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Autoimmune Endokrinopathien entstehen durch die Aktivierung pathogener TLymphozyten, welche in de Lage sind, bestimmte Ziel-Zellen mittels Zytokinen oder anderer Mechanismen zu zerstören. Typ I Diabetes mellitus ist ein durch Insulinmangel bedingter Defekt der Glukoseverwertung, der durch eine autoimmune Zerstörung der pankreatischen Beta-Zellen verursacht wird. Als häufigste chronische Erkrankung Jugendlicher und junger Erwachsener in den Industrienationen stellt sie durch ihre stetig steigende Inzidenz, ihr immer früheres Erkrankungsalter und nicht zuletzt die steigende allgemeine Lebenserwartung eine bedeutende medizinische und ökonomische Herausforderung dar. Die zunehmende Aufklärung der mannigfaltigen Wechselbeziehungen des Immunsystems und der starke Einfluss des Vitamin D auf die Entwicklung und Funktion des Immunsystems führten zu der Überlegung, dass auch der Vitamin D Rezeptor (VDR) in Verbindung mit seinem biologisch aktivsten Liganden 1,25 (OH)2D3 einen Einfluss auf die Entwicklung einer Autoimmunendokrinopathie haben könnte. In Tierexperimenten konnte gezeigt werden, dass 1,25 (OH)2D3 und auch seine Analoga die Produktion des Interleukins IL-12 hemmen, welches eine wichtige Rolle in der Entwicklung der Th1-Helferzellen ausübt, gleichzeitig wird die Produktion des Interleukins IL-10 stimuliert, welches die Entwicklung von Th1-Helferzellen blockiert. Dieser Zelltyp ist bei der Entwicklung eines Typ 1 Diabetes mellitus ursächlich beteiligt. 1,25 (OH)2D3 kann auch die Entwicklung der Th2 Helferzellen inhibieren, welche in der Pathogenese einer Hashimoto Thyreoiditis involviert sind. In betroffenen Geweben, in denen pathogen-wirksame Th1-Zellen die Bildung zytotoxischer T-Zellen und aktivierter Makrophagen bewirken, kann 1,25 (OH)2D3 und seine Analoga die Anzahl der Th1-Zellen herunterregeln. Des weiteren regt Vitamin D die Bildung von CD4+CD25+-regulatorischen T-Zellen und Th2-Zellen an, die ihrerseits wiederum hemmend auf Th1-Zellen wirken. Bisher haben bereits diverse Studien bestätigt, das funktionelle Auswirkungen verschiedener Einzelnukleotid-Polymorphismen in kodierenden und nicht kodierenden Regionen des VDR- Gens in kausalem Zusammenhang mit dem Auftreten eines Typ 1 Diabetes Mellitus stehen. In dieser Arbeit zeigten sich erniedrigte 1,25 (OH)2D3 Spiegel in deutschen Patienten mit Typ 1 Diabetes Mellitus. Eine vergleichbare Studie wurde in der finnischen Bevölkerung durchgeführt und bestätigt unsere Resultate. Dies spiegelt die zentrale Rolle des Vitamin D bei der Entwicklung eines Typ 1 Diabetes Mellitus wieder. Um den kausalen Zusammenhang zwischen molekularen und funktionellen Beziehungen des Vitamin D Rezeptors näher zu definieren, liegt die Frage nahe, inwiefern eine Korrelation der schon bekannten VDR- Polymorphismen und neu etablierten mit Vitamin D Spiegeln in Patienten und Kontrollen besteht, weiterhin, ob auf der Ebene der Genexpression schon ein signifikanter Unterschied bei Patienten mit Typ 1 Diabetes Mellitus zu beschreiben ist. Zusätzlich wurden sieben neue VDR- Polymorphismen in Familien, mit jeweils einem an Typ 1 Diabetes Mellitus erkrankten Kind, untersucht. Bestimmte Transmissionsmuster wurden bereits für die VDR- Polymorphismen ApaI, BsmI, FokI und TaqI bei Typ 1 Diabetes Mellitus beschrieben und eine signifikante Korrelation hergestellt. In dieser Doktorarbeit zeichnet sich eine grenzwertig signifikante Korrelation zwischen dem VDR- Polymorphismus 2238135 und Typ 1 Diabetes Mellitus ab. Das Allel „C“ wurde häufiger auf die erkrankten Kinder transmittiert. Dieses Ergebnis ließ sich ebenfalls in der Gegenüberstellung von Patienten zu Kontrollen nachweisen, in der Allelfrequenzanalyse stellte sich das Allel „C“ ebenfalls als dominant heraus. Für die anderen sechs untersuchten VDR- Polymorphismen konnte keine signifikante Korrelation zu Typ 1 Diabetes Mellitus in der deutschen Population nachgewiesen werden. Jedoch konnten bei vier der sieben VDR- Polymorphismen signifikante Haplotypen beschrieben werden, die den Zusammenhang zu Typ 1 Diabetes Mellitus erneut bestätigen. Dies zeigt, wie die alleinige Analyse eines VDR- Polymorphismus scheinbar keine Assoziation zum Typ 1 Diabetes Mellitus zu haben scheint, aber durch die Bildung von Allelkombinationen sich signifikante Korrelationen für die gleichen Polymorphismen ausbilden können. Die gemeinsame Analyse verleiht den untersuchten VDR-Polymorphismen erst die Signifikanz. Das Gleichgewicht war jedoch deutlich zugunsten der signifikant seltener transmittierten und damit protektiven Haplotypen verschoben. Nur „GCTG“ wurde häufiger transmittiert (62,7% vs. 37,3%, p= 0,0087), während die folgenden 3 Haplotypen „TCTG“, „TCGG“ und „GCGG“ seltener transmittiert wurden und sich als signifikant herausstellten. „TCGG“ stellte sich als grenzwertig signifikanter Haplotyp heraus, während „GCGG“ als signifikante Allelkombination anzusehen ist. Am stärksten jedoch zeigte sich der diabetogen- protekive Effekt beim Screening des „TCTG“ Haplotypen, der fast gar nicht an die erkrankten Nachkommen transmittiert wurde (99,1% vs. 0,9%, p= 0,0006). In der vorliegenden Doktorarbeit bestätigt sich einerseits die molekulare Korrelation zwischen bestimmten Polymorphismen des VDR- Gens und dem Auftreten eines Typ 1 Diabetes Mellitus. Andererseits konnten vier neue Haplotypen bestimmt werden, die im Rahmen des durchgeführten Screenings in der deutschen Bevölkerung das Risiko für die Entstehung eines Diabetes als schützende oder prädisponierende Faktoren mitbestimmen. 1,25(OH)2D3, der stärkste immunregulatorische Vitamin D Metabolit, stellt für die medikamentöse Prävention und Therapie der autoimmunen Erkrankungen auch weiterhin ein interessantes Ziel dar, unter Umständen auch über die Beeinflussung seiner Stoffwechselwege, deren molekulare Korrelation hier weiterführend geklärt wurde.
Die steigende Anzahl refraktiver, hornhautchirugischer Eingriffe macht eine immer genauere und effektivere Vermessung der Hornhaut erforderlich. Das Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war eine vergleichende Untersuchung des Orbscan II Topographiegerätes (Orbtek / Bausch & Lomb Surgical) mit einem Keratometer (Zeiss) und einem herkömmlichen kornealen Topographen - dem C-Scan (Technomed). Im Mittelpunkt der Studie stand eine Gegenüberstellung der Pachymetriewerte des Orbscan II mit denen des Ultraschallpachymeters (Storz) verglichen. Als Basis dienten 187 Augen (95 rechte und 92 linke Augen) von 96 Patienten (66 Frauen und 30 Männer) einer Normalpopulation mit einem Durchschnittsalter von 40 ±10,19 Jahren. Die Untersuchung erstreckte sich über einen Zeitraum von März 2000 bis März 2001. Die Hornhautbrechkraft und Hornhautdicke wurden mittels der genannten Gerätetypen gemessen statistisch analysiert und verglichen. Des Weiteren wurden die verschiedenen Muster der Orbscan-Vierfachkarte nach unterschiedlichen Standardschemata (Bogen et al., Liu et al. und Naufal et al.) klassifiziert. Die statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte auf Grundlage der Standardabweichung, Mittelwert, Bland-Altmann Diagrammen, T-Test für gepaarte Beobachtungen und chi-Test. Das Orbscan II Gerät lieferte eine durchschnittliche Brechkraft von 43,71 ±1,72 dpt, das C-Scan 43,91 ±1,64 dpt und der Keratometer 43,24 ±1,68 dpt. Der Durchschnitt der gemessenen Pachymetriewerte des Orbscan II mit eingeschaltetem Akustikfaktor (x = 0.92) betrug 541 ±44 Mikrometer. Darüber hinaus lag der Durchschnitt der gemessenen Ultraschallpachymetriewerte bei 542 ±40 Mikrometer. In der Orbscan II Topographie konnte kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen der Messung der Hornhautbrechkraft des rechten und des linken Auges festgestellt werden. Die Klassifizierung der Musterverteilung nach Bogen [11] wies einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen der Keratometrie von myopen und hyperopen Augen auf. Hingegen beschrieben die Pachymetriemuster nach der Klassifizierung von Liu [47] keinen statistischen Unterschied beim Vergleich von myopen und hyperopen Augen. Ferner zeigte die Klassifizierung der Musterverteilung der Hornhautvorderfläche nach Naufal [54] im Gegensatz zur Musterverteilung der Hornhautrückfläche keinen signifikanten Unterschied beim Vergleich myoper und hyperoper Augen. Es lies sich feststellen, dass die topographischen und pachymetrischen Messungen des Orbscan II mit den Standardmessungen des C-Scan und des Ultraschallpachymeters korrelierten. Aufgrund der Kombination der sich ergänzenden Technologien (Placido-Prinzip und Scheimpflug-Prinzip) bestand die Möglichkeit, mit den Daten der Hornhautvorderfläche und Hornhautrückfläche sowie Hornhautdicke, eine genauere Verrechnung der gesamten Hornhautbrechkraft zu erhalten. Zur Ermittlung der Gesamtbrechkraft der Hornhaut erfasste das C-Scan Keratometer lediglich die Hornhautvorderfläche. Daneben zeigte die vergleichende Messung der Gesamtbrechkraft der Hornhaut zwischen dem Orbscan und dem C-Scan nahezu identische Daten. Aufgrund dessen schien das aufwendigere Messverfahren des Orbscan keine signifikant anderen Messwerte als das C-Scan zu liefern. Die unterschiedlichen Klassifizierungen der Hornhaut Topographiekarten waren z.T. abhängig von den vorliegenden Refraktionsanomalien. Aufgrund unterschiedlicher Einteilungen der topographischen Karten war eine abschließende Beurteilung nur bedingt möglich. Hinsichtlich einer vergleichenden Analyse ist hier eine einheitliche Skalierung aller topographischen Hornhautkarten vorauszusetzen. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass das Orbscan II ein valides, nicht invasives ophthalmologisches Gerät ist, dessen Messung mit denen der Standardgeräte (Keratometer, C-Scan und Ultraschallpachymeter) vergleichbar ist. Die simultane Messung von kornealer Topographie und Hornhautdicke über die gesamte Hornhaut beim Orbscan II ist zusätzlich eine zeitsparende Messmethode. Die Darstellung der vorderen und hinteren Segment-Topographie mit dem Orbscan II Videotopographiesystem ermöglicht es zudem, weitere wesentliche Informationen über die Beschaffenheit und evtl. bestehende Pathologien der vorderen und hinteren Hornhautgrenzflächen zu erhalten.
P2X-Rezeptoren sind ligandengesteuerte Kationenkanäle, die durch extrazelluläres ATP aktiviert werden. Bisher wurden sieben Isoformen kloniert (P2X1-P2X7), die eine gemeinsame Topologie besitzen, bestehend aus intrazellulären N- und C-Termini, zwei Transmembranregionen und einer großen Ektodomäne. Um funktionelle Ionenkanäle ausbilden zu können, müssen P2X-Untereinheiten in Homo- oder Heterotrimere assemblieren. Das übergeordnete Ziel der vorliegenden Arbeit war das Identifizieren von Proteindomänen, die zu der Trimerisierung von P2X-Untereinheiten beitragen. Hierzu diente in erster Linie die humane P2X5- (hP2X5-) Untereinheit, der durch Herausspleißen von Exon 10 eine Region fehlt, die in der Literatur als eventuell wichtig für die Assemblierung beschrieben wird. Exon 10 kodiert 22 Aminosäuren, die in der distalen Ektodomäne und der äußeren Hälfte der zweiten Transmembranregion liegen. Das Fehlen dieser Aminosäuren führt zu Untereinheiten, die nicht in der Lage sind, zu trimerisieren und funktionelle Ionenkanäle auszubilden. Durch das schrittweise Einsetzen der von Exon 10 kodierten Aminosäuren in die hP2X5-Untereinheit sowie die Expression verschiedener Alanin-Mutanten mit nachfolgender Analyse durch Blaue-Native-PAGE konnte gezeigt werden, dass das fehlerhafte Assemblierungsverhalten der hP2X5-Untereinheit in erster Linie durch das Fehlen der äußeren Hälfte der zweiten Transmembranregion bewirkt wird. Zusätzliche gezielte Mutationen und die Konstruktion von Deletionsmutanten ergaben weiterhin, dass die zweite Transmembranregion vornehmlich als hydrophober Membrananker dient, um die korrekte Topologie und Positionierung von Assemblierungsdomänen zu gewährleisten. Die wichtigsten Assemblierungs-informationen scheinen in der Ektodomäne zu liegen. Die einzige Aminosäure in der zweiten Transmembranregion, die einen spezifischen Einfluss auf die Trimerisierung von hP2X5-Untereinheiten hatte, war 355D. Einzelmutationen in dieser Position zeigten, dass nur Aminosäuren, deren Seitenketten in der Membran interhelikale Wasserstoffbrücken ausbilden können, eine effiziente Trimerisierung ermöglichen. Dieses Ergebnis legte den Schluss nahe, dass 355D die Assemblierung unterstützt, indem es die Interaktion zwischen den Untereinheiten über eine Wasserstoffbrückenbildung stabilisiert. Die Suche nach einem potentiellen Interaktionspartner von 355D in der ersten Transmembranregion durch Einzelmutationen und Cystein-Crosslinking war allerdings nicht erfolgreich. Dies könnte bedeuten, dass die beiden Transmembranregionen jeweils benachbarter Untereinheiten nicht, wie für P2X2-Untereinheiten gezeigt, in einer „head to tail“-Orientierung angeordnet sind, sondern nur die zweiten Transmembranregionen miteinander in Kontakt stehen. Limitierte Proteolyse von hP2X5-Rezeptormutanten ergab einen engen Zusammenhang zwischen der Trimerisierung und der Resistenz gegenüber einer Proteolyse durch Trypsin. Daraus folgt, dass trimerisierungsfähige P2X-Mutanten korrekt gefaltet sind, während ein Verlust der Trimerisierungsfähigkeit eine Fehlfaltung anzeigt. Neben dem hP2X5-Rezeptor wurden auch Ratten-P2X1- (rP2X1-) Rezeptoren untersucht. rP2X1-Konstrukte, die lediglich aus der Ektodomäne sowie einem abspaltbaren Signalpeptid bestanden, konnten zwar partiell multimerisieren, aber keine definierten Trimere bilden. Die Analyse weiterer Konstrukte zeigte, dass beide Transmembranregionen für die Trimerisierung wichtig sind, auch wenn sie keine spezifischen Assemblierungsinformationen enthalten. Ein systematisches Alanin-Scanning der gesamten Ektodomäne der rP2X1-Untereinheit ergab, dass die Ektodomäne multiple Sequenzmotive enthält, die zu der Trimerisierung beitragen. Die genaue Rolle der identifizierten Sequenzmotive muss in weiteren Experimenten geklärt werden. Zusätzlich wurden Chimären aus rP2X1- und Ratten-P2X6- (rP2X6-) Untereinheiten untersucht. Da rP2X6-Untereinheiten nicht in der Lage sind zu trimerisieren, könnten sie in Kombination mit Sequenzelementen aus rP2X1-Untereinheiten ermöglichen, trimerisierungsrelevante Proteindomänen zu identifizieren. Es zeigte sich, dass eine Chimäre, die die Ektodomäne der rP2X1-Untereinheit und die Transmembranregionen und zytosolischen Domänen der rP2X6-Untereinheit enthielt, trimerisieren konnte, während die umgekehrte Chimäre dies nicht vermochte. Dies war ein weiterer Hinweis darauf, dass die Motive, die für die Trimerisierung von P2X-Untereinheiten essentiell sind, in der Ektodomäne liegen. Zusammenfassend belegen diese Ergebnisse, dass die Transmembranregionen bei der Assemblierung im Wesentlichen eine Funktion als hydrophobe Membrananker haben, die die korrekte Topologie und Positionierung der extrazellulären Assemblierungsdomänen ermöglichen. Die initiale Assemblierung wird durch die Ausbildung einer interhelikalen Wasserstoffbrücke über 355D stabilisiert. Somit können die wichtigsten Assemblierungsdomänen in Kontakt treten, die in der Ektodomäne lokalisiert sind.
Nach dem Auftreten unerwarteter Nebenwirkungen bei einer Gaumennahterweiterung (GNE) wurde mit Hilfe einer Umfrage bei allen hessischen Kieferorthopäden und Polikliniken ein möglichst breiter Überblick über auftretende Komplikationen und Nebenwirkungen angestrebt und diese quantitativ erfasst. Von den beobachteten Nebenwirkungen wurde das Phänomen der Kippung von Ankerzähnen näher betrachtet. Ihr Ausmaß wurde anhand von retrospektiv untersuchten Patientenfällen bestimmt, wobei drei verschiedene Verfahren zur Kippungsbestimmung auf ihre Durchführbarkeit und Genauigkeit hin überprüft wurden. Im Rahmen der Umfrageergebnisse zeigte sich, dass in Hessen sehr unterschiedliche Behandlungsprotokolle und Apparaturtypen zum Einsatz kommen. Unter den 95 die GNE anwendenden Kieferorthopäden wird meist eine konventionelle GNE, das heißt ohne chirurgische Unterstützung, durchgeführt. In dem der Umfrage vorangegangenen Jahr waren dies ca. 1420 Anwendungen. Die Altersgrenze, ab welcher die chirurgischen GNE empfohlen werden, schwankt zwischen dem 10. und 60. Lebensjahr. Die in Hessen am häufigsten verwendete Apparatur ist mit 61 Anwendern die an Ankerbänder gelötete Hyrax-Apparatur. Die alternative Verwendung verschiedener Geräte ist nach Angaben vieler Kollegen vom Zahnstatus bzw. Alter des Patienten abhängig. So ist die in 19 Fällen alternativ eingesetzte okklusal geklebte Apparatur die am zweithäufigsten verwendete. Gelaserte oder gegossene Apparaturen werden nur von wenigen Anwendern eingesetzt. Der Aktivierungsrhythmus wurde zwischen einmal und sechsmal täglich oder auch alternierend angegeben. Daraus ergaben sich je nach transversalem Erweiterungsbedarf aktive Behandlungszeiten von einer bis zu zwölf Wochen und eine durchschnittliche Oberkiefererweiterung von acht Millimetern. Zwischen dem Aktivierungsrhythmus und der Behandlungsdauer bestand nur eine leichte Korrelation. Die meisten Kollegen gaben an, zwischen acht und zwölf Wochen zu retinieren, wobei die Spanne zwischen keiner Retention und mehr als einem halben Jahr lag. Die vorliegende Umfrage und Untersuchung zeigt, dass verschiedene Komplikationen oder Nebenwirkungen bei dieser Behandlungsmethode auftreten können. Technische Komplikationen beziehen sich auf Komplikationen mit der Apparatur wie Lockerungen oder Brüche der Apparatur, Defekte der Schraube und auf Aktivierungsprobleme. Sie können meist kurzfristig behoben werden und begründen bei adäquater Handhabung keine Einschränkung dieser Behandlungsmethode. Einige medizinische Nebenwirkungen, wie die Diastemabildung und eine vorübergehende Bissöffnung, sind zu erwarten, stellen aber kein Problem dar und wurden daher nicht als Komplikation gewertet. Andere medizinische Nebenwirkungen, wie Druckstellen, Gingivitis, extreme Kippungen oder Nasenveränderungen, treten nur selten auf und sind meist reversibel. Lediglich Karies und Wurzelresorptionen können die Zahnhartsubstanz dauerhaft in Mitleidenschaft ziehen, bleiben aber laut Literatur meist auf ein klinisch nicht relevantes Maß begrenzt. Nur ein einziger Fall ist uns bekannt, bei dem unter einer lange gelockerten geklebten GNE-Apparatur alle Zähne von Karies zerstört wurden. Die von 19% der Anwender beobachtete nicht geöffnete Gaumennaht ist für starke Schmerzen während der Aktivierungszeit und wahrscheinlich auch für die von einem Kieferorthopäden angegebenen Fenestrationen verantwortlich zu machen. Die ursprünglich beobachteten extraoralen Veränderungen zweier Patientinnen mit verbreiterten Nasen, Nasenhöckern, leichten Schwellungen der Nasenwurzel und einem kleinen Hämatom wurden insgesamt von 18% der Befragten angegeben. Nasenbluten wurde einmal und andere Asymmetrien des Gesichts wurden zweimal angegeben. Diese den Patienten möglicherweise beunruhigenden Veränderungen waren in allen beobachteten Fällen reversibel und konnten anhand der Literaturstudie auf die skelettale Wirkung der GNE an der Nasenwurzel und dem Mittelgesicht zurückgeführt werden. Genauere quantitative Einschätzungen waren aufgrund des Datenumfangs und wegen Mehrfachnennungen nicht möglich. Dennoch zeigen diese Ergebnisse, dass bei der GNE durchaus mit vorübergehenden extraoralen Veränderungen gerechnet werden muss. Die Kippung von Ankerzähnen wurde in der Umfrage von 18% der Anwender als Nebenwirkung angegeben. Sie steht nach den Ergebnissen der vorliegenden retrospektiven Untersuchung von Archivmaterial nicht im Zusammenhang mit der Dauer der Behandlung oder der Größe der transversalen Dehnung. Lediglich mit dem Alter der 23 nachuntersuchten Patienten ließ sich ein minimaler Zusammenhang der Kippungen zwischen - 2 und 17 Grad erkennen. Da bei drei Behandlungsfällen Kippungen von 10 Grad oder deutlich mehr bestimmt wurden, sollte eine praktikable Methode zur Kippungsbestimmung aufgezeigt werden. Es wurden drei Methoden vorgestellt und auf Übereinstimmungen überprüft. Die Kippungseinschätzung nach Augenschein stellt eine akzeptable Methode für einen erfahrenen Behandler dar. Genauere Ergebnisse, die eine quantitative Einschätzung ermöglichen, sind nur durch eine instrumentelle Vermessung der Kippungswinkel möglich. Eine dritte Methode, von gemessenen Streckendifferenzen über eine mittlere Zahnhöhe auf die Kippungen zu schließen, ist wegen einer erheblichen Ungenauigkeit in der Winkelbestimmung nicht empfehlenswert. Trotz der beschriebenen Komplikationen bleiben die Vorteile der Gaumennahterweiterung offensichtlich und sie gilt zu Recht als effektives und zuverlässiges Behandlungsmittel. Ihrem Einsatz sollte jedoch eine fundierte Indikationsstellung und umfassende Aufklärung vorausgehen.
