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Hintergrund: Der interventionelle Verschluss stellt für viele Patienten mit Vorhofseptumdefekt eine wichtige Alternative zur Operation dar. Jedoch ist dieses Verfahren noch relativ jung, so dass wenige Langzeitstudien bezüglich des Outcomes nach interventionellem Verschluss existieren. In dieser Studie wird das Langzeit-Outcome hinsichtlich der kardiopulmonalen Belastbarkeit beider Verschlussmethoden miteinander verglichen. Der Idee, eine spiro-ergometrische Untersuchung durchzuführen, lag die Vermutung zugrunde, dass es möglicherweise durch die Thorakotomie bei der Operation zu einer pulmonalen Restriktion kommen kann. Methoden: Es wurden insgesamt 52 Patienten untersucht, bei denen zwischen 1993 und 2002 in Frankfurt am Main ein Vorhofseptumdefekt verschlossen wurde. Die spiroergometrische Untersuchung fand ½ Jahr bis 9 Jahre nach Verschluss des Vorhofseptumdefektes statt. Bei 25 Patienten wurde der Defekt operativ verschlossen, bei 27 mittels interventionellem Verschluss. Das Alter der Patienten lag zwischen 6 und 59 Jahren. Die spiroergometrischen Daten wurden auf einem Fahrradergometer in halbliegender Position nach dem Protokoll von Godfrey erhoben. Hierbei wurde vor allem die Sauerstoff-aufnahme (VO2), die Kohlendioxidabgabe (VCO2), das Tidalvolumen (Vt) und das Atemminutenvolumen (VE) kontinuierlich ermittelt. Ergebnisse: Ein statistisch signifikanter Unterschied bezüglich des Alters und des Geschlechts lag zwischen den beiden Gruppen nicht vor. Es konnte auch kein signifikanter Unterschied bezüglich der maximalen Belastbarkeit, maxi-maler Herzfrequenz, des Tidalvolumens, der Sauerstoffaufnahme und der Kohlendioxidabgabe festgestellt werden. Praktische Schlussfolgerungen: Der interventionelle und der operative Verschluss haben hinsichtlich der kardiopulmonalen Belastbarkeit ein ver-gleichbares gutes Langzeitergebnis. Beide Verfahren weisen in Bezug auf andere Punkte (Invasivität, Komplikationsrate, Erfolgsrate, Kosten etc) sowohl Vor- als auch Nachteile auf. Jedoch ist durch die geringere Invasivität sowie durch das Ausbleiben der Narbenbildung die subjektive Einschränkung der Patienten mit interventionellem Verschluss deutlich geringer, so dass diese Methode wenn möglich die Methode der 1. Wahl darstellen sollte.
Das Ziel dieses Promotionsvorhabens besteht darin die aktuelle Qualitätsdiskussion im Bildungsbereich aufzugreifen und auf Grundlage der aktuellen Lehrplanentwicklung einen Beitrag zur Qualitätsentwicklung und -sicherung des Sportunterrichts zu leisten. Aus diesem Vorhaben sind die drei Publikationen dieser kumulativen Dissertation sowie sechs weitere Veröffentlichungen zu dieser Thematik im weiteren Sinne entstanden. Als zentrales Ergebnis der SPRINT-Lehrplananalyse ist festzuhalten, dass sich der auf der Zielebene formulierte Doppelauftrag eines Erziehenden Sportunterrichts in der neueren Lehrplanentwicklung offensichtlich durchgesetzt hat. Die Orientierung der Lehrplanarbeit an der aktuellen sportpädagogischen Diskussion ist sicherlich ein positiv zu bewertender Befund dieser Untersuchung. Allerdings birgt diese Entwicklung in der konkreten Umsetzung die Gefahr, dass der gemeinsam anerkannte Kern des Unterrichtsfaches „Sport“ im Zuge einer solchen Öffnung zunehmend diffus zu werden droht. Aus diesem Grund sollte darüber nachgedacht werden, ob und auf welche Weise ein Rahmen geschaffen werden kann, der einen Identitätskern im Zuge der Öffnung des Faches sichert. Eine Möglichkeit, diesem Anliegen Rechnung zu tragen, wird in der Formulierung von Bildungsstandards vermutet, die ein zentrales Thema der v. a. seit TIMMS und PISA aufgekommenen bildungspolitischen Diskussion um die Qualitätsentwicklung und Qualitätssicherung der Schule sind. In der Fachdiskussion werden jedoch zunehmend auch Stimmen laut, die insbesondere vor einem einseitig outputorientierten Vorgehen warnen, das Bildung auf (sport-)motorische Fähig- und Fertigkeiten sowie sportspezifische Kenntnisse reduziere und die Prozessperspektive von Bildungssituationen aus den Augen verliere. Für die Sportpädagogik als Fachwissenschaft des Schulsports stellt sich mithin die komplexe Frage, ob bzw. wie Bildungsstandards für das Fach Sport derart formuliert werden können, dass sie sowohl der Tendenz zur Öffnung der Inhalte im Sinne von Bewegungsfeldern als auch dem Doppelauftrag der Integration von Bewegungsbildung und allgemeiner Bildung im Sportunterricht gerecht werden. Nach der Aufarbeitung der Diskussion um Bildungsstandards wird im nächsten Schritt dieses Promotionsvorhabens ein Konzept von Bildungsstandards entwickelt, das dem in der neuen Lehrplangeneration formulierten Doppelauftrag eines Erziehenden Sportunterrichts gerecht wird und zur Qualitätsentwicklung des Unterrichts beiträgt. Hierzu werden Kriterien für die Erfassung der Qualität des Sportunterrichts entwickelt, die Bildung nicht auf einen (motorischen) Output reduzieren. Am Praxisfeld „Bewegen an Geräten“ wird schließlich exemplarisch aufgezeigt, wie eine so verstandene pädagogische Qualität evaluiert werden kann. Bildungsstandards für den Sportunterricht definieren nach dem vorliegenden Ansatz neben Anforderungen an die Schülerinnen und Schüler, Anforderungen an die Qualität des Unterrichts. Der in neueren Lehrplänen formulierte Doppelauftrag des Erziehenden Sportunterrichts fungiert hierbei als Außenkriterium für „guten Unterricht“. Über die Formulierung von Bildungsstandards hinaus, muss überlegt werden, wie die Einhaltung dieser Standards evaluiert werden kann. Dies kann durch Kombination einer projektorientierten Evaluation mit einer Evaluation der Lerngelegenheit (opportunity to learn Evaluation) erfolgen. Bei der projektorientierten Evaluation wird erfasst, ob die definierten bewegungsfeldspezifischen Kompetenzen im Sinne motorischer Mindestanforderungen und bereichsspezifischer Kenntnisse sowie ergänzende Kriterien bei der Präsentation eines Projektes erfüllt werden. Die opportunity to learn Evaluation zielt auf die Qualität des Unterrichts und soll sicherstellen, dass der Unterricht die Möglichkeit dafür bereitstellt, dass sich die Schülerinnen und Schüler fachspezifisch weiterentwickeln können und dass dabei Schlüsselkompetenzen allgemeiner Bildung zum Tragen kommen. Am Institut für Sportwissenschaften der Universität Frankfurt wurde auf der skizzierten theoretischen Grundlage eine opportunity to learn Evaluation der Ausbildungskonzeption im Bewegungsfeld Bewegen an Geräten durchgeführt. Mit Hilfe eines standardisierten Fragebogens sowie ergänzender qualitativer Interviews wurde evaluiert, ob es gelingt, zentrale Erfahrungsinhalte dieses Bewegungsfeldes systematisch zu ermöglichen und ob es gelingt, diese Erfahrungsinhalte derart zu initiieren, dass dabei Selbstbestimmungs- und Teamfähigkeit zum Tragen kommen. Die Ergebnisse zeigen, dass das Ausbildungskonzept beides ermöglicht. Mit dem in dieser Dissertation entwickelten Konzept von Bildungsstandards und den skizzierten Formen der Evaluation, erscheint es möglich, der Forderung nach Qualitätssicherung im Bildungsbereich nachzukommen, ohne dass dabei durch eine einseitige Orientierung am Lern-Output die Prozessperspektive von Erziehungssituationen aus den Augen verloren wird.
Neben den Phytocannabinoiden und synthetischen Cannabinoiden exisitieren bei Säugetieren und Menschen endogene Cannabinoide (EC). Diese lipophilen Signalstoffe sind vorwiegend im ZNS und Immunsystem aktiv. Heute werden den EC vermehrt neuroprotektive Eigenschaften zugewiesen. Mit den Cannabinoid (CB)1- und -2-Rezeptoren wurden bisher zwei dem endogenen Cannabinoidsystem (ECS) zugehörige Rezeptoren kloniert. Pharmakologische Untersuchungen an CB1- und -2-Rezeptor defizienten Mäusen weisen jedoch auf noch weitere bisher nicht klonierte Rezeptoren hin. Zu den bekanntesten im ZNS selbst synthetisierten und gezielt freigesetzten Liganden für die CB Rezeptoren zählen Arachidonylethanolamin (AEA), 2-Arachidonylglycerin (2-AG) und Palmitylethanolamin (PEA). Deren Mengen steigen z.B. nach einer traumatischen Schädigung deutlich an. Die postulierte Neuroprotektion der EC erfolgt wahrscheinlich über eine Reduktion der glutamatergen Neurotransmission. Darüber hinaus kommt es auch in Mikrogliazellen und Astrozyten zur Cannabinoid induzierten Aktivierung intrazellulärer Signalkaskaden, wodurch Produktion und Freisetzung von proinflammatorischen Substanzen wie TNF-alpha vermindert werden. Im vorliegenden Projekt sollten die den Phytocannabinoiden (THC) und den EC zugewiesenen neuroprotektiven Eigenschaften am Modellsystem der organotypischen hippokampalen Schnittkultur (OHSC) nach einer exzitotoxischen Läsion vergleichend untersucht werden. Dazu wurden OHSC von 8 Tage alten Ratten hergestellt und durch Applikation von N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) exzitotoxisch geschädigt. Exzitotoxische Läsionen zeichnen sich durch einen massiven Neuronenverlust sowie durch die Aktivierung von Mikrogliazellen und Astrozyten aus. Die Anzahl der zerstörten Körnerzellen im Gyrus dentatus (GD) des Hippokampus wurde als Maß für die Bestimmung des neuronalen Schadens angesehen. Weiterhin wurde die Anzahl der aktivierten Mikrogliazellen im Bereich der Körnerzellschicht quantitativ bestimmt. Dann sollte geprüft werden, ob die eingesetzten Cannabinoide die Anzahl aktivierter Mikrogliazellen reduzieren und ob sich eine Reduktion der Mikrogliazellen positiv auf das Überleben der Neurone auswirkt. Ungeschädigte und NMDA geschädigte OHSC wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von THC, AEA, 2-AG oder PEA behandelt. Durch Zugabe von Propidiumiodid (PI) wurden die degenerierten Neurone markiert (PI+-Neurone). Mit Hilfe von FITC-konjugiertem Griffonia simplicifolia Isolektin B4 (IB4+) wurden die Mikrogliazellen dargestellt und die OHSC abschließend mit einem konfokalen Laserscanning Mikroskop analysiert. Es folgten weitere Versuche, bei denen verschiedene synthetische Agonisten/Antagonisten von CB-Rezeptoren verwendet wurden, um die möglicherweise an neuroprotektiven Prozessen beteiligten CB-Rezeptoren zu identifizieren. Um die mögliche Beteiligung des CB1- und -2-Rezeptors zu beleuchten, kamen die Antagonisten AM251 und AM630 zum Einsatz. Die Beteiligung von bisher nur pharmakologisch identifizierten CB-Rezeptoren, wie dem WIN- oder dem abnormalen (abn) Cannabidiol-Rezeptor, wurde mit Hilfe des Agonisten WIN und des Antagonisten Capsazepin für den WIN-Rezeptor, oder, im Falle des abn Cannabidiol Rezeptors, mit Hilfe der Agonisten abn Cannabidiol und 2-AG sowie der Antagonisten O-1918 und Cannabidiol untersucht. In ungeschädigten OHSC waren in der KZS des GD nahezu keine PI+-Neurone und nur sehr wenige IB4+-, ramifizierte Mikrogliazellen nachweisbar. Nach NMDA-Schädigung stieg die Zahl der PI+-Neurone und der IB4+-, amöboiden Mikrogliazellen massiv an. Die aktivierten Mikrogliazellen akkumulierten vorwiegend an Stellen höchster neuronaler Schädigung. Im Vergleich zu ausschließlich mit NMDA-behandelten OHSC verursachte das Phytocannabinoid THC eine konzentrationsabhängige numerische Reduktion der IB4+-Mikrogliazellen. Die Anzahl der PI+-Neurone wurde hingegen nicht beeinflusst. Alle verwendeten Endocannabinoide (AEA, 2-AG, PEA) reduzierten die Anzahl der IB4+-Mikrogliazellen. Darüber hinaus war die Zahl der PI+-Neurone nach Gabe von 2-AG und PEA im Sinne eines neuroprotektiven Effektes deutlich vermindert, wohingegen AEA keine neuroprotektiven Eigenschaften besaß. Die synthetischen CB-Rezeptor-Agonisten WIN und abn Cannabidiol reduzierten die Anzahl der IB4+-Mikrogliazellen und PI+-Neurone ebenfalls deutlich. Der Einsatz der oben beschriebenen Antagonisten ergab, dass die THC-induzierte Reduktion der IB4+-Mikrogliazellen durch den CB2-Rezeptor Antagonisten AM630 aufgehoben wurde, was auf eine Beteiligung des CB2-Rezeptors hindeutet. Die 2-AG-induzierte Reduktion der IB4+-Mikrogliazellen wurde durch die abn-Cannabidiol-Rezeptor-Antagonisten O-1918 und Cannabidiol gehemmt. Der 2-AG vermittelte neuroprotektive Effekt wurde ebenfalls durch O-1918 und Cannabidiol aufgehoben. Beide Antagonisten hoben auch die abn-Cannabidiol-induzierte Reduktion der IB4+-Mikrogliazellen und die abn-Cannabidiol-induzierte Neuroprotektion auf. Die am Modellsystem der OHSC durchgeführten Versuche zeigen deutlich, dass die verwendeten Cannabinoide nach einer exzitotoxischen Schädigung einen unterschiedlichen Einfluss auf die Anzahl aktivierter Mikrogliazellen und die Zahl degenerierender Neurone ausüben. Sie belegen ferner, dass eine Reduktion der Anzahl aktivierter Mikrogliazellen sich nicht per se neuroprotektiv auszuwirken scheint. Daher ist festzustellen, dass ein Zusammenspiel verschiedenartiger CB-Rezeptortypen auf der einen und unterschiedlicher Zelltypen auf der anderen Seite beim Mechanismus der Neuroprotektion stattfindet. In unseren Untersuchungen erwiesen sich THC und AEA als nicht neuroprotektiv, obwohl für beide Substanzen in der Literatur solche Effekte unter In-vivo-Bedingungen beschrieben wurden. Die Diskrepanz zwischen 2-AG und PEA auf der einen Seite und AEA und THC auf der anderen Seite in unserem Modellsystem ließe sich eventuell dadurch erklären, dass in der OHSC keine immunkompetenten Blutzellen vorhanden sind, die möglicherweise ein wichtiges Element im Zusammenspiel verschiedener Zelltypen bei der Neuroprotektion unter In- vivo-Bedingungen darstellen. Um diese Hypothese zu überprüfen, haben wir OHSC mit isolierten Milzmakrophagen inkubiert, um so aus der Blutbahn einwandernde immunkompetente Zellen zu simulieren. Die Ergebnisse dieser Experimente belegen, dass Milzmakrophagen tatsächlich zum Ort höchster neuronaler Schädigung in der OHSC migrieren und bei Anwesenheit dieser Milzkakrophagen sowohl AEA als auch THC neuroprotektiv sind. Schließlich wurde mit primären Kulturen von Mikroglialzellen und Astrozyten untersucht, ob Cannabinoide die Lipopolysaccharid (LPS) induzierte Freisetzung von proinflammatorischen Substanzen beeinflussen. Diesbezüglich wurde die Konzentrationen des Zytokins TNF-alpha im Kulturüberstand mittels ELISA bestimmt. Es zeigte sich, dass die eingesetzten Cannabinoide die Freisetzung von TNF-alpha äußerst differenziert regulieren. Zusammenfassend ist festzustellen, dass in der vorliegenden Arbeit interessante und neue Befunde zur neuroprotektiven Wirkung von Cannabinoiden erhoben wurden. Diese Daten werden sicherlich eine breite Ausgangsbasis für zukünftige Untersuchungen bieten, in denen die weitere Analyse des komplexen Zusammenspiels zwischen verschiedenen CB-Rezeptoren und unterschiedlichen Zelltypen des ZNS bei der Cannabinoid-vermittelten Neuroprotektion erfolgen wird.
Die Funktion biologischer Peptide und Proteine hängt wesentlich von deren intakten molekularen Struktur ab. Krankheiten, wie z.B. Alzheimer oder Diabetes, entstehen durch fehlgefaltete, aggregierte Peptidstrukturen. Die Ausbildung einer nativ gefalteten Konformation wird durch die Formierung von Sekundärstrukturelementen - in charakteristischer Weise angeordnete lokale Strukturen - initiiert und bildet einen geschwindigkeitslimitierenden Schritt in der Proteinfaltung. Die Erforschung und Analyse dieser ersten Faltungsprozesse ist deshalb von grundlegender Relevanz in der biophysikalischen Forschung, auch in Hinblick auf pharmazeutisch-medizinische Anwendungen. Bei der Untersuchung des Faltungsmechanismus kommen vor allem kleine Peptide mit eindeutig ausgebildeten Sekundärstrukturmotiven zum Einsatz. Ihre geringe Größe und strukturelle Eindeutigkeit machen diese kleinen Peptide zu idealen Modellsystemen, um diejenigen Faktoren zu untersuchen, die die Proteinfaltung steuern und beeinflussen. Die zur Untersuchung der Faltungsprozesse verwendeten Techniken müssen dabei sowohl eine Spezifität für die unterschiedlichen Strukturelemente, als auch eine der Faltungsdynamik angemessen Zeitauflösung besitzen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden CD- und FTIR-Messungen zur Untersuchung der Strukturstabilität von Polypeptiden unter Gleichgewichtsbedingungen durchgeführt. Durch Variation von pH-Wert und Temperatur wurden damit Stabilitätseigenschaften ausgewählter Peptidsysteme analysiert. Um zeitaufgelöste Faltungsdynamiken von Peptiden detektieren zu können, wurde ein Spektrometer mit Laser-induziertem Temperatursprung (DeltaT ca. 10 °C in 10 ns) und IR-Einzelwellendetektion so modifiziert und optimiert, dass Peptiddynamiken im nanosec bis microsec Zeitbereich gemessen werden konnten. Neben der Modifikation der Temperatursprung-Apparatur, bei der optische Komponenten ersetzt und Störsignale reduziert wurden, konnte auch die Auswertung der kinetischen Daten durch die Entwicklung eines geeigneten Algorithmus verbessert werden. Als notwendige Vorarbeit der Faltungsstudien an Peptiden in wässriger Lösung wurden statische FTIR-Absorptionsmessungen am Lösungsmittel D2O durchgeführt. Dadurch wurden die durch Temperaturvariation erzeugten Absorptionsänderungen des Lösungsmittels ermittelt. Diese wurden zudem zur Kalibrierung des Laser-induzierten Temperatursprunges verwendet. Um Lösungsmittelabsorptionen von strukturellen Änderungen des Peptids zu trennen, wurde ein Auswerteverfahren entwickelt, das die temperaturabhängigen Absorptionsänderungen des Lösungsmittels berücksichtigt. Temperatur- und pH-abhängige Konformationsdynamik wurde am alpha-helikalen Peptid Polyglutaminsäure untersucht. Zunächst wurden CD- und FTIR-Messungen zur Thermostabilität und der Reversibilität der Ent- und Rückfaltung unter Gleichgewichtsbedingungen und bei unterschiedlichen pH-Werten durchgeführt. Der thermisch induzierte Strukturübergang von alpha-Helix nach ungeordneter Knäuel-Struktur wurde mit Hilfe der Laser-induzierten Temperatursprung-Technik zeitaufgelöst untersucht und Relaxationsraten bei verschiedenen pH-Werten bestimmt. Weitere Messungen zur Konformationsstabilität und –dynamik wurden an beta- Hairpin-Peptiden durchgeführt, die kleine Modellsysteme für beta-Faltblattstrukturen darstellen. Die in dieser Arbeit untersuchten Trpzip2C Peptide, die aufgrund hydrophober Wechselwirkungen der Tryptophane eine stabile beta-Hairpin-Struktur in wässriger Lösung ausbilden, waren an verschiedenen Positionen innerhalb der Aminosäure-sequenz selektiv isotopenmarkiert. Durch diese Markierungen im Peptidrückgrat werden spezifisch spektrale Änderungen im Infrarotspektrum erzeugt, die Untersuchungen zur Amidbandenkopplung und lokalisierten Strukturdynamik ermöglichen. Diese Ergebnisse stellen die erste Anwendung der Kombination von selektiv isotopenmarkierten alpha-Hairpin-Peptiden und der Temperatursprung-Technik dar, um Konformationsdynamiken ortsaufgelöst zu untersuchen. Für alle untersuchten Trpzip2C-Peptidvarianten konnte gezeigt werden, dass der Faltungsprozess in einem Temperaturbereich unterhalb von ~ 300 K nicht durch ein Zwei-Zustandsmodell beschrieben werden kann, sondern Intermediate gebildet werden. In diesem Temperaturbereich konnten wellenlängenabhängig Unterschiede in Relaxationsraten gemessen werden, die die Hypothese des „hydrophoben Kollaps“ für den Faltungsmechanismus dieser beta-Hairpin-Peptide unterstützen.
