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NP25 wurde im Jahre 1994 als ein in allen Bereichen des zentralen Nervensystems Neuron-spezifisch exprimiertes Gen in der adulten Ratte identifiziert (Ren et al., 1994). Durch eigene Vorarbeiten konnte diese selektive neuronale Expression im Huhnembryo bestätigt werden, wobei die Expression von NP25 im Neuralrohr, den sympathischen paravertebralen Ganglien und sensorischen Hinterwurzelganglien vor der terminalen Differenzierung und Scg10-Expresison beginnt (M.Pape, Diplomarbeit, 2003). In dieser Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass NP25 in diesen Geweben nach den proneuralen Faktoren Ascl1 und Ngn2 exprimiert wird, zu einem Zeitpunkt an dem die Vorläuferzellen mit der Differenzierung beginnen. Im Neuralrohr beginnt die Expression von NP25 zeitgleich mit der Expression von NeuroM, einem der frühesten Marker für junge, postmitotische differenzierende Neurone (Roztocil et al., 1997). NP25 stellt somit einen der frühesten panneuronalen Marker für differenzierende Neurone dar. Das NP25-Protein ist in den Zellkörpern und Fortsätzen der Neurone im Neuralrohr und den untersuchten peripheren Ganglien lokalisiert, wobei die Fasern der Motoneurone, im Gegensatz zu deren Zellkörpern, NP25-negativ sind. Mit voranschreitender Differenzierung nimmt die NP25- Proteinkonzentration ähnlich wie die Expression auf mRNA-Ebene ab, wobei in den peripheren Ganglien NP25 über einen längeren Zeitraum hinweg auf hohem Niveau exprimiert wird. Kultivierte Neurone aus sensorischen Hinterwurzelganglien und sympathische Neurone der paravertebralen Ganglien zeigen eine Lokalisation des NP25-Proteins im Zytoplasma der Zellkörper und Fortsätze, wobei NP25 in den sympathischen Neuronen wesentlich stärker exprimiert wird. Dieser Befund konnte durch die Analyse der Proteinkonzentration mit Hilfe der Western Blot Methode bestätigt werden. Die Überexpression von NP25 in verschiedenen Zelltypen führte zu verstärktem oder reduzierten Neuritenauswachsen, wobei die Effekte mit dem NP25-Niveau korrelieren. Zellen mit einem geringen endogenen NP25-Expressionsniveau, wie sensorische Neurone aus fünf Tage alten Huhnembryonen und PC12-Zellen, reagieren auf die Erhöhung des NP25-Gehalts mit verstärktem Längenwachstum der Neuriten, während sympathische Neurone aus sieben Tage alten Huhnembryonen, die ein hohes endogenes Expressionsniveau aufweisen, reduziertes Längenwachstum und reduzierte Verzweigungskapazität zeigen. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass maximales Neuritenwachstum eine optimale NP25-Konzentration erfordert, wobei im Falle der Überexpression von NP25 in den sympathischen Neuronen das Optimum überschritten wird und dadurch Neuritenauswachsen und Verzweigung inhibiert werden. Die Effekte auf das Längenwachstum der Neuriten in den primären Neuronen konnten durch RNAi Experimente bestätigt werden. Neben dem Längenwachstum war auch das initiale Auswachsen von Fortsätzen durch die Veränderung des NP25-Expressionsniveaus betroffen. Im Falle der PC12-Zellen induzierte die NP25-Überexpression nicht nur Längenwachstum der Neuriten, sondern auch die Zahl der Fortsätze pro Zelle wurde erhöht. In den sympathischen Neuronen, in denen durch NP25- Überexpression das Längenwachstum und die Verzweigungskapazität negativ reguliert werden, nimmt die Anzahl der Neuriten pro Zellen nach Erniedrigung des NP25-Expressionsniveaus ebenfalls ab. Dies kann dadurch erklärt werden, dass Längenwachstum und initiales Auswachsen von Neuriten durch unterschiedliche Mechanismen reguliert werden (Glebova and Ginty, 2005; Luo, 2002), was hier möglicherweise dazu führt, dass Längenwachstum negativ und initiales Auswachsen positiv durch NP25 beeinflusst wird. In den sensorischen Neurone führte weder die Erhöhung noch die Erniedrigung des NP25-Expressionsniveaus zu einer Veränderung des initialen Auswachsens, was eine differentielle Regulation der Prozesse bestätigt. Da viele Mitglieder der CaP-Proteinfamilie mit F-Aktin interagieren (Gimona et al., 2002) wurde untersucht, ob NP25 und F-Aktin in kultivierten sympathischen und sensorischen Neuronen und in PC12-Zellen kolokalisieren. In den primären Neuronen wurde im Gegensatz zu der Situation in den PC12-Zellen keine Kolokalisation beobachtet, wobei NP25 und F-Aktin in den PC12-Zellen nur in kleinen Bereichen an den distalen Enden filopodienartiger Fortsätze kolokalisieren. Auch eine Interaktion von NP25 und G-Aktin konnte in den PC-Zellen ausgeschlossen werden. Durch die Identifikation zweier RhoGAP-Proteine (NIRGAP1 und 2) als potentielle Interaktionpartner (M.Geissen, nicht publiziert) könnte NP25 Neuritenauswachsen durch indirekte Beeinflussung des Aktinzytoskeletts über Rho-Signalwege regulieren. Die identifizierten RhoGAPs konnten durch in situ Hybridisierung im Rückenmark, in den Hinterwurzelganglien und den sympathischen paravertebralen Ganglien im Rattenembryo nachgewiesen werden. Sie gehören zu keiner bekannten Familie und unterscheiden sich auch strukturell von den meisten bisher beschriebenen RhoGAPs, da sie mehr als eine (drei) GAP-Domänen enthalten. Durch diesen Befund ergeben sich neue Ansätze für die weiteren Untersuchungen zur Regulation des Neuritenwachstums durch NP25. Da im adulten Nervensystem für NP25 eine Funktion in der Dynamik der Dendriten angenommen wird, sind Untersuchungen der Dendritenausbildung in vitro ebenfalls nahe liegend.
Die Zuckertransporterfamilie ist eine Unterfamilie der MFS („major facilitator superfamily“), wobei die MFS wiederum als Überfamilie von Transportproteinen definiert wurde, die sich aus Proteinen mit 12 Transmembran-Domänen zusammensetzt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollte die subzelluläre Lokalisation und physiologische Funktion der uncharakterisierten Mitglieder der Zuckertransporterfamilie Ybr241 und Ygl104 untersucht werden. Mittels Zellfraktionierung durch Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation und Fluoreszenzmikroskopie konnte eine Lokalisation von Ybr241 und Ygl104 in der vakuolären Membran festgestellt werden. Da Plasmamembran-Proteine zur Degradation ubiquitiniert, über Endocytose internalisiert und in der Vakuole abgebaut werden, wurden weitere Lokalisationsstudien sowohl in Endocytose-Mutanten als auch in einer Mutante mit Defekten in der Ubiquitinierung durchgeführt. Diese ergaben, daß die vakuoläre Lokalisation nicht auf Degradation zurückzuführen war. Somit handelt es sich bei Ybr241 und Ygl104 um residente vakuoläre Membranproteine. Lokalisationsstudien in vps-Mutanten erbrachten Hinweise darauf, daß zumindest Ygl104, wie die meisten vakuolären Proteine, über den CPY-Weg zur Vakuole befördert wird. Weder durch Wachstumsanalysen noch mit Hilfe von Phenotype MicroArrays™ (Biolog, Inc.) konnten Phänotypen der Deletionsmutanten von Ybr241 und Ygl104 identifiziert werden. Allerdings zeigte sich im Verlauf der Arbeit, daß die Deletionsmutanten einen Vorteil beim Wachstum mit geringen Glucosekonzentrationen bei 37°C haben. Des weiteren bestanden aufgrund von Datenbankanalysen Anhaltspunkte auf eine Beteiligung am Trehalosestoffwechsel. Durch Hitzeschockexperimente konnte eine essentielle Rolle von Ybr241 und Ygl104 bei der Resistenz von Zellen gegenüber schwerem Hitzestreß identifiziert werden. Die verminderte Thermotoleranz der Deletionsmutanten war aber nicht auf einen geringeren Gehalt der Zellen am Streßschutzmolekül Trehalose zurückzuführen. Zudem deckte ein SGA („synthetic genetic array“) eine synthetisch kranke Interaktion von YBR241C und YGL104C mit dem Gen der Trehalose-6-Phosphat-Synthase TPS1 auf. Diese Interaktion sprach gegen eine Beteiligung der Genprodukte am Trehalosestransport, da tps1-Mutanten keine Trehalose enthalten. tps1-Mutanten haben einen Wachstumsdefekt mit schnell fermentierbaren Kohlenstoffquellen, der höchstwahrscheinlich auf einen Mangel an freiem Phosphat zurückzuführen ist. Somit scheinen die Proteine Ybr241 und Ygl104 die intrazelluläre Phosphatkonzentration zu beeinflussen. Eine Analyse ergab, daß der Phosphat- und Polyphosphatgehalt der Mutanten teilweise stark herabgesetzt war. Der Einfluß könnte direkt durch Phosphatimport in die Vakuole stattfinden oder sekundär über eine Verminderung der Glycerinproduktion, da durch die Synthese von Glycerin wieder Phosphat freigesetzt wird. Somit handelt es sich bei Ybr241 und Ygl104 möglicherweise um vakuoläre Phosphat- oder Glycerintransporter. Ferner konnte gezeigt werden, daß die saure Trehalase Ath1 sekretiert wird und Trehalose extrazellulär in Glucose hydrolysiert. Die Glucosemoleküle werden dann von der Hefezelle aufgenommen und verstoffwechselt. Somit spielt Ath1 eine essentielle Rolle beim Wachstum der Hefe mit Trehalose als Kohlenstoffquelle. Ziel des zweiten Teils dieser Doktorarbeit war die Entwicklung eines genomweiten Screens nach ER-Verpackungschaperonen, durch den bisher unbekannte Verpackungschaperone identifiziert werden sollten. Durch Testen verschiedener Varianten des Screens konnte ein Verfahren entwickelt werden, das prinzipiell funktionierte. Für den Einsatz im genomweiten Maßstab war es jedoch ungeeignet, da mit einer hohen Rate an falsch negativen Ergebnissen zu rechnen gewesen wäre.
1. Halobacillus halophilus akkumuliert zum Ausgleich geringer, extrazellulärer Wasserpotentiale kompatible Solute. Bei Anzuchten in Gegenwart von 0,4 – 1,5 M NaCl wurden Glutamin und Glutamat als die dominierenden kompatiblen Solute identifiziert, während zwischen 2,0 und 3,0 M NaCl Prolin das dominierende Solut darstellt. Außerdem wurde Ectoin als zweites kompatibles Solut gefunden, das spezifisch bei hohen Salzgehalten akumuliert wird. Die Konzentrationen während der exponentiellen Wachstumsphase war jedoch um den Faktor 6 – 7 geringer im Vergleich zu Prolin. 2. Aus Wachstumsexperimenten in Gegenwart unterschiedlicher Anionen war bekannt, dass Glutamat, im Gegensatz zu Gluconat und Nitrat, in der Lage ist, das Wachstum von H. halophilus auch in Abwesenheit von Chlorid zu ermöglichen. Um der Frage nachzugehen, ob die wachstumsfördernde Wirkung von unphysiologisch hohen Glutamat-Konzentrationen im Medium auf die Verwendung von Glutamat als kompatiblem Solut in den Zellen zurückzuführen ist, wurden Gesamtsolutepools von Chlorid-, Nitrat-, Gluconat- und Glutamat-gezogenen Zellen gemessen. In NaCl-gezogenen Zellen zeigte sich Glutamat als dominantes Solut, während Prolin und Glutamin einen geringeren Teil am Gesamtpool ausmachten. In Nitrat-gezogenen Zellen betrug der Gesamtpool nur noch 83% und in Gluconat-gezogenen Zellen nur noch 27% im Vergleich zu Chlorid-gezogenen Zellen. Zellen, die mit Glutamat gezogen wurden, zeigten jedoch eine Gesamtkonzentration an Soluten, die ca. 100% über dem Vergleichswert aus Chlorid-gezogenen Zellen lag. Die Konzentration an Glutamin in den Zellen stieg dabei um 168%, die Konzentration an Glutamat sogar um 299%. Die Prolinkonzentration verringerte sich um 32%. Diese Daten belegen, dass der wachstumsstimulierende Effekt von Glutamat auf die Verwendung als kompatibles Solut zurückzuführen ist. 3. Zur Untersuchung der molekularen Grundlage der Salzadaptation sowie der Abhängigkeit von Chlorid in H. halophilus wurde in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Prof. D. Oesterhelt (MPI für Biochemie, Martinsried) die Sequenzierung des Genoms begonnen. Das Projekt ist zur Zeit noch nicht abgeschlossen und befindet sich in der „Lückenschluß-Phase“. Die bisherigen Sequenzdaten konnten dennoch für die in dieser Arbeit beschriebenen Untersuchungen herangezogen werden. Das Genom besitzt eine Größe von ca. 4,1 Mbp mit einem ungefähren GC-Gehalt von 40%. Außerdem wurden 2 Plasmide identifiziert mit einer Größe von 16047 und 3329 bp. 4. Die Schlüsselgene bekannter Biosynthesewege für Glutamin und Glutamat konnten identifiziert werden. Darunter befinden sich zwei Isogene für eine Glutamatdehydrogenase (gdh1 und gdh2), ein Gen für die große Untereinheit einer Glutamatsynthase (gltA), zwei Gene für die kleine Untereinheit einer Glutamat-Synthase (gltB1 und gltB2) und zwei Isogene für eine Glutaminsynthetase (glnA1 und glnA2). glnA1 befindet sich in einem Cluster zusammen mit einem Gen, das für einen Regulator kodiert (glnR), wie er auch aus B. subtilis bekannt ist. Über reverse Transkription von mRNA und anschließender PCR-Analyse konnte gezeigt werden, dass sowohl gltA/gltB1 als auch glnA1/glnR in einem Operon organisiert sind. 5. Wurde die Transkriptmenge der in Punkt 4 erwähnten Biosynthesegene in Zellen quantifiziert, die in Gegenwart unterschiedlicher Salzkonzentrationen (0,4 – 3,0 M NaCl) gezogen wurden, so zeigte sich keine Abhängigkeit von der Salzkonzentration für die Gene gltA, glnA1 und gdh1. Über die Transkriptmengen von gdh2 ließ sich keine abschließende Aussage treffen, da die gefundenen Transkriptmengen sehr gering waren und daher zu sehr großen Varianzen bei der Quantifizierung führten. Eine klare Abhängigkeit der Transkriptmenge von der im Medium zugesetzten Salzkonzentration konnte für glnA2 gezeigt werden. Die glnA2 mRNA-Menge stieg dabei mit steigender Salzkonzentration an und erreichte bei 1,5 – 2.0 M NaCl ein Maximum. Bei diesen Salzkonzentrationen war die Menge an mRNA ca. 4 mal höher als der Vergleichswert bei 0,4 M NaCl. Bei höhern Salzkonzentrationen sank die Menge an Transkript wieder leicht und war dann ca. nur noch 3 mal so hoch wie bei 0,4 M NaCl. 6. Die zelluläre Konzentration der glnA2-Transkripte in Abhängigkeit unterschiedlicher Anionen im Anzuchtmedium wurde untersucht. Die Quantifizierung der glnA2–mRNA ergab eine 2 mal höhere Transkriptmenge in Gegenwart von Chlorid verglichen mit Nitrat oder Gluconat. 7. Es wurde nach Enzymaktivitäten der bekannten Schlüsselenzyme im Glutamat und Glutamin-Biosyntheseweg gesucht. Eine Glutamatdehydrogenase und eine Glutamatsynthase – Aktivität konnte nicht oder nur in vernachlässigbarem Maße nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu konnt eine Glutaminsynthetase – Aktivität eindeutig belegt werden. Diese Aktivität erwies sich abhängig von der Art und der Konzentration des angebotenen Anions im Medium. Maximale Aktivitäten wurden mit NaCl in einer Konzentration von 2,5 – 3,0 M erreicht. Interessanterweise erwies sich die Glutaminsynthetase – Aktivität auch abhängig von der Art des im Testpuffers verwendeten Anions. Hier zeigte sich eine deutliche Stimulierung der Aktivität durch das Anion Chlorid. [Die für diesen Punkt zugrunde liegenden Daten wurden im Rahmen einer von mir mitbetreuten Diplomarbeit von Jasmin F. Sydow erhoben und sind aus Gründen der vollständigen Darstellung des Projektverlaufes mitaufgeführt!] 8. Wie im Punkt 1 dargelegt, wird Prolin vor allem bei hohen Salzkonzentrationen in H. halophilus - Zellen akkumuliert. Neben der Abhängigkeit von der Salzkonzentration wurde außerdem die Abhängigkeit von der Wachstumsphase untersucht. Die Analyse der Prolinkonzentrationen während verschiedener Wachstumsphasen in Kulturen, die bei 1,0 bzw. 2,5 M NaCl angezogen wurden, zeigte, (i) dass die Prolinkonzentration während der frühen exponentiellen Phase ca. 2,5-fach erhöht war im Vergleich zu Niedrigsalz-Zellen, (ii) dass die Prolinkonzentration beim Übergang von der frühen in die späte exponentielle Phase dramatisch abnahm (um 64% bei 2,5 M NaCl) und dass (iii) in der stationären Phase Prolin praktisch nicht mehr nachzuweisen war. 9. Die Biosynthesegene für die Herstellung von Prolin aus Glutamat konnten im Genom von H. halophilus identifiziert werden. Es handelt sich dabei um ein Cluster von 3 Genen, die für eine putative Pyrrolin-5-carboxylatreductase (proH), eine Glutamat-5-kinase (proJ), und eine Glutamat-5-semialdehyd-dehydrogenase (proA) kodieren. Mittels reverser Transkription von mRNA und anschließenden PCR-Analysen konnte gezeigt werden, dass die drei Gene ein Operon bilden. 