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Heute gewinnen pflanzliche Arzneimittel im Zeichen einer verstärkten Hinwendung zu natürlichen, relativ nebenwirkungsarmen Medikamenten zunehmend an Bedeutung, so auch die über Jahrtausende hinweg traditionell angewandte Ginsengwurzel (Panax ginseng) und der Indische Weihrauch (Boswellia serrata). Neben der Struktur- und Extraktanalytik konzentriert sich die Forschung in zunehmenden Maße darauf, die zahlreichen pharmakologisch untersuchten und klinisch beobachteten Wirkungen dieser beiden Arzneipflanzen einzelnen Inhaltsstoffen zuzuordnen. Bei der Ginsengwurzel gestaltet sich dies jedoch besonders schwierig. Dies ist begründet durch die große Anzahl strukturell ähnlicher Ginsenoside sowie durch deren unterschiedlicher Metabolismus. Zwar ist aus In-vitro-Experimenten bekannt, daß die Degradation über die stufenweise Deglukosylierung stattfindet, allerdings ist bislang nicht geklärt, ob intakte Ginsenoside überhaupt resorbiert werden und welche der vielen in vitro ermittelten Degradationsprodukte tatsächlich den systemischen Kreislauf erreichen. Anders als bei Ginseng, kann die therapeutische Wirkung des Indischen Weihrauches wohl definierten Inhaltsstoffen, AKBA und KBA, zugeschrieben werden. Dennoch mangelt es hier an verlässlichen pharmakokinetischen Daten, da bislang keine validierte bioanalytische Methode zur Verfügung stand. Im Rahmen der Bioanalytik von Ginsenosiden und Boswellliasäuren kamen in der vorliegenden Arbeit die Nano-ESI-MS(n)-Technik sowie die HPLC-Analytik zur Anwendung. Bereits bei der Strukturanalyse von Ginsenosiden erwies sich die Kombination der Nano-ESI-Technik mit MS(n)-Experimenten in einer Quadrupol-Ionenfalle als besonders vorteilhaft. Im Vergleich zu konventionellem ESI bietet Nano-ESI nicht nur den Vorzug, mit kleinsten Substanzmengen lange Messungen durchführen zu können, sondern auch den Vorteil einer effektiveren, weniger diskreminierenden Ionisation. Sowohl die hohe Sensitivität der Nano-Elektrosprayionisierung bei der Analyse von glykosidischen Verbindungen als auch die umfangreichen Strukturinformationen infolge mehrerer aufeinanderfolgender stoßinduzierter Fragmentierungen machen diese Technik zu einer attraktiven und effizienten Methode zur Analyse von Ginsenosiden. In MS(n)-Experimenten äußert sich das charakteristische Fragmentierungsverhalten der Ginsenoside in der sequentiellen Abspaltung der Zuckereinheiten in sukkzessiven Fragmentierungsschritten. Mit dieser Methode konnten die Zuckerketten an verschiedenen Positionen des Protopanaxadiol- bzw. Protopanaxatriolaglykons der Ginsenoside identifiziert, die glykosidischen Verknüpfungen innerhalb der einzelnen Zuckereinheiten durch spezifische Ringfragmente bestimmt und die genaue(n) Verknüpfungsposition(en) enzymatisch eingeführter Galaktose(n) lokalisiert werden. Bisher wurden allerdings Nano-ESI-MS/MS bzw. MS(n)-Untersuchungen primär an wässrigen oder organischen Lösungen von isolierten / aufgereinigten Stoffen oder Stoffgemischen durchgeführt. In dieser Arbeit wurde erstmals diese Technik in der Bioanalytik zur Identifizierung von Ginsenosiden und deren Degradationsprodukte in Humanplasma und -urin angewandt. Obwohl die optimale Analytkonzentration für die Nano-Elektrosprayionisierung im allgemeinen bei 10-5M liegt, ist es gelungen, die Ginsenoside anhand ihrer spezifischen Fragmentionen im MS/MS Modus bis zu einer Konzentration von 2 ng/mL (10-8M) in biologischen Matrices nachzuweisen. Auch wenn die Molekülionenpeaks bei diesen geringen Konzentrationen im Rauschen untergehen, können die Ginsenoside durch selektive Isolierung der gewünschten Vorläuferionen und deren anschließende Fragmentierung in der Quadrupol-Ionenfalle auf der Basis der Detektion spezifischer Fragmente identifiziert werden. Da bei der Fragmentierung der gleichen Vorläuferionenmasse in Leerplasma bzw. Urin keine charakteristischen Fragmentionen gebildet werden, handelt es sich somit um einen spezifischen Nachweis der Ginsenoside in biologischen Matrices. Vor dem Hintergrund dieser vielversprechenden Vorversuche wurde eine Pilotstudie zum qualitativen Screening von Ginsenosiden und deren Metaboliten in Humanplasma und –urin durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, daß Protopanaxatriol-Ginsenoside sowohl im Magen hydrolysiert als auch intestinal degradiert werden. Schon in den ersten Stunden nach der einmaligen oralen Einnahme von Ginsana G115 Kapseln wurden die Hydrolyseprodukte G-Rh1 und hydratisiertes G-Rh1 in Humanplasma detektiert. Die schnelle Resorption dieser beiden Verbindungen aus dem oberen Gastrointestinaltrakt deutet auf die Hydrolyse des Ginsenosides Rg1 im Magen hin. Das spätere Auftreten eines weiteren monoglukosylierten Protopanaxatriols, des Degradationsproduktes G-F1, liefert den ersten In-Vivo-Hinweis auf einen intestinalen Metabolismus von Protopanaxatriol-Ginsenoside. Im Gegensatz zu den Protopanaxatriolginsenosiden passieren die Protopanaxadiol-Ginsenoside den Magen unverändert, wie aus der Abwesenheit jeglicher Protopanaxadiol-Degradationsprodukte im Plasma und Urin in den ersten Stunden nach der Applikation geschlossen werden kann. Erst im unteren Gastrointestinaltrakt werden Protopanaxadiol-Ginsenoside durch intestinale Bakterien zu „Compound-K“ abgebaut und anschließend resorbiert. Der Nachweis von Ginsenosid Rb1 im Plasma, sowie weiterer Ginsenoside im Urin eines Probanden zeigt, daß auch Ginsenoside in ihrer intakten Form resorbiert werden können. Dennoch sind weitere Studien hierzu notwendig, um zu klären, ob die Resorption intakter Ginsenoside die Regel oder eher eine Ausnahme darstellt. Mit der Identifizierung des Hydrolyseproduktes G-Rh1, der Degradationsprodukte G-F1 sowie „Compound-K“ in Humanplasma und -urin konnte schließlich die Frage geklärt werden, welche der zahlreichen in vitro bestimmten Degradationsprodukte tatsächlich den systemischen Kreislauf erreichen. Damit ist die Basis für eine spätere Quantifizierung dieser Verbindungen nach ihrer Isolierung bzw. Herstellung und Charakterisierung als Referenzsubstanzen geschaffen. Außerdem können diese neuen Erkenntnisse helfen, pharmakologische Ergebnisse aus In-vitro-Versuchen mit In-vivo-Daten besser zu korrelieren, da sie erste Hinweise geben, welche der in vitro getesteten Substanzen für die in vivo beobachteten Effekte verantwortlich sein könnten. Bisher wurde Nano-ESI-MS(n) in der Bioanalytik pflanzlicher Arzneistoffe nicht eingesetzt. In dieser Arbeit wurde diese Technik erstmals zum Screening von Ginsenosiden und deren Degradationsprodukte in Humanplasma und –urin benutzt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß Nano-ESI-MS(n) auch eine empfindliche und sensitive Methode zur Identifizierung und zum Nachweis anderer medizinisch relevanter glykosidischer Verbindungen in biologischen Matrices darstellt, woraus sich neue Perspektiven für den Einsatz dieser Technik in der Metabolitenforschung sowie in der Bioanalytik pflanzlicher Xenobiotika ergeben. In den letzten Jahren rückte auch der Indische Weihrauch immer mehr in den Mittelpunkt des wissenschaftlichen sowie therapeutischen Interesses. Aufgrund der selektiven Hemmung der 5-Lipoxygenase gewinnen AKBA und KBA, als neue entzündungshemmende Verbindungen, zunehmend an Bedeutung. Während die quantitative Analytik der Boswelliasäuren in Extrakten und in verschiedenen Fertigarzneimitteln erhebliche Fortschritte erzielen konnte, fehlten auf dem Gebiet der Bioanalytik bislang validierte analytische Methoden zur Durchführung pharmakokinetischer Studien. Vor diesem Hintergrund wurde eine HPLC-Methode zur Bestimmung von KBA in Humanplasma entwickelt und validiert. Die Methode ist durch eine einfache Probenvorbereitung gekennzeichnet, die sich auf eine Festphasenextraktion der KBA aus der komplex zusammengesetzten biologischen Matrix beschränkt. Im Anschluß an die chromatographische Trennung auf einer RP-C18 Säule erfolgt die Quantifizierung der KBA mittels UV-Detektion bei 250 nm. Um eine adäquate Bestimmung der KBA in Humanplasma zu gewährleisten, wurde eine umfassende Validierung durchgeführt. Alle ermittelten Validierungsparameter, wie Spezifität, Linearität, Präzision, Richtigkeit, Reproduzierbarkeit, untere Quantifizierungsgrenze und Stabilität lagen innerhalb der vorgegebenen Grenzen. Damit erfüllt die entwickelte HPLC-Methode die allgemein gültigen Anforderungen an die Validierung bioanalytischer Methoden. Mit der Erstellung einer Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve im Rahmen einer ersten Pilotstudie konnte diese Methode zudem ihre praktische Anwendbarkeit unter Beweis stellen. Somit steht für zukünftige pharmakokinetische Studien eine validierte HPLC-Analytik zur Bestimmung von KBA, einer der Hauptwirkstoffe des Indischen Weihrauches, zur Verfügung, die sich durch hohe Spezifität, Reproduzierbarkeit und Präzision auszeichnet. Verlässliche Daten zur Pharmakokinetik am Menschen sind heute von besonderer Bedeutung, da sie helfen, die Dosierung zu optimieren, die biopharmazeutischen Eigenschaften von Präparaten zu verbessern und die Sicherheit bei der Anwendung zu erhöhen. Insbesondere im Hinblick auf bereits festgestellte Interaktionen von pflanzlichen Arzneimitteln mit Medikamenten reicht es nicht mehr aus, wenn sich pflanzliche Arzneimittel, wie beispielsweise Ginseng und Indischer Weihrauch, nur auf ihre langjährigen tradierten Anwendungserfahrungen berufen. So wird auch bei Phytopharmaka in verstärktem Maße eine wissenschaftliche Absicherung durch bioanalytische Forschung erwartet. Mit der Identifizierung der Ginsenoside und deren Degradationsprodukte im Menschen, der erstmaligen Anwendung von Nano-ESI-MS(n) in der Metabolitenforschung und der Entwicklung einer validierten bioanalytischen Methode zur Bestimmung der 11-Keto-Beta-Boswelliasäure in Humanplasma wurde diesen Erfordernissen Rechnung getragen.
Die Verwendung von photolabilen Schutzgruppen zur nicht-invasiven Kontrolle von Systemen birgt ein großes Potential für verschiedenste Anwendungsgebiete, die von der Erforschung und Regulation biologischer Prozesse, über den Einsatz in medizinischer Therapie bis hin zur Verwendung als molekulare Datenspeicher reichen. Für diese Umsetzung benötigt es allerdings eine breite Auswahl an entsprechenden PPGs und das Wissen über ihre Reaktionsmechanismen. Im Allgemeinen lässt sich die Konzeptionierung von PPGs in drei Prozesse einteilen, beginnend bei dem Design und der Synthese einer neuen PPG. Bei diesem Schritt liegt der Fokus auf ein oder zwei besonderen Eigenschaften, wie beispielsweise einer Absorptionswellenlänge in einem bestimmten Spektralbereich oder einer hohen Uncaging-Quantenausbeute. Im zweiten Schritt folgt die Untersuchung der PPG bezüglich spektroskopischer und mechanistischer Eigenschaften und ggf. anschließender Optimierung auf synthetischer Ebene. Die so gewonnenen Informationen sind dann hilfreich bei dem letzten Schritt, bei dem es um den Einsatz der PPG in einem entsprechenden System geht. Hierbei müssen die verwendeten PPGs genau auf das Zielsystem abgestimmt sein, dazu zählen verschiedenste Parameter wie Anregungswellenlänge, Extinktionskoeffizient, Art und Struktur der Photoprodukte sowie Uncaging-Effizienz und Geschwindigkeit.
In der vorliegenden Arbeit wurde über die drei vorgestellten Projekte mittels spektroskopischer Methoden zu allen drei genannten Stadien zur Konzeptionierung von PPGs ein Beitrag geleistet. Dazu zählt die Entwicklung der CBT-basierten PPGs, die Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehung von (DMA)(2)F-PPGs und die Etablierung einer wellenlängenselektiven An-/Aus-Funktionalität eines Antibiotikums. In enger interdisziplinärer Zusammenarbeit zwischen theoretischen, synthetischen und biologischen Teilgebieten konnte jedes Projekt innerhalb der jeweiligen Entwicklungsstufe erfolgreich abgeschlossen werden.
Mithilfe des relativ neuen Ansatzes, bei dem durch quantenmechanische Berechnungen der vertikalen Anregungsenergie von der kationischen Spezies einer PPG-Grundstruktur eine Aussage über ihre Qualität postuliert werden kann, konnte ausgehend von der Fluoren-Grundstruktur eine neue Klasse von PPGs gefunden werden. Dabei erwies sich die CBT-Struktur mit den Schwefelatomen an der para-Position als besonders geeignet. Insbesondere konnte die Grundstruktur durch die (OMePh)2-Substitution, welche in einer signifikanten bathochromen Verschiebung des Absorptionsmaximums resultierte, optimiert werden. Die Untersuchung der Ultrakurzzeit-Dynamik beider p-CBT Strukturen gab Aufschluss über die unterschiedlichen photochemischen Eigenschaften als PPG.
Für die Stoffklasse der Dimethylamino-Fluorene wurde ein wichtiger Unterschied zwischen den einfach- und zweifach-substituierten Derivaten aufgedeckt, der entscheidend für einen signifikanten Uncaging-Effizienzunterschied ist. Dabei stellt sich die Stabilität des symmetrisch-substituierten Fluorenyl-Kations als der wichtigste Faktor bezüglich der Uncaging-Quantenausbeuten heraus. Beide Schutzgruppen sind in der Lage photoinduziert eine AG freizusetzen, wobei der Reaktionsmechanismus über die kationische Spezies (DMA)(2)F + abläuft. Der Unterschied hierbei liegt in der Lebensdauer der beiden Kationen, die im Falle der symmetrischen PPG stark lösungsmittelabhängig ist und bis zu mehreren Stunden betragen kann, was bis dato das langlebigste Kation dieser Molekülklasse darstellt. Für die zukünftige Optimierung dieser PPG-Klasse ist die Erkenntnis über die Gründe für die Stabilität des Kations von großem Vorteil. Der stabilisierende Faktor ist zum einen die zweite Dimethylamino-Gruppe der symmetrischen Verbindung, welche durch die Erweiterung der Mesomerie zur besseren Verteilung der positiven Ladung im Molekül führt. Zum anderen spielt das Lösungsmittel eine entscheidende Rolle. Dabei bieten protische, polare Medien eine zusätzliche Stabilisierung, die notwendig für die Langlebigkeit des Kations ist. Die Lebensdauer des Kations war zudem durch eine zweite Bestrahlungswellenlänge kontrollierbar. Ausgehend vom Kation konnte eine reversible Nebenreaktion in protischen Lösungsmitteln identifiziert werden, die einen Austausch der AG durch das Lösungsmittel darstellt.
Zusätzlich konnte die kleine Stoffklasse der bisher bekannten Photobasen durch die Verbindung (DMA)2F-OH erweitert werden. Genauer betrachtet handelt es sich dabei um eine photoinduzierte Hydroxidfreisetzung, wodurch je nach eingesetzter Konzentration ein pH-Sprung von bis zu drei Einheiten erreicht werden konnte. Dabei stellt sich die Lebensdauer des pH-Sprungs als ein entscheidender Parameter für Photobasen dar, welcher sich für die hier untersuchte Verbindung aufgrund der besonderen Stabilität des entsprechenden Kations, im Vergleich zu einigen der bereits bekannten Verbindungen, als besonders langlebig herausgestellt hat. Ein weiterer Vorteil des Einsatzes von (DMA)2F-OH als Photobase ist die Möglichkeit den pH-Sprung durch zwei verschiedene Wellenlängen sowohl zeitlich als auch örtlich zu kontrollieren, indem die Verbindung zwischen den zwei Spezies (DMA)2F-OH und (DMA)2F + geschaltet werden kann.
Im Hinblick auf die Anwendungen von PPGs zur verbesserten zeitlichen und örtlichen Kontrolle biologischer Zielsysteme ist im Rahmen dieser Arbeit das Prinzip vom wellenlängenselektiven Uncaging zweier PPGs an einem Molekül (two-PPG-one-molecule, TPOM) etabliert worden. Das Zielmolekül war hier das Antibiotikum Puromycin, welches durch seine Fähigkeit an das Ribosom zu binden, die Proteinbiosynthese inhibieren kann. Dabei wurden zwei verschiedene PPGs gefunden, die sowohl aufeinander als auch auf das Biomolekül selbst abgestimmt sind. Im Ausgangszustand sind beide PPGs am Puromycin angebracht, wodurch es in seiner biologischen Wirkung inaktiv ist. Befindet sich das doppelt geschützte Puromycin in der ROI, so kann es durch die Bestrahlung mit einer bestimmten Wellenlänge infolge des ersten Uncaging-Schritts aktiviert werden. Da biologische Systeme nicht statisch sind, können aktivierte Moleküle stets von der gewünschten ROI nach außen gelangen, wodurch der Anspruch der räumlichen Kontrolle nicht erfüllt wird. In diesem Fall kann durch die TPOM-Umsetzung die zweite Bestrahlungswellenlänge auf den entsprechenden Bereich angewendet werden, wodurch das Uncaging der zweiten PPG initiiert und folglich das Puromycin deaktiviert wird. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Deaktivierungswellenlänge auch in der Lage ist beide PPGs zu entfernen, wodurch eine vollständige Inaktivierung des Puromycins außerhalb der ROI garantiert werden kann.
Ist die Proteinbiosynthese längerfristig blockiert, führt das schließlich zum Zelltod. Ein großes Anwendungsgebiet dieses Antibiotikums sind die Neurowissenschaften. Aufgrund der Tatsache, dass Puromycin keine Unterscheidung zwischen eukaryotischen und prokaryotischen Zellen macht, findet es keine Anwendung in der Medizin. Eine zeitliche und örtliche Kontrolle seiner Wirkung könnte den Anwendungsbereich dieses Antibiotikums evtl. ausweiten. Das wohl naheliegendste wäre der Einsatz bei Tumorzellen, deren Behandlung durch Zytostatika auf den gesamten Körper wirken und dadurch viele schwere Nebenwirkungen verursachen.
Wie bereits weiter oben beschrieben muss für jedes Biomolekül und das entsprechende Wirkzentrum die Auswahl des passenden PPG-Paares einzeln abgestimmt werden. Dennoch lässt sich anhand des hier etablierten Systems ein Konzept für die erfolgreiche Umsetzung zukünftiger TPOM-Systeme an anderen biomolekularen Wirkstoffen zusammenfassend formulieren.
* Der erste Schritt sollte die Betrachtung des Wirkzentrums des zu modifizierenden Biomoleküls sein: Welche funktionelle Gruppe bzw. Gruppen sind entscheidend für die Bindetasche oder –stelle? Dieser Bereich des Biomoleküls soll im Zuge des Uncagings entweder blockiert oder abgespalten werden. In der unmittelbaren Nähe muss die PPG1 angebracht werden.
* Bei der Wahl von PPG1 ist das wichtigste Kriterium, dass das Biomolekül mit enthaltener Schutzgruppe in seiner Wirkung unbeeinträchtigt bleibt. Dies schränkt die Auswahl beträchtlich ein. Eine mögliche Umsetzung wäre die Anbringung einer Nitro-Gruppe falls vorhanden an einen Benzolring, welcher sich im Fall eines großen Biomoleküls in der Nähe der wichtigen funktionellen Stelle befindet.
* Die zweite PPG (PPG2), deren photoinduzierte Abspaltung zur Aktivierung des Wirkstoffs führen soll, kann strukturell frei gewählt werden. Das Auswahlkriterium hierbei ist das Absorptionsspektrum. Hierbei sollte das Absorptionsmaximum rotverschoben zur PPG1 sein, um eine unerwünschte Abspaltung zu vermeiden. Außerdem darf keine signifikante Absorption von PPG2 bei der Uncaging-Wellenlänge von PPG1 vorhanden sein.
* Beide PPGs sollten eine ähnliche Uncaging-Quantenausbeute vorweisen, um im Deaktivierungsschritt der doppelt geschützten Verbindung durch das höher energetische Licht keine Bevorzugung einer einzelnen Schutzgruppe zu riskieren.
Anhand der erarbeiteten Herangehensweise können weitere Wirkstoffe oder Biomoleküle hin zu einer An- / Aus-Funktionalität modifiziert werden. Mit der Umsetzung des TPOM-Konzepts kann eine Verbesserung der örtlichen und zeitlichen Kontrolle der Aktivität eines Antibiotikums erreicht werden. Für die Anwendung in biologischer Umgebung ist diese präzische Kontrolle essentiell, um unerwünschte Nebenwirkungen angesundem Gewebe zu verhindern.
Charakterisierung intrazellulärer Bindepartner von metabotropen Glutamatrezeptoren der Gruppe III
(2001)
Die Aminosäure Glutamat ist der maßgebliche exzitatorische Neurotransmitter im zentralen Nervensystem, und glutamaterge Synapsen sind weit über das ganze Hirn ver breitet. Neben den Ionenkanalgekoppelten (ionotropen) Glutamatrezeptoren (iGluRs) aktiviert Glutamat auch prä und postsynaptische metabotrope Glutamatrezeptoren (mGluRs), die über trimere GProteine und nachgeschalteten Signalkaskaden Einfluss auf die Signalverarbeitung in der Synapse nehmen können (Pin und Duvoisin, 1995). Diesen Rezeptoren werden Aufgaben bei verschiedenen Formen neuronaler Plastizität und Neurotoxizität zugeschrieben (Pizzi et al., 1993; Pin und Duvoisin, 1995; Pekh letski et al., 1996; Pizzi et al., 1996a; Bushell et al., 1997; Maiese et al., 2000; Sabel haus et al., 2000). Zur Zeit sind acht verschiedene mGluRs zuzüglich ihrer Spleißvarian ten bekannt, die in drei Gruppen gegliedert werden, welche sich in ihrer Lokalisation, Struktur und pharmakologischen Eigenschaften unterscheiden (Nakanishi, 1992; Pin et al., 1993). Mitglieder der Gruppe III mGluRs sind spezifisch an der aktiven Zone der Präsy napse lokalisiert und dort an der Regulation der Neurotransmission beteiligt (Shigemoto et al., 1996; Ottersen und Landsend, 1997). Die Mechanismen, die zur spezifischen Lo kalisation führen, konnten bislang noch nicht aufgezeigt werden. Bereits im Vorfeld dieser Arbeit wurde eine Ca 2 abhängige Interaktion von Calmodulin (CaM) mit mGluR7a durch Kopräzipitationsstudien gezeigt. Die CaMBindung ist dabei von phy siologischer Relevanz für die Aktivierung des Rezeptors (O'Connor et al., 1999). In der vorliegenden Arbeit wurde nach neuen Interaktionspartnern für die Gruppe III mGluRs gesucht, um so weitere Aufschlüsse über die präsynaptische Verankerung und Regulati on dieser Rezeptorgruppe zu gewinnen. In einem ZweiHybridScreen konnten dabei die Proteine PxF und SGT, beides Genprodukte unbekannter Funktion, als zwei mögliche Interaktionspartner für mGluR4b identifiziert werden. Die Natur dieser Interaktionen konnte im Verlauf dieser Arbeit nicht genauer bestimmt werden und bleibt somit Gegenstand weiterer Untersuchungen. In einem parallelem Ansatz wurde die Interaktion von mGluR7a mit CaM näher untersucht. Dabei konnte ein hochkonservierter Bereich in allen Gruppe III mGluRs mit Ausnahme von mGluR4b und mGluR6 identifiziert werden, der eine Konsensussequenz zur CaMBindung (1510Motiv) enthält. Neben der CaMBindung konnte für diesen Bereich in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Dr. Michael Freissmuth auch eine Interaktion mit Gbetagamma nachgewiesen werden. Die GbetagammaBindung an den Rezeptor wird durch Ca 2 abhängige Aktivierung von CaM gehemmt. Es wird daher ein Modell zur dualen Aktivierung von Gruppe III mGluRs vorgeschlagen, welches mögliche Mecha nismen zur negativen Rückkopplung der Glutamatfreisetzung aufzeigt. Zusätzlich wurde eine mögliche Regulation der Gruppe III mGluRs durch PKC Phosphorylierung untersucht. Dabei konnte die in vitroPhosphorylierung eines einzel nen Restes (S862) im intrazellulären CTerminus von mGluR7a nachgewiesen werden, welche zur Hemmung der CaMBindung führte. Aufgrund dieser Daten wird ein erwei tertes Modell formuliert, in dem die Hemmung der Ca 2 /CaMabhängigen Aktivierung der GProteinsignalkaskade durch Phosphorylierung von mGluR7a eine übergeordnete Regulation des Rezeptors darstellt. Da die Gruppe III mGluRs bei Aktivierung zu einer Selbsthemmung der Neuro transmission führen (Pin und Duvoisin, 1995; Takahashi et al., 1996), stellt deren Ca 2 /CaMregulierte Aktivierung und die zusätzliche Regulation durch Phosphorylie rung eine Möglichkeit der Regulation von Lernprozessen dar.
Die Messung von heteronuklearen 15N-Relaxationszeiten (Longitudinale, transversale sowie heteronukleare NOE) bei verschiedenen Magnetfeldstärken (500, 600 und 800 MHz 1H Larmorfrequenz) ergeben Informationen über interne dynamische Prozesse in Biomolekülen. Diese verschiedenen Relaxationsraten sind voneinander abhängig und über die spektrale Leistungsdichtefunktion miteinander gekoppelt. Die mikrodynamischen Parameter des NH-Peptidrückgratvektors (der Ordnungsparameter S2 und die effektive interne Korrelationszeit te) sowie der Beitrag des konformationellen Austausches zur transversalen Relaxationsrate der Austauschparameter Rex wurden für einige Proteine errechnet und angepaßt. Das Human ILBP gehört zur Familie der intrazellulären Lipidbindungsproteine (LBP), die in der Lage sind, Fett- und Gallensäuren spezifisch zu binden und in Cytosol zu transportieren. Viele verschiedene Typen von LBPs sind bis heute identifiziert worden. Diese Proteine enthalten 127 - 135 Aminosäurereste und werden nach dem Gewebe benannt, aus dem sie isoliert wurden. Human-ILBP enthält 127 Aminosäurereste und besteht haupsächlich aus 10 antiparallelen beta-Faltblattsträngen, die eine beta-Fassstruktur mit einer großen Bindungstasche bilden, und zwei alpha-Helices. ILBP hat die Tendenz, Gallensäuren oder Fettsäuren zu binden. Diese geringe Tendenz zur liganden Spezifität ist entweder in der Struktur oder in seiner Dynamik begründet. Aus diesem Grund kann die Untersuchung der Dynamik des Human ILBP (apo- und holo-Form) in zwei Zeitfenstern zum besseren Verständnis der Funktion führen. Für die nicht-terminalen Peptidrückgratgruppen wurde ein S2-Parameter> 0,8 mit einen Durchschnitt von 0,88 beobachtet, was auf eine niedrige Mobilität im ganzen Protein in einem Nano- zu Picosekunden-Zeitfenster deutet, wobei eine Korrelationszeit von tc = 6.25 ns für ILBP (apo-form) und tc = 6.10 ns für ILBP (holo-Form) beobachtet wurde. Apo- und holo-Form (mit Taurocholat als Ligand) zeigen eine ähnliche Dynamik in diesem Zeitfenster. Überdurchschnittliche S2-Werte der alpha-Helix I deuten eine geringe Flexibilität des Peptidrückgrats an, während alpha-Helix II als Teil der Portalregion eine höhere Beweglichkeit zeigt. Austauschparameter Rex wurden hauptsächlich in den Regionen der Ligandenbindung nachgewiesen. Die hier beschriebenen Eigenschaften unterscheiden sich von denen des H-FABP und des E-FABP. Offensichtlich unterscheiden sich verschiedene Mitglieder der LBP-Familie wie ILBP (Human oder Schwein), H-FABP und E-FABP in der Funktion und Dynamik des Peptidrückgrats. In der vorliegenden Arbeit wurden die transversalen 15N CSA/DD-kreuzkorrelierten Kreuzrelaxationsraten bestimmt. Für die Bestimmung der Anisotropie des chemischen Verschiebungstensors wurde des Verhältnis zwischen den Auto- und Kreuzrelaxationsraten in Abhängigkeit von der magnetischen Feldstärke genutzt, wobei es möglich war, die Orientierung und Größe des CSA-Tensors einzelner Aminosäurereste zu bestimmen. Bei dieser Methode (wie auch in vielen anderen Studien gezeigt) wurde keine Korrelation zwischen der Sekundärstruktur des Proteins und den 15N CSA-Werten festgestellt. Zum Vergleich der CSA-Konstanten der ILBP-Spezies wurden die entsprechenden Parameter der RNaseT1 gemessen. Alle Daten wurden im Hinblick auf strukturelle Details kritisch diskutiert.
Die Atmungskette in der inneren Membran der Mitochondrien besteht aus fünf großen Enzymkomplexen. Die NADH-Dehydrogenase (I), Succinat-Dehydrogenase (II, indirekt), Cytochrom c-Reduktase (III) und Cytochrom c-Oxidase (IV) nutzen die Energie aus Elektronentransfers zum Aufbau eines Protonengradienten über die innere Mitochondrienmembran. Dieser wird anschließend von der FOF1-ATP-Synthase (V) als Energiequelle zur Phospho-rylierung von ADP verwendet. Für lange Zeit bestand eine Kontroverse, wie diese Proteine in der Membran organisiert sind. Nach dem „random collision“-Modell diffundieren sie frei als Einzelmoleküle und treffen sich nur zufällig, während sie nach dem „solid state“-Modell größere funktionelle Einheiten bilden. In den letzten Jahren gab es vermehrt Hinweise darauf, dass das letztere Modell das zutreffendere ist, da tatsächlich sogenannte Superkomplexe der Atmungskette in aktiver Form isoliert werden konnten. Schließlich konnte 2007 die erste drei-dimensionale Rekonstruktion eines Superkomplexes, bestehend aus Komplex I, dimerem Komplex III und Komplex IV publiziert werden. Aufgrund der Einschränkungen der verwendeten Negativkontrasttechnik hatte dieses Modell allerdings nur eine niedrige Auflösung und repräsentierte durch die Dehydrierung keinen nativen Zustand. Dadurch ließen sich die Strukturen der einzelnen Komplexe nur ungenau einpassen. Um diese Probleme zu umgehen, sollte eine Struktur unter Kryo-Bedingungen rekonstruiert werden. Um die für Kryo-EM benötigte größere Ausbeute und höhere Konzentration zu erzielen, wurde ein neues Reinigungsprotokoll für die Superkomplexe etabliert. Die wesentlichen Punkte darin sind der Austausch des für die Solubilisierung verwendeten Digitonins durch Amphipol A8-35 mittels ?-Cyclodextrin und eine anschließende Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Im BN-PAGE zeigten die auf diese Art gereinigten Superkomplexe das gleiche Banden- und Aktivitätsmuster wie Proben in Digitonin. Auch bei einer Einzelpartikelanalyse nach Negativ-kontrastfärbung konnten keine Unterschiede festgestellt werden und die Partikel zeigten ähnliche Orientierungen wie in der vorherigen Studie. Einige neue Ansichten ließen sich jedoch nicht zuordnen und stellten eventuell eine Verunreinigung mit größeren Superkomplexen dar. Da auch bei der Reinigung mit Amphipol die Proteinkonzentration letztlich nicht wesentlich erhöht werden konnte und sich die Superkomplexe nicht wie für Kryo-EM erforderlich in einen löchrigen Kohlefilm einlagerten, wurden die Proteine auf einem durchgehenden Kohlefilm in einer dünnen Pufferschicht vitrifiziert. Die dabei zu beobachtenden bevorzugten Orientierungen, sollten auch die Unterscheidung von verschiedenen Populationen von Superkomplexen erleichtern. Eine erste 3D-Rekonstruktion wurde mit Hilfe der „random conical tilt“-Methode errechnet. Dieses Modell wurde durch „projection matching“ bis zu einer Auflösung von 19 Å verfeinert, womit die Auflösung fast doppelt so hoch ist, wie bei der Rekonstruktion aus Negativ-kontrastfärbung (36 Å). Die Struktur repräsentiert einen natürlichen Zustand des Proteins und zeigt Details wie einzelne Domänen, Spalten zwischen Domänen und eine starke Krümmung des Membranarms von Komplex I, die zuvor nicht erkenn-bar waren. Die Amphipole bilden einen Gürtel um den Transmembranbereich. Die Röntgenstrukturen von Komplex I, III2 und IV konnten mit großer Präzision in die Dichtekarte eingepasst werden. Die wenigen kleinen Unterschiede zwischen Röntgenstrukturen und EM-Dichtekarte sind auf leichte Konformations-änderungen zurückzuführen. Die Kryo-EM-Rekonstruktion ist erheblich größer als die Rekonstruktion aus Negativfärbung, wodurch die enthaltenen Komplexe nur noch wenige punktuelle Kontakte haben. In den Zwischenräumen könnte eine spezielle Lipidumgebung die kleinen Elektronenüberträger Ubichinon und Cytochrom c in den Superkomplex integrieren. Ihre Bindestellen sind jeweils zueinander orientiert und die geringen Abstände, die zum ersten Mal bestimmt werden konnten, stützen die Hypothese eines gerichteten Substrattransfers über kurze Entfernungen. Von den möglichen Übertragungswegen scheint der kürzere mit weniger Transferreaktionen bevorzugt zu werden. Während der Entwicklung des neuen Reinigungsprotokolls für die Superkomplexe konnte zusätzlich eine neue Methode zur Rekonstitution von Membranproteinen entwickelt werden. Die solubilisierten Proteine werden dabei in Dichtegradienten mit steigenden Konzentrationen von ansolubilisierten Liposomen und Cyclodextrin zentrifugiert, wodurch ihnen langsam das Detergens entzogen und durch Lipid ersetzt wird. Proteoliposomen werden gleichzeitig von überschüssigem Lipid und Cyclodextrin-Detergens-Komplexen getrennt.
