Refine
Year of publication
Document Type
- Doctoral Thesis (446) (remove)
Language
- German (446) (remove)
Has Fulltext
- yes (446)
Is part of the Bibliography
- no (446)
Keywords
- Paracoccus denitrificans (7)
- RNS (7)
- Cytochromoxidase (6)
- NMR-Spektroskopie (6)
- Elektronentransfer (4)
- Gentherapie (4)
- HIV (4)
- Organische Synthese (4)
- RNA (4)
- Ubihydrochinon-Cytochrom-c-Reductase (4)
Institute
- Biochemie und Chemie (446) (remove)
Die enorme genetische Variabilität von HIV-1[14],[50] und die mangelnde Korrelation zwischen genetisch definierten Subtypen einerseits und antigener Variation[51]-[56] andererseits verhindern bisher die Entwicklung eines effizienten, breit neutralisierenden Impfstoffes. Neueren Ansätzen liegt daher das Konzept einer serologischen Klassifikation zu Grunde[61],[62], die verschiedene HIV-Subtypen nach ihrer serologischen Reaktivität und nicht nach ihrem genetischen Ursprung klassifiziert. Diese Ansätzen beruhten allerdings auf der Verwendung ausgewählter Consensus-Modellpeptide der immunodominanten V3-Region des viralen Hüllproteins gp120 und monoklonaler Antikörper weniger HIV-1-Subtypen[61]. Somit ist nicht auszuschließen, dass aus dem Einsatz weiterer Peptide und anderer Antikörper bislang unidentifizierte Serotypen resultieren. Es lag nahe, den ursprünglichen Ansatz auf eine wesentlich breitere Basis von Antikörpern und Peptiden zu stellen. Als Antikörperquelle kamen hierbei die polyklonalen Seren HIV-1-positiver Patienten in Betracht; man machte sich dabei das native HIV-spezifische Antikörperreservoir zu Nutze. Seitens der Peptide als Zielmoleküle einer Ermittlung serologischer Reaktivität bot sich ein kombinatorischer Zugang an. Ziel der vorliegenden Arbeit war demnach die Entwicklung eines immunologischen Testsystems für das Screening humaner HIV-positiver Seren gegen kombinatorisch erzeugte Peptide mit dem Hintergrund, einen minimalen Satz reaktiver Peptide zu identifizieren, die eine serologisch basierte Charakterisierung der Reaktivität verschiedener HIV-1-Subtypen erlaubt. Um Reaktivitätsmuster zwischen Seren verschiedener Subtypen ermitteln und ausschließlich signifikante, hochreaktive Sequenzen finden zu können, sollte dieses Assay zudem die Möglichkeit der mehrfachen Wiederholbarkeit mit derselben Peptidbibliothek bieten. Diese im Rahmen der vorliegenden Arbeit umgesetzten Ziele lassen sich somit wie folgt zusammenfassen: Entwicklung eines Verfahrens zur schnellen und eindeutigen massenspektrometrischen Sequenzierung von Peptiden aus kombinatorischen Bibliotheken, Entwicklung eines immunologischen Testsystems für das iterative Screening HIV-positiver Seren gegen festphasengebundene Peptide, Screening von Serenpools verschiedener genetisch bestimmter Subtypen von HIV-1 gegen eine kombinatorische Peptidbibliothek, die die genetische Variation der V3-Region von gp120 reflektiert, und Multivariate Analyse der gefundenen Peptidsequenzen mit dem Ziel einer serologischen Interpretation derselben. Das Verfahren zur schnellen und im Vergleich zum herkömmlichen Kettenabbauverfahren nach Edman weniger aufwändigen massenspektrometrischen Sequenzierung als reaktiv bestimmter Peptide basiert auf der adaptiven Einführung Kettenabbruch erzeugender Sequenzen während der Synthese der kombinatorischen Peptidbibliothek nach einer modifizierten One Bead One Peptide"-Synthese[118],[119]. Diese Codierung wird sequenztreu durch den Einsatz von Mischungen aus der Fmoc-geschützten Aminosäure, die für diese Sequenzposition vorgesehen ist, und ihres N-terminal permanent blockierten Derivats eingeführt. Das Programm Biblio optimiert das Codierungsmuster hinsichtlich minimaler Einführung von Terminationssequenzen und minimalem Einsatz Kettenabbruch erzeugender Reagenzien, um den Anteil des Hauptpeptids pro Bead nur so gering wie möglich zu vermindern. Eine MALDI-massenspektrometrische Analyse der Peptide eines betreffenden Beads liefert somit neben dem Signal des Hauptpeptids auch die Sequenz des Peptide codierenden Signale. Diese werden von Biblio zur gesuchten Peptidsequenz decodiert. Des weiteren konnte ein immunologisches Testsystem für das iterative Screening festphasengebundener Peptide entwickelt werden. Dieses beruht auf der Detektion der Bindung des Serumantikörpers an das Peptid durch einen Sekundärantikörper, der an den Primärantikörper bindet und mit einem fluoreszenten Farbstoff markiert ist. Eine Bindung ließ sich somit fluoreszenzmikroskopisch nachweisen. Um eine Wiederholbarkeit des Screenings zu gewährleisten, wurde die Peptidbibliothek mittels eines Epoxidharzklebstoffs auf der Probenunterlage fixiert. Eine Entfernung des Immunkomplexes gelingt durch mehrfache Behandlung mit pH 1. Eine 80640 Spezies umfassende Decapeptidbibliothek, die die genetische Variabilität der immunodominanten V3-Schleife der viralen Hüllproteins gp120 von HIV-1 wiedergibt, wurde gegen Serenpools verschiedener HIV-1-Subtypen gemäß diesem Verfahren iterativ gescreent. Insgesamt 36 Peptide konnten aufgrund ihrer intensiven Fluoreszenz als hochreaktiv erkannt werden; sie wurden mit MALDI-Massenspektroskopie und anschließender Decodierung durch Biblio sequenziert. Eine Auswahl von vier der 36 ermittelten Sequenzen erwies sich als ausreichend für eine Differenzierung der zugrunde liegenden HIV-1-Subtypen. Eine anschließende multivariate Analyse der gefundenen Sequenzen in bezug auf ihr Seroreaktivitätsmuster ermöglichte die Bestimmung neuer, konservierter Epitope der Bindung polyklonaler Serenantikörper von HIV-1 und die Identifikation der für diese Bindung kritischen Aminosäurepositionen der betrachteten Decapeptide. Diese Epitope könnten in nachfolgenden Studien auf ihre Bedeutung hinsichtlich ihres Neutralisationspotentials bezüglich primärer HIV-Isolate getestet werden. Das hier entwickelte Verfahren zum iterativen Screening codierter Peptidbibliotheken jedoch ist nicht auf das HIV-System beschränkt, es bietet vielmehr einen universellen Zugang zur reaktivitätsbasierten Evaluation festphasengebundener Substanzbibliotheken, die die volle genetische Variabilität ihrer biologischen Zielregion abbilden. Eine dieser Regionen könnte beispielsweise der Antigenrezeptor von B-Lymphocyten darstellen, der die B-Zellen durch Kontakt mit einem Antigen aktiviert. Diese regen die B-Zelle zur Proliferation und deren Nachkommen zur Differenzierung zu antikörpersezernierenden Zellen gegen diese Antigene an. Sie bilden damit ein interessantes Ziel, auf diesem Wege eine effektive Immunantwort hervorzurufen[146],[150].
In der vorliegenden Doktorarbeit wurden die folgenden fünf biochemischen Fragestellungen zu Enzymen und deren Wechselwirkungen mit ihren Substraten mit NMR spektroskopischen Methoden untersucht: (1) Die spontane Bildungsrate von NCarboxymethanofuran (Carbamat) aus CO 2 und Methanofuran im Gleichgewicht und die Beeinflussung der Geschwindigkeit durch FormylmethanofuranDehydrogenase aus Methanosarcina barkeri wurden über 2D ProtonenaustauschSpektroskopie (EXSY) bestimmt. Mit Hilfe der berechneten Geschwindigkeitskonstanten und der bekannten physiologischen Konzentrationen von CO 2 und Methanofuran konnte erstmals gezeigt werden, daß die spontane Carbamatbildungsrate ausreicht, um die in vivoCO 2 Reduktionsraten in methanogenen Archaea erklären zu können. (2) Die Konformation von N 5 ,N 10 Methylentetrahydromethanopterin (Methylen H 4 MPT) in Anwesenheit und in Abwesenheit H 2 bildender MethylenH 4 MPTDehydrogenase aus Methanothermobacter marburgensis wurde über TransferNOEMessungen bestimmt. Es wurde nachgewiesen, daß die Bindung zu einer Konformationsänderung des Substrats führt, welche die ReSeitenStereospezifität des Enzyms erklären kann. (3) Die Stereospezifität des Hydridtransfers von MethylenH 4 MPT auf NADP , katalysiert von NADPabhängiger MethylenH 4 MPTDehydrogenase aus Methylobacterium extorquens AM1, wurde NMRspektroskopisch untersucht. In Übereinstimmung mit der unter (2) entwickelten Theorie zum Übergangszustand des Hydridtranfers wurde gefunden, daß auch der Transfer auf NADP ReSeitenspezifisch in Bezug auf MethylenH 4 MPT verläuft. Zusätzlich wurde gezeigt, daß das Enzym das Hydrid auf die ReSeite von NADPH überträgt. (4) Die spontane Rate der Kondensationsreaktion von Glutathion und Formaldehyd zu SHydroxymethylglutathion wurde mit EXSYMessungen bestimmt. In Zellextrakten des methylotrophen Proteobakteriums Paracoccus denitrificans wurde eine Enzymaktivität nachgewiesen, die diese Reaktion beschleunigt. Bislang wurde vermutet, daß es eine solche Enzymaktivität nicht gibt. Mit EXSYMessungen konnte nicht nur diese Enzymaktivität nachgewiesen werden, sondern es gelang auch das verantwortliche Enzym, das Glutathion abhängiges FormaldehydaktivierendesEnzym (Gfa) genannt wurde, erstmals zu reinigen und das kodierende Gen zu identifizieren. (5) Die Anzahl der UbichinonBindungsstellen des Cytochrom bc 1 Komplexes aus Bos bovis wurde bestimmt. Dafür wurde eine NMRMethode entwickelt, die es ermöglicht, Bindungsstudien von wasserunlöslichen Cofaktoren an membranständigen Proteinen durchzuführen. Über die Aufnahme und Integration von 1 H, 13 CHSQCSpektren unter Verwendung von HRMASNMR konnte die Konzentration des Ubichinons, das in der Proteoliposomenmembran frei beweglich ist, quantifiziert werden. Verdrängungsstudien mit spezifischen Inhibitoren ermöglichten es dann, durch den Vergleich der freigesetzten Ubichinonkonzentrationen relativ zu der Cytochrom bc 1 Komplexkonzentration nachzuweisen, daß insgesamt drei Ubichinone spezifisch an den Cytochrom bc 1 Komplex binden. Die Ergebnisse werden in 5 Abschnitten beschrieben. Im Anhang zu jedem Abschnitt finden sich die Abdrucke der bereits erschienenen Veröffentlichungen (Abschnitte 1 bis 3) und ein zur Veröffentlichung akzeptiertes Manuskript (Abschnitt 5). In der Einleitung werden die Möglichkeiten aufgezeigt, mit modernen NMRspektroskopischen Methoden Protein LigandWechselwirkung zu studieren. In der Diskussion werden anhand der Ergebnisse die Limitierung, aber auch das noch nicht ausgeschöpfte Potential dieser Methoden erläutert. Während der Doktorarbeit wurden auch Untersuchungen zu den katalytischen Eigenschaften einer energiekonservierenden Hydrogenase aus M. barkeri durchgeführt. Die daraus entstandene Publikation ist im Anhang zu finden.
In der vorliegenden Arbeit wurden neue Methoden für die hochauflösende NMR Spektroskopie entwickelt, um damit native und denaturierte Proteine charakterisieren zu können. Neue Mess- und Anwendungsmethoden für dipolare Kopplungen bilden den Schwerpunkt der Doktorarbeit. Durch die Verwendung von flüssigkristallinen Medien ist es in NMR in Lösung möglich geworden dipolare Kopplungen zu bestimmen. Durch die Projektionen der einzelnen so bestimmten Vektoren auf andere Vektoren im Protein, welche beliebig weit entfernt sein können, kann weitreichende Orientierungsinformationen für die Strukturrechnung von Biomakromolekülen genutzt werden. Dies ist an den Beispielen Ubiquitin, Triggerfaktor und Raffinose in der Arbeit dargestellt. Durch diese Orientierungsinformation kann man auch Teile von Proteinen, wie zum Beispiel Domänen, gegeneinander ausrichten oder die relative Orientierung von Sekundärstrukturelementen nutzen um eine 3D Homologiesuche durchzuführen. Auch dies ist in der Arbeit beschrieben. Die neuen Messmethoden erlauben erstmals die Bestimmung von 1H-1H dipolaren Kopplungen mit Größe und Vorzeichen (JHH-NOESY) und von allen drei dipolaren Kopplungen in einer Seitenkettenmethylgruppe (SPITZE-HSQC). Ein weiterer wichtiger Punkt war die Extraktion dynamischer Parameter aus dipolaren Kopplungen. Der Vektor, der die wechselwirkenden Dipole verbindet, wird von der Dynamik des Proteins beeinflusst. Dadurch ist eine Analyse der Dynamik auf einer Zeitskala bis ca. 10ms möglich (bisher nur bis in den Bereich von ns). Besonders µs Dynamik, welche vorher nicht mittels NMR Methoden sichtbar, kann so dargestellt werden. Aus den dipolaren Kopplungen, welche in 11 verschiedenen Orientierungsmedien gemessen wurden, konnten modellfreie dipolare Ordnungsparameter extrahiert werden. Erstmals konnte zwischen axialsymmetrischen und anisotropen Bewegungen der NH Vektoren unterschieden werden. Unsere experimentellen Daten zeigen, dass Ubiquitin auf einer Zeitskala oberhalb der Korrelationszeit ähnlich viel Bewegung zeigt wie unterhalb der Korrelationszeit. Der mittlere Ordnungsparameter sinkt von 0.8 für Bewegungen bis zur Korrelationszeit auf 0.6 für alle Bewegungszeiten. Auch sieht man, dass viele Bewegungen bis zu 60% Anisotropie beinhalten. TOCSY-Sequenzen sind wichtige Bausteine für Moleküle jeder Größenordnung. Hierfür wurden neue adiabatische TOCSY Sequenzen entwickelt, welche TOCSY Spektroskopie bei allen Magnetfeldern mit höherer Intensität erlauben. Wichtig ist auch noch die viel größere Robustheit gegen B1-Inhomogenitäten und Pulsmisskalibrierung. Dipolare TOCSY Sequenzen (MOCCA) erlauben besseren Transfer mittels den zuvor schon erwähnten dipolaren Kopplungen. Durch die Analyse denaturierter Proteine wollte man ein besseres Verständnis dieses Zustandes erzielen. Hierfür wurden Kopplungskonstanten, kreuzkorrelierte und autokorrelierte Raten und chemische Verschiebungen gemessen und mit einem Modell, dem sogenannten Random Coil Modell verglichen. Mit Hilfe dieser experimentellen Daten sieht man erstmals direkt, dass Proteine im denaturiertem Zustand den Winkel zwischen 60° ( -Helix) und 120° ( -Faltblatt) absuchen.
Charakterisierung intrazellulärer Bindepartner von metabotropen Glutamatrezeptoren der Gruppe III
(2001)
Die Aminosäure Glutamat ist der maßgebliche exzitatorische Neurotransmitter im zentralen Nervensystem, und glutamaterge Synapsen sind weit über das ganze Hirn ver breitet. Neben den Ionenkanalgekoppelten (ionotropen) Glutamatrezeptoren (iGluRs) aktiviert Glutamat auch prä und postsynaptische metabotrope Glutamatrezeptoren (mGluRs), die über trimere GProteine und nachgeschalteten Signalkaskaden Einfluss auf die Signalverarbeitung in der Synapse nehmen können (Pin und Duvoisin, 1995). Diesen Rezeptoren werden Aufgaben bei verschiedenen Formen neuronaler Plastizität und Neurotoxizität zugeschrieben (Pizzi et al., 1993; Pin und Duvoisin, 1995; Pekh letski et al., 1996; Pizzi et al., 1996a; Bushell et al., 1997; Maiese et al., 2000; Sabel haus et al., 2000). Zur Zeit sind acht verschiedene mGluRs zuzüglich ihrer Spleißvarian ten bekannt, die in drei Gruppen gegliedert werden, welche sich in ihrer Lokalisation, Struktur und pharmakologischen Eigenschaften unterscheiden (Nakanishi, 1992; Pin et al., 1993). Mitglieder der Gruppe III mGluRs sind spezifisch an der aktiven Zone der Präsy napse lokalisiert und dort an der Regulation der Neurotransmission beteiligt (Shigemoto et al., 1996; Ottersen und Landsend, 1997). Die Mechanismen, die zur spezifischen Lo kalisation führen, konnten bislang noch nicht aufgezeigt werden. Bereits im Vorfeld dieser Arbeit wurde eine Ca 2 abhängige Interaktion von Calmodulin (CaM) mit mGluR7a durch Kopräzipitationsstudien gezeigt. Die CaMBindung ist dabei von phy siologischer Relevanz für die Aktivierung des Rezeptors (O'Connor et al., 1999). In der vorliegenden Arbeit wurde nach neuen Interaktionspartnern für die Gruppe III mGluRs gesucht, um so weitere Aufschlüsse über die präsynaptische Verankerung und Regulati on dieser Rezeptorgruppe zu gewinnen. In einem ZweiHybridScreen konnten dabei die Proteine PxF und SGT, beides Genprodukte unbekannter Funktion, als zwei mögliche Interaktionspartner für mGluR4b identifiziert werden. Die Natur dieser Interaktionen konnte im Verlauf dieser Arbeit nicht genauer bestimmt werden und bleibt somit Gegenstand weiterer Untersuchungen. In einem parallelem Ansatz wurde die Interaktion von mGluR7a mit CaM näher untersucht. Dabei konnte ein hochkonservierter Bereich in allen Gruppe III mGluRs mit Ausnahme von mGluR4b und mGluR6 identifiziert werden, der eine Konsensussequenz zur CaMBindung (1510Motiv) enthält. Neben der CaMBindung konnte für diesen Bereich in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Dr. Michael Freissmuth auch eine Interaktion mit Gbetagamma nachgewiesen werden. Die GbetagammaBindung an den Rezeptor wird durch Ca 2 abhängige Aktivierung von CaM gehemmt. Es wird daher ein Modell zur dualen Aktivierung von Gruppe III mGluRs vorgeschlagen, welches mögliche Mecha nismen zur negativen Rückkopplung der Glutamatfreisetzung aufzeigt. Zusätzlich wurde eine mögliche Regulation der Gruppe III mGluRs durch PKC Phosphorylierung untersucht. Dabei konnte die in vitroPhosphorylierung eines einzel nen Restes (S862) im intrazellulären CTerminus von mGluR7a nachgewiesen werden, welche zur Hemmung der CaMBindung führte. Aufgrund dieser Daten wird ein erwei tertes Modell formuliert, in dem die Hemmung der Ca 2 /CaMabhängigen Aktivierung der GProteinsignalkaskade durch Phosphorylierung von mGluR7a eine übergeordnete Regulation des Rezeptors darstellt. Da die Gruppe III mGluRs bei Aktivierung zu einer Selbsthemmung der Neuro transmission führen (Pin und Duvoisin, 1995; Takahashi et al., 1996), stellt deren Ca 2 /CaMregulierte Aktivierung und die zusätzliche Regulation durch Phosphorylie rung eine Möglichkeit der Regulation von Lernprozessen dar.