10. Eine Quantifizierung der Transkriptmengen der Biosynthesegene proH, proJ und proA mittels quantitativer PCR in Zellen, die bei unterschiedlichen NaCl-Konzentrationen gezogen wurden, zeigte einen deutlichen Zusammenhang zwischen der Salinität des Mediums und der Menge an Transkript. Diese war umso höher, je höher die Salinität des Mediums war. Die maximale Transkriptmenge (6-fach) wurde bei einer Salzkonzentration von 2,5 M NaCl erreicht. Bei noch höherer Salzkonzentration sank die Transkriptmenge auf die ca. 5-fache Menge des Kontrollwertes ab. 11. Um die Regulation und Dynamik der Osmoregulation unabhängig vom Wachstum untersuchen zu können, wurde ein Zellsuspensions-System für H. halophilus etabliert, bei dem eine konzentrierte Zellsuspension direkt von geringen auf hohe Salzkonzentrationen überführt wurde und bei dem die Prozesse der Transkription, Translation und Solut-Biosynthese erhalten blieben. Beispielhaft wurde dieses System an der Produktion von Prolin nach einem Salzschock von 0,8 auf 2,0 M NaCl getestet. Es zeigte sich bei der Analyse, dass sich die Transkriptmengen unmittelbar nach dem Salzschock deutlich erhöhten und bereits nach 1,5 Stunden ein Maximum erreicht wurde. Verglichen mit dem Wert zu Beginn des Versuches waren die Transkriptmengen ca. 13-fach erhöht, sanken im weiteren Verlauf jedoch wieder ab und blieben bei einer 4-fachen Transkriptmenge konstant. Mit der Erhöhung der Transkriptmenge ging auch eine Erhöhung der Prolinkonzentration einher, die ein Maximum von ca. 6 μmol/mg Protein nach 6 Stunden erreichte. Auch diese Konzentration verringerte sich im weiteren Verlauf wieder und erreichte nach 20 Stunden den Ausgangswert. 12. Um den Einfluß diverser Anionen bzw. Osmolyte im Medium auf die Produktion von Prolin zu untersuchen, wurden Zellsuspensionen von H. halophilus einer Erhöhung der Osmolarität von 0,8 M auf 2,0 M unterzogen. Es zeigte sich dabei, dass die maximale Akkumulation von Prolin in Anwesenheit von Chlorid am höchsten war. Nitrat und Glutamat führten zu ähnlichen, aber leicht geringeren maximalen Konzentrationen (92 bzw. 83% des Chloridwertes). Gluconat führte noch zu einer Akkumulation von ca. 51%, während die anderen Osmolyte zu keiner Akkumulation führten. Eine Analyse der Transkriptmengen zeigte jedoch ein völlig anderes Bild. Während Chlorid, Nitrat und Gluconat zu vergleichbaren Anstiegen der Transkripmengen führten, war die maximale Transkriptmenge der Glutamatinkubierten Zellen 3-9 mal höher als in Vergleichszellen mit Chlorid. In anschließenden Titrationsexperimenten mit verschiedenen Glutamatkonzentrationen konnte gezeigt werden, dass eine minimale Konzentration von 0,2 M Glutamat ausreichend ist, um eine 90-fache Steigerung der Transkriptmenge herbeizuführen. 13. Als Antwort auf Hochsalz-Bedingungen akkumuliert H. halophilus neben Prolin auch Ectoin. Die Ectoinkonzentration bei 2,5 M NaCl war ca. 2-3 mal höher als in Zellen, die bei 1,0 M gezogen wurden. Die Bestimmung der intrazellulären Ectoin-Konzentrationen während des Wachstums zeigte außerdem, dass die Produktion von Ectoin wachstumsphasenabhängig ist. Die Konzentration in der stationären Phase war ca. 5-fach höher als in der exponentiellen Phase. Die Entwicklung der Ectoin- Konzentration verhielt sich somit reziprok zur Entwicklung der Prolin-Konzentration während des Wachstums. 14. Es wurde ein Cluster von drei Genen im Genom von H. halophilus identifiziert, deren Genprodukte die Biosynthese von Ectoin aus Aspartatsemialdehyd katalysieren. ectA kodiert dabei für eine putative Diaminobutyrat-Acetyltransferase, ectB für eine putative Diaminobutyrat-2-oxoglutarat-Transaminase und ectC für eine putative Ectoin-Synthase. Mittels reverser Transkription von mRNA und anschließenden PCR-Analysen konnte gezeigt werden, dass die drei Gene ein Operon bilden. 15. Die Transkription der ect-Gene war abhängig von der Salinität des Mediums. Ab 2,0 M stieg die Menge an RNA um das 10-fache an und erreichte bei 3,0 M ein Maximum mit der 23,5-fachen Menge. 16. Nach einem osmotischen Schock stieg die Konzentration an ect-mRNA signifikant und erreichte ein Maximum nach 3 - 4 Stunden. Das Maximum wurde somit 1,5 – 2,5 Stunden später erreicht als bei anderen Genen der Solute-Biosynthese wie etwa gdh1, das für eine Glutamatdehydrogenase, glnA2, das für eine Glutamin-Synthetase oder proH, das für eine Pyrrolin-5-Carboxylase kodiert. Die maximal erreichten Wert lagen 13-fach (ectA), 6,5-fach (ectB) und 3-fach (ectC) über dem Wert vor dem Salzschock. Gegen EctC wurden polyklonale Antikörper generiert. Western-Blot Analysen mit diesem Antikörper zeigten, dass die EctC-Menge nach 4 Stunden um das 2,5-fache stieg, dann aber wieder abfiel auf das 1,6 – 1,7-fache des Ausgangswertes. Der Rückgang an EctC fand keine Entsprechung in der gemessenen Ectoin-Konzentration, welche über einen Zeitraum von 18 Stunden kontinuierlich anstieg. Die maximale Konzentration nach 18 Stunden betrug das ca. 6,3-fache des Ausgangswertes. 17. Wurden H. halophilus Zellen mit anderen Osmolyten außer NaCl geschockt, so ergab sich folgendes Bild der Regulation der Ectoin-Biosynthese: (i) die Transkription der ect-Gene zeigte keine Chlorid-abhängige Regulation. Die maximale Transkriptmenge wurde in Gegenwart von Nitrat erreicht, wohingegen Gluconat zu vergleichbachen mRNA-Mengen führte wie Chlorid. Glutamat führte nur zu schwacher Stimulierung der Transkription. (ii) auf Ebene der Proteinmenge war zu sehen, dass die Menge an EctC nach osmotischem Schock vergleichbar war in Zellen, die mit Chlorid oder Nitrat inkubiert wurden. Gluconat führte nur zu einer 40%-igen Zunahme während andere Osmolyte nahezu wirkungslos auf die Menge an EctC blieben. (iii) die höchste Akkumulation an Ectoin nach einer plötzlichen Erhöhung der Osmolarität wurde erreicht mit Chlorid (6-fache Zunahme) gefolgt von Nitrat (5,6-fache Zunahme). Gluconat führte lediglich zu einer 3,3-fachen und Glutamat nur noch zu einer 2-fachen Steigerung der Ectoinkonzentration. Glutamat hat somit ähnliche Effekte wie Tartrat, Saccharose oder Sulfat. Succinat führte zu keiner Akkumulation und Glycin sogar zu einer deutlichen Abnahme. Die Produktion von Ectoin ist somit hauptsächlich abhängig vom Anion/Osmolyt und nur untergeordnet von der Osmolarität.
In der vorliegenden Arbeit konnte das Subkompartiment der synaptischen aktiven Zone erstmals in der für Proteomstudien erforderlichen Qualität aufgereinigt werden. Nach Präparation des Gesamthirns der Ratte wurden über verschiedene Homogenisations- und Zentrifugationschritte Synaptosomen gewonnen, die durch einen hypoosmotischen Schock zum Platzen gebracht wurden. Der Inhalt, vornehmlich synaptische Vesikel, wurde in einem Saccharosedichtegradienen aufgetrennt. Die Analyse dieses Gradienten bestätigte, dass sich in den unteren, dichteren Fraktionen (Fraktionen 28-34) Elemente synaptischer Vesikel und auch der Plasmamembran befanden. Damit war eine wichtige Grundvoraussetzung für eine nachfolgende Proteomuntersuchung gedockter synaptischer Vesikel erfüllt. Die Analyse dieser Fraktionen durch Western-Blot und mittels Transmissionselektronenmikroskopie zeigte aber auch, dass sie diverse Organellmarker enthielten und insgesamt eine heterogene Zusammensetzung von membranären Strukturen zeigten. Daher folgte als weiterer Aufreinigungsschritt eine immunmagnetische Trennung mit monoklonalen Antikörpern gegen das ubiquitäre integrale Protein synaptischer Vesikel, SV2. Die hohe Reinheit der resultierenden Fraktion gedockter synaptischer Vesikel konnte durch elektronenmikroskopische Analysen und proteinchemische Methoden (2D BAC-/SDS-PAGE und Western Blot) nachgewiesen werden. Die Optimierung der Integrität der verwendeten Proben erlaubte eine funktionelle Zuordnung der durch die hochsensensitiven massenspektrometrischen Analysen identifizierten Proteine. Zur Proteinidentifikation wurden zwei verschiedene Methoden herangezogen: die zweidimensionale BAC-/SDS-PAGE mit anschliessender MALDI-TOF Analyse und die eindimensionale SDS-PAGE mit nachfolgender nanoLC ESI MS/MS. Beide Methoden ergänzten sich; generell wurde über die zweite Methode eine größere Anzahl von Proteinen identifiziert. Durch die Verwendung und Kombination der verschiedenen massenspektrometrischen Methoden und unterstützt durch eine Western Blot Analyse konnten insgesamt 245 Proteine identifiziert werden. Dabei handelte es sich um (i) integrale synaptische Vesikelproteine, (ii) transient mit synaptischen Vesikeln assoziierte Proteine, (iii) Proteine der Plasmamembran und Zelloberfläche, (iv) Signalkaskadenproteine und kleine GTPasen, (v) Proteine des Zytoskeletts, (vi) glykolytische und andere metabolische Enzyme, sowie (vii) Chaperone und (viii) mitochondriale Proteine. Im zweiten Teil der Arbeit wurden ausgewählte Proteine genauer untersucht. Die Analyse der löslichen Proteine WK1 und WK2 zeigten in Genexpressionsstudien eine ubiquitäre Gewebeverteilung. Rekombinante Proteine wurden in Zelllinien exprimiert, um einen Einblick in deren subzelluläre Lokalisierung zu erhalten. Die Expressionsanalyse der integralen Transmembranproteine zeigte für alle Kandidaten eine neuronale Expression der mRNA. Für jeden der Kandidaten wurden individuelle Genexpressionsmuster im Hirn beobachtet. Gegen zwei der Kandidatenproteine konnten funktionelle Antikörper erzeugt werden. Die Immunomarkierung mit anti-Ttyh1-Antikörpern zeigt eine hochspezifische Färbung der Fasertrakte in verschiedenen Hirnarealen sowie eine neuronale Lokalisation in Primärkulturen des Hippokampus und des Neokortex der Ratte. Lingo1-Immunfärbungen markierten selektiv Nervenzellen des limbischen Systems und Mitralzellen des Bulbus olfactorius. Diese Studie führt konsequent die Idee der spezifischen Aufreinigung von Vesikelkompartimenten der Synapse weiter: Mit der Einführung eines hochaffinen immunchemischen Anreicherungsschrittes in dem Aufreinigungsprozess wird dem bisherigen Methodenarsenal zur Spezifizierung der Probe über physiko-chemische Parameter eine neue Dimension hinzugefügt: Die molekulare Identität.
Die ribosomal synthetisierten und posttranslational modifizierten antimikrobiellen Peptide Subtilin aus B. subtilis und Nisin A aus L. lactis gehören zur Klasse der lanthioninhaltigen Bakteriocine, die als Lantibiotika bezeichnet werden. Die Regulation der Biosynthese beider Lantibiotika unterliegt der dichteabhängigen Genregulation, die auch als Quorum Sensing bezeichnet wird. Dabei wirken die Peptide als Pheromon autoinduzierend auf die eigene Biosynthese durch Signaltransduktion über die Zwei-Komponenten-Regulationssysteme SpaRK bzw. NisRK. Durch die Konstruktion und Anwendung zweier spezifischer Reportersysteme, die auf der transkriptionellen Induktion einer chromosomal integrierten PspaS-lacZ bzw. PnisA-gusA-Fusion beruhen, wurde die autoinduzierende Fähigkeit der Peptide sowohl qualitativ durch chromogene Analysen auf Agarplatten als auch quantitativ in Mikrotiterplatten spezifisch nachgewiesen. Beide Reportersysteme wurden zur Analyse von Struktur-Funktionsbeziehungen in Bezug zur autoinduzierenden Wirkung der Peptide verwendet. Dabei wurden neben dem Subtilinproduzenten B. subtilis ATCC 6633 acht weitere Subtilin-produzierende Bacillus-Stämme identifiziert. Durch die Konstruktion eines Expressionssystems zur Produktion von durch ortsgerichteter in vitro Mutagenese erstellten Subtilinvarianten bzw. Subtilin/Nisin AHybriden wurden mehr als 80 verschiedene Peptide durch rationales Design generiert. Deren Biosynthese wurde durch MALDI-TOF MS spezifisch nachgewiesen und hinsichtlich ihrer Wirkung als induzierende Peptide über beide Reportersysteme untersucht. Durch Überexpression des Responsregulators SpaR wurde eine Induktion der Promotorfusion unabhängig von der Autoinduktion durch die jeweiligen Peptide gezeigt. Dies ermöglicht die Produktion und Charakterisierung von induktionsdefizienten Varianten. Durch die Analysen der generierten Peptide wurde eine Beteiligung des N-terminalen Bereichs von Subtilin an der Sensierung durch die Histidinkinase SpaK identifiziert. Die in vivo Produktion von verkürzten Subtilinvarianten und proteolytische Analysen von Subtilin und Nisin A zur Generierung von N-terminalen Fragmenten der Peptide bestätigte die essentielle Rolle des Nterminalen Bereichs der Lantibiotika in Bezug zur Autoinduktion. Für beide Peptide und deren jeweilige N-terminalen Fragmente, bestehend aus den ersten zwanzig Aminosäuren, wurde keine Kreuzinduktion in den Reportersystemen zur Bestimmung der Autoinduktion festgestellt. Bei simultaner Applikation des nativen Induktors mit dem korrespondierenden Peptid bzw. den jeweiligen N-terminalen Fragmenten wurde eine signifikante Reduktion der vermittelten Enzymaktivität detektiert. Dieser Effekt wurde aufgrund der Inhibition der Signaltransduktion als Quorum Quenching bezeichnet und erstmalig für lantibiotische Peptide beschrieben. Da diese Reduktion durch die gleichzeitige Zugabe von Lipid II-bindenden Substanzen, wie Vancomycin und Bacitracin, nachgewiesen wurde, konnte erstmals eine Beteiligung von Lipid II an der Signalkaskade verdeutlicht werden. Lantibiotika wirken aufgrund hochaffiner Bindung an Lipid II und anschließender Porenbildung in der cytoplasmatischen Membran überwiegend antimikrobiell gegen Gram-positive Organismen. Da die Bindung an Lipid II über ein konserviertes Bindemotiv im Nterminalen Bereich der Peptide erfolgt, wird die Beteiligung von Lipid II an der Sensierung des externen Stimulus durch die Histidinkinase LanK unterstützt.
21 Hsfs belonging to classes A, B and C were identified in Arabidopsis following the sequencing of its genome. 1.) Cloning of full length and CTD chimeric constructs followed by transient reporter assays in tobacco protoplast using GUS fusion constructs of the promoters of Hsp17.4-CI, synthetic (HSE9) and APX2 showed Hsfs A1a, A1b, A1d, A1e, A2, A3 and A9 to be active. CTDs of Hsfs A7a, A7b and HsfC1 had activity but they showed poor DNA binding in reporter assays. Hsfs A1a, A1b, A1d, A1e, A2 and A3 were able to induce the expression of endogenous Hsps in tomato protoplasts. Interesting differences in promoter selectivity were observed for several Hsfs. 2.) RT-PCR and microarray analysis showed the Hsfs to be differentially expressed depending on tissue, abiotic and biotic stress, hormone and developmental s ge. Interesting patterns of coexpressed Hsfs were observed under different stresses and developmental stages. 3.) HsfA1b was found to be active on the plasmid borne PHsf:GUS reporters of Hsfs A1d, A2, A4a, A7b and B4 when tested in tobacco mesophyll protoplasts. Hsfs A1d, A2, A4a, A7b and B4 when tested in tobacco mesophyll protplasts. HsfA2 was inactive on PHsfA:GUS. HsfB1 showed repression of endogenous activity on several PHsf:GUS reporter constructs. 4.) The transcriptional regulation under heat stress and promoter organization of HsfA2 and FtSH4 (a metalloprotease gene oriented in a head to head fashion with HsfA2 in the Arabidopsis genome, sharing a common promoter region) was studied. The transcripts of FtSH4 and HsfA2 coaccumulated under heat stress. HsfA1b was active on PHsfA2:GUS and PFtSH4:GUS. Hsf binding sites on the intergenic region were determined using promoter deletion constructs in tobacco and Arabidopsis protoplasts. A bidirectional regulation of HsfA2 and FtSH4 by HsfA1b was observed in tobacco protoplast. 5.) Microarray analysis of a HsfA2 T-DNA insertion line vs. wild type Col-0 under heat stress conditions led to identification of a subset of target genes to be severely affected in the absence of HsfA2. Apart from several Hsps (heat stressproteins) and APX2 (Ascorbate peroxidase 2, oxidative stress scavenger), several other unknown genes are affected. APX2 was the most severely affected among them. HsfA2 was able to induce the transcription from its target gene promoters in fusion to GUS in transient reporter assays in tobacco protoplast. The HSE cluster to which HsfA2 binds on the APX2 promoter was also mapped by the same technique. The direct binding of HsfA2 to the promoter of selected target genes in the Arabidopsis genome was also demonstrated by chromatin immunoprecipitation studies.