Die endotheliale NO-Synthase (eNOS) ist im kardiovaskulären System der Hauptproduzent von Stickstoffmonoxid (NO). Studien deuten auf eine Beteiligung der eNOS im Krankheits-verlauf einer Leberzirrhose hin; zirrhotische Tiere zeigen eine reduzierte hepatische eNOS-Aktivität bei unveränderten Proteinmengen. Die reduzierte NO-Menge trägt zu einer Erhöh-ung des intrahepatischen Widerstandes und einer portalen Hypertonie bei. Inhibitoren und posttranslationale Modifikationen der eNOS wurden als auslösende Faktoren postuliert, aber auch am intrazellulären Transport der eNOS beteiligte Proteine könnten eine wichtige Rolle spielen. Ein solches ist das neue Protein NOSTRIN (“eNOS traffic inducer”), das über seine C-terminale SH3-Domäne an eNOS bindet und durch seine N-terminale FCH Domäne an Membranen assoziiert. In vorhergegangenen Studien wurde nur ein translatiertes Protein identifiziert, bezeichnet als NOSTRINalpha. In der vorliegenden Arbeit habe ich eine verkürzte Isoform entdeckt (NOSTRINbeta), die aus einem alternativen Spleißvorgang hervorgeht. Ihr fehlt fast die gesamte FCH Domäne, wodurch keine Membranbindung mehr stattfindet. Diese Isoform konnte nur in pathogenem Lebergewebe nachgewiesen werden. Untersuchun-gen mittels Western Blotting und qRT-PCR mit Proben aus Patienten mit Zirrhose, alkoholischer Hepatitis oder von gesunden Personen, zeigten eine deutliche Erhöhung der Expression beider NOSTRIN-Isoformen von gesundem zu zirrhotischem Gewebe. NOSTRINalpha mRNA-Mengen waren in zirrhotischen vs. gesunden Proben verdoppelt, und in Proben aus Patienten mit zusätzlicher Hepatitis verdreifacht. Dies deutet darauf hin, dass erhöhte Mengen von NOSTRINalpha zu einer Internalisierung und Inaktivierung der eNOS führen könnten. NOSTRINalpha und NOSTRINbeta wurden ebenfalls in Hep3B-Zellen auf Protein und mRNA-Ebene nachgewiesen, ihre Expression war durch Retinsäure zeit- und dosisabhängig stimulierbar. NOSTRINalpha lokalisiert an Plasmamembran und vesikulären Strukturen, NOSTRINbeta hingegen hauptsächlich im Zellkern, eine geringe Fraktion im Zytosol. Über Kartier-ungsstudien wurden zwei nuclear leading sequences (NLS) identifiziert, die den Transport in den Zellkern vermitteln, sowie eine Crm-1-abhängige nuclear export sequence (NES). Im EMSA konnte die Bindung von NOSTRINbeta an die Promotorregion des NOSTRIN-Gens gezeigt werden. Diese Ergebnisse legen eine Funktion von NOSTRINbeta als Transkriptionsfaktor nahe, evtl. innerhalb einer negativen Rückkopplung auf die NOSTRINalpha-Expression. Weiter-führende Studien sollen diesen potentiellen molekularen Mechanismus im Detail klären.
Ziele der vorliegenden Arbeit waren einerseits die Inventarisierung der Neo- und Archäophyten, die im Stadtgebiet von Frankfurt am Main im Zeitraum 1700-2006 nachweisbar sind, und die Analyse der Veränderungen während dieses Zeitraumes, andererseits die Untersuchung möglicher Auswirkungen von Neo- und Archäophyten auf die Biodiversität am Beispiel von Brachestandorten. Zur Inventarisierung wurde eine Kombination aus Literatur- und Herbarrecherche im Herbarium Senckenbergianum (FR) mit Feldarbeit in Form einer Rasterkartierung zwischen September 2002 und September 2005 mit Nachträgen aus dem Jahr 2006 durchgeführt. 609 Arten (unter Berücksichtigung von Unterarten/Varietäten 634 Sippen) aus 84 Familien wurden über den Gesamtzeitraum nachgewiesen, wobei mehr als 75 % der Sippen zu 20 Familien gehören. Die erfassten Sippen wurden nach ihrer Einwanderungsgeschichte, Einwanderungsweise und ihrem Einbürgerungsgrad bewertet. 54 % aller Sippen erwiesen sich als Ergasiophygophyten. Aktuell wurden 462 anthropochore Sippen nachgewiesen. Die Familie mit den meisten anthropochoren Vertretern sind sowohl aktuell als auch im Gesamtzeitraum die Asteraceae, die auch auf Brachen eine heruasragende Stellung einnehmen. Der gesamte Untersuchungszeitraum wurde in neun Abschnitte untergliedert. Die Häufigkeit jeder Sippe wurde für die einzelnen Abschnitte in einer sechsstufigen Skala, die sich an die Ergebnisse der Rasterkartierung anlehnt, eingeschätzt. Dadurch wurde es erstmals möglich die starke Zunahme der Neophyten in der Stadtflora sowie den Rückgang von Archäophyten für einen Zeitraum von 300 Jahren quantitativ darzustellen. Untersuchungen zur Diversität erfolgten auf Brachestandorten im Stadtgebiet. Dazu wurden 2003 und 2004 insgesamt 220 Vegetationsaufnahmen nach Braun-Blanquet durchgeführt. Die Probeflächen wurden nach geschätztem Alter in vier Kategorien unterteilt und mit Hilfe von Diversitätsindizes (Evenness, Simpsonund Shannon-Index) verglichen. Es zeigte sich, dass die Diversität auf jungen, d.h. 1-2 Jahre alten Brachen, am höchsten ist und mit zunehmendem Alter abnimmt. Brachen, die erst im Untersuchungsjahr angelegt worden waren, zeigten die größte Variabilität. Auf nährstoffreichen Böden war die Diversität besonders hoch, auf nährstoffarmen Böden extrem niedrig. Brachen, die älter als 5 Jahre waren, zeigten die geringste Diversität und die niedrigsten Zahlen von Archäo- und Neophytenarten. Die höchste Gesamtartenzahl auf 25 m² betrug 58, wobei maximal 16 Archäophyten- und 19 Neophytenarten, im Mittel jedoch nur drei Archäophyten- und vier Neophytenarten, nachgewiesen wurden. Zwischen der Gesamtartenzahl auf Brachen und der Artenzahl von Neo- und Archäophyten ließ sich kein signifikanter Zusammenhang feststellen. Allerdings sind Neophyten auf Brachen aller Altersklassen gleich erfolgreich, während Archäophyten ihren Schwerpunkt auf jungen Brachen haben und mit zunehmendem Brachealter zurückgehen. Die beiden am häufigsten auf Brachen gefundenen Sippen sind die indigenen Hypericum perforatum und Artemisia vulagris. Der Neophyt Fallopia x bohemica und das einheimische Calamagrostis epigejos sind als einzige im Untersuchungsgebiet in der Lage Einart-Bestände zu bilden. Andere, auf den ersten Blick von einer Art (z.B. Solidago canadensis) dominierte Flächen, wiesen bei näherer Untersuchung eine für Brachen durchschnittliche Diversität auf. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass jungen Brachen bis zum 3. Jahr eine besondere Bedeutung in der Stadtökologie zukommt. Sie bieten z.B. Segetalarten Lebens- und Rückzugsraum. Die Diversität alter Brachen beruht auf ihrem Mosaik verschiedener Lebensräume, die mit dieser Untersuchung nicht erfasst werden konnten.
Einleitung Uterusmyome gehören zu den häufigsten soliden Tumoren des weiblichen Genitaltraktes. Bei der Mehrheit der Frauen bleiben sie asymptomatisch. Bei Auftreten klinischer Symptome- typischerweise unerfüllter Kinderwunsch und Blutungsanomalien- gilt die operative Behandlung als der Goldstandard. Mögliche Operationsverfahren sind die Hysterektomie und bei nicht abgeschlossener Familienplanung die uteruserhaltende Myomenukleation. Diese kann in Abhängigkeit von Anzahl, Größe und Lokalisation der zu resezierenden Myome per Laparotomie, laparoskopisch oder hysteroskopisch durchgeführt werden. Ein besonderes Problem stellen die Leiomyome im graviden Uterus dar. Üblicherweise verläuft eine Schwangerschaft bei Uterus myomatosus symptomfrei. Bei Auftreten von Komplikationen (z.B. Schmerzen, Blutungen, Abruptio placentae und vorzeitiger Blasensprung) kann auch eine Myomenukleation aus dem graviden Uterus erfolgen; die Indikation sollte dann jedoch streng gestellt werden. Der Uterus septus/subseptus gehört zu den häufigsten kongenitalen Fehlbildungen des weiblichen Genitaltraktes. Üblicherweise haben die betroffenen Frauen keine Beschwerden, in seltenen Fällen führt ein Uterusseptum zu unerfülltem Kinderwunsch. Die Therapie des symptomatischen Uterus septus/subseptus besteht in der Resektion des Septums. Hier gilt die Hysteroskopie (HSK) als das Standardverfahren. Fragestellung Ziele der vorliegenden Dissertationsarbeit waren: 1. Die Ermittlung der Schwangerschaftsraten nach Myomenukleation per Laparotomie, Laparoskopie (LSK) und HSK anhand einer retrospektiven Patientinnenbefragung sowie die Bewertung des Einflusses einer Myomenukleation per Laparotomie, LSK und HSK auf präexistente Blutungsstörungen. Darüber hinaus sollte geklärt werden, welchen Einfluß ein Uterus myomatosus auf eine bestehende Schwangerschaft und die postpartale Entwicklung der betroffenen Kinder nimmt. 2. Die Ermittlung der Schwangerschaftsraten nach hysteroskopischer Septumdissektion anhand einer retrospektiven Patientinnenbefragung. Methodik Mittels einer retrospektiven Krankenblattrecherche wurden 121 Patientinnen ermittelt, die sich zwischen 1993 und 1998 am Zentrum für Gynäkologie und Geburtshilfe des Universitätsklinikums Frankfurt am Main einer Myomenukleation unterzogen hatten. Präoperativ beklagten 51 Patientinnen eine primäre bzw. sekundäre Sterilität, 62 Patientinnen hatten wegen des Uterus myomatosus Blutungsstörungen. Bei acht Patientinnen wurde im Rahmen einer Sectio caesarea eine Myomenukleation durchgeführt. Allen 121 Patientinnen wurde ein zur Beantwortung der Fragestellung eigens entwickelter Fragebogen zugesandt. Mittels einer retrospektiven Krankenblattrecherche wurden 14 Patientinnen ermittelt, die sich zwischen 1993 und 1998 am Zentrum für Gynäkologie und Geburtshilfe des Universitätsklinikums Frankfurt am Main einer hysteroskopischen Septumdissektion unterzogen hatten. Präoperativ beklagten alle 14 Patientinnen unerfüllten Kinderwunsch. Zur Beantwortung der Fragestellung wurde den Patientinnen ein eigens entwickelter Fragebogen zugesandt. Ergebnisse 40 von 51 Patientinnen mit Uterus myomatosus und dem Leitsymptom „Sterilität“ beantworteten den Fragebogen (Rücklaufquote: 78,4%). Die Auswertung ergab, daß nach der Myomenukleation bei 36 dieser 40 Patientinnen weiterhin Kinderwunsch bestand und bei 17 Patientinnen (=47,2%) auch in Erfüllung ging. Dabei wurden zehn von 22 laparotomierten Patientinnen (=45,5%), sechs von elf laparoskopierten (=54,5%) und eine von drei hysteroskopierten Patientinnen schwanger. Zum Befragungszeitpunkt hatten elf von 17 Patientinnen bereits erfolgreich entbunden; bei zwei Frauen dauerte die Schwangerschaft noch an. Drei Patientinnen erlitten einen Abort, zwei nach laparoskopischem Eingriff und eine nach Laparotomie. Bei einer Patientin kam es nach hysteroskopischem Vorgehen zu einer Abdominalgravidität. 33 von 62 Patientinnen mit Uterus myomatosus und dem Leitsymptom „Blutungsstörungen“ beantworteten den Fragebogen (Rücklaufquote: 53,2%). Bei 13 dieser 33 Patientinnen wurde eine Myomenukleation per Laparotomie, bei zehn Patientinnen eine LSK und bei weiteren zehn Patientinnen eine HSK durchgeführt. Sieben von 13 Patientinnen (=53,8%) gaben nach Laparotomie und neun von zehn Patientinnen (=90%) nach LSK eine Normalisierung ihrer Regelblutung an. Bei sieben von zehn Patientinnen bestand nach hysteroskopischer Myomenukleation eine Eumenorrhoe (=70%). Bei acht Patientinnen erfolgte die Myomenukleation im Rahmen einer Sectio caesarea, um einen sicheren Verschluß der Uterotomie durchführen zu können. Alle Patientinnen beantworteten den Fragebogen. Die Auswertung ergab, daß sechs der acht Patientinnen aufgrund des Uterus myomatosus Komplikationenwährend der Schwangerschaft hatten. Die Patientinnen berichteten über Blutungen in der Früh- und Spätschwangerschaft, vorzeitige Wehen und vorzeitigen Blasensprung. Es wurden fünf Knaben und drei Mädchen entbunden. Die postpartale Entwicklung aller Kinder war bis zum Befragungszeitpunkt altersentsprechend verlaufen. Neun von 14 Patientinnen mit Uterus septus/subseptus beantworteten den Fragebogen. Die Auswertung ergab, daß sechs von neun Patientinnen (=66,6%) nach hysteroskopischer Septumdissektion schwanger geworden waren. Davon endete eine Schwangerschaft in der 8.Schwangerschaftswoche (SSW) mit einem Abort. Schlussfolgerung Aus den erhobenen Daten ergibt sich, daß die Myomenukleation bei myominduzierter Sterilität die Fertilität der betroffenen Frauen erhöht und eine Schwangerschaftsrate von ca. 50% ermöglicht. Nach unserer Beobachtung erscheint die Fertilität der betroffenen Patientinnen höher nach LSK als nach Laparotomie bzw. HSK. Auch Blutungsanomalien bei Uterus myomatosus werden durch die operative Myomenukleation positiv beeinflusst. Die gewonnenen Daten deuten darauf hin, daß ein laparoskopisches wie auch ein hysteroskopisches Vorgehen einer Myomenukleation per Laparotomie überlegen ist. Die hysteroskopische Septumdissektion bei Uterus septus/subseptus ist ein Operationsverfahren, welches die Fertilität der betroffenen günstig beeinflusst und eine Schwangerschaftsrate von ca. 67% ermöglicht. Die gewonnenen Daten entsprechen einem Evidenzlevel Grad 5.
Es wird ein effektives Modell zur Berücksichtigung einer Minimalen Länge in der Quantenfeldtheorie vorgestellt. Im Falle der Existenz Großer Extradimensionen kann dies zu überprüfbaren Modifikationen verschiedener Experimente führen. Es werden verschiedene Phänomene wie z.B. der Casimir-Effekt, Neutrino-Nukleon-Reaktionen oder Neutrinooszillationen diskutiert.
Für Experimente der Atomphysikgruppe der GSI in Darmstadt wird ein Ionenabbremser gebaut, der niederenergetische, extrem hochgeladene Ionen zur Verfügung stellen wird. Die Planungen zu der soganennten HITRAP (highly charged ion's trap) begannen Anfang der neunziger Jahre. Mit dieser Anlage sollen hochgeladene, schwere Ionen auf sehr niedrige, thermische Geschwindigkeiten in zwei Stufen abgebremst und für hochpräzise Massenspektroskopie, Messungen des g-Faktors des gebundenen Elektrons wasserstoffähnlicher Ionen und andere atomphysikalische Experimente zur Verfügung stehen. Diese Deceleratoranlage soll zunächst im Reinjektionskanal hinter dem ESR aufgebaut werden, mit der Möglichkeit, alle Komponenten später beim Ausbau der GSI im Rahmen des FAIR-Projektes in der neu zu errichtenden Anlage für niederenergetische Antiprotonen und Ionen zu verwenden. Die vorliegende Arbeit behandelt die Entwicklung und den Aufbau eines integrierten RFQ-Debuncher-Abbremsbeschleunigers, der einen Teil der HITRAP-Abbremsstrukturen darstellt. Mit diesem wird der Ionenstrahl, vom IH-Abbremsbeschleuniger mit einer Energie von 5oo keV/u kommend auf 6 keV/u abgebremst. Mit dem integrierten Spiralbuncher kann der Strahl in Energie und Energieabweichung an die nachfolgende Kühlerfalle angepasst werden. Es wurden in dieser Arbeit die Grundlagen der Teilchendynamik in einem RFQ-Beschleuniger zum Abbremsen von Teilchenstrahlen erarbeitet und umgesetzt, die zur Auslegung einer solchen Struktur notwendigen Teilchendynamikrechnungen mit RFQSim durchgeführt, geeignete Hf-Strukturen mit dem Simulationsprogramm Microwave Studio entwickelt und untersucht, sowie die thermische Belastung der Strukturen mit dem finite Elementeprogramm ALGOR untersucht. Ein weiterer zentraler Punkt dieser Arbeit ist der Aufbau und die Hf-Abstimmung der RFQ-Struktur, um eine möglichst homogene Feldverteilung entlang der Elektroden zu erreichen. Messungen der Felder im RFQ wurden mit einem Störkondensator, am Debuncher mit einem Störkörper durchgeführt. Nach erfolgreich durchgeführten Vakuumtests am IAP ist die RFQ-Debuncher-Kombination nun bereit für erste Hochleistungstests an der GSI.
Deferred imitations assess declarative memory in infants. Many cross-sectional and a few longitudinal studies revealed that, with development, infants learn faster,and retain more target actions over longer retention intervals. Longitudinal stabilities are modest and increase through the second year. To date, there are only few multivariate deferred imitation studies pointing to interactions between declarative memory, language and self-development. However, as these studies applied variable-centered data analysis approaches, the individual stance was not taken into account.Therefore, the present dissertation focuses on the explanation of inter-individual differences of deferred imitation through the second year. In the multivariate, longitudinal Frankfurt Memory Study (FRAMES), declarative memory (deferred imitation), non-declarative memory (train task), as well as cognitive, language, motor, social, emotional and body self-awareness development (Developmental Test for 6-month- to 6-year-olds, ET6-6) were assessed on three measurement occasions (12-, 18- and 24-month-olds). From a psychometric perspective, sound tests for the assessment of deferred imitation in the respective age groups were developed (Paper 1 & 2). Reliability analyses (Paper 3) indicated relatively high short-term-stability for the deferred imitation test (12-month-olds). The co-development of declarative and nondeclarative memory in 12- and 18-month-olds provided evidence for discriminative validity (Paper 4). Longitudinally, deferred imitation performance tremendously increased throughout the second year, and performance was moderately stable between 12 and 18 months and stability increased between 18 and 24 months. Using a person-centered analysis approach (relative difference scores; cluster analysis), developmental subgroups were extracted out of the total sample. These groups differed in terms of mean growth and stability. However, between the first and second measurement occasion, the groups did not differ with respect to motor, cognitive and language development (Paper 5). Using the data of three measurement occasions, subgroups were extracted showing significant differences with respect to language, motor and body self-awareness development (Paper 6). The results are discussed against the background of infancy development theories.
