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Eine in der Forschung häufig gestellte Frage ist, welche schädlichen Auswirkungen Ärger und vor allem Ärgerausdruck haben kann. Bei Ärgerausdruck wird dabei typischerweise in nach innen gerichteten (anger-in) und nach außen gerichteten Ärger (anger-out) unterschieden. Hinsichtlich der gesundheitlichen Auswirkungen gibt es Hinweise dafür, dass beide typischen Ärgerausdrucksformen - sowohl nach innen als auch nach außen gerichteter Ärger - mit Risiken für das kardiovaskuläre System einhergehen. Allerdings ist die Vorhersagekraft einzelner Variablen nur sehr gering, so dass die Kombination von Variablen vielversprechender wirkt. Ein aktuell diskutiertes Risikocluster für koronare Herzkrankheiten ist das Typ D-Konstrukt. In Studie 1 wurden die Zusammenhänge von Typ D und Ärger und Ärgerausdruck in einer klinischen sowie einer nichtklinischen Stichprobe mit Hilfe von Fragebögen überprüft. In beiden Teilstichproben wies Typ D Beziehungen mit Ärger und Ärgerunterdrückung sowie offenem Ärgerausdruck auf. Ärger und Ärgerausdruck scheinen also auch im Typ D-Konzept eine wichtige Rolle zu spielen. Außer Belegen für gesundheitliche Auswirkungen von Ärgerausdruck wurden in jüngerer Zeit auch Hinweise auf Einflüsse auf Leistungsaspekte gefunden. Forschung aus dem Bereich der Emotionsregulation wies darauf hin, dass respondente Emotionsregulation, d.h. die Regulierung des emotionalen Ausdrucks ohne Änderung der erlebten Emotion, eine negative Wirkung auf die Bewältigung von kognitiven Aufgaben haben kann. In Studie 2 und Studie 3 wurde untersucht, ob sich auch für die respondente Regulierung des Ärgerausdrucks ein Effekt auf Leistungsvariablen feststellen lässt. Es wurde davon ausgegangen, dass sich ein inkongruenter Ärgerausdruck, also ein Ausdruck, der mit dem erlebten Ärger nicht übereinstimmt, leistungsreduzierend auswirkt. Ärger wurde mittels Provokation eines Konföderierten induziert. Der Ärgerausdruck wurde durch die Instruktion manipuliert, während einer der kognitiven Aufgabe zusätzlich eine bestimmte Emotion (ärgerlich oder neutral) darzustellen. Im Sinne der Annahme ließen sich nach inkongruentem Ärgerausdruck Defizite in der freien Erinnerung und im Zahlenverbindungstest finden. Die durchgeführten Studien sprechen dafür, dass Ärgerausdruck sowohl nach außen als auch nach innen gerichtet schädliche für Gesundheit und Leistung sein kann, wenn er übertrieben oder mit dem eigenen Erleben inkongruent ist.
Ziel der vorliegenden Arbeit war der Nachweis der bekannten Tonotopie im auditorischen Cortex der Katze mittels optical recording intrinsischer Signale (ORIS) mit der Frage, ob ORIS eine funktionelle Bildgebung ermöglicht, die den etablierten elektrophysiologischen Ableitungsmethoden an räumlicher und zeitlicher Auflösung ebenbürtig oder sogar überlegen ist. Hierzu wurde ein ORIS- Setup erstellt, dessen Schwankungsbreiten von Beleuchtungseinheit und aufzeichnendem System in Ableitung mit grünem Licht bei einer Größenordnung von 0,03% hinreichend niedrig lagen, um stimulusassoziierte Signale in den von den meisten Autoren berichteten Amplituden sicher ableiten zu können. Es wurden spontane wie durch elektrische und akustische Stimuli evozierte Änderungen in den Reflexionseigenschaften des primären auditorischen Cortex (A1) der Ketamin- und Isofluran- anästhesierten Katze beobachtet. In Ruhe stellten sich bei 540nm in sämtlichen Versuchstieren (n=4) spontane Absorptionsoszillationen mit einer Grundfrequenz von 0,1Hz und einer Amplitude zwischen 1 und 3,5% dar („Mayer-waves“), deren Ursprung (intra- versus extracerebral) jedoch nicht gesichert werden konnte und die sich von den anliegenden Stimuli unbeeinflußt zeigten. Ein der bekannten Tonotopie korrespondierendes Muster aktivierter Areale nach Stimulation konnte lediglich bei ¼ der Versuchstiere nachgewiesen werden (P124, elektrische Reizung, 30 Mittelungsdurchgänge). Die erreichten Absorptionsmaxima nach 12dB überschwelliger elektrischer Reizung des Hörnerven lagen bei etwa 0,5% mit einer Latenz bis zum Signalmaximum von 5,5 sec. Bei P126 war erst nach Mittelung von 18 Durchgängen ein zeitlicher Zusammenhang zwischen optisch erhobenen Daten und Stimulus nachweisbar. Bei P125 stellte sich nach 30 Mittelungsschritten zwar ein caudo-rostraler Shift der optischen Maxima bei Stimulation von 1kHz auf 4kHz dar, was der bekannten cortikalen Frequenzrepräsentation entsprach, doch ließ die darauffolgende Reizung mit 16 kHz keinen weiteren Shift nach rostral erkennen. Das cortikale Gebiet maximaler optischer Aktivität lag gegenüber dem Ort der 4kHz-Repräsentation caudomedial versetzt. Dies widerspricht der bekannten cortikalen Cochleotopie. Es fand sich nach Mittelung über 18 (P126) bzw. 30 (P124 und P125) Durchgänge gleicher Stimulation bei allen Tieren ein fleckiges, stimulusassoziiertes, jedoch nicht tonotop verteiltes Signal in Form einer Absorptionszunahme mit Maximum nach 6-8,5 Sekunden. Es erreichte Amplituden zwischen 1% und 2,5%. Die optischen Aktivitätsmuster zeigten eine erhebliche Varianz unter Durchgängen bei gleichem Stimulus. In einem Experiment (P126) fand ein Vergleich der optisch generierten Ergebnisse mit elektrophysiologischen Multiunit-Messungen statt. Es konnte nur bei einer Stimulationsfrequenz (8kHz) eine schwache Korrelation der lektrophysiologischen Multiunit-Antworten mit den optisch erhobenen Reflexionsänderungen festgestellt werden. Wir schließen daher, dass die Darstellung einer Tonotopie mittels ORIS nur in einem Bruchteil der untersuchten Versuchstiere mit gegenüber elektrophysiologischen Methoden deutlich geringerer Reliabilität, Validität und räumlicher Auflösung machbar ist, möglicherweise, weil ORIS am primären auditorischen Cortex der Katze lediglich ein grobes Signal der Tonotopie liefert, ohne hierbei auf die Lokalisation aktiver Neurone beschränkt zu sein. ORIS ist demnach zum Ersatz der etablierten Elektrophysiologie am A1 der Katze nicht geeignet.
Riboswitche sind hoch strukturierte RNA‐Elemente, die durch direkte Bindung von kleinen Metaboliten die Expression vieler bakterieller Gene kontrollieren. Sie bestehen aus einer Ligand‐bindenden Aptamerdomäne und einer so genannten Expressionsplattform. Im Zuge der Metabolitbindung an die Aptamerdomäne ändert sich die Konformation der Expressionsplattform. Diese Konformationsänderung führt zu einem vorzeitigen Abbruch der mRNA‐Transkription oder zu einer Inhibierung der Translationsinitiation. In Bacillus subtilis wurden zwei Klassen von Riboswitchen gefunden, die trotz einer sehr hohen Homologie in ihrer Primär‐ und Sekundärstruktur spezifisch zwischen den Purinen Guanin und Adenin unterscheiden.
Durch den direkten NMR‐spektroskopischen Nachweis von Wasserstoffbrückenbindungen konnte der Bindungsmodus von Adenin, Guanin und von weiteren Purinliganden an diese beiden Klassen von Riboswitch‐RNAs beschrieben werden. Für beide Purin‐Riboswitche wurde ein gemeinsamer Bindungsmechanismus des Purinliganden an die RNA beobachtet. Hierbei bildet der Purinligand ein intermolekulares Basentripel mit der Riboswitch‐RNA aus. Die Spezifität der Metabolitbindung ist das Resultat eines intermolekularen Watson‐Crick Basenpaars zwischen dem gebundenen Liganden Guanin und einem Cytidin bzw. zwischen dem Liganden Adenin und einem Uridin der jeweiligen Riboswitch‐RNA. Zusätzlich wurde eine zweite Basenpaarung zwischen der Riboswitch‐RNA und dem gebundenen Liganden entdeckt, die in beiden Riboswitch‐Klassen identisch ist und ein weiteres Uridin der RNA und die N3/N9 Seite des Purinliganden einschließt. Diese Basenpaarung entsteht durch ein bislang unbeschriebenes Wasserstoffbrückenbindungsmuster, das zur Affinität der RNA‐Ligand‐ Wechselwirkung beiträgt. Die beobachteten intermolekularen Wasserstoffbrückenbindungen zwischen der RNA und dem gebundenen Purinliganden erklären die beobachtete Spezifitätsumkehrung einer C zu U Mutation in der Ligandbindungstasche der Riboswitch‐ RNA und die Unterschiede der Bindungsaffinitäten von verschiedenen Purinanaloga.
Weiterhin wurden die Ligand‐ und Kation‐induzierten konformationellen Änderungen der isolierten Aptamerdomänen beider Purin‐bindenden Riboswitche und des gesamten Guanin‐ Riboswitches mittels NMR‐Spektroskopie untersucht. Demnach ist die Ligandbindungstasche in der Ligand‐ungebundenen Form unstrukturiert und Ligandbindung verläuft nach einem induced fit‐Mechanismus. Die Untersuchung der freien und Mg2+‐gebundenen Form der Ligand‐ungebundenen Aptamerdomäne zeigte Unterschiede zwischen den beiden eng verwandten Purin‐bindenden Riboswitchen. Während die Wechselwirkung zwischen den hoch konservierten Sequenzen der apikalen Schlaufen der Helix II und III in der Mg2+‐freien Form des Guanin‐Riboswitches vorgeformt ist, ist sie in der Mg2+‐freien Form des Adenin‐ Riboswitches nicht ausgebildet, wird jedoch in Gegenwart von Mg2+ ausgebildet. Es konnte gezeigt werden, dass dieser konformationelle Unterschied zwischen den Ligand‐ ungebundenen Purin‐Riboswitchen durch die Stabilität der apikalen Basenpaare in Helix II festgelegt wird. Die im Guanin‐Riboswitch gefundene stabile Schlaufen‐Schlaufen‐ Wechselwirkung kann auch außerhalb der Riboswitchsequenz existieren. Durch Mg2+, Mn2+ und Co(NH3)63+ Titrationen der Ligand‐gebundenen Purin‐Riboswitch Aptamerdomänen konnten spezifische Kationbindungsstellen lokalisiert werden, die in beiden Komplexen übereinstimmen und eine Rolle in der Stabilisierung der RNA‐Struktur spielen.
Um die Sekundärstruktur des gesamten Guanin‐Riboswitches in seiner freien und Ligand‐ gebundenen Form zu untersuchen, wurden die NMR‐Spektren dieser RNA mit denen der freien und Ligand‐gebundenen isolierten Aptamerdomäne und der isolierten Terminator‐ und Antiterminatorelemente verglichen. Überaschenderweise bildet bereits die freie Form des gesamten Guanin‐Riboswitches das Terminatorelement und die Aptamerdomäne aus. Somit finden konformationelle Änderungen im Zuge der Ligandbindung einzig in der Aptamerdomäne statt. Weiterhin wurde die Struktur der freien und Ligand‐gebundenen Form einer verkürzten Guanin‐Riboswitch‐RNA untersucht. Diese RNA ist ein Modell für ein Transkriptionsintermediat, das durch eine der drei RNA‐Polymerase‐Ruhestellen induziert wird, die in der Riboswitch‐Sequenz aufzufinden sind. Interessanterweis schließen sich die Ligandbindung an die Aptamerdomäne und die Ausbildung des Antiterminators nicht gegenseitig aus, wie bisher angenommen. Die verkürzte RNA kann in Abhaengigkeit von verschiedenen experimentellen Bedingungen unterschiedliche Sekundärstrukturen annehmen. Das hat interessante Auswirkungen auf die Rolle der im Terminatorelement lokalisierten Transkriptionsruhestelle für den genregulatorischen Prozess und führt zu einem neuen Modell der Funktionsweise des Guanin‐Riboswitches.
Nach schwerem Trauma wird häufig eine immunologische Dysregulation beobachtet, die durch das Vorliegen einer überschießenden Inflammationsreaktion bei gleichzeitig bestehender Immunsuppression gekennzeichnet ist. Diese inadäquate Immunreaktion wird für das Auftreten posttraumatischer Komplikationen wie Systemic Inflammatory Response Syndrome (SIRS), Sepsis oder Multiorganversagen mitverantwortlich gemacht. Eine entscheidende Rolle bei den posttraumatisch ablaufenden immunologischen Vorgängen scheint dabei den Monozyten als Teil des unspezifischen Immunsystems zuzukommen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Monozytenaktivität nach Trauma unterschiedlicher Ausprägung und Schwere sowie ihre Korrelation mit an der posttraumatischen immunologischen Dysregulation potentiell beteiligten Mediatoren wie Interleukin-6 und Interleukin-10. Im Rahmen dieser 12-monatigen prospektiven klinischen Studie wurde von insgesamt 57 Patienten bei Eintreffen im Schockraum sowie an fünf Folgetagen Vollblut abgenommen. Bei 18 ausgewählten Patienten erfolgten weitere Blutentnahmen bis Tag 14. Die Patienten wurden nach Verletzungsschwere mittels Injury Severity Score (ISS) in fünf Gruppen eingeteilt und einer Kontrollgruppe gegenübergestellt. Die Blutproben wurden zunächst für 24 Stunden mit bakteriellem Lipopolysaccharid (LPS) inkubiert. Schließlich erfolgte aus den gewonnenen Proben mittels ELISA die Messung der Konzentration von Interleukin-1β als Surrogatparameter für die Aktivierbarkeit der Monozyten. Des Weiteren erfolgte die Bestimmung der Konzentrationen von Interleukin-6, Interleukin-10 und CRP im Patientenserum. Die Monozytenaktivität war bereits bei leicht verletzten Patienten mit einem ISS von eins bis acht Punkten signifikant gegenüber der Kontrollgruppe supprimiert. Diese Suppression setzte sich mit steigender Verletzungsschwere signifikant fort. Des Weiteren zeigte sich bereits bei Eintreffen der Patienten im Schockraum in allen Gruppen eine signifikante Suppression der stimulierten monozytären IL-1β-Produktion gegenüber der Kontrollgruppe. In der Gruppe der Leichtverletzten erreichte die IL-1β-Konzentration im Überstand bereits am zweiten Tag nach Trauma wieder die Werte gesunder Probanden, während in Gruppe II an Tag fünf, in Gruppe IV und V erst an Tag sechs ein partieller, nicht signifikanter Anstieg der Werte beobachtet werden konnte. Der Vergleich zwischen männlichen und weiblichen Patienten zeigte eine signifikante Suppression der stimulierten IL-1β-Produktion im weiblichen Kollektiv. Der Vergleich von Patienten mit posttraumatischer Entwicklung eines SIRS und Patienten ohne SIRS-Nachweis zeigte in der SIRS-Gruppe eine signifikante Reduktion der Monozytenaktivität, wobei die SIRS-Patienten im Durchschnitt allerdings auch schwerer verletzt waren. Der Vergleich der stimulierten Monozytenaktivität mit den Serumkonzentrationen von IL-6 und IL-10 zeigte für IL-6 einen der stimulierten IL-1β-Produktion entgegen- gesetzten, signifikanten Konzentrationsanstieg in Abhängigkeit von der Verletzungsschwere. Die Serumkonzentrationen von IL-10 waren erst bei Schwerstverletzten mit einem ISS ≥ 25 Punkten signifikant erhöht. Die Untersuchung der CRP-Serumkonzentration in Abhängigkeit von der Verletzungsschwere zeigte von Gruppe I bis III einen signifikanten Anstieg. Ab einem ISS von ≥ 16 Punkten war jedoch keine signifikante Konzentrationserhöhung des Serum-CRP mehr zu verzeichnen. Die vorliegende Studie zeigt, dass es bereits bei leichten Verletzungen zu einer Suppression des unspezifischen Immunsystems und hierbei insbesondere der Monozytenaktivität kommt. Diese Immunsuppression lässt sich bereits kurz nach dem Trauma, bei Eintreffen in der Klinik, nachweisen. Die Ursache für die wider Erwarten deutliche Reduktion der Monozytenaktivität bei weiblichen gegenüber männlichen Patienten konnte nicht geklärt werden. Eine mögliche Ursache könnte das fortgeschrittene, postmenopausale Alter zahlreicher Patientinnen sein. Aufgrund seiner geringer ausgeprägten Korrelation mit der Verletzungsschwere erwies sich die Serumkonzentration von CRP im Vergleich mit der stimulierten IL-1β-Produktion und der IL-6-Serumkonzentration als der für diese Untersuchung weniger geeignete Parameter.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Tieftemperatureigenschaften dreier niedrigdimensionaler Spinsysteme. Der experimentelle Schwerpunkt liegt auf Messungen zur thermischen Ausdehnung und zur spezifischen Wärme, die mit einem hochauflösenden kapazitiven Dilatometer bzw. einem AC-Kalorimetrie-Aufbau durchgeführt wurden. Da die sogenannten magnetischen Grüneisenparameter, die die Stärke der Kopplung des magnetischen Teilsystems ans Gitter beschreiben, durchweg sehr groß sind, liefern insbesondere die thermischen Ausdehnungsmessungen wertvolle Informationen zum Verständnis der behandelten Systeme. Das zentrale Ergebnis dieser Arbeit stellen Messungen an der Hochdruckphase von (VO)2P2O7, kurz HP-VOPO, dar. Dieses System besteht aus alternierenden Spinketten, wobei die beiden Austauschkonstanten ähnliche Werte haben, das heißt es liegt nur eine schwache Alternierung vor. In der thermischen Ausdehnung beobachtet man eine insbesondere in Kettenrichtung sehr ausgeprägte Anomalie bei etwa 13 K. Die Erklärung dieser Anomalie offenbart einen neuartigen Aspekt von alternierenden Spinketten mit schwacher Alternierung, der auf dem Vorhandensein von zwei deutlich verschiedenen Energieskalen beruht, zum einen der größeren der beiden Austauschkonstanten und zum anderen der Energielücke im System. Eine sehr gute quantitative Beschreibung der thermischen Ausdehnungsmessungen gelingt durch eine Erweiterung des herkömmlichen Grüneisenmodells, welches eine Proportionalität zwischen den magnetischen Beiträgen zur thermischen Ausdehnung und zur spezifischen Wärme vorsieht, auf Systeme mit zwei magnetischen Austauschkonstanten. In diesem Fall tritt in der thermischen Ausdehnung ein zusätzlicher, zur Ableitung der Entropie nach der Energielücke proportionaler Term auf, der durch Messungen zur spezifischen Wärme nicht zugänglich ist. Aus den unter Verwendung dieses Modells bestimmten Grüneisenparametern lässt sich folgern, dass die ausgeprägte Tieftemperaturanomalie in HP-VOPO zum Teil von der starken Verzerrungsabhängigkeit der kleineren der beiden Austauschkonstanten, zum Teil aber auch von der Nähe zu einem quantenkritischen Punkt verursacht wird. Das zweidimensionale Dimersystem SrCu2(BO3)2 hat insbesondere durch die Lokalisierung der Triplettanregungen und die dadurch bedingten Magnetisierungsplateaus bei gewissen Bruchteilen der Sättigungsmagnetisierung Berühmtheit erlangt. In der thermischen Ausdehnung wird eine deutliche Anomalie bei der gleichen Temperatur beobachtet (T = 8K), wo sie auch in der spezifischen Wärme auftritt. Sie lässt sich durch die thermische Anregung der lokalisierten Tripletts erklären. Abschließend werden Messungen am natürlichen Mineral Azurit vorgestellt, bei dem die Spins zu sogenannten Diamantketten angeordnet sind. In der Literatur wird noch diskutiert, ob es sich bei Azurit um die magnetisch frustrierte Variante einer solchen Kette handelt. In der magnetischen Suszeptibilität, der spezifischen Wärme und der thermischen Ausdehnung tritt eine auffallende Doppelstruktur auf. Im Tieftemperaturbereich lässt sich die spezifische Wärme gut mit dem effektiven Modell einer homogenen Spinkette beschreiben. Auch der lambdaförmige antiferromagnetische Ordnungsübergang wurde untersucht und das in der Literatur bis B = 2 T gegebene Phasendiagramm, bestehend aus paramagnetischer, antiferromagnetische und Spin-Flop-Phase, bis B = 10 T erweitert.