The experiments presented in my thesis were performed to resolve the following major questions: i. Initial experiments are based on the systematic characterization of the C-terminal domains of all 21 HSFs of Arabidopsis with respect to their transactivation potential as well as intracellular localization. This led to the identification of a signature motif for class A HSFs, that consists of an AHA motif (essential for activator potential), and a C-treminal NES (nuclear export signal). With this signature motif, we could identify homologues sequences of more than 90 HSFs in various plant species. ii. Analysis of developmental expression profiles of HSFs using AtGenExpress microarray data led to the identification of the unique expression of HsfA9 during late seed developmental stages. This was the starting point for the investigation of the regulation of HsfA9 as well as its function during seed development. iii. The seed specific transcription factor ABI3 was identified to be responsible for the regulation of HsfA9 by using knock out mutant lines and ectopically expressing transgenic lines for ABI3 gene. Furthermore, the importance of a RY/Sph motif, as binding site for ABI3 on HsfA9 promoter has been analyzed with transient GUS reporter assays. In addition, contribution of component(s) of ABA (abscisic acid) signaling cascade as a functional interacting partner of ABI3 on HsfA9 promoter has been shown and discussed. iv. The essential role of HsfA9 as master regulator for the expression of seed specific members of of HSP encoding genes and GolS1 was shown by analyzing transgenic plants ectopically expressing HsfA9 as well as, by carrying out transient GUS reporter assays. Correlating with this, transgenic plants with ectopic expression of HsfA9 showed a thermotolerent phenotype. Furthermore, a model where HsfA9 plays a key function for the regulation of seed expressed genes which might involved in providing dessication tolerance during seed maturation has been proposed.
Eine Einschränkung des Hörvermögens durch Schäden der Sinnesrezeptoren im Innenohr gilt beim Menschen sowie bei allen anderen Säugetieren als irreversibel. Die Hörforschung ist an der Frage interessiert, ob durch Plastizität in zentralen Teilen des auditorischen Systems Kompensationsmechanismen die Folgen mildern können. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Frage, ob und in welchem Umfang nach peripheren Hörschäden durch zentrale Kompensationsmechanismen eine Erholung des Hörvermögens auftritt auf der Basis von plastischen Änderungen der neuronalen Verarbeitung der Eingangssignale aus dem geschädigten Hörorgan. Schäden des Sinnesepithels im Innenohr, z.B. durch überlaute Beschallung oder ototoxische Substanzen, betreffen in der Regel zunächst die äußeren Haarzellen und führen zu einem Verlust der Empfindlichkeit und Frequenzspezifität des Hörvermögens. Eine primäre selektive Schädigung der inneren Haarzellen (IHZ) tritt im Tiermodell, aus unbekannten Gründen nur bei einer Spezies auf, dem Chinchilla (Chinchilla laniger) und zwar nach Gabe des antineoplastischen Medikament Carboplatin. Das gute Tieffrequenzhören der Chinchillas (0.1-20 kHz) ermöglicht außerdem Aussagen zur akustischen Signalverarbeitung in einem für das menschliche Gehör relevanten Frequenzbereich (0.02-16 kHz). Dieses Tiermodell bietet somit die Gelegenheit, die Veränderungen in zentralen Teilen des auditorischen Systems nach einer definierten sensorischen Schädigung zu untersuchen. Hierfür kommt u.a. das auditorische Mittelhirn, der Colliculus Inferior (IC) in Frage. Der IC wird als Hauptintegrationszentrum der Hörbahn angesehen weil er Eingänge von fast allen vor ihm liegenden auditorischen Kernen (z.B. Nucleus cochlearis, Nucleus olivaris und Leminscus lateralis) bekommt. Ein weiterer Grund für die Wahl des IC als Untersuchungsgebiet der vorliegenden Arbeit ist, die Frage zu beantworten, ob die auf der Ebene des auditorischen Kortex bereits nachgewiesene funktionelle Plastizität auch auf der Ebene des IC schon realisiert oder vorbereitet wird. Die vorliegende Arbeit untersucht das Antwortverhalten der Neurone im ICc an wachen Tieren vor und nach einem selektiven Teilverlust der IHZ bei Erhalt der äußeren Haarzellen. Die Arbeitshypothese ist, dass es nach einem abgeschwächten sensorischen Eingang zu Veränderungen der exzitatorischen und inhibitorischen Antwortfelder kommt, die als funktionelle Plastizität bzw. als Kompensation verstanden werden können. Anhand elektrophysiologischer Ableitungen im ICc von wachen, chronisch implantierten Tieren wurden die exzitatorischen und die inhibitorischen Antwortfelder der Neurone durch Einton- und Zweiton- Stimulation getrennt gemessen und bestimmt. Die Resultate zeigen, dass die exzitatorischen und inhibitorischen Antworteigenschaften im IC bei wachen und narkotisierten Tieren unterschiedlich sind. In wachen Tieren weist die Inhibition generell höhere Variation auf als in narkotisierten Tieren und ist unabhängiger von der Art der Exzitation. Eine Carboplatinbehandlung führte bei allen Tieren nach 3-7 Tagen zu einer Abnahme der Amplituden und einer Erhöhung der Schwellen der akustisch evozierten Hirnstammpotentiale (ABRs). Die histologische Untersuchung des Innenohres (10 Wochen nach Carboplatinbehandlung), zeigte bei allen Tieren Verluste der IHZ (zwischen 20 und 60%) entlang der gesamten Basilarmembran. Es wurden aber keine Verluste von ÄHZ festgestellt. Die Gehirn-Schnitte zeigten, dass die Registrierungen aus dem zentralen Teil des Colliculus Inferior stammen. Die physiologische Untersuchung der Antworteigenschaften der Neurone im IC 4-6 Wochen nach der carboplatinbedingten Schädigung der IHZ zeigte eine Reduktion der Inhibition, die u.a. deutlich an dem Verlauf der Intensitätskennlinien zu beobachten war. Nach dem Teilverlust der IHZ wurden viel weniger nichtmonotone Kennlinien gefunden als vor der Innenohrschädigung. Darüber hinaus beobachteten wir eine Reduzierung der inhibitorischen Regionen und eine signifikante Ausweitung der exzitatorischen Antwortfelder nach dem Teilverlust der IHZ. Die Resultate der vorliegenden Arbeit führen zu der Schlussfolgerung, dass nach einer Teilschädigung der inneren Haarzellen, unter Erhalt der ÄHZ nur ein geringer Sensitivitätsverlust in der zentralen Hörbahn auftritt. Der Verlust von 20-60% der IHZ und der damit einhergehende reduzierte afferente Informationsfluss führt zu physiologischen Veränderungen in der Hörbahn, die im IC von wachen Tieren vor allem durch eine Reduktion der Inhibition hervortritt. Dies deutet daraufhin, dass zentrale Kompensationsmechanismen bei peripheren Hörschäden nicht, wie bisher vermutet, erst in kortikalen sondern zum Teil bereits in subkortikalen Arealen (im Mittelhirn) stattfinden.
Untersuchung der Interaktion zwischen NCoA-Koaktivator-Proteinen in der Transkriptionsregulation
(2007)
Die Mitglieder der NCoA-Koaktivator-Familie fungieren als Koaktivatoren für verschiedene Transkriptionsfaktoren, wie z.B. nukleäre Hormonrezeptoren und STAT-Proteine. NCoA-Proteine rekrutieren sekundäre Koaktivatoren, die durch die Modifikation des Chromatins die Transkriptionsaktivierung ermöglichen. Vorhergehende Studien postulierten die Dimerisierung von NCoA-Proteinen über die aminoterminalen bHLH/PAS-Domänen und die Rekrutierung von Paaren von NCoA-Proteinen, konnten jedoch eine direkte Interaktion nicht nachweisen. In unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass die PAS-B-Domäne von NCoA-1 ein LXXLL-Motiv in der Transaktivierungsdomäne von STAT6 binden kann. Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob eine Interaktion von Mitgliedern der NCoA-Proteinfamilie über die PAS-B-Domäne und eigene LXXLL-Motive vermittelt werden kann und welche physiologische Bedeutung die Interaktion von NCoA-Proteinen hat. Die Interaktion endogener NCoA-Proteine konnte in zwei verschiedenen Zelllinien nachgewiesen werden. Es konnte gezeigt werden, dass die PAS-B-Domänen aller drei NCoA-Familienmitglieder mit allen Volllängen-NCoA-Proteinen interagieren können und für eine solche Interaktion ausreichend sind. Dabei interagieren die PAS-B-Domänen spezifisch mit einer Region in der CBP-Interaktions-Domäne (CID/AD1) von NCoA-1, die zwei LXXLL-Motive und den vollständigen Bereich, der die Interaktion mit CBP vermittelt, enthält. Es zeigte sich, dass sich die Bindungsmotivspezifität der NCoA-1-PAS-B-Domäne von den Bindungsmotivspezifitäten der PAS-B-Domänen von NCoA-2 und NCoA-3 unterscheidet. Ebenso zeigten sich unterschiedliche Bindungsmotivspezifitäten für die Interaktion mit der CID/AD1 von NCoA-3, die nur mit der PAS-B-Domäne von NCoA-1 interagierte. Eine physiologische Bedeutung der charakterisierten PAS-B/CID/AD1-Interaktion auf die Bildung und Rekrutierung von Koaktivator-Komplexen wurde mittels Überexpressions-Experimenten untersucht, in denen dominant negative Effekte erwartet wurden. So führte die Überexpression der PAS-B-Domäne bzw. die Kompetition mit der CID/AD1 zur Inhibition der Interaktion von NCoA-1 mit dem Koaktivator CBP und dem Transkriptionsfaktor STAT6. Außerdem führte die stabile Überexpression der PAS-B-Domänen von NCoA-1 und NCoA-3 zu einer veränderten Expression des natürlichen endogenen Androgen-Rezeptor-Zielgenes PSA. Die in dieser Arbeit identifizierte Interaktion von NCoA-Proteinen stellt einen neuen und, zu den bisher bekannten Modellen der Koaktivator-Rekrutierung, ergänzenden Mechanismus dar. Dies gilt sowohl für eine postulierte inter- und intramolekulare Interaktion von NCoA-1 bei der STAT6-vermittelten Transkriptionsaktivierung, als auch für die durch nukleäre Hormonrezeptoren geforderte Rekrutierung von Paaren von NCoA-Proteinen. Zusammenfassend können die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse dabei helfen, das Verständnis der dynamischen Rekrutierung von Koaktivatoren bzw. Koaktivator-Komplexen und damit der Regulation der Genexpression, weiter zu verbessern.
Cytochrome b561 (cyt b561) proteins are members of the recently identified eukaryotic ascorbate reducible protein family named CYBASC (CYtochrome B, ASCorbate reducible). CYBASC proteins are di-heme-b-containing membrane proteins that catalyze the transmembrane electron transfer from ascorbate. The function of the CYBASC proteins has been correlated with ascorbate recycling and/or iron facilitation uptake. Therefore, investigations on this family are of great interest as ascorbate is one of the most powerful antioxidants and iron is essential for cell survival both in animals and plants. As the amino acid sequence conservation of animal and plant CYBASC proteins is relatively high, all CYBASC members are proposed to share the same structural motifs. However, no three-dimensional structure of any representative member of the CYBASC family has been determined to date. In the Arabidopsis thaliana (A. thaliana) genome, two complete putative CYBASC open reading frames (ORFs), artb561-a and artb561-b were identified. In this thesis, these two A. thaliana CYBASC ORFs, encoding for Acytb561-A and Acytb561-B proteins respectively, were investigated and obtained main results are listed. 1. A. thaliana CYBASC proteins were heterologously produced in Pichia pastoris and Escherichia coli and purified by a single-step immobilized metal affinity chromatography (IMAC). To facilitate detection and purification, the recombinant A. thaliana CYBASC proteins were produced in both expression systems with the histidine affinity tag. Pure and stable preparations of the cytochromes were obtained via a single-step IMAC in sufficient amounts to perform biochemical characterizations. 2. Detergent solubilized recombinant Acytb561-A and Acytb561-B are dimers. As previously suggested for other CYBASC proteins, analytical gel filtration experiment suggested that both detergent solubilized cytochromes are dimers. 3. Spectroscopic features of Acytb561-B differed from those of previously described bovine chromaffin granule cyt b561. A distinctive feature of the first identified CYBASC protein, the cyt b561 from bovine chromaffin vesicles of adrenal medulla (Bcytb561-CG), is that its differential visible absorbance spectra (visible-spectra) revealed an asymmetric α-band with a maximum at 562 nm and a clear shoulder at 557 nm. This feature was recently used to discriminate CYBASC proteins from not-CYBASC proteins. However, in this thesis, it is shown for the first time that not all CYBASC proteins display in their reduced-minus-oxidized visible-spectra an asymmetric α- band and therefore, this feature can not be used as a discriminating CYBASC characteristic. 4. Ascorbate dependent reduction of the A. thaliana CYBASC proteins is inhibited by diethylpyrocarbonate (DEPC). As previously reported for the Bcytb561-CG, the ascorbatedependent reduction of the A. thaliana CYBASC proteins was inhibited by DEPC treatment. In addition, the ‘ascorbate protectant’ effect against DEPC that was observed on the Bcytb561-CG was also observed on the Acytb561-A and Acytb561-B proteins. Furthermore, as the physiological electron donor of all CYBASC proteins is supposed to be ascorbate, ascorbate-affinity of Acytb561- A and Acytb561-B was monitored and was found to be in the same range of the one of the Bcytb561- CG. 5. A. thaliana CYBASC proteins are Fe3+-chelate reductases. Recently, the Fe3+-chelate reductase activity of various CYBASC proteins was presented. In this thesis, it is shown that also both A. thaliana CYBASC proteins reduced Fe3+-chelates such as Fe3+-EDTA and Fe3+-citrate. Consistently, heme potentiometric reductive-oxidative titration of purified Acytb561-A and Acytb561-B indicated that the midpoint potential of the two heme centres of both cytochromes was lower than the one of those Fe3+-chelates. The values of both heme centre potentials of Acytb561-A and Acytb561-B are also consistent with the observation that both cytochromes were only partially reducible by ascorbate and were fully reduced with the non-physiological reductant Na-dithionite. In summary, this work describes the heterologous production, purification and initial characterizations of two distinct CYBASC proteins from A. thaliana: Acytb561-A and Acytb561-B. Biochemical characterization of these cytochromes showed that the shape of the α-band in the differential spectra is not a discriminating factor for CYBASC proteins but it is likely the DEPC sensitivity and the Fe3+-chelate reductase activity. Establishment of a purification strategy to obtain sufficient amounts of monodispersed and stable A. thaliana CYBASC proteins has also enabled initial screening of three dimensional crystallization conditions which are a prerequisite for a deeper understanding of this new eukaryotic redox enzyme family.
Der metabotrope Glutamatrezeptor Untertyp 4 gehört zusammen mit den Untertypen 6, 7 und 8 zur Gruppe III der metabotropen Glutamatrezeptoren (mGluRs). Diese präsynaptisch lokalisierten Rezeptoren sind an der Regulation der Neurotransmission an glutamatergen und nicht-glutamatergen Synapsen beteiligt. In der vorliegenden Arbeit sollten bisher unbekannte intrazelluläre Interaktionspartner für den metabotropen Glutamatrezeptor Untertyp 4 (mGluR4) identifiziert werden, um neue Erkenntnisse zur Regulation und Funktion dieses Rezeptors zu gewinnen. Dazu wurden Bindungsstudien mit Fusionsprotein aus Glutathion-S-Transferase (GST) und der kompletten C-terminalen Domäne des mGluR4 (mGluR4-C) durchgeführt. Die gebundenen Proteine wurden auf silbergefärbten SDS-Polyacrylamidgelen analysiert und anschließend über MALDI-TOF-Massenspektrometrie und Datenbank-gestützte Computerprogramme identifiziert. Außerdem wurden in Zusammenarbeit mit Dr. John Caldwell Proteine über Tandemmassenspektrometrie identifiziert. Mit diesem Ansatz konnten zwölf potentielle mGluR4-Interaktionspartner identifiziert werden. Die Bindung an mGluR4 konnte für drei dieser Proteine durch Immunoblotanalyse mit spezifischen Antikörpern bestätigt werden: für das Mikrotubuli-assoziierte Protein 1B (MAP1B), das stable tubule-only polypeptide protein (STOP-Protein) und, in geringerem Ausmaß, für die schwere Kette des nicht-muskulären Myosin II-B (MHCIIB). Die Interaktion zwischen mGluR4 und MAP1B wurde im folgenden näher charakterisiert. Bindungsstudien mit GST-Fusionsproteinen zeigten, daß MAP1B auch an die C-terminalen Domänen von mGluR6, mGluR7 und mGluR8 und damit an alle mGluRs der Gruppe III bindet. Für die mGluRs der Gruppe II konnte keine Interaktion mit MAP1B belegt werden. Weitere Bindungsstudien mit Deletionsmutanten konnten die für die MAP1B-Bindung verantwortliche Binderegion auf die 24 bzw. 38 N-terminalen Aminosäuren der C-terminalen Domänen von mGluR7 bzw. mGluR8 eingrenzen. Es wurde gezeigt, daß das Ca2+-abhängig an dieselbe Rezeptorregion bindende Calmodulin mit MAP1B um die Bindung an mGluR4 konkurriert. Immuncytochemische Experimente konnten eine partielle Kolokalisation von MAP1B und mGluR4 in transfizierten Säugetierzellen nachweisen. In kultivierten Primärneuronen konnte eine partielle Kolokalisation von endogenem mGluR4 mit endogenem MAP1B gezeigt werden. Die teilweise Überlappung der Immunreaktivitäten von mGluR4 und MAP1B läßt darauf schließen, daß eine Interaktion der beiden Proteine auch unter physiologischen Bedingungen möglich ist.