Hsp90 ist ein äußerst vielseitiges Protein, welches nicht strikt cytosolisch anzusiedeln ist. Es besitzt eine Vielzahl von Partnerproteinen zu denen stetig neue hinzukommen und deren Interaktionen längst nicht alle hinreichend untersucht und verstanden wurden. Worin der Unterschied in der Funktionalität von Hsp90 in Eukaryoten und HtpG in Prokaryoten besteht, das Hsp90 für Eukaryoten (auch einzellige) derart essentiell werden lässt, ist absolut unklar. Ein möglicher Grund könnte die Beteiligung von Hsp90 an Transportprozessen in und um den Zellkern darstellen. Der Einfluss von Hsp90 auf den Export von 60S rUE aus dem Zellkern konnte manifestiert werden. Die Einwirkung Hsp90 spezifischer Inhibitoren wie Geldanamycin, Radicicol und Novobiocin zeigten deutliche Effekte in den Transportmessungen sowohl in vitro als auch in vivo. Durch Coinjektionen von Novobiocin und Radicicol in die Oocyten von Xenopus laevis ließ sich der Export von 125J markierten 60S rUE aus dem Zellkern gegenüber den Kontrollen deutlich reduzieren. Damit konnte der mittel- oder unmittelbare Zusammenhang zwischen Hsp90 und dem Export von 60S rUE in vivo erneut bewiesen werden. Hsp90 besitzt mehrere potentielle Phosphorylierungsstellen für die Casein Kinase II. Untersuchungen zeigten, dass die Phosphorylierung von Hsp90 den Effekt auf den in vitro Export von 60S rUE aufzuheben vermag. Die Phosphorylierung von Hsp90 durch die CKII könnte somit eine potentielle Regulationsmöglichkeit von Hsp90 darstellen. Die Phosphorylierung von Hsp90 durch die CKII ließ sich durch die Zugabe von Radicicol deutlich reduzieren. Es ist durchaus möglich, dass die potentielle Phosphorylierungsstelle im Bereich der Bindungsstelle von Radicicol am N-Terminus von Hsp90 zu suchen ist, da auch die Phosphorylierung des N-terminalen Fragments über Radicicol beeinflusst werden konnte. Über Quervernetzungsversuche zwischen Hsp90 und isolierten Zellkernen, konnten Proteine der Kernmembran spezifisch markiert werden. Aufgrund der äußerst geringen Proteinausbeute war eine Analyse sehr schwierig. Lediglich eine Proteinbande konnte schließlich partiell N-terminal ansequenziert werden. Die ermittelten Sequenzen deuten auf ein zu scNup57p homologes Protein der Ratte hin, welches bisher jedoch noch nicht über eine der Proteindatenbanken ermittelbar ist. Transmissionselektronenmikrokopische Aufnahmen von isolierten Rattenleberzellkernen, welche mit einem Anti-Hsp90 Antikörper inkubiert wurden, konnten zeigen, dass Hsp90 neben Komponenten im Bereich des Kernporenkomplex auch an Bestandteile im Nukleoplasma bindet. Da aufgrund der in vitro Messungen bisher ein rein cytosolische Effekt von Hsp90 in Bezug auf den Export von 60S rUE vermutet wurde, könnte dieser Befund nahe legen, dass die Einflussnahme von Hsp90 auf den Transport von 60S rUE wesentlich früher bereits im Nukleoplasma oder in den Nukleoli einsetzen könnte. Wenn dies der Fall ist, könnte Hsp90 auch im Zusammenhang mit den ribosomalen Untereinheiten eine Begleiterfunktion zukommen, welche den Transport vom Ort der Biosynthese bis an die spätere Wirkungsstätte unter Aufrechterhaltung der Funktion gewährleistet. Hierfür könnte auch sprechen, dass Hsp90 mit den 60S rUE interagiert, wie es in Copräzipitationsversuchen gezeigt wurde. Zudem konnte Hsp90 gezielt über proteinäre Bestandteile im Transport befindlicher 60S rUE radioaktiv markiert werden. Es spricht demnach vieles dafür, dass Hsp90 unmittelbar in den Transportprozess der großen ribosomalen Untereinheiten eingreift, und hierbei der Effekt nicht lediglich in der Unterstützung bei der Translokation zu suchen wäre, sondern eventuell schon sehr viel früher im inneren des Nukleoplasmas.
Die Vesikel des sarcoplasmatischen Reticulums (SR) der Skelettmuskulatur von Kaninchen enthalten neben Kanälen hoher (big chloride channel') und geringer (small chloride channel') Leitfähigkeit auch der äußeren Mitochondrienmembran bekannten voltagedependent anionselective channel' (VDAC). Der Kanal konnte mittels Immunodetektion Vesikeln heavy' und light' nachgewiesen, durch Affinitätschromatographie aufgereinigt nach der Spaltung Bromcyan teilsequenziert werden. Die Partialsequenzen beiden erhaltenen Fragmente stimmen Isoform 1 VDAC dem CorneaEndothel Oryctolagus cuniculus (Kaninchen) sowie aus dem Mitochondrium überein. Jedoch weist Kanal unterschiedliche Eigenschaften auf. zeigt Gegensatz dem mitochondrialen VDAC keine Affinität dem AnionenkanalInhibitor SITS bildet SRMembran keine Komplexe anderen Proteinen Bekannte Effektoren mitochondrialen VDAC wie NADH, DCCD antiVDAC Antikörper zeigen SulfatEffluxExperimenten entweder keine oder eine gegensätzliche Wirkung, was einen weiteren Hinweis unterschiedliche Regulationsfaktoren gibt. Die fehlenden Transporteigenschaften des rekonstituierten Kanals unter SulfatEfflux Bedingungen machen seine Beteiligung Sulfattransport und somit Transport SR sehr unwahrscheinlich. Vielmehr scheint den Transport von Nucleotiden, besonders ATP, SRLumen vermitteln. Allerdings weist auch hohe Affinitäten einem speziell synthetisierten GTPAnalogon auf könnte deshalb dem bekannten Eintransport von GTP in SRVesikel beteiligt sein. Nucleotide werden SRLumen Phos phorylierung verschiedener Proteine Sarcalumenin, HCP (histidinerich protein') und Calsequestrin benötigt, neben ihrer Funktion Speicher auch der Regulation Release beteiligt sind. den Vesikeln sarcoplasmatischen Reticulums existieren mindestens zwei Proteine, durch Immunodetektion Affinitätsmarkierung mit einem radioaktiv markierten GTPAnalogon nachgewiesen wurden. greifen regulierend in den Anionentransport SR ein, Antikörper gegen G Untereinheit dieser Proteine den Sulfattransport hemmen. Diese Wirkung scheint allerdings direkt erfolgen nicht über second messenger'. Einen weiteren Hinweis GProteinvermittelte Regulation Anionentransports stellt sehr effiziente Hemmung des SulfatEfflux SRVesikeln durch Suramin verschiedene Arbeitskreis synthetisierte Suraminderivate Ein Analogon, spezifisch GProteingekoppelten Ionenkanälen (P2Y Purinoceptoren) Wechselwirkung und bindet eine alpha Untereinheit der SRVesikel. Ein weiteres Derivat, SB 22, zeigt ebenfalls Affinität zu dieser G alpha Untereinheit sowie zu einem anderen Protein (40 kDa) und der Ca ATPase. ATPase keine Transport eigenschaften für Sulfat aufweist, muß die hemmende Wirkung auf den Anionentransport entweder durch Modifikation einer Galpha Untereinheit oder Zeit noch nicht näher charakterisierten Proteins erfolgen. Der VDAC zeigt Suraminderivaten gegenüber inert und kommt deshalb nicht Sulfattransporter des sarcoplasmatischen Reticulums Frage.
In dieser Arbeit wurde der neuronale Glutamattransporter EAAC1 (Excitatory Amino Acid Carrier 1), kloniert aus Rattenretina, in HEK (Human Embryonic Kidney) Zellen transient exprimiert und mit Hilfe der patch clampTechnik elektrophysiologisch untersucht. Der Glutamattransport ist gekoppelt an den Kotransport von drei Natriumionen und einem Proton und den Gegentransport von einem Kaliumion. Damit werden pro Transportzyklus zwei positive Nettoladungen in die Zelle verschoben. Zusätzlich zum Glutamattransport verfügt der EAAC1 über eine Glutamatinduzierte Anionenleitfähigkeit, die nicht thermodynamisch an den Glutamattransport gekoppelt ist und besonders deutlich bei chaotropen Anionen (wie SCN ) in Erscheinung tritt. Eine weitere Funktion des Transporters ist seine Glutamatunabhängige Leckleitfähigkeit. Mit Hilfe von Ganzzellableitungen unter definierten ionalen extra und intrazellulären Bedingungen und bestimmtem Haltepotenzial erfolgte die Charakterisierung des Glutamattransporters von der extrazellulären Seite. Eine hohe Überexpression von EAAC1 in den HEKZellen, mit einer durchschnittlichen Dichte von # 4#10 3 Transporter pro µm 2 Zellmembran, erlaubte zudem die Beschreibung des Transporters von der intrazellulären Seite, durch Messungen am insideout patch. Stationäre Messungen an EAAC1 unter kontrollierten Spannungs und ionalen Bedingungen ließen verschiedene Aussagen zu über 1) die Bindungsreihenfolge von Glutamat und den kotransportierten Ionen an den Transporter, 2) den Anteil der Anionenleitfähigkeit am Glutamatinduzierten Gesamtstrom 3) die Abhängigkeit der Glutamatunabhängigen Leckleitfähigkeit und der Glutamatabhängigen Anionenleitfähigkeit von der Protonen und Natriumkonzentration und 4) die Identifikation des Ladungsträgers beim EAAC1assoziierten Leckstrom. Bei den durchgeführten vorstationären Messungen handelte es sich meist um SubstratsprungExperimente mit Hilfe der LaserpulsPhotolyse von #CNBcaged Glutamat. Damit konnte 1) der geschwindigkeitsbestimmende Schritt im Transportzyklus ermittelt werden, 2) Geschwindigkeitskonstanten verschiedener Teilreaktion im Transportzyklus von EAAC1 abgeschätzt werden und 3) die Spannungsabhängigkeit von Teilreaktionen identifiziert werden. Die Kombination von stationären und vorstationären Messungen mit Hilfe der LaserpulsPhotolyse sowie die Kombination von Ganzzellableitungen und insideout patches ermöglichte damit eine umfassende kinetische Untersuchung der verschiedenen Funktionen von EAAC1 und führten zu dem im folgenden beschriebenen Transportmodell. EAAC1 bindet auf der extrazellulären Seite zunächst ein Natriumion, wobei die Natriumbindungsstelle im elektrischen Feld der Membran liegt (# 25#30 %). Dieser Na beladene Transporterzustand ist assoziiert mit einem Glutamatunabhängigen Leckstrom, der von Anionen getragen ist. Der Na Bindungsreaktion schließt sich eine elektroneutrale Protonenbindung an. Der apparente pKWert des Protonakzeptors in EAAC1 liegt bei # 8, sodass unter physiologischen Bedingungen EAAC1 hauptsächlich in seiner protonierten Form vorliegt. Die nachfolgende Glutamatbindung (KD # 50 µM) ist ebenfalls spannungsunabhängig und erfolgt mit einer Geschwindigkeitskonstanten von # 2#10 7 M #1 s #1 . Sie löst eine elektroneutrale Konformationsänderung aus, die in einem Zeitbereich von 0,5#1 Millisekunde stattfindet und damit langsam ist im Vergleich zu den anschließenden elektrogenen Na Bindungsreaktionen. Der vollständig beladene Transporters transloziert in einem spannungsabhängigen Prozess (# 60#65 % des elektrischen Felds) Glutamat über die Membran mit einer Geschwindigkeitskonstanten von # 800 s #1 bei einem physiologischen Membranpotenzial von #80 mV. Der GlutamatTransportprozess ist mit der Glutamatinduzierten Anionenleitfähigkeit assoziiert, wobei sich beim GlutamatEinwärtstransport ein Verhältnis zwischen Transport und Anionenstrom (von SCN # ) von 1 zu 4 ergab, während es beim GlutamatAuswärtstransport bei 1 zu 1,5 lag. Die Dissoziationsfolge auf der intrazellulären Seite wurde nur für den Protonen-GlutamatKotransport bestimmt und war in umgekehrter Reihenfolge zur extrazellulären Seite. Verschiedene Mechanismen fördern auf der zytosolischen Seite die Dissoziation des Glutamates, bzw. verhindern den GlutamatAuswärtstransport. So führt die Änderung der Zugänglichkeit des Protonakzeptors zur zytosolischen Seite zu einer Verschiebung des apparenten pKWertes zu # 6,5. Damit liegt EAAC1 unter physiologischen Bedingungen auf der intrazellulären Seite hauptsächlich deprotoniert vor, was die Glutamatdissoziation fördert. Ebenso ist die Affinität mit einem 45fach erhöhten K M Wert im Vergleich zur extrazellulären Seite stark herabgesetzt. Die Relokation des Transporters erfolgt nach der Bindung eines Kaliumions und stellt mit einer Geschwindigkeitskonstanten von # 100 s #1 (bei einem Membranpotenzial von #80 mV) den hauptsächlich geschwindigkeitsbestimmenden Schritt im Transportzyklus dar. Bei der Relokation handelt es sich um einen elektrogenen Prozess (# 70#75 % des elektrischen Felds), wobei negative Ladungsträger über die Membran verschoben werden. Daher muss der Transporter über eine Eigenladung von < #1 verfügen. Daraus ergibt sich, dass die zu transportierende Nettoladung von zwei positiven Ladungen pro Transportzyklus auf zwei Reaktionsschritte verteilt ist. Der neuronale Glutamattransporter EAAC1 verfügt damit über verschiedene Mechanismen, den Transportprozess in Richtung Glutamataufnahme in die postsynaptische Nervenzelle zu fördern, entsprechend seiner physiologischen Aufgabe, die Glutamatkonzentration im synaptischen Spalt gering zu halten.
Ziel dieser Arbeit war es, mit der Methode der NMR-Spektroskopie strukturelle und funktionelle Eigenschaften von Fettsäurebindungsproteinen zu untersuchen. NMR-Spektren von Proteinen mit hohem -Faltblattanteil, wie H-FABP, zeigen häufig eine große Dispersion mit einer typischen Verteilung tief- und hochfeldverschobener Signale. Es wurden 1D/2D 1H-NMR Spektren für den Wildtyp und mehrere Mutanten (F4E, F4S, F4S/W8E, W8E, F16E, F16S, K21I, F64S, L66G und E72S) des humanen H-FABP aufgenommen und so weit wie möglich zugeordnet. Auf diese Weise ließ sich bestimmen, ob die typische -Faßstruktur des Wildtyp bei den Mutanten noch intakt ist. Fast alle Mutanten wiesen eine Signalaufspaltung von 10,2 bis 0,4 ppm wie der Wildtyp auf, nur die W8- Mutanten W8E und F4S/W8E zeigen keine Struktur mehr. H-FABP zeigt in NMR-Spektren sogenannte Spinsystem-Heterogenitäten, die auf mehrere parallel existierende konformationelle Zustände zurückzuführen sind und im NMR- Zeitfenster ( < 200 ms) nicht untereinander austauschen. Diese Spinsystem-Heterogenitäten werden nicht direkt durch Liganden verursacht, da sie auch in delipidierten H-FABP-Spektren vorhanden sind. Noch sind sie abhängig von der Position der in räumlicher Nachbarschaft befindlichen Seitenkette des F57, da sie auch in den Spektren einer F57S-Mutante anwesend sind. Eine Relipidierung der H-FABP Proben mit unterschiedlichen Fettsäuren führte zu einer selektiven Bevorzugung einzelner Spinsysteme. So konnte gezeigt werden, daß die Ligandenbindung beim H-FABP nach einem ,,selected-fit" Mechanismus abläuft, bei dem je nach gebundenem Liganden (Palmitin-, Palmitolein-, Stearin- oder Ölsäure) unterschiedliche, schon vorher vorliegende Konformationen des Proteinrückgrates bevorzugt werden. Ein weiterer Teil der hier vorliegenden Arbeit war die Bestimmung der Lösungsstruktur des humanen B-FABP. Es wurde zur Strukturaufklärung die holo-Form des Proteins verwendetet, die ein Fettsäuregemisch endogener Fettsäuren enthielt. Durch den Einsatz mehrdimensionaler homonuklearer und 15N-editierter NMR-Experimente gelang es, nahezu alle 1H und 15N Resonanzen der Aminosäuren zuzuordnen. Lediglich für K37 konnten in den Spektren keine Signale gefunden werden. Nach einer automatisierten Zuordnung der aus den NOESY-Spektren gewonnenen Abstandsbeschränkungen wurde zur Verfeinerung der Lösungsstruktur des humanen B-FABP ein strukturgefilterter Iterationsprozeß durchlaufen. Mit 2490 Abstandsrandbedingungen zwischen Protonenpaaren sowie 106 stereospezifischen Zuordnungen wurden Torsionswinkeldynamikrechnungen mit abschließender Energieminimierung durchgeführt. Ein mittlerer globaler RMSD-Wert der Proteinrückgratatome von 0,85 ± 0,12 Å erfüllt die Ansprüche einer hochaufgelösten Struktur. Die Tertiärstruktur entspricht einem -Faß bzw. einer -Muschel. Sie besteht aus zehn antiparallelen -Faltblattsträngen und einer kurzen Helix-Turn-Helix Domäne. Die - Faltblattstränge bilden zwei nahezu orthogonale -Faltblätter von jeweils fünf Strängen. Die Lösungsstruktur ähnelt trotz teilweise niedriger Sequenzhomologie den bereits bekannten Strukturen der FABPs aus unterschiedlichsten Organismen. Eine sehr gute Übereinstimmung wurde im Vergleich mit der Lösungsstruktur des H-FABP beobachtet. Die enge Verwandtschaft beider zur Unterfamilie IV gehörenden Proteine äußert sich durch die hohe Sequenzhomologie (67%), die Ähnlichkeit der Konformation und Bindungsaffinität der Liganden, die helikale Konformation am N-Terminus (V1-F4) und ein vergleichbares Wasserstoffbrückennetzwerk innerhalb der Bindungstasche.
Ziel der Arbeit war es, die strukturellen Eigenschaften einer flüssigen Vorstufe einer Mullitkeramik mit Hilfe der NMR-Spektroskopie zu untersuchen. Die fertige Keramik soll später im Triebwerksbau in der Luft- und Raumfahrttechnik eingesetzt werden. Dazu wurden NMR-Messungen an den Kernen 1 H , 13 C, 27 Al und 29 Si durchgeführt. Als Experimente kamen dabei sowohl eindimensionale als auch zweidimensionale Methoden der NMR-Spektroskopie zum Einsatz. Zur Bildung von Strukturhypothesen wurden verschiedene Modellsysteme im Rechner simuliert. Eine besondere Herausforderung bei der Messung und Interpretation der Spektren stellte die hohe Viskosität der verwendeten Proben dar. Diese hohe Viskosität der Proben führte zu einer starken Verbreiterung der Resonanzlinien in den NMR-Spektren und zu den gezeigten Schwierigkeiten bei den Diffusionsmesungen. Die in der Literatur beschriebene strukturelle Vielfalt der Aluminiumalkoholate konnte nicht nur, wie in der Literatur bekannt, mit Hilfe von Aluminiumspektren, sondern auch über Protonen und Kohlenstoffspektren nachgewiesen und beschrieben werden. Insbesondere konnten Struktureinheiten jenseits der bekannten dimeren, trimeren und tertameren Strukturen der Aluminumalkoholate beschrieben werden. Das trimere Aluminiumsekundärbutylat steht mit einer dimeren Form im Gleichgewicht. Durch Temperaturerhöhung wird dieses Gleichgewicht in Richtung der dimeren Form verschoben. Im Falle der Verbindung [Al(OBu) 2n (iP rEtO) n ] konnte die direkte Nachbarschaft der 2-Butanol und iso-Propoxyethanolreste im Komplex über Signale im ROESY-Spektrum aufgezeigt werden. Es konnte eine sehr exakte und reproduzierbare Methode zur Bestimmung von Diffusionskonstanten in viskosen, gelartigen Lösungen mittels NMR-Messungen gefunden und erfolgreich auf die zu beobachtenden Systeme adaptiert und verwendet werden. Nur mit Hilfe dieser Methode war es möglich, den supramolekularen Charakter der Vorstufen einer Mullit-Keramik nachzuweisen. Insbesondere konnte gezeigt werden, daß das vorgestellte System eine hochgeordnete Struktur aufweist, und daß die einzelnen molekularen Einheiten über nicht kovalente Wechselwirkungen miteinander verbunden sind.
Bestimmung der Lösungsstruktur von Rinder-Adrenodoxin durch Auswertung hochaufgelöster NMR-Spektren
(2001)
Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung der Strukturen von RinderAdrenodoxin im oxidierten und im reduzierten Zustand. Die rekombinante Form dieses Elektronentransportproteins aus 128 Aminosäuren und dem [2Fe2S]EisenSchwefel Cluster mit einer Molmasse von 14,4 kDa wurde in E. coli exprimiert. Die hergestellten Proben wurden entweder mit 15 N oder 15 N, 13 Cangereichert, was den Einsatz einer breiten Palette heteronuklearer NMRExperimente ermöglichte. Nach der Zuordnung individueller Werte der chemischen Verschiebung für die NMRaktiven Kerne konnten durch 15 N und 13 Ceditierte dreidimensionale NOESYExperimente 1800 strukturrelevante Interprotonenabstände qualitativ bestimmt werden. Insgesamt konnten 70 Prozent der Resonanzen der NMR aktiven Kerne der jeweiligen Proteinzustände zugeordnet werden. Bedingt durch den paramagnetischen Einfluß des EisenSchwefelClusters waren durch enorme Linienbreiten und sehr schnelle T 1 Relaxationszeiten 30 Prozent der zu erwartenden Signale des Proteins nicht detektierbar. Zusätzlich konnten durch die Anwendung eines ct( 15 N, 1 H)HSQC Experiments weitere 18 Abstandsparameter von Amidprotonen im Einflußbereich des EisenSchwefelCluster, die aber gerade noch detektiert werden konnten, zu dem jeweiligen näheren Eisenkern gewonnen werden. Für die Strukturrechnung mußte der EisenSchwefelCluster künstlich mit der Aminosäure C46 verbunden werden, da das Programm DYANA keine Eisen Atome erkennt. Anschließend wurde dieser 'künstliche' Aminosäurerest neu benannt (CYSC). Diese neue Aminosäure wurde dann nach Energieminimierung in die DYANA Bausteinbibliothek eingebracht. Es zeigte sich, daß der EisenSchwefelCluster die Struktur wie eine 'Klammer' zusammenhält. Ohne die Einbindung des EisenSchwefelCluster kommt es nach der Strukturrechnung zu keiner Struktur, sondern zu einem ungeordneten 'Knäuel'. Bei der Interpretation der Strukturensembles wurde deutlich, daß Rinder Adrenodoxin ein relativ rigides Protein ist. Scheinbar hohe flexible Bereiche im Protein mußten korreliert werden mit den Bereichen des Proteins, die aufgrund von fehlenden Zuordnungen nicht gut genug definiert werden konnten. Es ist somit nicht definitiv zu bestimmen, woher diese Abweichung in den Strukturen herrührt. Allerdings wurde bei der Betrachtung von Aminosäureresten in der Wechselwirkungsdomäne deutlich, daß an den Positionen der Aminosäurereste D72, E73, D76 und D79 es zu Bewegungen beim Übergang aus dem oxidierten in den reduzierten Zustand kommen muß, da speziell die Aminosäurereste D72 und E73 ihre Position dramatisch verändern. Entsprechende Änderungen der Werte der X1 Diederwinkeleinstellungen wurden beobachtet und lokale Ramachandran Diagramme ergeben sich aus den Rechnungen. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß im reduzierten Zustand S112 mit einer T 1 Relaxationszeit von 62,5 ms im Einflußbereich des EisenSchwefelCluster liegen könnte. Ein Hinweis darauf ist auch die Änderung der Geometrie des C Terminus, da im oxidierten Zustand dieser gerade vom Proteinkörper wegweist, während im reduzierten Zustand das Cterminale Ende sich in Richtung Proteinkörper biegt. Bisher wurde angenommen, daß dem CTerminus keine funktionelle Rolle zukommt. Die Struktur des Adrenodoxins wurde nach der Distanzgeometrierechnung unter Berücksichtigung aller experimenteller Daten erhalten. RinderAdrenodoxin ist klassifiziert als ein (alpha beta)Protein welches 22% betaFaltblatt, 17% alphaHelix und 6% 3 10 Helix besitzt. Für den oxidierten und den reduzierten Zustand konnten jeweils 5 betaFaltblätter und 4 Helices identifiziert werden. Beim oxidierten Zustand erstrecken sich die 5 betaFaltblätter auf die Aminosäurereste 812, 1822, 5759, 8889 und 103106, während beim reduzierten Adrenodoxin sie sich auf die Aminosäurereste 612, 2124, 5758, 8889 und 103106 erstrecken. Die 4 identifizierten Helices erstrecken sich im oxidierten Zustand auf die Reste 2935, 6466, 7229 und 98100. Die 4 Helices für den reduzierten Zustand werden durch die Reste 3336, 6164, 7275 und 98100 charakterisiert. Der EisenSchwefelCluster ist kovalent an die vier CysteinReste 46, 52, 55 und 92 gebunden. Mit einem mittleren globalen RMSDWert der Rückgratatome zur Mittelstruktur für das oxidierte Adrenodoxin von 0,94 Å und für das reduzierte Andrenodoxin von 1,53 Å sind die Anforderungen an relativ gut aufgelöste Strukturen erfüllt. Die hier bestimmten Strukturen entsprechen in ihrer Güte einer Kristallstruktur mit der Auflösung von 2.0 Å (Programm PROCHECK) für den reduzierten und den oxidierten Zustand von RinderAdrenodoxin und sind somit zufriedenstellend aufgelöst.
