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Three-dimensional structure of the glycine-betaine transporter BetP by cryo electron crystallography
(2008)
The soil bacterium Corynebacterium glutamicum has five secondary transporters for compatible solutes allowing it to cope with osmotic stress. The most abundant of them, the transporter BetP, performs a high affinity uptake of glycine-betain when encountering hyperosmotic stress. BetP belongs to the betaine/carnitine/choline/transporter (BCCT) family, and is predicted to have twelve transmembrane helices with both termini facing the cytoplasm. The goal of this thesis is to facilitate understanding of BetP function by determining a three dimensional (3D) model of its structure. Two-dimensional (2D) crystallization of wild-type (WT) BetP has been successfully performed by reconstitution into a mixture of E. coli lipids and bovine cardiolipin, which resulted in vesicular crystals diffracting to 7.5 Å resolution (Ziegler, Morbach et al. 2004). Diffraction patterns of these crystals however showed unfocused spots, generally due to high mosaicity. Better results were obtained by using the constitutively active mutant BetPdeltaC45 in which the first 45 amino acids of the positively charged C-terminus were removed. BetPdeltaC45 crystals obtained under the same conditions for BetP WT were concluded to be pseudo crystals, based on the inconsistence of symmetry. These crystals had BetPdeltaC45 molecules randomly up/downwards inserted into membrane crystals, and cannot be used for structure determination, even though they diffracted up to 7 Å. The problem of pseudo crystal formation could be solved by changing the lipids used for 2D crystallization to a native lipid extract from C. glutamicum cells. This change of lipids improved the crystals to well-ordered packing with exclusive p121_b symmetry. To understand the role of lipids in crystal packing and order, lipids were extracted at different stages during crystallization, and identified by using multiple precursor ion scanning mass spectrometry. The results show that phosphatidyl glycerol (PG) 16:0-18:1 is the most dominant lipid species in C. glutamicum membranes, and that BetP has a preference for the fatty acid moieties 16:0-18:1. Crystallization with synthetic PG 16:0-18:1 proved that an excess of this lipid prevents pseudo crystal formation, but these crystals did not reach the quality as previously achieved by using the C. glutamicum lipids. Apart from the effect of lipids in crystallinity, the concentration and type of salts influenced crystal growth and morphology. High salt conditions (>400 mM LiCl or KCl) yielded tubular crystals, whereas low salt conditions (<300 mM LiCl, NaCl or KCl) led to formation of up to 10 µm large sheet-like crystals. The intermediate concentration gave a mixture of sheet-like and tubular crystals. In terms of resolution, sheets diffracted better than tubes. The sheet-like crystals used for 3D map reconstruction were obtained from a dialysis buffer containing 200 mM NaCl combined with using C. glutamicum lipids. Electron microscopic images were taken from frozen-hydrated crystals using a helium-cooled JEOL 300 SFF microscope or a liquid nitrogen-cooled FEI Tecnai G2 microscope at 300 kV, which allowed optimal data collection and minimized radiation damage to the sample. More than 1000 images of tilt angles up to 50° were taken and evaluated using optical diffraction of a laser beam. The best 200 images were processed with the MRC image processing software package, and 79 images from different tilt angles were merged to the final data set used for calculation of a 3D map at a planar resolution of 8 Å. The structure shows BetPdeltaC45 as a trimer with each monomer consisting of 12 transmembrane alpha-helices. Protein termini and loop regions could not be determined due to the limited resolution of the map. Six of the twelve helices line a central cavity forming a potential substrate-binding chamber. Each monomer shows a central cavity in different sizes and shapes. Thus, the constitutively active BetPdeltaC45 thus forms an unusual asymmetric homotrimer. BetP most likely reflects three different conformational states of secondary transporters: the cytoplasmically open (C), the occluded (O), and the periplasmically open (P) states. The C and O states are similar to BetP WT projection structure, while the P state is discrepant and highly flexible due to the shape and size of the central cavity as well as the lowest intensity of the density. The observation of the P state corresponds well to the constitutively active property of BetPdeltaC45. For the high resolution structure of the C and O states are available, this work presents the first structural information of the P state of a secondary transporter.
Transport of proteins into or across cellular membranes is mediated by the conserved and ubiquitous Sec-machinery. The Sec-homologue in the inner membrane of Escherichia coli is SecYEG. Sec-mediated insertion of numerous membrane proteins is aided by YidC, another protein integral to the inner membrane of Escherichia coli. YidC fulfils in addition the integration of a variety of membrane proteins Sec-independently. It belongs to a conserved but structurally uncharacterised family of proteins important for membrane protein biogenesis and comprises homologues in mitochondria and chloroplasts. By modification of a former crystallisation protocol two-dimensional crystals of SecYEG were grown in presence of the signal sequence peptide of LamB. Recording of structural data by electron cryo-microscopy and calculation of a difference structure comparing a former SecYEG projection structure with the one of SecYEG crystallised in presence of the substrate revealed several new and vacant densities. These hint to signal peptide binding close to the translocation pore and to significant rearrangements in proximity to the lateral exit site for transmembrane domains in SecYEG. The difference structure suggests that dimeric SecYEG is an asymmetric molecule consisting of one active and one inactive SecYEG monomer. Detergent removal from a mixture of purified YidC and lipids produced two-dimensional crystals that were highly dependent on the ionic strength and lipid composition for their growth. Electron cryo-microscopy on the frozen-hydrated crystals and image processing visualised structural details at about 10 Å resolution. Averaging two alternative projection structures in p2 and p121_a symmetry, respectively, yielded essentially the same features. Four YidC monomers form one unit cell (dimensions 82 x 71 Å, included angle 85 ° and 90 °, respectively) and seem to be arranged as two sets of dimers integrated in an anti-parallel fashion into the membrane. An area of low density in the centre of each YidC monomer resembles possibly a constriction of the membrane, which could have particular relevance for the integration of substrate proteins into the lipid bilayer.