Ziele der vorliegenden Arbeit waren einerseits die Inventarisierung der Neo- und Archäophyten, die im Stadtgebiet von Frankfurt am Main im Zeitraum 1700-2006 nachweisbar sind, und die Analyse der Veränderungen während dieses Zeitraumes, andererseits die Untersuchung möglicher Auswirkungen von Neo- und Archäophyten auf die Biodiversität am Beispiel von Brachestandorten. Zur Inventarisierung wurde eine Kombination aus Literatur- und Herbarrecherche im Herbarium Senckenbergianum (FR) mit Feldarbeit in Form einer Rasterkartierung zwischen September 2002 und September 2005 mit Nachträgen aus dem Jahr 2006 durchgeführt. 609 Arten (unter Berücksichtigung von Unterarten/Varietäten 634 Sippen) aus 84 Familien wurden über den Gesamtzeitraum nachgewiesen, wobei mehr als 75 % der Sippen zu 20 Familien gehören. Die erfassten Sippen wurden nach ihrer Einwanderungsgeschichte, Einwanderungsweise und ihrem Einbürgerungsgrad bewertet. 54 % aller Sippen erwiesen sich als Ergasiophygophyten. Aktuell wurden 462 anthropochore Sippen nachgewiesen. Die Familie mit den meisten anthropochoren Vertretern sind sowohl aktuell als auch im Gesamtzeitraum die Asteraceae, die auch auf Brachen eine heruasragende Stellung einnehmen. Der gesamte Untersuchungszeitraum wurde in neun Abschnitte untergliedert. Die Häufigkeit jeder Sippe wurde für die einzelnen Abschnitte in einer sechsstufigen Skala, die sich an die Ergebnisse der Rasterkartierung anlehnt, eingeschätzt. Dadurch wurde es erstmals möglich die starke Zunahme der Neophyten in der Stadtflora sowie den Rückgang von Archäophyten für einen Zeitraum von 300 Jahren quantitativ darzustellen. Untersuchungen zur Diversität erfolgten auf Brachestandorten im Stadtgebiet. Dazu wurden 2003 und 2004 insgesamt 220 Vegetationsaufnahmen nach Braun-Blanquet durchgeführt. Die Probeflächen wurden nach geschätztem Alter in vier Kategorien unterteilt und mit Hilfe von Diversitätsindizes (Evenness, Simpsonund Shannon-Index) verglichen. Es zeigte sich, dass die Diversität auf jungen, d.h. 1-2 Jahre alten Brachen, am höchsten ist und mit zunehmendem Alter abnimmt. Brachen, die erst im Untersuchungsjahr angelegt worden waren, zeigten die größte Variabilität. Auf nährstoffreichen Böden war die Diversität besonders hoch, auf nährstoffarmen Böden extrem niedrig. Brachen, die älter als 5 Jahre waren, zeigten die geringste Diversität und die niedrigsten Zahlen von Archäo- und Neophytenarten. Die höchste Gesamtartenzahl auf 25 m² betrug 58, wobei maximal 16 Archäophyten- und 19 Neophytenarten, im Mittel jedoch nur drei Archäophyten- und vier Neophytenarten, nachgewiesen wurden. Zwischen der Gesamtartenzahl auf Brachen und der Artenzahl von Neo- und Archäophyten ließ sich kein signifikanter Zusammenhang feststellen. Allerdings sind Neophyten auf Brachen aller Altersklassen gleich erfolgreich, während Archäophyten ihren Schwerpunkt auf jungen Brachen haben und mit zunehmendem Brachealter zurückgehen. Die beiden am häufigsten auf Brachen gefundenen Sippen sind die indigenen Hypericum perforatum und Artemisia vulagris. Der Neophyt Fallopia x bohemica und das einheimische Calamagrostis epigejos sind als einzige im Untersuchungsgebiet in der Lage Einart-Bestände zu bilden. Andere, auf den ersten Blick von einer Art (z.B. Solidago canadensis) dominierte Flächen, wiesen bei näherer Untersuchung eine für Brachen durchschnittliche Diversität auf. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass jungen Brachen bis zum 3. Jahr eine besondere Bedeutung in der Stadtökologie zukommt. Sie bieten z.B. Segetalarten Lebens- und Rückzugsraum. Die Diversität alter Brachen beruht auf ihrem Mosaik verschiedener Lebensräume, die mit dieser Untersuchung nicht erfasst werden konnten.
Im Rahmen der vorliegenden Dissertation sollte der Sphingolipid-Biosyntheseweg der Hefe Pichia ciferrii näher charakterisiert werden, um die Entwicklung einer fermentativen Route zur Sphingosin-Produktion zu ermöglichen. Darüber hinaus galt es patentierbare Selektionssysteme für diese Hefe zu etablieren. Durch Sequenzvergleiche mit nahe verwandten Hefen und das Ableiten degenerierter Primer wurden elf für die Sphingolipid-Biosynthese von Pichia ciferrii relevante Gene isoliert und sequenziert: LCB1 (codiert für eine UE der Serin-Palmitoyltransferase), TSC10 (3-Ketosphinganin-Reduktase), LAG1 und LAF1 (Ceramid-Synthasen), LIP1 (UE der Ceramid-Synthasen), DES1 (Dihydroceramid-delta4-Desaturase), YXC1 (Ceramidase), 8DES (Sphingolipid-delta8-Desaturase), 9MTR (Sphingolipid-C9-Methyltransferase), GCS1 (Ceramid-Glycosyltransferase) und LCB4 (LCB-Kinase). Bioinformatische Analysen, sowie in vivo-Experimente dienten der Einordnung der korrespondierenden Genprodukte in den Stoffwechselweg. Die Bestimmung der Substratspezifität einzelner Enzyme aus der Sphingolipid-Biosynthese erfolgte durch Überexpression der korrespondierenden Gene und anschließende Analyse des Einflusses auf die Zusammensetzung der Sphingolipidfraktion von Pichia ciferrii. Zusammengenommen wurde durch die Ergebnisse ein deutlich geschärftes Bild der Biosynthese von Sphingolipiden in Pichia ciferrii erstellt. Die gewonnenen Erkenntnisse über die Sphingolipid-Biosynthese in Pichia ciferrii fanden Anwendung auf die rationale Stammentwicklung eines Sphingosin-Produzenten. Durch die kombinierte Überexpression der die Dihydroceramid-delta4-Desaturase aus Pichia ciferrii, die Ceramid-Synthase aus Coccolithovirus und eine alkalische Ceramidase aus Mus musculus kodierenden Gene wurde eine 8,5-fache Erhöhung der Sphingosin-Konzentration von 7,5 mg/L in vom Wildtyp abgeleiteten Syringomycin-E-resistenten Stämmen auf 64,0 mg/L erzielt. Die Codon-Optimierung der heterolog exprimierten Gene zur Anpassung an die sehr eingeschränkte Codon-Verwendung von Pichia ciferrii erwies sich hierbei als essentiell. Zur Nutzbarmachung von rekombinanten Pichia ciferrii-Stämmen für die industrielle Anwendung wurden darüber hinaus drei neue Selektionssysteme etabliert. Zum einen wurde eine codon-optimierte Form des nat1-Gens genutzt, um eine Nourseothricin-Resistenz zu vermitteln. Zum anderen wurden stabile Uracil- bzw. Lysin-auxotrophe Pichia ciferrii-Stämme erzeugt, die mittels eines entsprechenden Integrationsvektors mit den Auxotrophie-Markergenen URA3 bzw. LYS2 aus Pichia ciferrii zu prototrophen Stämmen komplementiert werden konnten. Zusammengenommen mit der ersten gezielten Disruption eines Gens in Pichia ciferrii (SYR2, codiert für die Sphinganin-Hydroxylase) konnte somit auch die molekularbiologische Handhabbarkeit von Pichia ciferrii deutlich verbessert werden.
Untersuchungen zur molekularen Kontrolle der Kupferhomöostase in dem Ascomyceten Podospora anserina
(2007)
Das essentielle Spurenelement Kupfer ist Co-Faktor mehrerer Schlüsselenzyme (z B. Cu/Zn-SOD, Cytochrom c Oxidase). Da Kupfer leicht Elektronen aufnehmen und abgeben kann, eignet es sich besonders gut für Redox-Reaktionen. Wenn Kupfer jedoch mit Sauerstoff reagiert, entstehen hoch cytotoxische reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die nach der „freien Radikaltheorie des Alterns“ (nach D. Harman 1956) ursächlich für Alterung und Zelltod sind. Um deren Bildung zu vermeiden, erfolgen alle Aspekte des Kupferstoffwechsels – Aufnahme, Transport und Speicherung - stets proteingebunden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich bis auf drei Ausnahmen die gesamte bislang bekannte Maschinerie der molekularen Kupferhomöostase aus anderen Modellorganismen (z.B. S. cerevisiae oder H. sapiens) auch im Genom des Ascomyceten Podospora anserina mit Homologen bzw. Orthologen wiederfindet. Die drei Ausnahmen betreffen jeweils Proteine, für die in anderen Organismen mehrere Isoformen existieren und P. anserina nur jeweils ein Homolog/Ortholog besitzt. Für mehrere der neu vorhergesagten Gene (PaAtx1, PaCcc2, PaCcs1, PaCox11, PaCox19, PaCox23, PaSco1) konnte eine Expression im Wildstamm nachgewiesen werden. Dazu wurden Standardtechniken (Northern Blot Analyse, RT-PCR) und auch neu etablierte eGFP-Reporterkonstrukte verwendet. In Podospora anserina scheint Kupfer auf zwei verschiedene Arten Einfluss auf die Lebensspanne zu nehmen: Zum einen mittelbar darüber, dass die Verfügbarkeit von Kupfer über die in der mitochondrialen Atmung verwendete Endoxidase entscheidet. Bei Kupfermangel wird eine Eisen-abhängige alternative Oxidase (AOX) induziert. Durch Atmung über die AOX entstehen weniger ROS, was die Lebensspanne verlängert. Anhand einer Vielzahl langlebiger Mutanten konnte dieser Zusammenhang bereits mehrfach demonstriert werden. Zum anderen scheint Kupfer auch eine unmittelbare Rolle in der Seneszenz von P. anserina zu spielen. In früheren Arbeiten konnten mehrere indirekte Hinweise (Transkript- und Aktivitätsanalysen) gesammelt werden, dass im Alter die cytoplasmatische Kupferkonzentration drastisch ansteigt. Durch Messung der Kupferkonzentration mittels einer direkten chemisch-analytische Methode (TXRF) in fraktionierten Zellbestandteilen (Cytoplasma und Mitchondrien) konnten in dieser Arbeit diese Hinweise weiter untermauert werden. Experimente mit in die mitochondriale Matrix geleitetem eGFP brachten zusätzliche Indizien dafür, dass das mitochondriale Kupfer-Reservoir die Quelle des sich in seneszenten Pilzstämmen im Cytoplasma wiederfindenden Kupfers ist. Durch einen Prozess, der größenabhängig reguliert und in anderen Organismen als „Mitochondrial Permeability Transition – MPT“ zu Beginn der Apoptose bekannt ist, ergiesst sich beim Eintritt in die Seneszenz der Inhalt der mitochondrialen Matrix in das Cytosol. Die Bedeutung dieses Vorgangs und v.a. die Folgen der Umverteilung von Kupfer innerhalb der Zelle bleiben im Detail weiter zu klären. Durch die durchgeführten Arbeiten konnte ein weiterer deutlicher Beweis für das Ablaufen apoptotischer Mechansimen im Alterungsprozeß des Ascomyceten P. anserina erbracht werden.
Leukemia inhibitory factor enhances neurogenin's pro-neural effect during mouse cortical development
(2007)
Die Entwicklung von unterschiedlichen Zelltypen waehrend der embryonalen ZNS-Entwicklung ist abhaengig von zellintrinsischen und positionsabhaengigen, aeusseren Einfluessen. Dabei bilden sich die verschiedenen Zellen in nacheinander ablaufenden bzw. sich teilweise ueberlappenden Zeitraeumen. Zuerst entstehen Radiaglia und Neuronen, nachfolgend Astrozyten und zuletzt Oligodendrozyten. Werden neurale Stammzellen/Vorlaeuferzellen (NPCs – neural precursor cells) zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen und ohne den Einfluss von Wachstumsfaktoren kultiviert, so entwickeln sich diese Zellarten in der gleichen Reihenfolge. Die Neurogenese, die bei Mausembryos am Tag E11-12, nach dem Etablieren der Radialglia, beginnt, findet an E14 ihren Hoehepunkt. Zu diesem Zeitpunt werden die Gene Neurogenin1 (Ngn1) und Ngn2 in den neuralen Vorlaeuferzellen der Ventrikularzone des dorsalen Cortexes in hohem Masse exprimiert. Wie aus Untersuchungen von unserm Labor gezeigt wurde, beguenstigt es die Entstehung von Neuronen und blockiert gleichzeitig Pro-Astrozyten-Einfluesse. Zum einen inhibiert Ngn den JAK/STAT Signalweg, dessen Aktivierung fuer die Gliogenese noetig ist, indem es die Phosphoylierung von STAT1/3 auf bisher noch unbekannte Weise blockiert. Ausserdem bindet der Transkriptions-Coaktivator cAMP-response element binding protein (CBP), welches auch von den STATs fuer die Transkription benoetigt wird, bevorzugt an Ngn sobald dieses von den Vorlaeuferzellen exprimiert wird. Mit dem Tag E16 nimmt die Neurogenese in vivo wieder stark ab und es setzt die Gliogenese ein, bei der zunaechst ueberwiegend Astrozyten gebildet werden. Faktoren wie leukemia inhibitory factor (LIF) sowie ciliary neurotrophic factor (CNTF) beguenstigen dabei die Astrozytogenese indem sie den JAK/STAT Signalweg aktivieren. Die Bindung von LIF/CNTF fuehrt zur Phosphorylierung von STAT-Transkriptionsfaktoren, die ihrerseits dann an den CBP/p300 Komplex binden und schliesslich die Expression von Astrozyten-spezifischen Genen aktivieren. Die STAT-Faktoren koennen aber erst nach Abfall des Ngn-Spiegels an den Transkriptions-Coaktivator binden, da sich die Bindungsstellen dieser beiden ueberlappen. Um die Hypothese zu ueberpruefen, dass LIF auch die Neurogenese, oder spezifischer, die Wirkung von Ngn positiv beeinflusst, wurden cortikale NPCs von murinen Embryos entnommen und der Wirkung von LIF via Luciferase Assay untersucht. Dabei wurden die Vorlaeuferzellen mit Ngn und einem Reporter transfiziert, welcher den NeuroD-Promoter beinhaltete. NeuroD-Expression findet in der Regel gegen Mitte/Ende der Neurogenese statt und ist wichtig fuer die Reifung von Neuronen. Der Promoter von NeuroD beinhaltet ein E-box Element, an welches Ngn bindet und die Transkription einleitet. Wie unsere ersten Versuche zeigten, verstaerkt LIF die Transkriptionsaktivitaet von Ngn und somit die Transkription von NeuroD. Wenn aber im selben Versuch ein NeuroD-Reporter transfiziert wurde, dessen E-box mutiert war, wurde keine Transkriptionsaktivitaet gemessen, was wiederum bestaetigte, dass der pro-neurale LIF-Effekt ueber Ngn lief und E-box-Bindung noetig war. Um den Einfluss des pro-neuralen Effekts von LIF auf Proteinebene zu testen, wurden NPCs mit Ngn-Adenovirus infiziert und mit LIF stimuliert. Dabei wurden die Zellen auf die Expression von Neuron-spezifischem class III β-tubulin (TuJ1) untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass LIF bei Zellen, die Ngn exprimierten, die Rate der Neuronen von etwa 5% auf etwa 50% anstiegen liess, waehrend LIF bezueglich der Gliogenese (gezeigt durch die Expression von GFAP) in Ngn-exprimierenden Vorlaeuferzellen kaum Wirkung zeigte. Als naechstes sollte untersucht werden ueber welchen Signalweg LIF Ngn aktivierte. LIF bindet zunaechst an LIF receptor β (LIFRβ), der dann an glycoprotein 130 (gp130) bindet. Diese Bindung fuehrt dann zur Aktivierung mehrerer Signalkaskaden: dem JAK/STAT, dem MAPK, dem Akt/PI3K und dem PLCγ/PKC Signalweg. Da der JAK/STAT Signalweg fuer die Gliogenese wichtig ist, lag unser Fokus auf den anderen Signalwegen. Deren Aktivierung wurde dann mit spezifischen Inhibitoren blockiert und, wie auch in den Vorversuchen, die Wirkung von LIF auf Transkriptionsebene (NeuroD) in neuralen Vorlaeuferzellen bestimmt. Dabei zeigte sich, dass die Blockierung des PLCγ/PKC Signalweges die NeuroD-Promoteraktivitaet am starksten inhibierte, waehrend auch LIF´s pro-neurale Wirkung verloren ging. Dementsprechend zeigte die Western Blot Analyse, dass die Expression von class III β-tubulin (TuJ1) durch die Anwendung der PKC Inhibitoren am staerksten inhibiert wurde, wobei auch hier die Stimulation durch LIF keine erhoehte Neurogenese mit sich zog. In weiteren Versuchen konnten wir dann mit Hilfe von Immunoprezipitation demonstrieren, dass LIF die Bindung von Ngn an CBP verstaerkte (eine Bindung, welche durch PKC Inhibitoren aufgehoben wurde), was wiederum zu einer erhoehten Bindung dieses Transkriptionskomplexes an den NeuroD Promoter fuehrte, wie unsere Chromatin Immunoprezipitation (ChIP) Daten beweisen. Dies wiederum laesst darauf schliessen, dass womoeglich diese erhoehte Ngn-CBP/NeuroD-Promoter Bindung der Grund fuer die erhoehte NeuroD-Transkriptionsaktivitaet ist daher auch fuer die erhoehte neuronale Differenzierung. Interessanterweise konnten wir auch zeigen, dass Brahma-related gene 1 (Brg1), eine katalytische Untereinheit des SWI/SWF Komplexes, an den Ngn/CBP cotranscriptionalen Komplex bindet und dass diese Bindung durch LIF-Stimulation verstaerkt wurde. Dies suggeriert wiederum, dass auch Brg1 eine wichtige Rolle waehrend der murinen, cortikalen Neurogenese spielt. Dennoch, in folgenden Experimenten verblieb der Fokus auf Ngn und CBP. Um unsere Hypothese zu bestaetigen, dass PKCδ ein moeglicher Mediator des LIF-Effekts sein koennte, zeigten wir zunaechst, dass die PKCδ-Expression in cortikalen NPCs waehrend der Neurogenese erhoeht ist. Desweiteren demonstrierten wir, dass die Inhibition von PKCδ einen aehnliche Wirkung zeigte wie die Inhibition von PKC mit einem generellen PKC Inhibitor: weder war nach PKCδ-Inhibition eine LIF-induzierte NeuroD-Transkription erzielbar, noch wurde nach LIF-Stimulation der pro-neurale Marker class III β-tubulin/TuJ1 in Ngn1-infizierten NPCs exprimiert. Um aber mehr spezifisch die PKC- und PKCδ-Aktivitaet/Expression zu blockieren transfizierten wir NPCs mit PLCγ oder PKCδ siRNA. Unsere Daten zeigten hierbei, dass siRNA-transfizierte Zellen kein class III β-tubulin mehr aufweisen, was darauf hindeuted, dass PKCδ der potentielle Mediator des pro-neuralen LIF-Effekts ist. Durch unsere in vivo Daten demonstrierten wir schliesslich, dass LIF auch hierbei fuer die Neurogenese von Bedeutung ist. Verglichen wurden die Cortices von E13 LIF Het (heterozygote) und KO (knock out) Maeusen mit denen von WT (wild type) Maeusen. Durch Immunohistologie von Hirnschnitten konnten dabei keine groesseren Unterschiede bezueglich der Expression neuraler Marker beobachtet werden, waehrend aber mit Hilfe der Western Blot Analyse, eine quantitativere Methode, gezeigt wurde, dass LIF Het und KO Maeuse weniger pro-neurale Marker im Cortex exprimieren wie WT Mause. Um auch zu beweisen, dass dies auf eine verringerte Transkription von NeuroD zurueckzufuehren ist, demonstrierten wir mit Hilfe des ChIP Assay, dass LIF Het und KO Maeuse weniger Ngn1-CBP Bindung an den NeuroD-Promoter aufweisen wie WT Maeuse. Diese Experimente veranschaulichen einen eleganten Regulationsmechanismus, durch welchen ein einzelner, extrazellulaerer Faktor die unterschiedliche Differenzierung einer Zelle verstaerkt, abhaengig von der Anwesenheit oder Abwesenheit eines einzelnenn intrazellulaeren Faktors. Auch koennen durch die erlangten Resultate Strategien entworfen werden, durch die in Zukunft die Produktion bestimmter Neurone zur Heilung von verschiedenen, neurodegenerativen Krankheiten erhoeht wird.
