation und damit verbunden eine längere Überlebenszeit erreicht werden, jedoch ist eine vollständige Eradikation des Virus bisher nicht möglich. Hohe Behandlungskosten, Nebenwirkungen der antiviralen Substanzen, ihre unzureichende Wirkung in manchen Körperkompartimenten und die rasche Verbreitung resistenter Viren schränken die Effektivität von HAART ein. Alternative Therapieformen zielen in den letzten Jahren verstärkt auf die HIV-Eintrittshemmung durch Inhibition der Membranfusion von Virus und Wirtszelle („Fusionsinhibitoren“). Peptide, die sich aus der „heptad repeat“ Region 2, HR2, des gp41 ableiten (C-Peptide), sind äußerst wirksame antivirale Substanzen. 2003 wurde T-20, ein 36 Aminosäure langes C-Peptid, als erster Fusionsinhibitor zugelassen. Sein breiter Einsatz ist jedoch aufgrund rascher Resistenzbildung, mangelnder oraler Verfügbarkeit, einer äußerst kurzen Serumhalbwertszeit sowie daraus resultierender hoher Therapiekosten limitiert. Aufgrund dessen sollte in der vorliegenden Arbeit mit der Entwicklung von RNA-Aptameren als HIV-Fusionsinhibitoren ein neuer therapeutischer Ansatz etabliert werden. Zur Isolierung dieser RNA-Aptamere wurden zwei hoch komplexe RNA-Bibliotheken in manuellen sowie automatisierten Selektionen gegen verschiedene Zielstrukturen auf dem HIV-1 gp41 mit Hilfe der SELEX-Technologie selektiert. Der Wirkmechanismus der isolierten RNA-Aptamere sollte analog zu den gp41 HR-abgeleiteten Peptiden auf der Hemmung der Ausbildung des Sechs-Helix-Bündels als fusionaktive Struktur beruhen. So sollten die RNA-Aptamere die Ausbildung der zentralen N coiled-coil Struktur verhindern (Selektion gegen HR1-Peptide) oder die Anlagerung der HR-2 Domänen an die konservierten hydrophoben Furchen des zentralen N coiled-coils inhibieren (Selektion gegen HR2-Peptide). Die gewählten Zielstrukturen wurden entweder als freie synthetische Peptide oder membrangebunden auf der Oberfläche von humanen T-Zellen präsentiert. Um die Selektion von serumstabilen Aptameren zu gewährleisten, wurden die RNA-Aptamere unter Einsatz von 2’-F- oder 2’-NH2-modifizierten Pyrimidinen transkribiert. Nach initialen Selektionsrunden wurden die isolierten Aptamerfraktionen in einer „single-round infection“ unter Einsatz von HIV-Pseudotypvektoren auf spezifische Inhibition des Eintritts von HIV in die Zielzellen analysiert. Die isolierten RNA-Aptamere waren in der Lage, den HIV-Eintritt zu inhibieren, ihre Wirksamkeit war allerdings im Vergelich zu der naiven Bibliothek gering. Nach Durchführung von verschiedenen Reifungsstrategien, um die Affinität der vorselektieren RNA-Fraktionen zum jeweiligen Zielepitop zu erhöhen, konnte die inhibitorische Wirkung der gereiften RNA-Fraktionen auf das 10Fache im Vergleich zu der Urspungsbibliothek verbessert werden. Die wirksamste RNA-Fraktion, 435UU, wurde aus einer Selektion einer aminomodifizierten N30 RNA-Bibliothek gegen das membranverankerte Fusionsprotein M435, bestehend aus gp41 C46 und dem membranproximalen HIV-Linker, und anschließender Kompetiton mit dem 2F5 Antikörper gewonnen. Die 435UU RNA-Fraktion konnte den Eintritt von HIV mit einer IC50 ≈ 200 nM spezifisch hemmen. Weiterhin konnte die spezifische Fusionsinhibition der 435UU Aptamerfraktion in einem Zell-Zellfusionsassay unter Einsatz von HIV env exprimierenden Zellen und einer humanen T-Zelllinie demonstriert werden. Die Affinität der 435UU-Fraktion wurde in einem Gelmobilitätsversuch bestimmt. Die moderate HIV-Eintrittshemmung beruhte auf einer schwachen Bindung (Kd ≈ 750 nM) an das Zielepitop auf dem gp41. Die Analyse von Einzelaptameren aus der 435UU RNA-Population ergab keine signifikanten Unterschiede in ihrem HIV-Neutralisationspotential. Des Weiteren konnten nur