Strukturelle und funktionelle Untersuchungen am Cytochrom-bc1-Komplex aus Paracoccus denitrificans
(2005)
Cytochrom bc-Komplexe sind zentrale Enzyme energietransduzierender Elektronen-transportketten. Anerkanntes Funktionsprinzip ist der Q-Zyklus; mechanistische Details insbesondere der Chinoloxidation am Qo-Zentrum sind noch unklar. Ein Verständnis des Qo-Zentrums ist auch von Interesse, da hier Inhibitoren in Form von Fungiziden und Malariatherapeutika wichtige Anwendung finden. In den vergangenen Jahren wurde eine Reihe mitochondrialer Komplexe kristallographisch charakterisiert, die Struktur eines bakteriellen Enzyms steht jedoch aus. Hauptziel dieser Arbeit war es, Ansätze zur Strukturaufklärung des bc1-Komplexes aus Paracoccus denitrificans (P.d.) zu finden, der als homologes Enzym mitochondrialer Komplexe bei einfacher genetischer Zugänglichkeit ein wichtiges Modellsystem darstellt. In der vorliegenden Arbeit wurde auf die Kristallisation des bc1-Komplexes aus S. cerevisiae aufgebaut, die mit Hilfe monoklonaler Antikörperfragmente (Fv) gegen die Rieske-Untereinheit (ISP) erreicht wurde; die Fv-Fragmente erleichtern die Ausbildung von Kristallkontakten. Die Epitopregion des Hefeenzyms wurde genetisch auf den bakteriellen Komplex übertragen, um dessen Ko-Kristallisation mit dem bereits verfügbaren Fv zu ermöglichen. Punktuelle Anpassungen führten zu keiner signifikanten Bindung, ein weitergehender Austausch des entsprechenden ISP-Bereichs verbesserte die Bindung hingegen deutlich. Die besten Ergebnisse konnten mit chimären Enzymen erzielt werden, bei denen die gesamte ISP-Ektodomäne durch das Hefe-Homologe ersetzt wurde. Aufbauend auf dieser Arbeit scheint die Fv-vermittelte Kristallisation des Enzyms ein greifbares Ziel. Eine komplementäre Strategie zielte auf die strukturelle Charakterisierung der Rieske-Ektodomäne (ISF). Das klonierte ISF wurde in E. coli überexprimiert, lag jedoch fast vollständig in inclusion bodies vor. Das ISF konnte in eine lösliche Form rückgefaltet werden, die anschließende chemische Rekonstitution zum Holo-Protein gelang jedoch nur mit einer Ausbeute von ~ 1 %. Die geringe Menge an löslichem ISF, die sich nach Expression in E. coli isolieren lässt, trägt kein [2Fe-2S]-Zentrum. Durch Koexpression der für die Biogenese von Eisen-Schwefel-Zentren relevanten Gencluster konnte die lösliche ISF-Fraktion in vivo in die Holo-Form konvertiert werden. Auch hier war aber die Gesamtausbeute für strukturelle Untersuchungen zu gering. Eine homologe Expression in P.d. war nur für das komplette ISP nachweisbar, nicht für das verkürzte ISF. Durch gerichtete Mutagenese konnte hier erstmals gezeigt werden, dass das bakterielle Rieske-Protein über den Tat-Translokationsweg in die Membran inseriert. Die Kristallstrukturen mitochondrialer bc1-Komplexe zeigen ein dimeres Enzym. Die Assoziation des bakteriellen Komplexes wurde in dieser Arbeit mit der analytischen Ultrazentrifugation untersucht, und auch hier wurde eindeutig ein Dimer nachgewiesen. Dynamische Messverfahren deuteten jedoch auf einen höheren Assoziationszustand hin. Es bleibt unklar, ob diese Diskrepanz durch Formparameter oder die Detergenzbindung begründet ist oder ob unter bestimmten Versuchsbedingungen möglicherweise Tetramere vorliegen. In situ ist der bc1-Komplex strukturell mit den Komplexen I und IV sowie dem Elektronenüberträger Cyt c552 assoziiert. Die Analyse verschiedener Deletionsstämme zeigte, dass Komplex I der Atmungskette durch diesen Superkomplex stabilisiert wird. Dieser Befund konnte kürzlich in anderen Arbeiten auch an menschlichen Mitochondrien bestätigt werden. Neben strukturellen Aspekten wurden am bc1-Komplex auch die H+-Translokation und die Chinonbindung untersucht. Da chemische Modifikationsexperimente zeigen, dass ein saurer Rest im ISP eine kritische Rolle für die Kopplung von H+-Translokation und Elektronentransport spielt, wurden durch gerichtete Mutagenese kombinatorisch saure Reste gegen entsprechende Säureamide ersetzt. Die biochemische Charakterisierung wurde nur für eine Fünffach-Mutante durchgeführt; diese erwies sich jedoch als zu instabil, um verlässliche Daten aus H+-Pumpexperimenten zu gewinnen. Die Charakterisierung der übrigen Mutanten scheint lohnenswert, da der relevante Aminosäurerest auch in anderen Arbeiten noch nicht identifiziert werden konnte. Der Gehalt des aufgereinigten Enzyms an spezifisch gebundenem Chinon wurde FTIR-spektroskopisch quantifiziert. Eine Stöchiometrie von ~ 3 Chinonmolekülen/Monomer stützt das double occupancy-Modell, demzufolge zwei Substratmoleküle am Qo-Zentrum binden; das dritte Chinon bindet am Qi-Zentrum. Partielle Extraktion des Chinons und Messungen bei verschiedenen pH-Werten zeigten, dass die Substratbindung mit Protonierung eines sauren Rests einhergeht. Möglicherweise handelt es sich dabei um Glu295 des Cytochrom b, das auf Basis der Kristallstrukturen als primärer H+-Akzeptor am Qo-Zentrum diskutiert wird. Aufbauend auf dieser Arbeit können die an der Chinonbindung beteiligten Reste durch Mutagenese identifiziert werden.