1. Die Membran des SR besitzt mehrere unterscheidbare Transportsysteme für organische und anorganische Anionen. Diese Transportsysteme lassen sich durch Anionenfluxmessungen mit der FilterassayMethode und durch Einzelkanalmessungen mit der Planarmembrantechnik charakterisieren. Der Vergleich der mit beiden Methoden ermittelten Daten ergibt, dass der 35 SO 4 2 Flux unter Standardbedingungen durch den als BCl (Big Chloride Channel) bezeichneten Chloridkanal bewerkstelligt wird und eine Steigerung der Effluxrate im Vesikelfluxexperiment auf die zusätzliche Aktivierung des als SCl (Small Chloride Channel) bezeichneten Chloridkanals zurückzuführen ist. 2. Neben Chlorid und Sulfat werden auch andere organische und anorganische Anionen wie Jodid, Pyrophosphat, Oxalat und Nukleotide transportiert. 3. Der stärkste Hemmstoff von 35 SO 4 2 und NukleotidTransport ist der PurinozeptorAntagonist Suramin mit einer I 50 von 0.91.16 µM. 4. Eine Stimulation des 35 SO 4 2 Transports kann durch die Kationen Calcium, Magnesium und Cholin erreicht werden. Ebenso wirken Hemmstoffe des RyR wie Ryanodin und Atractylosid stimulierend bzw. aktivierend. 5. 35 SO 4 2 Influx und Efflux werden durch Nukleotide unterschiedlich beeinflusst. Der Efflux wird in Abhängigkeit von Nukleotidbase, Anzahl der Phosphatreste und der Ladung gehemmt. Unter Magnesiumeinwirkung ist der Hemmeffekt verstärkt und auch das als nicht hydrolysierbar geltende ATP Analogon AMPPNP wirkt inhibierend. Der maximale 35 SO 4 2 Influx hingegen ist in Anwesenheit von ATP erhöht. Die ATPAnaloga AMPPNP und AMP PCP zeigen diesen stimulierenden Effekt nicht. 6. ATP und GTP werden in Anwesenheit von SRProtein schnell ab und umgebaut. Dieser Umbau lässt sich durch Magnesium und verschiedene Hemmstoffe des Anionenfluxes beeinflussen. 7. Der Eintransport von Nukleotiden in das Lumen des SR lässt sich durch Hemmstoffe des Anionenfluxes inhibieren. Die zusätzliche Hemmbarkeit durch Atractylosid, einen Inhibitor des mitochondrialen ATP/ADP Translokators (AAT), impliziert die Möglichkeit einer Beteiligung dieses Transportproteins am Nukleotidtransport. 8. Inhibitoren der Ca 2 ATPase hemmen auch den Anionenflux. Die Vermittlung des Anionentransports durch die Ca 2 ATPase selbst sowie die Hemmung des Ca 2 Eintransports aufgrund der Inhibition der Anionenkanäle sind ausgeschlossen. Vesikel mit rekonstituierter Ca 2 ATPase weisen keinen Anionen transport auf, obwohl der Ca 2 Eintransport durch Anionenkanalhemmstoffe wie Suramin, DIDS und PPANS inhibiert werden kann. 9. Beim Anionenflux eingesetzt zeigen Aktivatoren und Inhibitoren des Ca 2 ReleaseKanals gegenläufige Effekte. Der Ca 2 ReleaseKanal ist nicht der Vermittler des Anionentransports. Anionentransporter sind im RyRfreien longitudinalen SR ebenso häufig wie in den RyRreichen terminalen SR Zisternen.
Im Rahmen einer genomumfassenden Suche nach biologisch aktiven Proviren des Typs HERV-K konnten insgesamt zwei Genorte den humanen Chromosomen C7 bzw. C19 zugeordnet werden. Beide Proviren weisen ORF für die retroviralen Gene gag, pol und env auf. Während der Genort HERV-K(C19) infolge eine Punktmutation ein defektes Proteasegen trägt und durch eine Deletion der 5´LTR transkriptionell inaktiv ist, besitzt der Genort HERV- K(C7) zwei intakte LTRs, deren Homologiegrad auf ein phylogenetisch junges Alter hindeutet. Mit Ausnahme eines Aminosäureaustausches innerhalb eines hochkonservierten Sequenzmotivs der reversen Transkriptase, der den Verlust der enzymatischen Aktivität zur Folge hat, kann der Genort HERV-K(C7) als das derzeit intakteste Provirus der Familie HERV-K angesehen werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit sprechen für eine HTDV- Partikelproduktion durch Komplementation unterschiedlicher Genorte und gegen die Existenz eines funktionellen und vermehrungsfähigen HERV-K Provirus mit allen retroviralen Charakteristika im menschlichen Genom. Desweiteren wurden mit HERV-K10 und HERV-K18 zwei bekannte Vertreter der Familie HERV-K eingehend untersucht. Zusätzlich zu der chromosomalen Zuordnung der Proviren gelang der experimentelle Nachweis eines intakten gag Genes für HERV-K10. Für HERV- K18 konnten ausgeprägte Homologien zu dem Superantigen-kodierenden Provirus IDDMK1,222 festgestellt werden. Bei den in dieser Arbeit vorgestellten Klonen pPERV-B(33), pPERV-A(42) und pPERV- B(43) handelt es sich um die ersten intakten Proviren der xenotropen Klassen PERV-A und PERV-B. Die vollständige Sequenzierung ermöglichte eine eingehende molekularbiologische Charakterisierung dieser C-Typ Viren. Computergestützt konnte eine PBS für eine tRNAGly4 sowie das Polyadenylierungssignal identifiziert werden. Der Sequenzvergleich offenbarte ein repetitives 39 bp Motiv, welches in unterschiedlicher Anzahl in den jeweiligen LTRs vorzufinden ist. Experimentell wurden der Transkriptionsstart und die verwendeten Spleißstellen identifiziert. Durch Rekombination konnten die molekularen Klone pPERV- B(33)/ATG und pPERV-B(43)/LTR generiert werden, die nach Transfektion in 293 Zellen zur Produktion infektiöser Partikel führten, welche sich seriell passagieren liessen. Mit Kenntnis der Genomorganisation und der RNA Expressionscharakteristika von PERV wurde eine RT PCR Virusdiagnostik etabliert mit deren Hilfe hochsensitiv differentiell PERV-A und PERV-B Transkripte detektiert werden können.
Membranproteine der renalen Bürstensaumzellen spielen eine wichtige Rolle beim Transport von organischen Kationen in der Niere. Mit der ersten Klonierung eines Transporters für organische Kationen wurden die Grundlagen für eine Aufklärung der Transportvorgänge auf molekularer Ebene gelegt. Der Transportmechanismus und die physiologische Funktion des in den Plasmamembranen von Niere und Gehirn exprimierten Transporters für organische Kationen 2 (OCT2) werden zur Zeit -- teilweise kontrovers -- diskutiert. In dieser Dissertation wurde der aus der Rattenniere klonierte elektrogene Transporter für organische Kationen rOCT2 nach heterologer Expression in Oozyten des Krallenfrosches Xenopus laevis mit elektrophysiologischen Methoden charakterisiert. Zur Anwendung kam neben der konventionellen ZweiElektrodenSpannungsklemme vor allem die ''giant patch clamp"Technik. Als neue Methode speziell für Transstimulationsexperimente bei geklemmtem Membranpotenzial wurde die amperometrische Spannungsklemme entwickelt, mit der ein Ausstrom von Dopamin aus vorinkubierten Oozyten mittels Oxidation an einer CarbonfaserElektrode bei gleichzeitiger Aufzeichnung des elektrischen Transmembranstromes gemessen werden kann. Die Kontrolle der physiologischen Salzlösungen beiderseits der Membran in ''patch clamp" Experimenten erlaubte eine leichte Unterscheidung wechselwirkender Substanzen in Substrate wie: Cholin, Dopamin, Tetramethylammonium und Tetraethylammonium und Hemmstoffe wie: Chinin und Tetrabutylammonium (TBA). Anhand von substratinduzierten elektrischen Ausströmen konnten erstmalig für einen Transporter für organische Kationen apparente Substrataffinitäten von der zytoplasmatischen Seite bestimmt werden. Sie liegen in derselben Größenordnung wie zuvor auf der extrazellulären Seite bestimmte Affinitäten. Der schon früher vorgeschlagene elektrogene Ausstrom von Substrat auch gegen ein negatives Membranpotenzial wurde damit bestätigt. Es wurde eine Hemmung rOCT2vermittelter Ströme durch Schwermetalle und durch Isobutylmethylxanthin gefunden. Die zytoplasmatische Zugabe der Inhibitoren TBA und Chinin hemmte sowohl substratinduzierte Einwärts als auch Auswärtsströme. Die Inhibierung der Auswärtsströme erfolgte dabei kompetitiv. Von der extrazellulären Seite aus hemmte Chinin im Gegensatz zu TBA Einwärtsströme nichtkompetitiv, was auf eine Transinhibierung nach einer unspezifischen Membranpassage des Chinins hindeutet. Die Analyse von StromSpannungskennlinien zeigte, dass die maximalen Transportraten und apparenten Affinitäten der Substrate spannungsabhängig sind. Umkehrpotenziale, die in Anwesenheit von Substrat beiderseits der Membran gemessen wurden, lagen bei den durch die Nernstgleichung vorhergesagten Werten. Dieses Ergebnis identifiziert das elektrochemische Potenzial als treibende Kraft für den Transport von organischen Kationen bei neutralem pH und schließt die Existenz eines elektroneutralen OrganischeKationen/ProtonenAustauschmodus aus. Die rOCT2spezifische Leitfähigkeit war bei sättigenden Konzentrationen von organischen Kationen beiderseits der Membran im Vergleich zu halbsättigenden reduziert. Diese Beobachtung ist mit einem zyklischen Transportmodell erklärbar, bei dem der Transporter nach erfolgtem Transport eines organischen Kations entweder als leerer Transporter oder mit einem auf der anderen Seite gebundenen Kation in seine Ausgangstellung zurückkehren kann, wobei die Translokation der Bindungsdomäne jeweils mit einer Konformationsänderung des Transporters einhergeht. Der Austausch von organischen Kationen erfolgt dabei elektroneutral. Einen weiteren Beleg für einen elektroneutralen Austauschmodus für organische Kationen liefern amperometrische Messungen an reversibel mit Dopamin beladbaren Oozyten. Es konnte ein rOCT2vermittelter, durch Chinin hemmbarer Dopaminausstrom gemessen werden, der in Abhängigkeit des Membranpotenzials durch extrazelluläres Cholin entweder transstimulierbar oder transinhibierbar war. Die im Rahmen dieser Dissertation durchgeführten Untersuchungen belegen, dass rOCT2 als basolateral lokalisierter Transporter hervorragend dazu geeignet ist, mit der vom elektrochemischen Potenzial getriebenen Substrataufnahme in die Bürstensaumzellen den ersten Schritt der Sekretion von organischen Kationen durch die Niere zu leisten. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass rOCT2 bei einem ausreichenden Konzentrationsgradienten von Cholin bei der physiologisch bedeutsamen Reabsorption von Cholin beteiligt sein könnte, indem dieses gegen das negative Membranpotenzial, womöglich im Austausch gegen ein anderes organisches Kation, transportiert wird. Zeitaufgelöste Messungen mit Substrat oder Spannungssprüngen sowie Bindungs und Transportstudien nach gezielter Mutagenese könnten zukünftig einer weiteren Aufklärung des Transportmechanismus dienen. Einige die Charakterisierung von rOCT2 in ''inside out"Patchen betreffende Ergebnisse dieser Dissertation wurden bereits im Journal of Biological Chemistry veröffentlicht und auf internationalen Konferenzen präsentiert. Andere Ergebnisse sind Teil einer vom American Journal of Physiology zur Veröffentlichung angenommenen Arbeit und eine weitere Veröffentlichung ist in Vorbereitung.
Der Cytochrom-bc1-Komplex katalysiert die Elektronenübertragung von Ubihydrochinon auf Cytochrom c in der Atmungskette und in der bakteriellen Photosynthese. Das Enzym stellt somit das Bindeglied zwischen den Ubihydrochinon bildenden Dehydrogenasen und der Cytochrom c oxidierenden Cytochrom-c-Oxidase dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Wechselwirkungen des Cytochrom-bc1-Komplexes aus Saccharomyces cerevisiae mit seinen Substraten Ubichinon und Cytochrom c sowie mit Phospholipiden der inneren Mitochondrienmembran untersucht. Durch Analyse von Gesamtlipidextrakten aus Proben des Cytochrom-bc1-Komplexes konnte gezeigt werden, daß das Enzym in Anwesenheit von vier verschiedenen Phospholipiden gereinigt und kristallisiert werden kann. In der Kristallstruktur des Enzyms bei 2,3 Å Auflösung wurden fünf Bindungsstellen für Phospholipide und eine Bindungsstelle für ein Detergensmolekül identifiziert. Die Bindungsstelle für eines der Phospholipide, ein Cardiolipin-Molekül, liegt am Eingang eines von zwei Protonierungspfaden für die Ubichinon-Reduktionsstelle (Qi-Bindungsstelle). Ein Phosphatidylinosit-Molekül befindet sich in einer außergewöhnlichen Position unweit der flexiblen "Linker"-Region des Rieske Eisen-Schwefel-Proteins und trägt vermutlich zur Stabilisierung dieser katalytischen Untereinheit bei. Durch Röntgenbeugung an Kokristallen bestehend aus Cytochrom-bc1-Komplex und gebundenem Cytochrom c konnte die dreidimensionale Struktur dieses transienten Enzym-Substrat-Komplexes bei 2,97 Å ermittelt werden. Die Kristallstruktur ist die erste Struktur des Cytochrom c im Komplex mit einem seiner beiden Redoxpartner aus der Atmungskette. Sie zeigt, daß das Cytochrom c hauptsächlich durch hydrophobe Wechselwirkungen an das Cytochrom c1 bindet und daß die Nähe der beiden c-Typ Hämgruppen eine schnelle Reduktion des Cytochrom c erlaubt. Im homodimeren Cytochrom-bc1-Komplex ist nur eine der beiden Bindungsstellen für Cytochrom c besetzt. Diese hälftige Substratbindung zeigte sich auch für das Ubichinon in der Qi- Bindungsstelle und weist darauf hin, daß die beiden Monomere des Enzyms unabhängig voneinander oder sequentiell arbeiten können. Möglicherweise dient dies der Regulation der Enzymaktivität des Cytochrom-bc1-Komplexes. Durch partielle Reduktion des Cytochrom-bc1-Komplexes in Anwesenheit von Ubichinon konnte ein proteingebundenes Ubisemichinonradikal erzeugt und durch Schockgefrieren stabilisiert werden. Die spektralen Eigenschaften dieses Radikals sind typisch für ein Ubisemichinon an der Qi-Bindungsstelle. Durch Spektroskopie an einer Probe, die einem Wasserstoff/Deuterium-Austausch unterzogen wurde, konnte gezeigt werden, daß dieses Radikal von Protonen koordiniert wird, die mit dem Solvens im Austausch stehen. Dies steht in Übereinstimmung mit der Theorie des Q-Zyklus und wurde durch die hochauflösenden Kristallstruktur des Enzyms bei 2,3 Å vorhergesagt. Die erzielten Ergebnisse zeigen neue Informationen zum Wechselspiel des Cytochrom- bc1-Komplexes mit Phospholipiden aus der inneren Mitochondrienmembran. Die Bestimmung der Struktur des transienten Komplexes bestehend aus Enzym und Cytochrom c erweitert das Bild über den Elektronentransfer durch Cytochrom c zwischen dem Cytochrom-bc1-Komplex und der Cytochrom-c-Oxidase. Das mögliche Zusammenwirken der Bindungstellen für Cytochrom c und Ubichinon ist ein neuer mechanistischer Aspekt, der auf eine Regulation der Enzymaktivität schließen läßt.