Ziel dieser Arbeit war die Evaluation eines 13C-Atemtests zur Beurteilung der hepatischen mitochondrialen Beta-Oxidation, der z.B. in Diagnostik und Therapiekontrolle der NASH zum Einsatz kommen könnte. Octanoat ist eine mittelkettige Fettsäure (8C), die im Dünndarm schnell resorbiert wird und über den portalvenösen Kreislauf in die Leber gelangt. Bisher wird Octanoat vor allem zur Beurteilung der Magenentleerung fester Speisen eingesetzt. Für diesen Atemtest wird die Fettsäure in Verbindung mit einer standardisierten Testmahlzeit verabreicht. Wir führten den Atemtest in vereinfachter Form mit 100mg 13C-Natrium-Octanoat, gelöst in 200ml Wasser, durch. So wurde die Magenentleerungszeit vernachlässigbar kurz und die Beta-Oxidation des Octanoats zum geschwindigkeitsbestimmenden Schritt des Tests. Zunächst analysierten wir retrospektiv die cPDR von 69 Patienten, die den Magenentleerungsatemtest erhalten hatten. Die Analyse zeigte bei 27/69 Patienten (p = 0,055) mit verlängerter Magenentleerungshalbwertszeit sowie in der Gesamtgruppe aller 69 Patienten (p = 0,054) eine leicht erhöhte cPDR bei Frauen im Vergleich zu Männern. Dies gab uns erste Hinweise auf geschlechtsspezifische Unterschiede im Octanoatmetabolismus. Anschließend führten wir den vereinfachten Octanoatatemtest bei 39 erwachsenen Kontrollen (20m, 19w), 10 Kindern (5m, 5w), 26 NAFLD bzw. NASH-Patienten (15m, 11w) und 12 Leberzirrhosepatienten (8m, 4w) durch. Die Atemproben wurden mittels nichtdispersiver Infrarotspektrometrie hinsichtlich PDR und cPDR analysiert. Bei 40 von 77 Kontrollen/Patienten erfolgten zusätzliche eine BIA und eine indirekte Kalorimetrie. Es zeigten sich zu keinem Zeitpunkt signifikante Differenzen zwischen PDR bzw. cPDR der einzelnen Gruppen. Die PDR erreichte in allen Gruppen ihren Höhepunkt nach durchschnittlich 30 Minuten. Im Vergleich der geschlechtsspezifischen Subgruppen erreichten Frauen signifikant höhere cPDR-Werte nach 180 Minuten sowohl in der Kontrollgruppe (38,7 ± 2,8 vs. 29,2 ± 5,7%; p < 0,0001), in der Kindergruppe (32,5 ± 5,2 vs. 26,1 ± 2,2%; p = 0,008) als auch in der NAFLD/NASH-Gruppe (37,0 ± 6,0 vs. 32,1 ± 5,2%; p = 0,046). In der Leberzirrhosegruppe erzielten die Männer höhere cPDR-Werte als die Frauen (33,1 ± 9,7 vs. 38,2 ± 6,2%, p = 0,28) und damit die signifikant höchste cPDR aller Männer. Beim Vergleich der Ergebnisse von BIA und indirekter Kalorimetrie ergaben sich keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf Körperzusammensetzung und Ruheenergieumsatz der verschiedenen Gruppen. Der Höhepunkt der PDR nach durchschnittlich 30 Minuten in allen Gruppen zeigte, dass die Oxidation des Octanoats den geschwindigkeitsbestimmenden Faktor des Atemtests darstellt und er somit zuverlässig die mitochondriale Beta-Oxidation auf Gesamtkörperniveau misst. Die Analyse der cPDR bestätigte eine deutliche Geschlechtsspezifität im Octanoatmetabolismus. Der Nachweis einer höheren cPDR auch bei Mädchen vor der Gonadarche im Vergleich zu Jungen gleichen Alters deutet auf eine frühe Determinierung der geschlechtsspezifischen Unterschiede hin. Die Geschlechtsabhängigkeit des MCFA-Metabolismus sollte in Zukunft sowohl in Studien mit MCFA als auch bei deren pharmakologischer und diätetischer Anwendung Beachtung finden. Die gesteigerte Beta-Oxidation, die in der Pathogenese der NASH eine entscheidende Rolle spielt, nahm keinen Einfluss auf den Octanoatmetabolismus. Der bei männlichen Leberzirrhosepatienten gesteigerte Octanoatstoffwechsel wies daraufhin, dass das Octanoat über portosystemische Shunts schneller zu den Hauptorten seiner Metabolisierung gelangt. Die Resultate von fünf zusätzlich untersuchten TIPS-Patienten, die cPDR-Werte bis zu 51,3% erreichten, unterstützten diese Annahme. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass Octanoat nach oraler Applikation hauptsächlich extrahepatisch und kaum in der Leber oxidiert wird. Daher ist der Octanoatatemtest nicht zum Einsatz in der Leberfunktionsdiagnostik geeignet.
Die Ausgangsfrage lautete: Warum konnte sich die berufliche Pflege trotz einer Stärkung und Aufwertung, die in der Akademisierung und beginnenden Verwissenschaftlichung, aber auch in einer die Pflege stärkenden Gesetzgebung zum Ausdruck kamen, noch immer nicht als eigenständiger Beruf oder gar als Profession etablieren? Bei der Beantwortung dieser Frage bin ich von der Annahme ausgegangen, dass Gründe für den Misserfolg auch im Diskurs zur Etablierung der Pflege an den Hochschulen zu suchen waren, der doch versuchte, die Grundlagen für die Emanzipation zu schaffen. In der Feinanalyse einer Reihe von charakteristischen Beiträgen im Diskurs habe ich gezeigt, wie sich bestimmte Strategien der Anpassung aneinander und auch an andere übergeordnete Diskurse durchgesetzt haben. Diese Orientierung beinhaltete neben einer Distanzierung von den Interessen der Mehrheit der Berufsangehörigen auch die immer deutlichere Tendenz, den Professionsstatus nicht mehr für alle einzufordern, sondern unterschiedliche Professionalisierungen für die verschiedenen Berufsgruppen zu legitimieren. Damit wurde der Forderung nach einer Autonomie des Berufs, also der Selbstbestimmung der beruflichen Aus- und Weiterbildung, der Unabhängigkeit pflegerischer Interventionen von der ärztlichen Weisung, der Zusammenfassung aller Berufsangehörigen in einer die beruflichen Interessen vertretenden Organisation, jegliche Grundlage entzogen. Somit erklärt sich auch, warum das Professionalisierungsprojekt, das mit Hilfe von Akademisierung und Verwissenschaftlichung vorangetrieben werden sollte, bis heute nur wenig Resonanz bei den beruflich Pflegenden findet – eine Resonanz und Unterstützung, derer sich die DiskursteilnehmerInnen zu Beginn ihrer Debatte noch vergewissern wollten, die sie dann aber aus den Augen verloren haben, obwohl sie für die Realisierung der Forderungen notwendig gewesen wäre. ...
Angesichts der Bedeutung, die Brustkrebs sowohl in der Medizin als auch im gesellschaftlichen Bewusstsein besitzt, wird es zunehmend wichtiger, ein verstärktes Augenmerk auf die Möglichkeiten und Grenzen entsprechender Vorsorge- und Früherkennungsmaßnahmen zu legen. Seit Mitte der 90er Jahre hat sich das Spektrum der Brustkrebsdiagnostik um die Möglichkeit der genetischen Testung von Risikopatienten erweitert. Der hier angesprochene BRCA-Gentest für erblichen Brust- und Eierstockkrebs zählt zu den prädiktiv-probabilistischen Gentests mit geringer Aussagekraft bezüglich der Vorhersage einer möglichen Krebserkrankung. Weder der genaue Zeitpunkt eines Krankheitsausbruchs, noch die Schwere einer möglichen Erkrankung können genau vorhergesagt werden. Auch ein negatives Testergebnis gibt keinerlei Gewissheit darüber, dass Brust- oder Eierstockkrebs nicht doch im Rahmen des durchschnittlichen Risikos von ca. 8% bei den Getesteten entstehen kann. Es besteht die Gefahr, dass das negative Testergebnis zu einer Unterschätzung dieses durchschnittlichen Risikos führt und entsprechende präventive Maßnahmen nicht ausreichend wahrgenommen werden. Ein positives Testergebnis kann zu Einschränkungen in der Lebensführung und in der weiteren Lebens- und Familienplanung führen. Des Weiteren können prophylaktische Maßnahmen, wie Mastektomie oder Ovarektomie, ergriffen werden, die der Situation möglicherweise nicht angemessen sind und einen fraglichen Nutzen besitzen. Im Zuge der Möglichkeiten einer genetischen Testung ist es zu einer Veränderung bzw. zu einer Erweiterung des Krankheitsbegriffs in der Medizin gekommen. Dabei sei angemerkt, dass die meisten Personen, die eine prädiktive Medizin in Anspruch nehmen, zumeist primär nicht krank sind, sondern eine Aufklärung über eine mögliche genetische Disposition haben möchten. Prädiktive Gentests, die im Falle einer Verdachtsdiagnose in präventive und prophylaktische Maßnahmen münden, setzen zum einen den Noch-Nicht-Kranken einem Behandlungsrisiko aus und machen zum anderen einen bestimmten Anteil an positiv Getesteten zu Patienten, obwohl diese die Erkrankung erst spät oder nie bekommen würden. Besteht bei der Erweiterung des Krankheitsbegriffs nicht die Gefahr der sozialen Diskriminierung von Gesunden mit genetischer Disposition? Ist das System der genetischen Testung für jeden Einzelnen frei zugänglich, und wie lassen sich die zusätzlichen Kosten rechtfertigen? Der Gentest auf erblichen Brust- und Eierstockkrebs ist eingebunden in eine interdisziplinäre Zusammenarbeit aus Gynäkologen, Humangenetikern, Onkologen, Psychoonkologen, Pathologen, Radiologen und Hausärzten. Die Autoren Günter Feuerstein und Regine Kollek kommen jedoch zu dem Schluss, dass auch eine qualifizierte genetische Beratung nicht in der Lage sei, alle Unsicherheiten auszuräumen, die sowohl mit den naturwissenschaftlich-genetischen Risikoaussagen als auch mit deren individuellen Wahrnehmung und Bewertung verbunden sind. Sie stellen sich die Frage, was ein „informed consent“ vor diesem Hintergrund komplexer genetischer Sachlagen und der gegenüber vielfältigen Einflüssen und Faktoren anfälligen Vermittlung probabilistischer Risikoinformationen bedeuten könne. Es stellt sich die Frage, wie es um das Recht auf Nichtwissen und die Freiwilligkeit der Inanspruchnahme von Gentests bestellt ist, wenn eine entsprechende gesundheitliche Verantwortung des Einzelnen gesellschaftlich eingefordert wird und wie viel Verantwortung eine Gesellschaft für den Einzelnen übernehmen kann. Vor diesem Hintergrund erscheint es daher umso wichtiger, einen Wirksamkeitsnachweis der präventiven Maßnahmen und der prophylaktischen Eingriffe zu erbringen. Mehrere Studien haben die Wirksamkeit prophylaktischer Eingriffe in Bezug auf erblichen Brust- und Eierstockkrebs untersucht und kamen zu einer Risikoreduktion für Brustkrebs bei einer prophylaktischen Mastektomie von bis zu 97% und zu einer Risikoreduktion für Eierstockkrebs bei einer prophylaktischen Ovarektomie von bis zu 50%. Ein unbestimmtes Restrisiko bleibt bei jeder Form des prophylaktischen Eingriffs bestehen. Mit entscheidend ist dabei einerseits das subjektive Körpergefühl der betroffenen Frau und andererseits der kulturelle Hintergrund, wie ein Vergleich zwischen Frankreich, Niederlande, England, Kanada, den USA und Deutschland zeigt. Studien und Erfahrungsberichte haben gezeigt, dass individuell auf die Wünsche der Patientinnen eingegangen wird, sie werden in ihren eigenen Vorstellungen bezüglich Körperbild und Vorsorgemaßnahmen respektiert, und besitzen eine aktive Rolle in der Kontrolle ihrer Behandlung. Daher sind sowohl die medizinischen Fachkräfte als auch die Betroffenen aufgefordert, entsprechende Vorsorge- und Früherkennungsmaßnahmen, insbesondere genetische Testverfahren, gemeinsam weiter zu entwickeln, aber auch kritisch zu hinterfragen, um gleichermaßen das Verantwortungsbewusstsein und den Aufklärungsbedarf unter Beachtung individueller Gegebenheiten zu stärken.
Am Zentrum der Dermatologie und Venerologie des Klinikums der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt haben 40 Patienten mit fortgeschrittenem metastasiertem malignem Melanom im Zeitraum von Januar 1996 bis Juni 2003 eine Chemotherapie mit dem liquorgängigen Nitrosoharnstoff Fotemustin erhalten. Sie alle hatten einen Progress unter einer oder zwei vorausgegangenen Chemotherapien erlitten, 30 Patienten erhielten Fotemustin als second-line und zehn Patienten als third-line Therapie. In einer retrospektiven Analyse der Patientenakten unter Zuhilfenahme von Auskünften von behandelnden Hausärzten und Meldeämtern wurde die Wirksamkeit und Verträglichkeit der Fotemustintherapie untersucht. In die Auswertung wurden 27 Männer und 13 Frauen aufgenommen. Der Altersmedian lag bei 58,6 Jahren. Die Überlebenszeiten der Patienten wurden ab Beginn der Fotemustintherapie berechnet; von besonderem Interesse war neben dem Gesamtüberleben das mediane Überleben von Untergruppen. Ansprechraten und Nebenwirkungen der Therapie wurden nach den Kriterien der WHO beurteilt. Kein Patient zeigte ein Ansprechen im Sinne einer partiellen oder kompletten Remission. Bei sechs Patienten konnte jedoch eine stabile Erkrankung mit einer Dauer zwischen drei und acht Monaten festgestellt werden. Das mediane Überleben dieser Patienten, die alle zu Beginn der Therapie als prognostisch günstigen Faktor einen Karnofsky-Index von 100% aufwiesen, lag bei 260 Tagen. Die mediane Überlebenszeit aller 40 Patienten dagegen betrug 107 Tage. Patienten, die bereits zu Beginn der Behandlung in einem schlechten Allgemeinzustand waren (Karnofsky Index < 90%) schienen eher nicht von einer Behandlung zu profitieren. Auch bei dem Kollektiv der Patienten mit Hirnmetastasen (n=13) lag die mediane Überlebenszeit mit 177 Tagen über der des Gesamtkollektivs. Möglicherweise profitierten diese Patienten von zusätzlichen Behandlungsmodalitäten wie Operation oder Bestrahlung von zerebralen Metastasen. Zudem waren die Patienten insgesamt weniger vortherapiert, zwölf von 13 erhielten Fotemustin als second-line Therapie. Insgesamt sind jedoch die kleinen Patientenzahlen bei der Interpretation dieser Daten zu berücksichtigen. Die subjektiven Nebenwirkungen der Fotemustintherapie waren gering. Thrombozytopenien vom Grad III und IV traten bei 17,5%, Leukozytopenien bei 10% des Kollektivs auf. Toxizitätsbedingte Therapieabbrüche kamen nicht vor. Die Behandlung mit Fotemustin stellt für Patienten mit fortgeschrittenem malignem Melanom eine gut verträgliche Behandlungsoption mit mäßiger Wirksamkeit dar. Obwohl im untersuchten Kollektiv keine objektiven Remissionen erzielt werden konnten, scheinen einige Patienten von dieser Therapie zu profitieren. So konnte bei einigen Patienten eine Stabilisierung der Erkrankung erzielt werden und eine längere Gesamtüberlebenszeit festgestellt werden. Der Allgemeinzustand bei Therapiebeginn zeigte sich in Übereinstimmung mit der Literatur als ein wichtiger prognostischer Faktor. Er ist damit insbesondere nach Versagen der First-line Therapie bei der Indikationsstellung einer weiteren Chemotherapie bei Patienten mit fortgeschrittenem Melanom zu berücksichtigen. Bei Patienten mit zerebraler Metastasierung scheint eine Therapie mit Fotemustin direkt bei Auftreten von Hirnmetastasen und/oder direkt nach Versagen der ersten Chemotherapie sinnvoll. Die derzeit übliche Kombinationstherapie aus liquorgängigem Zytostatikum, einer stereotaktischen Bestrahlung oder einer Operation und/oder einer Ganzhirnbestrahlung ist auch nach eigener Analyse als günstig zu werten. Nach Versagen von zwei verschiedenen Chemotherapien ist der Wert einer weiteren zytostatischen Therapie, also einer third-line Therapie, insgesamt kritisch zu bewerten. Zu diesem Zeitpunkt befinden sich die Patienten zum einen in der Regel in einem reduzierten Allgemeinzustand mit einer weit fortgeschrittenen Tumorerkrankung, zum anderen besteht aufgrund der ohnehin geringen Chemosensitivität des Melanoms wenig Hoffnung auf eine Beeinflussung des weiteren Krankheitsverlaufs in diesem Stadium. Bei diesen Patienten steht die Behandlung von krankheitsassoziierten Symptomen im Rahmen einer umfassenden palliativen Versorgung im Vordergrund.
Für die Analyse klimagesteuerter terrestrischer und mariner Ökosystemdynamik im Spätglazial und Holozän des Ägäisraums wurden terrestrische (Pollen und Sporen) und marine Palynomorphe (organischwandige Dinoflagellatenzysten) aus einem marinen Kern des Berg-Athos-Beckens hochauflösend (d.h. in einer zeitlichen Auflösung zwischen ~30 und ~200 Jahren) untersucht. Darüber hinaus wurden Pollen und Sporen eines terrestrischen Kerns aus dem Drama-Becken (nördliches Hinterland der Ägäis) analysiert. Neben der qualitativen Analyse wurden mit Hilfe der Technik der modernen Analoge quantitative Rekonstruktionen der Paläotemperaturen und -niederschläge im terrestrischen Raum vorgenommen. Für den marinen Kern wurden außerdem Sedimenthelligkeit, Sauerstoffisotopie und magnetische Suszeptibilität untersucht. Über die Entwicklung eines konsistenten Altersmodells für beide Kerne konnten Aussagen über eine regionale, klimagesteuerte Differenzierung zwischen der Vegetationsentwicklung im Küstenbereich und der Vegetationsentwicklung in intramontanen Ökosystemen getroffen werden. Während des Pleniglazials (~21 ka bis ~14,7 ka BP) herrschten im nördlichen Ägäisraum kühle und vor allem trockene Bedingungen vor. Offen liegende Schelfflächen wurden von einer Pinus-dominierten Vegetation besiedelt, bis der Schelf während des anschließenden Meiendorf-Bølling-Allerød-Interstadialkomplexes (~14,7 ka bis ~12,7 ka BP) durch den Schmelzwasserpuls MWP-1A überflutet wurde. Während des Meiendorf-Bølling-Allerød-Interstadialkomplexes herrschten im nördlichen Ägäisraum etwas humidere Bedingungen als während des Pleniglazials. In der anschließenden Jüngeren Dryas (~12,7 ka bis ~11,7 ka BP) war das Klima hingegen mindestens ebenso arid und die Oberflächenwassertemperaturen in der Nordägäis fast ebenso gering wie während des Pleniglazials. Das lokale Klima im Drama Becken war von ~21 ka BP bis zum Ende der Jüngeren Dryas generell trockener als die allgemeinen Klimabedingungen im nördlichen Ägäisraum. Die Vegetationsentwicklung im nördlichen Ägäisraum wurde während des Spätquartärs vor allem durch die zur Verfügung stehende Feuchtigkeit gesteuert. Auch nach der Jüngeren Dryas war die Humidität im Ägäisraum zu gering, um eine Wiederbewaldung zu ermöglichen, wie sie in Mitteleuropa und dem westlichen Mittelmeergebiet bereits ab ~11,6 ka BP stattfand. Ein Vegetationsrückschlag um ~11,0 ka BP korreliert mit der aus Mitteleuropa bekannten präborealen Oszillation bzw. dem 11,2-ka-Klimaereignis. Die holozäne Wiederbewaldung setzte im östlichen Ägäisraum erst ab 10,2 ka BP ein; sie wurde durch einen sukzessiven Anstieg der Winterniederschläge von ~225 auf über ~300 mm/Jahr ermöglicht. Sowohl dieser Anstieg der Winterniederschläge als auch ihr Rückgang nach 7,0 ka BP sind eng mit der Ablagerung des Sapropels S1 (zwischen ~9,6 ka und ~7,0 ka BP) verknüpft. Die relativ humiden und milden Winterbedingungen während der Ablagerung des S1 wurden von durch Vegetationsrückschläge dokumentierten, kurzfristigen Klimaereignissen bei ~9,3 ka, ~8,7 ka, ~8,2 ka und ~7,6 ka BP unterbrochen. Diese kurzfristigen Klimaereignisse gehen mit Unterbrechungen bzw. Abschwächungen der S1-Bildung einher. Besonders ausgeprägt ist der regionale Ausdruck des 8,2-ka-Ereignisses, welches für die am stärksten ausgeprägte und auch aus anderen Bereichen des östlichen Mittelmeers überlieferte Unterbrechung des S1 zwischen ~8,4 ka und ~8,0 ka verantwortlich zeichnet. Während der Bildung des S1 wurde die Klimaentwicklung im Ägäisraum generell weniger vom Klimasystem der hohen Breiten beeinflusst als vielmehr vom Monsunsystem der niederen Breiten. Allerdings war die Intensität des Sibirischen Hochs während des frühen Holozäns und nach dem S1-Intervall ein wichtiger Faktor für das Winterklima. Auch während des Holozäns wurden Klimaschwankungen im Drama-Becken deutlicher von der lokalen Vegetation reflektiert als von der Vegetation des nördlichen Ägäisraums im Allgemeinen. So wirkte sich z.B. das 8,2-ka-Ereignis sehr stark auf die Vegetationsentwicklung im Drama Becken aus; es verursachte einen Rückgang der Sommer- und Wintertemperaturen um mehr als 3° C. Dieser starke Temperatureinbruch ist auf lokale mesoklimatische Effekte zurückzuführen. Die Vegetation in den Randbereichen der Ägäis erfuhr weitere Rückschläge bei ~6,5 ka, ~5,6 ka und ~4,3 ka BP. Die Einbrüche bei ~5,6 ka und ~4,3 ka BP sind mit rapiden Klimaänderungen in großen Teilen der Nordhemisphäre korrelierbar, die ebenso wie die Jüngere Dryas und das 8,2-ka-Klimaereignis Einfluss auf Hochkulturen in Nordostafrika und im Mittleren Osten hatten. Die aus dem Holozän überlieferten Klimadaten machen deutlich, dass dieser Zeitraum von einer weitaus stärkeren Klimavariabilität geprägt wurde als noch bis vor kurzem angenommen.
The experiments presented in my thesis were performed to resolve the following major questions: i. Initial experiments are based on the systematic characterization of the C-terminal domains of all 21 HSFs of Arabidopsis with respect to their transactivation potential as well as intracellular localization. This led to the identification of a signature motif for class A HSFs, that consists of an AHA motif (essential for activator potential), and a C-treminal NES (nuclear export signal). With this signature motif, we could identify homologues sequences of more than 90 HSFs in various plant species. ii. Analysis of developmental expression profiles of HSFs using AtGenExpress microarray data led to the identification of the unique expression of HsfA9 during late seed developmental stages. This was the starting point for the investigation of the regulation of HsfA9 as well as its function during seed development. iii. The seed specific transcription factor ABI3 was identified to be responsible for the regulation of HsfA9 by using knock out mutant lines and ectopically expressing transgenic lines for ABI3 gene. Furthermore, the importance of a RY/Sph motif, as binding site for ABI3 on HsfA9 promoter has been analyzed with transient GUS reporter assays. In addition, contribution of component(s) of ABA (abscisic acid) signaling cascade as a functional interacting partner of ABI3 on HsfA9 promoter has been shown and discussed. iv. The essential role of HsfA9 as master regulator for the expression of seed specific members of of HSP encoding genes and GolS1 was shown by analyzing transgenic plants ectopically expressing HsfA9 as well as, by carrying out transient GUS reporter assays. Correlating with this, transgenic plants with ectopic expression of HsfA9 showed a thermotolerent phenotype. Furthermore, a model where HsfA9 plays a key function for the regulation of seed expressed genes which might involved in providing dessication tolerance during seed maturation has been proposed.