This study addresses the structure-function relationships of three essential membrane proteins: Porin from Paracoccus denitrificans, Porin OmpG from Eschericia coli and BetP from Corynobacterium glutamicum using Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy and Attenuated Total Reflection (ATR) techniques. The structure of porin from P. denitrificans is known for more than a decade; however, the mechanism for loss of functionality together with the monomerization was not clear. In this study we have addressed the role of lipids for the functionality of porin using FT-IR. OmpF porin was found to interact with the lipid molecules via the aromatic girdles surrounding the protein for functionality. In this study, molecular bonds and groups of the lipids were established as reporter groups probing at different depths of the bilayer in order to understand the interaction partner of the aromatic girdles of porins. Monomerization of the trimeric assembly of OmpF porin reconstituted in lipids is induced by increasing the temperature. Porin (OmpF) was found to be extremely stable: The secondary structure of the protein was unaltered up to the temperature-induced main transition, around 80-90 °C, above which it is denatured. However, the interaction of the aromatic girdle with the lipid molecules exhibited distinct changes at much lower temperature values (40 - 50°) where, according to the previous functional studies, monomerization and the loss of function occurs. The results are compared with OmpG porin from E.coli, for which the functional unit is a monomer. The aromatic girdle-lipid interaction was monitored by the tyrosine aromatic ring C=C vibrational mode, a universal marker for the protein stability and interaction. We have also found that the aromatic girdles of porins are interacting with the interfacial region of the lipid bilayer instead of lipid headgroups. Lipid-protein interaction was found to be not only essential for the structural stability, but also for the functionality of OmpF porin. We have also studied the structural properties of OmpG from E.coli. The structure of OmpG at two pH values has been resolved using X-ray crystallography and the channel has been proposed to attain different states at different pH values as closed (pH < 5.5) and open (pH >7.5). This study, using IR spectroscopy, revealed that the pH-induced opening and closing of the channel is reflected by the frequency shifts of the ? sheet structure. OmpG has more rigid ? barrel properties upon opening of the channel. IR spectral analysis revealed multiple ? sheet signals with different hydrogen bond strengths. This enabled us to monitor the formation of hydrogen bridges between the extracellular loops upon opening of the channel. The conclusion that OmpG porin having two states at different pH values was also confirmed by the three mutants where the role of the histidine pair (H231 & H261) and loop 6 has been addressed. Temperature-profiling of the wild type (WT) protein and the mutants did not show pH dependent structural stability differences in detergent solution. However, the WT protein was found to be more stable in the open form in 2D crystals than the closed form. Reconstitution into lipids has increased the transition temperature value by ~20 °C in the closed state and ~25 °C in the open state. Therefore we conclude that the open and closed state of OmpG has structural stability differences that are only revealed in the lipid environment. A comparison of the transition temperature values of OmpG WT and the mutants suggested that the hydrogen bond network among S218-H231-H261-D267, together with the formation of 12 residue-long ?-sheet contributes to the structural stability of the open channel. In the process of closing and opening of the channel, the globular structure of the protein remains mainly unchanged, while there are changes in the side chain moieties. In addition to the role of the histidine pair and the loop L6, in situ opening/closing experiments showed that the negatively charged amino acids, i.e. Asp and Glu, and Arg residues also play an active role; possibly by interacting with each other inside the pore lumen. Therefore it could be concluded that the closure of the channel at acidic pH values is not only via closing the channel entrance by loop 6, but also via changing the electric potential inside the lumen due to the different states of charged amino acids in order to effectively block the gateway. BetP from C.glutamicum attains an active and inactive state in order to adjust its glycine betaine uptake rate to the osmotic conditions that the cell encounters. The structure of BetP is not yet available. The WT protein exhibited structural differences in the presence of excess K+, which is one of the activation conditions. In 2D crystals, increasing the ionic strength to 700 mM K+ was shown to induce changes in the ?-helical moiety with contributions from the ester groups and one Tyr residue using ATR-FTIR. An increase in ionic strength to 220 mM K+ was found to be the threshold value of potassium concentration ([K+]) where the protein exhibits structural alterations in detergent solution. The determined [K+] values are in good agreement with the previous functional studies. However, there are differences in the activation profile of BetP in 2D crystals and in detergent solution, which points out that the lipids are involved in the conformational transition from the inactive to the active state and their absence can lead to different structural properties. BetP WT was found to have ~65% alpha-helix, ~25% random coil and ~10% turn structure in detergent solution. In the presence of excess K+, the WT protein is found to adapt more unordered structure. Secondary structure analysis of the mutants revealed that both the N- and C-terminus are in ?-helical conformation. Reconstitution of WT protein in 2D crystals increased the main transition (denaturation) temperature value from ~62 °C to ~85 °C, a clear indication that the protein is more stable in lipid environment. Temperature-profiling of the two forms of the WT protein revealed that the structural breakdown is preceeded by monomerization of the trimeric assembly. Comparing the two forms of the WT protein and the mutant BetA, we conclude that the oligomeric status is stabilized via the interactions among hydrophilic regions involving the N terminus. H/D exchange and activation with excess K+ in D2O-buffer revealed that activation of the protein involves the interaction of Arg and Asp/Glu residues in the cytoplasmic region of the protein. BetP WT and the two mutants tested, i.e. BetA and BetP?C45, showed differences in protein packing upon activation. The WT protein and BetP?C45 mutant also show changes in the hydrogen bonding properties of turns. Since BetA does not show such a property in activation, we conclude that the N-terminus interacts with the loops in the inactive state via the interaction of charged amino acids for the WT protein and that this interaction is altered during the activation. It could be argued that the protein packing is affected via the changes in turns upon activation. We also have found experimental evidence that one Tyr residue has different orientations in the active and inactive state of BetP. Based on the previous functional studies, it could be one of the five Tyr residues in the cytoplasmic region of the protein (in loop 3, 6, 7 or C-terminus). The mutant BetP?C45, on the other hand, showed fewer differences between the active and inactive state conditions and based on the H/D exchange rates, the mutant shows the properties of an active WT protein, proving that the C-terminal truncation impairs the conformational transition between the active and inactive states.