Obwohl die Kristallstrukturen der CytochromcOxidase aus RinderherzMitochondrien und dem Bodenbakterium P. denitrificans bekannt sind und die Funktionsweise des Enzyms mit Hilfe zahlreicher Methoden bereits intensiv untersucht wurde, wird nach wie vor kontrovers diskutiert, an welcher Stelle im katalytischen Zyklus wieviele Protonen aufgenommen bzw. gepumpt werden und über welchen der beiden Protoneneintrittspfade dies geschieht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, diesen Fragestellungen mit Hilfe von elektrischen Messungen nachzugehen, um dann ein genaueres Bild von der mechanistischen Funktionsweise des Enzyms zu erhalten. Hierzu wurden Teilschritte des katalytischen Zyklus der CytochromcOxidase aus P. denitrificans genauer untersucht. Dies gelang durch Spannungsmessungen an der schwarzen Lipidmembran mit Ru II (2,2'bipyridyl) 3 Cl 2 (Rubpy) als lichtinduzierbarem Einelektronendonor. Es konnte gezeigt werden, daß ausgehend vom vollständig oxidierten Zustand O nach Lichtanregung ein Elektron von Rubpy auf die Oxidase übertragen und anschließend vom CuA zum Häm a mit einer Zeitkonstanten von » 20 µs transportiert wird. Zeitaufgelöste spektroskopi sche Messungen deuten darauf hin, daß das Elektron auf dem Häm a verbleibt. Die Reduktion dieses Kofaktors führt zu einer Protonenaufnahme über den KWeg mit einer Zeitkonstanten von » 175 µs. Nimmt man an, daß sich Häm a in der Mitte des Dielektrikums befindet (Hinkle und Mitchell, 1970), so deuten die relativen Amplituden der beiden Phasen an, daß etwa 0.8 Protonen aufgenommen werden, in sehr guter Übereinstimmung mit (Capitanio et al., 2000). Aus MehrfachblitzExperimenten unter anaeroben Bedingungen, ausgehend vom OZustand, konnten erste Erkenntnisse über den E ® R Übergang gewonnen werden, nämlich daß hierbei ein Prozeß mit einer Zeitkonstanten von ca. 1.1 ms auftritt und daß sowohl K als auch DWeg an diesem Teilschritt des katalytischen Zyklus beteiligt sind. Da mit der MehrfachblitzMethode aber immer ein Gemisch aus verschiedenen Zuständen entsteht, war es nicht möglich, quantitative Aussagen über die Zahl der transportierten Ladungen zu treffen. Aus diesem Grund wurde eine Möglichkeit gesucht, den EZustand in hoher Ausbeute mit ausreichender Stabilität herzustellen, um dann ein Elektron zu übertragen. Dies gelang durch Darstellung des OxoferrylZustandes F mit Hilfe von H 2 O 2 und anschließende Zweielektronenreduktion durch CO. Die Übertragung von einem Elektron auf den so gebildeten EZustand lieferte 3 Phasen im Spannungssignal mit Zeitkonstanten von » 25 µs, » 200 µs und » 1.5 ms. Die relativen Amplituden dieser Phasen und die Ergebnisse von K und DWegMutanten legen nahe, daß nach Aufnahme des 2. Elektrons vermutlich ein Proton über den KWeg aufgenommen und anschließend 1 Proton über den DWeg gepumpt wird. Es konnte somit zum ersten Mal gezeigt werden, daß bereits während des reduktiven Teils (O ® R) des katalytischen Zyklus ein Proton von der intrazellulären zur extrazellulären Seite transportiert wird und zwar ohne daß unmittelbar vorher die Sauerstoffreduktion stattgefunden haben muß. Erste Experimente zum P ® F Übergang lassen sich so deuten, daß mit Aufnahme des 3. Elektrons ein Proton zum binuklearen Zentrum transportiert und mindestens 1, wenn nicht gar 2 Protonen durch das Enzym gepumpt werden. Hier sind noch weitere Experimente nötig, um die genaue Zahl der transportierten Ladungen und die für die einzelnen Protonenbewegungen verwendeten Protoneneintrittspfade zu bestimmen. Messungen zum F ® O Übergang schließlich zeigten, daß nach dem CuA ® Häm a Elektro nentransfer mit einer Zeitkonstanten von ca. 25 µs vermutlich 1 Proton über den DWeg bis zu den Hämen transportiert (t » 270 µs) und anschließend ein Proton ebenfalls über den DWeg gepumpt wird (t » 1.5 ms). Aus den gewonnenen Daten wurde ein neuer Mechanismus für die Sauerstoffreduktion in der ParacoccusCOX entwickelt. Dieser beruht auf dem von Mitchell und Rich postulierten Elektroneutralitätsprinzip (Mitchell und Rich, 1994) und ist stark an das von Michel vorgeschlagene Modell (Michel, 1998; Michel, 1999) angelehnt. Zur Klärung der Fragen, ob sich bakterielles und RinderzEnzym eventuell in ihrem Mechanismus unterscheiden oder ob nicht eventuell ein Proton während des O ® E Übergangs gepumpt wird (allerdings nur, wenn unmittelbar vorher die Sauerstoffreduktion durchlaufen wurde), sind u.a. noch intensivere Untersuchungen des P ® F Teilschrittes notwendig. Im Rahmen dieser Arbeit wurden weiterhin 2 verschiedene Kobaltkomplexe auf ihre Eignung als lichtinduzierbare Sauerstoffdonatoren (cagedSauerstoff) für die COX untersucht. Hierbei stellte sich heraus, daß beide Verbindungen ungeeignet sind, da sie entweder instabil sind ((µsuperoxo)bis[pentaammincobalt(III)]) oder Nebenreaktionen mit dem Protein eingehen ((µperoxo)(µhydroxo)bis[bis(bipyridyl)cobalt(III)]). Abschließend wurde der Einfluß von Zn 2 Ionen auf elektrogene Schritte im katalytischen Zyklus genauer erforscht. Es wurde deutlich, daß Zn 2 bakterielle COX von beiden Seiten inhibieren kann, wobei die Bindestelle(n) auf der intrazellulären Seite im Gegensatz zur extrazellulären Seite hochaffin ist/sind. Die elektrischen Messungen deuten darauf hin, daß hierbei sowohl D als auch KWeg blockiert werden, wobei die exakte Position der Metallbindestelle(n) noch zu klären ist.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Apolipoproteine des Liquors untersucht, um bestehende Zusammenhänge nachzuweisen, die eventuell später bei der Diagnose von Erkrankungen eingesetzt werden könnten. Das ApoE aller Proben wurde phänotypisiert. Die Konzentrationen des ApoJ und Apo(a) wurden mit Hilfe selbst- bzw. in der Arbeitsgruppe entwickelter ELISAs bestimmt. Durch Kombination der existierenden ELISAs konnte der von Borghini et al. 1995 beschriebene LpE-Partikel und ein bisher nicht bekannter Apolipoprotein-Partikel aus Apo(a) und ApoE nachgewiesen werden. Die relative Konzentration dieses Apo(a)/E- und des ApoJ/E-Partikels wurde bestimmt. Mit Hilfe der Kreuzimmunelektrophorese konnte nachgewiesen werden, daß die Apolipoproteine Bestandteil eines Partikels sind. Aufgrund der gefundenen Informationen wurde die These postuliert, daß es sich bei diesen Partikeln um einen gemeinsamen Partikel aus ApoE, ApoJ und Apo(a) handelt. Detaillierte Daten über den Aufbau und die Zusammensetzung des Partikels konnten bisher nicht gewonnen werden. Im Liquor wurden die Konzentrationen von ApoE, Apo(a) und ApoJ gemessen. Diese Konzentrationen wurden in Zusammenhang zu dem ApoE-Phänotyp der entsprechenden Probe gesetzt. Wo möglich wurde ApoE und Apo(a) auch im Serum der entsprechenden Patienten bestimmt. Auch diese Konzentrationen wurden in Beziehung zu ihrem ApoE-Phänotyp gesetzt. Zuletzt wurden für die Apolipoproteine E und (a) die Liquor- und Serumkonzentration in Beziehung zueinander gesetzt. Außer für das ApoE und den ApoJ/E-Partikel konnte für keines der untersuchten Apolipoproteine weder im Liquor noch im Serum ein offensichtlicher Zusammenhang zwischen der Konzentration des Apolipoproteins und dem ApoE-Phänotyp gefunden werden. Zusätzlich zu den Apolipoproteinen des Liquors wurde in Zusammenarbeit mit der Universität Dresden das Tau-Protein gemessen. Die Ergebnisse bestätigen die diagnostische Wertigkeit der Bestimmung von Protein Tau bei degenerativen Erkrankungen des ZNS. Eine Differenzierung zwischen verschiedenen degenerativen Erkrankungen des ZNS ist jedoch nicht möglich. Ein weiterer Teil dieser Arbeit untersuchte die Rolle des ApoE im Gehirn. Dabei zeigte sich, daß die Synthese des ApoE durch die Astrozyten ein sehr komplexer Vorgang sein muß. Eine weitere Untersuchung des ApoE wies die stärkere Glykolisierung im Liquor im Vergleich zum Serum nach.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Wechselwirkung des AD-assoziierten Proteins PS1 mit dem Cytoskelett in verschiedenen biochemischen und immuncytochemischen Modellen zu untersuchen. Auf diese Weise sollten Hinweise für das Verständnis der bisher nur in Grundzügen bekannten physiologischen Funktion von PS1 erhalten werden. Ausgehend vom Nachweis der Anreicherung endoproteolytischer PSI-Fragmente in Cytoskelett-Fraktionen aus Hirngewebe wurde die spezifische Assoziation des Proteins mit Mikrofilamenten, Mikrotubuli und Neurofilamenten untersucht. Alle durchgeführten biochemischen und immuncytochemischen Experimente zeigen übereinstimmend die spezifische Assoziation von PS1 mit Mikrofilamenten. So konnten PSI-Fragmente über zwei Depolymerisations/ Polymerisations-Zyklen zusammen mit Actin aus Rattenhirn aufgereinigt werden. Die spezifische Spaltung von Actin-Filamenten durch Gelsolin in cytoskelettreichen Fraktionen aus Hirngewebe führte zur Freisetzung kürzerer Filamente, die nach Zentrifugation zusammen mit PS1- Fragmenten im Überstand erschienen. In immuncytochemischen Färbungen kolokalisierte PS1 mit Actin-Filamenten in primären Gliazellen und der neuronalen Zelinie NT2. Eine vor kurzem veröffentlichte Arbeit zeigte außerdem die Kolokalisation von PS1 und Mikrofdamenten in primären Hippocampus-Neuronen. Die fehlende Kosedimentation von in-vitro translatiertem PS1 und Deletionskonstrukten von PS1 mit aufgereinigten und in-vitro assemblierten Actin-Filamenten, das Fehlen konservierter Actin-Bindungsmotive in der Aminosäuresequenz von PS1 sowie bekannte Interaktionen von PS1 mit Actin-bindenden Vertretern der Filamin- und Armadillo-Proteinfamilien lassen auf eine indirekte Assoziation von PS1 mit Mikrofdamenten schließen. Die vorliegende Arbeit konnte die Frage, welche Rolle Mikrotuli oder Neurofilamente bei der Cytoskelett-Assoziation von PS1 spielen, nicht abschließend Mären. PS1-Fragemente wurden im ersten, nicht jedoch im zweiten Depolymerisations/Polymerisations-Zyklus zusammen mit Tubulin aus Rattenhirn aufgereinigt. In dem gleichen Versuchsansatz kosedimentierte in-vitro translatiertes PS1 nicht mit Mikrotubuli. Immuncytochemische Färbungen zeigten dagegen die Kolokalisation von PS1 mit Mikrotubuli in primären Hippocampus-Neuronen, die auch von zwei aktuellen Arbeiten in primären Hippocampus-Neuronen und murinen Embryonen bestätigt wurde. Die spezifische Depolymerisation von Mikrotubuli in cytoskelettreichen Fraktionen war unter den in der vorliegenden Arbeit verwendeten Bedingungen nicht erfolgreich, so daß aus diesem Experiment keine Aussagen zur Assoziation von PS1 mit Mikrotubuli abgeleitet werden konnten. Es Iäßt sich die Hypothese aufstellen, daß sehr kleine PSI-haltige Vesikel über andere Proteine als PS1 mit Mikrotubuli verbunden sind, so daß PS1 mit Mikrotubuli scheinbar kolokalisiert ist. Hochauflösenden lichtmikroskopische bzw. elektronenmikroskopische Aufnahmen oder biochemische Versuche, die nicht zur Zerstörung der Vesikel durch Detergens führen, könnten für die Überprüfung dieser Hypothese herangezogen werden. In-vitro translatiertes PS1 sowie Deletionskonstrukte von PS1 kosedimentierten nicht mit aufgereinigten und in-vitro assemblierten Neurofilamenten, und in primären Hippocampus-Neuronen kolokalisierte PS1 nicht mit Neurofilamenten. Es wäre jedoch wünschenswert, die Experimente mit geeigneten Positiv-Kontrollen für die Kosedimentation und geeigneteren Antikörpern, die bei einem besseren Signal/Hintergrund-Verhältnis eine stärkere Vergrößerung der Immunfluoreszenzen erlauben, zu wiederholen. Im transgenen Tiermodell beeinträchtigten pathogene Mutationen von PS1 nicht, zumindest nicht quantitativ, die Fähigkeit von PS1, an Cytoskelett-Elemente zu binden. Es wäre jedoch möglich, daß es Unterschiede in der Cytoskelett-Assoziation von wt PS1 und PS1 mit pathogenen Mutationen gibt, die nur im Gewebe von FAD-Patienten zu detektieren sind, nicht aber im transgenen Tiermodell, da die bisher bekannten AD-Tiermodelle nicht alle Aspekte der Erkrankung reproduzieren. Die vorliegenden Ergebnisse können die Basis bilden für weitergehende Untersuchungen zur Funktion von PS1 und der Bedeutung von PS1-Cytoskelettinteraktionen in der Alzheimer Demenz. Aktuelle Arbeiten fokussieren dabei stark auf die Interaktion von PS1 mit Mikrofilament-bindenden Vertretern der Armadillo-Proteinfamilie, die bei Zell-Zell-Adhäsionsprozessen eine wichtige Rolle spielen. Im Diskussionsteil wurde ausgeführt, daß aber, gerade im Hinblick auf die Neurodegeneration bei der Alzheimer Demenz, ein möglicher Einfluß von PS1 auf den schnellen axonalen Transport ein interessanter Ansatz für weitere Versuche sein kann.
Sauerstoff wird in vielen prokaryotischen und eukaryotischen Atmungsketten von der Cytochrom c Oxidase zu Wasser reduziert. Dieses Enzym besteht in Paracoccus denitrificans aus vier Untereinheiten, von denen aber nur die ersten zwei für die Funktion essentiell sind. Elektronen werden von einem membrangebundenen Cytochrom c552 zunächst auf das CuA-Zentrum der Untereinheit II der Oxidase übertragen und gelangen von dort zum low-spin Häm a der Untereinheit I. Am binukleären Zentrum, das aus dem high-spin Häm a3 und dem CuB-Atom besteht, erfolgt schließlich die Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasser. Hauptziel dieser Arbeit war es, die Bindungsstelle für Cytochrom c durch das gezielte Einführen oder Entfernen negativer Ladungen auf der Oxidase-Oberfläche zu bestimmen. Die Charakterisierung dieser Mutanten erfolgte hauptsächlich durch spektroskopische Analyse der kinetischen Parameter unter Umsatzbedingungen. Zusätzlich wurde der Teilschritt der Susbtratbindung durch die Aufnahme von Assoziationskinetiken untersucht. Als Substrat diente das reduzierte mitochondriale Cytochrom c oder ein lösliches Fragment des Paracoccus-Cytochrom c552. Die eingeführten Mutationen beeinflußten in unterschiedlicher Weise die Bindung der beiden verwendeten Substrate. Hierbei ist der negativ geladene Bereich der Oberfläche von Untereinheit II der Oxidase, der zur Bindung des Paracoccus-eigenen Substrats beiträgt, größer als der für die Wechselwirkung mit dem mitochondrialen Cytochrom c. Erstmals kann somit ein Modell für die Bindung des nativen Substrats an die Paracoccus-Oxidase aufgestellt werden. Die aa3-Oxidase aus Paracoccus zeigte keine Elektronentransfereaktion mit dem Cytochrom c552 aus Thermus thermophilus, da dessen Oberfläche nicht die hierfür erforderlichen Ladungen trägt. Durch Erhöhung der Hydrophobizität auf der Untereinheit II der Paracoccus-Oxidase wurde deren Oberfläche so verändert, dass sie nunmehr auch durch dieses „hydrophobe“ Cytochrom c reduziert werden konnte. Der Aminosäurerest W121 auf der Oberfläche der Untereinheit II wurde in der Vergangenheit als ein möglicher Elektroneneintrittsort in die Cytochrom c Oxidase beschrieben. Die in der vorliegenden Arbeit an dieser Position hergestellten Mutanten zeigten zwar drastische Einbußen in den maximalen Wechselzahlen, aber eine weitgehend unveränderte Affinität zum Cytochrom c. Die exakte Positionierung der Seitengruppe des Tryptophans spielt hierbei gegenüber der Aromatizität die entscheidende Rolle. An benachbarten Positionen eingeführte Mutationen ergaben keine Hinweise auf alternative Elektroneneintrittsorte. Durch ortsspezifische Mutagenese auf dem löslichen Cytochrom c552-Fragment wurden die Lysine auf der Oberfläche entfernt, um zu klären, ob die Wechselwirkung zwischen Cytochrom c und Oxidase auf Ladungspaaren beruht oder über das Gesamtpotential der Bindungsstellen bestimmt wird. Die Lysin-Mutanten zeigten alle im gleichen Maße eine reduzierte Affinität zur Oxidase. Die vorliegenden Ergebnisse lassen den Schluß zu, dass die Wechselwirkung zwischen Oxidase und Cytochrom c552 über das Gesamt-Oberflächenpotential vermittelt wird. Steady-state-Kinetiken unter Verwendung von Pferdeherz-Cytochrom c oder Paracoccus Cytochrom c552 weichen von den klassichen Michaelis-Menten-Verhalten ab, da zwei separate Phasen für die Kinetik beobachtet werden. Dieses Phänomen bisher wurde mit der Anwesenheit einer zweiten Bindungsstelle oder einer redoxgekoppelten Konformationsänderung der Oxidase erklärt. Durch Untersuchungen von Oxidase-Präparationen mit unterschiedlicher Untereinheiten-Zusammensetzung oder gebundenem Antikörper konnte gezeigt werden, dass die Biphasizität der Oxidase-Kinetik ! nicht auf der Anwesenheit der Untereinheiten III und IV beruht, ! durch die spezifische Bindung von Antikörpern zu niedrigeren Ionenstärken verschoben wird bei gleichzeitiger Verringerung der Affinität zum Substrat, ! eine intrinsische Eigenschaft aller untersuchten Mutanten ist. Im Rahmen dieser Untersuchungen konnten keine Hinweise auf eine zweite Cytochrom c Bindungsstelle gefunden werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Expression, Reinigung und Charakterisierung des homologe, membrangebundenen Cytochrom c552 aus P. denitrificans. Das Protein wurde mit einem Histidin-Tag versehen und heterolog in E. coli in guter Ausbeute exprimiert und gereinigt. Seine Charakterisierung über steady-state-Messungen ergab ein deutlich verschobenes pH-Optimum mit höherer Affinität zur Oxidase im Vergleich zu seinen verkürzten löslichen Fragmenten.
Als Ergebnisse der vorliegenden Arbeit kann man folgendes festhalten: • Die zuverlässige Bestimmung der leichten Elemente Phosphor und Schwefel mit TXRF ist im Konzentrationsbereich 30 mg/l bis 0,1 mg/l (600 ng bis 2 ng) grundsätzlich möglich. • Die Bestimmung von Schwefel in Proben, die dazu tendieren dicke, dichte Probenrückstände zu bilden (z.B. Alkalimetallsulfate) erfordert eine spezielle Probenpräparation. Hier können durch den Einsatz von geeigneten Glättungsmitteln gute Ergebnisse erzielt werden. • Für die Detektion von Phosphor ist die Verwendung von Saphirprobenträgern notwendig, da die Lage der Absorptionskante von Silizium, als Hauptbestandteil der üblicherweise verwendeten Quarzglasprobenträger, diese negativ beeinflußt. • Für Schwefelkonzentrationen ≤ 0,5 mg/l (≤ 10 ng) sollte mit dem dünnen Filter (Filter 1) gemessen werden. • Die berechneten Erfassungsgrenzen liegen für Schwefel, je nach Zusammensetzung der Probe, bei 0,29 bis 0,76 ng. Für Phosphor erhält man in anorganischen Proben auf Saphirträgern 0,34 ng und bei biologischen Proben 0,70 ng. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen klar, daß die zuverlässige Bestimmung der Elemente Phosphor und Schwefel mit TXRF möglich ist. Die Möglichkeit diese leichten Elemente zu bestimmen, eröffnet der TXRF verschiedene neue Forschungsgebiete, wie beispielsweise Biologie und Biochemie. Durch den großen Vorteil der TXRF, der geringen Probenverbrauch kombiniert mit niedrigen Nachweisgrenzen, sind Screening von Proteinen, Enzymen oder auch von anderen Makromolekülen die Phosphor und Schwefel enthalten, möglich. Hier können Strukturfragen oder Mutagenese Schritte in Proteinen, Enzymen und Nucleinsäuren geklärt werden. Eine weitere Anwendung der TXRF ist die quantitative Proteinbestimmung. Die genaue Schwefelbestimmung macht es möglich ältere Methoden wie beispielsweise die Bestimmung nach Lowry zu ersetzen. Durch Kombination der TXRF mit weiteren analytischen Methoden (z.B. AAS) und oberflächenabbildenden Methoden (z.B. REM oder AFM) kann die Probenvorbereitung verbessert werden und somit die TXRF für weitere Gebiete der Elementanalytik in Zukunft als zuverlässige Standardmethode etabliert werden.