Für den mitochondrialen ABC-Transporter MDL1 (multidrug resistance like) aus Saccharomyces cerevisiae wurde eine Funktion als intrazellulärer Peptidexporter vorhergesagt. MDL1 ist wahrscheinlich am Export von Degradationsprodukten der m-AAA (matrixoriented ATPases associated with a variety of cellular activities) Protease in den Intermembranraum beteiligt (Young et al., 2001). Das MDL1-Homodimer besteht aus zwei Transmembrandomänen mit jeweils sechs potentiellen α-Helices und zwei Nukleotidbindedomänen. Eine Überexpression des ABC-Transporters in E. coli und L. lactis ist nicht möglich. Nur im homologen Expressionssystem kann eine bis zu 100-fach gesteigerte MDL1-Konzentration in Anwesenheit des induzierbaren GAL1-Promotors gegenüber dem endogenen Protein erreicht werden. Differentielle Zentrifugation, Immunogold-Markierungen und Proteasezugänglichkeitsexperimente zeigen, dass MDL1 ausschließlich in der mitochondrialen Innenmembran lokalisiert ist und die Nukleotidbindedomänen zur Matrix orientiert vorliegen. Mit Hilfe von Edman Sequenzierung des gereinigten His-getaggten MDL1 wurde eine 59 Aminosäuren lange mitochondriale Leitsequenz identifiziert. Die Deletionsvariante MDL1(60-695) wird ausschließlich in den Membranen des Endoplasmatischen Retikulums exprimiert. Ihre Motordomänen liegen zytosolisch orientiert vor. Beide MDL1-Varianten bilden homooligomere Komplexe vergleichbarer Größe und weisen ähnliche ATPase Aktivitäten auf. Die physiologischen Konsequenzen der Lokalisation in unterschiedlichen Membranen wurden in Zellen näher untersucht, deren mitochondrialer ABC-Transporter ATM1 (ABC transporter of mitochondria) deletiert ist. ATM1 ist von essentieller Bedeutung für die Biogenese zytosolischer Eisen/Schwefel-Proteine (Lill und Kispal, 2000). Der mitochondriale MDL1-Komplex kann zum Teil die ATM1-Funktion übernehmen, wohingegen ER-ständiges MDL1, als auch ATP Binde- und Hydrolyse inaktive Mutanten, den Δatm1 Wachstumsphänotyp nicht komplementieren können. Die physiologische Funktion von MDL1 ist somit eng mit der mitochondrialen Innenmembran und der Funktionalität des Proteins verbunden. Durch in vivo Komplementationsstudien wurden zwei mitochondriale ABC-Transporter ABCB10 und Pa_2_9660 aus H. sapiens bzw. P. anserina als funktionelle MDL1-Homologe identifiziert.
Im Rahmen der vorliegenden Dissertation sollte der Sphingolipid-Biosyntheseweg der Hefe Pichia ciferrii näher charakterisiert werden, um die Entwicklung einer fermentativen Route zur Sphingosin-Produktion zu ermöglichen. Darüber hinaus galt es patentierbare Selektionssysteme für diese Hefe zu etablieren. Durch Sequenzvergleiche mit nahe verwandten Hefen und das Ableiten degenerierter Primer wurden elf für die Sphingolipid-Biosynthese von Pichia ciferrii relevante Gene isoliert und sequenziert: LCB1 (codiert für eine UE der Serin-Palmitoyltransferase), TSC10 (3-Ketosphinganin-Reduktase), LAG1 und LAF1 (Ceramid-Synthasen), LIP1 (UE der Ceramid-Synthasen), DES1 (Dihydroceramid-delta4-Desaturase), YXC1 (Ceramidase), 8DES (Sphingolipid-delta8-Desaturase), 9MTR (Sphingolipid-C9-Methyltransferase), GCS1 (Ceramid-Glycosyltransferase) und LCB4 (LCB-Kinase). Bioinformatische Analysen, sowie in vivo-Experimente dienten der Einordnung der korrespondierenden Genprodukte in den Stoffwechselweg. Die Bestimmung der Substratspezifität einzelner Enzyme aus der Sphingolipid-Biosynthese erfolgte durch Überexpression der korrespondierenden Gene und anschließende Analyse des Einflusses auf die Zusammensetzung der Sphingolipidfraktion von Pichia ciferrii. Zusammengenommen wurde durch die Ergebnisse ein deutlich geschärftes Bild der Biosynthese von Sphingolipiden in Pichia ciferrii erstellt. Die gewonnenen Erkenntnisse über die Sphingolipid-Biosynthese in Pichia ciferrii fanden Anwendung auf die rationale Stammentwicklung eines Sphingosin-Produzenten. Durch die kombinierte Überexpression der die Dihydroceramid-delta4-Desaturase aus Pichia ciferrii, die Ceramid-Synthase aus Coccolithovirus und eine alkalische Ceramidase aus Mus musculus kodierenden Gene wurde eine 8,5-fache Erhöhung der Sphingosin-Konzentration von 7,5 mg/L in vom Wildtyp abgeleiteten Syringomycin-E-resistenten Stämmen auf 64,0 mg/L erzielt. Die Codon-Optimierung der heterolog exprimierten Gene zur Anpassung an die sehr eingeschränkte Codon-Verwendung von Pichia ciferrii erwies sich hierbei als essentiell. Zur Nutzbarmachung von rekombinanten Pichia ciferrii-Stämmen für die industrielle Anwendung wurden darüber hinaus drei neue Selektionssysteme etabliert. Zum einen wurde eine codon-optimierte Form des nat1-Gens genutzt, um eine Nourseothricin-Resistenz zu vermitteln. Zum anderen wurden stabile Uracil- bzw. Lysin-auxotrophe Pichia ciferrii-Stämme erzeugt, die mittels eines entsprechenden Integrationsvektors mit den Auxotrophie-Markergenen URA3 bzw. LYS2 aus Pichia ciferrii zu prototrophen Stämmen komplementiert werden konnten. Zusammengenommen mit der ersten gezielten Disruption eines Gens in Pichia ciferrii (SYR2, codiert für die Sphinganin-Hydroxylase) konnte somit auch die molekularbiologische Handhabbarkeit von Pichia ciferrii deutlich verbessert werden.
Der ubiquitäre Redoxregulator Thioredoxin-1 (Trx-1) hat wichtige Funktionen für den zellulären Redoxstatus, Zellwachstum und Apoptose. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind beteiligt an der Pathogenese kardiovaskulärer Erkrankungen wie der Atherosklerose und werden zunehmend in ihrer Rolle als intra- und extrazelluläre Signalmoleküle charakterisiert. Ein Ungleichgewicht zwischen der Entstehung von ROS und ihrem Abbau durch antioxidative Systeme führt zu oxidativem Stress, zur Oxidation von Proteinen und letztlich zum Zelltod. Daher wurde in dieser Doktorarbeit untersucht, wie reaktive Sauerstoffspezies Trx-1 in Endothelzellen regulieren, welchen Einfluss dies für die Endothelzellapoptose hat und welche Bedeutung Antioxidantien, Stickstoffmonoxid (NO) und Schubspannung haben. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass H2O2 konzentrationsabhängig die Expression von Trx-1 beeinflusst. Geringe Konzentrationen H2O2 wie 10 und 50 µM induzierten Trx-1-mRNA nach 3 Stunden. Auf Proteinebene fand sich dann nach 6 Stunden eine transiente Hochregulation von Trx-1. Diese geringen Konzentrationen von H2O2 wirkten antiapoptotisch. Dieser antiapoptotische Effekt war von der Trx-1 Proteinexpression abhängig. Im Gegensatz dazu kam es bei hohen Konzentrationen H2O2 zu einer Degradierung von Trx-1. Durch das Antioxidans NAC und NO konnte der Abbau von Trx-1 unter höheren H2O2-Konzentrationen verhindert werden. Untersuchungen zum Mechanismus des Degradierungsprozesses ergaben, dass Trx-1 durch die Aspartatprotease Cathepsin D abgebaut wird. Der protektive Effekt von NO auf die Trx-1 Expression konnte auch im Gewebe eNOS-defizienter Mäuse gezeigt werden, da bereits eNOS-defiziente Mäuse in den Nieren weniger Trx-1 Protein aufwiesen im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollmäusen. Bei der Entstehung endothelialer Läsionen und der Stabilität atheromatöser Plaques spielt die Endothelzellapoptose vermutlich eine wichtige Rolle. Trx-1 schützt Endothelzellen vor Apoptose, wird jedoch unter oxidativem Stress abgebaut. Faktoren, die Trx-1 unter oxidativem Stress stabilisieren wie NAC und NO, kommt daher eine besondere Bedeutung für die Endothelzellhomöostase zu.
Bei inflammatorischen Schmerzen kann durch Hemmung der COX-2 im Rückenmark die zentrale Sensibilisierung reduziert werden. Da die Hemmung der gesamten COX-2 vermittelten Prostaglandinsynthese jedoch zahlreiche unerwünschte Nebenwirkungen verursacht, wird in jüngster Zeit diskutiert, ob eine selektive Hemmung der PGE2 Synthese auf Ebene der mPGES-1 für die Therapie passagerer Schmerzen sinnvoller ist. Um die funktionellen Rollen von COX-2 und mPGES-1 im Rückenmark zu charakterisieren, wurden in der vorliegenden Arbeit die Folgen einer COX-Inhibierung und mPGES-1-Deletion auf den spinalen Eicosanoidmetabolismus, die neuronale Erregbarkeit, die Synthese proinflammatorischer Zytokine und das nozizeptive Verhalten untersucht. Das proinflammatorische Zytokin TNFa induzierte in primären Rückenmarksneuronen eine COX-2- und mPGES-1-Expression und eine erhöhte PGE2 Synthese. Diese Induktion der PGE2 Synthese konnte durch den selektiven COX-2 Inhibitor Rofecoxib und den „selektiven COX-1 Inhibitor“ SC-560 gleichermaßen potent gehemmt werden. Da der Effekt von SC-560 unerwartet war, wurde sein Wirkmechanismus genauer untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass SC-560 in Rückenmarkskulturen weder die COX-2 und mPGES-1 Expression, die PLA2 Aktivität, die mPGES-1 Aktivität noch den PGE2 Transport hemmte. Durch Experimente mit Zellen aus COX-1-/- Mäusen konnte gezeigt werden, dass SC-560 in Rückenmarkskulturen die COX-2 unabhängig von COX-1 in nanomolaren Konzentrationen inhibiert. Da dieses Ergebnis den postulierten COX-1-selektiven Eigenschaften von SC-560 widersprach, wurde nach der Ursache für den Verlust der COX-1-Selektivität gesucht. Es zeigte sich, dass SC-560 in einer zellfreien in vitro Synthese und im Vollbluttest mit klarer Selektivität COX-1 hemmt. In kultivierten Rückenmarkszellen, RAW-Makrophagen und Blutzellen (Monozyten und Thrombozyten) inhibiert SC-560 allerdings d beide COX-Isoformen potent. Es wurde dadurch deutlich, dass die zelluläre Einbindung von COX-2 sowie ein niedriger Proteingehalt im extrazellulären Medium die halbmaximalen Konzentrationen (IC50) für die COX-2-Hemmung durch SC-560 stark reduzieren kann und hierdurch die COX-1-Selektivität der Substanz verloren geht. Neben einer COX-2 Hemmung verursachte auch eine mPGES-1-Deletion in Rückenmarkskulturen sowie im adulten Rückenmark eine Reduktion der PGE2 Synthese. Überrachenderweise bewirkte jedoch die mPGES-1-Defizienz im Gegensatz zur COX-2 Hemmung durch Etoricoxib im Zymosanmodell keine Reduktion der mechanischen Hyperalgesie. Um die Ursache für die unterschiedliche antihyperalgetische Wirkung der COX-2-Hemmung und mPGES-1-Deletion zu finden, wurden zunächst die Konsequenzen für die gesamte Prostaglandinsynthese untersucht. Die Analyse mittels LC-MS/MS zeigte, dass im Rückenmark mPGES-1-defizienter Mäuse verstärkt PGI2, PGF2a und PGD2 synthetisiert wird. Da für alle drei Prostaglandine bereits pronozizeptive Effekte beschrieben wurden, wurde die Expression von den entsprechenden Rezeptoren im Rückenmark und die Konsequenzen der Rezeptoraktivierung auf die neuronale Erregbarkeit untersucht. Mittels „calcium imaging“ wurde demonstriert, dass selektive IP Rezeptoragonisten in Rückenmarksneuronen eine PKA und PKC vermittelte Phosphorylierung der NMDA Rezeptoren verursachen und die Aktivierbarkeit der NMDA Rezeptoren sensibilisieren. Eine Verstärkung des NMDA induzierten Calciumeinstromes konnte nach Applikation der anderen Prostaglandine nicht beobachtet werden. Die Ergebnisse zeigen daher, dass in mPGES-1-defizienten Mäusen durch die Umleitung der Prostaglandinsynthese zu Prostacyclin die exzitatorischen NMDA Rezeptoren sensibilisiert und hierdurch die antihyperalgitische Wirkung von PGE2-Synthesehemmung kompensiert werden kann. Zusammenfassend lässt sich aus den Ergebnissen schlussfolgern, dass mPGES-1 als Zielmolekül für die Schmerztherapie eher nicht eignet ist. mPGES-1-defiziente Tiere zeigten in inflammatorischen Schmerzmodellen ein normales nozizeptives Verhalten. Dies kann dadurch erklärt werden, dass es nach einer mPGES-1 Deletion im Rückenmark zwar zur Reduktion der PGE2 Synthese aber auch gleichzeitig zur verstärkten Synthese anderer pronozizeptiv wirkender Prostaglandine kommt.
Both practitioners and academics agree about the importance of price and its direct influenceon consumers’ purchase decision as well as the company profit. In the reality, we rarely see a
single price for a given product. One visit in a store already shows that consumers face many various prices. This strategy of differential prices allows to increase profit but also improves consumers’ situation and increases welfare. A wide range of various price differentiation mechanisms exists on the market which makes price differentiation a very interesting phenomenon. Additionally, market developments constantly allow for new price differentiation applications. In this work, I research a fascinating topic of price differentiation, its various forms
and new application possibilities in changing market areas.
I investigate some of the inert phases in three-flavor, spin-zero color-superconducting quark matter: the CFL phase (the analogue of the B phase in superfluid 3He), the A and A* phases, and the 2SC and sSC phases. I compute the pressure of these phases with and without the neutrality condition. Without the neutrality condition, after the CFL phase the sSC phase is the dominant phase. However, including the neutrality condition, the CFL phase is again the energetically favored phase except for a small region of intermediate densities where the 2SC/A* phase is favored. It is shown that the 2SC phase is identical to the A* phase up to a color rotation. In addition, I calculate the self-energies and the spectral densities of longitudinal and transverse gluons at zero temperature in color-superconducting quark matter in the CFL phase. I find a collective excitation, a plasmon, at energies smaller than two times the gap parameter and momenta smaller than about eight times the gap. The dispersion relation of this mode exhibits a minimum at some nonzero value of momentum, indicating a van Hove singularity.
Transport of proteins into or across cellular membranes is mediated by the conserved and ubiquitous Sec-machinery. The Sec-homologue in the inner membrane of Escherichia coli is SecYEG. Sec-mediated insertion of numerous membrane proteins is aided by YidC, another protein integral to the inner membrane of Escherichia coli. YidC fulfils in addition the integration of a variety of membrane proteins Sec-independently. It belongs to a conserved but structurally uncharacterised family of proteins important for membrane protein biogenesis and comprises homologues in mitochondria and chloroplasts. By modification of a former crystallisation protocol two-dimensional crystals of SecYEG were grown in presence of the signal sequence peptide of LamB. Recording of structural data by electron cryo-microscopy and calculation of a difference structure comparing a former SecYEG projection structure with the one of SecYEG crystallised in presence of the substrate revealed several new and vacant densities. These hint to signal peptide binding close to the translocation pore and to significant rearrangements in proximity to the lateral exit site for transmembrane domains in SecYEG. The difference structure suggests that dimeric SecYEG is an asymmetric molecule consisting of one active and one inactive SecYEG monomer. Detergent removal from a mixture of purified YidC and lipids produced two-dimensional crystals that were highly dependent on the ionic strength and lipid composition for their growth. Electron cryo-microscopy on the frozen-hydrated crystals and image processing visualised structural details at about 10 Å resolution. Averaging two alternative projection structures in p2 and p121_a symmetry, respectively, yielded essentially the same features. Four YidC monomers form one unit cell (dimensions 82 x 71 Å, included angle 85 ° and 90 °, respectively) and seem to be arranged as two sets of dimers integrated in an anti-parallel fashion into the membrane. An area of low density in the centre of each YidC monomer resembles possibly a constriction of the membrane, which could have particular relevance for the integration of substrate proteins into the lipid bilayer.
Lineare sowie zyklische 3-Alkylpyridinalkaloide sind vor allem in Schwämmen der Ordnung Haplosclerida, zu der auch Haliclona viscosa zählt, weit verbreitet. Die Synthese der zuvor von C. Volk isolierten Haliclamine C und D, des Viscosamins und des Viscosalin C bildete den Ausgangspunkt dieser Arbeit.[1-4] Sie erfolgte ausgehend von den bekannten Synthesen der Cyclostellettamine und Haliclamine[5-7] und gliedert sich in drei Abschnitte: erstens Synthese eines ω-Hydroxyalkylpyridins aus einem Bromalkohol, zweitens Funktionalisierung der Monomere in Abhängigkeit der gewählten Methode zur Di- bzw. Trimerisierung und drittens Verknüpfung und gegebenenfalls Zyklisierung. Durch Anwendung und Weiterentwicklung der bekannten Synthesewege wurden so insgesamt 14 lineare Monomere, zwei zyklische Monomere, 16 Cyclostellettamine, zwei Isocyclostellettamine, sieben Haliclamine, fünf Viscosaline sowie Viscosamin[8] und ein Analogon mit Heptylkette hergestellt. Dieser synthetische Zugang ermöglichte es, sowohl den finalen Strukturbeweis für die zuvor isolierten Verbindungen zu erbringen, als auch durch die Analyse der Fragmentierungs-muster von synthetischen und natürlichen Verbindungen mehr über das Verhalten dieser Verbindungen unter MS-Bedingungen zu erfahren. Die so gewonnenen Erkenntnisse führten dazu, dass drei unbekannte Verbindungen ohne Isolierung der Reinsubstanz mit einer Kombination von MS- und HPLC-Daten identifiziert werden konnten. So konnten das erste monozyklische 3-Alkylpyridinalkaloid marinen Ursprungs und zwei neue Haliclamine identifiziert und synthetisiert werden Des Weiteren gelang es, für die von C. Volk isolierten, jedoch nicht identifizierten Verbindungen Strukturen zu ermitteln bzw. auf Grund der MS-Daten Strukturvorschläge zu machen. Die durch den synthetischen Zugang große Anzahl verfügbarer 3-Alkylpyridinalkaloide ermöglichte außerdem eine systematische Untersuchung über den Zusammenhang von biologischer Aktivität und Struktur. Die Ergebnisse der am Helmholtz Institut für Infektionsforschung durchgeführten Experimente zu den antibakteriellen sowie cytotoxischen Eigenschaften von natürlichen wie auch rein synthetischen 3-Alkylpyridinalkaloiden zeigten, dass die Aktivität sich schon beim Addieren bzw. Subtrahieren einer Methylengruppe in einer Alkylkette signifikant ändert. [1] C. A. Volk, M. Köck, Org. Lett. 2003, 5, 3567-3569. [2] C. A. Volk, M. Köck, Org. Biomol. Chem. 2004, 2, 1827-1830. [3] C. A. Volk, H. Lippert, E. Lichte, M. Köck, Eur. J. Org. Chem. 2004, 3154-3158. [4] C. A. Volk, Dissertation, Johann Wolfgang Goethe Universität (Frankfurt am Main), 2004. [5] A. Grube, C. Timm, M. Köck, Eur. J. Org. Chem. 2006, 1285-1295 und Referenzen darin. [6] J. E. Baldwin, D. R. Spring, C. E. Atkinson, V. Lee, Tetrahedron 1998, 54, 13655-13680. [7] A. Kaiser, X. Billot, A. Gateau-Olesker, C. Marazano, B. C. Das, J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8026-8034. [8] C. Timm, M. Köck, Synthesis 2006, 2580-2584.
Untersuchungen zur zerstörungsfreien Emittanzmessung an einem negativen Wasserstoffionenstrahl
(2007)
Die Arbeit beschäftigte sich sowohl theoretisch wie auch praktisch mit einem neuartigen Konzept zur Strahldiagnose — der zerstörungsfreien Emittanzmessung für negative Ionenstrahlen. Bei H¯ Strahlen kann auf mechanische Bauteile verzichtet werden, wenn bei einem kleinen Teil der H¯ Ionen das zusätzliche, nur mit 0,754 eV schwach gebundene Elektron durch Photodetachment abgelöst wird. Die neutralisierten H¯ Ionen können magnetisch oder elektrostatisch von den Elektronen und den verbliebenen H¯ Ionen separiert werden. Insbesonders die Neutralteilchen bieten sich zur Bestimmung der Phasenraumverteilung des Ionenstrahls an, da der Impulsübertrag bei der Photoneutralisation für die vorliegende Anwendung vernachlässigbar ist. Die Detektion des Divergenzwinkels kann durch einen Szintillator mit einer CCD–Kamera erfasst werden. Ein Modell zur Berechnung der Anzahl der neutralisierten Teilchen ist unter der Annahme homogener Dichteverteilungen entwickelt worden, um Aussagen zu den Anforderungen an Lasersystem und Detektor zu machen. Dabei zeigt sich die besondere Eignung des Meßverfahrens für Strahlstöme und Strahlparameter, wie sie typischerweise nach einem RFQ vorliegen. Da im Gegensatz zur Schlitz–Schlitz Emittanzmessung wird hier die Winkeldetektion mit einem ortsauflösenden Szintillator durchgeführt. Daraus ergibt sich als neues Verfahren eine Schlitz–Punkt Abbildung. Im Vergleich zum Schlitz–Schlitz Messprinzip können damit mehr Informationen über die Phasenraumverteilung gewonnen werden. Um diese neue Abbildungsfunktion zu untersuchen, ist eine Methode zur Simulation der Winkeldetektion entwickelt worden. In den Simulationen ist angenommen worden, daß der Schlitz bzw. Laser analog zur Messung einer yy´ Emittanz entlang der y–Achse durch den Ionenstrahl gefahren wird, die ausgeschnittene Teilchenverteilung ist bis zum Ort des Szintillators transportiert worden. Dabei sind etliche Zusammenhänge der Abbildungsfunktion zwischen den 2dim Phasenraumprojektionen yy´ , xx´ und der Verteilung der neutralisierten Ionen auf dem Teilchendetektor aufgezeigt worden. Dabei läßt sich nachweisen, daß die Aberrationen aus der anderen transversalen Ebene (x–Ebene) die Verteilungsfunktion mit beeinflusst. Für die experimentellen Untersuchung der Photodetachment Strahldiagnose wurde eine Beamline aus Ionenquelle mit Dumpingsystem, differentiellem Pumptank und Linsensystem aufgebaut. Dabei wurde bei einer vorhandenen H¯ Quelle der Strom von anfänglich 70 mycroA auf 2,5 mA gesteigert. Das Dumpingsystem erwies sich als sehr effektiv und lenkte bis zur Nachweisgrenze alle zusätzlich extrahierten Elektronen aus dem Strahl aus. Die Komponenten und der gesamte Aufbau zur Photodetachment Strahldiagnose schließen den Dipol bzw. die Konstruktion der Vakuumkammer zur Ladungsseparation, die Auswahl eines geeigneten Szintillators und die Bestimmung der Laserstrahlparameter und dessen Strahlwegs mit ein. Bei den Experimenten zur Photoneutralisation konnte eindeutig das Meßsignal dem Photodetachment zugeordnet werden. Auch die Linearität des Szintillators konnte eindeutig gezeigt werden. Ebenfalls konnte die Beeinflussung der Einzellinsen auf den Ionenstrahl an Hand neutralisierter Teilchen gezeigt werden: Bei Vergrößerung der Brechkraft wurde der zunächst große Strahldruchmesser mit einem Intensitätsmaximum im Strahlkern zu einer hohlstrahlähnlichen Verteilung mit einem Peak in der Strahlmitte und am Strahlrand fokussiert. Bei weiterer Steigerung der Linsenspannung ließ sich die Intensität im Strahlrand wieder reduzieren. Durch die Veränderung der y–Position wurden Winkelprofile mit den zuvor gemessenen Schlitz–Schlitz Emittanzfiguren verglichen. Dabei konnte der Divergenzwinkel und auch die Lage des Strahlkerns im Rahmen der Meßgenauigkeit sehr gut wiedergegeben werden. Andererseits zeigten sich deutliche Unterschiede bei der Auswertung der Intensitäten. Dies ist zum Teil auf die schlechte Wiedergabe eines Holhlstrahls durch eine zweidimensionale Phasenraumprojektion yy´ zu erklären. Außerdem ist der Ionenstrahl durch die kleine Bauhöhe der Magnetkammer kollimiert worden, was den Strahl im Vergleich zu den vorherigen Schlitz–Schlitz Emittanzmessungen nachhaltig beeinflusst hat. Dagegen wiesen im direkten Vergleich, nämlich der zweidimensionalen, „wahren“ Ortsverteilung des Ionenstrahls am Szintillator mit den aufaddierten Neutralteilchen–Verteilungen, beide Verteilungen sehr ähnliche Muster auf. Die Messungen sind fast ausnahmslos an stark aberrationsbehafteten Ionenstrahlen durchgeführt worden. Dabei konnte die in den Simulationen der Abbildungseigenschaften gefundenen geschlossenen, achtförmigen Verteilungen unter Berücksichtigung der begrenzten Nachweisempfindlichkeit des Detektors sehr gut nachvollzogen werden.