My graduate thesis is on the "Structural studies of membrane transport proteins". Transporters are membrane proteins that have multiple membrane-spanning a-helices. They are dynamic and diverse proteins, undergoing a large conformational change and transporting wide range of susbtrates. Based on their energy source they can be classified into primary and secondary transport systems. Primary transport systems are driven by the use of chemical (ATP) or light energy, while secondary transporters utilize ion gradients to transport substrates. I began my PhD dissertation on secondary transporters by two-dimensional crystallization and electron crystallographic analysis and recently my focus also has shifted towards 3D crystallization. The following projects constitute my PhD thesis: 1) 2D crystallization of MjNhaP1 and pH induced structural change: MjNhaP1, a Na+/H+ antiporter that is regulated by pH has been implicated in homeostasis of H+ and Na+ in Methanococcus jannaschii, a hyperthermophilic archaeon that grows optimally at 85°C. MjNhaP1 was cloned and expressed in E. coli. Two-dimensional crystals were obtained from purified protein at pH4. Electron cryo-microscopy yielded an 8Å projection map. The map of MjNhaP1 shows elongated densities in the centre of the dimer and a cluster of density peaks on either side of the dimer core, indicative of a bundle of 4-6 membrane-spanning helices. The effect of pH on the structure of MjNhaP1was studied in situ in 2D crystals revealing a major change in density within the helix bundle relative to the dimer interface. This change occurred at pH6 and above. The two conformations at low and high pH most likely represent the closed and open states of the antiporter, respectively. This is the first instance where a conformational change associated with the regulation of a secondary transporter appears to map structurally. Reconstruction of 3D map and high-resolution structure by x-ray crystallography would be necessary to understand the mechanism of ion transport and regulation by pH. 2) 2D crystallization of Proline transporter: Proline transporter (PutP) from E.coli belongs the sodium-solute symporter family that includes disease related sodium dependent glucose and iodide transporter in humans. Sodium and proline are co-transported with a stoichiometry of 1:1. Purified PutP was reconstituted to yield 2D crystals that were hexagonal in nature. The 2D crystals had tendency to stack indicating their willingness to form 3D crystals. A projection map of PutP from negatively stained crystals showed trimeric arrangement of protein. Other members of the SSF family have been shown to be monomers. My analysis of oligomeric state of PutP in detergent by blue native gel indicates a monomer in detergent solution. It is likely that PutP can function as a monomer but at higher concentration and in lipid bilayer it tends to form trimer. 3) Oligomeric state and crystallization of carnitine transporter from E.coli: E.coli carnitine transporter (CaiT) belongs to the BCCT (Betaine, Carnitine and Choline) superfamily that transports molecules with quaternary amine groups. CaiT is predicted to span the membrane 12 times and acts as a L-carnitine/g-butyrobetaine exchanger. Unlike other members in this transporter family, it does not require an ion gradient and does not respond to osmotic stress. Over-expression of the protein yielded ~2mg of protein/L of culture. The structure and oligomeric state of the protein were analyzed in detergent and lipid bilayers. Blue native gel electrophoresis indicated that CaiT was a trimer in detergent solution. Gel filtration and cross-linking studies further support this. Reconstitution of CaiT into lipid bilayers resulted in 2D crystals. Analysis of negatively stained 2D crystals confirmed that CaiT is a trimer in the membrane. Initial 3D crystallization trials have been successful and currently, the crystals diffract to 6Å and are being improved. 4) Monomeric porin OmpG: OmpG is a bacterial outer membrane b-barrel protein. It is monomeric and its size (33kDa) places it as a prime candidate for a structural solution, using the recently developed method of solid state NMR (work in collaboration with Prof.Hartmut Oskinat, FMP, Berlin). A long-term aim would be to study porins as templates for designing nanopores, for DNA sequencing and identification. I have expressed OmpG in inclusion bodies and refolded at an efficiency of >90% into a functional form using detergent. OmpG was then crystallized by 2D crystallization yielding an 8Å projection map whose structure was similar to native protein. In addition, these crystals were used for structure determination by solid state NMR. An initial spectrum of heavy isotopically labeled OmpG has allowed identification of specific amino acid residues including threonine and proline. Additionally, I obtained 3D crystals in detergent that diffract to 5.5Å and are being improved.
Die P-Typ-ATPasen finden sich in allen Domänen des Lebens und stellen die größte Gruppe aktiver Ionentransporter in Zellen dar. Es handelt sich bei den P-Typ-ATPasen um integrale Membranproteine, die eine große Anzahl verschiedenster Ionen aktiv über eine biologische Membran transportieren. Die für diesen Ionentransport notwendige Energie wird durch Bindung und Hydrolyse von Adenosintriphosphat (ATP) und durch Phosphorylierung des Enzyms gewonnen. Diese, im cytoplasmatischen Teil gewonnene Energie, muss für den Ionentransport von der Phosphorylierungsstelle zur räumlich entfernten transmembranen Ionenbindungsstelle übertragen werden, bei dem das Protein einem Reaktionszyklus mit zwei Hauptkonformationszuständen E1 und E2 unterliegt. Zwischen diesen beiden Zuständen finden große strukturelle Änderungen statt, durch die die Ionenaffintät und die Zugänglichkeit der Ionenbindungsstelle reguliert wird. Da dieser Mechanismus der Energiegewinnung für alle Ionenpumpen dieser Art ähnlich ist, wurde die Ca2+-ATPase und die Na+/K+-ATPase als Modellproteine für die Untersuchung molekularer Mechanismen in P-Typ-ATPasen ausgewählt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit soll die Energietransduktion in P-Typ-ATPasen im Allgemeinen und der Protonengegentransport bzw. ein potentieller Protonentransportweg in der Ca2+-ATPase im Speziellen untersucht werden. Die beiden oben genannten Mechanismen sollen mittels computergestützter Methoden analysiert werden. Vor allem die Ca2+-ATPase ist prädestiniert für computergestützte Untersuchungen, da für diese sehr viele hochaufgelöste Röntgenstrukturdaten vorliegen, wenn auch bisher aufgrund der Größe und Komplexität des Systems nur sehr wenige theoretische Arbeiten durchgeführt wurden. Um den Energietransduktionsmechanismus in P-Typ-ATPasen zu untersuchen, wurde mittels Elektrostatik-Rechnungen der Einfluss eines elektrischen Feldes auf die verschiedenen Transmembranhelices untersucht. Dazu wurde ein Simulationssystem entwickelt, welches aus einem molekularen Kondensator besteht, der im Modell das Anlegen eines homogenen elektrischen Feldes über den Transmembranbereich simuliert. Da es sich bei dem Energietransduktionsmechanismus um einen dynamischen Prozess handelt, wurden die Elektrostatik-Rechnungen um Molekulardynamik-Simulationen erweitert. Mit diesen kann die konformelle Dynamik der P-Typ-ATPasen während der Energietransduktion in die Elektrostatik-Rechnungen einbezogen werden. Aus Spannungsklemmen-Fluorometrie-Experimenten, bei denen eine Spannung über eine Membran angelegt wird, kann geschlossen werden, dass die Helix M5 für die Energietransduktion verantwortlich ist. Mit den in dieser Arbeit durchgeführten Elektrostatik-Rechnungen konnte für verschiedene Enzymzustände der Ca2+-ATPase und für die Na+/K+-ATPase gezeigt werden, dass die Helix M5 die größten Konformeränderungen aufgrund des elektrischen Feldes aufweist. Durch die Erweiterung der Elektrostatik-Rechnungen um die Methode der Molekulardynamik-Simulation konnte zusätzlich die elektrische Feldstärke reduziert werden. Auch dabei zeigte sich, dass auf der Helix M5 die meisten Rotameränderungen durch das elektrische Feld induziert werden. Die aus Experimenten vermutete Rolle der Helix M5 als wichtiges Energietransduktionselement ließ sich mit diesen Simulationsrechnungen bestätigen. Um einen möglichen Protonenweg durch den Transmembranbereich der Ca2+-ATPase aufzuklären, wurden explizite Wassermoleküle in sechs verschiedene Enzymzustände der Ca2+-ATPase eingefügt. Aus Experimenten ist bekannt, dass in der Ca2+-ATPase ein Protonengegentransport stattfindet. Deshalb wurden für verschiedene Enzymzustände der Ca2+-ATPase mittels Elektrostatik-Rechnungen die Protonierungen der eingefügten Wassermoleküle sowie der titrierbaren Aminosäuren bestimmt. Aus den Ergebnissen dieser Rechnungen kann geschlossen werden, dass es sich bei dem Protonentransfer nicht um einen linearen Transport der Protonen handelt. Die Untersuchungen zeigen einen mehrstufigen Prozess, an dem Protonen in verschiedenen Transmembranbereichen der Ca2+-ATPase beteiligt sind. Anhand der berechneten Protonierungszustände der eingefügten Wassermoleküle und der pK-Werte der Aminosäuren im Transmembranbereich konnte weiterhin ein möglicher Protonenweg identifiziert werden.
