Refine
Year of publication
- 2007 (313) (remove)
Document Type
- Doctoral Thesis (313) (remove)
Language
- German (232)
- English (79)
- Portuguese (2)
Has Fulltext
- yes (313)
Is part of the Bibliography
- no (313) (remove)
Keywords
- Apoptosis (3)
- Endothel (3)
- Gentherapie (3)
- Kardiovaskuläre Krankheit (3)
- Molekularbiologie (3)
- Molekülstruktur (3)
- NMR-Spektroskopie (3)
- ABC-Transporter (2)
- Arteriosklerose (2)
- Arzneimitteldesign (2)
Institute
- Medizin (113)
- Biochemie und Chemie (56)
- Biowissenschaften (47)
- Physik (24)
- Pharmazie (18)
- Wirtschaftswissenschaften (9)
- Geowissenschaften (7)
- Gesellschaftswissenschaften (7)
- Psychologie (7)
- Erziehungswissenschaften (3)
Lineare sowie zyklische 3-Alkylpyridinalkaloide sind vor allem in Schwämmen der Ordnung Haplosclerida, zu der auch Haliclona viscosa zählt, weit verbreitet. Die Synthese der zuvor von C. Volk isolierten Haliclamine C und D, des Viscosamins und des Viscosalin C bildete den Ausgangspunkt dieser Arbeit.[1-4] Sie erfolgte ausgehend von den bekannten Synthesen der Cyclostellettamine und Haliclamine[5-7] und gliedert sich in drei Abschnitte: erstens Synthese eines ω-Hydroxyalkylpyridins aus einem Bromalkohol, zweitens Funktionalisierung der Monomere in Abhängigkeit der gewählten Methode zur Di- bzw. Trimerisierung und drittens Verknüpfung und gegebenenfalls Zyklisierung. Durch Anwendung und Weiterentwicklung der bekannten Synthesewege wurden so insgesamt 14 lineare Monomere, zwei zyklische Monomere, 16 Cyclostellettamine, zwei Isocyclostellettamine, sieben Haliclamine, fünf Viscosaline sowie Viscosamin[8] und ein Analogon mit Heptylkette hergestellt. Dieser synthetische Zugang ermöglichte es, sowohl den finalen Strukturbeweis für die zuvor isolierten Verbindungen zu erbringen, als auch durch die Analyse der Fragmentierungs-muster von synthetischen und natürlichen Verbindungen mehr über das Verhalten dieser Verbindungen unter MS-Bedingungen zu erfahren. Die so gewonnenen Erkenntnisse führten dazu, dass drei unbekannte Verbindungen ohne Isolierung der Reinsubstanz mit einer Kombination von MS- und HPLC-Daten identifiziert werden konnten. So konnten das erste monozyklische 3-Alkylpyridinalkaloid marinen Ursprungs und zwei neue Haliclamine identifiziert und synthetisiert werden Des Weiteren gelang es, für die von C. Volk isolierten, jedoch nicht identifizierten Verbindungen Strukturen zu ermitteln bzw. auf Grund der MS-Daten Strukturvorschläge zu machen. Die durch den synthetischen Zugang große Anzahl verfügbarer 3-Alkylpyridinalkaloide ermöglichte außerdem eine systematische Untersuchung über den Zusammenhang von biologischer Aktivität und Struktur. Die Ergebnisse der am Helmholtz Institut für Infektionsforschung durchgeführten Experimente zu den antibakteriellen sowie cytotoxischen Eigenschaften von natürlichen wie auch rein synthetischen 3-Alkylpyridinalkaloiden zeigten, dass die Aktivität sich schon beim Addieren bzw. Subtrahieren einer Methylengruppe in einer Alkylkette signifikant ändert. [1] C. A. Volk, M. Köck, Org. Lett. 2003, 5, 3567-3569. [2] C. A. Volk, M. Köck, Org. Biomol. Chem. 2004, 2, 1827-1830. [3] C. A. Volk, H. Lippert, E. Lichte, M. Köck, Eur. J. Org. Chem. 2004, 3154-3158. [4] C. A. Volk, Dissertation, Johann Wolfgang Goethe Universität (Frankfurt am Main), 2004. [5] A. Grube, C. Timm, M. Köck, Eur. J. Org. Chem. 2006, 1285-1295 und Referenzen darin. [6] J. E. Baldwin, D. R. Spring, C. E. Atkinson, V. Lee, Tetrahedron 1998, 54, 13655-13680. [7] A. Kaiser, X. Billot, A. Gateau-Olesker, C. Marazano, B. C. Das, J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8026-8034. [8] C. Timm, M. Köck, Synthesis 2006, 2580-2584.
Untersuchungen zur zerstörungsfreien Emittanzmessung an einem negativen Wasserstoffionenstrahl
(2007)
Die Arbeit beschäftigte sich sowohl theoretisch wie auch praktisch mit einem neuartigen Konzept zur Strahldiagnose — der zerstörungsfreien Emittanzmessung für negative Ionenstrahlen. Bei H¯ Strahlen kann auf mechanische Bauteile verzichtet werden, wenn bei einem kleinen Teil der H¯ Ionen das zusätzliche, nur mit 0,754 eV schwach gebundene Elektron durch Photodetachment abgelöst wird. Die neutralisierten H¯ Ionen können magnetisch oder elektrostatisch von den Elektronen und den verbliebenen H¯ Ionen separiert werden. Insbesonders die Neutralteilchen bieten sich zur Bestimmung der Phasenraumverteilung des Ionenstrahls an, da der Impulsübertrag bei der Photoneutralisation für die vorliegende Anwendung vernachlässigbar ist. Die Detektion des Divergenzwinkels kann durch einen Szintillator mit einer CCD–Kamera erfasst werden. Ein Modell zur Berechnung der Anzahl der neutralisierten Teilchen ist unter der Annahme homogener Dichteverteilungen entwickelt worden, um Aussagen zu den Anforderungen an Lasersystem und Detektor zu machen. Dabei zeigt sich die besondere Eignung des Meßverfahrens für Strahlstöme und Strahlparameter, wie sie typischerweise nach einem RFQ vorliegen. Da im Gegensatz zur Schlitz–Schlitz Emittanzmessung wird hier die Winkeldetektion mit einem ortsauflösenden Szintillator durchgeführt. Daraus ergibt sich als neues Verfahren eine Schlitz–Punkt Abbildung. Im Vergleich zum Schlitz–Schlitz Messprinzip können damit mehr Informationen über die Phasenraumverteilung gewonnen werden. Um diese neue Abbildungsfunktion zu untersuchen, ist eine Methode zur Simulation der Winkeldetektion entwickelt worden. In den Simulationen ist angenommen worden, daß der Schlitz bzw. Laser analog zur Messung einer yy´ Emittanz entlang der y–Achse durch den Ionenstrahl gefahren wird, die ausgeschnittene Teilchenverteilung ist bis zum Ort des Szintillators transportiert worden. Dabei sind etliche Zusammenhänge der Abbildungsfunktion zwischen den 2dim Phasenraumprojektionen yy´ , xx´ und der Verteilung der neutralisierten Ionen auf dem Teilchendetektor aufgezeigt worden. Dabei läßt sich nachweisen, daß die Aberrationen aus der anderen transversalen Ebene (x–Ebene) die Verteilungsfunktion mit beeinflusst. Für die experimentellen Untersuchung der Photodetachment Strahldiagnose wurde eine Beamline aus Ionenquelle mit Dumpingsystem, differentiellem Pumptank und Linsensystem aufgebaut. Dabei wurde bei einer vorhandenen H¯ Quelle der Strom von anfänglich 70 mycroA auf 2,5 mA gesteigert. Das Dumpingsystem erwies sich als sehr effektiv und lenkte bis zur Nachweisgrenze alle zusätzlich extrahierten Elektronen aus dem Strahl aus. Die Komponenten und der gesamte Aufbau zur Photodetachment Strahldiagnose schließen den Dipol bzw. die Konstruktion der Vakuumkammer zur Ladungsseparation, die Auswahl eines geeigneten Szintillators und die Bestimmung der Laserstrahlparameter und dessen Strahlwegs mit ein. Bei den Experimenten zur Photoneutralisation konnte eindeutig das Meßsignal dem Photodetachment zugeordnet werden. Auch die Linearität des Szintillators konnte eindeutig gezeigt werden. Ebenfalls konnte die Beeinflussung der Einzellinsen auf den Ionenstrahl an Hand neutralisierter Teilchen gezeigt werden: Bei Vergrößerung der Brechkraft wurde der zunächst große Strahldruchmesser mit einem Intensitätsmaximum im Strahlkern zu einer hohlstrahlähnlichen Verteilung mit einem Peak in der Strahlmitte und am Strahlrand fokussiert. Bei weiterer Steigerung der Linsenspannung ließ sich die Intensität im Strahlrand wieder reduzieren. Durch die Veränderung der y–Position wurden Winkelprofile mit den zuvor gemessenen Schlitz–Schlitz Emittanzfiguren verglichen. Dabei konnte der Divergenzwinkel und auch die Lage des Strahlkerns im Rahmen der Meßgenauigkeit sehr gut wiedergegeben werden. Andererseits zeigten sich deutliche Unterschiede bei der Auswertung der Intensitäten. Dies ist zum Teil auf die schlechte Wiedergabe eines Holhlstrahls durch eine zweidimensionale Phasenraumprojektion yy´ zu erklären. Außerdem ist der Ionenstrahl durch die kleine Bauhöhe der Magnetkammer kollimiert worden, was den Strahl im Vergleich zu den vorherigen Schlitz–Schlitz Emittanzmessungen nachhaltig beeinflusst hat. Dagegen wiesen im direkten Vergleich, nämlich der zweidimensionalen, „wahren“ Ortsverteilung des Ionenstrahls am Szintillator mit den aufaddierten Neutralteilchen–Verteilungen, beide Verteilungen sehr ähnliche Muster auf. Die Messungen sind fast ausnahmslos an stark aberrationsbehafteten Ionenstrahlen durchgeführt worden. Dabei konnte die in den Simulationen der Abbildungseigenschaften gefundenen geschlossenen, achtförmigen Verteilungen unter Berücksichtigung der begrenzten Nachweisempfindlichkeit des Detektors sehr gut nachvollzogen werden.
This work analyses several granitic bodies of the Variscan Orogen of Central and Western Europe in order to improve our knowledge about different aspects of their evolution, regarding their ascent and emplacement mechanisms, as well as their deformation history. In the Iberian Massif two granitoid bodies, namely the La Bazana pluton and the Nisa-Alburquerque batholith, were studied in order to decipher their ascent and emplacement history. The La Bazana pluton is a small, sub-circular body in map view that intruded into rocks of the Ossa-Morena Zone in the core of a late upright antiform. Its three-dimensional drop-pipe shape, its internal dome foliation pattern and the structure of the host rock suggest that the magma ascended and emplaced diapirically. The Nisa-Alburquerque batholith is a large body that intruded into rocks of the Central Iberian Zone, the Central Unit, and the Ossa-Morena Zone. Its cartographic shape is elongate and parallel to the NW—SE to WNW—ESE Variscan structures. In the light of the available structural data and the gravimetric models, the intrusion is viewed as a continuous lateral magma flow from the eastern root guided towards the west through the southern limb of a kilometre-scale antiform. As mass-transfer mechanisms, a combination of rigid translation of the country rocks, stoping, and possibly ballooning is proposed. In the Bohemian Massif several small granitoid bodies showing a strong solid-state deformation were studied in order to integrate their tectonometamorphic history in the geotectonic framework of the south-western Bohemian Massif, focusing principally on the deformation phase referred to as D3. Four ductile deformation phases are proposed for the study area. D1 produced high-temperature fabrics under upper amphibolite to granulite facies conditions. Its kinematics is unknown. D2 occurred under amphibolite to upper greenschist facies conditions under N—S to NNW—SSE compression. It is responsible for a subvertical NW—SE striking foliation in migmatites developed under dextral simple shear and for the deformation at the Bayerischer Pfahl shear-zone system at its earlier stages. Many granitoid dykes and stocks were found to be affected by sinistral shear along subvertical planes trending ENE to ESE. Since this deformation, which is called D3 in the present work, is not compatible with a N—S to NNW—SSE compression, it is proposed that these sinistral shear zones in granites do not belong to the Bayerischer Pfahl shear-zone system and constitute themselves a separated one, which is called “D3 shear-zone system”. D3 took place under upper greenschist to lower amphibolite facies conditions (~480-550°C). Both the intrusion and the deformation of the granites affected by D3 occurred at deep to intermediate levels of the crust, whereas the deformation took place under NE—SW compression. Datings on two of the deformed granites yielded 324.4 ± 0.8 Ma and 315.0 ± 1.0 Ma: Thus, the age of D3 is most probably ~315 Ma. The intrusion of most of the sheared granitoids was pre-kinematic with respect to D3. After D3 the N—S to NNW—SSE compression which governed D2 was restored, giving way to the next deformation phase D4, which was linked to further deformation at and next to the principal shears of the Bayerischer Pfahl shear-zone system under greenschist facies conditions. The causes for the change of the stress field leading to a NE—SW compression during D3 might be related to (1) global changes in the dynamics of the tectonic plates in late Variscan times, (2) orogenic collapse leading to the sinking of the Teplá-Barrandian and lateral extrusion of the surrounding Moldanubian rocks, (3) distortion of the regional stress field by local intrusion of large stocks, such as the Saldenburg granite of the Fürstenstein Massif, or (4) distortion of the regional stress field due to the existence of ephemeral releasing bends in the Bayerischer Pfahl shear zone during its early evolution.
Die Funktion biologischer Peptide und Proteine hängt wesentlich von deren intakten molekularen Struktur ab. Krankheiten, wie z.B. Alzheimer oder Diabetes, entstehen durch fehlgefaltete, aggregierte Peptidstrukturen. Die Ausbildung einer nativ gefalteten Konformation wird durch die Formierung von Sekundärstrukturelementen - in charakteristischer Weise angeordnete lokale Strukturen - initiiert und bildet einen geschwindigkeitslimitierenden Schritt in der Proteinfaltung. Die Erforschung und Analyse dieser ersten Faltungsprozesse ist deshalb von grundlegender Relevanz in der biophysikalischen Forschung, auch in Hinblick auf pharmazeutisch-medizinische Anwendungen. Bei der Untersuchung des Faltungsmechanismus kommen vor allem kleine Peptide mit eindeutig ausgebildeten Sekundärstrukturmotiven zum Einsatz. Ihre geringe Größe und strukturelle Eindeutigkeit machen diese kleinen Peptide zu idealen Modellsystemen, um diejenigen Faktoren zu untersuchen, die die Proteinfaltung steuern und beeinflussen. Die zur Untersuchung der Faltungsprozesse verwendeten Techniken müssen dabei sowohl eine Spezifität für die unterschiedlichen Strukturelemente, als auch eine der Faltungsdynamik angemessen Zeitauflösung besitzen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden CD- und FTIR-Messungen zur Untersuchung der Strukturstabilität von Polypeptiden unter Gleichgewichtsbedingungen durchgeführt. Durch Variation von pH-Wert und Temperatur wurden damit Stabilitätseigenschaften ausgewählter Peptidsysteme analysiert. Um zeitaufgelöste Faltungsdynamiken von Peptiden detektieren zu können, wurde ein Spektrometer mit Laser-induziertem Temperatursprung (DeltaT ca. 10 °C in 10 ns) und IR-Einzelwellendetektion so modifiziert und optimiert, dass Peptiddynamiken im nanosec bis microsec Zeitbereich gemessen werden konnten. Neben der Modifikation der Temperatursprung-Apparatur, bei der optische Komponenten ersetzt und Störsignale reduziert wurden, konnte auch die Auswertung der kinetischen Daten durch die Entwicklung eines geeigneten Algorithmus verbessert werden. Als notwendige Vorarbeit der Faltungsstudien an Peptiden in wässriger Lösung wurden statische FTIR-Absorptionsmessungen am Lösungsmittel D2O durchgeführt. Dadurch wurden die durch Temperaturvariation erzeugten Absorptionsänderungen des Lösungsmittels ermittelt. Diese wurden zudem zur Kalibrierung des Laser-induzierten Temperatursprunges verwendet. Um Lösungsmittelabsorptionen von strukturellen Änderungen des Peptids zu trennen, wurde ein Auswerteverfahren entwickelt, das die temperaturabhängigen Absorptionsänderungen des Lösungsmittels berücksichtigt. Temperatur- und pH-abhängige Konformationsdynamik wurde am alpha-helikalen Peptid Polyglutaminsäure untersucht. Zunächst wurden CD- und FTIR-Messungen zur Thermostabilität und der Reversibilität der Ent- und Rückfaltung unter Gleichgewichtsbedingungen und bei unterschiedlichen pH-Werten durchgeführt. Der thermisch induzierte Strukturübergang von alpha-Helix nach ungeordneter Knäuel-Struktur wurde mit Hilfe der Laser-induzierten Temperatursprung-Technik zeitaufgelöst untersucht und Relaxationsraten bei verschiedenen pH-Werten bestimmt. Weitere Messungen zur Konformationsstabilität und –dynamik wurden an beta- Hairpin-Peptiden durchgeführt, die kleine Modellsysteme für beta-Faltblattstrukturen darstellen. Die in dieser Arbeit untersuchten Trpzip2C Peptide, die aufgrund hydrophober Wechselwirkungen der Tryptophane eine stabile beta-Hairpin-Struktur in wässriger Lösung ausbilden, waren an verschiedenen Positionen innerhalb der Aminosäure-sequenz selektiv isotopenmarkiert. Durch diese Markierungen im Peptidrückgrat werden spezifisch spektrale Änderungen im Infrarotspektrum erzeugt, die Untersuchungen zur Amidbandenkopplung und lokalisierten Strukturdynamik ermöglichen. Diese Ergebnisse stellen die erste Anwendung der Kombination von selektiv isotopenmarkierten alpha-Hairpin-Peptiden und der Temperatursprung-Technik dar, um Konformationsdynamiken ortsaufgelöst zu untersuchen. Für alle untersuchten Trpzip2C-Peptidvarianten konnte gezeigt werden, dass der Faltungsprozess in einem Temperaturbereich unterhalb von ~ 300 K nicht durch ein Zwei-Zustandsmodell beschrieben werden kann, sondern Intermediate gebildet werden. In diesem Temperaturbereich konnten wellenlängenabhängig Unterschiede in Relaxationsraten gemessen werden, die die Hypothese des „hydrophoben Kollaps“ für den Faltungsmechanismus dieser beta-Hairpin-Peptide unterstützen.
A detailed understanding of how potassium channels function is crucial e. g. for the development of drugs, which could lead to novel therapeutic concepts for diseases ranging from diabetes to cardiac abnormalities. An improved understanding of channel structure may allow researchers to design medication that can restore proper function of these channels. This is particularly important for KCNQ channels, since four out of five family members are involved in human inherited disease. In addition to structure and function relationships the determinants which govern assembly of KCNQ subunits are decisive to understand the physiological role of the KCNQ channel family members. Many details of KCNQ channel assembly remain incompletely understood. Previous work has shown that the subunit-specific heteromerisation between KCNQ subunits is determined by a ~115 amino acid-long subunit interaction domain (si) within the C-terminus (Schwake et al., 2003). Recently, Jenke et al. (2003) proposed that the C-terminal domains in eag and erg K+ channels act as sites which drive tetramerization. From their ability to form coiled coils, these domains were referred to as tetramerizing coiled-coil (TCC) sequences. Jenke et al. also pointed out that KCNQ channels contain bipartite TCC motifs within their C-termini, exactly within the si domain, which is responsible for the subunit-specific interaction pattern. The first part of this thesis was dedicated to determine the individual role of these TCC domains on homomeric and heteromeric channel formation in order to further characterize the molecular determinants of KCNQ channel assembly. In the second part of this thesis cystein-scanning mutagenesis was employed, followed by thiol-specific modification using MTS reagents to screen more than 20 residues in the S3-S4 linker region and in the S4 transmembrane domain of the KCNQ1 channel to gain information about residue accessibility, the functional effects of thiol-modifying reagents (MTSES), and effects of crosslinking selected pairs of Cys residues by Cd+ ions, which could be used for testing model predictions based upon known Kv channel structures from the literature. According to homology modelling based on the Kv1.2 structure it was attempted to determine the proximity of individual residues from different transmembrane segments using the metal bridge approach (crosslinking by Cd+ ions). This led us to derive structural constraints for interactions between the S4 voltage sensor and adjacent transmembrane segments of KCNQ1. Similar studies have previously been performed on the Shaker K+ channel, which has served as a paradigm for structure-function research of voltage-gated K+ channels for a long time, but little is known for KCNQ channels concerning their similarity to published K+ channel structures.
Molecular mechanism of intracellular signal transduction by the angiotensin-converting enzyme
(2007)
The angiotensin converting enzyme (ACE) is an important component of the renin-angiotensin system (RAS) and is crucially involved in the homeostasis of fluid and electrolyte balance and thus in the regulation of blood pressure. The zinc metallopeptidase is involved in the generation of angiotensin II, a potent vasoconstrictor and in the degradation of bradykinin, a potent vasodilator. It is worth noting that ACE more readily hydrolyzes bradykinin than it does angiotensin I thus culminating in the net physiological effect of the production of a vasoconstrictor and the decrease in the availability of a vasodilator. ACE inhibitors have become one of the most successful therapeutic approaches as a first line of therapy in hypertension, and are also widely used in treating heart failure, myocardial infarction, stroke, coronary artery disease and impaired left ventricular function. However, one unexpected clinically relevant finding related to ACE inhibitors is their ability to delay the onset of type II diabetes that was revealed by various large clinical trials. However, the mechanisms underlying these beneficial effects of ACE inhibitor therapy are currently unclear and cannot be explained by the prevention of angiotensin II formation or the attenuated degradation of bradykinin. Thus the potential beneficial effects attributed to ACE inhibitors may occur independent of reductions in blood pressure paving way for new and/or unknown mechanism. Our group has recently redefined ACE as a signal transduction molecule which upon binding to ACE inhibitor turns on a signalling cascade leading to phosphorylation of Ser1270 by CK2, activation of JNK and changes in gene expression in endothelial cells. However the mechanism by which ACE inhibitor initiates the signalling cascade was not clear. It was hypothesized that ACE, which is anchored to the membrane with a single transmembrane domain should dimerize prior to initiating further downstream signalling events in endothelial cells. Therefore, we sought to explore whether or not ACE forms dimers in endothelial cells and whether ACE dimerization is essential for the initiation of ACE signalling in endothelial cells. Using native gel electrophoresis, we found that ACE forms dimers in endothelial cells and that there is an increase in the dimer formation upon treatment of endothelial cells with ACE inhibitors. ACE homodimerization was also demonstrated using the split-ubiquitin system and chemical cross-linking experiments. ACE dimers are also formed in endothelial cells overexpressing the non-phosphorylatable ACE, wherein ACE signalling was abolished indicating that dimerization process is not influenced by the phosphorylation of the serine residue residing in the cytoplasmic tail. Monosaccharides like glucose, galactose and mannitol did not have any influence on ACE-inhibitor induced dimerization. Making use of different monoclonal antibodies directed to the epitopes of N-domain which harbours carbohydrate recognizing domain, also did not affect dimerization. However, inactivation of the C-domain active site by introducing mutation of the key histidine residues in HEMGH consensus sequences, which complexes the zinc ions, abolished enzyme dimerization both in the basal state and in response to ramiprilat. Mutation of the C-domain also resulted in the loss of ACE inhibitor-induced ACE signalling, that is we failed to observe ramiprilat-induced increase in the phosphorylation of the Ser1270 and the subsequent JNK activation. ACE-inhibitor induced dimerization precedes the phosphorylation of Ser1270 and activation of JNK. Thus the ACE-inhibitor induced dimerization via the C-domain of ACE represents the initial step in the ACE signalling pathway which involves the activation of JNK/c-Jun pathway and leading to the changes in the gene expression in endothelial cells. Our group previously identified ACE itself as well as cyclooxygenase-2 (COX-2) as two “ACE signalling-regulated” genes. To screen for additional genes regulated in a similar manner we used DNA microarray technology, to assess ramiprilat-induced changes in the endothelial cell gene expression. 21 genes were identified to be differentially regulated of which, 7 were upregulated and 14 were downregulated by ramiprilat. However, when screened at the protein level, we found no significant differences between the untreated control cells and those treated with ramiprilat. As several other cells and tissues possess a fully functional RAS we screened plasma samples from healthy volunteers as well as from patients with coronary artery disease for the proteins identified in the microarray. We observed that the cellular retinal binding protein-1 (CRBP-1) was detectable at low levels in plasma from patients and that ramipril markedly increased serum levels of this protein. Endothelial cells overexpressing CRBP-1 demonstrated increased RXRE and PPRE activity when stimulated with 9-cis retinoic acid and rosiglitazone respectively suggesting that CRBP-1 might affect gene expression via heterodimerization of PPAR elements with RXR elements by virtue of its function as a transport protein of retinoic acid. Studies aimed at determining the consequences of elevated CRBP-1 expression on endothelial cell homeostasis are ongoing. Although the RAS has been described in many other tissues apart from endothelial cells, ACE signalling has not yet been addressed in tissues such as monocytes/macrophages, which have an increased ACE expression in an atherosclerotic setting. We observed that upon stimulation of cultured ACE expressing monocytes with ramiprilat, JNK is activated suggesting the occurrence of ACE signalling in human monocytes. It is worth noting that ACE inhibitors delay the onset of type II diabetes in spite of moderate decrease in blood pressure. To further elucidate the mechanism underlying this effect, we found that ACE inhibitors increase the PPARgamma levels in the nuclear extracts of ACE expressing monocytes which were also reproduced in human endothelial cells overexpressing human somatic ACE. However, ramiprilat did not have any direct effect on the activity of a luciferase-coupled promoter containing several copies of the PPRE in human endothelial cells. These results contrasted with the actions of the PPARgamma agonist suggesting that ramiprilat enhances PPARgamma levels through an indirect mechanism. We next hypothesized that ramiprilat might increase the levels of 15-deoxy-D12,14-prostaglandin J2 (15dPGJ2) which is a natural ligand for PPARgamma via COX enzymes in monocytes. We observed that ramiprilat was able to decrease the diminution of COX-2 levels upto 48 hours of treatment but the levels of 15dPGJ2 were too low to be detected by ELISA. However ramiprilat enhanced the plasma levels of adiponectin, a downstream target of PPARgamma, which is a anti-atherogenic and anti-inflammatory adipokine, in patients with coronary artery disease. Though adiponectin is a PPARgamma-regulated gene, the observed increase in adiponectin might be attributed to the increase in RXR rather than via PPARgamma. Taken together, the results of this investigation have revealed that ACE inhibitors initiate ACE signalling by eliciting the dimerization of the enzyme, more specifically via its C-domain active centers. The ACE signalling cascade when activated leads to the enhanced expression of ACE, COX-2 and CRBP-1 which in turn favours the heterodimerization of PPARgamma with RXR and thus results in the increased expression of “PPARgamma regulated” genes such as adiponectin. The latter results provide a molecular basis for the observation that ACE inhibitors can delay the onset of type 2 diabetes in as much as it was possible to link ramipril with CRBP-1, RXR activity and the expression of adiponectin, an adipokine associated with improved insulin sensitivity. Further work is however required to elucidate the consequences of ACE inhibitors in monocytes and adipocytes as well as in intact animals.