Einführung/Zielsetzung: Die sekundäre Peritonitis stellt nach wie vor ein kompliziertes Krankheitsbild dar, das mit einer Letalität zwischen 20% und 40% einhergeht. Untersuchungen haben gezeigt, dass die Prognose eines Patienten mit einer sekundären Peritonitis von einer adäquaten systemischen und lokalen Immunantwort abhängt. Eine inadäquate Immunantwort kann durch das Auftreten einer Hyperinflammation oder aber einer Immunparalyse charakterisiert sein. Sie trägt erheblich zu den Komplikationen einer sekundären Peritonitis wie zum Beispiel septischer Schock, Multiorganversagen oder Abszessbildung bei. Diese Arbeit wurde durchgeführt, um ein besseres Verständnis über die Rolle der polymorphnukleären Leukozyten (PMNL) in der Peritonitis zu erlangen. Daher konzentrierte sich diese Studie auf die Untersuchung der Phagozytose, der Expression von Fc-Rezeptoren, Komplement-Rezeptoren und Rezeptoren, die an Adhäsionsvorgängen beteiligt sind, bei zirkulierenden und intraabdomiell emigrierten PMNL (zPMNL, ePMNL). Methodik: In der vorliegenden Arbeit wurden Funktionen (Phagozytose, respiratorischer Burst), Stimulierbarkeit sowie die Expression funktionsassoziierter Oberflächenrezeptoren (CD14, CD16, CD18, CD32, CD35, CD54, CD62L, CD64) zirkulierender und intraabdominell emigrierter PMNL mittels FACS-Analyse charakterisiert. Zirkulierende und emigrierte PMNL (zPMNL, ePMNL) wurden von Patienten mit einer diffusen sekundären Peritonitis (n=18) intra- und bis 96 Stunden postoperativ untersucht. Die Kontrollgruppe bestand aus abdominalchirurgisch operierten Patienten ohne Peritonitis (n=8). Um den Einfluss von Anästhesie und abdomineller Operation zu ermitteln, untersuchten wir diese Parameter auch an zirkulierenden PMNL gesunder Probanden (n=9). Ergebnisse: Nach intraabdomineller Emigration wiesen die PMNL deutliche phänotypische Veränderungen im Vergleich zu zPMNL auf. Die Expression des CD62L war bei ePMNL nicht mehr nachweisbar, die Expression des b2-Integrins (CD18) hingegen um ein Mehrfaches erhöht. Die Expression des CD54-Moleküls stieg nur auf ePMNL von Patienten mit Peritonitis in einem nennenswerten Umfang an. Ferner konnte nachgewiesen werden, dass nach intraabdomineller Emigration der Anteil phagozytierender PMNL drastisch reduziert war im Vergleich zu zirkulierenden PMNL, und dass der Anteil phagozytierender ePMNL bei Patienten mit einer sekundären diffusen Peritonitis noch tiefer supprimiert war. Bei Patienten mit Peritonitis und zusätzlichen Komplikationen kam es zu einer noch weiterreichenden Depression der Phagozytose der ePMNL. Die rezeptorabhängige bzw. die rezeptorunabhängige Stimulierbarkeit der CD16- bzw. CD18-Expression bei ePMNL war im Vergleich zu zPMNL herabgesetzt. Die Untersuchungen wurden durch die Bestimmung pround antiinflammatorischer humoraler Mediatoren (IL-8, IL-10, TNF-a, Endotoxin) im Plasma und im Peritonealsekret komplementiert und mit den Ergebnissen der zellulären Untersuchungen korreliert. Es zeigten sich erhöhte TNF-a-Konzentrationen in der Bauchhöhle im Vergleich zu dem Kontrollkollektiv, für IL-10 konnten nur intraoperativ erhöhte Werte gemessen werden. Diskussion: Nicht bei jeder Peritonitis scheint ein Bedarf für eine immunmodulierende Therapie zu bestehen. Patienten mit komplizierter Peritonitis könnten von einer Modulation der PMNL profitieren, wenn diese Therapie in der Lage wäre, überschießend aktivierte zirkulierende PMNL herunterzuregulieren und die supprimierten Funktionen der emigrierten PMNL zu verbessern.
Deferred imitations assess declarative memory in infants. Many cross-sectional and a few longitudinal studies revealed that, with development, infants learn faster,and retain more target actions over longer retention intervals. Longitudinal stabilities are modest and increase through the second year. To date, there are only few multivariate deferred imitation studies pointing to interactions between declarative memory, language and self-development. However, as these studies applied variable-centered data analysis approaches, the individual stance was not taken into account.Therefore, the present dissertation focuses on the explanation of inter-individual differences of deferred imitation through the second year. In the multivariate, longitudinal Frankfurt Memory Study (FRAMES), declarative memory (deferred imitation), non-declarative memory (train task), as well as cognitive, language, motor, social, emotional and body self-awareness development (Developmental Test for 6-month- to 6-year-olds, ET6-6) were assessed on three measurement occasions (12-, 18- and 24-month-olds). From a psychometric perspective, sound tests for the assessment of deferred imitation in the respective age groups were developed (Paper 1 & 2). Reliability analyses (Paper 3) indicated relatively high short-term-stability for the deferred imitation test (12-month-olds). The co-development of declarative and nondeclarative memory in 12- and 18-month-olds provided evidence for discriminative validity (Paper 4). Longitudinally, deferred imitation performance tremendously increased throughout the second year, and performance was moderately stable between 12 and 18 months and stability increased between 18 and 24 months. Using a person-centered analysis approach (relative difference scores; cluster analysis), developmental subgroups were extracted out of the total sample. These groups differed in terms of mean growth and stability. However, between the first and second measurement occasion, the groups did not differ with respect to motor, cognitive and language development (Paper 5). Using the data of three measurement occasions, subgroups were extracted showing significant differences with respect to language, motor and body self-awareness development (Paper 6). The results are discussed against the background of infancy development theories.
Osteochondrosis dissecans des Kniegelenkes: röntgenologische und kernspintomographische Studie
(2007)
Erkennbar wird die Operationsmethode der Wahl vom festgestellten Stadium der Erkrankung bei der ersten Untersuchung der Patienten bestimmt. Bei denjenigen Patienten, die über Schmerzen im Kniegelenk ohne Traumaanamnese klagen, steht meistens nach der klinischen Untersuchung die Röntgendiagnostik an erster Stelle. Die dabei festgestellten Röntgenstadien der OD bestimmen das weitere Vorgehen. Liegt in den angefertigten Röntgenaufnahmen das Röntgenstadium 1 vor, so kann durchaus eine konservative Behandlung oder schlichtes Abwarten angebracht sein. Auch beim Stadium 2 können diese therapeutischen Ansätze in Betracht gezogen werden, im Zweifelsfall sollte jedoch eine weitere Diagnostik – wie MRT oder eine Arthroskopie – zur Abklärung herangezogen werden. Stellt sich dabei der begründete Verdacht einer Knorpelerweichung, so ist eine diagnostische Arthroskopie angezeigt, bei der u.U. schon weitere operative Maßnahmen – wie etwa eine retrograde Stanzung – ergriffen werden können. Im Röntgenstadium 3 ist eine Arthroskopie zu empfehlen. Ab diesem Stadium ist eine weitere MRT-Untersuchung im allgemeinen überflüssig, da im weiteren ohnehin meistens operative Verfahren zur Anwendung kommen werden. Stellt sich dabei in der Arthroskopie die Knorpeloberfläche zwar als erweicht, jedoch vollständig intakt dar, so bietet sich eine retrograde Stanzung als Therapie an. In diesem Erkrankungsstadium kann aber auch immer noch die konservativ abwartende Vorgehensweise mit regelmäßigen Kontrolluntersuchungen in Betracht gezogen werden. Läßt sich allerdings bereits der Knorpel abheben, so sollte er refixiert werden. Hier bietet sich das Verfahren mit resorbierbaren Pins (z.B. Ethipin) an. Auch durch PRIDIE-Bohrungen kann vor der Refixation versucht werden, die Sklerosezone zu durchbrechen, damit das refixierte Dissekat besser einwachsen kann. Ab dem Röntgen-Stadium 4 ist eine Arthroskopie praktisch nicht vermeidbar. Meistens besteht dann nämlich ein ausgeprägter Knorpeldefekt, der eine operative Therapie nach sich ziehen sollte. Ein nur teilweise gelöster OD-Herd sollte nach Möglichkeit refixiert werden, um die Kongruenz der Gelenkflächen wiederherzustellen. Im Stadium 5 ist die Refixierung die Methode der Wahl. Dieses Verfahren sollte zusätzlich durch eine weitere operative Maßnahme – wie Stanzung oder PRIDIE-Bohrungen – flankiert werden. Eine Stanzung kann ggf. sowohl retrograd als auch von anterograd durchgeführt werden. Beim Vorliegen des Röntgenstadiums 6 – dem Stadium eines freien Gelenkkörpers–, wird in den meisten Fällen auch intraoperativ ein freier Gelenkkörper festgestellt, der häufig jedoch so degeneriert und malazisch ist, daß er für eine Refixation nicht mehr in Frage kommt. In diesem Fall sollten alternative Verfahren – z.B. die Knorpel-Knochen-Transplantation wie DBCS (Diamond Bone Cutting System) oder OATS (Osteochondrale Autologes Transplantations System)– in Erwägung gezogen werden, da die bloße Entfernung des OD-Herdes in aller Regel eine vorzeitige Arthrose nach sich zieht. Da die Röntgenaufnahme nur freie Gelenkkörper mit subchondralem Anteil zeigt, häufig aber auch noch knorpelige freie Gelenkkörper vorliegen, sollten diese ggf. möglichst wieder refixiert werden. Die MRT-Diagnostik ist für die Beurteilung des Erkrankungsgrades einer OD mit Sicherheit ein vorzüglich geeignetes Instrument, das zumindest in Zweifelsfällen und bei röntgenologischen Anfangsstadien zur Abklärung herangezogen werden sollte.
Chlamydomonas reinhardtii ist eines der bekanntesten Modellsysteme der Forschung, um photo-, zell- und molekularbiologische Fragestellungen zu untersuchen. Die phototaktischen Reaktionen dieser einzelligen Grünalge werden durch mikrobielle Rhodopsine, sogenannte Photorezeptoren initiiert, deren Chromophor all-trans-Retinal ist. Eines dieser Rhodopsine ist Channelrhodopsin 2 (ChR2). Ein Sequenzvergleich mit anderen mikrobiellen Rhodopsinen aus Archaebakterien, wie z.B. der lichtgetriebenen Protonenpumpe Bakteriorhodopsin, zeigt eine Homologie von bis zu 20 %. Aus diesem Grund kann angenommen werden, dass die hydrophobe N-terminale Hälfte mit circa 300 von 737 Aminosäuren ebenso aus einem Siebentransmembranhelixmotiv besteht, wie dies für Rhodopsinmoleküle typisch ist. Seit der Entdeckung 2003 durch Nagel et al. ist bekannt, dass es sich bei ChR2 um einen lichtgetriebenen, kationenselektiven Ionenkanal handelt, der in dieser Form bisher nicht bekannt war. Diese biophysikalische Charakteristik konnte durch detaillierte elektrophysiologische Daten erhoben werden. Sie lieferten zudem die Erkenntnis, dass ChR2 als „Werkzeug“ in der Neurobiologie verwendet werden kann, da die lichtinduzierte Depolarisation zum Feuern von Aktionspotentialen in ChR2-exprimierenden Neuronen führt. Die vorliegende Arbeit sollte dazu beitragen, die molekularen Mechanismen von ChR2 aufzuklären, indem elektrophysiologische, spektroskopische und biochemische Daten miteinander korreliert wurden. Dazu wurde ChR2 funktionell in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris exprimiert. Ein Glykosylierungstest konnte belegen, dass Pichia pastoris in der Lage ist, die für ChR2 erforderliche N-Glykosylierung durchzuführen. Mit einer 90%igen Expression war es somit möglich, ausreichend Protein für eine Metallchelat-Affinitätschromatographie zu gewinnen. Weiterhin konnte die bestehende Funktionalität nach der Isolierung von ChR2 nachgewiesen werden. Dies erfolgte zum einen über Messungen des charakteristischen Photostroms mittels der BLM-Technik. Zum anderen konnte dies durch spektroskopische Messungen der spezifischen Absorption von ChR2 bei 480 nm bestätigt werden. Die zeitaufgelöste Laserblitzabsorptionsspektroskopie lieferte zudem Differenzspektren des isolierten ChR2, die erstmalig das Vorhandensein eines spektral verschiedenen Intermediats bei 540 nm zeigten. Zusammen mit dem Zeitverlauf aller vier korrespondierenden Intermediate und der Hinzunahme elektrophysiologischer Daten konnte somit ein linearer Photozyklus bestehend aus vier Zuständen erstellt werden (erstellt durch Dr. Christian Bamann). Die ersten drei Intermediate des Photozyklus P1-P3 werden demnach durch die rotverschobene Spezies beschrieben, mit einer Relaxationszeit von unter einer Millisekunde. Dieses rote Intermediat spiegelt die Konformationsänderung des Retinals wider und geht mit dem Öffnen des Kanals einher. Die Zustände P2 und P3 konnten beide als kationenleitende Zustände identifiziert werden. Das Schließen des Kanals wird durch den Übergang von P3 zu P4 (spektral mit dem Grundzustand gleich) vermittelt. Das Zurückkehren in den Grundzustand folgt einem langsamen Prozess im Bereich von mehreren Sekunden. Biochemische, spektroskopische und elektrophysiologische Daten haben damit erfolgreich zur weiteren Aufklärung der molekularen Funktionsweise von ChR2 beigetragen. Mit diesen Ergebnissen ist nun die Erschließung neuer Informationen über die verschiedenen Signaltransduktionswege von Membranproteinen möglich.
In einer prospektiven klinischen Studie wurden 40 Procera-AllCeram-Kronen unter standardisierten Bedingungen bei 18 konsekutiv ausgewählten Patientinnen und Patienten im Front- und Seitenzahnbereich eingegliedert. Als Untersuchungszeitpunkte wurde ein Termin vor der Eingliederung, bei der Eingliederung, sowie nach ein und zwei Jahren Tragedauer festgelegt. Insgesamt 21 Untersuchungskriterien bezogen sich auf die Bewertung der Pfeilerzähne, der Kronen und der Keramik. Weiterhin wurde eine subjektive Beurteilung des Zahnersatzes durch die versorgten Patienten anhand eines Fragenkataloges vorgenommen. Zur Kontrolle der parodontalen Verhältnisse wurden der Approximalraum-Plaqueindex (modifiziert nach LANGE, 1977) und der Sulkus-Blutungsindex (modifiziert nach MÜHLEMANN und SON, 1971) erhoben und die Sondierungstiefen gemessen. Als Kontrollgruppe dienten die entsprechenden kontralateralen Zähne, an denen die gleiche Untersuchung erfolgte. Zusätzlich zu den klinisch erhobenen Daten wurden die Restaurationen zu jedem Untersuchungszeitpunkt fotografisch dokumentiert. Die Untersuchungen nach 24 Monaten Tragedauer ergaben folgende Resultate: Bei keinem der Pfeilerzähne traten ein Vitalitätsverlust, eine Perkussionsempfindlichkeit oder Schmerzen auf. Im Vergleich zu den bei Eingliederung erhobenen Daten (Baseline) verringerte sich die Mobilität der Pfeilerzähne (Veränderung des Anteils der Pfeilerzähne mit Lockerungsgrad 0 von 25,0 % auf 27,5 %, Lockerungsgrad I von 67,5 % auf 70,0 % und Lockerungsgrad II 7,5 % auf 2,5 %). Die Plaqueakkumulation reduzierte sich im Vergleich zu den Daten zum Zeitpunkt der Kroneneingliederung (Baseline) von 12,5 % auf 7,5 %. Eine gingivale Irritation konnte nach zweijähriger Tragedauer bei nur 2,5 % der Pfeilerzähne festgestellt werden, während bei Kroneneingliederung (Baseline) noch 15,0 % betroffen waren. Die Sondierungstiefe blieb an 35 Zähnen konstant oder verbesserte sich um bis zu zwei Millimeter, während bei fünf Pfeilerzähnen eine Erhöhung von einem Millimeter auftrat. Bei keiner Krone konnte die Entstehung einer Sekundärkaries, die Bildung eines sondierbaren Randspaltes oder einer positiven oder negativen Stufe am Kronenrand festgestellt werden. Ebenso kam es bei keiner Restauration zum Verlust der Retention bzw. zur Veränderung der Approximalkontakte. Bezüglich der Keramik lagen bei keiner der eingegliederten Vollkeramikkronen eine Hartkernfraktur, eine partielle Fraktur oder einzelne Frakturlinien vor. Hinsichtlich der Verblendkeramik ließ sich bei keiner Krone eine Verfärbung bzw. ein Glanzverlust feststellen. Die okklusalen Verhältnisse änderten sich im Vergleich zu den bei Eingliederung erhobenen Daten nach Prüfung mit Shimstock- und farbiger Okklusionsfolie nicht. Im Hinblick auf die subjektive funktionelle Bewertung anhand von zehn Fragen durch die versorgten Patient(inn)en resultierte eine positive Bewertung bei allen Personen. Das mittels des Schulnotensystems evaluierte ästhetische Ergebnis ergab bei 17 Patient(inn)en (39 Kronen) die Beurteilung „sehr gut“. Eine Person bewertete das Aussehen der bei Ihr eingegliederten Krone lediglich als „befriedigend“. Unter Berücksichtigung des begrenzten Beobachtungszeitraumes von zwei Jahren kann anhand der vorliegenden Studie festgestellt werden, dass Procera-AllCeram-Vollkeramikkronen eine positiv zu bewertende Behandlungsmethode im Hinblick auf Funktion und Ästhetik darstellen. Bei Gegenüberstellung der ermittelten Ergebnisse zu den in der Literatur vorliegenden Daten von Vollguss- oder Metallkeramikkronen zeigen die eigenen klinischen Resultate, dass das untersuchte vollkeramische System zur Herstellung von konventionell zementierbaren Einzelzahnkronen im Front- und Seitenzahnbereich geeignet erscheint.
Die Lyme-Borreliose, eine durch Zecken übertragene Multisystem-Erkrankung, wird durch die Spirochäte B. burgdorferi s. l. hervorgerufen. Die in vitro-Empfindlichkeit von Borrelien gegenüber einer ganzen Reihe von Substanzen ist bislang nicht oder nur unzureichend bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde daher die in vitro-Empfindlichkeit von B. burgdorferi gegenüber einer Reihe von neu entwickelten Antibiotika im Vergleich zu bekannten Substanzen unter standardisierten Bedingungen untersucht. Im 1. Teil der Arbeit wurde ein neues kolorimetrisches Mikrodilutionstestverfahren in Kombination mit konventioneller Subkultivierung in Flüssigmedium zur Bestimmung der in vitro-Empfindlichkeit von 17 repräsentativ ausgewählten Borrelienstämmen gegenüber dem neu entwickelten Ketolid Cethromycin eingesetzt. Das Verfahren ist standardisiert, gut reproduzierbar und erlaubt es, mehrere Antibiotika bzw. Isolate gleichzeitig effizient zu testen. Die MHK90 für Cethromycin lag für die getesteten Isolate einheitlich bei  0,002 µg/ml. Die MBK90 lag bei 0,75 µg/ml. Im 2. Teil der Arbeit wurden auf der Basis von konventionellen Zellzählungen mittels Dunkelfeldmikroskopie zusätzlich Untersuchungen zur Aktivität von Cethromycin, Sitafloxacin und Gemifloxacin im Vergleich zu Ciprofloxacin und den bekanntermaßen gut gegen Borrelien wirksamen Substanzen Doxycyclin und Ceftriaxon für je ein repräsentatives Isolat der humanpathogenen Genospezies B. burgdorferi s. s., B. garinii und B. afzelii durchgeführt. Von den untersuchten neuen Substanzen zeigten Cethromycin (MHK [Mittelwert]: ≤ 0,002 µg/ml; MBK [Mittelwert]: 0,3 µg/ml) und Gemifloxacin (MHK [Mittelwert]: 0,06 µg/ml; MBK [Mittelwert]: 8 µg/ml) im Vergleich zu den in der Therapie der Lyme-Borreliose bewährten Substanzen Ceftriaxon (MHK [Mittelwert]: 0,016 µg/ml; MBK [Mittelwert]: 1,2 µg/ml) und Doxycyclin (MHK [Mittelwert]: 0,25 µg/ml; MBK: von 24 bis >32 µg/ml) die vielversprechendste Aktivität gegen B. burgdorferi. Diese Ergebnisse konnten in Hinblick auf die Aktivität der getesteten Antibiotika gegenüber Borrelien durch die zusätzlich über 120 h durchgeführten Time-Kill-Experimenten abgesichert werden. Im 3. Teil der Arbeit wurden dann unter Zuhilfenahme eines theoretischen Modells mittels Einbeziehung weiterer pharmakologischer und pharmakokinetischer Daten für alle getesteten Substanzen sogenannte Bakterizidie-Indizes (BIs) auf der Basis der erzielten in vitro-Resultate berechnet. BIs von > 2,8 stehen dabei für eine gute bis sehr gute antimikrobielle Aktivität. Für Cethromycin zeigte sich bei den untersuchten Isolaten ein rascher Anstieg der BIs schon nach einer sehr kurzen Inkubationszeit von 48 h. Dabei lagen die Werte für Cethromycin (BIs 5,0-7,59) nach 120 h sogar über denen von Doxycyclin (BIs 2,81-3,15). Ebenso lagen die errechneten BIs für Gemifloxacin nach 120 h (BIs 3,33-8,05) höher als für Doxycyclin. Ceftriaxon war allerdings die bei weitem am besten wirksame Substanz und zeigte auch die höchsten BIs von 14,96 bis 18,48. Unter Berücksichtigung aller verfügbaren Daten ergab sich aus der vorliegenden Arbeit zusammenfassend folgende Rangordnung für die in vitro-Aktivität der getesteten antibiotischen Substanzen: Ceftriaxon > Cethromycin > Gemifloxacin > Doxycyclin > Sitafloxacin > Ciprofloxacin. Für neu entwickelte Antibiotika stellen in vitro-Untersuchungen einen ersten Schritt für eine Charakterisierung ihrer antimikrobiellen Wirksamkeit gegen Infektionserreger dar. Die Einbeziehung weiterer pharmakologischer Daten in die Interpretation solcher experimentell gewonnenen Ergebnisse ist innovativ, vermittelt zusätzliche Informationen und erlaubt eine vergleichende modellhafte Abschätzung der Aktivität solcher Substanzen unter Berücksichtigung wichtiger pharmakokinetischer und pharmakodynamischer Parameter. Zusammenfassend legen die in der vorliegenden Arbeit herausgearbeiteten Ergebnisse eine vielversprechende Aktivität von zwei neuen Substanzen (Cethromycin und Gemifloxacin) gegen B. burgdorferi nahe und lassen daher eine weitergehende klinische Prüfung dieser Antibiotika für eine mögliche therapeutische Anwendung bei Lyme-Borreliose sinnvoll erscheinen.
This thesis is concerned with various aspects of estimating trend output and growth and discusses and evaluates methods to prepare medium-term GDP growth projections. Furthermore, econometric techniques suited for cross-correlated macroeconomic panel data with a focus on factor models are applied for unit root and cointegration testing as well as panel error correction estimation. Applications involve the identification of growth determinants as well as the modelling of aggregate labor supply in a multi-country framework. The first chapter evaluates a very popular method for potential output estimation and medium-term forecasting---the production function approach---in terms of predictive performance. For this purpose, a particular forecast evaluation framework is developed and an evaluation of the predictions of GDP growth for the three to five years ahead for each individual G7 country is carried out. In chapter two, a new approach for estimating trend growth of advanced economies is proposed. The suggestion combines econometric methods that have been used to test and estimate the implications of the extended Solow growth model in a cross sectional time series setting with an application of multivariate time series filter techniques. The last chapter discusses several panel unit root tests designed to accommodate cross-sectional dependence. These methods are then applied to an OECD country sample of the aggregate labor supply measure "hours worked".