Während der letzten Jahrzehnte hat sich die Totalreflexions-Röntgenfluoreszenzanalyse (TXRF) als eine tragende Methode in der Elementanalytik etabliert. Sie ist eine universelle, auf vielen Gebieten einsetzbare, ökonomische Multielementmethode zur Mikro- und Spurenanalyse. Die Vorteile der TXRF mit ihrer hohenEmpfindlichkeit kombiniert mit einer einfachen Quantifizierung und einem geringen Probenverbrauch prädestinieren sie für Elementbestimmungen in verschiedenen biologischen Matrices - besonders auf dem Gebiet der Protein- und Enzymanalytik. Das Potential der TXRF für die Bestimmung von Übergangsmetallen in diesenMatrices wurde schon in der Literatur beschrieben. Eine bedeutende Rolle kommt hier auch der Analyse leichter Elemente zu, insbesondere der des Schwefels. Als Bestandteil der beiden Aminosäuren Cystein und Methionin erlaubt die quantitative Bestimmung des Schwefelgehaltes eine zur Metall-Cofaktoren-Bestimmung einfache und simultane Bestimmung der Enzym- oder Proteinkonzentration. Die Evaluation dieses Verfahrens mit seinen Möglichkeiten und Grenzen für die TXRF, sowie die Weiterentwicklung von Anwendungsgebieten auf diesem Gebiet waren die vorrangigen Ziele dieser Arbeit. Zuvor erfolgte eine Überprüfung der für die quantitative Auswertung notwendigen und wichtigen relativen Empfindlichkeitsfaktoren (Kalibrierfaktoren). Für die beiden untersuchten leichteren Elemente Schwefel und Phosphor ließen sich im Gegensatz zu den höheren Elementen Abweichungen von > ± 10 % zu den in der Spektrometer-Software bereits vorinstallierten Faktoren feststellen. Die Betrachtung der Matrix- und Konzentrationsabhängigkeit des relativen Empfindlichkeitsfaktors von Schwefel zeigte eine starke Matrixabhängigkeit des Faktors bei höheren Konzentrationen. Hier spielen vorrangig Absorptionseffekte der induzierten Fluoreszenzstrahlung des Schwefels in den unterschiedlich massiven Rückständen der untersuchten Verbindungen Al2(SO4)3, MgSO4 und Na2SO4 eine entscheidende Rolle. Im Zuge der Probenvorbereitung für die Analyse der Protein- und Enzymproben erwies sich die Trocknung an Luft bei Raumtemperatur als eine gut geeignete Methode im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren (Trocknung unter Wärmezufuhr). Bei letzterem Verfahren besteht die Gefahr möglicher Elementverluste von flüchtigen Verbindungen z. B. beim Vorhandensein sulfidischer Bestandteile. Der Einfluss der Matrixbestandteile (Puffer/bio-organische Matrix der Enzyme selbst) und ihre systematischen Zusammenhänge auf die ausgebildeten Trocknungsrückstände zeigten sich deutlich in den zur Evaluation der Schwefelbestimmung durchgeführten Konzentrationsreihen mit schwefelhaltigen anorganischen Standardlösungen. Bei den beiden untersuchten Enzymen Diisopropylfluorophosphatase (DFPase) undCytochrom c Oxidase wurden über die durchgeführten Konzentrationsbereiche sehr gute Wiederfindungen dokumentiert. Bei der Cytochrom c Oxidase trägt vor allem der im Vergleich zur DFPase deutlich höhere Anteil an Pufferkomponenten zur Ausbildung massiverer Trocknungsrückstände (max. 5 μm Dicke) bei. Dennoch traten erst bei der NADH:Q Oxidoreduktase (Komplex I) deutliche, reproduzierbare Minderbefunde bei der Schwefelbestimmung im Verlauf der Konzentrationsreihe auf. Anhand der topologischen Untersuchungen ließen sich hier für die Minderbefunde Schichtdickeneinflüsse und eine damit verbundene Absorption der emittierten Fluoreszenzstrahlung verantwortlich machen. Der Einsatz von sogenannten Filmbildnern zur Minimierung der Schichtdicken von Trocknungsrückständen und der damit verbundenen besseren Elementwiederfindungen brachte dagegen keine deutlichen und reproduzierbaren Verbesserungen, insbesondere nicht für den Schwefel. Eine Erhöhung der Anregungseffizienz durch die Verwendung einer Cr-Kα-Strahlung zeigte in den untersuchten Proben (wässrige Matrix/Enzymmatrix: DFPase) keine deutlichen Vorteile in der Bestimmung des leichten Elementes. Die beiden, in herkömmlichen Spektrometern zur Verfügung stehenden, AnregungsmodenW-Lα und Mo-Kα, sind für die Anlayse von Enzymproben und einer vergleichenden Bestimmung der Enzymkonzentration gut geeignet. Dies zeigten auch Vergleiche mit den biochemisch bestimmten Protein- bzw. Enzymkonzentrationen. Kritische Schichtdicken im Rahmen von Schwefel-Bestimmungen wurden für die verwendeten Anregungsmoden auf etwa 20 μm (Mo-Kα), 3 μm (W-Lα) und rund 2 μm (Cr-Kα) kalkuliert. Eine Beeinträchtigung der Zuverlässigkeit der TXRF-Messungen für die höheren Elemente durch die Matrixbestandteile konnte nicht festgestellt werden. Somit wird in den meisten Fällen die einfache Probenpräparation auf hydrophoben oder hydrophilen (siliconisierten/unsiliconisierten) Probenträgern, ohne die Notwendigkeit eines Verfahrens zur vorherigen Matrixabtrennung, möglich sein. Jedoch muss bei allen künftig zu untersuchenden Protein- oder Enzymproben mit hohen Matrixanteilen mit dem Auftreten von Schichtdickeneffekten und damit verbundenen Absorptionseffekten von leichten Elementen (Schwefel, Phosphor) gerechnet werden. Die in der Arbeit vorgestellten, unterschiedlichen Projekte zeigen deutlich das Potential der TXRF als eine Standardmethode auf diesem Anwendungsgebiet.
Der erste Teil der Arbeit beschäftigt sich mit dem Vergleich der Charge Transfer induzierten Prozesse bei der Löschung von Triplett angeregten Sensibilisatoren durch Sauerstoff mit den Charge Transfer induzierten Prozessen bei der Löschung von Singulettsauerstoff durch die gleichen Sensibilisatoren im Grundzustand. Dazu wurden die Geschwindigkeitskonstanten für beide Prozesse in verschiedenen Lösungsmitteln unterschiedlicher Polarität sowie notwendige photophysikalische Parameter wie Triplettenergien und Triplettquantenausbeuten bestimmt. Für eine Reihe von Naphthalin- und Biphenylderivaten kann erstmals gezeigt werden, daß die Geschwindigkeitskonstanten für beide Charge Transfer Prozesse eindeutig durch eine gemeinsame Marcus Abhängigkeit von der Freien Enthalpie für die Bildung eines Ionenpaares beschrieben werden können. Weiterhin wird am Beispiel der Naphthalinderivate gezeigt, daß die Dipolmomente der Übergangszustände der Reaktion von aus Aromat und Sauerstoff gebildeten Encounter-Komplexen zu Charge Transfer-Komplexen bei beiden Prozessen den gleichen Wert besitzen. Diese Ergebnisse werden durch einen gemeinsamen Desaktivierungskanal erklärt: beide Prozesse verlaufen über angeregte Komplexe mit der gleichen supra-supra Struktur. Dabei ergibt sich ein konsistentes Bild. Es wird gezeigt, daß der Charge Transfer Charakter für beide Prozesse im Einklang mit den Erwartungen mit steigernder Lösungsmittelpolarität ansteigt und wesentlich größer ist als bisher in der Literatur vermutet. Die Reorganisationsenergie wird für beide Prozesse in einen lösungsmittelunabhängigen intramolekularen und einen lösungsmittelabhängigen Beitrag aufgeteilt. Dabei stellt sich heraus, daß die leicht höheren Werte für die Naphthalinderivate durch höhere intramolekulare Reorganisationsenergien verursacht werden. Dies wird durch eine größere Delokalisation der aromatischen Elektronen erklärt. Ganz anders verhalten sich Benzophenonderivate. Zwar ist die Abhängigkeit der Geschwindigkeitskonstanten der Charge Transfer induzierten Löschung von O2(1Δg) durch die Benzophenonderivate im Grundzustand nahezu identisch mit der Abhängigkeit der Naphthalin- und Biphenylderivate. Jedoch weichen die Geschwindigkeitskonstanten der Charge Transfer induzierten Desaktivierung der Triplettzustände der Benzophenonderivate durch O2 enorm von der für ππ* Sensibilisatoren gefundenen gemeinsamen Korrelation ab. Hauptsächlich im endergonischen Bereich liegen die Werte um mehrere Größenordnungen höher. Andererseits wird ein wesentlich geringerer Charge Transfer Beitrag zur Geschwindigkeitskonstante festgestellt. Relativ große intramolekulare Reorganisationsenergien zeigen, daß bei der Desaktivierung der Komplexe von Triplett angeregtem Benzophenon und Sauerstoff große Änderungen der Bindungslängen stattfinden. Dies führt zu einer Verschiebung der Potentialkurve des angeregten Komplexes, verglichen mit der des Grundzustandskomplexes, und somit zu großen Franck-Condon Faktoren und zu hohen Geschwindigkeitskonstanten für die Desaktivierung in die Grundzustände im Bereich hoher Triplettenergien. Es wird gezeigt, daß die räumliche Struktur der angeregten Komplexe aus Keton und Sauerstoff für dieses Verhalten verantwortlich ist. Diese Ergebnisse führen zu einem plausiblen Mechanismus, der die niedrigen Effizienzen der Bildung von Singulettsauerstoff bei der Löschung von nπ* angeregten Ketonen erstmals zwanglos erklärt. Im zweiten Teil der Arbeit wird die Abhängigkeit der Geschwindigkeitskonstanten der Bildung von O2(1Σg+), O2(1Δg) und O2(3Σg-) bei der Löschung von ππ* angeregten Triplettzuatänden durch Sauerstoff von der Freien Enthalpie ΔGCET für die Bildung eines Ionenpaares und von der Überschußenergie ΔE für die Bildung des jeweiligen Zustands von O2 untersucht. Zur Bestimmung dieser Geschwindigkeitskonstanten wird ein Aufbau zur zeitgleichen Detektion der O2(1Σg+ 􀂤 1Δg) Fluoreszenz, der O2(1Σg+ 􀂤 3Σg-) Phosphoreszenz und der O2(1Δg 􀂤 3Σg-) Phosphoreszenz erstellt. Mit diesem Aufbau wird eine Reihe von Sensibilisatoren mit sehr unterschiedlichen Oxidationspotentialen, Triplettenergien und Strukturen in Tetrachlorkohlenstoff untersucht. Es wird gezeigt, daß die Geschwindigkeitskonstanten kT 1Σ, kT 1Δ und kT 3Σ der Bildung von O2(1Σg+), O2(1Δg) und O2(3Σg-) zusammen mit den Werten für alle bisher mit der gleichen Methode untersuchten Sensibilisatoren durch eine gemeinsame Abhängigkeit von ΔGCET und ΔE beschrieben werden können. Dies bedeutet, daß kT 1Σ, kT 1Δ und kT 3Σ hauptsächlich durch die Triplettenergie und das Oxidationspotential des Sensibilisators bestimmt werden, und daß die Variation der molekularen Struktur nur eine untergeordnete Rolle spielt. Damit wird es zum ersten Mal möglich, die Geschwindigkeitskonstanten der Bildung von O2(1Σg+), O2(1Δg) und O2(3Σg-) bei der Löschung von ππ* Triplettzuständen durch Sauerstoff in Tetrachlorkohlenstoff für beliebige Sensibilisatoren mit hinreichender Genauigkeit vorauszusagen.
Mit Hilfe des Modellorganismus S. cerevisiae konnten alle bisher unbekannten Gene der Gluconeogenese und des Glyoxylat-Zyklus des opportunistisch humanpathogenen Pilzes C. albicans isoliert werden. Erste Hinweise führten zu der Annahme, dass diese Stoffwechselwege möglicherweise essentiell für das vegetative Wachstum sind, so dass sie gute Wirkorte für neu zu entwickelnde Antimycotica darstellen könnten. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass diese Stoffwechselwege ungeeignete Wirkorte für Antimycotica sind, da sie weder essentiell für das vegetative Wachstum sind noch von ihnen Virulenzfaktoren von C. albicans beeinflusst werden (z.B. Hyphenentwicklung). Die Regulation der Gluconeogenese und des Glyoxylat-Zyklus in S. cerevisiae ist gut untersucht und alle Ergebnisse mit C. albicans zeigen, dass die Regulation dieser Stoffwechselwege zwischen diesen beiden Hefen sehr konserviert ist. Es wurde eine Methode für die Identifizierung von essentiellen Genen durch funktionelle Komplementation in S. cerevisiae entwickelt. Diese sogenannte Split-Marker-Selektion basiert auf einer Cre/loxP-vermittelten induzierten Deletion eines essentiellen Gens von S. cerevisiae und der Komplementation des resultierenden letalen Phänotyps durch ein heterolog exprimiertes Gen in einer DNS Genbank. Die Methode ist auch für die Funktionsanalyse von essentiellen Genen in S. cerevisiae geeignet (z.B. Identifizierung von Suppressoren, Analyse finaler Phänotypen). Mit Hilfe der Split-Marker-Selektion wurde das putativ essentielle Gen NEP1 ("nuclear essential protein") von C. albicans identifiziert. Die Funktionsanalyse des homologen Gens in S. cerevisiae ergab, dass das Gen für ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein kodiert, das in allen Eukaryonten existiert. Es erwies sich, dass das menschliche Homolog in S. cerevisiae funktionell ist und den letalen Phänotyp einer NEP1 Deletion in S. cerevisiae überwindet. Es zeigte sich weiterhin, dass das menschliche Homolog in S. cerevisiae nicht an Mikrotubuli assoziiert ist. Dies deutet darauf hin, dass die Mikrotubuli-Assoziation nicht für die essentielle Funktion von Nep1p nötig ist. Das bisher uncharakterisierte Protein Ydl148p wurde als Interaktionspartner von Nep1p gefunden. Desweitern konnte SAM2 als Multicopy-Suppressor des konditional letalen Phänotyps (Temperatursensitivität) eines NEP1 Mutantenallels (nep1-ts1) identifiziert werden. Die Suppression wurde hierbei über die erhöhte Konzentration an S-Adenosylmethionin vermittelt. Dieser Cofaktor ist an Methylierungsreaktionen beteiligt, so besteht die Möglichkeit, dass Nep1p eine Methyltransferase ist oder an Methylierungsreaktionen beteiligt ist.
Die Stat-Proteine liegen als latente Transkriptionsfaktoren im Zytoplasma vor, und spielen eine wichtige Rolle in der Übertragung von Zytokinsignalen von der Zellmembran in den Nukleus. Nach ligandeninduzierter Aktivierung der Zytokinrezeptoren phosphorylieren sich die assoziierten Jak-Kinasen selbst, die intrazellulären Donänen der Rezeptoren und die Mitglieder der Stat-Proteinfamilie. Nach Tyrosinphosphorylierung dimerisieren die Stat Proteine, indem sie Homo- oder Heterodimere bilden und wandern in den Zellkern. Dort können sie spezifische DNASequenzen von Zielgenen binden und deren Transkription steuern. Posttranslationale Modifikationen spielen eine wichtige Rolle in der Aktivierung von Proteinen, Interaktion mit Kofaktoren und in der Proteintranslokation. An einigen zytoplasmatischen und nukleäre Proteinen wie Transkriptionsfaktoren, RNA Polymerase II, Onkoproteinen, Kernporenproteinen und viralen Proteinen wurde eine O-Verknüpfung von einzelnen N-Acetylglukosamin Zuckerresten an Threoninen und Serinen nachgewiesen. Die Rolle dieser posttranslationalen Modifikation beinhaltet unter anderem den Schutz vor Proteolysis, Einfluß auf den Kerntransport, Regulation der Serin- und Tyrosin-Phosphorylierung und Transkriptionskontrolle. Ziel dieser Arbeit war es, eine Modifikation von Stat5a mit einem einzelnen Overknüpften N-Acetylglukosamin (O-GlcNAc) zu identifizieren, und die Funktion dieser Modifikation für Stat5 zu charakterisieren. Es wurde eine O-GlcNAc Modifikation von Stat5a nur im Zellkern nach Zytokinstimulation nachgewiesen. Es konnte auch gezeigt werden, daß andere Stat-Proteine, wie Stat1, Stat3, Stat5b und Stat6, mit O-GlcNAc modifiziert sind, und daß Stat5a auch in Krebs- und Leukämiezellinien glykosyliert vorliegt. Für die Analyse der Glykosylierungsstellen im Massenspektrum und für die weiteren funktionellen Experimente wurde phosphoryliertes, Stat5a rekombinant mit dem Baculovirussystem in Insektenzellen exprimiert. Hierfür wurden die Insektenzellen mit Jak2- und Stat5a-Baculoviren koinfiziert, und die Lysate anschließend chromatographisch aufgereinigt. Es konnte ein O-GlcNAc modifiziertes Peptid am N-Terminus von Stat5a identifiziert werden. Dieses Peptid trägt zwei potentielle Glykosylierungsstellen, Threonin 92 und Threonin 97. Die potentielle Glykosylierungstelle Threonin 92 wurde zu einem Alanin mutiert (Stat5a-T92A) und in funktionellen Experimenten mit glykosyliertem und nicht glykosyliertem Stat5a verglichen. Um den möglichen Einfluß der Stat5a-Glykosylierung auf den Kerntransport zu analysieren, wurden HC11-Zellen mit dem O-GlcNAcase Inhibitor PUGNAc und den Vorstufen von N-Acetylglukosamin, Glukose und Glukosamin, inkubiert. Dadurch wurde der allgemeine Glykosylierungsstatus der Proteine und auch von Stat5a erhöht, und die Kerntranslokation von Stat5a vor und nach Zytokinstimulation untersucht. Dabei konnte kein Unterschied in der Kerntranslokation von Stat5a im Vergleich von behandelten zu unbehandelten Zellen beobachtet werden. Da bekannt ist, daß die O-GlcNAc Modifikation die DNA-Bindung und die Protein-Protein Interaktionen von großen Proteinkomplexen beinflußt, wurde der Einfluß der Stat5-Glykosylierung auf die DNA-Bindung und auf bekannte Stat5a-Interaktionspartner, wie den Glukokortikoid Rezeptor, den Korepressor der Transkription N-CoR (nuclear corepressor receptor) und den Koaktivator der Transkription CBP (CREB binding protein), untersucht. Die in vitro DNA-Bindung am beta-Casein Oligomer zeigte keinen Unterschied hervorgerufen durch die Glykosylierung oder die Mutation von Threonin 92 von Stat5a auf. Die Interaktion mit N-CoR und mit dem Glukokortikoid Rezeptor wurde durch die Stat5a-Glykosylierung nicht beeinflußt, doch CBP interagierte bevorzugt mit glykosyliertem Stat5a. Die Interaktion mit CBP war nach Mutation der potentiellen Glykosylierungsstelle in Stat5a-T92A aufgehoben. In Luciferase-Experimenten konnte nachgewiesen werden, daß Stat5a-T92A keine Transaktivierungsaktivität im Vergleich zu Wildtyp Stat5a am β-Casein Promotor besitzt. Die Ergebnisse sprechen dafür, daß die Glykosylierungsstelle von Stat5a durch die Mutation des Threonins 92 am N-Terminus zerstört wurde, und daß die fehlende Interaktion mit CBP die Transkription von Zielgenen negativ beinflußt.
In der vorliegenden Arbeit wurden marine Schwämme der Gattungen Agelas und Stylissa von den Florida Keys und Bahamas untersucht. Dabei lag das Hauptinteresse neben der Isolierung und Strukturaufklärung der Schwamminhaltsstoffe vor allem auf der ökologischen Funktion der Sekundärstoffe. Die Chemie dieser Schwämme ist sehr charakteristisch und wird von bromierten Derivaten der Pyrrol-2-carbonsäure bestimmt. Insgesamt wurden 17 bromierte Pyrrol-Alkaloide isoliert, von denen die Verbindungen N-alpha-(4-Brompyrrolyl-2-carbonyl)-L-homoarginin (isoliert aus Agelas wiedenmayeri), Bromsceptrin (Agelas conifera), N-Methyl-dibromisophakellin (Stylissa caribica), Monobromisophakellin (Agelas sp.) und Sventrin (Agelas sventres) erstmals beschrieben wurden. Die Strukturaufklärung erfolgte mit spektroskopischen Methoden (2D NMR, MS, IR, UV, CD) und durch Vergleich mit literaturbekannten Daten. Im Fall von N-alpha-(4-Brompyrrolyl-2-carbonyl)- L-homoarginin gelang die Bestimmung der absoluten Konfiguration erst nach Synthese der Verbindung und anschließendem Vergleich der CD-Spektren von Naturstoff und synthetischer Verbindung. Insgesamt wurden die Dichlormethan/Methanol-Rohextrakte von 125 Schwämmen der Gattung Agelas, die an verschiedenen Standorten der Bahamas gesammelt wurden, mittels HPLC qualitativ untersucht und die Hauptsekundärmetaboliten quantitativ bestimmt. In sämtlichen Schwämmen konnten Brompyrrol-Alkaloide nachgewiesen werden, wobei sich drei charakteristische Inhaltsstoffmuster zeigten. Während die Rohextrakte von 71 Proben der Schwämme Agelas cervicornis, Agelas clathrodes, Agelas dispar und Agelas wiedenmayeri durch die beiden Alkaloide Oroidin und 4,5-Dibrompyrrol-2-carbonsäure gekennzeichnet sind, bestimmen dimere Pyrrol-Imidazol-Alkaloide vom Sceptrin- und Ageliferin-Typ, wobei Sceptrin stets dominiert, das Inhaltsstoffmuster von 50 untersuchten Proben der Schwämme Agelas cerebrum, Agelas conifera, Agelas dilatata und Agelas sceptrum. Ein drittes Inhaltsstoffmuster wurde für vier Proben des Schwamms Agelas sp. gefunden, welches durch bromierte Pyrrol-Alkaloide vom Phakellin- und Isophakellin-Typ charakterisiert ist. Zur Untersuchung der ökologischen Bedeutung von Brompyrrol-Alkaloiden wurde die fraßabschreckende Wirkung gegenüber Fischen getestet. In Aquarium- und Freilandversuchen konnte gezeigt werden, daß die fraßhemmende Wirkung der Rohextrakte gegenüber Fischen im Fall von Agelas conifera auf bromierte Pyrrol-Alkaloide vom Sceptrin- und Ageliferin-Typ bzw. Isophakellin-Typ für Stylissa caribica zurückzuführen ist. Erstmals wurden Reinsubstanzen vom Sceptrin-, Ageliferin- und Isophakellin-Typ getestet. Sceptrin und N-Methyl-dibromisophakellin sind bei natürlichen Konzentrationen fraßabschreckend. In weiteren ökologischen Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß die bromierten Pyrrol-Alkaloide Oroidin, 4,5-Dibrompyrrol-2-carbonsäure und Sceptrin neben einem fraßabschreckenden Potential gegenüber Fischen auch besiedlungshemmend auf Fäulnisbakterien wirken. Bromierte Pyrrol-Alkaloide erfüllen somit mindestens zwei ökologische Funktionen, die das Überleben von Agelas-Schwämmen sichern und sie zu einer der erfolgreichsten Arten in Lebensgemeinschaften karibischer Riffe machen.
