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Im Zentrum dieser Arbeit stand die Umsetzung der Thematik Arzneimittel für den Chemieunterricht an allgemein bildenden Schulen. Ein Hauptziel war es, die wichtigsten Bereiche des Themenkomplexes Arzneimittel für den Chemieunterricht zu strukturieren und für einen problemorientierten sowie alltags- und lebensweltbezogenen Experimentalunterricht zu erschließen. Dabei sollten Versuche entwickelt werden, die einerseits grundlegende Aspekte des Themas Arzneimittel exemplarisch behandeln und mit deren Hilfe sich andererseits fachliche Inhalte der Schulchemie anwendungsorientiert erarbeiten lassen. Dazu wurden geeignete Modellversuche entwickelt und die oft sehr komplexen fachlichen Inhalte entsprechend didaktisch reduziert. ...
Isolation des Carotinoidbiosynthese Genclusters aus Flavobacterium spec P99-3. Das isolierte Gencluster von 15 kb Größe zeigt 7 offene Leseraster, die auf Grund ihrer Sequenzhomologie Carotinoidgenen zugeordnet werden können oder anhand von Komplementationen in einem heterologen Expressionssystem in E. coli mit anschließender HPLC-Analayse eine eindeutige Funktion im Biosysnthesewegs des selten vorkommenden Myxols zugeordnet werden kann.
1. Die Deletionsderivate der Kompetenzproteine PilN und PilQ wurden als Fusionsproteine mit dem Maltosebindeprotein überproduziert, über eine Amylosesäule aufgereinigt und in nativer Form für die Generierung von polyklonalen Kaninchen-Antikörpern eingesetzt. 2. Unter Einsatz der spezifischen alpha-PilN- und alpha-PilQ-Antikörpern konnte das PilN-und PilQ-Kompetenzprotein im Rohextrakt von T. thermophilus HB27 detektiert werden. 3. Die Überprüfung bereits vorliegender Antikörper gegen die Kompetenzproteine PilM, PilW und PilA4 ergaben, dass es sich hier ebenfalls um spezifische Antikörper handelt. 4. Mittels Western-Blot-Analysen unterschiedlicher Mutanten konnte gezeigt werden, dass die Markerinsertion in den Genen pilM, pilN, pilO und pilW zu keinem polaren Effekt der jeweils stromabwärts gelegenen Gene führt. 5. Analysen der subzellulären Lokalisation der Kompetenzproteine ergaben, dass PilM und PilN ausschließlich in der inneren Membran lokalisiert sind, während PilW, PilQ und PilA4 sowohl in der inneren als auch äußeren Membran detektiert wurden. Die größte Menge an PilQ wurde allerdings in der äußeren Membran gefunden. 6. Mutantenstudien ergaben, dass eine pilQ-Mutantion zur Abwesenheit von PilW und PilA4 in der äußeren Membran führte. Ebenso führte eine pilW-Mutantion zu Abwesenheit von PilQ und PilA4 in der äußeren Membran. Diese Ergebnisse indizieren Interaktionen zwischen PilW, PilQ und PilA4. 7. In der pilD-Mutante wurde kein PilA4 mehr in der äußeren Membran detektiert. Dieser Befund untermauert den Schluss, dass es sich bei PilD um eine PilA4 prozessierende Präpilin-Peptidase handelt. 8. Western-Blot-Analysen der gereinigten Pili führen zu dem Schluss, dass das Kompetenzprotein PilA4 die strukturelle Untereinheit der Pilus-Struktur repräsentiert. Das Sekretin-ähnliche Kompetenzprotein PilQ wurde ebenfalls in der gereinigten Pilus-Fraktion detektiert und könnte Teil der globulären Struktur an den Pilusenden sein. 9. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Dünnschnitten durch T. thermophilus HB27 Zellen ließen den ungewöhnlichen Aufbau der Zellperipherie erkennen. Zwischen der inneren Membran (8 nm dick) und der äußeren Membran (8 nm dick) befand sich neben dem dünnen Peptidoglykan (8 nm dick) eine 40 nm dicke kontrastarme Schicht, die radial von Fäden durchzogen schien. 10. Die Dünnschnitte wurden für Immunogoldmarkierungen mit alpha-PilQ-Antikörpern eingesetzt, um PilQ zu detektieren. Allerdings konnte in den elektronenmikroskopischen Analysen keine spezifische Goldmarkierung nachgewiesen werden. Ursache hierfür könnte die Unzugänglichkeit des nativen PilQ in den Dünnschnitten sein. 11. Die Immunogoldmarkierung des Gefrierbruchs von ganzen Thermus-Zellen mit alpha-PilQ-Antikörpern führte zur Detektion von PilQ-haltigen Ring-ähnlichen Strukturen in der äußeren Membran. Der Durchmesser des PilQ-Komplexes mit 17 - 18 nm ist mit denen der aus Sekretinen bestehenden Ringsystemen anderer Organismen vergleichbar. 12. In den T. thermophilus HB27 Membransolubilisaten wurde ein >669 kDa PilW-PilQ-Komplex identifiziert. Dieser Komplex ließ sich optimal mit n-Dodecyl-beta-D-maltosid (1 mg Detergenz pro mg Membranprotein) aus der Membranfraktion solubilisieren. Stabilitätsuntersuchungen ergaben, dass dieser Komplex bei 4 °C einige Tage, bei Raumtemperatur und bei Anwesenheit von 1 M NaCl einige Stunden stabil ist. 13. Mittels einer DEAE-Austausch-Chromatographie konnte der PilW-PilQ-Komplex angereichert werden. Die Western-Blot-Analysen ergaben, dass das Kompetenzprotein PilM mit dem PilW-PilQ-Komplex koeluiert. 