Camponotus ist die erfolgreichste Ameisengattung der Welt. Neben Pheidole und Crematogaster weist sie die meisten Arten, die höchste Dispersion und die größte Variabilität in morphologischer, ethologischer und ökologischer Hinsicht auf. Die Ursachen dieses Erfolges zu erkennen, war bisher nicht möglich, da nur fragmentarische Ergebnisse aus Freiland- und Laboruntersuchungen zur Verfügung standen. Die vorliegende Arbeit untersucht die Biologie und Ökologie ausgewählter Arten und gibt einen Einblick in die Komplexität ihrer Lebensstrategien. Um zu klären, welche ethologischen und ökologischen Anpassungen zur Gesamtfitness der Arten beitragen, wurden acht Arten der Gattung Camponotus in vier unterschiedlichen Habitaten ausgewählt. C. vagus und C. ligniperda in Laubmischwäldern Deutschlands, C. cruentatus und C. truncatus im mediterranen Klima der Pyrenäenausläufer Südfrankreichs, C. gombaki und C. gigas in offenen Park- und Uferregionen Malaysias sowie C. texens und C. gombaki im tropischen Sekundärwald der malaiischen Halbinsel. Das Verhalten dieser Arten wurde in den für das Überleben einer Kolonie zentralen Bereichen, nämlich Nisten, Außenaktivität und Nahrungserwerb untersucht. Als soziale Insekten sind Ameisen auf permanente und effektive Kommunikationssysteme angewiesen. Deshalb wurde die Rekrutierung, die mit Nestumzug und Nahrungserwerb im Zusammenhang steht, in das Untersuchungsprogramm aufgenommen. Unter Einbeziehung bereits publizierter Daten wird es möglich, den Erfolg von Camponotus zu verstehen. ...
Starke allergische Reaktionen gegen nicht spezifische Lipidtransfer Proteine sind im Mediterranen Raum weit verbreitet. LTPs besitzen als Klasse 1 Nahrungsmittelallergene vermutlich die Fähigkeit über den oralen Weg, durch den Verzehr von Nahrung, eine Sensibilisierung auszulösen. Zu Beginn dieser Arbeit wurde jedoch in der Literatur die Möglichkeit diskutiert, ob auch bei einer LTP-Sensibilisierung eine Pollen-assozierte Nahrungsmittelallergie vorliegen könnte. Untersuchungen zur IgE-Bindungskapazität von Lebensmittel- und Pollen-LTPs zeigten partielle Kreuzreaktivitäten. Eine Aussage über eine einheitliche Tendenz zur stärkeren IgE-Bindungskapazität konnte anhand der derzeitigen Ergebnisse weder für die Lebensmittel- noch für die Pollen-LTP-Gruppe getroffen werden. Dementsprechend lag kein eindeutiger Hinweis zur Korrelation zwischen der Sensibilisierung gegen Pollen- und Nahrungsmittel-LTPs vor, wodurch die Frage zur Fähigkeit der einzelnen LTPs kausal eine Allergie auszulösen weiterhin offen bleibt. Die Untersuchungen dieser Arbeit fokussierten sich auf die Lebensmittelallergene und sollten ihre klinische Bedeutung analysieren und Aufschluss über die Fähigkeit dieser Allergene eine Allergie kausal auszulösen bringen. Hierbei sollte untersucht werden, ob jedes Nahrungsmittel-LTP die Fähigkeit besitzt eine IgE-Sensibilisierung auszulösen oder ob ein LTP als primär sensibilisierendes Agens wirkt und nachfolgend immunologische Kreuzreaktionen zu anderen LTPs auftreten. Aufgrund der großen Häufigkeit von Patienten mit einer Pfirsichallergie im mediterranen Raum mit einer Sensibilisierung gegen das Pfirsich-LTP (Pru p 3), sowie einer schweren Symptomatik, wird vermutet, dass dieses Allergen eine wichtige Rolle spielt und eventuell als primär sensibilisierendes Agens fungieren könnte. Zur Identifizierung eines primär sensibilisierenden Agens sollte das Ausmaß der Antikörper-Kreuzreaktivität, die Aufschluss über die Affinität und Vorkommen gemeinsamer Epitope liefern soll, untersucht werden. Weiterhin sollte die IgE-Prävalenz der einzelnen Allergene, ihre Immunogenität (T-Zell-Kreuzreaktivität und in vivo Antikörperinduktion) und die biologische Potenz untersucht werden. Um der Fragestellung nachzugehen wurden die LTPs aus taxonomisch verwandten (Kirsche, Pru av 3 und Pfirsich, Pru p 3) und nicht verwandten (Haselnuss, Cor a 8 und Salat, Lac s 1) Lebensmitteln in die Studie einbezogen. Für die Untersuchungen standen 51 Seren von spanischen Lebensmittelallergikern zur Verfügung, deren Allergien gegen Pfirsich, Salat, Haselnuss und Kirsche anamnestisch und serologisch erfasst wurden. Die Relevanz der LTPs wurde durch die Schwere der klinischen Symptomatik deutlich. LTPs besitzen eine hohe Stabilität gegenüber thermischer und proteolytischer Prozessierung. Natürliches Pru p 3 zeigte bei einer Erhitzung auf 90°C zum größten Teil eine intakte Sekundärstruktur. Diese Eigenschaften könnten die Aufnahme von intakten Allergenen im gastrointestinalen Trakt begünstigen, wodurch die teilweise starken allergischen Reaktionen erklärt werden können. Bei der Untersuchung zur Relevanz von Pru p 3 im Vergleich zu Lac s 1, Cor a 8 und Pru av 3 wurde die IgE-Prävalenz, IgE-Bindekapazität, IgE-Kreuzreaktivität und biologische Potenz untersucht. Spezifisches IgE gegen Lac s 1 (93%), Pru p 3 (90%), Cor a 8 (88%) und Pru av 3 (85%) wurde mittels ImmunoCAP-FEIA in der jeweiligen Lebensmittelallergikergruppe gefunden und quantitativ bestimmt. Alle untersuchten Lebensmittel-LTPs erwiesen sich als Hauptallergene in der jeweiligen Patientengruppe. Bei Untersuchungen der IgE-Bindekapazität zeigten alle untersuchten Patienten, mit Ausnahme von einem, eine stärkere IgE-Bindungen gegen Pru p 3 im Vergleich zu Cor a 8. Demnach korreliert eine IgE-Sensibilisierung gegen Cor a 8 mit der gegen Pru p 3. Lac s 1 zeigte in einigen Fällen eine stärkere IgE-Bindung im Vergleich zu Pru p 3 und umgekehrt. Mit Ausnahme eines Patienten war eine IgE-Sensibilisierung gegen Lac s 1 immer mit der gegen Pru p 3 assoziiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in Einzelfällen spezies-spezifische Epitope beobachtet wurden, während IgE-Reaktivitäten gegen LTPs, die nicht zu der Familie der Rosengewächse gehören, in seltenen Fällen ohne eine begleitende Sensibilisierung gegen Pru p 3 auftraten. Die IgE-Bindung an Pru p 3 konnte durch Cor a 8 und Lac s 1 maximal bis 60% inhibiert werden, während Pru p 3 eine komplette Inhibition der Cor a 8 und Lac s 1 IgE-Bindung bewirkte. Demnach besitzt Pru p 3 alle IgE-Epitope von Lac s 1 und Cor a 8 und/oder eine stärkere Affinität zu den IgE-Antikörpern. Cor a 8 zeigte, trotz der Fähigkeit schwere Symptome auszulösen, eine relativ geringe biologische Potenz. Lediglich bei einem von fünf untersuchten Patienten zeigte Lac s 1 eine starke maximale Histaminfreisetzung. Pru p 3 und Pru av 3 zeigten die stärkste biologische Potenz bei allen untersuchten Pfirsichallergikern. Ein Salatallergiker ohne Pfirsichallergie zeigte durch die Stimulation mit Pru p 3 eine geringe Mediatorfreisetzung, wodurch dem Allergen Pru p 3 in Einzelfällen ohne klinische Symptomatik gegen das Allergen nicht zwangsläufig die stärkste biologische Potenz zugeschrieben werden kann. Pru p 3 und Pru av 3 zeigten aufgrund einer hohen Sequenzidentität von 85% nahezu identische IgE-Bindekapazitäten, IgE-Kreuzreaktivitäten, sowie eine ähnliche biologische Potenz. Eine Kreuzreaktivität auf T-Zell-Ebene wurde ebenfalls zwischen Pru p 3 und Pru av 3 detektiert, während im murinen System mittels RBL-2H3-Mediatorfreisetzungstest keine Kreuzreaktivität unter allen untersuchten Lebensmittel-LTPs nachweisbar war. Fehlende T-Zell-Kreuzreaktivitäten zwischen Pru p 3/Cor a 8 und Pru p 3/Lac s 1 deuten auf unterschiedliche T-Zell-Epitope der untersuchten Proteine hin. Um eine generelle Aussage über die T-Zell-Kreuzreaktivität treffen zu können, wären weitere systematische T-Zell-Proliferationsstudien erforderlich. Die erhaltenen Ergebnisse verdeutlichen, dass dem Allergen Pru p 3 hinsichtlich IgE-Prävalenz, IgE-Bindekapazität, IgE-Kreuzreaktivität im Inhibitions-ELISA und der biologischen Potenz im Mediatorfreisetzungstest die bedeutendste Rolle unter den untersuchten LTPs zukommt. In Einzelfällen konnten jedoch spezies-spezifische Epitope nachgewiesen werden, wodurch die Annahme verstärkt wird, dass Pru p 3 nicht das alleinige Immunogen sein kann. Weiterhin waren alle untersuchten LTPs im murinen System immunogen, wodurch die Annahme verstärkt wird, dass jedes untersuchte LTP eine Allergie kausal auslösen kann. Unterstützt wird diese Vermutung durch die fehlende Kreuzreaktivtität der murinen IgE-Antikörper. Eine eindeutige Aussage kann aufgrund der erhaltenen Ergebnisse derzeit noch nicht getroffen werden, da weitere systematische T-Zell-Proliferationsstudien und Inhibitions-ELISA der Maus-Immunsera in dieser Arbeit nicht mehr durchgeführt werden konnten.
NP25 wurde im Jahre 1994 als ein in allen Bereichen des zentralen Nervensystems Neuron-spezifisch exprimiertes Gen in der adulten Ratte identifiziert (Ren et al., 1994). Durch eigene Vorarbeiten konnte diese selektive neuronale Expression im Huhnembryo bestätigt werden, wobei die Expression von NP25 im Neuralrohr, den sympathischen paravertebralen Ganglien und sensorischen Hinterwurzelganglien vor der terminalen Differenzierung und Scg10-Expresison beginnt (M.Pape, Diplomarbeit, 2003). In dieser Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass NP25 in diesen Geweben nach den proneuralen Faktoren Ascl1 und Ngn2 exprimiert wird, zu einem Zeitpunkt an dem die Vorläuferzellen mit der Differenzierung beginnen. Im Neuralrohr beginnt die Expression von NP25 zeitgleich mit der Expression von NeuroM, einem der frühesten Marker für junge, postmitotische differenzierende Neurone (Roztocil et al., 1997). NP25 stellt somit einen der frühesten panneuronalen Marker für differenzierende Neurone dar. Das NP25-Protein ist in den Zellkörpern und Fortsätzen der Neurone im Neuralrohr und den untersuchten peripheren Ganglien lokalisiert, wobei die Fasern der Motoneurone, im Gegensatz zu deren Zellkörpern, NP25-negativ sind. Mit voranschreitender Differenzierung nimmt die NP25- Proteinkonzentration ähnlich wie die Expression auf mRNA-Ebene ab, wobei in den peripheren Ganglien NP25 über einen längeren Zeitraum hinweg auf hohem Niveau exprimiert wird. Kultivierte Neurone aus sensorischen Hinterwurzelganglien und sympathische Neurone der paravertebralen Ganglien zeigen eine Lokalisation des NP25-Proteins im Zytoplasma der Zellkörper und Fortsätze, wobei NP25 in den sympathischen Neuronen wesentlich stärker exprimiert wird. Dieser Befund konnte durch die Analyse der Proteinkonzentration mit Hilfe der Western Blot Methode bestätigt werden. Die Überexpression von NP25 in verschiedenen Zelltypen führte zu verstärktem oder reduzierten Neuritenauswachsen, wobei die Effekte mit dem NP25-Niveau korrelieren. Zellen mit einem geringen endogenen NP25-Expressionsniveau, wie sensorische Neurone aus fünf Tage alten Huhnembryonen und PC12-Zellen, reagieren auf die Erhöhung des NP25-Gehalts mit verstärktem Längenwachstum der Neuriten, während sympathische Neurone aus sieben Tage alten Huhnembryonen, die ein hohes endogenes Expressionsniveau aufweisen, reduziertes Längenwachstum und reduzierte Verzweigungskapazität zeigen. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass maximales Neuritenwachstum eine optimale NP25-Konzentration erfordert, wobei im Falle der Überexpression von NP25 in den sympathischen Neuronen das Optimum überschritten wird und dadurch Neuritenauswachsen und Verzweigung inhibiert werden. Die Effekte auf das Längenwachstum der Neuriten in den primären Neuronen konnten durch RNAi Experimente bestätigt werden. Neben dem Längenwachstum war auch das initiale Auswachsen von Fortsätzen durch die Veränderung des NP25-Expressionsniveaus betroffen. Im Falle der PC12-Zellen induzierte die NP25-Überexpression nicht nur Längenwachstum der Neuriten, sondern auch die Zahl der Fortsätze pro Zelle wurde erhöht. In den sympathischen Neuronen, in denen durch NP25- Überexpression das Längenwachstum und die Verzweigungskapazität negativ reguliert werden, nimmt die Anzahl der Neuriten pro Zellen nach Erniedrigung des NP25-Expressionsniveaus ebenfalls ab. Dies kann dadurch erklärt werden, dass Längenwachstum und initiales Auswachsen von Neuriten durch unterschiedliche Mechanismen reguliert werden (Glebova and Ginty, 2005; Luo, 2002), was hier möglicherweise dazu führt, dass Längenwachstum negativ und initiales Auswachsen positiv durch NP25 beeinflusst wird. In den sensorischen Neurone führte weder die Erhöhung noch die Erniedrigung des NP25-Expressionsniveaus zu einer Veränderung des initialen Auswachsens, was eine differentielle Regulation der Prozesse bestätigt. Da viele Mitglieder der CaP-Proteinfamilie mit F-Aktin interagieren (Gimona et al., 2002) wurde untersucht, ob NP25 und F-Aktin in kultivierten sympathischen und sensorischen Neuronen und in PC12-Zellen kolokalisieren. In den primären Neuronen wurde im Gegensatz zu der Situation in den PC12-Zellen keine Kolokalisation beobachtet, wobei NP25 und F-Aktin in den PC12-Zellen nur in kleinen Bereichen an den distalen Enden filopodienartiger Fortsätze kolokalisieren. Auch eine Interaktion von NP25 und G-Aktin konnte in den PC-Zellen ausgeschlossen werden. Durch die Identifikation zweier RhoGAP-Proteine (NIRGAP1 und 2) als potentielle Interaktionpartner (M.Geissen, nicht publiziert) könnte NP25 Neuritenauswachsen durch indirekte Beeinflussung des Aktinzytoskeletts über Rho-Signalwege regulieren. Die identifizierten RhoGAPs konnten durch in situ Hybridisierung im Rückenmark, in den Hinterwurzelganglien und den sympathischen paravertebralen Ganglien im Rattenembryo nachgewiesen werden. Sie gehören zu keiner bekannten Familie und unterscheiden sich auch strukturell von den meisten bisher beschriebenen RhoGAPs, da sie mehr als eine (drei) GAP-Domänen enthalten. Durch diesen Befund ergeben sich neue Ansätze für die weiteren Untersuchungen zur Regulation des Neuritenwachstums durch NP25. Da im adulten Nervensystem für NP25 eine Funktion in der Dynamik der Dendriten angenommen wird, sind Untersuchungen der Dendritenausbildung in vitro ebenfalls nahe liegend.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung des Prototypen einer supraleitenden CH-Beschleuniger-Struktur. Viele zukünftige Beschleunigeranlagen benötigen ein hohes Tastverhältnis bis hin zum so genannten cw-Betrieb. Dies würde bei normalleitenden Beschleunigern zu sehr großer Wärmeentwicklung führen, welche durch aufwendige Verfahren weggekühlt werden müsste. Da dies meistens gar nicht mehr möglich ist, kommen in solchen Bereichen heutzutage schon häufig supraleitende Beschleuniger zum Einsatz. Große Projekte, die im Hochenergiebereich auf die Supraleitung setzten, sind die SNS Beschleunigeranlage in Oak Ridge (Inbetriebnahme läuft) und das RIA-Projekt, welches radioaktive Isotope beschleunigen soll. Auch zukünftige Projekte, wie ein cw-Linac zur SHE-Synthese, EUROTRANS und IFMIF, sind ohne supraleitende Komponenten nur schwer vorstellbar. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zunächst die anderen zur Familie der so genannten H-Moden-Beschleuniger gehörenden Resonatoren kurz vorgestellt. Danach wurde eine Einführung in die Supraleitung mit den wichtigsten Parametern für Niob und den HF-Eigenschaften von Supraleitern gegeben. Um Beschleuniger zu charakterisieren wurde in einem weiteren Kapitel ein überblick über wichtige Kenngrößen gegeben. Dabei wurde auch ein Vergleich der Skalierung von verschiedenen Parametern zwischen Normalleitung und Supraleitung gegeben. Da die Simulationsrechnungen mit dem Programm CST MicroWave Studio durchgeführt wurden, wurden die Grundlagen dieses Programms ebenfalls eingeführt. Es basiert auf der Finiten Integrationstheorie, welche die Maxwell-Gleichungen in eine Zwei-Gitter-Matrixform überführt, damit diese numerisch gelöst werden können. In einem weiteren Kapitel wurde eine Methode zur Bestimmung der Einkopplungsstärke in einen Resonator näher beschrieben. Dabei wurde auf zwei wesentliche Einkopplungsarten, die induktive und die kapazitive, im Detail eingegangen. Die Bestimmung der so genannten externen Güte stellt einen wesentlichen Punkt dar, um die Leitung, die durch einen Sender und Verstärker zur Verfügung gestellt wird, möglichst optimal in den Beschleuniger einzuführen. Wobei auch hierbei wieder auf die Unterschiede zwischen einer Einkopplung in einen normalleitenden und einen supraleitenden Beschleuniger eingegangen wurde. Bei einer supraleitenden Struktur erfolgt die Einkopplung in der Regel überkoppelt. Dies bedeutet, dass man durch zu starke Einkopplung die belastete Güte des Systems herabsetzt, damit eine bessere Regelung möglich ist. Um eine numerische Methode auf ihre Tauglichkeit hin zu testen, wurde zuerst eine Pillbox genommen, um die simulierten Ergebnisse mit einer Messung zu vergleichen. Als sich dabei sehr gute Ergebnisse herausstellten, wurde die Methode noch an einem Kupfermodell einer CH-Struktur verifiziert, bevor die Einkopplung für den supraleitenden Prototyp berechnet wurde. Im 7. Kapitel dieser Arbeit wurden die Voraussetzungen, die vorher geschaffen wurden, für die Optimierung des Prototyps der supraleitenden CH-Struktur angewendet. Dabei ging es um die Optimierung der Feldverteilung auf der Strahlachse durch Anpassung des Endzellendesigns, der Stützenoptimierung, um die magnetischen und elektrischen Spitzenfelder zu reduzieren, einer Untersuchung des Quadrupolanteils in den Spalten der CH-Struktur, der Einkopplung und schließlich um die Möglichkeit des statischen Tunings während der Fertigstellung der Struktur. Auf Grund dieser Untersuchungen wurde schließlich die Fertigstellung eines ersten supraleitenden Prototyps bei der Firma ACCEL in Bergisch-Gladbach in Auftrag gegeben. Diese Struktur wurde in mehreren Kalttests untersucht. Dabei konnten die vorher durch die Simulation festgelegten Designparameter sehr gut verifiziert werden. In den beiden letzten Kapiteln wurden noch Simulationen für eine im Betrieb befindliche Beschleunigeranlage durchgeführt und ein Ausblick auf mögliche Einsatzgebiete der supraleitenden CH-Struktur gegeben. Die durchgeführten Optimierungen für den Hochstrominjektor führten zu einem stabileren Betrieb der Anlage. Durch diese Arbeit konnte gezeigt werden, dass die neuentwickelte CH-Struktur für den Einsatz in supraleitenden Beschleunigern sehr gut geeignet ist. Sie stellt eine sehr kompakte Struktur dar und bietet somit auf kurzer Stecke eine hohe Beschleunigung. Sie ist im Bereich von 10-30% Lichtgeschwindigkeit die einzige supraleitende Vielzellenstruktur.
Tumormarker dienen im Allgemeinen der Verlaufskontrolle bei der Behandlung von Malignomen, unabhängig, ob die Therapie chirurgischen, radiologischen oder chemotherapeutischen Ursprungs ist. Als Ausnahme wäre das PSA zu nennen, welches auch als Screeningparameter Verwendung findet. Die etablierten Tumormarker, die in der Therapie des Mammakarzinoms Verwendung finden, sind unter anderem MCA und CA 15-3. Hierbei handelt es sich ebenso wie bei dem in der vorliegenden Arbeit untersuchten Tumormarker TAG 12 um ein Glykoprotein. Die diagnostische Sensitivität der beiden etablierten Marker beträgt zwischen 50 und 59%, wobei CA 15-3 nur in Kombination mit CEA, ebenfalls ein Glykoprotein, diesen Wert erreicht. TAG 12 dient der Verlaufskontrolle in der Therapie des Mammakarzinoms, als Untersuchungsmaterial wird Serum verwendet. Mittels eines ELISA-Tests, sowie eines Spektralphotometers, erfolgte die Berechnung der Sensitivität, der Spezifität, der Prävalenz, des positiven prädiktiven Wertes und des negativ prädiktiven Wertes. Im Verlauf der durchgeführten Studie stellte sich heraus, dass verschiedene Lebererkrankungen, maligner und benigner Genese, einen Einfluss auf die Höhe des Markerwertes haben, es zeigte sich falschpositive Werte. Dieses Phänomen ist allerdings bei diversen anderen Tumormarkern ebenfalls zu beobachten. Es konnte bei TAG 12 eine Sensitivität von 67% nachgewiesen werden, womit sich der neue Marker mit den oben genannten bereits etablierten Markern durchaus messen kann.