Untersuchungen zur Interaktion zytoplasmatischer Proteine mit dem Serotonintransporter Der plasmamembranständige Serotonintransporter SERT terminiert die Neurotransmission an serotonergen Synapsen durch den schnellen Rücktransport des Neurotransmitters Serotonin (5HT) in die Präsynapse. Neben seinem präsynaptischen Vorkommen wird der SERT auch axonal in Varikositäten immundetektiert. Der Substrattransport selbst unterliegt der Kontrolle des Ca 2 /CaM, des Stickoxid (NO) und des Proteinkinase C (PKC) Signaltransduktionsweges. Letzterer bestimmt die Oberflächenverfügbarkeit des SERT durch dessen Sequestrierung. Die Regulation der Lokalisation und des Substrattransports des SERT sollte durch assoziierte Proteine erzielt werden. Da bislang jedoch keine interagierenden Proteine des SERT bekannt waren, sollten in dieser Arbeit mit Hilfe des HefeZweiHybridSystems zytoplasmatische Interaktionspartner des SERT identifiziert werden. Erste Untersuchungen an heterolog exprimierten Deletionsmutanten der Termini des SERT ergaben, daß diese zytoplasmatischen Domänen für die Funktion des Proteins unabdingbar sind. Im folgenden wurde daher mit dem Carboxyterminus des SERT eine hirnspezifische cDNABibliothek der neugeborenen Ratte durchsucht. Es wurden vier cDNAKlone isoliert, die für putative Interaktionspartner des SERT kodierten. Die Relevanz dieser genetisch nachgewiesenen Interaktionen wurde biochemisch mittels affinitätschromatographischer Studien untersucht, während immunzytochemische Analysen die Interaktionen durch die Umverteilung oder durch die Colokalisation der coexprimierten Proteine in vivo validierte. Pharmakologische Untersuchungen sollten darüberhinaus Aufschluß über den regulatorischen Einfluß der Interaktion auf die Transportfunktion des SERT geben. Nach diesen Aspekten wurden zwei der putativen Interaktionspartner näher untersucht. Der erste untersuchte cDNAKlon kodierte für die ßUntereinheit der intrazellulären Acetylhydrolase des "plateletactivating factor" (ßPAFAH). Affinitätschromatographisch wurde die Interaktion durch die Präzipitation der eukaryotisch überexprimierten ß Untereinheit an einem bakteriell exprimierten Fusionsprotein des SERTCT bestätigt. Die immunzytochemische Analyse zeigte nach der Coexpression der ßPAFAH und dem SERT eine Umlokalisierung des zytoplasmatischen Proteins an Bereiche plasmamembranständiger SERTImmunreaktivität. Durch Wiederaufnahmestudien wurde kein Effekt der ßPAFAH auf die Transportfunktion des SERT ermittelt, weshalb die funktionelle Bedeutung dieser Interaktion vorerst unklar bleibt. Der zweite Klon kodierte für das Rattenspezifische Homolog des myristoylierten Alanin reichen Proteinkinase CSubstrats (MacMARCKS). Der biochemische Nachweis einer Interaktion konnte hier nicht erbracht werden. Dagegen zeigte die immunzytochemische Analyse eine Colokalisation von MacMARCKS und SERT in diskreten Bereichen der Plasmamembran. Hinweise auf die physiologische Bedeutung konnten durch die pharmakologische Analyse gewonnen werden. So induzierte die Coexpression von MacMARCKS und SERT eine Abnahme der maximalen Transportrate (Vmax) um 29,6 ± 18,6 % (n = 3) im Vergleich zu GFPexprimierenden Kontrollzellen. Die Stimulierung der PKC erzielte dagegen kaum eine weitere Reduktion der Vmax im Gegensatz zu den Kontrollzellen, während die Behandlung der Zellen mit einem PKCInhibitor zum Angleich der Vmax der Konrollzellen und der MacMARCKSexprimierenden Zellen führte. Daraus wurde gefolgert, daß MacMARCKS an der Regulation der Transportfunktion des SERT durch dessen Sequestrierung beteiligt ist. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit zwei Interaktionspartner des SERTCT identifiziert, deren mögliche Funktionen in der Regulation der intrazellulären 5HT Konzentration einerseits bzw. der Regulation der Transportfunktion des SERT andererseits liegen könnten.
Der Lichtsammelkomplex II (LHCII) dient als Lichtantenne für das photosynthetische Reaktionszentrum II der höheren Pflanzen. Seine Trimere stellen das häufigste Protein in der Thylakoidmembran dar. Ungefähr die Hälfte des Chlorophylls der Pflanze befindet sich in diesem Komplex. Der LHCII ist ein integrales Membranprotein und bindet neben Chlorophyll a und b auch verschiedene Carotinoide. Seine Pigmente absorbieren Licht und geben die dadurch aufgenommene Energie an die photosynthetischen Reaktionszentren weiter, wo sie ausgehend von einer Ladungstrennung chemisch konserviert wird. Die Weiterleitung der Anregungsenergie im LHCII geschieht über spezifische Pfade und mit ultraschneller Kinetik im Femtosekundenbereich. Der LHCII ist das einzige Antennenprotein der höheren Pflanzen, dessen dreidimensionale Struktur bei einer fast atomaren Auflösung von 3.4Å gelöst wurde. Bei dieser Auflösung war es jedoch nicht möglich, den Unterschied zwischen Chlorophyll a und b zu bestimmen, außerdem waren nur zwei der insgesamt drei bis vier gebundenen Carotinoide sichtbar. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die einzelnen Pigmente, deren Positionen aus der Struktur bekannt waren, nach ihrer chemischen Natur zuzuordnen. Hierzu wurden mutierte Komplexe untersucht, bei denen jeweils ein bestimmtes Chlorophyllmolekül fehlte. Dies wurde durch Punktmutationen im Polypeptid erreicht, bei denen diejenige Aminosäure ausgetauscht war, an die ein bestimmtes Chlorophyllmolekül über das zentrale Mg 2 Atom gebunden war. Die veränderten Proteine wurden durch ortsgerichtete Mutagenese und Überexpression des Polypeptids in E. coli hergestellt, wo sie ohne die Pigmente aggregiert in Einschlusskörpern vorlagen. Die Rückfaltung in Gegenwart von Pigmenten und Detergenzien erfolgte auf einer NickelAffinitätssäule, an die das LHC Protein mittels einer HexaHistidinmarkierung gebunden war. So konnte in einem biochemischen Schritt das Protein gefaltet, die Pigmente inkorporiert und die native, trimere Form gebildet werden. Die Rückfaltung von histidinmarkierten Proteinen auf Metallaffinitätssäulen kann als generelle Methode auch für andere, schwierig zu faltende, lösliche und Membranproteine angewandt werden. Der native Zustand des rückgefalteten LHCII wurde folgendermaßen bewiesen: Der Pigmentgehalt, der durch HPLC Analyse bestimmt worden war, war identisch zum nativ isolierten Protein. Auch ein Absorptionsspektrum zeigte bei 4K die charakteristische Aufspaltung in mehrere Chlorophyllmaxima. Es konnte gezeigt werden, dass in einem Fluoreszenzexperiment die Anregungsenergie, die bei kurzwelligem Chlorophyll b eingestrahlt wurde, im Komplex komplett auf das langwelligste Chlorophyll a übertragen wurde. Schließlich wurden aus dem rekombinanten Protein zweidimensionale Kristalle erzeugt, deren elektronenmikroskopische Projektionsbilder identisch zu denen des Nativproteins waren. Der Austausch der Chlorophylle an einigen Bindungsstellen durch Chlorophyllderivate, die entweder im Zentralatom oder in der Porphyrinringstruktur verändert waren, zeigte, dass das Zentralatom den entscheidenden Faktor zur Stabilisierung der Chlorophyllbindung darstellt. Es wurden neun Mutanten erzeugt, bei denen jeweils derjenige Aminosäurerest ausgetauscht war, von dem aus der Struktur bekannt war, dass er den fünften Liganden für das zentrale Mg 2 Atom eines bestimmten Chlorophylls darstellt. Die HPLC Analyse ihrer Pigmente zeigte, dass die Mutanten tatsächlich jeweils ungefähr ein Chlorophyllmolekül verloren hatten; dies diente dazu, die jeweilige Bindungstasche zu Chl a oder Chl b zuzuordnen. Nur sechs Mutanten bildeten Trimere, ihre biochemischen Daten zeigten, dass die in der Struktur vorgenommene Zuordnung bis auf das Chl b3 korrekt war. Einige Chlorophyllmutanten waren auch in ihrem Gehalt an Neoxanthin reduziert, daraus konnte die ungefähre Lage des Neoxanthins in der Nähe der Helix C abgeleitet werden. Die mutierten Proteine lieferten nicht nur die Zuordnung einer Bindungstasche zu einem bestimmten Chlorophylltyp, sondern es konnte aus den Differenzspektren im Vergleich zum Wildtyp auch die Wellenlänge eines bestimmten Chlorophylls abgeleitet werden. Um eine höhere spektrale Auflösung zu erzielen, wurden die Spektren bei 4K aufgenommen. Die Zuordnung einzelner spektraler Banden zu bestimmten Chlorophyllen zeigte, dass in einer bestimmten Bindungstasche nur entweder Chlorophyll a oder Chlorophyll b gebunden war, da sich nur eine einzige Differenzbande im Spektrum ergab. Weiterhin implizieren die gefundenen Einzelbanden, dass die Pigmente keiner starken excitonischen Kopplung unterliegen, wie dies zum Beispiel im B850 Ring des bakteriellen Lichtsammelkomplexes der Fall ist. Bei LHCII Komplexen, die nur mit Chlorophyll b rückgefaltet worden waren, zeigte sich eine ungewöhnlich langwellige Fluoreszenz bei 77K. Dies könnte auf eine räumlich limitierte Kopplung eines einzelnen Chlorpohyllpaars hinweisen. Bei der Mutante der Chl a2 Bindungsstelle zeigte sich, dass dies das langwelligste der untersuchten Pigmente war. Der zugehörige Koomplex war auch der einzige, bei dem die Fluoreszenz ins Kürzerwellige verschoben war. Die Lage des Chlorophylls a2 an der Außenseite des Proteins ist prädestiniert für die Energieübertragung zum photosynthetischen Reaktionszentrum oder zu benachbarten LHC Komplexen.
Bislang ist unklar, warum Afrikanische Grüne Meerkatzen (AGM, Chlorocebus), die in ihrem natürlichen Habitat bis zu 50% mit SIVagm infiziert sind, zeitlebens keine Symptome einer Immundefizienz zeigen, d.h. eine Resistenz gegen AIDSähnliche Symptome besitzen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde in einer Studie die Immunantwort SIVagminfizierter AGM nach Immunstimulation mittels Tetanustoxoid untersucht. Ziel dieses Projekts war die Klärung der Frage, ob die Virusreplikation durch Stimulation des Immunsystem und damit einhergehend einer Vermehrung der Zielzellen von SIV, eine Änderung erfährt oder ob diese durch immunologische Kontrollmechanismen konstant bleibt. Untersucht wurde dazu eine Gruppe von vier natürlich SIVagminfizierten AGM, die zwei Jahre nach Basisimmunisierung mit Tetanustoxoid im Abstand von vier Wochen i.m. immunisiert wurden. Der Zeitpunkt der SIVInfektion lag vor der Basisimmunisierung. Wöchentlich fanden Blutentnahmen statt und es wurden immunologische und virologische Parameter bestimmt. Die gemessenen Lymphozytenwerte, die FACSDaten und die Lymphozytenproliferationskapazität ließen nach Tetanustoxoidgabe keine Änderung erkennen. Die Daten gaben keinen Hinweis darauf, daß die exogene Antigenspezifische Stimulation zu einer Proliferation der Gedächtniszellen geführt hätte. Es ist davon auszugehen, daß es während der Basisimmunisierung zu einer Proliferation von CD4 TZellen kam und diese nachfolgend infiziert bzw. eliminiert wurden. Somit waren keine Tetanusspezifischen Gedächtniszellen zum Zeitpunkt der Immunstimulation mehr existent. Um dieses Problem auszuschließen, müssten SIVagmnegative AGM eine Basisimmunisierung erhalten und erst anschließend dürfte eine Infektion mit SIVagm stattfinden. Aufgrund des Versuchsaufbaus kann keine Aussage darüber getroffen werden, ob eine Immunstimulation auf die Höhe der Virusbelastung Einfluß nimmt. Für das apathogene SIV/Primatensystem konnte im Vergleich mit AIDSsuszeptiblen SIV/PrimatenSystemen zwar keine deutlich stärkere humorale oder zelluläre Immunantwort gefunden werden, jedoch gibt es signifikante Unterschiede. AGM zeigen nur eine geringe Virusbelastung in den Lymphknoten und es konnte bislang in keinem natürlichen Wirt von SIV sog. ''VirusTrapping", daß heißt die Anheftung von Viruspartikeln auf der Oberfläche von Follikulär Dendritischen Zellen nachgewiesen werden. Es wurde auch nie, trotz chronischer Infektion, eine Strukturänderung des lymphatischen Gewebes gefunden. Ein weiterer kurioser Unterschied ist das Fehlen einer Immunantwort gegen natives GagProtein, obwohl es zu einer starken Immunantwort gegen das EnvProtein kommt. In der zweiten durchgeführten Studie im Rahmen dieser Doktorarbeit sollte, unter der Annahme, daß die obengenannten Phänomene miteinander assoziiert sind, folgende Hypothese untersucht werden: Aufgrund des Fehlens der GagAntikörper kommt es bei AGM nicht wie bei einer HIVInfektion zur Bildung von Immunkomplexen. Dementsprechend können keine Viruspartikel via Fc Rezeptor auf FDC gebunden werden. Nachfolgend findet deshalb auch keine verstärkte Apoptose der FDC bzw. Lyse der germinalen Zentren statt, und die Lymphknotenarchitektur bzw.struktur bleibt intakt. Zunächst sollte deshalb im folgenden Projekt eine humorale Immunantwort gegen das Kernprotein von SIV induziert werden. Nach mehrfacher Immunisierung mit affinitätschromatographisch gereinigtem GagProtein entwickelten alle untersuchten Tiere (Gruppe A) hohe AntikörperTiter. Nachfolgend wurden die Gagimmunisierte Gruppe und eine Kontrollgruppe (Gruppe B) experimentell infiziert. Die Negativkontrollgruppe (Gruppe C) blieb unbehandelt. In regelmäßigen Abständen erfolgten Blutbzw. Lymphknotenentnahmen. Ein wichtiger Teil dieses Projekts war die Etablierung einer quantitativen RTPCR zum Nachweis von SIVagmRNA. Bislang war es nicht möglich, die virale RNA zu quantifizieren und bei der chronischen, benignen SIVagmInfektion von AGM lag lange der Verdacht nahe, daß es aufgrund einer niedrigen Viruslast nicht zum Krankheitsausbruch kommt. Es konnte eine quantitative TaqmanRTPCR etabliert werden, mit der der spezifische Nachweis mit einer Sensitivität von 100 RNAKopien pro ml möglich ist. Die Tiere zeigten Plasmaund Proviruslasten in einer Höhe, die durchaus vergleichbar ist mit der Viruslast HIVinfizierter Menschen bzw. SIVmacinfizierter Rhesusaffen. Es kann somit ausgeschlossen werden, daß eine niedrige Viruslast der Grund für die Apathogenität ist. Die Viruslast in den Lymphknoten wurde immunhistochemisch untersucht. Die zuvor Gag immunisierten Tiere zeigten mehr infizierte Zellen, insbesondere im Bereich der Follikel, als Gruppe B. Diese Daten stimmten mit den Ergebnissen der InsituHybridisierung überein. Auch hier konnte mehr virale RNA in den Follikeln der GruppeA detektiert werden. Zwei der Tiere zeigten Anzeichen von VirusTrapping in den Keimzentren der Lymphknoten. Die histologischen Daten könnten darauf schließen lassen, daß die Existenz von GagAntikörpern auf die Viruslast in lymphatischem Gewebe Einfluß nimmt.
Paracoccus denitrificans besitzt eine verzweigte Elektronentransportkette. Unter aeroben Bedingungen werden die Elektronen ausgehend von Ubichinol bevorzugt über den bc 1 Komplex auf die aa 3 Cytochrom c Oxidase übertragen. Alternativ können die Elektronen jedoch unter Umgehung des bc 1 Komplexes direkt auf die ba 3 Chinoloxidase transferiert werden. Diese gehört wie die Cytochrom c Oxidase zur Gruppe der HämKupfer Oxidasen; sie reduzieren Sauerstoff zu Wasser und koppeln diese Reaktion an eine vektorielle Translokation von Protonen über die Membran. Die vorgelegte Dissertation befaßt sich mit der Charakterisierung der ba 3 Chinoloxidase. Mittels Mutationen sollen ausgesuchte Aminosäuren untersucht werden, die an der Protonen Translokation bzw. der Reduktion von Sauerstoff beteiligt sind. Zudem soll das Phänomen der heterogenen Untereinheit II geklärt sowie die Notwendigkeit für die Anwesenheit von Häm a in der highspin Position untersucht werden. Dazu mußte zunächst das homologe Expressionssystem für die ba 3 Chinoloxidase verbessert werden. Zu diesem Zweck wurde ein aa 3 /ba 3 ParacoccusDeletionsstamm geschaffen, der es ermöglicht, die Expression der auf einem Plasmid in trans angebotenen Gene der Chinoloxidase um den Faktor fünf zu erhöhen. In Anlehnung an ein bereits existierendes Reinigungsprotokoll ist es gelungen, die Chinoloxidase in einem zweistufigen säulenchromatographischen Verfahren zu isolieren. Das gereinigte Enzym oxidiert sein Substrat Ubichinol in einer pHabhängigen, aber Ionenstärke unabhängigen Reaktion. Bis dato sind zwei Kanäle definiert, der D und der KKanal, über die Protonen ausgehend vom Cytoplasma bis zum binukleären Zentrum transportiert werden. Diese werden dann entweder für die Reduktion des Sauerstoffs verwendet oder gekoppelt an diesen Prozeß über die Membran transloziert. Durch gezielte Punktmutationen sowie GanzzellPumpexperimente kann der Beginn eines weiterführenden ProtonenAusgangskanals bestimmt werden, der durch die benachbarten Arginine 490, 491 und das DRingPropionat des highspin Häms gebildet wird. Durch WasserstoffbrückenBindungen und Ladungsinteraktionen stabilisieren diese Arginine die deprotonierte, anionische Form der PropionatGruppe und erlauben somit eine transiente Bindung von Protonen an das Propionat. Für die Stabilisierung dieses Zustands bzw. die spätere Weiterleitung von Protonen scheint unter anderem die Aminosäure Aspartat 416 verantwortlich zu sein, da eine Mutation an dieser Position zu einem entkoppelten Phänotyp führen kann. Für die Reduktion des Sauerstoffs werden vier Elektronen benötigt. Da aber das vollständig reduzierte binukleäre Zentrum nur drei Elektronen liefern kann, wird ein Tyrosinradikal diskutiert, welches das benötigte vierte Elektron zur Verfügung stellen soll. Gezielte Punktmutationen und spektroskopische Analysen der ba 3 Chinoloxidase sollten zeigen, ob es sich dabei um Tyrosin 297 handelt, dessen Radikalform durch eine kovalente Bindung zu Histidin 293 stabilisiert wäre. Die Mutationen Y297H und Y297F führen in beiden Fällen zu einer enzymatisch inaktiven ba 3 Chinoloxidase. Durch FTIRSpektroskopie kann gezeigt werden, daß Mutationen an dieser Position die Stabilität des binukleären Zentrums beeinflussen. Es läßt sich jedoch aufgrund der fehlenden Enzymaktivität sowie der Störung der geometrischen Struktur des binukleären Zentrums keine Aussage über die Bedeutung der Aminosäure Tyrosin 297 als Elektronendonor treffen. Die Verkürzung des CTerminus der Untereinheit II durch das Einbringen von StopCodons zeigt, daß es sich bei der Heterogenität dieser Untereinheit um einen proteolytischen Abbau handeln muß. Dieser geschieht an spezifischen, aber bisher noch nicht näher charakterisierten Positionen, hat aber keinen Einfluß auf den Zusammenbau oder die Aktivität der Oxidase. Durch die heterologe Expression der bo 3 Chinoloxidase aus E. coli in Paracoccus kann gezeigt werden, daß eine Grundvoraussetzung für eine aktive Chinoloxidase ein farnesyliertes Häm b Derivat in der highspin HämPosition ist. Die dadurch gebildete HydroxylGruppe stellt eine Möglichkeit dar, wie die für die Reduktion des Sauerstoffs notwendigen Protonen das binukleäre Zentrum erreichen können. Ob es sich dabei um ein Häm a oder o handelt, ist wirtsspezifisch und eine Frage der HämVerfübarkeit bzw. des HämEinbaus.