wenig gemeinsame Primärstrukturmotive bestimmt werden. Der Gehalt an inkorporierten Pyrimidinen in den 435UU-Einzelaptameren war allerdings mit ca. 70% vergleichsweise hoch. Unter Einsatz von randomisierten RNA-Transkripte mit definiertem Pyrimidingehalt konnte festgestellt werden, dass tendenziell ein höherer Gehalt an NH2-Pyrimidinen die HIV-Neutralisation fördert. Allerdings konnte keine eindeutige Korrelation zwischen der Bindung an das C46-HIVLinker Fusionskonstrukt und dem Pyrimidingehalt der Transkripte ermittelt werden. Die Sekundärstukturvorhersage ergab keine strukturelle Verwandtschaft unter den 435UU-Einzelaptameren noch konnten klar definierte Sekundärstrukturmotive gefunden werden. Die Selektion der 435UU-Aptamerfraktion erfolgte deshalb nich allein aufgrund ihres hohen Pyrimidingehaltes. Ein direkter Vergleich der 435UU Aptamerfraktion mit dem bisher einzigen RNA-Eintrittsinhibitor, einem anti-gp120 RNA-Aptamer, ergab zwar eine geringfügig schwächere HIV-Inhibition, jedoch ein wesentlich breiteres Wirkspektrum der isolierten anti-gp41 RNA-Aptamere wahrscheinlich durch ihren hoch konservierten Wirkmechanismus. Schlussendlich könnte die Wahl der Präsentation der Zielstrukturen sowie der Selektionsdurchführung die Gewinnung von RNA-Aptameren mit moderater Affinität fördern und gleichzeitig zum Verlust von hoch affinen RNA-Strukturen führen. In nachfolgenden Selektionen sollte deshalb die Selektionsstringenz erhöht sowie gegen membrangebundene Zielstrukturen selektiert werden, die die tatsächliche native gp41 Konformation darstellen.
Apoptose ist für grundlegende Prozesse des Lebens wie die Embryonalentwicklung und die Infektabwehr unentbehrlich. Defekte im Apoptoseprozess haben ernste Erkrankungen wie z.B. Krebs zur Folge. Ein charakteristisches Kennzeichen von Krebszellen ist deren Apoptoseresistenz, die verhindert, dass Krebszellen auf natürlichem Wege vernichtet werden. Die Tumorzellen reagieren im allgemeine nicht mehr auf Zelltod-Signale, die z. B. bei Nähr- und Sauerstoffmangel oder einem Angriff durch Effektorzellen des Immnunsystems empfangen werden. Ein wesentlicher Grund dafür sind Mutationen im Signalweg der Apoptose. Häufig wird in Tumoren die Überaktivierung von antiapoptotischen Proteinen beobachtet. Die Aufklärung der Apoptose-Signalwege und die Charakterisierung der ihnen zu Grunde liegenden molekularen Interaktionsmechanismen sind wichtig für die Erklärung der Pathogenesse vieler Erkrankungen. Daher ist es von großem Interesse, neue anti-apoptotische Proteine zu identifizieren, die als Targets zur Entwicklung alternativer therapeutischer Strategien benutzt werden können. Ein wichtiger Bestandteil des Apoptoseweges ist das Mitochondrium. Ausgangspunkt für den mitochondrialen oder intrinsischen Apoptose-Signalübertragungsweg ist die Freisetzung von Cytochrom c (Cyt c) und anderen apoptogenen Faktoren aus dem Mitochondrien. Zytoplasmatisches Cytochrom c bindet zusammen mit ATP oder dATP an das Adaptorprotein Apaf-1 und induziert daraufhin eine Konformationsänderung sowie die Oligomerisation von Apaf-1. Die Selbstassoziation von Apaf-1 führt zur zusätzlichen Rekrutierung von Caspase-9, die in diesem des sogenannten Apoptosomskomplexes durch die Erhöhung ihrer lokalen Konzentration autokatalytisch aktiviert wird. Aktive Caspase-9 wiederum spaltet und aktiviert Effektorcaspasen wie Caspase-3, die zelluläre Targetproteine spalten und damit den Zelltod verursachen. Viele apoptotische Stimuli aktivieren den mitochondrialen Apoptoseweg. Defekte im intrinsischen Signalweg finden sich häufig im Tumoren und sind oft mit Resistenzen gegen apoptoseauslösende Krebstherapien assoziert. Anti-apoptotische Proteine, die mit dem apoptotischen Programm