Viele aerobe Organismen besitzen eine NADH:Ubichinon Oxidoreduktase, ein Enzym, welches der Haupteintrittspunkt für Elektronen in die Atmungskette darstellt. An den Elektronentransfer ist die Protonentranslokation vom Zytosol in den Intermembranenraum der Mitochondrien gekoppelt. Störungen des mitochondrialen Energiestoffwechsels bedingen Mitochondriopathien. Der Befall verschiedener Organsysteme, v.a. denjenigen mit hohem Energiestoffwechsel (Gehirn, Skelettmuskel, Retina, Myokard), verursacht multiple Symptome, was für diese Erkrankungen bezeichnend ist. Die Aufklärung der exakten Funktionsweise eines Enzyms bedarf der Kenntnis über seine räumliche Struktur. Diese lässt sich zur Zeit für ein Protein dieser Größe nur mittels Elektronenmikroskopie an zweidimensionalen Kristallen oder durch Röntgenkristallographie an dreidimensionalen Einkristallen realisieren. Das Ziel und die Herausforderung dieser Arbeit galt der Kristallisation und Strukturanalyse der NADH:Ubichinon Oxidoreduktase, eines der größten Membran-proteinkomplexe. Mit Hilfe der Kristallisation sollten Auskünfte über die Struktur und Rückschlüsse auf seine Funktion, sowie weitere Einblicke in die Bedeutung dieses Proteinkomplexes ermöglicht werden. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen eine L-förmige Struktur des Enzyms mit einem peripheren Arm, der in die mitochondriale Matrix ragt, und einem Membranarm, der in der Lipiddoppelschicht angeordnet ist. In beiden Armen befinden sich insgesamt bis zu 46 Untereinheiten des Enzymkomplexes. Die NADH-Bindungsstelle und alle bekannten Redoxgruppen (FMN, bis zu neun FeS-Zentren) liegen im peripheren Arm. Der Winkel zwischen beiden Armen ist variabel. Mit dem Ziel Komplex I in seiner Gesamtheit zu kristallisieren, wurden Antikörperfragmente zur Ko-Kristallisation eingesetzt. Die Βedeutung der Fv-Fragmente, als kleinste antigenbindende Domäne eines Antikörpers, liegt in der Vergrößerung der hydrophilen Oberfläche. Es wurden Fv-Fragmente gegen die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase aus Yarrowia lipolytica erzeugt und ihre Eignung für die Kristallisation überprüft. Die Klonierung und Expression erfolgte in Escherichia coli. Es zeigte sich durchweg nur ein sehr niedriges oder auch vollkommen unbefriedigendes Expressionsniveau der Fv-Fragmente. Nach gezielter Mutation konnte bei dem Klon Y30C12 eine Expressionssteigerung erreicht werden, welche allerdings für Kristallisationsversuche noch immer unzureichend war. Mit dem Klon Y34C10 konnte in Expressionsversuchen eine ausreichende Menge an Fv-Fragmenten gewonnen werden. Mit diesen Fv-Fragmenten gelang auch die Einschrittreinigung an der Streptavidin-Sepharosesäule und es konnten Bindungs- und Kristallisationsversuche mit Komplex I unternommen wurden. Durch eine FPLC-Gelfiltration konnte ein stöchiometrischer 1:1 Komplex aus der NADH:Ubichinon Oxidoreduktase und dem Fv-Fragment Y34C10 gewonnen werden, welcher bei der Suche nach geeigneten Kristallisationsbedingungen eingesetzt wurde. Eine Kristallisation des Komplexes gelang unter den ausgewählten Bedingungen mit diesem Komplex jedoch noch nicht. Dennoch eignen sich die Klone Y34C10 und Y30C12-M für weitere Studien, die eine Expressionssteigerung durch Punktmutationen in der schweren und leichten Kette (siehe unter 4.3) beinhalten sollten. Zum anderen besteht die Wahrscheinlichkeit den Kristallisationserfolg durch breite Variation der Bedingungen zu erhöhen. ...
Die Zuckertransporterfamilie ist eine Unterfamilie der MFS („major facilitator superfamily“), wobei die MFS wiederum als Überfamilie von Transportproteinen definiert wurde, die sich aus Proteinen mit 12 Transmembran-Domänen zusammensetzt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollte die subzelluläre Lokalisation und physiologische Funktion der uncharakterisierten Mitglieder der Zuckertransporterfamilie Ybr241 und Ygl104 untersucht werden. Mittels Zellfraktionierung durch Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation und Fluoreszenzmikroskopie konnte eine Lokalisation von Ybr241 und Ygl104 in der vakuolären Membran festgestellt werden. Da Plasmamembran-Proteine zur Degradation ubiquitiniert, über Endocytose internalisiert und in der Vakuole abgebaut werden, wurden weitere Lokalisationsstudien sowohl in Endocytose-Mutanten als auch in einer Mutante mit Defekten in der Ubiquitinierung durchgeführt. Diese ergaben, daß die vakuoläre Lokalisation nicht auf Degradation zurückzuführen war. Somit handelt es sich bei Ybr241 und Ygl104 um residente vakuoläre Membranproteine. Lokalisationsstudien in vps-Mutanten erbrachten Hinweise darauf, daß zumindest Ygl104, wie die meisten vakuolären Proteine, über den CPY-Weg zur Vakuole befördert wird. Weder durch Wachstumsanalysen noch mit Hilfe von Phenotype MicroArrays™ (Biolog, Inc.) konnten Phänotypen der Deletionsmutanten von Ybr241 und Ygl104 identifiziert werden. Allerdings zeigte sich im Verlauf der Arbeit, daß die Deletionsmutanten einen Vorteil beim Wachstum mit geringen Glucosekonzentrationen bei 37°C haben. Des weiteren bestanden aufgrund von Datenbankanalysen Anhaltspunkte auf eine Beteiligung am Trehalosestoffwechsel. Durch Hitzeschockexperimente konnte eine essentielle Rolle von Ybr241 und Ygl104 bei der Resistenz von Zellen gegenüber schwerem Hitzestreß identifiziert werden. Die verminderte Thermotoleranz der Deletionsmutanten war aber nicht auf einen geringeren Gehalt der Zellen am Streßschutzmolekül Trehalose zurückzuführen. Zudem deckte ein SGA („synthetic genetic array“) eine synthetisch kranke Interaktion von YBR241C und YGL104C mit dem Gen der Trehalose-6-Phosphat-Synthase TPS1 auf. Diese Interaktion sprach gegen eine Beteiligung der Genprodukte am Trehalosestransport, da tps1-Mutanten keine Trehalose enthalten. tps1-Mutanten haben einen Wachstumsdefekt mit schnell fermentierbaren Kohlenstoffquellen, der höchstwahrscheinlich auf einen Mangel an freiem Phosphat zurückzuführen ist. Somit scheinen die Proteine Ybr241 und Ygl104 die intrazelluläre Phosphatkonzentration zu beeinflussen. Eine Analyse ergab, daß der Phosphat- und Polyphosphatgehalt der Mutanten teilweise stark herabgesetzt war. Der Einfluß könnte direkt durch Phosphatimport in die Vakuole stattfinden oder sekundär über eine Verminderung der Glycerinproduktion, da durch die Synthese von Glycerin wieder Phosphat freigesetzt wird. Somit handelt es sich bei Ybr241 und Ygl104 möglicherweise um vakuoläre Phosphat- oder Glycerintransporter. Ferner konnte gezeigt werden, daß die saure Trehalase Ath1 sekretiert wird und Trehalose extrazellulär in Glucose hydrolysiert. Die Glucosemoleküle werden dann von der Hefezelle aufgenommen und verstoffwechselt. Somit spielt Ath1 eine essentielle Rolle beim Wachstum der Hefe mit Trehalose als Kohlenstoffquelle. Ziel des zweiten Teils dieser Doktorarbeit war die Entwicklung eines genomweiten Screens nach ER-Verpackungschaperonen, durch den bisher unbekannte Verpackungschaperone identifiziert werden sollten. Durch Testen verschiedener Varianten des Screens konnte ein Verfahren entwickelt werden, das prinzipiell funktionierte. Für den Einsatz im genomweiten Maßstab war es jedoch ungeeignet, da mit einer hohen Rate an falsch negativen Ergebnissen zu rechnen gewesen wäre.
Hintergrund: Der interventionelle Verschluss stellt für viele Patienten mit Vorhofseptumdefekt eine wichtige Alternative zur Operation dar. Jedoch ist dieses Verfahren noch relativ jung, so dass wenige Langzeitstudien bezüglich des Outcomes nach interventionellem Verschluss existieren. In dieser Studie wird das Langzeit-Outcome hinsichtlich der kardiopulmonalen Belastbarkeit beider Verschlussmethoden miteinander verglichen. Der Idee, eine spiro-ergometrische Untersuchung durchzuführen, lag die Vermutung zugrunde, dass es möglicherweise durch die Thorakotomie bei der Operation zu einer pulmonalen Restriktion kommen kann. Methoden: Es wurden insgesamt 52 Patienten untersucht, bei denen zwischen 1993 und 2002 in Frankfurt am Main ein Vorhofseptumdefekt verschlossen wurde. Die spiroergometrische Untersuchung fand ½ Jahr bis 9 Jahre nach Verschluss des Vorhofseptumdefektes statt. Bei 25 Patienten wurde der Defekt operativ verschlossen, bei 27 mittels interventionellem Verschluss. Das Alter der Patienten lag zwischen 6 und 59 Jahren. Die spiroergometrischen Daten wurden auf einem Fahrradergometer in halbliegender Position nach dem Protokoll von Godfrey erhoben. Hierbei wurde vor allem die Sauerstoff-aufnahme (VO2), die Kohlendioxidabgabe (VCO2), das Tidalvolumen (Vt) und das Atemminutenvolumen (VE) kontinuierlich ermittelt. Ergebnisse: Ein statistisch signifikanter Unterschied bezüglich des Alters und des Geschlechts lag zwischen den beiden Gruppen nicht vor. Es konnte auch kein signifikanter Unterschied bezüglich der maximalen Belastbarkeit, maxi-maler Herzfrequenz, des Tidalvolumens, der Sauerstoffaufnahme und der Kohlendioxidabgabe festgestellt werden. Praktische Schlussfolgerungen: Der interventionelle und der operative Verschluss haben hinsichtlich der kardiopulmonalen Belastbarkeit ein ver-gleichbares gutes Langzeitergebnis. Beide Verfahren weisen in Bezug auf andere Punkte (Invasivität, Komplikationsrate, Erfolgsrate, Kosten etc) sowohl Vor- als auch Nachteile auf. Jedoch ist durch die geringere Invasivität sowie durch das Ausbleiben der Narbenbildung die subjektive Einschränkung der Patienten mit interventionellem Verschluss deutlich geringer, so dass diese Methode wenn möglich die Methode der 1. Wahl darstellen sollte.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es die Bedeutung von Veränderungen im Neurotransmitterstoffwechsels für die Entstehung der Methotrexat assoziierten Neurotoxizität zu untersuchen. Des Weiteren sollte die Messung der Methyl-Tetrahydrofolsäure als Methode in das Spektrum der Liquordiagnostik des Stoffwechsellabors integriert werden. Es wurden bei 19 Patienten im Rahmen der ALL-BFM 2000 Studie die Konzentrationen der Neurotransmittermetaboliten HVA und 5-HIAA im Liquor gemessen. Begleitend wurde ein klinisches Monitoring durchgeführt um zu untersuchen ob zwischen Veränderungen auf Ebene der biogenen Amine und neurologischer Symptomatik ein Zusammenhang besteht. Bei der Betrachtung des Gesamtkollektives von 19 Patienten zeigte sich unter HDMTX in Protokoll M über den Zeitraum von 6 Wochen zunächst ein diskreter Anstieg der Liquorspiegel von 5-HIAA und HVA, gefolgt von einer deutlichen Konzentrationsminderung der beiden Metaboliten. Die 5-HIAA zeigte dabei einen ausgeprägteren Abfall der Konzentration. Während des zweiten Zyklus MTX in Protokoll M gab es einen transienten Anstieg der Liquorkonzentrationen der biogenen Amine. Der Grund dafür ist wahrscheinlich eine gehemmte Elimination der Metaboliten aus dem Liquor, weil MTX in niedriger Konzentration um dasselbe Auswärtstransportsystem konkurriert, nicht aber ein erhöhter Neurotransmitterumsatz. Die Abnahme der Liquorspiegel in der zweiten Hälfte von Protokoll M kann durch Hemmung der Neurotransmitterbiosynthese durch höhere MTX-Spiegel bei zuvor alterierter Bluthirnschranke bedingt sein. Bei alleiniger intrathekaler Applikation von MTX in Protokoll I und II war keine signifikante Veränderung der biogenen Amine nachweisbar. Die Synthese der biogenen Amine scheint daher nur unter Behandlung mit HDMTX betroffen zu sein. Dass auch das Auftreten von klinisch-neurologischen Ereignissen in Protokoll M gegenüber den übrigen Behandlungsabschnitten erhöht war legt sowohl eine Beteiligung des Neurotransmitterstoffwechsels an der Neurotoxizität, als auch eine Abhängigkeit von der MTX-Dosis in diesen Zusammenhang nahe. Trotzdem bei den Einzelverläufen der 19 Patienten im Verlauf der Therapie kein einheitliches Muster feststellbar ist, spricht die Tatsache, dass die Konzentrationen von HVA und 5-HIAA an Tagen mit neurologischem Ereignis signifikant niedriger waren als an den ereignisfreien Tagen, für die Beteiligung erniedrigter Spiegel der biogenen Amine an der Genese der Methotrexat assoziierten Neurotoxizität. Da Patienten, die im Verlauf neurologische Komplikationen aufwiesen, gegenüber nichtbetroffenen Patienten keine generellen Unterschiede der Neurotransmitterkonzentrationen aufweisen, kann aufgrund des bei Therapiebeginn gemessenen Ausgangswertes eines Patienten keine prädiktive Aussage für die weitere Intensivphase gemacht werden. Demgegenüber könnten Patienten, die unter Behandlung mit MTX bereits zu Beginn einen deutlichen Abfall der biogenen Amine zeigen, ohne dass es bis dahin zu neurologischen Komplikationen gekommen ist, möglicherweise von einer erweiterten supportiven Therapie profitieren. Dabei könnten die Neurotransmittervorstufen L-Dopa und 5-Hydroxytryptophan, sowie Tetrahydrobiopterin eingesetzt werden. Außerdem können Adenosinantagonisten, und Präparate zur Behandlung der Hyperhomocysteinämie verabreicht werden. Durch diese Behandlung kann das Risiko für neurologische Ereignisse eventuell vermindert werden. Veränderungen im Neurotransmitterstoffwechsel unter MTX und deren Bedeutung für das Auftreten von neurologischen Komplikationen wurden in zahlreichen Arbeiten und Fallberichten beschrieben. Dabei konnte allerdings bisher keine eindeutige Beziehung abgeleitet werden. Die gegenseitige Beeinflussung mit den Veränderungen im Stoffwechsel von Adenosin, Homocystein und den schwefelhaltigen exzitatorischen Aminosäuren macht eine multifaktorielle Genese der neurologischen Ereignisse wahrscheinlich. Dabei könnte durch eine Verminderung der biogenen Amine eine Prädisposition geschaffen werden, die durch Wechselwirkung mit den anderen beschriebenen Mechanismen zum Auftreten eines unerwünschten Ereignisses führt. Es ist dabei durchaus möglich, dass es bestimmte Stoffwechselveränderungen gibt, deren Kombination regelhaft zum Auftreten von neurologischen Komplikationen führt. Aufgrund des absolut gesehen seltenen Auftretens der Methotrexat assoziierten Neurotoxizität konnten solche möglichen Risikofaktoren-Profile allerdings bisher nicht charakterisiert werden. Es ist wahrscheinlich dass Methotrexat auch in Zukunft eine bedeutende Rolle bei der Behandlung der kindlichen Leukämie spielen wird. Daher ist eine weitere Aufklärung der Pathomechanismen der Neurotoxizität anzustreben um durch erweiterte supportive Maßnahmen die Therapie für die Patienten weiter verbessern zu können. Ein wesentlicher Fortschritt in der Aufklärung der MTX-Neurotoxizität könnte durch eine prospektive Studie erreicht werden, die standardisierte zusätzliche Liquorpunktionen beinhaltet. Durch die Auswertung dieser Messungen könnte der Verlauf der Konzentrationen der biogenen Amine und weiterer MTX induzierter Stoffwechselveränderungen sehr viel besser beurteilt werden. Eine wichtige Rolle spielt auch die Bestimmung der Methyl-Tetrahydrofolsäure, deren Messung im Liquor als Bestandteil dieser Arbeit in das Leistungsspektrum des Labors integriert wurde. Nach Durchführung des beschriebenen Qualitätskontrollprogramms, welches die Bestimmung einer Messkurve, Reproduzierbarkeit, Stabilitätstestung und Wiederfindungsrate beinhaltet, kann die MTHF-Messung als sichere und reproduzierbare Analyse angewendet werden. Bei den in dieser Studie untersuchten 19 Patienten war kein Zusammenhang zwischen der MTHF-Konzentration im Liquor und den Spiegeln von HVA oder 5-HIAA feststellbar. Auch zum Auftreten von klinisch-neurologischen Komplikationen besteht keine Korrelation. Neben der Bestimmung der Methyl-Tetrahydrofolsäure in weiteren Arbeiten zur Methotrexat assoziierten Neurotoxizität ist diese Messung in der Diagnostik anderer neurologischer Krankheitsbilder einsetzbar.