RNA-Interferenz (RNAi) erlangte eine herausragende Bedeutung zum Studium der Genfunktion, nachdem auch in Säugersystemen gezeigt wurde, daß durch Applikation von 21 nt langen siRNAs (small interfering RNAs) eine Sequenz-spezifische Degradierung der mRNA-Transkripte kognitiver Gene erreicht werden konnte. Im Gegensatz zur antisense-Technologie erwies sich die Wirkung von siRNA im Hinblick auf die Hemmung der Genexpression um ein Vielfaches potenter und hoch spezifisch. Für eine längerfristige Unterdrückung von Genen kristallisierte sich die Methode der Plasmid-Vektor-vermittelten intrazellulären Expression von shRNA (short hairpin RNA) heraus, welche transient oder stabil angewendet werden kann. Diese exprimierte shRNA wird intrazellulär enzymatisch zu wirksamer siRNA prozessiert, welche den eigentlichen Enzym-vermittelten RNAi-Mechanismus der Degradierung von mRNA-Transkripten kognitiver Gene auslöst. Die Anwendung von RNA-Polymerase III-abhängigen Promotoren für die stabile konstitutive Expression von shRNA stellte ein großes Problem für behandelte Zellen dar, wenn es sich bei dem zu unterdrückenden Zielgen um ein Gen mit essentiellen Funktionen für die Zelle handelte. Im Falle der Polo-like Kinase 1 (Plk1), einer in vielen Spezies hoch konservierten Serin/Threonin-Kinase mit essentiellen mitotischen Funktionen, bedeutete eine dauerhafte und stringente Unterdrückung einen veränderten Phänotyp beteiligter Zellen, welcher sich durch Defekte bei mitotischen Ereignissen bemerkbar machte. Plk1 ist in zahlreiche mitotische Prozesse, wie den Eintritt der Zellen in die Mitose, die Segregation der Chromosomen und die Aktivierung des APC/C (anaphase promoting complex / cyclosome), eingebunden. Darüber hinaus ist bekannt, daß Plk1 in nahezu allen Tumorarten überexprimiert vorliegt und die Prognose von Tumorwachstum und Metastasierungspotential über den Plk1-Gehalt definiert werden kann. Des weiteren bewirkte eine RNAi-vermittelte Unterdrückung der Plk1-Expression bei Tumorzellen eine Hemmung der Zellproliferation mit Auslösung der Apoptose. Hingegen konnte bei gesunden primären Zellen weder eine signifikante Hemmung der Proliferation noch die Auslösung der Apoptose beobachtet werden, was die große Bedeutung von Plk1 als Ansatzpunkt für eine Krebstherapie hervorhebt. Um die Funktion von Plk1 im Hinblick auf molekularbiologische Zusammenhänge besser studieren zu können, war es notwendig, den intrazellulären Plk1-Gehalt zu variieren. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurden dazu induzierbare RNAi-Elemente entwickelt, mit deren Hilfe die intrazelluläre Plk1-Expression konditionell inhibiert werden konnte. Unter Verwendung des prokaryotischen Tet-Systems wurden auf Basis des RNA-Polymerase abhängigen H1-Promotors durch Insertion von einer oder zwei Operatorsequenzen (TetO) für den Tetrazyklin-Repressor (TetR) an verschiedene Orte innerhalb der Sequenz des H1-Promotors drei induzierbare Promotor-Derivate geschaffen. Die drei entwickelten H1-Promotor-Derivate wurden zur Expression von shRNA gegen Plk1 eingesetzt und in bezug auf die Auslösung der RNAi-Antwort getestet und untereinander verglichen. Zu diesem Zwecke wurde der endogene Plk1-Gehalt von HeLa-Tumorzellen auf Transkript- und auf Proteinebene bestimmt. Die Zellen wurden zuvor mit Plasmid-Vektoren für konstitutive TetR-Expression und jeweils einer der verschiedenen shRNA-Expressions-Kassetten ko-transfiziert. Als Kontrollen dienten dabei Wildtyp-H1-Promotoren, welche zur konstitutiven Expression von shRNA gegen Plk1 und einer unwirksamen Kontroll-shRNA eingesetzt wurden. Mit Hilfe des synthetischen Tetrazyklin-Analogons Doxyzyklin, welches einen potenten Aktivator für TetR darstellt, konnten die hergestellten Promotor-Derivate induziert werden, was durch einen reduzierten intrazellulären Plk1-Gehalt sichtbar wurde. Dabei fiel auf, daß alle drei Promotor-Typen unterschiedliche Eigenschaften im nichtinduzierten Zustand wie auch im induzierten Zustand unter Anwesenheit von Doxyzyklin aufwiesen. Für die Basalaktivität in Abwesenheit von Doxyzyklin (leakiness) war die relative Lage der TetO-Sequenz(en) innerhalb des Promotors verantwortlich. So veränderte die Insertion einer TetO-Sequenz in 3’-Richtung der TATA-Box die Eigenschaften des Wildtyp-H1-Promotors weniger als die Insertion einer TetO-Sequenz in 5’-Richtung der TATA-Box. Zum Studium von Plk1 als Zielgen in der Krebstherapie wurde das Proliferationsverhalten von HeLa-Tumorzellen als Antwort auf die Doxyzyklin-vermittelte Induktion der shRNAExpression unter Kontrolle eines der induzierbaren Promotoren ermittelt. Dabei konnte die Proliferation von Tumorzellen durch einen reduzierten Plk1-Gehalt, welcher durch die Doxyzyklin-induzierte Auslösung der RNAi-Antwort vermittelt wurde, erfolgreich inhibiert werden. Zur Überprüfung der Eignung entwickelter Systeme, Tumorwachstum in vivo inhibieren zu können, wurden die entwickelten RNAi-Kassetten in das Genom von TetRexprimierenden HeLa-Zellen integriert und so stabile Klone geschaffen. Stabile HeLa-Klone zur induzierbaren Expression von Plk1-spezifischer shRNA, wie auch zur induzierbaren Expression von einer Kontroll-shRNA, wurden in die gegenüberliegenden Flanken von immunsupprimierten Nacktmäusen inokuliert, um anhand von Xenograft-Modellen einen direkten Vergleich des Tumorwachstums unter gleichen äußeren Bedingungen zu ermöglichen. Einem Teil der Mäuse wurde Doxyzyklin ins Trinkwasser gegeben, während Kontrollmäuse kein Doxyzyklin verabreicht bekamen. Das Tumorwachstum von Xenograft-Tumoren, welche aus Klonen zur Expression von shRNA gegen Plk1 hervorgingen, konnte in Doxyzyklin-behandelten Mäusen um 53% auf 47% an Tag 51 nach Inokulierung der Zellen inhibiert werden. Tumoren nicht-induzierter Mäuse, sowie Tumoren aus induzierten Mäusen, welche Kontroll-shRNA exprimierten, wuchsen dagegen unverändert in gleichem Maße. Anhand der in dieser Arbeit entwickelten induzierbaren H1-Promotor-Derivate zur konditionellen Auslösung von RNAi wurden wertvolle genetische Werkzeuge geschaffen, welche für das Studium der Genfunktion eingesetzt werden können. Im Falle der Unterdrückung von Plk1 können mit ihrer Hilfe sowohl grundlegende molekularbiologische Zusammenhänge studiert als auch die Bewertung von Plk1 als Zielgen in der Krebstherapie bewertet werden. Im Gegensatz zu kürzlich entwickelten Kinase-Inhibitoren, welche auf Proteinebene gegen Plk1 gerichtet sind und aufgrund ihrer bislang nicht nachgewiesenen Spezifität verwandte Kinasen in ihrer Wirkungsweise beeinflussen könnten, ist eine RNAibasierte Strategie hoch spezifisch und verspricht eine große Relevanz für zukünftige therapeutische Ansätze. Vorraussetzung für erfolgversprechende RNAi-basierte Strategien ist eine hohe Konservierung der Sequenz beteiligter Zielgene. Im Falle von Plk1 konnte eine hohe Konservierung durch Sequenzanalyse der Plk1-Gene von 15 Mamma-Karzinomen, 11 Ovarial-Karzinomen und mehrerer Tumorzellinien bestätigt werden.
Die Prognose für Patienten mit hepatisch metastasierten kolorektalen Karzinomen ist weiterhin sehr heterogen und hängt von Anzahl, Größe und Lokalisation der Metastasen ab. Neben potentiell kurativer Metastasenchirurgie und palliativer Chemotherapie stehen zunehmend lokal ablative Verfahren (LITT/Kryotherapie/RFA) zur Verfügung. Die LITT arbeitet nach dem Prinzip einer hitzebasierten Tumorkoagulation, wobei Laserappliaktoren innerhalb gekühlter Hüllkatheter in bzw. nahe der zu abladierenden Läsion platziert werden und unter Abgabe von Licht im NIR-Bereich eine Gewebeerwärmung induzieren. Die Prozesskontrolle wird durch schnelle T1 gewichtete Gradientenechosequenzen im MRT gewährleistet. Die in vitro und ex vivo Experimente dieser Arbeit konnten den linearen Zusammenhang zwischen Temperatur und MR-Signalintensität in verschiedenen Modellen sowie an unterschiedlichen Geräten demonstrieren. Die zwischen November 1999 und Februar 2001 abladierten 580 Läsionen wurden in 10 verschiedenen Gruppen, abhängig von den resultierenden Nekrosevolumina, eingeteilt. Anschließend wurden die zugehörigen mittleren, minimalen und maximalen Energiemengen sowie die Standardabweichungen ermittelt. Es konnte gezeigt werden, dass keine prädiktiv verwertbare Aussage über die Läsions- beziehungsweise die Nekrosegröße sowie die notwendige Laserenergie erhältlich ist. Die mediane Überlebenszeit im untersuchten Kollektiv betrug 22 Monate, die mittlere Überlebenszeit betrug 29,4 Monate. Mit p<0,05 im Log-Rank-Test ergab sich ein signifikanter Überlebensvorteil für: 1. Patienten, die trotz chirurgisch bestätigter Operabilität die Operation ablehnen 2. Patienten mit maximalen Tumordiametern von bis zu 1 cm Durchmesser Die Lokalrezidivrate im untersuchten Kollektiv betrug 0 %. Auf Grund der bei unterschiedlichen Lokalrezidivraten bei teilweise vergleichbaren Überlebensraten sollten lokal ablative Therapieverfahren einem weitergehenden, studienbasierten Vergleich unterzogen werden.
Die zunehmende Resistenzentwicklung bei der Therapie gegen Herpes Simplex Viren vom Typ-1, besonders bei immundefizienten Patienten, erfordert die Entwicklung von Therapie-Alternativen. In Anlehnung an die Erkenntnisse der Traditionellen Chinesischen Medizin, die sich die Wirksamkeit von Heilpflanzen zu Nutze macht, wurde in dieser Arbeit das antivirale Potential von Extrakten aus Rheum Spezies gegen HSV-1 untersucht. Rheum oder Rhabarber gehört zur Familie der Polygonaceae. Die hier verwendeten Extrakte stammen aus den Wurzeln und Rhizomen von Rheum palmatum L. und Rheum rhaponticum, welche ursprünglich aus Asien stammende Heilpflanzen sind. Rheum ist reich an polyphenolen Inhaltsstoffen der Gruppe der Flavonoide und Tannine, welche Gegenstand der Forschung sind und denen schon vielfache pharmakologische Wirkungen zugesprochen wurden. Die antivirale Wirksamkeit von Rheum wurde bislang nur in der chinesischen Literatur veröffentlicht, wo bestimmte Untersuchungen mit HBV und HSV vorgenommen wurden. Hier wurde in einem Zellkulturmodell mit Vero-Zellen eine antivirale Testung vorgenommen. Die Auswirkungen der Rheum Extrakte auf den durch HSV-1 verursachten zytopathischen Effekt wurden untersucht. Eine Verminderung oder das Fehlen des CPE wurde als antivirale Wirksamkeit gewertet. In zwei Versuchsreihen, einmal mit simultaner Beimpfung der Vero-Zellen mit Virus in einer MOI von 0,01 und Extrakten in Konzentrationen von 500µg/ml bis 4µg/ml und dann mit viraler Vorinkubation von 1, 6 und 24 Stunden wurde das Verhalten der Zellen beobachtet. Unter dem Auflichtmikroskop wurde das Ausmaß des CPE beurteilt und anschließend mit Hilfe des Computerprogramms CalcuSyn die IC50 Werte berechnet. Der Wert der 50% inhibitorischen Konzentration sagt aus, bei welcher Extraktkonzentration 50% der Zellen einen CPE aufweisen und ist somit Maß für die antivirale Wirksamkeit. Weiterhin wurden die Rheum Extrakte mittels MTT-Assay auf ihre Zytotoxizität hin untersucht und der TC50 Wert als Maß der Toxizität berechnet. Der aus IC50 und TC50 berechnete Therapeutische Index setzt Wirksamkeit und Toxizität in Relation und ist ein Wert für die mögliche Validität einer Substanz. Je höher dieser Wert, desto viel versprechender die Substanz. Besonders Extrakte 9, 10 und 17 bedürfen der genaueren Betrachtung, da sie in der vorliegenden Untersuchung Therapeutische Indexe von >12, >9,8 und >17,9 gezeigt haben. Dies deutet auf ein antivirales Potential, bei keiner nachweisbaren Zytotoxizität in verwendeten Konzentrationen, hin. Im Vergleich zeigte Aciclovir einen TI von 22. Mit diesen drei Substanzen wurde der Versuch dann mit viraler Vorinkubation von 1, 6 und 24 Stunden wiederholt. Vor Allem Extrakt Nr. 17 zeigte auch bei Vorinkubation von einer und sechs Stunden mit einem IC50 von 80µg/ml und 95,5 µg/ml eine signifikante Reduktion des CPE. Dies gibt einen Hinweis auf die mögliche Art des Wirkmechanismus, denn Zeichen der Wirksamkeit trotz Vorinkubation sprichen für eine Intervention im späteren Stadium des viralen Replikationszyklus. Problematisch ist die Übertragung der hier ermittelten in vitro Ergebnisse auf in vivo Verhältnisse. Allerdings sind die Ergebnisse vielversprechend und eine weiterführende Untersuchung erscheint lohnenswert. Hier ist vor Allem die genaue Charakterisierung und Isolierung der Inhaltsstoffe der wirksamen Extrakte notwendig. Nachfolgend könnte die Wirksamkeit der ermittelten Polyphenole in einem Tierversuch verifiziert werden.
In Hugo von Hofmannsthals ‚Bewegungs-Texten’ wird das Schweigen zu einem beredten Gestus von (bewegten) Körpern und Bildern. Schweigen nicht als Leerstelle, als Negativ des Sprechens, sondern als sein Urgrund generiert Bedeutungen und dringt durch die Weise, wie es jene vermittelt, auf eine Modifikation der Wahrnehmung. Bewegung wird dabei gleichermaßen zum Konzept der Darstellungsabsicht, die eine Transgression des Textuellen anstrebt, wie zur Metapher der Umstrukturierung von Wahrnehmung und Erfahrung des Menschen in der Moderne. Um die ‚stummen’ Künste wie Pantomime, Tanz und Film in den (Be)Griff zu bekommen, stellt Hofmannsthal - ausgehend von der eigenen Beobachter-Erfahrung - den Zuschauer des Schauspiels in den Mittelpunkt seiner Texte. Stets ist in den Szenarien der medienreflexive Blick des Autors auf Bühne, Leinwand und Zuschauer präsent und wird dabei begleitet von Überlegungen zur spezifischen Medialität von Sprache, Musik und Bild. So bedenken beispielsweise auch zahlreiche Texte Hofmannsthals aus der Sammlung der Erfundenen Gespräche und Briefe, die den Zusammenhang von Wahrnehmung, Körper und Sprache thematisieren, den (beweglichen) Standpunkt des Beobachters als eigentlichen Prüfstein des Medialen. Auf diese Weise wird nicht nur erkennbar, wie Medien je unterschiedlich die Wahrnehmungsweisen des Menschen formen, sondern auch wie sie Selbst- und Weltverhältnisse herstellen, indem sie versuchen Absenz in Präsenz zu überführen. Dementsprechend weit gefasst ist Hofmannsthals Medienbegriff. Ihr grundsätzlich symbolischer Charakter verbindet die einzelnen Medien miteinander. Das Interesse des Dichters, der erkennt, dass er niemals „aus seinem Beruf, Worte zu machen, herausgehen“ können wird, konzentriert sich auf die Interdependenzen und die Austauschverhältnisse verschiedener symbolischer Formen, die nichtsdestotrotz nach je eigenen Gesetzmäßigkeiten funktionieren und diesen auch gerecht werden müssen, um ‚das Leben transponieren’ zu können. In den Szenarien für Pantomime, Tanz und Film spürt Hofmannsthal diesen Funktionsweisen nach. Er erkundet den Zusammenhang von Literatur, Musik und Tanz, entdeckt das Wissen des Körpers, dessen Erinnerungsfähigkeit derjenigen der klassischen Memorialtechnik der Schrift gegenübergestellt wird. Er thematisiert über den tanzenden Körper den Konnex von Mimesis und Identität, von Imagination und Wirklichkeit, Projektion und Abbild. Zudem wird der tanzende Körper als Inbegriff des Anderen, Fremden, (Weiblichen) vorgeführt und darüber sein fragwürdiger Status als ‚Natur’ problematisiert. Die vermeintlichen Antagonismen von Natur und Kultur, Leib und Seele, Sprache und Körper, Individuum und Gesellschaft sowie Freiheit und Determiniertheit geraten in Vermittlung und können dergestalt begreiflich machen, wie komplex verschiedene mediale Verfahren der Verkörperung, Einschreibung und Verbildlichung strukturiert und miteinander verzahnt sind. So können mystische Visionen auf der Bühne als filmische Bilderflucht inszeniert, die Schaulust im Kino zum Wahrnehmungsdispositiv einer Pantomime oder der Akt des Schreibens im Film mit dessen Performativiät und der Prozessualität der filmischen Bilderfolge in Beziehung gesetzt werden.
Ibuprofen gehört zu den am meisten verwendeten nichtsteroidalen Antiphlogistika (NSAIDs) und ist in niedriger Dosierung von 200-400 mg als sogenanntes OTC (over the counter) Analgetikum frei erhältlich. Obwohl es in den meisten Fällen als razemische Mischung aus S- und R-Ibuprofen verabreicht wird, ist mittlerweile auch das reine S-Ibuprofen (Dexibuprofen) als Medikament erhältlich. Während S-Ibuprofen ein potenter COX-Inhibitor ist, zeigt R-Ibuprofen in den klinisch relevanten Konzentrationen keine COX-Hemmung. Seit längerem ist bekannt, dass NSAIDs bei einer kontinuierlichen Einnahme über mehrere Jahre die Initiierung und Proliferation von Tumoren hemmen. Die Hemmung der Cyclooxygenase wird dabei als ein wichtiger Mechanismus für die antikarzinogene Wirkung angesehen, doch für viele NSAIDs sind auch schon COX unabhängige Mechanismen beschrieben worden. In der vorliegenden Arbeit wurde unter Verwendung zweier Tumorzelllinien mit unterschiedlicher COX-2 Expression und dem Einsatz von beiden Ibuprofen Enantiomeren untersucht, inwieweit COX unabhängige Mechanismen für die antikarzinogenen Effekte von S- und R-Ibuprofen verantwortlich sind. Sowohl die COX-2 defizienten HCT-15 als auch die COX-2 exprimierenden HCA-7 Zellen wurden durch Behandlung mit S- oder R-Ibuprofen in ihrer Proliferaton gehemmt. Dabei führte die Behandlung mit S- und R-Ibuprofen für 24 h zu einem G1-Zellzyklusblock und nach 72 h zu einem signifikanten Anstieg von apoptotischen Zellen, was im Western-Blot Assay durch eine verminderte Cyclin A und B Expression, einer erhöhten Expression des Zellzyklusinhibitors p27KIP1 und PARP-Spaltung bestätigt wurde. Dabei zeigten beide Enantiomere in den Tumorzellen eine gleich starke antiproliferative und apoptotische Wirkung. Eine Messung der intrazellulären S- und R-Ibuprofen Konzentrationen ergab außerdem, dass in den verwendeten Tumorzellen keine unidirektionale Konfigurationsinversion von R- zu S-Ibuprofen stattgefunden hat. In den COX-2 exprimierenden HCA-7 Zellen waren die antikarzinogenen Effekte von S- und R-Ibuprofen schwächer ausgeprägt als in den HCT-15 Zellen, was jedoch auf eine niedrigere intrazelluläre S- bzw. R-Ibuprofen Konzentration zurückzuführen war. Diese Ergebnisse zeigen auf jeden Fall, dass COX unabhängige Mechanismen bei der antikarzinogenen Wirkung von S- und R- Ibuprofen eine Rolle spielen. Dass auch COX abhängige Mechanismen an der antikarzinogenen Wirkung von Ibuprofen beteiligt sind, konnte in verschiedenen Studien gezeigt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Abnahme an PGE2 nach S-Ibuprofen Behandlung in den COX-2 exprimierenden Tumorzellen beobachtet. In welchem Ausmaß aber die COX Hemmung an der antikarzinogenen Wirkung von S-Ibuprofen in den COX-2 exprimierenden (Hemmung der PGE2 Synthese) und möglicherweise auch in den COX-2 defizienten Zellen (Anstieg an Arachidonsäure und daraus resultierend an Ceramid) beteiligt war, konnte anhand der Ergebnisse nicht geklärt werden. Es kann jedoch angenommen werden, dass S-Ibuprofen zumindest in den COX exprimierenden HCA-7 Zellen sowohl über COX Hemmung als auch über COX unabhängige Mechanismen antiproliferativ und apoptotisch wirkt. Auch im Tumormodell der Maus wurde bei einer täglichen i.p. Applikation von 15 mg/kg S- oder R-Ibuprofen eine Hemmung des Tumorwachstums beobachtet. Dabei betrug die unidirektionale Inversion von R- zu S-Ibuprofen ca. 54 %. Die Inkubation mit S- bzw. R-Ibuprofen führte in beiden Zelllinien außerdem zu einer Akkumulation des Tumorsuppressors p53, der an der Regulierung von Zellzyklus und Apoptose beteiligt ist. Daher wurde im zweiten Teil der Arbeit untersucht, ob S- und R-Ibuprofen die Induktion von Apoptose und Zellzyklusarrest über die Aktivierung des Transkriptionsfaktors p53 und dessen Zielgene vermitteln. Verwendet wurde eine HCT-116 Zelllinien, in der beide p53 Allele durch homologe Rekombination inaktiviert waren (p53-/-). Im Gegensatz zu den HCT-116 p53wt Zellen führte die Behandlung mit S- bzw. R-Ibuprofen in den p53 defizienten Zellen zu keinem signifikanten G1-Zellzyklusblock und auch die Apoptoserate war in diesen Zellen deutlich geringer als in p53wt Zellen. In vivo zeigte eine tägliche i.p. Injektion von 15 mg/kg S- bzw. R-Ibuprofen bei den Mäusen mit p53-/- Tumoren keine signifikante Wachstumshemmung. Im Vergleich dazu wurde die Proliferation der HCT-116 p53wt Tumore durch die R-Ibuprofen Behandlung signifikant gehemmt, und auch die mit S-Ibuprofen behandelten Tieren zeigten deutlich kleinere Tumore als die Gruppe mit den p53 defizienten Tumoren. Nach der Inkubation mit S- bzw. R-Ibuprofen wurde in beiden HCT-116 Zelllinien eine erhöhte Expression des Membranrezeptors p75NTR beobachtet. Außerdem führte die Behandlung mit S- bzw. R-Ibuprofen in den p53wt Zellen, im Gegensatz zu den p53 defizienten Zellen, zu einer vermehrten Bax Expression und einem Anstieg an Bax Protein in der mitochondrialen Fraktion. Schließlich wurde gezeigt, dass die erhöhte p53 Konzentration in den Zellen zumindest teilweise über den p75NTR Rezeptor reguliert wird, da durch die externe Zugabe des Liganden NGF die Ibuprofen induzierte Akkumulation von p53 in den HCT-116 p53wt Zellen wieder aufgehoben wurde. Da in vitro in den HCA-7 Zellen nicht nur die Behandlung mit S-Ibuprofen, sondern auch die mit R-Ibuprofen zu einer Hemmung der PGE2 Synthese führte, wurde im dritten Teil der Arbeit die Wirkung von S- und R-Ibuprofen auf die Expression der PGE-Synthasen und auf die mPGES-1 Aktivität untersucht. Dabei wurden HeLa Zellen verwendet, deren mPGES-1 Expression durch die Zugabe von IL-1ß und TNF-alpha stimmuliert wurde. Nach gleichzeitiger Inkubation mit S- bzw. R-Ibuprofen wurde keine Inhibierung der mPGES-1, mPGES-2 oder cPGES Expression beobachtet. Auch die Enzymaktivität von mPGES-1 wurde weder durch die Inkubation mit S-Ibuprofen noch mit R-Ibuprofen beeinflußt. Die bei der Inkubation mit R-Ibuprofen auftretende Hemmung der PGE2 Synthese konnte in der vorliegenden Arbeit nicht abschließend erklärt werden und bietet somit einen interessanten Ansatzpunkt für weitere Untersuchungen.