an dieser Stelle interferieren und in Tumoren überexprimiert werden, stellen attraktive Targets für Tumortherapien dar. In der Arbeitsgruppe von Dr. Martin Zörnig am Georg-Speyer-Haus wurde ein S. pombe Hefesystem etabliert, um in einem funktionellen „Survival-Screen“ neue anti-apoptotische Säugergene aus Tumor-cDNA-Banken zu identifizieren. Hefen können durch die Expression bestimmter pro-apoptotischer Säugerproteine abgetötet werden. Dieser Hefezelltod weist äusserliche Gemeinsamkeiten mit apoptotischen Zellen multizelluläre Organismen auf. Frühere Studien haben gezeigt, dass es möglich ist, mit Hilfe dieses Screens tatsächlich anti-apoptosische Säugerproteine zu identifizieren, die den induzierten Hefezelltod inhibieren können. In einem Screen, bei dem das Apaf-1 Homolog in C.elegans, CED-4, als Killerprotein verwendet wurde, konnte unter anderem das Gen Aven isoliert werden, das nicht nur CED-4-induzierten Zelltod in Hefe, sondern auch Apaf-1/Casp-9-vermittelte Apoptose in Säugerzellen inhibiert. Dabei wurde ein unvollständiges ΔAven-cDNA-Plasmid isoliert, dem das 5´-Ende fehlte. Diese Verkürzung ist vermutlich auf ein vorzeitiges Abbrechen der cDNA-Synthese durch die Reverse Transkriptase zurückzuführen. Die vollständige humane Aven cDNA wurde im Rahmen einer Kooperation von Prof. J. M. Hardwick (J. Hopkins University, Baltimore USA) bereitgestellt, zusammen mit zwei polyklonalen anti-Aven Antiseren. Die Antisera erkennen die N-terminalen Aminosäuren 98-112 (anti-Aven A) sowie am C-terminus aa 256-268 (anti-Aven B). In der AG Zörnig wurde ein zusätzliches Antiserum (anti-Aven C) gegen ein Peptid generiert, das die letzten 17 Aminosäuren des humanen und des Maus-Aven-Proteins erkennt. Aven wurde in der Gruppe von M. Hardwick als anti-apoptotisches Protein beschrieben, das an das anti-apoptotische Bcl-2 Familienmitglied Bcl-xL und Apaf-1 bindet (Chau et al., 2000). Aven wurde mit Hilfe eines „Hefe-2-Hybrid Screens“ mit Bcl-xL als Köder („bait“) isoliert. Es wurde publiziert, dass Aven die Apaf-1 Selbstassoziation (und damit Caspase-9-Aktivierung) verhindert. Das humane Aven Gen kodiert für insgesamt 362 Aminosäuren. Die Sequenz ist in zahlreichen Spezies hoch konserviert. Aven mRNA Expression wurde in vielen Geweben (Herz, Nieren, Pankreas, Testis und Skelet-Muskulatur) und in mehreren Zelllinien gefunden. Dies deutet auf eine ubiquitäre Expression hin. In der Zelle ist Aven hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert. Immunfluoreszenzanalysen der Arbeitsgruppe Hardwick zeigten zusätzlich eine schwache Expression des Proteins im Nukleus. In der Arbeitsgruppe Zörnig konnte gezeigt werden, dass die isolierte Deletionsmutante ΔAven (aa 180-362) CED-4-induzierten Zelltod in Hefen inhibiert (Doktorarbeit M.L. Brezniceanu, unpublizierte Daten). Eine anti-apoptotische Wirkung konnte für ΔAven zusätzlich im Säugersystem verifiziert werden. Durch Überexpressionsstudien eines ΔAven- GFP-Fusionskonstruktes wurde Apaf-1/Caspase-9-induzierte Apoptose in der humanen Kolonkarzinomzelllinie RKO inhibiert. Weitere Experimente zeigten, dass sich in Tumoren des Kolons, der Niere und der Schilddrüse erhöhte Aven mRNA-Mengen nachweisen lassen und dass Aven auf mRNA-Ebene während der Entwicklung der Brustdrüse reguliert wird (unpublizierte Daten). Im Rahmen dieser Arbeit wurde Aven biochemisch und genetisch näher charakterisiert. Dabei wurden sowohl das volle-Länge-Aven sowie die artifizielle ΔAven Deletionsmutante untersucht. Zunächst wurde ein Teil der publizierten Daten verifiziert. Beschrieben ist eine Bindung zwischen Aven und Bcl-xL, die durch die N-terminale Domäne von Aven (Aminosäure 74-108) vermittelt wird. ΔAven, das den N-Terminus nicht enthält, sollte