14. In der MALDI-TOF-Massenspektrometrie konnte das Kompetenzprotein PilQ und Untereinheiten der DNA-gerichteten RNA-Polymerase, ein Membran-Lipoprotein sowie Energie-Stoffwechsel-Proteine in der angereicherten PilW-PilQ-haltigen Fraktion nachgewiesen werden. Diese Proteine müssen auf die Beteiligung an der Transformation untersucht werden. 15. Immunelektronenmikroskopische Analysen des angereicherten PilW-PilQ-Komplexes führten zur Identifizierung von Ringstrukturen mit einem Durchmesser von 17 nm. Dieser Durchmesser entspricht den Sekretin-Komplexen von P. aeruginosa (18,3 ± 1,2 nm) bzw. N. gonorrhoeae (15,5 - 16,5 nm) und dem Durchmesser der über Immunogoldmarkierung detektierten PilQ-haltigen Strukturen in T. thermophilus HB27.
G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute an important class of integral membrane proteins that are involved in several signaling pathways. About 50% of the currently available drugs are targeted against these receptors and high-resolution structures of these receptors will be of immense importance from the perspective of designing specific and potent drugs. However, structure determination of these receptors and of membrane proteins in general, has been a very challenging task till date. A major limitation in the structure determination of these proteins is that they are present in minute amounts in the native tissues and therefore, they must be produced heterologously. Additionally, crystallization of GPCRs is difficult owing to their flexible nature and limited hydrophilic surface area available for crystal contacts. The aim of my Ph.D. thesis work is two fold, first, to address the problem of GPCR crystallization by using a fusion protein complex approach and second, to tailor Rhodobacter sphaeroides as an expression system for the heterologous production of GPCRs. In the first approach, R. sphaeroides was used as an expression system to generate a fusion protein complex of the photosynthetic reaction center (RC) with a GPCR, expecting that such a complex would be easier to crystallize than the receptor alone. The notion behind this approach is that the RC will act as a scaffold in providing surface area to create crystal contacts and at the same time, it will also reduce the flexibility of the receptor, hopefully without perturbing the functionality of the receptor. Based on the computational modelling experiments, two ways to generate a fusion complex were assigned. Long linkers were inserted between the subunits of the RC and the GPCR. The linkers were designed with a possibility of straightforward alteration of their length as they contained a number of restriction enzyme sites. A series of these constructs were designed and expressed in R. sphaeroides deletion strain, which did not possess the chromosomal RC genes. Though most of these fusion constructs could be successfully expressed, as analyzed by western blot, majority of them were not functional in terms of ligand binding of the GPCR component of the fusion complex. Interestingly, one of these constructs, where the M subunit of RC was directly fused to the human angiotensin II type 1a receptor (AT1aR), exhibited significant functional expression. Based on saturation binding analysis using [125I] iodotyrosyl4Sar1Ile8-angiotensin II (an AT1aR subtype specific antagonist), an expression level of 40+5 pmol/mg of total membrane protein was calculated. This expression level corresponds to approximately 0.3 mg of functional receptor per liter culture and it is significantly higher than the AT1aR expression in native tissues. Additionally, the binding affinity of the recombinant receptor for its endogenous ligand angiotensin II was found to be 1±0.1 nM, which is similar to that observed for the AT1aR in native tissues. More interestingly, the RC part of the fusion complex was structurally assembled in other words, properly folded as judged by the presence of the characteristic peaks at 760 nm, 800 nm and 850 nm by absorption spectroscopy. However, a slight change in the intensity of the peak at 800 nm was observed while comparing the spectra of native RC with that in the fusion protein complex. This slight variation might be due to the change in the protein environment. The fusion protein complex RC-AT1aR was functionally solubilized and purified using a decahistidine tag fused at the c-terminus of the AT1aR. Subsequently, the monodispersity and integrity of the complex was confirmed by size exclusion chromatography, which revealed a homogeneous peak. Additionally, it