Im Rahmen dieser Arbeit werden die Synthese, Eigenschaften und Anwendungsmöglichkeiten von Arylalkyl-Rückgrat modifizierten DNA-Oligonucleotiden untersucht. Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit war, lipophile, arylalkylmodifizierte Oligonucleotide zu synthetisieren und die Auswirkungen der absoluten Konfiguration der Modifikationen auf die Eigenschaften der resultierenden Duplexe zu untersuchen. Als zweites sollten die Modifikationen in Antisense-Oligonucleotide eingebaut werden um diese auf ihre Anwendbarkeit für die lnhibierung der HCV Genexpression zu testen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 18 unterschiedliche Rückgrat-Modifikationen synthetisiert. Dabei wurde die Alkylkettenlänge wie auch die Größe des aromatischen Systems variiert. Zudem wurde untersucht, welchen Einfluss Ringsubstituenten auf die Eigenschaften der resultierenden Oligonucleotide ausüben. Die Rückgratmodifikationen wurden über die Festphasensynthese nach der Phosphoramiditmethode in Oligonucleotide eingebaut. Als Ausgangsverbindungen für die modifizierten Phosphoramidite dienten die Arylalkylhalogide. Diese wurden in einer dreistufigen in situ Reaktion - über das Grignard-Reagenz zu der entsprechenden cadmiumorganischen Verbindung und deren weitere Reaktion mit Phosphortrichlorid - zu den Arylalkyldichlorphosphanen umgesetzt. Die als Phosphorylierungsreagenzien fungierenden (Arylalkyl)(diisopropylamin)-chlorphosphane konnten durch Umsetzung mit N,N-Diisopropylamin erhalten werden. Die folgende Reaktion mit den 5'-hydroxyl- und aminogeschützten, natürlichen Nucleosiden führte zu den modifizierten Phosphoramidit-Bausteinen. Diese wurden mittels der OligonucleotidFestphasensynthese selektiv, an verschiedenen Positionen in sehr guten Ausbeuten in ModellOligonucleotide eingebaut und die erhaltenen Diastereoisomeren mittels RP-HPLC getrennt. Die einfach modifizierten, diastereoisomerenreinen Oligonucleotide zeigten eine signifikant erhöhte Lipophilie im Vergleich zu den unmodifizierten Strängen. Die Lipophilie nahm bei der Verlängerung der Alkylkettenlänge und der Vergrößerung des aromatischen Ringsystems pro (CH2)-Gruppe sowie pro weiterem Sechsring in konstanten Schritten zu, wodurch die Lipophilie gezielt gesteuert werden kann. Um den Einfluss der Modifikationen im Doppelstrang zu untersuchen wurden die Tm-Werte der Duplexe bestimmt und diese zudem CD- und Fluoreszenzspektroskopisch untersucht. Die erhaltenen Tm-Werte variierten sehr stark in Abhängigkeit der Alkylkettenlänge, der Ringgröße und der absoluten Konfiguration. Mit den Rp-konfigurierten benzyl- (B), (naphth-1-yl)methyl- (I) und 2,4-difluorbenzylmodifizierten (M) Oligonucleotid-Duplexen konnte eine Schmelzpunktserhöhung erzielt werden. Auch konnte mit den 3-(Anthracen-9-yl)propylphosphonaten K eine signifikante Tm-Wert Steigerung aufgrund eines "Dangling-End-Effektes" beobachtet werden. Die erhaltenen Tm-Werte korrelierten hervorragend mit den erhaltenen CD- und Fluoreszenz-Daten. Für die Zuordnung der absoluten Konfiguration der Modifikation wurden drei 3-Phenylpropylphosphonat-Dimere E synthetisiert. Die Zuordnung erfolgte mittels der 2D-ROESY-NMR-Spektren und den berechneten Protonenabständen der diastereoisomerenreinen Dimere sowie über empirische Regeln die von den Methylphosphonaten S abgeleitet wurden. Diese Ergebnisse lassen sich auf längere Oligonucleotide übertragen. Neben den Untersuchungen der Charakteristika der Arylalkyl-Rückgrat modifizierten Oligonucleotide wurden während dieser Arbeit einige Modifikationen gezielt auf ihre Einsetzbarkeit für den Antisense-Einsatz getestet. Als RNA-Zielsequenz wurden die Nucleotide 326-342 der 5'-nicht codierenden Region des Hepatitis C Virus gewählt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden fünf unterschiedlich modifizierte Antisense-Oligonucleotide synthetisiert. Die arylalkylmodifizierten Oligonucleotide zeigten gute Hybridisierungseigenschaften gegenüber der sense-DNA bzw. sense-RNA und eine deutlich erhöhte Stabilität gegenüber der Nuclease Pl. Ferner konnte die Lipophilie der Oligonucleotide signifikant gesteigert werden. Die 2-Phenylethylphosphonate (D) und 2,4-Difluorbenzylphosphonate (M) sind zudem in der Lage die RNase H zu aktivieren. Alle dargestellten Antisense-Oligonucleotide wurden in einem zellfreien in vitro- sowie in einem in vitro-Zellkultur-Translations-Assay auf ihr lnhibierungspotential gegen die Hepatitis C Virus Genexpression getestet. Dabei zeigten die Benzylphosphonate (B), Phosphorthioate (Ps) und die 2-Phenylethylphosphonate (D) im zellfreien in vitro Testsystem hohe, spezifische Inhibierungsraten (>87%), bei einer Oligonucleotid-Konzentration von 5 µM. Auch erwiesen sich die arylalkylmodifizierten Antisense-Oligonucleotide, mit Ausnahme der 4-Phenylbutylphosphonate F, als sehr gute lnhibitoren der HCV-Genexpression in CCI13- und HepG2-Zellen.
MHC Klasse I Moleküle liegen im Endoplasmatischen Reticulum (ER) als Dimer bestehend aus einer schweren Kette mit Transmembrandomäne und einem 12 kDa-Protein, dem ß2-Mikroglobulin vor. Nach der Beladung des MHC-Klasse I-Moleküls mit einem antigenen Peptid, welche vorwiegend im Cytosol durch proteasomalen Abbau generiert und durch den Transportkomplex TAP ins ER transloziert werden, findet der Transport des MHC-Peptid-Komplexes zur Zelloberfläche statt. Dort wird das Antigen cytotoxischen T-Zellen präsentiert. An der Assemblierung und Reifung von MHC-Klasse I-Molekülen sind verschiedene Chaperone beteiligt. Eine wichtige Rolle beim Peptidbeladungsprozess von MHC-Klasse I-Molekülen spielt Tapasin. Dabei handelt es sich um ein 48 kDa, MHC-codiertes Typ I Transmembran-Glycoprotein aus der Immunglobulinsuperfamilie. Es verbrückt den TAP-Komplex mit MHC-Klasse I-Molekülen, hält unbeladene MHC-Klasse I-Moleküle im ER zurück und führt eine Qualitätskontrolle des gebundenen Peptids durch. Bei dieser Peptideditierung werden Peptide wieder selektiv aus der MHC-Bindungstasche entfernt, wenn sie mit einer niedrigen Affinität gebunden sind. Dadurch wird sichergestellt, dass keine leeren oder suboptimal beladenen MHC-Peptid-Komplexe an die Zelloberfläche gelangen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein System etabliert, mit dem der Einfluss von Tapasin auf die Peptidbeladung von MHC-Klasse I-Molekülen in vitro untersucht werden kann. Dazu wurde ein Verfahren zur heterologen Expression und Reinigung von funktionalem, löslichem Tapasin aus E. coli-Zellen aufgestellt. Weiterhin wurden ß2m und die schwere Kette von HLA-B*2705 heterolog in E. coli-Zellen exprimiert, isoliert und zusammen mit einem Reporterpeptid zum funktionalen HLA-B*2705 renaturiert. Bei Untersuchungen der Wechselwirkung zwischen Tapasin und HLA-B*2705-Molekülen konnte mittels der Oberflächen-Plasmonen-Resonanz-Spektroskopie eine direkte Interaktion zwischen Tapasin und unbeladenem HLA-B*2705 gezeigt werden. Detailliertere Untersuchungen zur Rolle von Tapasin bei der Peptidbeladung wurden mittels einer Gelfiltration gekoppelt mit der Fluoreszenzdetektion des Reporterpeptids durchgeführt. Dabei konnte festgestellt werden, dass unbeladene MHC-Klasse I-Moleküle in Anwesenheit von Tapasin stabilisiert werden und in einer Konformation gehalten werden, die eine Assoziation mit Peptid fördert. Weiterhin wurde gezeigt, dass durch Tapasin die Assoziationsrate für die Peptidbindung erhöht ist. Somit kann in Anwesenheit von Tapasin eine größere Anzahl an Peptiden auf eine stabile und hochaffine Bindung an MHC-Klasse I-Moleküle überprüft werden. In Experimenten mit bereits beladenen MHC-Klasse I-Molekülen konnte gezeigt werden, dass der neugebildetete Komplex auch nach erfolgter Peptidassoziation durch Tapasin stabilisiert wird. Dies ist vermutlich auf eine Erniedrigung der Dissoziationsrate für das Peptid zurückzuführen. Mit dem in dieser Arbeit etablierten Untersuchungssystem ist die Grundlage zu detaillierten Studien der Rolle von Tapasin bei der Peptidbeladung von MHC-Klasse I-Molekülen geschaffen.
Strukturelle und funktionelle Untersuchungen am Cytochrom-bc1-Komplex aus Paracoccus denitrificans
(2005)
Cytochrom bc-Komplexe sind zentrale Enzyme energietransduzierender Elektronen-transportketten. Anerkanntes Funktionsprinzip ist der Q-Zyklus; mechanistische Details insbesondere der Chinoloxidation am Qo-Zentrum sind noch unklar. Ein Verständnis des Qo-Zentrums ist auch von Interesse, da hier Inhibitoren in Form von Fungiziden und Malariatherapeutika wichtige Anwendung finden. In den vergangenen Jahren wurde eine Reihe mitochondrialer Komplexe kristallographisch charakterisiert, die Struktur eines bakteriellen Enzyms steht jedoch aus. Hauptziel dieser Arbeit war es, Ansätze zur Strukturaufklärung des bc1-Komplexes aus Paracoccus denitrificans (P.d.) zu finden, der als homologes Enzym mitochondrialer Komplexe bei einfacher genetischer Zugänglichkeit ein wichtiges Modellsystem darstellt. In der vorliegenden Arbeit wurde auf die Kristallisation des bc1-Komplexes aus S. cerevisiae aufgebaut, die mit Hilfe monoklonaler Antikörperfragmente (Fv) gegen die Rieske-Untereinheit (ISP) erreicht wurde; die Fv-Fragmente erleichtern die Ausbildung von Kristallkontakten. Die Epitopregion des Hefeenzyms wurde genetisch auf den bakteriellen Komplex übertragen, um dessen Ko-Kristallisation mit dem bereits verfügbaren Fv zu ermöglichen. Punktuelle Anpassungen führten zu keiner signifikanten Bindung, ein weitergehender Austausch des entsprechenden ISP-Bereichs verbesserte die Bindung hingegen deutlich. Die besten Ergebnisse konnten mit chimären Enzymen erzielt werden, bei denen die gesamte ISP-Ektodomäne durch das Hefe-Homologe ersetzt wurde. Aufbauend auf dieser Arbeit scheint die Fv-vermittelte Kristallisation des Enzyms ein greifbares Ziel. Eine komplementäre Strategie zielte auf die strukturelle Charakterisierung der Rieske-Ektodomäne (ISF). Das klonierte ISF wurde in E. coli überexprimiert, lag jedoch fast vollständig in inclusion bodies vor. Das ISF konnte in eine lösliche Form rückgefaltet werden, die anschließende chemische Rekonstitution zum Holo-Protein gelang jedoch nur mit einer Ausbeute von ~ 1 %. Die geringe Menge an löslichem ISF, die sich nach Expression in E. coli isolieren lässt, trägt kein [2Fe-2S]-Zentrum. Durch Koexpression der für die Biogenese von Eisen-Schwefel-Zentren relevanten Gencluster konnte die lösliche ISF-Fraktion in vivo in die Holo-Form konvertiert werden. Auch hier war aber die Gesamtausbeute für strukturelle Untersuchungen zu gering. Eine homologe Expression in P.d. war nur für das komplette ISP nachweisbar, nicht für das verkürzte ISF. Durch gerichtete Mutagenese konnte hier erstmals gezeigt werden, dass das bakterielle Rieske-Protein über den Tat-Translokationsweg in die Membran inseriert. Die Kristallstrukturen mitochondrialer bc1-Komplexe zeigen ein dimeres Enzym. Die Assoziation des bakteriellen Komplexes wurde in dieser Arbeit mit der analytischen Ultrazentrifugation untersucht, und auch hier wurde eindeutig ein Dimer nachgewiesen. Dynamische Messverfahren deuteten jedoch auf einen höheren Assoziationszustand hin. Es bleibt unklar, ob diese Diskrepanz durch Formparameter oder die Detergenzbindung begründet ist oder ob unter bestimmten Versuchsbedingungen möglicherweise Tetramere vorliegen. In situ ist der bc1-Komplex strukturell mit den Komplexen I und IV sowie dem Elektronenüberträger Cyt c552 assoziiert. Die Analyse verschiedener Deletionsstämme zeigte, dass Komplex I der Atmungskette durch diesen Superkomplex stabilisiert wird. Dieser Befund konnte kürzlich in anderen Arbeiten auch an menschlichen Mitochondrien bestätigt werden. Neben strukturellen Aspekten wurden am bc1-Komplex auch die H+-Translokation und die Chinonbindung untersucht. Da chemische Modifikationsexperimente zeigen, dass ein saurer Rest im ISP eine kritische Rolle für die Kopplung von H+-Translokation und Elektronentransport spielt, wurden durch gerichtete Mutagenese kombinatorisch saure Reste gegen entsprechende Säureamide ersetzt. Die biochemische Charakterisierung wurde nur für eine Fünffach-Mutante durchgeführt; diese erwies sich jedoch als zu instabil, um verlässliche Daten aus H+-Pumpexperimenten zu gewinnen. Die Charakterisierung der übrigen Mutanten scheint lohnenswert, da der relevante Aminosäurerest auch in anderen Arbeiten noch nicht identifiziert werden konnte. Der Gehalt des aufgereinigten Enzyms an spezifisch gebundenem Chinon wurde FTIR-spektroskopisch quantifiziert. Eine Stöchiometrie von ~ 3 Chinonmolekülen/Monomer stützt das double occupancy-Modell, demzufolge zwei Substratmoleküle am Qo-Zentrum binden; das dritte Chinon bindet am Qi-Zentrum. Partielle Extraktion des Chinons und Messungen bei verschiedenen pH-Werten zeigten, dass die Substratbindung mit Protonierung eines sauren Rests einhergeht. Möglicherweise handelt es sich dabei um Glu295 des Cytochrom b, das auf Basis der Kristallstrukturen als primärer H+-Akzeptor am Qo-Zentrum diskutiert wird. Aufbauend auf dieser Arbeit können die an der Chinonbindung beteiligten Reste durch Mutagenese identifiziert werden.
Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Formulierungsentwicklung eines nanopartikulären Arzneistoffträgers für Zytostatika zur Gewinnung einer „Drug Targeting“ Zubereitung. Im Fokus der Arbeit stand dabei die Stabilität der unterschiedlichen Zubereitungen. Die untersuchten Partikel waren dabei auf Basis von humanem Serumalbumin. Mittels einer etablierten Desolvatationsmethode ließen sich reproduzierbar Nanopartikel im Größenbereich von 200 nm herstellen. Zur Partikelgrößenbestimmung bediente man sich sowohl der hotonenkorrelationsspektroskopie (PCS) als auch der Analytischen Ultrazentrifugation (AUZ). Bei der Untersuchung verschiedener HSA-Chargen, stellte sich heraus, dass das Ausgangsmaterial einen Einfluss auf die Partikelgröße besaß. Nichtsdestotrotz waren die Partikelgrößenschwankungen aufgrund von unterschiedlichen HSA-Chargen gering. Durch Einlagerung von Doxorubicin in die Partikelmatrix kam es zu einer wesentlichen Partikelvergrößerung, so dass die resultierten Partikel eine Größe von etwa 400 nm aufwiesen. Die Inkorporation des Arzneistoffs in die Partikelmatrix war reproduzierbar und stabil. Auch der Einsatz von Serumalbumin aus rekombinanter Quelle erwies sich als geeignet um Nanopartikel herstellen zu können. Allerdings waren unbeladene Partikel aus diesem Material wesentlich größer als Nanopartikel, die aus dem Standardmaterial hergestellt wurden. Doxorubicinbeladene Partikel zeigten wiederum eine vergleichbare Größe wie Partikel aus HSA. Allerdings war die Beladung der rHSA-Nanopartikel geringer als die der SA-Nanopartikel. Dies zeigte sich besonders bei der geringeren Quervernetzung von 40%. Als Fazit lässt sich sagen, dass prinzipiell eine Herstellung von sowohl Leerpartikeln als auch Doxorubicin-beladenen Partikeln möglich war. Die Biodegradierbarkeit von Nanopartikeln ist eine wichtige Voraussetzung für einen therapeutischen Einsatz kleinpartikulärer Strukturen, damit diese nicht im Körper kumulieren. Zudem könnte bei nicht abbaubaren Partikeln die Idee der intrazellulären Freigabe des eingebetteten Arzneistoffs aus der Partikelmatrix nicht verwirklicht werden. Vorversuche haben gezeigt, dass sich Nanopartikel auf Basis von HSA mit einer Reihe von Enzymen abbauen lassen. Versuche, Nanopartikel aus rHSA enzymatisch abzubauen, führten zu vergleichbaren Abbaukinetiken wie bei Partikeln aus HSA. Zu den eingesetzten nzymen zählten Proteinase K, Protease, Trypsin, Pankreatin, Pepsin und Cathepsin B, die mit Partikel aus rHSA mit den Quervernetzungen 40, 60, 80 und 100% inkubiert wurden. Alle Abbaukinetiken zeigten dabei, dass die Abbaugeschwindigkeit vom Grad der Quervernetzung abhängig war. 40% quervernetzte Nanopartikel wurden am schnellsten, 100% quervernetzte Partikel am langsamsten enzymatisch degradiert. Die Abbauversuche mit Cathepsin B bei zwei verschiedenen pH-Werten zeigten, dass die Wahl des richtigen pH-Werts entscheidend für einen effektiven Abbau ist, denn nur bei einem pH-Wert von 5,4 wurden die Nanopartikel von Cathepsin B abgebaut. Im Gegensatz dazu, wurden die Nanopartikel bei pH 6,4 kaum degradiert. Des Weiteren wurden Beladungsversuche von HSA-Nanopartikeln mit Cisplatin durchgeführt. Dabei wurden im ersten Schritt Adsorptionsversuche an gelöstes HSA durchgeführt, da viele Arzneistoffe eine hohe Plasmaeiweißbindung besitzen, wenn sie sich im Blutkreislauf des Menschen befinden. Diese Tatsache sollte bei der Herstellung von arzneistoffhaltigen Nanopartikel auf Basis von humanem Serumalbumin ausgenutzt werden. Vor dem eigentlichen Desolvatationsprozess wurden gelöstes HSA und Cisplatin bei unterschiedlichen pH-Werten und für unterschiedliche Zeitintervalle inkubiert, um eine Adsorption des Cisplatins an das Protein zu erreichen. Dadurch soll es bei der anschließenden Desolvatation zu einer effektiveren Inkorporation des Arzneistoffs kommen. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass bei sauren pH-Werten die Adsorption schwächer ausfällt als bei einem pH-Wert von 8,0. Zudem war die Adsorption umso ausgeprägter, je länger die Inkubation stattfand. Bei einem pH-Wert von 8,0 führten steigende Konzentrationen an eingesetztem Cisplatin bei konstanter Menge an HSA, zu höheren Konzentrationen an adsorbiertem Arzneistoff. Prozentual gesehen, führten aber zunehmende Mengen an eingesetztem Cisplatin zu geringeren Adsorptionsraten. Als Fazit muss aber festgehalten werden, dass Cisplatin eine geringe Tendenz zur Adsorption an gelöstes HSA zeigte. Die Herstellung von Cisplatin-beladenen HSA-Nanopartikeln zeigte, dass die Desolvatation bei pH 8,0 zu guten Ergebnissen führte. Zum einen wiesen die erhaltenen Nanopartikel gute physikochemische Eigenschaften mit nahezu quantitativen Partikelausbeuten auf, zum anderen besaßen die Partikel eine hohe Beladungseffizienz. Dabei galt, je höher die eingesetzte Menge an Cisplatin war, umso mehr Cisplatin wurde in die Matrix der Partikel eingelagert. Die Dauer der zuvor stattfindenden Adsorption spielte dabei eine eher untergeordnete Rolle im Vergleich zu den Adsorptionsversuchen. Eine Erklärung für diese Beobachtung könnte sein, dass die Zugabe des Desolvatationsmittels Ethanol, in welchem Cisplatin sehr schwer löslich ist, zu einer verstärkten Interaktion zwischen Arzneistoff und Protein führt und diese Komponenten zusammen ausfallen, nahezu unabhängig von der zuvor stattfindenden Adsorptionsphase. Um die Idee einer „Drug Targeting“ Zubereitung umsetzen zu können, wurden mit Hilfe von Polyethylenglykol-Ketten sowohl Leerpartikel als auch arzneistoffbeladene Nanopartikel auf ihrer Oberfläche mit monoklonalen Antikörpern modifiziert. Als Verum wurde dabei Trastuzumab verwendet, als Kontrolle diente ein IgG-Antikörper von Sigma, der kein Target besitzt. Sowohl eine adsorptive Bindung als auch die kovalente Kopplung der Antikörper an die Oberfläche der nanopartikulären Strukturen konnte reproduzierbar durchgeführt werden. Dabei spielte es keine Rolle, ob die Partikel mit Arzneistoff beladen waren oder nicht. Trastuzumab zeigte ein hohes Maß an adsorptiver Bindung an die Oberfläche von HSA-Nanopartikeln, die bei dem Kontollantikörper nicht festgestellt werden konnte. Von allen Partikelpräparationen wurden die Partikelgröße, die Größenverteilung, das Zetapotential und die Partikelausbeute bestimmt. Durch das Aufbringen neuer Oberflächenstrukturen, kam es zu keiner wesentlichen Veränderung der Partikelgröße bzw. der Oberflächenladung. Durch die zahlreichen Umsetzungsschritte, die für eine Oberflächenmodifikation nötig sind, kam es bei Nanopartikeln ohne Arzneistoffbeladung zu einem Verlust an Partikelausbeute. Da die Doxorubicin-beladenen Partikel viel größer waren als Leerpartikel, ließen sie sich einfacher und effektiver abzentrifugieren, was in einem geringeren Partikelausbeuteverlust sichbar wurde. Da die Gefriertrocknung zu den Standardmethoden zählt Zubereitungen eine gute Haltbarkeit zu verleihen, wurden eine Reihe von nanopartikulären Zubereitungen der Lyophilisation unterzogen und im Hinblick auf ihre Langzeitstabilität unter verschiedenen Lagerungsbedingungen getestet. Dabei stellte sich heraus, dass es mittels Gefriertrocknung möglich war aus HSA-Nanopartikelsuspensionen einfach und reproduzierbar Lyophilisate herzustellen. Als geeignete Hilfsstoffe kristallisierten sich dabei die Zucker Sucrose, Trehalose, der Zuckeralkohol Mannitol und Emulgatoren wie Tween® 80 und Pluronic® F68 heraus. Als ungeeignet zeichnete sich der Einsatz von L-Arginin und eines Natriumphosphat-Puffers pH 8,0 ab. Larginin führte schon vor dem Gefriertrocknen zu einer Partikelvergrößerung, die nach der Lyophilisation noch ausgeprägter war. Puffer auf Basis von Natriumsalzen führen zu einem starken pH-Shift während des Gefriertrocknungsprozesses. Dies führte beim Einsatz des Phosphat-Puffers pH 8,0 zu einem starken Partikelwachstum. Gefriertrocknungsprozesse mit unterschiedlichen Geräten haben gezeigt, dass der Zusatz von Sucrose bzw. Trehalose oder Mannitol ab einer Konzentration von 2% (m/V) zu guten physikochemischen Eigenschaften der rekonstituierten Proben führte. Hilfsstoffkombinationen, wie sie in der Literatur beschrieben sind, waren für die Stabilisierung der nanopartikulären Strukturen nicht nötig. Die Langzeitlagerungsstabilitätsdaten der gefriergetrockneten HSA-Nanopartikel über 13 Wochen bei unterschiedlichen Temperatur- und Luftfeuchtigkeitsbedingungen zeigten eine Überlegenheit der Hilfsstoffe Sucrose und Trehalose im Vergleich zu Mannitol. Als geeignete Hilfsstoffkonzentration stellte sich hier ein 3%iger (m/V) Zusatz heraus. Versuchsansätze mit unterschiedlichen Gefriertrocknern und somit unterschiedlichen Prozessen zeigten, dass nicht nur die Auswahl der Hilfsstoffe, sondern auch die Bedingungen des Gefriertrocknungsprozesses Einfluss auf die Lagerungsstabilität hatten. Ein kontrollierter Prozess zeigte sich dabei gegenüber dem schnellen Einfrieren mittels Stickstoff als überlegen. Von Nanopartikelsuspensionen mit den Hilfsstoffen Trehalsoe, Sucrose und Mannitol wurden die Glasübergangstemperaturen bestimmt. Die Ergebnisse deckten sich im Wesentlichen mit den in der Literatur beschriebenen Daten, so dass schlussgefolgert werden kann, dass die HSA-Nanopartikel keinen wesentlichen Einfluß auf die Glasübergangstemperatrur hatten. Zusätzlich wurde die Restfeuchte der Lyophilisate direkt nach der Gefriertrocknung und nach 13 wöchiger Einlagerungszeit bestimmt. Die Proben wiesen direkt nach dem Prozess eine Restfeuchte von ungefähr 3% auf, durch Lagerung der Partikel bei erhöhter Luftfeuchtigkeit kam es zu einem Anstieg des Wassergehalts in den Proben. Mit den Hilfsstoffzusätzen Trehalose, Sucrose und Mannitol ließen sich auch Doxorubicin-beladene HSA-Nanopartikel gefriertrocknen. Dabei kam es nach der Rekonstitution dieser Partikel zu keinem Austreten des eingelagerten Arzneistoffs. Zusätzlich wurden oberflächenmodifizierte Partikel lyophilisiert. Dabei bestand die Modifikation zum einen aus Methoxypolyethylenglykol-Ketten. Zum anderen wurden über NHS-PEG-Mal Crosslinker kovalent monoklonale Antikörper auf die Oberfläche von HSANanopartikeln gebunden. Zusätzlich wurden auch HSA-NP in Suspension einer Untersuchung bezüglich Langzeitlagerungsstabilität unterworfen. Dabei wiesen auch HSA-Nanopartikel in Suspension bei verschiedenen Einlagerungsbedingungen eine hohe Stabilität auf. Partikel, die über einen Zeitraum von 210 Tagen eingelagert wurden, zeigten bei den Temperaturen 4°C, 20°C und 30°C im Hinblick auf Partikelgröße und Polydispersität kaum Veränderungen. Die Lagerung der Nanopartikel bei Minusgraden führte allerdings zu Mikropartikeln. Bei der Untersuchung der Partikelüberstände hinsichtlich herausgelöstem HSA zeigte sich, dass je höher die Lagerungstemperatur und je länger die Einlagerung war, umso mehr HSA löste sich aus der mittels Glutaraldehyd fixierten Matrix heraus. Bei den eingefrorenen Partikeln löste sich über die gesamte Lagerungszeit kein Protein aus den Nanopartikeln heraus. Zellkulturexperimente zeigten, dass im Gegensatz zu Kontrollzubereitungen, Nanopartikel, die an ihrer Oberfläche therapeutisch wirksame Antikörper trugen, spezifisch von Krebszellen aufgenommen wurden und im Zellinneren den eingebetteten Arzneistoff freisetzten. Daraus resultierte eine spezifische Toxizität dieser Zubereitungen gegenüber Tumorzellen. Dies ist ein erster Ansatz, um zeigen zu können, dass durch nanopartikuläre Trägersysteme die unerwünschten Nebenwirkungen der unspezifisch wirkenden Zytostatika reduziert werden können. In weiteren Versuchen, vor allem mit Hilfe von in vivo Versuchen muss gezeigt werden, dass das Partikelsystem stabil genug ist, ausreichend lang im Körper zirkulieren zu können. Nur so ist das Trägersystem in der Lage, sein Zielgewebe zu erreichen. Zudem müssen Tierversuche die in der Literatur beschriebene Anreicherung des Partikelsystems im Tumorgewebe verifizieren. Dies ist nur möglich, wenn die Nanopartikel in der Lage sind, das Gefäßsystem im Bereich des Tumorgewebes zu verlassen und anschließend in die Tumormasse einwandern können. Nur dann können die in den Zellkulturversuchen gezeigten Effekte greifen.
Qualität und Qualitätsmanagement in der universitären naturwissenschaftlichen Lehrerfortbildung
(2010)
Vor dem Hintergrund der politischen Entwicklungen in Hessen und der allgemeinen Debatte über Qualität im Bildungsbereich sollte im Lehrerfortbildungszentrum Chemie (lfbz-Chemie) der Universität Frankfurt am Main eine systematische Qualitätsentwicklung etabliert und dieses Vorhaben wissenschatflich begleitet werden. Die wissenschaftliche Arbeit besteht aus drei Säulen: - Eine erste, qualitative Studie sollte Qualitätskriterien und -indikatoren liefern. - In einer Fallstudie am lfbz-Chemie Frankfurt sollte die Einführung von Instrumenten des Qualitätsmanagements aus dem gewerblichen Weiterbildungsbereich beobachtet und bewertet werden. - Eine bundesweite Umfrage unter universitären Fortbildungsanbietern im naturwissenschaftlichen Bereich sollte sowohl die Struktur der anbietenden Institutionen als auch die allgemeine Einstellung der Befragten zum professionellen Qualitätsmanagement (QM) nach einem im gewerblichen Bereich geläufigen Modell (LQW) beleuchten. Die Qualitätsindikatoren und -kriterien fielen sehr spezifisch für die naturwissenschaftliche Lehrerfortbildung aus. Allein die drei folgenden Bereiche erfassen zwei Drittel aller Nennungen: die „Qualität der Teamer bzw. Moderatoren“, die „Fortbildungsgestaltung“ und die „Zielgruppenorientierung (Schulbezug)“. Nimmt man die Anzahl der Indikatoren und Kriterien pro Bereich als Maßstab, fokussieren die Befragten sehr stark auf Anforderungen, die die Professionalität des Personals betreffen. Zur Orientierung für die Qualitätsarbeit am lfbz-Chemie (Fallstudie) wurde das QM-Modell LQW 2 gewählt; als kleinere Instrumente kamen die Tabellen nach dem Vorbild der Balanced Scorecard (BSC) nach Kaplan und Norton sowie die Stärken-Schwächen-Analyse zum Einsatz. Als erstes Ergebnis der Fallstudie kristallisierten sich drei Arbeitsbereiche heraus: Personalorganisation, Evaluation und Innovationen. Diese Arbeitsfelder ergänzten die identifizierten Anforderungen an Fortbildung somit um Bereiche, die eher der organisatorischen Ebene zuzuordnen sind. Es ließ sich in der Fallstudie feststellen, dass ein ganzes Qualitätsmanagementmodell wie LQW 2 nur als Anregung für den einen oder anderen, als wichtig erachteten Bereich dienen konnte, während sich kleinere Instrumente eher als handhabbar erwiesen. Außerdem konnte postuliert werden, dass - ein persönlicheres Eingehen auf die Ziele und Aufgaben der einzelnen Personen im Sinne eines Total Quality Managements vermutlich zu besseren Ergebnissen geführt hätte als die Konzentration auf allgemeine Themen und die Orientierung am eher abstrakten Modell, - Erfolge sehr nachdrücklich kommuniziert werden müssen und - möglichst eine Person aus dem Stammpersonal für den Bereich Qualität verantwortlich sein sollte. Um ergänzend zur Fallstudie zu allgemeineren Schlüssen gelangen zu können, wurde eine Charakterisierung der universitären Fortbildungsanbieter mittels Clusteranalyse mit Daten der bundesweiten Umfrage durchgeführt. Sie zeigte vier Typen von Anbietern auf. Insgesamt fanden sich neben der Gruppe der großen Anbieter, zu denen auch das lfbz-Chemie gehört, nur vergleichsweise kleine Anbieter. Die in der Fallstudie erhaltenen Ergebnisse können somit nur eingeschränkt auf die meisten Anbieter übertragen werden. Insgesamt konnten Stärken und Schwächen der universitären Anbieter identifiziert werden, mit denen sich die universitäre naturwissenschaftliche Lehrerfortbildung von der gewerblichen Weiterbildung abhebt. Stärken lagen vor allem in den besonderen Kompetenzen, die an der Hochschule anzutreffen sind. Problemfelder lagen ausgerechnet hauptsächlich im Personalbereich. Als spezifische Schwächen der universitären Anbieter im Personalbereich kann z. B. die Stellung der Fortbildung als Nebenaufgabe oder der Verlust von Know-how durch die Fluktuation des Personals gelten. Auch allgemein kann ein Modell wie LQW 2 als Anregung für die Qualitätsarbeit in der universitären Lehrerfortbildung dienen, nicht jedoch umfassend umgesetzt werden. Die „kleineren“ Instrumente können dagegen eher als allgemein geeignet betrachtet werden. Während die „großen“ Anbieter durch verbesserte personelle Ressourcen für Aufgaben wie die Qualitätsarbeit unterstützt werden könnten, bietet sich für die „kleinen“ Anbieter eher die Unterstützung durch eine zentrale Stelle der Universität an, um die Fortbildungsanbieter doch noch in ein professionelles Qualitätsmanagement einbinden zu können.