(1) Die genomweite Expressionsanalyse von salzadaptierten Zellen von M. mazei Gö1 identifizierte eine Reihe von salzregulierten Genen. Neben den beiden Operone ota und abl, die für die Akkumulierung von Glycin-Betain und Ne-Azetyl-b-Lysin verantwortlich sind, konnte ein ABC-Transporter (MM0953), der in seiner Genumgebung weitere Transporter sowie Proteine mit konservierten S-Layer-Domänen aufweist, als salzreguliert erkannt werden. Dies deutet auf ein S-Layer-Exportsystem hin, das eine Rolle in salzadaptierten Zellen spielen könnte. (2) Eine genomweite Expressionsanalyse von Zellen von M. mazei Gö1 zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach einem hyperosmotischen Schock auf 400 mM NaCl ermöglichte Einblicke in den Verlauf der Genexpression. Die Erhöhung der externen Osmolarität resultierte in der erhöhten Expression von Genen, die für die Aufnahme und Biosynthese von kompatiblen Soluten verantwortlich sind sowie von Genen deren Produkte regulatorische Funktion haben könnten. (3) Genomweite Expressionsanalysen von Zellen von M. mazei Gö1 nach einem hypoosmotischen Schock zeigten erhöhte Expression von Genen, die an der Regulation und an der generellen Stressantwort beteiligt sind. Gene, deren Produkte im Stoffwechsel wichtig sind – besonders Gene, die für Methylamin-Corrinoid-Methyltransferasen kodieren – erscheinen stark reprimiert. (4) Die Bestimmung der intrazellulären Ionenkonzentrationen zeigte ein unspezifisches Einströmen von den Ionen, die den osmotischen Schock auslösen sofort nach dem Schock, sowie den Ausstrom derselben Ionen im Verlauf von 5 Minuten. Die Ionenkonzentrationen der Ionen, die den Schock auslösten, blieben intrazellulär erhöht. Das Ein- und Ausströmen der Ionen nach einem hyperosmotischen Stress ist nicht energieabhängig. (5) M. mazei akkumulierte nach einem hyperosmotischen Schock kein K+, zeigte aber eine erhöhte intrazelluläre Konzentration dieses Ions, wenn die Zellen in Medium mit erhöhter Osmolarität angezogen wurden. (6) Durch hyperosmotische Schocks mit verschiedenen Salzen und Zuckern konnte gezeigt werden, dass die kurzzeitige Akkumulation von Ionen keine gerichtete Antwort auf den osmotischen Stress ist. (7) Es konnte weiters gezeigt werden, dass Zellen von M. mazei Gö1, die mit dem kompatiblen Solut Betain inkubiert wurden, nach einem hyperosmotischen Schock K+ akkumulieren. Dies bedeutet möglicherweise eine K+-abhängige Regulation des Glycin-Betain-Transporters. (8) Die Funktion der drei im Genom kodierten Na+/H+-Antiporter konnte auf transkriptioneller Ebene nicht geklärt werden. Trotzdem zeigt ein Hydrophobizitätsplot des Proteins eine mögliche Beteiligung von Nha1 (MM0294) an der Osmoregulation durch eine hydrophile C-terminale Domäne. (9) Nach einem hyperosmotischen Schock von 38,5 auf 400 mM NaCl erhöhte sich die intrazelluläre Konzentration an Glutamat, das in M. mazei als kompatibles Solut fungiert, bereits nach drei Stunden. Zellen, die bereits an die erhöhte Salzkonzentration adaptiert waren, enthielten 1,4 μmol Glutamat/mg Protein. (10) Die Glutamin-Synthetase zeigte eine erhöhte Transkription nach einem hyperosmotischen Schock. Das Protein wird aber nicht salzabhängig produziert und zeigt keine Enzymaktivität. Die Biosynthese des Solutes über eine Glutamat-Dehydrogenase ist die wahrscheinliche Alternative. (11) Aufgrund der generierten Expressionsprofile und der physiologischen Daten konnte ein Modell der Osmoadaptation in Methanosarcina mazei Gö1 erstellt werden.
1. Die Deletionsderivate der Kompetenzproteine PilN und PilQ wurden als Fusionsproteine mit dem Maltosebindeprotein überproduziert, über eine Amylosesäule aufgereinigt und in nativer Form für die Generierung von polyklonalen Kaninchen-Antikörpern eingesetzt. 2. Unter Einsatz der spezifischen alpha-PilN- und alpha-PilQ-Antikörpern konnte das PilN-und PilQ-Kompetenzprotein im Rohextrakt von T. thermophilus HB27 detektiert werden. 3. Die Überprüfung bereits vorliegender Antikörper gegen die Kompetenzproteine PilM, PilW und PilA4 ergaben, dass es sich hier ebenfalls um spezifische Antikörper handelt. 4. Mittels Western-Blot-Analysen unterschiedlicher Mutanten konnte gezeigt werden, dass die Markerinsertion in den Genen pilM, pilN, pilO und pilW zu keinem polaren Effekt der jeweils stromabwärts gelegenen Gene führt. 5. Analysen der subzellulären Lokalisation der Kompetenzproteine ergaben, dass PilM und PilN ausschließlich in der inneren Membran lokalisiert sind, während PilW, PilQ und PilA4 sowohl in der inneren als auch äußeren Membran detektiert wurden. Die größte Menge an PilQ wurde allerdings in der äußeren Membran gefunden. 6. Mutantenstudien ergaben, dass eine pilQ-Mutantion zur Abwesenheit von PilW und PilA4 in der äußeren Membran führte. Ebenso führte eine pilW-Mutantion zu Abwesenheit von PilQ und PilA4 in der äußeren Membran. Diese Ergebnisse indizieren Interaktionen zwischen PilW, PilQ und PilA4. 7. In der pilD-Mutante wurde kein PilA4 mehr in der äußeren Membran detektiert. Dieser Befund untermauert den Schluss, dass es sich bei PilD um eine PilA4 prozessierende Präpilin-Peptidase handelt. 8. Western-Blot-Analysen der gereinigten Pili führen zu dem Schluss, dass das Kompetenzprotein PilA4 die strukturelle Untereinheit der Pilus-Struktur repräsentiert. Das Sekretin-ähnliche Kompetenzprotein PilQ wurde ebenfalls in der gereinigten Pilus-Fraktion detektiert und könnte Teil der globulären Struktur an den Pilusenden sein. 9. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Dünnschnitten durch T. thermophilus HB27 Zellen ließen den ungewöhnlichen Aufbau der Zellperipherie erkennen. Zwischen der inneren Membran (8 nm dick) und der äußeren Membran (8 nm dick) befand sich neben dem dünnen Peptidoglykan (8 nm dick) eine 40 nm dicke kontrastarme Schicht, die radial von Fäden durchzogen schien. 10. Die Dünnschnitte wurden für Immunogoldmarkierungen mit alpha-PilQ-Antikörpern eingesetzt, um PilQ zu detektieren. Allerdings konnte in den elektronenmikroskopischen Analysen keine spezifische Goldmarkierung nachgewiesen werden. Ursache hierfür könnte die Unzugänglichkeit des nativen PilQ in den Dünnschnitten sein. 11. Die Immunogoldmarkierung des Gefrierbruchs von ganzen Thermus-Zellen mit alpha-PilQ-Antikörpern führte zur Detektion von PilQ-haltigen Ring-ähnlichen Strukturen in der äußeren Membran. Der Durchmesser des PilQ-Komplexes mit 17 - 18 nm ist mit denen der aus Sekretinen bestehenden Ringsystemen anderer Organismen vergleichbar. 12. In den T. thermophilus HB27 Membransolubilisaten wurde ein >669 kDa PilW-PilQ-Komplex identifiziert. Dieser Komplex ließ sich optimal mit n-Dodecyl-beta-D-maltosid (1 mg Detergenz pro mg Membranprotein) aus der Membranfraktion solubilisieren. Stabilitätsuntersuchungen ergaben, dass dieser Komplex bei 4 °C einige Tage, bei Raumtemperatur und bei Anwesenheit von 1 M NaCl einige Stunden stabil ist. 13. Mittels einer DEAE-Austausch-Chromatographie konnte der PilW-PilQ-Komplex angereichert werden. Die Western-Blot-Analysen ergaben, dass das Kompetenzprotein PilM mit dem PilW-PilQ-Komplex koeluiert. 14. In der MALDI-TOF-Massenspektrometrie konnte das Kompetenzprotein PilQ und Untereinheiten der DNA-gerichteten RNA-Polymerase, ein Membran-Lipoprotein sowie Energie-Stoffwechsel-Proteine in der angereicherten PilW-PilQ-haltigen Fraktion nachgewiesen werden. Diese Proteine müssen auf die Beteiligung an der Transformation untersucht werden. 15. Immunelektronenmikroskopische Analysen des angereicherten PilW-PilQ-Komplexes führten zur Identifizierung von Ringstrukturen mit einem Durchmesser von 17 nm. Dieser Durchmesser entspricht den Sekretin-Komplexen von P. aeruginosa (18,3 ± 1,2 nm) bzw. N. gonorrhoeae (15,5 - 16,5 nm) und dem Durchmesser der über Immunogoldmarkierung detektierten PilQ-haltigen Strukturen in T. thermophilus HB27.
Seit der Einführung der antiretroviralen Therapie (HAART) ist die Mortalität von HIV-Infizierten in der westlichen Welt zwar deutlich zurückgegangen, die HIV-Infektion ist jedoch bis heute nicht heilbar. Die derzeitige Therapie unterdrückt zwar sehr effektiv die Virusreplikation, kann aber nicht das Virus vollständig eliminieren und somit die Infizierten nicht heilen. Die daher notwendige Langzeitbehandlung wird wiederum durch die relativ hohe Toxizität der Medikamente und durch das Auftreten resistenter Virusvarianten limitiert. Die Suche nach neuen Therapienansätzen und Wirkstoffklassen ist daher immer noch von größter Wichtigkeit. Die HIV-Gentherapie stellt neben der konventionellen antiretroviralen Therapie eine mögliche zusätzliche Behandlungsform dar. Die Arbeitsgruppe von Laer hat am Georg-Speyer-Haus retrovirale Vektoren entwickelt, die membrangebundene (ma) HIV-Eintrittsinhibitoren, sog. C Pepitde, kodieren. Das durch den Prototyp-Vektor M87 kodierte maC36-Peptid zeigte eine moderate Inhibition des Viruseintritts. In einem Optimierungsprozess wurde der Vektor M87o generiert. M87o kodiert im Vergleich zu M87 ein wirksameres maC-Peptid (maC46) und weist auch eine wesentlich höhere Expressionsstärke und dadurch eine stärkere inhibitorische Wirkung als der Prototypvektor auf. Ziel dieser Arbeit war es zunächst, HIV Varianten, die resistent gegenüber dem M87o–Genprodukt maC46 sind, in vitro zu generieren und anschließend den Resistenzmechanismus aufzuklären. In einer Kollaboration mit der Gruppe um M. Dittmar aus Heidelberg war durch Passage des HIV 1 Wildtyp (wt) Ba L-Isolats auf M87-transduzierten Zellen bereits das maC36-resistente Virusisolat Ba L_sel_MD generiert worden. Ba L_sel_MD wies zwei Resistenzmutationen in der gp41-Untereinheit des Hüllproteins auf: I556V (heptad repeat 1 Region) und N634K (heptad repeat 2 Region). Für die Mutation 634K war dabei gezeigt worden, dass sie auch zu einer leichten Reduktion der maC46-Sensibilität führt. In der vorliegenden Arbeit diente Ba L_sel_MD als Ausgang für die Selektion einer Virusvariante mit deutlich verminderter Sensibilität gegenüber maC46. Hierfür wurde Ba L_sel_MD über 149 Tage lang auf Zellen mit steigender maC46 Expressionshöhe passagiert und so das Isolat Ba L_FH1 generiert. Das Hüllprotein des selektierten Isolats war ausreichend, um einen maC46-resesistenten Phänotyp hervorzurufen. Das selektierte Hüllprotein war im Vergleich zu dem Ausgangsisolat ca. fünf- bis zehnfach weniger empfindlich gegenüber maC46. Die Sequenzierung des Ba L_FH1 Hüllproteingens zeigte, dass die Aminosäureausprägung an Position 634 des Ausgangsisolats (BaLsel_MD) konserviert worden war, während die Position 556 zur Wildtypsequenz revertiert war. Darüber hinaus wurden drei Mutationen in der gp120-Untereinheit des Hüllproteins (V2-Region (I187T), V3-Region (N305Y), C3-Region (E352K)), sowie eine Mutation in der heptad repeat 1 Region (A579T) der gp41-Untereinheit identifiziert. Für die reduzierte maC46-Empfindlichkeit waren in erster Linie die Mutation N305Y in der V3 Region und die Rückmutation 556I in Zusammenwirkung mit der bereits vorhandenen Mutation 634K verantwortlich. Die verbleibenden Mutationen hatten allenfalls modulierende Wirkung auf die maC46-Sensibilität. Die Resistenz ist vermutlich auf die beobachtete erhöhte Fusionsgeschwindigkeit des Hüllproteins von Ba L_FH1 im Vergleich zum Ausgangsisolat zurückzuführen, die interessanterweise mit einer reduzierten Corezeptoraffinität verknüpft war. Die erhöhte Fusionsgeschwindigkeit verkürzt das zeitliche Fenster, in welchem maC46 an seine Zielstruktur innerhalb des gp41 binden kann. Es scheinen zwei unterschiedliche Phasen des Eintrittprozesses durch die Mutationen verändert worden zu sein. Die Mutation in der V3-Region (N305Y) der gp120-Untereinheit beschleunigt wohl eine frühe Phase. Vermutlich ermöglicht diese Mutation, dass bestimmte Übergangszustände nach der Corezeptorbindung schneller durchlaufen werden können, indem die gp120/Corezeptorbindung destabilisiert wird. Die Rückmutation 556I beschleunigt wahrscheinlich in Zusammenspiel mit der bereits vorhandenen Mutation 634K die Ausbildung des 6 Helixbündels. Diese beiden Mutationen wirken somit auf eine späte Phase der Fusion. Obwohl bekannt ist, dass natürliche Variationen in gp120 die Sensibilität des HIV-Hüllproteins gegenüber C-Peptiden beeinflussen, konnte in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass solche Mutationen auch in vitro selektiert werden, um eine C-Peptidresistenz herbeizuführen.