In der klassischen Theorie der formalen Sprachen gehört die Beschreibung von Sprachen durch Grammatiken oder Automaten zu den wichtigen Themen. Im Gegensatz zu diesen Modellen, die aus einer einzelnen Komponente bestehen, beschäftigt sich die Informatik heute aber immer häufiger mit verteilten Systemen, deren Komponenten auf verschiedene Art und Weise zusammenarbeiten. Eine Möglichkeit, dieses Konzept auf die Theorie der formalen Sprachen zu übertragen, ist die Definition von Grammatiksystemen. Ein Grammatiksystem besteht aus mehreren Grammatiken, die nach bestimmten Regeln zusammenarbeiten. Hauptsächlich unterscheidet man dabei zwischen sequentieller und paralleler Kooperation. In dieser Arbeitwerden kontextfreie „cooperating distributed“ (CD) Grammatiksysteme, ein Modell mit sequentieller Kooperation, betrachtet. Zur Erzeugung eines Wortes arbeiten dabei mehrere kontextfreie Grammatiken, die Komponenten, an einer gemeinsamen Satzform. Zu jedem Zeitpunkt ist immer nur eine einzige Komponente aktiv. Der Schwerpunkt der Arbeit liegt auf der Beschreibungskomplexität von CD Grammatiksystemen. Dabei wird zuerst auf die verschiedenen Maße für die Größe oder statische Komplexität eines CD Grammatiksystems eingegangen. Ein wichtiges Ergebnis im ersten Teil der Arbeit ist, daß man für CD Grammatiksysteme und insbesondere hybride CD Grammatiksysteme, eine Verallgemeinerung von kontextfreien CD Grammatiksystemen, einige dieser Maße nach oben beschränken kann. Darunter fallen die Anzahl der Komponenten und die maximale Anzahl von Produktionen in einer Komponente. Hält man einen der beiden Parameter fest, so entsteht eine unendliche Hierarchie über dem anderen Parameter. Der zweite Teil der Arbeit konzentriert sich darauf, Ergebnisse für Größenmaße zu erzielen, die nicht nur einzelne Aspekte der Komplexität, sondern die gesamte Größe oder Länge eines CD Grammatiksystems darstellen. Dafür werden CD Grammatiksysteme geeignet eingeschränkt. Man erhält metalineare Systeme und Systeme von endlichem Index. Im Gegensatz zum unbeschränkten Modell kann hier die generative Mächtigkeit sehr genau charakterisiert werden und es können Hilfsmittel wie Pumpinglemmata gezeigt werden.Weitere Resultate sind eine unendliche Hierarchie über der Breite beziehungsweise dem Index solcher Grammatiksysteme. Das wesentliches Resultat im zweiten Teil dieser Arbeit besteht daraus, daß zwischen zwei Klassen von diesen eingeschränkten CD Grammatiksystemen, deren entsprechende Sprachklassen echt ineinander enthalten sind, nichtrekursive Tradeoffs existieren. Das heißt, daß sich der Größenzuwachs beim Wechsel von der stärkeren Klasse von CD Grammatiksystemen in die schwächere durch keine rekursive Funktion beschränken läßt.
Untersuchungen zur molekularen Kontrolle der Kupferhomöostase in dem Ascomyceten Podospora anserina
(2007)
Das essentielle Spurenelement Kupfer ist Co-Faktor mehrerer Schlüsselenzyme (z B. Cu/Zn-SOD, Cytochrom c Oxidase). Da Kupfer leicht Elektronen aufnehmen und abgeben kann, eignet es sich besonders gut für Redox-Reaktionen. Wenn Kupfer jedoch mit Sauerstoff reagiert, entstehen hoch cytotoxische reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die nach der „freien Radikaltheorie des Alterns“ (nach D. Harman 1956) ursächlich für Alterung und Zelltod sind. Um deren Bildung zu vermeiden, erfolgen alle Aspekte des Kupferstoffwechsels – Aufnahme, Transport und Speicherung - stets proteingebunden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich bis auf drei Ausnahmen die gesamte bislang bekannte Maschinerie der molekularen Kupferhomöostase aus anderen Modellorganismen (z.B. S. cerevisiae oder H. sapiens) auch im Genom des Ascomyceten Podospora anserina mit Homologen bzw. Orthologen wiederfindet. Die drei Ausnahmen betreffen jeweils Proteine, für die in anderen Organismen mehrere Isoformen existieren und P. anserina nur jeweils ein Homolog/Ortholog besitzt. Für mehrere der neu vorhergesagten Gene (PaAtx1, PaCcc2, PaCcs1, PaCox11, PaCox19, PaCox23, PaSco1) konnte eine Expression im Wildstamm nachgewiesen werden. Dazu wurden Standardtechniken (Northern Blot Analyse, RT-PCR) und auch neu etablierte eGFP-Reporterkonstrukte verwendet. In Podospora anserina scheint Kupfer auf zwei verschiedene Arten Einfluss auf die Lebensspanne zu nehmen: Zum einen mittelbar darüber, dass die Verfügbarkeit von Kupfer über die in der mitochondrialen Atmung verwendete Endoxidase entscheidet. Bei Kupfermangel wird eine Eisen-abhängige alternative Oxidase (AOX) induziert. Durch Atmung über die AOX entstehen weniger ROS, was die Lebensspanne verlängert. Anhand einer Vielzahl langlebiger Mutanten konnte dieser Zusammenhang bereits mehrfach demonstriert werden. Zum anderen scheint Kupfer auch eine unmittelbare Rolle in der Seneszenz von P. anserina zu spielen. In früheren Arbeiten konnten mehrere indirekte Hinweise (Transkript- und Aktivitätsanalysen) gesammelt werden, dass im Alter die cytoplasmatische Kupferkonzentration drastisch ansteigt. Durch Messung der Kupferkonzentration mittels einer direkten chemisch-analytische Methode (TXRF) in fraktionierten Zellbestandteilen (Cytoplasma und Mitchondrien) konnten in dieser Arbeit diese Hinweise weiter untermauert werden. Experimente mit in die mitochondriale Matrix geleitetem eGFP brachten zusätzliche Indizien dafür, dass das mitochondriale Kupfer-Reservoir die Quelle des sich in seneszenten Pilzstämmen im Cytoplasma wiederfindenden Kupfers ist. Durch einen Prozess, der größenabhängig reguliert und in anderen Organismen als „Mitochondrial Permeability Transition – MPT“ zu Beginn der Apoptose bekannt ist, ergiesst sich beim Eintritt in die Seneszenz der Inhalt der mitochondrialen Matrix in das Cytosol. Die Bedeutung dieses Vorgangs und v.a. die Folgen der Umverteilung von Kupfer innerhalb der Zelle bleiben im Detail weiter zu klären. Durch die durchgeführten Arbeiten konnte ein weiterer deutlicher Beweis für das Ablaufen apoptotischer Mechansimen im Alterungsprozeß des Ascomyceten P. anserina erbracht werden.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Hypothese, dass der „Life Orientation Test (-Revised)“ (LOT-R), der als Selbstberichtsfragebogen zur Erfassung von dispositionellem Optimismus konstruiert wurde, nicht nur „Optimismus“ erfasse, sondern auch „Pessimismus“; Pessimismus wird im Rahmen dieser „OP-Hypothese“ nicht als der Gegenpol von Optimismus aufgefasst, sondern als ein partiell unabhängiges Konstrukt. Die OP-Hypothese wird typischerweise mit sog. „konfirmatorischen“ Faktorenanalysen untersucht. Die OP-Hypothese wird zunächst aus theoretischer Perspektive analysiert, insbesondere auch deshalb, weil die Begriffe „Optimismus“ und „Pessimismus“ im Rahmen der OP-Hypothese nicht auf dieselbe Art verwendet werden wie sonst in der Psychologie oder in anderen Wissenschaften üblich. Dabei zeigt sich, dass keine angemessene theoretische Herleitung der OP-Hypothese möglich ist: Was „Pessimismus“ ist, wenn es nicht der Gegenpol von Optimismus ist, bleibt unklar. Ausgehend von dem Befund, dass die theoretische Herleitung der OP-Hypothese unangemessen ist, wird diese Hypothese aus methodologisch-testtheoretischer Perspektive und mittels zweier empirischer Arbeiten kritisch überprüft. Aus methodologischer und mathematisch-statistischer Perspektive wird dargestellt, dass die empirischen Befunde, die für die OP-Hypothese sprechen, nicht eindeutig sind; die OP-Hypothese ist also unterdeterminiert. Die Gültigkeit eines reflexiven Messmodells, das für die Untersuchung der OP-Hypothese mittels konfirmatorischer Faktorenanalysen erforderlich wäre, kann nicht ohne Weiteres angenommen werden. Die mathematisch-statistischen Annahmen der „experimentellen Unabhängigkeit“ und der „lokalen Homogenität“, die ein reflexives Messmodell konstituieren, sind für Selbstberichtsfragebogen in vielen Fällen verletzt. Noch gravierender ist das Ergebnis, dass sich aus „konfirmatorischen“ Faktorenmodellen, die für die OP-Hypothese sprechen, keine ausreichenden Informationen über den empirischen Gehalt der Hypothese ergeben. In grundsätzlicher Form und anhand einfacher Beispiele wird gezeigt, dass für eine gegebene Kovarianzmatrix, die die Datenbasis einer „konfirmatorischen“ Faktorenanalyse darstellt, grundsätzlich unendlich viele Alter-nativmodelle konstruiert werden können, von denen zumindest eine Teilmenge auch mit sinnvollen Interpretationen verbunden ist. Angesichts der Existenz solcher Alternativmodelle müssen andere Kriterien zur Überprüfung der OP-Hypothese herangezogen werden als „konfirmatorische“ Faktorenmodelle. Anhand einer empirischen Untersuchung mit dem LOT-R wird gezeigt, dass ein „Methodeneffektmodell“ eine bessere Anpassung an die Daten ermöglicht als das mit der OP-Hypothese verbundene Modell. Das Methodeneffektmodell beinhaltet die Annahme, dass die Antworten auf LOT-R-Items nicht ausschließlich durch die individuelle Ausprägung in „Optimismus“ bedingt werden, sondern zum Teil auch unerwünschte Effekte der Itemformulierungen abbilden. Entsprechend lässt sich eine Korrelation des „Methodenfaktors“ mit sozial erwünschtem Antwortverhalten beobachten. Schließlich wird in einer weiteren empirischen Untersuchung gezeigt, dass mit der Skala „Personaler Optimismus“ ein Instrument zur Erfassung von dispositionellem Optimismus vorliegt, welches nicht unter der faktorenanalytischen Mehrdimensionalität leidet, die den LOT-R kennzeichnet. In der Zusammenschau der methodologischen und empirischen Ergebnisse muss die OP-Hypothese als zu gering begründet zurückgewiesen werden. Über den Rahmen des speziellen Inhaltsgebietes „Optimismus“ hinaus weist die vorliegende Arbeit aber auch auf die Notwendigkeit multipler Betrachtungsebenen bei der Untersuchung persönlichkeitspsychologischer Fragestellungen hin. Nachteilig für die persönlichkeitspsychologische Forschung könnten sich insbesondere die unreflektierte Verwendung von Selbstberichtsfragebogen auf der Seite der Datenerhebung und die unreflektierte Verwendung von „konfirmatorischen“ Faktorenanalysen auf der Seite der Datenauswertung auswirken.
Die Kritik am jüdischen Religionsunterricht hat in der jüdischen Bildungsgeschichte eine lange Tradition. Nicht erst F. Rosenzweig beklagte in den 20er Jahren des vorigen Jahrhunderts die Situation der jüdischen Unterweisung. Unter Einfluss der jüdischen Aufklärung wurde vor allem die traditionsgebundene jüdische Erziehung durch die verschiedenen Repräsentanten der Haskala bemängelt , denen es gelang, diese Erziehung in verschiedener Hinsicht zu transformieren. Die Zielsetzung der jüdischen Unterweisung seit biblischer Zeit, die Weitergabe der Überlieferung an die nächste Generation wird seit der Emanzipation als Vermittlung jüdischer Identität verstanden, verbunden mit der Frage, wie man diese Identität entfalten kann.
Heute steht der jüdische Religionsunterricht in Deutschland erneut in kritischer Observanz und damit auch die Frage, wie bei Kindern und Jugendlichen jüdische Identität entwickelt werden kann. ...
Zur Rolle der Typ-I-Interferone in der Abwehr von viralen Infektionen des zentralen Nervensystems
(2007)
Das zentrale Nervensystem (ZNS) bildet eine einzigartige Umgebung für Immunantworten, da Neuronen eine essentielle und in weiten Teilen nicht-erneuerbare Zellpopulation bilden. Virale Infektionen des ZNS und lokale anti-virale Immunantworten können zu dem Verlust von Neuronen und somit zu katastrophalen Erkrankungen führen. Unter normalen Bedingungen ist das ZNS weitgehend von der Kontrolle durch das Immunsystem ausgeschlossen. In diesem Zusammenhang wurde das ZNS oft auch als „immunprivilegiert“ bezeichnet. Dieses Konzept musste in den letzten Jahren revidiert werden, da es sich gezeigt hat, dass das ZNS nicht völlig vom Immungeschehen isoliert ist. Wichtige Mediatoren antiviraler Immunantworten sind die Typ I Interferone (IFN). Die verschiedenen Typ I IFN binden an einen gemeinsamen Rezeptor, den Typ I Interferon-rezeptor (IFNAR). Die Bedeutung von Typ I IFN Antworten für die Kontrolle viraler Infektionen wurde besonders eindrucksvoll mit IFNAR-defizienten Mäusen (IFNAR-/-) gezeigt. Nach Infektion mit dem neurotropen Vesikulären Stomatitis Virus (VSV) führt das Fehlen des IFNAR zu einer stark erhöhten Empfänglichkeit für tödlich verlaufende Infektionen. In allen Organen und besonders im ZNS von VSV infizierten IFNAR-/- Tieren fanden sich stark erhöhte Virusmengen. Um zu untersuchen, ob die VSV-Infektion des zentralen Nervensystems in IFNAR-/- Mäusen in erster Linie auf ein Versagen der peripheren Immunität oder des IFN Systems innerhalb des ZNS zurückzuführen ist, wurden mittels der Cre loxP Tech-nologie Mäuse hergestellt, die auf allen peripheren Zellen IFNAR exprimieren, während die Neuronen des ZNS IFNAR defizient sind (NesCre+/-IFNARflox/flox). Nach intranasaler VSV Infektion zeigten NesCre+/-IFNARflox/flox Mäuse zunächst keine Krankheitssymptome. Nach 5 bis 6 Tagen traten aber aufsteigende und halbseitige Lähmungen auf, so dass die infizierten Tiere verstärkt im Kreis liefen und schließlich verstarben. Im Vergleich dazu verstarben IFNAR-/- Mäuse bereits nach 2 bis 3 Tagen während normale C57BL/6 Tiere nach Infektion keine Symptome zeigten und überlebten. Der beobachtete Krankheitsverlauf lässt in den IFNAR-/- Mäuse auf ein Multiorganversagen als Todesursache schließen. 3 und 6 Tage nach Infektion konnte in den Organen von C57BL/6 Tieren kein Virus reisoliert werden. In den NesCre+/ IFNARflox/flox Tieren fanden sich zum Todeszeitpunkt nur im Gehirn Viruspar-tikel, während alle anderen Organe virusfrei waren. Die Virustiter im Hirn waren im Vergleich zu den IFNAR-/- Mäusen 10- bis 100-fach erhöht. In den anderen Organen und im Blut sind keine Viruspartikel nachweisbar. Dieser Befund deutete gemeinsam mit den beobachteten Krankheitsverläufen auf eine neuropathologische Symptomatik hin, bei der es wahrscheinlich zu einer VSV-Infektion des Hirnstammes kam. Die Analyse einzelner Regionen des ZNS zeigte in IFNAR-/- Tieren, dass 2 Tage nach Infektion in allen Regionen des ZNS signifikante Virusmengen zu finden waren. In den NesCre+/-IFNARflox/flox und den C57BL/6 Tieren fanden sich zu diesem Zeitpunkt nur im Riechhirn (Bulbus olfactorius) signifikante Virustiter. In den C57BL/6 Tieren blieb das Virus auf diese Region beschränkt und wurde dort innerhalb von 6 Tagen eliminiert. In den NesCre+/-IFNARflox/flox Tieren kam es in den folgenden Tagen jedoch zu einer fortschreitenden Infektion des ZNS, und auch das Großhirn, das Kleinhirn, der Hirn-stamm und das Rückenmark zeigten hohe Virustiter. In der Induktion peripherer Immunantworten unterschieden sich NesCre+/-IFNARflox/flox und C57BL/6 Mäuse nicht. In den WT Tieren kam es im Gegensatz zu den NesCre+/ IFNARflox/flox und IFNAR-/- Tieren innerhalb von 48 Stunden nach Infektion im Riechhirn zu einer Typ I IFN abhängigen Phosphorylierung von STAT-1, einer Komponente des IFNAR-Signaltransduktionsweges. Alles deutet darauf hin, dass die Induktion geringer Mengen Typ I IFN innerhalb des Riechhirns notwendig ist, um Im-munantworten zu aktivieren, die ein Übergreifen der Virusinfektion auf andere Regio-nen des ZNS verhindern. Eine funktionierende Immunität in der Peripherie und die Blut-Hirn-Schranke scheinen nicht ausreichend zu sein, um eine Infektion des ZNS mit VSV zu verhindern. Stattdessen muss es zur Aktivierung von IFN-abhängigen Mechanismen innerhalb des Riechhirns kommen, die ein Übergreifen der VSV Infektion auf andere Hirnregionen verhindert und zur Elimination von VSV im Riechhirn beiträgt.
Im Zentrum dieser Arbeit steht die Operation der Gruppe Gamma:=SL_n(Z[1/m]) auf dem symmetrischen Raum M:=SL_n(R)/SO(n). Allgemeiner betrachten wir die Operation rho:Gamma->Isom(M) einer S-arithmetischen algebraischen Gruppe durch Isometrien auf dem zugehörigen symmetrischen Raum M. Die symmetrischen Räume sind Riemannsche Mannigfaltigkeiten mit nichtpositiver Krümmung und daher insbesondere CAT(0)-Räume. R. Bieri und R. Geoghegan haben für die Operation rho:G->Isom(M) einer abstrakten Gruppe G auf einem CAT(0)-Raum M die geometrischen Invarianten Sigma^k(rho) als Teilmenge des Randes von M eingeführt (vgl. [Robert Bieri and Ross Geoghegan, Connectivity properties of group actions on non-positively curved spaces, vol. 161, Memoirs of the AMS, no. 765, American Mathematical Society, 2003]). Die Fokusierung, die durch die geometrischen Invarianten erreicht wird, hat sich in vielen Fällen bewährt, in denen eine Operation durch Translationen auf dem euklidischen Raum zur Verfügung steht. Über die Invarianten von anderen CAT(0)-Operationen ist noch wenig bekannt. In der vorliegenden Arbeit berechnen wir nun die geometrischen Invarianten Sigma^k(rho) für die oben erwähnte Operation rho der S-arithmetischen Gruppe Gamma auf dem zugehörigen symmetrischen Raum M. Wir erhalten für die Gruppe SL_n(Z[1/m]) die folgende Invariante: Sigma^k(rho) ist der ganze Rand von M, falls k kleiner als s(n-1) ist; Sigma^k(rho) ist die Menge aller Randpunkte e von M, die nicht im Rand eines rational definierten flachen Unterraum von M liegen, falls k größer oder gleich s(n-1) ist. Hierbei ist s die Anzahl der verschiedenen Primteiler von m. Die obigen Resultate sind eine Verallgemeinerung derer in [Robert Bieri and Ross Geoghegan, Controlled Connectivity of SL_2(Z[1/m]), Geometriae Dedicata 99 (2003), 137--166]. Der Beweis, den wir geben, besteht aus einer Vereinfachung des Beweises von Bieri und Geoghegan, die dann auf die allgemeinere Situation angepasst werden konnte. Ein interessanter Aspekt ergibt sich, wenn wir für eine Operation rho auf M die Zahlen k betrachten, für die gilt: (*) Sigma^k(rho) ist der ganze Rand von M. Operiert die Gruppe Gamma mit diskreten Bahnen, dann ist (*) äquivalent zur Eigenschaft, daß die Punktstabilisatoren Gamma_a, für a aus M, vom Typ F_k sind. Die Eigenschaft (*) ist auch von Interesse für S-arithmetische Untergruppen einer linearen algebraischen Gruppe über einem Funktionenkörper. Wir zeigen, daß es hier eine naheliegende Operation rho' auf einem Bruhat-Tits Gebäude M' gibt, so daß Gamma' ein Punktstabilisator und damit die Eigenschaft (*) mit der Eigenschaft "Gamma' ist vom Typ F_k" zusammenfällt. Im Zahlkörperfall sind die Verhältnisse ganz anders. Unsere S-arithmetischen Gruppen operieren auf dem symmetrischen Raum M nicht mit diskreten Bahnen und sind durchwegs vom Typ F_k für alle k. Dagegen erlaubt unser Hauptresultat die Bestimmung der Zahlen k mit der Eigenschaft (*) und zeigt eine interessante Abhängigkeit von s=|S| und dem Rang r der algebraischen Gruppen (rho erfüllt (*) <=> k<rs). Das Hauptresultat wird außerdem nicht nur für SL_n(Q), sondern allgemeiner für Chevalley-Guppen über Q oder Q(i) gezeigt, so daß wir damit für eine Reihe von klassischen CAT(0)-Operationen die Invarianten Sigma^k(rho) bestimmt haben.