Die vorliegende Arbeit präsentiert die Ergebnisse der Erzeugung und Diagnostik eines HF-Plasmas in einem magnetischen Quadrupolfeld. Einen Schwerpunkt bildete dabei der Einfluss des magnetischen Quadrupolfeldes auf die Plasmaparameter Elektronentemperatur Te und Elektronendichte ne. Die Extraktion eines Ionenstrahls bietet die Möglichkeit, Zusammenhänge zwischen den erreichten Strahlparametern und den physikalischen Eigenschaften des HF-Plasmas herzustellen. Zudem wird eine Korrelation zwischen der Geometrie der Entladung, der erreichbaren Plasmaparameter und der eingespeisten HF-Leistung aufgezeigt werden. Zunächst wurde die Elektronentemperatur in Abhängigkeit vom eingestellten Gasdruck und von der Stromstärke in den Feldspulen des magnetischen Quadrupols vermessen. Die Emissionsspektroskopie bot sich hierbei als nicht invasive Diagnostik an. Eine umfangreiche Messreihe ergab schließlich ein Profil der Elektronentemperatur, als Funktion der variablen Parameter Gasdruck und Erregerstromstärke. Die Elektronentemperatur im Plasma lag dabei im Bereich zwischen 3eV ohne Magnetfeld bis maximal 11eV mit magnetischem Einschluss. Hierbei zeigten sich einige, auf den ersten Blick überraschende Ergebnisse. So ergab sich ein lokales Maximum der Elektronentemperatur von 11eV bei einem Gasdruck von 1Pa und einer Flussdichte von 11mT. Als physikalische Ursache konnte die Kombination aus zwei resonanten Heizmechanismen identifiziert werden. Sowohl die stochastische Heizung als auch die lokale Anwesenheit von Zyklotronresonanzbedingungen führten zu einer starken Erhöhung der Elektronentemperatur. Ferner konnte experimentell nachgewiesen werden, dass die charakteristischen Eigenschaften des Quadrupolfeldes, das Entstehen dieser Heizmechanismen in einem engen Parameterbereich begünstigte. In diesem Zusammenhang ist die Ausprägung einer Gyroresonanzzone im HF-Plasma erwähnenswert, deren Ausdehnung mit dem Erregerstrom in den Feldspulen des Quadrupols skaliert und die einen maßgeblichen Einfluss auf die Ausprägung hochenergetischer Elektronen hat. Neben der Diagnostik stand auch die Extraktion eines Ionenstrahls im Vordergrund. Das Potential des Gesamtsystems, als Ionenquelle zu fungieren wurde dabei experimentell verifiziert. Spezifische Strahlstromdichten von 8mA/cm²kW konnten dabei erreicht werden. Es ergab sich hierdurch auch die Möglichkeit, einen Zusammenhang zwischen der Elektronendichte im Plasma und der eingespeisten HF-Leistung herzustellen. Die Ergebnisse dienten anschließen dazu, den Einschluss des Plasmas im magnetischen Quadrupolfeld zu quantifizieren. Beim Betrieb des Plasmagenerators ohne Magnetfeld wurden Elektronendichten von 3 . 1016m-3 erzielt. Mit fokussierendem Quadrupolfeld konnte eine lokale Steigerung der Elektronendichte um den Faktor 10 auf 3 . 1017m-3 dokumentiert werden, was die theoretischen Studien von C. Christiansen und J. Jacoby [Chr99], zu den fokussierenden Eigenschaften eines magnetischen Quadrupols, bestätigte. Große Sorgfalt war bei der Konzeption der HF-Einspeisung erforderlich. Da für Entladungsplasmen ein im hohen Maß nichtlinearer Zusammenhang, zwischen den Plasmaparametern und der eingespeisten HF-Leistung besteht, erwies sich die Entwicklung einer HF-Einkopplung als besondere Herausforderung. Hier zeigte sich die Plasmadiagnostik als unverzichtbares Hilfsmittel, um theoretische Vorhersagen und experimentellen Befund in Einklang zu bringen. Als limitierende Rahmenbedingungen erwiesen sich hier die Abmessungen des Quadrupols. In der vorliegenden Arbeit konnte dokumentiert werden, wie die geometrischen Einschränkungen die Auswahl der HF-Einkopplung bestimmten. Das zur Untersuchung des magnetischen Plasmaeinschlusses verwendete Glasrohr, mit einer verhältnismäßig großen Oberfläche und einem vergleichsweise kleinem Volumen, war für eine kapazitive HF-Einkopplung wesentlich besser geeignet als für die ursprünglich antizipierte induktive Plasmaanregung. Die physikalischen Zusammenhänge zwischen den erreichbaren Plasmaparametern, der verwendeten Koppelmethode, der erzielbaren Stromstärke des Ionenstrahls und den Abmessungen des Entladungsgefäßes, konnten durch eine umfassende Analyse aufgeklärt werden. Zudem wurde auch die Problematik des Zerstäubens von Elektrodenmaterial einer qualitativen Untersuchung unterzogen. Hier kristallisierten sich vor allen Dingen die hohen Randschichtpotentiale bei der verwendeten HF-Einkopplung, als physikalische Ursache für die Sputterrate heraus. Basieren auf den gewonnenen Erkenntnissen wurde eine Maßnahme zur Reduzierung der Sputterproblematik vorgenommen. Die Untersuchung des magnetisch eingeschlossenen Entladungsplasmas brachte Einsichten über die Zusammenhänge zwischen gewählter HF-Einkopplung, den Plasmaparametern und den Rahmenbedingungen der Entladungsgeometrie. Es ergeben sich hierdurch wichtige Erkenntnisse, die eine Aufskalierung des vorliegenden Aufbaus hin zu einer Hochstromionenquelle mit spezifischen Strahlstromdichten von 100mA/cm²kW ermöglichen. Ferner ist auch ein Einsatz der Konfiguration als Plasmatarget möglich, um Wechselwirkungen zwischen hochenergetischen Schwerionen und magnetisch fokussierten Entladungsplasmen zu untersuchen.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war in einer klinisch prospektiven Studie das diagnostische Potential der 2-Phasen-Positronenemissionstomographie mit 18-Fluor-2-Deoxy-D-Glukose bei Patienten mit suspekter, zufälliger, intestinaler FDG-Aufnahme abzuschätzen. Bei 56 Patienten aus einem Patientenkollektiv von 1098, die im Rahmen des Stagings oder Restagings einer malignen Grunderkrankung eine solitäre fokal suspekte abdominelle Läsion aufwiesen, wurde im Zeitraum vom August 2001 bis Oktober 2002 am Universitätsklinikum Frankfurt am Main eine Zwei-Phasen-PET mit quantitativer Analyse des maximalen Standard-Uptake-Value-Wertes (SUVmax) vorgenommen. Die Erstaufnahme begann 65 ± 19,5 min und die Spätaufnahme 211 ± 52,5 min nach der Injektion des FDG. Die letztendliche Diagnose der initialen suspekten abdominellen Läsionen erfolgte durch Endoskopie (6), Histopathologie (6), CT (18) oder MRT (1); alle Patienten wurden während eines Zeitraums von 13 ± 2,8 Monaten beobachtet. Von den suspekten abdominalen Läsionen zeigten 42 einen initialen SUVmax ≥ 2,5 (75 %) im Gegensatz zu 14 Fällen mit initialem SUVmax < 2,5 (25 %). Von allen untersuchten Patienten zeigten 32 einen Uptake-Anstieg (57 %); 10 maligne (31 %) und 22 benigne Läsionen (69 %). Bei benignen Läsionen mit einer initialen SUVmax ≥ 2,5 (n=31) wurde ein Uptake-Anstieg bei 17 Patienten (55 %) und ein Uptake-Abfall bei 14 Patienten (45 %) beobachtet. Die Hälfte der benignen Läsionen mit einen initialen SUVmax < 2,5 (n=10) zeigten einen Uptake-Anstieg, die restlichen 50% einen Uptake-Abfall. In 5 benignen Fällen veränderte sich die Konfiguration in der Spätaufnahme. Maligne Läsionen mit einem initialen SUVmax ≥ 2,5 zeigten eine FDG- Uptake-Abfall in 4 Fällen (36 %) und einen Uptake-Anstieg in 6 Fällen (54 %). Bei einem Patient mit einer malignen Läsion blieb der SUVmax stabil bei 3,0. Alle malignen Läsionen mit einer initialen SUVmax < 2,5 zeigten eine Steigerung. Läsionen, die eine FDG-Uptake-Steigerung von ≥ 15 % zeigten, wurden mit einer Sensitivität von 60 % und einer Spezifität von 68 % korrekt diagnostiziert. Die Auswertungen zeigen, dass lediglich Läsionen, die in der Spätaufnahme ihre Konfiguration verändern oder nicht mehr festzustellen sind, und Läsionen mit einem SUVmax < 2,5, die einen Uptake-Abfall in der Spätaufnahme zeigen, zuverlässig als benigne eingestuft werden können. Ein maligner Prozess muss bei Läsionen mit einem initialen SUVmax < 2,5, die einen Uptake-Anstieg von mehr als 30 % zeigen, weiter abgeklärt werden. Diese Daten müssten in größeren Patientenkollektiven einschließlich histopathologischer Korrelation weiter untersucht werden. In allen anderen Läsionen mit Uptake-Anstieg und -Abfall konnte ein maligner Prozess durch die 2-Phasen-PET nicht ausgeschlossen werden. Diese Foci sollten durch weitere Untersuchungen unbedingt abgeklärt werden. Zusammenfassend ist die 2-Phasen-PET eine bildgebende Methode mit einem limitierten diagnostischen Potential bei der Interpretation von abdominellen Läsionen. Es lässt sich kein zuverlässiger Cut-Off-Wert des SUVmax zur sicheren Unterscheidung benigner von malignen Läsionen definieren, da die abdominellen Foci unabhängig von ihrer Dignität ein sehr heterogenes Uptake-Muster zeigen.
Die Autoimmunerkrankungen Typ 1 Diabetes mellitus, autoimmune Schilddrüsenerkrankungen und Morbus Addison betreffen zusammen etwa 3% der Bevölkerung. Ihre Genese ist multifaktoriell, also von verschiedenen endo- als auch exogenen Faktoren abhängig. Sie alle tragen gemeinsame prädisponierende genetische Merkmale, das wichtigste unter ihnen ist der Risikogenort der HLA- Gene auf Chromosom sechs, der etwa die Hälfte des genetischen Risikos vermittelt. Für Typ 1 Diabetes mellitus wurde die Insulingenregion als ein weiterer wichtiger Risikogenort postuliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde dieser Zusammenhang in der deutschen Bevölkerung untersucht und nach einer eventuellen Assoziation dieses Genortes mit anderen Autoimmunerkrankungen geforscht. Bei den Untersuchungen in der Insuligenregion wurde der Polymorphismus -2221 MspI (C/T) in der Promotoregion des Insulingens auf seine Assoziation mit der Erkrankung Typ 1 Diabetes mellitus sowie der Erkrankungen Morbus Addison, Morbus Basedow und Hashimoto- Thyreoiditis untersucht. Es wurden auch Patienten genotypisiert, die an einem PGAS- II Syndrom litten, also neben der Erkrankung Typ 1 Diabetes mellitus und/oder Morbus Addison noch zusätzlich an mindestens einer der Erkrankungen Hashimoto- Thyreoiditis oder Morbus Basedow erkrankt waren. Das „C“- Allel der Polymorphismus -2221 MspI (C/T) ist mit den VNTR Klasse IAllelen verknüpft, diese Allele gelten als Risikogenorte für die Entwicklung eines Typ 1 Diabetes mellitus. Das „T“- Allel hingegen steht im Kopplungsungleichgewicht mit den VNTR- Klasse III- Allelen, die vor der Entwicklung eines Typ 1 Diabetes mellitus schützen können. Die von uns untersuchten Typ 1 Diabetiker zeigten das „C“- Allel signifikant häufiger als die Kontrollen (77,2% vs. 49,1%). Es fand sich eine Tendenz zur Bevorzugung des weiblichen Geschlechtes. In den 213 untersuchten Familien transmittierten phänotypisch gesunde Eltern das „C“- Allel signifikant häufiger an ihre erkrankten Kinder als das protektive „T“- Allel. Der Zusammenhang zwischen Polymorphismen der Insulingenregion und den HLA-Risikoallelen wurde bereits in verschiedenen Populationen untersucht und kontrovers diskutiert. Unsere Untersuchungen wiesen bei Kindern mit dem HLAHochrisikohaplotyp DQ2/DQ8 das krankheitsauslösende „C“- Allel signifikant häufiger nach als bei Kindern mit einem niedrigen HLA- Risikohaplotyp. Für Kinder mit einem mittleren HLA- Risiko konnte ebenfalls eine häufigere Transmission des „C“- Allels gezeigt werden. Die von uns untersuchten Patienten mit einer Hashimoto- Thyreoiditis zeigten keine signifikante Assoziation mit dem Polymorphismus, betrachtet man aber nur die erkrankten Frauen in dieser Gruppe, zeigt sich eine borderline- Signifikanz von p=0,0533, was zu der Annahme führt, dass durch eine Erhöhung der Fallzahl durchaus eine Assoziation mit der Erkrankung gezeigt werden könnte. Bei der Gruppe der Addison – Patienten fanden wir eine signifikante Assoziation mit dem Polymorphismus, die aber nicht ganz so deutlich wie bei den Diabetikern war. Hier zeichnet sich eine Bevorzugung des weiblichen Geschlechtes ab. In der Gruppe der PGAS- II Patienten zeigten nur diejenigen Patienten eine Assoziation mit dem Polymorphismus, die an Typ 1 Diabetes mellitus in Kombination mit einer Hashimoto- Thyreoiditis und die an Morbus Addison in Kombination mit Morbus Basedow litten. Bei den anderen Autoimmunendokrinopathien zeigte sich kein Zusammenhang mit der Insulingenregion. Zusammengefasst lässt sich also festhalten, dass der Einfluss der Insulingenregion auf andere Autoimmunerkrankungen neben Typ 1 Diabetes mellitus nicht ausgeschlossen werden kann, ein endgültiger Beweis aber noch zu erbringen ist. Für die Entwicklung von Autoimmunendokrinopathien ist neben der genetischen Komponente aber auch der Einfluss anderer Faktoren von Bedeutung. Eine große Rolle spielt besonders der Einfluss von Vitamin D auf das menschliche Immunsystem. In mehreren Studien wurde gezeigt, dass niedrige Vitamin D Spiegel für die Entwicklung von Typ 1 Diabetes mellitus prädisponieren und die Gabe von 1, 25 (OH)2D3 bei NOD Mäusen die Entstehung die Erkrankung verhindern kann. Zum Erreichen ausreichend hoher Mengen an aktivem Vitamin D wird 25 (OH)D3 nach der glomerulären Filtration in der Niere über die endozytotischen Rezeptoren Megalin und Cubilin wieder rückresorbiert. Bei defektem Megalin- oder Cubilin- Rezeptor konnte ein deutlicher Vitamin D- Verlust nachgewiesen werden. Deshalb wurden im Rahmen dieser Dissertation an Typ 1 Diabetes mellitus erkrankte Patienten auf fünf verschiedenen Polymorphismen des Cubilingens untersucht und nach einem signifikanten Unterschied zwischen dieser Patientengruppe und gesunden Kontrollen gesucht. Die untersuchten Cubilingenpolymorphismen Cub-33, Cub-29, Cub-35 und Cub-68 zeigten keine Assoziation mit der Erkrankung Typ 1 Diabetes mellitus. Beim untersuchten Polymorphismus Cub-65 hingegen zeigten sich zwischen Patienten und Kontrollen signifikante Unterschiede in der Genotypverteilung. Der Genotyp „AA“ kommt bei den untersuchten Patienten zu 26,7% vor, bei den Kontrollen nur zu 5,1%. Allerdings führt der Polymorphismus nicht zur Änderung der Aminosäuresequenz des Cubilins, weshalb seine biologische Bedeutung fraglich ist. Nach heutiger Kenntnis scheint der Polymorphismus also keine Assoziation mit der Erkrankung Typ 1 Diabetes mellitus zu zeigen. Die Bedeutung des Cubilins für die Reabsorption von 25 (OH)D3 bleibt jedoch außer Frage, weshalb weitergehende Untersuchungen mit größeren Patientengruppen auf andere Polymorphismen des Gens einen Zusammenhang zwischen Polymorphismen des Cubilingens und Typ 1 Diabetes mellitus zeigen könnten.
In der vorliegenden Arbeit konnte das Subkompartiment der synaptischen aktiven Zone erstmals in der für Proteomstudien erforderlichen Qualität aufgereinigt werden. Nach Präparation des Gesamthirns der Ratte wurden über verschiedene Homogenisations- und Zentrifugationschritte Synaptosomen gewonnen, die durch einen hypoosmotischen Schock zum Platzen gebracht wurden. Der Inhalt, vornehmlich synaptische Vesikel, wurde in einem Saccharosedichtegradienen aufgetrennt. Die Analyse dieses Gradienten bestätigte, dass sich in den unteren, dichteren Fraktionen (Fraktionen 28-34) Elemente synaptischer Vesikel und auch der Plasmamembran befanden. Damit war eine wichtige Grundvoraussetzung für eine nachfolgende Proteomuntersuchung gedockter synaptischer Vesikel erfüllt. Die Analyse dieser Fraktionen durch Western-Blot und mittels Transmissionselektronenmikroskopie zeigte aber auch, dass sie diverse Organellmarker enthielten und insgesamt eine heterogene Zusammensetzung von membranären Strukturen zeigten. Daher folgte als weiterer Aufreinigungsschritt eine immunmagnetische Trennung mit monoklonalen Antikörpern gegen das ubiquitäre integrale Protein synaptischer Vesikel, SV2. Die hohe Reinheit der resultierenden Fraktion gedockter synaptischer Vesikel konnte durch elektronenmikroskopische Analysen und proteinchemische Methoden (2D BAC-/SDS-PAGE und Western Blot) nachgewiesen werden. Die Optimierung der Integrität der verwendeten Proben erlaubte eine funktionelle Zuordnung der durch die hochsensensitiven massenspektrometrischen Analysen identifizierten Proteine. Zur Proteinidentifikation wurden zwei verschiedene Methoden herangezogen: die zweidimensionale BAC-/SDS-PAGE mit anschliessender MALDI-TOF Analyse und die eindimensionale SDS-PAGE mit nachfolgender nanoLC ESI MS/MS. Beide Methoden ergänzten sich; generell wurde über die zweite Methode eine größere Anzahl von Proteinen identifiziert. Durch die Verwendung und Kombination der verschiedenen massenspektrometrischen Methoden und unterstützt durch eine Western Blot Analyse konnten insgesamt 245 Proteine identifiziert werden. Dabei handelte es sich um (i) integrale synaptische Vesikelproteine, (ii) transient mit synaptischen Vesikeln assoziierte Proteine, (iii) Proteine der Plasmamembran und Zelloberfläche, (iv) Signalkaskadenproteine und kleine GTPasen, (v) Proteine des Zytoskeletts, (vi) glykolytische und andere metabolische Enzyme, sowie (vii) Chaperone und (viii) mitochondriale Proteine. Im zweiten Teil der Arbeit wurden ausgewählte Proteine genauer untersucht. Die Analyse der löslichen Proteine WK1 und WK2 zeigten in Genexpressionsstudien eine ubiquitäre Gewebeverteilung. Rekombinante Proteine wurden in Zelllinien exprimiert, um einen Einblick in deren subzelluläre Lokalisierung zu erhalten. Die Expressionsanalyse der integralen Transmembranproteine zeigte für alle Kandidaten eine neuronale Expression der mRNA. Für jeden der Kandidaten wurden individuelle Genexpressionsmuster im Hirn beobachtet. Gegen zwei der Kandidatenproteine konnten funktionelle Antikörper erzeugt werden. Die Immunomarkierung mit anti-Ttyh1-Antikörpern zeigt eine hochspezifische Färbung der Fasertrakte in verschiedenen Hirnarealen sowie eine neuronale Lokalisation in Primärkulturen des Hippokampus und des Neokortex der Ratte. Lingo1-Immunfärbungen markierten selektiv Nervenzellen des limbischen Systems und Mitralzellen des Bulbus olfactorius. Diese Studie führt konsequent die Idee der spezifischen Aufreinigung von Vesikelkompartimenten der Synapse weiter: Mit der Einführung eines hochaffinen immunchemischen Anreicherungsschrittes in dem Aufreinigungsprozess wird dem bisherigen Methodenarsenal zur Spezifizierung der Probe über physiko-chemische Parameter eine neue Dimension hinzugefügt: Die molekulare Identität.
Hintergrund und Fragestellung Die dermatologische Ausbildung von Studierenden an der Johann Wolfgang Goethe-Universität in Frankfurt am Main wird seit dem Wintersemester 2002/2003 durch ein teilweise verpflichtendes Onlineangebot ergänzt. Wichtigster Bestandteil der Onlinelehre ist die verpflichtende Bearbeitung von virtuellen Patientenfällen. Durch die Bearbeitung soll die Vorgehensweise der Patientenbehandlung (Anamnese erheben → dermatologischen Befund beschreiben→ Diagnose erstellen → Therapieplan erarbeiten) simuliert und trainiert werden. Ziel der Untersuchungen Die vorliegende Promotion geht der Frage nach, wie das in die Präsenzlehre integrierte Onlineangebot genutzt wurde und wie die Qualität der Bearbeitung zu bewerten ist. Zusätzlich wurde die Akzeptanz der Onlinelehre in Form von Evaluationen hinterfragt. Die ausgewerteten elektronischen Benutzerprotokolle (Log-Files) und Evaluationsergebnisse dienten der Überarbeitung des Onlineangebots zum Wintersemester 2006/2007. Zusätzlich wurden die Ergebnisse der für das Wintersemester 2006/2007 geänderten Inhalte untersucht und bewertet. Material und Methode Die durch die Nutzung des Onlineangebots automatisch aufgezeichneten elektronischen Benutzerprotokolle (Log-Files) wurden retrospektiv ausgewertet. Dabei wurden die Nutzungsdaten von 805 Studierenden, die das Onlineangebot nur mittels eines individuellen Passworts nutzen konnten, untersucht. Es erfolgte keine personalisierte Auswertung. Die Datenerhebung erfolgte ab dem Wintersemester 2002/2003. Ausgewertet wurden die Nutzungsdaten folgender Wintersemester: 2003/2004, 2004/2005, 2005/2006, 2006/2007. Weiterhin wurden die Evaluationsergebnisse der Onlineevaluationen, die im Anschluss an folgende Wintersemester erfolgte: 2003/2004, 2004/2005, 2005/2006 analysiert. Zudem fand eine persönliche Befragung von 10 Studierenden bezüglich des Onlineangebots im Sommersemester 2006 statt. Ergebnisse * Anzahl der Fallbearbeitungen Durchschnittliche bearbeitete jeder Kursteilnehmer 4,4 virtuelle Patientenfälle. Somit wurden 10 % aller Partienfälle freiwillig bearbeitet. Dabei fand die Fallbearbeitung vorzugsweise einen Tag vor der Freischaltung des nächsten Patientenfalls statt. * Durchschnittliche Bearbeitungszeit Die Auswertungen ergaben, dass die Bearbeitungszeit eines virtuellen Patientenfalls von der Anzahl der Einsendeabfragen und der Fallpositionierung bei der Präsentation abhängig ist. Dabei beträgt die Fragenbearbeitungszeit des jeweils erstpositionierten Patientenfalls ca. 6 Minuten und vermindert sich auf ca. 3 Minuten beim letztpositionierten Patientenfall. * Die inhaltliche Auswertung der Onlinefälle Die inhaltliche Auswertung der virtuellen Patientenfälle und die Ergebnisse der Fallevaluationen zeigten einen Optimierungsbedarf hinsichtlich der Fragestellung einzelner Fragen. Daher wurden 13 der insgesamt 49 Fallfragen zum Wintersemester 2006/2007 überarbeitet (26,5 %). Die Überarbeitung führte im Wintersemester 2006/2007 bei 9 Fragen zu signifikant höheren Ergebnissen. Bei 4 Fragen, die „Transferleistungen“ erforderten, kam es zu keiner signifikanten Verbesserung der Ergebnisse. Die Freitext-Fragen der virtuellen Patientenfälle wurden auch ohne konkrete elektronische Korrektur ernst genommen und so gut wie möglich von 99,4 % der Studierenden beantwortet. Dieses Ergebnis zeigte, dass die Selbstkorrektur im Anschluss an die Fragenbearbeitung ausreichend war. Zudem wurde deutlich, dass der Präsentationszeitpunkt eines virtuellen Patientenfalls keinen Einfluss auf die durchschnittlichen Gesamtergebnisse hatte. * Befundbeschreibungsergebnisse Bezüglich der Befundbeschreibungen zeigten sich grundsätzlich drei Probleme: 1. Die Befundbeschreibungen waren nicht vollständig 2. Es zeigten sich Defizite bei der Benennung der richtigen Effloreszenz 3. Die Bedeutung des Übungsbereichs „Befundbeschreibungen“ wurde nicht erkannt * Evaluationsergebnisse des Onlineangebots Die Evaluationsergebnisse ergaben eine positive Bewertung des Onlineangebots durch die Studierenden, obwohl das Onlineangebot teilweise verpflichtend war. Dabei gaben ca. 90 % der Studierenden an, durch die Bearbeitung der Onlinefälle, einen Lerneffekt erzielt zu haben. Auch das Verhältnis zwischen Präsenzveranstaltung und Onlineunterricht wurde von ca. 90% der Studierenden positiv bewertet. Zudem bezeichneten ca. 80 % der Studierenden die Verzahnung der Onlinelehre („Hausaufgaben“) mit der Präsenzlehre („interaktive Vorlesung“) als motivationsfördernd. Schlussfolgerungen Integrierte verpflichtende Online-Angebote mit sinnvoll auf die Präsenzlehre abgestimmten Inhalten (Blended-Learning) werden gut bewertet. Ebenfalls gut bewertete, singuläre freiwillige Online-Angebote werden dagegen nur vereinzelt genutzt. Wichtige Inhalte sollten "Online" zu Kursbeginn angeboten werden, da die Bearbeitungszeit im Laufe des Semesters sinkt. Die Positionierung der Online-Elemente vor die Präsenzlehre erhöht die Bearbeitungszeit und verbessert die Gesamtergebnisse. Durch Umformulierung ließen sich die Ergebnisse bei 9 Fragen signifikant verbessern. Das vorhandene Lehrangebot konnte die Fähigkeiten der Studierenden zur Befundbeschreibung nicht verbessern. Evaluationen wie diese können damit Schwachstellen vorhandener Lehrangebote identifizieren und dabei helfen, diese zu optimieren.