was also possible to solubilize and purify this complex in the presence of a fluorescein tagged angiotensin II ligand which provides a nice tool to judge the functionality of the AT1aR and integrity of the complex at the same time. The purified RC-AT1aR fusion complex was then subjected to three-dimensional (3-D) crystallization trials and it was possible to obtain reproducible crystals of this complex. The crystals were fluorescent (as the complex was purified in presence of fluorescently labelled angiotensin II) and needle or tetragonal in shape, but produced a powdery diffraction pattern. Further attempts to improve the crystallization condition and to optimize the cryo-conditions are underway. In addition, attempts are also being made to obtain the crystals of this complex with the antagonist (e.g. losartan) bound to the receptor. In view of several limitations in the heterologous expression of GPCRs, as the second part of my Ph.D. thesis, I decided to explore the possibilities of developing a novel expression system based on R. sphaeroides for production of recombinant GPCRs. The notion behind using this host is that lack of inclusion bodies and high concentration of membranes in R. sphaeroides would result in efficient functional overexpression of recombinant membrane proteins. For this purpose, a R. sphaeroides strain, modified by the deletion of the genes encoding the RC and the light harvesting proteins LH1 and LH2, was used. The genes for RC and LHs constitute about 85-90% of total membrane proteins in a R. sphaeroides cell. These membranes are normally housed in special membrane vesicles called intracytoplasmic membranes (ICMs) that can fill almost the entire cell volume under certain growth conditions. Synthesis of a heterologous protein under the control of the moderately strong photosynthetic superoperonic promoter should be coordinated with the synthesis of new membranes to harbour these proteins, thus acting as a natural induction system. Moreover, as most of the native membrane proteins are absent in this deletion strain, heterologously produced protein should not experience a shortage of molecular chaperones for proper folding and insertion. Additionally, the absence of inclusion bodies in this host should enhance the functional and homogenous population of the recombinant proteins. Three human GPCRs, namely the adenosine A2a receptor (A2a), the angiotensin II type 1a receptor (AT1aR) and the bradykinin subtype 2 receptor (B2R) were tested for expression and functionality in this system. Two different constructs were used to determine the optimal position and ribosome-binding site (RBS) in the superoperon for the highest expression level. Of these three receptors, the AT1aR and B2R were successfully produced, while the A2aR failed to express, producing green carotenoid free R. sphaeroides mutants, for unknown reasons. For the recombinant B2R, [3H] bradykinin binding analysis revealed a low functional expression level of 0.7-0.8 pmol/mg of total membrane protein. This expression level corresponds to 0.01 mg functional receptor per liter of culture and is not sufficient for large-scale expression of this receptor. However, for the recombinant AT1aR, [125I] iodotyrosyl4Sar1Ile8- angiotensin II binding analysis revealed an expression level of 12±1 pmol/mg of total membrane protein. This expression level corresponds to approximately 0.1 mg functional receptor per liter culture and this is significantly higher than the AT1aR expression in native tissues. This expression system is still in the nascent stages of development and there are several parameters, which are still to be assessed for the optimal use of this system for the production of GPCRs and other membrane proteins. In conclusion, my Ph.D. work presents a novel fusion protein complex based approach for obtaining crystallizable GPCRs and a novel expression system for producing heterologous GPCRs. It was possible, for the first time, to produce a functional RC-GPCR complex that could easily be crystallized, though further finetuning of the system is required. R. sphaeroides based novel expression system was successfully used to produce functional human GPCRs under the control of a moderately strong photosynthetic superoperonic promoter. This expression system represents a naturally induced system where the expression of a heterologous protein is coordinated with the synthesis of new membranes to harbour the recombinant protein. The fusion protein complex approach and the expression system presented here can hopefully be used as a general method to facilitate the expression and crystallization of other membrane proteins.