In this thesis we investigate the role played by gauge fields in providing new observable signatures that can attest to the presence of color superconductivity in neutron stars. We show that thermal gluon fluctuations in color-flavor locked superconductors can substantially increase their critical temperature and also change the order of the transition, which becomes a strong first-order phase transition. Moreover, we explore the effects of strong magnetic fields on the properties of color-flavor locked superconducting matter. We find that both the energy gaps as well as the magnetization are oscillating functions of the magnetic field. Also, it is shown that the magnetization can be so strong that homogeneous quark matter becomes metastable for a range of parameters. This points towards the existence of magnetic domains or other types of magnetic inhomogeneities in the hypothesized quark cores of magnetars. Obviously, our results only apply if the strong magnetic fields observed on the surface of magnetars can be transmitted to their inner core. This can occur if the superconducting protons expected to exist in the outer core form a type-I I superconductor. However, it has been argued that the observed long periodic oscillations in isolated pulsars can only be explained if the outer core is a type-I superconductor rather than type-I I. We show that this is not the only solution for the precession puzzle by demonstrating that the long-term variation in the spin of PSR 1828-11 can be explained in terms of Tkachenko oscillations within superfluid shells.
This thesis is concerned with various aspects of estimating trend output and growth and discusses and evaluates methods to prepare medium-term GDP growth projections. Furthermore, econometric techniques suited for cross-correlated macroeconomic panel data with a focus on factor models are applied for unit root and cointegration testing as well as panel error correction estimation. Applications involve the identification of growth determinants as well as the modelling of aggregate labor supply in a multi-country framework. The first chapter evaluates a very popular method for potential output estimation and medium-term forecasting---the production function approach---in terms of predictive performance. For this purpose, a particular forecast evaluation framework is developed and an evaluation of the predictions of GDP growth for the three to five years ahead for each individual G7 country is carried out. In chapter two, a new approach for estimating trend growth of advanced economies is proposed. The suggestion combines econometric methods that have been used to test and estimate the implications of the extended Solow growth model in a cross sectional time series setting with an application of multivariate time series filter techniques. The last chapter discusses several panel unit root tests designed to accommodate cross-sectional dependence. These methods are then applied to an OECD country sample of the aggregate labor supply measure "hours worked".
Für pädiatrische Patienten mit Hochrisikoleukämien ist die Donor-Lymphozyten-Infusion eine etablierte Therapieform, um nach Stammzelltransplantation die Immunrekonstitution zu verbessern oder ein beginnendes Rezidiv abzuwehren. Als schwerwiegende Nebenwirkung kann jedoch eine „Graft-versus-host“-Krankeit (graft-versus-host disease; GVHD) auftreten, bei der die T-Zellen gesundes Gewebe angreifen. In ersten klinischen Studien mit veränderten, Suizidgen tragenden Donor-Lymphozyten konnte durch die rechtzeitige Gabe eines Suizidinduktors die GVHD unterbunden werden. Die genetische Manipulation der T-Zellen führte jedoch zu einem Funktionsverlust, der vermutlich auf die zur Transduktion notwendige Aktivierung zurückzuführen ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Aktivierungsprotokolle mit Beads-gekoppelten oder löslichen Antikörpern hinsichtlich der Expansionsrate und dem Einfluss auf die Funktionalität der T-Zellen näher untersucht. Dazu wurden primäre humane T-Zellen im klinischen oder im Labormaßstab immunomagnetisch über eine CD3 sowie CD4/CD8 Selektion oder mittels der RosetteSep-Prozedur auf > 96% angereichert und anschließend expandiert. Die Transduktion erfolgte an den Tagen 3 und 4 mit einem „GMP-grade“ CD34/HSV-TK Vektor. Zur Aktivierung wurden zum einen lösliche CD3/CD28 Antikörper und zum anderen zellgroße Kügelchen - sogenannte Beads – verwendet. Die Beads wurden mit CD3/CD28 Antikörper und fakultativ mit CD2 beladen. Die beladenen Beads imitieren in der Zellkultur eine Antigen präsentierende Zelle und sollten damit eine möglichst physiologische Situation schaffen. Außerdem wurden unterschiedliche IL-2 Konzentrationen zugesetzt (20-1000 U/ml), um einen potentiellen IL-2 Effekt auf die T-Zellen zu untersuchen. Die Aktivierung mit den löslichen Antikörpern führte zu einer IL-2 abhängigen Proliferation der T-Zellen über 14 Tage mit maximaler Expansionsrate (47fach) bei 1000 U/ml IL-2. Die Expansion mit Beads-gekoppelten Antikörpern war ebenfalls IL-2 abhängig, beschränkte sich jedoch auf die erste Woche und erreichte eine maximale Expansionsrate von 3-4. In der zweiten Woche fiel die Zellzahl ab. Zusammenfassend sind für eine starke Expansion der T-Zellen eine hohe IL-2 Konzentration, aber auch die löslichen Antikörper per se verantwortlich. Gleichzeitig konnte demonstriert werden, dass es große individuelle Unterschiede in der T-Zellexpansion verschiedener Spender gibt. Der Einfluss der Aktivierung auf die Veränderung der T-Zellsubpopulationen wurde mit Hilfe von multiparametrischen Analysen am Durchflusszytometer untersucht. Hohe IL-2 Konzentrationen (100 und 1000 U/ml) sowie die Verwendung löslicher Antikörper führten zu einer starken Zunahme der CD8+ T-Zellen. Der CD4/CD8 Quotient blieb lediglich unter Stimulierung mit den Beads-gekoppelten Antikörpern in Verbindung mit 20 U/ml IL-2 konstant. Mit allen Aktivierungsprotokollen ergab sich für den immunologischen Phänotyp eine Verschiebung vom naiven zum Gedächtniszelltyp. Die Proliferation CMV-spezifischer T-Zellen konnte mit allen Aktivierungsprotokollen erreicht werden und korrelierte mit der Expansionsrate der gesamten CD3+ T-Zellen. Die Zytokinausschüttung war verringert bei den T-Zellen, die mit den löslichen Antikörpern stimuliert wurden. Eine verminderte Zytokinproduktion könnte auf einen Verlust der Funktionalität der T-Zellen hindeuten. Von besonderer Bedeutung ist, dass die Stimulierung über Beads-gekoppelte Antikörper zu einer gleichmäßigen Transduktion von CD4+ und CD8+ T-Zellen führte. Im Gegensatz dazu hatte die Aktivierung mit löslichen Antikörpern zur Folge, dass hauptsächlich CD8+ T-Zellen transduziert wurden. Für eine kompetente Immunantwort im Rahmen einer DLI erscheint jedoch eine physiologische Zusammensetzung der CD4+ und CD8+ T-Zellen äußerst wichtig. Residuale Stammzellen könnten potentiell co-transduziert werden. Um diese Gefahr abschätzen zu können, wurden ficollisierte PBSC analog der T-Zellen expandiert. Unter allen T-Zellaktivierungsprotokollen blieben die CD34+ Stammzellen in den ersten Tagen der Kultur vital und durchflusszytometrisch nachweisbar. Die Stammzellen expandierten sogar geringfügig und waren damit potentiell transduzierbar - mit der Gefahr einer klonalen Entartung durch Insertionsmutagenese. Dies deutet auf die Wichtigkeit einer T-Zellselektion zur Manipulation von DLI hin, um residuale Stammzellen zu entfernen. Die Suizidstrategie ist eine vielversprechende Möglichkeit zur Kontrolle der GVHD im Rahmen einer DLI. Voraussetzung ist aber, dass die infundierten Zellen auch immunologisch kompetent bleiben und einen GvL-Effekt bewirken. Die Aktivierung mit Beads-gekoppelten Antikörpern scheint zum Erhalt der Immunkompetenz den löslichen Antikörpern überlegen zu sein.
Im Vorfeld des 200jährigen Jubiläums der Expedition von Lewis & Clark (2003-2006) begannen auf der Standing Rock Indian Reservation auf der Grenze der US-Bundesstaaten North Dakota und South Dakota die Planungen für den Aus- bzw. Aufbau einer touristischen Infrastruktur auf der Reservation. Diese sollten bis zum Jahr 2004 weitgehend abgeschlossen sein sollte, um von den erwarteten drei Millionen Jubiläumsreisenden einerseits wirtschaftlich zu profitieren, andererseits diese aber auch inhaltlich und räumlich zu kontrollieren. Die Studie beschäftigt sich mit der Entwicklung bis 2004 und untersucht, welche Faktoren diese positiv und negativ beeinflussten. Dabei wird deutlich, dass die Tätigkeiten auf der Reservation nicht allein von internen, sondern vielmehr auch von externen Faktoren, wie beispielsweise den Tourismusbehörden der Bundesstaaten, der Nachbargemeinde Mobridge, South Dakota, der Tribal Tourism Partnership Initiative des United Tribes Technical College, abhängig waren. Zudem wirft die Studie einen Blick auf die Organisationsstruktur der Reservation, wo das stammeseigene College eine wichtige Rolle in der Wirtschaftsförderung spielt und die Tourismusplanungen in Gang gebracht hat.
The formation and maintenance of a defined three-dimensional structure is a prerequisite for most proteins in order to fulfill their function in the native context. However, there are proteins, which are intrinsically unstructured and thus natively unfolded. In addition, the misfolding and aggregation of many proteins can lead to severe diseases. The investigation of non-native states of proteins significantly contributes to the understanding of protein folding and misfolding. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is the only known technique that can provide information on structure and dynamics of non-native states of proteins at atomic resolution. Unfolded and non-native states of proteins have to be treated as ensembles of rapidly interconverting conformers and their observed properties are ensemble and time averaged. In this thesis, hen egg white lysozyme (HEWL) and mutants thereof have been investigated by NMR spectroscopy. The reduction of its four disulfide bridges and the successive methylation of the cysteine residues renders HEWL permanently non-native (‘HEWL-SMe’). Alternatively, the exchange of the eight cysteines for alanines results in very similar states (‘all-Ala-HEWL’). Under these conditions, HEWL-SMe and all-Ala-HEWL do not resemble random coil conformations, but exhibit residual secondary and tertiary structure. The presence of hydrophobic clusters and long-range interactions around the proteins six tryptophan residues and the modulation of these properties by single-point mutants has been observed. For the NMR spectroscopic investigation, HEWL has been isotopically labelled in E. coli by expression into inclusion bodies. After purification, the 1HN, 15NH, 13Calpha, 13Cbeta, 13C’, 1Halpha and 1Hbeta resonances of HEWL-SMe and all-Ala-HEWL have been assigned almost completely using three-dimensional NMR experiments. The analysis of secondary chemical shifts revealed regions in the proteins sequence — particularly around the six tryptophan residues—with significantly populated alpha-helix like conformations. In order to further elucidate the influence of the tryptophan side chains, a set of two new pulse sequences has been developed that allowed for the successful assignment of the 13Cg, 15Ne and 1HNe resonances in these side chains. This knowledge was eventually exploited in the interpretation of two-dimensional 15N-1H photo-CIDNP spectra, which revealed a differential solvent accessibility of the tryptophan residues in all-Ala-HEWL but not in the single point mutant W62G-all-Ala-HEWL. In addition, heteronuclear R2 relaxation rates have been determined for the indole 15Ne nuclei of all-Ala-HEWL and W62G. While in the wild-type like all-Ala-HEWL, the rates are different among the six tryptophan residues, in W62G they are more uniform. Together with relaxation data from the amide backbone, these results indicate the significant destabilization of the hydrophobic clusters in the absence of W62. In contrast, in the W108G mutant the profile of the R2 relaxation rates was not found to be significantly altered. No evidence was found by R1rho relaxation rates and relaxation dispersion measurements for conformational exchange on slower (micro- to millisecond) timescales. Residual dipolar couplings have been determined for non-native HEWL in order to retrieve structural information of these states. The differences of the W62G and the wild-type like non-native HEWL is also picked up in NH-RDCs of these proteins aligned in polyacrylamide gels. Significant positive RDCs are observed in the regions of the hydrophobic clusters in all-Ala-HEWL, but to a much lesser degree in W62G. So far, all attempts to simulate RDCs from generated non-native ensembles failed even when including long-range contacts or specific phi/psi backbone angle propensities. However, the measured RDCs can be used to cross-validate structural ensembles of non-native HEWL generated by molecular dynamics simulations that are based on restraints from the other experimental data, such as the differential solvent accessibilities from the photo-CIDNP experiments and the data on the hydrophobic clustering gained from the combined mutational and relaxation studies. Finally, non-native HEWL has been investigated for the first time using two-dimensional NMR in organic solvents, which are able to induce secondary structures and ultimately lead to amyloid formation. Under these conditions severe line broadening was observed, which was attributed to exchange between different — mostly a-helical— conformations. In summary, in this thesis methods have been developed, optimized and successfully applied for the structural and dynamical characterization of non-native states of proteins and the effect of single-point mutants on the properties of such ensembles has been investigated. Data has been gained that can considerably contribute to the further elucidation of the nature of non-native states of HEWL by molecular dynamics simulations.
Humane hämatopoetische Stammzellen (HSCs) besitzen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und übernehmen die kontinuierliche Neubildung aller zellulären Bestandteile des Blutes. Aufgrund der zunehmenden klinischen Bedeutung der HSCs ist es essentiell die molekularen Mechanismen, die den Prozess der Vermehrung und Differenzierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen steuern, aufzuklären und deren funktionelle Bedeutung zu verstehen. Das Ziel der Arbeit war die Identifizierung, Charakterisierung und gerichtete Modulation funktionell relevanter Signalwege, die am Differenzierungsprozess von HSCs zu myeloiden Effektorzellen beteiligt sind. Für diese Untersuchung wurde ein Expansionsprotokoll für humane HSCs, sowie ein Differenzierungsprotokoll für das humane myeloide DC Differenzierungsmodell entwickelt. In der Arbeit wurden drei wichtige Signalwege der Zelle, die Mitogenen Signalkaskade (MAPK), Protein Kinase C (PKC) gekoppelten Prozessen und dem JAK/STAT Signalweg untersucht. Die vorliegende Arbeit zeigt, daß die Stimulation der HSCs mit GM-CSF und IL-4 zu einer zeitlich begrenzten Aktivierung von MAPK/ERK1/2, PKC delta, JAK2, sowie STAT5 und STAT6 führte. Kommerzielle Inhibitoren von MEK, PKC und Januskinase hemmten selektiv diese Aktivierung und führten zu einer veränderten Hämatopoese. Die Aktivierung dieser Signalwege ist daher für die myeloide Differenzierung von HSCs zu Dendritischen Zellen von entscheidender Bedeutung. Einer der entscheidenden nuklearen Faktoren für die myeloide Differenzierung ist der Ets-Transkriptionsfaktor PU.1, dessen Aktivität durch Phosphorylierung reguliert sein könnte. Obwohl die funktionelle Rolle von PU.1 in der Differenzierung von HSC in der vorliegenden Arbeit nicht vollständig geklärt werden konnte, wurde jedoch erstmals im in vitro Kinase-Assay gezeigt, daß PU.1 durch PKC delta, aber nicht durch MAPK/ERK2 spezifisch phosphoryliert wird. In einem PU.1-spezifischen Luciferasereporter-Assay wurde die transkriptionelle Aktivität von PU.1 durch die Inhibition von PKC delta und MAPK/ERK1/2 deutlich reduziert. Weiterführende Experimente in einem komplexen Differenzierungsmodell von humanen HSCs wiesen darauf hin, daß durch den gezielten Einsatz von Signalweginhibitoren eine Verschiebung der Verhältnisse der gebildeten Blutzellkolonieformen erreicht werden kann. So war die Differenzierung zu Erythrozyten von der Mitogenen Signalkaskade unabhängig, wohingegen die Differenzierung zu Makrophagen eine deutliche Abhängigkeit von der Aktivität der Mitogenen Signalkaskade sowie von der Aktivierung des Protein Kinase C Signalwegs zeigte. Im Gegensatz dazu führte die Inhibition der Januskinasen (JAKs) zu einer Hemmung der Differenzierung in allen Kolonieformen. Insgesamt zeigten die Ergebnisse, daß der MAPK/ERK und PKC delta Signalweg bei der Differenzierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen eine wichtige Rolle spielen und eine gerichtete Steuerung der Differenzierung durch den Einsatz spezifischer Signalweginhibitoren möglich erscheint.
Leukemia inhibitory factor enhances neurogenin's pro-neural effect during mouse cortical development
(2007)
Die Entwicklung von unterschiedlichen Zelltypen waehrend der embryonalen ZNS-Entwicklung ist abhaengig von zellintrinsischen und positionsabhaengigen, aeusseren Einfluessen. Dabei bilden sich die verschiedenen Zellen in nacheinander ablaufenden bzw. sich teilweise ueberlappenden Zeitraeumen. Zuerst entstehen Radiaglia und Neuronen, nachfolgend Astrozyten und zuletzt Oligodendrozyten. Werden neurale Stammzellen/Vorlaeuferzellen (NPCs – neural precursor cells) zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen und ohne den Einfluss von Wachstumsfaktoren kultiviert, so entwickeln sich diese Zellarten in der gleichen Reihenfolge. Die Neurogenese, die bei Mausembryos am Tag E11-12, nach dem Etablieren der Radialglia, beginnt, findet an E14 ihren Hoehepunkt. Zu diesem Zeitpunt werden die Gene Neurogenin1 (Ngn1) und Ngn2 in den neuralen Vorlaeuferzellen der Ventrikularzone des dorsalen Cortexes in hohem Masse exprimiert. Wie aus Untersuchungen von unserm Labor gezeigt wurde, beguenstigt es die Entstehung von Neuronen und blockiert gleichzeitig Pro-Astrozyten-Einfluesse. Zum einen inhibiert Ngn den JAK/STAT Signalweg, dessen Aktivierung fuer die Gliogenese noetig ist, indem es die Phosphoylierung von STAT1/3 auf bisher noch unbekannte Weise blockiert. Ausserdem bindet der Transkriptions-Coaktivator cAMP-response element binding protein (CBP), welches auch von den STATs fuer die Transkription benoetigt wird, bevorzugt an Ngn sobald dieses von den Vorlaeuferzellen exprimiert wird. Mit dem Tag E16 nimmt die Neurogenese in vivo wieder stark ab und es setzt die Gliogenese ein, bei der zunaechst ueberwiegend Astrozyten gebildet werden. Faktoren wie leukemia inhibitory factor (LIF) sowie ciliary neurotrophic factor (CNTF) beguenstigen dabei die Astrozytogenese indem sie den JAK/STAT Signalweg aktivieren. Die Bindung von LIF/CNTF fuehrt zur Phosphorylierung von STAT-Transkriptionsfaktoren, die ihrerseits dann an den CBP/p300 Komplex binden und schliesslich die Expression von Astrozyten-spezifischen Genen aktivieren. Die STAT-Faktoren koennen aber erst nach Abfall des Ngn-Spiegels an den Transkriptions-Coaktivator binden, da sich die Bindungsstellen dieser beiden ueberlappen. Um die Hypothese zu ueberpruefen, dass LIF auch die Neurogenese, oder spezifischer, die Wirkung von Ngn positiv beeinflusst, wurden cortikale NPCs von murinen Embryos entnommen und der Wirkung von LIF via Luciferase Assay untersucht. Dabei wurden die Vorlaeuferzellen mit Ngn und einem Reporter transfiziert, welcher den NeuroD-Promoter beinhaltete. NeuroD-Expression findet in der Regel gegen Mitte/Ende der Neurogenese statt und ist wichtig fuer die Reifung von Neuronen. Der Promoter von NeuroD beinhaltet ein E-box Element, an welches Ngn bindet und die Transkription einleitet. Wie unsere ersten Versuche zeigten, verstaerkt LIF die Transkriptionsaktivitaet von Ngn und somit die Transkription von NeuroD. Wenn aber im selben Versuch ein NeuroD-Reporter transfiziert wurde, dessen E-box mutiert war, wurde keine Transkriptionsaktivitaet gemessen, was wiederum bestaetigte, dass der pro-neurale LIF-Effekt ueber Ngn lief und E-box-Bindung noetig war. Um den Einfluss des pro-neuralen Effekts von LIF auf Proteinebene zu testen, wurden NPCs mit Ngn-Adenovirus infiziert und mit LIF stimuliert. Dabei wurden die Zellen auf die Expression von Neuron-spezifischem class III β-tubulin (TuJ1) untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass LIF bei Zellen, die Ngn exprimierten, die Rate der Neuronen von etwa 5% auf etwa 50% anstiegen liess, waehrend LIF bezueglich der Gliogenese (gezeigt durch die Expression von GFAP) in Ngn-exprimierenden Vorlaeuferzellen kaum Wirkung zeigte. Als naechstes sollte untersucht werden ueber welchen Signalweg LIF Ngn aktivierte. LIF bindet zunaechst an LIF receptor β (LIFRβ), der dann an glycoprotein 130 (gp130) bindet. Diese Bindung fuehrt dann zur Aktivierung mehrerer Signalkaskaden: dem JAK/STAT, dem MAPK, dem Akt/PI3K und dem PLCγ/PKC Signalweg. Da der JAK/STAT Signalweg fuer die Gliogenese wichtig ist, lag unser Fokus auf den anderen Signalwegen. Deren Aktivierung wurde dann mit spezifischen Inhibitoren blockiert und, wie auch in den Vorversuchen, die Wirkung von LIF auf Transkriptionsebene (NeuroD) in neuralen Vorlaeuferzellen bestimmt. Dabei zeigte sich, dass die Blockierung des PLCγ/PKC Signalweges die NeuroD-Promoteraktivitaet am starksten inhibierte, waehrend auch LIF´s pro-neurale Wirkung verloren ging. Dementsprechend zeigte die Western Blot Analyse, dass die Expression von class III β-tubulin (TuJ1) durch die Anwendung der PKC Inhibitoren am staerksten inhibiert wurde, wobei auch hier die Stimulation durch LIF keine erhoehte Neurogenese mit sich zog. In weiteren Versuchen konnten wir dann mit Hilfe von Immunoprezipitation demonstrieren, dass LIF die Bindung von Ngn an CBP verstaerkte (eine Bindung, welche durch PKC Inhibitoren aufgehoben wurde), was wiederum zu einer erhoehten Bindung dieses Transkriptionskomplexes an den NeuroD Promoter fuehrte, wie unsere Chromatin Immunoprezipitation (ChIP) Daten beweisen. Dies wiederum laesst darauf schliessen, dass womoeglich diese erhoehte Ngn-CBP/NeuroD-Promoter Bindung der Grund fuer die erhoehte NeuroD-Transkriptionsaktivitaet ist daher auch fuer die erhoehte neuronale Differenzierung. Interessanterweise konnten wir auch zeigen, dass Brahma-related gene 1 (Brg1), eine katalytische Untereinheit des SWI/SWF Komplexes, an den Ngn/CBP cotranscriptionalen Komplex bindet und dass diese Bindung durch LIF-Stimulation verstaerkt wurde. Dies suggeriert wiederum, dass auch Brg1 eine wichtige Rolle waehrend der murinen, cortikalen Neurogenese spielt. Dennoch, in folgenden Experimenten verblieb der Fokus auf Ngn und CBP. Um unsere Hypothese zu bestaetigen, dass PKCδ ein moeglicher Mediator des LIF-Effekts sein koennte, zeigten wir zunaechst, dass die PKCδ-Expression in cortikalen NPCs waehrend der Neurogenese erhoeht ist. Desweiteren demonstrierten wir, dass die Inhibition von PKCδ einen aehnliche Wirkung zeigte wie die Inhibition von PKC mit einem generellen PKC Inhibitor: weder war nach PKCδ-Inhibition eine LIF-induzierte NeuroD-Transkription erzielbar, noch wurde nach LIF-Stimulation der pro-neurale Marker class III β-tubulin/TuJ1 in Ngn1-infizierten NPCs exprimiert. Um aber mehr spezifisch die PKC- und PKCδ-Aktivitaet/Expression zu blockieren transfizierten wir NPCs mit PLCγ oder PKCδ siRNA. Unsere Daten zeigten hierbei, dass siRNA-transfizierte Zellen kein class III β-tubulin mehr aufweisen, was darauf hindeuted, dass PKCδ der potentielle Mediator des pro-neuralen LIF-Effekts ist. Durch unsere in vivo Daten demonstrierten wir schliesslich, dass LIF auch hierbei fuer die Neurogenese von Bedeutung ist. Verglichen wurden die Cortices von E13 LIF Het (heterozygote) und KO (knock out) Maeusen mit denen von WT (wild type) Maeusen. Durch Immunohistologie von Hirnschnitten konnten dabei keine groesseren Unterschiede bezueglich der Expression neuraler Marker beobachtet werden, waehrend aber mit Hilfe der Western Blot Analyse, eine quantitativere Methode, gezeigt wurde, dass LIF Het und KO Maeuse weniger pro-neurale Marker im Cortex exprimieren wie WT Mause. Um auch zu beweisen, dass dies auf eine verringerte Transkription von NeuroD zurueckzufuehren ist, demonstrierten wir mit Hilfe des ChIP Assay, dass LIF Het und KO Maeuse weniger Ngn1-CBP Bindung an den NeuroD-Promoter aufweisen wie WT Maeuse. Diese Experimente veranschaulichen einen eleganten Regulationsmechanismus, durch welchen ein einzelner, extrazellulaerer Faktor die unterschiedliche Differenzierung einer Zelle verstaerkt, abhaengig von der Anwesenheit oder Abwesenheit eines einzelnenn intrazellulaeren Faktors. Auch koennen durch die erlangten Resultate Strategien entworfen werden, durch die in Zukunft die Produktion bestimmter Neurone zur Heilung von verschiedenen, neurodegenerativen Krankheiten erhoeht wird.