This work analyses several granitic bodies of the Variscan Orogen of Central and Western Europe in order to improve our knowledge about different aspects of their evolution, regarding their ascent and emplacement mechanisms, as well as their deformation history. In the Iberian Massif two granitoid bodies, namely the La Bazana pluton and the Nisa-Alburquerque batholith, were studied in order to decipher their ascent and emplacement history. The La Bazana pluton is a small, sub-circular body in map view that intruded into rocks of the Ossa-Morena Zone in the core of a late upright antiform. Its three-dimensional drop-pipe shape, its internal dome foliation pattern and the structure of the host rock suggest that the magma ascended and emplaced diapirically. The Nisa-Alburquerque batholith is a large body that intruded into rocks of the Central Iberian Zone, the Central Unit, and the Ossa-Morena Zone. Its cartographic shape is elongate and parallel to the NW—SE to WNW—ESE Variscan structures. In the light of the available structural data and the gravimetric models, the intrusion is viewed as a continuous lateral magma flow from the eastern root guided towards the west through the southern limb of a kilometre-scale antiform. As mass-transfer mechanisms, a combination of rigid translation of the country rocks, stoping, and possibly ballooning is proposed. In the Bohemian Massif several small granitoid bodies showing a strong solid-state deformation were studied in order to integrate their tectonometamorphic history in the geotectonic framework of the south-western Bohemian Massif, focusing principally on the deformation phase referred to as D3. Four ductile deformation phases are proposed for the study area. D1 produced high-temperature fabrics under upper amphibolite to granulite facies conditions. Its kinematics is unknown. D2 occurred under amphibolite to upper greenschist facies conditions under N—S to NNW—SSE compression. It is responsible for a subvertical NW—SE striking foliation in migmatites developed under dextral simple shear and for the deformation at the Bayerischer Pfahl shear-zone system at its earlier stages. Many granitoid dykes and stocks were found to be affected by sinistral shear along subvertical planes trending ENE to ESE. Since this deformation, which is called D3 in the present work, is not compatible with a N—S to NNW—SSE compression, it is proposed that these sinistral shear zones in granites do not belong to the Bayerischer Pfahl shear-zone system and constitute themselves a separated one, which is called “D3 shear-zone system”. D3 took place under upper greenschist to lower amphibolite facies conditions (~480-550°C). Both the intrusion and the deformation of the granites affected by D3 occurred at deep to intermediate levels of the crust, whereas the deformation took place under NE—SW compression. Datings on two of the deformed granites yielded 324.4 ± 0.8 Ma and 315.0 ± 1.0 Ma: Thus, the age of D3 is most probably ~315 Ma. The intrusion of most of the sheared granitoids was pre-kinematic with respect to D3. After D3 the N—S to NNW—SSE compression which governed D2 was restored, giving way to the next deformation phase D4, which was linked to further deformation at and next to the principal shears of the Bayerischer Pfahl shear-zone system under greenschist facies conditions. The causes for the change of the stress field leading to a NE—SW compression during D3 might be related to (1) global changes in the dynamics of the tectonic plates in late Variscan times, (2) orogenic collapse leading to the sinking of the Teplá-Barrandian and lateral extrusion of the surrounding Moldanubian rocks, (3) distortion of the regional stress field by local intrusion of large stocks, such as the Saldenburg granite of the Fürstenstein Massif, or (4) distortion of the regional stress field due to the existence of ephemeral releasing bends in the Bayerischer Pfahl shear zone during its early evolution.
Die Funktion biologischer Peptide und Proteine hängt wesentlich von deren intakten molekularen Struktur ab. Krankheiten, wie z.B. Alzheimer oder Diabetes, entstehen durch fehlgefaltete, aggregierte Peptidstrukturen. Die Ausbildung einer nativ gefalteten Konformation wird durch die Formierung von Sekundärstrukturelementen - in charakteristischer Weise angeordnete lokale Strukturen - initiiert und bildet einen geschwindigkeitslimitierenden Schritt in der Proteinfaltung. Die Erforschung und Analyse dieser ersten Faltungsprozesse ist deshalb von grundlegender Relevanz in der biophysikalischen Forschung, auch in Hinblick auf pharmazeutisch-medizinische Anwendungen. Bei der Untersuchung des Faltungsmechanismus kommen vor allem kleine Peptide mit eindeutig ausgebildeten Sekundärstrukturmotiven zum Einsatz. Ihre geringe Größe und strukturelle Eindeutigkeit machen diese kleinen Peptide zu idealen Modellsystemen, um diejenigen Faktoren zu untersuchen, die die Proteinfaltung steuern und beeinflussen. Die zur Untersuchung der Faltungsprozesse verwendeten Techniken müssen dabei sowohl eine Spezifität für die unterschiedlichen Strukturelemente, als auch eine der Faltungsdynamik angemessen Zeitauflösung besitzen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden CD- und FTIR-Messungen zur Untersuchung der Strukturstabilität von Polypeptiden unter Gleichgewichtsbedingungen durchgeführt. Durch Variation von pH-Wert und Temperatur wurden damit Stabilitätseigenschaften ausgewählter Peptidsysteme analysiert. Um zeitaufgelöste Faltungsdynamiken von Peptiden detektieren zu können, wurde ein Spektrometer mit Laser-induziertem Temperatursprung (DeltaT ca. 10 °C in 10 ns) und IR-Einzelwellendetektion so modifiziert und optimiert, dass Peptiddynamiken im nanosec bis microsec Zeitbereich gemessen werden konnten. Neben der Modifikation der Temperatursprung-Apparatur, bei der optische Komponenten ersetzt und Störsignale reduziert wurden, konnte auch die Auswertung der kinetischen Daten durch die Entwicklung eines geeigneten Algorithmus verbessert werden. Als notwendige Vorarbeit der Faltungsstudien an Peptiden in wässriger Lösung wurden statische FTIR-Absorptionsmessungen am Lösungsmittel D2O durchgeführt. Dadurch wurden die durch Temperaturvariation erzeugten Absorptionsänderungen des Lösungsmittels ermittelt. Diese wurden zudem zur Kalibrierung des Laser-induzierten Temperatursprunges verwendet. Um Lösungsmittelabsorptionen von strukturellen Änderungen des Peptids zu trennen, wurde ein Auswerteverfahren entwickelt, das die temperaturabhängigen Absorptionsänderungen des Lösungsmittels berücksichtigt. Temperatur- und pH-abhängige Konformationsdynamik wurde am alpha-helikalen Peptid Polyglutaminsäure untersucht. Zunächst wurden CD- und FTIR-Messungen zur Thermostabilität und der Reversibilität der Ent- und Rückfaltung unter Gleichgewichtsbedingungen und bei unterschiedlichen pH-Werten durchgeführt. Der thermisch induzierte Strukturübergang von alpha-Helix nach ungeordneter Knäuel-Struktur wurde mit Hilfe der Laser-induzierten Temperatursprung-Technik zeitaufgelöst untersucht und Relaxationsraten bei verschiedenen pH-Werten bestimmt. Weitere Messungen zur Konformationsstabilität und –dynamik wurden an beta- Hairpin-Peptiden durchgeführt, die kleine Modellsysteme für beta-Faltblattstrukturen darstellen. Die in dieser Arbeit untersuchten Trpzip2C Peptide, die aufgrund hydrophober Wechselwirkungen der Tryptophane eine stabile beta-Hairpin-Struktur in wässriger Lösung ausbilden, waren an verschiedenen Positionen innerhalb der Aminosäure-sequenz selektiv isotopenmarkiert. Durch diese Markierungen im Peptidrückgrat werden spezifisch spektrale Änderungen im Infrarotspektrum erzeugt, die Untersuchungen zur Amidbandenkopplung und lokalisierten Strukturdynamik ermöglichen. Diese Ergebnisse stellen die erste Anwendung der Kombination von selektiv isotopenmarkierten alpha-Hairpin-Peptiden und der Temperatursprung-Technik dar, um Konformationsdynamiken ortsaufgelöst zu untersuchen. Für alle untersuchten Trpzip2C-Peptidvarianten konnte gezeigt werden, dass der Faltungsprozess in einem Temperaturbereich unterhalb von ~ 300 K nicht durch ein Zwei-Zustandsmodell beschrieben werden kann, sondern Intermediate gebildet werden. In diesem Temperaturbereich konnten wellenlängenabhängig Unterschiede in Relaxationsraten gemessen werden, die die Hypothese des „hydrophoben Kollaps“ für den Faltungsmechanismus dieser beta-Hairpin-Peptide unterstützen.
A detailed understanding of how potassium channels function is crucial e. g. for the development of drugs, which could lead to novel therapeutic concepts for diseases ranging from diabetes to cardiac abnormalities. An improved understanding of channel structure may allow researchers to design medication that can restore proper function of these channels. This is particularly important for KCNQ channels, since four out of five family members are involved in human inherited disease. In addition to structure and function relationships the determinants which govern assembly of KCNQ subunits are decisive to understand the physiological role of the KCNQ channel family members. Many details of KCNQ channel assembly remain incompletely understood. Previous work has shown that the subunit-specific heteromerisation between KCNQ subunits is determined by a ~115 amino acid-long subunit interaction domain (si) within the C-terminus (Schwake et al., 2003). Recently, Jenke et al. (2003) proposed that the C-terminal domains in eag and erg K+ channels act as sites which drive tetramerization. From their ability to form coiled coils, these domains were referred to as tetramerizing coiled-coil (TCC) sequences. Jenke et al. also pointed out that KCNQ channels contain bipartite TCC motifs within their C-termini, exactly within the si domain, which is responsible for the subunit-specific interaction pattern. The first part of this thesis was dedicated to determine the individual role of these TCC domains on homomeric and heteromeric channel formation in order to further characterize the molecular determinants of KCNQ channel assembly. In the second part of this thesis cystein-scanning mutagenesis was employed, followed by thiol-specific modification using MTS reagents to screen more than 20 residues in the S3-S4 linker region and in the S4 transmembrane domain of the KCNQ1 channel to gain information about residue accessibility, the functional effects of thiol-modifying reagents (MTSES), and effects of crosslinking selected pairs of Cys residues by Cd+ ions, which could be used for testing model predictions based upon known Kv channel structures from the literature. According to homology modelling based on the Kv1.2 structure it was attempted to determine the proximity of individual residues from different transmembrane segments using the metal bridge approach (crosslinking by Cd+ ions). This led us to derive structural constraints for interactions between the S4 voltage sensor and adjacent transmembrane segments of KCNQ1. Similar studies have previously been performed on the Shaker K+ channel, which has served as a paradigm for structure-function research of voltage-gated K+ channels for a long time, but little is known for KCNQ channels concerning their similarity to published K+ channel structures.
Molecular mechanism of intracellular signal transduction by the angiotensin-converting enzyme
(2007)
The angiotensin converting enzyme (ACE) is an important component of the renin-angiotensin system (RAS) and is crucially involved in the homeostasis of fluid and electrolyte balance and thus in the regulation of blood pressure. The zinc metallopeptidase is involved in the generation of angiotensin II, a potent vasoconstrictor and in the degradation of bradykinin, a potent vasodilator. It is worth noting that ACE more readily hydrolyzes bradykinin than it does angiotensin I thus culminating in the net physiological effect of the production of a vasoconstrictor and the decrease in the availability of a vasodilator. ACE inhibitors have become one of the most successful therapeutic approaches as a first line of therapy in hypertension, and are also widely used in treating heart failure, myocardial infarction, stroke, coronary artery disease and impaired left ventricular function. However, one unexpected clinically relevant finding related to ACE inhibitors is their ability to delay the onset of type II diabetes that was revealed by various large clinical trials. However, the mechanisms underlying these beneficial effects of ACE inhibitor therapy are currently unclear and cannot be explained by the prevention of angiotensin II formation or the attenuated degradation of bradykinin. Thus the potential beneficial effects attributed to ACE inhibitors may occur independent of reductions in blood pressure paving way for new and/or unknown mechanism. Our group has recently redefined ACE as a signal transduction molecule which upon binding to ACE inhibitor turns on a signalling cascade leading to phosphorylation of Ser1270 by CK2, activation of JNK and changes in gene expression in endothelial cells. However the mechanism by which ACE inhibitor initiates the signalling cascade was not clear. It was hypothesized that ACE, which is anchored to the membrane with a single transmembrane domain should dimerize prior to initiating further downstream signalling events in endothelial cells. Therefore, we sought to explore whether or not ACE forms dimers in endothelial cells and whether ACE dimerization is essential for the initiation of ACE signalling in endothelial cells. Using native gel electrophoresis, we found that ACE forms dimers in endothelial cells and that there is an increase in the dimer formation upon treatment of endothelial cells with ACE inhibitors. ACE homodimerization was also demonstrated using the split-ubiquitin system and chemical cross-linking experiments. ACE dimers are also formed in endothelial cells overexpressing the non-phosphorylatable ACE, wherein ACE signalling was abolished indicating that dimerization process is not influenced by the phosphorylation of the serine residue residing in the cytoplasmic tail. Monosaccharides like glucose, galactose and mannitol did not have any influence on ACE-inhibitor induced dimerization. Making use of different monoclonal antibodies directed to the epitopes of N-domain which harbours carbohydrate recognizing domain, also did not affect dimerization. However, inactivation of the C-domain active site by introducing mutation of the key histidine residues in HEMGH consensus sequences, which complexes the zinc ions, abolished enzyme dimerization both in the basal state and in response to ramiprilat. Mutation of the C-domain also resulted in the loss of ACE inhibitor-induced ACE signalling, that is we failed to observe ramiprilat-induced increase in the phosphorylation of the Ser1270 and the subsequent JNK activation. ACE-inhibitor induced dimerization precedes the phosphorylation of Ser1270 and activation of JNK. Thus the ACE-inhibitor induced dimerization via the C-domain of ACE represents the initial step in the ACE signalling pathway which involves the activation of JNK/c-Jun pathway and leading to the changes in the gene expression in endothelial cells. Our group previously identified ACE itself as well as cyclooxygenase-2 (COX-2) as two “ACE signalling-regulated” genes. To screen for additional genes regulated in a similar manner we used DNA microarray technology, to assess ramiprilat-induced changes in the endothelial cell gene expression. 21 genes were identified to be differentially regulated of which, 7 were upregulated and 14 were downregulated by ramiprilat. However, when screened at the protein level, we found no significant differences between the untreated control cells and those treated with ramiprilat. As several other cells and tissues possess a fully functional RAS we screened plasma samples from healthy volunteers as well as from patients with coronary artery disease for the proteins identified in the microarray. We observed that the cellular retinal binding protein-1 (CRBP-1) was detectable at low levels in plasma from patients and that ramipril markedly increased serum levels of this protein. Endothelial cells overexpressing CRBP-1 demonstrated increased RXRE and PPRE activity when stimulated with 9-cis retinoic acid and rosiglitazone respectively suggesting that CRBP-1 might affect gene expression via heterodimerization of PPAR elements with RXR elements by virtue of its function as a transport protein of retinoic acid. Studies aimed at determining the consequences of elevated CRBP-1 expression on endothelial cell homeostasis are ongoing. Although the RAS has been described in many other tissues apart from endothelial cells, ACE signalling has not yet been addressed in tissues such as monocytes/macrophages, which have an increased ACE expression in an atherosclerotic setting. We observed that upon stimulation of cultured ACE expressing monocytes with ramiprilat, JNK is activated suggesting the occurrence of ACE signalling in human monocytes. It is worth noting that ACE inhibitors delay the onset of type II diabetes in spite of moderate decrease in blood pressure. To further elucidate the mechanism underlying this effect, we found that ACE inhibitors increase the PPARgamma levels in the nuclear extracts of ACE expressing monocytes which were also reproduced in human endothelial cells overexpressing human somatic ACE. However, ramiprilat did not have any direct effect on the activity of a luciferase-coupled promoter containing several copies of the PPRE in human endothelial cells. These results contrasted with the actions of the PPARgamma agonist suggesting that ramiprilat enhances PPARgamma levels through an indirect mechanism. We next hypothesized that ramiprilat might increase the levels of 15-deoxy-D12,14-prostaglandin J2 (15dPGJ2) which is a natural ligand for PPARgamma via COX enzymes in monocytes. We observed that ramiprilat was able to decrease the diminution of COX-2 levels upto 48 hours of treatment but the levels of 15dPGJ2 were too low to be detected by ELISA. However ramiprilat enhanced the plasma levels of adiponectin, a downstream target of PPARgamma, which is a anti-atherogenic and anti-inflammatory adipokine, in patients with coronary artery disease. Though adiponectin is a PPARgamma-regulated gene, the observed increase in adiponectin might be attributed to the increase in RXR rather than via PPARgamma. Taken together, the results of this investigation have revealed that ACE inhibitors initiate ACE signalling by eliciting the dimerization of the enzyme, more specifically via its C-domain active centers. The ACE signalling cascade when activated leads to the enhanced expression of ACE, COX-2 and CRBP-1 which in turn favours the heterodimerization of PPARgamma with RXR and thus results in the increased expression of “PPARgamma regulated” genes such as adiponectin. The latter results provide a molecular basis for the observation that ACE inhibitors can delay the onset of type 2 diabetes in as much as it was possible to link ramipril with CRBP-1, RXR activity and the expression of adiponectin, an adipokine associated with improved insulin sensitivity. Further work is however required to elucidate the consequences of ACE inhibitors in monocytes and adipocytes as well as in intact animals.
In der klassischen Theorie der formalen Sprachen gehört die Beschreibung von Sprachen durch Grammatiken oder Automaten zu den wichtigen Themen. Im Gegensatz zu diesen Modellen, die aus einer einzelnen Komponente bestehen, beschäftigt sich die Informatik heute aber immer häufiger mit verteilten Systemen, deren Komponenten auf verschiedene Art und Weise zusammenarbeiten. Eine Möglichkeit, dieses Konzept auf die Theorie der formalen Sprachen zu übertragen, ist die Definition von Grammatiksystemen. Ein Grammatiksystem besteht aus mehreren Grammatiken, die nach bestimmten Regeln zusammenarbeiten. Hauptsächlich unterscheidet man dabei zwischen sequentieller und paralleler Kooperation. In dieser Arbeitwerden kontextfreie „cooperating distributed“ (CD) Grammatiksysteme, ein Modell mit sequentieller Kooperation, betrachtet. Zur Erzeugung eines Wortes arbeiten dabei mehrere kontextfreie Grammatiken, die Komponenten, an einer gemeinsamen Satzform. Zu jedem Zeitpunkt ist immer nur eine einzige Komponente aktiv. Der Schwerpunkt der Arbeit liegt auf der Beschreibungskomplexität von CD Grammatiksystemen. Dabei wird zuerst auf die verschiedenen Maße für die Größe oder statische Komplexität eines CD Grammatiksystems eingegangen. Ein wichtiges Ergebnis im ersten Teil der Arbeit ist, daß man für CD Grammatiksysteme und insbesondere hybride CD Grammatiksysteme, eine Verallgemeinerung von kontextfreien CD Grammatiksystemen, einige dieser Maße nach oben beschränken kann. Darunter fallen die Anzahl der Komponenten und die maximale Anzahl von Produktionen in einer Komponente. Hält man einen der beiden Parameter fest, so entsteht eine unendliche Hierarchie über dem anderen Parameter. Der zweite Teil der Arbeit konzentriert sich darauf, Ergebnisse für Größenmaße zu erzielen, die nicht nur einzelne Aspekte der Komplexität, sondern die gesamte Größe oder Länge eines CD Grammatiksystems darstellen. Dafür werden CD Grammatiksysteme geeignet eingeschränkt. Man erhält metalineare Systeme und Systeme von endlichem Index. Im Gegensatz zum unbeschränkten Modell kann hier die generative Mächtigkeit sehr genau charakterisiert werden und es können Hilfsmittel wie Pumpinglemmata gezeigt werden.Weitere Resultate sind eine unendliche Hierarchie über der Breite beziehungsweise dem Index solcher Grammatiksysteme. Das wesentliches Resultat im zweiten Teil dieser Arbeit besteht daraus, daß zwischen zwei Klassen von diesen eingeschränkten CD Grammatiksystemen, deren entsprechende Sprachklassen echt ineinander enthalten sind, nichtrekursive Tradeoffs existieren. Das heißt, daß sich der Größenzuwachs beim Wechsel von der stärkeren Klasse von CD Grammatiksystemen in die schwächere durch keine rekursive Funktion beschränken läßt.