Autoimmune Endokrinopathien entstehen durch die Aktivierung pathogener TLymphozyten, welche in de Lage sind, bestimmte Ziel-Zellen mittels Zytokinen oder anderer Mechanismen zu zerstören. Typ I Diabetes mellitus ist ein durch Insulinmangel bedingter Defekt der Glukoseverwertung, der durch eine autoimmune Zerstörung der pankreatischen Beta-Zellen verursacht wird. Als häufigste chronische Erkrankung Jugendlicher und junger Erwachsener in den Industrienationen stellt sie durch ihre stetig steigende Inzidenz, ihr immer früheres Erkrankungsalter und nicht zuletzt die steigende allgemeine Lebenserwartung eine bedeutende medizinische und ökonomische Herausforderung dar. Die zunehmende Aufklärung der mannigfaltigen Wechselbeziehungen des Immunsystems und der starke Einfluss des Vitamin D auf die Entwicklung und Funktion des Immunsystems führten zu der Überlegung, dass auch der Vitamin D Rezeptor (VDR) in Verbindung mit seinem biologisch aktivsten Liganden 1,25 (OH)2D3 einen Einfluss auf die Entwicklung einer Autoimmunendokrinopathie haben könnte. In Tierexperimenten konnte gezeigt werden, dass 1,25 (OH)2D3 und auch seine Analoga die Produktion des Interleukins IL-12 hemmen, welches eine wichtige Rolle in der Entwicklung der Th1-Helferzellen ausübt, gleichzeitig wird die Produktion des Interleukins IL-10 stimuliert, welches die Entwicklung von Th1-Helferzellen blockiert. Dieser Zelltyp ist bei der Entwicklung eines Typ 1 Diabetes mellitus ursächlich beteiligt. 1,25 (OH)2D3 kann auch die Entwicklung der Th2 Helferzellen inhibieren, welche in der Pathogenese einer Hashimoto Thyreoiditis involviert sind. In betroffenen Geweben, in denen pathogen-wirksame Th1-Zellen die Bildung zytotoxischer T-Zellen und aktivierter Makrophagen bewirken, kann 1,25 (OH)2D3 und seine Analoga die Anzahl der Th1-Zellen herunterregeln. Des weiteren regt Vitamin D die Bildung von CD4+CD25+-regulatorischen T-Zellen und Th2-Zellen an, die ihrerseits wiederum hemmend auf Th1-Zellen wirken. Bisher haben bereits diverse Studien bestätigt, das funktionelle Auswirkungen verschiedener Einzelnukleotid-Polymorphismen in kodierenden und nicht kodierenden Regionen des VDR- Gens in kausalem Zusammenhang mit dem Auftreten eines Typ 1 Diabetes Mellitus stehen. In dieser Arbeit zeigten sich erniedrigte 1,25 (OH)2D3 Spiegel in deutschen Patienten mit Typ 1 Diabetes Mellitus. Eine vergleichbare Studie wurde in der finnischen Bevölkerung durchgeführt und bestätigt unsere Resultate. Dies spiegelt die zentrale Rolle des Vitamin D bei der Entwicklung eines Typ 1 Diabetes Mellitus wieder. Um den kausalen Zusammenhang zwischen molekularen und funktionellen Beziehungen des Vitamin D Rezeptors näher zu definieren, liegt die Frage nahe, inwiefern eine Korrelation der schon bekannten VDR- Polymorphismen und neu etablierten mit Vitamin D Spiegeln in Patienten und Kontrollen besteht, weiterhin, ob auf der Ebene der Genexpression schon ein signifikanter Unterschied bei Patienten mit Typ 1 Diabetes Mellitus zu beschreiben ist. Zusätzlich wurden sieben neue VDR- Polymorphismen in Familien, mit jeweils einem an Typ 1 Diabetes Mellitus erkrankten Kind, untersucht. Bestimmte Transmissionsmuster wurden bereits für die VDR- Polymorphismen ApaI, BsmI, FokI und TaqI bei Typ 1 Diabetes Mellitus beschrieben und eine signifikante Korrelation hergestellt. In dieser Doktorarbeit zeichnet sich eine grenzwertig signifikante Korrelation zwischen dem VDR- Polymorphismus 2238135 und Typ 1 Diabetes Mellitus ab. Das Allel „C“ wurde häufiger auf die erkrankten Kinder transmittiert. Dieses Ergebnis ließ sich ebenfalls in der Gegenüberstellung von Patienten zu Kontrollen nachweisen, in der Allelfrequenzanalyse stellte sich das Allel „C“ ebenfalls als dominant heraus. Für die anderen sechs untersuchten VDR- Polymorphismen konnte keine signifikante Korrelation zu Typ 1 Diabetes Mellitus in der deutschen Population nachgewiesen werden. Jedoch konnten bei vier der sieben VDR- Polymorphismen signifikante Haplotypen beschrieben werden, die den Zusammenhang zu Typ 1 Diabetes Mellitus erneut bestätigen. Dies zeigt, wie die alleinige Analyse eines VDR- Polymorphismus scheinbar keine Assoziation zum Typ 1 Diabetes Mellitus zu haben scheint, aber durch die Bildung von Allelkombinationen sich signifikante Korrelationen für die gleichen Polymorphismen ausbilden können. Die gemeinsame Analyse verleiht den untersuchten VDR-Polymorphismen erst die Signifikanz. Das Gleichgewicht war jedoch deutlich zugunsten der signifikant seltener transmittierten und damit protektiven Haplotypen verschoben. Nur „GCTG“ wurde häufiger transmittiert (62,7% vs. 37,3%, p= 0,0087), während die folgenden 3 Haplotypen „TCTG“, „TCGG“ und „GCGG“ seltener transmittiert wurden und sich als signifikant herausstellten. „TCGG“ stellte sich als grenzwertig signifikanter Haplotyp heraus, während „GCGG“ als signifikante Allelkombination anzusehen ist. Am stärksten jedoch zeigte sich der diabetogen- protekive Effekt beim Screening des „TCTG“ Haplotypen, der fast gar nicht an die erkrankten Nachkommen transmittiert wurde (99,1% vs. 0,9%, p= 0,0006). In der vorliegenden Doktorarbeit bestätigt sich einerseits die molekulare Korrelation zwischen bestimmten Polymorphismen des VDR- Gens und dem Auftreten eines Typ 1 Diabetes Mellitus. Andererseits konnten vier neue Haplotypen bestimmt werden, die im Rahmen des durchgeführten Screenings in der deutschen Bevölkerung das Risiko für die Entstehung eines Diabetes als schützende oder prädisponierende Faktoren mitbestimmen. 1,25(OH)2D3, der stärkste immunregulatorische Vitamin D Metabolit, stellt für die medikamentöse Prävention und Therapie der autoimmunen Erkrankungen auch weiterhin ein interessantes Ziel dar, unter Umständen auch über die Beeinflussung seiner Stoffwechselwege, deren molekulare Korrelation hier weiterführend geklärt wurde.
In der vorliegenden Arbeit sollte das basolaterale Targeting des Transmembranproteins shrew-1 in polarisierten Epithelzellen analysiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die cytoplasmatische Domäne von shrew-1 mehrere spezifische basolaterale Sortingmotive enthält. Die Funktionalität dieser Motive wurde anhand Mutationsanalysen von Schlüsselaminosäuren untersucht. Substitution dieser Aminosäuren führt zu einer apikalen Lokalisation von shrew-1 in polarisierten MDCK Zellen. Durch Analyse der Proteinverteilung von shrew-1 Varianten in polarisierten LLC-PK1 Zellen wurde deutlich, dass das Sorting von shrew-1 in die basolaterale Plasmamembran ein AP-1B-abhängiger Prozess ist. Außerdem konnte mittels Coimmunopräzipitation eine Interaktion zwischen shrew-1 und der Untereinheit my1B aus dem Adapterproteinkomplex AP-1B nachgewiesen werden. Untersuchungen des Targetings von shrew-1 Varianten in polarisierten MDCK und LLCPK1 Zellen mit Hilfe der Transzytoseexperimente zeigten, dass die apikal lokalisierte Mutante shrew-1-NTD5 auf dem Weg zur apikalen Membranregion, trotz fehlender Sortinginformation, die basolaterale Plasmamembran durchquert. Durch Inhibition der Membranfusion mittels Tanninsäure konnte zusätzlich gezeigt werden, dass die Passage der basolateralen Plasmamembran für das Targeting von sowohl shrew-1 als auch von shrew-1-NTD5 essentiell ist. Die Beobachtungen des Turnovers von shrew-1 in der Plasmamembran von lebenden Zellen zeigten, dass shrew-1 aktiv endozytiert wird und dass nachfolgend ein Recycling des Proteins zur Plasmamembran stattfindet. Anhand der durchgeführten Untersuchungen lässt sich zusammenfassend ein Targetingmodell für shrew-1 in polarisierten Epithelzellen aufstellen, das ein postendozytotisches Sorting beschreibt: Dabei wird shrew-1 zunächst in Post-Golgi-Carriern auf unbekanntem Weg zur basolateralen Plasmamembran gebracht, wo seine unmittelbare Internalisierung und ein Weitertransport zum Recyclingendosom stattfinden. Der im Recyclingendosom lokalisierte und am Sorting beteiligte Adapterproteinkomplex AP-1B vermittelt dann den Rücktransport von shrew-1 zur basolateralen Plasmamembran.
The thesis is devoted to the study of the Antarctic polar vortex, mainly by analyzing data collected during APE-GAIA (1999) and ASHOE (1994) campaigns and recorded by the ADEOS satellite (1996-1997), and to improvement of the chromato-graphic processing schemes. A general introduction and overview of the campaigns and instruments relevant to the present work are given in Chapters 1 and 2. A relatively large part of the thesis (Chapters 3-5) is on improvement of the analysis of raw chromatographic data recorded during in-flight measurements of the trace gases. A Gaussian non-straight-base-line method, i.e. the Gaussian processing scheme (Chapter 3), is developed for better evaluation of the chromatographic peak size. Furthermore, a statistical cross-correlation method (Chapter 5) based on statistical behaviour of the whole chromatogram series fNchrg recorded, e.g., during a research flight or laboratory calibration, is developed and applied to measure the low-concentration trace gases. As demonstrated for HAGAR's chromatograms (HAGAR - High Altitude Gas Analyzer), the combination of the Gaussian fitting scheme for individual chromatograms and the statistical cross-correlation method for a series of subsequent chromatograms considerably improves and stabilizes quantitative analysis of in-flight chromatographic data. In this case, the detection accuracy of weak and noisy chromatographic signals can be improved by up to 40 %. A particular attention is paid to the in-flight two-standard calibration method. For this method, a special procedure, that allows to evaluate and effectively remove a weak background chromatographic signal associated with residual molecules in the carrier gas N2, is proposed and coded (Chapter 4). The developed approaches and methods are completely automized and, therefore, can be used for processing of in-flight chromatograms of recent and future field campaigns. The main part of the thesis (Chapters 6-8) deals with a two-dimensional quasi-Lagrangian coordinate system ... , based on a long-lived stratospheric trace gas i, and its systematic use for i = N2O in order to describe the structure of a well-developed Antarctic polar vortex, linearization and compactization of the tracer-tracer correlations in the polar vortex core (i.e. the stratospheric dynamics in this area), and the differential ozone losses in the Antarctic polar vortex area. In the coordinate system ... (...-method, Chapter 6), which refers to a well-developed polar vortex, the mixing ratio Âi is the vertical coordinate and ... = .... i is the reference profile in the vortex core) is the meridional coordinate. The quasi-Lagrangian coordinates ... are much more long-lived comparing with the standard quasi-isentropic coordinates, potential temperature ... and equivalent latitude ..e, do not require explicit reference to geographic space, and therefore well-suited for studying the dynamics of the Antarctic polar vortex and the relevant ozone loss processes. By using the introduced coordinate system ... to analyze the well-developed Antarctic vortex investigated in the APE-GAIA campaign, it is shown, in concurrence with the conclusion of A. M. Lee et al. (2001), that the Antarctic vortex area can be described in terms of the well-mixed and well-isolated vortex core, relatively wide vortex boundary region and adjoining surf zone. In this case, the reference profile ... i , which is compact in a well-developed and isolated polar vortex core [J. B. Greenblatt et al. (2002)], can be found by combining airborne (and/or balloon) data with high-altitude satellite measurements. A criterion, which uses the local in-situ measurements of Âi = Âi(£) and attributes the inner vortex edge to a rapid change (±-step) in the meridional pro¯le of the mixing ratio..., is developed in Chapter 6 to determine the (Antarctic) inner vortex edge. In turn, the outer vortex edge of a well-developed Antarctic vortex is proposed to attribute to the position of a local maximum of ...H2O in the polar vortex area. For a well-developed Antarctic vortex, the ...-parametrization of tracer-tracer correlations allows to distinguish the tracer-tracer inter-relationships in the vortex core, vortex boundary region and surf zone (Chapter 7). This is clearly illustrated by analyzing the tracer-tracer relationships Âi ¡ ÂN2O obtained from the in-situ data of the APE-GAIA campaign for i = CFCl3 (CFC-11), CF2Cl2 (CFC-12), CBrClF2 (H-1211) and SF6. The solitary anomalous points in the ...CFC11 ¡ ÂN2O correlation, observed in the Antarctic vortex core during the APE-GAIA and ASHOE campaigns, are interpreted in terms of small-scale localized differential descent. As detailed in Chapter 8, the quasi-Lagrangian coordinate system fÂN2O; ¢ÂN2Og is an effective tool for evaluation of the differential ozone losses in the polar vortex area. With this purpose, a two-parametric reference function ...O3 = F(...), which characterizes the unperturbed O3 distribution in the early winter polar vortex area, is introduced to separate and quantify in terms of the meridional coordinate ...2O the differential ozone losses in the vortex core and vortex boundary region. The method is applied to analyze the ozone depletion in the Antarctic stratosphere during the austral spring 1999 (APE-GAIA campaign). In Chapter 9, the main results of the thesis are summarized.
Physical soil properties feature high spatial variabilities which are known to affect geophysical measurements. However, these variations are not considered in most cases. The challenging task is to quantify the influence of soil heterogeneities on geophysical data. This question is analysed for DC resistivity and GPR measurements which are frequently used for near-surface explorations. To determine the pattern of electric soil properties in situ with the required high spatial resolution, geophysical measuring techniques are methodically enhanced. High-resolution dipole-dipole resistivity measurements are used to determine the electric conductivity distribution of the topsoil. Due to the small electrode separations, the actual electrode geometry has to be considered and an analytic expression for geometric factors is derived instead of assuming point electrodes. Two methods are used to determine soil permittivity with GPR:(i) the coefficient of reflection at the interface air-soil is measured with an air-launched horn antenna, (ii) the velocity of the groundwave is measured with a new setup using two receiver antennas enhancing the lateral resolution from in the best case 0.5 m for standard techniques to approximately 0.1 m with the new technique. With the optimised measuring techniques, the electric properties of sandy soils are determined in the field. Conductivity and permittivity show high spatial variability with correlation lengths of a few decimetres. Geostatistical simulation techniques are used to generate synthetic random media featuring the same statistical properties as in the field. FD calculations are carried out with this media to provide realistic synthetic data of resistivity and GPR measurements. Conductivity variations as determined in the field generate significant variations of simulated Schlumberger sounding curves resulting in uncertainties of the inverted models. Even in pedologically homogeneous sandy soil, moisture pattern and resulting permittivity variations cause strong GPR diffractions as demonstated by FD calculations. This influences the detectability of small objects such as e.g. landmines or of large reflectors as e.g. the groundwater table. Conductivity variations as typical for soils showed to have a minor effect on GPR measurements than variations of permittivity. In summary, geostatistical analysis and simulation provide a powerful tool to simulate geophysical measurements under field conditions including soil heterogeneity which can be used to quantify the uncertainty of field measurements by geologic noise.
Vor dem Hintergrund der gestiegenen medizinischen und sozioökonomischen Relevanz von Akupunktur und Laserakupunktur werden im Rahmen der vorliegenden Arbeit Anwendungsfelder und Forschungsperspektiven in der präventiven und rehabilitativen Sportmedizin skizziert. Hierzu zählen insbesondere die Therapie von Sportverletzungen und Sportschäden, die Steigerung der körperlichen Leistungsfähigkeit, die Unterstützung und Förderung der Regeneration sowie die Vorbeugung von belastungsinduziertem Asthma. Aufbauend auf den aktuellen Forschungsstand werden eigene Originalarbeiten vorgestellt, die sich mit der Evaluation spezifischer Effekte der Akupunktur und Laserakupunktur befassen.
Für pädiatrische Patienten mit Hochrisikoleukämien ist die Donor-Lymphozyten-Infusion eine etablierte Therapieform, um nach Stammzelltransplantation die Immunrekonstitution zu verbessern oder ein beginnendes Rezidiv abzuwehren. Als schwerwiegende Nebenwirkung kann jedoch eine „Graft-versus-host“-Krankeit (graft-versus-host disease; GVHD) auftreten, bei der die T-Zellen gesundes Gewebe angreifen. In ersten klinischen Studien mit veränderten, Suizidgen tragenden Donor-Lymphozyten konnte durch die rechtzeitige Gabe eines Suizidinduktors die GVHD unterbunden werden. Die genetische Manipulation der T-Zellen führte jedoch zu einem Funktionsverlust, der vermutlich auf die zur Transduktion notwendige Aktivierung zurückzuführen ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Aktivierungsprotokolle mit Beads-gekoppelten oder löslichen Antikörpern hinsichtlich der Expansionsrate und dem Einfluss auf die Funktionalität der T-Zellen näher untersucht. Dazu wurden primäre humane T-Zellen im klinischen oder im Labormaßstab immunomagnetisch über eine CD3 sowie CD4/CD8 Selektion oder mittels der RosetteSep-Prozedur auf > 96% angereichert und anschließend expandiert. Die Transduktion erfolgte an den Tagen 3 und 4 mit einem „GMP-grade“ CD34/HSV-TK Vektor. Zur Aktivierung wurden zum einen lösliche CD3/CD28 Antikörper und zum anderen zellgroße Kügelchen - sogenannte Beads – verwendet. Die Beads wurden mit CD3/CD28 Antikörper und fakultativ mit CD2 beladen. Die beladenen Beads imitieren in der Zellkultur eine Antigen präsentierende Zelle und sollten damit eine möglichst physiologische Situation schaffen. Außerdem wurden unterschiedliche IL-2 Konzentrationen zugesetzt (20-1000 U/ml), um einen potentiellen IL-2 Effekt auf die T-Zellen zu untersuchen. Die Aktivierung mit den löslichen Antikörpern führte zu einer IL-2 abhängigen Proliferation der T-Zellen über 14 Tage mit maximaler Expansionsrate (47fach) bei 1000 U/ml IL-2. Die Expansion mit Beads-gekoppelten Antikörpern war ebenfalls IL-2 abhängig, beschränkte sich jedoch auf die erste Woche und erreichte eine maximale Expansionsrate von 3-4. In der zweiten Woche fiel die Zellzahl ab. Zusammenfassend sind für eine starke Expansion der T-Zellen eine hohe IL-2 Konzentration, aber auch die löslichen Antikörper per se verantwortlich. Gleichzeitig konnte demonstriert werden, dass es große individuelle Unterschiede in der T-Zellexpansion verschiedener Spender gibt. Der Einfluss der Aktivierung auf die Veränderung der T-Zellsubpopulationen wurde mit Hilfe von multiparametrischen Analysen am Durchflusszytometer untersucht. Hohe IL-2 Konzentrationen (100 und 1000 U/ml) sowie die Verwendung löslicher Antikörper führten zu einer starken Zunahme der CD8+ T-Zellen. Der CD4/CD8 Quotient blieb lediglich unter Stimulierung mit den Beads-gekoppelten Antikörpern in Verbindung mit 20 U/ml IL-2 konstant. Mit allen Aktivierungsprotokollen ergab sich für den immunologischen Phänotyp eine Verschiebung vom naiven zum Gedächtniszelltyp. Die Proliferation CMV-spezifischer T-Zellen konnte mit allen Aktivierungsprotokollen erreicht werden und korrelierte mit der Expansionsrate der gesamten CD3+ T-Zellen. Die Zytokinausschüttung war verringert bei den T-Zellen, die mit den löslichen Antikörpern stimuliert wurden. Eine verminderte Zytokinproduktion könnte auf einen Verlust der Funktionalität der T-Zellen hindeuten. Von besonderer Bedeutung ist, dass die Stimulierung über Beads-gekoppelte Antikörper zu einer gleichmäßigen Transduktion von CD4+ und CD8+ T-Zellen führte. Im Gegensatz dazu hatte die Aktivierung mit löslichen Antikörpern zur Folge, dass hauptsächlich CD8+ T-Zellen transduziert wurden. Für eine kompetente Immunantwort im Rahmen einer DLI erscheint jedoch eine physiologische Zusammensetzung der CD4+ und CD8+ T-Zellen äußerst wichtig. Residuale Stammzellen könnten potentiell co-transduziert werden. Um diese Gefahr abschätzen zu können, wurden ficollisierte PBSC analog der T-Zellen expandiert. Unter allen T-Zellaktivierungsprotokollen blieben die CD34+ Stammzellen in den ersten Tagen der Kultur vital und durchflusszytometrisch nachweisbar. Die Stammzellen expandierten sogar geringfügig und waren damit potentiell transduzierbar - mit der Gefahr einer klonalen Entartung durch Insertionsmutagenese. Dies deutet auf die Wichtigkeit einer T-Zellselektion zur Manipulation von DLI hin, um residuale Stammzellen zu entfernen. Die Suizidstrategie ist eine vielversprechende Möglichkeit zur Kontrolle der GVHD im Rahmen einer DLI. Voraussetzung ist aber, dass die infundierten Zellen auch immunologisch kompetent bleiben und einen GvL-Effekt bewirken. Die Aktivierung mit Beads-gekoppelten Antikörpern scheint zum Erhalt der Immunkompetenz den löslichen Antikörpern überlegen zu sein.