Die Ergebnisse zur Sedimentologie, Taphonomie und Paläoökologie der Dinotheriensande des Urrheins in Rheinhessen geben weiteren Aufschluß über die tektonosedimentäre und paläoökologische Entwicklung des Urrheins. Die als Dinotheriensande bekannten Ablagerungen des Urrheins, deren Bildung nach biostratigraphischen Kleinsäugerfunden ins Obermiozän (Vallesium, MN 9, ca. 10,5 - 11 Ma.) gestellt werden, zeichnen sich durch fossile Wirbeltierfragmente teils großer Säugetiere sowie grober Gerölle überwiegend an der Basis, in einigen Bereichen auch aus Grobsand sowie größtenteils aus Fein- bis Mittelsand bestehenden fluviatilen Sedimenten aus. Der im heutigen Raum von Eppelsheim unter einer Ca. 3 m mächtigen Lössschicht liegende ehemalige Flusslauf des Urrheins floß von Worms und Westhofen aus dem Süden kommend entlang einer tektonisch bedingten Schwächezone in Eppelsheim nach Norden über Bermersheim Richtung Wißberg und Sprendlingen weiter nach Bingen. Dabei räumte die anfänglich sehr starke Strömung die durch tektonische Bewegung und eventuelle Verkarstung geschwächten Kalke der Inflata-Schichten (Aquitanium, Unter Miozän) und den Oberen Cerithienschichten (Chattium, oberstes Ober Oligozän bis Aquitanium, Unter Miozän) zu einem Flussbett aus. Die dabei durch die starke Strömung mitgeführten gut gerundeten, max. 170 mm großen Gerölle und Wirbeltierfragmente wurden an der Basis der Dinotheriensande über den abdichtenden Tonen der oligozänen Süßwasserschichten, in Verbindung mit glimmerfreien Grobsanden, abgelagert. Neben den Grobsanden (0,63 - 2 mm) an der Basis zwischen den großen Geröllen bestehen die Dinotheriensande überwiegend aus Feinsand (0,06 - 0,2 mm) und Mittelsand (0,2 - 0,63 mm), teils in gradierter Schichtung. In einigen Bereichen kommen immer wieder auch Grobsande und kleine bis mittelgroße Gerölle bis zum Top vor. Dabei erreichen die aus mehreren Schichtkörpern bestehenden Ablagerungen der Dinotheriensande bei Eppelsheim eine Gesamtmächtigkeit von 6,96 m. Die einzelnen Schichtkörper dieser Ablagerungen zeigen überwiegend Schrägschichtung, wobei die einzelnen Schichtungsblätter tangentiale Schrägschichtung erkennen lassen. Die Auswertung der Vorschüttungsrichtung aus Schrägschichtungsmessungen ergeben für die Hauptrichtung der Paläoströmung über der Basis eine Strömung aus SSE kommend, wobei die Strömung im weiteren Verlauf der Ablagerungen im Grabungsbereich von Eppelsheim von SE bis hin zum Top der Dinotheriensande von SSW kommend wechselt. Dabei lassen sich in den Ablagerungen der Dinotheriensande mit einer Gesamtmächtigkeit von 6,96 m schwerpunktmäßig von der Basis bis zum Top drei Fossilhorizonte erkennen. Hierbei variiert die Höhe des 2. Fossilhorizontes, von der Basis des 1. Fossilhorizontes in den Dinotherie~sandenü ber dem Ton der Süßwasserschichten gemessen, bei Ca. 140 - 150 Cm, sowie die Höhe des 3. Fossilhorizontes bei Ca. 400 - 410 cm. Neben der Anreicherung von fossilen Wirbeltierresten und den großen Geröllen an der Basis befinden sich in den Dinotheriensanden auch bis zu 50 mm große Gerölle, die überwiegend in dem 2. und 3. Fossilhorizont abgelagert wurden. Die Analyse von 10000 unterschiedlichen Geröllen ergab eine Zusammensetzung von gut gerundeten Quarzarten, Quarzite, Sandsteine, Kieselschiefer, Hornsteine, unterschiedliche Variationen von Chalzedon sowie Karneol, Rhyolith und Granit von der Basis bis zum Top der Dinotheriensande. Zwischen den Sanden eingeschaltete große Tonlinsen machen den Eindruck ehemaliger abgebrochener Uferbruchstücke, zumal sie teilweise mit großen Geröllen sedimentiert wurden. Die eigentlichen Sande bestehen aus überwiegend gut bis kantengerundetem Quarzsand, mit einem Glimmer-Anteil von Muskovit, etwas Biotit und im geringem Maße Phlogopit. Das Schwermineralspektrum setzt sich aus Granat, Apatit, Amphibol, Staurolith, Turmalin, Zirkon, Alterit, Hypersthen, Spinell, Siderit, Rutil, Topas, Gips und Augit sowie einem hohen Gehalt an opaken Mineralen zusammen. Die fossilen Wirbeltierfragmente, von Proboscidae, Rhinocerotidae, Equidae, Suidae, Cervidae, Bovidae, Tragulidae, Anthracotheriidae, Tapiroidae, Castoridae, unterschiedliche Arten von Carnivora sowie von Primaten und Insectivora stammend, bestehen zum größten Teil aus deren Zahnen und Zahnfragmenten. Weitere craniale und postcraniale Fragmente kommen gegenüber den Zähnen in geringerem Umfang vor. Fast alle Fragmente sind leicht bis stark abgerollt (Abrollungsgrad). Der größte Teil der Knochenfragmente zeigt ein einheitliches Bruchmuster, welches sich durch eine sägezahnförmige Fraktur mit scharfen Bruchkanten kennzeichnet. Einige Spuren in Form von Oberflächenmarken an den fossilen Knochen und Zähnen zeigen neben Bißspuren von Carnivora auch postmortale Spuren von Insekten und Nagern. Trockenrisse deuten auf eine mehr oder weniger längere Liegezeit der Kadaver bzw. der Skelette, Teilskelette oder vereinzelter Knochen an der Erdoberfläche vor der eigentlichen Sedimentation in den Dinotheriensanden hin. Auffallend finden sich die fossilen Wirbeltierreste in den Dinotheriensanden fast immer in unartikulierter und vereinzelter Fundlage, ausgenommen im Strömungsschatten größerer Objekte, wie zum Beispiel der große Kalkklotz im Grabungsbereich von Eppelsheim. Dabei handelt es sich um eine durchmischte Ansammlung von unartikulierten Wirbeltier-Fragmenten (Voorhies-Gruppen). Seit Beginn des 19. Jahrhunderts kamen die durch Zufall ausgegrabenen fossilen Wirbeltierreste aus den sogenannten Sandkauten Rheinhessens durch Ankauf ins Hessische Landesmuseum von Darmstadt (HLMD) und, neben anderen Instituten im In- und Ausland sowie einigen Privatsammlungen, ins Naturhistorische Museum von Mainz (NHMM). Die seit 1996 jährlich laufenden wissenschaftlichen Grabungen des Forschungsinstituts Senkenberg / Frankfurt a. Main (FIS) und im Anschluss des NHMM in Eppelsheim lieferten zu diesen historischen Sammlungen weitere Funde. Derzeit sind im HLMD 3217, im NHMM 5432 und im FIS 2278 fossile Funde aus den Dinotheriensanden von Rheinhessen inventarisiert (Stand: Frühjahr 2006). Die bei der Auswertung gewonnenen Daten der bestimmbaren, teilbestimmbaren und unbestimmbaren Funde aller drei Museen (HLMD, NHMM U. FIS) lieferten neben den schon erwahnten Daten über Abrollungsgrad, Bruchmuster, Oberflächenmarken und Voorhies- Gruppen, auch die über die orientierten Zähne ermittelbaren Werte der Mindestanzahl von Individuen aus den bekannten Fundorten in Rheinhessen. Über den Abkauungsgrad der Zähne, in Verbindung mit ihrer natürlichen Position, ließ sich das Altersspektrum dieser Individuen erstellen. Daneben wurde die Fossilienfarbe erfasst, mit deren Hilfe man die Funde in den historischen Sammlungen zur nachträglich Bestimmung des Fundhorizontes benutzen kann, da durch postsedimentäre Ausfällungen die Dinotheriensande, inklusive der darin befindlichen Fossilien, von der Basis bis zum Top unterschiedlich gefärbt sind. Schließlich wurde über die durchschnittlichen Gewichtsdaten der rezenten Vertreter der hier zu behandelten Tierarten eine Verteilungsübersicht in den drei bekannten Museen (HLMD, NHMM u. FIS) erstellt.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein tierexperimentelles Wundheilungsmodell etabliert, welches nach Kultivierung und Transplantation autologer Keratinozyten auf einer biologische Trägermembran aus Hyaluronsäure ein Vergleich mit verschiedenen Wundauflagen im Rahmen einer standardisierten Wundbehandlung erlaubte. Acht narkotisierten Schweinen wurden paravertebral 6 Polytetraflouroethylen-Kammern implantiert und die entstandenen Vollhautwunden mit verschiedenen Wundauflagen konditioniert. Parallel dazu erfolgte die Gewinnung und Kultivierung autologer Keratinozyten auf dem Zellkulturträger Laserskin – einer Hyaluronsäureestermembran. Die Transplantation der Zellen erfolgte 1 Woche nach Wundsetzung und anschließend wurden die Wunden mit den verwendeten Wundauflagen Jelonet, Schaumstoff und Hyalofill-F, einem Hyaluronsäureesterfleece, zweitägig über einen Zeitraum von 3 Wochen behandelt. Zu fest definierten Zeitpunkten erfolgten die vergleichenden photooptischen Dokumentationen und histologischen Untersuchungen (Hämatoxilin-Eosin-Färbung, Bindegewebsfärbung nach Goldner, Elastika-Anfärbung nach Weigert) der Wunden. Zur Bestimmung der biomechanischen Narbenqualität wurde das exzidierte Narbengewebe am Versuchsende 21 Tage nach Transplantation mechanischen Zugversuchen im Laserextensiometer zugeführt und die Zugfestigkeit und Dehnung bei Maximalspannung des Gewebes bestimmt. Sowohl die mikro- und makroskopischen als auch die biomechanischen Eigenschaften der untersuchten Wunden zeigten unabhängig von dem untersuchten Tier, der untersuchten Wunde bzw. der Wundbehandlung und unabhängig vom Zeitpunkt das einheitliche Bild eines neu entstandenen Narbengewebes ohne Anzeichen einer Epithelneubildung und ohne signifikante Unterschiede hinsichtlich der Zugfestigkeit und des Dehnungsverhaltens. Verschiedene Ursachen mögen für die ausbleibende Reepithelialisierung verantwortlich sein. Es konnte jedoch mit Hilfe der hier vorgestellten Wundheilungsstudie mit verschiedenen Wundauflagen an einem Hausschweinemodell eine systematische, reproduzierbare und standardisierte Methode entwickelt werden, um Narbengewebe hinreichend zu beschreiben. Weitere Anstrengungen werden noch notwendig sein, um die Lücke zwischen tierexperimentellen Studien und bereits klinisch erfolgreich angewandten Transplantation autologer Keratinozyten beim Menschen zu schließen.
The retinoic acid related orphan receptor alpha (RORalpha) regulates the expression of various target genes by binding to specific response elements in their promoter region. RORalpha is an interesting pharmaceutical target since it positively affects several pathophysiological processes of clinical relevance. RORalpha enhances the expression of Apo-AI protein, the major constituent of HDL, which is responsible for the cholesterol transportation. RORalpha notably contributes to the bone mineralization and generation of the extracellular bone matrix, demonstrating its involvement in osteoporosis, and by up-regulating the gene for IKBalpha, RORalpha has anti-inflammatory effects. Moreover, RORalpha is necessary for cerebellar development and the maintenance of the mammalian day-night periodicity governed by the core-clock within the suprachiasmatic nuclei. RORalpha receptors have been reported to bind cholesterol, melatonin, or to function ligand-independent. By monomeric binding to the recognition motif AGGTCA preceded by an A/T-rich sequence (ROR response element, RORE), RORalpha constitutively activates gene transcription. However, RORalpha activity is passively suppressed by its opponents RevErbalpha and RevErbbeta, which both bind to the same target sequence. ...
Für die NO-Produktion aus L-Arginin sind drei Isoformen der NO-Synthase verantwortlich: Die Calcium unabhängige induzierbare NO-Synthase (iNOS) sowie die Calcium abhängige endotheliale konstitutive (eNOS) und die neuronale (nNOS) NO-Synthase. Die Stickstoffmonoxid (NO)-Produktion von Endothelzellen ist wegen der verschiedenen Effekte von NO von Interesse. So erhöht NO den Blutfluss, spielt eine Rolle bei der Induktion der Angiogenese, führt jedoch auch zum Zelltod von Tumorzellen und reduziert die Tumorzelladhäsion. NO schützt einerseits vor der von TNF-α induzierten Apoptose, andererseits kann die cytokin-aktivierte NO-Produktion adhärente Tumorzellen töten [34, 72, 37, 36, 49].In einer Studie von Loibl et al. wurde zuvor iNOS-Aktivität in Tumorzellen bei in situ und invasiven primären Mammakarzinomen nachgewiesen. Ihre Rolle als Prognosefaktor ist jedoch bisher noch unzureichend geklärt [42]. Ziel der Arbeit war es, einen Zusammenhang zwischen dem Verlauf primärer Mammakarzinomerkrankungen und der iNOS-Expression nachzuweisen. Es war zu klären, ob iNOS mit klassischen Prognosefaktoren beim Mammakarzinom korreliert oder ob die iNOS-Expression selbst einen unabhängigen Prognosefaktor für diese Patientinnen darstellt. Unsere Studie zeigt bei dem bisher größten Kollektiv an 161 Patientinnen mit primärem Mammakarzinom einen signifikanten Zusammenhang sowohl zwischen der Expression von iNOS und der Tumorgröße (P=0,018) als auch zwischen iNOS und dem histologischen Differenzierungsgrad (P=0,039). Die iNOS-Expression korreliert ebenfalls signifikant mit einer schlechteren Gesamtüberlebenswahrscheinlichkeit (P=0,049), wobei die Expression von iNOS kein unabhängiger Prognosefaktor für das Gesamtüberleben ist (P=0,077; Hazard Ratio 2,25 [95% Confidence Intervall: 0,89-5,65]).
Für die vorliegende Arbeit wurden in einem Beobachtungszeitraum von 1994 bis 2003 insgesamt 51 Patienten untersucht, bei denen eine arthroskopische subacromiale Dekompression durchgeführt wurde. Es handelte sich hier um 30 Männer sowie 21 Frauen. Das Durchschnittsalter der Patienten betrug 52,8 Jahre. Das Durchschnittsalter bei Nachuntersuchung des Patientenkollektives lag bei 54,7 Jahren. Das „Follow up“ betrug durchschnittlich 48 Monate, in 50 % der Fälle wurde die führende Hand operiert, in 40,74 % der Fälle wurde die nicht führende Hand operiert. Aufgenommen in die Studie wurden lediglich Patienten mit einem Impingementsyndrom Grad I oder Grad II, alle Patienten wurden mit einer SAD-Technik operiert. Es erfolgte ein Debridement und eine Teilsynovektomie, ein selektives Weichteildebridement (arthrosko-pisches Kapselrelease) mit einer teilweisen Durchtrennung des Ligamentum coracoacromiale sowie einer Bursektomie subacromialis und einer zum Teil durchgeführten modifizierten Acromioplastik nach Neer. Die Untersuchung wurde retrospektiv durchgeführt und im Jahre 2003 abgeschlossen. Es wurden die subjektive Patientenzufriedenheit, das Bewegungsausmaß im prä- und postoperativen Vergleich im Rahmen des Constant-Murley-Scores erfasst, die Berufstätigkeit, die Händigkeit des Patienten im Vergleich zur operierten Seite, die postoperative Komplikationsrate im Vergleich zu den Ergebnissen des Constant-Murley-Scores sowie im Vergleich zu den prä- und postoperativ erfassten Röntgenbefunden im Standard-Röntgenverfahren des betroffenen Schultergelenkes. Die Mehrzahl der Fälle 61,29 % zeigten postoperativ ein sehr gutes Bewertungsergebnis. Nur bei 12,9 % der Patienten fand sich eine postoperativ schlechte Bewertung bzw. ein postoperativ schlechtes Ergebnis. Als wesentlicher Baustein der Untersuchung wurde hier der Constant-Murley-Score zugrunde gelegt. Es fand sich, wie in anderen Studien auch, dass je höher der präoperativ erfasste Constant-Murley-Score gelegen war, desto besser das postoperative Ergebnis erschien. Das hier untersuchte Patientenkollektiv hat gezeigt, dass die Schulterarthroskopie bei Patienten mit einem Impingementsyndrom Grad I oder II sehr gute bis gute Operationsergebnisse erzielen kann. Es konnte hier gezeigt werden, dass der Constant-Murley-Score einen hervorragenden Parameter darstellt zur Erfassung der prä- und postoperativen objektiven und subjektiven Ergebnisse. Die weiter im Rahmen dieser Studie erhobenen Parameter zeigten, dass auch andere Faktoren bei der Zufriedenheit des Patienten eine Rolle spielten, hier muß insbesondere die Geschlechterverteilung als Parameter erwähnen, sowie den radiologischen Befund. Besonders hervorzuheben ist, dass nach einer postoperativen Erholungszeit von 3 bis 6 Monaten das erhobene Ergebnis nicht mehr verändert wird, so dass 6 Monate postoperativ der Zeitpunkt für die Entscheidung zu einer Revisionsoperation zu setzen ist. Abschließend wird in dieser Studie bestätigt, dass die arthroskopische subacromiale Dekompression eine hervorragende operative Technik ist, bei der der Großteil der Patienten mit einem sehr guten bis guten Ergebnis auch über einen langen Zeitraum nach zu untersuchen ist. Ein kritischer Punkt bei der präoperativen Planung ist die sorgfältige Indikationsstellung , um postoperativ schlechte Ergebnisse primär vermeiden zu können, eine Entscheidung zur Revision, sei es eine offene Acromioplastik bzw. SAD-Technik , sollte nach 6 Monaten postoperativ gestellt werden.
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind von großer Bedeutung für die Regulation des vaskulären Tonus und die intrazelluläre Signaltransduktion. Die ROS-produzierenden Enzyme der Gefäßwand sind bisher nur unzureichend charakterisiert. Wir untersuchten, ob eine ähnliche NADPH Oxidase wie in Leukozyten, mit den Untereinheiten p22phox und gp91phox auch in den Endothel- und glatten Muskelzellen der Gefäßwand existiert. Phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) aktiviert die leukozytäre NADPH Oxidase und steigert in endothelintakten Aortenringen die ROS-Produktion. PMA steigert auch die Radikalproduktion in Endothelzellen (EC); jedoch nicht in glatten Muskelzellen (SMC) und denudierten Aortenringen. ECs und SMCs exprimieren p22phox, während gp91phox nur in ECs nachgewiesen werden konnte. Mox1, ein Homolog von gp91phox konnte im Gegensatz dazu nur in SMCs und nicht in ECs gefunden werden. Die funktionelle Relevanz von gp91phox wurde mittels vergleichender Experimente mit Aorten-Segmenten von Wildtyp-, gp91phox-/--und eNOS-/--Mäusen analysiert. Die PMA-induzierte ROS-Produktion der Aortenring von Wildtyp und eNOS-/--Mäusen war ähnlich stark, während sie in den Aortenringen von gp91phox-/--Mäusen ausblieb. Der Radikalfänger Tiron verstärkte die endothelabhängige Relaxation in Aortensegmenten von Wildtyp-, jedoch nicht von gp91phox-/--Mäusen. Unsere Daten zeigen, dass ECs, ähnlich wie Leukozyten, eine gp91phox enthaltende NADPH Oxidase exprimieren. Dieses Enzym ist eine Hauptquelle arterieller ROS und beeinflusst die Bioverfügbarkeit von endothelialem NO.
(1) Die genomweite Expressionsanalyse von salzadaptierten Zellen von M. mazei Gö1 identifizierte eine Reihe von salzregulierten Genen. Neben den beiden Operone ota und abl, die für die Akkumulierung von Glycin-Betain und Ne-Azetyl-b-Lysin verantwortlich sind, konnte ein ABC-Transporter (MM0953), der in seiner Genumgebung weitere Transporter sowie Proteine mit konservierten S-Layer-Domänen aufweist, als salzreguliert erkannt werden. Dies deutet auf ein S-Layer-Exportsystem hin, das eine Rolle in salzadaptierten Zellen spielen könnte. (2) Eine genomweite Expressionsanalyse von Zellen von M. mazei Gö1 zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach einem hyperosmotischen Schock auf 400 mM NaCl ermöglichte Einblicke in den Verlauf der Genexpression. Die Erhöhung der externen Osmolarität resultierte in der erhöhten Expression von Genen, die für die Aufnahme und Biosynthese von kompatiblen Soluten verantwortlich sind sowie von Genen deren Produkte regulatorische Funktion haben könnten. (3) Genomweite Expressionsanalysen von Zellen von M. mazei Gö1 nach einem hypoosmotischen Schock zeigten erhöhte Expression von Genen, die an der Regulation und an der generellen Stressantwort beteiligt sind. Gene, deren Produkte im Stoffwechsel wichtig sind – besonders Gene, die für Methylamin-Corrinoid-Methyltransferasen kodieren – erscheinen stark reprimiert. (4) Die Bestimmung der intrazellulären Ionenkonzentrationen zeigte ein unspezifisches Einströmen von den Ionen, die den osmotischen Schock auslösen sofort nach dem Schock, sowie den Ausstrom derselben Ionen im Verlauf von 5 Minuten. Die Ionenkonzentrationen der Ionen, die den Schock auslösten, blieben intrazellulär erhöht. Das Ein- und Ausströmen der Ionen nach einem hyperosmotischen Stress ist nicht energieabhängig. (5) M. mazei akkumulierte nach einem hyperosmotischen Schock kein K+, zeigte aber eine erhöhte intrazelluläre Konzentration dieses Ions, wenn die Zellen in Medium mit erhöhter Osmolarität angezogen wurden. (6) Durch hyperosmotische Schocks mit verschiedenen Salzen und Zuckern konnte gezeigt werden, dass die kurzzeitige Akkumulation von Ionen keine gerichtete Antwort auf den osmotischen Stress ist. (7) Es konnte weiters gezeigt werden, dass Zellen von M. mazei Gö1, die mit dem kompatiblen Solut Betain inkubiert wurden, nach einem hyperosmotischen Schock K+ akkumulieren. Dies bedeutet möglicherweise eine K+-abhängige Regulation des Glycin-Betain-Transporters. (8) Die Funktion der drei im Genom kodierten Na+/H+-Antiporter konnte auf transkriptioneller Ebene nicht geklärt werden. Trotzdem zeigt ein Hydrophobizitätsplot des Proteins eine mögliche Beteiligung von Nha1 (MM0294) an der Osmoregulation durch eine hydrophile C-terminale Domäne. (9) Nach einem hyperosmotischen Schock von 38,5 auf 400 mM NaCl erhöhte sich die intrazelluläre Konzentration an Glutamat, das in M. mazei als kompatibles Solut fungiert, bereits nach drei Stunden. Zellen, die bereits an die erhöhte Salzkonzentration adaptiert waren, enthielten 1,4 μmol Glutamat/mg Protein. (10) Die Glutamin-Synthetase zeigte eine erhöhte Transkription nach einem hyperosmotischen Schock. Das Protein wird aber nicht salzabhängig produziert und zeigt keine Enzymaktivität. Die Biosynthese des Solutes über eine Glutamat-Dehydrogenase ist die wahrscheinliche Alternative. (11) Aufgrund der generierten Expressionsprofile und der physiologischen Daten konnte ein Modell der Osmoadaptation in Methanosarcina mazei Gö1 erstellt werden.