Untersuchungen zur molekularen Kontrolle der Kupferhomöostase in dem Ascomyceten Podospora anserina
(2007)
Das essentielle Spurenelement Kupfer ist Co-Faktor mehrerer Schlüsselenzyme (z B. Cu/Zn-SOD, Cytochrom c Oxidase). Da Kupfer leicht Elektronen aufnehmen und abgeben kann, eignet es sich besonders gut für Redox-Reaktionen. Wenn Kupfer jedoch mit Sauerstoff reagiert, entstehen hoch cytotoxische reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die nach der „freien Radikaltheorie des Alterns“ (nach D. Harman 1956) ursächlich für Alterung und Zelltod sind. Um deren Bildung zu vermeiden, erfolgen alle Aspekte des Kupferstoffwechsels – Aufnahme, Transport und Speicherung - stets proteingebunden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich bis auf drei Ausnahmen die gesamte bislang bekannte Maschinerie der molekularen Kupferhomöostase aus anderen Modellorganismen (z.B. S. cerevisiae oder H. sapiens) auch im Genom des Ascomyceten Podospora anserina mit Homologen bzw. Orthologen wiederfindet. Die drei Ausnahmen betreffen jeweils Proteine, für die in anderen Organismen mehrere Isoformen existieren und P. anserina nur jeweils ein Homolog/Ortholog besitzt. Für mehrere der neu vorhergesagten Gene (PaAtx1, PaCcc2, PaCcs1, PaCox11, PaCox19, PaCox23, PaSco1) konnte eine Expression im Wildstamm nachgewiesen werden. Dazu wurden Standardtechniken (Northern Blot Analyse, RT-PCR) und auch neu etablierte eGFP-Reporterkonstrukte verwendet. In Podospora anserina scheint Kupfer auf zwei verschiedene Arten Einfluss auf die Lebensspanne zu nehmen: Zum einen mittelbar darüber, dass die Verfügbarkeit von Kupfer über die in der mitochondrialen Atmung verwendete Endoxidase entscheidet. Bei Kupfermangel wird eine Eisen-abhängige alternative Oxidase (AOX) induziert. Durch Atmung über die AOX entstehen weniger ROS, was die Lebensspanne verlängert. Anhand einer Vielzahl langlebiger Mutanten konnte dieser Zusammenhang bereits mehrfach demonstriert werden. Zum anderen scheint Kupfer auch eine unmittelbare Rolle in der Seneszenz von P. anserina zu spielen. In früheren Arbeiten konnten mehrere indirekte Hinweise (Transkript- und Aktivitätsanalysen) gesammelt werden, dass im Alter die cytoplasmatische Kupferkonzentration drastisch ansteigt. Durch Messung der Kupferkonzentration mittels einer direkten chemisch-analytische Methode (TXRF) in fraktionierten Zellbestandteilen (Cytoplasma und Mitchondrien) konnten in dieser Arbeit diese Hinweise weiter untermauert werden. Experimente mit in die mitochondriale Matrix geleitetem eGFP brachten zusätzliche Indizien dafür, dass das mitochondriale Kupfer-Reservoir die Quelle des sich in seneszenten Pilzstämmen im Cytoplasma wiederfindenden Kupfers ist. Durch einen Prozess, der größenabhängig reguliert und in anderen Organismen als „Mitochondrial Permeability Transition – MPT“ zu Beginn der Apoptose bekannt ist, ergiesst sich beim Eintritt in die Seneszenz der Inhalt der mitochondrialen Matrix in das Cytosol. Die Bedeutung dieses Vorgangs und v.a. die Folgen der Umverteilung von Kupfer innerhalb der Zelle bleiben im Detail weiter zu klären. Durch die durchgeführten Arbeiten konnte ein weiterer deutlicher Beweis für das Ablaufen apoptotischer Mechansimen im Alterungsprozeß des Ascomyceten P. anserina erbracht werden.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Hypothese, dass der „Life Orientation Test (-Revised)“ (LOT-R), der als Selbstberichtsfragebogen zur Erfassung von dispositionellem Optimismus konstruiert wurde, nicht nur „Optimismus“ erfasse, sondern auch „Pessimismus“; Pessimismus wird im Rahmen dieser „OP-Hypothese“ nicht als der Gegenpol von Optimismus aufgefasst, sondern als ein partiell unabhängiges Konstrukt. Die OP-Hypothese wird typischerweise mit sog. „konfirmatorischen“ Faktorenanalysen untersucht. Die OP-Hypothese wird zunächst aus theoretischer Perspektive analysiert, insbesondere auch deshalb, weil die Begriffe „Optimismus“ und „Pessimismus“ im Rahmen der OP-Hypothese nicht auf dieselbe Art verwendet werden wie sonst in der Psychologie oder in anderen Wissenschaften üblich. Dabei zeigt sich, dass keine angemessene theoretische Herleitung der OP-Hypothese möglich ist: Was „Pessimismus“ ist, wenn es nicht der Gegenpol von Optimismus ist, bleibt unklar. Ausgehend von dem Befund, dass die theoretische Herleitung der OP-Hypothese unangemessen ist, wird diese Hypothese aus methodologisch-testtheoretischer Perspektive und mittels zweier empirischer Arbeiten kritisch überprüft. Aus methodologischer und mathematisch-statistischer Perspektive wird dargestellt, dass die empirischen Befunde, die für die OP-Hypothese sprechen, nicht eindeutig sind; die OP-Hypothese ist also unterdeterminiert. Die Gültigkeit eines reflexiven Messmodells, das für die Untersuchung der OP-Hypothese mittels konfirmatorischer Faktorenanalysen erforderlich wäre, kann nicht ohne Weiteres angenommen werden. Die mathematisch-statistischen Annahmen der „experimentellen Unabhängigkeit“ und der „lokalen Homogenität“, die ein reflexives Messmodell konstituieren, sind für Selbstberichtsfragebogen in vielen Fällen verletzt. Noch gravierender ist das Ergebnis, dass sich aus „konfirmatorischen“ Faktorenmodellen, die für die OP-Hypothese sprechen, keine ausreichenden Informationen über den empirischen Gehalt der Hypothese ergeben. In grundsätzlicher Form und anhand einfacher Beispiele wird gezeigt, dass für eine gegebene Kovarianzmatrix, die die Datenbasis einer „konfirmatorischen“ Faktorenanalyse darstellt, grundsätzlich unendlich viele Alter-nativmodelle konstruiert werden können, von denen zumindest eine Teilmenge auch mit sinnvollen Interpretationen verbunden ist. Angesichts der Existenz solcher Alternativmodelle müssen andere Kriterien zur Überprüfung der OP-Hypothese herangezogen werden als „konfirmatorische“ Faktorenmodelle. Anhand einer empirischen Untersuchung mit dem LOT-R wird gezeigt, dass ein „Methodeneffektmodell“ eine bessere Anpassung an die Daten ermöglicht als das mit der OP-Hypothese verbundene Modell. Das Methodeneffektmodell beinhaltet die Annahme, dass die Antworten auf LOT-R-Items nicht ausschließlich durch die individuelle Ausprägung in „Optimismus“ bedingt werden, sondern zum Teil auch unerwünschte Effekte der Itemformulierungen abbilden. Entsprechend lässt sich eine Korrelation des „Methodenfaktors“ mit sozial erwünschtem Antwortverhalten beobachten. Schließlich wird in einer weiteren empirischen Untersuchung gezeigt, dass mit der Skala „Personaler Optimismus“ ein Instrument zur Erfassung von dispositionellem Optimismus vorliegt, welches nicht unter der faktorenanalytischen Mehrdimensionalität leidet, die den LOT-R kennzeichnet. In der Zusammenschau der methodologischen und empirischen Ergebnisse muss die OP-Hypothese als zu gering begründet zurückgewiesen werden. Über den Rahmen des speziellen Inhaltsgebietes „Optimismus“ hinaus weist die vorliegende Arbeit aber auch auf die Notwendigkeit multipler Betrachtungsebenen bei der Untersuchung persönlichkeitspsychologischer Fragestellungen hin. Nachteilig für die persönlichkeitspsychologische Forschung könnten sich insbesondere die unreflektierte Verwendung von Selbstberichtsfragebogen auf der Seite der Datenerhebung und die unreflektierte Verwendung von „konfirmatorischen“ Faktorenanalysen auf der Seite der Datenauswertung auswirken.
Die Kritik am jüdischen Religionsunterricht hat in der jüdischen Bildungsgeschichte eine lange Tradition. Nicht erst F. Rosenzweig beklagte in den 20er Jahren des vorigen Jahrhunderts die Situation der jüdischen Unterweisung. Unter Einfluss der jüdischen Aufklärung wurde vor allem die traditionsgebundene jüdische Erziehung durch die verschiedenen Repräsentanten der Haskala bemängelt , denen es gelang, diese Erziehung in verschiedener Hinsicht zu transformieren. Die Zielsetzung der jüdischen Unterweisung seit biblischer Zeit, die Weitergabe der Überlieferung an die nächste Generation wird seit der Emanzipation als Vermittlung jüdischer Identität verstanden, verbunden mit der Frage, wie man diese Identität entfalten kann.
Heute steht der jüdische Religionsunterricht in Deutschland erneut in kritischer Observanz und damit auch die Frage, wie bei Kindern und Jugendlichen jüdische Identität entwickelt werden kann. ...
Zur Rolle der Typ-I-Interferone in der Abwehr von viralen Infektionen des zentralen Nervensystems
(2007)
Das zentrale Nervensystem (ZNS) bildet eine einzigartige Umgebung für Immunantworten, da Neuronen eine essentielle und in weiten Teilen nicht-erneuerbare Zellpopulation bilden. Virale Infektionen des ZNS und lokale anti-virale Immunantworten können zu dem Verlust von Neuronen und somit zu katastrophalen Erkrankungen führen. Unter normalen Bedingungen ist das ZNS weitgehend von der Kontrolle durch das Immunsystem ausgeschlossen. In diesem Zusammenhang wurde das ZNS oft auch als „immunprivilegiert“ bezeichnet. Dieses Konzept musste in den letzten Jahren revidiert werden, da es sich gezeigt hat, dass das ZNS nicht völlig vom Immungeschehen isoliert ist. Wichtige Mediatoren antiviraler Immunantworten sind die Typ I Interferone (IFN). Die verschiedenen Typ I IFN binden an einen gemeinsamen Rezeptor, den Typ I Interferon-rezeptor (IFNAR). Die Bedeutung von Typ I IFN Antworten für die Kontrolle viraler Infektionen wurde besonders eindrucksvoll mit IFNAR-defizienten Mäusen (IFNAR-/-) gezeigt. Nach Infektion mit dem neurotropen Vesikulären Stomatitis Virus (VSV) führt das Fehlen des IFNAR zu einer stark erhöhten Empfänglichkeit für tödlich verlaufende Infektionen. In allen Organen und besonders im ZNS von VSV infizierten IFNAR-/- Tieren fanden sich stark erhöhte Virusmengen. Um zu untersuchen, ob die VSV-Infektion des zentralen Nervensystems in IFNAR-/- Mäusen in erster Linie auf ein Versagen der peripheren Immunität oder des IFN Systems innerhalb des ZNS zurückzuführen ist, wurden mittels der Cre loxP Tech-nologie Mäuse hergestellt, die auf allen peripheren Zellen IFNAR exprimieren, während die Neuronen des ZNS IFNAR defizient sind (NesCre+/-IFNARflox/flox). Nach intranasaler VSV Infektion zeigten NesCre+/-IFNARflox/flox Mäuse zunächst keine Krankheitssymptome. Nach 5 bis 6 Tagen traten aber aufsteigende und halbseitige Lähmungen auf, so dass die infizierten Tiere verstärkt im Kreis liefen und schließlich verstarben. Im Vergleich dazu verstarben IFNAR-/- Mäuse bereits nach 2 bis 3 Tagen während normale C57BL/6 Tiere nach Infektion keine Symptome zeigten und überlebten. Der beobachtete Krankheitsverlauf lässt in den IFNAR-/- Mäuse auf ein Multiorganversagen als Todesursache schließen. 3 und 6 Tage nach Infektion konnte in den Organen von C57BL/6 Tieren kein Virus reisoliert werden. In den NesCre+/ IFNARflox/flox Tieren fanden sich zum Todeszeitpunkt nur im Gehirn Viruspar-tikel, während alle anderen Organe virusfrei waren. Die Virustiter im Hirn waren im Vergleich zu den IFNAR-/- Mäusen 10- bis 100-fach erhöht. In den anderen Organen und im Blut sind keine Viruspartikel nachweisbar. Dieser Befund deutete gemeinsam mit den beobachteten Krankheitsverläufen auf eine neuropathologische Symptomatik hin, bei der es wahrscheinlich zu einer VSV-Infektion des Hirnstammes kam. Die Analyse einzelner Regionen des ZNS zeigte in IFNAR-/- Tieren, dass 2 Tage nach Infektion in allen Regionen des ZNS signifikante Virusmengen zu finden waren. In den NesCre+/-IFNARflox/flox und den C57BL/6 Tieren fanden sich zu diesem Zeitpunkt nur im Riechhirn (Bulbus olfactorius) signifikante Virustiter. In den C57BL/6 Tieren blieb das Virus auf diese Region beschränkt und wurde dort innerhalb von 6 Tagen eliminiert. In den NesCre+/-IFNARflox/flox Tieren kam es in den folgenden Tagen jedoch zu einer fortschreitenden Infektion des ZNS, und auch das Großhirn, das Kleinhirn, der Hirn-stamm und das Rückenmark zeigten hohe Virustiter. In der Induktion peripherer Immunantworten unterschieden sich NesCre+/-IFNARflox/flox und C57BL/6 Mäuse nicht. In den WT Tieren kam es im Gegensatz zu den NesCre+/ IFNARflox/flox und IFNAR-/- Tieren innerhalb von 48 Stunden nach Infektion im Riechhirn zu einer Typ I IFN abhängigen Phosphorylierung von STAT-1, einer Komponente des IFNAR-Signaltransduktionsweges. Alles deutet darauf hin, dass die Induktion geringer Mengen Typ I IFN innerhalb des Riechhirns notwendig ist, um Im-munantworten zu aktivieren, die ein Übergreifen der Virusinfektion auf andere Regio-nen des ZNS verhindern. Eine funktionierende Immunität in der Peripherie und die Blut-Hirn-Schranke scheinen nicht ausreichend zu sein, um eine Infektion des ZNS mit VSV zu verhindern. Stattdessen muss es zur Aktivierung von IFN-abhängigen Mechanismen innerhalb des Riechhirns kommen, die ein Übergreifen der VSV Infektion auf andere Hirnregionen verhindert und zur Elimination von VSV im Riechhirn beiträgt.
Im Zentrum dieser Arbeit steht die Operation der Gruppe Gamma:=SL_n(Z[1/m]) auf dem symmetrischen Raum M:=SL_n(R)/SO(n). Allgemeiner betrachten wir die Operation rho:Gamma->Isom(M) einer S-arithmetischen algebraischen Gruppe durch Isometrien auf dem zugehörigen symmetrischen Raum M. Die symmetrischen Räume sind Riemannsche Mannigfaltigkeiten mit nichtpositiver Krümmung und daher insbesondere CAT(0)-Räume. R. Bieri und R. Geoghegan haben für die Operation rho:G->Isom(M) einer abstrakten Gruppe G auf einem CAT(0)-Raum M die geometrischen Invarianten Sigma^k(rho) als Teilmenge des Randes von M eingeführt (vgl. [Robert Bieri and Ross Geoghegan, Connectivity properties of group actions on non-positively curved spaces, vol. 161, Memoirs of the AMS, no. 765, American Mathematical Society, 2003]). Die Fokusierung, die durch die geometrischen Invarianten erreicht wird, hat sich in vielen Fällen bewährt, in denen eine Operation durch Translationen auf dem euklidischen Raum zur Verfügung steht. Über die Invarianten von anderen CAT(0)-Operationen ist noch wenig bekannt. In der vorliegenden Arbeit berechnen wir nun die geometrischen Invarianten Sigma^k(rho) für die oben erwähnte Operation rho der S-arithmetischen Gruppe Gamma auf dem zugehörigen symmetrischen Raum M. Wir erhalten für die Gruppe SL_n(Z[1/m]) die folgende Invariante: Sigma^k(rho) ist der ganze Rand von M, falls k kleiner als s(n-1) ist; Sigma^k(rho) ist die Menge aller Randpunkte e von M, die nicht im Rand eines rational definierten flachen Unterraum von M liegen, falls k größer oder gleich s(n-1) ist. Hierbei ist s die Anzahl der verschiedenen Primteiler von m. Die obigen Resultate sind eine Verallgemeinerung derer in [Robert Bieri and Ross Geoghegan, Controlled Connectivity of SL_2(Z[1/m]), Geometriae Dedicata 99 (2003), 137--166]. Der Beweis, den wir geben, besteht aus einer Vereinfachung des Beweises von Bieri und Geoghegan, die dann auf die allgemeinere Situation angepasst werden konnte. Ein interessanter Aspekt ergibt sich, wenn wir für eine Operation rho auf M die Zahlen k betrachten, für die gilt: (*) Sigma^k(rho) ist der ganze Rand von M. Operiert die Gruppe Gamma mit diskreten Bahnen, dann ist (*) äquivalent zur Eigenschaft, daß die Punktstabilisatoren Gamma_a, für a aus M, vom Typ F_k sind. Die Eigenschaft (*) ist auch von Interesse für S-arithmetische Untergruppen einer linearen algebraischen Gruppe über einem Funktionenkörper. Wir zeigen, daß es hier eine naheliegende Operation rho' auf einem Bruhat-Tits Gebäude M' gibt, so daß Gamma' ein Punktstabilisator und damit die Eigenschaft (*) mit der Eigenschaft "Gamma' ist vom Typ F_k" zusammenfällt. Im Zahlkörperfall sind die Verhältnisse ganz anders. Unsere S-arithmetischen Gruppen operieren auf dem symmetrischen Raum M nicht mit diskreten Bahnen und sind durchwegs vom Typ F_k für alle k. Dagegen erlaubt unser Hauptresultat die Bestimmung der Zahlen k mit der Eigenschaft (*) und zeigt eine interessante Abhängigkeit von s=|S| und dem Rang r der algebraischen Gruppen (rho erfüllt (*) <=> k<rs). Das Hauptresultat wird außerdem nicht nur für SL_n(Q), sondern allgemeiner für Chevalley-Guppen über Q oder Q(i) gezeigt, so daß wir damit für eine Reihe von klassischen CAT(0)-Operationen die Invarianten Sigma^k(rho) bestimmt haben.
In this thesis we investigate the role played by gauge fields in providing new observable signatures that can attest to the presence of color superconductivity in neutron stars. We show that thermal gluon fluctuations in color-flavor locked superconductors can substantially increase their critical temperature and also change the order of the transition, which becomes a strong first-order phase transition. Moreover, we explore the effects of strong magnetic fields on the properties of color-flavor locked superconducting matter. We find that both the energy gaps as well as the magnetization are oscillating functions of the magnetic field. Also, it is shown that the magnetization can be so strong that homogeneous quark matter becomes metastable for a range of parameters. This points towards the existence of magnetic domains or other types of magnetic inhomogeneities in the hypothesized quark cores of magnetars. Obviously, our results only apply if the strong magnetic fields observed on the surface of magnetars can be transmitted to their inner core. This can occur if the superconducting protons expected to exist in the outer core form a type-I I superconductor. However, it has been argued that the observed long periodic oscillations in isolated pulsars can only be explained if the outer core is a type-I superconductor rather than type-I I. We show that this is not the only solution for the precession puzzle by demonstrating that the long-term variation in the spin of PSR 1828-11 can be explained in terms of Tkachenko oscillations within superfluid shells.
This thesis is concerned with various aspects of estimating trend output and growth and discusses and evaluates methods to prepare medium-term GDP growth projections. Furthermore, econometric techniques suited for cross-correlated macroeconomic panel data with a focus on factor models are applied for unit root and cointegration testing as well as panel error correction estimation. Applications involve the identification of growth determinants as well as the modelling of aggregate labor supply in a multi-country framework. The first chapter evaluates a very popular method for potential output estimation and medium-term forecasting---the production function approach---in terms of predictive performance. For this purpose, a particular forecast evaluation framework is developed and an evaluation of the predictions of GDP growth for the three to five years ahead for each individual G7 country is carried out. In chapter two, a new approach for estimating trend growth of advanced economies is proposed. The suggestion combines econometric methods that have been used to test and estimate the implications of the extended Solow growth model in a cross sectional time series setting with an application of multivariate time series filter techniques. The last chapter discusses several panel unit root tests designed to accommodate cross-sectional dependence. These methods are then applied to an OECD country sample of the aggregate labor supply measure "hours worked".