daher nicht an Bcl-xL binden können. In einem Immunpräzipitations-Experiment mit dem anti-Aven B Antiserum wurde entsprechend einer Interaktion mit Bcl-xL nur für das volle-Länge-Aven-Protein, nicht aber für ΔAven nachgewiesen. Den Publizierten Daten zufolge bindet Aven mit den Aminosäuren 180 bis 300 an Apaf-1, und diese Interaktion konnte in einem weiteren Ko-Immunpräzipitations-Experiment bestätigt werden. Ein Ziel dieser Arbeit bestand darin, den Einfluß von Aven auf die Bildung des Apoptosoms zu untersuchen. Dafür wurden Apoptosom-Immunpräzipitations-Experimente mit 293T Zelllysaten etabliert, in denen man endogene Apaf-1/Caspase-9-Komplexe nachweisen konnte. Durch Zugabe von Cytochrom c und dATP direkt zu den Zelllysaten wurde die Bildung des Apoptosoms induziert, das anschließend mit einem monoklonalen anti-Caspase-9 Antiköper immunpräzipitiert werden konnte. Bei gleichzeitiger Überexpression von ΔAven wurde weniger Apaf-1 mit Caspase-9 ko-immunpräzipitiert, ein Hinweis darauf, dass die Apoptosombildung unterdrückt wurde. Das Ergebnis wurde durch die Beobachtung bestätigt, dass Caspase-9-Spaltung und -Aktivierung durch ΔAven vermindert wurde. Interessanterweise konnte eine Überexpression des volle-Längen Aven-Proteins die Bildung des Apoptosoms nicht verhindert. Apaf-1 wurde wie bei den Lysaten nichttransfizierter Zellen mit Caspase-9 Ko-immunopräzipitiert, und die Caspase-9 Spaltprodukte p35 und p37, die bei Aktivierung des Apoptosoms entstehen, wurden unverändert detektiert. Bei den beschriebenen Ko-Immunpräzipitationsexperimenten konnte auch eine Bindung von Aven und ΔAven an Caspase-9 (und nicht nur an Apaf-1) nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass der C-Terminus von Aven für die Bindung an Caspase-9 wichtig ist. Interessanterweise nahm die Bindung von ΔAven an Caspase-9 nach Apoptosominduktion ab, während kein Unterschied in der Bindung des vollständigen Aven-Proteins an Caspase-9 vor oder nach Apoptosominduktion beobachtet werden konnte. Wegen der Bindung von Aven und ΔAven an Caspase-9 konnte mit diesen Experimenten nicht festgestellt werden, ob Aven bzw. ΔAven Teil des gebildeten Apoptosomkomplexes sind, d. h. ob sie auch nach Apoptosombildung an Apaf-1 binden. Eine Hemmung der Apoptosomsbildung führt zur Inhibierung der Caspase-Aktivierungskaskade und damit zu verringerter Caspase-3 Aktivität. Entsprechend wurde die Caspase-3-Aktivität nach in vitro Apoptosominduktion bei Überexpression von ΔAven inhibiert, während das volle-Länge Aven keinen Einfluß auf die Caspase-3-Aktivität hatte. In weiteren Verlauf des Projektes wurden funktionelle Apoptoseexperimente mit transfizierten RKO-Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten eine Protektion durch Aven und ΔAven nach Staurosporin- und UV- Behandlungen. Dabei zeigte ΔAven einen stärkeren anti-apoptotischen Effekt als das volle-Länge-Aven in vivo. Die Tatsache, dass ΔAven ein höheres anti-apoptotisches Potential als das volle-Länge-Aven-Protein aufweist, deutet auf eine mögliche Spaltung oder Konformationsänderung von Aven in vivo hin, die zur Entstehung eines aktiven anti-apoptotischen C-terminalen Proteins führt. Um dies nachzuweisen, wurden einzel- und doppel-getaggte Fusionskonstrukte kloniert. Western Blot Analysen mit dem anti-Aven B Antiserum zeigten zusätzlich zu der volle-Längen-Aven- Bande (50 kDa) eine kleinere immunreaktive Bande mit einer Größe von ca. 35 kDa. Nach Apoptoseinduktion nahm die relative Menge dieser kleineren Bande zu. Das 35 kDa Aven-Spaltprodukt wurde nicht nur nach Überexpression, sondern auch auf endogener Proteinebene detektiert. Es konnte gezeigt werden, dass diese Spaltung Caspasen-abhängig ist. Eine Behandlung der