1. Die Deletionsderivate der Kompetenzproteine PilN und PilQ wurden als Fusionsproteine mit dem Maltosebindeprotein überproduziert, über eine Amylosesäule aufgereinigt und in nativer Form für die Generierung von polyklonalen Kaninchen-Antikörpern eingesetzt. 2. Unter Einsatz der spezifischen alpha-PilN- und alpha-PilQ-Antikörpern konnte das PilN-und PilQ-Kompetenzprotein im Rohextrakt von T. thermophilus HB27 detektiert werden. 3. Die Überprüfung bereits vorliegender Antikörper gegen die Kompetenzproteine PilM, PilW und PilA4 ergaben, dass es sich hier ebenfalls um spezifische Antikörper handelt. 4. Mittels Western-Blot-Analysen unterschiedlicher Mutanten konnte gezeigt werden, dass die Markerinsertion in den Genen pilM, pilN, pilO und pilW zu keinem polaren Effekt der jeweils stromabwärts gelegenen Gene führt. 5. Analysen der subzellulären Lokalisation der Kompetenzproteine ergaben, dass PilM und PilN ausschließlich in der inneren Membran lokalisiert sind, während PilW, PilQ und PilA4 sowohl in der inneren als auch äußeren Membran detektiert wurden. Die größte Menge an PilQ wurde allerdings in der äußeren Membran gefunden. 6. Mutantenstudien ergaben, dass eine pilQ-Mutantion zur Abwesenheit von PilW und PilA4 in der äußeren Membran führte. Ebenso führte eine pilW-Mutantion zu Abwesenheit von PilQ und PilA4 in der äußeren Membran. Diese Ergebnisse indizieren Interaktionen zwischen PilW, PilQ und PilA4. 7. In der pilD-Mutante wurde kein PilA4 mehr in der äußeren Membran detektiert. Dieser Befund untermauert den Schluss, dass es sich bei PilD um eine PilA4 prozessierende Präpilin-Peptidase handelt. 8. Western-Blot-Analysen der gereinigten Pili führen zu dem Schluss, dass das Kompetenzprotein PilA4 die strukturelle Untereinheit der Pilus-Struktur repräsentiert. Das Sekretin-ähnliche Kompetenzprotein PilQ wurde ebenfalls in der gereinigten Pilus-Fraktion detektiert und könnte Teil der globulären Struktur an den Pilusenden sein. 9. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Dünnschnitten durch T. thermophilus HB27 Zellen ließen den ungewöhnlichen Aufbau der Zellperipherie erkennen. Zwischen der inneren Membran (8 nm dick) und der äußeren Membran (8 nm dick) befand sich neben dem dünnen Peptidoglykan (8 nm dick) eine 40 nm dicke kontrastarme Schicht, die radial von Fäden durchzogen schien. 10. Die Dünnschnitte wurden für Immunogoldmarkierungen mit alpha-PilQ-Antikörpern eingesetzt, um PilQ zu detektieren. Allerdings konnte in den elektronenmikroskopischen Analysen keine spezifische Goldmarkierung nachgewiesen werden. Ursache hierfür könnte die Unzugänglichkeit des nativen PilQ in den Dünnschnitten sein. 11. Die Immunogoldmarkierung des Gefrierbruchs von ganzen Thermus-Zellen mit alpha-PilQ-Antikörpern führte zur Detektion von PilQ-haltigen Ring-ähnlichen Strukturen in der äußeren Membran. Der Durchmesser des PilQ-Komplexes mit 17 - 18 nm ist mit denen der aus Sekretinen bestehenden Ringsystemen anderer Organismen vergleichbar. 12. In den T. thermophilus HB27 Membransolubilisaten wurde ein >669 kDa PilW-PilQ-Komplex identifiziert. Dieser Komplex ließ sich optimal mit n-Dodecyl-beta-D-maltosid (1 mg Detergenz pro mg Membranprotein) aus der Membranfraktion solubilisieren. Stabilitätsuntersuchungen ergaben, dass dieser Komplex bei 4 °C einige Tage, bei Raumtemperatur und bei Anwesenheit von 1 M NaCl einige Stunden stabil ist. 13. Mittels einer DEAE-Austausch-Chromatographie konnte der PilW-PilQ-Komplex angereichert werden. Die Western-Blot-Analysen ergaben, dass das Kompetenzprotein PilM mit dem PilW-PilQ-Komplex koeluiert. 14. In der MALDI-TOF-Massenspektrometrie konnte das Kompetenzprotein PilQ und Untereinheiten der DNA-gerichteten RNA-Polymerase, ein Membran-Lipoprotein sowie Energie-Stoffwechsel-Proteine in der angereicherten PilW-PilQ-haltigen Fraktion nachgewiesen werden. Diese Proteine müssen auf die Beteiligung an der Transformation untersucht werden. 15. Immunelektronenmikroskopische Analysen des angereicherten PilW-PilQ-Komplexes führten zur Identifizierung von Ringstrukturen mit einem Durchmesser von 17 nm. Dieser Durchmesser entspricht den Sekretin-Komplexen von P. aeruginosa (18,3 ± 1,2 nm) bzw. N. gonorrhoeae (15,5 - 16,5 nm) und dem Durchmesser der über Immunogoldmarkierung detektierten PilQ-haltigen Strukturen in T. thermophilus HB27.
Seit der Einführung der antiretroviralen Therapie (HAART) ist die Mortalität von HIV-Infizierten in der westlichen Welt zwar deutlich zurückgegangen, die HIV-Infektion ist jedoch bis heute nicht heilbar. Die derzeitige Therapie unterdrückt zwar sehr effektiv die Virusreplikation, kann aber nicht das Virus vollständig eliminieren und somit die Infizierten nicht heilen. Die daher notwendige Langzeitbehandlung wird wiederum durch die relativ hohe Toxizität der Medikamente und durch das Auftreten resistenter Virusvarianten limitiert. Die Suche nach neuen Therapienansätzen und Wirkstoffklassen ist daher immer noch von größter Wichtigkeit. Die HIV-Gentherapie stellt neben der konventionellen antiretroviralen Therapie eine mögliche zusätzliche Behandlungsform dar. Die Arbeitsgruppe von Laer hat am Georg-Speyer-Haus retrovirale Vektoren entwickelt, die membrangebundene (ma) HIV-Eintrittsinhibitoren, sog. C Pepitde, kodieren. Das durch den Prototyp-Vektor M87 kodierte maC36-Peptid zeigte eine moderate Inhibition des Viruseintritts. In einem Optimierungsprozess wurde der Vektor M87o generiert. M87o kodiert im Vergleich zu M87 ein wirksameres maC-Peptid (maC46) und weist auch eine wesentlich höhere Expressionsstärke und dadurch eine stärkere inhibitorische Wirkung als der Prototypvektor auf. Ziel dieser Arbeit war es zunächst, HIV Varianten, die resistent gegenüber dem M87o–Genprodukt maC46 sind, in vitro zu generieren und anschließend den Resistenzmechanismus aufzuklären. In einer Kollaboration mit der Gruppe um M. Dittmar aus Heidelberg war durch Passage des HIV 1 Wildtyp (wt) Ba L-Isolats auf M87-transduzierten Zellen bereits das maC36-resistente Virusisolat Ba L_sel_MD generiert worden. Ba L_sel_MD wies zwei Resistenzmutationen in der gp41-Untereinheit des Hüllproteins auf: I556V (heptad repeat 1 Region) und N634K (heptad repeat 2 Region). Für die Mutation 634K war dabei gezeigt worden, dass sie auch zu einer leichten Reduktion der maC46-Sensibilität führt. In der vorliegenden Arbeit diente Ba L_sel_MD als Ausgang für die Selektion einer Virusvariante mit deutlich verminderter Sensibilität gegenüber maC46. Hierfür wurde Ba L_sel_MD über 149 Tage lang auf Zellen mit steigender maC46 Expressionshöhe passagiert und so das Isolat Ba L_FH1 generiert. Das Hüllprotein des selektierten Isolats war ausreichend, um einen maC46-resesistenten Phänotyp hervorzurufen. Das selektierte Hüllprotein war im Vergleich zu dem Ausgangsisolat ca. fünf- bis zehnfach weniger empfindlich gegenüber maC46. Die Sequenzierung des Ba L_FH1 Hüllproteingens zeigte, dass die Aminosäureausprägung an Position 634 des Ausgangsisolats (BaLsel_MD) konserviert worden war, während die Position 556 zur Wildtypsequenz revertiert war. Darüber hinaus wurden drei Mutationen in der gp120-Untereinheit des Hüllproteins (V2-Region (I187T), V3-Region (N305Y), C3-Region (E352K)), sowie eine Mutation in der heptad repeat 1 Region (A579T) der gp41-Untereinheit identifiziert. Für die reduzierte maC46-Empfindlichkeit waren in erster Linie die Mutation N305Y in der V3 Region und die Rückmutation 556I in Zusammenwirkung mit der bereits vorhandenen Mutation 634K verantwortlich. Die verbleibenden Mutationen hatten allenfalls modulierende Wirkung auf die maC46-Sensibilität. Die Resistenz ist vermutlich auf die beobachtete erhöhte Fusionsgeschwindigkeit des Hüllproteins von Ba L_FH1 im Vergleich zum Ausgangsisolat zurückzuführen, die interessanterweise mit einer reduzierten Corezeptoraffinität verknüpft war. Die erhöhte Fusionsgeschwindigkeit verkürzt das zeitliche Fenster, in welchem maC46 an seine Zielstruktur innerhalb des gp41 binden kann. Es scheinen zwei unterschiedliche Phasen des Eintrittprozesses durch die Mutationen verändert worden zu sein. Die Mutation in der V3-Region (N305Y) der gp120-Untereinheit beschleunigt wohl eine frühe Phase. Vermutlich ermöglicht diese Mutation, dass bestimmte Übergangszustände nach der Corezeptorbindung schneller durchlaufen werden können, indem die gp120/Corezeptorbindung destabilisiert wird. Die Rückmutation 556I beschleunigt wahrscheinlich in Zusammenspiel mit der bereits vorhandenen Mutation 634K die Ausbildung des 6 Helixbündels. Diese beiden Mutationen wirken somit auf eine späte Phase der Fusion. Obwohl bekannt ist, dass natürliche Variationen in gp120 die Sensibilität des HIV-Hüllproteins gegenüber C-Peptiden beeinflussen, konnte in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass solche Mutationen auch in vitro selektiert werden, um eine C-Peptidresistenz herbeizuführen.
Der menschliche Körper ist permanent mechanischen Reizen in Form von Dehnung oder Druck ausgesetzt. Diese Stimuli können vielfältige zelluläre Prozesse induzieren. Dehnungsreize erhöhen die Zellproliferation in allen bisher untersuchten Zellspezies, inklusive Endothel- und Epithelzellen. Im Gegensatz dazu scheinen mechanische Druckbelastungen zu zellulärer Differenzierung zu führen. Die Relevanz dieser mechanischen Reize für die Physiologie und Pathophysiologie ist für viele Organe nachgewiesen worden. Jedoch gibt es bislang keine hinreichenden Untersuchungen, die belegen, dass mechanische Reize ebenso eine Rolle bei der Tumorproliferation spielen könnten. Im Fokus dieser Promotionsarbeit steht die Fragestellung, inwieweit die mechanischen Verhältnisse in Tumoren in einem funktionellen Zusammenhang mit der Tumorgenese stehen. Zur Klärung dieser Fragestellung ist ein Xenograft-Tumormodell etabliert worden, das es erlaubt in vivo-Untersuchungen an humanen epithelialen Tumoren durchzuführen. Um Erfahrungen aus vorherigen in vitro-Versuchen nutzen zu können, wurden humane epitheliale A431-Vulvakarzinom- und humane epitheliale A549-Lungenkarzinomzellen für das Tumormodell verwendet. Mit diesem Modell konnte erstmals in vivo gezeigt werden, dass solide humane Tumore einer permanenten mechanischen Dehnung ausgesetzt sind, die direkten Einfluss auf die Proliferation der Tumorzellen hat. Als zentraler Auslöser für die mechanische Dehnung der Tumorzellen konnte der erhöhte tumorinterstitielle Flüssigkeitsdruck (TIFP) identifiziert werden. Der Einfluss der mechanischen Dehnung auf die Proliferation der Tumorzellen wurde anhand der Phosphorylierung der extracellular regulated kinase 1/2 (ERK1/2) bzw. der Ki-67 Expression gezeigt. Durch die Punktion bzw. Drainage von Tumoren konnte der TIFP experimentell abgesenkt werden und in Folge dessen kam es zu einer reduzierten mechanischen Dehnung der Tumorzellen. In allen Versuchen war die Abnahme der mechanischen Dehnung von einer verringerten Phosphorylierung der ERK1/2 bzw. reduzierten Expression des Proliferationsmarkers Ki-67 begleitet. Der TIFP induziert aber nicht nur mechanische Dehnungsreize, sondern er stellt darüber hinaus eine physikalische Barriere für den effizienten Transport von Therapeutika in den Tumor dar. Der gegenüber dem umliegenden Gewebe erhöhte TIFP behindert den interstitiellen Transport und die Aufnahme von Molekülen aus dem Gefäßsystem in die Tumorzellen. Die Etablierung einer neuen experimentellen Technik zur Senkung des TIFP, durch i.v. Injektion von konzentriertem humanem Serumalbumin, führte zu einer signifikanten Verbesserung der Aufnahme und einer Verlängerung der Verweildauer von Makromolekülen/Therapeutika innerhalb von Tumoren. Des Weiteren konnten immunhistochemische Färbungen gegen lymphspezifische Marker in Gewebeproben von A431 und A549 Tumoren keinen direkten Zusammenhang zwischen Lympharchitektur und TIFP zeigen. Dies bedeutet, dass in den untersuchten Tumoren die Ausbildung des hohen TIFP eher auf eine erhöhte Rigidität der extrazellulären Matrix bzw. die hohe Permeabilität des tumorversorgenden vaskulären Gefäßsystems zurückzuführen ist. Parallel zu den in vivo-Untersuchungen durchgeführte in vitro-Versuche konnten Proteine identifizieren, die an der druckinduzierten p38 Signaltransduktionskaskade beteiligt sind. Diese Ergebnisse untermauern die bisherigen in vitro-Daten bzgl. der differentiellen Reaktionen von Zellen auf mechanische Druckreize. Abschließend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse der in vivo-Versuche die Bedeutung und die klinische Relevanz des biophysikalischen Parameters TIFP hervorgehoben haben. Die Zukunft der Krebstherapie liegt nicht alleine in der Entwicklung neuer hochspezifischer Wirkstoffe, sondern auch in der Lösung des Transports der Wirkstoffe an den Zielort. Die vorgestellten Ergebnisse dieser Promotionsarbeit weisen eine beträchtliche klinische Relevanz auf, denn sie zeigen, dass die experimentelle Absenkung des TIFP zu einer verbesserten Aufnahme von Therapeutika beiträgt. Gleichzeitig wird die Proliferationsrate von Tumorzellen durch die reduzierte mechanische Dehnung signifikant verringert. Dieser Doppeleffekt könnte zu einer effizienteren Krebstherapie führen in Folge derer es zu einer verlängerten Überlebensrate sowie einer Verbesserung der Lebensqualität von Krebspatienten kommen könnte.
Many environmental chemicals are suspected of disturbing the human and animal endocrine system. These so-called endocrine disruptors can operate in many ways. The interaction of endocrine disruptive effects that eventually endanger human health is still unclear. However, one of the basic mecha-nisms of endocrine disruption is the inhibition of key enzymes in the hormone metabolism. In this study, we focused on the inhibitory potency of suspected endocrine disrupting compounds on aromatase (P450arom) and 5alpha-reductase (5alpha-Re) activities in human tissue and human cancer cells. Both enzymes are essential for the human sex steroid hormone metabolism. We were able to demonstrate that the organotin compounds tributyltin (TBT) and triphenyltin (TPT) are potent unspecific inhibitors of P450arom and 5alpha-Re activity. Prochloraz and fenarimol inhibited P450arom activity at low concentrations (IC50<2 µM), while 5alpha-Re activity was only impaired at higher concentrations (IC50>10 µM). While the human tissue assay proved to be more practical and sensitive as a screening tool for putative endocrine disruptors, the cell assay reflected partly the situation in vivo. In another experimental series, we investigated the inhibitory effect of TPT on P450arom, 5alpha-Re, 3beta-HSD type 2, 17beta-HSD type 1 and type 3 alone and in combination with the strong antioxidant dithioerythrithol (DTE). TPT inhibited unspecifically all enzymes that were tested. The experiments also showed that DTE is able to compensate the adverse effects of TPT, and that the effectiveness of the compensatory activity of DTE differs among the enzymes investigated. The suppressed 5alpha-Re activity could not be reactivated with DTE. Conceivably, cysteine residues that are responsible for the tertiary and quarternary structure of the enzyme are critical targets for TPT. A human sampling study was undertaken with the COMPRENDO partner in Gdansk. 60 Polish and 15 German blood samples were investigated for chemical residues and sex hormone concentrations. In addition, 15 placenta samples from Poland and Germany, respectively, were tested for chemical residues, P450arom activities and CYP19 mRNA contents. The chemical analysis was performed by the COMPRENDO partners in Milan (p,p´DDE), Orleans (TBT and TPT) and Ioannina (diuron, fenarimol, linuron und vinclozolin). The results showed that individual sex hormone concentrations in blood were not correlated with chemical body burden. The detected differences in sex hormone concentrations, specific aromatase activity and relative CYP19 mRNA content of Polish and German donors were presumably the result of other factors than the ones determined in this study. Another task of the EU-project was the investigation of the effects of chemical exposure of the aquatic model organisms Pimephales promelas, Rutilus rutilus and Xenopus laevis. We investigated the specific P450arom and 5alpha-Re activities in brain and gonads of the animals. During the qualitative investigation of the androgen metabolism in Xenopus laevis brain, 5alpha-reductase activity was discovered for the first time. In contrast to the inhibitory potency of TPT discovered in our enzyme assays, TPT exposure of aquatic model organisms had no observed effect on enzyme activity in the organs investigated, except for P450arom activities in female gonads of Pimephales promelas at 320 ng TPT/L. In this group, mean P450arom activities were elevated, possibly as a result of an overshooting upregulation due to the inhibition of P450arom by TPT. The exposure of Rutilus rutilus and Xenopus laevis to the effector substances methyltestosterone and letrozole resulted in slightly different mean enzyme activities compared to the control group. In conclusion, many of the tested pesticides are able to inhibit P450arom and 5alpha-Re, and thus might be of clinical relevance. However, results are not always coherent, and possible risks for human and wildlife health are therefore difficult to predict. Risk assessment will require large studies with an additional number of short and long term in vitro and in vivo assays. Any extrapolation to humans should be very meticulously performed.
The following thesis is concerned with the elucidation of structural changes of RNA molecules during the time course of dynamic processes that are commonly denoted as folding reactions. In contrast to the field of protein folding, the concept of RNA folding comprises not only folding reactions itself but also refolding- or conformational switching- and assembly processes (see chapter III). The method in this thesis to monitor these diverse processes is high resolution liquid-state NMR spectroscopy. To understand the reactions is of considerable interest, because most biological active RNA molecules function by changing their conformation. This can be either an intrinsic property of their respective sequence or may happen in response to a cellular signal such as small molecular ligand binding (like in the aptamer and riboswitch case), protein or metal binding. The first part of the thesis (chapters II & III) provides a general overview over the field of RNA structure and RNA folding. The two chapters aim at introducing the reader into the current status of research in the field. Chapters II is structured such that primary structure is first described then secondary and tertiary structure elements of RNA structure. A special emphasis is given to bistable RNA systems that are functionally important and represent models to understand fundamental questions of RNA conformational switching. RNA folding in vitro as well as in vivo situations is discussed in Chapter III. The following chapters IV and V also belong to the introduction part and review critically the NMR methods that were used to understand the nature and the dynamics of the conformational/structural transitions in RNA. A general overview of NMR methods quantifying dynamics of biomolecules is provided in chapter IV. A detailed discussion of solvent exchange rates and time-resolved NMR, as the two major techniques used, follows. In the final chapter V of the first part the NMR parameters used in structure calculation and structure calculation itself are conferred. The second part of the thesis, which is the cumulative part, encompasses the conducted original work. Chapter VI reviews the general NMR techniques applied and explains their applicability in the field of RNA structural and biochemical studies in several model cases. Chapter VII describes the achievement of a complete resonance assignment of an RNA model molecule (14mer cUUCGg tetral-loop RNA) and introduces a new technique to assign quaternary carbon resonances of the nucleobases. Furthermore, it reports on a conformational analysis of the sugar backbone in this RNA hairpin molecule in conjunction with a parameterization of 1J scalar couplings. Achievements: • Establishment of two new NMR pulse-sequences facilitating the assignment of quaternary carbons in RNA nucleobases • First complete (99.5%) NMR resonance assignment of an RNA molecule (14mer) including 1H, 13C, 15N, 31P resonances • Description of RNA backbone conformation by a complete set of NMR parameters • Description of the backbone conformational dependence in RNA of new NMR parameters (1J scalar couplings) Chapters VII & VIII summarize the real-NMR studies that were conducted to elucidate the conformational switching events of several RNA systems. Chapter VIII gives an overview on the experiments that were accomplished on three different bistable RNAs. These molecules where chosen to be good model systems for RNA refolding reactions and so consequently served as reporters of conformational switching events of RNA secondary structure elements. Achievements: • First kinetic studies of RNA refolding reactions with atomic resolution by NMR • Application of [new] RT-NMR techniques either regarding the photolytic initiation of the reaction or regarding the readout of the reaction • Discovery of different RNA refolding mechanisms for different RNA molecules Deciphering of a general rule for RNA refolding methodology to conformational switching processes of RNA tertiary structure elements. The models for these processes were a) the guanine-dependent riboswitch RNA and b) the minimal hammerhead ribozyme. Achievements: • NMR spectroscopic assignment of imino-resonances of the hypoxanthine bound guanine-dependent riboswitch RNA • Application of RT-NMR techniques to monitor the ligand induced conformational switch of the aptamer domain of the guanine-dependent riboswitch RNA at atomic resolution • Translation of kinetic information into structural information • Deciphering a folding mechanism for the guanine riboswitch aptamer domain • Application of RT-NMR techniques to monitor the reaction of the catalytically active mHHR RNA at atomic resolution In the appendices the new NMR pulse-sequences and the experimental parameters are described, which are not explicitly treated in the respective manuscripts.
All living organisms exhibit daily fluctuations in biochemical, physiological and behavioural parameters driven by endogenous oscillators, residing in the organism itself. In mammals, the core circadian oscillator is located in the paired suprachiasmatic nuclei (SCN) of the hypothalamus. Circadian rhythm generation in the SCN depends upon the expression of clock genes interacting in positive and negative transcriptional/translational feedback loops. The SCN governs the timing of peripheral circadian oscillators by neuronal pathways and by neuroendocrine mechanisms. An important neuroendocrine hand of the core circadian oscillator is melatonin, which is produced in and secreted from the pineal gland night by night. The adenohypophysis represents a peripheral circadian oscillator and the secretion of one of its hormones, prolactin, is known to be regulated by melatonin. The aim of the present study was to analyze a putative influence of melatonin on the activity state and diurnal variations of identified cell types in the hypophysis. Particular attention was paid to lactotroph, gonadotroph and pars intermedia cells. Experiments were performed with young male mice of different strains: melatonin-proficient C3H, melatonin-deficient C57BL, melatonin-proficient C3H with targeted deletions of the Mel1a receptor (MelaaBB), Mel1b receptor (MelAAbb) or both receptors (Melaabb). Cells producing prolactin (PRL), follicle stimulating hormone (FSH) were immunocytochemically identified and the presence of phosphorylated CREB protein (pCREB) and clock gene protein PER1 was demonstrated by double immunolabeling at different time points during the light/dark cycle in melatonin deficient, melatonin proficient and melatonin receptor knockout mice. Melatonin influence on Prl mRNA levels was investigated by means of in situ hybridization. At night the percentage of lactotroph cells showing a positive nuclear pCREB- and PER1-immunoreaction is significantly smaller in C57BL than in C3H mice. In both mouse strains, the percentage of pCREB –immunoreactive cells is minimal in the early morning and gradually increases to reach a maximum in the late night. PER1 levels show a parallel temporal variation in C3H, but in C57BL, they are drastically reduced in the early afternoon. The percentage of FSH-immunoreactive cells showing pCREB immunoreaction was significantly lower in the melatonin-deficient C57Bl mice than in the melatonin-proficient C3H mice during the second part of the day and during the night. In each strain, the percentage of FSH-immunoreactive cells was lowest at the early morning and gradually increases until the maximum at late night. In wild type (MelAABB) and MelAAbb mice the percentage of lactotroph cells with nuclear pCREB immunoreactions varied significantly over 24 h period, whereas in MelaaBB and Melaabb mice no significant differences were found between the five time points analyzed. The number of Prl mRNA expressing cells was significantly higher in MelaaBB and MelAAbb than in their wild type (MelAABB) littermates. pCREB levels in the pars intermedia did not show rhythmic variation in wild type or Melaabb animals, but wild type mice had higher pCREB levels than Melaabb. The observation that, during darkness, the percentage of lactotroph cells with nuclear pCREB immunoreaction is significantly higher in C3H than in C57BL mice suggests the existence of a distinct cell population that is under the control of melatonin-dependent intrapituitary signaling. Results with melatonin receptor knockout mice indicate that Mel1a and Mel1b melatonin receptors are involved in the control of the activity state of lactotroph cells, but to a differing degree. Analysis of cells expressing Prl mRNA showed that inhibitory action on the Prl expression is mostly mediated through the Mel1a receptor. The significant difference between pCREB immunoreaction in gonadotroph cells of C3H and C57BL mice might suggest that, like lactotrophes, FSH cells represent a heterogeneous population and only a subpopulation is under control of melatonin signaling. The present study is first to show that melatonin signaling also affects pCREB levels in pars intermedia of mice.