Für pädiatrische Patienten mit Hochrisikoleukämien ist die Donor-Lymphozyten-Infusion eine etablierte Therapieform, um nach Stammzelltransplantation die Immunrekonstitution zu verbessern oder ein beginnendes Rezidiv abzuwehren. Als schwerwiegende Nebenwirkung kann jedoch eine „Graft-versus-host“-Krankeit (graft-versus-host disease; GVHD) auftreten, bei der die T-Zellen gesundes Gewebe angreifen. In ersten klinischen Studien mit veränderten, Suizidgen tragenden Donor-Lymphozyten konnte durch die rechtzeitige Gabe eines Suizidinduktors die GVHD unterbunden werden. Die genetische Manipulation der T-Zellen führte jedoch zu einem Funktionsverlust, der vermutlich auf die zur Transduktion notwendige Aktivierung zurückzuführen ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Aktivierungsprotokolle mit Beads-gekoppelten oder löslichen Antikörpern hinsichtlich der Expansionsrate und dem Einfluss auf die Funktionalität der T-Zellen näher untersucht. Dazu wurden primäre humane T-Zellen im klinischen oder im Labormaßstab immunomagnetisch über eine CD3 sowie CD4/CD8 Selektion oder mittels der RosetteSep-Prozedur auf > 96% angereichert und anschließend expandiert. Die Transduktion erfolgte an den Tagen 3 und 4 mit einem „GMP-grade“ CD34/HSV-TK Vektor. Zur Aktivierung wurden zum einen lösliche CD3/CD28 Antikörper und zum anderen zellgroße Kügelchen - sogenannte Beads – verwendet. Die Beads wurden mit CD3/CD28 Antikörper und fakultativ mit CD2 beladen. Die beladenen Beads imitieren in der Zellkultur eine Antigen präsentierende Zelle und sollten damit eine möglichst physiologische Situation schaffen. Außerdem wurden unterschiedliche IL-2 Konzentrationen zugesetzt (20-1000 U/ml), um einen potentiellen IL-2 Effekt auf die T-Zellen zu untersuchen. Die Aktivierung mit den löslichen Antikörpern führte zu einer IL-2 abhängigen Proliferation der T-Zellen über 14 Tage mit maximaler Expansionsrate (47fach) bei 1000 U/ml IL-2. Die Expansion mit Beads-gekoppelten Antikörpern war ebenfalls IL-2 abhängig, beschränkte sich jedoch auf die erste Woche und erreichte eine maximale Expansionsrate von 3-4. In der zweiten Woche fiel die Zellzahl ab. Zusammenfassend sind für eine starke Expansion der T-Zellen eine hohe IL-2 Konzentration, aber auch die löslichen Antikörper per se verantwortlich. Gleichzeitig konnte demonstriert werden, dass es große individuelle Unterschiede in der T-Zellexpansion verschiedener Spender gibt. Der Einfluss der Aktivierung auf die Veränderung der T-Zellsubpopulationen wurde mit Hilfe von multiparametrischen Analysen am Durchflusszytometer untersucht. Hohe IL-2 Konzentrationen (100 und 1000 U/ml) sowie die Verwendung löslicher Antikörper führten zu einer starken Zunahme der CD8+ T-Zellen. Der CD4/CD8 Quotient blieb lediglich unter Stimulierung mit den Beads-gekoppelten Antikörpern in Verbindung mit 20 U/ml IL-2 konstant. Mit allen Aktivierungsprotokollen ergab sich für den immunologischen Phänotyp eine Verschiebung vom naiven zum Gedächtniszelltyp. Die Proliferation CMV-spezifischer T-Zellen konnte mit allen Aktivierungsprotokollen erreicht werden und korrelierte mit der Expansionsrate der gesamten CD3+ T-Zellen. Die Zytokinausschüttung war verringert bei den T-Zellen, die mit den löslichen Antikörpern stimuliert wurden. Eine verminderte Zytokinproduktion könnte auf einen Verlust der Funktionalität der T-Zellen hindeuten. Von besonderer Bedeutung ist, dass die Stimulierung über Beads-gekoppelte Antikörper zu einer gleichmäßigen Transduktion von CD4+ und CD8+ T-Zellen führte. Im Gegensatz dazu hatte die Aktivierung mit löslichen Antikörpern zur Folge, dass hauptsächlich CD8+ T-Zellen transduziert wurden. Für eine kompetente Immunantwort im Rahmen einer DLI erscheint jedoch eine physiologische Zusammensetzung der CD4+ und CD8+ T-Zellen äußerst wichtig. Residuale Stammzellen könnten potentiell co-transduziert werden. Um diese Gefahr abschätzen zu können, wurden ficollisierte PBSC analog der T-Zellen expandiert. Unter allen T-Zellaktivierungsprotokollen blieben die CD34+ Stammzellen in den ersten Tagen der Kultur vital und durchflusszytometrisch nachweisbar. Die Stammzellen expandierten sogar geringfügig und waren damit potentiell transduzierbar - mit der Gefahr einer klonalen Entartung durch Insertionsmutagenese. Dies deutet auf die Wichtigkeit einer T-Zellselektion zur Manipulation von DLI hin, um residuale Stammzellen zu entfernen. Die Suizidstrategie ist eine vielversprechende Möglichkeit zur Kontrolle der GVHD im Rahmen einer DLI. Voraussetzung ist aber, dass die infundierten Zellen auch immunologisch kompetent bleiben und einen GvL-Effekt bewirken. Die Aktivierung mit Beads-gekoppelten Antikörpern scheint zum Erhalt der Immunkompetenz den löslichen Antikörpern überlegen zu sein.
Im Vorfeld des 200jährigen Jubiläums der Expedition von Lewis & Clark (2003-2006) begannen auf der Standing Rock Indian Reservation auf der Grenze der US-Bundesstaaten North Dakota und South Dakota die Planungen für den Aus- bzw. Aufbau einer touristischen Infrastruktur auf der Reservation. Diese sollten bis zum Jahr 2004 weitgehend abgeschlossen sein sollte, um von den erwarteten drei Millionen Jubiläumsreisenden einerseits wirtschaftlich zu profitieren, andererseits diese aber auch inhaltlich und räumlich zu kontrollieren. Die Studie beschäftigt sich mit der Entwicklung bis 2004 und untersucht, welche Faktoren diese positiv und negativ beeinflussten. Dabei wird deutlich, dass die Tätigkeiten auf der Reservation nicht allein von internen, sondern vielmehr auch von externen Faktoren, wie beispielsweise den Tourismusbehörden der Bundesstaaten, der Nachbargemeinde Mobridge, South Dakota, der Tribal Tourism Partnership Initiative des United Tribes Technical College, abhängig waren. Zudem wirft die Studie einen Blick auf die Organisationsstruktur der Reservation, wo das stammeseigene College eine wichtige Rolle in der Wirtschaftsförderung spielt und die Tourismusplanungen in Gang gebracht hat.
The formation and maintenance of a defined three-dimensional structure is a prerequisite for most proteins in order to fulfill their function in the native context. However, there are proteins, which are intrinsically unstructured and thus natively unfolded. In addition, the misfolding and aggregation of many proteins can lead to severe diseases. The investigation of non-native states of proteins significantly contributes to the understanding of protein folding and misfolding. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is the only known technique that can provide information on structure and dynamics of non-native states of proteins at atomic resolution. Unfolded and non-native states of proteins have to be treated as ensembles of rapidly interconverting conformers and their observed properties are ensemble and time averaged. In this thesis, hen egg white lysozyme (HEWL) and mutants thereof have been investigated by NMR spectroscopy. The reduction of its four disulfide bridges and the successive methylation of the cysteine residues renders HEWL permanently non-native (‘HEWL-SMe’). Alternatively, the exchange of the eight cysteines for alanines results in very similar states (‘all-Ala-HEWL’). Under these conditions, HEWL-SMe and all-Ala-HEWL do not resemble random coil conformations, but exhibit residual secondary and tertiary structure. The presence of hydrophobic clusters and long-range interactions around the proteins six tryptophan residues and the modulation of these properties by single-point mutants has been observed. For the NMR spectroscopic investigation, HEWL has been isotopically labelled in E. coli by expression into inclusion bodies. After purification, the 1HN, 15NH, 13Calpha, 13Cbeta, 13C’, 1Halpha and 1Hbeta resonances of HEWL-SMe and all-Ala-HEWL have been assigned almost completely using three-dimensional NMR experiments. The analysis of secondary chemical shifts revealed regions in the proteins sequence — particularly around the six tryptophan residues—with significantly populated alpha-helix like conformations. In order to further elucidate the influence of the tryptophan side chains, a set of two new pulse sequences has been developed that allowed for the successful assignment of the 13Cg, 15Ne and 1HNe resonances in these side chains. This knowledge was eventually exploited in the interpretation of two-dimensional 15N-1H photo-CIDNP spectra, which revealed a differential solvent accessibility of the tryptophan residues in all-Ala-HEWL but not in the single point mutant W62G-all-Ala-HEWL. In addition, heteronuclear R2 relaxation rates have been determined for the indole 15Ne nuclei of all-Ala-HEWL and W62G. While in the wild-type like all-Ala-HEWL, the rates are different among the six tryptophan residues, in W62G they are more uniform. Together with relaxation data from the amide backbone, these results indicate the significant destabilization of the hydrophobic clusters in the absence of W62. In contrast, in the W108G mutant the profile of the R2 relaxation rates was not found to be significantly altered. No evidence was found by R1rho relaxation rates and relaxation dispersion measurements for conformational exchange on slower (micro- to millisecond) timescales. Residual dipolar couplings have been determined for non-native HEWL in order to retrieve structural information of these states. The differences of the W62G and the wild-type like non-native HEWL is also picked up in NH-RDCs of these proteins aligned in polyacrylamide gels. Significant positive RDCs are observed in the regions of the hydrophobic clusters in all-Ala-HEWL, but to a much lesser degree in W62G. So far, all attempts to simulate RDCs from generated non-native ensembles failed even when including long-range contacts or specific phi/psi backbone angle propensities. However, the measured RDCs can be used to cross-validate structural ensembles of non-native HEWL generated by molecular dynamics simulations that are based on restraints from the other experimental data, such as the differential solvent accessibilities from the photo-CIDNP experiments and the data on the hydrophobic clustering gained from the combined mutational and relaxation studies. Finally, non-native HEWL has been investigated for the first time using two-dimensional NMR in organic solvents, which are able to induce secondary structures and ultimately lead to amyloid formation. Under these conditions severe line broadening was observed, which was attributed to exchange between different — mostly a-helical— conformations. In summary, in this thesis methods have been developed, optimized and successfully applied for the structural and dynamical characterization of non-native states of proteins and the effect of single-point mutants on the properties of such ensembles has been investigated. Data has been gained that can considerably contribute to the further elucidation of the nature of non-native states of HEWL by molecular dynamics simulations.
Humane hämatopoetische Stammzellen (HSCs) besitzen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und übernehmen die kontinuierliche Neubildung aller zellulären Bestandteile des Blutes. Aufgrund der zunehmenden klinischen Bedeutung der HSCs ist es essentiell die molekularen Mechanismen, die den Prozess der Vermehrung und Differenzierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen steuern, aufzuklären und deren funktionelle Bedeutung zu verstehen. Das Ziel der Arbeit war die Identifizierung, Charakterisierung und gerichtete Modulation funktionell relevanter Signalwege, die am Differenzierungsprozess von HSCs zu myeloiden Effektorzellen beteiligt sind. Für diese Untersuchung wurde ein Expansionsprotokoll für humane HSCs, sowie ein Differenzierungsprotokoll für das humane myeloide DC Differenzierungsmodell entwickelt. In der Arbeit wurden drei wichtige Signalwege der Zelle, die Mitogenen Signalkaskade (MAPK), Protein Kinase C (PKC) gekoppelten Prozessen und dem JAK/STAT Signalweg untersucht. Die vorliegende Arbeit zeigt, daß die Stimulation der HSCs mit GM-CSF und IL-4 zu einer zeitlich begrenzten Aktivierung von MAPK/ERK1/2, PKC delta, JAK2, sowie STAT5 und STAT6 führte. Kommerzielle Inhibitoren von MEK, PKC und Januskinase hemmten selektiv diese Aktivierung und führten zu einer veränderten Hämatopoese. Die Aktivierung dieser Signalwege ist daher für die myeloide Differenzierung von HSCs zu Dendritischen Zellen von entscheidender Bedeutung. Einer der entscheidenden nuklearen Faktoren für die myeloide Differenzierung ist der Ets-Transkriptionsfaktor PU.1, dessen Aktivität durch Phosphorylierung reguliert sein könnte. Obwohl die funktionelle Rolle von PU.1 in der Differenzierung von HSC in der vorliegenden Arbeit nicht vollständig geklärt werden konnte, wurde jedoch erstmals im in vitro Kinase-Assay gezeigt, daß PU.1 durch PKC delta, aber nicht durch MAPK/ERK2 spezifisch phosphoryliert wird. In einem PU.1-spezifischen Luciferasereporter-Assay wurde die transkriptionelle Aktivität von PU.1 durch die Inhibition von PKC delta und MAPK/ERK1/2 deutlich reduziert. Weiterführende Experimente in einem komplexen Differenzierungsmodell von humanen HSCs wiesen darauf hin, daß durch den gezielten Einsatz von Signalweginhibitoren eine Verschiebung der Verhältnisse der gebildeten Blutzellkolonieformen erreicht werden kann. So war die Differenzierung zu Erythrozyten von der Mitogenen Signalkaskade unabhängig, wohingegen die Differenzierung zu Makrophagen eine deutliche Abhängigkeit von der Aktivität der Mitogenen Signalkaskade sowie von der Aktivierung des Protein Kinase C Signalwegs zeigte. Im Gegensatz dazu führte die Inhibition der Januskinasen (JAKs) zu einer Hemmung der Differenzierung in allen Kolonieformen. Insgesamt zeigten die Ergebnisse, daß der MAPK/ERK und PKC delta Signalweg bei der Differenzierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen eine wichtige Rolle spielen und eine gerichtete Steuerung der Differenzierung durch den Einsatz spezifischer Signalweginhibitoren möglich erscheint.
Leukemia inhibitory factor enhances neurogenin's pro-neural effect during mouse cortical development
(2007)
Die Entwicklung von unterschiedlichen Zelltypen waehrend der embryonalen ZNS-Entwicklung ist abhaengig von zellintrinsischen und positionsabhaengigen, aeusseren Einfluessen. Dabei bilden sich die verschiedenen Zellen in nacheinander ablaufenden bzw. sich teilweise ueberlappenden Zeitraeumen. Zuerst entstehen Radiaglia und Neuronen, nachfolgend Astrozyten und zuletzt Oligodendrozyten. Werden neurale Stammzellen/Vorlaeuferzellen (NPCs – neural precursor cells) zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen und ohne den Einfluss von Wachstumsfaktoren kultiviert, so entwickeln sich diese Zellarten in der gleichen Reihenfolge. Die Neurogenese, die bei Mausembryos am Tag E11-12, nach dem Etablieren der Radialglia, beginnt, findet an E14 ihren Hoehepunkt. Zu diesem Zeitpunt werden die Gene Neurogenin1 (Ngn1) und Ngn2 in den neuralen Vorlaeuferzellen der Ventrikularzone des dorsalen Cortexes in hohem Masse exprimiert. Wie aus Untersuchungen von unserm Labor gezeigt wurde, beguenstigt es die Entstehung von Neuronen und blockiert gleichzeitig Pro-Astrozyten-Einfluesse. Zum einen inhibiert Ngn den JAK/STAT Signalweg, dessen Aktivierung fuer die Gliogenese noetig ist, indem es die Phosphoylierung von STAT1/3 auf bisher noch unbekannte Weise blockiert. Ausserdem bindet der Transkriptions-Coaktivator cAMP-response element binding protein (CBP), welches auch von den STATs fuer die Transkription benoetigt wird, bevorzugt an Ngn sobald dieses von den Vorlaeuferzellen exprimiert wird. Mit dem Tag E16 nimmt die Neurogenese in vivo wieder stark ab und es setzt die Gliogenese ein, bei der zunaechst ueberwiegend Astrozyten gebildet werden. Faktoren wie leukemia inhibitory factor (LIF) sowie ciliary neurotrophic factor (CNTF) beguenstigen dabei die Astrozytogenese indem sie den JAK/STAT Signalweg aktivieren. Die Bindung von LIF/CNTF fuehrt zur Phosphorylierung von STAT-Transkriptionsfaktoren, die ihrerseits dann an den CBP/p300 Komplex binden und schliesslich die Expression von Astrozyten-spezifischen Genen aktivieren. Die STAT-Faktoren koennen aber erst nach Abfall des Ngn-Spiegels an den Transkriptions-Coaktivator binden, da sich die Bindungsstellen dieser beiden ueberlappen. Um die Hypothese zu ueberpruefen, dass LIF auch die Neurogenese, oder spezifischer, die Wirkung von Ngn positiv beeinflusst, wurden cortikale NPCs von murinen Embryos entnommen und der Wirkung von LIF via Luciferase Assay untersucht. Dabei wurden die Vorlaeuferzellen mit Ngn und einem Reporter transfiziert, welcher den NeuroD-Promoter beinhaltete. NeuroD-Expression findet in der Regel gegen Mitte/Ende der Neurogenese statt und ist wichtig fuer die Reifung von Neuronen. Der Promoter von NeuroD beinhaltet ein E-box Element, an welches Ngn bindet und die Transkription einleitet. Wie unsere ersten Versuche zeigten, verstaerkt LIF die Transkriptionsaktivitaet von Ngn und somit die Transkription von NeuroD. Wenn aber im selben Versuch ein NeuroD-Reporter transfiziert wurde, dessen E-box mutiert war, wurde keine Transkriptionsaktivitaet gemessen, was wiederum bestaetigte, dass der pro-neurale LIF-Effekt ueber Ngn lief und E-box-Bindung noetig war. Um den Einfluss des pro-neuralen Effekts von LIF auf Proteinebene zu testen, wurden NPCs mit Ngn-Adenovirus infiziert und mit LIF stimuliert. Dabei wurden die Zellen auf die Expression von Neuron-spezifischem class III β-tubulin (TuJ1) untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass LIF bei Zellen, die Ngn exprimierten, die Rate der Neuronen von etwa 5% auf etwa 50% anstiegen liess, waehrend LIF bezueglich der Gliogenese (gezeigt durch die Expression von GFAP) in Ngn-exprimierenden Vorlaeuferzellen kaum Wirkung zeigte. Als naechstes sollte untersucht werden ueber welchen Signalweg LIF Ngn aktivierte. LIF bindet zunaechst an LIF receptor β (LIFRβ), der dann an glycoprotein 130 (gp130) bindet. Diese Bindung fuehrt dann zur Aktivierung mehrerer Signalkaskaden: dem JAK/STAT, dem MAPK, dem Akt/PI3K und dem PLCγ/PKC Signalweg. Da der JAK/STAT Signalweg fuer die Gliogenese wichtig ist, lag unser Fokus auf den anderen Signalwegen. Deren Aktivierung wurde dann mit spezifischen Inhibitoren blockiert und, wie auch in den Vorversuchen, die Wirkung von LIF auf Transkriptionsebene (NeuroD) in neuralen Vorlaeuferzellen bestimmt. Dabei zeigte sich, dass die Blockierung des PLCγ/PKC Signalweges die NeuroD-Promoteraktivitaet am starksten inhibierte, waehrend auch LIF´s pro-neurale Wirkung verloren ging. Dementsprechend zeigte die Western Blot Analyse, dass die Expression von class III β-tubulin (TuJ1) durch die Anwendung der PKC Inhibitoren am staerksten inhibiert wurde, wobei auch hier die Stimulation durch LIF keine erhoehte Neurogenese mit sich zog. In weiteren Versuchen konnten wir dann mit Hilfe von Immunoprezipitation demonstrieren, dass LIF die Bindung von Ngn an CBP verstaerkte (eine Bindung, welche durch PKC Inhibitoren aufgehoben wurde), was wiederum zu einer erhoehten Bindung dieses Transkriptionskomplexes an den NeuroD Promoter fuehrte, wie unsere Chromatin Immunoprezipitation (ChIP) Daten beweisen. Dies wiederum laesst darauf schliessen, dass womoeglich diese erhoehte Ngn-CBP/NeuroD-Promoter Bindung der Grund fuer die erhoehte NeuroD-Transkriptionsaktivitaet ist daher auch fuer die erhoehte neuronale Differenzierung. Interessanterweise konnten wir auch zeigen, dass Brahma-related gene 1 (Brg1), eine katalytische Untereinheit des SWI/SWF Komplexes, an den Ngn/CBP cotranscriptionalen Komplex bindet und dass diese Bindung durch LIF-Stimulation verstaerkt wurde. Dies suggeriert wiederum, dass auch Brg1 eine wichtige Rolle waehrend der murinen, cortikalen Neurogenese spielt. Dennoch, in folgenden Experimenten verblieb der Fokus auf Ngn und CBP. Um unsere Hypothese zu bestaetigen, dass PKCδ ein moeglicher Mediator des LIF-Effekts sein koennte, zeigten wir zunaechst, dass die PKCδ-Expression in cortikalen NPCs waehrend der Neurogenese erhoeht ist. Desweiteren demonstrierten wir, dass die Inhibition von PKCδ einen aehnliche Wirkung zeigte wie die Inhibition von PKC mit einem generellen PKC Inhibitor: weder war nach PKCδ-Inhibition eine LIF-induzierte NeuroD-Transkription erzielbar, noch wurde nach LIF-Stimulation der pro-neurale Marker class III β-tubulin/TuJ1 in Ngn1-infizierten NPCs exprimiert. Um aber mehr spezifisch die PKC- und PKCδ-Aktivitaet/Expression zu blockieren transfizierten wir NPCs mit PLCγ oder PKCδ siRNA. Unsere Daten zeigten hierbei, dass siRNA-transfizierte Zellen kein class III β-tubulin mehr aufweisen, was darauf hindeuted, dass PKCδ der potentielle Mediator des pro-neuralen LIF-Effekts ist. Durch unsere in vivo Daten demonstrierten wir schliesslich, dass LIF auch hierbei fuer die Neurogenese von Bedeutung ist. Verglichen wurden die Cortices von E13 LIF Het (heterozygote) und KO (knock out) Maeusen mit denen von WT (wild type) Maeusen. Durch Immunohistologie von Hirnschnitten konnten dabei keine groesseren Unterschiede bezueglich der Expression neuraler Marker beobachtet werden, waehrend aber mit Hilfe der Western Blot Analyse, eine quantitativere Methode, gezeigt wurde, dass LIF Het und KO Maeuse weniger pro-neurale Marker im Cortex exprimieren wie WT Mause. Um auch zu beweisen, dass dies auf eine verringerte Transkription von NeuroD zurueckzufuehren ist, demonstrierten wir mit Hilfe des ChIP Assay, dass LIF Het und KO Maeuse weniger Ngn1-CBP Bindung an den NeuroD-Promoter aufweisen wie WT Maeuse. Diese Experimente veranschaulichen einen eleganten Regulationsmechanismus, durch welchen ein einzelner, extrazellulaerer Faktor die unterschiedliche Differenzierung einer Zelle verstaerkt, abhaengig von der Anwesenheit oder Abwesenheit eines einzelnenn intrazellulaeren Faktors. Auch koennen durch die erlangten Resultate Strategien entworfen werden, durch die in Zukunft die Produktion bestimmter Neurone zur Heilung von verschiedenen, neurodegenerativen Krankheiten erhoeht wird.