Der menschliche Körper ist permanent mechanischen Reizen in Form von Dehnung oder Druck ausgesetzt. Diese Stimuli können vielfältige zelluläre Prozesse induzieren. Dehnungsreize erhöhen die Zellproliferation in allen bisher untersuchten Zellspezies, inklusive Endothel- und Epithelzellen. Im Gegensatz dazu scheinen mechanische Druckbelastungen zu zellulärer Differenzierung zu führen. Die Relevanz dieser mechanischen Reize für die Physiologie und Pathophysiologie ist für viele Organe nachgewiesen worden. Jedoch gibt es bislang keine hinreichenden Untersuchungen, die belegen, dass mechanische Reize ebenso eine Rolle bei der Tumorproliferation spielen könnten. Im Fokus dieser Promotionsarbeit steht die Fragestellung, inwieweit die mechanischen Verhältnisse in Tumoren in einem funktionellen Zusammenhang mit der Tumorgenese stehen. Zur Klärung dieser Fragestellung ist ein Xenograft-Tumormodell etabliert worden, das es erlaubt in vivo-Untersuchungen an humanen epithelialen Tumoren durchzuführen. Um Erfahrungen aus vorherigen in vitro-Versuchen nutzen zu können, wurden humane epitheliale A431-Vulvakarzinom- und humane epitheliale A549-Lungenkarzinomzellen für das Tumormodell verwendet. Mit diesem Modell konnte erstmals in vivo gezeigt werden, dass solide humane Tumore einer permanenten mechanischen Dehnung ausgesetzt sind, die direkten Einfluss auf die Proliferation der Tumorzellen hat. Als zentraler Auslöser für die mechanische Dehnung der Tumorzellen konnte der erhöhte tumorinterstitielle Flüssigkeitsdruck (TIFP) identifiziert werden. Der Einfluss der mechanischen Dehnung auf die Proliferation der Tumorzellen wurde anhand der Phosphorylierung der extracellular regulated kinase 1/2 (ERK1/2) bzw. der Ki-67 Expression gezeigt. Durch die Punktion bzw. Drainage von Tumoren konnte der TIFP experimentell abgesenkt werden und in Folge dessen kam es zu einer reduzierten mechanischen Dehnung der Tumorzellen. In allen Versuchen war die Abnahme der mechanischen Dehnung von einer verringerten Phosphorylierung der ERK1/2 bzw. reduzierten Expression des Proliferationsmarkers Ki-67 begleitet. Der TIFP induziert aber nicht nur mechanische Dehnungsreize, sondern er stellt darüber hinaus eine physikalische Barriere für den effizienten Transport von Therapeutika in den Tumor dar. Der gegenüber dem umliegenden Gewebe erhöhte TIFP behindert den interstitiellen Transport und die Aufnahme von Molekülen aus dem Gefäßsystem in die Tumorzellen. Die Etablierung einer neuen experimentellen Technik zur Senkung des TIFP, durch i.v. Injektion von konzentriertem humanem Serumalbumin, führte zu einer signifikanten Verbesserung der Aufnahme und einer Verlängerung der Verweildauer von Makromolekülen/Therapeutika innerhalb von Tumoren. Des Weiteren konnten immunhistochemische Färbungen gegen lymphspezifische Marker in Gewebeproben von A431 und A549 Tumoren keinen direkten Zusammenhang zwischen Lympharchitektur und TIFP zeigen. Dies bedeutet, dass in den untersuchten Tumoren die Ausbildung des hohen TIFP eher auf eine erhöhte Rigidität der extrazellulären Matrix bzw. die hohe Permeabilität des tumorversorgenden vaskulären Gefäßsystems zurückzuführen ist. Parallel zu den in vivo-Untersuchungen durchgeführte in vitro-Versuche konnten Proteine identifizieren, die an der druckinduzierten p38 Signaltransduktionskaskade beteiligt sind. Diese Ergebnisse untermauern die bisherigen in vitro-Daten bzgl. der differentiellen Reaktionen von Zellen auf mechanische Druckreize. Abschließend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse der in vivo-Versuche die Bedeutung und die klinische Relevanz des biophysikalischen Parameters TIFP hervorgehoben haben. Die Zukunft der Krebstherapie liegt nicht alleine in der Entwicklung neuer hochspezifischer Wirkstoffe, sondern auch in der Lösung des Transports der Wirkstoffe an den Zielort. Die vorgestellten Ergebnisse dieser Promotionsarbeit weisen eine beträchtliche klinische Relevanz auf, denn sie zeigen, dass die experimentelle Absenkung des TIFP zu einer verbesserten Aufnahme von Therapeutika beiträgt. Gleichzeitig wird die Proliferationsrate von Tumorzellen durch die reduzierte mechanische Dehnung signifikant verringert. Dieser Doppeleffekt könnte zu einer effizienteren Krebstherapie führen in Folge derer es zu einer verlängerten Überlebensrate sowie einer Verbesserung der Lebensqualität von Krebspatienten kommen könnte.
Many environmental chemicals are suspected of disturbing the human and animal endocrine system. These so-called endocrine disruptors can operate in many ways. The interaction of endocrine disruptive effects that eventually endanger human health is still unclear. However, one of the basic mecha-nisms of endocrine disruption is the inhibition of key enzymes in the hormone metabolism. In this study, we focused on the inhibitory potency of suspected endocrine disrupting compounds on aromatase (P450arom) and 5alpha-reductase (5alpha-Re) activities in human tissue and human cancer cells. Both enzymes are essential for the human sex steroid hormone metabolism. We were able to demonstrate that the organotin compounds tributyltin (TBT) and triphenyltin (TPT) are potent unspecific inhibitors of P450arom and 5alpha-Re activity. Prochloraz and fenarimol inhibited P450arom activity at low concentrations (IC50<2 µM), while 5alpha-Re activity was only impaired at higher concentrations (IC50>10 µM). While the human tissue assay proved to be more practical and sensitive as a screening tool for putative endocrine disruptors, the cell assay reflected partly the situation in vivo. In another experimental series, we investigated the inhibitory effect of TPT on P450arom, 5alpha-Re, 3beta-HSD type 2, 17beta-HSD type 1 and type 3 alone and in combination with the strong antioxidant dithioerythrithol (DTE). TPT inhibited unspecifically all enzymes that were tested. The experiments also showed that DTE is able to compensate the adverse effects of TPT, and that the effectiveness of the compensatory activity of DTE differs among the enzymes investigated. The suppressed 5alpha-Re activity could not be reactivated with DTE. Conceivably, cysteine residues that are responsible for the tertiary and quarternary structure of the enzyme are critical targets for TPT. A human sampling study was undertaken with the COMPRENDO partner in Gdansk. 60 Polish and 15 German blood samples were investigated for chemical residues and sex hormone concentrations. In addition, 15 placenta samples from Poland and Germany, respectively, were tested for chemical residues, P450arom activities and CYP19 mRNA contents. The chemical analysis was performed by the COMPRENDO partners in Milan (p,p´DDE), Orleans (TBT and TPT) and Ioannina (diuron, fenarimol, linuron und vinclozolin). The results showed that individual sex hormone concentrations in blood were not correlated with chemical body burden. The detected differences in sex hormone concentrations, specific aromatase activity and relative CYP19 mRNA content of Polish and German donors were presumably the result of other factors than the ones determined in this study. Another task of the EU-project was the investigation of the effects of chemical exposure of the aquatic model organisms Pimephales promelas, Rutilus rutilus and Xenopus laevis. We investigated the specific P450arom and 5alpha-Re activities in brain and gonads of the animals. During the qualitative investigation of the androgen metabolism in Xenopus laevis brain, 5alpha-reductase activity was discovered for the first time. In contrast to the inhibitory potency of TPT discovered in our enzyme assays, TPT exposure of aquatic model organisms had no observed effect on enzyme activity in the organs investigated, except for P450arom activities in female gonads of Pimephales promelas at 320 ng TPT/L. In this group, mean P450arom activities were elevated, possibly as a result of an overshooting upregulation due to the inhibition of P450arom by TPT. The exposure of Rutilus rutilus and Xenopus laevis to the effector substances methyltestosterone and letrozole resulted in slightly different mean enzyme activities compared to the control group. In conclusion, many of the tested pesticides are able to inhibit P450arom and 5alpha-Re, and thus might be of clinical relevance. However, results are not always coherent, and possible risks for human and wildlife health are therefore difficult to predict. Risk assessment will require large studies with an additional number of short and long term in vitro and in vivo assays. Any extrapolation to humans should be very meticulously performed.
Die Verbreitung westlicher Verhaltens- und Lebensmuster im Rahmen der Globalisierung führt zu einer dramatischen Zunahme des Typ 2 Diabetes. Eine schwerwiegende Komplikation der diabetischen Erkrankung ist die Wundheilungsstörung, deren molekulare Pathophysiologie noch weitgehend unverstanden ist. Voraussetzung für einen koordinierten Wundheilungsprozess ist die ausgewogene Interaktion wundheilungsrelevanter Faktoren, die eine Vielfalt an Signaltransduktionskaskaden induzieren und somit zu einem streng kontrollierten Heilungsprozess beitragen. Darüber hinaus scheint auch die Insulinsensitivität der Haut für den Heilungsverlauf eine essentielle Rolle zu spielen. Da die Proteinkinase B/Akt nicht nur ein zentrales Molekül der Insulin-Signaltransduktion ist, sondern als Knotenpunkt vieler Signalkaskaden im Mittelpunkt zellulärer Ereignisse steht, sollte in der vorliegenden Arbeit die Rolle und Funktion der Proteinkinase Akt in der kutanen Wundheilung untersucht werden. Sowohl in der Haut als auch im Wundgewebe konnte Akt1 als dominante Isoform identifiziert werden. Die Verletzung des Hautgewebes induzierte einen Anstieg der Akt1-Expression und -Phosphorylierung in der Epidermis akut heilender Wunden. Insbesondere die am Wundrand gelegenen Keratinozyten waren durch eine starke Expression der Akt1-Kinase gekennzeichnet. Die Phosphorylierung und somit Aktivierung der Akt1-Kinase stieg im Verlauf der Wundheilung stetig an und erreichte ihr Maximum in der Endphase des Heilungsprozesses. Begleitet wurde die Aktivierung dieser Kinase von einer Phosphorylierung des eIF4E-BP1 und einer starken VEGF-Sekretion. Dagegen konnte in diabetisch chronischem Wundgewebe weder eine Aktivierung der Akt1-Kinase noch eine Phosphorylierung des eIF4E-BP1 nachgewiesen werden, was mit einer deutlich verminderten VEGF-Sekretion einherging. Um nun zu untersuchen, ob im Prozess der Wundheilung die VEGF-Sekretion in einem funktionellen Zusammenhang zur Akt1-Aktivierung steht, wurde in vitro der Einfluss wundheilungsrelevanter Faktoren, wie EGF, einer Kombination proentzündlicher Zytokine oder Insulin auf die Aktivierung der Akt1-Kinase und VEGF-Biosynthese untersucht. Obwohl alle Faktoren sowohl eine Aktivierung der Akt1-Kinase als auch VEGF-Sekretion induzierten, wurde ausschließlich die Insulininduzierte VEGF-Biosynthese über den PI3-Kinase/Akt-Signalweg vermittelt. Die Regulation der Insulin-induzierten VEGF-Biosynthese erfolgte posttranskriptionell aus einem gleichbleibenden Pool an VEGF-mRNA über die Phosphorylierung des eIF4E-BP1. Durch die Überexpression einer konstitutiv aktiven Akt1-Mutante und die Verwendung des mTOR-Inhibitors Rapamycin konnte mTOR als Mediator der Akt1-vermittelten Phosphorylierung des eIF4E-BP1 und somit der VEGF-Biosynthese identifiziert werden. In vitro-Lokalisationsexperimente zeigten, dass eine vollständig phosphorylierte und somit aktive Akt1-Kinase nach Insulinstimulation im Zytoplasma lokalisiert ist - exakt dort, wo die Regulation der Translation stattfindet. Zusammenfassend weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass Insulin im kutanen Heilungsverlauf die VEGF-Biosynthese posttranskriptionell über eine Akt1-vermittelte Phosphorylierung des eIF4E-BP1 induzieren kann. Eine ausbleibende Akt-Aktivierung in insulinresistenten Keratinozyten könnte somit zu einer verminderten VEGF Sekretion und folglich zu einer verzögerten Angiogenese in chronisch diabetischen Wunden beitragen.
Maligne Gliome sind die häufigsten Neoplasien des Zentralen Nervensystems. Sie zählen zu den hypoxischsten Tumoren und entwickeln u.a. durch die Adaption an niedrige Sauerstoffbedingungen Apoptose-resistente Phänotypen. Darüber hinaus zeichnen sie sich durch schnelle Proliferation und ein diffuses, infiltratives Wachstum in das umliegende Neuropil aus, was eine vollständige Tumor-Resektion unmöglich macht. Entsprechend liegt die mediane Überlebenszeit nach der Diagnose trotz chirurgischen Eingriffs bei anaplastischen Astrozytomen (WHO Grad III) zwischen 18 und 20 Monaten und bei Glioblastomen (WHO Grad IV) zwischen 12 und 15 Monaten. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurden 17 Gliomzelllinien in einem in vitro-Anoxiemodell auf ihre Hypoxie-Sensitivität hin untersucht. Dabei wurde eine hohe Variabilität hinsichtlich der Hypoxie-Toleranz festgestellt, sowie die Tendenz zu einer ausgeprägter Anpassung an niedrige Sauerstoffverhältnisse, begleitet von der Fähigkeit, das mitochondriale Membranpotential (delta psi m) aufrecht zu erhalten. Der durch Hypoxie induzierte Zelltod wurde als Caspase-unabhängig und Nekrose-ähnlich charakterisiert. Apoptose wurde hingegen auch in den Hypoxie-sensitiven Zelllinien nach 48 stündigem Sauerstoffentzug nur in sehr geringem Ausmaß beobachtet. Funktionelle Analysen mit den synthetischen BH3-Mimetika HA14-1 und BH3I 2’, die selektiv Bcl-2 bzw. Bcl xL/Bcl-2 inhibieren, lassen darauf schließen, dass die für Gliomzellen typische Bcl-2- und Bcl xL-Überexpression eine Blockade des mitochondrialen Signalwegs verursacht und so entscheidend zur Apoptose-Resistenz der Zellen beiträgt. Der Todesligand TRAIL, der selektiv in Tumorzellen Zelltod aktiviert, ist ein vielversprechender Kandidat für neue Apoptose-induzierende Krebstherapien. Da jedoch einige Krebszelltypen einschließlich maligner Gliome weitgehend gegen TRAIL resistent sind, richtet sich das Interesse verstärkt auf kombinatorische Therapieansätze, die Tumorzellen für TRAIL resensitivieren sollen. Nur zwei von sechs untersuchten Gliomzelllinien reagierten auf die Behandlung mit TRAIL, wobei eine Korrelation zwischen Hypoxie- und TRAIL-Resistenz deutlich wurde und die Hypothese einer ausgeprägten Kreuzresistenz stärkt. Ein Zusammenhang zwischen TRAIL-Sensitivität und TRAIL-Todes- bzw. –Decoy-Rezeptor-Expression konnte indes nicht hergestellt werden. Der Vergleich von konventionellen Therapienansätzen (Gamma-Bestrahlung) mit neuartigen Wirkstoffklassen (BH3-Mimetika und Proteasomeninhibitoren) zeigte, dass Gamma-Bestrahlung lediglich in TRAIL-sensitiven Zellen synergistisch mit TRAIL wirkte, während die BH3-Mimetika den TRAIL-induzierten Zelltod sowohl in TRAIL-sensitiven als auch –resistenten Zellen signifikant erhöhten. Diese Befunde legen nahe, dass die hohen Bcl-2- und Bcl xL-Proteinlevel verschiedene Signalwege hemmen, die an den Mitochondrien konvergieren und dadurch die Apoptose- bzw. Therapie-Resistenz maligner Gliome steigern. Der Einsatz der Proteasomeninhibitoren MG132 und Epoxomicin erwies sich vergleichsweise als am effizientesten: Beide Substanzen vervielfachten p53-unabhängig den TRAIL-induzierten Zelltod in TRAIL-sensitiven Gliomzellen und reaktivierten darüber hinaus potent die TRAIL-induzierte Apoptose in den TRAIL-resistenten Zelllinien. Microarray- und semi-quantitative RT-PCR-Analysen ergaben eine potente transkriptionelle Aktivierung des TRAIL-Rezeptors DR5 und der Stress-induzierten Transkriptionsfaktoren CHOP und c-Jun. Weitere Untersuchungen mit Hilfe von chemischen Inhibitoren und RNA-Interferenz zeigten, dass die CHOP-unabhängige, JNK/c-Jun-Signalwegs-vermittelte Aktivierung von DR5 eine maßgebliche Rolle bei der Proteasomeninhibitor-induzierten Sensitivierung von Gliomzellen für TRAIL spielt. Zusammengenommen legen die vorgelegten Befunde nahe, dass neue Ansätze basierend auf TRAIL oder agonistischen TRAIL-Rezeptor-Antikörpern in Kombination mit Proteasomeninhibitoren oder BH3-Mimetika vielversprechende Strategien zur Überwindung der Therapieresistenz maligner Gliome darstellen.
The rate of species extinctions due to anthropogenic activities has dramatically increased within the past few centuries (Dirzo & Raven, 2003; Novacek & Cleland, 2001). Although the mechanisms and ultimate causes leading to the extinction of species remain largely unclear (Frankham et al., 2002), five threats to global biodiversity have frequently been referred to as the most important: habitat destruction and fragmentation, global climate change, hunting and overuse of food resources, biological invasions and environmental pollution (Dudgeon et al., 2006; Lewis, 2006; Novacek & Cleland, 2001). Different research fields, as conservation biology, ecology and ecotoxicology, investigate the effects of these factors on organisms and found strong evidence for their negative impact on regional and global biodiversity.
In most cases, natural populations will be impacted not only by one threat, but rather a combination of them (Buckley & Roughgarden, 2004; Kappelle et al., 1999). Multiple environmental stress factors can have cumulative negative effects on the survival of populations (Sih et al., 2004). To understand, how natural populations respond to combinations of different stress factors is thus of crucial importance in order to understand our present and future impact on all scales of biodiversity (Warren et al., 2001).
The effects of anthropogenically introduced chemicals on organisms and ecosystems are investigated in the field of ecotoxicology. Research in this area has led to a large body of information concerning the impact of chemical stress on the fitness of model species in the laboratory. In contrast to this, there is an obvious lack of knowledge on the effects of contaminants on natural populations and communities (Bickham et al., 2000; Bourdeau et al., 1990). For instance, ecotoxicologists have just started to investigate the impact of environmental pollution on the genetic variability of natural populations (Bickham et al., 2000; Whitehead et al., 2003). Genetic variation provides the raw material for populations in order to adapt to changing environmental conditions and is thus the substrate for evolution and long-term survival of populations and species (Frankham, 2005). The amount of genetic variation in populations is positively correlated with the effective population size (Frankham, 1996). Habitat destruction and fragmentation has divided the ranges of many species into small and isolated refuges. Without migration from adjacent habitats, isolated populations will decrease in their level of genetic diversity through random loss of alleles (Hedrick, 2000). Frankham (1995) for instance, showed that 32 of the 37 endangered species (which occur in small populations per definition) of different animals and plant taxa display reduced levels of heterozygosity compared to closely related and more frequent species.
In strongly human impacted landscapes, both factors, environmental pollution and habitat destruction, can be expected to occur frequently together. It is thus of crucial importance to investigate the impact of reduced genetic diversity and inbreeding on the response to chemical stress. In addition, chemical exposure has frequently been discussed to have an impact on the extent of genetic variability in exposed populations (Guttman, 1994; Staton et al., 2001; van Straalen & Timmermans, 2002). However, evidence for this 'genetic erosion hypothesis' remained scarce to date, most likely because of the difficulty to single out the impact of pollution stress from a background of multiple factors which influence patterns of genetic variability in natural populations (Belfiore, 2001; Staton et al., 2001; van Straalen & Timmermans, 2002).