A detailed understanding of how potassium channels function is crucial e. g. for the development of drugs, which could lead to novel therapeutic concepts for diseases ranging from diabetes to cardiac abnormalities. An improved understanding of channel structure may allow researchers to design medication that can restore proper function of these channels. This is particularly important for KCNQ channels, since four out of five family members are involved in human inherited disease. In addition to structure and function relationships the determinants which govern assembly of KCNQ subunits are decisive to understand the physiological role of the KCNQ channel family members. Many details of KCNQ channel assembly remain incompletely understood. Previous work has shown that the subunit-specific heteromerisation between KCNQ subunits is determined by a ~115 amino acid-long subunit interaction domain (si) within the C-terminus (Schwake et al., 2003). Recently, Jenke et al. (2003) proposed that the C-terminal domains in eag and erg K+ channels act as sites which drive tetramerization. From their ability to form coiled coils, these domains were referred to as tetramerizing coiled-coil (TCC) sequences. Jenke et al. also pointed out that KCNQ channels contain bipartite TCC motifs within their C-termini, exactly within the si domain, which is responsible for the subunit-specific interaction pattern. The first part of this thesis was dedicated to determine the individual role of these TCC domains on homomeric and heteromeric channel formation in order to further characterize the molecular determinants of KCNQ channel assembly. In the second part of this thesis cystein-scanning mutagenesis was employed, followed by thiol-specific modification using MTS reagents to screen more than 20 residues in the S3-S4 linker region and in the S4 transmembrane domain of the KCNQ1 channel to gain information about residue accessibility, the functional effects of thiol-modifying reagents (MTSES), and effects of crosslinking selected pairs of Cys residues by Cd+ ions, which could be used for testing model predictions based upon known Kv channel structures from the literature. According to homology modelling based on the Kv1.2 structure it was attempted to determine the proximity of individual residues from different transmembrane segments using the metal bridge approach (crosslinking by Cd+ ions). This led us to derive structural constraints for interactions between the S4 voltage sensor and adjacent transmembrane segments of KCNQ1. Similar studies have previously been performed on the Shaker K+ channel, which has served as a paradigm for structure-function research of voltage-gated K+ channels for a long time, but little is known for KCNQ channels concerning their similarity to published K+ channel structures.
In der vorliegenden Arbeit wurden neue Interaktionspartner des einwärtsrektifizierenden, renalen ROMK-Kaliumkanals identifiziert und funktionell in Xenopus Oozyten untersucht. Zunächst wurde mit Hilfe eines modifizierten Hefe-Zwei-Hybrid-Systems und dem zytosolischen C-Terminus von ROMK als Köderprotein eine cDNS-Bibliothek der humanen Niere durchmustert. Eine Besonderheit hierbei war, daß das Köderprotein im Gegensatz zu dem herkömmlichen Hefe-Zwei-Hybrid-System in der nativen, tetrameren Konformation vorlag. Die Interaktion der isolierten Proteine mit dem ROMK-C-Terminus wurde anschließend in der Hefe in direkten Bindungsstudien bestätigt. Auf diese Weise konnten 25 neue Interaktionspartner für ROMK gefunden werden. Aufgrund ihrer teilweise bekannten Funktionen und Strukturen wurden einige, insbesondere das Golgi-Protein Golgin-160, das Adapterprotein GRB7 und die Serin/Threonin-Proteinphosphatase-Untereinheit PP2A B56β, für eine weitergehende Charakterisierung ausgewählt. Die vermutete Beteiligung von Golgin-160 am vesikulären Membrantransport machte die gefundene Interaktion mit ROMK besonders interessant, da über den Transport des Kanals vom Endoplasmatischen Retikulum über den Golgi-Apparat bis an die Zelloberfläche nur wenig bekannt ist. Zunächst konnte die Bindung von Golgin-160 an das ROMK Kanalprotein durch Koimmunpräzipitation beider Proteine aus Lysaten transfizierter Säugerzellen unterstützt werden. Immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen bestätigten weiterhin, daß beide Proteine tatsächlich und ausschließlich im Bereich des Golgi-Apparats kolokalisiert sind. Dies verstärkte die Vermutung, daß Golgin-160 am Membrantransport von ROMK beteiligt ist. Funktionelle Untersuchungen in Xenopus Oozyten mit Hilfe der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme ergaben nach Koexpression beider Proteine reproduzierbar eine Verdopplung der ROMK-Stromamplitude. Mittels einer Chemolumineszenz-Oberflächenexpressionsanalyse konnte dies auf eine Zunahme der Dichte des Kanalproteins