Die Ergebnisse zur Sedimentologie, Taphonomie und Paläoökologie der Dinotheriensande des Urrheins in Rheinhessen geben weiteren Aufschluß über die tektonosedimentäre und paläoökologische Entwicklung des Urrheins. Die als Dinotheriensande bekannten Ablagerungen des Urrheins, deren Bildung nach biostratigraphischen Kleinsäugerfunden ins Obermiozän (Vallesium, MN 9, ca. 10,5 - 11 Ma.) gestellt werden, zeichnen sich durch fossile Wirbeltierfragmente teils großer Säugetiere sowie grober Gerölle überwiegend an der Basis, in einigen Bereichen auch aus Grobsand sowie größtenteils aus Fein- bis Mittelsand bestehenden fluviatilen Sedimenten aus. Der im heutigen Raum von Eppelsheim unter einer Ca. 3 m mächtigen Lössschicht liegende ehemalige Flusslauf des Urrheins floß von Worms und Westhofen aus dem Süden kommend entlang einer tektonisch bedingten Schwächezone in Eppelsheim nach Norden über Bermersheim Richtung Wißberg und Sprendlingen weiter nach Bingen. Dabei räumte die anfänglich sehr starke Strömung die durch tektonische Bewegung und eventuelle Verkarstung geschwächten Kalke der Inflata-Schichten (Aquitanium, Unter Miozän) und den Oberen Cerithienschichten (Chattium, oberstes Ober Oligozän bis Aquitanium, Unter Miozän) zu einem Flussbett aus. Die dabei durch die starke Strömung mitgeführten gut gerundeten, max. 170 mm großen Gerölle und Wirbeltierfragmente wurden an der Basis der Dinotheriensande über den abdichtenden Tonen der oligozänen Süßwasserschichten, in Verbindung mit glimmerfreien Grobsanden, abgelagert. Neben den Grobsanden (0,63 - 2 mm) an der Basis zwischen den großen Geröllen bestehen die Dinotheriensande überwiegend aus Feinsand (0,06 - 0,2 mm) und Mittelsand (0,2 - 0,63 mm), teils in gradierter Schichtung. In einigen Bereichen kommen immer wieder auch Grobsande und kleine bis mittelgroße Gerölle bis zum Top vor. Dabei erreichen die aus mehreren Schichtkörpern bestehenden Ablagerungen der Dinotheriensande bei Eppelsheim eine Gesamtmächtigkeit von 6,96 m. Die einzelnen Schichtkörper dieser Ablagerungen zeigen überwiegend Schrägschichtung, wobei die einzelnen Schichtungsblätter tangentiale Schrägschichtung erkennen lassen. Die Auswertung der Vorschüttungsrichtung aus Schrägschichtungsmessungen ergeben für die Hauptrichtung der Paläoströmung über der Basis eine Strömung aus SSE kommend, wobei die Strömung im weiteren Verlauf der Ablagerungen im Grabungsbereich von Eppelsheim von SE bis hin zum Top der Dinotheriensande von SSW kommend wechselt. Dabei lassen sich in den Ablagerungen der Dinotheriensande mit einer Gesamtmächtigkeit von 6,96 m schwerpunktmäßig von der Basis bis zum Top drei Fossilhorizonte erkennen. Hierbei variiert die Höhe des 2. Fossilhorizontes, von der Basis des 1. Fossilhorizontes in den Dinotherie~sandenü ber dem Ton der Süßwasserschichten gemessen, bei Ca. 140 - 150 Cm, sowie die Höhe des 3. Fossilhorizontes bei Ca. 400 - 410 cm. Neben der Anreicherung von fossilen Wirbeltierresten und den großen Geröllen an der Basis befinden sich in den Dinotheriensanden auch bis zu 50 mm große Gerölle, die überwiegend in dem 2. und 3. Fossilhorizont abgelagert wurden. Die Analyse von 10000 unterschiedlichen Geröllen ergab eine Zusammensetzung von gut gerundeten Quarzarten, Quarzite, Sandsteine, Kieselschiefer, Hornsteine, unterschiedliche Variationen von Chalzedon sowie Karneol, Rhyolith und Granit von der Basis bis zum Top der Dinotheriensande. Zwischen den Sanden eingeschaltete große Tonlinsen machen den Eindruck ehemaliger abgebrochener Uferbruchstücke, zumal sie teilweise mit großen Geröllen sedimentiert wurden. Die eigentlichen Sande bestehen aus überwiegend gut bis kantengerundetem Quarzsand, mit einem Glimmer-Anteil von Muskovit, etwas Biotit und im geringem Maße Phlogopit. Das Schwermineralspektrum setzt sich aus Granat, Apatit, Amphibol, Staurolith, Turmalin, Zirkon, Alterit, Hypersthen, Spinell, Siderit, Rutil, Topas, Gips und Augit sowie einem hohen Gehalt an opaken Mineralen zusammen. Die fossilen Wirbeltierfragmente, von Proboscidae, Rhinocerotidae, Equidae, Suidae, Cervidae, Bovidae, Tragulidae, Anthracotheriidae, Tapiroidae, Castoridae, unterschiedliche Arten von Carnivora sowie von Primaten und Insectivora stammend, bestehen zum größten Teil aus deren Zahnen und Zahnfragmenten. Weitere craniale und postcraniale Fragmente kommen gegenüber den Zähnen in geringerem Umfang vor. Fast alle Fragmente sind leicht bis stark abgerollt (Abrollungsgrad). Der größte Teil der Knochenfragmente zeigt ein einheitliches Bruchmuster, welches sich durch eine sägezahnförmige Fraktur mit scharfen Bruchkanten kennzeichnet. Einige Spuren in Form von Oberflächenmarken an den fossilen Knochen und Zähnen zeigen neben Bißspuren von Carnivora auch postmortale Spuren von Insekten und Nagern. Trockenrisse deuten auf eine mehr oder weniger längere Liegezeit der Kadaver bzw. der Skelette, Teilskelette oder vereinzelter Knochen an der Erdoberfläche vor der eigentlichen Sedimentation in den Dinotheriensanden hin. Auffallend finden sich die fossilen Wirbeltierreste in den Dinotheriensanden fast immer in unartikulierter und vereinzelter Fundlage, ausgenommen im Strömungsschatten größerer Objekte, wie zum Beispiel der große Kalkklotz im Grabungsbereich von Eppelsheim. Dabei handelt es sich um eine durchmischte Ansammlung von unartikulierten Wirbeltier-Fragmenten (Voorhies-Gruppen). Seit Beginn des 19. Jahrhunderts kamen die durch Zufall ausgegrabenen fossilen Wirbeltierreste aus den sogenannten Sandkauten Rheinhessens durch Ankauf ins Hessische Landesmuseum von Darmstadt (HLMD) und, neben anderen Instituten im In- und Ausland sowie einigen Privatsammlungen, ins Naturhistorische Museum von Mainz (NHMM). Die seit 1996 jährlich laufenden wissenschaftlichen Grabungen des Forschungsinstituts Senkenberg / Frankfurt a. Main (FIS) und im Anschluss des NHMM in Eppelsheim lieferten zu diesen historischen Sammlungen weitere Funde. Derzeit sind im HLMD 3217, im NHMM 5432 und im FIS 2278 fossile Funde aus den Dinotheriensanden von Rheinhessen inventarisiert (Stand: Frühjahr 2006). Die bei der Auswertung gewonnenen Daten der bestimmbaren, teilbestimmbaren und unbestimmbaren Funde aller drei Museen (HLMD, NHMM U. FIS) lieferten neben den schon erwahnten Daten über Abrollungsgrad, Bruchmuster, Oberflächenmarken und Voorhies- Gruppen, auch die über die orientierten Zähne ermittelbaren Werte der Mindestanzahl von Individuen aus den bekannten Fundorten in Rheinhessen. Über den Abkauungsgrad der Zähne, in Verbindung mit ihrer natürlichen Position, ließ sich das Altersspektrum dieser Individuen erstellen. Daneben wurde die Fossilienfarbe erfasst, mit deren Hilfe man die Funde in den historischen Sammlungen zur nachträglich Bestimmung des Fundhorizontes benutzen kann, da durch postsedimentäre Ausfällungen die Dinotheriensande, inklusive der darin befindlichen Fossilien, von der Basis bis zum Top unterschiedlich gefärbt sind. Schließlich wurde über die durchschnittlichen Gewichtsdaten der rezenten Vertreter der hier zu behandelten Tierarten eine Verteilungsübersicht in den drei bekannten Museen (HLMD, NHMM u. FIS) erstellt.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein tierexperimentelles Wundheilungsmodell etabliert, welches nach Kultivierung und Transplantation autologer Keratinozyten auf einer biologische Trägermembran aus Hyaluronsäure ein Vergleich mit verschiedenen Wundauflagen im Rahmen einer standardisierten Wundbehandlung erlaubte. Acht narkotisierten Schweinen wurden paravertebral 6 Polytetraflouroethylen-Kammern implantiert und die entstandenen Vollhautwunden mit verschiedenen Wundauflagen konditioniert. Parallel dazu erfolgte die Gewinnung und Kultivierung autologer Keratinozyten auf dem Zellkulturträger Laserskin – einer Hyaluronsäureestermembran. Die Transplantation der Zellen erfolgte 1 Woche nach Wundsetzung und anschließend wurden die Wunden mit den verwendeten Wundauflagen Jelonet, Schaumstoff und Hyalofill-F, einem Hyaluronsäureesterfleece, zweitägig über einen Zeitraum von 3 Wochen behandelt. Zu fest definierten Zeitpunkten erfolgten die vergleichenden photooptischen Dokumentationen und histologischen Untersuchungen (Hämatoxilin-Eosin-Färbung, Bindegewebsfärbung nach Goldner, Elastika-Anfärbung nach Weigert) der Wunden. Zur Bestimmung der biomechanischen Narbenqualität wurde das exzidierte Narbengewebe am Versuchsende 21 Tage nach Transplantation mechanischen Zugversuchen im Laserextensiometer zugeführt und die Zugfestigkeit und Dehnung bei Maximalspannung des Gewebes bestimmt. Sowohl die mikro- und makroskopischen als auch die biomechanischen Eigenschaften der untersuchten Wunden zeigten unabhängig von dem untersuchten Tier, der untersuchten Wunde bzw. der Wundbehandlung und unabhängig vom Zeitpunkt das einheitliche Bild eines neu entstandenen Narbengewebes ohne Anzeichen einer Epithelneubildung und ohne signifikante Unterschiede hinsichtlich der Zugfestigkeit und des Dehnungsverhaltens. Verschiedene Ursachen mögen für die ausbleibende Reepithelialisierung verantwortlich sein. Es konnte jedoch mit Hilfe der hier vorgestellten Wundheilungsstudie mit verschiedenen Wundauflagen an einem Hausschweinemodell eine systematische, reproduzierbare und standardisierte Methode entwickelt werden, um Narbengewebe hinreichend zu beschreiben. Weitere Anstrengungen werden noch notwendig sein, um die Lücke zwischen tierexperimentellen Studien und bereits klinisch erfolgreich angewandten Transplantation autologer Keratinozyten beim Menschen zu schließen.
The retinoic acid related orphan receptor alpha (RORalpha) regulates the expression of various target genes by binding to specific response elements in their promoter region. RORalpha is an interesting pharmaceutical target since it positively affects several pathophysiological processes of clinical relevance. RORalpha enhances the expression of Apo-AI protein, the major constituent of HDL, which is responsible for the cholesterol transportation. RORalpha notably contributes to the bone mineralization and generation of the extracellular bone matrix, demonstrating its involvement in osteoporosis, and by up-regulating the gene for IKBalpha, RORalpha has anti-inflammatory effects. Moreover, RORalpha is necessary for cerebellar development and the maintenance of the mammalian day-night periodicity governed by the core-clock within the suprachiasmatic nuclei. RORalpha receptors have been reported to bind cholesterol, melatonin, or to function ligand-independent. By monomeric binding to the recognition motif AGGTCA preceded by an A/T-rich sequence (ROR response element, RORE), RORalpha constitutively activates gene transcription. However, RORalpha activity is passively suppressed by its opponents RevErbalpha and RevErbbeta, which both bind to the same target sequence. ...
Für die NO-Produktion aus L-Arginin sind drei Isoformen der NO-Synthase verantwortlich: Die Calcium unabhängige induzierbare NO-Synthase (iNOS) sowie die Calcium abhängige endotheliale konstitutive (eNOS) und die neuronale (nNOS) NO-Synthase. Die Stickstoffmonoxid (NO)-Produktion von Endothelzellen ist wegen der verschiedenen Effekte von NO von Interesse. So erhöht NO den Blutfluss, spielt eine Rolle bei der Induktion der Angiogenese, führt jedoch auch zum Zelltod von Tumorzellen und reduziert die Tumorzelladhäsion. NO schützt einerseits vor der von TNF-α induzierten Apoptose, andererseits kann die cytokin-aktivierte NO-Produktion adhärente Tumorzellen töten [34, 72, 37, 36, 49].In einer Studie von Loibl et al. wurde zuvor iNOS-Aktivität in Tumorzellen bei in situ und invasiven primären Mammakarzinomen nachgewiesen. Ihre Rolle als Prognosefaktor ist jedoch bisher noch unzureichend geklärt [42]. Ziel der Arbeit war es, einen Zusammenhang zwischen dem Verlauf primärer Mammakarzinomerkrankungen und der iNOS-Expression nachzuweisen. Es war zu klären, ob iNOS mit klassischen Prognosefaktoren beim Mammakarzinom korreliert oder ob die iNOS-Expression selbst einen unabhängigen Prognosefaktor für diese Patientinnen darstellt. Unsere Studie zeigt bei dem bisher größten Kollektiv an 161 Patientinnen mit primärem Mammakarzinom einen signifikanten Zusammenhang sowohl zwischen der Expression von iNOS und der Tumorgröße (P=0,018) als auch zwischen iNOS und dem histologischen Differenzierungsgrad (P=0,039). Die iNOS-Expression korreliert ebenfalls signifikant mit einer schlechteren Gesamtüberlebenswahrscheinlichkeit (P=0,049), wobei die Expression von iNOS kein unabhängiger Prognosefaktor für das Gesamtüberleben ist (P=0,077; Hazard Ratio 2,25 [95% Confidence Intervall: 0,89-5,65]).
Für die vorliegende Arbeit wurden in einem Beobachtungszeitraum von 1994 bis 2003 insgesamt 51 Patienten untersucht, bei denen eine arthroskopische subacromiale Dekompression durchgeführt wurde. Es handelte sich hier um 30 Männer sowie 21 Frauen. Das Durchschnittsalter der Patienten betrug 52,8 Jahre. Das Durchschnittsalter bei Nachuntersuchung des Patientenkollektives lag bei 54,7 Jahren. Das „Follow up“ betrug durchschnittlich 48 Monate, in 50 % der Fälle wurde die führende Hand operiert, in 40,74 % der Fälle wurde die nicht führende Hand operiert. Aufgenommen in die Studie wurden lediglich Patienten mit einem Impingementsyndrom Grad I oder Grad II, alle Patienten wurden mit einer SAD-Technik operiert. Es erfolgte ein Debridement und eine Teilsynovektomie, ein selektives Weichteildebridement (arthrosko-pisches Kapselrelease) mit einer teilweisen Durchtrennung des Ligamentum coracoacromiale sowie einer Bursektomie subacromialis und einer zum Teil durchgeführten modifizierten Acromioplastik nach Neer. Die Untersuchung wurde retrospektiv durchgeführt und im Jahre 2003 abgeschlossen. Es wurden die subjektive Patientenzufriedenheit, das Bewegungsausmaß im prä- und postoperativen Vergleich im Rahmen des Constant-Murley-Scores erfasst, die Berufstätigkeit, die Händigkeit des Patienten im Vergleich zur operierten Seite, die postoperative Komplikationsrate im Vergleich zu den Ergebnissen des Constant-Murley-Scores sowie im Vergleich zu den prä- und postoperativ erfassten Röntgenbefunden im Standard-Röntgenverfahren des betroffenen Schultergelenkes. Die Mehrzahl der Fälle 61,29 % zeigten postoperativ ein sehr gutes Bewertungsergebnis. Nur bei 12,9 % der Patienten fand sich eine postoperativ schlechte Bewertung bzw. ein postoperativ schlechtes Ergebnis. Als wesentlicher Baustein der Untersuchung wurde hier der Constant-Murley-Score zugrunde gelegt. Es fand sich, wie in anderen Studien auch, dass je höher der präoperativ erfasste Constant-Murley-Score gelegen war, desto besser das postoperative Ergebnis erschien. Das hier untersuchte Patientenkollektiv hat gezeigt, dass die Schulterarthroskopie bei Patienten mit einem Impingementsyndrom Grad I oder II sehr gute bis gute Operationsergebnisse erzielen kann. Es konnte hier gezeigt werden, dass der Constant-Murley-Score einen hervorragenden Parameter darstellt zur Erfassung der prä- und postoperativen objektiven und subjektiven Ergebnisse. Die weiter im Rahmen dieser Studie erhobenen Parameter zeigten, dass auch andere Faktoren bei der Zufriedenheit des Patienten eine Rolle spielten, hier muß insbesondere die Geschlechterverteilung als Parameter erwähnen, sowie den radiologischen Befund. Besonders hervorzuheben ist, dass nach einer postoperativen Erholungszeit von 3 bis 6 Monaten das erhobene Ergebnis nicht mehr verändert wird, so dass 6 Monate postoperativ der Zeitpunkt für die Entscheidung zu einer Revisionsoperation zu setzen ist. Abschließend wird in dieser Studie bestätigt, dass die arthroskopische subacromiale Dekompression eine hervorragende operative Technik ist, bei der der Großteil der Patienten mit einem sehr guten bis guten Ergebnis auch über einen langen Zeitraum nach zu untersuchen ist. Ein kritischer Punkt bei der präoperativen Planung ist die sorgfältige Indikationsstellung , um postoperativ schlechte Ergebnisse primär vermeiden zu können, eine Entscheidung zur Revision, sei es eine offene Acromioplastik bzw. SAD-Technik , sollte nach 6 Monaten postoperativ gestellt werden.
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind von großer Bedeutung für die Regulation des vaskulären Tonus und die intrazelluläre Signaltransduktion. Die ROS-produzierenden Enzyme der Gefäßwand sind bisher nur unzureichend charakterisiert. Wir untersuchten, ob eine ähnliche NADPH Oxidase wie in Leukozyten, mit den Untereinheiten p22phox und gp91phox auch in den Endothel- und glatten Muskelzellen der Gefäßwand existiert. Phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) aktiviert die leukozytäre NADPH Oxidase und steigert in endothelintakten Aortenringen die ROS-Produktion. PMA steigert auch die Radikalproduktion in Endothelzellen (EC); jedoch nicht in glatten Muskelzellen (SMC) und denudierten Aortenringen. ECs und SMCs exprimieren p22phox, während gp91phox nur in ECs nachgewiesen werden konnte. Mox1, ein Homolog von gp91phox konnte im Gegensatz dazu nur in SMCs und nicht in ECs gefunden werden. Die funktionelle Relevanz von gp91phox wurde mittels vergleichender Experimente mit Aorten-Segmenten von Wildtyp-, gp91phox-/--und eNOS-/--Mäusen analysiert. Die PMA-induzierte ROS-Produktion der Aortenring von Wildtyp und eNOS-/--Mäusen war ähnlich stark, während sie in den Aortenringen von gp91phox-/--Mäusen ausblieb. Der Radikalfänger Tiron verstärkte die endothelabhängige Relaxation in Aortensegmenten von Wildtyp-, jedoch nicht von gp91phox-/--Mäusen. Unsere Daten zeigen, dass ECs, ähnlich wie Leukozyten, eine gp91phox enthaltende NADPH Oxidase exprimieren. Dieses Enzym ist eine Hauptquelle arterieller ROS und beeinflusst die Bioverfügbarkeit von endothelialem NO.