In dieser Studie wurden drei Patientenkollektive der pädiatrischen Gerinnungsambulanz der Uniklinik Frankfurt auf das Vorhandensein von Antiphospholipid-Antikörpern (APA) untersucht: 1.) Kinder mit verlängerter PTT (n=121) 2.) Kinder mit Z.n. cerebralen Infarkten (n=20) 3.) Kinder mit Z.n. venösen Thrombosen (n=29) Diese drei Kollektive wurden mit drei dem jeweiligen Patientenkollektiv alters- und geschlechtsentsprechenden Kontrollkollektiven verglichen: 1.) Kontrollgruppe A: das dem Kollektiv mit Kindern mit verlängerter PTT entsprechende Kontrollkollektiv (n=25) 2.) Kontrollgruppe B: das dem Kollektiv mit Kindern mit cerebralen Infarkten entsprechende Kontrollkollektiv (n=20) 3.) Kontrollgruppe C: das dem Kollektiv mit Kindern mit Thrombosen entsprechende Kontrollkollektiv (n=29) Der statistische Vergleich zwischen den Patientenkollektiven und dem jeweils entsprechenden Kontrollkollektiv erfolgte mit dem Fisher´s exact Test oder dem Wilcoxon-Mann-Whitney-UTest. Es wurden folgende Parameter bestimmt, um die Patienten und die Kontrollen als „Antiphospholipid-Antikörper-positiv“ bzw. „Antiphospholipid-Antikörper-negativ“ zu klassifizieren: Die Anticardiolipine (ACL) IgG und IgM, die Anti-ß2-Glykoproteine I (Anti-ß2GP I) IgG, IgM und IgA, Lupus Screen, Lupus Ratio und die PTT. Bei einzelnen Patienten konnten als weitere Bestätigungstests ebenfalls KCT und ICA herangezogen werden. Als „APA-positiv“ wurden diejenigen Kinder eingestuft, die erhöhte mittels ELISA bestimmte ACL oder Anti-ß2GP I hatten und/oder die positive, über die PTT als Screeningtest und den Lupus Screen und die Lupus Ratio als Bestätigungstests ermittelte Lupusantikoagulantien (LA) hatten. Als Grenzwerte wurden für die ACL und die Anti-ß2GP I die 95. Percentilen der drei Kontrollkollektive berechnet, wobei diese Werte, mit Ausnahme der Anti-ß2GP I, deutlich unter den Grenzwerten des Testherstellers lagen. Für die PTT, den Lupus Screen, die Lupus Ratio, die KCT und den ICA wurden als Grenzwerte die Testherstellerangaben übernommen. APA wurden bei 53/121 Kindern mit verlängerter PTT, bei 13/20 Kindern mit cerebralen Infarkten und bei 16/29 Kindern mit Thrombosen diagnostiziert und traten in allen drei Patientenkollektiven signifikant häufiger (p<0,05) als in dem jeweils entsprechenden Kontrollkollektiv auf. Es wurde eine Odds Ratio von 7,43 errechnet, bei positiven APA einen cerebralen Infarkt zu erleiden und eine Odds Ratio von 7,38, bei positiven APA eine venöse Thrombose zu bekommen. Die Titer der ACL IgG lagen bei den Kindern mit verlängerter PTT und bei den Kindern mit Thrombosen signifikant höher als in der Kontrollgruppe A bzw. C (p=0,002; p<0,001). Erhöht waren die ACL IgG signifikant häufiger bei den Kindern mit cerebralen Infarkten und bei den Kindern mit Thrombosen als in der Kontrollgruppe B bzw. C (p=0,044; p=0,002). Die Titer der ACL IgM lagen in allen drei Patientenkollektiven signifikant höher als in den drei Kontrollgruppen (p<0,05), und bei den Kindern mit cerebralen Infarkten waren die ACL IgM signifikant häufiger erhöht als in der Kontrollgruppe B (p=0,008). Die Titerhöhe der Anti-ß2GP I IgG, IgM und IgA war in keinem der Patientenkollektive signifikant höher als in den Kontrollgruppen. Auch waren Anti-ß2GP I IgG, IgM und IgA in keinem der Patientenkollektive signifikant häufiger erhöht als in der entsprechenden Kontrollgruppe. Die Werte des Lupus Screens lagen in keinem der Patientenkollektive signifikant über denen des entsprechenden Kontrollkollektivs, jedoch wurde bei den Kontrollen im Gegensatz zu den Patienten kein einziger positiver Lupus Screen durch eine erhöhte Lupus Ratio bestätigt, sodass, auch unter Berücksichtigung der PTT, der KCT und des ICA, bei den Kindern mit verlängerter PTT signifikant häufiger LA nachgewiesen wurden als in der Kontrollgruppe A (p=0,003). Bei den Kindern mit Thrombosen waren LA häufiger positiv als in dem Kontrollkollektiv C, aber ohne Signifikanz (p=0,068). APA scheinen eine wichtige Rolle in der Thrombophilie-Diagnostik zu spielen, wobei wir einen statistischen Zusammenhang zwischen ACL und Thrombosen sowie zwischen ACL und cerebralen Infarkten fanden. Auch können vermutlich APA in vielen Fällen für eine verlängerte PTT bei ansonsten klinisch unauffälligen Kindern verantwortlich gemacht werden. Ob es von Bedeutung ist, bei einem Thrombophilie-Screening bzw. zur Abklärung einer TTVerlängerung die Anti-ß2GP I zu bestimmen, wird durch unsere Studie in Frage gestellt.
Die Replikation und Pathogenese von HIV ist in hohem Maße von zellulären Faktoren abhängig. Das Virus muss einerseits die protektiven und antiviralen Abwehrmechanismen der Wirtszelle umgehen können und gleichzeitig ist seine Replikation an die Nutzung zellulärer Faktoren adaptiert. Neben der Interaktion mit konstitutionell exprimierten zellulären Proteinen bewirkt das HI-Virus auch eine transkriptionelle Regulation zellulärer Gene, um sich einen für seine Replikation vorteilhaften Funktionszustand der Wirtszelle zu schaffen. Durch eine HIV-Infektion differentiell exprimierte Gene stellen daher potentielle Kandidatengene zur Identifizierung essentieller Wirtsfaktoren oder zellulärer Restriktionsfaktoren der HIV-Replikation dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die durch HIV-Infektion differentiell regulierten Gene LEREPO4, GLiPR, SCC-112 und Moesin auf eine mögliche Funktion bei der HIV-Replikation analysiert. Dabei wurden diese durch RNA Interferenz (RNAi) im Kontext einer HIV-Infektion reprimiert. Als zelluläres Modellsystem wurden P4-CCR5-Zellen verwendet, bei denen eine Infektion mit dem Virusstamm HIV-1Bru eine Induktion der Gene LEREPO4, GLiPR und Moesin sowie eine Repression von SCC-112 bewirkte. Die RNA-Interferenz vermittelte Suppression dieser Gene erfolgte durch Applikation von synthetischen siRNA Oligonukleotiden oder durch intrazelluläre Expression von short hairpin RNAs (shRNA). Durch den Einsatz von shRNAs konnte jedoch unter den vorliegenden Versuchsbedingungen nur eine unzureichende Gensuppression erreicht werden. Aus diesem Grund wurden synthetische siRNA Oligonukleotide verwendet. Es konnte eine deutliche Reduktion der jeweiligen Zielgene bewirkt werden, ohne dass nennenswerte Effekte auf den Phänotyp und die Viabilität der Zellen beobachtet wurden. Der Einfluss der siRNA-vermittelten Gensuppression auf die HIV-Replikation wurde durch Infektion der Zellen ermittelt. Hierbei zeigte sich, dass die Depletion von GLiPR und LEREPO4 eine deutliche Inhibition der HIV-Replikation bewirkte. Das Ausmaß der Inhibition war ähnlich ausgeprägt, wie durch Verwendung einer bereits publizierten, gegen das virale Gen p24 gerichteten siRNA. Die Depletion von SCC-112 hatte im Gegensatz hierzu keine eindeutige Wirkung auf die HIV-Replikation, so dass nicht ausgeschlossen werden kann, dass seine Repression während einer HIV-Infektion ein unspezifischer bzw. sekundärer Effekt ist. Die siRNA-vermittelte Suppression von Moesin führte zu einem unerwarteten Ergebnis, da eine deutliche Steigerung der HIV-Replikation im Vergleich zur Kontrolle festgestellt wurde. Damit konnte erstmals belegt werden, dass Moesin nicht für die HIV-Replikation benötigt wird, wie es durch andere Arbeiten postuliert wurde. Diese Annahme begründete sich auf der Beobachtung, dass Moesin in Viruspartikel inkorporiert wird. Daher wurde eine Beteiligung an der Zusammenlagerung oder Abschnürung viraler Partikel vermutet. Die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse lassen vermuten, dass LEREPO4 und GLiPR notwendige Faktoren der HIV-Replikation sind, wohingegen Moesin einen negativen Effekt zu vermitteln scheint. Die zugrunde liegenden Mechanismen dieser Wirkung auf die HIVReplikation sind jedoch weitgehend unklar. Da die Proteine LEREPO4, SCC-112 und GLiPR nicht oder nur unzureichend charakterisiert sind, war ein weiteres Ziel dieser Arbeit zelluläre Funktionen dieser Proteine zu ermitteln, um Rückschlüsse auf ihre Funktion bei der HIV-Replikation zu gewinnen. Es konnten polyklonale Antikörper gegen LEREPO4 generiert werden, mit denen eine Bestimmung der zellulären Lokalisation möglich war. Mittels Co-Immunopräzipitation wurde die Interaktion von LEREPO4 und TRAF-2 nachgewiesen. Die Bestimmung des Einflusses von LEREPO4 auf die NF-κB-Aktivierung lässt vermuten, dass LEREPO4 an der TRAF-vermittelten Signaltransduktion beteiligt ist. Untersuchungen zur Funktion von GLiPR zeigten, dass es sich möglicherweise um ein sekretorisches Protein handeln könnte, wie durch den fluoreszenzmikroskopischen Nachweis eines GLiPR-EGFP-Fusionsproteins in HeLa-Zellen ermittelt wurde. Weiterhin konnte mittels Annexin-V-Färbung und TUNEL-Assay belegt werden, dass eine exogene Expression des GLiPRs in HeLa Zellen zu einem deutlichen Anstieg der Apoptoserate führte. Zusätzlich wurden für jedes Protein Genexpressionsprofile nach siRNA vermittelter Repression mittels Microarray-Analyse erstellt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass LEREPO4 und GLiPR mögliche Kofaktoren der HIV-Replikation darstellen. Im Gegensatz hierzu scheint Moesin einen negativen Effekt zu vermitteln. Auf Grundlage der in dieser Arbeit ermittelten Daten können weiterführende Untersuchungen durchgeführt werden, um die genaue Funktion der oben genannten Proteine bei der HIV-Replikation zu klären.
Lichtsensitive Proteine bzw. Photorezeptoren eignen sich hervorragend für das Studium des Zusammenhangs von Proteinstruktur und –funktion. Lichtrezeptorproteine werden leicht durch Licht angeregt, wodurch eine gute Zeitauflösung für deren Untersuchung erreicht werden kann. Weiterhin sind sie als Signalproteine während der Etablierung des aktiven Zustandes und dessen Zerfalls großen konformationellen und strukturellen Änderungen unterworfen. Ausgehend von diesen Eigenschaften wurde bereits eine große Zahl von Lichtrezeptorproteinen genauer untersucht. Diese vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit lichtinduzierten konformationellen Änderungen in Membranproteinen. Dafür wurden drei verschiedene Systeme herangezogen: das kleine α-helikale Peptid Gramicidin A, der G-Protein gekoppelte Rezeptor Rhodopsin and die BLUF (blue light using FAD) Domäne des hypthetischen Membranproteins Blrp (blue-light regulated phosphodiesterase) aus E. coli. Gramicidin A (gA) ist ein aus dem Bodenbakterium B. brevis isoliertes Antibiotikum, das Transportkanäle für einwertige Kationen wie Lithium, Natrium und Kalium ausbildet. Gelöst in Detergenzmizellen, wurde für gA unerwartet eine Wechselwirkung mit Blaulicht fest gestellt (Abbildung 1). Diese Beobachtung wurde mit statischen und zeitaufgelösten NMRspektroskopischen Methoden genauer untersucht und ist in Kapitel 2 näher beschrieben. Basierend auf den gewonnenen Erkenntnissen wird postuliert, dass einer der Tryptophanreste (Trp9) eine lichtinduzierte konformationelle Änderung erfährt. Ausgehend von der Konformation in Lösung befindet sich die Seitenkette von Trp9 in einem Gleichgewicht (70:30) mit einer zweiten Konformation. Bei der zweiten Konformation handelt es sich möglicherweise um die Orientierung, die der Tryptophanrest unter Festkörper-NMR Bedingungen einnimmt. Die Lebensdauer der neuen Konformation beträgt in etwa eine Sekunde. Der G-Protein gekoppelte Rezeptor Rhodopsin ist verantwortlich für die Verarbeitung von Lichtsignalen in den Stäbchenzellen der Retina. Die Absorption eines einzelnen Photons führt zur Isomerisierung des kovalent gebundenen Chromophors 11-cis-Retinal, wodurch konformationelle Änderungen im Protein veranlasst werden. Der aktivierte Metarhodopsin II (MetaII) Zustand induziert eine Enzymkaskade und schließlich einen Nervenimpuls, das Säugern das Kontrastsehen ermöglicht. Eine große Bandbreite an hochauflösenden NMRspektroskopischen Methoden, (einschließlich zeitaufgelöster und Festkörper-NMR Methoden) wurde im Laufe dieser Arbeit angewandt, um Konformation und Dynamik von bovinem Rhodopsin näher zu untersuchen. In Kapitel 3.1 sind zu Beginn mehrere Optimierungsschritte im Hinblick auf ein kostengünstiges, isotopenmarkiertes Säugerzellenmedium beschrieben. In diesem Zusammenhang wurden mehrere Rhodopsin NMR-Proben hergestellt, wobei der Gehalt an isotopenmarkierten Aminosäuren ca. 50% betrug. Anhand dieser Proben konnte bewiesen werden dass sich mit Lösungs-NMR-Spektroskopie auch sehr große, in Detergenzmizellen stabilisierte Membranproteine (~150 kD Gesamtmasse) detailliert studieren lassen. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf den C-Terminus, für den nach sequentieller Zuordnung (Abbildung 2a) und heteronuklearern Relaxationsmessungen ein Mobilitätsverhalten bestimmt wurde, das dem mittelgroßer Proteine ähnelt. Des Weiteren konnten keinerlei definierte Strukturelemente innerhalb des C-Terminus identifiziert werden, u.a. durch einen Vergleich mit eines 19mer Peptids, dessen Primärsequenz des Rhodopsin C-Terminus entspricht (Abbildung 2a und 2b). In Kapitel 3.2 wird die nichtinvasive Zuordnung der Rückgratresonanzen aller fünf Trytophane mit Hilfe einer Kombination aus Lösungs- und Festkörper-NMR beschrieben. Dazu wurden verschiedene Rhodopsinproben hergestellt, die alle möglichen 13C’i-1-Carbonyl/15Ni-Tryptophan isotopenmarkierten Amidpaare enthielten. Eine Teilzuordnung der Tryptophanindolsignale konnte in Lösung durch Protonen-/Deuteriumaustausch und heteronukleare Relaxationsmessungen erreicht werden. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Kombination aus Lösungs- und Festkörper-NMR-Spektroskopie sehr gut geeignet ist um komplementäre Informationen zu strukturellen und dynamischen Eigenschaften von Rhodopsin zu liefern. Fehlende Zuordnungen in den Lösungspektren konnten durch den Verglich mit Festkörperspektren ergänzt werden und umgekehrt (Abbildung 3). In Kapitel 3.3 ist die erfolgreiche Adaption der zeitaufgelösten NMR-Spektroskopie für die Untersuchung des Rhodopsin MetaII Zerfalls in vitro beschrieben. Die zeitaufgelösten protonendetektieren NMR-Experimente wurden mit unmarkiertem, in Detergenzmizellen stabilisiertem Protein bei verschiedenen Temperaturen aufgenommen, wobei sich die anschließende Auswertung auf die stark tieffeldverschobene Indolregion konzentrierte (Abbildung 4). Für die berücksichtigten Signale traten nach Induktion des aktivierten Zustandes deutliche chemische Verschiebungsänderungen auf, außerdem zeigten sie unterschiedlich schnellen MetaII Zerfall. Zusätzlich zu der erwarteten Zeitkonstante des MetaII Zerfalls (~6 min bei 298 K) konnte erstmalig eine zweite, ca. zehnmal langsamere Zeitkonstante bestimmt werden. Diese zweite Zeitkonstante ist möglicherweise ein Ausdruck für die langsame Entfaltung von Sekundärstrukturelementen nach dem Zerfall des Proteins in Opsin und Retinal. Die BLUF-Domänen verwenden Flavinadeninnukleotid (FAD) als Chromophor und gehören zu der Familie der Blaulichtrezeptoren. In Kapitel 4 wird die Untersuchung des lichtadaptierten Zustandes der E. coli BLUF Domäne auf Protein- und Ligandenebene mit zeitaufgelösten proton- und phosphordetektierten NMR-Experimenten beschrieben. In Abbildung 5 sind die statischen Licht- und Dunkelspektren (jeweils licht- und dunkeladaptiert) dargestellt. Im Folgenden konnte durch Beobachtung der Dunkeladaption bei verschiedenen Temperaturen die Aktivierungsenergie des Lichtzustandes bestimmt werden. Des Weiteren wurden zum ersten Mal phosphordetektierte NMR-Experimente erfolgreich angewandt, um einen biologisch relevanten Vorgang zeitabhängig näher zu bestimmen.
Im Zentrum dieser Arbeit stand die Umsetzung der Thematik Arzneimittel für den Chemieunterricht an allgemein bildenden Schulen. Ein Hauptziel war es, die wichtigsten Bereiche des Themenkomplexes Arzneimittel für den Chemieunterricht zu strukturieren und für einen problemorientierten sowie alltags- und lebensweltbezogenen Experimentalunterricht zu erschließen. Dabei sollten Versuche entwickelt werden, die einerseits grundlegende Aspekte des Themas Arzneimittel exemplarisch behandeln und mit deren Hilfe sich andererseits fachliche Inhalte der Schulchemie anwendungsorientiert erarbeiten lassen. Dazu wurden geeignete Modellversuche entwickelt und die oft sehr komplexen fachlichen Inhalte entsprechend didaktisch reduziert. ...