To determine the effects of inhaled IL-10 at different doses and different time points on the pulmonary and systemic inflammatory response during endotoxemia, 48 ventilated, anaesthetized rats (mean body weight ± standard deviation, 500 ± 33g) were randomly assigned to six groups (n = 8, each). Interleukin-10 was nebulised either prior to or following the intravenous injection of LPS (5mg/kg) at two doses (5.0 mycro-g or 0.5 mycro-g) in our groups. Eight rats received the same insult with no further treatment (LPS-only group). Another eight rats served as controls without endotoxemia but with aerosolized phosphate-buffered saline, the solvent of IL-10 (Sham group). Concentrations of TNF-alpha, IL-1beta, IL-6, and IFN-gamma were analyzed in plasma and bronchoalveolar lavage fluid (BALF). In addition, the nitrite release from ex-vivo cultured alveolar macrophages was determined. As compared to the LPS-only group, the concentrations of the proinflammatory cytokines TNF-alpha, IL-1beta, IL-6, and IFN-gamma in plasma were significantly reduced in the group, which inhaled 5 mycro-g IL-10 before LPS injection (p< 0.0125). Spontaneous nitrite release from exvivo cultured alveolar macrophages was suppressed in this group (p< 0.0125). Inhalation of 0.5 mycro-g IL-10 before LPS injection and both dosages of IL-10 inhalation (5 mycro-g or 0.5 mycro-g) after LPS injection did not significantly influence either inflammatory cytokine concentrations in BALF, in plasma or the nitrite release from ex-vivo cultured alveolar macrophages. In this study, inhaled IL-10 only demonstrated anti-inflammatory effects when it was administered at 5 mycro-g prior to the induction of experimental endotoxemia. Interleukin-10 aerosol had no effect when it was given either following induction of endotoxemia or given at a lower dosage (which here was 0.5 mycro-g) either before or following injection of lipopolysaccharide.
Thema der vorliegenden Arbeit ist die systematische Darstellung und methodische Bewertung von wissenschaftlichen Publikationen zu psychosozialen Aspekten von Herzrhythmusstörungen. Thematisch ergaben sich zwei Hauptrichtungen: 1. Das Befinden und die Lebensqualität von Patienten mit Herzrhythmusstörungen. 2. Das Problem der psychischen Beteiligung an der Auslösung von ventrikulären Arrhythmien und dem plötzlichen Herztod. Mit der Eignungsbewertung nach Hermann-Lingen und Buss (2002), mit der der Hauptteil der Studien bewertet wurde, konnten die Studien meist gut eingeteilt werden. Die Klassifizierung erfolgte anhand zweier Aspekte: der Fallzahl und der methodischen Qualität (entsprechend der Fragestellung der vorliegenden Arbeit). Die Gesamt-Eignung einer Studie errechnet sich aus dem Produkt von Fallzahl und dem Mittelwert der methodischen Qualität. Eine Ausnahme von der o.g. Bewertung stellen Studien dar, die Fragen zur Lebensqualität nur als ein weiteres Kriterium zusätzlich zu kardiologischen Parametern untersuchen, welche das größere Gewicht haben. Die Eignung ergibt sich hier als die Summe aus Fallzahl und Nutzung eines validierten Messinstrumentes. Da sie trotzdem meist als „weniger geeignet“ bewertet wurden, haben sie in dieser Arbeit kaum Gewicht. In der vorliegenden Arbeit wurden die gesichteten Originalarbeiten entsprechend ihrem Design in 3 Subgruppen unterteilt und bewertet: Querschnitts-, Verlaufs- und Prädiktorstudien. Die Verlaufsstudien befassen sich hauptsächlich mit Fragen der Lebensqualität und dem Befinden, die Prädiktorstudien ausschließlich mit dem Problem der psychischen Beteiligung an der Auslösung von ventrikulären Arrhythmien und dem plötzlichen Herztod, die Querschnittstudien bearbeiten beide Schwerpunkte. Die methodische Qualität der Studien war bei den o.g. Hauptthemen sehr unterschiedlich. Dabei ist das Niveau der Studien zur eher jungen Forschungsrichtung Lebensqualität bei den Verlaufsstudien mit 10 von 17 oder 59% Studien mit guter Bewertung eher mäßig, bei den Querschnittstudien mit 6 von 7 oder 86% gut. Bei den Studien die eher andere, einzelne Parameter zum Befinden von Patienten abfragen wie Distress, Angst, Depression, Schmerz, Anpassung an die Krankheit, Sorge um die Krankheit oder Unsicherheit wegen der Krankheit und sie mit der Lebensqualität in Beziehung setzen, ist das Niveau schlechter mit formal 11 von 11 als „weniger geeignet“ bewerteten Studien bei den Querschnittstudien und 4 von 4 bei den Verlaufsstudien, was hauptsächlich an kleinen Fallzahlen lag. Beim schon älteren Thema der psychischen Beteiligung an der Auslösung von ventrikulären Arrhythmien und dem plötzlichen Herztod ist das Niveau wesentlich besser. Das Niveau der 13 Prädiktorstudien ist hier formal hoch mit 9 von 12 also 75% als „gut“ oder „besonders gut“ geeignet bewerteten Studien. 7 Querschnittstudien befassen sich ebenfalls mit dem Thema. Davon sind 6, also 86% als „gut“ oder „besonders gut geeignet“ bewertet worden. Probleme ergaben sich durch die Änderung der Forschungsmeinung im Laufe der Zeit, was eine relevante Arrhythmie darstellt und was behandelt wird. So maß man noch 1990 Herzrhythmusstörungen ab Lown Klasse III so viel Bedeutung zu, dass man bei Symptomen eine Behandlungsindikation sah. Insbesondere die CAST-Studie von 1987 bis 1991 führte zu Veränderungen in der Sicht von Arrhythmien. Ab 1993 wird der Wandel dann auch in Lehrbüchern ersichtlich. 2004 werden unter ventrikulären Herzrhythmusstörungen nur noch Tachykardien mit einer Herzfrequenz von > 120/min. mit breitem QRS-Komplex angesehen. Vereinzelten VES wird keine Bedeutung mehr zugemessen. Als Risikofaktor für den plötzlichen Herztod wird heutzutage hauptsächlich eine eingeschränkte linksventrikuläre Ejektionsfraktion (EF) angesehen. Man geht heute davon aus, dass komplexe VES eher eine linksventrikuläre Dysfunktion anzeigen und nur für die Prognose von Patienten mit struktureller Herzerkrankung bedeutsam sind. Es wird in der vorliegenden Arbeit die neuere Definition von 2004 gewählt und bei Betrachtung von vereinzelten VES ein relevanter arrhythmischer Endpunkt (z.B. anhaltende Tachykardien, lebensbedrohliche Rhythmusstörungen) gefordert. Zum ersten Schwerpunkt zeigte sich bei den Studien zur Lebensqualität, dass Patienten mit ventrikulären und supraventrikulären Herzrhythmusstörungen eine eingeschränkte Lebensqualität aufweisen. Eine „kurative“ Therapie mit Ablation, die ohne weitere Medikamentengabe auskommt, führt dabei zu einer starken, stabilen Verbesserung der Lebensqualität, der Symptome, des psychologischen Distress und die Lebensqualität nach Ablation gleicht der von Gesunden. Bei Betrachtung der Studien zu nicht-kurativen Therapien von supraventrikulären Herzrhythmusstörungen drängt sich der Verdacht auf, dass sich eine vom Patienten empfundene Verbesserung des Befindens aus verschiedenen Komponenten zusammensetzt. Die Symptomkontrolle ist wichtig, und korrelierte gut mit Verbesserungen im sozialen Bereich und körperlichen Wohlbefinden, aber darüber hinaus scheinen auch psychische Mechanismen beteiligt zu sein. Hier könnte sich die weitere Forschung stärker und mit höheren Fallzahlen mit den psychischen Komponenten beschäftigen und versuchen, sie von den kardiologischen abzutrennen. Die objektiven, kardiologischen Parameter korrelierten nur schlecht mit den erhobenen Parametern der Lebensqualität und der Aktivität des täglichen Lebens bei supraventrikulären Arrhythmien. Die Studien zu ventrikulären Arrhythmien beschränken sich thematisch meist auf den Vergleich der Lebensqualität bei Therapie mit ICD oder Antiarrhythmika. Allgemein gaben jüngere Patienten mit ventrikulären Arrhythmien eine schlechtere Lebensqualität an als ältere. Eine größere Gesundheitsstörung und stärkerer Distress hatten eine geringere Lebensqualität zur Folge, und stärkere Medikamentennebenwirkungen hatten stärkeren Distress zur Folge. Die Sorgen wg. der Krankheit waren bei Baseline für Arrhythmiepatienten erhöht und führten zu einer schlechteren Lebensqualität. Problematisch bei den Originalarbeiten zu ventrikulären Arrhythmien war, dass meist gemischte Kollektive von Patienten nach Reanimation und ohne Reanimation untersucht wurden. Bei Bearbeitung der Originalarbeiten gewann man den Eindruck, dass diese beiden Untergruppen sich zu stark voneinander unterscheiden, als dass eine gemeinsame Betrachtung sinnvoll erscheint. Dies müssten geeignete Studien überprüfen. Zum zweiten Schwerpunkt unterscheidet man akute von chronischen psychischen Auslösern von ventrikulären Arrhythmien und dem plötzlichen Herztod. Von den akuten psychischen Zuständen scheinen 15 min. vor einer Herzrhythmusstörung bei einem hohen Prozentsatz der Patienten Ärger zu bestehen. Oft gingen vielfältige psychische Ausnahmezustände bis 24 Stunden einer ventrikulären Herzrhythmusstörung voraus. Dabei war Wut der Hauptaffekt, andere waren Depression, Angst, ängstliche Erwartung und Trauer. An chronischen Zuständen wurden folgende Konstrukte untersucht: psychischer Distress, Depression, Angst, Typ A/B-Verhalten, unterdrückter Ärger, soziale Unterstützung, der Wunsch nach Kontrolle und vitale Erschöpfung. Dabei ist die Depression am besten untersucht. Nach der Datenlage scheint es eine Korrelation mit arrhythmischen Ereignissen zu geben. Der psychische Distress, ein aus verschiedenen Variablen zusammengesetzter Parameter, ist nach Datenlage ebenfalls von Bedeutung. Für die Konstrukte Angst, unterdrückter Ärger, soziale Unterstützung, Wunsch nach Kontrolle und vitale Erschöpfung kann keine definitive Aussage gemacht werden, da sie zum Teil nur von einer Studie untersucht werden. Sie zeigen jedoch alle eine positive Korrelation zur Auslösung von Herzrhythmusstörungen. Von einer Relevanz des Typ A-Verhaltens kann man eher nicht ausgehen. Bei den Randthemen ist das Verhältnis von funktionellen Herzrhythmusstörungen zu relevanten Herzrhythmusstörungen erwähnenswert. So gibt es Hinweise, dass Patienten mit funktionellen Herzbeschwerden ängstlicher sind und sie erschienen hysterischer und stärker entfremdet im gesellschaftlichen Bereich. Jedoch werden bei Patienten mit relevanten Herzrhythmusstörungen ebenfalls oft die Beschwerden als psychisch abgetan. Als Forschungsdefizit fiel auf, dass die meisten guten Arbeiten zur Lebensqualität das Ziel haben, die Lebensqualität unter bestimmten Therapien zu bewerten. Originalarbeiten, die psychische Aspekte untersuchen, die bei Arrhythmiepatienten Einfluss nehmen auf die Lebensqualität oder das Befinden, gibt es nur wenige und es wird nur mit sehr kleinen Fallzahlen untersucht. Insgesamt fehlen größere, aussagekräftigere Studien dazu. Außerdem entsteht der Eindruck, dass viele Studien zur Lebensqualität Placebo-Effekte, z.B. der stärkeren Hinwendung zum Patienten bei bestimmten Therapien, nicht kontrollieren und schon gar nicht thematisieren. Es fehlen Untersuchungen, wo ausdrücklich geforscht wird, welche Komponenten bei hochsymptomatischen sowie auch mäßig symptomatischen Patienten mit supraventrikulären Rhythmusstörungen zur Besserung der Lebensqualität beitragen. Speziell zu den Arbeiten zu ventrikulären Arrhythmien wäre eine Untersuchung wünschenswert, inwieweit sich Patienten mit lebensbedrohlichen Herzrhythmusstörungen nach Reanimation von Patienten mit lebensbedrohlichen Herzrhythmusstörungen ohne Reanimation im Befinden, im kognitiven Erleben und in der Lebensqualität voneinander unterscheiden. Es müsste geklärt werden, ob die Reanimation ein so stark dominierender Faktor ist, dass er die kleineren Unterschiede zwischen Gesunden und Arrhythmiepatienten überlagert und verdeckt, wie es bei der vorliegenden Arbeit den Anschein hatte. Die Unterschiede von Frauen und Männern wurden von nur einer hochwertigen Arbeit zum Vorhofflimmern bearbeitet. Hier besteht noch Forschungsbedarf, da in anderen Feldern der Kardiologie durchaus Unterschiede im Erleben der Krankheit festgestellt wurden.
Die aus dem LZ-EKG bestimmbare HRT ist eine relativ neue, viel versprechende Methode zur Detektierung von Patienten mit einem erhöhten Risiko für arrhythmische Ereignisse. Die HRT konnte in den letzten Jahren als Risikomarker bei Überlebenden eines Myokardinfarktes etabliert werden und beschreibt Fluktuationen des Sinusrhythmus nach spontan einfallenden VES. Die Einführung dieses Risikomarkers erfolgte an zwei großen Populationen (MPIP und EMIAT), die Patienten in der frühen Postinfarktsituation einschlossen [67]. Dabei zeigte sich in der univariaten Analyse, dass die HRT allen anderen Risikomarkern aus dem LZ-EKG überlegen war. Dies konnte Ghuran et al in einer Untersuchung an den Patienten aus dem ATRAMI-Pool bestätigen [21]. Aber nicht nur an Patienten mit einer KHK mit stattgehabten Myokardinfarkt, sondern auch an Patienten mit einer Herzinsuffizienz und idiopathischen DCM konnte der gute prädiktive Wert der HRT nachgewiesen werden, was für eine mögliche breitere klinische Anwendung dieses Risikoparameters spricht [22, 38]. Die vorliegende Arbeit untersuchte den TO und den TS der HRT sowie die Zeitbereichsparameter SDNN und rMSSD der HRV an 27 Patienten, die sich wegen symptomatischer VES vorstellten, sowohl unter als auch ohne Therapie mit Sotalol. Unsere Untersuchungen haben gezeigt, dass der TS mit anderen Risikomarkern des autonomen Nervensystems, hier die Zeitbereichsparameter der HRV, korreliert, nicht jedoch der TO der HRT. Diese Korrelation der HRT mit der HRV konnte auch in anderen Studien nachgewiesen werden. Für das pathophysiologische Verständnis der HRT bedeutet diese Korrelation, dass sie nicht nur die BRS, also die vagale Reflexaktivierbarkeit des Herzens, reflektiert, wie es weithin angenommen wird, sondern wie die HRV auch, mutmaßlich den basalen autonomen Tonus illustriert [26]. Weiter konnten wir feststellen, dass die HRT auch dann valide aus dem 24h- LZ-EKG bestimmbar ist, wenn die Patienten gehäufte ventrikuläre Arrhythmien bieten, d.h., dass es keine Beziehung zwischen der Validität der HRT-Bestimmung und der Anzahl der VES gibt. Dieser Sachverhalt stellt einen möglichen Vorteil gegenüber der HRV dar, die bei gehäuft auftretenden VES nicht präzise bestimmbar ist. Für antiarrhythmisch behandelte Patienten konnten wir eine Unabhängigkeit der Bestimmung der HRT von der medikamentösen Therapie mit Sotalol zeigen. Durch die Anwendung von Sotalol konnte erwartungsgemäß eine Reduktion der Anzahl der VES nachgewiesen werden. Die HRT kann also auch unter einer Therapie mit diesem Klasse II- und III-Antiarrhythmikum valide aus dem LZ-EKG bestimmt werden. Eine signifikante Verbesserung der HRT unter der Sotalol-Therapie, wie Hohnloser et al sie für die HRV finden und Lin et al für die HRT an Atenolol therapierten Patienten mit einer Herzinsuffizienz zeigen konnten, war in unserer Untersuchung nicht nachzuweisen [28, 40]. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die HRT sowohl methodologisch als auch hinsichtlich ihres prädiktiven Wertes prospektiv bei ausreichend großen Patientenkollektiven weitergehend untersucht werden sollte, um diese Methode gegebenenfalls in der klinischen Routinediagnostik etablieren zu können. Und das gerade deshalb, weil sie eine kostengünstige, nicht invasive Möglichkeit darstellt, die diagnostische Erfassung von Patienten mit einem niedrigen Risikoprofil, die keine prophylaktische Therapie benötigen, und Hochrisikopatienten, die durch das übliche diagnostische Netz fallen, z. B. solche mit einer erhaltenen LVEF, zu erleichtern.
Die Verbreitung westlicher Verhaltens- und Lebensmuster im Rahmen der Globalisierung führt zu einer dramatischen Zunahme des Typ 2 Diabetes. Eine schwerwiegende Komplikation der diabetischen Erkrankung ist die Wundheilungsstörung, deren molekulare Pathophysiologie noch weitgehend unverstanden ist. Voraussetzung für einen koordinierten Wundheilungsprozess ist die ausgewogene Interaktion wundheilungsrelevanter Faktoren, die eine Vielfalt an Signaltransduktionskaskaden induzieren und somit zu einem streng kontrollierten Heilungsprozess beitragen. Darüber hinaus scheint auch die Insulinsensitivität der Haut für den Heilungsverlauf eine essentielle Rolle zu spielen. Da die Proteinkinase B/Akt nicht nur ein zentrales Molekül der Insulin-Signaltransduktion ist, sondern als Knotenpunkt vieler Signalkaskaden im Mittelpunkt zellulärer Ereignisse steht, sollte in der vorliegenden Arbeit die Rolle und Funktion der Proteinkinase Akt in der kutanen Wundheilung untersucht werden. Sowohl in der Haut als auch im Wundgewebe konnte Akt1 als dominante Isoform identifiziert werden. Die Verletzung des Hautgewebes induzierte einen Anstieg der Akt1-Expression und -Phosphorylierung in der Epidermis akut heilender Wunden. Insbesondere die am Wundrand gelegenen Keratinozyten waren durch eine starke Expression der Akt1-Kinase gekennzeichnet. Die Phosphorylierung und somit Aktivierung der Akt1-Kinase stieg im Verlauf der Wundheilung stetig an und erreichte ihr Maximum in der Endphase des Heilungsprozesses. Begleitet wurde die Aktivierung dieser Kinase von einer Phosphorylierung des eIF4E-BP1 und einer starken VEGF-Sekretion. Dagegen konnte in diabetisch chronischem Wundgewebe weder eine Aktivierung der Akt1-Kinase noch eine Phosphorylierung des eIF4E-BP1 nachgewiesen werden, was mit einer deutlich verminderten VEGF-Sekretion einherging. Um nun zu untersuchen, ob im Prozess der Wundheilung die VEGF-Sekretion in einem funktionellen Zusammenhang zur Akt1-Aktivierung steht, wurde in vitro der Einfluss wundheilungsrelevanter Faktoren, wie EGF, einer Kombination proentzündlicher Zytokine oder Insulin auf die Aktivierung der Akt1-Kinase und VEGF-Biosynthese untersucht. Obwohl alle Faktoren sowohl eine Aktivierung der Akt1-Kinase als auch VEGF-Sekretion induzierten, wurde ausschließlich die Insulininduzierte VEGF-Biosynthese über den PI3-Kinase/Akt-Signalweg vermittelt. Die Regulation der Insulin-induzierten VEGF-Biosynthese erfolgte posttranskriptionell aus einem gleichbleibenden Pool an VEGF-mRNA über die Phosphorylierung des eIF4E-BP1. Durch die Überexpression einer konstitutiv aktiven Akt1-Mutante und die Verwendung des mTOR-Inhibitors Rapamycin konnte mTOR als Mediator der Akt1-vermittelten Phosphorylierung des eIF4E-BP1 und somit der VEGF-Biosynthese identifiziert werden. In vitro-Lokalisationsexperimente zeigten, dass eine vollständig phosphorylierte und somit aktive Akt1-Kinase nach Insulinstimulation im Zytoplasma lokalisiert ist - exakt dort, wo die Regulation der Translation stattfindet. Zusammenfassend weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass Insulin im kutanen Heilungsverlauf die VEGF-Biosynthese posttranskriptionell über eine Akt1-vermittelte Phosphorylierung des eIF4E-BP1 induzieren kann. Eine ausbleibende Akt-Aktivierung in insulinresistenten Keratinozyten könnte somit zu einer verminderten VEGF Sekretion und folglich zu einer verzögerten Angiogenese in chronisch diabetischen Wunden beitragen.
Die Umstellung der Abrechnung unfallchirurgischer Patienten von der Bundespflegesatzordnung (BPflV) auf die von Diagnosis Related Groups (DRG) abhängige Vergütung stellt die Akutkrankenhäuser, die im Wesentlichen die Versorgung der Schwerstverletzten sicherstellen, vor erhebliche finanzielle Schwierigkeiten. Die Diskrepanz zwischen tatsächlichen Aufwendungen des Krankenhauses an Lohn- und Sachkosten zur Behandlung der Leicht- sowie Schwerverletzten und der Vergütung nach den German Diagnosis Related Groups (G-DRG) wird zur Existenzfrage der unfallchirurgischen Kliniken in Deutschland. Die vorliegende Arbeit will klären, wie hoch die finanziellen Aufwendungen sind, um in einem Haus der Maximalversorgung Patienten zu behandeln, die im Rahmen ihrer unfallchirurgischen Notfallbehandlung über den Schockraum aufgenommen werden. Es wurde berechnet, ob die ermittelten reellen Kosten sich durch die erhaltenen Erstattungen, bis zum 31.12. 2003 auf Grundlage des Krankenhauspflegesatzes und durch das zum 01.01.2004 eingeführte DRG-Vergütungssystem, decken lassen. Falls dies nicht der Fall ist, gilt darzustellen, in welchem Rahmen sich die Über- bzw. Unterdeckung bewegt und ob ein alternatives Vergütungssystem die entstandenen Kosten besser abbilden könnte. Für die vorliegende Arbeit wurden im Routineablauf des Schockraums der Universitätsklinik Frankfurt/Main im Zeitraum vom 01.09.2002 bis 31.08.2003 420 Erwachsene mit unterschiedlichen Verletzungsmustern prospektiv erfasst. Die Dokumentation erfolgte mittels des PC gestützten Online Dokumentationsprogramms Traumawatch ®. Aufgrund der Verletzungsmuster wurde bei allen Schockraumpatienten der Injury Severity Score (ISS) bestimmt und 5 Untergruppen gebildet (Gr.1 ISS < 9, Gr.2 ISS >= 9 < 16, Gr.3 ISS >= 16 < 25, Gr.4 ISS >= 25 < 41, Gr.5 ISS >= 41). Stichprobenartig wurden jeder Gruppe 10 Patienten entnommen und der Kostenkalkulation zugeführt. Zur Ermittlung der gesamten Personal- und Sachkosten, die durch die stationäre Behandlung der 50 Patienten entstanden, wurden Daten des Operativen Controllings der Universitätsklinik Frankfurt verwendet. Diese Berechnungen wurden den Erstattungen durch die BPflV und durch G-DRG gegenüber gestellt. Es ergab sich für die berechneten Schockraumpatienten bei einem mittleren ISS von 22,6 eine durchschnittliche Vergütung nach G-DRG von 14.557 Euro gegenüber Aufwendungen in Höhe von 19.010 Euro, welches einem Verlust von durchschnittlich 4.453 Euro pro Patient entspräche. Für die Klinik errechnete sich ein Gesamtverlust von ca. 1,5 Millionen Euro im Jahr für die Versorgung von 420 Patienten, die über den Schockraum aufgenommen wurden. Die Gegenüberstellung der Kosten und der Verletzungsschwere nach ISS-Klassifikation ergab einen Durchschnittswert von 1.300 Euro pro ISS-Punkt mit einer Korrelation von 0,98. Eine Vergütung in Abhängigkeit des ISS hätte Vorteile gegenüber der starren Einteilung in DRG-Gruppen, insbesondere der „Polytrauma DRGs“. Das bisher notwendige und zum Teil komplexe „Groupen“ der Patienten in eine Haupt- und Nebendiagnose würde entfallen. Als Grundlage der Vergütung wäre die international anerkannte, genau definierte und einfache Erfassung der Verletzungsschwere mittels ISS geeignet.