(1) Die genomweite Expressionsanalyse von salzadaptierten Zellen von M. mazei Gö1 identifizierte eine Reihe von salzregulierten Genen. Neben den beiden Operone ota und abl, die für die Akkumulierung von Glycin-Betain und Ne-Azetyl-b-Lysin verantwortlich sind, konnte ein ABC-Transporter (MM0953), der in seiner Genumgebung weitere Transporter sowie Proteine mit konservierten S-Layer-Domänen aufweist, als salzreguliert erkannt werden. Dies deutet auf ein S-Layer-Exportsystem hin, das eine Rolle in salzadaptierten Zellen spielen könnte. (2) Eine genomweite Expressionsanalyse von Zellen von M. mazei Gö1 zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach einem hyperosmotischen Schock auf 400 mM NaCl ermöglichte Einblicke in den Verlauf der Genexpression. Die Erhöhung der externen Osmolarität resultierte in der erhöhten Expression von Genen, die für die Aufnahme und Biosynthese von kompatiblen Soluten verantwortlich sind sowie von Genen deren Produkte regulatorische Funktion haben könnten. (3) Genomweite Expressionsanalysen von Zellen von M. mazei Gö1 nach einem hypoosmotischen Schock zeigten erhöhte Expression von Genen, die an der Regulation und an der generellen Stressantwort beteiligt sind. Gene, deren Produkte im Stoffwechsel wichtig sind – besonders Gene, die für Methylamin-Corrinoid-Methyltransferasen kodieren – erscheinen stark reprimiert. (4) Die Bestimmung der intrazellulären Ionenkonzentrationen zeigte ein unspezifisches Einströmen von den Ionen, die den osmotischen Schock auslösen sofort nach dem Schock, sowie den Ausstrom derselben Ionen im Verlauf von 5 Minuten. Die Ionenkonzentrationen der Ionen, die den Schock auslösten, blieben intrazellulär erhöht. Das Ein- und Ausströmen der Ionen nach einem hyperosmotischen Stress ist nicht energieabhängig. (5) M. mazei akkumulierte nach einem hyperosmotischen Schock kein K+, zeigte aber eine erhöhte intrazelluläre Konzentration dieses Ions, wenn die Zellen in Medium mit erhöhter Osmolarität angezogen wurden. (6) Durch hyperosmotische Schocks mit verschiedenen Salzen und Zuckern konnte gezeigt werden, dass die kurzzeitige Akkumulation von Ionen keine gerichtete Antwort auf den osmotischen Stress ist. (7) Es konnte weiters gezeigt werden, dass Zellen von M. mazei Gö1, die mit dem kompatiblen Solut Betain inkubiert wurden, nach einem hyperosmotischen Schock K+ akkumulieren. Dies bedeutet möglicherweise eine K+-abhängige Regulation des Glycin-Betain-Transporters. (8) Die Funktion der drei im Genom kodierten Na+/H+-Antiporter konnte auf transkriptioneller Ebene nicht geklärt werden. Trotzdem zeigt ein Hydrophobizitätsplot des Proteins eine mögliche Beteiligung von Nha1 (MM0294) an der Osmoregulation durch eine hydrophile C-terminale Domäne. (9) Nach einem hyperosmotischen Schock von 38,5 auf 400 mM NaCl erhöhte sich die intrazelluläre Konzentration an Glutamat, das in M. mazei als kompatibles Solut fungiert, bereits nach drei Stunden. Zellen, die bereits an die erhöhte Salzkonzentration adaptiert waren, enthielten 1,4 μmol Glutamat/mg Protein. (10) Die Glutamin-Synthetase zeigte eine erhöhte Transkription nach einem hyperosmotischen Schock. Das Protein wird aber nicht salzabhängig produziert und zeigt keine Enzymaktivität. Die Biosynthese des Solutes über eine Glutamat-Dehydrogenase ist die wahrscheinliche Alternative. (11) Aufgrund der generierten Expressionsprofile und der physiologischen Daten konnte ein Modell der Osmoadaptation in Methanosarcina mazei Gö1 erstellt werden.
1. Die Deletionsderivate der Kompetenzproteine PilN und PilQ wurden als Fusionsproteine mit dem Maltosebindeprotein überproduziert, über eine Amylosesäule aufgereinigt und in nativer Form für die Generierung von polyklonalen Kaninchen-Antikörpern eingesetzt. 2. Unter Einsatz der spezifischen alpha-PilN- und alpha-PilQ-Antikörpern konnte das PilN-und PilQ-Kompetenzprotein im Rohextrakt von T. thermophilus HB27 detektiert werden. 3. Die Überprüfung bereits vorliegender Antikörper gegen die Kompetenzproteine PilM, PilW und PilA4 ergaben, dass es sich hier ebenfalls um spezifische Antikörper handelt. 4. Mittels Western-Blot-Analysen unterschiedlicher Mutanten konnte gezeigt werden, dass die Markerinsertion in den Genen pilM, pilN, pilO und pilW zu keinem polaren Effekt der jeweils stromabwärts gelegenen Gene führt. 5. Analysen der subzellulären Lokalisation der Kompetenzproteine ergaben, dass PilM und PilN ausschließlich in der inneren Membran lokalisiert sind, während PilW, PilQ und PilA4 sowohl in der inneren als auch äußeren Membran detektiert wurden. Die größte Menge an PilQ wurde allerdings in der äußeren Membran gefunden. 6. Mutantenstudien ergaben, dass eine pilQ-Mutantion zur Abwesenheit von PilW und PilA4 in der äußeren Membran führte. Ebenso führte eine pilW-Mutantion zu Abwesenheit von PilQ und PilA4 in der äußeren Membran. Diese Ergebnisse indizieren Interaktionen zwischen PilW, PilQ und PilA4. 7. In der pilD-Mutante wurde kein PilA4 mehr in der äußeren Membran detektiert. Dieser Befund untermauert den Schluss, dass es sich bei PilD um eine PilA4 prozessierende Präpilin-Peptidase handelt. 8. Western-Blot-Analysen der gereinigten Pili führen zu dem Schluss, dass das Kompetenzprotein PilA4 die strukturelle Untereinheit der Pilus-Struktur repräsentiert. Das Sekretin-ähnliche Kompetenzprotein PilQ wurde ebenfalls in der gereinigten Pilus-Fraktion detektiert und könnte Teil der globulären Struktur an den Pilusenden sein. 9. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Dünnschnitten durch T. thermophilus HB27 Zellen ließen den ungewöhnlichen Aufbau der Zellperipherie erkennen. Zwischen der inneren Membran (8 nm dick) und der äußeren Membran (8 nm dick) befand sich neben dem dünnen Peptidoglykan (8 nm dick) eine 40 nm dicke kontrastarme Schicht, die radial von Fäden durchzogen schien. 10. Die Dünnschnitte wurden für Immunogoldmarkierungen mit alpha-PilQ-Antikörpern eingesetzt, um PilQ zu detektieren. Allerdings konnte in den elektronenmikroskopischen Analysen keine spezifische Goldmarkierung nachgewiesen werden. Ursache hierfür könnte die Unzugänglichkeit des nativen PilQ in den Dünnschnitten sein. 11. Die Immunogoldmarkierung des Gefrierbruchs von ganzen Thermus-Zellen mit alpha-PilQ-Antikörpern führte zur Detektion von PilQ-haltigen Ring-ähnlichen Strukturen in der äußeren Membran. Der Durchmesser des PilQ-Komplexes mit 17 - 18 nm ist mit denen der aus Sekretinen bestehenden Ringsystemen anderer Organismen vergleichbar. 12. In den T. thermophilus HB27 Membransolubilisaten wurde ein >669 kDa PilW-PilQ-Komplex identifiziert. Dieser Komplex ließ sich optimal mit n-Dodecyl-beta-D-maltosid (1 mg Detergenz pro mg Membranprotein) aus der Membranfraktion solubilisieren. Stabilitätsuntersuchungen ergaben, dass dieser Komplex bei 4 °C einige Tage, bei Raumtemperatur und bei Anwesenheit von 1 M NaCl einige Stunden stabil ist. 13. Mittels einer DEAE-Austausch-Chromatographie konnte der PilW-PilQ-Komplex angereichert werden. Die Western-Blot-Analysen ergaben, dass das Kompetenzprotein PilM mit dem PilW-PilQ-Komplex koeluiert. 14. In der MALDI-TOF-Massenspektrometrie konnte das Kompetenzprotein PilQ und Untereinheiten der DNA-gerichteten RNA-Polymerase, ein Membran-Lipoprotein sowie Energie-Stoffwechsel-Proteine in der angereicherten PilW-PilQ-haltigen Fraktion nachgewiesen werden. Diese Proteine müssen auf die Beteiligung an der Transformation untersucht werden. 15. Immunelektronenmikroskopische Analysen des angereicherten PilW-PilQ-Komplexes führten zur Identifizierung von Ringstrukturen mit einem Durchmesser von 17 nm. Dieser Durchmesser entspricht den Sekretin-Komplexen von P. aeruginosa (18,3 ± 1,2 nm) bzw. N. gonorrhoeae (15,5 - 16,5 nm) und dem Durchmesser der über Immunogoldmarkierung detektierten PilQ-haltigen Strukturen in T. thermophilus HB27.
Seit der Einführung der antiretroviralen Therapie (HAART) ist die Mortalität von HIV-Infizierten in der westlichen Welt zwar deutlich zurückgegangen, die HIV-Infektion ist jedoch bis heute nicht heilbar. Die derzeitige Therapie unterdrückt zwar sehr effektiv die Virusreplikation, kann aber nicht das Virus vollständig eliminieren und somit die Infizierten nicht heilen. Die daher notwendige Langzeitbehandlung wird wiederum durch die relativ hohe Toxizität der Medikamente und durch das Auftreten resistenter Virusvarianten limitiert. Die Suche nach neuen Therapienansätzen und Wirkstoffklassen ist daher immer noch von größter Wichtigkeit. Die HIV-Gentherapie stellt neben der konventionellen antiretroviralen Therapie eine mögliche zusätzliche Behandlungsform dar. Die Arbeitsgruppe von Laer hat am Georg-Speyer-Haus retrovirale Vektoren entwickelt, die membrangebundene (ma) HIV-Eintrittsinhibitoren, sog. C Pepitde, kodieren. Das durch den Prototyp-Vektor M87 kodierte maC36-Peptid zeigte eine moderate Inhibition des Viruseintritts. In einem Optimierungsprozess wurde der Vektor M87o generiert. M87o kodiert im Vergleich zu M87 ein wirksameres maC-Peptid (maC46) und weist auch eine wesentlich höhere Expressionsstärke und dadurch eine stärkere inhibitorische Wirkung als der Prototypvektor auf. Ziel dieser Arbeit war es zunächst, HIV Varianten, die resistent gegenüber dem M87o–Genprodukt maC46 sind, in vitro zu generieren und anschließend den Resistenzmechanismus aufzuklären. In einer Kollaboration mit der Gruppe um M. Dittmar aus Heidelberg war durch Passage des HIV 1 Wildtyp (wt) Ba L-Isolats auf M87-transduzierten Zellen bereits das maC36-resistente Virusisolat Ba L_sel_MD generiert worden. Ba L_sel_MD wies zwei Resistenzmutationen in der gp41-Untereinheit des Hüllproteins auf: I556V (heptad repeat 1 Region) und N634K (heptad repeat 2 Region). Für die Mutation 634K war dabei gezeigt worden, dass sie auch zu einer leichten Reduktion der maC46-Sensibilität führt. In der vorliegenden Arbeit diente Ba L_sel_MD als Ausgang für die Selektion einer Virusvariante mit deutlich verminderter Sensibilität gegenüber maC46. Hierfür wurde Ba L_sel_MD über 149 Tage lang auf Zellen mit steigender maC46 Expressionshöhe passagiert und so das Isolat Ba L_FH1 generiert. Das Hüllprotein des selektierten Isolats war ausreichend, um einen maC46-resesistenten Phänotyp hervorzurufen. Das selektierte Hüllprotein war im Vergleich zu dem Ausgangsisolat ca. fünf- bis zehnfach weniger empfindlich gegenüber maC46. Die Sequenzierung des Ba L_FH1 Hüllproteingens zeigte, dass die Aminosäureausprägung an Position 634 des Ausgangsisolats (BaLsel_MD) konserviert worden war, während die Position 556 zur Wildtypsequenz revertiert war. Darüber hinaus wurden drei Mutationen in der gp120-Untereinheit des Hüllproteins (V2-Region (I187T), V3-Region (N305Y), C3-Region (E352K)), sowie eine Mutation in der heptad repeat 1 Region (A579T) der gp41-Untereinheit identifiziert. Für die reduzierte maC46-Empfindlichkeit waren in erster Linie die Mutation N305Y in der V3 Region und die Rückmutation 556I in Zusammenwirkung mit der bereits vorhandenen Mutation 634K verantwortlich. Die verbleibenden Mutationen hatten allenfalls modulierende Wirkung auf die maC46-Sensibilität. Die Resistenz ist vermutlich auf die beobachtete erhöhte Fusionsgeschwindigkeit des Hüllproteins von Ba L_FH1 im Vergleich zum Ausgangsisolat zurückzuführen, die interessanterweise mit einer reduzierten Corezeptoraffinität verknüpft war. Die erhöhte Fusionsgeschwindigkeit verkürzt das zeitliche Fenster, in welchem maC46 an seine Zielstruktur innerhalb des gp41 binden kann. Es scheinen zwei unterschiedliche Phasen des Eintrittprozesses durch die Mutationen verändert worden zu sein. Die Mutation in der V3-Region (N305Y) der gp120-Untereinheit beschleunigt wohl eine frühe Phase. Vermutlich ermöglicht diese Mutation, dass bestimmte Übergangszustände nach der Corezeptorbindung schneller durchlaufen werden können, indem die gp120/Corezeptorbindung destabilisiert wird. Die Rückmutation 556I beschleunigt wahrscheinlich in Zusammenspiel mit der bereits vorhandenen Mutation 634K die Ausbildung des 6 Helixbündels. Diese beiden Mutationen wirken somit auf eine späte Phase der Fusion. Obwohl bekannt ist, dass natürliche Variationen in gp120 die Sensibilität des HIV-Hüllproteins gegenüber C-Peptiden beeinflussen, konnte in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass solche Mutationen auch in vitro selektiert werden, um eine C-Peptidresistenz herbeizuführen.
Der menschliche Körper ist permanent mechanischen Reizen in Form von Dehnung oder Druck ausgesetzt. Diese Stimuli können vielfältige zelluläre Prozesse induzieren. Dehnungsreize erhöhen die Zellproliferation in allen bisher untersuchten Zellspezies, inklusive Endothel- und Epithelzellen. Im Gegensatz dazu scheinen mechanische Druckbelastungen zu zellulärer Differenzierung zu führen. Die Relevanz dieser mechanischen Reize für die Physiologie und Pathophysiologie ist für viele Organe nachgewiesen worden. Jedoch gibt es bislang keine hinreichenden Untersuchungen, die belegen, dass mechanische Reize ebenso eine Rolle bei der Tumorproliferation spielen könnten. Im Fokus dieser Promotionsarbeit steht die Fragestellung, inwieweit die mechanischen Verhältnisse in Tumoren in einem funktionellen Zusammenhang mit der Tumorgenese stehen. Zur Klärung dieser Fragestellung ist ein Xenograft-Tumormodell etabliert worden, das es erlaubt in vivo-Untersuchungen an humanen epithelialen Tumoren durchzuführen. Um Erfahrungen aus vorherigen in vitro-Versuchen nutzen zu können, wurden humane epitheliale A431-Vulvakarzinom- und humane epitheliale A549-Lungenkarzinomzellen für das Tumormodell verwendet. Mit diesem Modell konnte erstmals in vivo gezeigt werden, dass solide humane Tumore einer permanenten mechanischen Dehnung ausgesetzt sind, die direkten Einfluss auf die Proliferation der Tumorzellen hat. Als zentraler Auslöser für die mechanische Dehnung der Tumorzellen konnte der erhöhte tumorinterstitielle Flüssigkeitsdruck (TIFP) identifiziert werden. Der Einfluss der mechanischen Dehnung auf die Proliferation der Tumorzellen wurde anhand der Phosphorylierung der extracellular regulated kinase 1/2 (ERK1/2) bzw. der Ki-67 Expression gezeigt. Durch die Punktion bzw. Drainage von Tumoren konnte der TIFP experimentell abgesenkt werden und in Folge dessen kam es zu einer reduzierten mechanischen Dehnung der Tumorzellen. In allen Versuchen war die Abnahme der mechanischen Dehnung von einer verringerten Phosphorylierung der ERK1/2 bzw. reduzierten Expression des Proliferationsmarkers Ki-67 begleitet. Der TIFP induziert aber nicht nur mechanische Dehnungsreize, sondern er stellt darüber hinaus eine physikalische Barriere für den effizienten Transport von Therapeutika in den Tumor dar. Der gegenüber dem umliegenden Gewebe erhöhte TIFP behindert den interstitiellen Transport und die Aufnahme von Molekülen aus dem Gefäßsystem in die Tumorzellen. Die Etablierung einer neuen experimentellen Technik zur Senkung des TIFP, durch i.v. Injektion von konzentriertem humanem Serumalbumin, führte zu einer signifikanten Verbesserung der Aufnahme und einer Verlängerung der Verweildauer von Makromolekülen/Therapeutika innerhalb von Tumoren. Des Weiteren konnten immunhistochemische Färbungen gegen lymphspezifische Marker in Gewebeproben von A431 und A549 Tumoren keinen direkten Zusammenhang zwischen Lympharchitektur und TIFP zeigen. Dies bedeutet, dass in den untersuchten Tumoren die Ausbildung des hohen TIFP eher auf eine erhöhte Rigidität der extrazellulären Matrix bzw. die hohe Permeabilität des tumorversorgenden vaskulären Gefäßsystems zurückzuführen ist. Parallel zu den in vivo-Untersuchungen durchgeführte in vitro-Versuche konnten Proteine identifizieren, die an der druckinduzierten p38 Signaltransduktionskaskade beteiligt sind. Diese Ergebnisse untermauern die bisherigen in vitro-Daten bzgl. der differentiellen Reaktionen von Zellen auf mechanische Druckreize. Abschließend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse der in vivo-Versuche die Bedeutung und die klinische Relevanz des biophysikalischen Parameters TIFP hervorgehoben haben. Die Zukunft der Krebstherapie liegt nicht alleine in der Entwicklung neuer hochspezifischer Wirkstoffe, sondern auch in der Lösung des Transports der Wirkstoffe an den Zielort. Die vorgestellten Ergebnisse dieser Promotionsarbeit weisen eine beträchtliche klinische Relevanz auf, denn sie zeigen, dass die experimentelle Absenkung des TIFP zu einer verbesserten Aufnahme von Therapeutika beiträgt. Gleichzeitig wird die Proliferationsrate von Tumorzellen durch die reduzierte mechanische Dehnung signifikant verringert. Dieser Doppeleffekt könnte zu einer effizienteren Krebstherapie führen in Folge derer es zu einer verlängerten Überlebensrate sowie einer Verbesserung der Lebensqualität von Krebspatienten kommen könnte.
Many environmental chemicals are suspected of disturbing the human and animal endocrine system. These so-called endocrine disruptors can operate in many ways. The interaction of endocrine disruptive effects that eventually endanger human health is still unclear. However, one of the basic mecha-nisms of endocrine disruption is the inhibition of key enzymes in the hormone metabolism. In this study, we focused on the inhibitory potency of suspected endocrine disrupting compounds on aromatase (P450arom) and 5alpha-reductase (5alpha-Re) activities in human tissue and human cancer cells. Both enzymes are essential for the human sex steroid hormone metabolism. We were able to demonstrate that the organotin compounds tributyltin (TBT) and triphenyltin (TPT) are potent unspecific inhibitors of P450arom and 5alpha-Re activity. Prochloraz and fenarimol inhibited P450arom activity at low concentrations (IC50<2 µM), while 5alpha-Re activity was only impaired at higher concentrations (IC50>10 µM). While the human tissue assay proved to be more practical and sensitive as a screening tool for putative endocrine disruptors, the cell assay reflected partly the situation in vivo. In another experimental series, we investigated the inhibitory effect of TPT on P450arom, 5alpha-Re, 3beta-HSD type 2, 17beta-HSD type 1 and type 3 alone and in combination with the strong antioxidant dithioerythrithol (DTE). TPT inhibited unspecifically all enzymes that were tested. The experiments also showed that DTE is able to compensate the adverse effects of TPT, and that the effectiveness of the compensatory activity of DTE differs among the enzymes investigated. The suppressed 5alpha-Re activity could not be reactivated with DTE. Conceivably, cysteine residues that are responsible for the tertiary and quarternary structure of the enzyme are critical targets for TPT. A human sampling study was undertaken with the COMPRENDO partner in Gdansk. 60 Polish and 15 German blood samples were investigated for chemical residues and sex hormone concentrations. In addition, 15 placenta samples from Poland and Germany, respectively, were tested for chemical residues, P450arom activities and CYP19 mRNA contents. The chemical analysis was performed by the COMPRENDO partners in Milan (p,p´DDE), Orleans (TBT and TPT) and Ioannina (diuron, fenarimol, linuron und vinclozolin). The results showed that individual sex hormone concentrations in blood were not correlated with chemical body burden. The detected differences in sex hormone concentrations, specific aromatase activity and relative CYP19 mRNA content of Polish and German donors were presumably the result of other factors than the ones determined in this study. Another task of the EU-project was the investigation of the effects of chemical exposure of the aquatic model organisms Pimephales promelas, Rutilus rutilus and Xenopus laevis. We investigated the specific P450arom and 5alpha-Re activities in brain and gonads of the animals. During the qualitative investigation of the androgen metabolism in Xenopus laevis brain, 5alpha-reductase activity was discovered for the first time. In contrast to the inhibitory potency of TPT discovered in our enzyme assays, TPT exposure of aquatic model organisms had no observed effect on enzyme activity in the organs investigated, except for P450arom activities in female gonads of Pimephales promelas at 320 ng TPT/L. In this group, mean P450arom activities were elevated, possibly as a result of an overshooting upregulation due to the inhibition of P450arom by TPT. The exposure of Rutilus rutilus and Xenopus laevis to the effector substances methyltestosterone and letrozole resulted in slightly different mean enzyme activities compared to the control group. In conclusion, many of the tested pesticides are able to inhibit P450arom and 5alpha-Re, and thus might be of clinical relevance. However, results are not always coherent, and possible risks for human and wildlife health are therefore difficult to predict. Risk assessment will require large studies with an additional number of short and long term in vitro and in vivo assays. Any extrapolation to humans should be very meticulously performed.