Verglichen mit normal progredierenden HIV-1 Infizierten weisen Langzeit Nicht-Progredierende (LTNP), trotz chronischer Infektion und ohne antivirale Therapie, keinerlei Anzeichen einer klinischen Progression sowie stabil hohe CD4+-Zellzahlen und eine geringe Viruslast auf. Für diesen ungewöhnlichen Infektionsverlauf wurden mehrere virologische, genetische und immunologische Ursachen in der Literatur beschrieben. Anhand einer gut charakterisierten LTNP-Kohorte und einer Kontrollgruppe mit vergleichbaren klinischen Markern, wurde hier der Einfluss der einzelnen Faktoren, vor allem der humoralen Immun-antwort, auf den Infektionsverlauf analysiert. Die Analyse viraler und patienteneigener Gene zeigt, dass keiner der LTNP die ccr5Delta32 Mutation aufweist und auch der Vergleich der viralen Proteine Env, Nef, Rev, Tat und Vpr ergab keine zwingende Ursache für ein Ausbleiben der Progression. So zeigt sich zwar eine Anreicherung von Insertionen in den Variablen Schleifen (v.a. V1/V2) in den Env der LTNP-Viren, die Funktionalität der viralen Hüllproteine wurde jedoch mit Hilfe HIV-1 Env-rekombinanter Reporterviren aufgezeigt. Die HIV-1 Env-rekombinanten Reporterviren der LTNP unterschieden sich weder in ihrer Infektiosität, noch in der Effizienz der frühen Replikationsschritte von den korrespondierenden Viren der HIV-1 Kontrollpatienten, was einen entscheidenden Einfluss der Hüllproteine auf den Infektionsverlauf nahezu aus-schließt. Seitens der zellulären Immunantwort wurden in einigen LTNP HLA-B Typen identifiziert, die in der Literatur mit einem verlangsamten Infektionsverlauf und einer aus-geprägten zellulären Immunantwort in Verbindung gebracht wurden. Die Untersuchung der zellulären Immunantwort der LTNP (außerhalb dieser Arbeit) ergab jedoch keine Besonder-heiten, was den Einfluss der identifizierten HLA-B Typen auf den nicht-progredierenden Infektionsverlauf relativiert. Die humorale Immunantwort der Patienten wurde in umfassen-den Neutralisationsstudien mit Hilfe der HIV-1 Env-rekombinanten Reporterviren analysiert. Hierbei zeigte sich, dass die LTNP, verglichen mit den HIV-1 Kontrollpatienten, eine signifikant bessere humorale Immunantwort besitzen. Zusammen mit den zuvor gewonnenen Erkenntnissen legt dies einen entscheidenden Einfluss neutralisierender Antikörper am Nicht-Progredieren der LTNP nahe. Durch den Einsatz HIV-1 Env-spezifischer Peptidphagen wurde die humorale Immunantwort der zwei Patientengruppen weiter untersucht, wobei einige Unterschiede zwischen der Antikörperantwort der LTNP und HIV-1 Kontrollpatienten aufgezeigt wurden. Mit Hilfe dieser Peptidphagen wurde in Versuchstieren eine HIV-1 Env-reaktive Immunant-wort induziert. Die Fusion von Myelomzellen mit den B-Zellen der immunisierten Tiere und die anschließende Selektion führten zur Isolierung HIV-1 Env-spezifischer Hybridomazellen. Um sich den Vorteil der langjährigen Antikörperreifung in den Patienten selbst zu Nutze zu machen und gezielt breit-neutralisierende Antikörper zu isolieren, wurden, ausgehend von B-Zell mRNA der LTNP, patienteneigene scFv Phagen Display Bibliotheken erstellt. Die in vitro Selektion dieser scFv Phagen Display Bibliotheken mit unterschiedlichen HIV-1 Env Varianten führte zur Isolierung einiger HIV-1 Env spezifischer scFv-Phagen. Die Untersuchung der Bindungseigenschaften des reaktivsten scFv-Phagens zeigte eine breite Reaktivität gegen unterschiedliche HIV-1 Env Varianten, die durch HIV-1 positives Serum kompetiert werden konnte. Das Epitop dieses scFv-Phagens wurde in der Variablen Schleife 3 von HIV-1 Env lokalisiert. Diese Arbeit zeigt den entscheidenden Einfluss der humoralen Immunantwort für die nicht-progredierende Infektion der hier untersuchten LTNP und gibt erste Hinweise auf mögliche Ursachen für die außergewöhnlich breite Serumreaktivität. Die Identifikation charakteristischer Eigenschaften in der humoralen Immunantwort, sowie die Identifizierung der hierfür verantwortlichen Antikörper kann bei der Entwicklung aktiver oder passiver Vakzine von entscheidendem Vorteil sein oder als Ausgangspunkt für neue therapeutische Ansätze dienen.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuer Algorithmus für die automatische Optimierung einer NMR-Zuweisung des back bones in gelabelten Proteinen und seine Implementierung vorgestellt. Der Algorithmus ermöglicht eine Zuweisungsstrategie, die sich näher an der manuellen Vorgehensweise orientiert als vergleichbare Implementierungen von Lukin (LUK 11 ) [Lukin97] oder Leutner (PASTA) [Leutner98], da er die Entscheidung über konkurrierende Protospinsysteminterpretationen in die globale Optimierung der Zuweisung verlegt und die Benutzer nicht zwingt, sich vorzeitig auf eine Interpretation pro Aminosäure und Peak zu beschränken. Der Algorithmus löst daher nicht nur das Reihenfolgenproblem für einen schon vorgegebenen Satz von Protospinsystemen, sondern auch das Auswahlproblem zwischen verschiedenen, sich widersprechenden, Interpretationen der gleichen Peakgruppe. Durch das zusätzliche Auswahlproblem erhöht sich die Komplexität der Optimierungsaufgabe, der Lösungsraum wächst daher um mehrere Größenordnungen. Dies verlängert die Laufzeit für den einfachen RANDOM Algorithmus gegenüber einem vergleichbaren Reihenfolgeproblem. Es wurden daher verschiedene Methoden untersucht, um die Laufzeit wieder zu reduzieren. Die erzielten Verbesserungen führen nicht nur zu einer besseren Konvergenz, sondern ermöglichen auch erstmals eine echte parallele Implementierung des Algorithmus. Die algorithmischen Verbesserungen sind die Reduktion des Protospinsystemcaches und der GENETISCHe Algorithmus. Zusätzlich wurde eine verbesserte Konfiguration zur Kontrolle der Suboptimierer gefunden. Die Implementierung der zugrundeliegenden Datenstrukturen ermöglicht die Umsetzung zusätzlicher Nebenbedingungen für die Positionen der Protospinsysteme innerhalb der Zuweisung. Ein Beispiel für die Nebenbedingungen sind die knotenlokalen Filter und die Strukturfilter aus Kapitel 2. Ihre Effizienz wird am besten durch die Aminosäuretypenerkennung demonstriert, die die Größe des Lösungsraumes um 168 Größenordnungen für Trigger reduziert. Dadurch verringert sich die Laufzeit des RANDOM Algorithmus bis zu einem Faktor von 132. Für PASTA wurde in [Leutner98] statt dessen der umgekehrte Effekt auf die Laufzeit festgestellt. In ihrer Implementierung verlängert sich die Laufzeit auf das Doppelte. Der Unterschied kann nur durch eine unterschiedliche Nutzung der Aminosäuretypenerkennung im Protospinsystempool erklärt werden. PASTA nutzt diese Information anscheinend nicht, um den Pool und damit den Lösungsraum zu reduzieren, sondern nur bei der Bewertung der Zuweisung. Diese Konfiguration kann in RANDOM näherungsweise nachvollzogen werden, wenn man im AS-Cache jeder Aminosäure jedes Protospinsystem zuweist. Die Bewertung der Aminosäuretypen und den Austausch zwischen Pool und Individuum kann man aber nicht abschalten. Ein möglicher Nachteil der Reduktion des AS-Caches mittels der Aminosäuretypenerkennung ist die Möglichkeit, daß Aminosäuren mit untypischen Frequenzen der falschen Aminosäure zugewiesen werden oder nicht in den Cache für die theoretische Aminosäure aufgenommen werden. Um eine falsche Zuweisung durch die Reduktion auszuschließen oder zu überprüfen, kann man zuerst mit einem AS-Cache mit Typenerkennung optimieren und das Ergebnis in einer zweiten Optimierung mit einem AS-Cache ohne Typenerkennung nachoptimieren. Diese Möglichkeit wurde bei der Zuweisung von Trigger demonstriert. Für Trigger konnte durch den Wechsel des Caches gezeigt werden, daß auch mit dem reduzierten Cache eine stabile Zuweisung gefunden wird, die der Zuweisung ohne Aminosäuretypenerkennung weitgehend entspricht. Die Zuweisungen unterscheiden sich in Aminosäuren mit unsicherer Typenzuweisung. In Trigger wird nur ein Protospinsystem (Phe66,Ile67) aufgrund der Typeninformation von der Position im AS-Cache ausgeschlossen, der es in der manuellen und der Zuweisung ohne Reduktion zugewiesen wurde. In anderen Fällen führt erst die Typeninformation zur richtigen Zuweisung (zB. Thr60,Ile61), während die Zuweisung ohne Typenerkennung eine Fehlzuweisung erzeugt. Man sollte daher immer beide Versionen berechnen und dann vergleichen, da eine manuelle Zuweisung beide Defekte aufweisen kann, weil sie die Zuweisungsregeln nicht so strikt optimiert, wie es ein automatischer Algorithmus kann. Für beide Algorithmen wurde der Parameterraum untersucht und eine sowohl optimale als auch robuste Konfiguration gesucht. Dabei wurde der Einfluß jedes Parameters des Algorithmus auf die Laufzeit bis zur Konvergenz zum globalen theoretischen Maximum bestimmt. Bei RANDOM waren hauptsächlich die Zusammensetzung des Aktionsprofils und die minimale und maximale Lebenszeit der veränderten Zustände, minTTL und maxTTL, für die Laufzeit entscheidend. Alle drei kontrollieren, welche Pfade durch den Lösungsraum ab einem Zustand erlaubt sind. Die gleiche Untersuchung wurde auch für die Parameter der zu berechnenden Probleme (Proteine) durchgeführt. Für den Datensatz wurde sowohl der Einfluß der Proteingröße, des maximalen CA Abstandes zwischen den Peaks der benachbarten Aminosäuren und der Aufbereitung des Protospinsystemcaches auf die Laufzeit, als auch der Einfluß eines unvollständigen Datensatzes auf die Konvergenz untersucht. Der Algorithmus zeigte sich dabei sehr robust gegen fehlende Peaks, da bis zu 45% der theoretischen Peaks fehlen können, ohne daß die Konvergenz zum theoretischen Optimum verloren geht. Unterhalb von 55% hängt die Übereinstimmung der gefundenen Lösung mit der theoretischen Lösung von der Zusammensetzung der gebildeten Protospinsystemfragmente ab. Proteingröße und maximaler CA Abstand haben dagegen großen Einfluß auf die Laufzeit. Während die Parametrisierung des RANDOM Algorithmus sich auf die Untersuchung des Wertebereichs der Kontrollparameter beschränken kann, muß die Parametrisierung des GENETISCHen Algorithmus auch die verschiedenen Crossover Operatoren und die Kontrolle der Suboptimierer umfassen. In Kapitel 3 wurden die verschiedene Crossover Algorithmen und unterschiedliche Konfigurationsvarianten für den Suboptimierer im GENETISCHen Algorithmus untersucht. Die aus der Literatur bekannten Crossover Operatoren waren dabei den spezialisierten G Operatoren unterlegen. Auch die Varianten elitär und statistisch, die keinen genetischen Austausch zwischen verschiedenen Individuen zulassen, waren den speziellen Operatoren immer unterlegen. Selbst kleine Anteile eines Genaustausches bewirkten eine Verbesserung der Laufzeit und die Qualität der Lösung. Dabei verbesserte sich besonders die Konvergenz durch den genetischen Austausch. Die speziellen G Operatoren übertragen nur die Differenz der Eltern statt, wie im klassischen Crossover, blind irgendeinen zusammenhängenden Bereich zu kopieren. Dadurch vermeiden sie es, hauptsächlich identische Bereiche zu kopieren, sondern übertragen nur Protospinsysteme, die sich in den Eltern unterscheiden. Außerdem wurde die Effizienz der speziellen Operatoren noch weiter gesteigert, indem die übertragenen Informationen mit Hilfe von Filtern gezielt auswählt wurden. Die übertragene Differenz wird dazu aufgrund ihrer Nachbarn und der Verknüpfung mit den Nachbarn ausgewählt. Mit unterschiedlichen Filtern wurden so Bereiche mit einem unterschiedlich hohen lokalen Optimierungsgrad für die Übertragung ausgesucht. Die Laufzeituntersuchungen in Kapitel 3 zeigen, daß es eine Grenze für die Effizienzsteigerung durch die Übertragung lokal voroptimierter Bereiche gibt. Während es beim Wechsel von unkoordinierten, punktförmigen Übertragungen (s1) zur Übertragung von kurzen Strecken aus benachbarten Protospinsystemen, mit oder ohne Verknüpfung (s2), noch zu einer geringen Verbesserung der Laufzeit und der Konvergenz kommt, führt die zusätzliche Koordinierung der übertragenen Nachbarn durch die Nebenbedingung der Verknüpfung in den s3 Algorithmen sogar zu einer geringen Verschlechterung der Laufzeit. Die Gründe für die Verschlechterung konnten nicht eindeutig nachgewiesen werden. Möglicherweise verringert sich die Anzahl der kopierbaren Bereiche durch die zusätzlichen Nebenbedingungen so sehr, daß nicht genügend unterschiedliche Differenzen für die Übertragung in die neuen Individuen gebildet werden. Die neuen Individuen erhalten dann hauptsächlich die gleichen neuen Gene. Dadurch kann es zu einer Verarmung des genetischen Pools, d.h. zum Verlust der genetischen Diversität in der Population kommen. Die neuen Individuen suchen dann identische Bereiche im Lösungsraum ab und nehmen dadurch die lokale Optimierung doppelt vor. Dadurch verschwendet diese Konfiguration CPU Zeit auf schon untersuchte Bereiche. Neben der direkten Übertragung zusammenhängender Bereiche gibt es noch einen weiteren Faktor der die spezialisierten Operatoren, gegenüber dem klassischen Crossover, verbessert. Die Differenzbildung im Crossover nimmt auf die Konkurrenz um die Peaks zwischen den Protospinsystemen keine Rücksicht. Dadurch befinden sich die neuen Individuen zuerst meist im illegalen Teil des Zustandsraumes S n . Nach dem Crossover wird daher ein Teil der ursprünglichen Protospinsysteme des neuen Individuums durch den Reparaturmechanismus gelöscht und dadurch schon optimierte Bereiche zerstört. Daher kommt dem Reparaturmechanismus für illegale Zustände die entscheidende Rolle zu, denn er erzwingt die Neuberechnung der Positionen, die vor dem Crossover durch einen Konkurrenten eines übertragenen Protospinsystems belegt waren. Die ehemaligen Zuweisungen in den zerstörten Bereichen sind dabei nur über die Resourcenkonkurrenz mit den im Crossover neu injizierten korreliert. Das Crossover mit Zerstörungen erweitert dadurch den erreichbaren Lösungsraum, statt ihn, wie beim klassischen Crossover, auf den Raum zwischen den Eltern einzuschränken! Die Zerstörungen sind für die Optimierung daher von Vorteil. Außerdem zeigte sich in Kapitel 3, daß für die speziellen Operatoren eine besondere Konfiguration des Suboptimierers besonders effizient ist, die den einzelnen Individuen nur die CPU-Zeit zuteilt, die sie, effizienter als ihre Konkurrenten, zu einer Verbesserung nutzen können. Diese Verteilung der Rechenzeit wird durch die sogenannte Ratenbegrenzung erreicht. Die veränderlichsten Individuen erhalten dabei die meiste Rechenzeit. Dies sind normalerweise die Individuen, die in einem der letzten genetischen Zyklen neu erzeugt wurden. Sobald ein Individuum in ein tiefes lokales Optimum, d.h. eine Sackgasse, geraten ist, erhält es weniger Rechenzeit, da seine Verbesserungsrate unter den Schwellwert sinkt. Dadurch darf man den einzelnen Individuen eine höhere maximale Laufzeit zuteilen, da sie sie nur nutzen können, wenn sie sich währenddessen verbessern. Die Kombination "ratenbegrenzt" mit Operator Gs2p2A verbraucht trotz des komplexeren Algorithmus weniger CPU-Zeit bei gesteigerter Konvergenzwahrscheinlichkeit und geringerer paralleler Laufzeit als jede andere Konfiguration. Sie ist damit die beste bekannte Konfiguration für GENETISCH. Im Praxistest in Kapitel 5 mit dem Proteinabschnitt Trigger M bestanden zwischen den automatischen Zuordnungen und der manuellen Zuweisung nur geringe Unterschiede. Die Unterschiede zwischen den Optimierungen mit unterschiedlichen Caches entstehen hauptsächlich in den Bereichen, die an einem Ende keinen verknüpften Nachbarn haben oder bei denen die manuelle Zuweisung unsicher ist, wie im Bereich 10 - 20. Durch die automatische Zuweisung konnte die manuelle Zuweisung sogar an einigen Stellen vervollständigt werden. Sie ist daher einer manuellen Zuweisung gleichwertig. Darüber hinaus entsteht bei der automatischen Zuweisung immer eine Dokumentation über die Verwendung der Peaks, so daß man ungenutzte Spinsysteme leichter finden kann. Der genetische Algorithmus kann optimal auf einem Netzwerkcluster implementiert werden, daher bietet sich ein echte parallele Implementierung an. GENETISCH braucht dabei keine besondere Hardware, wie Vektorrechner, shared memory oder besonders schnelle Netzwerkverbindungen, sondern kann auf einer Gruppe von normalen Rechnern mit einer üblichen Ethernet100 Netzwerkverbindung implementiert werden, da nur zum Austausch der Individuen, bzw. ihrer Differenz, eine Kommunikation zwischen den Rechnern notwendig ist. Dadurch kann die Kommunikation auf wenige KB alle paar Sekunden beschränkt bleiben. GENETISCH sollte außerdem leicht zu skalieren sein, da man die Anzahl der Individuen leicht an größere Probleme anpassen kann. Eine echte parallele Implementierung erlaubt daher sowohl die Rechenzeit für komplexere Problem auf wenige Minuten zu reduzieren als auch größere und mehrdeutigere Spektren zuzuweisen. Außerdem kann man die Wahl der Prozessparameter selbst auch dem selben Optimierungsprozeß unterwerfen, der bisher für die Optimierung der Zuweisung verwendet wurde. Dadurch sollte es möglich sein, die Optimierungsparameter, analog dem Profil der Abkühlung im simulated annealing, dynamisch an die Phase der Optimierung anzupassen und den Individuen immer die optimalsten Optimierungsparameter zu bieten, ohne diese vorher von Hand suchen zu müssen. Diese Veränderung erfordert aber eine große Anzahl an Individuen und damit die echte parallele Implementierung.
Natrium/Protonen-Austauscher sind integrale Proteine biologischer Membranen und aufgrund ihrer funktionalen Abhängigkeit von einem elektrochemischen Gradienten der Klasse der Sekundärtransporter zugeordnet. Sie spielen eine essentielle Rolle sowohl in der Adaption von Bakterien an eine saline, alkalische Umgebung, als auch in der Regulation des intrazellulären pH- und Natriumhaushalts in Eukaryonten. Aufgrund der medizinischen Relevanz, unter anderem im Rahmen in der Behandlung des Herzinfarkts, besteht großes Interesse an der Struktur und den biochemischen Charakteristika des im Menschen ubiquitär vorkommenden Natrium/Protonen-Austauschers NHE1. Die heterologe und funktional aktive Produktion eukaryontischer Membranproteine stellt jedoch immer noch eine enorme Herausforderung dar, bei der sich das auf dem Semliki Forest Virus basierende Expressionssystem als gut geeignet erwiesen hat. Da die Überexpression von NHE1 mittels verschiedener eukaryontischer Expressionssysteme bisher kein kristallisationsfähiges Material liefern konnte, sollte in dieser Arbeit die heterologe Gewinnung von NHE1 mit dem Semliki Forest Virus Expressionssystem ermöglicht werden. Das Semliki Forest Virus Expressionssystem wurde auf Basis eines Vektorkonstrukts mit GFP zur späteren Übertragung der Parameter auf die Produktion von NHE1 etabliert. Konstrukte von NHE1 mit N- und C-terminalem Affinitäts-Tag wurden erfolgreich kloniert und zur Infektion von BHK-21 Zellkulturen eingesetzt. Dabei konnte beobachtet werden, dass der N-Terminus abgespalten wird und wahrscheinlich als Signalpeptid zum Einbau in die Membran dient. Das Protein wurde im Endoplasmatischen Retikulum lokalisiert, wo die Glykosylierung zum Transport in die Plasmamembran unterbleibt, was auf eine Interferenz mit der Virusinfektion zurückgeführt wurde. Eine Infektion der Zellen mit dem Semliki Forest Virus hat neben einem bereits bekannten massiven Anstieg des intrazellulären Natriumgehalts eine starke Alkalinisierung des Zytoplasma zur Folge. Ähnliches ist bisher über die Infektion von Zellen mit dem Poliovirus bekannt und stellt dort ein Schlüsselelement in der Sicherstellung der viralen Replikation dar, was auch für das Semliki Forest Virus zu gelten scheint. Die Expression von NHE1 konnte im 8 Liter-Maßstab optimiert und sowohl die Präparation als auch die Solubilisierung mit verschiedenen Detergenzien erfolgreich eingeführt werden. NHE1 erfährt jedoch bereits in vivo einen erheblichen proteolytischen Abbau, der sich während der Membranpräparation und Aufreinigung fortsetzt und zu einer Fragmentierung führt, die trotz des Einsatzes unterschiedlicher Kultivierungszeiten, Detergenzien, Additive oder Proteaseinhibitoren in vivo als auch in vitro nicht in einem Maße reduziert werden konnte, welches zur Gewinnung von kristallisationsfähigem Material erforderlich gewesen wäre. Es muss empfohlen werden einen in vivo Ansatz zu etablieren, um die proteolytische Degradation zu unterdrücken. Da die Virusreplikation nicht erforderlich ist, wäre Bafilomycin als Inhibitor der V-Typ ATPase geeignet, um die intrazelluläre Alkalinisierung und somit wahrscheinlich den Abbau von NHE1 zu verhindern. Ebenso erscheint der Einsatz von MG-132 zur spezifischen Inhibierung des Proteasoms Erfolg versprechend, was aber wegen hoher Kosten praktisch kaum in Frage kommt. Da man trotz individuell gelagerter Unterschiede zwischen den einzelnen Natrium/Protonen-Austauschern von einem ähnlichen Prinzip in Regulation und Transport ausgeht, wurden Strukturuntersuchungen mit Hilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie am bakteriellen Natrium/Protonen-Antiporter NhaA aus Escherichia coli durchgeführt, um die strukturelle Basis der pH-Wahrnehmung und die Translokation von Natrium in das Periplasma besser zu verstehen. Die vorliegende Röntgen- und EM-Struktur repräsentieren den inaktiven Zustand, weshalb der eigentliche Ablauf des Transportvorgangs bisher biochemisch herzuleiten war, da bislang keine Kristalle im aktiven Zustand gezüchtet werden konnten. Durch die in situ Inkubation von 2D-Kristallen konnten aktive Zustände des Proteins direkt auf dem EM-Netz induziert und kryo-elektronenmikroskopisch festgehalten werden. Einzelne Datensätzen wiesen Reflexe bis zu 5 Å auf. Aus den angefertigten Projektionsdichte- und Differenzkarten ergaben sich pH- und Natrium-abhängige Konformationsänderungen. Die Röntgenstruktur wurde mit Hilfe des Molekularen Ersatzes in die EM-Struktur eingepasst und diente der Zuordnung und Interpretation der beobachteten Zustände als Basis. Die pH-abhängige Konformationsänderung wurde einem mit der funktional wichtigen Helix 9 assoziierten Bereich zugeordnet, welcher durch die Röntgenstruktur nicht definiert ist und wahrscheinlich die fehlenden Aminosäuren des regulatorisch relevanten N-Terminus enthält. Die beobachtete Konformationsänderung stellt das Entstehen einer besser geordneten Struktur dar und geht mit der pH-regulierten Aktivierung von NhaA zwischen pH 6 und 7 einher, weshalb dieser Bereich des Proteins zumindest als Bestandteil des sogenannten pH-Sensors betrachtet werden kann. Nach der vollständigen Aktivierung durch den pH-Wert, welche der folgenden Natrium-abhängigen Konformationsänderung vorauslaufen muss, konnte beobachtet werden, dass die Präsenz von Natrium im Rahmen der Ionentranslokation eine Bewegung des periplasmatischen Teils von Helix 4 induziert. Es wäre interessant, eine tiefergehende und genauere Charakterisierung der beobachteten Konformationsänderungen durch die Erstellung einer dreidimensionalen EM-Dichtekarte zu ermöglichen. Des Weiteren hat die eingehendere Untersuchung des röntgenkristallographischen Monomers nach der Einpassung in das physiologisch vorliegende Dimer der EM-Struktur sowohl eine für Membranproteine neuartige „Joint β-Sheet“ Dimerisierungsdomäne im Periplasma, als auch eine Verzahnung von Helix 7 und 9 an der Monomer-Monomer-Grenze aufgezeigt. Diesen Charakteristika kommt wahrscheinlich eine tragende Rolle in der Dimerisierung von NhaA zu, was durch weitere Untersuchungen im Rahmen einer Mutagenesestudie unter Einbeziehung der periplasmatischen β-Haarnadelstrukturen überprüft werden sollte.
Glycin ist ein wichtiger inhibitorischer Neurotransmitter im zentralen Nervensystem. Um die glycinerge Erregungsübertragung zu sichern, muss die Glycinkonzentration an Synapsen präzise reguliert werden. Hierfür sind die Glycintransporter, GlyT1 und GlyT2, verantwortlich. Der GlyT2 ist ein präsynaptisches Protein, das in glycinergen Nervenendigungen nahe der aktiven Zone lokalisiert ist. Das über den Transporter aus dem extrazellulären Raum aufgenommene Glycin steht anschließend für die Befüllung der synaptischen Vesikel durch den vesikulären inhibitorischen Aminosäuretransporter (VIAAT) zur Verfügung. Die GlyT2-Defizienz führt in Mäusen zu einem letalen Phänotyp und verdeutlicht die Notwendigkeit eines hochaffinen Glycinaufnahmesystems in glycinergen Neuronen. Um mögliche Mechanismen zu untersuchen, die zur präzisen Lokalisation des GlyT2 in der Präsynapse führen, wurde das PDZ-Domänenbindungsmotiv (PDZ-DBM) am extremen C-Terminus bzw. die lange N-terminale Domäne dieses Transporters deletiert. Durch biochemische und pharmakologische Analysen von transfizierten HEKT-Zellen konnte gezeigt werden, dass der Verlust des PDZ-DBM oder der N-terminalen Domäne die Proteinexpression, die Glykosylierung und die Transportaktivität des GlyT2 nicht beeinflussten. Längere Deletionen des N-Terminus (ΔAA1-184) setzten jedoch die Effizienz der Glycinaufnahme herab und ergaben im Vergleich zum wt-Protein einen um 60% reduzierten vmax-Wert, während die apparente Glycinaffinität (KM-Wert) unverändert blieb. Lokalisationsstudien und Oberflächenbiotinylierungen zeigten GlyT2 wt-Immunreaktivität an der Plasmamembran, die sich qualitativ und quantitativ nicht von denen der N- und C-terminalen Mutanten unterschied. Das PDZDBM und die N-terminale Domäne spielen folglich in der Prozessierung und der Transportfunktion des GlyT2 eine untergeordnete Rolle. Möglicherweise reduziert die fast vollständige Deletion der N-terminalen Domäne jedoch die Stabilität des GlyT2. In transfizierten hippocampalen Neuronen wurde der Einfluss des PDZ-DBM und der N-terminalen Domäne hinsichtlich der GlyT2 Lokalisation analysiert. Die transfizierten Mutantenproteine zeigten eine diffuse Verteilung mit partiellen Anreicherungen von GlyT2-Immunreaktiviät. Das wt-Protein kolokalisierte mit Synaptophysin, exzitatorischen synaptischen Markern wie PSD95 und mit den inhibitorischen Markern Gephyrin und VIAAT. Nach Deletion des PDZ-DBM hingegen zeigte der GlyT2 eine um ca. 50% verminderte Kolokalisation mit allen untersuchten synaptischen Markern. Damit konnte hier erstmals eine Funktion des PDZ-DBM für die Anreicherung von GlyT2 an Synapsen gezeigt werden. Mit N-terminalen Deletionsmutanten transfizierte hippocampale Neurone wiesen kolokalisierende GlyT2ΔN-PSD95-Puncta zumeist in MAP2-positiven Neuriten auf, während das wt-Protein zumeist in MAP2-negativen Neuriten kolokalisierte. MAP2 ist ein mikrotubuli-assoziertes Protein, das in Dendriten, aber nicht in Axonen, auftritt und somit eine Unterscheidung derselben ermöglicht. Aufgrund der Überexpression in transfizierten Neuronen war die GlyT2-Immunreaktivität aber sowohl in axonalen als auch dendritischen Neuriten zu beobachten. Zusätzlich zu der in größeren Clustern gefundenen synaptischen GlyT2ΔN-Immunreaktivität war eine Färbung hauptsächlich in sehr kleinen Strukturen (<= 1 μm) nachzuweisen, die Transportvesikeln entsprechen könnten. Dies ist mit einem längeren Verbleib der Deletionsmutanten in intrazellulären Strukturen erklärbar. Im Hippocampus wird GlyT2 endogen nur sehr schwach in einer Subpopulation von putativ glycinergen Neuronen exprimiert. Um die Lokalisation der N-terminalen GlyT2-Proteine in Zellen zu untersuchen, die eine hohe endogene GlyT2-Expression aufweisen, wie spinalen Neuronen, die sich aber nur schlecht transfizieren lassen und in Kultur keine adulte GlyT2-Lokalisation aufweisen, wurden BAC-transgene Mäuse generiert, die myc-markierte GlyT2ΔN-Proteine unter Kontrolle des GlyT2-Promotors exprimieren. Der Vorteil von BAC-transgenen Mauslinien ist, dass sie aufgrund der Verwendung des endogenen Promotors das Transgen nur schwach überexprimieren. Founder-Mäuse, in denen der jeweilige modifizierte BAC-Klon (mGlyT2 wt, ΔAA14-174 oder ΔAA14-184) integriert wurde, wurden identifiziert und mit C57BL/6J-Mäusen verpaart, um so transgene Mauslinien zu etablieren und die Lokalisation der mutierten GlyT2-Proteine zu analysieren. Zusätzlich wurde eine BAC-transgene Cre-Mauslinie generiert, die die Cre-Rekombinase in GlyT2-positiven Zellen exprimiert. Durch die Verpaarung mit konditionalen oder transgenen Mauslinien soll mit diesen GlyT2/Cre-Mäusen die Funktion einzelner Genprodukte in glycinergen Zellen untersucht werden. In dieser Arbeit wurden außerdem die Glycinrezeptor (GlyR) α-Untereinheiten (UE) in GlyT2-defizienten Mäusen untersucht. GlyT2 -/- Tiere sterben in der zweiten postnatalen Woche nach der Geburt und zeigen einen starken neuromotorischen Phänotyp. Da in demselben Zeitraum ein Austausch der embryonalen α2- durch die adulte α1-UE erfolgt, wurde die Entwicklung der α1- und der Gesamt-α- Immunreaktivität in Rückenmarksschnitten von wt und GlyT2 -/- Tieren analysiert und miteinander verglichen. Die Daten zeigen, dass der α-UE-Austausch in den GlyT2-defizienten Tieren ähnlich wie in wt Tieren erfolgt. In α1-GlyRs ist die Öffnungszeit des aktivierten Kanals kürzer als bei α2-GlyRs. Zusammen mit der geringeren Ausschüttung an Glycin aufgrund der GlyT2-Defizienz lässt sich so das Auftreten des Krampf-Phänotyps der GlyT2 -/- Mäuse nach erfolgtem UE-Austausch erklären.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, MALDI-Massenspektrometrie als robuste Analysenmethode für die quantitative Analyse niedermolekularer Verbindungen aus komplexen biologischen Matrizes zu etablieren. Zu Beginn der Arbeit wurden drei typische Fragestellungen im Bereich der Lebensmittelanalytik, der medizinischen Forschung und der klinischen Chemie ausgewählt, um die Methodik anhand dieser Modellsysteme zielgerichtet zu entwickeln und zu bewerten. Für jede dieser Fragestellungen wird routinemäßig ein hoher Probendurchsatz verlangt und damit werden hohe Anforderungen an die Probenvorbereitung gestellt, da diese einfach, schnell, reproduzierbar, Matrix-tolerant und automatisierbar sein muss um die Weiterentwicklung zur Hochdurchsatzanalytik zu erlauben.
Der quantitative Nachweis von Melamin und seinen Derivaten wurde aufgrund des Aufkommens von Milchprodukten, die mit diesen Verbindungen kontaminiert waren, ein wichtiger Bestandteil der Analytik dieser Lebensmittel. Insbesondere an diesem Beispiel zeigte sich der Vorteil des Einsatzes von MALDI-Massenspektrometrie zur Analyse kleiner Moleküle. Aufgrund der höheren Toleranz gegenüber Puffern und Salzen konnte die Probenvorbereitungszeit der für die FDA entwickelten Methode zur Quantifizierung von Melamin in Milchpulver mittels LC-ESI von ca. 140 min auf 90 min reduziert werden, da auf die zeitaufwendige Flüssigchromatographie verzichtet werden konnte. So wurde Melamin mit einem LLOQ von 0,5 ppm quantifiziert, was unterhalb der Vorgaben der WHO (2,5 ppm in Milichpulver und 1 ppm in Babynahrung) lag. Cyanursäure, ein Derivat von Melamin welches für die Bildung schwerlöslicher Komplexe in der Niere mitverantwortlich gemacht wird, konnte ebenfalls mit der entwickelten MALDI-MS Methode quantifiziert werden. Allerdings war die ermittelte Bestimmungsgrenze mit 15 ppm um den Faktor 30 schlechter als bei Melamin. Die Nachweisgrenze bei MALDI-MS ist stark von der MALDI-Matrix abhängig und die Verwendung von Sinapinsäure war eine gute Kompromisslösung, um die Analyten in einem Spot im positiven und negativen Reflektormodus zu analysieren. Allerdings wurde diese Matrix zur Analyse von Analyten im positiven Reflektormodus entwickelt. Bislang wurden nur wenige Matrizes für MALDI-MS im negativen Reflektormodus beschrieben, um z.B. Säuren besser nachweisen zu können. Forschung in diesem Bereich wird neue Möglichkeiten zur Detektion negativ geladener kleiner Moleküle ergeben.
Des Weiteren wurden im Rahmen dieser Arbeit auch Lösungen für klinische Fragestellungen wie etwa den Nachweis von Methylphenidat im Plasma und Gehirn von Ratten oder der Dried Blood Spot Analytik entwickelt. Bei beiden Methoden wurde jeweils nur eine einfache Flüssig-Flüssig-Extraktion zur Probenvorbereitung angewendet und sie ließen sich sehr gut auf Realproben übertragen.