Ziel der Studie war, die diagnostische Aussagekraft von vier nicht invasiven Nachweisverfahren von Helicobacter pylori (H. pylori) für ein Patientenkollektiv des Universitätsklinikums Frankfurt am Main zu überprüfen. Es wurden der 13CHarnstoff-Atemtest, ein Stuhl-Antigennachweis mittels ELISA, ein Stuhl-Schnelltest sowie ein Urin-Schnelltest untersucht. In die Studie wurden 169 Patienten aufgenommen. Bei allen Patienten wurde eine diagnostische Gastroskopie durchgeführt, um den H. pylori Status mittels Histologie oder Urease-Schnelltest zu definieren - H. pylori positiv waren 52 Patienten, H. pylori negativ 85 Patienten. Bei 32 Patienten konnte kein invasiver H. pylori Nachweis geführt werden. In dieser Studie zählten die Einnahme von PPI, H2-Blocker, Antazida und Antibiotika nicht zu den Ausschlusskriterien. Die Studie bestätigte den aus der Literatur bekannten Einfluss von säurehemmenden Medikamenten auf die diagnostische Aussagekraft nicht invasiver Testverfahren mit direktem Erregernachweis. Eine nicht invasive Diagnostik sollte immer vor dem Beginn einer Therapie mit solchen Medikamenten erfolgen. Alle vier Nachweisverfahren lieferten in dieser Studie hohe Werte für die Spezifität (ELISA 100%, Urin-Schnelltest 96,5%, 13C-Harnstoff-Atemtest 94,7%, Stuhl-Schnelltest 93%). Die in der Studie ermittelten Werte für die Sensitivität waren niedriger als in publizierten Studien bzw. niedriger als die Herstellerangaben. Der ELISA schnitt mit 79,2% am besten ab. Die Sensitivität des Stuhl-Schnelltests lag bei 72,9%, die des 13C-Harnstoff-Atemtests bei 68,8% und die des Urin-Schnelltests 62,5%. Die diagnostische Aussagekraft der vier untersuchten Tests ist als akzeptabel, beim ELISA als gut zu bewerten. Der gerechtfertigte Ersatz der Gastroskopie in der H. pylori Diagnostik durch ein nicht invasives Verfahren reduziert die Kosten beträchtlich.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Evaluation der Wertigkeit des Enteroklysmas in der modernen Dünndarmdiagnostik sowie der Vergleich von Untersuchungsdaten eines digitalen urchleuchtungssystems aus dem Zeitraum 2000 bis 2004 mit älteren Daten, die 1990 bei Untersuchungen mit einem analogen Durchleuchtungssystem erhoben wurden. Bei diesem Vergleich wurde insbesondere auf die Analyse der Strahlendosisbelastung für den Patienten eingegangen. Es wurden 395 mit dem digitalen Durchleuchtungssystem und 241 mit dem analogen Durchleuchtungssystem untersuchte Patienten in die Studie eingeschlossen. Folgende Schlussfolgerungen konnten erhoben werden: 1. Es war ein Rückgang von 241 Enteroklysmauntersuchungen im Jahr 1990 auf durchschnittlich 79 Untersuchungen pro Jahr im Zeitraum 2000 bis 2004 festzustellen. 