Aven-überexprimierenden Zellen vor Apoptoseinduktion mit dem Caspase-Inhibitor z-VAD-fmk blockierte die Spaltung von Aven vollständig. Gleiche Ergebnisse konnten mit dem endogenen Protein gezeigt werden. Obwohl die Aven-Sequenz keine in silico vorausgesagten Spaltstellen für Caspasen enthält, zeigten in vitro Experimente mit rekombinanter Caspase-3, dass Aven von Caspase-3 direkt prozessiert wird. In vivo Experimente mit Wildtyp-MCF-7-Zellen, die keine endogene Caspase-3 exprimieren, sowie mit transfizierten MCF-7-Zellen, die Caspase-3 stabil exprimieren, bestätigten dies. Aven wurde nur in den mit Caspase-3 transfizierten MCF-7-Zellen nach Staurosporin-Behandlung in das 35 kDa Fragment gespalten. Western Blot Analysen mit Antikörpern, die das N-terminale Ende von Aven erkennen (anti-Flag oder anti-Aven A) zeigten eine zusätzliche kleinere Bande. Dieses Spaltprodukt ist ungefähr 30 kDa groß, und im Vergleich mit dem 35 kDa Aven-Peptid veränderte sich seine Expression kaum unter apoptotischen Bedingungen. Dieses Aven-Fragment ist jedoch nicht das Ergebnis einer Caspase-Spaltung, weil seine Entstehung nicht durch z-VAD-fmk inhibiert wurde. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass auch Serin-Proteasen nicht für diese Spaltung verantwortlich sind. Western Blot Analysen mit Antikörpern, die gegen den C-Terminus von Aven gerichtet sind, zeigten erstaunlicherweise kein zusätzlichen Aven-Spaltprodukte, sondern nur das volle Länge-Aven-Protein. Offensichtlich ist das entstehende C-terminale Fragment nach Spaltung durch Caspase-3 instabil und kann nicht nachgewiesen werden. Zusätzliche, nicht näher identifizierte 40 und 45 kDa große Aven Spaltprodukte wurden in MCF7-Zellen detektiert, die jedoch nicht in RKO-, HeLa-, oder 293T-Zellen beobachtet wurden. Mit Hilfe einer frei verfügbaren Software (GrabCas; ein Programm, das auch Granzyme Bund Caspase-Spaltstellen voraussagt, die sich von den Konsensusspaltsequenzen unterscheiden) sowie mit Western Blot Analysen von verschiedenen Aven-Deletionsmutante sollten potenzielle Schnittstellen näher charakterisiert werden. Dabei wurde die Spaltung durch Caspase-3 bei D293 (oder D287) bestätigt. Außerdem wurden zusätzliche mögliche Spaltstellen bei aa 240 oder zwischen aa 142-175 in Aven gefunden. Eine Spaltung zwischen den Aminosäuren 142 und 175 würde zu einem ähnlichen C-terminalen Aven-Peptid führen wie das artifizielle ΔAven und sollte von daher potente anti-apoptotische Eigenschaften aufweisen. Eine weitere Spaltstelle wurde ungefähr bei aa 100 kartiert. Die Isolierung von Aven Spaltprodukten aus eindimensionalen SDS-PA Gelen für eine nachfolgende massenspektrometische Analyse war aus technischen Gründe leider nicht erfolgreich. Die vorausgesagte Aven-Prozessierungsstellen sowie die in Western Blot Analysen beobachteten Aven-Fragmente lassen die Schlussfolgerung zu, dass Aven nach proteolytischer Aktivierung (d. h. nach Abspaltung inhibierender N-terminaler Sequenzen) anti-apoptotische Eigenschaften annimmt. Das generierte C-terminale Peptid wird dann möglicherweise durch Caspase-3-Spaltung bei D293 inaktiviert, wenn ein starker apoptotischer Stimulus auftritt. Zu Aufklärung der physiologischen Funktion von Aven in Normalgewebe und um zu untersuchen, ob Aven bei der Tumorentstehung eine Rolle spielt, wurden verschiedene Mausmodelle etabliert. Dazu wurde die humane Aven-cDNA zum einen unter der Kontrolle eines Hühner-ß-Aktin-Promotors und eines CMV-Enhancers kloniert. Diese Kombination regulatorischer Elemente sollte zu einer hohen und ubiquitären Expression des Transgens führen. Zusätzlich wurde die humane Aven-cDNA in den Vektor p1017 unter die Kontrolle des proximalen lck-Promotors kloniert, der eine Expression in