in der Plasmamembran zurückgeführt werden. Ähnliche Resultate wurden auch für das nahe verwandte Kir2.1-Kanalprotein erhalten. Diese Untersuchungen zeigten zudem, daß nur das Kanalprotein an der Zelloberfläche, nicht aber die Gesamtmenge des Proteins in der Zelle erhöht war. Dementsprechend waren auch die biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften des ROMK-Kanals durch das koexprimierte Golgin-160 nicht verändert. Um die Bedeutung der gefundenen Interaktion näher zu untersuchen, wurden Bindungsstudien mit C-terminalen Bartter-Mutanten von ROMK durchgeführt. Alle untersuchten Punkt- und Trunkationsmutanten waren noch zur Bindung von Golgin-160 fähig, und zwei Punktmutanten konnten durch Golgin-160 auch funktionell stimuliert werden. Daraus kann geschlossen werden, daß diese hochkonservierten Aminosäurereste des Kanalproteins nicht an der Bindung von Golgin-160 beteiligt sind, und daß der defekte Membrantransport dieser krankheitsverursachenden Mutanten nicht auf einer gestörten Interaktion mit dem untersuchten Golgi-Protein beruht. Mit diesen Untersuchungen wurde erstmalig gezeigt, daß Golgin-160 am Golgi-Apparat selektiv mit transportierten Membranproteinen interagiert und dadurch deren Zelloberflächenexpression reguliert. Eine spezifische Rolle beim Transport von Oberflächenproteinen zur Plasmamembran wird durch das Ergebnis unterstrichen, daß auch die Oberflächenexpression der entfernt verwandten Kv1.5- und Kv4.3-Kanalproteine stimuliert wird, aber nicht die des HERGKaliumkanals. In weiteren funktionellen Untersuchungen konnten auch für GRB7 und PP2A B56β erstmalig Einflüsse auf die ROMK-Kanalaktivität gezeigt werden. Die Koexpression von GRB7 führte sowohl bei ROMK als auch bei verwandten Kir2-Kanalproteinen zu einer Verringerung der Stromamplitude. Bei PP2A B56β war der Effekt von der Expressionshöhe dieser regulatorischen Phosphatase- Untereinheit abhängig. So waren die ROMK-Ströme bei geringen Mengen an injizierter PP2A B56β erhöht, nach Injektion größerer Mengen dagegen reduziert. Die Regulation der ROMK-Kanalaktivität wird größtenteils durch die Kontrolle der Kanaldichte an der Zelloberfläche erzielt. Da unterschiedliche Signalwege die Häufigkeit des Kanalproteins an der Zelloberfläche modulieren können, kann vermutet werden, daß nicht nur Golgin-160 sondern auch GRB7 und PP2A B56β an der Regulation der Oberflächenexpression von ROMK beteiligt sind (Abb. 36). Die Identifizierung dieser neuen Interaktionspartner stellt deshalb einen ersten wichtigen Schritt bei der Aufklärung der dieser Regulation zugrundeliegenden molekularen Mechanismen dar.
In der vorliegenden Arbeit wurden festkörperunterstützte Membranen in Verbindung mit schnellen Lösungswechseln als Methode zur Messung von elektrogenen Transportvorgängen in biologischen Membranen untersucht und charakterisiert. Parallel zu einem manuellen Messsystem wurde eine Technologie auf der Basis eines Pipettierroboters mitentwickelt und charakterisiert, die es erlaubt, automatisierte Messungen mit erhöhtem Durchsatz durchzuführen. Die Sensoren wurden als Sensorarray auf der Basis einer standardisierten 96er Mikrotiterplatte realisiert. Zur Lösungshantierung kam ein Pipettierroboter zum Einsatz, der mit einer selbstentwickelten Injektionseinheit bestückt wurde. In dieser Injektionseinheit ließen sich die verwendeten Lösungen überschichten, wodurch ein Lösungswechsel von einer substratfreien zu einer substrathaltigen Lösung durchgeführt werden konnte. Mit dem beschriebenen System konnten die in dieser Arbeit behandeleten Proteine EAAC1 und NhaA erfolgreich aktiviert und charakterisiert werden. Hinsichtlich der Transportaktivität wurden mit beiden Proteinen vergleichbare Ergebnisse erzielt wie mit dem manuellen Messsystem. Aus kultivierten CHO-Zellen, die den neuronalen Glutamattransporter EAAC1 rekombinant und fuktional exprimierten, wurden EAAC1-haltigen Cytoplasmamembranen in einem Aufreinigungsschritt (Membranpräparation) gewonnen. Die derart vorliegenden Membranfragmente konnten erfolgreich auf der festkörperunterstützten Membran angelagert werden. In der Abwesenheit von Natriumionen war der EAAC1 nicht aktiv, und er konnte durch den spezifischen kompetitiven Inhibitor TBOA inhibiert werden (Inhibitionskonstante Ki = 1µM). Es wurde beobachtet, dass die Transportströme des EAAC1 in der Abwesenheit von Kaliumionen eine andere Kinetik aufwiesen als in der Anwesenheit von Kaliumionen, und die Affinität für L-Glutamat war in der Abwesenheit von Kaliumionen verringert (K0,5 = 144 µM). Analysen der Signalformen ergaben eine reduzierte Relokationsrate, wobei es wahrscheinlich ist, dass der EAAC1 ohne Kaliumionen einen Single-Turnover durchführt. Eine weitere Eigenschaft des EAAC1 ist die Fähigkeit, bestimmte Anionen zu leiten. Diese Anionenleitfähigkeit ist strikt Natriumabhängig und wird durch die Bindung von