2. Das Anforderungsprofil veränderte sich zwischen den genannten Zeiträumen. So war ein am jeweiligen Gesamtkollektiv gemessener deutlicher prozentualer Zuwachs an Anforderungen gastroenterologischer Abteilungen zu beobachten. Die Absolutzahlen der jährlichen Anforderungen dieser Abteilungen gingen jedoch zurück. Der Anteil anderer internistischer und chirurgischer Abteilungen fiel im zeitlichen Verlauf. Dies wurde als Ausdruck der Innovationen im Bereich endoskopischer Verfahren und konventioneller medikamentöser Therapiestrategien im Rahmen eines M. Crohn gewertet. Es war ein Zuwachs an Anforderungen von Seiten pädiatrischer Abteilungen festzustellen. Die Betrachtung der demographischen Daten der Patientenkollektive und die in verschiedenen internationalen Studien beschriebene Zunahme an jungen Patienten mit chronisch entzündlicher Darmerkrankung unterstreichen diese Entwicklung. 3. Das Enteroklysma ist in der Diagnostik frühester Krankheitsstadien eines M. Crohn heute noch nicht durch Schnittbildverfahren ersetzbar. Dementsprechend gehörte die Anforderungsdiagnose M. Crohn von Seiten der Überweiser sowie die diagnostizierte Pathologie M. Crohn – vor allen anderen Differentialdiagnosen – zu den häufigsten bearbeiteten Fragestellungen. 4. Den größten Anteil positiver Befunde (73,5%) hatten Patienten mit bekanntem M. Crohn. Insgesamt ergaben 53,4% der digitalen Untersuchungen einen positiven Befund, von den 1990 durchgeführten analogen Untersuchungen zeigten 34,0% eine Pathologie. Diese Entwicklung konnte in anderen Studien ebenfalls beobachtet werden und spricht für eine strengere Indikationsstellung zur Enteroklysmauntersuchung. 5. Vor- und Nachteile konkurrierender bildgebender Verfahren wie Sonographie, CT, MRT und endoskopische Methoden wurden im Rahmen der verschiedenen Anforderungsdiagnosen und Pathologien diskutiert. Diese sollten in der klinischen Evaluation des M. Crohn mit eingesetzt werden, um die Limitationen des Enteroklysmas bezüglich der Identifikation von extraluminalen Komplikationen zu kompensieren. Bei Kindern und Jugendlichen ist die MRT aus Gründen der Strahlenhygiene schon heute Methode der Wahl. Die Blutungs- und Tumorsuche ist Domäne der Endoskopie. Moderne endoskopische Verfahren wie die Kapselendoskopie und die Doppelballonendoskopie gewinnen neben konventionellen endoskopischen Methoden zunehmend an Bedeutung. In der Diagnostik von Dünndarmadhäsionen hat neben dem konventionellen Enteroklysma das CT-Enteroklysma einen sehr hohen Stellenwert. 6. Die kumulative Darstellung aller Untersuchungen und die auf bestimmte Diagnosen festgelegten Subgruppenanalysen zeigten einheitlich, dass die mit dem analogen Durchleuchtungsgerät erzielten Durchleuchtungszeiten statistisch signifikant kürzer waren als die digitalen (arithmetisches Mittel 9 min 43 sek analog versus 17 min 10 sek digital). Trotzdem belegten sie eine statistisch signifikant niedrigere Dosisbelastung der Patienten, die mit dem digitalen Gerät untersucht wurden (arithmetisches Mittel 7513,6 cGycm² analog versus 4945,1 cGycm² digital). Somit lag der digitale Dosismittelwert deutlich unter dem für Dünndarm-Durchleuchtungen geltenden diagnostischen Referenzwert von 7000 cGycm², der analoge Mittelwert lag etwas über diesem Wert. Technische Verbesserungen der digitalen Bildaufnahmetechnik wie der „Last-Image-Hold“ und die gepulste Durchleuchtung resultieren in einer signifikanten Dosisreduktion.