Aufgrund der immensen Bedeutung der Prävention von Infektionskrankheiten und nicht-infektionsbedingten Problemen bei jährlich mehreren Millionen in tropische und subtropische Regionen reisenden deutschen Passagieren sowie des derzeit nur fragmentarischen Bildes von der Qualität der reisemedizinischen Beratung in Deutschland widmete sich diese Datenerhebung der Feststellung der Vollständigkeit und in Teilen der Korrektheit der Empfehlungen zu präventiven Maßnahmen. Die Untersuchung hatte zum Ziel, die Inanspruchnahme einer Beratung bei verschiedenen Beratungsstellen zu eruieren und diese mit erfassten Personen- und Reisedatenmerkmalen in Beziehung zu setzen. Weiterhin wurden die reisemedizinische Beratung in Deutschland auf Schwachstellen hin überprüft und die Empfehlungen der Hausärzte mit denen der nicht-hausärztlichen professionellen Berater (Apotheken, Tropeninstitute, Gesundheitsämter und die Flughafenklinik Frankfurt am Main) verglichen. In einem 27 Punkte umfassenden Erhebungsbogen wurden umfangreiche Daten von Passagieren zu fünf repräsentativen Reisezielen (Dominikanische Republik, Kenia, Senegal, Südafrika, Thailand) am Flughafen Frankfurt am Main zur Zeit der Herbstferien 2001 gesammelt. Die Ergebnisse erfuhren in einem weiteren Schritt eine vorwiegend deskriptive Auswertung, Unterschiede zwischen den Beratungsstellen und -gruppen (Hausärzte, nicht-hausärztliche Berater, Laiengruppe) wurden im Rahmen der induktiven Statistik mittels des exakten Fisher-Tests genauer betrachtet. Von 603 Passagieren haben 91% reisemedizinische Informationen in irgendeiner Form eingeholt, wobei die Anteile für die verschiedenen Reiseziele zwischen 89% und 96% variieren. Eine Mehrfachberatung der Reisenden hat bei 77% der Teilnehmer stattgefunden, wobei sich keine Abhängigkeit vom Risikograd eines Bestimmungsortes zeigt. ...
Die Zahl der tödlichen Arbeitsunfälle hat im Untersuchungszeitraum von 1991-2004 in absoluten Zahlen kontinuierlich abgenommen. Damit setzt sich ein erfreulicher Trend fort, der auch in Arbeiten aus der Zeit davor festzustellen war und der sich in der vorliegenden Untersuchung genauso wie in der gesamtdeutschen Entwicklung spiegelt. Allerdings stellt sich das Bild etwas anders dar, wenn man diese Zahlen zur ebenfalls stark rückläufigen Zahl der Vollbeschäftigten in den hauptsächlich betroffenen Sparten, d.h. der Baubranche und der gewerblichen Industrie in Beziehung setzt. Vor diesem Hintergrund stellt sich heraus, daß sich ein gewisses Maß an Unfällen wohl trotz verbesserter Arbeitsschutzbedingungen nicht vermeiden läßt und daß die relative Abnahme weit geringer als angenommen ist. Es sind fast ausschließlich Männer, die am Arbeitsplatz tödliche Unfälle erleiden. Allerdings läßt sich die Hypothese, daß dies im männlichen Risikoverhalten begründet sei, nicht erhärten. Vielmehr spiegelt sich darin das Geschlechterverhältnis an unfallgefährdeten Arbeitsplätzen. Der Altersgipfel der Unfallopfer liegt wesentlich höher als dies dem Durchschnitt aller Arbeitnehmer entspräche, so daß von einer deutlich erhöhten Mortalität im höheren Alter ausgegangen werden muß. Die Mortalität ausländischer Arbeitnehmer ist ebenfalls stark erhöht und spiegelt nicht den relativen Anteil von Ausländern an den betroffenen Arbeitsplätzen. Noch mehr zeigt sich dies bei Absturzunfällen, die die größte Gruppe im Hinblick auf den Unfallmechanismus darstellen. Im Jahresverlauf zeigt sich durchweg eine im konstanten Verhältnis zur Zahl der Arbeitnehmer am Arbeitsplatz stehende Anzahl von tödlichen Unfällen. Auch im Verlauf über die Woche kann anhand der vorliegenden Zahlen die früher häufig nachgewiesene erhöhte Montagsmortalität nicht mehr bestätigt werden. Die Mortalität verhält sich proportional zur Zahl der geleisteten Arbeitsstunden. Eine tageszeitliche Schwankung ergibt sich mit einem Gefährdungshöhepunkt zwischen 10:00 und 11:00 Uhr vormittags. Bezüglich der Todesursache zeigte sich, daß besonders Opfer von Absturzunfällen ein stark erhöhtes Risiko haben, an einer Lungenembolie zu versterben, unabhängig von der Sturzhöhe. Sicherheit am Arbeitsplatz ist nach wie vor ein Problem, das es weiter zu verbessern gilt, wenn man die Feststellung berücksichtigt, daß nur in rund einem Viertel aller Unfälle die vorgeschriebenen Sicherheitsmaßnahmen sowohl von Arbeitgeber- wie von Arbeitnehmerseite eingehalten wurden und daß mithin drei Viertel aller Unfälle höchstwahrscheinlich vermeidbar gewesen wären.
Maligne Gliome sind die häufigsten Neoplasien des Zentralen Nervensystems. Sie zählen zu den hypoxischsten Tumoren und entwickeln u.a. durch die Adaption an niedrige Sauerstoffbedingungen Apoptose-resistente Phänotypen. Darüber hinaus zeichnen sie sich durch schnelle Proliferation und ein diffuses, infiltratives Wachstum in das umliegende Neuropil aus, was eine vollständige Tumor-Resektion unmöglich macht. Entsprechend liegt die mediane Überlebenszeit nach der Diagnose trotz chirurgischen Eingriffs bei anaplastischen Astrozytomen (WHO Grad III) zwischen 18 und 20 Monaten und bei Glioblastomen (WHO Grad IV) zwischen 12 und 15 Monaten. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurden 17 Gliomzelllinien in einem in vitro-Anoxiemodell auf ihre Hypoxie-Sensitivität hin untersucht. Dabei wurde eine hohe Variabilität hinsichtlich der Hypoxie-Toleranz festgestellt, sowie die Tendenz zu einer ausgeprägter Anpassung an niedrige Sauerstoffverhältnisse, begleitet von der Fähigkeit, das mitochondriale Membranpotential (delta psi m) aufrecht zu erhalten. Der durch Hypoxie induzierte Zelltod wurde als Caspase-unabhängig und Nekrose-ähnlich charakterisiert. Apoptose wurde hingegen auch in den Hypoxie-sensitiven Zelllinien nach 48 stündigem Sauerstoffentzug nur in sehr geringem Ausmaß beobachtet. Funktionelle Analysen mit den synthetischen BH3-Mimetika HA14-1 und BH3I 2’, die selektiv Bcl-2 bzw. Bcl xL/Bcl-2 inhibieren, lassen darauf schließen, dass die für Gliomzellen typische Bcl-2- und Bcl xL-Überexpression eine Blockade des mitochondrialen Signalwegs verursacht und so entscheidend zur Apoptose-Resistenz der Zellen beiträgt. Der Todesligand TRAIL, der selektiv in Tumorzellen Zelltod aktiviert, ist ein vielversprechender Kandidat für neue Apoptose-induzierende Krebstherapien. Da jedoch einige Krebszelltypen einschließlich maligner Gliome weitgehend gegen TRAIL resistent sind, richtet sich das Interesse verstärkt auf kombinatorische Therapieansätze, die Tumorzellen für TRAIL resensitivieren sollen. Nur zwei von sechs untersuchten Gliomzelllinien reagierten auf die Behandlung mit TRAIL, wobei eine Korrelation zwischen Hypoxie- und TRAIL-Resistenz deutlich wurde und die Hypothese einer ausgeprägten Kreuzresistenz stärkt. Ein Zusammenhang zwischen TRAIL-Sensitivität und TRAIL-Todes- bzw. –Decoy-Rezeptor-Expression konnte indes nicht hergestellt werden. Der Vergleich von konventionellen Therapienansätzen (Gamma-Bestrahlung) mit neuartigen Wirkstoffklassen (BH3-Mimetika und Proteasomeninhibitoren) zeigte, dass Gamma-Bestrahlung lediglich in TRAIL-sensitiven Zellen synergistisch mit TRAIL wirkte, während die BH3-Mimetika den TRAIL-induzierten Zelltod sowohl in TRAIL-sensitiven als auch –resistenten Zellen signifikant erhöhten. Diese Befunde legen nahe, dass die hohen Bcl-2- und Bcl xL-Proteinlevel verschiedene Signalwege hemmen, die an den Mitochondrien konvergieren und dadurch die Apoptose- bzw. Therapie-Resistenz maligner Gliome steigern. Der Einsatz der Proteasomeninhibitoren MG132 und Epoxomicin erwies sich vergleichsweise als am effizientesten: Beide Substanzen vervielfachten p53-unabhängig den TRAIL-induzierten Zelltod in TRAIL-sensitiven Gliomzellen und reaktivierten darüber hinaus potent die TRAIL-induzierte Apoptose in den TRAIL-resistenten Zelllinien. Microarray- und semi-quantitative RT-PCR-Analysen ergaben eine potente transkriptionelle Aktivierung des TRAIL-Rezeptors DR5 und der Stress-induzierten Transkriptionsfaktoren CHOP und c-Jun. Weitere Untersuchungen mit Hilfe von chemischen Inhibitoren und RNA-Interferenz zeigten, dass die CHOP-unabhängige, JNK/c-Jun-Signalwegs-vermittelte Aktivierung von DR5 eine maßgebliche Rolle bei der Proteasomeninhibitor-induzierten Sensitivierung von Gliomzellen für TRAIL spielt. Zusammengenommen legen die vorgelegten Befunde nahe, dass neue Ansätze basierend auf TRAIL oder agonistischen TRAIL-Rezeptor-Antikörpern in Kombination mit Proteasomeninhibitoren oder BH3-Mimetika vielversprechende Strategien zur Überwindung der Therapieresistenz maligner Gliome darstellen.
Nicotinic acid has been used in the clinical treatment of elevated blood lipid levels for over 50 years. Although it has a beneficial effect on myocardial infarction and blood lipid profiles, its widespread use has been hampered by side effects such as skin rashes and a burning sensation on the upper body. Since elevated blood lipid levels, especially ones of VLDL and LDL cholesterol are a frequent indication and high risk factor for coronary and cardiac diseases, finding a compound with an enhanced pharmacological profile, still holding the desired effects, but without inconvenient side effects, is a very appealing aim to many pharmaceutical companies. These efforts have already produced two marketed drugs, Acipimox and Acifran, but they have not been able to overcome the restrictions already imposed on the treatment by nicotinic acid. Although proposed long before, in the year 2000 the gene for the nicotinic acid receptor in mouse PUMA-G was cloned, and in 2003 the discovery of the genes HM74 and HM74A followed, which comprise the homologous low and high affinity receptors for nicotinic acid in humans. The discovery of this G Protein-coupled receptor target allowed a more directed approach for the search of alternative compounds. This work is the first report of the heterologous overexpression of the high affinity GPCR gene HM74A in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The protein product, NAR1, was pharmacologically characterized, and displayed a binding affinity of 224.8 nM to its ligand nicotinic acid, showing a similar activity profile compared to those displayed in human tissue, which were determined to be 60 nM to 90 nM. Additionally, inhibitory constants (Ki) for Acifran and Acipimox were determined to be 4.5 µM and 50.5 µM, respectively. Furthermore, the total yield of NAR1 reached 42 pmol/mg membrane protein, which corresponds to 0.4 mg of receptor produced per liter yeast culture, opening up the perspective of large scale protein production to facilitate high throughput screening drug discovery efforts and structural studies. In addition, NAR1 could be solubilized in n-decyl-β-D-maltopyranoside and purified to homogeneity after immobilized metal affinity chromatography and a second affinity chromatography step on immobilized monomeric avidin, yielding a single peak on gel filtration, while the purified receptor was able to bind ligand, as shown in NMR Saturation Transfer Difference (STD) measurements. It could be shown that NAR1 is desensitized by β-arrestin 1 in vivo in confocal microscopy studies on HEK and BHK cells. This finding provides a native binding partner for the stabilization of the receptor upon solubilization and purification. Finally human β-arrestin 1 could be produced as a constitutively active variant, comprising residues 1-382 in Pichia pastoris and Escherichia coli. The purified protein was used for in vitro binding experiments and shown to be capable of interacting with NAR1. Although the interaction and formation of the complex was only possible to a limited extent, it leaves open the perspective of crystallizing NAR1 in its active conformation, bound to nicotinic acid and β-arrestin 1.
Ibuprofen gehört zu den am meisten verwendeten nichtsteroidalen Antiphlogistika (NSAIDs) und ist in niedriger Dosierung von 200-400 mg als sogenanntes OTC (over the counter) Analgetikum frei erhältlich. Obwohl es in den meisten Fällen als razemische Mischung aus S- und R-Ibuprofen verabreicht wird, ist mittlerweile auch das reine S-Ibuprofen (Dexibuprofen) als Medikament erhältlich. Während S-Ibuprofen ein potenter COX-Inhibitor ist, zeigt R-Ibuprofen in den klinisch relevanten Konzentrationen keine COX-Hemmung. Seit längerem ist bekannt, dass NSAIDs bei einer kontinuierlichen Einnahme über mehrere Jahre die Initiierung und Proliferation von Tumoren hemmen. Die Hemmung der Cyclooxygenase wird dabei als ein wichtiger Mechanismus für die antikarzinogene Wirkung angesehen, doch für viele NSAIDs sind auch schon COX unabhängige Mechanismen beschrieben worden. In der vorliegenden Arbeit wurde unter Verwendung zweier Tumorzelllinien mit unterschiedlicher COX-2 Expression und dem Einsatz von beiden Ibuprofen Enantiomeren untersucht, inwieweit COX unabhängige Mechanismen für die antikarzinogenen Effekte von S- und R-Ibuprofen verantwortlich sind. Sowohl die COX-2 defizienten HCT-15 als auch die COX-2 exprimierenden HCA-7 Zellen wurden durch Behandlung mit S- oder R-Ibuprofen in ihrer Proliferaton gehemmt. Dabei führte die Behandlung mit S- und R-Ibuprofen für 24 h zu einem G1-Zellzyklusblock und nach 72 h zu einem signifikanten Anstieg von apoptotischen Zellen, was im Western-Blot Assay durch eine verminderte Cyclin A und B Expression, einer erhöhten Expression des Zellzyklusinhibitors p27KIP1 und PARP-Spaltung bestätigt wurde. Dabei zeigten beide Enantiomere in den Tumorzellen eine gleich starke antiproliferative und apoptotische Wirkung. Eine Messung der intrazellulären S- und R-Ibuprofen Konzentrationen ergab außerdem, dass in den verwendeten Tumorzellen keine unidirektionale Konfigurationsinversion von R- zu S-Ibuprofen stattgefunden hat. In den COX-2 exprimierenden HCA-7 Zellen waren die antikarzinogenen Effekte von S- und R-Ibuprofen schwächer ausgeprägt als in den HCT-15 Zellen, was jedoch auf eine niedrigere intrazelluläre S- bzw. R-Ibuprofen Konzentration zurückzuführen war. Diese Ergebnisse zeigen auf jeden Fall, dass COX unabhängige Mechanismen bei der antikarzinogenen Wirkung von S- und R- Ibuprofen eine Rolle spielen. Dass auch COX abhängige Mechanismen an der antikarzinogenen Wirkung von Ibuprofen beteiligt sind, konnte in verschiedenen Studien gezeigt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Abnahme an PGE2 nach S-Ibuprofen Behandlung in den COX-2 exprimierenden Tumorzellen beobachtet. In welchem Ausmaß aber die COX Hemmung an der antikarzinogenen Wirkung von S-Ibuprofen in den COX-2 exprimierenden (Hemmung der PGE2 Synthese) und möglicherweise auch in den COX-2 defizienten Zellen (Anstieg an Arachidonsäure und daraus resultierend an Ceramid) beteiligt war, konnte anhand der Ergebnisse nicht geklärt werden. Es kann jedoch angenommen werden, dass S-Ibuprofen zumindest in den COX exprimierenden HCA-7 Zellen sowohl über COX Hemmung als auch über COX unabhängige Mechanismen antiproliferativ und apoptotisch wirkt. Auch im Tumormodell der Maus wurde bei einer täglichen i.p. Applikation von 15 mg/kg S- oder R-Ibuprofen eine Hemmung des Tumorwachstums beobachtet. Dabei betrug die unidirektionale Inversion von R- zu S-Ibuprofen ca. 54 %. Die Inkubation mit S- bzw. R-Ibuprofen führte in beiden Zelllinien außerdem zu einer Akkumulation des Tumorsuppressors p53, der an der Regulierung von Zellzyklus und Apoptose beteiligt ist. Daher wurde im zweiten Teil der Arbeit untersucht, ob S- und R-Ibuprofen die Induktion von Apoptose und Zellzyklusarrest über die Aktivierung des Transkriptionsfaktors p53 und dessen Zielgene vermitteln. Verwendet wurde eine HCT-116 Zelllinien, in der beide p53 Allele durch homologe Rekombination inaktiviert waren (p53-/-). Im Gegensatz zu den HCT-116 p53wt Zellen führte die Behandlung mit S- bzw. R-Ibuprofen in den p53 defizienten Zellen zu keinem signifikanten G1-Zellzyklusblock und auch die Apoptoserate war in diesen Zellen deutlich geringer als in p53wt Zellen. In vivo zeigte eine tägliche i.p. Injektion von 15 mg/kg S- bzw. R-Ibuprofen bei den Mäusen mit p53-/- Tumoren keine signifikante Wachstumshemmung. Im Vergleich dazu wurde die Proliferation der HCT-116 p53wt Tumore durch die R-Ibuprofen Behandlung signifikant gehemmt, und auch die mit S-Ibuprofen behandelten Tieren zeigten deutlich kleinere Tumore als die Gruppe mit den p53 defizienten Tumoren. Nach der Inkubation mit S- bzw. R-Ibuprofen wurde in beiden HCT-116 Zelllinien eine erhöhte Expression des Membranrezeptors p75NTR beobachtet. Außerdem führte die Behandlung mit S- bzw. R-Ibuprofen in den p53wt Zellen, im Gegensatz zu den p53 defizienten Zellen, zu einer vermehrten Bax Expression und einem Anstieg an Bax Protein in der mitochondrialen Fraktion. Schließlich wurde gezeigt, dass die erhöhte p53 Konzentration in den Zellen zumindest teilweise über den p75NTR Rezeptor reguliert wird, da durch die externe Zugabe des Liganden NGF die Ibuprofen induzierte Akkumulation von p53 in den HCT-116 p53wt Zellen wieder aufgehoben wurde. Da in vitro in den HCA-7 Zellen nicht nur die Behandlung mit S-Ibuprofen, sondern auch die mit R-Ibuprofen zu einer Hemmung der PGE2 Synthese führte, wurde im dritten Teil der Arbeit die Wirkung von S- und R-Ibuprofen auf die Expression der PGE-Synthasen und auf die mPGES-1 Aktivität untersucht. Dabei wurden HeLa Zellen verwendet, deren mPGES-1 Expression durch die Zugabe von IL-1ß und TNF-alpha stimmuliert wurde. Nach gleichzeitiger Inkubation mit S- bzw. R-Ibuprofen wurde keine Inhibierung der mPGES-1, mPGES-2 oder cPGES Expression beobachtet. Auch die Enzymaktivität von mPGES-1 wurde weder durch die Inkubation mit S-Ibuprofen noch mit R-Ibuprofen beeinflußt. Die bei der Inkubation mit R-Ibuprofen auftretende Hemmung der PGE2 Synthese konnte in der vorliegenden Arbeit nicht abschließend erklärt werden und bietet somit einen interessanten Ansatzpunkt für weitere Untersuchungen.