Methylphenidat konnte im Plasma im Konzentrationsbereich von 0,1-40 ng/mL und im Hirnhomogenat im Konzentrationsbereich von 0,4-40 ng/mL quantifiziert werden, was gut im Konzentrationsbereich der Realproben von mit Methylphenidat gefütterten Ratten lag. Dazu standen das Plasma und die Gehirne von fünf Ratten zur Verfügung. Es wurde eine lineare Korrelation zwischen der MPH-Konzentration im Gehirnhomogenat und im Plasma gefunden, was basierend auf den bis dato bekannten Literaturergebnissen ein zu erwartendes Ergebnis war, aber zukünftig mit einer größeren Anzahl von Versuchstieren verifiziert werden sollte. Während der Methodenentwicklung war auch bei diesem Projekt die Auswahl der MALDI-Matrix ausschlaggebend für den Erfolg der Messungen. Im MALDI-Massenspektrum interferierte das Signal des Natriumaddukts von CHCA mit dem Signal von MPH. Für dieses Problem kamen zwei mögliche Lösungen in Betracht. Erstens die Quantifizierung mit ClCCA als MALDI-Matrix, da hier keine Interferenzen auftraten. In ersten Vorversuchen konnte MPH so in einem Konzentrationsbereich von 1-48 ng/mL mit einer exzellenten Linearität von R2=0,9992 quantifiziert werden. Eine zweite mögliche Problemlösung war die Verwendung von Tandem-Massenspektrometrie. Hierzu wurden Fragmentionen-Massenspektren der überlagerten Signale aufgenommen. MPH und der verwendete interne Standard MPH-d9 zeigten dabei spezifische Fragmentionensignale, über die quantifiziert wurde. Da die Sensitivität um den Faktor 100 im Vergleich zu MS-Spektren von CHCA und ClCCA gesteigert werden konnte, wurde die weitere Methodenentwicklung basierend auf der Tandem-Massenspektrometrie mit der MALDI-Matrix CHCA durchgeführt. Überdies sind MS/MS-Versuche unter Verwendung von ClCCA als MALDI-Matrix für kleine Moleküle sehr erfolgsversprechend und sollten in weiteren Forschungsarbeiten durchgeführt werden.
Die Dried Blood Spot Technik als alternative Probenvorbereitung bietet eine Reihe von Vorteilen, wie etwa den einer einfacheren Lagerung und eines einfacheren Transports einer großen Menge von Proben. Darüber hinaus werden nur wenige Mikroliter Blut verwendet, was vorteilhaft ist bei z B. klinischen Studien oder dem Therapeutic Drug Monitoring. Diese Art der Probennahme ist somit eine perfekte Ergänzung für weitere quantitative Analysen von Methylphenidat in Rattenblut. Den Ratten würden nur wenige Mikroliter Blut entnommen werden, was ihr Überleben sichert und der Transport der Proben auf dem Postweg wäre wesentlich einfacher. Um eine allgemein verwendbare DBS-MALDI-MS-Methode zu entwickeln, wurden neben Methylphenidat auch bekannte Analyten aus dem Bereich des Dopings sowie Lamotrigin, Coffein und Theophyllin als Beispiele für das Therapeutic Drug Monitoring verwendet. Es wurden verschiedene Lösungsmittel zur Extraktion eingesetzt, wobei sich eine Kombination aus Methyl-tert-Butylether und Ethanol, sowie Aceton als am besten geeignet erwies. Einige Analyten wie Coffein, Theophyllin und Lamotrigin wurden bis zu einer Konzentration von 0,5 μg/mL quantifiziert. Diese Bestimmungsgrenze ist bei Analyten aus dem Bereich des Dopings wie z.B. Salbutamol, Methylphenidat oder Clenbuterol, deren therapeutisch wirksame Plasmakonzentration im Bereich von wenigen Nanogramm pro Milliliter Blut liegt, um den Faktor 15-500 zu hoch. Diese Analyten waren bis zu einer Konzentration von 5 μg/mL im Blut mittels MALDI-MS problemlos nachweisbar. Um die Sensitivität zu erhöhen, ist es allerdings sinnvoll, die Extraktion zukünftig für die einzelnen Analyten zu optimieren, sie mittels Festphasenextraktion oder LC anzureichern und MS/MS-Spektren aufzunehmen. Für die Analyten Coffein, Theophyllin und Lamotrigin, deren therapeutisch wirksame Plasmakonzentration im ein- bis zweistelligen Mikrogramm-pro-Milliliter Bereich liegt, eignete sich die entwickelte Methode sehr gut. Es wurde eine Methodenvalidierung durchgeführt, wobei die validierten Parameter den Vorgaben der FDA entsprachen.
Da die Auswahl der MALDI-Matrix bei den verschiedenen Methodenentwicklungen jeweils ein kritischer Faktor war, wurden abschließend eine Auswahl von Analyten mit einer Molekülmasse bis ca. 600 Da mit verschiedenen MALDI-Matrizes präpariert. Ein Großteil der Analyten wurde am sensitivsten mit ClCCA nachgewiesen. Im Rahmen dieser Versuche wurde auch erstmals ein Strukturanalogon von ClCCA, und zwar ClCCA-Tetrazol, als alternative MALDI-Matrix eingesetzt, bei welchem die Carboxylgruppe durch einen Tetrazolring ausgetauscht wurde. Diese zeigte eine sehr homogene Kristallisation und für einige Analyten eine bis zu Faktor 3 höhere Signalintensität im Vergleich zu ClCCA. Außerdem war auffällig, dass einige Analyten unter bestimmten Präparationsbedingungen wie z B. der Graphite Supported Preparation sensitiver mittels MALDI-MS nachweisbar waren. Bei anderen Analyten verschlechterten sich die Analysenergebnisse. Graphit verändert stark die Kristallisation der MALDI-Matrix und es wird vermutet, dass sich dies auf den Einbau der Analyten in die Matrixkristalle auswirkt. Es konnte bislang aber noch nicht abschließend geklärt werden, wie genau die Präparation der Proben Einfluss auf den Einbau der Analyten in die Matrix nimmt. Eine Untersuchung dieser Phänomene sollte daher Gegenstand weiterer Forschungsprojekte sein.
Zusammenfassend stellt die MALDI-Massenspektrometrie eine schnelle und robuste Methode zur Quantifizierung einer Vielzahl kleiner Moleküle in komplexen biologischen Matrizes dar.
In der vorliegenden Arbeit wurden marine Schwämme der Gattungen Agelas und Stylissa von den Florida Keys und Bahamas untersucht. Dabei lag das Hauptinteresse neben der Isolierung und Strukturaufklärung der Schwamminhaltsstoffe vor allem auf der ökologischen Funktion der Sekundärstoffe. Die Chemie dieser Schwämme ist sehr charakteristisch und wird von bromierten Derivaten der Pyrrol-2-carbonsäure bestimmt. Insgesamt wurden 17 bromierte Pyrrol-Alkaloide isoliert, von denen die Verbindungen N-alpha-(4-Brompyrrolyl-2-carbonyl)-L-homoarginin (isoliert aus Agelas wiedenmayeri), Bromsceptrin (Agelas conifera), N-Methyl-dibromisophakellin (Stylissa caribica), Monobromisophakellin (Agelas sp.) und Sventrin (Agelas sventres) erstmals beschrieben wurden. Die Strukturaufklärung erfolgte mit spektroskopischen Methoden (2D NMR, MS, IR, UV, CD) und durch Vergleich mit literaturbekannten Daten. Im Fall von N-alpha-(4-Brompyrrolyl-2-carbonyl)- L-homoarginin gelang die Bestimmung der absoluten Konfiguration erst nach Synthese der Verbindung und anschließendem Vergleich der CD-Spektren von Naturstoff und synthetischer Verbindung. Insgesamt wurden die Dichlormethan/Methanol-Rohextrakte von 125 Schwämmen der Gattung Agelas, die an verschiedenen Standorten der Bahamas gesammelt wurden, mittels HPLC qualitativ untersucht und die Hauptsekundärmetaboliten quantitativ bestimmt. In sämtlichen Schwämmen konnten Brompyrrol-Alkaloide nachgewiesen werden, wobei sich drei charakteristische Inhaltsstoffmuster zeigten. Während die Rohextrakte von 71 Proben der Schwämme Agelas cervicornis, Agelas clathrodes, Agelas dispar und Agelas wiedenmayeri durch die beiden Alkaloide Oroidin und 4,5-Dibrompyrrol-2-carbonsäure gekennzeichnet sind, bestimmen dimere Pyrrol-Imidazol-Alkaloide vom Sceptrin- und Ageliferin-Typ, wobei Sceptrin stets dominiert, das Inhaltsstoffmuster von 50 untersuchten Proben der Schwämme Agelas cerebrum, Agelas conifera, Agelas dilatata und Agelas sceptrum. Ein drittes Inhaltsstoffmuster wurde für vier Proben des Schwamms Agelas sp. gefunden, welches durch bromierte Pyrrol-Alkaloide vom Phakellin- und Isophakellin-Typ charakterisiert ist. Zur Untersuchung der ökologischen Bedeutung von Brompyrrol-Alkaloiden wurde die fraßabschreckende Wirkung gegenüber Fischen getestet. In Aquarium- und Freilandversuchen konnte gezeigt werden, daß die fraßhemmende Wirkung der Rohextrakte gegenüber Fischen im Fall von Agelas conifera auf bromierte Pyrrol-Alkaloide vom Sceptrin- und Ageliferin-Typ bzw. Isophakellin-Typ für Stylissa caribica zurückzuführen ist. Erstmals wurden Reinsubstanzen vom Sceptrin-, Ageliferin- und Isophakellin-Typ getestet. Sceptrin und N-Methyl-dibromisophakellin sind bei natürlichen Konzentrationen fraßabschreckend. In weiteren ökologischen Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß die bromierten Pyrrol-Alkaloide Oroidin, 4,5-Dibrompyrrol-2-carbonsäure und Sceptrin neben einem fraßabschreckenden Potential gegenüber Fischen auch besiedlungshemmend auf Fäulnisbakterien wirken. Bromierte Pyrrol-Alkaloide erfüllen somit mindestens zwei ökologische Funktionen, die das Überleben von Agelas-Schwämmen sichern und sie zu einer der erfolgreichsten Arten in Lebensgemeinschaften karibischer Riffe machen.
Paläobotanische Untersuchungen an Euramerischen Kohlenbecken haben an der Westfal/Stefan-Grenze in früheren Arbeiten einen deutlichen, weitgehend klimatisch gesteuerten Florenwechsel erkennen lassen. Desweiteren wurden in Kohlen aus dem Saar/Nahe-Becken beginnend mit dem obersten Westfal D erstmals Diageneseprodukte von Isoarborinol bzw. Fernen/Fernenol nachgewiesen, für die Koniferen, Cordaiten oder Farnsamer als mögliche Bioproduzenten vorgeschlagen wurden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten die Arboran-/Fernanderivate MAPH, MATH, DAPH 1 und DAPH 2 in den Gesamtextrakten von Kohlen und Sedimenten aus dem Stefan des Saar/Nahe-Beckens durchgängig identifiziert werden, während die Verbindungen im Westfal lediglich in Proben aus dem obersten Westfal D auftraten. Folglich sind die Arboran-/Fernanderivate tatsächlich in besonderem Maße dazu geeignet, den Florenwechsel an der Westfal/Stefan-Grenze auf molekularer Basis zu beschreiben. Um einzugrenzen, zu welcher Pflanzengruppe die Bioproduzenten der Ausgangsverbindungen der Arboran-/Fernanderivate gehören, wurden isolierte Makrofossilien verschiedener Pflanzengruppen aus verschiedenen Euramerischen Kohlenbecken organisch-geochemisch analysiert. Dabei konnten MATH, MAPH, DAPH 1 und DAPH 2 in nahezu allen Gesamtextrakten fossiler Cordaiten-Reste identifiziert werden. In den Extrakten von Sediment-Vergleichsproben, die in unmittelbarer Nähe der Cordaiten-Reste entnommen wurden, konnten die Verbindungen dagegen nicht bzw. nur in vergleichsweise geringen Konzentrationen identifiziert werden. Ebenso waren die Arboran-/Fernanderivate in den Gesamtextrakten fossiler Koniferen-Reste sowie in den Extrakten verschiedener Farnsamerarten (Alethopteris, Dicroidium, Lescuropteris, Macroneuropteris, Neuropteris) nicht enthalten. Lediglich in der extrahierbaren organischen Substanz einiger fossiler Odontopteris-Reste aus dem Blanzy-Montceau-Becken (Frankreich) konnten MAPH und MATH (sowie teilweise DAPH 1 und DAPH 2) identifiziert werden. Allerdings ist das Auftreten der Verbindungen in diesen Odontopteris-Extrakten wahrscheinlich auf eine Überprägung des Pflanzenmaterials durch das umgebende Sediment zurückzuführen, da die Verbindungen in den Sediment-Vergleichsproben in höheren bzw. ähnlichen Konzentrationen enthalten sind. Insgesamt sind daher in den oberkarbonischen Kohlenbecken die Cordaiten als einer, möglicherweise sogar als „die“ Bioproduzenten der Ausgangsverbindungen der Arboran-/Fernanderivate MATH, MAPH, DAPH 1 und DAPH 2 anzusehen. Die deutlich negativere Kohlenstoffisotopie (-31,68 ‰) einer Sedimentprobe aus der Bohrung Wemmetsweiler-Nord, die gleichzeitig die höchsten Arboran-/Fernanderivat-Konzentrationen enthält, weist auf eine verstärkte mikrobielle Überarbeitung des organischen Materials hin. Fluoreszenz- und Auflichtmikroskopie-Untersuchungen zeigen zudem einen erheblichen, ebenfalls auf bakterielle Aktivität hindeutenden Bituminitanteil, während Relikte von höheren Landpflanzen nur geringfügig vertreten sind. Dies legt den Schluß nahe, daß die Arboran-/Fernanderivate in dieser Probe nicht von Cordaiten, sondern alternativ von Bakterien (oder Algen) abstammen. In diesem Fall ist Isoarborinol als biologischer Vorläufer anzunehmen und es tritt eine deutliche Verschiebung der Kohlenstoffisotopie-Werte zu negativeren Werten auf. Bei den Cordaiten ist eine derartige Isotopenverschiebung dagegen nicht zu beobachten, so daß für MATH, MAPH, DAPH 1 und DAPH 2 Fernen bzw. Fernenol als biologische Vorläufer anzunehmen sind.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit unterschiedlichen Aspekten der Faltung von Tendamistat, einem aus 74 Aminosäuren bestehenden a-Amylase lnhibitor aus Streptomyces tendae. Bei der oxidativen Rückfaltung des Tendamistats konnten bisher drei kinetische Phasen (t1, t2 und t3) identifiziert werden. Die mittlere (t2) bzw. langsame (ti) kinetische Phase, resultiert als Folge einer cis/trans lsomerisierung um eine der drei Xaa-Pro Bindungen im Tendamistat. Wie im ersten Teil dieser Arbeit gezeigt werden konnte, entsteht die prolinabhängige lsomerisierungsreaktion während der Rückfaltung (t3) als Folge einer trans -> cis Umlagerung um die A1a49-Pro50 Amidbindung nach Entfaltung des Proteins. Der Nachweis einer solchen lsomerisierung gelang auf rekombinantem Weg, durch gezielten Austausch der einzelnen Proline. Im Gegensatz dazu resultiert die mittlere kinetischen Phase (t2) als Folge einer Prolin-unabhängigen cis/trans-lsomerisierungsreaktion um mindestens eine vorhandenen nicht-Prolinbindungen im Protein. Diese Schlußfolgerung konnte durch Vergleich mit zahlreichen Literaturdaten und Experimenten weiter gestützt werden. Tendamistat ist damit das erste Protein in der Literatur, bei dem es gelang, eine solche Prolin-unabhängige lsomerisierungsreaktion experimentell nachzuweisen. Wie mit Hilfe von weiteren Substitutionsexperimenten im zweiten Teil der Arbeit gezeigt werden konnte, tragen hydrophobe Oberflächencluster entscheidend zur Stabilisierung des lnhibitors bei. Die dabei gemessenen Stabilisierungsbeiträge stehen in einem linearen Verhältnis zum Seitenkettenvolumen der eingeführten Aminosäurereste (Alanin << Valin << Isoleucin). Hierdurch ließ sich zeigen, daß der stabilisierende Einfluß solcher Cluster im Wesentlichen auf das Vorhandensein von hydrophoben Wechselwirkungen zurückzuführen ist. Für die Faltung von Proteinen, die wie das Tendamistat ausschließlich aus ß-Faltblättern bestehen, spielt die Bildung von ß-Hairpinstrukturen eine entscheidende Rolle Die in dieser Arbeit untersuchten ß-Hairpinmutanten L14A bzw. N25A zeigen im Vergleich zum Wildtyp eine extreme Destabilisierung der ß-Faltblattstruktur. Durch Vergleich der Aktivierungsenergien (DeltadeltaGD-TS) mit den freien Enthalpien (DeltadeltaG0N-D) konnte die strukturelle Entwicklung des ß-Hairpins im Übergangszustand an den beiden Positionen 14 bzw. 25 mitverfolgt werden (~-Wert Analyse). Entgegen den Erwartungen zeigen diese Untersuchungen, daß beide Positionen im Übergangszustand noch weitestgehend solvatisiert vorliegen. Damit scheint die nativ-ähnliche Zusammenlagerung des ersten ß-Hairpins erst nach Erreichen des Übergangszustands stattzufinden. Alle in dieser Arbeit vorgelegten Daten über die Faltung des alpha-Amylase lnhibitors sind konsistent mit dem Nukleations-Kondensations Modell. Analog der Tröpfchenbildung bei unterkühlten Gasen kommt es nach dem kollabieren der Proteinkette als Reaktion auf die veränderten Lösungsmittelbedingungen zur intramolekularen Suche nach Nukleationsstellen. Der Übergangszustand wird erreicht, wenn sich eine kritische Zahl stabilisierender Kontakte (unspezifische Nukleation) ausbilden konnte. Ob an einem solchen Nukleationskern stets bestimmte Seitenketten beteiligt sind (spezifische Nukleation), bleibt an dieser Stelle noch offen.
Bei der Expression einer Phospholipase A2 aus Soja in Aspergillus oryzae (Probe PL-1007), Trichoderma viride (Probe PL-1008) und Pichia pastoris (Probe PL-1035) wurde neben der erwarteten Phospholipaseaktivität auch eine deutliche Lysophospholipaseaktivität beobachtet. Eine Trennung dieser Aktivitäten war nur mittels einer Free-Flow-Elektrophorese kurzzeitig möglich, bevor sich in jeder Fraktion wieder das ursprüngliche Aktivitätsverhältnis zwischen Phospholipase und Lysophospholipase einstellte. Zur näheren Untersuchung und Charakterisierung dieser Enzymsysteme wurden für einen gaschromatischen Aktivitätstest hochspezifisch substituierte Substrate eingesetzt, die eine parallele Bestimmung der Phospholipase- und Lysophospholipaseaktivitäten ermöglichten. So konnte gezeigt werden, dass nicht in allen Organismen eine Phospholipase A2 exprimiert wird, sondern es in Pichia pastoris (Probe PL-1035) zur Expression einer Phospholipase A1 kommt. Im Falle der Probe PL-1007 konnte die beobachtete Lysophospholipaseaktivität durch Versuche mit veränderten Substratverhältnissen zwischen Lysophospholipase- und Phospholipasesubstrat einem separaten aktiven Zentrum zugeschrieben werden. Durch elektrophoretische Trennungsversuche konnte gezeigt werden, dass es sich nicht nur um separate aktive Zentren, sondern um verschiedene Enzyme handelt. Die Tatsache, dass sich das Aktivitätsverhältnis nach der Trennung selbständig wieder einstellt, lässt das Vorliegen von Faltungsisomeren vermuten. Bezüglich ihrer katalytischen Eigenschaften weisen alle drei Enzymsysteme eine große Ähnlichkeit auf. Sowohl die Phospholipase- wie auch die Lysophospholipaseaktivitäten sind erst ab einer Reaktionstemperatur von über 70°C nicht mehr nachweisbar. Das Aktivitätsmaximum wurde in allen drei Fallen zwischen 45°C und 55°C beobachtet. Auch die pH-Bereiche in denen eine maximale enzymatische Aktivität zu beobachten ist, liegen mit pH 3,6 (PL-1007) bis pH 4,3 (PL-1035) für die Phospholipaseaktivitäten und pH 4,3 (PL-1007 / PL-1008) und pH 4,6 (PL-1035) in ähnlichen Bereichen. Die Aktivität der untersuchten Enzymsysteme zeigt jedoch im beobachteten pH-Bereich von pH 3 bis pH 5 nur eine geringe pH-Abhängigkeit. Deutlichere Unterschiede konnten jedoch für die Substratspezifitäten nachgewiesen werden. Die Phospholipasen A2 zeigen tendenziell höhere Umsätze bei Substraten mit C 12:0 bis C 16:0 Fettsäureresten, während die Phospholipase A1 aus Probe PL-1035 maximale Umsätze bei C 18:0 Fettsäureresten aufweist. Bei allen Enzymproben jedoch bleiben die Umsatzraten der ein- bis mehrfach ungesättigten Fettsäurereste hinter denen der gesättigten zurück. Lediglich bei der Probe PL-1007 sind die Aktivitätsunterschiede zwischen gesättigten und ungesättigten Substraten nicht signifikant. Neben der Untersuchung der katalytischen Eigenschaften konnte im Rahmen dieser Arbeit die in der Literatur mehrfach aufgestellte These der Hemmung der Phospholipaseaktivität in Gegenwart von Uteroglobin bestätigt werden. Ein Hemmungsmechanismus aufgrund direkter Wechselwirkung der Enzyme konnte ausgeschlossen werden. Vielmehr konnte zweifelsfrei bewiesen werden, dass der Hemmungsmechanismus bei den hier eingesetzten Enzymsystemen auf einer Bindung des für die Phospholipasereaktion essentiellen Ca2+ durch das Uteroglobin zurückzuführen ist.
Protonen gekoppelter Elektronentransfer ist ein zentraler Bestandteil der chemiosmotischen Theorie. Die Beschreibung seiner Natur ist aufgrund seines transienten Charakters eine komplexe Aufgabe. Elektrometrische Messungen stellen hier eine große Hilfe in der Erfassung von Ladungsverschiebungen dar. Sie erlauben die zeitliche Beschreibung des Elektronen- und Protonentransportes, der mit kaum einer geeigneten Methode beobachtet werden kann, und geben Einblick in deren molekularen Mechanismus. Diese Technik wurde hier an drei verschiedenen Membrankomplexen der Atmungskette angewandt: der Cytochrom c Oxidase (COX) aus Paracoccus denitrificans, der Quinol-Fumarat-Reduktase (QFR) aus Wolinella succinogenes und dem bc(1)-Komplex aus Saccharomyces cerevisiae. Hinsichtlich der experimentellen Vorgehensweise für kinetische Untersuchungen stellte sich ein übergreifendes Problem. Neben einer schnellen Aktivierung der Enzymsysteme bedurfte es eines definierten Ausgangszustands. Ziel dieser Arbeit war das Etablieren von Bedingungen, die elektrometrische Messungen am bc(1) und der QFR erlauben, sowie die Fortführung dieser Methodik am bereits vorhandenen System der COX. Cytochrom c Oxidase Elektrometrische Untersuchungen an der COX wurden basierend auf Vorarbeiten weitergeführt. Insbesondere die Ladungsverschiebungen nach Photoreduktion ausgehend vom völlig oxidierten Zustand rückten in den Fokus. In diesem Schritt wird ein Proton aufgenommen, während Häm a vom angeregten Zustand eines Rutheniumkomplexes reduziert wird. Dieses Verhalten ist unabhängig vom heterogenen Ausgangszustand der COX, er wird jedoch durch eine Änderung des pH-Wertes beeinflußt. Der heterogene Ausgangszustand im O-E-Übergang wurde in einem sequentiellen Modell diskutiert. Dabei wurde auf die Diskrepanz zwischen den elektrometrischen und den publizierten spektroskopischen Messungen hingewiesen. Während spektroskopisch die Cu(A)-Oxidation und Häm a-Reduktion in einer Phase verliefen, wurde in den elektrometrischen Messungen eine zweite deutlich langsamere Phase für den Protonentransfer beobachtet. Ein sequentielles Reaktionsmodell führte hier zu einem Widerspruch. Die Auswirkungen auf die Natur der Kopplung von Häm a und dem aufgenommenen Proton wurden diskutiert. Die Kinetik der Ladungsverschiebung wurde detailliert anhand der Temperaturabhängigkeit und des Isotopeneffektes untersucht und mit den Ergebnissen aus den Messungen an einem thermophilen Enzym, der ba(3)-Oxidase aus Thermus thermophilus, verglichen. Quinol-Fumarat-Reduktase Für eine schnelle Aktivierung der QFR wurde ein caged Fumarat synthetisiert, das nach Photolyse zu einer schnellen Erhöhung der Fumaratkonzentration führte. Die neue Substanz wurde bezüglich einer möglichen Verwendung für die QFR charakterisiert. Die Freisetzung erfolgte mit einer Zeitkonstante von 0,1 ms und aktivierte die QFR nur im photolysierten Zustand. Aufgrund der Photochemie der metallischen Kofaktoren in der QFR konnten jedoch keine kinetischen Messungen durchgeführt werden. Da die photochemisch induzierten Elektronenbewegungen in der QFR mit zunehmender Wellenlänge abnahmen, wurde eine neue Substanz vorgeschlagen, die im sichtbaren Spektralbereich gespalten werden kann. bc(1)-Komplex Der bc(1)-Komplex kann wie die COX durch einen Rutheniumkomplex aktiviert werden. Ein dimerer sowie ein an Cytochrom c gekoppelter Rutheniumkomplex wurde hierfür anhand von Literaturdaten synthetisiert, und die Verbindungen wurden hinsichtlich ihrer Eigenschaften nach Lichtanregung charakterisiert. Für die elektrometrischen Messungen wurde der bc(1)-Komplex in Proteoliposomen rekonstituiert, und der Ausgangszustand des bc(1)-Komplexes unter reduktiven und oxidativen Bedingungen eingestellt. Mit dem dimeren Rutheniumkomplex wurden elektrometrische Experimente durchgeführt, die zu zwei Phasen in der Spannungsantwort führten. Die Daten wurden zusammen mit den publizierten spektroskopischen diskutiert. Dabei wurde eine schnelle elektrogene Phase einem Elektronentransfers zwischen Häm c(1) und dem Eisen-Schwefel-Cluster des Rieske-Proteins zugeordnet. Eine langsamere Phase erwies sich sensitiv gegenüber Antimycin und spiegelt Vorgänge unter der Kontrolle der Q(i)-Bindungsstelle wider.
Tunikaten produzieren eine Vielzahl an cytotoxischen und antimikrobiellen Verbindungen, die ihnen in ihrem Ökosystem zu überlebenswichtigen Vorteilen verhelfen. Wegen ihrer strukturellen Diversität und ihrer spezifischen Eigenschaften haben bislang einige dieser Sekundärstoffe Eingang in die pharmazeutische Industrie gefunden. Ziel der vorliegenden Arbeit war eine umfassende Untersuchung des chemischen Potentials benthischer Ascidien der Nordsee. Die Eigenschaften der organischen Ascidienextrakte wurden anhand von vier Bioassays beschrieben. Die Assays fungierten gleichzeitig als Wegweiser zur Isolierung der aktiven Sekundärmetaboliten, der sich eine Strukturaufklärung mit spektroskopischen Methoden (NMR, MS, IR) anschloss. Es wurden Tests auf bewuchshemmende, antimikrobielle, cytotoxische und enzymhemmende Eigenschaften durchgeführt. Eingesetzt wurden organische Extrakte von 13 solitären und koloniebildenden Ascidienarten der nördlichen und südlichen Nordsee. In allen vier Assays zeigten mehrere oder alle Ascidienarten Aktivität. Es ließen sich keine Hinweise auf eine mit der Wuchsform der Arten korrelierte biologische Aktivität sammeln. In einem Freilandversuch zur Untersuchung der besiedlungshemmenden Wirkung der Extrakte konnte gezeigt werden, dass einige Ascidien eine chemische Abwehr von Algensporen oder Epibionten aufweisen, die artspezifisch unterschiedlich stark ausgeprägt ist. Alle Ascidienarten bewiesen antimikrobielle Aktivität, es ergaben sich aber sowohl in der Hemmhofbreite als auch in der Anzahl der gehemmten Bakterienstämme große artspezifische Unterschiede. Auffallend war, dass deutlich mehr Gram-positive sowie marine Bakterienstämme als Gram-negative bzw. nicht-marine Bakterienstämme inhibiert wurden. Im Gegensatz zur antimikrobiellen Aktivität wurden in den Assays zur Cytotoxizität und zur spezifischen Enzymhemmung lediglich bei jeweils vier Ascidienarten positive Effekte festgestellt. Durch die spezifische Anfärbung von Zellorganellen konnten morphologische Veränderungen, die durch die Ascidienmetaboliten in den Mausfibroblasten induziert wurden, sichtbar gemacht und der Einfluß der Extrakte auf das Cytoskelett und spezifische Zellfunktionen dokumentiert werden. Im Protein-Tyrosin-Kinase-Assay führte eine Bioassay-guided Fractionation von Extrakten der Ascidie Dendrodoa grossularia zur Isolierung der aktiven Substanz. Über spektroskopische Methoden sowie den Vergleich mit Literaturdaten konnte der enzymhemmende Metabolit als das Guanidinostyren Tubastrin identifiziert werden. Tubastrin wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals in Tunikaten nachgewiesen. Der Metabolit zeigte als Reinsubstanz nur geringe cytotoxische Effekte und keine antimikrobiellen Eigenschaften. Als weitere Metaboliten der Ascidien Dendrodoa grossularia und Ascidiella aspersa wurden Homarin, Betain, Adenosin und Inosin identifiziert. Keiner dieser Substanzen konnte in der vorliegenden Arbeit eine biologische Aktivität zugeordnet werden. Während Betain, Adenosin und Inosin Funktionen innerhalb des Primärmetabolismus besitzen oder als Zwischenprodukte in Synthesewege eingebunden sein können, stellt Homarin einen Sekundärmetaboliten dar, der in einer Vielzahl von marinen Organismen unterschiedliche Funktionen erfüllt. Seine Aufgabe in Tunikaten muss durch weitere Untersuchungen geklärt werden. Dass antimikrobielle Aktivität bei allen Ascidienarten gefunden wird, lässt auf eine grundlegende Bedeutung prokaryontischer Abwehr schließen. Die Unterschiede in der Stärke der Effekte aller Bioassays legen nahe, dass jede Ascidienart eine eigene Gesamtstrategie zur Verteidigung gegen Bewuchs und Fraßfeinde ausgebildet hat. Die aus den Laborversuchen erhaltenen Daten verdeutlichen eine weitreichende biologisch-chemische Aktivität von Aplidium punctum, Dendrodoa grossularia und Didemnum candidum, die neben der antimikrobiellen auch starke cytotoxische und/oder enzymhemmende Wirkung gezeigt haben. Die Lokalisation der aktiven Substanzen im Tier sowie eingehendere Versuche zur molekularen Wirkungsweise sind notwendig, die beobachteten Aktivitäten umfassend zu deuten und ihre Nutzbarkeit unter pharmakologischen Gesichtspunkten zu evaluieren.
In der vorliegenden Doktorarbeit wurden die folgenden fünf biochemischen Fragestellungen zu Enzymen und deren Wechselwirkungen mit ihren Substraten mit NMR spektroskopischen Methoden untersucht: (1) Die spontane Bildungsrate von NCarboxymethanofuran (Carbamat) aus CO 2 und Methanofuran im Gleichgewicht und die Beeinflussung der Geschwindigkeit durch FormylmethanofuranDehydrogenase aus Methanosarcina barkeri wurden über 2D ProtonenaustauschSpektroskopie (EXSY) bestimmt. Mit Hilfe der berechneten Geschwindigkeitskonstanten und der bekannten physiologischen Konzentrationen von CO 2 und Methanofuran konnte erstmals gezeigt werden, daß die spontane Carbamatbildungsrate ausreicht, um die in vivoCO 2 Reduktionsraten in methanogenen Archaea erklären zu können. (2) Die Konformation von N 5 ,N 10 Methylentetrahydromethanopterin (Methylen H 4 MPT) in Anwesenheit und in Abwesenheit H 2 bildender MethylenH 4 MPTDehydrogenase aus Methanothermobacter marburgensis wurde über TransferNOEMessungen bestimmt. Es wurde nachgewiesen, daß die Bindung zu einer Konformationsänderung des Substrats führt, welche die ReSeitenStereospezifität des Enzyms erklären kann. (3) Die Stereospezifität des Hydridtransfers von MethylenH 4 MPT auf NADP , katalysiert von NADPabhängiger MethylenH 4 MPTDehydrogenase aus Methylobacterium extorquens AM1, wurde NMRspektroskopisch untersucht. In Übereinstimmung mit der unter (2) entwickelten Theorie zum Übergangszustand des Hydridtranfers wurde gefunden, daß auch der Transfer auf NADP ReSeitenspezifisch in Bezug auf MethylenH 4 MPT verläuft. Zusätzlich wurde gezeigt, daß das Enzym das Hydrid auf die ReSeite von NADPH überträgt. (4) Die spontane Rate der Kondensationsreaktion von Glutathion und Formaldehyd zu SHydroxymethylglutathion wurde mit EXSYMessungen bestimmt. In Zellextrakten des methylotrophen Proteobakteriums Paracoccus denitrificans wurde eine Enzymaktivität nachgewiesen, die diese Reaktion beschleunigt. Bislang wurde vermutet, daß es eine solche Enzymaktivität nicht gibt. Mit EXSYMessungen konnte nicht nur diese Enzymaktivität nachgewiesen werden, sondern es gelang auch das verantwortliche Enzym, das Glutathion abhängiges FormaldehydaktivierendesEnzym (Gfa) genannt wurde, erstmals zu reinigen und das kodierende Gen zu identifizieren. (5) Die Anzahl der UbichinonBindungsstellen des Cytochrom bc 1 Komplexes aus Bos bovis wurde bestimmt. Dafür wurde eine NMRMethode entwickelt, die es ermöglicht, Bindungsstudien von wasserunlöslichen Cofaktoren an membranständigen Proteinen durchzuführen. Über die Aufnahme und Integration von 1 H, 13 CHSQCSpektren unter Verwendung von HRMASNMR konnte die Konzentration des Ubichinons, das in der Proteoliposomenmembran frei beweglich ist, quantifiziert werden. Verdrängungsstudien mit spezifischen Inhibitoren ermöglichten es dann, durch den Vergleich der freigesetzten Ubichinonkonzentrationen relativ zu der Cytochrom bc 1 Komplexkonzentration nachzuweisen, daß insgesamt drei Ubichinone spezifisch an den Cytochrom bc 1 Komplex binden. Die Ergebnisse werden in 5 Abschnitten beschrieben. Im Anhang zu jedem Abschnitt finden sich die Abdrucke der bereits erschienenen Veröffentlichungen (Abschnitte 1 bis 3) und ein zur Veröffentlichung akzeptiertes Manuskript (Abschnitt 5). In der Einleitung werden die Möglichkeiten aufgezeigt, mit modernen NMRspektroskopischen Methoden Protein LigandWechselwirkung zu studieren. In der Diskussion werden anhand der Ergebnisse die Limitierung, aber auch das noch nicht ausgeschöpfte Potential dieser Methoden erläutert. Während der Doktorarbeit wurden auch Untersuchungen zu den katalytischen Eigenschaften einer energiekonservierenden Hydrogenase aus M. barkeri durchgeführt. Die daraus entstandene Publikation ist im Anhang zu finden.