Pflanzliche Arzneimittel erfreuen sich nach wie vor einer großen Beliebtheit. Da sie sich in enger Konkurrenz zu den auf Wirksamkeit und Unbedenklichkeit untersuchten chemisch definierten Arzneistoffen befinden, reicht es heute häufig nicht mehr aus, wenn Phytopharmaka sich nur auf ihre tradierte und dokumentierte Verwendung berufen. „Rationale“ Phytopharmaka müssen dieselben Anforderungen erfüllen, wie synthetische Arzneimittel. Das führt dazu, dass sich die Forschung neben der Aufklärung der chemischen Strukturen und Zusammensetzung der Pflanzenzubereitung, darüber hinaus auch der in-vitro und in-vivo Wirkung von Phytopharmaka widmet. Bei einigen dieser Untersuchungen konnte nicht nur die Wirkung des untersuchten Phytopharmakons aufgeklärt, sondern ebenso neue Indikationsgebiete eröffnet werden. So führte die Aufklärung des Wirkmechanismus des traditionell in der indischen Volksmedizin als Antirheumamittel angewandten Boswellia serrata-Extraktes dazu, dass Weihrauchzubereitungen heute in klinischen Studien auf Ihre Wirksamkeit bei der Behandlung des peritumoralen Hirnödems geprüft werden. In vorausgegangenen Tierstudien und klinischen Pilotstudien mit Glioblastom-Patienten konnte nämlich eine Reduktion des Hirnödems unter Weihrauchtherapie beobachtet werden. Die antiinflammatorischen, zytostatischen wie auch antiödematösen Effekte werden den im Weihrauch enthalten Boswelliasäuren zugeschrieben. Vor allem die ketylierten Boswelliasäuren KBA und AKBA zeigen in in-vitro Untersuchungen eine sehr hohe Wirksamkeit und gelten deshalb auch als Leitsubstanzen in der Monographie Boswellia serrata des DAC. Während einige Daten zur Bioverfügbarkeit von KBA bereits vorliegen, reichen die bisher zur Verfügung stehenden analytischen Methoden nicht aus, um die wesentlich geringere AKBA-Konzentration im Plasma zu bestimmen. Des Weiteren fehlte bisher der Nachweis, ob die Keto-Boswelliasäuren die Blut-Hirnschranke in der Tat überwinden können, um im ZNS zu wirken. Für die parallele Bestimmung von KBA und AKBA aus Plasma und Hirnmatrix wurde deshalb in dieser Arbeit eine sensitive analytische Methode entwickelt und gemäß internationalen Richtlinien validiert. Diese Methode ist charakterisiert durch eine sehr einfache Probenaufarbeitung mittels sorbensgestützter Flüssig-Flüssig-Extraktion auf Kieselgurbasis, gefolgt von einer chromatographischen Trennung auf einer RP-18-Säule und einer massenspektrometrischen Detektion anhand der Übergänge m/z 471,2 --> 95,1 für KBA und m/z 513,4 --> 91,1 für AKBA im positiven MRM-Modus. Die Quantifizierung erfolgte über die pentazyklische Triterpensäure „Asiatische Säure“, die als interner Standard eingesetzt wurde. Bei der anschließenden Validierung konnte die Spezifität der Methode nachgewiesen, sowie die international anerkannten Grenzen für die Linearität, die Nachweisgrenze sowie die inter- und intraday Präzision und Richtigkeit eingehalten werden. Die Stabilität der Plasma- und Hirnproben konnte bei T=-20°C für fünf Monate, bei Raumtemperatur für 24 Stunden und nach mehreren Einfrier-Auftauzyklen belegt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die entwickelte analytische Methode zur Aufnahme von Plasma-Spiegel-Kurven von KBA und AKBA nach oraler Administration von Weihrauchzubereitungen eingesetzt werden kann. Gegenüber den bereits beschriebenen HPLC-UV- und GC-MS-Methoden besitzt die neu entwickelte Methode den Vorteil, dass mit der Nachweisgrenze von 5 ng/ml für KBA und AKBA, auch die Plasmakonzentrationen von AKBA erstmals