L-Glutamat getriggert. Wenn bei einem Experiment zusätzlich bestimmte Anionen (z.B. Chlorid oder Thiocyanat) anwesend waren, wies der Transportstrom des EAAC1 in der Abwesenheit von Kaliumionen eine negative Komponente auf. Diese Komponente konnte auf den Einstrom der Anionen entlang des durch den Glutamattransport aufgebauten elektrischen Gradienten zurückgeführt werden. Des Weiteren konnte die Anionenleitfähigkeit mit Anionensprüngen in der Anwesenheit von L-Glutamat und Natriumionen direkt induziert werden. Damit wurden erstmals kanalartige Ionenströme an der festkörperunterstützten Membran nachgewiesen. Der Anionenstrom wies dabei die gleiche Abhängigkeit von der Glutamatkonzentration auf (K0,5 = 31 µM) wie der Transportstrom. Der Übergang in den leitfähigen Zustand und der Transport hängt demnach von dem gleichen L-glutamatgebundenen Zustand des EAAC1 ab. Dies konnte auch unter Verwendung des Inhibitors HIP-B gezeigt werden. HIP-B wurde erstmals an EAAC1 getestet und wies eine Inhibitionswirkung auf den Transportstrom auf, die nicht auf eine kompetitive Bindung zurückzuführen war. Die Anionenleitfähigkeit ließ sich mit HIP-B hingegen nicht inhibieren. Der bakterielle Natrium-Protonen-Austauscher NhaA lag rekonstituiert in Liposomen vor, die auf der festkörperunterstützten Membran angelagert wurden. Bedingt durch die RSO-Orientierung des NhaA, konnte der Natriumtransport entgegen der natürlichen Transportrichtung (extrazelluläre Natriumbindung) untersucht werden. Der Transportstrom wies eine ausgeprägte Abhängigkeit vom pH-Wert auf. Bei neutralen bzw. sauren pH-Werten (pH <= 7) war die Aktivität des NhaA gegenüber dem alkalischen Bereich (7 < pH < 9) erheblich reduziert. Dieses Verhalten entspricht Literaturangaben für die Intrazellulärseite des NhaA. Dennoch war der NhaA bei einem neutralen pH-Wert nicht vollständig inaktiv. Die Affinität für Natriumionen konnte bei einem pH-Wert von 8,5 zu K0,5 = 11 mM und bei pH 7,0 zu K0,5 = 180 mM bestimmt werden. Neben einer Verringerung der Wechselzahl sinkt im neutralen/sauren Bereich also auch die Affinität für Natriumionen. Durch die Verwendung von Liposomen, in denen der NhaA mit verschiedenen Lipid- zu Protein-Verhältnissen rekonstituiert wurde, konnte gezeigt werden, dass die Messströme auf die Aufladung der Liposomen zurückführbar sind. Der Transportstrom konnte mit der amiloridähnlichen Substanz 2-Aminoperimidin inhibiert werden (Ki = 3 µM). Eine Inhibitionswirkung war nur zu beobachten, wenn der pH-Wert kleiner als pH 8 war. Zusammmen mit der ausgeprägten pH-Wertabhängigkeit kann dieses Phänomen auf eine pH-induzierte Konformationsänderung des NhaA zurückgeführt werden.
Im Hauptteil der Dissertation wird die Expression und Lokalisation organellärer und synaptischer Proteine in Astrocyten der transgenen PGFAPEGFP-Maus, die unter der Kontrolle des GFAP-Promotors EGFP exprimiert, analysiert. Zum einen wird ein grundlegender Vergleich der Expression synaptischer Proteine in kultivierten Astrocyten der Ratte und der PGFAPEGFP-Maus angestellt, zum anderen werden Kulturdauer- und Altersabhängigkeit der Expression untersucht. Des weiteren wird die Expression organellärer und synaptischer Proteine in Astrocyten der PGFAPEGFP-MauS in situ überprüft. Die immuncytologischen Untersuchungen zeigten zum einen die Expression und organelläre Lokalisation der synaptischen Proteine SNAP-25, SV2, VAMP2 und Synaptophysin in Astrocyten der transgenen PGFAPEGFP-Maus, zum anderen einen kulturdauerabhängigen Rückgang der Expression von SNAP-25, wie er für kultivierte Astrocyten aus Neopallia der Ratte beschrieben ist. Des weiteren wird festgestellt, dass die Expression organellärer und synaptischer Proteine in kultivierten Astrocyten der PGFAPEGFP-Maus keine Eigenschaft undifferenzierter Astrocyten oder Vorläuferzellen ist. Eine vergleichbare Expression solcher Proteine findet sich in astroglialen Primärkulturen, die aus den Gehirnen unterschiedlich alter Tiere gewonnen worden waren. In der vorliegenden Arbeit gelingt erstmals der Nachweis der Expression und organellären Lokalisation verschiedener organellärer und synaptischer Proteine (SNAP-23, SNAP-25, Synaptophysin, Cellubrevin, SCAMP, vATPase) in Astrocyten in situ. Dieser Befund birgt weitreichende Implikationen bezüglich der in der glialen Signalübertragung und bidirektionalen Kommunikation mit Neuronen verwendeten zellulären Mechanismen in sich. Aufgrund des proteinären Repertoires erscheint es möglich, dass Astrocyten in situ eine mit Neuronen vergleichbare molekulare Maschinerie zur regulierten exocytotischen Freisetzung besitzen. Ein weiterer Teil der Arbeit stellt die Expression und Calcium-abhängige Freisetzung des modulatorischen Neuropeptids Secretogranin II aus U373MG Astrocytoma-Zellen dar. Dieser Zelltyp wird als mögliches Modellsystem für kultivierte hippocampale Astrocyten vorgeschlagen.