Der CD95 Ligand (CD95L, FasL) ist ein Mitglied der Tumor-Nekrose-Faktor(TNF)- Superfamilie und ist in der Lage, Apoptose oder -unter bestimmten Bedingungen- Proliferation in CD95 Rezeptor-positiven Zellen auszulösen. Zusätzlich überträgt der CD95 Ligand aber auch als Rezeptor Signale in die ligandentragende Zelle, ein Phänomen, das auch bei anderen TNF-Familienmitgliedern beobachtet und als "reverse signalling" bezeichnet wird. Diese reverse Signalübertragung bewirkt in T-Zellen ein costimulatorisches Signal, welches zur vollständigen Aktivierung nach Antigen-Erkennung durch den T-Zellrezeptor (TZR) benötigt wird und über bisher unbekannte Adaptorproteine stattfindet, die vermutlich an den intrazellulären Anteil des CD95L binden. Die zytoplasmatische CD95L-Domäne ist auf Primärsequenzebene stark konserviert und besitzt eine prolinreiche Proteininteraktionsdomäne sowie eine Casein Kinase I Phosphorylierungsstelle, welche sich auch im intrazellulären Bereich des membrangebundenen TNFalpha findet und bei diesem Protein für die reverse Signalübertragung essentiell ist. Eine weitere Funktion des CD95L ist der Transport des Liganden zu einem speziellen Typ von Lysosomen in NK- und zytotoxischen T-Zellen. Hierfür ist die prolinreiche Region in der CD95L-intrazellulären Domäne wichtig. In diesen sekretorischen Lysosomen wird der CD95L gespeichert, bis er nach einem TZR-vermittelten Signal an die Zelloberfläche transportiert wird und dort mit dem CD95 Rezeptor der Ziel- Zellen interagieren kann. In der vorliegenden Arbeit wurde zur Aufklärung der oben beschriebenen Funktionen des CD95 Liganden ein Hefe-2-Hybrid Screen mit der intrazellulären CD95L-Domäne als Köder durchgeführt. Mit dieser Methode war es möglich, mehrere potentielle Interaktionspartner zu identifizieren. Eines dieser Proteine, FBP11, wurde schon zuvor als "human fas ligand associated factor" in der Datenbank veröffentlicht. Der HMG-Box-Transkriptionsfaktor Lef- 1, das Formin-bindende Protein FBP11, das thymozytenspezifische Protein TARPP und das Adaptorprotein PSTPIP ("proline serine threonin phosphatase interacting protein")/ CD2BP1 ("CD2 binding protein") interagierten in vitro in einem GST-Pulldown-Experiment mit der intrazellulären Domäne des CD95 Liganden. Mit Hilfe von Co- Immunpräzipitationsstudien und Co-Lokalisierungsexperimenten konnte die Interaktion von überexprimiertem CD95L und PSTPIP auch in vivo bestätigt werden. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass diese Interaktion über eine nicht näher eingegrenzte Aminosäuresequenz in der prolinreichen Region des CD95L mit der SH3-Domäne des PSTPIP-Proteins realisiert wird. Die Phosphatase PTP-PEST bindet an einen Bereich der PSTPIP-Coiled-coil-Domäne, und es besteht die Möglichkeit, dass CD95L, PSTPIP und PTPPEST in der Zelle als ternärer Komplex vorliegen, in welchem der Phosphorylierungsstatus von PSTPIP und CD95L durch PTP-PEST reguliert wird. Wie die gleichzeitige Expression von PSTPIP die Oberflächenexpression von CD95L beeinflusst, war ein weiterer Untersuchungsgegenstand dieser Arbeit. Es konnte festgestellt werden, dass bei Überexpression von PSTPIP weniger CD95L auf der Oberfläche nachgewiesen wird. Interessanterweise wurde auch weniger Apoptose durch den CD95L ausgelöst, sobald PSTPIP überexprimiert wurde. Neben den Untersuchungen zur Interaktion von CD95L und PSTPIP (sowie PTP-PEST) wurden auch funktionelle Studien zur reversen Signalübertragung des CD95L durchgeführt. Sowohl in CD4- als auch in CD8-einzelpositiven frisch isolierten Maus-T-Zellen wurde ein co-stimulatorisches Signal nach suboptimaler TZR-Stimulation über CD95L beobachtet, was sich in verstärkter Proliferation und erhöhter Expression von Aktivierungsmarkern wie CD25 äußerte. Außerdem führt die Stimulation des CD95 Liganden zu einer transienten p42/p44-MAPK-Phosphorylierung, die durch Co-Expression von PSTPIP jedoch nicht beeinflusst wird. Die MAPK-Signalkaskade führt zur Zellproliferation und könnte daher eine wichtige Rolle in der CD95L-vermittelten Co- Stimulation spielen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte auch zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Lokalisation des CD95L in Lipid Rafts (Mikrodomänen der Zellmembran) wichtig für dessen apoptoseauslösendes Potential ist, da die Behandlung CD95L-positiver Zellen mit Substanzen, die Cholesterol entfernen und so Rafts zerstören, zur Inhibition der Apoptoseinduktion führt. Die Lokalisation sowohl des CD95 Rezeptors als auch des CD95 Liganden in unterschiedlichen Kompartimenten der Zellmembran könnte beide Moleküle voneinander abschirmen und so autokrine Apoptosemechanismen verhindern. Dadurch wird eine weitere Möglichkeit der Regulation der durch CD95L induzierten Apoptose realisiert.
Mit kombinatorisch-chemischer Synthese und einem Gel-shift Test wurden niedermolekulare, peptidische RNA-Liganden gefunden. Als Target-Moleküle dienten ein 23mer RNA-Oligonukleotid (CETP-RNA) aus der Cholesterol Ester Transfer Protein mRNA und ein 27mer RNA-Oligonukleotid aus der HIV-1 Transactivation response region (TAR) RNA (delta-TAR-RNA). Zudem wurde erstmals die Methode des Phage Display angewendet, um RNA-Liganden zu finden. Die aus beiden Screeningmethoden erhaltenen Liganden wurden mit verschiedenen biophysikalischen Methoden, insbesonders der NMR-Spektroskopie auf ihre Bindungseigenschaften und mittels in vitro und in vivo-Tests auf ihre physiologische Aktivität hin untersucht. Ein 16mer Peptid der Antennapedia Homeodomäne internalisiert rasch in Zellen verschiedener Kulturen. Im Screening gefundene Peptidliganden wurde über flexible Spacer (2 beta-Ala-Einheiten) mit diesen 16mer synthetisiert. Es wurde gezeigt, daß diese Peptide so in die Zielzellen und besonders in deren Zellkern gelangen. Basische delta-TAR-RNA-Liganden zeigen diese Verhalten auch ohne Transportersequenz. Die Ergebnisse des Phage-Display-Screenings sind widersprüchlich, da die so gefundenen RNA-Liganden mit den genutzen biophysikalischen Methoden (NMR, CD, Gelelektrophorese) keine größere Affinität an die delta-TAR-RNA zeigen. Im physiologischen Test haben diese Liganden dennoch eine HIV-1 inhibitorische Aktivität gezeigt. In einer humanen Makrophagenkultur, der Wirtszelle von HIV, wurden mit den Peptiden Thr-Pro- Glu-Leu-Pro-Trp-His-NH2 und Phe-His-Ser-Val-Gln-Ala-Leu das HIV-1 Wachstum um 20- 30% inhibiert. Diese Ergebnisse widersprechen den strukturellen Bindungsinfornmationen und sind deshalb fraglich. Ein Monitoring während der Panning-Prozedur wurde nicht durchgeführt. Es wurde auch nicht überprüft, wieviel RNA wirklich immobilisiert wurde. Aufgrund der sehr geringen Substanzmengen was das nicht möglich. In einem deutlich größerem Maßstab, könnten in Zukunft strukturelle Informationen über die immobilisierte RNA gewonnen werden, z. B. mit HR-MAS-NMR-Techniken. Die im Gel-shift-Screening gefundenen delta-TAR-RNA-Liganden des Gel-shift-Screening zeigen keine HIV-1 inhibitorische Aktivität. Die gefundenen Bindungskonstanten sind allerdings um eine Größenordnung kleiner als die der natürliche Bindungsregion Tat10, welche eine HIV-1 inhibitorische Wirkung besitzt. Die im Gel-Shift-Screening gefundenen CETP-RNA/Peptid-Paare mit den stärksten Affinitäten wurden mittels NMR-Spektroskopie und CD- und Gel-shift-Experimenten charakterisiert. Die Bindungskonstanten lagen im niedrig mikromolaren Bereich. Wie in 1D Jump Return-Experimenten gezeigt wurde, verschoben sich die Signale verschiedener Liganden in Gegenwart der CETP-RNA unterschiedlich stark. Zudem konnte eine Verbreiterung der Signale der Liganden festgestellt werden. Das Peptid Lys-Tyr-Lys-Leu- Tyr-Lys-Cys-NH2 zeigte bei der CETP-RNA den stärksten Effekt mit Bindungsaffinitäten von Kd = 32±2 mikro-M (CD-Titration). In 2D NOESY Experimenten zeigt der Peptid-Ligand Kreuz-Signale zu den Iminoprotonen der CETP-RNA. Da die Sekundärstruktur der CETPRNA ein Hairpin ist, sollte das Peptid somit Kontakt zu der Doppelstrang-Region haben. Dieses Peptid zeigt zudem einen deutlichen Effekt auf das CD-Verhalten seiner CETP-RNA. Offenbar wird die Basenpaarung der Sekundärstruktur unter Peptideinfluß geschwächt. Im physiologischem Test am Tiermodell einer transgenen Maus zeigt dieser Ligand eine Erniedrigung des Cholesterolester Transfers. In Zukunft könnte das Peptid Lys-Tyr-Lys-Leu- Tyr-Lys-Cys-NH2 mit z. B. unnatürlichen Aminosäuren modifiziert werden, um eine bessere physiologische Stabilität zu erhalten und dadurch möglicherweise die physiologische Aktivität zu erhöhen. Auch eine Leitstrukturoptimierung kann durchgeführt werden.
Das onkogene Fusionsprotein AML1/ETO entsteht durch die chromosomale Translokation t(8;21), die in etwa 12 % aller primären akuten myeloischen Leukämien (AML) auftritt. Die DNA-Bindedomäne des hämatopoetischen Transkriptionsfaktors AML1 wird hierbei mit fast dem gesamten ETO-Protein fusioniert, das als transkriptioneller Repressor wirkt. In den transformierten Zellen kommt es somit zur Blockierung der myeloischen Differenzierung und zur verstärkten Proliferation. Entscheidend für das leukämische Potential von AML1/ETO ist die Fähigkeit zur Oligomerisierung, die durch die Nervy-Homologie-Region-2 (NHR2)-Domäne im ETO-Anteil vermittelt wird.
Durch lentivirale Transduktion konnte bereits gezeigt werden, dass Proteine, welche die NHR2-Domäne enthalten, die Oligomerisierung von AML1/ETO inhibieren und damit den leukämischen Phänotyp AML1/ETO-exprimierender myeloischer Zellen aufheben. In der vorliegenden Arbeit sollten nun alternative Wege zur Einbringung der therapeutischen Proteine in t(8;21)-positive AML-Zellen untersucht werden. Dafür wurde sowohl die Möglichkeit der Proteintransduktion als auch die Verwendung nicht-integrierender viraler Vektoren analysiert.
Im ersten Projekt wurden durch Fusion mit der HIV-1 TAT-Domäne zellpermeable NHR2-Proteine generiert. Zunächst wurde ein Protokoll zur Expression und Reinigung der rekombinanten Proteine etabliert. Durch eine ausführliche biochemische Charakterisierung konnte gezeigt werden, dass die aus Bakterien aufgereinigten NHR2-Proteine funktionell und sehr rein waren. Sie wiesen den erwarteten hohen alpha-helikalen Anteil auf und behielten ihre Fähigkeit zur Bildung von Tetrameren in vitro bei. Die TAT-NHR2-Fusionsproteine sind in der Lage, in humane Zellen einzudringen und konnten erfolgreich in den Lysaten nachgewiesen werden. Mikroskopische Studien zeigten, dass der Großteil der internalisierten Proteine in Endosomen-ähnlichen Vesikeln lokalisiert war. Die Zugabe des Endosomeninhibitors Chloroquin oder eines endosomolytischen, zellpermeablen Peptides ermöglichte eine erhöhte intrazelluläre Stabilität der zellpenetrierenden Proteine. Co-Immunpräzipitations-Experimente konnten bestätigen, dass die aufgenommenen NHR2-Proteine spezifisch an das ETO-Protein in transfizierten, adhärenten Zellen binden können. Die Proteintransduktion in die myeloische, AML1/ETO-wachstumsabhängige Zelllinie Kasumi-1 ist unter serumfreien Bedingungen ebenfalls möglich. Die konsekutive Behandlung der AML-Zellen mit den TAT-NHR2-Fusionsproteinen führte zu einer Reduktion der Expression des Stammzellmarkers c-kit (CD117) in 26 % der behandelten Zellen. Die Anwendung zellpermeabler NHR2-Proteine ist demnach prinzipiell möglich, bedarf aber weiterer Optimierung, um die notwendige hohe Bioverfügbarkeit zu erreichen.
In einem zweiten Projekt wurden Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren verwendet, um die NHR2-Proteine in den hämatopoetischen Zellen zu exprimieren. Mit Hilfe mehrerer Methoden konnte gezeigt werden, dass sich mit den generierten Vektoren, die auf dem AAV-Serotyp 2 basierten, erfolgreich eine transiente Genexpression induzieren ließ. Der CMV-Promoter vermittelte jedoch nur eine schwache Expression in den hämatopoetischen Zellen. Unter Verwendung des stärkeren SFFV-Promoters konnte die Expressionsstärke deutlich gesteigert werden. Die von den optimierten AAV-Vektoren vermittelte Expression der NHR2-Proteine führte in den beiden AML1/ETO-positiven Zelllinien Kasumi-1 und SKNO-1 zu den erwarteten, spezifischen Effekten. So wurde das Wachstum verlangsamt und gleichzeitig die Apoptoserate erhöht. AML1/ETO-unabhängige Zellen wurden dagegen von den AAV-NHR2-Vektoren nicht beeinflusst. Obwohl die Proteinexpression in SKNO-1 Zellen stärker war, zeigten die Kasumi-1 Zellen deutlichere Effekte. Die NHR2-Proteine bewirkten in den transduzierten t(8;21)-positiven Zellen außerdem eine Reduktion der Expression der Stammzellmarker CD34 bzw. c-kit. Dies deutet auf eine partielle Differenzierung der beiden AML1/ETO-abhängigen Zelllinien hin. Damit ließen sich durch AAV-vermittelte Transduktion in den AML-Zellen dieselbe Wirkung in Hinblick auf Wachstum, Differenzierbarkeit und Apoptoserate erzielen wie dies mit den lentiviralen Vektoren zuvor beschrieben wurde. In einem abschließenden Vergleich wurde aber deutlich, dass nicht-integrierende Vektorsysteme generell eine schwächere NHR2-Proteinexpression induzieren und demzufolge auch schwächere Effekte als integrierende Vektoren in den AML1/ETO-positiven Zellen auslösen.
Der Ein-Elektron Transporter Adrenodoxin spielt in der Steroidhormonbiosynthese eine entscheidende Rolle. Bislang konnte der Elektronentransportmechanismus zwischen der Adrenodoxin-Reduktase und dem Cytochrom P450 mittels Adrenodoxin nicht eindeutig nachgewiesen werden. Um die molekularen Wechselwirkungen besser verstehen zu können wurden in der vorliegenden Arbeit strukturelle Untersuchungen am Rinderadrenodoxin durchgeführt. Nachdem es bereits 1998 gelang die Struktur des oxidierten Zustands des Adrenodoxins aufzuklären [Müller et al. 1998], sollte die Struktur des reduzierten Zustands Aufschluss über mögliche redoxbedingte konformationelle Änderungen geben. Die Strukturaufklärung mittels NMR erfordert hohe Expressionsausbeuten und effektive Aufreinigungsstrategien des rekombinant hergestellten Proteins. Deshalb wurde zunächst eine Steigerung der Expression von löslichem Adrenodoxin in E.coli angestrebt. In Minimalmedium lieferte die Expression unter Zusatz von 2,5g Glycerin und 1g Glucose optimale Ergebnisse. So konnte nach Optimierung der Aufreinigungsabfolge aus einem Liter M9-Medium bis zu 50 mg homogenes Protein isoliert werden. Nach Optimierung der Expressionsbedingungen und der Aufreinigungsstrategie konnte das Adrenodoxin mit den NMR aktiven Isotopen 15N sowie 13C angereichert werden. Die Reduktion des Adrenodoxins erfolgte durch Zusatz von Natriumdithionit unter strikt anaeroben Bedingungen. Die strukturelle Untersuchung mittels NMR setzt eine Zuordnung der Proteinresonanzen voraus. Diese erfolgte unter Verwendung verschiedener Tripleresonanzexperimente. Eine Zuordnung war aufgrund des stark ausgeprägten Paramagnetismus nur für solche Reste möglich, die sich mindestens 8 Å vom [2Fe-2S]-Cluster des Adrenodoxins entfernt befinden. Trotzdem konnten wichtige Regionen, die sich außerhalb des Einflussbereichs des [2Fe-2S]- Clusters befinden, zugeordnet und mit dem oxidierten Zustand verglichen werden. Aus den 15N-NOESY-HSQC und 13C-NOESY-HSQC-Spektren wurden für den reduzierten Zustand unter Zuhilfenahme des Programms NMR2st 1300 effektiv abstandsbeschränkende NOESignale eindeutig zugeordnet. Nach Minimierung der Zielfunktion wurden im letzten Schritt 50 Strukturen mit dem Strukturkalkulationsprogramm DYANA berechnet. Die 20 Strukturen mit den besten Targetfunkionen wurden als Strukturensemble dargestellt. Für das Proteinrückrat beträgt der RMSD 2,34 Å. Anhand der chemischen Verschiebungsänderungen konnten erste Unterschiede zwischen oxidierten und reduzierten Zustand des Adrenodoxins festgestellt werden. Besonders markant sind diese Veränderungen im Bereich des C-Terminus und des Loops 80-86. Änderungen konnten auch im "Chemical Shift Index" und beim Vergleich der NOE-Konnektivitäten beider Redoxzustände beobachtet werden. Gerade für die Aminosäurereste Asp76 und Asp79, die für die Wechselwirkung zu den Redoxpartnern essentiell sind, konnten Veränderungen im Aufspaltungsmuster der "NOE-Pattern" nachgewiesen werden, was auf konformationelle Änderungen im Bereich der Wechselwirkungsdomäne hindeutet. Der Vergleich der beiden Tertiärstrukturen lieferte weitere Indizien dafür, dass der C-Terminus redoxbedingte konformationelle Änderungen erfährt. Während des Erstellens dieser Arbeit konnte eine US-amerikanische Gruppe durch Zufall die Existenz eines Adrenodoxin (oxidiert) Dimers bei physiologisch relevanten Konzentrationen nachweisen [Pikuleva et al. 2000]. Bei der Dimerisierung spielt der C-Terminus eine entscheidende Rolle. Zwei intermolekulare Wasserstoffbrücken bilden sich zwischen CTerminus und Protein des jeweils anderen Partners aus. Redoxbedingte konformationelle Änderungen im Bereich des C-Terminus sollten die Auflösung des Dimers begünstigen. Um diese Vermutung zu bestätigen wurden Cross-Linking Experimente mit dem reduzierten und oxidierten Zustand des Adrenodoxins durchgeführt. Die Ergebnisse bestätigten die Annahme, dass sich das Adrenodoxin Dimer nach Reduktion auflöst. Außerdem konnte anhand der voll funktionsfähigen C-terminal verkürzten Mutante Adx(4-108) die tragende Rolle des CTerminus bei der Dimerbildung bewiesen werden. Aus den experimentell erhaltenen Daten wurde ein neuer Elektronentransportmechanismus postuliert, der sowohl Adrenodoxin Dimere als auch Adrenodoxin Monomere als Elektronentransporter annimmt [Beilke et al. 2002]. Die streng kontrollierte Steroidhormonbiosynthese wird durch den Einsatz von Adrenodoxin Dimeren beschleunigt und durch die redoxbedingte Auflösung der Dimere optimert. Die redoxbedingte Auflösung eines Dimers ist in der Biochemie einzigartig und kann zum Verständnis molekularer Wechselwirkungen beitragen. Für die gesamte Gruppe der vertebraten Ferredoxine sind aufgrund der Struktur- und Sequenzhomologie ähnliche Ergebnisse zu erwarten. Im zweiten Teil der Arbeit sollte die Ferredoxin-NADP -Reduktase (FNR) für strukturelle Untersuchungen mittels NMR zugänglich gemacht werden. Durch Verwendung von bakteriellen Expressionssystemen, insbesondere dem pQE30-Expressionssystem, konnte der Anteil an löslichem Protein im Vergleich zum Ursprungssystem um den Faktor 12 erhöht werden. Dabei führten möglichst niedrige Expressionstemperaturen und IPTG Konzentrationen zu den höchsten Proteinausbeuten. Ein verbessertes Isolationsverfahren wurde etabliert und ermöglicht die Darstellung von bis zu 90 mg FNR aus einem Liter LB-Medium. Eine Verlängerung der Expressionsdauer, hervorgerufen durch das Wachstum in M9-Medium und in D2O, verringerte den Anteil an vollständig intaktem Protein, weshalb auf eine kostspielige Proteinpräparation in dreifach angereicherten Minimalmedium verzichtet wurde.
Entwicklung neuer Multikomponentenreaktionen zur Synthese von Amin- und α-Aminosäurederivaten
(2016)
Die Entwicklung neuer Synthesemethoden ist von enormer Bedeutung hinsichtlich der Darstellung von neuen Verbindungen mit speziellen, anwendungsorientierten Eigenschaften und in Bezug auf die Suche nach ökologisch verträglicheren und effizienteren Herstellungsmethoden. Multikomponentenreaktionen (MCRs) bieten hierbei eine gute Ansatzmöglichkeit. Gegenüber den klassischen, linear verlaufenden 2-Stufen-Reaktionen weisen MCRs eine hohe Atom-Ökonomie und effiziente Bindungsbildung auf, können zur Minimierung von Zeit-, Energie-, Material- und Kostenaufwand sowie zur geringeren Generierung von Abfallmengen beitragen und ermöglichen einen schnellen Aufbau diverser Molekülstrukturen. Vor diesem Hintergrund gelang im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Entwicklung mehrerer 3-Komponentenreaktionen basierend auf der nukleophilen Addition von Arylboronsäuren an in situ gebildete N-Acyl- bzw. N-Sulfonylimine, womit die Synthese von diversen alpha-substituierten Amiden, chiralen, alpha-substituierten Sulfonamiden, chiralen alpha-Arylglycinen sowie von Arylmethylsulfonamiden erfolgte. Der Schlüssel zu einer erfolgreichen Umsetzung hinsichtlich der Methode mit Amiden war die Verwendung eines dualen Katalysatorsystems aus Lewis-Säure und Pd(II) sowie die Anwesenheit von Wasser. Die enantioselektiven Varianten konnten mittels Sulfonamide anstelle der Amide sowie unter Einsatz von Pd(II) und einem chiralen Oxazolin-Liganden erreicht werden. Die neuen Methoden sind einfach in der Durchführung, weisen einen breiten Substrat-bereich auf und im Falle der asymmetrischen Varianten hohe Enantioselektivitäten.
Allerdings besitzt die Reaktionsführung über Organoboronsäuren zwei entscheidende Nachteile: Zum einen bedarf es der Verwendung vorfunktionalisierter Boronsäuren und zum anderen werden stöchiometrische Mengen borhaltiger Abfälle erzeugt. Daher wurden im Rahmen dieser Arbeit auch Prozesse untersucht, bei denen hinsichtlich der Atom-Ökonomie keine unnötig vorfunktionalisierten Startmaterialien eingesetzt werden und bei denen keine oder nur ökologisch vollkommen unbedenkliche Nebenprodukte entstehen. Ein erster Ansatz in diese Richtung gelang dabei mit der Entwicklung einer neuen 3-Komponentenreaktion basierend auf einer Brønsted-Säurekatalysierten, benzylischen C–H-Bindungsfunktionalisierung von 2-Alkylazaarenen.
Die vorliegende Arbeit ist das Extrakt umfangreicher Untersuchungen an ausgewählten organischen und metallorganischen Verbindungen im Hinblick auf ihre Polymorphie. Nicht nur die praktischen Arbeiten, wie Synthesen, Polymorphie-Screenings (nach eigens entwickeltem Vorgehen), die chemisch-physikalischen Charakterisierungen neuer polymorpher Formen, sondern auch die Kristallstrukturbestimmungen aus Röntgenbeugungsdaten wurden durchgeführt. Im Fokus der Untersuchungen standen Pigmentvorprodukte, Pigmente, pharmazeutische Wirkstoffe und weitere organische und metallorganische Verbindungen.
Ein Auszug zu Pigmentvorprodukten bilden 2-Ammoniobenzolsulfonate, welche klassische Vorprodukte verlackter Hydrazonpigmente sind. Die bislang unbekannte tautomere Form und Kristallstruktur der CLT-Säure als Zwitterion konnte erfolgreich aus dem Zusammenspiel von IR-, Festkörper-NMR-Spektroskopie und Röntgen-Pulverdiffraktometrie ermittelt werden [1]. Mit Hilfe eines Polymorphie-Screenings konnten nicht nur zwei neue Pseudopolymorphe, sondern auch das Ansolvat der CLT-Säure selbst kristallisiert und ihre Strukturen aus Röntgen-Einkristalldaten bestimmt werden. Hierbei konnte das, aufgrund der Strukturbestimmung aus Röntgen-Pulverdaten proklamierten Tautomer der CLT-Säure verifiziert werden [2]. Mit Hilfe thermischer und röntgenographischer Untersuchungen an drei Derivaten der CLT-Säure, konnte der Einfluss des Substitutionsmusters (Chlor- und Methylsubstituenten) auf die Kristallpackung aufgezeigt werden [3]. Mit Hilfe eines Polymorphie-Screenings an der Iso-CLT-Säure konnten Reaktionen der zum Polymorphie-Screening eingesetzten Lösungsmittel und der Iso-CLT-Säure beobachtet und mittels thermischer und röntgenographischer Ergebnisse aufgeklärt werden. In zwei Fällen konnte eine Deprotonierung und im dritten Fall eine Desulfonierung beobachtet werden. Durch Erwärmen der deprotonierten und desulfonierten Verbindung(en) ist die Rückgewinnung der Iso-CLT-Säure möglich [4]. Ein Polymorphie-Screening an Pigment Red 53 lieferte vierundzwanzig neue Phasen, welche identifiziert und charakterisiert werden konnten. Ferner konnten von neun Phasen die Kristallstrukturen bestimmt werden (acht aus Röntgen-Einkristall- und eine aus Röntgen-Pulverdaten). Mit Hilfe dieser konnte ein Teil der Funktionalisierung von Lösungsmittelmolekülen in Pigment Red 53 aufgedeckt werden. Diverse Beziehungen pseudopolymorpher Formen zueinander konnten auf Basis der gewonnenen Erkenntnisse bestimmt werden [5]. Mit Hilfe der Ergebnisse aus den Untersuchungen zu Pigment Red 53 konnte mittels Modifizierung der bekannten Syntheseroute zu Pigment Red 53:2 die bekannte α-Phase erhalten werden. Weiterhin konnten neben zehn bekannten weitere fünfzehn neue Polymorphe identifiziert und weitestgehend charakterisiert werden. Die Kristallstrukturen von fünf bekannten und zwei neuen Phasen (sechs aus Röntgen-Einkristall- und eine aus Röntgen-Pulverdaten [6]) konnten bestimmt werden. Anhand der Ergebnisse aus den chemisch-physikalischen Charakterisierungen konnten Einzelbeziehungen zwischen den Phasen beobachtet werden. Die eigene Synthese von Pigment Red 57:1 resultierte in der bereits bekannten α-Phase. Ein Polymorphie-Screening an der α-Phase lieferte neben der bereits bekannten β-Phase elf neue Modifikationen. Schließlich konnte mit Hilfe der gesammelten Daten zur α-, β- und γ-Phase ein Zusammenhang zwischen De-/Rehydratation und dem damit einhergehenden Farbwechsel hergestellt und nachgewiesen werden [7]. Die bislang unbekannte Protonierung und Kristallstruktur von Nimustin-Hydrochlorid konnten erfolg-reich aus der Symbiose von Festkörper-NMR und Röntgen-Pulverdiffraktometrie des Handelsproduktes ermittelt werden [8]. Ebenso konnte die bislang unbekannte Kristallstruktur von 5′-Deoxy-5-fluorouridin konnte erfolgreich aus Röntgen-Pulverdaten des Handelsproduktes bestimmt werden [9]. Nach einem umfangreichen Polymorphie-Screening gelang es, Einkristalle von Tizanidin-Hydrochlorid zu erhalten und dessen Struktur aus Röntgen-Einkristalldaten zu bestimmen. Die bislang angenommene Tautomerie von Tizanidin im Festkörper und flüssiger Phase konnte mittels Röntgen-Einkristalldiffraktometrie und 1H-NMR korrigiert werden [10]. Während thermischer Untersuchungen wurden zwei bisher nicht beschriebene Polymorphe (ein Hochtemperatur- und ein Raumtemperaturpolymorph) gefunden. Schließlich konnte die Kristall-struktur des zweiten bei Raumtemperatur stabilen Polymorphs aus Röntgen-Pulverdaten bestimmt werden.
Es konnte die Kristallstruktur von 4,5,9,10-Tetramethoxypyren [11], eines neuen 2:1 Co-Kristalls aus Chinolin und Fumarsäure [12] und einer biradikalen Azoverbindung [13] aus Röntgen-Pulverdaten bestimmt werden. Neben diesen Verbindungen konnten aus analytischen und röntgenographischen Untersuchungen an ausgewählten Stereoisomeren von Inositol dreizehn neue Phasen erhalten werden. Zudem konnten mehrere Schmelzpunkte mittels DSC-Messungen korrigiert oder als Phasenübergänge oder Zersetzungs-punkte identifiziert werden. Acht Strukturen geordneter Phasen konnten aus Röntgen-Pulverdaten bestimmt werden. Zusätzlich konnten fünf der dreizehn Phasen als Rotatorphasen identifiziert und deren Elementarzelle ermittelt werden [14]. Auf Basis einer neuen Syntheseroute konnten ein Cobalt(II)- und ein Zink(II)-fumarat-Anhydrat, welche im Vergleich zu den bisher bekannten Hydraten besser wasser-löslich sind, erhalten werden. Diese Anhydrate konnten zur Kristallisation eingesetzt werden und lieferten alle bisher bekannten und zusätzlich drei neue Kristallphasen (zwei neue Cobalt(II)-fumarat-Hydrate und ein neues Zink(II)-fumarat-Hydrat). Die Kristallstrukturen der drei neuen Kristallphasen konnten aus Röntgen-Einkristalldaten bestimmt werden [15 und 16].
[1] S. L. Bekö, S. D. Thoms, J. Brüning, E. Alig, J. van de Streek, A. Lakatos, C. Glaubitz & M. U. Schmidt (2010), Z. Kristallogr. 225, 382–387; [2] S. L. Bekö, J. W. Bats & M. U. Schmidt (2012), Acta Cryst. C 68, o45–o50; [3] S. L. Bekö, C. Czech, M. A. Neumann & M. U. Schmidt. "Doubly substituted 2-ammonio-benzenesulfonates: Substituent influence on the packing pattern", eingereicht; [4] S. L. Bekö, J. W. Bats, E. Alig & M. U. Schmidt (2013), J. Chem. Cryst. 43, 655–663; [5] S. L. Bekö, E. Alig, J. W. Bats, M. Bolte & M. U. Schmidt. "Polymorphism of C.I. Pigment Red 53", eingereicht; [6] T. Gorelik, M. U. Schmidt, J. Brüning, S. Bekö & U. Kolb (2009), Cryst. Growth Des. 9, 3898–3903; [7] S. L. Bekö, S. M. Hammer & M. U. Schmidt (2012), Angew. Chem. Int. Ed. 51, 4735–4738 und Angew. Chem. 124, 4814–4818; [8] S. L. Bekö, D. Urmann, A. Lakatos, C. Glaubitz & M. U. Schmidt (2012), Acta Cryst. C 68, o144–o148; [9] S. L. Bekö, D. Urmann & M. U. Schmidt (2012), J. Chem. Cryst. 42, 933–940; [10] S. L. Bekö, S. D. Thoms, M. U. Schmidt & M. Bolte (2012), Acta Cryst. C 68, o28–o32; [11] M. Rudloff, S. L. Bekö, D. Chercka, R. Sachser, M. U. Schmidt, K. Müllen & M. Huth. "Structural and electronic properties oft he organic charge transfer system 4,5,9,10-tetramethoxypyrene - 7,7,8,8-tetracyanoquinodimethane", eingereicht; [12] S. L. Bekö, M. U. Schmidt & A. D. Bond (2012), CrystEngComm 14, 1967–1971; [13] S. L. Bekö, S. D. Thoms & M. U. Schmidt (2013), Acta Cryst. C 43, 1513–1515; [14] S. L. Bekö, E. Alig, M. U. Schmidt & J. van de Streek (2014), IUCrJ 1, 61–73; [15] S. L. Bekö, J. W. Bats & M. U. Schmidt (2009), Acta Cryst. C 65, m347–m351; [16] S. L. Bekö, J. W. Bats & M. U. Schmidt. "One-dimensional zinc(II) fumarate coordination polymers", akzeptiert.