valide erfasst werden konnten. Da sie darüber hinaus eine einfache Probenaufarbeitung mit einer kurzen Analysenzeit von 6 Minuten verbindet, ist sie für die Durchführung von Pharmakokinetikstudien gut geeignet. Wie wichtig derartige pharmakokinetische Studien für die Etablierung von Weihrauch als rationales Phytopharmakon sind, erbrachte der Vergleich der Bioverfügbarkeit von H15™-Ayurmedica mit einem Referenzpräparat. Hierbei wurde deutlich, dass für die Resorption von KBA und AKBA neben der Extraktzusammensetzung auch die Arzneiform eine entscheidende Rolle spielt. Für die Zukunft stellt daher die Erhöhung der Bioverfügbarkeit von KBA und AKBA z.B. durch eine verbesserte technologische Formulierung einer der wichtigsten Meilensteine im Sinne einer verbesserten Therapie mit Weihrauchextrakt dar. Im Hinblick auf die potentielle Indikation von Boswellia serrata Extrakt für die Therapie des tumor-assoziierten Hirnödems wurde darüber hinaus untersucht, ob die beiden Keto-Boswelliasäuren die Blut-Hirn-Schranke überwinden und in das Hirn gelangen können. Dazu wurden die Konzentrationen von KBA und AKBA im Hirn nach einem Fütterungsversuch an neun gesunden Ratten bestimmt. Es konnten Spiegel von 99 ng/g für KBA und 95 ng/g für AKBA drei Stunden nach Gabe von 240 mg/kg Körpergewicht H15™-Ayurmedica detektiert werden. Bei gliominplantierten Ratten konnte mit der 3-mal täglichen Gabe dieses Präparates in dieser Dosierung eine Reduktion des Ödemvolumens, eine Zunahme von apoptotischen Zellen und eine Verlängerung der Überlebenszeit beobachtet werden. Interessant ist deshalb auch die Frage, wie es sich mit den Konzentrationen der Keto-Boswelliasäuren in Tumorgeweben verhält. Zur Klärung dieses Aspektes könnte die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte LC-MS/MS-Methode beitragen. Häufig können die Chemotherapeutika in den Tumorzellen nicht die Spiegel des gesunden Gewebes erreichen. Dies kann in vielen Fällen in Verbindung mit der Effluxpumpe P-Glycoprotein (Pgp) gebracht werden. Dieses membranständige Transportprotein hindert Arzneistoffe daran in das Cytoplasma zu gelangen. Inwieweit eine Pgp vermittelte Resistenz bei den Glioblastomen eine Rolle spielt, ist derzeit noch nicht vollständig geklärt. Pgp ist darüber hinaus in seiner physiologischen Funktion an der schnellen Ausscheidung von Fremdstoffen und am Schutz spezieller Kompartimente, wie dem Gehirn, beteiligt. Eine Interaktion von Arzneistoffen mit Pgp kann deshalb auch die Pharmakokinetik dieser Substanzen empfindlich beeinflussen. Unter diesen Gesichtspunkten wurden in dieser Arbeit auch die pharmakologisch wichtigen Inhaltsstoffe des Weihrauchextraktes auf eine mögliche Modulation der Pgp-Funktion untersucht. Dieser Test erfolgte mittels zellbasierten Calcein-AM-Assays in Schweinehirnendothel-Zellen (PBCEC-Zellen) und in einer Pgp-expremierenden humanen Leukämiezelllinie (VLB-Zellen). In beiden Zellsystemen erwies sich Weihrauchextrakt (84Mikrogramm/ml H15™-Ayurmedica) als ein Modulator der Transportfunktion von Pgp. Bei der Untersuchung der einzelnen Boswelliasäuren, stellte sich heraus, dass die im Extrakt am häufigsten vorkommenden Beta-Boswelliasäuren und Acetyl-Beta-Boswelliasäuren für diesen Effekt nicht verantwortlich sind. Auch die Alpha-Boswelliasäure und Acetyl-Alpha-Boswelliasäure beeinflussen ebenfalls die Transportaktivität nicht. Eine Interaktion mit dem Transportprotein konnte dagegen bei den Keto-Boswelliasäuren KBA (10 MikroM) und AKBA (3 MikroM) in den Schweinehirnendothelzellen