unreifen T Zellen erlaubt. Die Etablierung der Mauslinien wurde in Kollaboration mit dem GSF-Institut für Experimentelle Genetik (AG Prof. M. Hrabé de Angelis) in München durchgeführt. Bei einer Untersuchung der Organe zeigte sich, dass in der ß-Aktin Aven-transgenen Maus eine starke Überexpression von Aven nur im Herz nachgewiesen wurde. Diese transgenen Mäuse werden zurzeit in Kollaboration mit Dr. S. Barrère-Lemaire (Institut of Functional Genomics, Montpellier, Frankreich) analysiert. Des Weiteren wurde im Rahmen dieser Arbeit auch eine lck Aven-Maus Linie untersucht. Western Blot Analyse zeigten eine starke Proteinexpression des Transgens im Thymus und auch in reifen T-Zellen (Milz). Mit Hilfe des anti-Aven C Antiserums konnte im Western Blot ein weiteres, vorher nicht beobachtetes Aven-Spaltprodukt in Thymozyten und aufgereinigten periphären T-Zellen nachgewiesen werden. Diese Überexpression von Aven in Thymozyten und gereinigten T-Zellen hatte jedoch keine messbare Inhibition von Apoptose zur Folge. Dagegen wurde eine Inhibition der aktivierungsinduzierten Proliferation von T-Zellen in transgenen Aven-Mäuse beobachtet. Bemerkenswerterweise zeigten die transgenen Aven-Mäuse keine spontane Tumorentwicklung obwohl eine Korrelation zwischen Aven-Expression und einer schlechten Prognose in Kinderleukämien publiziert worden ist. Um zu untersuchen, ob Aven in Kombination mit anderen Onkogenen in Tumorentstehung oder Progression kooperieren kann, sollen transgene Aven-Mäuse mit anderen transonkogenen Mausstämmen (z.B. p53-/- Mäusen) gekreuzt werden.
Gehirne von an Scrapie erkrankten Tieren sind histopathologisch durch Vakuolisierung, Astrogliose, Neurodegeneration und charakteristische PrPSc-Ablagerungen gekennzeichnet. Die pathologischen Mechanismen, die zu diesen Veränderungen führen, sind noch weitgehend unverstanden. Die Untersuchung der differentiellen Genexpression in Scrapie-infizierten Mausgeweben kann zu einem besseren Verständnis der pathogenen Mechanismen dieser Erkrankung auf molekularer Ebene beitragen. Auch könnten einige der differentiell exprimierten Gene zur Entwicklung eines auf Surrogatmarkern basierenden Testsystems beitragen oder für die Entwicklung von Strategien zur therapeutischen Intervention nützlich sein. Um im Verlauf der Scrapieerkrankung in Mäusen hoch- oder herunterregulierte Gene zu identifizieren, wurden RNA arbitrarily primed PCR (RAP-PCR) und suppression subtractive hybridisation (SSH) an Hirn- und Milzproben Scrapie-infizierter Mäuse und gesunder Kontrolltiere durchgeführt. Die Ergebnisse wurden anhand eines differentiellen Screening-Schrittes, Sequenzanalysen und Northernblots bestätigt. Durch einen Datenbankabgleich der erhaltenen Sequenzen wurden mehrere Kandidaten identifiziert. Einige davon, wie GFAP, Apolipoprotein D, Vimentin, Mx-Protein, MHC I und II wurden bereits als in Scrapie-infizierten Gehirnen hochreguliert von anderen Arbeitsgruppen publiziert. Eine differentielle Regulation weniger weiterer Kandidaten, wie Cytochromoxidase, Ubiqitinierungsfaktor E4a und das herunterregulierte Stathmin wurden bisher noch nicht beschrieben. Auch eine bisher unbekannte differentiell exprimierte Sequenz wurde gefunden. Ergänzend zu den Untersuchungen auf Nukleinsäureebene wurde die 2DElektrophorese für Gehirngewebe zur Untersuchung der differentiellen Expresssion auf Proteinebene unter Berücksichtigung posttranslationaler Modifikationen etabliert. Protokolle für die Vorbereitung von Mäusegehirnproben, die Durchführung der isoelektrischen Fokussierung und der 2. Dimension, sowie Färbeprotokolle für qualitative und quantitative Analysen der Gele unter Berücksichtigung der Erfordernisse nachfolgender MALDI-Analysen wurden erarbeitet.