Präklinische Untersuchungen zur Gentherapie der HIV-Infektion mit dem retroviralen Vektor M87o
(2007)
Mit der Einführung der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) 1995 wandelte sich die HIV-Infektion in den Industrieländern von einer akut lebensbedrohlichen zu einer chronisch verlaufenden und scheinbar gut kontrollierten Erkrankung. Das Virus wird allerdings nie vollständig aus dem Körper eliminiert, sodass die Betroffenen zeitlebens Medikamente einnehmen müssen. Die Langzeit-Medikation wird häufig von schweren Nebenwirkungen begleitet, führt zur Selektion resistenter Viren und muss häufig umgestellt werden. Gentherapeutische Verfahren, die die CD4+ Zielzellen durch die Expression antiviraler Gene vor der Infektion durch HIV schützen („intrazelluläre Immunisierung“), stellen viel versprechende Therapiealternativen dar. Der in der Arbeitsgruppe von Laer entwickelte retrovirale Vektor M87o (EGELHOFER et al. 2004, EGELHOFER 2004) exprimiert das 46 Aminosäuren lange membran-verankerte Peptid C46, das in der Lage ist, die gp41-vermittelte Fusion von Virus- und Zellmembran zu inhibieren. In Zelllinien und primären Lymphozyten konnte gezeigt werden, dass M87o die Infektion durch unterschiedliche HIV-Isolate sehr effektiv verhindert. Im Rahmen vorklinischer Untersuchungen konnte in vitro gezeigt werden, dass die retrovirale Transduktion mit M87o das Transformationsrisiko und damit das Risiko der Entstehung von Neoplasien nicht steigert. An primären peripheren T-Zellen konnte zeigt werden, dass M87o die Zielzellen weder phänotypische noch funktionelle verändert. Für die Untersuchung der retroviralen Gentherapie im Rhesusaffenmodell wurde zunächst ein Gentransferprotokoll für periphere Affenlymphozyten entwickelt, mit dem in Vorversuchen Gentransferraten von ca. 50% erreicht werden konnten. Das Transduktionsprotokoll wurde anschließend im Rahmen einer präklinischen Studie zur Toxizität und Immunogenität der M87o-Gentherapie, bei der Herstellung zweier Studientransplantate angewandt. Beide Zellpräparate wurden den Versuchstieren transplantiert. Während des Eingriffs traten keine akuttoxischen Reaktionen auf. M87o+-Zellen konnten bis 140 Tage nach der Transplantation mittels PCR nachgewiesen werden. Immunologische Untersuchungen (Cytokinfärbung, Proliferationsassay, ELISPOT) ergaben keine Hinweise auf zelluläre oder humorale Immunreaktionen. M87o-spezifische Antikörper waren im Serum nicht nachweisbar. Für die Durchführung einer klinischen Studie zur Toxizität und Wirksamkeit (Phase I/II) an HIV-infizierten Probanden wurde ein Protokoll zur Produktion M87o-modifizierter T-Zellen (mindestens 5 × 108 M87o+ CD4-T-Zellen pro Spender) entwickelt. In die klinische Prüfung wurden Patienten aufgenommen, die nach multiplem Therapieversagen durch das Auftreten multiresistenter HIV eine CD4-Zellzahl von 50 bis 200 µl-1 Blut, sowie eine Viruslast von >5.000 Kopien ml-1 Blut aufwiesen. Im Versuchsmaßstab konnte ein Transduktionsprotokoll erarbeitet werden, mit dem im Mittel 46% der CD4+ T-Zellen mit M87o transduziert werden konnten. Innerhalb von 10 Tagen expandierte die Zellzahl im Mittel um den Faktor 153, wobei die HIV-Replikation vollständig inhibiert wurde. Das Protokoll wurde erfolgreich vom Versuchsmaßstab in den klinisch relevanten Produktionsmaßstab übersetzt. In drei Versuchsläufen wurde im Mittel eine Transduktionsrate von 29% erreicht und die Zellzahl um den Faktor 44 vermehrt. Der Anteil an CD3+/CD4+ Zellen an der Gesamtpopulation lag im Mittel bei 91%. Insgesamt konnten mit dem etablierten Protokoll durchschnittlich 2,3 × 109 CD3+/CD4+/M87o+ Zellen, bei gleichzeitig vollständiger Inhibition der HIV-Replikation, generiert werden. Im Rahmen einer klinischen Studie zur Toxizität und Wirksamkeit der M87o-Gentherapie wurden 10 Studientransplantate gemäß dem im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Protokoll hergestellt. Alle Transplantate wurden am Universitäts-Krankenhaus Eppendorf in Hamburg transfundiert und von den Patienten sehr gut vertragen.
Shaped by some of the most dramatic tectonic events of the Cenozoic, the parts of southern and eastern Asia that have become known as the Oriental faunal region comprise vast areas of great geological complexity and ecological diversity. One of the four major groups of terrestrial elapid snakes in this region is the genus Bungarus. These nocturnal and predominantly ophiophagous snakes are widely known as kraits and are an important cause of snakebite mortality throughout their wide range that extends from Afghanistan to Vietnam and eastern China, and south to the Indonesian islands of Java and Bali. Although present on Borneo, kraits have not been found on any island of the Philippines, nor on Lesser Sunda Islands east of Bali. Despite their medical significance and the great importance of Bungarus toxins as tools in neuropharmacology, krait systematics and taxonomy have remained largely unstudied. Twelve species of Bungarus were recognized at the beginning of the present study. Many of these are rare in collections, and most aspects of their biology are unknown. While some species are highly distinct, most kraits are conservative morphologically, rendering molecular methods invaluable for the study of their diversity and biogeography. This study is the first to address the relationships within Bungarus and the historical biogeography of kraits based on molecular evidence. I inferred phylogeographic relationships based on analyses of new nucleotide sequences of the entire mitochondrial cytochrome b gene of 51 kraits and partial NADH dehydrogenase subunit 4 sequences of 40 kraits which I analyzed together with a representative sample of 32 published elapid and non-elapid outgroup taxa using Bayesian, maximum-likelihood, maximum-parsimony and neighbor-joining methods. I then used the recovered phylogeny to investigate the evolution of selected morphological characters and, together with collections-based geographical distribution information, in dispersal-vicariance analyses with models of variable taxonomic and biogeographic complexity. The phylogenetic analyses demonstrate that the current taxonomy of kraits does not adequately represent either the relationships or the genetic diversity in this genus. In contrast, I identified monophyletic groups that are congruent with recognized biogeographic units as well as extensive ecomorph evolution and morphologically cryptic speciation. The following additional conclusions are collectively supported by the mitochondrial phylogeny and morphological as well as biochemical synapomorphies: (1) Kraits are monophyletic with respect to the remaining taxa of the Elapidae; (2) Bungarus flaviceps and Bungarus bungaroides form the monophyletic sister clade of a clade formed by B. fasciatus, black-and-white-banded, and uniformly black taxa; (3) the remaining taxa are divisible into two sister clades, the South Asian species (Bungarus sindanus (Bungarus caeruleus, Bungarus ceylonicus)) vs. Himalayan, Burmese, Southeast and East Asian taxa; (4) within the latter, Burmese taxa form the sister clade to Southeast and East Asian taxa; (5) the widespread and medically significant species Bungarus candidus and Bungarus multicinctus are paraphyletic. The results of this study highlight the importance of vicariant geological events and sea level fluctuations for the cladogenesis of kraits. Events of particular importance in the evolution of kraits include the uplift of the Indo-Burman ranges (Arakan-Naga Hills) which separated black-and-white banded kraits in India and Southeast Asia, and the uplift of mountain ranges in Yunnan, China (e.g., the Gaoligong Shan), which coincided with lineage separation in two distantly related clades of kraits. Alternating dispersal and vicariance events due to Pleistocene climatic and sea level changes have caused complex phylogeographic patterns in kraits in Southeast Asia. Zones of contact between closely related evolutionary lineages of the B. candidus complex are identified in Thailand, Vietnam, and southern China (Hainan). Within this complex, two main clades are revealed. One includes populations from the Southeast Asian mainland and is in contact with B. multicinctus in southern China. The other consists of populations from Thailand, southern Vietnam, Java, and Bali. The phylogeny as well as genetic distances suggest a scenario in which a Pleistocene southward dispersal of B. candidus to Sumatra, Java, and Bali during times of low sea levels was temporarily interrupted by vicariant events (rising sea levels, especially flooding of the Malacca Strait between Sumatra and the Malay Peninsula, and of the Bali Strait between Java and Bali). In this context, the close phylogenetic relationship between haplotypes from southern Vietnam and those from Java and Bali suggests that "southern" B. candidus dispersed directly via colonization of the widely receded South Chinese Sea, and not by taking a detour via the Malay Peninsula and Thailand, which were already inhabited by other populations of B. candidus. Using these phylogenetic estimates as the framework for a study on the diversity and evolution of krait venom components, I applied biochemical and molecular genetic approaches to identify and quantify polypeptide and protein toxins in krait venom, focusing on the distribution and molecular evolution of alpha-bungarotoxin, an irreversible competitive antagonist of nicotinic acetylcholine receptors with an exceptionally high applied significance as a receptor probe. I was specifically interested in the medically relevant question of intraspecific and interspecific variability in toxin diversity, and whether receptor-binding postsynaptic toxins evolve at rates different from those of presynaptic neurotoxins like beta-bungarotoxin, which act by destroying the nerve terminal and are believed to exhibit hypervariable functional diversification due to an accelerated mode of molecular evolution. In the context of this question, I isolated and purified the major lethal neurotoxins from B. candidus venoms by sequential steps of liquid chromatography for structural and functional characterization studies. Cloning and sequence analysis of toxin-coding genomic DNAs showed that the gene encoding the alpha-bungarotoxin alanine-31 variant, originally isolated from B. multicinctus venom, is widely present and highly conserved in multiple populations of B. candidus and is expressed as the principal postsynaptic neurotoxin at least in Javan B. candidus. In addition to the widespread presence of genomic DNAs encoding the alpha-bungarotoxin alanine-31 variant, the present study also revealed the partial genes of three novel alpha-bungarotoxin isoforms in addition to the previously known alanine-31 and valine-31 variants, all of which share an invariant exon 3 coding region. While alpha-bungarotoxin is the principal postsynaptic neurotoxin of Taiwanese B. multicinctus and Javan B. candidus, the main postsynaptic neurotoxin of Thai B. candidus both by quantity and lethality was a novel polypeptide of similar toxicity with a mass of 8030 Da and 73 amino acid residues, whose characterization at the genetic and protein levels revealed a novel subgroup of krait neurotoxins, here named alpha-delta-bungarotoxins and represented by four sequences from Bungarus caeruleus and B. candidus. alpha-delta-Bungarotoxins share high sequence homology with alpha-bungarotoxins but the purified, 8030 Da alpha-delta-bungarotoxin-1 exhibits only reversible, low affinity binding to nicotinic receptors and high site-selectivity for the acetylcholine binding site at the alpha-delta-subunit interface of the receptor. These properties render alpha-delta-bungarotoxin not only the first snake long-chain neurotoxin with reversible binding and binding-site selectivity, but also an exciting natural tool with which to address structure-function relationships at the subunit interfaces of the human receptor. The results of comparisons of the number of non-synonymous nucleotide substitutions per nonsynonymous site (dN) to the number of synonymous nucleotide substitutions per synonymous site (dS) strongly suggest that positive selection is acting on exon 2 of the alpha-bungarotoxin and probably also of the alpha-delta-bungarotoxin genes. In addition, the numbers of nucleotide substitutions per site of intron (dI) compared to the dS value of the toxin-coding exon regions provide strong evidence for accelerated molecular evolution in exon 2 of alpha-delta-bungarotoxins —whose value of dI is only one-eighth of the value of dS—whereas the hypothesis of accelerated evolution is rejected for 13 unique genomic DNAs encoding five alpha-bungarotoxin isoforms from B. candidus and B. multicinctus....
In der vorliegenden Arbeit sollte das basolaterale Targeting des Transmembranproteins shrew-1 in polarisierten Epithelzellen analysiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die cytoplasmatische Domäne von shrew-1 mehrere spezifische basolaterale Sortingmotive enthält. Die Funktionalität dieser Motive wurde anhand Mutationsanalysen von Schlüsselaminosäuren untersucht. Substitution dieser Aminosäuren führt zu einer apikalen Lokalisation von shrew-1 in polarisierten MDCK Zellen. Durch Analyse der Proteinverteilung von shrew-1 Varianten in polarisierten LLC-PK1 Zellen wurde deutlich, dass das Sorting von shrew-1 in die basolaterale Plasmamembran ein AP-1B-abhängiger Prozess ist. Außerdem konnte mittels Coimmunopräzipitation eine Interaktion zwischen shrew-1 und der Untereinheit my1B aus dem Adapterproteinkomplex AP-1B nachgewiesen werden. Untersuchungen des Targetings von shrew-1 Varianten in polarisierten MDCK und LLCPK1 Zellen mit Hilfe der Transzytoseexperimente zeigten, dass die apikal lokalisierte Mutante shrew-1-NTD5 auf dem Weg zur apikalen Membranregion, trotz fehlender Sortinginformation, die basolaterale Plasmamembran durchquert. Durch Inhibition der Membranfusion mittels Tanninsäure konnte zusätzlich gezeigt werden, dass die Passage der basolateralen Plasmamembran für das Targeting von sowohl shrew-1 als auch von shrew-1-NTD5 essentiell ist. Die Beobachtungen des Turnovers von shrew-1 in der Plasmamembran von lebenden Zellen zeigten, dass shrew-1 aktiv endozytiert wird und dass nachfolgend ein Recycling des Proteins zur Plasmamembran stattfindet. Anhand der durchgeführten Untersuchungen lässt sich zusammenfassend ein Targetingmodell für shrew-1 in polarisierten Epithelzellen aufstellen, das ein postendozytotisches Sorting beschreibt: Dabei wird shrew-1 zunächst in Post-Golgi-Carriern auf unbekanntem Weg zur basolateralen Plasmamembran gebracht, wo seine unmittelbare Internalisierung und ein Weitertransport zum Recyclingendosom stattfinden. Der im Recyclingendosom lokalisierte und am Sorting beteiligte Adapterproteinkomplex AP-1B vermittelt dann den Rücktransport von shrew-1 zur basolateralen Plasmamembran.
Isolation des Carotinoidbiosynthese Genclusters aus Flavobacterium spec P99-3. Das isolierte Gencluster von 15 kb Größe zeigt 7 offene Leseraster, die auf Grund ihrer Sequenzhomologie Carotinoidgenen zugeordnet werden können oder anhand von Komplementationen in einem heterologen Expressionssystem in E. coli mit anschließender HPLC-Analayse eine eindeutige Funktion im Biosysnthesewegs des selten vorkommenden Myxols zugeordnet werden kann.
Obwohl für eine Vielzahl von Chemikalien Ergebnisse aus Standardtest vorliegen, gibt es relativ wenige Erkenntnisse über generationsübergreifende Substanzeffekte und die Auswirkungen von Chemikalien auf die genetische Diversität. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation werden generationsübergreifende Effekte des Modellschadstoffes Tributylzinn (TBT) bei drei subakuten Konzentrationen (4,46; 6,69 und 8,93 mikro g Sn/kg TG) auf Life-Cycle-Parameter und genetische Diversität der Zuckmücke Chironomus riparius untersucht. Dabei wird eine genetisch variable (GEN+) und eine genetisch verarmte (GEN-) Populationen betrachtet. Darüber hinaus wird das Anpassungspotential an den Stressor TBT abgeschätzt. Die genetische Variabilität von C. riparius wird mittels neu entwickelter Mikrosatellitenmarker bestimmt. Dabei werden geringfügige Längenunterschiede zwischen hochvariablen DNA-Fragmenten detektiert. Weiterhin werden Abweichungen vom Hardy-Weinberg-Gleichgewicht bestimmt. Für die Ermittlung von potentiellen Anpassungsprozessen an den Stressor TBT werden nach ausgewählten Generationen akute und chronische Anpassungstest durchgeführt. Um der Fragestellung nachzugehen, ob eine TBT-Vorexposition zu einer veränderten Sensitivität gegenüber einem Zweitstressor führt, werden Experimente mit Cadmium durchgeführt. Auch in den Zweitstressorstudien wird der Multigenerationsansatz gewählt, und es werden Life-Cycle-Experimente über drei weitere Generationen durchgeführt. Für die Experimente werden die mit 4,46 und 8,93 mikro g Sn/kg TG vorexponierten Tiere anschließend nach unterschiedlicher Generationenzahl einer umweltrelevanten Cadmiumkonzentration (1,2 mg/kg TG) ausgesetzt. Im Verlauf der Multigenerationsstudie mit 4,46 mikro g Sn/kg TG werden in beiden Populationen signifikante Effekte auf die Entwicklung und Reproduktion beobachtet. In den ersten Generationen ist der Schlupfzeitpunkt der Larven bei TBT-Exposition signifikant (p < 0,05, t-Test) verzögert. Die Reproduktion scheint ebenso ein sensitiver Parameter zu sein, wobei die Weibchen der genetisch variableren Population signifikant (p < 0,05, t-Test) größere Gelege in den späteren Generationen produzieren. Die niedrige TBT-Konzentration hat in beiden Populationen keinen signifikanten Effekt auf die durchschnittliche Populationswachstumsrate. In den letzten Generationen der Studie wird für die genetisch variablere Population eine Veränderung des Lebenszyklus festgestellt, wobei die Weibchen eine erhöhte Reproduktionsleistung aufweisen. Es werden keine Effekte auf die Heterozygotie festgestellt. Allerdings treten in beiden Populationen zahlreiche Abweichungen vom Hardy-Weinberg-Gleichgewicht auf. Weiterhin werden signifikante (Pearson-Korrelation, p < 0,05) Effekte der genetischen Diversität auf zahlreiche Life-Cycle-Parameter (Gelegeanzahl pro Weibchen, Gelegegröße) ermittelt. In den chronischen und akuten Anpassungsexperimenten gibt es deutliche Hinweise auf Adaptationsprozesse gegenüber dem Stressor TBT. In der TBT-Studie mit 8,93 mikro g Sn/kg TG werden in beiden Populationen signifikante Effekte auf zahlreiche Life-Cycle-Parameter festgestellt, wobei die Entwicklung und Reproduktion der Tiere negativ beeinflusst wird. Darüber hinaus werden in der genetisch variableren Population signifikante (p < 0,05, X2-Test) Effekte von TBT auf die genetische Diversität beobachtet. Diese nimmt im Verlauf der Studie ab. Nach der vierten Generation gibt es in der genetisch variableren Population Hinweise auf Anpassungsprozesse, die allerdings in den letzten Generationen nicht mehr nachzuweisen sind. Ähnlich wie in der ersten Multigenerationsstudie wird auch in dieser Studie ein signifikant (Pearson-Korrelation, p < 0,05) positiver Zusammenhang zwischen der genetischen Diversität und der Populationswachstumsrate bei TBT-Exposition festgestellt. In den Zweitstressorexperimenten wird der Effekt der Vorbelastung bei der genetisch variableren Population deutlich. Die mit 8,93 mikro g Sn/kg TG über neun Generationen exponierte Population reagiert dabei empfindlicher auf den Stressorwechsel als die dazugehörige Referenzpopulation. Innerhalb der Multigenerationsstudien werden zahlreiche Effekte der Organozinnverbindung TBT auf Life-Cycle-Parameter und die genetische Diversität von C. riparius deutlich. Diese Dissertation zeigt die hohe Bedeutung von Mehrgenerationenstudien für die Abschätzung und Bewertung eines Risikopotentials von Schadstoffen.