Die Übergangsmetalle Vanadium und Niob wurden in einer neuartigen Thermowaage bzw. mit dem Rapid Thermal Processing (RTP) unter Verwendung von Ammoniak und Stickstoff als Prozessgas nitridiert. In der Thermowaage, die die in situ Aufzeichnung von Massenänderungen während der Reaktion möglich macht, wurde die Nitridierung hauptsächlich an pulverförmigen Proben durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass sowohl Temperatur- und Druckerhöhung, als auch eine Verlängerung der Temperzeit zu größeren Massenzunahmen führten. Die Bildung der unterschiedlichen Nitridphasen war aber allein von der Temperatur während des Versuches und dem verwendeten Prozessgas abhängig. Die detektierten Massenzunahmen bei der Erhöhung von Temperzeit und Druck wurden nur von der vermehrten Einlagerung von Stickstoff bzw. Sauerstoff in das Metall verursacht, die keine neue Phasenbildung zur Folge hatte. Sauerstoff wurde in allen getemperten Proben gefunden, was die Untersuchung von dünnen Schichten in der Thermowaage verhinderte, da aufgrund des erhöhten Sauerstoffgehaltes die Schichten vollständig oxidierten. Der Sauerstoff wurde hauptsächlich von dem Glasreaktor geliefert. Ein dort abgelagerter Belag, der sich durch Korrosion der Edelstahlgasleitung gebildet hatte, wirkte vermutlich katalytisch. Aus diesem Grund war die Thermowaage in dieser Konfiguration nicht für Nitridierungsversuche geeignet und konnte ihren eigentlichen Zweck, die genaue Untersuchung des Reaktionsmechanismus mit Hilfe der Massenänderung und der anschließenden massenspektrometrischen Untersuchung des Prozessgases nach der Reaktion, nicht erfüllen. 200 nm und 500 nm Vanadium- und Niob-Schichten wurden im RTP nitridiert. Auch hier konnte man eine Bildung von Oxiden bzw. Oxynitriden beobachten, diese bildeten sich aber durch die Ausdiffusion von Sauerstoff aus dem Substrat in die Metallschicht, was anhand von SNMS- und TEM/EFTEM/EELS-Untersuchungen eindeutig belegt werden konnte. Um dieses Phänomen zu untersuchen wurden Schichten auch auf Saphir-Substrat, welches gegenüber der Ausdiffusion von Sauerstoff inert sein sollte, aufgebracht. Für die beiden verwendeten Metalle wurden unterschiedliche Ergebnisse gefunden. Während bei den Vanadium-Schichten nur aus dem SiO2-Substrat Sauerstoff ausdiffundierte, wurde dies bei den Niob-Schichten bei beiden Substraten festgestellt. Die Temperatur während der Versuche (V: 600 und 700°C; Nb: 800°C) scheint also auch einen Einfluss auf die Ausdiffusion von Sauerstoff zu haben. Dabei zeigt Saphir eine etwas größere Temperatur-Stabilität als SiO2. Ein Einfluss des Prozessgases auf die Reaktion an der Grenzfläche Metall/Substrat konnte nicht nachgewiesen werden. Zwar kam es bei der Verwendung von Wasserstoff zur Bildung von mehr und sauerstoffreicheren Phasen, was dafür spricht, dass die Substrate stärker angegriffen werden, aber auch beim Einsatz von Inert-Gas (N2) wurde eine Ausdiffusion von Sauerstoff aus den Substraten beobachtet. Allerdings wirkte sich die Schichtdicke der Probe auf die Ausdiffusion von Sauerstoff und die Bildung der Oxid-Phase aus. Da von der Oberfläche der Schicht eindiffundierender Stickstoff die Diffusion von Sauerstoff behindert, kann Sauerstoff mit zunehmender Schichtdicke weiter in das Metall vordringen. Bei dünneren Schichten wird er eher aufgestaut und es bilden sich Oxide mit höherem Sauerstoffgehalt. Ein Einfluss der unterschiedlichen Herstellungsverfahren (Elektronenstrahlverdampfung / Magnetronsputtern) für die Ausgangsschichten auf die Ausdiffusion von Sauerstoff aus dem Substrat konnte, trotz der größeren Kristallinität der gesputterten Proben, nicht nachgewiesen werden.
Ziel dieser Arbeit war es, mit den Methoden der NMR-Spektroskopie die elektrostatischen Eigenschaften der Xylanase aus Bacillus agaradhaerens in Abhängigkeit vom pH-Wert zu charakterisieren. Für die vorliegende Arbeit wurde das Strukturgen der Xylanase in verschiedene Expressionsvektoren des pET-Systems kloniert, wobei das Enzym auf 207 Aminosäuren verkürzt wurde. Diese Länge entspricht der publizierten Kristallstrukur von Sabini et al. (1999). Die Expression in pET3a und die Aufreinigung des Genproduktes mit Ionenaustauschchromatographie wurde optimiert, sodass homogenes Protein mit guten Ausbeuten erhalten werden konnte. Die Xylanase wurde mit den Isotopen 15N und 13C markiert und heteronukleare, mehrdimensionale NMR-Spektren wurden für die Zuordnung der Resonanzen des Proteins aufgenommen. Die chemischen Verschiebungswerte des Proteinrückgrats und die der aliphatischen Seitenketten wurden vollständig zugeordnet. Als eine weitere Voraussetzung für eine pH-Titration wurden sequenzspezifisch die Resonanzen der Histidin- bzw. Carboxylatgruppen bestimmt. Die Lösungsstruktur der Xylanase wurde anhand mehrerer automatisierter Prozeduren errechnet, um die Zuordnung der Resonanzen zu validieren. Alle Strukturelemente, die bereits aus der Kristallstruktur bekannt sind, wurden korrekt wiedergegeben. Da die Lösungsstruktur mit einem backbone RMSD-Wert von 2.44 ± 0.29 Å hoch 2 als vorläufig zu betrachten war, wurde im Folgenden ausschließlich die Kristallstruktur zur Bewertung der Distanzbeziehungen verwendet. In Abwesenheit des Substrats wurden die pH-abhängigen Resonanzen der Histidin- und Carboxylatgruppen sowie der Amide des Proteinrückgrats gemessen. Die Auswertung ergab 220 Titrationsprofile der 15N- and 13C-Resonanzen in einem pH-Bereich von 3.2 bis 8.7. Durch nichtlineare Regression der gemessenen Werte an eine modifizierte Henderson-Hasselbalch Gleichung wurden die pK S-Werte der Seitenketten von Aspartat und Glutamat, sowie für das C-terminale Carboxylat und für die Histidingruppen bestimmt. Die Titrationskurven der katalytischen Dyade zeigten eine ausgeprägte gegenseitige Wechselwirkung. Die korrespondierenden pK S-Werte stimmen gut mit dem vorhergesagten enzymatischen Mechanismus überein (Sabini et al., 1999) und belegen, dass das Nukleophil Glu94 bei einem neutralem pH-Wert deprotoniert ist, während die Bronsted Säure/Base GIu184 zu ca. 30% protoniert ist. Um die Untersuchungen zur katalytischen Aktivität zu vervollständigen, wurden alle pH-abhängigen [15N]-Resonanzen der Amide des Proteinrückgrats wie auch die der lndolstickstoffe in der Substratbindungsspalte analysiert. Die Wendepunkte konnten dem Titrationsverhalten der benachbarten sauren Aminosäure-Seitenketten zugeordnet werden. Aber es erscheint sehr wahrscheinlich, dass ein wesentlich komplexerer Ablauf stattfindet. Die asymmetrische Wechselwirkung von Trptophan-Seitenketten bezüglich der katalytischen Dyade wie auch das wechselnde Monotonieverhalten der Titrationskurven deuten auf eine simultane Reorganisation der Seitenkettenkonformere bei pH ungefähr gleich 6 und/oder auf eine Änderung des Wasserstoffbrückennetzwerkes innerhalb der Bindungsspalte.
Natürliche Enantioselektivität und Isotopendiskriminierung - Schlüssel zur Echtheit ätherischer Öle
(2002)
Als Grundlage für die Beurteilung der Echtheit ätherischer Öle können zwei biochemische Prinzipien Enantioselektivität und Isotopendiskriminierung während der Biosynthese herangezogen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die enantioselektive Kapillargaschromatographie sowie die online-Kopplung der Gaschromatographie mit der Isotopenmas- senspektrometrie zur Authentizitätsbewertung verschiedener ätherischer Öle eingesetzt. Die Bestimmung von Enantiomerenverhältnissen mittels Multidimensionaler Gaschromatographie-Massenspektrometrie (MDGC-MS) sowie von 13C/12C-Isotopenverhältnissen mittels GC-C-IRMS (Gaschromatographie-Combustion- Isotopenmassenspektrometrie) sind etablierte Methoden, die in der Authentizitätsbewertung von Aroma- und Duftstoffen eingesetzt werden. Dagegen ist die Bestimmung von 2H/1H-Isotopenverhältnissen mittels GC-P-IRMS (Gaschromatographie-Pyrolyse-Isotopenmassenspektrometrie) eine relativ neue Methode. In der vorliegenden Arbeit wurden Strategien zur Bestimmung von zuverlässigen 2H/1H-Isotopenverhältnissen mittels GC-P-IRMS entwickelt. Die Kalibrierung des Referenzgases mit Hilfe von internationalen Standards kann nur mittels eines Elemental Analyzers (EA-IRMS) erfolgen, da für die Gaschromatographie geeignete Standards nicht zur Verfügung stehen. Daher ist insbesondere der Vergleich von Isotopenverhältnissen von Standardsubstanzen, die mittels TC/EA-IRMS und GC- P-IRMS bestimmt wurden, von Bedeutung. Es konnte gezeigt werden, dass eine Konditionierung (Einbringen einer Kohlenstoffschicht) des Pyrolysereaktors im GC- P-IRMS-System notwendig ist, um für die untersuchten Aromastoffe mittels GC-P- IRMS zum Elemental Analyzer vergleichbare Ergebnisse zu erzielen. Von zwei verschiedenen getesteten Methoden zur Konditionierung des Pyrolysereaktors war die Konditionierung durch Einleiten von Methan in den Pyrolysereaktor die geeignetere und effektivere Methode. Weiterhin wurden der Einfluss des Trägergasflusses des Gaschromatographen auf die bestimmten Isotopenwerte sowie der lineare Bereich der Methode untersucht. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass die mittels GC-P-IRMS bestimmten Isotopenverhältnisse von verschiedenen Parametern abhängig sind. Richtige Ergebnisse zu erzielen setzt folgende Konditionen voraus: Konditionierung des Pyrolysereaktors, optimaler Trägergasfluss sowie Mindestmenge des Analyten (> 0,3 µg on column). Die neuen Möglichkeiten, die die online-Bestimmung von 2H/1H-Isotopenverhältnissen in der Authentizitätsbewertung von Lavendelölen, Anis- und Fenchelölen sowie Kümmelölen bietet, wurden erstmalig untersucht. Darüber hinaus wurden die enantioselektive Kapillargaschromatographie und die Bestimmung von 13C/12C-Isotopenverhältnissen mittels GC-C-IRMS eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass sich die Bereiche der 2HV-SMOW-Werte von Linalool und Linalylacetat aus authentischen Lavendelölen deutlich vom Bereich der Isotopenverhältnisse kommerziell erhältlicher, synthetischer Analoga unterscheiden und somit eine Verfälschung von Lavendelölen mit synthetischem Linalool und/oder Linalylacetat nachweisbar ist. Mit dieser Methode konnten diverse Handelsöle eindeutig als verfälscht beurteilt werden. Über die Bestimmung der Enantiomerenverhältnisse von Linalool und Linalylacetat dieser Öle konnte die Aussage bestätigt werden (hohe Reinheit zugunsten des (R)-Enantiomeren in genuinen Lavendelölen). Anhand der unterschiedlichen 13C/12C-Isotopenverhältnisse ist eine Unterscheidung zwischen synthetischem und Linalylacetat aus Lavendel möglich. Die 13CV-PDB-Werte von synthetischem und natürlichem Linalool aus Lavendelölen liegen im gleichen Bereich und sind somit zur analytischen Differenzierung natürlich/naturidentisch nicht geeignet. Mittels GC-C(P)-IRMS Analyse von trans-Anethol aus Fenchel- und Anisölen wurden die authentischen Bereiche der 13C/12C- und 2H/1H-Isotopenverhältnisse ermittelt. Es konnte gezeigt werden, dass sich einige der synthetischen trans-Anethol- Muster nur aufgrund eines der beiden bestimmten Isotopenverhältnisse von dem authentischen Bereich abgrenzen lassen. Somit konnte gezeigt werden, dass die integrale Betrachtungsweise der 13CV-PDB-Werte und der 2HV-SMOW-Werte biogener Stoffe für die Authentizitätsbewertung von großer Bedeutung ist. Zur Authentizitätsbewertung von Kümmelölen wurden die Enantiomerenverhältnisse, die 13C/12C- und die 2H/1H-Isotopenverhältnisse der Hauptkomponenten Limonen und Carvon bestimmt. Aufgrund der 2HV-SMOW-Werte von Limonen lassen sich keine Unterscheidungen zwischen kommerziell erhältlichen Limonen und Limonen aus Kümmelölen treffen. Dagegen können die 13CV-PDB-Werte von Limonen zur Authentizitätsbewertung von Kümmelölen herangezogen werden. Die dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Bestimmung von 2H/1H- Isotopenverhältnissen mittels GC-P-IRMS neue Möglichkeiten in der Echtheitsbewertung ätherischer Öle bietet. Insbesondere die integrale Betrachtung von 2HV- SMOW- und 13CV-PDB-Werten ( 2H/ 13C-Korrelation) wird eine Authentizitätsbewertung künftig noch wesentlich differenzierter möglich machen. Weitere Perspektiven wird die Bestimmung von 18O/16O-Isotopenverhältnissen bieten. Die Authentizitätsbewertung anhand der Multielement-Analyse mittels GC- IRMS eröffnet gerade für achirale Aromastoffe Perspektiven, stellt aber auch eine Ergänzung zur enantioselektiven Analytik dar.
Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Entwicklung, Synthese und
Charakterisierung neuartiger redoxaktiver Liganden und deren Metallkomplexen. Basierend
auf dem para- und ortho-Hydrochinon / Benzochinon-Redoxsystem wurden 13 neue
Bis(pyrazol-1-yl)methan-Liganden (28 – 36 und 67 – 70; Schema 47) synthetisiert und
vollständig charakterisiert. Ein Schwerpunkt lag auf der Einführung von Substituenten am
Bis(pyrazol-1-yl)methan-Donor, um deren Einfluss auf das N,N′-Koordinationsverhalten
gegenüber Metallionen zu untersuchen. In Analogie zu den klassichen Skorpionaten sind
Substituenten in Position 3 der Pyrazolringe in der Lage, koordinativ ungesättigte
Metallzentren kinetisch zu stabilisieren, was für potentielle Anwendungen in der Katalyse
essentiell ist. Bei den ortho-chinoiden Liganden (67 – 70; Schema 47) erfüllt die redoxaktive
Gruppe eine zweite Funktion, nämlich als Chelatdonor gegenüber Metallzentren, was die
Synthese und Untersuchung (hetero-)dinuklearer Komplexe erlaubt.
Schema 47: In dieser Arbeit synthetisierte und charakterisierte redoxaktive Bis(pyrazol-1-yl)methan-
Liganden.
Die kristallographische Charakterisierung von 10 dieser Liganden (28 – 33, 67 – 70) zeigte
größtenteils sehr ähnliche strukturelle Parameter. Ein steigender sterischer Anspruch der
Substituenten am Bis(pyrazol-1-yl)methan führte zu einer leichten Streckung der
Chinon–Bis(pyrazol-1-yl)methan-Bindung und zu kurzen Kontakten zwischen Substituenten
am zentralen Methin-Kohlenstoffatom und den ipso- (HQ-C1) bzw. ortho-Kohlenstoffatomen
(HQ-C2) am sechsgliedrigen Ring. Diese kurzen Kontakte spielten in der oxidativen
Demethylierung von 32 eine Rolle. Während alle anderen para-chinoiden Liganden mit
Cerammoniumnitrat (CAN) zu den erwarteten para-Benzochinon-Derivaten reagierten
(Schema 48), wurde im Zuge der Oxidation von 32 ein zusätzliches Sauerstoffatom am
sechsgliedrigen Ring eingeführt (47; Schema 48). Im Gegenzug wurde die sterisch am
stärksten abgeschirmte Methoxygruppe nicht oxidativ demethyliert. Letztendlich konnte
gezeigt werden, dass (i) das neu eingeführte Sauerstoffatom von atmosphärischem Sauerstoff
stammt und (ii) alle fünf Methylgruppen und beide Methoxygruppen in 32 für die Oxidation
essentiell sind.
Zusammenfassung
72
Schema 48: Oxidation der para-chinoiden Bis(pyrazol-1-yl)methan-Liganden mit CAN.
Die Cyclovoltammogramme der ortho-chinoiden Bis(pyrazol-1-yl)methan-Liganden
(untersucht am Beispiel von 67, 68 und 70) zeigten irreversible Redoxwellen, da im Zuge der
Oxidation OH-Protonen abgespalten wurden; die Redoxpotentiale liegen in einem mit
chemischen Oxidationsmitteln gut zugänglichen Bereich. 70 wurde von CAN erfolgreich
oxidiert, das Produkt 71 zersetzte sich unter den Reaktionsbedingungen allerdings sehr
schnell und konnte nicht isoliert, sondern lediglich als Additionsprodukt von 4-tert-
Butylpyridin abgefangen werden. Unter optimierten Reaktionsbedingungen und mit DDQ als
Oxidationsmittel ließen sich 70 und 68 in ihre oxidierte Form überführen und in Reinform
gewinnen. Die für ortho-Benzochinone typische Neigung zur Zersetzung wurde auch bei 71
und 73 beobachtet, wobei letzteres sich wesentlich schneller zersetzte (innerhalb von
Stunden) als 71 (innerhalb eines Tages).
Abb. 36: N,N′-Cobalt- und Palladium-Komplexe 59, 60, 74 und 75.
Die Koordinationschemie repräsentativer Vertreter der 13 redoxaktiven Bis(pyrazol-1-
yl)methan-Liganden wurde untersucht. Bereits der sterisch nur mäßig anspruchsvolle parachinoide
Ligand 29 ist in der Lage, koordinativ ungesättigte CoII-Ionen kinetisch gegenüber
der Bildung von 1:2 Komplexen zu stabilisieren. Im Festkörper liegen ausschließlich
Verbindungen mit einer 1:1 Zusammensetzung von Ligand zu CoII vor (59 und 60; Abb. 36).
In Lösung scheinen hingegen Gleichgewichte zu existieren, in denen auch die koordinativ
abgesättigten oktaedrischen 2:1 Komplexe auftreten. Die ortho-chinoiden Liganden 67 und 68
bildeten selektiv entsprechende N,N′-koordinierte PdCl2-Komplexe, ohne dass das ortho-
Hydrochinonat (Catecholat) als konkurrierender O,O′-Donor wirkte (74 und 75).
Zusammenfassung
73
Es zeigte sich jedoch auch, dass sterisch sehr anspruchsvolle Substituenten am
Bis(pyrazol-1-yl)methan-Fragment in Reaktionen mit Übergangsmetallen zu einer Zersetzung
des Ligandengerüsts führen können. So reagierte der para-chinoide tert-Butyl-substituierte
Ligand 31 mit [Co(NO3)2] zu [(HpztBu,H)2Co(NO3)2] (63). Eine analoge Zersetzung zu trans-
[(HpzR,H)2PdCl2] (76: R = Ph und 77: R = tBu) wurde nach der Reaktion der ortho-chinoiden
Liganden 69 bzw. 70 mit [PdCl2]-Quellen beobachtet.
Schema 49: Synthese von O,O′-Koordinationskomplexen der ortho-chinoiden Bis(pyrazol-1-
yl)methan-Liganden 68, 69 und 70.
Die ortho-chinoiden Bis(pyrazol-1-yl)methan-Liganden (67 – 70) besitzen mit ihrem
Catecholat-O,O′-Donor eine zweite Koordinationsstelle, was diese Liganden für die Synthese
von dinuklearen Komplexen interessant macht. Da gezeigt werden konnte, dass [PdCl2]
selektiv an den Bis(pyrazol-1-yl)methan-Donor koordiniert (vgl. 59, 60, 74 und 75; Abb. 36),
galt es als nächstes zu evaluieren, ob eine ähnlich selektive Bindung anderer Metallionen an
den O,O′-Donor möglich ist.
Abb. 37: Molekulare Strukturen ausgewählter O,O′-Koordinationskomplexe ortho-chinoider
Bis(pyrazol-1-yl)methan-Komplexe 82 (links), 83 (Mitte) und 85 (rechts).
In der Tat konnten in sehr guten Ausbeuten O,O′-gebundene [(p-cym)Ru]-, [(Phpy)2Ir]-
und [(Cp*)Ir]-Komplexe ausgewählter redoxaktiver ortho-chinoider Liganden dargestellt
werden. Vorteilhaft war die Verwendung der kristallinen, nicht-flüchtigen Base TlOtBu zum
Abfangen der im Zuge der Komplexierung freiwerdenden Protonen (Schema 49, Abb. 37).
Die Eliminierung von TlCl sorgt für eine irreversible Reaktion zu den entsprechenden
Zusammenfassung
74
Komplexen. Besonders interessant ist die Koordinationschemie des Liganden 68 im chiralen,
anionischen IrIII-Komplex 83 (Abb. 37 Mitte), der in der Synthese als Thallium-Salz anfiel
und im Festkörper TlI-verbrückte Dimere bildete.
Eine elektrochemische Charakterisierung wurde mit 85 durchgeführt. Wie erwartet, zeigte
der komplexierte Bis(dimethylpyrazol-1-yl)methan-Ligand im Gegensatz zu freiem 68 eine
reversible Oxidationswelle. Die Potentialdifferenz zwischen Liganden-Oxidation und Iridium-
Reduktion beträgt fast 2 V, was in diesem Zusammenhang bedeutet, dass sich 68 als
unschuldiger Ligand verhält und man Iridium zweifelsfrei die Oxidationsstufe +III zuweisen
kann. Mit Komplexen von 68 und leichter reduzierbaren Übergangsmetallen sollte es
hingegen möglich sein, in den Bereich des nicht-unschuldigen Verhaltens vorzudringen und
z.B. Valenz-Tautomerie zu beobachten.
Mit effizienten Synthesewegen zu N,N′-Komplexen einerseits (74 und 75; Abb. 36) und
O,O′-Komplexen andererseits (u.a. 83 und 85; Abb. 37) wurde als nächstes ein heterodinuklearer
Komplex synthetisiert (87; Schema 50). 68 erwies sich als am besten geeigneter
Ligand, da er, wie bereits erwähnt, eine gute Löslichkeit bei moderatem sterischen Anspruch
besitzt und der N,N′-Donor auch in Gegenwart von Lewis-sauren Metallionen beständig ist.
Die Wannenform des Bis(pyrazol-1-yl)methan-PdII-Chelatrings in 87 bringt das Palladium-
Ion in räumliche Nähe zum ortho-Hydrochinonat π-System. In früheren Studien dieser
Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass ein solches Arrangement Elektronenübertragungen
zwischen dem Chinon und dem koordinierten Palladium-Zentrum erlaubt.
Durch die direkte konjugative Wechselwirkung des zweiten Metallzentrums (IrIII) mit der
redoxaktiven Gruppe über die Sauerstoffatome in 87 sollte eine effektive elektronische
Ligand ↔ Metall- und Metall ↔ Metall-Kommunikation möglich sein. Die elektrochemische
Charakterisierung zeigte allerdings, dass im vorliegenden Fall die Potentiale der drei
Komponenten Chinon / PdII / IrIII mit jeweils ca. einem Volt zu weit auseinander liegen.
Schema 50: Synthese eines hetero-dinuklearen IrIII/PdII-Komplexes.
Im letzten Teilgebiet dieser Arbeit wurde die Eignung der ortho-chinoiden Liganden 67
und 70 für den Aufbau höhermolekularer Koordinationsverbindungen und oligonuklearer
Aggregate untersucht.
Zusammenfassung
75
Schema 51: Synthese der oktaedrischen Komplexliganden 89 – 96.
Dafür wurden Komplexliganden synthetisiert, die aus einem Zentralmetall bestehen, das
oktaedrisch von je drei O,O′-koordinierenden Liganden 67 bzw. 70 umgeben ist (Schema 51).
Mit den freien Bis(pyrazol-1-yl)methan-Donorgruppen vermag jeder dieser Komplexliganden
drei weitere Metallzentren zu koordinieren. Derartige Verbindungen könnten aufgrund ihrer
dreidimensionalen Struktur z.B. Anwendung im Aufbau von redoxaktiven metallorganischen
Netzwerken oder elektrisch leitfähigen Koordinationspolymeren finden. Als Zentralmetalle
dienten FeIII- und AlIII-Ionen; erstere, weil sie selbst redoxaktiv sind, und letztere, weil sie
eine im Vergleich zu FeIII ähnliche Koordinationschemie besitzen, aber wegen ihres
Diamagnetismus‘ eine NMR-spektroskopische Charakterisierung ermöglichen. Je nach
verwendeter Base wurden die dreifach anionischen Komplexliganden als Lithium- bzw.
Thallium-Salze isoliert. Die NMR-Spektren von 89, 90, 93 und 94 zeigten jeweils nur einen
Signalsatz, obwohl sich, bedingt durch die Asymmetrie des Liganden und die Chiralität des
oktaedrischen Metallzentrums, fac- und mer-Isomere bilden können. Es konnte nicht
abschließend geklärt werden, ob sich exklusiv das höhersymmetrische fac-Isomer bildet, oder
ob ein Mechanismus aktiv ist, der alle Isomere auf der NMR-Zeitskala schnell ineinander
überführt, sodass die Gegenwart lediglich einer Spezies vorgetäuscht wird. In
elektrochemischen Untersuchungen zeigten die Komplexliganden mehrere irreversible
Oxidationswellen. Ob dieses Verhalten auf eine intramolekulare Kommunikation der
einzelnen redoxaktiven Gruppen zurückzuführen ist, müssen weitergehende Studien zeigen.
Als prinzipieller Beleg für die präparative Anwendbarkeit der Komplexliganden und
Grundlage für die Untersuchung der Koordinationschemie der oktaedrischen
Komplexliganden, wurden PdII-Komplexe von 89 und 93 synthetisiert.
Der Einsatz von Mikrowellen zur Synthese von Organosilicioumverbindungen ist bislang nicht beschrieben und wird mit der vorliegenden Arbeit eingeführt. Dazu wurde eine Haushaltsmikrowelle durch Öffnen des Sicherheitskäfigs und entsprechender Abschirmung so modifiziert, dass mit den üblichen Labormaterialien gearbeitet werden konnte. Exemplarische Reaktionen in flüssiger Phase, wie die Synthese von Silatranen und silatrananalogen Verbindungen, können gegenüber der klassischen Reaktionsführung bis zum Faktor 60 bei vergleichbaren Ausbeuten und Reinheiten beschleunigt werden. Auch die direkte Konversion von SiO2 in reaktive Verbindungen gelingt unter Mikrowellenbedingungen deutlich beschleunigt. Weitere Modifikationen der Apparatur ermöglichen die Durchführung von Festphasen-Gas Reaktionen unter Verwendung von Silicium und verschiedenen Reaktionsgasen. Verwendet wurden dazu Cl2, HCl, CH3Cl sowie Gemishce dieser Gase. Auch wurden die Reaktionen unter verschiedenen Stufen der Argonverdünnung durchgeführt. Erstaunlicherweise glüht dabei das Silicium innerhalb von Sekunden mit einer Temperatur von über 1000°C. Die Untersuchungen zeigen eine hohe Tendenz zur Bildung von monomeren Siliciumverbindungen, sobald Methylchlorid beteiligt ist, wird bevorzugt das technisch bedeutsame Me2SiCl2 beobachtet. Alle Ergebnisse gehen konform mit der Annahme, dass durche Mikrowelle aktiviertes Silicium bereitgestellt wird. Dadurch kann es zur Bildung und Stabilisierung von intermediären Silylenen kommen, die in verschiedene Bindungen der Reaktionspartner insertieren. Bemerkenswert ist auch die geringe elektrische Leistung von 200 Watt, die in allen diskutierten Umsetzungen ausreicht, um die gewünschten Reaktionen durchzuführen. Darüber hinaus wurde auch der Unterschied zwischen Multimode- und Singlemodegeräten untersucht. Nur bei Verwendung von Multimodegeräten könenn die beschriebenen Ergebnisse erzielt werden. Beim Einsatz von Singlemodegeräten entsprechen die Resultate denen, die bei klassischer thermischer Reaktionsführung erzielt werden.
Ein früherer Vorschlag zum Reaktionsmechanismus der DFPase, der eine Wasseraktivierung durch den Rest H287 postulierte, mußte nach neuen experimentellen Daten verworfen werden. Daher lag zu Beginn der hier vorliegenden Arbeit kein Vorschlag für den Mechanismus der DFPase vor, der die experimentellen Daten erklären konnte. Für das längerfristige Ziel, die katalytischen Eigenschaften der DFPase gezielt verändern zu können, war es daher notwendig, zunächst den Mechanismus der Hydrolyse von Verbindungen wie DFP durch die DFPase näher zu untersuchen. Durch computergestützte Modellierung im aktiven Zentrum der DFPase (Docking) wurde die Bindung von DFP und anderen Substraten der DFPase genauer untersucht und mit vorhandenen experimentellen Daten verglichen. Diese Arbeiten führten auch zur theoretischen Untersuchung des Bindungsverhaltens von O,O-Dialkylphosphoroamidaten als potentiellen Inhibitoren der DFPase. Diese den Dialkylfluorophosphaten strukturell sehr ähnlichen Substanzen werden durch die DFPase nicht umgesetzt. Die Ergebnisse der Dockinguntersuchung führten schließlich zu der Synthese von drei Phosphoroamidaten unter der Untersuchung ihres Verhaltens als Inhibitoren der DFPase. DIe Charakterisierung erfolgte dabei über enzymkinetische Methoden sowie NMR-Experimente. Mit dem stärksten Inhibitor O,O-Dicyclopentylphosphoroamidat gelang die Kristallisation eines Komlexes mit der DFPase, der mit der Methode der Röntgenbeugung strukturell bestimmt werden konnte. Dieser Komplex belegt die Bindung der Phosphorylgruppe von Substraten an das katalytisch wirksame Calciumion im aktiven Zentrum der DFPase und zeigt die vorherrschenden Bindungskräfte zwischen Ligand und Protein auf. Eine Reihe von Mutanten der DFPase, bei denen gezielt die koordinierenden Aminosäuren des katalytischen Calciumions verändert wurden, ergänzte die bereits in früheren Arbeiten erzeugten Mutanten. Die katalyischen Eigenschaften dieser Mutanten und ihre Fähigkeit zur Metallbindung gestatten es, diese Metallbindungsstelle genauer zu beschreiben und lassen zusammen mit den Dockingexperimenten und der Struktur des Inhibitor-Enzymkomplexes vermuten, dass der calciumkoordinierende Aminosäurerest D229 als aktives Nukleophil im Reaktionsmechanismus der DFPase fungiert. Diese Vermutung ließ sich mit experimentellen Daten untermauern. Durch 18O-Isotopenmarkierung konnte gezeigt werden, dass ein Sauerstoffatom von D229 auf das entstehende Produkt übertragen wird. Hierdurch konnte die Existenz eines Phosphoenzymintermediats nachgewiesen werden. Des weiteren gelang es, Kristalle der DFPase zu züchten, die für Neutronenbeugungsexperimente geeignet waren. Im Rahmen dieser Experimente gelang die Aufnahme eines vollständigen Datensatzes und die Lösung der Neutronenbeugungsstruktur der DFPase in einer Auflösung von 2,2 Å. Diese Neutronenstruktur, in der Wasserstoffatome im Unterschied zu Röntgenstrukturen gut sichtbar sind, zeigt eindeutig, dass der Rest D229 wie erforderlich deprotoniert und dass das in der Bindungstasche an das Calciumion koordinierende Wassermolekül nicht als Hydroxid vorliegt. Damit ließ sich die direkte Aktivierung von Wasser durch das Metallion ausschließen. Neben wichtigen Informationen über die Bindungstasche der DFPase lieferte die Neutronenstruktur auch detaillierte Einblicke in das Wasserstoffbrückennetzwerk im zentralen, wassergefüllten Tunnel des Proteins. Über die Bestimmung des Wasserstoff/Deuteriumaustausches von Proteinrückgradamiden konnten weitere Aussagen über die Solvenszugänglichkeit von verschiedenen Proteinbereichen gemacht werden. Für die DFPase konnten strukturell und funktionell ähnliche Proteine identifiziert werden. Neben der Paraoxonase 1 waren dies das Calciumbindeprotein Regucalcin aus Agrobacterium thumefaciens sowie das Drug Resistance Protein 35 aus Staphylococcus aureus. Es konnte gezeigt werden, dass diese Proteine eine der katalytischen Calciumbindestelle der DFPase vergleichbare Metallbindestelle aufweisen und verschiedene Enzymaktivitäten dieser Proteine durch einen Mechanismus mit einem zu D229 analogen Nukleophil erklärt werden können. Ein direkter Vergleich zwischen der DFPase und der humanen Paraoxonase gelang durch Untersuchungen mit fluorogenen Organophosphaten als Substrate. Hierbei konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die DFPase in der Lage ist, Substrate mit einer P-O Bindung hydrolytisch zu spalten. Die unterschiedlich gute Umsetzung der verschiedenen Substrate durch die beiden Enzyme konnte auf der Grundlage der Proteinstrukturen erklärt werden, wobei für die Paraoxonase postuliert wurde, dass der calciumbindende Aminosäurerest D269 als zu D229 analoges Nukleophil wirkt. Abschließend gelang es, zusätzlich eine Zusammensetzung für eine Enzympräparation zu finden, die eine Gefriertrocknung der DFPase mit nur geringem Verlust an enzymatischer Aktivität erlaubt. Ein solches lagerstabiles Enzympulver ist ein notwendiger Schritt hin zu einer praktischen Anwendung der DFPase für die technische Dekontamination von hochtoxischen Nervenkampfstoffen.