Ziel der vorliegenden Retrospektivbefragung ist die disziplinspezifische Analyse von Verletzungsarten und -häufigkeiten bei Leistungs- und Breitensportlern im Mountainbikesport. Methodik: In einer retrospektiven Erhebung wurden in zwei aufeinander folgenden Jahren aktive Mountainbikesportler mittels standardisierter Fragebogeninstrumente interviewt. Die Verwendung des Begriffs Verletzung bzw. Sportverletzung war definiert als eine während der Sportausübung im Wettkampf oder Training aufgetretene Körperschädigung durch kurzfristige äußere Gewalteinwirkung oder akute Überlastung des Bewegungsapparates mit daraus resultierendem Fahrausfall. Die Auswertung der Verletzungsraten erfolgte unter Berücksichtigung der Faktoren Professionalisierungsgrad (Breitensport vs. Welt-Cup) und Wettkampfdisziplin (Abfahrtsdisziplinen vs. Cross-Country) in Bezug auf die Expositionszeit. Ergebnisse: Bei einer Gesamtrücklaufquote von 75 % ergibt sich eine Datenbasis von 107 Welt-Cup- (39♀; 67♂, 23.1J.) und 134 Breitensportlern (17♀; 117♂, 27.4J.). Vom Erleiden mindestens einer „schweren“ Verletzung berichten 78.5% der Weltcup-Fahrer und die Hälfte aller Breitensportler. Welt-Cup-Abfahrer (1.08/1000h) charakterisiert im Vergleich zu Cross- Country Athleten (0.39/1000h) eine relativ betrachtet mehr als doppelte Verletzungsrate. Welt-Cup-Abfahrer berichten 5.5 Verletzungen/verletztem Fahrer, Cross-Country-Fahrer 4.1. Verletzungen der unteren (47 vs. 35%) und oberen Extremität (40 vs. 41%) zeigen für Leistungs- und Breitensportler vergleichbare Prävalenzraten. Bei Breitensportlern dominieren offene Wunden gefolgt von Prellungen und Frakturen, bei Leistungssportlern eine signifikant (p<0.01) höhere Frakturrate. Zudem exponieren unter den Welt-Cup Athleten die Angaben von Schädel-Hirn-Traumata (n=40). Schlussfolgerung: Mountainbikesportler weisen im Vergleich mit Sportlern anderer Sportarten eine durchschnittliche Verletzungsgefährdung auf. Wenngleich eine Welt-Cup-Teilnahme per se keine wesentliche Erhöhung des Verletzungsrisikos darstellt, zeigt sich eine höhere Gefährdung für die Abfahrtsdisziplin. Das disziplinbezogenen Gefahrenpotenzial einer schnellen Bergabfahrt mit Kurven und Sprüngen führt trotz fahrerischer Qualität und obligatorischem Tragen von vollständiger Schutzausrüstung bei den Abfahrtsdisziplinen zu einer hohen Zahl erlittener knöcherner Verletzungen und Schädel-Hirn-Traumata.
Der Mangel von Faktor VIII (FVIII) führt zur häufigsten Gerinnungsstörung, der Hämophilie A. Die rekombinante Expression von FVIII für gentherapeutische Ansätze oder zur Herstellung von FVIII ist zwei bis drei Größenordnungen niedriger verglichen mit anderen Proteinen vergleichbarer Größe. Die Ursachen für die geringe Expression liegen zum großen Teil an der ineffizienten Transkription und dem ineffizientem intrazellulären Transport. (1) Im Rahmen der Untersuchung der FVIII-Sekretion, konnte durch Verwendung von FVIII-GFP Fusionsproteinen zum ersten Mal gezeigt werden, wie FVIII in lebenden Zellen transportiert wird. Außerdem wurde anhand von vergleichenden Immunfluoreszensfärbungen, FVIII-Messungen und Westernblotanalysen demonstriert, dass weder bei der B-Domäne deletierten noch bei der Volllängenvariante signifikante Unterschiede zwischen den GFP-fusionierten und Wildtyp-FVIII-Varianten messbar waren. Offensichtlich wird die Funktionalität von FVIII durch die C-terminal fusionierte GFP-Domäne nicht eingeschränkt. In ersten Lebendzellanalysen konnte gezeigt werden, dass sich FVIII in primären Zellen und Zelllinien hauptsächlich im ER befindet und eine für lumenale ER-Proteine charakteristischen Mobilität aufweist. Beim frühen sekretorischen Transport zeigte sich bei Temperaturblock-Experimenten eine verlängerte Dauer der Akkumulation in ER-Exit-Sites und eine vergleichsweise niedrige Frequenz von ER-Golgi-Bewegungen. Es konnte zum ersten Mal der Nachweis von FVIII-Transport durch vesikuläre tubuläre Cluster erbracht werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der möglicherweise durch Faltungsprobleme blockierte Austritt aus dem ER das Hauptproblem des ineffizienten FVIII-Transports zu sein scheint und weniger der intrazelluläre Transport an sich. Mittels siRNA-Silencing wurde außerdem die überwiegende Beteiligung von COPI am intrazellulären Transport von FVIII deutlich, dessen Herunterregulierung zu einer 78 prozentigen Reduktion der FVIII-Sekretion im Gegensatz zu 32 Prozent bei COPII führte. Dagegen konnte durch Herunterregulierung der Expression der p24-Cargo-Rezeptor Familienmitglieder p24 und p26 und der Clathrin Adapterproteine µ- und -Adaptin bzw. durch physiologischen Knock-out im Falle von ER-Exit-Rezeptor MCFD2 kein Einfluß auf die FVIII-Sekretion festgestellt werden. (2) Als Alternative zu dem ineffizienten FVIII-Expressionsystem in unphysiologischen Zelllinien, bieten primäre Endothelzellen den Vorteil einer hocheffizienten FVIII-Sekretion. Zur Verwendung bei der rekombinanten Produktion benötigt man allerdings eine kontinuierlich wachsende gut charakterisierte Zelllinie. Zur Immortalisierung wurden aus Nabelschnurblut gewonnene Endothelprogenitorzellen mit der aktiven Untereinheit der humanen Telomerase (hTERT) transduziert. Trotz erfolgreicher Transduktion und langfristiger Expression von hTERT, welche im TRAP-Assay normale Aktivität zeigte, gingen die Zellen nach der natürlichen Teilungsspanne in die Seneszenz über. Möglicherweise wird noch ein weiteres Immortalisierungsgen benötigt oder hTERT ist durch die ektopischen Expression in diesen Endothelzellen nicht funktionell. (3) Der Einsatz hämatopoetischer Stammzellen für gentherapeutische Ansätze zur Expression von humanen FVIII ist bislang aufgrund niedriger Expressionseffizienz der Vektoren limitiert. Es wurden daher die Kombinationen verschiedener transkriptioneller und posttranskriptioneller Elemente in FVIII-Expressionsvektoren ausgetestet. Hierbei zeigte sich, dass die Verwendung einer 5’ untranslatierten Region (5’UTR) des hämatopoetisch exprimierten FXIIIA-Gens die FVIII-Sekretion in verschiedenen Zelllinien und primären Zellen deutlich steigerte. Am stärksten war die Wirkung in primären Monozyten, in denen die FVIII-Expression den 6fachen Wert im Vergleich zum Ursprungsvektor ohne 5’UTR erreichte. Leberzellen stellen weitere attraktive Zielzellen für gentherapeutische Ansätze dar, da Sie den primären physiologischen Ort der FVIII-Synthese darstellen. Die häufig für Gentherapievektoren verwendeten ubiquitär exprimierenden viralen Promotoren bewirken zwar hohe Expression in den transduzierten Zellen, haben allerdings den Nachteil durch ektopische Expression vermehrt Immunantworten auszulösen und durch starke Interaktion mit benachbarten Promotoren der Integrationsstelle im Genom möglicherweise tumorgene Effekte zu verursachen. Bei der Untersuchung verschiedener physiologischer Promotoren im Vergleich zum viralen CMV Promotor in Leberzellen konnte mit dem zum ersten mal getesteten minimalen FVIII-Promoter in einem lentiviralen Vektor der dritten Generation in Leberzelllinien eine vergleichsweise hohe Expression von 0,5 IU/ml FVIII /106 Zellen erzielt werden. Der FVIII-Promoter ist daher geeignet für eine lebergerichtete Expression und minimiert dabei das potentielle Risiko der häufig verwendeten ubiquitären viralen Promotoren.
Die ribosomal synthetisierten und posttranslational modifizierten antimikrobiellen Peptide Subtilin aus B. subtilis und Nisin A aus L. lactis gehören zur Klasse der lanthioninhaltigen Bakteriocine, die als Lantibiotika bezeichnet werden. Die Regulation der Biosynthese beider Lantibiotika unterliegt der dichteabhängigen Genregulation, die auch als Quorum Sensing bezeichnet wird. Dabei wirken die Peptide als Pheromon autoinduzierend auf die eigene Biosynthese durch Signaltransduktion über die Zwei-Komponenten-Regulationssysteme SpaRK bzw. NisRK. Durch die Konstruktion und Anwendung zweier spezifischer Reportersysteme, die auf der transkriptionellen Induktion einer chromosomal integrierten PspaS-lacZ bzw. PnisA-gusA-Fusion beruhen, wurde die autoinduzierende Fähigkeit der Peptide sowohl qualitativ durch chromogene Analysen auf Agarplatten als auch quantitativ in Mikrotiterplatten spezifisch nachgewiesen. Beide Reportersysteme wurden zur Analyse von Struktur-Funktionsbeziehungen in Bezug zur autoinduzierenden Wirkung der Peptide verwendet. Dabei wurden neben dem Subtilinproduzenten B. subtilis ATCC 6633 acht weitere Subtilin-produzierende Bacillus-Stämme identifiziert. Durch die Konstruktion eines Expressionssystems zur Produktion von durch ortsgerichteter in vitro Mutagenese erstellten Subtilinvarianten bzw. Subtilin/Nisin AHybriden wurden mehr als 80 verschiedene Peptide durch rationales Design generiert. Deren Biosynthese wurde durch MALDI-TOF MS spezifisch nachgewiesen und hinsichtlich ihrer Wirkung als induzierende Peptide über beide Reportersysteme untersucht. Durch Überexpression des Responsregulators SpaR wurde eine Induktion der Promotorfusion unabhängig von der Autoinduktion durch die jeweiligen Peptide gezeigt. Dies ermöglicht die Produktion und Charakterisierung von induktionsdefizienten Varianten. Durch die Analysen der generierten Peptide wurde eine Beteiligung des N-terminalen Bereichs von Subtilin an der Sensierung durch die Histidinkinase SpaK identifiziert. Die in vivo Produktion von verkürzten Subtilinvarianten und proteolytische Analysen von Subtilin und Nisin A zur Generierung von N-terminalen Fragmenten der Peptide bestätigte die essentielle Rolle des Nterminalen Bereichs der Lantibiotika in Bezug zur Autoinduktion. Für beide Peptide und deren jeweilige N-terminalen Fragmente, bestehend aus den ersten zwanzig Aminosäuren, wurde keine Kreuzinduktion in den Reportersystemen zur Bestimmung der Autoinduktion festgestellt. Bei simultaner Applikation des nativen Induktors mit dem korrespondierenden Peptid bzw. den jeweiligen N-terminalen Fragmenten wurde eine signifikante Reduktion der vermittelten Enzymaktivität detektiert. Dieser Effekt wurde aufgrund der Inhibition der Signaltransduktion als Quorum Quenching bezeichnet und erstmalig für lantibiotische Peptide beschrieben. Da diese Reduktion durch die gleichzeitige Zugabe von Lipid II-bindenden Substanzen, wie Vancomycin und Bacitracin, nachgewiesen wurde, konnte erstmals eine Beteiligung von Lipid II an der Signalkaskade verdeutlicht werden. Lantibiotika wirken aufgrund hochaffiner Bindung an Lipid II und anschließender Porenbildung in der cytoplasmatischen Membran überwiegend antimikrobiell gegen Gram-positive Organismen. Da die Bindung an Lipid II über ein konserviertes Bindemotiv im Nterminalen Bereich der Peptide erfolgt, wird die Beteiligung von Lipid II an der Sensierung des externen Stimulus durch die Histidinkinase LanK unterstützt.
Die Ausgangsfrage lautete: Warum konnte sich die berufliche Pflege trotz einer Stärkung und Aufwertung, die in der Akademisierung und beginnenden Verwissenschaftlichung, aber auch in einer die Pflege stärkenden Gesetzgebung zum Ausdruck kamen, noch immer nicht als eigenständiger Beruf oder gar als Profession etablieren? Bei der Beantwortung dieser Frage bin ich von der Annahme ausgegangen, dass Gründe für den Misserfolg auch im Diskurs zur Etablierung der Pflege an den Hochschulen zu suchen waren, der doch versuchte, die Grundlagen für die Emanzipation zu schaffen. In der Feinanalyse einer Reihe von charakteristischen Beiträgen im Diskurs habe ich gezeigt, wie sich bestimmte Strategien der Anpassung aneinander und auch an andere übergeordnete Diskurse durchgesetzt haben. Diese Orientierung beinhaltete neben einer Distanzierung von den Interessen der Mehrheit der Berufsangehörigen auch die immer deutlichere Tendenz, den Professionsstatus nicht mehr für alle einzufordern, sondern unterschiedliche Professionalisierungen für die verschiedenen Berufsgruppen zu legitimieren. Damit wurde der Forderung nach einer Autonomie des Berufs, also der Selbstbestimmung der beruflichen Aus- und Weiterbildung, der Unabhängigkeit pflegerischer Interventionen von der ärztlichen Weisung, der Zusammenfassung aller Berufsangehörigen in einer die beruflichen Interessen vertretenden Organisation, jegliche Grundlage entzogen. Somit erklärt sich auch, warum das Professionalisierungsprojekt, das mit Hilfe von Akademisierung und Verwissenschaftlichung vorangetrieben werden sollte, bis heute nur wenig Resonanz bei den beruflich Pflegenden findet – eine Resonanz und Unterstützung, derer sich die DiskursteilnehmerInnen zu Beginn ihrer Debatte noch vergewissern wollten, die sie dann aber aus den Augen verloren haben, obwohl sie für die Realisierung der Forderungen notwendig gewesen wäre. ...
Die vorliegende Arbeit untersuchte die CIN- Inzidenz und die HPV- Prävalenz bei Frauen mit einer HIV- Infektion, die aus dem Patientinnenkollektiv der Universitäts-frauenklinik Frankfurt am Main, rekrutiert wurden. Die Daten von 305 Frauen wurden in die Studie eingebracht. Dieses Kollektiv wur-de einer HIV- negativen Kontrollgruppe gegenübergestellt. Die wichtigsten Ergebnisse der Untersuchung waren: - die CIN- Inzidenz in dem HIV-positiven Kollektiv lag bei 27% (n=83 von 305) - die CIN- Inzidenz in der HIV- negativen Kontrollgruppe lag bei 31% (n=14 von 45) - HIV- positive Frauen mit CIN 1-3 hatten eine signifikant höhere HPV- Prävalenz (78%) als HIV- positive Frauen mit CIN 0 (27%) - die CIN- Inzidenz bei HIV- und HPV- positiven Frauen war mit 52 % (n=65 von 126) signifikant höher als die CIN- Inzidenz bei HIV- positi-ven aber HPV- negativen Frauen, die bei 10% (n=18 von179) lag - die CIN- Inzidenz bei HIV- negativen und HPV- positiven Frauen mit 88% (n=14 von 18) signifikant erhöht war, während HIV- und HPV- negative Frauen eine CIN- Inzidenz von 0 % hatten (n=0 von 29) - die CIN- Inzidenz bei HIV- und HPV- positiven Frauen unabhängig von der CD4 Zellzahl war - die CIN- Inzidenz bei HIV- positiven und HPV- negativen Frauen ab-hängig von der CD4 Zellzahl ist und bei Zellzahlen unter 200/ul signifkant erhöht ist (39% versus 7%, p< 0,01) - eine antiretrovirale Therapie beeinflusst die CIN- Inzidenz anscheinend nicht - der Infektionsweg der betroffenen Frauen (Drogenabusus, heterose-xuelle Kontakte, Abstammung aus Hochprävalenzländern) keinen signifikanten Unterschied bezüglich der CIN- Inzidenz ausmacht - Frauen mit Nikotinkonsum in der Anamnese haben eine signifikant erhöhte CIN- Inzidenz (38%,n=63 von 163) als Frauen ohne Nikotin-konsum (14%, n=20 von 143) Insgesamt reihen sich die Untersuchungergebnisse in die umfangreiche Datenlage der aktuellen Literatur weitgehend ein. Zudem ist das hier untersuchte Kollektiv zahlenmäßig, sicherlich eines der größten im deutschen und internationalen Ver-gleich. Schlussfolgern lässt sich eine erhöhtes CIN- Risiko bei HIV- positiven Frauen. Die hier erhobenen Daten erhärten einmal mehr, die Forderung eines intensivierten Screeningprogramms für die betroffenen Frauen.
The experiments presented in my thesis were performed to resolve the following major questions: i. Initial experiments are based on the systematic characterization of the C-terminal domains of all 21 HSFs of Arabidopsis with respect to their transactivation potential as well as intracellular localization. This led to the identification of a signature motif for class A HSFs, that consists of an AHA motif (essential for activator potential), and a C-treminal NES (nuclear export signal). With this signature motif, we could identify homologues sequences of more than 90 HSFs in various plant species. ii. Analysis of developmental expression profiles of HSFs using AtGenExpress microarray data led to the identification of the unique expression of HsfA9 during late seed developmental stages. This was the starting point for the investigation of the regulation of HsfA9 as well as its function during seed development. iii. The seed specific transcription factor ABI3 was identified to be responsible for the regulation of HsfA9 by using knock out mutant lines and ectopically expressing transgenic lines for ABI3 gene. Furthermore, the importance of a RY/Sph motif, as binding site for ABI3 on HsfA9 promoter has been analyzed with transient GUS reporter assays. In addition, contribution of component(s) of ABA (abscisic acid) signaling cascade as a functional interacting partner of ABI3 on HsfA9 promoter has been shown and discussed. iv. The essential role of HsfA9 as master regulator for the expression of seed specific members of of HSP encoding genes and GolS1 was shown by analyzing transgenic plants ectopically expressing HsfA9 as well as, by carrying out transient GUS reporter assays. Correlating with this, transgenic plants with ectopic expression of HsfA9 showed a thermotolerent phenotype. Furthermore, a model where HsfA9 plays a key function for the regulation of seed expressed genes which might involved in providing dessication tolerance during seed maturation has been proposed.
Das Prostatakarzinom ist die häufigste maligne Erkrankung des männlichen Patienten. Sie weist von allen Krebskrankheiten den extremsten Anstieg mit dem Lebensalter auf. In den letzten Jahren gab es einen kontinuierlichen Anstieg der Neuerkrankungen in Deutschland. Das Prostatakarzinom kann unter Umständen zu einer beträchtlichen Einschränkung der Lebensqualität führen und ist in fortgeschrittenen Stadien nicht mehr heilbar. Daher ist es das Ziel, durch Ausschöpfung aller frühdiagnostischen Maßnahmen, möglichst viele Patienten in einem früheren Stadium mit einem kleinen, auf die Prostata begrenzten Tumor zu entdecken und entsprechend auch zu therapieren. Die Behandlung als auch die Prognose des Patienten sind wesentlich durch das Stadium der Erkrankung bei Diagnosestellung bestimmt. Im organbegrenzten Tumorstadium ist das Prostatakarzinom heilbar [11-13]. Ein auf die Prostata beschränktes Karzinom wird üblicherweise durch eine radikale Entfernung von Prostata, Samenblasen und Lymphknoten mit kurativer Zielsetzung behandelt [14]. Bei organbegrenztem Tumor beträgt das progressionsfreie 10-Jahres Überleben ungefähr 75 Prozent [15]. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin durch Untersuchung der klinischen Ergebnisse und der prä- und postoperativen Daten einen Zusammenhang zwischen Komplikationen, Rezidivrate und Kontinenz zu erkennen. In der vorliegenden Studie sind 204 Patienten, bei denen in der Zeit vom 01.03.2001 bis 31.12.2003 eine radikale Prostatektomie durchgeführt wurde, retrospektiv untersucht worden. Im August 2006 wurden die niedergelassenen weiterbehandelnden Urologen angeschrieben und der aktuelle PSA-Wert sowie die Kontinenz erfragt. Die Analyse der erfassten Daten zeigt, dass verschiedene präoperative und pathologische Parameter einen deutlichen Zusammenhang zu den postoperativen Ergebnissen aufweisen. Es konnte gezeigt werden, dass Patienten, die präoperativ einen hohen PSA-Wert (> 10 ng/ml) hatten, auch postoperativ einen PSA-Wert > 0,2 ng/ml hatten. 25 Patienten haben ein PSA-Rezidiv in der Zeit bis August 2006 bekommen. 12 der 25 Patienten, die ein PSA-Rezidiv bekommen haben, hatten präoperativ ein PSAWert > 10 ng/ml. Auch konnte gezeigt werden, dass eine Dauer < 40 Tage zwischen Diagnose und Operation sich positiv auf ein rezidivfreies Überleben auswirkt. 3 Patienten, die ein Gleason-Grading < 7 bei der Operation hatten, haben aktuell einen PSA-Wert > 0,1 ng/ml. 12 Patienten, die ein Gleason-Grading > 7 bei der Operation hatten, haben aktuell einen PSA-Wert > 0,1 ng/ml. Auch kam es bei einer Dauer > 40 Tage zwischen Diagnose und Operation seltener zu einem zutreffenden Grading oder Overgrading aber häufiger zu einem Undergrading. Sowohl der PSA-Verlauf als auch der Gleason-Score sind entscheidende Faktoren für die Prognose des Patienten. Die Zeit zwischen positivem Stanzbefund und Operation sollte nicht unnötig lange sein.