Der Nachweis nichtkovalenter Komplexe mittels ESIMS erfordert Analysebedingungen, die sich deutlich von den Bedingungen der etablierten Standard-ESIMS kovalent gebundener Biopolymere unterscheiden. Für die ESIMS-Analyse nichtkovalenter Komplexe ist insbesondere die Einschränkungen auf das Lösungsmittel Wasser mit Zusatz von Salzen oder Puffern problematisch, was den Nachweis vollständig desolvatisierter Analytionen unter Erhalt der häufig relativ schwachen nichtkovalenten Wechselwirkungen erschwert. Die Problematik für die massenspektrometrische Analyse nichtkovalenter Komplexe steht dabei in engem Zusammenhang mit dem Mechanismus der ElektrosprayIonisierung. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, grundlegende Phänomene des ESIProzesses zu untersuchen und so ein besseres Verständnis der einzustellenden Randbedingungen beim ESImassenspektrometrischen Nachweis nichtkovalenter Komplexe zu erlangen. Die Untersuchungen erfolgten dabei unter Verwendung geeigneter Modellsysteme, wie Salze, Kohlenhydrate, Peptide und ausgewählte nichtkovalente Komplexe. Eine wesentliche Bedeutung kam der Charakterisierung der physikalischen Randbedingungen der im Rahmen der vorliegenden Arbeit eingesetzten ESIMS-Systeme zu. Auf experimenteller und theoretischer Basis wurden die verschiedenen Aufbautypen im Eingangsbereich des oTOFMS-Systems MICKEY verglichen, wobei ein besonderes Augenmerk auf deren desolvatisierende Wirkung gelegt wurde. Es ließ sich zeigen, daß an diesem oTOFMS-System der Aufbau mit geheizter Transferkapillare dem Aufbau mit Stickstoffgegenstrom vorzuziehen ist, um eine effiziente Desolvatisierung von Analytionen in der ESI zu erzielen. Am oTOFMS-System MARINER wurde die Bedeutung des Drucks in der ersten Druckstufe für die Desolvatisierung von Analytionen am Beispiel ausgewählter nichtkovalenter Proteinkomplexe demonstriert. Dabei konnte gezeigt werden, daß eine Erhöhung des Drucks den Nachweis vollständig desolvatisierter, aber dennoch intakter nichtkovalenter Komplexe dramatisch begünstigt. Dies kann auf die mit der Druckerhöhung einhergehenden Veränderungen der Stoßbedingungen der Analytionen mit dem Restgas beim Passieren der ersten Druckstufe sowie auf die größere Verweilzeit der Ionen in diesem Bereich zurückgeführt werden. Als weitere Randbedingung für Untersuchungen an ESIoTOFMS-Systemen wurde zudem der Einfluß der Axialgeschwindigkeit der Ionen auf das Erreichen des Detektors auf der Grundlage theoretischer und experimenteller Befunde charakterisiert. Die Bedeutung der Axialgeschwindigkeit insbesondere für den Nachweis von Analytionen mit hohen m/zVerhältnissen konnte dabei am Beispiel des nichtkovalenten Komplexes Hämoglobin gezeigt werden. Ebenfalls wurden ausgewählte Phasen des ESIProzesses bei der Überführung gelöster Analyte in massenspektrometrisch detektierbare Gasphasenionen untersucht. So wurde der Einfluß der Zerstäubungsbedingungen auf das resultierende Ionensignal am Beispiel der diskontinuierlichen Zerstäubung von Analytlösung getestet. Künstlich induzierte Zerstäubungsimpulse an der Spraykapillare wurden mit den Extraktionsimpulsen des verwendeten oTOFMSSystems synchronisiert, was die gezielte Analyse einzelner Phasen der diskontinuierlichen Emission von Flüssigkeit ermöglicht. Mit Hilfe des Modellanalyts Bariumbromid ließ sich anhand charakteristischer Indikatorsignale in den Massenspektren auf qualitativer Basis zeigen, daß zu Beginn einzelner Sprayimpulse zunächst kleine Tröpfchen an der Spraykapillare emittiert werden und die Tröpfchengröße im zeitlichen Verlauf des Emissionsimpulses zunimmt. Dieser Befund steht im Einklang mit der von Juraschek [Jur97] vorgestellten Verteilung der Tröpfchengrößen während der diskontinuierlichen Zerstäubung unter den Bedingungen der ESIMS. Ferner konnte durch synchronisierte ESIoTOFAnalyse am Modellsystem einer ZuckerPeptidMischung gezeigt werden, daß Analyte mit höherer Aufenthaltswahrscheinlichkeit an der Flüssigkeitsoberfläche bevorzugt (d.h. zu früheren Zeitpunkten der diskontinuierlichen Zerstäubung) in die geladenen Initialtröpfchen gelangen. Analyte, welche eine höhere Aufenthaltswahrscheinlichkeit im Flüssigkeitsinneren aufweisen, gelangen mit geringerer Wahrscheinlichkeit und somit zu einem späteren Zeitpunkt eines Zerstäubungsimpulses in die Tröpfchen. Die vorgestellten Resultate stehen im Einklang mit den Modellvorstellungen zur Verteilung der Analyte beim für die Desolvatisierung relevanten unsymmetrischen Tropfenzerfall, die unter anderem die geringere Nachweiseffizienz hydrophiler Analyte zu erklären vermag. Der Einfluß des Lösungsmittels auf das resultierende Ionensignal wurde im Rahmen dieser Arbeit im Hinblick auf seine Wirkung als chemische Umgebung des Analyten, auf seine Eigenschaften als Trägerkomponente des Analyten und auf seine Wirkung als Reaktionspartner der Analytionen in der Gasphase untersucht. Als Modellsystem diente der Analyt Bariumbromid in verschiedenen Alkoholen und AlkoholMischungen. Die Untersuchungen ergaben, daß insbesondere die Polarität des eingesetzten Lösungsmittels einen relevanten Aspekt für dessen Wirkung als chemische Umgebung des Modellanalyten darstellt. Eine hohe Polarität des eingesetzten Lösungsmittels begünstigt die Dissoziation des Analyten in Lösung und wirkt somit dem Nachweis von AnalytGegenionAddukten entgegen. Als maßgebliche Eigenschaft in der Rolle der Trägerkomponente ließ sich am Modellanalyt Bariumbromid die Verdampfbarkeit des Lösungsmittels identifizieren. Untersuchungen an einer Analytmischung aus Turanose und Octylglucosid ergaben ferner, daß ebenfalls ausgeprägte Wechselwirkungen zwischen Analyt und Lösungsmittelmolekülen der Verdampfung des Lösungsmittels entgegenwirken. Eine geringe Verdampfbarkeit des Lösungsmittels und eine starke Solvatisierung des Analyten erschweren somit die Desolvatisierung der Analytionen und haben geringe Analytsignalintensitäten in den Massenspektren zur Folge. Ebenfalls ist dem Einfluß der Leitfähigkeit der Analytlösung und somit der Polarität des Lösungsmittels auf die Intensität des resultierenden Ionensignals Rechnung zu tragen. Reaktionen in der Gasphase sind in den ausgewählten Modellsystemen im wesentlichen stoßinduzierte Elektronentransferreaktionen zwischen Lösungsmittel molekülen und zweiwertigen Metallkationen. Eine niedrige Ionisierungsenergie sowie ein hoher Energieeintrag während der Stoßaktivierung - und somit eine hohe Molekülmasse des Lösungsmittels - konnten dabei als begünstigende Faktoren für diese Reaktionen ermittelt werden. Die Resultate zum grundsätzlichen Einfluß des Lösungsmittels dienten als Basis zur Untersuchung des Lösungsmitteleinflusses auf die Bildung von Gramicidin DDimeren mit Hilfe der ESIMS. Am Beispiel dieser nichtkovalenten Peptidkomplexe konnte gezeigt werden, daß die resultierenden Massenspektren unter schonenden Desolvatisierungsbedingungen die Veränderungen des Dimerisierungsgleichgewichts bei Variation des Lösungsmittels widerspiegeln. Die verschiedenen Komponenten der Peptidmischung Gramicidin D bilden zudem in Lösung gemischte Dimere, deren Signale in den Massenspektren eine eindeutige Identifizierung auch geringer Mengen Dimere zulassen. Es ließ sich ferner zeigen, daß die Veränderung der Zusammensetzung von Lösungsmittelgemischen während der Desolvatisierung aus kinetischen Gründen keinen Einfluß auf den detektierbaren Anteil GramicidinDimere aufweist. Untersuchungen zur unspezifischen Adduktbildung in der ESIMS zwischen einem Analyten und weiteren Komponenten der Lösung wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit am Beispiel verschiedener PeptidAnionenAddukte durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, daß insbesondere im negativen Ionenmodus eine ausgeprägte unspezifische Adduktbildung eintritt, während im positiven Ionenmodus nur in geringem Maße PeptidAnionenAddukte zu beobachten sind. MS 2 Untersuchungen der Addukte im negativen Ionenmodus ergaben, daß deren Dissoziation unter Abspaltung der zum Anion korrespondierenden Säure erfolgt, wobei in der Reihe der untersuchten Anionen die Stabilität des Addukts mit abnehmender Gasphasenbasizität des Anions zunimmt. Es konnte aber ferner gezeigt werden, daß neben der Gasphasenbasizität noch weitere Faktoren für die Adduktstabilität von Bedeutung sind; insbesondere sind in diesem Zusammenhang dem Einfluß von CoulombWechselwirkungen und räumlichen Faktoren im Addukt Rechnung zu tragen. Soll die Adduktbildung eines Analyten mit in der Lösung vorhandenen Anionen generell vermindert werden, so ist eine Analyse im positiven Ionenmodus vorzuziehen. Untersuchungen zur Stabilität spezifischer nichtkovalenter Komplexe in der ESIMS wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit am Beispiel der HämGlobinKomplexe von Hämoglobin und Myoglobin durchgeführt. Unter schonenden Desolvatisierungsbedingungen sind die in Lösung vorhandenen nichtkovalenten Komplexe ebenfalls in den ESIMassenspektren detektierbar. Durch vergleichende Untersuchungen im positiven und negativen Ionenmodus sowie durch Variation des Ladungszustands der HämGruppe ließ sich allerdings zeigen, daß die Stabilisierung dieser Komplexe in der ESIMS im wesentlichen auf CoulombWechselwirkungen zwischen Protein und prosthetischer Gruppe in der Gasphase beruht. Die Resultate demonstrieren deutlich, daß die in der ESIMS beobachtete Stabilität nichtkovalenter Komplexe in der Gasphase unter Umständen erheblich von der biologisch relevanten Stabilität dieser Spezies in Lösung abweicht. Zwar kann mit Hilfe der ESIMS die Stöchiometrie nichtkovalenter Komplexe zuverlässig ermittelt werden; zur Ermittlung ihrer Stabilität sind jedoch analytische Untersuchungen in kondensierter Phase prinzipiell vorzuziehen. Zum Nachweis nichtkovalenter Komplexe mittels ESIMS ist für jedes Instrument und jede neue analytische Fragestellung stets eine Optimierung der Analysebedingungen erforderlich. Die vorgestellten Resultate bestätigen anhand ausgewählter Beispiele, daß in Lösung vorhandene spezifische Komplexe intakt in Gasphasenionen überführt und massenspektrometrisch detektiert werden können, sofern die Analyseparameter sorgfältig angepaßt wurden. Dabei stellt der Energieeintrag in die Analytionen während der Desolvatisierung ebenso einen bedeutenden Parameter dar wie die Stabilität des nichtkovalenten Komplexes in der Gasphase, welche in einigen Fällen durch die Wahl des ''richtigen" Ionenmodus zur Analyse beeinflußt werden kann. Ein grundsätzliches ''Patentrezept" zum erfolgreichen massenspektrometrischen Nachweis nichtkovalenter Komplexe kann jedoch nicht gegeben werden. Die Desolvatisierung von Analyten aus einem relativ schwer verdampfbaren Lösungsmittel, wie z.B. Wasser, ist problematisch, und die Freisetzung hydrophiler Analytionen wird durch die ausgeprägte Solvatisierung dieser Spezies erschwert. Um neben diesen unabänderlichen Schwierigkeiten weitere Probleme, wie die Bildung von Addukten, zu vermeiden, sollten für die ESIMSAnalyse möglichst saubere Proben Verwendung finden. Ist zur Stabilisierung des Komplexes in Lösung allerdings der Zusatz von Salzen erforderlich, so sollten unter anderem solche Anionen gewählt werden, die nur in geringem Maße Addukte bilden. Ferner ist im Hinblick auf eine Minimierung der Adduktbildung mit Anionen eine Untersuchung im positiven Ionenmodus vorzuziehen. Für die Weiterentwicklung der ESIMS zur Analyse nichtkovalenter Komplexe ist eine weitere Optimierung der grundsätzlichen Desolvatisierungsmöglichkeiten wünschenswert, welche eine schonende Desolvatisierung des Analyten unter Erhalt der spezifischen nicht kovalenten Wechselwirkungen ermöglichen. Ferner sind Methoden zu entwickeln, um Proben effizient und schnell zu reinigen, ohne die Proteinkomplexe irreversibel zu dissoziieren. Durch Entwicklungen dieser Art sollten erhebliche Fortschritte in der ESIMSAnalytik nichtkovalenter Komplexe möglich sein, die dem Ziel eines zuverlässige en Einsatzes dieser Methode in der Routineanalytik biologisch bedeutender Proben näherkommen.
In der vorliegenden Arbeit wurde die dreidimensionale Struktur des CaM/C20W Komplexes mit Hilfe von heteronuklearer, mehrdimensionaler NMRSpektroskopie ermittelt. Der stabile CaM/C20WKomplex mit einer Bindungskonstanten KD = 11 nM besteht aus dem Protein CaM und dem Peptid C20W. CaM, ein kleines, saures Protein (16,7 kDa), das in allen eukaryontischen Zellen vorkommt und hantelförmig mit zwei Domänen aufgebaut ist, übermittelt die Signalwirkung von Calciumionen an eine Reihe von Zielenzymen. Durch die Bindung von CaM an die Plasmamembran Ca 2 ATPase wird das Calciumsignal wieder beendet. Das Peptid C20W entspricht dem Nterminalen Teil der CalmodulinBindungsdomäne der Ca 2 ATPase. Röntgenkleinwinkelstreu experimente an dem CaM/C20WKomplex führten zu der Vermutung, daß das Peptid C20W nur an die Cterminale Domäne von CaM bindet und damit einen unterschiedlichen Bindungsmodus im Gegensatz zu den bekannten Calmodulin bindenden Peptiden zeigt. Zur Strukturbestimmung des CaM/C20WKomplexes wurde eine Probe aus 13 C, 15 Nmarkiertem CaM und unmarkiertem C20W verwendet. Diese unterschiedliche Markierungsweise erlaubt die Unterscheidung beider Komponenten in den NMR Spektren. Für CaM wurden eine Serie von heteronuklearen, dreidimensionalen Tripelresonanzexperimente aufgenommen, die zunächst die Zuordnung der Resonanzen des Proteinrückgrats und dann auch der der Seitenketten erlaubte. Spezielle NMR Experimente wurden für die Zuordnung der neun Methionine durchgeführt, die bei der Bindung des Peptids eine wichtige Rolle spielen. Durch die Auswertung von NOESY Spektren wurden 1645 Abstandsrestraints für CaM ermittelt, die sich in 794 intraresiduale, 387 sequentielle, 311 mittelreichweitige und 153 langreichweitige restraints aufteilen. Durch die Bestimmung der Temperaturkoeffizienten der Amidprotonen konnten 52 Wasserstoffbrücken von CaM zugeordnet werden. Durch doppeltgefilterte, homonukleare Korrelationsexperimente, bei denen die Protonen resonanzen von 13 C, 15 Nmarkiertem CaM unterdrückt werden, konnten die Resonanzen des unmarkierten Peptids C20W zugeordnet werden. Es wurden 163 NOE restraints ermittelt, wobei 102 intraresidual, 32 sequentiell und 29 mittelreichweitig waren. Schließlich konnten mit Hilfe eines halbgefilterten NOESYExperiments 49 intermolekulare NOE's zwischen CaM und C20W zugeordnet werden. Außerdem wurden neben den Abstandsrestraints für CaM 129 Dihedralwinkelrestraints ermittelt. Die gesamte Zuordnung des CaM/C20WKomplexes wurde in der Datenbank BioMagResBank mit der Nummer 4284 abgelegt (http://www.bmrb.wisc.edu/). Die experimentell gewonnenen restraints wurden in einer MoleküldynamikRechnung mit einem simulated annealingProtokoll verwendet, wobei insgesamt 200 Strukturen berechnet wurden. Die 26 energieärmsten Strukturen wurden als repräsentativ ausgewählt und in der Brookhaven Protein Datenbank mit dem PDB IDCode 1CFF abgelegt (http://www.rcsb.org/). Die 26 Strukturen weisen für die Nterminale Domäne einen RMSDWert von 0.75 Å über die Proteinrückgratatome und für die Cterminale Domäne zusammen mit dem Peptid C20W einen RMSDWert von 0.53 Å über die Proteinrückgratatome auf. Die hohe Konvergenz der Strukturen und gute Werte bei der RamachandranStatistik (73.7% in den erlaubten Bereichen) sprechen für eine gute Qualität der ermittelten Strukturen. Die ermittelte Struktur des CaM/C20WKomplexes zeigte einen neuartigen Bindungsmodus des Peptids. C20W bindet nur an die Cterminale Domäne von CaM, die Nterminale Domäne ist nicht in der Bindung involviert. Diese Struktur steht damit im Gegensatz zu den bisher bekannten CaM/PeptidKomplexen, bei denen das Peptid von beiden Domänen gebunden wird und ein globulärer Komplex entsteht. Der Bindungsmodus des C20Ws wurde zum einen durch chemische Verschiebungs differenzen der Amidprotonen und der Methionine ermittelt. Zum anderen konnten ausgehend von C20W intermolekulare NOE's nur zur Cterminalen Domäne von CaM zugeordnet werden. Die Sekundärstruktur von CaM ändert sich durch die Bindung des Peptids kaum. Beide Domänen, die zueinander homolog sind, bestehen aus vier alphaHelices und einem kurzen antiparallelen betaFaltblatt. Verbunden sind beide Domänen durch eine flexiblen Linkerbereich, wobei die Domänen zueinander keine Orientierung zeigen, da keine NOE's zwischen den Domänen gefunden wurden. Der ungewöhnliche Bindungsmodus des Peptids C20W steht im Einklang mit der Tatsache, daß die Plasmamembran Ca 2 ATPase bereits durch die Cterminale Domäne von CaM aktiviert werden kann. Der CaM/C20WKomplex läßt sich daher als Schnappschuß auf dem Weg der vollständigen Aktivierung der Ca 2 ATPase durch CaM verstehen. Die Ergebnisse der NMRspektroskopischen Untersuchung des CaM/C20WKomplexes wurden in (1999) Biochemistry 38, 1232012332 veröffentlicht. Die Publikation ist im Anhang (Kapitel 6.9) beigefügt. Um die Orientierung der Domänen des CaM/C20WKomplexes zueinander zu untersuchen, sind weiterführende Experimente geplant. Hierzu sollen Messungen an einem CaM/C20WKomplex unternommen werden, der am NTerminus des Peptids einen paramagnetischen Marker trägt, wobei dipolare Kopplungen und Pseudo kontaktshifts ermittelt werden sollen. Weiterhin sind ähnliche Untersuchungen an einem CaM/C20WKomplex geplant, der am NTerminus von CaM einen paramagnetischen Marker trägt. Mit diesen Experimenten sollte es gelingen, die Frage der Domänen orientierung zu klären.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden konformationelle und strukturelle Eigenschaften Biomolekülen Hilfe NMRspektroskopischen und biochemischen Methoden, sowie Synthese Liganden untersucht. Kapitel wurde das Verhalten beiden Hauptkonformere des Dolastatin Gegenwart Tubulin untersucht. wurden sechs neuartige Dolastatin 10Derivate synthetisiert, welche TubulinPolymerisation unterschiedlich inhibieren. Das Protein Tubulin wurde sowohl die vitroBindungsstudien auch für NMR spektroskopischen Experimente isoliert. Verbindungen 35b repräsentieren jeweils und das transKonformer des Dolastatin 10, wobei erstere einen stärke inhibitorischen Effekt der TubulinPolymerisation das lineare Dolastatin Derivat zeigte. Daraus kann man schließen, cisKonformation Dola statin Inhibition der TubulinPolymerisation verantwortlich ist. Durch diese neue Erkenntnis können Dolastatin 10Derivate, welche dem cisKonformer Dolastatin entsprechen, synthetisiert werden und potentielle Krebstherapeutika Anwendung finden. einem zweiten Ansatz wurde das Nmarkierte lineare Dolastatin 10Derivat heteronuclearen zweidimensionalen NMRExperimenten in Gegenwart von DEAE MAPTubulin untersucht. Durch Bestimmung der Korrelationszeiten Konformer Verbindung Gegenwart DEAE und MAPTubulin den beiden Dimensionen gekoppelten 1 H 15 NHSQCSpektren konnte gezeigt werden, cisKonformer von schnellen Austausch gebundenen Form befindet. Gegenwart DEAETubulin stellt man einen erhöhten cisGehalt von fest, welcher auf eine schwache Bindung des Liganden hindeutet. Falle MAP Tubulins der Anteil cisKonformers von Vergleich freien Verbin dung nahezu unverändert. Durch erhöhte Korrelationszeit des cisKonformers Gegenwart von MAPTubulin kann man eine zusätzliche Wechselwirkung mit MAPs annehmen, welche eventuell Bindung betaUntereinheit des Tubulins verstärkt. Außerdem könnte die Wechselwirkung der MAPs mit dem Tubulin durch den Liganden gestört werden. Bei den entsprechenden Messungen mit Cmarkiertem Colchicin in Gegenwart DEAE und MAPTubulin konnte ebenfalls schneller Austausch Liganden gebundenen Form nachgewiesen werden. Hierbei wurde aber kein unterschiedliches Verhalten bei beiden TubulinSorten festgestellt. Die Bindungsstelle Colchicin betaUntereinheit Tubulins unterscheidet sich der Dola statin (Abb. 2.12). Deshalb kann man zusätzliche Wechselwirkungen MAPs ausschließen. Versuche zum Einsatz Vanadat Übergangszustandanalogon Phosphat Spaltreaktion des Hammerhead Ribozyms wurden in Kapitel beschrieben. Zunächst wurden experimentellen Rahmenbedingungen Komplexbildung Vanadat 1,2cisDiolen der Ribose einfachen Nucleosiden und Nucleotiden getestet. konnte gezeigt werden, daß freie Phosphatgruppen Komplexierung Vanadats dem 1,2cisDiol Ribose verhindern. Allerdings stört die Anwesenheit Phosphosäurediestern nicht gewünschte Komplexbildung. Diese Erkenntnisse wurden bei verschiedenen RNAKonstrukten Hammerhead Ribozyms berück sichtigt. Durch Einführung von desoxyRibose den 3'terminalen Nucleosiden konnte Komplexbildung Vanadat den Fällen beobachtet werden, denen erwarten war, wenn sich das Vanadat anstelle Phosphates nach dem A17 Hammerhead Ribozym befindet. konnte gezeigt werden, daß Vanadat Über gangszustandsanalogon Phosphat bei Spaltung Hammerhead Ribozyms gesetzt werden könnte. Bestimmung dreidimensionalen Struktur des Membranproteins Phospholamban CDCl 3 /CD 3 wurde Kapitel 4 beschrieben. Hierbei wurden homo nuclearen zweidimensionalen Spektren gewonnenen Abstandsinformationen NOE Daten Dihedralwinkel aus Kopplungskonstanten verwendet, die Struktur Phospholambans Lösung zu gewinnen. Phospholamban besteht aus zwei alphahelikalen Regionen (Val4Ser16 und Pro21Val49), die über einen betaturn (Typ verbunden sind. Die turnRegion weist eine hohe Flexibilität auf, welche wichtig seine biolo gische Wirkung sein könnte. So könnte hier Annäherung von Enzymen Proteinkinasen oder der ATPase erleichtert werden.