Das wachsende Verständnis für das fein abgestimmte Zusammenspiel aus Struktur und Funktion von Nukleinsäuren resultiert aus unzähligen Forschungsprojekten. Forschende stehen dabei vor der Herausforderung, dass die zu untersuchenden Oligonukleotide sowohl modifiziert als auch in ausreichender Menge und Reinheit dargestellt werden müssen. Die chemische Festphasensynthese ist ein bewährtes Mittel zur Synthese hochmodifizierter DNA und RNA. Allerdings werden Oligonukleotide mit zunehmender Länge unzugänglicher, da die einzelnen Kupplungsreaktionen nicht quantitativ ablaufen, was zu schwer abtrennbaren Abbruchsequenzen führt. Hinzu kommt, dass während der chemischen Synthese harsche Reaktionsbedingungen nötig sind, denen die gewünschten Modifikationen standhalten müssen. (Chemo-) enzymatische Methoden können diese Hürden überwinden und somit den Zugang zu biologisch interessanten, längeren modifizierten Sequenzen ermöglichen. Jedoch erfolgt der enzymatische Einbau von Modifikationen ohne aufwendige Optimierung lediglich statistisch verteilt. Um weitere Erfolge im Bereich der Strukturaufklärung zu erzielen, werden somit Synthesemethoden benötigt, die sich zum positionsspezifischen Einbau von Modifikationen eignen und gleichzeitig den Zugang zu längeren Oligonukleotiden ermöglichen. Zur Untersuchung der Zusammenhänge zwischen Struktur und Funktion haben sich in den letzten Jahren lichtadressierbare Verbindungen als gefragte Modifikationen erwiesen. Der Einsatz von Licht als mildes, nicht-invasives Auslösesignal stellt besonders im biologischen Kontext eine interessante Herangehensweise dar. Um hochwertige Aussagen über das Verhalten von Oligonukleotiden in komplexer biologischer Umgebung machen zu können, muss durch die gezielte Platzierung lichtaktivierbarer Verbindungen ein effizientes AN/AUS-Verhältnis geschaffen werden. Der Einbau photolabiler Schutzgruppen erlaubt eine vorübergehende Beeinflussung der Oligonukleotidstruktur, die durch Abspaltung der Schutzgruppe irreversibel (re-) aktiviert werden kann. Im Gegensatz dazu ermöglicht der Einbau von Photoschaltern eine reversible Adressierbarkeit durch Isomerisierungsprozesse. Die Synthese komplexer gezielt-markierter Oligonukleotide erfolgt zumeist chemisch und ist daher längenlimitiert.
Ziel dieser Doktorarbeit war es, beide Fragestellungen zu vereinen und eine chemo-enzymatische Methode zur RNA-Synthese zu untersuchen, die zum einen die positionsspezifische Modifizierung mit lichtaktivierbaren Einheiten erlaubt und darüber hinaus die Längenlimitierung der chemischen Festphasensynthese überkommt. Im Zentrum der Methode stehen drei enzymatische Reaktionsschritte zum Einbau von photolabil- und photoschaltbar-modifizierten Nukleosid-3‘,5‘-Bisphosphaten: I) eine 3‘-Verlängerung, in der die modifizierten Bisphosphate mit T4 RNA Ligase 1 mit dem 3‘-Ende einer RNA verknüpft werden; II) die Dephosphorylierung des 3‘-Phosphats mit Shrimp Alkaline Phophatase und III) die Verknüpfung der 3‘-terminal modifizierten RNA mit einem zweiten 5‘-phosphorylierten RNA-Fragment, wodurch eine Gesamtsequenz mit gezielt platzierter Modifikation entsteht (Abb. I).
Im ersten Teilprojekt wurden in kollaborativer Arbeit zunächst benötigte photolabile NPE- und photoschaltbare Azobenzol-C-Nukleosid-3‘,5‘-Bisphosphate synthetisiert und grundlegende Bedingungen der enzymatischen Reaktionen erarbeitet. Hierbei konnte der enzymatische Syntheseansatz erfolgreich in Lösung umgesetzt und der chemo-enzymatische Einbau aller synthetisierten Bausteine nachgewiesen werden. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen wurde die Methode in eigenständigen Arbeiten weiterverfolgt, um den multiplen Einbau NPE-modifizierter Nukleosid-3‘,5‘-Bisphosphate in direkter Nachbarschaft sowie deren Einbau in DNA/RNA-Mixmere mit Phosphodiester- oder Phosphorthioatrückgrat zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass die verwendeten Enzyme neben lichtaktivierbaren Modifikationen zusätzliche Anpassungen der Phosphateinheit sowie unterschiedliche Ribosebausteine in Kombination tolerieren. Da exogene RNA schnell von Exonukleasen abgebaut und somit unwirksam wird, werden zahlreiche stabilisierende Anpassungen an synthetischen RNAs vorgenommen. Zu den häufigsten zählen Phosphorthioate und Modifikationen der Ribose. Mit der erfolgreichen Modifikation der chimären Oligonukleotide eröffnet die erarbeitete Methode einen wichtigen Zugang zu therapeutisch interessanten Oligonukleotiden. Ein weiterer wichtiger Schritt in Richtung biologisch relevanter Anwendungsmöglichkeiten konnte mit der Synthese, Charakterisierung und Umsetzung eines DEACM-geschützten Uridin-3‘,5‘-Bisphosphates (pUDEACMp) errungen werden. Im Vergleich zur verwendeten NPE-Schutzgruppe ist das Absorptionsspektrum der DEACM-Schutzgruppe bathochrom-verschoben, was eine Abspaltung mit Wellenlängen > 400 nm erlaubt. Dadurch können Zellschäden vermieden und Oligonukleotide mit NPE- und DEACM-Modifikation wellenlängenselektiv angesprochen werden...
Eine in vivo Modifizierung von Blutstammzellen wäre für eine Reihe gentherapeutischer Therapieansätze vorteilhaft. Dies würde voraussetzen, dass retrovirale Vektoren gezielt auf Blutstammzellen ausgerichtet werden können. Für dieses sogenannte Zelltargeting bietet sich das vom Milznekrose-Virus von Vögeln (SNV) abgeleitete Vektorsystem an, bei dem die Rezeptorbindungsdomäne des Env-Proteins modifiziert werden kann. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte ein SNV-basierter retroviraler Zelltargeting-Vektor entwickelt werden, der einen selektiven Gentransfer in die primären humanen CD34-positiven hämatopoetischen Zellen ermöglicht. Zur weitergehenden Charakterisierung des SNV-Vektorsystems sollte geklärt werden, ob das Env-Protein des SNV ein mit anderen gamma-retroviralen Env-Proteinen vergleichbares R-Peptid aufweist, dessen mögliche Rolle bei viralem Zelleintritt ebenfalls untersucht werden sollte. Um eine Zielzell-Spezifität des SNV-Vektors zu erreichen, wurde die gesamte SU-Domäne des SNV-Env-Proteins mit einem einkettigen Antikörperfragment (scFv) ersetzt, das gegen das CD34 Molekül gerichtet ist,. Mit diesem modifizierten Env gelang es, [(antiCD34-TM)SNV]-Vektorpartikel herzustellen, die spezifisch CD34-positive Zellen transduzierten. Essentiell für die Erzeugung solcher Vektoren war die Etablierung einer stabilen Verpackungszelllinie, die Vektorpartikel mit einem Titer von 2x105 i.E./ml produzierte. In Transduktionsexperimenten mit verschiedenen Zelllinien wurde gezeigt, dass [(antiCD34-TM)SNV]-Vektoren eine deutliche Präferenz für CD34+-Zellen und nicht für CD34--Zellen besitzen, wobei der Unterschied in der Transduktionseffizienz zwischen CD34-positiven und –negativen Zellen um den Faktor 100 lag. [(antiCD34-TM)SNV]-Vektoren waren in der Lage, den Reportergentransfer auch in primäre humane Stammzellen zu bewirken. Hierzu wurde ein Transduktionsprotokoll so optimiert, dass die aus dem Nabelschnurblut isolierten CD34+-Zellen transduziert werden konnten. Der für diese Zielzellen bestimmte Vektortiter betrug bis zu 2x106 i.E./ml. In einem Gemisch von primären CD34+- und CD34--Zellen konnte der Vektor zwischen dem Target- und Nontarget-Zellen unterscheiden. Somit wurde zum ersten Mal nicht nur Spezifität, sondern auch Selektivität des SNV-Vektorsystems demonstriert. Dieses Ergebnis ist für eine Weiterentwicklung des Vektors für die in vivo Anwendung in Rahmen einer Gentherapie eine wichtige Voraussetzungen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Fusionsvorgang bei Virus-Eintritt näher untersucht. Anlass dafür war die experimentelle Beobachtung, dass das Env-Protein des SNV bei der Virusknospung von einer viralen Protease innerhalb der zytoplasmatischen Domäne proteolytisch gespalten wird. Ein Sequenz-Vergleich des SNV TM-Proteins mit dem MLV TM-Protein ergab Hinweise darauf, dass es sich um die Abspaltung des sogenannten R-Peptides analog zu MLV handeln könnte. Die Expression von SNV-Env- Mutanten mit einem entsprechend verkürzten C-Tail (Env delta R) führte zur Synzytien-Bildung. Die bildung hochfusogener Oberflächenhüllproteine durch die Abspaltung des R-Peptids konnte auch für andere gamma-Retroviren gezeigt werden. Die Synzytienbildung konnte quantitativ unter den Env delta R-Varianten verschiedener gamma-Retroviren in einem etablierten Fusionsassay verglichen werden. Das Env delta R des endogenen Retrovirus des Schweins (PERV) des Typs A erwies sich als potentestes Fusionsagens. Als Folge der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wurde postuliert, dass die Abspaltung des R-Peptides ein allgemeiner Mechanismus bei der Partikelreifung der gamma-Retroviren ist und eine fusionsregulierende Rolle besitzt. Eine Weiterentwicklung fusionsaktiver Env-Varianten als mögliche therapeutische Gene für eine Tumor-Gentherapie ist somit diskutierbar.
Erfolgreich wurde die biochemische Synthese eines Kernbereiches der spleißosomalen U4/U6-RNA etabliert und die Sekundärstruktur mittels NMR-spektroskopischer Methoden charakterisiert. Die Konformationen von zwei molekularen Regeleinheiten, des auf Gramicidin A basierenden Ionenkanals Minigramicidin sowie einem aus zwei cis-Dekalinen aufgebautenmolekularen Schalters konnten in unterschiedlichen Umgebungen mit Hilfe der NMR-Spektroskopie erfolgreich bestimmt werden. Die Synthese des RNA-Konstruktes u4u6a46phh2 erfolgte durch Transkription von plasmidischer Templat-DNA mit T7-Polymerase und anschließender Aufreinigung mittels Gelelektrophorese und Homogenisierung am 3’-Ende mit Hilfe eines passenden Hammerhead-Ribozyms. u4u6a46phh2-RNA kann als Konstrukt für die Synthese von 13C/15N-gelabelter RNA dienen, da die Schneidreaktion und die daraus resultierende RNA definiert ist und die Integrale der Iminoprotonen für eine einzige Konformation der RNA sprechen. Das von Dr. Hans-Dieter Arndt in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Koert an der Humboldt-Universität zu Berlin hergestellte Minigramicidin ist aus zwei verkürzten Gramicidin A-Einheiten aufgebaut, die in einer Kopf-an-Kopf Anordnung durch einen Bernsteinsäure-Linker kovalent verknüpft sind. In dieser Arbeit wurden die Strukturen von Minigramicidin in zwei unterschiedlichen Umgebungen aufgeklärt: in Benzol/Aceton (10:1, v/v) ohne Zusatz von Kationen und in gesättigter Cäsiumchlorid-Chloroform/Methanol (3:1, v/v)-Lösung. Im ersten Fall findet man ein doppelt helikales linksgängiges Dimer von Minigramicidin mit ca. 5.7 Resten pro Windung. Diese Struktur hat eine Länge von ca. 38 Å und einen Durchmesser von ca. 1.2 Å. Mit Cäsium-Kationen liegt die Verbindung als Monomer vor. Sie bildet eine rechtsgängige pi-Helix mit ca. 6.3 Resten pro Windung. Die Struktur hat eine Länge von 17 Å und einen Durchmesser von ca. 4.5 Å. Es konnte erstmals eine zur ionenkanalaktiven Form des gA ähnliche Konformation eines auf gA basierenden künstlichen Ionenkanals in organischen Lösemitteln nachgewiesen werden. Der von Dr. Michael Karle aus der Arbeitsgruppe von Prof. Koert an der Philipps-Universität Marburg synthetisierte molekulare Schalter besteht aus zwei cis-Dekalineinheiten, die durch einen 14-gliedrigen Bislactam-Ring miteinander gekoppelt sind. Der Schaltprozeß wurde dabei durch die saure Spaltung des Ley-Acetals in 13 ausgelöst. Es wurde für die Verbindung 13 eine all-axial Stellung für den Makrozyklus gefunden. Diese Struktur wird auch durch die gefundenen Kopplungskonstanten gestützt. Nach dem Schaltprozeß wurde die Struktur von 16 ermittelt. Wie erwartet, wurde durch das Lösen der konformativen Klammer ein Doppelringflip im linken Dekalingerüst ausgelöst und durch den Makrozyklus auf das rechte Dekalingerüst übertragen. Die gefundenen ROE-Abstände und Kopplungskonstanten für bestimmte Dekalinprotonen bestätigen die umgeschaltete Struktur.
In den letzten zwei Dekaden wurde die Rolle der RNA in biologischen Prozessen intensiv untersucht. Man erkannte immer deutlicher, dass ihre Funktion über die einfache Vermittlung von Information von der DNA hin zum Protein weit hinausgeht. So spielt sie eine entscheidende Rolle bei der Genexpression und besitzt darüber hinaus auch katalytische Eigenschaften. Die Entdeckung der reversen Transcriptase beim HI-Virus konnte zeigen, dass genetische Informationen nicht nur in Richtung von DNA zu RNA, sondern auch in Entgegengesetzter Richtung übertragen werden kann. Diese Schlüsselrolle in vielen wichtigen biochemischen Prozessen macht die RNA zu einem viel versprechenden Ziel für die Entwicklung neuer Wirkstoffe, um in diese Prozesse eingreifen zu können. RNA bildet eine Vielzahl von stabilen Sekundär- und Tertiärstrukturen aus, die es Proteinen und Antibiotika ermöglicht, sie zu adressieren. Die bis heute wohl mit Ausnahme des Ribosoms und der tRNAs am besten aufgeklärte Struktur einer RNA ist die der HIV TAR-RNA (transaktivierende Region). Ein essentieller Bestandteil für die virale Genexpression ist die so genannte TAR-RNA. Diese befindet sich am 5-Ende aller viraler Transcripte und bildet eine aus 59 Basen bestehende stem-bulge-loop hairpin Struktur. Diese tritt in Wechselwirkung mit dem tat-Protein. Die Grundlage für die Erkennung des hierbei entstehenden Komplexes ist eine Wechselwirkung von tat mit der bulge- und loop-Region von TAR. Durch Interaktion mit der loop- Region kommt es zur Ausbildung eines CyclinT1/tat Komplexes, der im weiteren dafür verantwortlich ist, dass sich die Rate der Transkription um das mehrere hundertfache erhöht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Liganden zu synthetisieren, die spezifische Bindungen mit der TAR-RNA aus HIV-1 eingehen. Durch eine solche Bindung ist es möglich, den viralen Replikationszyklus zu unterbrechen. Ausgehend von einem relativ rudimentären Design, basierend auf dem Arginin-Fork-Model von Frankel, gelang es, mit Triaminopyrazol und verschiedenen seiner Derivaten dieses Ziel zu erreichen. Nach erfolgreicher Synthese der Zielstrukturen wurden diese in einem FRET-Assay im Hinblick auf ihre Affinität zu der TAR-RNA getestet. 3,4,5-Triaminopyrazol übertraf trotz seiner geringen Größe und Ladung mit einem IC50-Wert von 30 µM die Werte vieler tetrakationischer Tripeptide (FRET). Nach erfolgreicher Bestimmung der TAR-Affinität von Triaminopyrazol wurde seine Wirkung auf HIV-infizierte Hela P4-Zellen untersucht, die ein Tat-TAR-kontrolliertes Reportergen exprimierten. Dabei zeigte Triaminopyrazol eine Inhibierung mit IC50 = 50 µM. Bis zu einer Konzentration von 500 µM traten hierbei keine toxischen Effekte auf. Dies legt die Vermutung nahe, dass es sich bei Triaminopyrazol tatsächlich um einen tat- Antagonisten handelt. Ebenso konnte gezeigt werden, dass die Wirkung von Triaminopyrazol nicht die eines Entryinhibitors ist, sondern dass die Verbindung in der Lage ist, die Zellmembran zu durchdringen.
Die vorliegende Arbeit befasste sich in erster Linie mit der Regulation des P2X2 Rezeptors (P2X2R) durch Phosphoinositide (PI). P2X Rezeptoren sind durch extrazelluläres ATP aktivierte Kationenkanäle, die ubiquitär unter Vertebraten, v. a. im zentralen wie peripheren Nervensystem exprimiert werden. Bis heute sind 7 verschiedene Untereinheiten dieser Rezeptorfamilie bekannt, die nach homo- oder heterotrimerer Assemblierung unterschiedliche funktionelle Phänotypen ausbilden. Die P2X Rezeptoren sind an einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen beteiligt. Für ihre Beteiligung am zellulären Signalgeschehen wurde in der Vergangenheit der Begriff der purinergen Signaltransduktion geprägt. PI4,5P2 ist ein zelluläres, an der Innenseite der Plasmamembran verankertes Phospholipid, dem zahlreiche, essentielle Funktionen zukommen. Dass es auch Signalfunktion besitzen kann, wurde erst spät (1980) bekannt; dass es darüber hinaus zudem membranäre Transportsysteme reguliert, konnte erst in den letzten Jahren gezeigt werden. Die ersten Kanäle, für die eine Phosphoniositid (PI)-Beeinflussung nachgewiesen wurde, waren die einwärts gleichrichtenden K+-Kanäle. 2006 wurden die ersten vorläufigen Hinweise publiziert, dass auch die Kanalfunktion der P2X Rezeptoren durch Phosphoinositide beeinflusst werden kann. Darauf aufbauend wurde in der vorliegenden Arbeit der P2X2R nach Expression in Xenopus Oozyten elektrophysiologisch auf eine mögliche Regulation durch PIPns untersucht. Um die in der Oozyte vorliegenden PI-Level gezielt während der Messung ändern zu können, wurde die spannungsgesteuerte Phosphoinositid-Phosphatase Ci-VSP coexprimiert. Ci-VSP, die der PTEN-Phosphatase strukturell sehr ähnlich ist, wurde 2005 aus der Schlauchascidie Ciona intestinalis kloniert. In der veröffentlichten Klonierungsarbeit wurde bereits gezeigt, dass Ci-VSP in der Lage ist, bekannte PI4,5P2-sensitive Membrankanäle, wie z. B. bestimmte K+-Kanäle, spannungsabhängig zu inhibieren. Es konnte in TEVC-Experimenten gezeigt werden, dass die durch Depolarisation induzierte Aktivierung dieser Phosphatase den P2X2 Rezeptorstrom in seiner Desensibilisierung sowohl beschleunigt als auch verstärkt. Dieser Effekt war spannungsabhängig und nahm mit höherer Depolarisation zu. Die ermittelte Spannungsabhängigkeit stimmte dabei mit dem sensitiven Potentialbereich der spannungsgesteuerten Ci-VSP-Domäne, gemessen an ihren gating-Strömen, überein. Der „Ci-VSP-Effekt“ auf den P2X Rezeptor konnte nur in Anwesenheit von ATP, d.h. bei aktiviertem Rezeptor, beobachtet werden. Wurden die Oozyten mit Wortmannin, einem PI4-Kinase(PI4K)-Inhibitor, behandelt, zeigte sich eine vergleichbare Veränderung des Rezeptorstroms. Eine PI4K-Inhibition zielt demnach offensichtlich auf die gleichen Regulationsmechanismen wie die Ci-VSP-Aktivierung. In weiterführenden zellfreien Patch Clamp-Messungen an Oozytenmembranen wurden sowohl Einzelkanal- als auch makroskopische Ströme des P2X2R unter Einfluss verschiedener, intrazellulär verabreichter PIs und PI-beeinflussender Enzyme untersucht. Einzig die Zugabe von PI4,5P2 hatte einen deutlich aktivierenden Einfluss auf den makroskopischen Rezeptorstrom, andere getestete PIs (wie auch PI3-Kinase und PTEN-Phosphatase) zeigten keinerlei Wirkung. Vergleichbare Ergebnisse konnten in vorläufigen Einzelkanal-Messungen an diesem Rezeptor Subtyp beobachtet werden. Da die PI4-Kinase offensichtlich an der beobachteten Beeinflussung der P2X2R Desensibilisierung beteiligt ist, wurde die P2X2-Rezeptorsequenz auf potentielle - über sogenannte SH3-Epitope vermittelte - PI4K-Interaktionsbereiche hin untersucht. Diese SH3-Epitope kommen in vielen zellulären Proteinen vor, um Protein-Protein-Interaktionen zu vermitteln. Nach Sequenzanalyse des maßgeblich am Desensibilisierungsgeschehen beteiligten C-Terminus des P2X2R konnte im distalen Teil ein SH3-Bindungsmotiv lokalisiert werden, das daraufhin durch gerichtete Mutagenese (P2X2-P451A/P454A) unwirksam gemacht wurde. Dieser mutierte Rezeptor verhielt sich in seiner Desensibilisierung wie der Wildtyp nach Wortmannin-Behandlung, zeigte also eine intrinsisch verstärkte Desensibilisierung. Eine Wortmannin-Behandlung der Oozyten, die den mutierten Rezeptor exprimierten, führte hingegen zu keiner weiteren Beeinflussung des Rezeptorstroms. Somit konnte letztlich der Schluss gezogen werden, dass die PI4K, und das mit ihr in direkter Verbindung stehende PI4,5P2, einen maßgeblichen Einfluss auf das Desensibilisierungsverhalten des P2X2R hat. Auf Basis der erarbeiteten Befunde wurde ein kinetisches Reaktionsmodell des P2X2R erstellt, das bisher aufgestellte Modelle mit den Ergebnissen dieser Arbeit vereint, aber auch in teilweisem Gegensatz zu dem von FUJIWARA & KUBO [2006] steht. Des Weiteren wurde im Verlauf dieser Arbeit die reversible Inhibition des P2X2R durch eine Reihe von Aminoglykosid-Antibiotika untersucht. Durch Analyse der Dosis-Wirkungs-Beziehungen, der Spannungs- sowie wie ATP-Konzentrations-Abhängigkeit der Inhibition konnte gezeigt werden, dass es sich dabei um einen nicht-kompetitiven open pore block handelte. Durch weiterführende Untersuchungen an einer nicht-desensibilisierenden P2X2/1 Rezeptorchimäre wurde gezeigt, dass eine Aminoglykosid-Inhibition die ATP-Dissoziation von der Rezeptorbindungsstelle signifikant verlangsamte. Dieser Befund deutet auf eine im Vergleich zum geschlossenen Zustand erhöhte Affinität des offenen Zustands für ATP hin. Neben den hier untersuchten Aminglykosiden sind bislang keine weiteren Substanzklassen bekannt, die den P2X2R durch einen derartigen Mechanismus hemmen.
PPARs gehören wie die Steroidhormon-Rezeptoren (z. B.Glucocorticoid-, Estrogen- oder Testosteron-Rezeptoren) zur Superfamilie der nukleären Rezeptoren. Es existieren drei PPAR-Subtypen, die als PPARalpha, PPARbeta/delta und PPARgamma bezeichnet werden und von drei verschiedenen Genen kodiert werden. Fibrate sind PPARalpha-Agonisten, welche die Plasma-Triglyceridspiegel reduzieren und gleichzeitig eine moderate Steigerung des HDL-Cholesterols bewirken. Thiazolidindione (Glitazone) sind PPARgamma-Agonisten, die bei Typ-2-Diabetes-mellitus indiziert sind und als Insulinsensitizer wirken. Duale PPARalpha/gamma-Agonisten stellen eine neue Klasse von Arzneistoffen dar, die zukünftig zur Behandlung von Typ-2-Diabetikern mit gestörtem Lipidprofil eingesetzt werden könnten. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde eine Leitstrukturoptimierung des selektiven PPARalpha-Agonisten Pirinixinsäure (WY 14643) durchgeführt. Die pharmakologische In-vitro-Charakterisierung der Substanzen erfolgte mit Hilfe subtypspezifischer Reportergen-Assays. Zusätzlich wurde gezeigt130, dass Chinolinderivate der Pirinixinsäure 5-LOX-inhibierende Eigenschaften in polymorphnukleären Leukozyten zeigen. Zunächst wurde eine geeignete Synthesestrategie zur Darstellung von Pirinixinsäurederivaten etabliert, was zur Charakterisierung und Identifizierung einer Serie von potenten dualen PPARalpha/gamma-Agonisten und 5-LOX-Inhibitoren führte. Die Synthesestrategie zur Darstellung von sowohl im Arylamino-Bereich (W) als auch in alpha- Position (R) modifizierten Derivaten der Pirinixinsäure bestand in einer vierstufigen Reaktionsfolge (I–IV; siehe Abb.). ... Die PPAR-Modulatoren (Carbonsäuren) 4, 8, 14, 32–38, 41 und 42 wurden in-vitropharmakologisch unter Anwendung subtypselektiver Reportergen-Assays (hPPARalpha, beta, gamma) charakterisiert. Die 5-LOX-Modulatoren (Carbonsäureester) 3, 7, 8, 13, 14, 24–29, 31–42 und 50 wurden in-vitro-pharmakologisch unter Anwendung des 5-LOX-Standardassays in intakten PMNL (polymorphnukleäre neutrophile Leukozyten) evaluiert. Die vorliegende Untersuchung deckte auf, dass der Ersatz des 2,3-Dimethylanilin-Strukturelements der Pirinixinsäure durch 6-Aminochinolin zu einem Gesamtverlust des PPARalpha/gamma-Agonismus führt. Durch Strukturmodifikationen im Arylamino-Bereich der Leitstruktur WY 14643 mit für 5-LOX-Non-Redoxinhibitoren typischen Pharmakophorresten, Tetrahydropyran-4-yl (Substanzen 13–14) und Methoxychinolin-2-yl (Substanz 43), konnte eine signifikante Steigerung des 5-LOX-inhibitorischen Potenzials erzielt werden [IC50 7 mikro M (13) bzw. 4 mikro M (43)]. Die alpha-alkylsubstituierten Carbonsäurederivate 33–38 zeigten sowohl am hPPARalpha als auch am hPPARgamma eine mit der aliphatischen Kettenlänge steigende Potenz. Am hPPARalpha erwiesen sich das alpha-Hexyl-Derivat 35 und das alpha-Butyl-Derivat 34 mit EC50-Werten von 1,9 mikro M (35) bzw. 11,5 mikro M (34) entsprechend einer Steigerung der Aktivität gegenüber WY 14643 um den Faktor 20 (35) bzw. den Faktor 4 (34) als besonders potent. Im Falle des hPPARgamma zeigten ebenso das alpha-butylsubstituierte Derivat 34 und der alpha-hexylsubstituierte Ligand 35 die höchste Aktivität mit EC50-Werten von 8,7 mikro M (34) bzw. 5,8 mikro M (35) und einer Steigerung der Aktivität gegenüber WY 14643 von Faktor 6 (35) bzw. Faktor 9 (34). Die Einführung von alpha-Alkylsubstituenten in das Grundgerüst der Pirinixinsäure führt möglicherweise zum Besetzen der linken proximalen Bindungstasche und somit zu einer im Vergleich zur Leitstruktur WY14643 stärkeren Bindung in die Ligandenbindungstasche des Rezeptors. Die Besetzung dieser proximalen Bindungstasche entscheidet jedoch nicht über die PPAR-Selektivität, da diese sowohl von hPPARalpha- als auch von hPPARgamma-Agonisten belegt wird. PPARalpha/gamma-Selektivität kann zum einen durch das Besetzen der linken bzw. rechten distalen Bindungstasche erzielt werden, zum anderen durch die Auswahl verschiedener acider Kopfgruppen. Aufgrund unterschiedlicher Aminosäuresequenzen der Bindungstaschen der einzelnen PPAR-Subtypen ergibt sich für die Kopfgruppen der PPAR-Modulatoren im hPPARalpha und hPPARgamma eine durch den sterischen Einfluss von Carboxyl- bzw. TZD-Kopfgruppen verursachtes unterschiedliches Wasserstoffbrückennetzwerk. Im Vergleich mit Pirinixinsäure konnte nur durch die Einführung der größeren Alkylketten (n-Butyloder n-Hexyl) ein stark erhöhter dualer PPARalpha/gamma-Agonismus erreicht werden. Die Substitution des sekundären Amins der Chinolin-6-ylverbindungen durch einen Ether-Sauerstoff in den Substanzen 41 und 42 sowie die Einführung eines Linkers, genauer einer Methylengruppe, zwischen dem Chinolin-6-ylrest und dem Scaffold (Derivate 29 und 36), führt zu einer verminderten Aktivität sowohl an hPPARalpha als auch an hPPARgamma. Eine mögliche Erklärung hierfür könnte sein, dass an entsprechender Position der Liganden-Bindungstasche eine Wasserstoffbrücken-Akzeptor-Position vorhanden ist, welche zur Erhöhung der Affinität beiträgt. Offensichtlich wird, durch die Ausbildung einer Wasserstoffbrücke zwischen der NH-Funktion und einem Wasserstoffbrücken-Akzeptor innerhalb der LBP im Falle von WY 14643 ein hoher Bindungsbeitrag erreicht. Daten bezüglich der Inhibierung der 5-Lipoxygenase demonstrieren, dass 6-Aminochinolinderivate potente 5-LOX-Inhibitoren sind. Die Einführung eines 3,5-Bis-(2,2,2-trifluor-ethoxy)-phenylrestes in 6-Position des alpha-hexylsubstituierten Scaffolds führt zu Ligand 38. Dieser ist ein potenter dualer PPARalpha/gamma-Agonist mit einem EC50-Wert von 11 mikro M an hPPARalpha bzw. 7,7 mikro M an hPPARgamma und ein stark wirksamer 5-LOX-Inhibitor mit einem IC50-Wert von 1 mikro M im 5-LOX-PMNL-Standardassay. Die Substanz 38 wurde in präklinischen Studien eingesetzt. Vier Stunden nach oraler Administration bei Mäusen (n = 6) wurde einen Plasmaspiegel von 40 mikro M erreicht. Im Hinblick auf eine Steigerung der PPAR-agonistischen Aktivität und der Reduktion der hepatotoxischen Eigenschaften der Leitstruktur Pirinixinsäure wurde eine Leitstrukturoptimierung durch Einführung der größeren Alkylketten in alpha-Position zur pharmakophoren Carboxyl-Funktion durchgeführt. Für die inhibierende Wirkung auf die 5-LOX scheint das Chinolin-Strukturelement verantwortlich zu sein, während die Potenz der Inhibition durch das Substitutionsmuster moduliert wird.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden modifizierte Nukleoside synthetisiert, um ihren Einfluss auf die Stabilität von RNA-Duplexen zu untersuchen. Bei den fluorierten Benzimidazol-Nukleosidanaloga handelt es sich um universelle Basen, die bei der Basenpaarung nicht zwischen den vier natürlichen Nukleosiden unterscheiden können. Die dabei auftretende Destabilisierung der RNA-Duplexe sollte durch die Änderung physikalisch-chemischer Eigenschaften vermindert werden. Durch die Synthese der fluorierten Indol-Nukleosidanaloga mit denselben Fluoratompositionen sollte nachgewiesen werden, welche Rolle ein ausfallendes Stickstoffatom im Fünfring-System spielt. Weitere Untersuchungen wurden so entwickelt, dass die zwei spC-F in 4,6DFBI wie auch in 4,6DFI mit Stickstoffatomen getauscht wurden. So wurde noch eine neue Serie Nukleosidanaloga synthetisiert (Abbildung 9.2). Schließlich wurde noch 1-Desoxy-D-ribofuranose AS als absischer Baustein synthetisiert. Die Synthese der Indol- und 9-Deazapurin-Nukleosidanaloga wurde über eine Glycsilierungsreaktion mit geeignet geschützter Deoxyribose durchgeführt. Dies wurde über vier Stufen, ohne Aufreinigung, aus Deoxyribose synthetisiert. Die entsprechenden Deoxy-nukleoside wurden danach in fünf Schritten zu Ribo-nukleosiden transformiert. Nach der Entschützung von Toluoyl-Gruppen wurden die 5´- und 3´-OH Gruppen sukzessiv geschützt. Nach simultaner 5´-OH Entschützung und 3´-OMs Eliminierung, wurden die gewünschten Ribonukleoside durch katalytische Dihydroxilierung erhalten. Die Darstellung der Verbindung 7NP erfolgte über die Silyl-Hilbert-Johnson-Reaktion. Der abasische Baustein AS wurde ausgehend von 2,3,5-Tri-O-benzyl-ribofuranose durch Dehydroxylierung und anschließende Entschützung erreicht. Von allen Nukleosiden gelang es Kristalle aus Wasser oder Methanol zu erhalten und röntgenkristallographisch zu untersuchen. Die Kristallpackungen zeigten eine sehr interessante Anordnung der Moleküle. Alle Fluorindol-Nukleoside mit Ausnahme von 7-N-Purin-Nukleosid 7NP zeigten nicht die für aromatische Systeme normale Fischgräten-Struktur, sondern eine Anordnung, in der die Moleküle gegenüberliegen. Die Kristallpackung besteht abwechselnd aus hydrophilen und lipophilen Schichten. Die hydrophilen Schichten bestehen aus den Zuckeruntereinheiten und die lipophilen aus den Fluoraromaten. Die Zucker sind durch Wasserstoffbrücken miteinander verbunden. Für die Orientierung der Moleküle zueinander sind aber die Fluoratome verantwortlich. In der Kristallpackung von 7-Fluorindol-Nukleosid 7FI kann ein Fluor-Wasserstoff-Abstand von nur 230 pm detektiert werden. Dies ist deutlich kürzer als die Summe der van-der-Waals Radien von Fluor und Wasserstoff von 2,55 Å. Der Abstand wird zwischen dem Fluor des einen Nukleosids und einem Wasserstoff eines gegenüberliegenden Nukleosids gemessen. Der Abstand von 2,30 Å ist einer der kürzesten jemals in Kristallen gemessenen F-H Abstände des Typs Csp²-F...H-Csp². Bedingt durch diesen kurzen Abstand kann von einer F...H Wasserstoffbrücke gesprochen werden. Auf der anderen Seite in der Kristallstruktur von 4-Fluorindol-Nukleosid 4FI konnte ein F-H Abstand von 2,69 Å nachgewiesen werden, welcher deutlich länger als die Summe der van-der-Waals Radien von Fluor und Wasserstoff ist. Die Nukleoside wurden auf ihre Lipophilie hin untersucht. Zu diesem Zweck wurden Octanol-Wasser Verteilungskoeffizienten der Nukleoside gemessen. Die fluorierten Nukleoside zeigten im Gegensatz zu den nichtfluorierten Nukleosiden eine deutlich größere Lipophilie. Nach Umsetzung der Nukleoside zu den Phosphoramiditen konnten diese kupplungsfähigen Monomere in den RNA-Festphasensynthesen eingesetzt und in RNA 12mere eingebaut werden. Um den Einfluss der aromatischen Fluorosubstitutionen auf die thermodynamische Stabilität von RNA-Duplexen zu untersuchen, wurden UV/VIS- und CD- spektroskopische Messungen an monomodifizierten RNA 12meren durchgeführt. Aus den erhaltenen Schmelzkurven wurden die Schmelzpunkte bestimmt (Abbildung 9.3) und die thermodynamischen Daten ausgerechnet. Die Anwendung hydrophober, Fluorsubstituierter Nukleobasen führte im Fall der fluorierten Indol-Nukleoside zu Destabilisierung im Vergleich mit natürlichen Basenpaaren. Aus den folgenden Resultaten lässt sich zusammenfassen: 1. Position der Fluoratom in fluorierten Indole spielt eine wesentliche Rolle für die Stabilität des RNA-Duplex 2. 6FI bildet die stabilste Basenpaaren mit natürlichen Basen. 3. Basenpaarung von 4FI trägt eine deutlich höhere Destabilisierung. Für diese Modifikation wurden auch die längsten Abstandwerte zwischen C-F…H in der Kristallpackung gemessen. (Die Vermutung liegt nahe, dass diese Base sich außerhalb des Duplex befindet). 4. Alle Fluorindol-Basenanaloga zeigen die Tendenz zur Paarung mit Adenosin. 5. Bei 4,6DFI handelt sich um universelle Base. Um noch weniger destabilisierende universelle Basen zu finden, wurde das Forschungsfeld mit Methoden aus dem Bereich der strukturellen Bioinformatik, Molekül-dynamiksimulationen und freie Energie-Rechnungen ausgeweitet. Resultierende Simulationen führten zu zwei neuen Basen: 7NP als Analogon zu 4,6DFBI und 9DP als Analogon zu 4,6DFI (siehe Kapitel 8). Theoretische Rechnungen ließen sich bestätigen durch experimentelle Ergebnisse Die so entstandene Serie von Purin-Basenanaloga hat uns gezeigt, dass der Austausch von Fluoratomen durch Stickstoffatome stabilisierende Effekte bringt. Die chemischen Änderungen beeinflussen die physikalischen Eigenschaften, welche dadurch Stabilisierung oder Destabilisierung des RNA-Duuplex dirigieren. In Abbildung 9.5 befinden sich ausgerechnete Dipolmomente. Somit können wir für diese Serie folgendes resümieren: * 4,6FI als universelles Base Analogon zu 4,6DFBI zeigt geringere destabilisierende Effekte auf den 12mer RNA-Duplex. * Umtausch von Fluoratomen in den beiden Basen (4,6DFI und 4,6DFBI) resultiert in deutlich besserer Basenpaarung. * Auserrechnete thermodynamische Parametern (von gemessenen Tm-Werten) wurde ersichtlicht, dass höhere Tm-Werte durch geringere Destabilisierung aus Solvatation resultieren, nicht aus erhöhten Stacking Effekten des RNA-Duplex.