Der menschliche Körper ist permanent mechanischen Reizen in Form von Dehnung oder Druck ausgesetzt. Diese Stimuli können vielfältige zelluläre Prozesse induzieren. Dehnungsreize erhöhen die Zellproliferation in allen bisher untersuchten Zellspezies, inklusive Endothel- und Epithelzellen. Im Gegensatz dazu scheinen mechanische Druckbelastungen zu zellulärer Differenzierung zu führen. Die Relevanz dieser mechanischen Reize für die Physiologie und Pathophysiologie ist für viele Organe nachgewiesen worden. Jedoch gibt es bislang keine hinreichenden Untersuchungen, die belegen, dass mechanische Reize ebenso eine Rolle bei der Tumorproliferation spielen könnten. Im Fokus dieser Promotionsarbeit steht die Fragestellung, inwieweit die mechanischen Verhältnisse in Tumoren in einem funktionellen Zusammenhang mit der Tumorgenese stehen. Zur Klärung dieser Fragestellung ist ein Xenograft-Tumormodell etabliert worden, das es erlaubt in vivo-Untersuchungen an humanen epithelialen Tumoren durchzuführen. Um Erfahrungen aus vorherigen in vitro-Versuchen nutzen zu können, wurden humane epitheliale A431-Vulvakarzinom- und humane epitheliale A549-Lungenkarzinomzellen für das Tumormodell verwendet. Mit diesem Modell konnte erstmals in vivo gezeigt werden, dass solide humane Tumore einer permanenten mechanischen Dehnung ausgesetzt sind, die direkten Einfluss auf die Proliferation der Tumorzellen hat. Als zentraler Auslöser für die mechanische Dehnung der Tumorzellen konnte der erhöhte tumorinterstitielle Flüssigkeitsdruck (TIFP) identifiziert werden. Der Einfluss der mechanischen Dehnung auf die Proliferation der Tumorzellen wurde anhand der Phosphorylierung der extracellular regulated kinase 1/2 (ERK1/2) bzw. der Ki-67 Expression gezeigt. Durch die Punktion bzw. Drainage von Tumoren konnte der TIFP experimentell abgesenkt werden und in Folge dessen kam es zu einer reduzierten mechanischen Dehnung der Tumorzellen. In allen Versuchen war die Abnahme der mechanischen Dehnung von einer verringerten Phosphorylierung der ERK1/2 bzw. reduzierten Expression des Proliferationsmarkers Ki-67 begleitet. Der TIFP induziert aber nicht nur mechanische Dehnungsreize, sondern er stellt darüber hinaus eine physikalische Barriere für den effizienten Transport von Therapeutika in den Tumor dar. Der gegenüber dem umliegenden Gewebe erhöhte TIFP behindert den interstitiellen Transport und die Aufnahme von Molekülen aus dem Gefäßsystem in die Tumorzellen. Die Etablierung einer neuen experimentellen Technik zur Senkung des TIFP, durch i.v. Injektion von konzentriertem humanem Serumalbumin, führte zu einer signifikanten Verbesserung der Aufnahme und einer Verlängerung der Verweildauer von Makromolekülen/Therapeutika innerhalb von Tumoren. Des Weiteren konnten immunhistochemische Färbungen gegen lymphspezifische Marker in Gewebeproben von A431 und A549 Tumoren keinen direkten Zusammenhang zwischen Lympharchitektur und TIFP zeigen. Dies bedeutet, dass in den untersuchten Tumoren die Ausbildung des hohen TIFP eher auf eine erhöhte Rigidität der extrazellulären Matrix bzw. die hohe Permeabilität des tumorversorgenden vaskulären Gefäßsystems zurückzuführen ist. Parallel zu den in vivo-Untersuchungen durchgeführte in vitro-Versuche konnten Proteine identifizieren, die an der druckinduzierten p38 Signaltransduktionskaskade beteiligt sind. Diese Ergebnisse untermauern die bisherigen in vitro-Daten bzgl. der differentiellen Reaktionen von Zellen auf mechanische Druckreize. Abschließend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse der in vivo-Versuche die Bedeutung und die klinische Relevanz des biophysikalischen Parameters TIFP hervorgehoben haben. Die Zukunft der Krebstherapie liegt nicht alleine in der Entwicklung neuer hochspezifischer Wirkstoffe, sondern auch in der Lösung des Transports der Wirkstoffe an den Zielort. Die vorgestellten Ergebnisse dieser Promotionsarbeit weisen eine beträchtliche klinische Relevanz auf, denn sie zeigen, dass die experimentelle Absenkung des TIFP zu einer verbesserten Aufnahme von Therapeutika beiträgt. Gleichzeitig wird die Proliferationsrate von Tumorzellen durch die reduzierte mechanische Dehnung signifikant verringert. Dieser Doppeleffekt könnte zu einer effizienteren Krebstherapie führen in Folge derer es zu einer verlängerten Überlebensrate sowie einer Verbesserung der Lebensqualität von Krebspatienten kommen könnte.
Background: False aneurysms at the puncture site develop in up to 8 % after catheter procedures. They can be treated surgically or by ultrasound guided manual compression. A new method is to inject thrombin into the aneurysm under ultrasound guidance. We evaluated safety and efficacy of this approach in a multicenter registry. Methods: In 595 consecutive patients (age: 31-94 years, median 70) a pseudoaneurysm (593 femoral arteries, 2 brachial arteries) was diagnosed 0 to 250 days (median 3 days) after a catheter procedure. The diameter of the aneurysm ranged from 0.5 x 0.5 x 0.5 (L x W x D) to 8x11x16 cm (median 2 x 2 x1.6 cm). 20 U to 4000 U of thrombin solution (median 400 U) were injected percutaneously into the aneurysm under ultrasound guidance. Results: The procedure was technically successful in 587/595 (99%) patients. The aneurysms were thrombosed after the first injection in 531 patients (89 %). Thirty-eight (6%) patients needed a second injection and 8 (1%) patients a third injection because residual flow in the aneurysm was visible at follow-up. In 4 additional patients (0.7%) the thrombosis of the aneurysms was delayed and occurred only after 24 hours to 7 days. 6 (1%) patients surgery was performed after successful closure of the aneurysm to remove the resulting haematoma. The overall technical success rate was 99% (587/595) and clinical success was achieved in 572/595 (96%) patients. Eight (1%) other patients underwent surgery due to thrombin injection failure. Complications occurred in 9 patients (1.5%): Intravascular thrombus formation (n=3), deep venous thrombosis (n=3), pulmonary embolism due to deep venous thrombosis (n=1), transient paresthesia in the leg during injection (n=3). Conclusion: Ultrasound guided thrombin injection is a safe, painless, effective and rapid alternative to treat false aneurysms. Complications and recurrent pseudoaneurysms are very rare. It has become the treatment of choice in our institution.
Für Experimente der Atomphysikgruppe der GSI in Darmstadt wird ein Ionenabbremser gebaut, der niederenergetische, extrem hochgeladene Ionen zur Verfügung stellen wird. Die Planungen zu der soganennten HITRAP (highly charged ion's trap) begannen Anfang der neunziger Jahre. Mit dieser Anlage sollen hochgeladene, schwere Ionen auf sehr niedrige, thermische Geschwindigkeiten in zwei Stufen abgebremst und für hochpräzise Massenspektroskopie, Messungen des g-Faktors des gebundenen Elektrons wasserstoffähnlicher Ionen und andere atomphysikalische Experimente zur Verfügung stehen. Diese Deceleratoranlage soll zunächst im Reinjektionskanal hinter dem ESR aufgebaut werden, mit der Möglichkeit, alle Komponenten später beim Ausbau der GSI im Rahmen des FAIR-Projektes in der neu zu errichtenden Anlage für niederenergetische Antiprotonen und Ionen zu verwenden. Die vorliegende Arbeit behandelt die Entwicklung und den Aufbau eines integrierten RFQ-Debuncher-Abbremsbeschleunigers, der einen Teil der HITRAP-Abbremsstrukturen darstellt. Mit diesem wird der Ionenstrahl, vom IH-Abbremsbeschleuniger mit einer Energie von 5oo keV/u kommend auf 6 keV/u abgebremst. Mit dem integrierten Spiralbuncher kann der Strahl in Energie und Energieabweichung an die nachfolgende Kühlerfalle angepasst werden. Es wurden in dieser Arbeit die Grundlagen der Teilchendynamik in einem RFQ-Beschleuniger zum Abbremsen von Teilchenstrahlen erarbeitet und umgesetzt, die zur Auslegung einer solchen Struktur notwendigen Teilchendynamikrechnungen mit RFQSim durchgeführt, geeignete Hf-Strukturen mit dem Simulationsprogramm Microwave Studio entwickelt und untersucht, sowie die thermische Belastung der Strukturen mit dem finite Elementeprogramm ALGOR untersucht. Ein weiterer zentraler Punkt dieser Arbeit ist der Aufbau und die Hf-Abstimmung der RFQ-Struktur, um eine möglichst homogene Feldverteilung entlang der Elektroden zu erreichen. Messungen der Felder im RFQ wurden mit einem Störkondensator, am Debuncher mit einem Störkörper durchgeführt. Nach erfolgreich durchgeführten Vakuumtests am IAP ist die RFQ-Debuncher-Kombination nun bereit für erste Hochleistungstests an der GSI.
Maligne Gliome sind die häufigsten Neoplasien des Zentralen Nervensystems. Sie zählen zu den hypoxischsten Tumoren und entwickeln u.a. durch die Adaption an niedrige Sauerstoffbedingungen Apoptose-resistente Phänotypen. Darüber hinaus zeichnen sie sich durch schnelle Proliferation und ein diffuses, infiltratives Wachstum in das umliegende Neuropil aus, was eine vollständige Tumor-Resektion unmöglich macht. Entsprechend liegt die mediane Überlebenszeit nach der Diagnose trotz chirurgischen Eingriffs bei anaplastischen Astrozytomen (WHO Grad III) zwischen 18 und 20 Monaten und bei Glioblastomen (WHO Grad IV) zwischen 12 und 15 Monaten. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurden 17 Gliomzelllinien in einem in vitro-Anoxiemodell auf ihre Hypoxie-Sensitivität hin untersucht. Dabei wurde eine hohe Variabilität hinsichtlich der Hypoxie-Toleranz festgestellt, sowie die Tendenz zu einer ausgeprägter Anpassung an niedrige Sauerstoffverhältnisse, begleitet von der Fähigkeit, das mitochondriale Membranpotential (delta psi m) aufrecht zu erhalten. Der durch Hypoxie induzierte Zelltod wurde als Caspase-unabhängig und Nekrose-ähnlich charakterisiert. Apoptose wurde hingegen auch in den Hypoxie-sensitiven Zelllinien nach 48 stündigem Sauerstoffentzug nur in sehr geringem Ausmaß beobachtet. Funktionelle Analysen mit den synthetischen BH3-Mimetika HA14-1 und BH3I 2’, die selektiv Bcl-2 bzw. Bcl xL/Bcl-2 inhibieren, lassen darauf schließen, dass die für Gliomzellen typische Bcl-2- und Bcl xL-Überexpression eine Blockade des mitochondrialen Signalwegs verursacht und so entscheidend zur Apoptose-Resistenz der Zellen beiträgt. Der Todesligand TRAIL, der selektiv in Tumorzellen Zelltod aktiviert, ist ein vielversprechender Kandidat für neue Apoptose-induzierende Krebstherapien. Da jedoch einige Krebszelltypen einschließlich maligner Gliome weitgehend gegen TRAIL resistent sind, richtet sich das Interesse verstärkt auf kombinatorische Therapieansätze, die Tumorzellen für TRAIL resensitivieren sollen. Nur zwei von sechs untersuchten Gliomzelllinien reagierten auf die Behandlung mit TRAIL, wobei eine Korrelation zwischen Hypoxie- und TRAIL-Resistenz deutlich wurde und die Hypothese einer ausgeprägten Kreuzresistenz stärkt. Ein Zusammenhang zwischen TRAIL-Sensitivität und TRAIL-Todes- bzw. –Decoy-Rezeptor-Expression konnte indes nicht hergestellt werden. Der Vergleich von konventionellen Therapienansätzen (Gamma-Bestrahlung) mit neuartigen Wirkstoffklassen (BH3-Mimetika und Proteasomeninhibitoren) zeigte, dass Gamma-Bestrahlung lediglich in TRAIL-sensitiven Zellen synergistisch mit TRAIL wirkte, während die BH3-Mimetika den TRAIL-induzierten Zelltod sowohl in TRAIL-sensitiven als auch –resistenten Zellen signifikant erhöhten. Diese Befunde legen nahe, dass die hohen Bcl-2- und Bcl xL-Proteinlevel verschiedene Signalwege hemmen, die an den Mitochondrien konvergieren und dadurch die Apoptose- bzw. Therapie-Resistenz maligner Gliome steigern. Der Einsatz der Proteasomeninhibitoren MG132 und Epoxomicin erwies sich vergleichsweise als am effizientesten: Beide Substanzen vervielfachten p53-unabhängig den TRAIL-induzierten Zelltod in TRAIL-sensitiven Gliomzellen und reaktivierten darüber hinaus potent die TRAIL-induzierte Apoptose in den TRAIL-resistenten Zelllinien. Microarray- und semi-quantitative RT-PCR-Analysen ergaben eine potente transkriptionelle Aktivierung des TRAIL-Rezeptors DR5 und der Stress-induzierten Transkriptionsfaktoren CHOP und c-Jun. Weitere Untersuchungen mit Hilfe von chemischen Inhibitoren und RNA-Interferenz zeigten, dass die CHOP-unabhängige, JNK/c-Jun-Signalwegs-vermittelte Aktivierung von DR5 eine maßgebliche Rolle bei der Proteasomeninhibitor-induzierten Sensitivierung von Gliomzellen für TRAIL spielt. Zusammengenommen legen die vorgelegten Befunde nahe, dass neue Ansätze basierend auf TRAIL oder agonistischen TRAIL-Rezeptor-Antikörpern in Kombination mit Proteasomeninhibitoren oder BH3-Mimetika vielversprechende Strategien zur Überwindung der Therapieresistenz maligner Gliome darstellen.
The chemiosmotic theory suggested by Peter Mitchell (Mitchell, 1961, Nature 191:144-148; see Mitchell, 1979, Science 206:1148-1159 for review) postulated that the energy released upon the oxidation of electron donor substrates is transiently stored as electrochemical proton potential, delta-p across energy-transducing membranes, which acts then as the driving force for the ATP synthesis. Membrane protein complexes can both generate and utilise a transmembrane electrochemical proton potential, either by transmembrane proton transfer or by transmembrane electron transfer coupled to protolytic reactions on opposite sides of the membrane. The dihaem-containing membrane protein complex quinol:fumarate reductase (QFR) from the anaerobic epsilon-proteobacterium Wolinella succinogenes apparently combines both of these mechanisms (Haas et al, 2005, Biochemistry 44:13949-13961; Lancaster et al, 2005, PNAS 102:18860–18865; Mileni et al, 2005, Biochemistry 44:16718-16728; Madej et al, 2006, EMBO J 25:4963-4970). QFR is the terminal enzyme of anaerobic fumarate respiration that allows bacteria to use fumarate as the terminal electron acceptor (Kröger, 1978, Biochim Biophys Acta 505:129-45; Lancaster, 2004, In: Respiration in Archaea and Bacteria Volume 1:57-85). QFR couples the two-electron reduction of fumarate to succinate to the two-electron oxidation of quinol to quinone. QFR contains two haem b groups bound by the transmembrane subunit C, which are termed the ‘proximal haem’, bP, and the ‘distal haem’, bD, according to the relative proximity to the hydrophilic subunits A and B (Lancaster et al, 1999, Nature 402:377-85). The two-electron transfer via the two haem groups has been proposed (Lancaster, 2002, Biochimica et Biophysica Acta 1565:215-231) and demonstrated (Madej et al, 2006, EMBO J 25:4963-4970) to be coupled to a compensatory, parallel transfer of two protons via a transmembrane proton transfer pathway. The two most prominent constituents of the proposed pathway were suggested to be the haem bD ring C propionate and the side chain of amino-acid residue Glu C180, after which the proton transfer pathway was named the ‘E-pathway’ (Lancaster, 2002, Biochimica et Biophysica Acta 565:215-231). The essential role of Glu C180 was supported by site-directed mutagenesis and structural and functional characterization of the enzyme E180Q, where the Glu C180 was replaced with a Gln residue (Lancaster et al, 2005, PNAS 102:18860–18865). Moreover, multiconformer continuum electrostatics (MCCE) calculations (Haas and Lancaster 2004, Biophys J 87:4298-4315) and Fouriertransformed infrared (FTIR) spectroscopy experiments (Haas et al, 2005, Biochemistry 44:13949-13961) indicated the Glu C180 side chain to undergo a combination of a conformational change and protonation upon haem reduction. The contribution of haem bD propionate is less clear, however, a combination of 13C labelling of the haem propionates with redox-induced FTIR experiments (Mileni et al, 2005, Biochemistry 44:16718-16728) and MCCE calculations (Haas and Lancaster, 2004, Biophys J 87:4298-4315) support a change in protonation, possibly accompanied by a change in environment upon haem reduction. These experiments and their results strongly support the existence of the ‘E-pathway’ which is transiently open during the reduction of the haem groups and blocked in the oxidized state of the enzyme (Lancaster, 2002b, Biochim Biophys Acta 1565:215-231). All available crystal structures of the QFR, however, are those of the oxidized enzyme. Therefore, it is advantageous to perform simulations of various redox states of the enzyme to determine for instance, how the side-chain of Glu C180 and haem bD ring C propionate behave upon changes of the redox states of the haem groups and why is the ‘E-pathway’ blocked in the oxidized state of the enzyme. Although the distal haem ring C propionate and Glu C180 were identified as the most prominent components of the proton transfer pathway, it was not clear, on the basis of the structure, how proton transfer could occur between them. In addition, two constituents are not enough to span the membrane region and the additional participants in the proton transfer pathway must be identified. Since an atomistic investigation of proton transfer in this system is not yet possible experimentally, I used available theoretical methods such as classical molecular dynamics (MD) simulation (Alder and Wainwright, 1959, J Phys Chem 31:459-466; McCammon et al, 1977, Nature 267:585-590) and Q-HOP molecular dynamics (Q-HOP MD) simulation (Lill and Helms, 2001, J Chem Phys 115:7993-8005) to investigate the postulated mechanism of electron coupled proton transfer in QFR. MD simulations allowed us to move away from static difference pictures obtained from FTIR experiments and MCCE calculations. The advantage of the MD simulations over the experiments and the simulations performed so far is that the time-dependent properties could now be analyzed. The behaviour of various residues and their side-chains and any environmental changes may be directly observed during MD simulations. Although classical MD simulations cannot be used to study proton transfer reactions, they can provide information on formation of configurations that would allow either direct proton transfer between donor and acceptor residues or indirect proton transfer mediated by water molecules. To avoid the static protonation of residues which is inherent in classical MD simulations, Q-HOP MD simulations were performed which explicitly describe proton transfer reactions by allowing the change of the protonation state of residues ‘on the fly’. The structures obtained after classical molecular dynamics simulations ....
Die Erstellung und Auswertung der Frankfurter HIV-Resistenzdatenbank dient der Analyse von Prävalenzen von Primär- und Sekundärmutationen im HIV-Genom für die spezifischen antiretroviralen Medikamente sowie der Untersuchung von Korrelationen von Punktmutationen in der Protease mit klinischen Parametern. Die hier vorgestellte allgemeine Datenbankauswertung bestätigte die in der Literatur beschriebene nur geringe Mutationsprävalenz in der Protease, sowohl im Bereich der Primärmutationen (AS-Pos. 30, 46, 48, 50, 82, 84 und 90) also auch der Sekundärmutationen. Ebenso zeigte sich, dass die Ausbildung von Mutationen unter Selektionsdruck durch eine antiretrovirale Therapie deutlich über der von ART-naiven Patienten liegt. Die Untersuchung von Patienten mit niedriger Virusbeladung (Low-level-Patienten) konnte zeigen, dass auch bei Sequenzierungen mit geringem Virusmaterial aussagefähige Ergebnisse zu erzielen sind. Die Mutationen passten sowohl zu den entsprechenden Vortherapien als auch zu den klinischen Parametern, wie Viruslast und CD4+-Zellzahl. Das Verfahren der Genotypisierung stellt daher auch für Patienten mit einer niedrigen Viruslast (< 1000 Kopien/ml Blut) eine geeignete Methode dar, um Fragestellungen nach Mutationen, Therapieverläufen und Resistenzentwicklungen zu beantworten. Die Analyse von Patientenverläufen aus dem Low-level-Kollektiv bestätigte die reziproke Korrelation zwischen Viruslast und CD4+-Zellzahl. Auch hier spiegelte sich in den Ergebnissen der Genotypisierungen der jeweilige klinische Verlauf wider. Die Auswertung von Mutationsveränderungen unter Therapiewechseln bzw. ARTPausen lässt den Erfolg von Therapiepausen zur Rückbildung von Mutationen kritisch betrachten. Bei dem Frankfurter Kollektiv kam es bei allen Patienten nach erneutem Therapiebeginn zu einer Reselektionierung der ursprünglichen Mutationen und war mit einem erneuten Therapieversagen verbunden. Die STI konnte hier zu keiner langfristigen Reduktion der Resistenzen führen. Ebenso wurde deutlich, dass auch bei einem bereits vielfach mutierten HIV-Genom zusätzliche Mutationen selektioniert werden können. Insgesamt gesehen zeigen die Auswertungen aller hier zugrunde liegenden Daten, dass die Genotypisierung eine unverzichtbare diagnostische Methode darstellt, ohne die für den Patienten eine effiziente und optimale medikamentöse Therapie nicht gewährleistet werden kann.