Im Rahmen unserer Arbeit haben wir die diagnostische Aussagekraft von dem Nukleären Matrix-Protein 22 (NMP22) bei Urothelkarzinomen anhand des Standard-Laborverfahrens „Two-Side-ELISA“ ( Enzym-Immunoassay) überprüft. Unsere Studie umfasste 107 Patienten, diese Anzahl erwies sich als ausreichend, um signifikante Ergebnisse über die Eignung des Tests zu erhalten. Unser repräsentatives Patientengut aus der Urologischen Klinik – mit dem Symptom Makrohämaturie – setzte sich aus benignen und malignen Harnwegserkrankungen, darunter 54 Harnblasenkarzinome, 8 Nierenbeckenkarzinome, 2 Ureterkarzinome und 43 benigne Harnwegserkrankungen (z.B. Zystitis, Urethritis, Pyelonephritis, Blasenhalssklerose, Harnleiter- und Blasenpapillome) zusammen. Patienten mit unterschiedlichen Stadien des Urothelkarzinoms G1, G2 und G3 wurden gezielt in unsere Studie aufgenommen. Die Tumorstadienklassifizierung erfolgte mit Hilfe der histologischen Untersuchungen nach der TNM-Klassifikation. Unsere gewonnenen histologischen Ergebnisse wurden mit den NMP22-Werten korreliert. Für die Ermittlung der NMP22-Levels bei den 107 gesammelten Urinproben wurde ein kommerzieller Kit verwendet (MATRITECH, WallacADL-GmbH, Freiburg, Deutschland). Die Aussagekraft des NMP22-Tests konnte anhand eigener Untersuchungen und durch Vergleich mit Untersuchungen in der Fachliteratur- anhand bestehender Vergleichskriterienbeurteilt werden. Die Auswertung erfolgte gemäß den in der Fachliteratur etablierten Kenngrößen Sensitivität und Spezifität. Die Sensitivität und Spezifität des NMP22-Tests in unserer Studie wurden bei einem von uns bestimmten Cut-off-Wert von 7,5 U/ml, der mit dem Cut-off-Wert vom NMP22-Kit Hersteller übereinstimmt, errechnet. Es zeigte sich eine Sensitivitätsabhängigkeit vom Grading. Der Bereich der Sensitivität bei dem Tumormarker NMP22 reichte von 38%-77%. Die Spezifität schwankte zwischen 66% und 80%. Die Spezifität bei den Patienten, die unter Harnwegsinfektionen litten betrug 42.9%. Die allgemeine Sensitivität des NMP22-Tests betrug bei den Blasentumoren 55.6 %. Die Sensitivität für die oberflächlichen Blasenkarzinome (Ta, T1) war 36%. Invasive Blasentumore wurden in 80% der Fälle entdeckt. Abhängig von dem Grading der Blasentumore fanden wir folgende Sensitivitäten des NMP22-Tests : G1 38%, G2 52% und G3 77%. Die Spezifität war 66.9%. Zusammenfassend können wir sagen, dass wir in Übereinstimmung mit allen uns bekannten Studien eine sehr hohe Sensitivität für den NMP22-Test bei Patienten mit invasivem Blasenkrebs finden. Im Grading 1 befinden sich allerdings in unserer Studie die meisten Werte im Normbereich. Aus diesem Grunde haben wir bei Urothelkarzinomen bei Grading 1 eine totale Einschränkung der Aussage des NMP22-Immunoassays und deshalb ist es für das Grading 1 nicht geeignet. NMP22 ist erst für die Früherkennung der Grading 2 und 3 der Blasenkrebse geeignet. Gutartige urologische Erkrankungen, wie die Zystitis oder andere Harnwegsinfektionen, führten zu falsch-positiven Ergebnissen. Unsere Schlussfolgerung ist, dass der NMP22-Test erst ab fortgeschrittenen Stadien, d.h. ab Grading 2 und Grading 3 echte positive Ergebnisse liefert und somit eine diagnostische Aussage macht. Unsere Werte für Sensitivität und Spezifität decken sich weitgehend mit den Angaben aus der Literatur. Unsere Studie hat gezeigt, dass zum gegenwärtigen Zeitpunkt die routinemäßige Anwendung des Harnblasentumormarkers NMP22 für die Primärdiagnostik von Urothelkarzinomen nicht geeignet ist. Zusammenfassend kann derzeit der NMP22 Test somit nicht die Zystoskopie und die Zytologie als Standarddiagnostik für die Frühdetektion von Blasentumoren ersetzen. Wegen der hohen Rate an falschpositiven Resultaten durch entzündliche Reizzustände der Blase bzw. benigne Harnwegserkrankungen wie z.B. Harnwegsinfekte und Harnsteine und wegen der sehr arbeits- und zeitaufwendigen Durchführung können wir den NMP22-ELISA-Test nicht zur routinemäßigen Blasenkrebsfrüherkennung empfehlen. Als Voraussetzung zur richtigen Interpretation der erhaltenen NMP22-Messwerte sollten bestimmte Ausschlusskriterien beachtet werden, so dass andere Ursachen für erhöhte NMP22- Messwerte weitestgehend ausgeschlossen werden können. Unter diesen Bedingungen erachten wir die Einsatzmöglichkeiten für den NMP22-Test als immunologischen nicht-invasiven Test in Verbindung mit der Zystoskopie und der Zytologie bei der Früherkennung von Blasentumoren als sinnvoll. Der Einsatz des NMP22-Tests könnte beispielsweise bei bereits erfolgreich behandelten Blasenkrebs-Patienten als Maßnahme zur Beobachtung in Verbindung mit der Zystoskopie und Zytologie sinnvoll sein. Alle Untersuchungen gemeinsam ermöglichen eine umfassende Diagnostik und eine höhere Sicherheit, und sie sind somit bei der Detektion des Harnblasenkarzinoms aussagekräftiger. Für die Zukunft sind nicht nur weitere randomisierte, prospektive Studien bedeutsam, die über ein geeignetes heterogenes, klinisch relevantes Patientengut verfügen, sondern auch die Vereinfachung der NMP22-Test Durchführung, so dass die Akzeptanz des Testsystems in Klinik und Praxis erhöht werden kann.
Eine Einschränkung des Hörvermögens durch Schäden der Sinnesrezeptoren im Innenohr gilt beim Menschen sowie bei allen anderen Säugetieren als irreversibel. Die Hörforschung ist an der Frage interessiert, ob durch Plastizität in zentralen Teilen des auditorischen Systems Kompensationsmechanismen die Folgen mildern können. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Frage, ob und in welchem Umfang nach peripheren Hörschäden durch zentrale Kompensationsmechanismen eine Erholung des Hörvermögens auftritt auf der Basis von plastischen Änderungen der neuronalen Verarbeitung der Eingangssignale aus dem geschädigten Hörorgan. Schäden des Sinnesepithels im Innenohr, z.B. durch überlaute Beschallung oder ototoxische Substanzen, betreffen in der Regel zunächst die äußeren Haarzellen und führen zu einem Verlust der Empfindlichkeit und Frequenzspezifität des Hörvermögens. Eine primäre selektive Schädigung der inneren Haarzellen (IHZ) tritt im Tiermodell, aus unbekannten Gründen nur bei einer Spezies auf, dem Chinchilla (Chinchilla laniger) und zwar nach Gabe des antineoplastischen Medikament Carboplatin. Das gute Tieffrequenzhören der Chinchillas (0.1-20 kHz) ermöglicht außerdem Aussagen zur akustischen Signalverarbeitung in einem für das menschliche Gehör relevanten Frequenzbereich (0.02-16 kHz). Dieses Tiermodell bietet somit die Gelegenheit, die Veränderungen in zentralen Teilen des auditorischen Systems nach einer definierten sensorischen Schädigung zu untersuchen. Hierfür kommt u.a. das auditorische Mittelhirn, der Colliculus Inferior (IC) in Frage. Der IC wird als Hauptintegrationszentrum der Hörbahn angesehen weil er Eingänge von fast allen vor ihm liegenden auditorischen Kernen (z.B. Nucleus cochlearis, Nucleus olivaris und Leminscus lateralis) bekommt. Ein weiterer Grund für die Wahl des IC als Untersuchungsgebiet der vorliegenden Arbeit ist, die Frage zu beantworten, ob die auf der Ebene des auditorischen Kortex bereits nachgewiesene funktionelle Plastizität auch auf der Ebene des IC schon realisiert oder vorbereitet wird. Die vorliegende Arbeit untersucht das Antwortverhalten der Neurone im ICc an wachen Tieren vor und nach einem selektiven Teilverlust der IHZ bei Erhalt der äußeren Haarzellen. Die Arbeitshypothese ist, dass es nach einem abgeschwächten sensorischen Eingang zu Veränderungen der exzitatorischen und inhibitorischen Antwortfelder kommt, die als funktionelle Plastizität bzw. als Kompensation verstanden werden können. Anhand elektrophysiologischer Ableitungen im ICc von wachen, chronisch implantierten Tieren wurden die exzitatorischen und die inhibitorischen Antwortfelder der Neurone durch Einton- und Zweiton- Stimulation getrennt gemessen und bestimmt. Die Resultate zeigen, dass die exzitatorischen und inhibitorischen Antworteigenschaften im IC bei wachen und narkotisierten Tieren unterschiedlich sind. In wachen Tieren weist die Inhibition generell höhere Variation auf als in narkotisierten Tieren und ist unabhängiger von der Art der Exzitation. Eine Carboplatinbehandlung führte bei allen Tieren nach 3-7 Tagen zu einer Abnahme der Amplituden und einer Erhöhung der Schwellen der akustisch evozierten Hirnstammpotentiale (ABRs). Die histologische Untersuchung des Innenohres (10 Wochen nach Carboplatinbehandlung), zeigte bei allen Tieren Verluste der IHZ (zwischen 20 und 60%) entlang der gesamten Basilarmembran. Es wurden aber keine Verluste von ÄHZ festgestellt. Die Gehirn-Schnitte zeigten, dass die Registrierungen aus dem zentralen Teil des Colliculus Inferior stammen. Die physiologische Untersuchung der Antworteigenschaften der Neurone im IC 4-6 Wochen nach der carboplatinbedingten Schädigung der IHZ zeigte eine Reduktion der Inhibition, die u.a. deutlich an dem Verlauf der Intensitätskennlinien zu beobachten war. Nach dem Teilverlust der IHZ wurden viel weniger nichtmonotone Kennlinien gefunden als vor der Innenohrschädigung. Darüber hinaus beobachteten wir eine Reduzierung der inhibitorischen Regionen und eine signifikante Ausweitung der exzitatorischen Antwortfelder nach dem Teilverlust der IHZ. Die Resultate der vorliegenden Arbeit führen zu der Schlussfolgerung, dass nach einer Teilschädigung der inneren Haarzellen, unter Erhalt der ÄHZ nur ein geringer Sensitivitätsverlust in der zentralen Hörbahn auftritt. Der Verlust von 20-60% der IHZ und der damit einhergehende reduzierte afferente Informationsfluss führt zu physiologischen Veränderungen in der Hörbahn, die im IC von wachen Tieren vor allem durch eine Reduktion der Inhibition hervortritt. Dies deutet daraufhin, dass zentrale Kompensationsmechanismen bei peripheren Hörschäden nicht, wie bisher vermutet, erst in kortikalen sondern zum Teil bereits in subkortikalen Arealen (im Mittelhirn) stattfinden.
Untersuchung der Interaktion zwischen NCoA-Koaktivator-Proteinen in der Transkriptionsregulation
(2007)
Die Mitglieder der NCoA-Koaktivator-Familie fungieren als Koaktivatoren für verschiedene Transkriptionsfaktoren, wie z.B. nukleäre Hormonrezeptoren und STAT-Proteine. NCoA-Proteine rekrutieren sekundäre Koaktivatoren, die durch die Modifikation des Chromatins die Transkriptionsaktivierung ermöglichen. Vorhergehende Studien postulierten die Dimerisierung von NCoA-Proteinen über die aminoterminalen bHLH/PAS-Domänen und die Rekrutierung von Paaren von NCoA-Proteinen, konnten jedoch eine direkte Interaktion nicht nachweisen. In unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass die PAS-B-Domäne von NCoA-1 ein LXXLL-Motiv in der Transaktivierungsdomäne von STAT6 binden kann. Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob eine Interaktion von Mitgliedern der NCoA-Proteinfamilie über die PAS-B-Domäne und eigene LXXLL-Motive vermittelt werden kann und welche physiologische Bedeutung die Interaktion von NCoA-Proteinen hat. Die Interaktion endogener NCoA-Proteine konnte in zwei verschiedenen Zelllinien nachgewiesen werden. Es konnte gezeigt werden, dass die PAS-B-Domänen aller drei NCoA-Familienmitglieder mit allen Volllängen-NCoA-Proteinen interagieren können und für eine solche Interaktion ausreichend sind. Dabei interagieren die PAS-B-Domänen spezifisch mit einer Region in der CBP-Interaktions-Domäne (CID/AD1) von NCoA-1, die zwei LXXLL-Motive und den vollständigen Bereich, der die Interaktion mit CBP vermittelt, enthält. Es zeigte sich, dass sich die Bindungsmotivspezifität der NCoA-1-PAS-B-Domäne von den Bindungsmotivspezifitäten der PAS-B-Domänen von NCoA-2 und NCoA-3 unterscheidet. Ebenso zeigten sich unterschiedliche Bindungsmotivspezifitäten für die Interaktion mit der CID/AD1 von NCoA-3, die nur mit der PAS-B-Domäne von NCoA-1 interagierte. Eine physiologische Bedeutung der charakterisierten PAS-B/CID/AD1-Interaktion auf die Bildung und Rekrutierung von Koaktivator-Komplexen wurde mittels Überexpressions-Experimenten untersucht, in denen dominant negative Effekte erwartet wurden. So führte die Überexpression der PAS-B-Domäne bzw. die Kompetition mit der CID/AD1 zur Inhibition der Interaktion von NCoA-1 mit dem Koaktivator CBP und dem Transkriptionsfaktor STAT6. Außerdem führte die stabile Überexpression der PAS-B-Domänen von NCoA-1 und NCoA-3 zu einer veränderten Expression des natürlichen endogenen Androgen-Rezeptor-Zielgenes PSA. Die in dieser Arbeit identifizierte Interaktion von NCoA-Proteinen stellt einen neuen und, zu den bisher bekannten Modellen der Koaktivator-Rekrutierung, ergänzenden Mechanismus dar. Dies gilt sowohl für eine postulierte inter- und intramolekulare Interaktion von NCoA-1 bei der STAT6-vermittelten Transkriptionsaktivierung, als auch für die durch nukleäre Hormonrezeptoren geforderte Rekrutierung von Paaren von NCoA-Proteinen. Zusammenfassend können die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse dabei helfen, das Verständnis der dynamischen Rekrutierung von Koaktivatoren bzw. Koaktivator-Komplexen und damit der Regulation der Genexpression, weiter zu verbessern.
Ziel dieser Arbeit war die Evaluation eines 13C-Atemtests zur Beurteilung der hepatischen mitochondrialen Beta-Oxidation, der z.B. in Diagnostik und Therapiekontrolle der NASH zum Einsatz kommen könnte. Octanoat ist eine mittelkettige Fettsäure (8C), die im Dünndarm schnell resorbiert wird und über den portalvenösen Kreislauf in die Leber gelangt. Bisher wird Octanoat vor allem zur Beurteilung der Magenentleerung fester Speisen eingesetzt. Für diesen Atemtest wird die Fettsäure in Verbindung mit einer standardisierten Testmahlzeit verabreicht. Wir führten den Atemtest in vereinfachter Form mit 100mg 13C-Natrium-Octanoat, gelöst in 200ml Wasser, durch. So wurde die Magenentleerungszeit vernachlässigbar kurz und die Beta-Oxidation des Octanoats zum geschwindigkeitsbestimmenden Schritt des Tests. Zunächst analysierten wir retrospektiv die cPDR von 69 Patienten, die den Magenentleerungsatemtest erhalten hatten. Die Analyse zeigte bei 27/69 Patienten (p = 0,055) mit verlängerter Magenentleerungshalbwertszeit sowie in der Gesamtgruppe aller 69 Patienten (p = 0,054) eine leicht erhöhte cPDR bei Frauen im Vergleich zu Männern. Dies gab uns erste Hinweise auf geschlechtsspezifische Unterschiede im Octanoatmetabolismus. Anschließend führten wir den vereinfachten Octanoatatemtest bei 39 erwachsenen Kontrollen (20m, 19w), 10 Kindern (5m, 5w), 26 NAFLD bzw. NASH-Patienten (15m, 11w) und 12 Leberzirrhosepatienten (8m, 4w) durch. Die Atemproben wurden mittels nichtdispersiver Infrarotspektrometrie hinsichtlich PDR und cPDR analysiert. Bei 40 von 77 Kontrollen/Patienten erfolgten zusätzliche eine BIA und eine indirekte Kalorimetrie. Es zeigten sich zu keinem Zeitpunkt signifikante Differenzen zwischen PDR bzw. cPDR der einzelnen Gruppen. Die PDR erreichte in allen Gruppen ihren Höhepunkt nach durchschnittlich 30 Minuten. Im Vergleich der geschlechtsspezifischen Subgruppen erreichten Frauen signifikant höhere cPDR-Werte nach 180 Minuten sowohl in der Kontrollgruppe (38,7 ± 2,8 vs. 29,2 ± 5,7%; p < 0,0001), in der Kindergruppe (32,5 ± 5,2 vs. 26,1 ± 2,2%; p = 0,008) als auch in der NAFLD/NASH-Gruppe (37,0 ± 6,0 vs. 32,1 ± 5,2%; p = 0,046). In der Leberzirrhosegruppe erzielten die Männer höhere cPDR-Werte als die Frauen (33,1 ± 9,7 vs. 38,2 ± 6,2%, p = 0,28) und damit die signifikant höchste cPDR aller Männer. Beim Vergleich der Ergebnisse von BIA und indirekter Kalorimetrie ergaben sich keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf Körperzusammensetzung und Ruheenergieumsatz der verschiedenen Gruppen. Der Höhepunkt der PDR nach durchschnittlich 30 Minuten in allen Gruppen zeigte, dass die Oxidation des Octanoats den geschwindigkeitsbestimmenden Faktor des Atemtests darstellt und er somit zuverlässig die mitochondriale Beta-Oxidation auf Gesamtkörperniveau misst. Die Analyse der cPDR bestätigte eine deutliche Geschlechtsspezifität im Octanoatmetabolismus. Der Nachweis einer höheren cPDR auch bei Mädchen vor der Gonadarche im Vergleich zu Jungen gleichen Alters deutet auf eine frühe Determinierung der geschlechtsspezifischen Unterschiede hin. Die Geschlechtsabhängigkeit des MCFA-Metabolismus sollte in Zukunft sowohl in Studien mit MCFA als auch bei deren pharmakologischer und diätetischer Anwendung Beachtung finden. Die gesteigerte Beta-Oxidation, die in der Pathogenese der NASH eine entscheidende Rolle spielt, nahm keinen Einfluss auf den Octanoatmetabolismus. Der bei männlichen Leberzirrhosepatienten gesteigerte Octanoatstoffwechsel wies daraufhin, dass das Octanoat über portosystemische Shunts schneller zu den Hauptorten seiner Metabolisierung gelangt. Die Resultate von fünf zusätzlich untersuchten TIPS-Patienten, die cPDR-Werte bis zu 51,3% erreichten, unterstützten diese Annahme. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass Octanoat nach oraler Applikation hauptsächlich extrahepatisch und kaum in der Leber oxidiert wird. Daher ist der Octanoatatemtest nicht zum Einsatz in der Leberfunktionsdiagnostik geeignet.