g/d TLymphozyten stellen beim Menschen ca. 15% der intestinalen intraepithelialen Lymphozyten. Die physiologische Funktion der g/d TZellpopulation ist ungeklärt. Auf grund ihrer Akkumulation in mukosalen Oberflächen scheinen sie eine Komponente der ''ersten Verteidigungslinie" zu bilden. Das d TZell Rezeptor (TCR) Repertoire gesunder Erwachsener ist oligoklonal, streng individuenspezifisch und zeitlich stabil. Zudem besteht eine charakteristische Kompartimentierung, d.h. im Intestinum liegt ein anderes d TCRRepertoire vor als im peripheren Blut. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob das intestinale d TCRRepertoire einer entwicklungsabhängi gen Dynamik unterliegt. Hierzu wurde die Diversität der antigenbindenden (CDR3) Domäne intestinaler dKettentranskripte von Feten, Neugeborenen, Kindern und Erwachsenen mittels denaturierender PAGE und DNASequenzierung molekular biologisch analysiert. Unsere Studien dokumentieren, daß im Verlauf der Reifung vom Fetus zum adulten Individuum gravierende Veränderungen stattfinden. Das fetale d TCRRepertoire ist stark eingeschränkt und zeichnet sich durch niedrige Komplexität der dKettentrans kripte aus was darauf beruht, daß innerhalb der CDR3Domänen kaum matrizen unabhängige ''N"Nukleotide existieren und zudem homologieabhängige Rekombina tionsereignisse stattfinden. Die Tatsache, daß verschiedene Feten teilweise identi sche dKettentranskripte exprimieren kann jedoch nicht allein auf obige Mechanis men zurückgeführt werden. Somit bleibt unklar, ob das fetale d TCRRepertoire vorprogrammiert ist oder Selektionsprozessen unterliegt. Im Gegensatz zu Feten ist das d TCRRepertoire Neugeborener polyklonal. Wie bei Erwachsenen weisen die CDR3Domänen ihrer dKettentranskripte zahlreiche ''N"Nukleotide auf. Da das d TCRRepertoire bereits im Alter von 14 17 Jahren starke Einschränkungen seiner Diversität zeigt und mit demjenigen siebzigjähriger Personen vergleichbar ist wird angenommen, daß die klonalen Expansionen eine Folge kontinuierlicher Selektions prozesse darstellen, die z.B. durch HSP verwandte Eigenantigene vermittelt werden. Vergleichbar dem Intestinaltrakt bildet auch die Haut eine bedeutende Grenzfläche des Organismus zu seiner Umgebung. Möglicherweise spielen kutane g/d TZellen ebenfalls eine Rolle im Rahmen einer ''ersten Verteidigungslinie". Wir wiesen anhand gesunder Erwachsener nach, daß das kutane d TCRRepertoire analog zum Intesti num oligoklonal ist und sich signifikant vom peripheren d TCRRepertoire unter scheidet. Da in multiplen Hautbiopsien identische dKettentranskripte gefunden wer den, sind dominante g/d TZellklone offenbar weiträumig in der Haut verteilt. Weiterhin wurde untersucht, ob spezifisch aktivierte g/d TLymphozyten an der Patho genese chronisch entzündlicher Darmerkrankungen beteiligt sind. Im Fall der ange nommenen antigenvermittelten Aktivierung müßten klonale Expansionen einzelner g/d TZellpopulationen zu charakteristischen Verschiebungen des d TCRRepertoires innerhalb entzündlich veränderter Darmareale führen. Vergleichende Analysen der läsionalen und nichtläsionalen Darmabschnitte von M.CrohnPatienten lassen jedoch keine krankheitsassoziierten Repertoireverschiebungen erkennen. Vielmehr weisen entzündliche und nichtentzündliche Areale nahezu identische d TCRRepertoires auf. Da dies auch im Fall der bakteriell verursachten Divertikulitis gilt, werden g/d TLym phozyten vermutlich generell indirekt oder über TCRunabhängige Mechanismen (z.B. Zytokine) aktiviert. Alternativ wird eine Erkennung streßinduzierbarer Eigenanti gene durch intestinale g/d TZellen diskutiert. Beide Vorgänge würden zu keiner Beeinflussung des d TCRRepertoires führen und in Einklang mit den nachgewiese nen Expansionen einzelner weniger Rezeptorspezifitäten stehen. Da vermutlich auch die BLymphozyten der intestinalen Lamina propria an der ''ers ten Verteidigungslinie" beteiligt sind nahmen wir an, daß die Ig H Transkripte IgA bzw. IgM exprimierender BZellen ebenfalls Einschränkungen ihres Rezeptor Repertoires aufweisen. Wir fanden, daß die kleinen V H 5, V H 6 und V H 7Familien intestinaler B Zellen oligoklonale Expansionen zeigen, während das Repertoire der dominierenden V H Familien deutlich diverser ausfällt. Durch Subklonierung lassen sich jedoch bei sämtlichen VH Familien klonal verwandte IgATranskripte in weit voneinander ent fernten Darmabschnitten identifizieren. Zudem stellen ~ 75% aller Basensubstitutio nen stille Mutationen dar oder führen zum Ersatz durch Aminosäuren vergleichbarer Eigenschaften, was auf einen starken Selektionsdruck schließen läßt. Da kaum Hin weise auf Isotypwechsel vorliegen, stellen intestinale IgM und IgAImmunozyten ver mutlich divergente Zellinien dar. Das V H Repertoire peripherer BZellen ist stark limitiert, wobei kaum Überlappungen mit intestinalen IgVH Repertoires bestehen. Aufgrund der partiellen Einschränkung des V H Repertoires ist anzunehmen, daß Teile der humoralen Immunabwehr konservierte Antigene erkennen, wobei es sich im Gegensatz zu TZellen wahrscheinlich nicht um Eigenantigene, sondern um Oberflächenstrukturen symbiontischer Mikroorganismen handelt. Unsere Resultate zeigen, daß die Begrenzung des Rezeptor Repertoires ein Charak teristikum von B und TLymphozyten darstellt. Übereinstimmend hiermit wurden von anderen Arbeitsgruppen klonale Expansionen auch bei a/b TZellen nachgewiesen. Vermutlich wird die Expansion einzelner Zellklone durch permanente Wechselwirkun gen mit ''Schlüsselantigenen" induziert, wobei es sich um invariante Fremdantigene oder konservierte Eigenantigene handeln dürfte.
Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung und Verfeinerung der Lösungsstruktur der rekombinanten pI=5,1 Isoform des H-FABPs aus Rinderherz. Dabei wurde von Proben mit einem Fettsäuregemisch ausgegangen und somit die HOLO–Form des Proteins untersucht. Der Einsatz von mehrdimensionaler NMR–Spektroskopie zur Bestimmung von Abstandsrandbedingungen, stereospezi…schen Zuordnungen und Diederwinkeln aus 3J–Kopplungskonstanten ermöglichte die Verwendung von 1877 Abstandsrandbedingungen, 52 stereospezifischen Zuordnungen und 81 Diederwinkelbeschränkungen. Die Struktur basiert im Schnitt auf 15 geometrischen Beschränkungen je Aminosäurerest. Mit einem mittleren globalen RMSD–Wert der Rückgratatome von 1,07+-0,15Å und den relativ niedrigen berechneten Energiewerten sind die Ansprüche an eine hochaufgelöste Struktur erfüllt. Vergleiche mehrerer struktureller Kriterienmit 160 Proteinkristallstrukturen haben ergeben, daß die hier bestimmte Lösungsstruktur in ihrer Güte einer Kristallstruktur mit einer Auflösung von etwa 2,4 Å entspricht. Die Molekulardynamiksimulation der energetisch niedrigsten Lösungsstruktur in einer Wassersimulation führte anfangs zu einer raschen Konformationsänderung der Struktur. Diese war gekennzeichnet durch eine Vergrößerung des als Eingangsportal für den Fettsäureliganden postulierten Bereiches. Zugleich wurden zwei weitere kleine Öffnungen erkennbar, welche als Austrittsöffnungen für Wassermoleküle dienen könnten.
Metalle, die mit kubisch innenzentrierter Struktur oder in dichtesten Kugelpackungen kristallisieren, wandeln sich in guter Näherung ohne Volumenänderung ineinander um. Dieser bereits von Pearson 1972 beschriebene Sachverhalt wird hier als Volumenregel formuliert. Elemente in den genannten Strukturen haben die gleiche Dichte. Mit der für die Abhängigkeit des Bindungsgrades s vom Atomabstand r von Pauling 1947 angegebenen Funktion s(r) = exp((R1 - r)/b) wird aus den Kristallstrukturen der festen Elemente das Atomvolumen berechnet, das das jeweilige Element bei gleicher Bindungswertigkeit in einer dieser Strukturen hat. Dabei werden Strukturen mit höherer Dichte als die kubisch innenzentrierte Struktur oder die dichtesten Kugelpackungen nicht gefunden. Diese und einige weitere Strukturen gleicher Dichte (+- 1%) werden hier als dichte Strukturen bezeichnet. Außer den Edelgasen sind alle Elemente, die mit dichten Strukturen kristallisieren, Metalle, doch haben eine Reihe von Metallen (Mangan, Zink, Cadmium, Quecksilber, Gallium und Zinn) nichtdichte Strukturen. Für diese und für die nichtmetallischen Elemente wird das Atomvolumen ihrer dichten Formen berechnet, d.h. das Volumen, das sie unter Normalbedingungen im dichten (metallischen) Zustand einehmen würden. Ist für ein Element der Bindungsgrad für eine Bindungslänge bekannt, so kann aus diesem das Atomvolumen im dichten Zustand abgeschätzt werden. Aus verschiedenen Strukturen von Nichtmetallen (Phosphor und Schwefel etc.) berechnet sich jeweils in guter Näherung das gleiche Atomvolumen für den dichten Zustand VD. Dies bestätigt die Gültigkeit der Pauling-Funktion. Eine weitere Bestätigung liegt darin, dass für Mangan, Kupfer und Technetium in verschiedenen Strukturen quantenmechanisch berechnete Volumenverhältnisse nach den hier abgeleiteten Beziehungen ebenfalls erhalten werden. Der dichte Zustand der Elemente erscheint hier als ein von der Kristallstruktur unabhängiger Grenzzustand der kondensierten Materie. Bei bekannter Bindungswertigkeit eines Elements können die Parameter R1 und b der Paulingfunktion (Bindungsgrad-Parameter) und damit die Abstandsabhängigkeit des Bindungsgrades berechnet werden. Dies wird für alle s-, p- und d-Elemente durchgeführt. Dabei ergeben sich für die Länge der Einfachbindung R1 Werte, die zum Teil erheblich von den Literaturdaten abweichen. Der Parameter b ist im Gegensatz zu den Literaturangaben nicht konstant, sondern der dritten Wurzel aus VD proportional. Aufgrund derBindungsgrad-Parameter kann derBeitrag vonMetall-Metall-Bindungen zur Wertigkeit in Verbindungen bestimmt werden. Die Volumenverhältnisse von intermetallischen Phasen sowie Hochdruckformen der Elemente werden aufgrund der hier abgeleiteten Beziehungen diskutiert.
Mit kombinatorisch-chemischer Synthese und einem Gel-shift Test wurden niedermolekulare, peptidische RNA-Liganden gefunden. Als Target-Moleküle dienten ein 23mer RNA-Oligonukleotid (CETP-RNA) aus der Cholesterol Ester Transfer Protein mRNA und ein 27mer RNA-Oligonukleotid aus der HIV-1 Transactivation response region (TAR) RNA (delta-TAR-RNA). Zudem wurde erstmals die Methode des Phage Display angewendet, um RNA-Liganden zu finden. Die aus beiden Screeningmethoden erhaltenen Liganden wurden mit verschiedenen biophysikalischen Methoden, insbesonders der NMR-Spektroskopie auf ihre Bindungseigenschaften und mittels in vitro und in vivo-Tests auf ihre physiologische Aktivität hin untersucht. Ein 16mer Peptid der Antennapedia Homeodomäne internalisiert rasch in Zellen verschiedener Kulturen. Im Screening gefundene Peptidliganden wurde über flexible Spacer (2 beta-Ala-Einheiten) mit diesen 16mer synthetisiert. Es wurde gezeigt, daß diese Peptide so in die Zielzellen und besonders in deren Zellkern gelangen. Basische delta-TAR-RNA-Liganden zeigen diese Verhalten auch ohne Transportersequenz. Die Ergebnisse des Phage-Display-Screenings sind widersprüchlich, da die so gefundenen RNA-Liganden mit den genutzen biophysikalischen Methoden (NMR, CD, Gelelektrophorese) keine größere Affinität an die delta-TAR-RNA zeigen. Im physiologischen Test haben diese Liganden dennoch eine HIV-1 inhibitorische Aktivität gezeigt. In einer humanen Makrophagenkultur, der Wirtszelle von HIV, wurden mit den Peptiden Thr-Pro- Glu-Leu-Pro-Trp-His-NH2 und Phe-His-Ser-Val-Gln-Ala-Leu das HIV-1 Wachstum um 20- 30% inhibiert. Diese Ergebnisse widersprechen den strukturellen Bindungsinfornmationen und sind deshalb fraglich. Ein Monitoring während der Panning-Prozedur wurde nicht durchgeführt. Es wurde auch nicht überprüft, wieviel RNA wirklich immobilisiert wurde. Aufgrund der sehr geringen Substanzmengen was das nicht möglich. In einem deutlich größerem Maßstab, könnten in Zukunft strukturelle Informationen über die immobilisierte RNA gewonnen werden, z. B. mit HR-MAS-NMR-Techniken. Die im Gel-shift-Screening gefundenen delta-TAR-RNA-Liganden des Gel-shift-Screening zeigen keine HIV-1 inhibitorische Aktivität. Die gefundenen Bindungskonstanten sind allerdings um eine Größenordnung kleiner als die der natürliche Bindungsregion Tat10, welche eine HIV-1 inhibitorische Wirkung besitzt. Die im Gel-Shift-Screening gefundenen CETP-RNA/Peptid-Paare mit den stärksten Affinitäten wurden mittels NMR-Spektroskopie und CD- und Gel-shift-Experimenten charakterisiert. Die Bindungskonstanten lagen im niedrig mikromolaren Bereich. Wie in 1D Jump Return-Experimenten gezeigt wurde, verschoben sich die Signale verschiedener Liganden in Gegenwart der CETP-RNA unterschiedlich stark. Zudem konnte eine Verbreiterung der Signale der Liganden festgestellt werden. Das Peptid Lys-Tyr-Lys-Leu- Tyr-Lys-Cys-NH2 zeigte bei der CETP-RNA den stärksten Effekt mit Bindungsaffinitäten von Kd = 32±2 mikro-M (CD-Titration). In 2D NOESY Experimenten zeigt der Peptid-Ligand Kreuz-Signale zu den Iminoprotonen der CETP-RNA. Da die Sekundärstruktur der CETPRNA ein Hairpin ist, sollte das Peptid somit Kontakt zu der Doppelstrang-Region haben. Dieses Peptid zeigt zudem einen deutlichen Effekt auf das CD-Verhalten seiner CETP-RNA. Offenbar wird die Basenpaarung der Sekundärstruktur unter Peptideinfluß geschwächt. Im physiologischem Test am Tiermodell einer transgenen Maus zeigt dieser Ligand eine Erniedrigung des Cholesterolester Transfers. In Zukunft könnte das Peptid Lys-Tyr-Lys-Leu- Tyr-Lys-Cys-NH2 mit z. B. unnatürlichen Aminosäuren modifiziert werden, um eine bessere physiologische Stabilität zu erhalten und dadurch möglicherweise die physiologische Aktivität zu erhöhen. Auch eine Leitstrukturoptimierung kann durchgeführt werden.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung inter- und intramolekularer Wechselwirkungen in Molekülkristallen, Ausgangspunkt sind die Kristallisation und Strukturbestimmung ausgewählter Modellverbindungen. Die einzelnen Fragestellungen werden durch geeignete Kombinationen sich ergänzender Analysenmethoden, umfangreichen Datenbank-Recherchen und quantenchemischen sowie Atompotential-Berechnungen zu beantworten versucht.
The formation of aliphatic α-amino acids by X-ray induced carboxylation of simple amines or amination of simple carboxylic acids is not favored over the formation of other amino acids. The new carboxylic and amino groups are more or less distributed statistically over the carbon atoms of the starting material. On radiationchemical formation of aliphatic hydrocarbons over C3, therefore, an increasing amount of unusual amino acids is produced. The results are influenced by various parameters such as temperature, pH, concentration, linear energy transfer and total dosis of radiation applied. Also peptides can be formed radiationchemically. However, the formation of greater molecules by radiationchemical processes under the conditions of a primitive earth seems to have only a low probability. The reaction mechanisms of radiationchemical carboxylation and amination are discussed.
Beiträge zur Erweiterung der Hückel'schen Theorie der π-Elektronensysteme [Pi-Elektronensysteme]
(1963)
Beiträge zur Erweiterung der Hückel'schen Theorie der Pi-Elektronensysteme Hückel entwickelte 1931 ein Verfahren zur quantenmechanischen Berechnung zahlreicher Eigenschaften von zr-Elektronensystemen. Obwohl die Theorie halbtheoretisch ist, hat sie einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis solcher Eigenschaften von ungesättigten und aromatischen Verbindungen geliefert, die dem Grundzustand der Moleküle zugeschrieben werden können, so z. B. der Resonanzstabilität und der Reaktivität. Doch ist sie nur in der Lage, die Eigenschaften dieser Verbindungen richtig zu beschreiben, die durch angeregte Zustände der Moleküle mitbestimmt werden, wie z. B. die Spektren, wenn man für das Resononanzintegral einen entsprechenden Wert verwendet, der von dem für den Grundzustand benutzten bedeutend abweichen kan. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wird die Hückel'schen Theorie der Pi-Elektronensysteme diskutiert. Einen nur annähernd vollständigen Überblick über die Beiträge zu dieser Theorie zu geben, würde den Rahmen der Arbeit überschreiten. Daher wurde sich im Wesentlichen darauf beschänkt, die Grundgedanken und die Näherungen des Verfahrens klar darzustellen und kritisch zu betrachten, sowie die Anwendungsmöglicheiten zu beschreiben. Hartmann hat 1960 eine Erweiterung der Hückel 'schen Theorie vorgeschlagen, die auch solche Eigenschaften ungesättigter und aromatischer Verbindunsen richtig erfaßt, die aur der Beteiligung angeregter Zustände beruhen, wie am Beispiel der Spektren gezeigt wurde. Im zweiten Teil dieser Arbeit wird die Hückel-Hartmann'sche Theorie der Pi-Elektronensysteme dargestellt und die Ergebnisse mit denen der Hückel'schen Theorie verglichen. Hartmann selbst hat die Erweiterung nur für gleichatomige Pi-Elektronensysteme und unter zahlreichen Vernachlässigunen durchgeführt. Dieser Umstand und die wenigen zu der Theorie erst vorliegenden Arbeiten ließen es wünschensert erscheinen, die Hückel-Hartmannsche Theorie der Pi-Elektronensysteme systematisch und in möglichst allgemeiner Form zu diskutieren. Im dritten Abschnitt der Arbeit wird daher eine Generalisierung der Hückel-Hartmannt'schen Theorie durchgeführt. Mit Hilfe des entwickelten Verfahrens wird anschließend der Einfluß der Überlappungen auf die Ergebnisse untersucht und eine Erweiterung der Hückel-Hartmann'schen Theorie auf heteroatomare Pi-Elektronensysteme angegeben.
Wir ermittelten die Geschwindigkeitskonstanten sowie die Arrhenius sehen Aktivierungsenergien und Aktionskonstanten der alkalischen Hydrolyse einer Reihe von Di- und Tripeptiden. Die zur Gewinnung der kinetischen Daten führende quantitative Analyse der Hydrolysate gelang, indem die Peptide vor ihrer Hydrolyse geeignet mit 14C markiert, die Hydrolysate mit Hilfe der Papierchromatographie bzw. der Zonenelektrophorese getrennt und die isolierten Hydrolyseprodukte auf Grund ihrer Radioaktivität quantitativ bestimmt wurden.
Der zeitliche Verlauf der alkalischen Hydrolyse von Di- und Tripeptiden wird durch ein Zeitgesetz 1. Ordnung bezüglich des Peptids und bezüglich der Hydroxylionen dargestellt. Die Abstufungen der Aktivierungsenergien, die den einzelnen Peptidbindungen in Di- und Tripeptiden zugeordnet sind, lassen sich durch die Annahme deuten, daß die Hydrolyse nach dem BAC 2-Mechanismus verläuft. Die Aktionskonstanten wachsen, wenn auch nicht regelmäßig, mit den Aktivierungsenergien.