A solid-supported membrane (SSM) is an alkanethiol/lipid hybrid membrane with comparable lipid mobility, conductivity, and capacitance than a black lipid membrane (BLM). However, mechanical perturbations, which usually destroy a BLM, do not influence the life-time of a SSM, which is mechanically so stable that solutions may be rapidly exchanged at its surface. This key property has been utilized in this thesis to characterize electrophysiologically two bacterial secondary active transporters (MelB and LacY) as well as to investigate the specific interactions between ions and lipid membranes. These three different projects are summarized below: (1) The properties of lipid membranes, which represent the most important biological interface between intracellular and extracellular compartments, are essentially modulated by the ionic composition of the surrounding aqueous medium. To investigate specific interactions between ions and lipid membranes, solutions of different ionic composition were exchanged at the surface of a SSM through a flow system. This solution exchange resulted in charge translocations that were interpreted in terms of binding of the ions to the lipid headgroups at the SSM surface. We found that chaotropic anions and kosmotropic cations are attracted to the membrane independent of the membrane composition. In particular, the same behaviour was found for lipid headgroups bearing no charge like monoolein. This general trend is modulated by the electrostatic interaction of the ions with the lipid headgroup charge. Our experimental results are in agreement with recent molecular dynamic simulations of PC membranes. (2) Rapid solution exchange on a solid-supported membrane (SSM) is investigated using fluidic structures and a solid-supported membrane in a wall jet geometry. The flow was analyzed with a new technique based on specific ion interactions with the surface combined with an electrical measurement. The critical parameters affecting the time course of the solution exchange and the transfer function describing the time resolution of the SSM system were determined. The experimental data indicate that the solution transport follows a plug flow geometry while the rise of the surface concentration can be approximated by Hagen Poiseuille flow with ideal mixing at the surface of the SSM. Using an improved cuvette design a solution exchange as fast as 2 ms was achieved at the surface of a solid supported membrane. As an application of the technique the rate constant of a fast electrogenic reaction in the melibiose permease MelB, a bacterial (Escherichia coli) sugar transporter, is determined. For comparison, the kinetics of a conformational transition of the same transporter was measured using stopped-flow tryptophan fluorescence spectroscopy. The relaxation time constant obtained for the charge displacement agrees with that determined in the stopped-flow experiments. This supports the previous proposition that upon sugar binding MelB undergoes an electrogenic conformational transition with a rate constant of k ~ 250 s-1. (3) Electrogenic events due to activity of wild-type lactose permease from Escherichia coli (LacY) were investigated with proteoliposomes containing purified LacY adsorbed on a solid-supported membrane electrode. Downhill sugar/H+ symport into the proteoliposomes generates transient currents. Studies at different lipid to protein ratios and at different pH values, as well as inactivation by N-ethylmaleimide, show that the currents are due specifically to the activity of LacY. From analysis of the currents under different conditions and comparison with biochemical data, it is apparent that the predominant electrogenic event in downhill sugar/H+ symport is H+ release. In contrast, LacY mutants E325A and C154G, which bind ligand normally but are severely defective with respect to lactose/H+ symport, exhibit a minor electrogenic event upon addition of LacY-specific substrates, representing only 6% of the total charge displacement of the wild-type. This activity is due either to substrate binding per se or to a conformational transition following substrate binding. We propose that turnover of LacY involves at least two electrogenic reactions: (i) a minor reaction that occurs upon sugar binding and is due to a conformational transition in LacY; and (ii) a major reaction due to cytoplasmic release of H+ during downhill sugar/H+ symport, which is the limiting step for this mode of transport.
Zusammenfassung Die Alzheimersche Krankheit (AD) ist mit 60% die am häufigsten auftretende Art der Demenz. Weltweit sind ca. 24 Mio. Menschen von der neurodegenerativen Krankheit betroffen, welche sich durch den Verlust der kognitiven Fähigkeiten auszeichnet. Es gibt zwei Ausprägungen der Demenz, zum einen die sporadische Verlaufsform, die bei Menschen in einem Alter ab 65 Jahren auftritt und zum anderen die familiäre Alzheimersche Krankheit (FAD), die schon weitaus jüngere Menschen betrifft und auf genetische Mutationen zurück zu führen ist. Beide Formen der Demenz zeigen den gleichen neuropathologische Phänotyp, der zur Ausbildung von extrazellulären Plaques und intrazellulären Neurofibrillen führt. Durch die Entstehung der Plaques und der Neurofibrillen werden die Verbindungen zwischen den einzelnen Neuronen verringert und die Neuronen sterben ab. Für das Auftreten der FAD sind Mutationen in den Genen des Amyloid Vorläufer Proteins (APP, Substrat) sowie der Aspartatprotease Einheit des γ-Sekretase Komplexes, Presenilin 1 (PS1) oder Presenilin 2 (PS2), verantwortlich. Die γ-Sekretase ist ein membranständiger Komplex bestehend aus den vier Untereinheiten PS1 oder PS2, Nicastrin (Nct), Aph-1 und Pen-2. Um ausreichende Informationen über den γ-Sekretase Komplex bezüglich seiner Interaktionsflächen, seines Katalysemechanismus und seiner Substraterkennung zu erhalten, wäre es hilfreich seine 3 Dimensionale Struktur aufzuklären, wozu große Mengen der sauberen und homogenen Proteine benötigt werden. Die Herstellung von ausreichenden Proteinmengen stellt derzeit aber einen Engpass für die strukturelle und funktionelle Charakterisierung des γ-Sekretase Komplexes in-vitro dar. Alzheimer’s disease (AD) is the most common cause of dementia, which affects 24 million people worldwide. It is a neurodegenerative disorder, which occurs either in its most common form in people over 65 years or in the rare early-onset familial AD (FAD). Responsible for the autosomal dominant FAD are mutations in the genes encoding for the β-amyloid precursor protein (APP) and the two homologues integral membrane proteins Presenilin 1 (PS1) and Presenilin 2 (PS2). The two PSs are major but alternative components of the intramembrane aspartyl protease γ-secretase. Further components are the membrane proteins Nicastrin (Nct), Aph-1 and Pen-2. Production of sufficient amounts of protein samples is still the major bottleneck for the detailed functional and structural in-vitro characterization of the γ-secretase complex. Due to toxicity, stability and targeting problems, the overproduction of MPs in conventional in-vivo systems often has only limited success. Therefore, efficient expression protocols using the cell-free (CF) system were established in this work. After optimization, I was able to produce up to milligram amounts of the single proteins PS1 and PS2, the cleavage products PS1-NTF and PS1-CTF, and Pen-2. The in-vitro produced γ-secretase subunits were further characterized, concerning their purity, secondary fold, thermal stability and homogeneity. Highest purities with over 90% after affinity chromatography could be achieved for PS1-CTF and Pen-2. Reconstitution of PS1, PS1-NTF, PS1-CTF and Pen-2 into E. coli liposomes results in a homogeneously distribution, which gives evidence for a structural folding. This was confirmed by CD spectroscopy of PS1-CTF and Pen-2. The thermal stability of Pen-2 shows a transition at 68°C, whereas PS1-CTF is stable up to 95°C. Both proteins show in addition homogeneous elution profiles investigated by analytical SEC and exhibit a monomeric (Pen-2) or dimeric (PS1-CTF) character analyzed by blue native PAGE. Different methods were performed to get evidence about the assembly of the complex, like pull-down experiments, immunoprecipitation, co-expression of radioactive labeled subunits and titration assays by liquid-state NMR. First hints for an interaction of the CF synthesized proteins could be observed by co-expression. Supplemental, Pen-2 and CTF could be purified in sufficient amounts and to apparent homogeneity that allow structural approaches by X-ray crystallography and liquid-state NMR spectroscopy. First conditions for protein crystals were achieved for Pen-2 and structural investigations of PS1-CTF by liquid-state NMR could be performed after optimization of the expression-, purification- and detergent conditions.