Die Alzheimer-Demenz (AD) ist gekennzeichnet durch extrazelluläre Ablagerungen bestehend aus dem Amyloidbeta-Peptid (Aß), durch neurofibrilläre Bündel bestehend aus dem Tau-Protein, massiven Neuronenverlust und synaptische Dysfunktion. Weiterhin ist bekannt, dass mitochondriale Dysfunktion eine entscheidende Rolle bei der AD spielt. Mit Hilfe von dissoziierten Hirnzellen von NMRI, Thy1-APP-, P301L Tau- und JNK-Knockout-Mäusen wurden Veränderungen, verursacht durch genetisch, alters- und geschlechtsbedingten Risikofaktoren, auf die mitochondriale Funktion untersucht. Die Abeta-Belastung der untersuchten Thy1-APP Mäuse führte zu einer mitochondrialen Fehlfunktion durch intrazelluläres Abeta und damit zu einem Energiedefizit. Aß hemmte die Atmungskette, vor allem die COX-Aktivität, indem es an die COX-Untereinheit bindet und damit die Anlagerung von Cytochrom C verhindert. Eine zusätzliche Mutation wie PS1M146L verursacht eine größere und früher einsetzende Abeta-Akkumulation im Gehirn der Mäuse und führte zu größerer mitochondrialer Schädigung im Vergleich zu den APP transgenen Mäusen. Der Grad der Abeta-Schädigung ist auch von dem Aggregationszustand von Abeta abhängig. Eine Akkumulation von intra- und extrazellulären Oligomeren reicht aus, um das mitochondriale Membranpotential zu erniedrigen. Die Aß-Belastung nimmt im Alter zu und es bilden sich ab dem 6. Monat Amyloid-Plaques im Gehirn der Thy1-APP Mäuse aus, die zu einem veränderten Verhältnis von Bcl-xL und Bax in Richtung Bax führten. Bax und Bcl-2 sind an der Bildung der mitochondrialen Pore beteiligt. Durch die Öffnung der mitochondrialen Pore sinkt das mitochondriale Membranpotential und die ATP-Spiegel. Bax begünstigt zusätzlich die Freisetzung von Cytochrom C und Smac. Der Abfall des mitochondrialen Membranpotentials, die geringen ATP-Spiegel und die Cytochrom C Freisetzung werden mit der Apoptose in Verbindung gebracht und erklären die erhöhte Empfindlichkeit der Mäuse gegenüber oxidativem Stress. Desweiteren muss die JNK3 berücksichtigt werden. Sie ist der mitochondrialen Fehlfunktion vorgeschaltet und löst eine degenerative Apoptose aus. Abeta und Tau werden bei der Entstehung von AD miteinander in Verbindung gebracht. Dieser Synergismus führt zu einer mitochondrialen Fehlfunktion im Kortex der Mäuse. Aufgrund des unveränderten Transmembranpotentials der dissoziierten Hirnzellen im Gehirn der Thy1APP Mäuse ab dem 6. Monat scheinen nur die aggregierten Polypeptide für die Neurotoxizität bei der AD eine Rolle zu spielen. Die COX-Aktivität wurde im Alter ebenfalls wieder verbessert und stabilisierte dadurch die ATPSpiegel. Die P301L-Taumäuse entwickeln ebenfalls erst im Alter neurofibrilläre Bündel (NFT) durch die Akkumulation von hyperphosphorylierten Tau. Ab dem 2. Lebensjahr der Mäuse wurde ein starker signifikanter Abfall des mitochondrialen Membranpotentials und der ATPSpiegel beobachtet. Der Anstieg der ROS-Spiegel der zwei Jahre alten Mäuse führte direkt zu einer Reduzierung der Komplex-I-Aktivität. Für diese Neurotoxizität scheint die Bildung der NFT verantwortlich zu sein. Die Wirkung von Ginkgo-biloba-Extrakt (EGb 761) und Piracetam auf die mitochondriale Fehlfunktion in jungen und alten NMRI-Mäusen untersucht. Eine Stabilisierung des mitochondrialen Membranpotentials und die Normalisierung der ATP-Spiegel konnte mit Hilfe von EGb 761 und Piracetam festgestellt werden. Besonders bei alten Mäusen konnte die schon angefangene mitochondriale Fehlfunktion fast komplett kompensiert werden. EGb 761 und Piracetam waren in der Lage nach zweiwöchiger Behandlung der APP transgenen Mäusen die löslichen Abeta-Spiegel im Gehirn signifikant zu senken. Durch diese Entlastung wurde die durch Abeta-verursachte Destabilisierung der mitochondrialen Membranen aufgehoben und die Mitochondrien vor oxidativen Schädigungen geschützt. Drei wichtige Angriffspunkte werden aufgrund der Daten für Piracetam vorgeschlagen: 1. die Senkung der Abeta-Spiegel im Gehirn, 2. die Stabilisierung der mitochondrialen Membranen und eine dadurch verbesserte Membranfluidität und 3. die Verbesserung der mitochondrialen Funktion vor altersbedingten Schädigungen. Die drei Punkte sind miteinander verknüpft, aufgrunddessen, dass Abeta die mitochondriale Membranen destabilisiert und dies zu einer mitochondrialen Fehlfunktion führen kann. Die neuroprotektiven Effekte von EGb 761 wurden durch 1. Senkung der Aß-Spiegel, 2. Mitochondrienmembranstabilisierende Wirkungen, 3. antioxidative Effekte, und 4. durch Modulation von Chloridkanälen hervorgerufen. In APP transgenen Mäusen wird trotz gleicher APP Expression in weiblichen Mäuse eine erhöhte Beta-Sekretasespaltung von APP mit verstärkter Bildung von C99 und Abeta (unlösliches und lösliches) im Vergleich zu den männlichen Tieren gebildet. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten zeigen, dass die erhöhten Abeta-Spiegel und der damit verbundene oxidative Stress in transgenen Mäusen zusätzlich die Mitochondrien der weiblichen Tiere besonders schädigen und die Atmungskette beeinträchtigen. Damit bestätigt sich, dass das Geschlecht ein weiterer Risikofaktor der AD ist. Daher unterstützen die im Rahmen dieser Doktorarbeit erhobenen Befunde grundsätzlich die weitere Erforschung pharmakologischer Ansätze besonders von Ginkgo-biloba-Extrakt und Piracetam zur Verbesserung kognitiver Störungen als Therapie oder auch zur Prophylaxe der Alzheimer Krankheit. Der Schutz von EGb 761 und Piracetam auf die Mitochondrien vor oxidativem Stress kann daher zur Vorbeugung vor allgemeinen Alterungsprozessen dienen. Abeta und Tau spielen zusammen beim Untergang der Neurone eine große Rolle. Therapien, welche die Ablagerungen von Abeta im Gehirn verringern, sollten in einem frühen Stadium der Krankheit besonders wirksam sein. In einem späteren Stadium wären hingegen zusätzlich Medikamente nötig, die gegen die neurofibrilläre Bündel gerichtet sind. Damit ließe sich theoretisch der fortschreitende Zelluntergang bei Alzheimerpatienten zu mindestens verlangsamen.
Angesichts der Bedeutung, die Brustkrebs sowohl in der Medizin als auch im gesellschaftlichen Bewusstsein besitzt, wird es zunehmend wichtiger, ein verstärktes Augenmerk auf die Möglichkeiten und Grenzen entsprechender Vorsorge- und Früherkennungsmaßnahmen zu legen. Seit Mitte der 90er Jahre hat sich das Spektrum der Brustkrebsdiagnostik um die Möglichkeit der genetischen Testung von Risikopatienten erweitert. Der hier angesprochene BRCA-Gentest für erblichen Brust- und Eierstockkrebs zählt zu den prädiktiv-probabilistischen Gentests mit geringer Aussagekraft bezüglich der Vorhersage einer möglichen Krebserkrankung. Weder der genaue Zeitpunkt eines Krankheitsausbruchs, noch die Schwere einer möglichen Erkrankung können genau vorhergesagt werden. Auch ein negatives Testergebnis gibt keinerlei Gewissheit darüber, dass Brust- oder Eierstockkrebs nicht doch im Rahmen des durchschnittlichen Risikos von ca. 8% bei den Getesteten entstehen kann. Es besteht die Gefahr, dass das negative Testergebnis zu einer Unterschätzung dieses durchschnittlichen Risikos führt und entsprechende präventive Maßnahmen nicht ausreichend wahrgenommen werden. Ein positives Testergebnis kann zu Einschränkungen in der Lebensführung und in der weiteren Lebens- und Familienplanung führen. Des Weiteren können prophylaktische Maßnahmen, wie Mastektomie oder Ovarektomie, ergriffen werden, die der Situation möglicherweise nicht angemessen sind und einen fraglichen Nutzen besitzen. Im Zuge der Möglichkeiten einer genetischen Testung ist es zu einer Veränderung bzw. zu einer Erweiterung des Krankheitsbegriffs in der Medizin gekommen. Dabei sei angemerkt, dass die meisten Personen, die eine prädiktive Medizin in Anspruch nehmen, zumeist primär nicht krank sind, sondern eine Aufklärung über eine mögliche genetische Disposition haben möchten. Prädiktive Gentests, die im Falle einer Verdachtsdiagnose in präventive und prophylaktische Maßnahmen münden, setzen zum einen den Noch-Nicht-Kranken einem Behandlungsrisiko aus und machen zum anderen einen bestimmten Anteil an positiv Getesteten zu Patienten, obwohl diese die Erkrankung erst spät oder nie bekommen würden. Besteht bei der Erweiterung des Krankheitsbegriffs nicht die Gefahr der sozialen Diskriminierung von Gesunden mit genetischer Disposition? Ist das System der genetischen Testung für jeden Einzelnen frei zugänglich, und wie lassen sich die zusätzlichen Kosten rechtfertigen? Der Gentest auf erblichen Brust- und Eierstockkrebs ist eingebunden in eine interdisziplinäre Zusammenarbeit aus Gynäkologen, Humangenetikern, Onkologen, Psychoonkologen, Pathologen, Radiologen und Hausärzten. Die Autoren Günter Feuerstein und Regine Kollek kommen jedoch zu dem Schluss, dass auch eine qualifizierte genetische Beratung nicht in der Lage sei, alle Unsicherheiten auszuräumen, die sowohl mit den naturwissenschaftlich-genetischen Risikoaussagen als auch mit deren individuellen Wahrnehmung und Bewertung verbunden sind. Sie stellen sich die Frage, was ein „informed consent“ vor diesem Hintergrund komplexer genetischer Sachlagen und der gegenüber vielfältigen Einflüssen und Faktoren anfälligen Vermittlung probabilistischer Risikoinformationen bedeuten könne. Es stellt sich die Frage, wie es um das Recht auf Nichtwissen und die Freiwilligkeit der Inanspruchnahme von Gentests bestellt ist, wenn eine entsprechende gesundheitliche Verantwortung des Einzelnen gesellschaftlich eingefordert wird und wie viel Verantwortung eine Gesellschaft für den Einzelnen übernehmen kann. Vor diesem Hintergrund erscheint es daher umso wichtiger, einen Wirksamkeitsnachweis der präventiven Maßnahmen und der prophylaktischen Eingriffe zu erbringen. Mehrere Studien haben die Wirksamkeit prophylaktischer Eingriffe in Bezug auf erblichen Brust- und Eierstockkrebs untersucht und kamen zu einer Risikoreduktion für Brustkrebs bei einer prophylaktischen Mastektomie von bis zu 97% und zu einer Risikoreduktion für Eierstockkrebs bei einer prophylaktischen Ovarektomie von bis zu 50%. Ein unbestimmtes Restrisiko bleibt bei jeder Form des prophylaktischen Eingriffs bestehen. Mit entscheidend ist dabei einerseits das subjektive Körpergefühl der betroffenen Frau und andererseits der kulturelle Hintergrund, wie ein Vergleich zwischen Frankreich, Niederlande, England, Kanada, den USA und Deutschland zeigt. Studien und Erfahrungsberichte haben gezeigt, dass individuell auf die Wünsche der Patientinnen eingegangen wird, sie werden in ihren eigenen Vorstellungen bezüglich Körperbild und Vorsorgemaßnahmen respektiert, und besitzen eine aktive Rolle in der Kontrolle ihrer Behandlung. Daher sind sowohl die medizinischen Fachkräfte als auch die Betroffenen aufgefordert, entsprechende Vorsorge- und Früherkennungsmaßnahmen, insbesondere genetische Testverfahren, gemeinsam weiter zu entwickeln, aber auch kritisch zu hinterfragen, um gleichermaßen das Verantwortungsbewusstsein und den Aufklärungsbedarf unter Beachtung individueller Gegebenheiten zu stärken.
Grundlage der hier vorliegenden retrospektiven Studie stellen alle in der Zeit von März bis Oktober 2004 an den Städtischen Kliniken Frankfurt-Höchst zur Geburt aufgenommenen 102 Patientinnen mit der Diagnose Gestationsdiabetes (GDM) und ihrer gleichstarken Kontrollgruppe dar. In beiden Gruppen kamen jeweils 102 Kinder auf die Welt. Die Untersuchung erstreckte sich darauf, innerhalb der beiden Gruppen fetales Outcome, Unterschiede und Risikofaktoren, die für einen GDM prädisponieren, herauszuarbeiten. Keine Auffälligkeiten ergaben sich bei mütterlichem Alter und Herkunft der Patientinnen. Die Gestationsdiabetikerinnen hatten im Mittel ein höheres Körpergewicht sowie einen höheren BMI vor und nach der Schwangerschaft. Die Gewichtszunahme während der Schwangerschaft war dagegen in der Kontrollgruppe mit 20,3 % höher als in der GDM-Gruppe (16,3 %). Hinsichtlich der Fehlgeburtenrate, der Anzahl an vorherigen Geburten, der Schwangerschaftsdauer und der Frühgeburtlichkeit konnten wir keine Unterschiede zwischen den beiden Gruppen feststellen. Bestätigen konnten wir jedoch den Risikofaktor „familiärer Diabetes“. In der GDM-Gruppe gaben 30,6 % der Patientinnen eine positive familiäre Diabetesanamnese an gegenüber 6,9 % in der Kontrolle. Beim Entbindungsmodus fiel in der GDM-Gruppe eine erhöhte Anzahl an sekundären Sectiones mit 20,6 % gegenüber 6,9 % in der Kontrollgruppe auf. Betrachtet man die Gruppe der adipösen Gestationsdiabetikerinnen separat, so fiel ebenfalls eine erhöhte Anzahl an Schnittentbindungen auf. Den in der Literatur beschriebenen Trend zur Schnittentbindung bei GDM bzw. Adipositas können wir somit in unserer Studie bestätigen. Die primäre Sectiorate bei makrosomen Kindern der GDM-Gruppe war mit 52,9 % ebenfalls erhöht. Geburtstraumata wie Schulterdystokien und Plexusschäden fielen bei keinem der untersuchten Kinder auf. Erhöhte Verlegungsraten in die Kinderklinik und somit ein schlechteres fetales Outcome ergaben sich bei Gestationsdiabetikerinnen mit erhöhtem Alter (> 34 Jahren), osteuropäischer und asiatischer Herkunft, erhöhtem BMI (> 30 kg/m²) vor und nach Schwangerschaft sowie starker Gewichtszunahme (> 30 %) während der Schwangerschaft. Tendenziell erhöhte Verlegungsraten in der GDM-Gruppe fanden sich bei Mehrgravida und bei Frauen mit mehr als einer Fehlgeburt in der geburtshilflichen Anamnese. Die Neugeborenen der beiden Gruppen unterschieden sich nicht hinsichtlich Geschlecht, Körperlänge, Körpergewicht, Kopfumfang, pH-Wert, Base Excess und Fehlbildungsrate. Auffälligkeiten ergaben sich dagegen bei der Makrosomierate. 16,7 % der GDM-Kinder lagen über der 90. Perzentile, gegenüber 5,9 % der Kinder der Kontrollgruppe. Das Outcome unmittelbar nach Geburt war bei Neugeborenen gestationsdiabetischer Mütter öfter schlechter als bei Neugeborenen der Kontrolle. Dies wurde beim APGAR-Score deutlich. In den ersten 5 Minuten hatten 8 GDMKinder jeweils einen APGAR-Wert < 7 gegenüber nur einem Kind aus der Kontrolle. Bei 35,3 % der Neugeborenen diabetischer Mütter wurde eine Hypoglykämie ≤ 45 mg/dl innerhalb der ersten 3 Stunden nach Geburt gemessen. Hiervon stammen 41,7 % der Kinder von insulinär eingestellten Frauen. Als mütterliche Risikofaktoren, die eine Verlegung des Neugeborenen in die Kinderklinik wahrscheinlich machen, sind eine kurze Schwangerschaftsdauer, Adipositas und eine Insulintherapie bei Gestationsdiabetes aufzuführen. Insgesamt ist festzustellen, dass es Unterschiede zwischen gestationsdiabetischen und normoglykämischen Schwangeren gibt. Bestimmte Risikofaktoren stellen weiterhin eine Gefahr für das Neugeborene dar. Es gilt diese Unterschiede und Prädiktoren rechtzeitig zu erkennen und zu therapieren. Nur durch Aufklärung der Bevölkerung über den Gestationsdiabetes und Verschärfung der metabolischen Kontrolle in der Schwangerschaft, sowie frühzeitiges Erkennen prädisponierender Risikofaktoren für einen Gestationsdiabetes lässt sich für die Zukunft eine Angleichung der kindlichen Morbidität bei GDM an das Schwangerschaftsprodukt normoglykämisch Schwangerer erreichen.
Die akute lymphatische Leukämie (ALL) ist eine aggressive Krankheit des hämatopoetischen Systems. Die Gegenwart des Philadelphia - Chromosoms (Ph), das die Translokation t(9;22) kodiert, oder die t(4,11) definieren Hochrisiko - ALL - Patienten mit einer besonders schlechten Prognose (Hoelzer and Gokbuget 2000; Hoelzer et al. 2002; Hoelzer et al. 2002)]. Das Ph Chromosom führt je nach Bruchpunkt der Translokation zur Expression von p185(BCR-ABL) oder p210(BCR-ABL). Die Fusion der Abl-Tyrosin Kinase an Bcr führt zur konstitutiven Aktivierung der Abl-Kinase, die hauptsächlich für die Transformation der Zellen verantwortlich ist. Die Überlebensrate durch aktuelle zytostatische Therapien der Ph+ ALL liegt bei 0-10%, trotz initialer Komplettremission (CR) von 80%, die ähnlich hoch wie die von Ph– Patienten ist. Imatinib (GleevecTM, GlivecTM, früher STI571) ist ein spezifischer Inhibitor der Abl – Kinase mit hoher Effizienz für die Behandlung der Ph+ ALL. Trotz der effektiven Hemmung von BCR-ABL durch Imatinib kommt es beinahe immer zum Rezidiv. Dies verschlechtert weiter die Prognose (Donato et al. 2004). Die Entstehung von Mutationen ist die häufigste Ursache für Resistenz gegen Imatinib, Nilotinib und/oder Dasatinib - Therapie. In dieser Arbeit wurden alternative Therapiestrategien für die Behandlung der ALL untersucht. Dazu wurden zwei Ansätze gewählt, wobei 1.) Gene identifiziert wurden, die zur Imatinib – Resistenz führen, um der Resistenzentwicklung vorzubeugen oder die Resistenz zu überwinden. Weiterhin wurde 2.) versucht die aberrante Transkription leukämischer Zellen zu verhindern. Dazu wurde die Inhibition der Histon – Deazetylierung, die für die aberrante Remodellierung des Chromatins verantwortlich ist, untersucht. ...
Ein wichtiges Element zur Steuerung der Transkriptionseffizienz im Replikationszyklus des HI-Virus ist das Tat/TAR-System. Im Rahmen dieser Arbeit wurden einige kleine heterozyklische Verbindungen synthetisiert, die als potenzielle Inhibitoren des Tat-TAR-Komplexes von HIV-1 wirken sollten. Nach der Synthese des 1H-Pyrazol-3,4,5-triamin-sulfates sollte diese Verbindung dann in größere Strukturmotive eingebettet werden, von denen man sich erhoffte, dass sie in ihrer reduzierten Form in der Lage sein sollten, weitere H-Brücken zu benachbarten Basen der RNA auszubilden und dadurch die Affinität zu erhöhen. Es zeigte sich, dass die im Rahmen dieser Dissertation synthetisierten Phenazinderivate zwar alle mit Natriumdithionit reduziert werden konnten, diese Strukturen aber nicht luftstabil waren.
Die Studie evaluierte die Dimensionsgenauigkeit und -stabilität sowie das Rückstellverhalten von acht verschiedenen handelsüblichen Abformmaterialien für die Einphasenabformung. Bei zwei Produkten handelte es sich um Polyether-Abformmaterialien, sechs Abformmaterialien stammten aus der Gruppe der additionsvernetzenden Silikone. Zur Bestimmung der oben genannten Parameter erfolgte eine direkte zweidimensionale Vermessung der Abformungen ohne Einbeziehung eines Modellwerkstoffs. Als Grundlage für die Vermessung der elastomeren Abformmaterialien diente eine speziell entwickelte Präzisionsform, die sich aus einem individuell hergestellten Metallmodell mit vier stilisierten Pfeilern und einer speziell entwickelten Abformküvette zusammensetzte. Die Rotationsachsen der stilisierten Pfeiler 14, 17, 25 und 27 wurden im okklusalen Bereich durch eine Zentrierbohrung markiert. Zusätzlich wurde der stilisierte Pfeiler 17 mit vier Markierungspunkten, die sich mesial, distal, palatinal und vestibulär auf Höhe der Präparationsgrenze befanden, versehen. Die Markierungspunkte der Pfeiler wurden unter einem Stereomikroskop bei einer Temperatur von 23,0 ± 1,0°C mit einem Präzisions-Linearverstellerund drehtisch angefahren. Die Vermessung erfolgte nach dem vom Hersteller angegebenen frühest möglichen Zeitpunkt für die Modellherstellung, sowie 90 Minuten, 24 Stunden und 48 Stunden nach Entformung. Die statistische Datenauswertung wurde mit Hilfe von Varianzanalysen durchgeführt. Die Abformmaterialien unterschieden sich bezüglich der okklusalen Messstrecken zum Teil vom Urmodell. Unterschiede ließen sich bezüglich der Messstrecke A (1417) (Impregum Penta Soft), der Strecke B (14-25) (Impregum Penta, Honigum MixStar) und der Strecke D (14-17) (Impregum Penta Soft, Impregum Penta, Honigum MixStar, Flexitime Monophase, President System 75) nachweisen. Über die vier Messzeitpunkte wurden meist keine signifikanten Veränderungen bei den acht untersuchten Abformmaterialien festgestellt. Ausnahmen bildeten Aquasil Monophase bezüglich Strecke C (25-27) und Impregum Penta bezüglich Messstrecke D (14-17). Bei den Messstrecken auf Höhe der Präparationsgrenze unterschieden sich die Materialien zum Teil vom Urmodell. Unterschiede ließen sich nachweisen bezüglich der Messstrecken a (Impregum Penta Soft), b (Aquasil Monophase) und c (Aquasil Monophase). Einige wenige signifikante Veränderungen wurden über die vier Messzeitpunkte bei den Abformmaterialien festgestellt, und zwar bei den Materialien Impregum Penta, Aquasil Monophase, President System 75 und Provil novo Monophase bezüglich der Strecken a (mesialvestibulär), sowie bei den Materialien Impregum Penta und President System 75 bezüglich der Strecken c (distal-vestibulär). Die Materialien Monopren transfer und Provil novo Monophase zeigten bei den okklusalen und auf der Präparationsgrenze befindlichen Messstrecken die geringsten Unterschiede zum Urmodell bezüglich der Dimensionsgenauigkeit und des Rückstellverhaltens bei Verformung. Weiterhin ist festzuhalten, dass die Abformmaterialien innerhalb der Zeitspanne von bis zu 48 Stunden im Rahmen der Lagerung bei Raumtemperatur eine hohe Dimensionsstabilität aufwiesen.