Koalas are popular zoo animals, but difficult in husbandry. In addition to their specialised diet of eucalyptus leaves, they are prone to “stress” and disease. Particularly in European zoos, themonitoring of theirwell-being has high priority and they are protected from possible stressors. However, stress signs in koalas are vague and monitoring techniques like weighing might result in discomfort itself. Additionally, husbandry routines are planned according to keeper’s schedule, not to the endogenous rhythms of the koalas. Therefore it is necessary to investigate activity pattern in captive koalas and the signals influencing them. These signals have to be assessed on the strength and quality of their impact. A total of 17 koalas have been observed in three zoological gardens in Australia and Europe. Koalas kept in outdoor enclosures with little human contact (Koala Walkabout, Taronga Zoo, Sydney) showed a uniform activity pattern, which was clearly entrained by light. Activity levels were higher during the night, and there was a pronounced resting period in the morning which corresponds with low body temperature measured by Degabriele and Dawson (1979). Activity peaks were related to twilight and changed during the year related to day lengths. However, there was a clear influence from the introduction of fresh browse which resulted in a distinct feeding peak in the afternoon. With short day lengths, this stimulus competed with dusk. Activity patterns from koalas in indoor enclosures (Zoo Duisburg, Vienna Zoo) varied between individuals and in some cases lacked a detectable rhythm. Though activity peaks were related to light, entrainment to sunlight was weak. In winter, koalas reacted primarily to the artificial light, but some also showed activity peaks related to sunlight. Activity patterns in these koalas were less structured and differed severely from patterns expected according to literature. Activity was often related to the keeper’s presence and food introduction. Frequency of feeding bouts was considerably higher at Vienna Zoo compared to the other zoos and the bouts were shorter in duration. Time budgets of the koalas were within the range given in free-range studies. Feeding showed seasonal changes and was increased in lactating females. Koalas at Vinna Zoo had a high level of locomotor activity compared to the size of the enclosure. Koalas at Koala Walkabout were not used to handling, so they resisted the keeper. The koalas at the two European zoos were handled regularly and settled down quickly. However, handling took place in the morning; in most koalas, there was no activity prior to it. In Vienna, resting periods were interrupted daily due to weighing. Food introduction at KoalaWalkabout took place in the afternoon. It was preceded by locomotor activity and triggered a long feeding bout in the koalas. It is not clear, whether food had true Zeitgeber properties or masked the endogenous rhythm. In the two European zoos, food was introduced in the morning. The peaks related to this were smaller than those at Koala Walkabout. Activity was rarely observed prior to food introduction. The koalas at Koala Encounter, Taronga Zoo (Sydney),were regularly confronted with visitors, though no contact was allowed. Direct observation by the keepers did rarely show any stress signs. Activity patterns at night were strikingly similar to Koala Walkabout, but differed dramatically during the day. Food was introduced three times a day, which usually resulted in activity that interrupted a resting period. Generally, the koalas at Koala Encounter were more active than those at KoalaWalkabout. They also displayed a high level of locomotor activity, especially on the ground, which is an accepted sign of discomfort in koalas (Wood 1978; Zoological Society of San Diego 2001; Yusuf& Rosenthal unpublished data). In summary, this chronoethological study of the captive koalas showed that there are several problems with koala husbandry. Artificial light regimes for koalas are not sufficient for entrainment and result in unstructured activity pattern. This is especially the case in winter, when the day in Europe is artificially extended. Due to the mainly nocturnal behaviour of koalas, such an extension might not be necessary and therefore should be avoided. Handling in Europe took place during the physiological resting time of the koalas. Interruptions of resting times are considered as stressors (Wood 1978) and should be avoided. Handling in the afternoon would be more suitable for the koalas and triggered activity in the two koalas at Vienna Zoo. It is also arguable if daily weighing is necessary to monitor health in captive koalas or if the frequent interruption of resting countervail the advantages of constant monitoring. Frequent contact with visitors, evenwithout the so-called cuddling, has a considerable impact on activity patterns and time budget of koalas, even if no immediate stress signs are displayed. Such contact should therefore be reduced to a minimum and chronoethological observations of the koalas should be used. A study on koalas with direct visitor contact is also advisable to revise the current legislation on “koala cuddling”. Koalas frequently rested in living trees if they had access to it. Since no food-poisoning has been reported from koalas using living non-food trees, the provision of living trees with an appropriate canopy should be included in the husbandry guidelines. Increased locomotor activity has been shown to be related to conditions of discomfort or stress and possibly to oestrus. This is in accordance with literature (Wood 1978; Zoological Society of San Diego 2001). Further observation, combined with hormone analysis, are advisable to establish this parameter for evaluation of well-being. Chronoethology has proven to be useful for the evaluation of husbandry conditions and group dynamics. Different to other, traditional ethologicalmethods, it indicated problems and enabled me to advise more appropriate times for handling and food introduction. It is desirable that zoos already using 24-hour video observation include chronoethological aspects into their analysis.
RNA-Interferenz (RNAi) erlangte eine herausragende Bedeutung zum Studium der Genfunktion, nachdem auch in Säugersystemen gezeigt wurde, daß durch Applikation von 21 nt langen siRNAs (small interfering RNAs) eine Sequenz-spezifische Degradierung der mRNA-Transkripte kognitiver Gene erreicht werden konnte. Im Gegensatz zur antisense-Technologie erwies sich die Wirkung von siRNA im Hinblick auf die Hemmung der Genexpression um ein Vielfaches potenter und hoch spezifisch. Für eine längerfristige Unterdrückung von Genen kristallisierte sich die Methode der Plasmid-Vektor-vermittelten intrazellulären Expression von shRNA (short hairpin RNA) heraus, welche transient oder stabil angewendet werden kann. Diese exprimierte shRNA wird intrazellulär enzymatisch zu wirksamer siRNA prozessiert, welche den eigentlichen Enzym-vermittelten RNAi-Mechanismus der Degradierung von mRNA-Transkripten kognitiver Gene auslöst. Die Anwendung von RNA-Polymerase III-abhängigen Promotoren für die stabile konstitutive Expression von shRNA stellte ein großes Problem für behandelte Zellen dar, wenn es sich bei dem zu unterdrückenden Zielgen um ein Gen mit essentiellen Funktionen für die Zelle handelte. Im Falle der Polo-like Kinase 1 (Plk1), einer in vielen Spezies hoch konservierten Serin/Threonin-Kinase mit essentiellen mitotischen Funktionen, bedeutete eine dauerhafte und stringente Unterdrückung einen veränderten Phänotyp beteiligter Zellen, welcher sich durch Defekte bei mitotischen Ereignissen bemerkbar machte. Plk1 ist in zahlreiche mitotische Prozesse, wie den Eintritt der Zellen in die Mitose, die Segregation der Chromosomen und die Aktivierung des APC/C (anaphase promoting complex / cyclosome), eingebunden. Darüber hinaus ist bekannt, daß Plk1 in nahezu allen Tumorarten überexprimiert vorliegt und die Prognose von Tumorwachstum und Metastasierungspotential über den Plk1-Gehalt definiert werden kann. Des weiteren bewirkte eine RNAi-vermittelte Unterdrückung der Plk1-Expression bei Tumorzellen eine Hemmung der Zellproliferation mit Auslösung der Apoptose. Hingegen konnte bei gesunden primären Zellen weder eine signifikante Hemmung der Proliferation noch die Auslösung der Apoptose beobachtet werden, was die große Bedeutung von Plk1 als Ansatzpunkt für eine Krebstherapie hervorhebt. Um die Funktion von Plk1 im Hinblick auf molekularbiologische Zusammenhänge besser studieren zu können, war es notwendig, den intrazellulären Plk1-Gehalt zu variieren. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurden dazu induzierbare RNAi-Elemente entwickelt, mit deren Hilfe die intrazelluläre Plk1-Expression konditionell inhibiert werden konnte. Unter Verwendung des prokaryotischen Tet-Systems wurden auf Basis des RNA-Polymerase abhängigen H1-Promotors durch Insertion von einer oder zwei Operatorsequenzen (TetO) für den Tetrazyklin-Repressor (TetR) an verschiedene Orte innerhalb der Sequenz des H1-Promotors drei induzierbare Promotor-Derivate geschaffen. Die drei entwickelten H1-Promotor-Derivate wurden zur Expression von shRNA gegen Plk1 eingesetzt und in bezug auf die Auslösung der RNAi-Antwort getestet und untereinander verglichen. Zu diesem Zwecke wurde der endogene Plk1-Gehalt von HeLa-Tumorzellen auf Transkript- und auf Proteinebene bestimmt. Die Zellen wurden zuvor mit Plasmid-Vektoren für konstitutive TetR-Expression und jeweils einer der verschiedenen shRNA-Expressions-Kassetten ko-transfiziert. Als Kontrollen dienten dabei Wildtyp-H1-Promotoren, welche zur konstitutiven Expression von shRNA gegen Plk1 und einer unwirksamen Kontroll-shRNA eingesetzt wurden. Mit Hilfe des synthetischen Tetrazyklin-Analogons Doxyzyklin, welches einen potenten Aktivator für TetR darstellt, konnten die hergestellten Promotor-Derivate induziert werden, was durch einen reduzierten intrazellulären Plk1-Gehalt sichtbar wurde. Dabei fiel auf, daß alle drei Promotor-Typen unterschiedliche Eigenschaften im nichtinduzierten Zustand wie auch im induzierten Zustand unter Anwesenheit von Doxyzyklin aufwiesen. Für die Basalaktivität in Abwesenheit von Doxyzyklin (leakiness) war die relative Lage der TetO-Sequenz(en) innerhalb des Promotors verantwortlich. So veränderte die Insertion einer TetO-Sequenz in 3’-Richtung der TATA-Box die Eigenschaften des Wildtyp-H1-Promotors weniger als die Insertion einer TetO-Sequenz in 5’-Richtung der TATA-Box. Zum Studium von Plk1 als Zielgen in der Krebstherapie wurde das Proliferationsverhalten von HeLa-Tumorzellen als Antwort auf die Doxyzyklin-vermittelte Induktion der shRNAExpression unter Kontrolle eines der induzierbaren Promotoren ermittelt. Dabei konnte die Proliferation von Tumorzellen durch einen reduzierten Plk1-Gehalt, welcher durch die Doxyzyklin-induzierte Auslösung der RNAi-Antwort vermittelt wurde, erfolgreich inhibiert werden. Zur Überprüfung der Eignung entwickelter Systeme, Tumorwachstum in vivo inhibieren zu können, wurden die entwickelten RNAi-Kassetten in das Genom von TetRexprimierenden HeLa-Zellen integriert und so stabile Klone geschaffen. Stabile HeLa-Klone zur induzierbaren Expression von Plk1-spezifischer shRNA, wie auch zur induzierbaren Expression von einer Kontroll-shRNA, wurden in die gegenüberliegenden Flanken von immunsupprimierten Nacktmäusen inokuliert, um anhand von Xenograft-Modellen einen direkten Vergleich des Tumorwachstums unter gleichen äußeren Bedingungen zu ermöglichen. Einem Teil der Mäuse wurde Doxyzyklin ins Trinkwasser gegeben, während Kontrollmäuse kein Doxyzyklin verabreicht bekamen. Das Tumorwachstum von Xenograft-Tumoren, welche aus Klonen zur Expression von shRNA gegen Plk1 hervorgingen, konnte in Doxyzyklin-behandelten Mäusen um 53% auf 47% an Tag 51 nach Inokulierung der Zellen inhibiert werden. Tumoren nicht-induzierter Mäuse, sowie Tumoren aus induzierten Mäusen, welche Kontroll-shRNA exprimierten, wuchsen dagegen unverändert in gleichem Maße. Anhand der in dieser Arbeit entwickelten induzierbaren H1-Promotor-Derivate zur konditionellen Auslösung von RNAi wurden wertvolle genetische Werkzeuge geschaffen, welche für das Studium der Genfunktion eingesetzt werden können. Im Falle der Unterdrückung von Plk1 können mit ihrer Hilfe sowohl grundlegende molekularbiologische Zusammenhänge studiert als auch die Bewertung von Plk1 als Zielgen in der Krebstherapie bewertet werden. Im Gegensatz zu kürzlich entwickelten Kinase-Inhibitoren, welche auf Proteinebene gegen Plk1 gerichtet sind und aufgrund ihrer bislang nicht nachgewiesenen Spezifität verwandte Kinasen in ihrer Wirkungsweise beeinflussen könnten, ist eine RNAibasierte Strategie hoch spezifisch und verspricht eine große Relevanz für zukünftige therapeutische Ansätze. Vorraussetzung für erfolgversprechende RNAi-basierte Strategien ist eine hohe Konservierung der Sequenz beteiligter Zielgene. Im Falle von Plk1 konnte eine hohe Konservierung durch Sequenzanalyse der Plk1-Gene von 15 Mamma-Karzinomen, 11 Ovarial-Karzinomen und mehrerer Tumorzellinien bestätigt werden.
Synaptopodin is the founding member of a family of actin-associated proline-rich proteins. It is present in a subset of telencephalic dendritic spines, where it is tightly associated with the dendritic spine apparatus, a putative calcium store. Synaptopodin-deficient mice lack the spine apparatus and show deficits in long-term potentiation and spatial memory. Thus, synaptopodin appears to play a role in synaptic plasticity. In the present thesis, three major questions were addressed: (1) What is the distribution of synaptopodin and the spine apparatus in identified hippocampal neurons? (2) Is the distribution of synaptopodin affected by denervation? (3) Is synaptopodin involved in the regulation of denervation-induced spine loss? The major findings of this thesis are: (1) Immunohistochemistry in the hippocampus of wildtype and EGFP-transgenic mice revealed significant layer-specific differences in the prevalence of synaptopodin at the level of individual neurons. (2) Light and electron microscopic analysis also revealed the presence of synaptopodin in axon initial segments of cortical and hippocampal principal neurons. There, it was found to be an essential component of the cisternal organelle, a putative axonal homologue of the dendritic spine apparatus. (3) Immunohistochemistry in the rat fascia dentata before and following entorhinal deafferentation revealed changes in synaptopodin expression in denervated and non-denervated layers of the hippocampus, suggesting that the distribution of synaptopodin in hippocampal neurons is regulated by presynaptic signals. (4) The dynamics of denervation-induced spine plasticity were studied in vitro using confocal live imaging of organotypic entorhino-hippocampal slice cultures. Whereas spines were remarkably stable under control conditions, spine loss and spine formation were seen following denervation. No significant differences were observed between cultures from wildtype and synaptopodin-deficient mice, suggesting that synaptopodin is not involved in lesion-induced spine plasticity. (5) Finally, a set of transgenic mice expressing fluorescently tagged synaptopodin were generated to facilitate future experiments on the dynamics and function of synaptopodin. In summary, this thesis presents novel findings on (1) the subcellular distribution of synaptopodin in spines and the axon initial segment, (2) the molecular composition of the cisternal organelle, and (3) the dynamics of spines and the spine apparatus organelle following deafferentation in vivo and in vitro.
Compared to all other organisms with 1 to 3 heat stress transcription factors (Hsfs) or Hsf-related factors, plants have extraordinarily large Hsf families with more than 20 Hsfs. Plant Hsfs are classified into three classes according to their oligomerization domains which is built of hydrophobic heptad repeats (HR) in two parts, HR-A and HR-B. Both parts may be immediately adjacent (class B), or they are separated by insertion of 21 (class A) and 7 amino acid residues (class C). In plant Hsf family, detailed investigations are so far limited to Hsfs A1a, A2, A3, A4d, A9, and B1. They strongly indicate functional diversification to be the main reason for the coexistence of multiple Hsfs. As an example the functional triad of HsfA1a, HsfA2, and HsfB1 is essential for all three phases of the hs response, (i) the triggering of the response by HsfA1a as master regulator, (ii) the maintenance and high efficiency of hs gene transcription by cooperation of HsfA1a with Hsfs A2 and B1, and finally, (iii) the restoration of house-keeping gene transcription during the recovery phase mediated by HsfB1 in cooperation with house-keeping transcription factors. The results presented in this thesis for Hsfs A4 and A5 open completely different aspects of functional diversification and cooperation of Hsfs. HsfA4 and HsfA5 homooligomerize and bind to corresponding HSE motifs. But in contrast to the highly active HsfA4, HsfA5 is completely inactive as transcriptional activator. Yeast two hybrid and GST pull-down techniques showed that both Hsfs have strong tendency for heterooligomerization. Using fluorescence microscopy the HsfA4/A5 heterooligomers were found to localize in the nucleus. These complexes are transcriptionally inactive due to the impairment of DNA binding. The repressor function of HsfA5 requires only its OD and no additional factors, e.g. a putative co-repressor recruited by the C-terminal domain, are involved. Evidently, the repressor effect mainly results from the interference with the oligomeric state of HsfA4b, which is essential for efficient DNA binding and activator functions. EST database search revealed that plants have a single HsfA5 and usually two A4-type Hsfs. Using bioinformatics tools, Hsfs A4 and A5 were found to be phylogenetically closely related and clearly distinct from the other members of the Hsf family. On the basis of RT-PCR and Microarray data the representatives of the A4/A5 group are well expressed in different plant tissues albeit at very different levels which change with the developmental stages and stress conditions In rice and Arabidopsis, HsfA4 functions as an anti-apoptotic factor for stress induced oxidative damages. Based on my results, I hypothesize that HsfA5 functions as a novel type of selective repressor, regulating the function of A4-type Hsfs in plants. Considering the high sequence conservation with in plant Hsf family, it is tempting to speculate that this role of Hsf4/A5 pair is a fundamental feature of the Hsf system in plants.