Seit der Einführung der antiretroviralen Therapie (HAART) ist die Mortalität von HIV-Infizierten in der westlichen Welt zwar deutlich zurückgegangen, die HIV-Infektion ist jedoch bis heute nicht heilbar. Die derzeitige Therapie unterdrückt zwar sehr effektiv die Virusreplikation, kann aber nicht das Virus vollständig eliminieren und somit die Infizierten nicht heilen. Die daher notwendige Langzeitbehandlung wird wiederum durch die relativ hohe Toxizität der Medikamente und durch das Auftreten resistenter Virusvarianten limitiert. Die Suche nach neuen Therapienansätzen und Wirkstoffklassen ist daher immer noch von größter Wichtigkeit. Die HIV-Gentherapie stellt neben der konventionellen antiretroviralen Therapie eine mögliche zusätzliche Behandlungsform dar. Die Arbeitsgruppe von Laer hat am Georg-Speyer-Haus retrovirale Vektoren entwickelt, die membrangebundene (ma) HIV-Eintrittsinhibitoren, sog. C Pepitde, kodieren. Das durch den Prototyp-Vektor M87 kodierte maC36-Peptid zeigte eine moderate Inhibition des Viruseintritts. In einem Optimierungsprozess wurde der Vektor M87o generiert. M87o kodiert im Vergleich zu M87 ein wirksameres maC-Peptid (maC46) und weist auch eine wesentlich höhere Expressionsstärke und dadurch eine stärkere inhibitorische Wirkung als der Prototypvektor auf. Ziel dieser Arbeit war es zunächst, HIV Varianten, die resistent gegenüber dem M87o–Genprodukt maC46 sind, in vitro zu generieren und anschließend den Resistenzmechanismus aufzuklären. In einer Kollaboration mit der Gruppe um M. Dittmar aus Heidelberg war durch Passage des HIV 1 Wildtyp (wt) Ba L-Isolats auf M87-transduzierten Zellen bereits das maC36-resistente Virusisolat Ba L_sel_MD generiert worden. Ba L_sel_MD wies zwei Resistenzmutationen in der gp41-Untereinheit des Hüllproteins auf: I556V (heptad repeat 1 Region) und N634K (heptad repeat 2 Region). Für die Mutation 634K war dabei gezeigt worden, dass sie auch zu einer leichten Reduktion der maC46-Sensibilität führt. In der vorliegenden Arbeit diente Ba L_sel_MD als Ausgang für die Selektion einer Virusvariante mit deutlich verminderter Sensibilität gegenüber maC46. Hierfür wurde Ba L_sel_MD über 149 Tage lang auf Zellen mit steigender maC46 Expressionshöhe passagiert und so das Isolat Ba L_FH1 generiert. Das Hüllprotein des selektierten Isolats war ausreichend, um einen maC46-resesistenten Phänotyp hervorzurufen. Das selektierte Hüllprotein war im Vergleich zu dem Ausgangsisolat ca. fünf- bis zehnfach weniger empfindlich gegenüber maC46. Die Sequenzierung des Ba L_FH1 Hüllproteingens zeigte, dass die Aminosäureausprägung an Position 634 des Ausgangsisolats (BaLsel_MD) konserviert worden war, während die Position 556 zur Wildtypsequenz revertiert war. Darüber hinaus wurden drei Mutationen in der gp120-Untereinheit des Hüllproteins (V2-Region (I187T), V3-Region (N305Y), C3-Region (E352K)), sowie eine Mutation in der heptad repeat 1 Region (A579T) der gp41-Untereinheit identifiziert. Für die reduzierte maC46-Empfindlichkeit waren in erster Linie die Mutation N305Y in der V3 Region und die Rückmutation 556I in Zusammenwirkung mit der bereits vorhandenen Mutation 634K verantwortlich. Die verbleibenden Mutationen hatten allenfalls modulierende Wirkung auf die maC46-Sensibilität. Die Resistenz ist vermutlich auf die beobachtete erhöhte Fusionsgeschwindigkeit des Hüllproteins von Ba L_FH1 im Vergleich zum Ausgangsisolat zurückzuführen, die interessanterweise mit einer reduzierten Corezeptoraffinität verknüpft war. Die erhöhte Fusionsgeschwindigkeit verkürzt das zeitliche Fenster, in welchem maC46 an seine Zielstruktur innerhalb des gp41 binden kann. Es scheinen zwei unterschiedliche Phasen des Eintrittprozesses durch die Mutationen verändert worden zu sein. Die Mutation in der V3-Region (N305Y) der gp120-Untereinheit beschleunigt wohl eine frühe Phase. Vermutlich ermöglicht diese Mutation, dass bestimmte Übergangszustände nach der Corezeptorbindung schneller durchlaufen werden können, indem die gp120/Corezeptorbindung destabilisiert wird. Die Rückmutation 556I beschleunigt wahrscheinlich in Zusammenspiel mit der bereits vorhandenen Mutation 634K die Ausbildung des 6 Helixbündels. Diese beiden Mutationen wirken somit auf eine späte Phase der Fusion. Obwohl bekannt ist, dass natürliche Variationen in gp120 die Sensibilität des HIV-Hüllproteins gegenüber C-Peptiden beeinflussen, konnte in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass solche Mutationen auch in vitro selektiert werden, um eine C-Peptidresistenz herbeizuführen.
Tumormarker dienen im Allgemeinen der Verlaufskontrolle bei der Behandlung von Malignomen, unabhängig, ob die Therapie chirurgischen, radiologischen oder chemotherapeutischen Ursprungs ist. Als Ausnahme wäre das PSA zu nennen, welches auch als Screeningparameter Verwendung findet. Die etablierten Tumormarker, die in der Therapie des Mammakarzinoms Verwendung finden, sind unter anderem MCA und CA 15-3. Hierbei handelt es sich ebenso wie bei dem in der vorliegenden Arbeit untersuchten Tumormarker TAG 12 um ein Glykoprotein. Die diagnostische Sensitivität der beiden etablierten Marker beträgt zwischen 50 und 59%, wobei CA 15-3 nur in Kombination mit CEA, ebenfalls ein Glykoprotein, diesen Wert erreicht. TAG 12 dient der Verlaufskontrolle in der Therapie des Mammakarzinoms, als Untersuchungsmaterial wird Serum verwendet. Mittels eines ELISA-Tests, sowie eines Spektralphotometers, erfolgte die Berechnung der Sensitivität, der Spezifität, der Prävalenz, des positiven prädiktiven Wertes und des negativ prädiktiven Wertes. Im Verlauf der durchgeführten Studie stellte sich heraus, dass verschiedene Lebererkrankungen, maligner und benigner Genese, einen Einfluss auf die Höhe des Markerwertes haben, es zeigte sich falschpositive Werte. Dieses Phänomen ist allerdings bei diversen anderen Tumormarkern ebenfalls zu beobachten. Es konnte bei TAG 12 eine Sensitivität von 67% nachgewiesen werden, womit sich der neue Marker mit den oben genannten bereits etablierten Markern durchaus messen kann.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Gallensäure UDC, CDC und LC auf die Aktivität der ADH untersucht. Dabei wurden einmal die freie ADH und die in Liposomen eingebaute ADH verwendet. Die Liposomen besaßen eine unterschiedliche Lipidzusammensetzung, die sich an der Hepatozytenmembran orientierte. Des Weiteren wurde der Einfluss des bei der Oxidation von Äthanol entstehenden toxischen Produktes Acetaldehyd auf die ADHAktivität untersucht. Die ADH-Aktivität wurde nach Messung des entstehenden NADH im Photometer bei 340 nm berechnet. Es konnte gezeigt werden, dass die Geschwindigkeit der Äthanoloxidation mit der freien ADH bis zu einer Äthanolkonzentration von 20 mM gesteigert werden konnte. Bei 40 mM Äthanol war keine weitere ADH-Aktivitätszunahme mehr zu verzeichnen. Die Enzymmoleküle waren mit Substrat gesättigt. Wurde die ADH jedoch in Liposomen, unabhängig von ihrer Zusammensetzung eingeschlossen, dann konnte eine Aktivitätssteigerung bis 40 mM Äthanol beobachtet werden. Die Ursache des Effektes muss an anderer Stelle geklärt werden. Die Grundaktivität des Enzyms bei einer Äthanolkonzentration von 20 mM schwankte in den einzelnen Versuchen zwischen 20,40 bis 140,60 U · l-1. Die Ursache ist einerseits der unterschiedliche Proteingehalt, andererseits eine mögliche Instabilität des Hefeenzyms an sich. Wird anstelle des Substrates Äthanol das eigentliche Produkt der Oxidationsreaktion Acetaldehyd eingesetzt, dann lässt sich ein NADH-Anstieg im Photometer messen. Die ADH besitzt somit auch eine Aldehyddehydrogenase-Aktivität, die zwar im Gegensatz zu der Alkoholdehydrogenase-Aktivität schwächer ist, aber dennoch das Aldehyd in Gegenwart von NAD+ zu Essigsäure und NADH umsetzt. Auffällig war dies ab 20 mM Acetaldehydkonzentration in den Versuchen mit der freien ADH und bereits ab 5 mM Acetaldehyd mit der liposomal rekonstituierten ADH. Die Reaktion mit steigender Konzentration von Acetaldehyd und Zugabe von 20 mM Äthanol ergab einen Abfall der ADH-Aktivität. Äthanol hemmt Acetaldehyd nicht kompetitiv, so dass Äthanol langsamer umgesetzt wird. Auch eine kompetitive Hemmung von Acetaldehyd gegenüber Äthanol, bei der es zu einer direkten Konkurrenz um das aktive Zentrum des Enzyms kommt, ist denkbar. Eine Beeinflussung der Enzymaktivität durch die hydrophilen Gallensäuren UDC und CDC konnte in den vorliegenden Untersuchungen nicht erbracht werden. Dadurch konnte auch nicht die Wirkung der Gallensäuren auf die als Modellmembranen fungierenden Liposomen gezeigt werden. Allein die hydrophobe Gallensäure LC inhibierte signifikant die Enzymaktivität. Jedoch zeigte sich dabei kein Unterschied zwischen der Reaktion der freien ADH mit Äthanol und LC und der Reaktion der in die Liposomen eingebauten ADH mit Äthanol und LC. Die Inhibierung kann somit nicht auf die Modellmembran zurückgeführt werden. Sie müsste dementsprechend mit der direkten Interaktion der LC mit dem Enzym zusammenhängen. Der Beweis dafür kann mit dieser Arbeit nicht erbracht werden. Der hepatoprotektive Effekt der hydrophilen Gallensäuren, insbesondere der UDC, beeinflusst die toxische Wirkung des Äthanols und der Produkte der Äthanoloxidation nicht in dem Maße, dass eine therapeutische Konsequenz bei Patienten mit alkoholischen Hepatopathien, ähnlich der Gallensäurentherapie bei Patienten mit primär biliärer Zirrhose, gerechtfertigt wäre.
Der Mangel von Faktor VIII (FVIII) führt zur häufigsten Gerinnungsstörung, der Hämophilie A. Die rekombinante Expression von FVIII für gentherapeutische Ansätze oder zur Herstellung von FVIII ist zwei bis drei Größenordnungen niedriger verglichen mit anderen Proteinen vergleichbarer Größe. Die Ursachen für die geringe Expression liegen zum großen Teil an der ineffizienten Transkription und dem ineffizientem intrazellulären Transport. (1) Im Rahmen der Untersuchung der FVIII-Sekretion, konnte durch Verwendung von FVIII-GFP Fusionsproteinen zum ersten Mal gezeigt werden, wie FVIII in lebenden Zellen transportiert wird. Außerdem wurde anhand von vergleichenden Immunfluoreszensfärbungen, FVIII-Messungen und Westernblotanalysen demonstriert, dass weder bei der B-Domäne deletierten noch bei der Volllängenvariante signifikante Unterschiede zwischen den GFP-fusionierten und Wildtyp-FVIII-Varianten messbar waren. Offensichtlich wird die Funktionalität von FVIII durch die C-terminal fusionierte GFP-Domäne nicht eingeschränkt. In ersten Lebendzellanalysen konnte gezeigt werden, dass sich FVIII in primären Zellen und Zelllinien hauptsächlich im ER befindet und eine für lumenale ER-Proteine charakteristischen Mobilität aufweist. Beim frühen sekretorischen Transport zeigte sich bei Temperaturblock-Experimenten eine verlängerte Dauer der Akkumulation in ER-Exit-Sites und eine vergleichsweise niedrige Frequenz von ER-Golgi-Bewegungen. Es konnte zum ersten Mal der Nachweis von FVIII-Transport durch vesikuläre tubuläre Cluster erbracht werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der möglicherweise durch Faltungsprobleme blockierte Austritt aus dem ER das Hauptproblem des ineffizienten FVIII-Transports zu sein scheint und weniger der intrazelluläre Transport an sich. Mittels siRNA-Silencing wurde außerdem die überwiegende Beteiligung von COPI am intrazellulären Transport von FVIII deutlich, dessen Herunterregulierung zu einer 78 prozentigen Reduktion der FVIII-Sekretion im Gegensatz zu 32 Prozent bei COPII führte. Dagegen konnte durch Herunterregulierung der Expression der p24-Cargo-Rezeptor Familienmitglieder p24 und p26 und der Clathrin Adapterproteine µ- und -Adaptin bzw. durch physiologischen Knock-out im Falle von ER-Exit-Rezeptor MCFD2 kein Einfluß auf die FVIII-Sekretion festgestellt werden. (2) Als Alternative zu dem ineffizienten FVIII-Expressionsystem in unphysiologischen Zelllinien, bieten primäre Endothelzellen den Vorteil einer hocheffizienten FVIII-Sekretion. Zur Verwendung bei der rekombinanten Produktion benötigt man allerdings eine kontinuierlich wachsende gut charakterisierte Zelllinie. Zur Immortalisierung wurden aus Nabelschnurblut gewonnene Endothelprogenitorzellen mit der aktiven Untereinheit der humanen Telomerase (hTERT) transduziert. Trotz erfolgreicher Transduktion und langfristiger Expression von hTERT, welche im TRAP-Assay normale Aktivität zeigte, gingen die Zellen nach der natürlichen Teilungsspanne in die Seneszenz über. Möglicherweise wird noch ein weiteres Immortalisierungsgen benötigt oder hTERT ist durch die ektopischen Expression in diesen Endothelzellen nicht funktionell. (3) Der Einsatz hämatopoetischer Stammzellen für gentherapeutische Ansätze zur Expression von humanen FVIII ist bislang aufgrund niedriger Expressionseffizienz der Vektoren limitiert. Es wurden daher die Kombinationen verschiedener transkriptioneller und posttranskriptioneller Elemente in FVIII-Expressionsvektoren ausgetestet. Hierbei zeigte sich, dass die Verwendung einer 5’ untranslatierten Region (5’UTR) des hämatopoetisch exprimierten FXIIIA-Gens die FVIII-Sekretion in verschiedenen Zelllinien und primären Zellen deutlich steigerte. Am stärksten war die Wirkung in primären Monozyten, in denen die FVIII-Expression den 6fachen Wert im Vergleich zum Ursprungsvektor ohne 5’UTR erreichte. Leberzellen stellen weitere attraktive Zielzellen für gentherapeutische Ansätze dar, da Sie den primären physiologischen Ort der FVIII-Synthese darstellen. Die häufig für Gentherapievektoren verwendeten ubiquitär exprimierenden viralen Promotoren bewirken zwar hohe Expression in den transduzierten Zellen, haben allerdings den Nachteil durch ektopische Expression vermehrt Immunantworten auszulösen und durch starke Interaktion mit benachbarten Promotoren der Integrationsstelle im Genom möglicherweise tumorgene Effekte zu verursachen. Bei der Untersuchung verschiedener physiologischer Promotoren im Vergleich zum viralen CMV Promotor in Leberzellen konnte mit dem zum ersten mal getesteten minimalen FVIII-Promoter in einem lentiviralen Vektor der dritten Generation in Leberzelllinien eine vergleichsweise hohe Expression von 0,5 IU/ml FVIII /106 Zellen erzielt werden. Der FVIII-Promoter ist daher geeignet für eine lebergerichtete Expression und minimiert dabei das potentielle Risiko der häufig verwendeten ubiquitären viralen Promotoren.
Kindliche Sarkome sind eine heterogene Gruppe maligner Erkrankungen mesodermalen Ursprungs. Trotz operativer Therapie, Chemotherapie und Bestrahlung versterben noch viele Patienten. Auch gegenüber immunologischen Behandlungsansätzen sind Sarkome relativ resistent. Inhalt dieser Arbeit sind die Mechanismen, die der Resistenz kindlicher Sarkome gegenüber NK-Zellen zugrunde liegen könnten. Hierbei wurde insbesondere die Interaktion von HLA-Klasse-I-Molekülen mit inhibitorischen NK-Zellrezeptoren untersucht. Als einzige Sarkomzelllinie konnte A-673 mit einer Zelllyse von 40% bei einer E : T-Ratio von 20 : 1 als sensitiv eingestuft werden. Schwach sensitiv waren die Zelllinien MHH-ES und HOS-TE mit einer spezifischen Lyse von 25%. Als resistent gegenüber einer Zelllyse durch NK-92 erwiesen sich die Sarkomzelllinien SAOS-2, ZK58 und RD-ES mit einer Lyserate zwischen 10 und 15%. Die HLA-Klasse-I-Expression war bei den untersuchten Zelllinien HOSTE, SAOS-2, ZK58 und RD relativ schwach, bei A-673 und MHH-ES moderat und bei RD-ES stark. Gegenüber der klonalen NK-Zelllinie NK-92 zeigten sie mit Ausnahme von A-673 (40% Lyse) keine Sensitivität gegenüber einer NK-vermittelten Lyse. Dies liegt offenbar nicht an der Inhibition der NK-Zellen durch HLA-Klasse-I-Liganden, wie durch funktionelle Untersuchungen mit Blockierung der korrespondierenden HLA-Liganden gezeigt werden konnte. Auch korreliert die Sensitivität bzw. Resistenz der Sarkomzelllinien nicht mit der Expressionsdichte der HLA-Klasse-I-Moleküle auf den untersuchten Sarkomzelllinien. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten somit darauf hin, dass die Resistenz kindlicher Sarkome gegenüber NK-Zellen möglicherweise nicht auf eine Inhibition, sondern auf eine mangelnde Aktivierung der Immunzellen zurückzuführen ist.
Aims: The purpose of this study was to evaluate the feasibility and short-term efficacy of transcatheter paravalvular leak closure using different occlusion devices. Methods and Results: Twenty one patients underwent transcatheter closure of either aortic or mitral paravalvular leak from June 2002 to February 2006 using the Amplatzer PDA, ASD or VSD occluder. All patients had symptoms and signs of haemolysis and/or cardiac decompensation with dyspnoea. Implantation of a device was technically successful in twenty patients (95 %). Immediate residual leak was found in seventeen patients (85 %). Significant shunting persisted in nine cases during follow up (45 %). Permanent leaflet obstruction was observed in one patient. Severe complications during follow up led to early death in one patient and surgical intervention in three. A successful second catheter treatment was performed in another three patients. The event-free survival from reoperation, death and stroke at the end of the observation period was 80 %. Conclusion: Transcatheter closure of paravalvular leaks is a technically feasible, but demanding procedure. Residual leaks are common and may worsen pre-existing haemolysis. Due to the significant ongoing morbidity in this group of patients and the complexity of follow up individual patient results differ considerably. Nevertheless, it is possible to achieve some symptomatic relief, thus an interventional approach should be discussed as a potential treatment option for those patients with a limited defect and who are not deemed suitable for another operation.
Die Steriltestung der Blutprodukte zur Reduzierung des Übertragungsrisikos von Pathogenen stellt vor allem bei Thrombozytenkonzentraten ein wichtiges wissenschaftliches Interesse in der Transfusionsmedizin dar. In der vorliegenden Arbeit wurde ein synoptischer Vergleich sowohl von Apheresethrombozytenkonzentraten als auch von Pool-Thrombozytenkonzentraten bezüglich bakterieller Kontaminationen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sich beide Thrombozytenprodukte hinsichtlich der bakteriellen Kontaminationsrate nicht unterscheiden und somit im Hinblick auf die Transmission von Bakterien als gleichwertig zu betrachten sind. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Kulturmethoden (BacT/ALERT und Pall eBDS) und eine Schnelltestmethode (Scansystem) miteinander hinsichtlich der analytischen Sensitivtät miteinander verglichen. Der Hauptnachteil der getesteten Schnelltestmethode (ScansystemTM) ist die geringere analytische Sensitivität und v. a. der Umstand, dass die Auswertung der Ergebnisse subjektiv und somit personenabhängig ist. BacT/ALERT überzeugt durch eine hohe analytische Sensitivität, basierend auf einem langen Untersuchungszeitraum von bis zu sieben Tagen. Auch Pall eBDS überzeugte mit einer hohen analytischen Sensitivität, ist aber ein Testsystem, welches ausschließlich für aerobe Bakterien geeignet ist. Dagegen wurden in der Studie überwiegend Anaerobier (>90%) gefunden. ScansystemTM fand aerobe und anaerobe Keime in einer sehr kurzen Testzeit von ca. 70 Minuten, hatte jedoch die niedrigste analytische Sensitivität. In der klinischen Anwendungsbeobachtung konnte kein Zusammenhang zwischen den aufgetretenen Symptomen und der Thrombozytentransfusion festgestellt werden. Da das bakterielle Restinfektionsrisiko bei Thrombozytenkonzentraten das Restrisiko für virale Infektionen übertrifft, wird empfohlen bestehende Testverfahren zu optimieren, bzw. alternative Methoden, wie die der Pathogeninaktivierung zu entwickeln.
Die Rheumatoide Arthritis ist die häufigste entzündliche Gelenkerkrankung in den westlichen Industriestaaten und hat eine Prävalenz zwischen 0,5 und 1%. Frauen sind ungefähr 3mal häufiger betroffen als Männer. Eine genetische Disposition besteht für Träger des HLA-DR 4 Typs. Als Auslöser der RA werden bakterielle und virale Infekte diskutiert. Immer mehr Anhänger findet auch die Theorie, dass es sich bei der rheumatoiden Arthritis um eine Autoimmunerkrankung handeln könnte. Zur Klassifizierung der Krankheit hat das American College of Rheumatology einen Kriterienkatalog entwickelt. Charakteristisch für die rheumatoide Arthritis ist die chronische Gelenkentzündung und die Gelenkdestruktion. Bei 70% der RA Patienten finden sich heterophile Autoantikörper gegen den konstanten Teil humaner Immunglobuline vom IgG Isotyp. Sie werden als Rheumafaktoren bezeichnet und gehen mit einer häufigeren Beteiligung extraartikulärer Systeme einher, die in erster Linie auf einer begleitenden Vaskulitis beruhen. Der entzündliche Prozess der RA beginnt in der Gelenkkapsel. Es kommt zu einer Verbreiterung und Auftreibung der Synovialmembran durch Einwanderung und Organisation von CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten. Durch ein unbekanntes Antigen stimulieren die TLymphozyten synoviale Makrophagen, die dann mit der Produktion proinflammatorischer Zytokine, insbesondere TNF-α und IL-1, weitere Zellsysteme aktivieren und zur Aufrechterhaltung des Entzündungsprozesses beitragen. Resultat dieser tumorähnlichen Proliferation ist der Gelenkpannus, von dem die weitere Destruktion von Knorpel, Knochen und umgehenden Weichteilen ausgeht. Ein weiteres wichtiges Zytokin in der T-Zell- und Makrophagenaktivierung ist Interleukin-18, ein proinflammatorischer Mediator der angeborenen und erworbenen Immunantwort. IL-18 wurde ursprünglich als IFN-γ induzierender Faktor beschrieben und wird von vielen mesenchymalen und epithelialen Zellen exprimiert. Im Zusammenhang mit der RA sind vor allem Makrophagen und dendritische Zellen von Bedeutung. Die Expression von IL-18 ist bei Patienten mit RA im Sinne einer Reduktion in der Peripherie und einer Erhöhung in den entzündeten Synovialgeweben pathologisch verändert und weist auf eine proinflammatorische Rolle von IL-18 bei der RA hin. Das humane IL-18 Gen ist auf dem Chromosom 11q22.2- q22.3 lokalisiert. In der Promotorregion von IL-18 konnten 5 Single Nucleotid Polymorphismen identifiziert werden. Bei SNPs handelt es sich um Basenvariationen der Nukleotidsequenz an bestimmten Genpositionen. Sie können zu unterschiedlichen Konsequenzen im Phänotyp führen. In der vorliegenden Arbeit wurden die SNPs an den Positionen -137 und -607 bei 102 Patienten mit einer nach ACR-Kriterien definierten RA und einer gesunden Kontrollgruppe von 98 Personen untersucht. Anlass für die Untersuchungen war der Gedanke, dass die Ursache für die veränderte Produktion von IL-18 bei der RA auf genregulatorischer Ebene liegen kann. Nach Isolierung mononukleärer Zellen aus dem peripherem Blut erfolgte die DNA-Gewinnung. Mittels allelspezifischer PCR und Enzymverdauung durch Restriktionsendonukleasen wurden die einzelnen Allele an den Positionen -137 und -607 identifiziert und auf Agarosegel sichtbar gemacht. Zur Kontrolle der Ergebnisse wurden zusätzlich Sequenzierungen durchgeführt. An Position -137 sind die beiden Allele C und G möglich, an Position -607 die Allele A und C. Weder an Positon -137 noch an Position -607 zeigten sich signifikante Unterschiede bei der Verteilung der Allelhäufigkeiten zwischen RA Patienten und der gesunden Kontrollgruppe. Da beim Menschen jedes Gen zweimal vorhanden ist liegen auch bei jedem Menschen zwei Allele vor. Liegen zwei verschiedene Allele eines Gens vor wird dieses als heterozygot bezeichnet, während ein homozygoter Organismus zwei Kopien desselben Allels trägt. Bei Betrachtung dieser Diplotypen ergaben sich für die Position -137 erneut keine signifikanten Unterschiede zwischen RA Patienten und Gesunden. An Position -607 hingegen war der Diplotyp -607CC bei den RA Patienten signifikant häufiger vertreten. Die Relevanz dieser Ergebnisse wurde durch das Hardy- Weinberg-Gleichgewicht gestützt. Bei Betrachtung der Genotypen wurde eine signifikante Verknüpfung der Genotypen -607AA und -137CC und der Genotypen -607CC und -137GG miteinander festgestellt. Diese Signifikanz war unabhängig vom Gesundheitsstatus. Zusätzlich war der -607AC Diplotyp häufiger mit den Diplotypen -137CG und -137GG verknüpft, nicht aber mit dem Diplotypen -137CC. Ob das Risiko eine RA zu entwickeln von den einzelnen Positionen -137 und -607 des IL-18 Promotors, deren Kombination oder eventuellen anderen Lokalitäten in einem gewissen Ausmaß anhängig ist bleibt unklar. Fest steht, dass SNPs eine bedeutende Rolle als natürliche Inhibitoren und Aktivatoren auf molekularer Ebene spielen. Ob dies bei der RA zu einer erhöhten IL-18 Expression führen kann und somit signifikante Folgen für die Krankheitsausprägung hat konnte im Rahmen der Untersuchungen nicht geklärt werden und bedarf weiterer Untersuchungen.