Das genetische Material der Zellen besteht aus Molekülketten der Desoxyribonukleinsäure (DNA), die ein Träger der Erbinformation ist. In normalen Körperzellen wird die Erbinformation der DNA in eine andere Molekülkette, die sogenannte Ribonukleinsäure (RNA), übersetzt. Die RNA reguliert die Bildung von neuem Protein in der Zelle. Dass die RNA nicht bloß ein „Stempel“ ist, der die Informationen der DNA weitervermittelt, darin sind sich die Experten heute einig. RNA-Moleküle können Informationen speichern, katalytische Aktivitäten entfalten, sich perfekt tarnen, und sie regulieren auch als Produkt ihre eigene Synthese. Manche Viren enthalten ebenfalls RNA (oder DNA) und können so den Produktionsapparat der Zelle täuschen. Erkenntnisse über die Wechselwirkung dieser RNA mit natürlichen und synthetischen Liganden können zur Suche nach potentiellen Wirkstoffen beitragen. Nukleinsäuren sind lineare Biopolymere von grundlegenden Untereinheiten, die Nukleotide genannt werden und aus Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G), Urazil (U), und Thymin (T) zusammengesetzt sind. Sie sind jedoch in der Lage sich zu falten und so eine Doppel-Helixstruktur auszubilden. Diese besteht größtenteils aus den bekannten "Watson-Crick-Basenpaaren" (G-C und A-U oder A-T), die zur Stabilität der Struktur beitragen, sowie aus den weniger stabilen G-U-Paaren. Durch die Wechselwirkung zwischen verschiedenen Sekundärstrukturelementen entstehen Tertiärstrukturelemente, deren Struktur und Dynamik oft nur schwer experimentell zu bestimmen sind. Fortschritte in der RNA-Strukturanalyse wurden durch Röntgenkristallographie und Kernresonanzspektroskopie (NMR) möglich. Durch die Röntgenkristallographie wurden viele RNA-Eigenschaften festgestellt. Allerdings besteht keine Kristallstruktur für alle mögliche Einzelnfaser-RNA-Haarnadeln, weil diese immer dazu neigen, in eine linearen doppelte Faserform zu kristallisieren, die geringe biologische Bedeutung hat. Außerdem wurde mit Hilfe der NMR-Spektroskopie das dynamische Verhalten von RNA, z.B. Entfaltungsprozesse bei ansteigender Temperatur, beobachtet. Jedoch erlauben diese experimentellen Daten oft keine direkte mikroskopische Beschreibung der molekularen Prozesse. Molekulardynamik (MD)-Simulationen von biologischen Systemen ermöglichen es hingegen, diese Prozesse in atomischem Detail zu untersuchen. Die MD-Simulation beschreibt ein molekulares System auf atomarer Ebene mit Hilfe der klassischen Mechanik. Kräfte werden von empirischen Potentialen abgeleitet. Sie liefern zeitabhängige Trajektorien, die sich aus den Newton'schen Bewegungsgleichungen ergeben. Durch verbesserte Computerleistung, bessere Kraftfelder, und neu entwickelte genauere Methoden stimmen heutzutage MD-Simulationen von RNA mit experimentellen Daten immer besser überein. In meiner Doktorarbeit wurden MD-Simulationen durchgeführt um die Dynamik, die Struktur und insbesondere die Stabilität von RNA-Hairpins theoretisch zu beschreiben, um so ein erweitertes Verständnis für die dynamischen Vorgänge zu erhalten. Auch der SFB 579 der Universität Frankfurt beschäftigt sich mit RNA-Systemen. Erforscht wird unter anderem der D-Loop des Coxsackievirus B3 (CVB3), der Virenmyocarditis verursacht. Die Interpretation dieser experimentellen Daten wird durch MD-Simulation möglich. In dieser Arbeit wurden das GROMACS Software-Paket und das AMBER Kraftfeld verwendet, um das strukturelle, dynamische und thermische Verhalten der RNA-Hairpins mit Hilfe von MD-Simulationen auf atomarer Ebene zu untersuchen. Betrachtet wurden die 14-mer RNA-Hairpins, uCACGg und cUUCGg. Die verfügbaren NMR-Strukturen zeigen, dass das uCACGg-Tetraloop auffallend ähnlich in der gesamten Geometrie und den Wasserstoffbindungen zu der experimentellen Struktur des cUUCGg-Tetraloop ist, obwohl die schließende Basenpaarsequenz der beiden Tetraloops unterschiedlich sind. Trotz beachtlicher struktureller Ähnlichkeit unterscheiden sich allerdings die uCACGg und cUUCGg Tetraloops in Funktionalität und Thermostabilität. Zunächst orientiert sich unser erstes Bemühen an der Frage nach einem guten Modell für RNA-Hairpins und Simulationsbedingungen, um die zu untersuchenden RNA-Hairpins in Wasser möglichst realitätsnah zu simulieren. Erstens werden drei Versionen des biomolekularen AMBER-Kraftfelds geprüft, indem man die 60 ns Simulationen des 14-mer uCACGg-Hairpins durchführt. Die simulierten strukturellen Eigenschaften und Atomfluktuationen zeigen hohe Ähnlichkeiten in den drei Kraftfeldern. Darüber hinaus stimmen die von MD-Simulationen berechneten Atomkernabstände mit den experimentellen NMR-Daten gut überein. Die gute Übereinstimmung zwischen den Simulationen und den strukturellen NMR Daten belegt die Fähigkeit des AMBER-Kraftfelds zur Beschreibung der strukturellen Eigenschaft von kleinen RNA-Hairpins. Anschließend werden die Einflüsse der Methoden, welche die langreichweitigen, elektrostatischen Wechselwirkungen beschreiben, auf die strukturellen Eigenschaften untersucht. Insbesondere werden die Ergebnisse der Reaktionfeld-Methode mit denen der Particle Mesh Ewald (PME)-Methode verglichen. Es zeigt sich, dass die PME-Methode die elektrostatischen Wechselwirkungen am besten beschreibt, auch wenn die Simulationen der beiden Methoden Ähnlichkeit in der Struktur-Stabilität und der Atomfluktuation bei niedriger Natriumkonzentration aufweisen. Drittens wird der Kationseffekt auf die RNA-Stabilität untersucht. Betrachtet wurden zwei unterschiedliche Kationen (ein- und zweiwertig) und verschiedene Konzentrationen. Die Simulationen weisen darauf hin, dass sich die Metallionen in der Affinität zum RNA-Hairpin unterscheiden, wenn Na+ und/oder Mg2+ als Gegenionen verwendet werden. Weiterhin wird gezeigt, dass sich die bevorzugten Positionen der Na+-Ionen in der großen Furche (major groove) des RNA-Hairpins befinden. Insbesondere die Anlagerungsort der Na+-Ionen liegen in der Nähe des schließenden Basenpaar U5-G10. Im Vergleich zu Na+-Ionen lagern sich Mg2+-Ionen sowohl an die RNA-Basen U3, A4-U11, und die Phosphat-Gruppe, als auch an das schließenden Basenpaar U5-G10 an. Bestätigt werden die Modelle und Simulationsbedingungen durch den Vergleich von Parametern, die sowohl experimentell als auch durch Simulationen ermittelt werden können. Ferner erlauben MD-Simulationen Einblick in das System, indem sie detallierte Konformations- und andere Verteilungen liefern. In der vorliegenden Arbeit wurden die Einflüsse der Loopsequenz und des schließenden Basenpaares auf die Verteilung der Konformationen, der internen Bewegungen, und auf die Thermostabilität von zwei RNA-Hairpins mit Hilfe dieser Modelle untersucht. Zunächst wurden die strukturellen Eigenschaften bei Raumtemperatur ausgewertet. Die starken strukturellen Ähnlichkeiten und die gute Übereinstimmung mit NMR-Daten bestätigen die Hypothese, dass die zwei Tetraloops zur gleichen “erweiterten” RNA-Familie gehören. Diese zwei Hairpins haben ähnliche Lösemittelzugängliche Oberflächen (solvent accessible surface), wobei deren Lösemittel zugänglichen funktionellen Gruppen unterschiedlich sind. Weiterhin weist das uCACGg-Hairpin eine stärkere Tendenz auf Wasserstoffe abzugeben als das cUUCGg-Hairpin, was in den unterschiedlichen Bindungsaffinitäten zwischen diesen Hairpins und der viralen Protease begründet liegt. Darüber hinaus wurde der Faltungs- und Entfaltungsprozess mit Hilfe der Replica-Exchange-Molekulardynamik-Simulationen untersucht. Diese Untersuchung zielt auf das bessere Verständnis der unterschiedlichen Thermostabilität der Hairpins, indem sie die möglichen Zwischenprodukte im atomaren Detail liefern. Sowohl experimentell als auch von den MD-Simulationen ergibt sich eine Differenz in den Schmelztemperaturen der beiden Hairpins von ungefähr 20 K. Allerdings sind die von MD beobachteten Schmelztemperaturen 20 % höher als die von Experiment zu ansehende Wert. Die Ergebnisse machen deutlich, dass die Schmelztemperaturdifferenz nicht auf die Unterschiede in der Sequenz, in der Struktur, oder in der Dynamik der Loops zurückführen sind, sondern auf die Unterschiede der Basenpaaren in den Stämmen. Weiterhin wird gezeigt, dass sich das uCACGg-Hairpin einerseits kooperativ entfaltet, und die Entfaltung des cCACGg-Hairpins anderseits weniger kooperativ stattfindet. Um die schnelle interne Dynamik der uCACGg- und cUUCGg-Hairpins zu untersuchen, erlauben die Simulationen von 50 ns eine akurate Beschreibung der schnellen internen Bewegung der RNA-Hairpin, obwohl der den Hairpins zugängliche Konformationsraum nicht vollständig abgedeckt wird. Die NMR-Relaxationsparameter, die mit Hilfe der MD-Simulationen zurückgerechnet wurden, bestätigen das Modell und die Simulationsbedingungen der MD-Simulationen. Im Hinblick auf die Übereinstimmung kann man den besten Ansatz zur Berechnung der NMR-Ordnungsparameter bestimmen. In dieser Arbeit wurden drei verschiedene Ansätze angewandt, nämlich das Fitting von 100 ps auf modellfreiem Ansatz nach Lipari-Szabo, equilibrium average, und das Gaussian Axial Fluctuation (GAF)-Modell. Die zwei letzteren können nur qualitativ mit den experimentellen Daten übereinstimmen. Die NMR-Ordnungsparameter können mit Hilfe des Modells von Lipari-Szabo richtig ermittelt werden, wenn sich die interne Bewegung in kleineren Zeitskalen als zur Gesamtbewegung vollzieht. Vorausetzung für die Berechnung dieses Modells ist aber, dass das Fitting der internen Korrelationsfunktionen nur auf den ersten Teil von 100 ps der Korrelationsfunktionen eingesetzt wird. Die berechneten Ordnungsparameter deuten auf ein unterschiedliches Verhalten der beiden Hairpins besonders im Loop-Bereich hin. Die konformationelle Umordnung, die beim UUCG-Loop beobachtet wurde, tritt beim CACG-Loop nicht ein. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es durch den Einsatz von MD Simulationen ermöglicht wird, die strukturellen und dynamischen Eigenschaften der RNA-Systeme auf atomarer Ebene zu untersuchen. Als Schlussfolgerung zeigt diese Doktorarbeit, dass sich die Studie der konformationell Dynamik der RNA-Systeme durch die Kombination aus MD-Simulation und NMR-Spektroskopie sowie der Leistungsfähigkeit der MD-Simulationen, die die interne Bewegungen deutlich beschreiben können, untersuchen lässt.
Das Non-LTR-Retrotransposon TRE5 A.1 aus Dictyostelium discoideum integriert positionsspezifisch 48 ± 2 bp oberhalb von tRNA Genen. Es konnte gezeigt werden, dass TRE5 A.1 Wechselwirkungen zwischen ORF1p und dem RNA Polymerase III spezifischen Transkriptionsfaktor DdTFIIIB nutzt, um seinen Integrationsort zu identifizieren. Damit wurden in dieser Arbeit erstmals direkte Proteininteraktionen zwischen einem Non-LTR-Retrotransposon und Komponenten des Chromatins zur Definition des Integrationsortes nachgewiesen. DdTFIIIB wurde durch Blastp Suchen in silico identifiziert. Wie auch in S. cerevisiae wird innerhalb des D. discoideum TFIIIB Komplexes eine stabile Interaktion zwischen der N terminal gelegenen Helix H2 von DdTBP und dem C Terminus von DdBrf1 gebildet. Es konnte sowohl mittels bakterieller Zweihybrid Versuche als auch durch biochemische Pulldown Experimente gezeigt werden, dass TRE5 A kodiertes ORF1 Protein (ORF1p) mit allen drei Untereinheiten von DdTFIIIB in Wechselwirkung tritt. Am ausgeprägtesten war diese mit DdTBP. Durch Mutations und Deletionsanalysen wurden die Kontaktflächen auf DdTBP und ORF1p näher charakterisiert. Demnach interagiert ORF1p über seinen N Terminus (AS 112 158) mit DdTBP, während die C terminalen 40 Aminosäuren sowohl von DdBrf1 als auch von ORF1p beansprucht werden und beide Proteine vermutlich um diese Bindestelle konkurrieren. DdTBP bindet hauptsächlich mit der C terminalen  Helix H2’ an ORF1p. Eine wichtige Position für diese Interaktion ist Ser195 auf DdTBP. Obwohl HsTBP selbst nicht mit ORF1p interagiert, kann die Einführung der Helix H2’ aus DdTBP in das humane Protein die Interaktion mit ORF1p wiederherstellen. Interaktionen zwischen DdTFIIIB und TRE5 A ORF2p wurden nicht detektiert, allerdings konnte ein vermutliches Dimerisationsmotiv in ENp entdeckt werden. Für weiterführende Versuche, die die Relevanz der hier gefundenen Proteininteraktionen für die Target Identifizierung in D. discoideum Zellen untersuchen soll, wurden in dieser Arbeit zwei monoklonale Antikörper gegen DdTBP und einen zufällig entdeckten „Epitop Tag“ isoliert und charakterisiert. Die genaue Rolle von ORF1p während der Retrotransposition von TRE5 A.1 ist noch ungeklärt. Erste grundlegende Einblicke weisen darauf hin, dass ORF1p Teil des Präintegrationskomplexes von TRE5 A sein muss.
Two types of proteins transport ions across the membrane – ion channels and ion pumps. Ion pumps transport ions against their electrochemical gradient by co-transporting another ion or a substrate molecule through a concentration gradient or by coupling this process to an energy source like ATP. Those that couple ATP hydrolysis to ion transport are called ion motive ATPases and can be classified as ‘V’, ‘F’ and ‘P’ types. In this thesis, two sub-classes of P-type ATPases, PIIIA and PIB were studied. Attempts were made to over-express and crystallize the plant proton pump AHA2 (a PIIIA-ATPase). Also, the two putative copper transporting ATPases, CtrA3 (CopB-like) and CtrA2 (CopA-like) from Aquifex aeolicus (both PIB pumps) were over-expressed in E. coli and characterized. PIIIA-type pumps transport protons across the membrane and are found exclusively in plants and fungi, and probably some archaea. One of the most characterized proton pump biochemically is the A. thaliana proton pump AHA2. An 8Å projection map of this enzyme is already available (Jahn 2001). PIBATPases, also called CPX type pumps transport heavy metal ions such as Cu+, Cu2+, Zn2+, Pb2+, Cd2+, Co2+ across biological membranes and play an important role in homeostasis and biotolerance of these metals. CopA and CopB are two such proteins that transport copper across cell membrane found in many prokaryotes. CopB-like proteins are found almost exclusively in bacteria, with CPH sequence motif, while CopA-like proteins have CPC sequence motif, also found in eukaryotic copper transporters including human ATP7A and ATP7B. CopB extrudes Cu2+ across the membrane. CopA is activated by and transports Cu+ but the direction of transport is debated. Attempts were made to over-express the plant proton pump AHA2 in yeast Pichia pastoris. However, the yeast expressed only a truncated protein, which could not be used for further studies. It can be concluded that P. pastoris strain SMD1163 is not a good host for expression of AHA2. Focus was then shifted to AHA2 that has been over-expressed and purified from S. cerevisiae strain RS72. Growth and purification protocols had to be changed from published methods because of laboratory constraints and this probably had an effect on the protein produced. The protein purified from S. cerevisiae could not be crystallized reproducibly for structural studies by electron microscopy. CtrA3 was expressed in E. coli and purified using Ni2+-NTA matrix. Like CopB of A. fulgidus (Mana Capelli 2003), it was active only in the presence of Cu2+ and to some extent in Ag+. The protein was maximally active at 75°C, at pH 7 and in presence of cysteine. Lipids were essential for the activity of CtrA3. However, when the protein was purified in Cymal-6, CtrA3 could not hydrolyze ATP, even when lipids were added to the reaction mixture. For reconstitution of CtrA3 into liposomes for 2D crystallization, several lipids were tested. To screen the lipids compatible for protein incorporation, CtrA3 was dialyzed with different lipids at a high lipid-to-protein ratio of 10:1 and centrifuged by sucrose density gradient. Protein incorporated in lipids localized with liposome fraction in the gradient. Most of the CtrA3 was incorporated into DPPC with no aggregation. This lipid was used for reconstitution of CtrA3 at low LPRs, and at an LPR of 0.3-0.5, the protein formed 2D crystals. A NaCl concentration of 50mM was necessary for the formation of crystals. However, salt removal by dialysis prior to harvesting was essential for obtaining wellordered lattices of CtrA3. Addition of preservatives like trehalose and tannin or direct plunging in liquid ethane for cryo-microscopy destroyed the crystal lattice. Similar to CtrA3, the gene responsible for expression of CtrA2 was amplified from genomic DNA of A. aeolicus and expressed in E. coli and purified by Ni2+-NTA. Functional characterization of CtrA2 was done by analyzing ATP hydrolysis activity of the enzyme. Similar to CopA of A. fulgidus (Mandal 2002), CtrA2 was activated in the presence of Ag+ and to some extent, Cu+. It is possible that both the copper ATPases of A. aeolicus have different ion selectivity- CtrA3, specific for Cu2+ and CtrA2, specific for Cu+. Maximal activity of CtrA2 was also at 75°C. Cysteine was essential for activity of CtrA2, but the protein was not dependent on addition of lipids for activation. Reconstitution of CtrA2 was done similar to CtrA3 for screening of lipids for 2D crystallization. Of the lipids tested, DOPC reconstituted the protein best. However, screening at low LPRs did not yield any crystals. Even though both CtrA3 and CtrA2 are similar heavy metal transporting Ptype ATPases from the same organism and have 36% identity, they behaved completely different in their expression levels in E. coli, purification profiles, activity and reconstitution in lipids.
Purification and characterization of heterologously produced cannabinoid receptor 1 and G proteins
(2007)
G protein coupled receptors form the largest group of transmembrane proteins, which are involved in signal transduction and are targeted directly or indirectly by 40-50% of the drugs in the market. Even though a lot of biochemical and pharmacological information was acquired for these receptors in the past decades, structural information is still insufficient. G protein coupled receptors are expressed in a very minute scale in the tissues. Purification of G protein coupled receptors, in amounts needed for structural studies, from native tissue is tedious and almost impossible. To overcome this first hurdle of insufficient protein, several heterologous protein expression systems are being used. Another difficulty in structural determination of a G protein coupled receptor is that it is a membrane protein. Membrane proteins are difficult targets for structural studies. One of the possible reasons is the little hydrophilic surface area on the membrane protein, reducing the chances of crystal contact between the molecules. The present work is an attempt to investigate possible ways to overcome these problems. Aim of the project was to use G proteins to increase the hydrophilic area of the G protein coupled receptor. G protein is a physiological partner to the G protein coupled receptor which makes the complex functionally relevant. In the present work five G alpha proteins were purified to homogeneity by a two step purification using metal affinity and ion-exchange chromatography. The G alpha subunits purified were tested for their detergent susceptibility. It was found that only some G proteins were active in the presence of detergent. Observation from contemporary reports also suggest that the G alpha proteins expressed in Escherichia coli, alone may not be sufficient to bind to the G protein coupled receptors in solution. So the project was extended towards expressing a G protein coupled receptor which was reported to exist in a complex with the G proteins, in the cells. Purifying such a functional complex could be more beneficial to use for crystallization. Cannabinoid receptors were chosen for heterologous expression and purification. Production of recombinant cannabinoid receptor 2 was investigated in Pichia pastoris. The protein obtained was highly heterogenous. There were several oligomeric forms as well as degradation products in the cell membranes. Most of the protein was lost in the purification steps leading to a poor yield. Several oligomeric forms and other impurities were still present in the protein sample after purification. Alternatively, a baculovirus mediated insect cell expression system was investigated, to produce the receptors. Cannabinoid receptor 1 was investigated in insect cell expression system because of its better biochemical understanding and pharmacological importance than cannabinoid receptor 2. Cannabinoid receptor 1 was produced in two forms, a full length and a distal carboxy terminal truncated version. All the several gene constructs made could be expressed in the Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells. Expression levels (Bmax) for the constructs with a decahistidine tag at the amino terminus and Strep-tagII at the carboxy terminus were 40 pmol/mg and 53 pmol/mg respectively, for full length and truncated versions. These expression levels are 2 fold higher than the levels reported till now in the literature. As was quite evident from previous experiences of other research groups, purification of this receptor was a challenge. Protein purified from immobilized metal affinity chromatography (Ni-nitrilo tri acetate)(Ni-NTA) was not even 50% pure. A second purification by immobilized monomeric avidin or Streptactin agarose, making use of Biotag and StreptagII respectively, drastically reduced the protein recovery. Later on, purification of receptor was investigated on different metal chelating resins. His-Select, a Ni-NTA based matrix from Sigma, with much lesser density than Ni-NTA from Qiagen, showed a better purification profile. Purification was optimized to get 80% homogeneity but with low yield (20%). Further efforts are needed to improve the yield and purity of the receptor, to use it for crystallization. Cannabinoid receptors are known to exist in a precoupled form to G proteins in the cells. The existence of such precoupled forms of the receptor was investigated using the fluorescence techniques. Guanosine-5-triphosphate binding assay on the cell membranes, in the absence of agonists confirmed the active precoupled form of the receptor. It was found that it is possible to co-immunoprecipitate the complex. These results show that the truncated cannabinoid receptor can be produced in functional form in insect cells in much higher yields than reported. This receptor exists as a complex with G proteins even in the absence of ligands. It was also shown that the receptor/G protein complex can be coimmunoprecipitated. Further work is required to investigate the possibility of purifying this complex to use it for co-crystallization.
CSDH gehören zu den häufigen Krankheitsbildern in der Neurochirurgie, vor allem bei Patienten mit hohem Lebensalter. Ebenfalls weit verbreitet ist die Einnahme von hämostaseologisch wirksamen Substanzen. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss davon auf die Revisionsoperationsrate und das Outcome von Patienten mit CSDH, sowohl funktionell als auch in der QoL, zu untersuchen. Medizinische Daten von 144 Patienten, mit besonderer Berücksichtigung von hämostaseologischen Risikofaktoren und präoperativer Medikation, wurden zusammen mit der mRS, dem Barthel Index, der SA-SIP 30, einer Selbsteinschätzung und der Revisionsoperationsrate erfasst. Diese Daten wurden in uni- und multivariaten Tests analysiert. Die präoperative Einnahme von hämostaseologisch wirksamen Medikamenten hat keinen signifikanten Einfluss auf das Outcome oder die Revisionsoperationsrate von Patienten mit CSDH. Mussten Patienten mit Gerinnungsfaktoren substituiert werden, hatten sie jedoch ein signifikant schlechteres Ergebnis in der mRS, allerdings ohne einem erhöhten Rezidivrisiko zu unterliegen. Patienten mit einer Revisionsoperation weisen ein signifikant schlechteres Ergebnis in der QoL und der Selbsteinschätzung auf als die Patienten ohne. Die multivariate Untersuchung der Revisionsoperationen zeigt ein signifikant erhöhtes Rezidivrisiko bei einer frischen Einblutung in das CSDH. Außerdem sind mRS, Barthel Index und QoL signifikant schlechter bei Patienten mit einer anamnestisch erhöhten eigenen Blutungsneigung. Eine solche Blutungsneigung ist zudem von Signifikanz für ein schlechteres Ergebnis beim Barthel Index in der multivariaten Analyse. Für ein ungünstiges Ergebnis in der mRS sind ein hoher INR und eine niedrige AT-Aktivität signifikante Parameter in den multivariaten Tests. Patienten mit einem erinnerlichen zweiten Trauma geben ein signifikant schlechteres Outcome in der QoL und der Selbsteinschätzung an. Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass die Art der operativen Therapie keinen statistisch signifikanten Einfluss auf das Outcome oder die Rezidivrate ausübt. Von besonderem Interesse waren die Ergebnisse in den multivariaten Tests und bei der QoL, da diese Aspekte bisher von keinem Autor berücksichtigt worden waren. Außerdem wäre es wünschenswert, wenn in Zukunft einheitliche Definitionen von Rezidiv, Koagulopathie und Outcome gebraucht würden, um einen internationalen Vergleich zu erleichtern.
G-protein coupled receptors (GPCRs) comprise the largest superfamily of cell surface receptors and possess a signature motif of seven transmembrane helices. The endothelin B (ETB) receptor is a member of rhodopsin like GPCR family. It plays an important role in vasodilation and is found in the membranes of the endothelial cells enveloping blood vessels. Knowledge of the three-dimensional structure of G-protein coupled receptors in general would significantly add to our understanding of their molecular mechanisms and would be useful in the search for new specific drugs. However, three-dimensional structural analysis will require milligram quantities of pure and homogeneous protein. This dissertation is a study of the production, biochemical characterization and preliminary structural studies of the human ETB G-protein coupled receptor. The present work aimed at elucidating the structure and mechanistic details of function of the receptor by using a combination of X-ray crystallographic and NMR methods for collecting structural data. To obtain homogenous and monodisperse receptor protein preparation for structural and functional studies, we implemented the baculovirus expression system for the production of ETB receptor for the present work. The two step affinity purification ensured capture of full-length receptor. Silver stained SDS-PAGE of the purified receptor-ligand complex indicated greater than 90% protein purity. Based on previous reports, we used the high affinity ligand (endothelin -1) binding to the receptor for co-crystallization of receptor-ligand complex by locking the receptor in the activated conformation. As a prerequisite for 3D crystallization trials, the stability of the detergent solubilized receptor-ligand complex was assessed with respect to pH, temperature and time. Receptor-ligand complex did not show any degradation and aggregation over 6 days at 4°C and 18°C. Interestingly, change of pH suggested that receptor-ligand complex is unstable at lower pH due to possible charge induced conformational changes. In our work, we introduced the idea of using fluorophore labeled ligand for simple visual recognition of the receptor-ligand complex during purification and crystallization. On the other hand, we alternatively used biotinylated endothelin-1 to produce an adequate amount of ligand bound receptor complex, thus ensuring homogeneity of the purified complex for use in structural studies. Thus far, preliminary crystals have been obtained for both the unlabelled ET-1 and fluorophore labeled ET-1 complexed with ETB receptor. Moreover, we performed the systematic investigation of the protein/peptide binding partner for the receptor-ligand complex with the chief aims of stabilizing structure and increasing the possibilities of 3D-crystal contacts. Thus subsequent to formation of receptor-ligand complex, the additional in vitro formation of a ternary arrestin-receptor-ligand complex was also attempted for use in structural studies. We successfully demonstrated that arrestin mutant (R169E) forms a tight complex with ETB receptor regardless of its phosphorylation state. A second approach to get insight into the ETB receptor ligand binding site relied on the use of spin isotope labeled ET-1 ligand peptide by employing solid state MAS NMR method. Preliminary data provided compelling evidence that the C-terminal region of the peptide is immobilized in an ordered environment and presumably bound to the receptor. This indicates that the approach is feasible, although there are difficulties in sample preparation for further spectral measurements and data collection which are currently being discussed in ongoing investigations. At this point of our research work, we initiated a collaborative effort to obtain high yields of pure, active receptor without post translational modifications, from an E. coli cell lysate based in vitro expression system. We successfully optimized the production of homogenous and monodisperse endothelin B receptor in mg amounts. Thus this could potentially provide an alternative source of high quality receptor production in large quantities for immediate crystallization trials. Thus we hope that the results from these investigations can be applied in a more general sense to the production and crystallization of other G protein-coupled receptors.