Starkes Übergewicht und eine damit einhergehende Hypertrophie von Geweben aber auch des Herz-Kreislauf-Systems führen zu einer Reihe von Folgeerkrankungen wie z. B. Diabetes mellitus Typ 2 oder auch Arteriosklerose. Während im Fettgewebe freie Fettsäuren, die von Makrophagen aufgenommen werden, eine entscheidende Rolle spielen, scheint in der Pathogenese von Arteriosklerose die Aufnahme von Fettsäuren aus Lipoproteinpartikeln durch Makrophagen von großer Wichtigkeit zu sein. Ein weiterer Faktor, der durch freie Fettsäuren ausgelöst wird ist ER-Stress. Makrophagen, die zu Triglycerid (TG) reichen Schaumzellen geworden sind, akkumulieren in arteriosklerotischen Läsionen. Der Lipidmetabolismus von Makrophagen wird transkriptionell u.a. durch den Transkriptionsfaktor PPARγ (Peroxisomproliferator aktivierter Rezeptor γ) reguliert. Sein Zielgen FABP4 (Fettsäuren bindendes Protein 4) beschleunigt die Entwicklung von Arteriosklerose in Mausmodellen. Da die Expression von PPARγ und FABP4 in IL 4- (Interleukin-4) polarisierten Makrophagen induziert wird, sollte die Rolle von FABP4 in humanen, mit IL 4 polarisierten Makrophagen untersucht werden. Hierfür wurden primäre humane Monozyten in Anwesenheit von LPS/IFNγ (Lipopolysaccharid/Interferon γ) bzw. IL 4 zu Makrophagen differenziert. Es zeigte sich, dass in LPS/IFNγ stimulierten Makrophagen PPARγ und dessen Zielgene nicht exprimiert wurden. Dagegen waren sie bei unstimulierten Makrophagen bei IL 4 stimulierten Makrophagen deutlich erhöht. Dies spiegelte sich auch in einer erhöhten Aufnahme von Triglyceriden aus VLDL-Partikeln (Lipoproteinpartikel sehr niedriger Dichte) wider. IL 4 induzierte also einen Fettsäuren akkumulierenden Phänotyp. Durch einen PPAR-Luciferase-Reporter-Test wurde untersucht, ob FABP4 für die Aktivierung von PPARγ nötig war. Dies konnte bestätigt werden, da PPARγ durch seinen Liganden Linolsäure nur in Anwesenheit von FABP4 aktiviert werden konnte. Diese Aktivierung konnte zusätzlich durch den FABP4-Inhibitor HTS01037 verhindert werden. Nun sollte der Einfluss von FABP4 auf die PPARγ-abhängige Genexpression untersucht werden. Hierfür wurde FABP4 während der Differenzierung mit den beiden Inhibitoren HTS01037 oder BMS309403 in IL 4 stimulierten Makrophagen inhibiert. Durch die Inhibition von FABP4 sank die Expression von FABP4 und LPL (Lipoproteinlipase), während die von PPARγ unverändert blieb. Die LPL spielt eine entscheidende Rolle in der Aufnahme von Lipiden aus VLDL-Partikeln und trägt somit zur TG-reichen Schaumzellbildung bei. Die verminderte Expression von LPL spiegelte sich in einer verminderten Lipidaufnahme aus VLDL-Partikeln wider. Gleichzeitig wurde durch die FABP4-Inhibition die Entzündungsantwort der Makrophagen auf VLDL-Partikel abgeschwächt. IL 4 induziert also LPL, indem es PPARγ aktiviert. FABP4 unterstützt hierbei die Aktivierung von PPARγ. Durch die Inhibition kann die LPL-Expression vermindert werden, was die TG-reiche Schaumzellbildung und die Entzündungsreaktion in einem VLDL-reichen Umfeld vermindert und eine neue Therapiemöglichkeit von Arteriosklerose eröffnet. Im Fettgewebe kommt bei starkem Übergewicht, bedingt durch die erhöhte Konzentration an freien Fettsäuren und Hypoxie, zu einer leichten Entzündungsreaktion. Diese Entzündungsreaktion wurde durch eine Stimulation mit Palmitat unter Hypoxie (1 % O2) nachgebildet. Überstände von Makrophagen nach dieser Stimulation (MCM) wurden auf primäre humane Adipozyten übertragen. Diese Überstände konnten zwar keine Insulinresistenz in Adipozyten auslösen, induzierten jedoch eine Entzündungsreaktion. Diese zeigte sich in einer erhöhten Expression der proentzündlichen Zytokine CCL2 (CC-Chemokin-Ligand-2) und IL 6. Gleichzeitig wurde die Expression des antientzündlichen Zytokins Adiponectin vermindert. Der Transfer von MCM ist also ein Modell für die Entstehung der Insulinresistenz in einem frühen Stadium. Beim Versuch, die entzündungsfördernde Fähigkeit des MCMs zu verhindern, wurde AMPK mit verschiedenen Aktivatoren stimuliert. Es zeigte sich, dass der AMPK-Aktivator AICAR (5-Aminoimidazol-4-carboxamidribonukleotid) die Entzündungsantwort und den ER-Stress von mit Hypoxie und Palmitat stimulierten Makrophagen deutlich reduzierte. Der starke Effekt auf den ER-Stress konnte auch mit anderen ER-Stress-Auslösern wie Thapsigargin oder Tunicamycin nachvollzogen werden. Da AICAR ein AMPK-Aktivator ist, wurden typische Effekte der AMPK-Aktvierung wie reduzierte Proteinexpression, verstärkte Sirtuin-1-Aktivierung und Steigerung der Fettsäurenoxidation mittels Inhibitoren verhindert. Dies hatte keinen Einfluss auf die Wirkung von AICAR. Ebenso wurde untersucht, ob AICAR in die Zelle aufgenommen werden musste und ob es zu seiner phosphorylierten Form ZMP umgewandelt werden musste. Durch den Inhibitor ABT 702 kann die Adenosinkinase inhibiert werden, welche die Phosphorylierung katalysiert. Es zeigte sich, dass die Phosphorylierung von AICAR zu ZMP nicht erforderlich war, damit AICAR die ER-Stress-Antwort hemmen konnte. AICAR und nicht ZMP wirkte gegen den ER-Stress. Da durch das fehlende ZMP die AMPK nicht aktiviert wurde, war das ein weiteres Zeichen, dass AICAR AMPK-unabhängig wirkte. Dies konnte durch einen AMPK-Knockdown bestätigt werden. Durch einen Knockdown verschiedener Adenosintransporter konnte gezeigt werden, dass SLC28A3 (Soluttransporterfamlie 28 Typ A3) verantwortlich für die Aufnahme von AICAR in primäre humane Makrophagen war. Es konnte demnach gezeigt werden, dass AICAR den ER-Stress in primären humanen Makrophagen in einem von AMPK unabhängigen Mechanismus vermindert. Dafür wird es mittels SLC28A3 in die Zelle aufgenommen und wirkt als AICAR und nicht als ZMP. Diese Erkenntnisse stellen eine interessante, neue therapeutische Möglichkeit im Feld von Arteriosklerose und Diabetes dar.
Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung und Verfeinerung der Lösungsstruktur der rekombinanten pI=5,1 Isoform des H-FABPs aus Rinderherz. Dabei wurde von Proben mit einem Fettsäuregemisch ausgegangen und somit die HOLO–Form des Proteins untersucht. Der Einsatz von mehrdimensionaler NMR–Spektroskopie zur Bestimmung von Abstandsrandbedingungen, stereospezi…schen Zuordnungen und Diederwinkeln aus 3J–Kopplungskonstanten ermöglichte die Verwendung von 1877 Abstandsrandbedingungen, 52 stereospezifischen Zuordnungen und 81 Diederwinkelbeschränkungen. Die Struktur basiert im Schnitt auf 15 geometrischen Beschränkungen je Aminosäurerest. Mit einem mittleren globalen RMSD–Wert der Rückgratatome von 1,07+-0,15Å und den relativ niedrigen berechneten Energiewerten sind die Ansprüche an eine hochaufgelöste Struktur erfüllt. Vergleiche mehrerer struktureller Kriterienmit 160 Proteinkristallstrukturen haben ergeben, daß die hier bestimmte Lösungsstruktur in ihrer Güte einer Kristallstruktur mit einer Auflösung von etwa 2,4 Å entspricht. Die Molekulardynamiksimulation der energetisch niedrigsten Lösungsstruktur in einer Wassersimulation führte anfangs zu einer raschen Konformationsänderung der Struktur. Diese war gekennzeichnet durch eine Vergrößerung des als Eingangsportal für den Fettsäureliganden postulierten Bereiches. Zugleich wurden zwei weitere kleine Öffnungen erkennbar, welche als Austrittsöffnungen für Wassermoleküle dienen könnten.
Um die Bedeutung bestimmter Neurone oder Klassen von Neuronen innerhalb von Nervensystemen zu untersuchen, sind Methoden, die eine Manipulation der Aktivität der Neurone in vivo erlauben, besonders nützlich. Die bisher zur Verfügung stehenden Methoden haben jedoch Einschränkungen in beispielsweise der Zelltypspezifität, der zeitlichen Präzision, der Reversibilität oder der Anwendbarkeit in frei beweglichen Tieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden optogenetische, d.h. auf der Expression lichtempfindlicher Proteine basierende Methoden entwickelt, um eine präzise Manipulation des Membranpotentials definierter Neurone durch Licht zu ermöglichen. Die Techniken wurden daraufhin zur Untersuchung z.B. der Neurotransmission sowie der Funktion kleiner Netzwerke im Nervensystem des Nematoden Caenorhabditis elegans verwendet. Die zelltypspezifische heterologe Expression des lichtgesteuerten Kationenkanals Channelrhodopsin-2 (ChR2) aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii ermöglichte es, Muskel- oder Nervenzellen der Nematoden durch blaue Beleuchtung innerhalb weniger Millisekunden zu depolarisieren. Dadurch ließen sich spezifische Verhaltensweisen in frei beweglichen Tieren auslösen. Dieser Ansatz wird in Zukunft die Untersuchung der Bedeutung einzelner Neurone innerhalb ihrer Schaltkreise deutlich erleichtern. So konnte hier gezeigt werden, dass die Photostimulation des propriorezeptiven Neurons DVA eine signifikante Erhöhung der mittleren Körperbiegungswinkel während der sinusförmigen Fortbewegung der Tiere zur Folge hatte. Außerdem wurde versucht, die Anwendbarkeit von ChR2 durch die gezielte Manipulation der subzellulären Lokalisation mittels Fusion mit speziellen Peptiden oder Proteinen zu erhöhen. Des Weiteren wurde eine zur Verwendung von ChR2 analoge Methode zur Hemmung von Neuronen durch Licht entwickelt. Hierfür wurde die lichtgetriebene Cl--Pumpe Halorhodopsin aus Natronomonas pharaonis (NpHR) zelltypspezifisch in C. elegans exprimiert. Durch Photoaktivierung von NpHR mit gelbem Licht war es möglich, Muskelzellen und cholinerge Neurone zu hyperpolarisieren und somit in ihrer Aktivität zu hemmen. Dies führte in frei beweglichen Tieren zu einer augenblicklichen Paralyse verbunden mit einer drastischen Reduktion der Schwimmfrequenz und einer Erhöhung der Körperlänge. Die Aktionsspektren von ChR2 und NpHR sind unterschiedlich genug, um eine unabhängige Photoaktivierung der beiden Proteine mit blauem und gelbem Licht zu ermöglichen. Dadurch konnte die Aktivität von Muskelzellen und cholinergen Neuronen nach Koexpression der beiden Proteine bidirektional kontrolliert werden. Es wurden somit Methoden entwickelt, die in vivo eine zeitlich äußerst präzise Manipulation des Membranpotentials definierter Neurone mit Licht verschiedener Wellenlängen ermöglichen. Die Beobachtung der dadurch induzierten Verhaltensänderungen erlaubt es, zuverlässige Aussagen über die Bedeutung einer Nervenzelle für die Ausprägung eines Verhaltens zu treffen und wird die Erforschung der Nervensysteme von C. elegans und anderen Modellorganismen deutlich vereinfachen. Schließlich wurden in dieser Arbeit optogenetische Methoden zur Untersuchung der synaptischen Übertragung an neuromuskulären Synapsen (neuromuscular junctions, NMJs) von C. elegans entwickelt. Hierfür wurde ChR2 in GABAergen oder cholinergen Neuronen exprimiert, um eine lichtgesteuerte Freisetzung des inhibitorischen Neurotransmitters GABA bzw. des exzitatorischen Neurotransmitters Acetylcholin (ACh) an NMJs zu erreichen. Die Methode wurde OptIoN getauft, ein Akronym für „Optogenetic Investigation of Neurotransmission“, also „optogenetische Untersuchung der Neurotransmission“. Die GABA-Freisetzung hatte ähnlich wie die NpHR-vermittelte Photoinhibition von Muskelzellen eine Reduktion der Schwimmfrequenz und Erhöhung der Körperlänge zur Folge. Die Ausschüttung von ACh verursachte hingegen starke Muskelkontraktionen verbunden mit einer Reduktion der Körperlänge. Die Änderungen der Körperlänge waren bei Mutanten mit verschiedenen Neurotransmissionsdefekten signifikant unterschiedlich im Vergleich zum Wildtyp. Außerdem kam es während längerer Beleuchtungsphasen in Mutanten mit defektem Recycling der synaptischen Vesikel (SV) zu einer verstärkten Abnahme der lichtinduzierten Effekte. OptIoN ermöglicht es dadurch erstmals, die Mechanismen des SV-Recyclings in C. elegans Verhaltensexperimenten zu untersuchen. In elektrophysiologischen Messungen ließen sich durch kurze Lichtpulse wiederholt und mit hoher Frequenz Neurotransmitter-spezifische postsynaptische Ströme evozieren. Diese Ströme waren in Mutanten mit gestörter SVExozytose reduziert und gingen bei wiederholter Stimulation in Mutanten mit defektem SVRecycling schneller zurück. Die Verwendung von OptIoN erleichtert die elektrophysiologische Untersuchung neuronaler Defekte und stellt erstmals eine Möglichkeit dar, Vorgänge der neuronalen Plastizität in dem genetischen Modellsystem C. elegans zu untersuchen. Das Potential von OptIoN zeigte sich unter anderem auch in der Identifizierung eines neuen, über metabotrope GABA-Rezeptoruntereinheiten vermittelten Mechanismus zur heterosynaptischen Hemmung cholinerger Neurone.
Ein bekanntes Beispiel für regulatorische RNA-Protein-Wechselwirkung stellt der Komplex der TAR-RNA von HIV-1 und dem viralen Protein Tat dar. Dieser Komplex ist wichtig für die effiziente Transkription des viralen Genoms. Essentiell für die Erkennung der Stem-Loop Struktur ist die Wechselwirkung des Tat-Proteins mit dem aus drei Nukleotiden bestehenden Bulge der TAR-RNA. Das Wissen über die Prinzipien der Erkennung von Tat zu TAR-RNA sollte es möglich machen, spezifische Liganden zu designen, die als antivirale Tat Antagonisten angreifen können. Das Ziel dieser Arbeit war die Synthese von RNA Liganden für die Festphasenpeptidsynthese (FPPS) basierend auf heteroaromatischen Bausteinen. Als Strategie wurde gewählt, die heteroaromatischen Reste über Amid-Bindungen an ein Fmoc geschütztes (2-Aminoethyl)glycin-Rückgrat einzufügen. Die peptidomimetischen Bausteine X konnten in der FPPS zur Synthese von Tripeptiden mit der allgemeinen Struktur Arg-X-Arg und Modifikationen mit Lysin eingesetzt werden. Die Bindungsaffinitäten der Tripeptide und kleinen Moleküle zur TAR-RNA von HIV-1 wurden über einen fluoreszenzbasierten Assay bestimmt. Der Assay verwendet ein doppelt endmarkiertes Tat-Peptid mit Fluorescein und Rhodamin als Farbstoff. Durch Verdrängung des Tat-Peptides durch einen konkurrierenden Liganden kommt es zur Konformationsänderung des Peptides, die zur Löschung der Lichtemmission führt. Dabei zeigen die Tripeptide H2N-(D)Arg-Lactam-(D)Arg-CONH2 (154) und H2N-(D)Arg-Amidin-(D)Arg-CONH2 (158) IC50-Werte von 2-3 mikroM, die auch durch Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS) bestätigt wurden. In massenspektrometrischen Untersuchungen von 158 bzw. Tat-Protein mit TAR-RNA konnten bei beiden Peptiden 1:1 und 1:2-Komplexe beobachtet werden. 158 zeigt antivirale Eigenschaften (IC50 = 10-50 mikroM) in HeLa P4-Zellassays. Durch NMR-Untersuchungen und molekulardynamische Berechnungen war es möglich, eine Konformationsänderung der TAR-RNA durch eine Wechselwirkung mit Guanidinium-Gruppen festzustellen. Ein weiteres Ziel der Arbeit war daher ausgehend von den gewonnenen Daten die Untersuchung des Bindungskonzeptes von Diaminopyrazolen und Indazolen. Diaminopyrazole mit kleinen Resten und Triaminopyrazol übertreffen im protonierten Zustand den dikationischen Liganden Argininamid. In Übereinstimmung mit dem Bindungsmodell verhalten sich protonierte Aminopyrazole wie „Super-Guanidine“ hinsichtlich der TAR-RNA. Das Einfügen des Triaminopyrazols in ein Phenazin-Grundgerüst führt zu Verbindungen, die im protonierten und reduzierten Zustand zusätzliche Wasserstoffbrückenbindungen eingehen können und nicht planar, aber lipophil sind. Der Austausch von Stickstoff zu Sauerstoff im Phenazinring sollte den reduzierten Zustand stabilisieren. Die resultierende Struktur ist jedoch zersetzlich, so dass auf weitere Untersuchungen verzichtet wurde.
Es wurden mit phys. Verfahren hergestellte 200 und 500 nm dicke Niobfilme auf oxidiertem Si thermischen Kurzzeitprozessen (RTP) unterzogen, um Oxynitride zu synthetisieren. Die Filme wurden mit verschiedenen Methoden untersucht, um einen Überblick über die entstandenen Produkte und ihre Position im Film zu erlangen. Die Reaktionen wurden in N2 oder NH3 zur Nitridierung mit anschließender Oxidation in O2 durchgeführt. Um eine mögliche direkte Einstufensynthese von Oxynitriden des Niobs zu finden, wurde N2O eingesetzt. Der einfachste Ansatz zur Präparation von Oxynitriden bestand in der Verwendung des N2 und NH3, mit denen die Metallfilme zwischen 600 und 1200 °C umgesetzt wurden. Die Nitridierung mit N2 verlief von der Bildung einer festen Stickstofflösung in Niob bei tiefen Temperaturen über Nb2N zwischen 700 und 1000 °C bis zum Nb4N3 oberhalb 1000 °C. Aus dem Substrat diffundierte Sauerstoff aus, der am Interface Nb/SiO2 zur Bildung einer Oxidzone führte. Der O-Gehalt der Oxide stieg mit steigender Reaktionstemp. Unterhalb 1000 °C wurde NbO gefunden, oberhalb 1000 °C bildete sich NbO2. Eine TEM-Untersuchung gekoppelt mit EEL-Spektrometrie ergab Hinweise auf die Bildung einzelner stickstoffreicher NbOxNy-Kristallite im Bulk der mit N2 umgesetzten Filme. Auch die Nitridierung mit NH3 ergab eine Abhängigkeit des N-Gehaltes der Produkte von der Rkt.-Temperatur. Es erfolgte die Bildung der festen Lösung und Nb2N bei tiefen und mittleren Temperaturen. Ab 900 °C bildete sich NbN, oberhalb 1100 °C wurde vermutlich Nb4N5 detektiert. Im Gegensatz zur Umsetzung mit N2 ergaben genauere Untersuchungen der in NH3 nitridierten Filme keine Hinweise auf die Bildung von Oxynitriden. Die Erstellung von Tiefenprofilen zeigte, dass sich Nitridphasen mit höchstem N-Gehalt an der Oberfläche befanden und der Anteil des Stickstoffs in den Produkten mit zunehmender Tiefe abnahm. Mit Oxiden verhielt es sich umgekehrt: Sobald höhere Oxide gebildet wurden, befanden sie sich am Interface, wo die Sauerstoffkonzentration am höchsten ist. Oxide mit niedrigerem O-Gehalt wurden in der Filmmitte gefunden, wo der Sauerstoff durch die gebildeten Nitride an der Diffusion in Richtung Filmoberfläche gehindert wurde. Die 200-nm-Filme waren formal reaktiver als die 500-nm-Filme. Sie bildeten bereits bei tieferen Temperaturen Phasen mit höherem N- oder O-Gehalt, wofür das geringere zur Verfügung stehende Volumen ursächlich ist. Die Reinheit der Filme führte zu Unterschieden in der Reaktivität: Gesputterte Filme waren reiner als aufgedampfte Filme, die auf Grund der Einlagerung einer geringen Sauerstoffmenge während der Präparation passiviert waren. Dadurch wurde die Diffusion des Stickstoffs eingeschränkt zur Bildung abweichender Phasen zwischen aufgedampften und gesputterten Filmen. Eine Variante der Nitridierung in N2 bzw. NH3 bestand in der Verwendung von O2 als Kühlgas. Die Zugabe des O2 wurde bei unterschiedlichen Temperaturen untersucht. Statt der Einlagerung von Sauerstoff in das Oberflächennitrid unter Oxynitridbildung kam es zur Bildung einer oxidischen Deckschicht. Die Bildung der Schicht erforderte eine Zugabetemperatur höher als 700 °C, bei tieferen Temperaturen war der Film durch das bereits gebildete Nitrid soweit passiviert, dass keine chemische Veränderung stattfand. Die im Nitridierungsschritt gebildeten Produkte wurden als Auswirkung des sog. Schneepflugeffektes unter Kompression in tiefere Filmregionen verschoben. Dies führte zur Bildung von Produkten höherer Stöchiometrie (Nb2N zu NbN oder NbO zu NbO2). Der Einsatz von Lachgas, der zur Einlagerung von N2O-Einheiten in den Metallfilm führen sollte, verlief ergebnislos. Bei Prozesstemperaturen unterhalb 450 °C wurde lediglich die Bildung einer festen Lösung von Sauerstoff im Niob nachgewiesen. Oberhalb 450 °C zersetzte sich N2O unter O-Bildung wodurch der Film oxidiert wurde. Die Umsetzung nitridierter Filme mit N2O und auch dessen Verwendung als Kühlgas brachte keine Veränderung. Die Oberflächennitride waren stabil gegenüber dem N2O. Die Nitridierung der Filme im N2-Strom wurde durch die stoßweise Zugabe von O2 bzw. N2O nach definierten Zeiten variiert. Die Filme bilden nach kurzen Nitridierungszeiten von maximal 20 s gefolgt von einem 10-sek. Sauerstoffstoß eine komplizierte Filmstruktur aus, wie das elementare Tiefenprofil zeigt, das in denselben Filmzonen sowohl Stickstoff als auch Sauerstoff nachweist. Da die Röntgendaten lediglich die Bildung von NbO2 nachweisen, jedoch mit einer leichten Verschiebung der Reflexe zu kleineren Winkeln aufgrund der Einlagerung der größeren Nitridionen in das Oxidgitter, muss es sich bei dem präparierten Film um ein Oxynitrid der Form NbO(2-x)Nx handeln, in dem das Verhältnis von N zu O auf der sauerstoffreichen Seite liegt.
Die Dissertationsarbeit mit dem Titel "Aufhebung der peripheren Immuntoleranz durch Kopplung eines Melanomantigens mit immunogenen Fremdproteinen" befasst sich mit der Weiterentwicklung einer effektiven Melanomvakzine im tierexperimentellen Modell im Hinblick auf die spätere klinische Anwendung im Patienten. Als Antigen wurde das in Melanomzellen und in Melanozyten natürlicherweise exprimierte Protein TRP2 verwendet. Dieses Antigen kann bei Mäusen und Menschen von zellulären Komponenten des Immunsystems erkannt werden. Durch die Fusion des wenig immunogenen Selbstantigens mTRP2 mit dem immunogenen Fusionspartner EGFP gelang es bei C57BL/6 Mäusen, die körpereigene Toleranz gegen Selbstantigene zu umgehen und so eine antigenspezifische Immunantwort zu induzieren. In den mit der cDNA von EGFPmTRP2aa30-519 immunisierten Mäusen konnte eine vitiligoartige Felldepigmentierung nachgewiesen werden, die nach Immunisierung mit der cDNA von mTRP2 nicht beobachtet wurde. In diesen Tieren ließen sich auch im Elispot TRP2-spezifische T-Zellen nachweisen. Tiere, die mit Ad-EGFPmTRP2aa30-519 immunisiert wurden waren gegen das Wachstum von transplantierten Melanomzellen geschützt. Eine Immunantwort und ein Tumorschutz konnte jedoch nur induziert werden, wenn eine direkte Fusion zwischen dem Selbstantigen TRP2 und dem immunogenen Fusionspartner EGFP besteht. In Versuchen mit knockout Mäusen und Depletionsexperimenten konnte gezeigt werden, das CD4+ T-Zellen eine entscheidende Rolle in der Primingphase CD8+T-Zellen von die Induktion von antigenspezifischen CD8+T-Zellen spielen. In weiteren Experimenten nach Immunisierung mit dem Fusionskonstrukten EGFPmTRP2aa30-188, EGFPmTRP2aa30-179 und EGFPmTRP2aa180-188 konnte gezeigt werden, dass das Peptidepitop mTRP2 aa180-188 für die Induktion einer Felldepigmentierung und für eine effektive Abwehr von transplantierten Melanomzellen vorhanden sein muss. Um den Einfluss von kompetitiven MHC-Klasse I bindenden Peptidepitopen auf die Induktion einer Immunantwort zu untersuchen wurden Mäuse mit dem Fusionskonstrukt ß-Galaktosidase-mTRP2aa180-188 immunisiert. In diesen Mäusen konnte eine vtiligoartige Felldepigmentierung der beschossenen Bauchhaut und im Elispot-Test gleichzeitig TRP2 und ß-gal spezifische T-Zellen nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu Arbeiten anderer Arbeitsgruppen scheint in diesem System keine kompetitive Hemmung zwischen dem ß-gal und dem TRP2 Peptid zu bestehen. Um den Einfluss der Kopplung auf die intrazelluläre Lokalisation zu charakterisieren wurden Fusionskonstrukte bestehend aus EGFP und mTRP2 mit unterschiedlichen Lokalisationssequenzen generiert, DCEK-Zellen stabil transfiziert und die intrazelluläre Lokalisation mit konfokaler Mikroskopie bestimmt. Nach Immunsisierung von Mäusen mit diesen Fusionskonstrukten konnte gezeigt werde, das die intrazelluläre Lokalisation keinen Einfluss auf die Entstehung einer Immunantwort hat. Für die spätere Anwendung der Kopplung in klinischen Studien wurde ein Fusionskonstrukt bestehend aus mTRP2 und dem gut charakterisiertem Antigen des humanen Cytomegalovirus pp65 generiert. Nach Gene-Gun Immunisierung von C57BL/6 Mäusen mit pp65mTRP2 zeigte sich ähnlich wie bei EGFPmTRP2 eine vitiligoartige Felldepigmentierung. Im Elispot-Test ließen sich TRP2 spezifische T-Zellen nachweisen. Das Ergebnis bestätigt die Annahme, dass auch pp65 zur Verstärkung einer antigenspezifischen Immunantwort gegen ein wenig immunogenes Selbstantigen in der Lage ist.
Über lange Zeit wurden in der EPR-Spektroskopie hauptsächlich cw-Experimente bei einer Mikrowellenfrequenz von 9 GHz durchgeführt. In den letzten 10 bis 15 Jahren aber haben zwei verschiedene Entwicklungen immer stärkere Verbreitung gefunden. Dies sind zum einen die Verwendung von immer höheren Magnetfeldern und damit Mikrowellenfrequenzen, und zum anderen die Anwendung von Puls-Experimenten. Hochfeld-EPR bietet zwei wesentliche Vorteile gegenüber den klassisch verwendeten Magnetfeldstärken. Dies ist einerseits die erhöhte spektrale Auflösung bei Systemen mit anisotropen g-Tensoren, andererseits die höhere absolute Empfindlichkeit in Verbindung mit einem geringeren Probenvolumen. Puls-Experimente andererseits bieten die Möglichkeit, Informationen zu gewinnen, die mit cw-EPR Spektroskopie nicht oder nur sehr schwer zu erhalten sind. Die Kombination dieser beiden Weiterentwicklungen der EPR-Spektroskopie eröffnet die Möglichkeit, mittels mehrdimensionaler Spektroskopie detaillierte orientierungsabhängige Informationen zu erhalten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Puls EPR-Spektrometer aufgebaut, welches bei einer Mikrowellenfrequenz von 180 GHz und einem statischen Magnetfeld von 6,4 T arbeitet. 180 GHz ist derzeit weltweit die höchste Mikrowellenfrequenz, bei der routinemäßig ein zylindrischer Hohlraumresonator verwendet wird und bei der Puls EPR-Experimente durchgeführt werden. Da bei solchen Mikrowellenfrequenzen einige benötigte Bauteile nicht mehr in konventioneller Bauweise erhältlich sind, wurden quasioptische Elemente verwendet, um einen Zirkulator aufzubauen. Der Transport der Mikrowellenstrahlung von der Quelle zur Probe und von dort zurück zur Detektion geschieht mittels überdimensionierter Hohlleiter, um die Verluste zu minimieren. Ein zylindrischer Hohlraumresonator wird in einer fundamentalen Mode betrieben, um am Probenort die für Puls-Experimente notwendige Mikrowellenleistung zu erzeugen. Mit der erreichten Mikrowellenleistung und der Ankopplung des Resonators werden Pulslängen von ca. 60 bis 80 ns für Systeme mit S=1/2 erzielt. Die Eigenschaften des aufgebauten Spektrometers wie die Empfindlichkeit oder die Totzeit im Pulsbetrieb werden ausführlich dargestellt und diskutiert. Ebenso werden die Eigenschaften der implementierten Spektrometersteuerung, insbesondere im Hinblick auf das Zeitverhalten bei Puls-Experimenten, dargestellt und diskutiert. Im letzten Teil der Arbeit wird ein ausführliches Anwendungsbeispiel für Hochefeld-EPR diskutiert. Das Ras-Protein spielt eine wichtige Rolle in der intrazellulären Signalweiterleitung und reguliert solche Prozesse wie Zellwachstum, Differentiation und Apoptose. In ca. 30 % aller menschlicher Tumore werden Mutationen dieses Proteins gefunden, was die wichtige Rolle dieses Proteins demonstriert. Trotz dieser wichtigen Funktion ist der genaue Mechanismus des Aktivierungszykluses noch nicht im Detail aufgeklärt worden. Mittels cw-EPR Spektroskopie wurden die GDP-gebundenen inaktiven Proteinkomplexe verschiedener Mutanten untersucht. Durch Messungen in H217O-angereichertem Wasser konnte gezeigt werden, dass bei Raumtemperatur beim Wildtyp ein Wasserligand weniger am aktiven Zentrum der Proteinkomplexe vorliegt als bei einer onkogenen Mutante. Dieses Ergebnis widerspricht den bisher durch verschiedene Röntgenstrukturuntersuchungen gewonnen Erkenntnissen. Es wird ausführlich darüber diskutiert, dass diese unterschiedlichen Ergebnisse vermutlich auf Kristallbildungseffekte zurückzuführen sind.