Quantum chromodynamics predicts the existence of a phase transition from hadronic to quark-gluon matter when temperature and pressure are sufficiently high. Colliding heavy nuclei at ultra-relativistic speeds allows to deposit large amounts of energy in a small volume of space, and is the only available experimental mean to produce the extreme conditions necessary to obtain the deconfined state. Numerous models and ideas were developed in the last decades to study heavy ion physics and understand the properties of extremely heated and compressed nuclear matter. With the ever increasing energy available in the center of mass frame (and thus number of particles produced) and the development of large acceptance detectors, it has become possible to study the fluctuations of physical quantities on an event-by-event basis, and access thermodynamical properties not present in particle spectra. The characteristics of the highly excited matter produced, e.g. thermalization, effect of resonance decay. . . can be investigated by fluctuation analyses. In fact, fluctuations are good indicators for a phase transition and a plethora of fluctuation probes have been proposed to pin down the existence and the properties of the QGP. We study various fluctuation quantities within the Ultra-relativistic Quantum Molecular Dynamics UrQMD and the quantum Molecular Dynamics qMD models. UrQMD is based on hadron and string degrees of freedom and allows to disentangle purely hadronic effects. In contrast, the qMD model includes an explicit transition from quark to hadronic matter and can serve to test adequate probes of the initial QGP state. We show that the qMD model can reasonably reproduce various experimental particles rapidity distributions and transverse mass spectra in wide energy range. Within the frame of the dynamical recombination procedure used in qMD, we study the enhancement of protons over pions (p/π) ratio in the intermediate pt range (1.5 < pt < 2.5). We show that qMD can reproduce the large p/π ≈ 1 observed experimentally at RHIC energies at hadronization. However, the subsequent decay of resonances makes the ratio fall to values incompatible with experimental data. We thus conclude that resonance decay might have a drastic influence on this observable in the quark recombination picture. Charged particles multiplicity fluctuations measured at SPS by the NA49 collaboration are enhanced in midperipheral events for Pb+Pb collisions at Elab = 160 AGeV. This feature is not reproduce by hadron-string transport approaches, which show a flat centrality dependence, within the proper experimental acceptance and with the proper centrality selection procedure. However, we show that the behavior of multiplicity fluctuations in transport codes is similar to the experimental result in full 4π acceptance. We identify the centrality selection procedure as the reason for the enhanced particle multiplicity fluctuations in midperipheral reactions and argue that it can be used to distinguish between different scenarios of particle productions. We show that experimental data might indicate a strong mixing of projectile and target related production sources. Strangeness over entropy K/π and baryon number over entropy p/π ratio fluctuations have been measured by the NA49 experiment in the SPS energy range, from Elab = 20 AGeV up to Elab = 160 AGeV. We investigate the sensitivity of this observable to kinematical cuts and discuss the influence of resonance decay. We find the dynamical p/π ratio fluctuations to increase with beam energy, in agreement with the measured data points. On the contrary, the dynamical K/π ratio fluctuations are essential flat as a function of centrality and depend only weakly on the kinematical cuts applied. Our results are in line with the simulations performed earlier by the NA49 collaboration in their detector acceptance filter. Finally, we focus on the correlations and fluctuations of conserved charges. It was proposed that these fluctuations are sensitive to the fractional charge carried by the quarks in the initial QGP stage and survive the whole course of heavy ion reactions. A crucial point is the influence of hadronization that may relax the initial QGP fluctuation/correlation signals to their hadronic values. We use the quark Molecular Dynamics qMD model to disentangle the effect of recombination-hadronization on charged particles ratio fluctuations, charge transfer fluctuations, baryon number-strangeness correlation coefficient and various ratios of susceptibilities (i.e. correlations over fluctuations). We find that the dynamical recombination procedure implemented in the qMD model destroys all studied initial QGP fluctuations and correlations and might ex- plain why no signal of a phase transition based on event-by-event fluctuations was found in the experimental data until now.
Leukemia inhibitory factor enhances neurogenin's pro-neural effect during mouse cortical development
(2007)
Die Entwicklung von unterschiedlichen Zelltypen waehrend der embryonalen ZNS-Entwicklung ist abhaengig von zellintrinsischen und positionsabhaengigen, aeusseren Einfluessen. Dabei bilden sich die verschiedenen Zellen in nacheinander ablaufenden bzw. sich teilweise ueberlappenden Zeitraeumen. Zuerst entstehen Radiaglia und Neuronen, nachfolgend Astrozyten und zuletzt Oligodendrozyten. Werden neurale Stammzellen/Vorlaeuferzellen (NPCs – neural precursor cells) zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen und ohne den Einfluss von Wachstumsfaktoren kultiviert, so entwickeln sich diese Zellarten in der gleichen Reihenfolge. Die Neurogenese, die bei Mausembryos am Tag E11-12, nach dem Etablieren der Radialglia, beginnt, findet an E14 ihren Hoehepunkt. Zu diesem Zeitpunt werden die Gene Neurogenin1 (Ngn1) und Ngn2 in den neuralen Vorlaeuferzellen der Ventrikularzone des dorsalen Cortexes in hohem Masse exprimiert. Wie aus Untersuchungen von unserm Labor gezeigt wurde, beguenstigt es die Entstehung von Neuronen und blockiert gleichzeitig Pro-Astrozyten-Einfluesse. Zum einen inhibiert Ngn den JAK/STAT Signalweg, dessen Aktivierung fuer die Gliogenese noetig ist, indem es die Phosphoylierung von STAT1/3 auf bisher noch unbekannte Weise blockiert. Ausserdem bindet der Transkriptions-Coaktivator cAMP-response element binding protein (CBP), welches auch von den STATs fuer die Transkription benoetigt wird, bevorzugt an Ngn sobald dieses von den Vorlaeuferzellen exprimiert wird. Mit dem Tag E16 nimmt die Neurogenese in vivo wieder stark ab und es setzt die Gliogenese ein, bei der zunaechst ueberwiegend Astrozyten gebildet werden. Faktoren wie leukemia inhibitory factor (LIF) sowie ciliary neurotrophic factor (CNTF) beguenstigen dabei die Astrozytogenese indem sie den JAK/STAT Signalweg aktivieren. Die Bindung von LIF/CNTF fuehrt zur Phosphorylierung von STAT-Transkriptionsfaktoren, die ihrerseits dann an den CBP/p300 Komplex binden und schliesslich die Expression von Astrozyten-spezifischen Genen aktivieren. Die STAT-Faktoren koennen aber erst nach Abfall des Ngn-Spiegels an den Transkriptions-Coaktivator binden, da sich die Bindungsstellen dieser beiden ueberlappen. Um die Hypothese zu ueberpruefen, dass LIF auch die Neurogenese, oder spezifischer, die Wirkung von Ngn positiv beeinflusst, wurden cortikale NPCs von murinen Embryos entnommen und der Wirkung von LIF via Luciferase Assay untersucht. Dabei wurden die Vorlaeuferzellen mit Ngn und einem Reporter transfiziert, welcher den NeuroD-Promoter beinhaltete. NeuroD-Expression findet in der Regel gegen Mitte/Ende der Neurogenese statt und ist wichtig fuer die Reifung von Neuronen. Der Promoter von NeuroD beinhaltet ein E-box Element, an welches Ngn bindet und die Transkription einleitet. Wie unsere ersten Versuche zeigten, verstaerkt LIF die Transkriptionsaktivitaet von Ngn und somit die Transkription von NeuroD. Wenn aber im selben Versuch ein NeuroD-Reporter transfiziert wurde, dessen E-box mutiert war, wurde keine Transkriptionsaktivitaet gemessen, was wiederum bestaetigte, dass der pro-neurale LIF-Effekt ueber Ngn lief und E-box-Bindung noetig war. Um den Einfluss des pro-neuralen Effekts von LIF auf Proteinebene zu testen, wurden NPCs mit Ngn-Adenovirus infiziert und mit LIF stimuliert. Dabei wurden die Zellen auf die Expression von Neuron-spezifischem class III β-tubulin (TuJ1) untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass LIF bei Zellen, die Ngn exprimierten, die Rate der Neuronen von etwa 5% auf etwa 50% anstiegen liess, waehrend LIF bezueglich der Gliogenese (gezeigt durch die Expression von GFAP) in Ngn-exprimierenden Vorlaeuferzellen kaum Wirkung zeigte. Als naechstes sollte untersucht werden ueber welchen Signalweg LIF Ngn aktivierte. LIF bindet zunaechst an LIF receptor β (LIFRβ), der dann an glycoprotein 130 (gp130) bindet. Diese Bindung fuehrt dann zur Aktivierung mehrerer Signalkaskaden: dem JAK/STAT, dem MAPK, dem Akt/PI3K und dem PLCγ/PKC Signalweg. Da der JAK/STAT Signalweg fuer die Gliogenese wichtig ist, lag unser Fokus auf den anderen Signalwegen. Deren Aktivierung wurde dann mit spezifischen Inhibitoren blockiert und, wie auch in den Vorversuchen, die Wirkung von LIF auf Transkriptionsebene (NeuroD) in neuralen Vorlaeuferzellen bestimmt. Dabei zeigte sich, dass die Blockierung des PLCγ/PKC Signalweges die NeuroD-Promoteraktivitaet am starksten inhibierte, waehrend auch LIF´s pro-neurale Wirkung verloren ging. Dementsprechend zeigte die Western Blot Analyse, dass die Expression von class III β-tubulin (TuJ1) durch die Anwendung der PKC Inhibitoren am staerksten inhibiert wurde, wobei auch hier die Stimulation durch LIF keine erhoehte Neurogenese mit sich zog. In weiteren Versuchen konnten wir dann mit Hilfe von Immunoprezipitation demonstrieren, dass LIF die Bindung von Ngn an CBP verstaerkte (eine Bindung, welche durch PKC Inhibitoren aufgehoben wurde), was wiederum zu einer erhoehten Bindung dieses Transkriptionskomplexes an den NeuroD Promoter fuehrte, wie unsere Chromatin Immunoprezipitation (ChIP) Daten beweisen. Dies wiederum laesst darauf schliessen, dass womoeglich diese erhoehte Ngn-CBP/NeuroD-Promoter Bindung der Grund fuer die erhoehte NeuroD-Transkriptionsaktivitaet ist daher auch fuer die erhoehte neuronale Differenzierung. Interessanterweise konnten wir auch zeigen, dass Brahma-related gene 1 (Brg1), eine katalytische Untereinheit des SWI/SWF Komplexes, an den Ngn/CBP cotranscriptionalen Komplex bindet und dass diese Bindung durch LIF-Stimulation verstaerkt wurde. Dies suggeriert wiederum, dass auch Brg1 eine wichtige Rolle waehrend der murinen, cortikalen Neurogenese spielt. Dennoch, in folgenden Experimenten verblieb der Fokus auf Ngn und CBP. Um unsere Hypothese zu bestaetigen, dass PKCδ ein moeglicher Mediator des LIF-Effekts sein koennte, zeigten wir zunaechst, dass die PKCδ-Expression in cortikalen NPCs waehrend der Neurogenese erhoeht ist. Desweiteren demonstrierten wir, dass die Inhibition von PKCδ einen aehnliche Wirkung zeigte wie die Inhibition von PKC mit einem generellen PKC Inhibitor: weder war nach PKCδ-Inhibition eine LIF-induzierte NeuroD-Transkription erzielbar, noch wurde nach LIF-Stimulation der pro-neurale Marker class III β-tubulin/TuJ1 in Ngn1-infizierten NPCs exprimiert. Um aber mehr spezifisch die PKC- und PKCδ-Aktivitaet/Expression zu blockieren transfizierten wir NPCs mit PLCγ oder PKCδ siRNA. Unsere Daten zeigten hierbei, dass siRNA-transfizierte Zellen kein class III β-tubulin mehr aufweisen, was darauf hindeuted, dass PKCδ der potentielle Mediator des pro-neuralen LIF-Effekts ist. Durch unsere in vivo Daten demonstrierten wir schliesslich, dass LIF auch hierbei fuer die Neurogenese von Bedeutung ist. Verglichen wurden die Cortices von E13 LIF Het (heterozygote) und KO (knock out) Maeusen mit denen von WT (wild type) Maeusen. Durch Immunohistologie von Hirnschnitten konnten dabei keine groesseren Unterschiede bezueglich der Expression neuraler Marker beobachtet werden, waehrend aber mit Hilfe der Western Blot Analyse, eine quantitativere Methode, gezeigt wurde, dass LIF Het und KO Maeuse weniger pro-neurale Marker im Cortex exprimieren wie WT Mause. Um auch zu beweisen, dass dies auf eine verringerte Transkription von NeuroD zurueckzufuehren ist, demonstrierten wir mit Hilfe des ChIP Assay, dass LIF Het und KO Maeuse weniger Ngn1-CBP Bindung an den NeuroD-Promoter aufweisen wie WT Maeuse. Diese Experimente veranschaulichen einen eleganten Regulationsmechanismus, durch welchen ein einzelner, extrazellulaerer Faktor die unterschiedliche Differenzierung einer Zelle verstaerkt, abhaengig von der Anwesenheit oder Abwesenheit eines einzelnenn intrazellulaeren Faktors. Auch koennen durch die erlangten Resultate Strategien entworfen werden, durch die in Zukunft die Produktion bestimmter Neurone zur Heilung von verschiedenen, neurodegenerativen Krankheiten erhoeht wird.
Starke allergische Reaktionen gegen nicht spezifische Lipidtransfer Proteine sind im Mediterranen Raum weit verbreitet. LTPs besitzen als Klasse 1 Nahrungsmittelallergene vermutlich die Fähigkeit über den oralen Weg, durch den Verzehr von Nahrung, eine Sensibilisierung auszulösen. Zu Beginn dieser Arbeit wurde jedoch in der Literatur die Möglichkeit diskutiert, ob auch bei einer LTP-Sensibilisierung eine Pollen-assozierte Nahrungsmittelallergie vorliegen könnte. Untersuchungen zur IgE-Bindungskapazität von Lebensmittel- und Pollen-LTPs zeigten partielle Kreuzreaktivitäten. Eine Aussage über eine einheitliche Tendenz zur stärkeren IgE-Bindungskapazität konnte anhand der derzeitigen Ergebnisse weder für die Lebensmittel- noch für die Pollen-LTP-Gruppe getroffen werden. Dementsprechend lag kein eindeutiger Hinweis zur Korrelation zwischen der Sensibilisierung gegen Pollen- und Nahrungsmittel-LTPs vor, wodurch die Frage zur Fähigkeit der einzelnen LTPs kausal eine Allergie auszulösen weiterhin offen bleibt. Die Untersuchungen dieser Arbeit fokussierten sich auf die Lebensmittelallergene und sollten ihre klinische Bedeutung analysieren und Aufschluss über die Fähigkeit dieser Allergene eine Allergie kausal auszulösen bringen. Hierbei sollte untersucht werden, ob jedes Nahrungsmittel-LTP die Fähigkeit besitzt eine IgE-Sensibilisierung auszulösen oder ob ein LTP als primär sensibilisierendes Agens wirkt und nachfolgend immunologische Kreuzreaktionen zu anderen LTPs auftreten. Aufgrund der großen Häufigkeit von Patienten mit einer Pfirsichallergie im mediterranen Raum mit einer Sensibilisierung gegen das Pfirsich-LTP (Pru p 3), sowie einer schweren Symptomatik, wird vermutet, dass dieses Allergen eine wichtige Rolle spielt und eventuell als primär sensibilisierendes Agens fungieren könnte. Zur Identifizierung eines primär sensibilisierenden Agens sollte das Ausmaß der Antikörper-Kreuzreaktivität, die Aufschluss über die Affinität und Vorkommen gemeinsamer Epitope liefern soll, untersucht werden. Weiterhin sollte die IgE-Prävalenz der einzelnen Allergene, ihre Immunogenität (T-Zell-Kreuzreaktivität und in vivo Antikörperinduktion) und die biologische Potenz untersucht werden. Um der Fragestellung nachzugehen wurden die LTPs aus taxonomisch verwandten (Kirsche, Pru av 3 und Pfirsich, Pru p 3) und nicht verwandten (Haselnuss, Cor a 8 und Salat, Lac s 1) Lebensmitteln in die Studie einbezogen. Für die Untersuchungen standen 51 Seren von spanischen Lebensmittelallergikern zur Verfügung, deren Allergien gegen Pfirsich, Salat, Haselnuss und Kirsche anamnestisch und serologisch erfasst wurden. Die Relevanz der LTPs wurde durch die Schwere der klinischen Symptomatik deutlich. LTPs besitzen eine hohe Stabilität gegenüber thermischer und proteolytischer Prozessierung. Natürliches Pru p 3 zeigte bei einer Erhitzung auf 90°C zum größten Teil eine intakte Sekundärstruktur. Diese Eigenschaften könnten die Aufnahme von intakten Allergenen im gastrointestinalen Trakt begünstigen, wodurch die teilweise starken allergischen Reaktionen erklärt werden können. Bei der Untersuchung zur Relevanz von Pru p 3 im Vergleich zu Lac s 1, Cor a 8 und Pru av 3 wurde die IgE-Prävalenz, IgE-Bindekapazität, IgE-Kreuzreaktivität und biologische Potenz untersucht. Spezifisches IgE gegen Lac s 1 (93%), Pru p 3 (90%), Cor a 8 (88%) und Pru av 3 (85%) wurde mittels ImmunoCAP-FEIA in der jeweiligen Lebensmittelallergikergruppe gefunden und quantitativ bestimmt. Alle untersuchten Lebensmittel-LTPs erwiesen sich als Hauptallergene in der jeweiligen Patientengruppe. Bei Untersuchungen der IgE-Bindekapazität zeigten alle untersuchten Patienten, mit Ausnahme von einem, eine stärkere IgE-Bindungen gegen Pru p 3 im Vergleich zu Cor a 8. Demnach korreliert eine IgE-Sensibilisierung gegen Cor a 8 mit der gegen Pru p 3. Lac s 1 zeigte in einigen Fällen eine stärkere IgE-Bindung im Vergleich zu Pru p 3 und umgekehrt. Mit Ausnahme eines Patienten war eine IgE-Sensibilisierung gegen Lac s 1 immer mit der gegen Pru p 3 assoziiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in Einzelfällen spezies-spezifische Epitope beobachtet wurden, während IgE-Reaktivitäten gegen LTPs, die nicht zu der Familie der Rosengewächse gehören, in seltenen Fällen ohne eine begleitende Sensibilisierung gegen Pru p 3 auftraten. Die IgE-Bindung an Pru p 3 konnte durch Cor a 8 und Lac s 1 maximal bis 60% inhibiert werden, während Pru p 3 eine komplette Inhibition der Cor a 8 und Lac s 1 IgE-Bindung bewirkte. Demnach besitzt Pru p 3 alle IgE-Epitope von Lac s 1 und Cor a 8 und/oder eine stärkere Affinität zu den IgE-Antikörpern. Cor a 8 zeigte, trotz der Fähigkeit schwere Symptome auszulösen, eine relativ geringe biologische Potenz. Lediglich bei einem von fünf untersuchten Patienten zeigte Lac s 1 eine starke maximale Histaminfreisetzung. Pru p 3 und Pru av 3 zeigten die stärkste biologische Potenz bei allen untersuchten Pfirsichallergikern. Ein Salatallergiker ohne Pfirsichallergie zeigte durch die Stimulation mit Pru p 3 eine geringe Mediatorfreisetzung, wodurch dem Allergen Pru p 3 in Einzelfällen ohne klinische Symptomatik gegen das Allergen nicht zwangsläufig die stärkste biologische Potenz zugeschrieben werden kann. Pru p 3 und Pru av 3 zeigten aufgrund einer hohen Sequenzidentität von 85% nahezu identische IgE-Bindekapazitäten, IgE-Kreuzreaktivitäten, sowie eine ähnliche biologische Potenz. Eine Kreuzreaktivität auf T-Zell-Ebene wurde ebenfalls zwischen Pru p 3 und Pru av 3 detektiert, während im murinen System mittels RBL-2H3-Mediatorfreisetzungstest keine Kreuzreaktivität unter allen untersuchten Lebensmittel-LTPs nachweisbar war. Fehlende T-Zell-Kreuzreaktivitäten zwischen Pru p 3/Cor a 8 und Pru p 3/Lac s 1 deuten auf unterschiedliche T-Zell-Epitope der untersuchten Proteine hin. Um eine generelle Aussage über die T-Zell-Kreuzreaktivität treffen zu können, wären weitere systematische T-Zell-Proliferationsstudien erforderlich. Die erhaltenen Ergebnisse verdeutlichen, dass dem Allergen Pru p 3 hinsichtlich IgE-Prävalenz, IgE-Bindekapazität, IgE-Kreuzreaktivität im Inhibitions-ELISA und der biologischen Potenz im Mediatorfreisetzungstest die bedeutendste Rolle unter den untersuchten LTPs zukommt. In Einzelfällen konnten jedoch spezies-spezifische Epitope nachgewiesen werden, wodurch die Annahme verstärkt wird, dass Pru p 3 nicht das alleinige Immunogen sein kann. Weiterhin waren alle untersuchten LTPs im murinen System immunogen, wodurch die Annahme verstärkt wird, dass jedes untersuchte LTP eine Allergie kausal auslösen kann. Unterstützt wird diese Vermutung durch die fehlende Kreuzreaktivtität der murinen IgE-Antikörper. Eine eindeutige Aussage kann aufgrund der erhaltenen Ergebnisse derzeit noch nicht getroffen werden, da weitere systematische T-Zell-Proliferationsstudien und Inhibitions-ELISA der Maus-Immunsera in dieser Arbeit nicht mehr durchgeführt werden konnten.