beobachtet werden. In der Leukämiezelllinie konnte bei beiden Keto-Boswelliasäuren ebenfalls einen Einfluss auf die Transportaktivität des Pgp festgestellt werden, der allerdings nur bei AKBA (3 MikroM) signifikant war. Um zu verifizieren, ob die 11-Ketogruppe für die modulierende Wirkung der Boswelliasäuren verantwortlich ist, wurde Glycyrrhetinsäure, eine pentazyklische Triterpensäure, die wie KBA und AKBA eine Ketofunktion an Position 11 besitzt, getestet. Da im Calcein-AMAssay bei dieser Substanz ein mit AKBA vergleichbarer Effekt auftrat, scheint für eine Wechselwirkung des P-Glycoproteins mit Boswelliasäuren die 11-Ketogruppe essentiell zu sein. In dieser Arbeit wurde ein erster Hinweis auf eine Wechselwirkung zwischen Keto-Boswelliasäuren und Pgp erbracht. Inwiefern diese in-vitro-Daten auch auf in-vivo klinische Relevanz besitzen, muss noch in weiteren Studien mit Weihrauch geklärt werden. Gerade für die Behandlung des peritumoralen Hirnödems von Glioblastom-Patienten wäre es wichtig, den Mechanismus der Wechselwirkung von KBA und AKBA mit P-Glycoprotein näher zu untersuchen. Da Weihrauchextrakt häufig in der Co-Medikation verwendet wird, sollte auch im Hinblick auf die Arzneimittelsicherheit geprüft werden, ob es zu Arzneimittelinteraktionen auf Pgp-Ebene mit Weihrauchextrakt kommen kann.
Die Infektion von retinalen Pigmentepithel (RPE)-Zellen mit humanen Zytomegalieviren (HCMV) ist ein Modell für die HCMVRetinitis, die bei Immunsupprimierten, insbesondere bei AIDS-Patienten, zu einer Erblindung führen kann. In dieser Arbeit wurde der Einfluss des klinisch u.a. zur Behandlung von Epilepsie verwendeten Histondeacetylase (HDAC)-Inhibitors Valproinsäure (VPA) und von Strukturderivaten auf die HCMV-induzierte Antigenexpression in RPE-Zellen nach 24-stündiger Vorinkubation sowie auf die Histonacetylierung, als Indikator für die HDACHemmung, untersucht. Eine 24-stündige Vorinkubation mit VPA führte zu einer konzentrationsabhängigen Erhöhung der HCMV Immediate Early Antigen (IEA)- und Late Antigen (LA)-Expression im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Die Verwendung von VPA 1mM, einer therapeutischen Plasmakonzentration, führte zu einer 3fach erhöhten IEA- und einer 3-fach erhöhten LA-Expression. Darüber hinaus erhöhte die VPA-Behandlung die Menge an acetyliertem Histon H4, was auf eine VPA-induzierte Histondeacetylase (HDAC)- Hemmung hindeutet. Die Untersuchung systematisch strukturell veränderter VPA-Derivate zeigte, dass die HCMV IEA und LA Expression in strikter Korrelation mit der Erhöhung der Menge an acetyliertem Histon H4 erfolgte. VPA-Derivate, die keinen Einfluss auf die Histonacetylierung zeigten, beeinflussten die HCMV Antigen-Expression nicht. Die Ergebnisse legen nahe, dass die VPA-induzierte HDAC-Hemmung eine zentrale Rolle im Rahmen der erhöhten HCMV Antigen-Expression in RPE-Zellen spielt. Ob die hier erzielten Ergebnisse eine klinische Bedeutung haben, ist unklar. VPA sollte jedoch bei Patienten mit einem HCMV Retinitis-Risiko mit Vorsicht verwendet werden.
Intrinsic response properties of auditory thalamic neurons in the Gerbil (Meriones unguiculatus)
(2007)
Neurons in the medial geniculate body (MGB) have the complex task of processing the auditory ascending information from the periphery and a more extensive descending input from the cortex. Differences in the pattern of afferent and efferent neuronal connections suggest that neurons in the ventral and dorsal divisions of the MGB take different roles in this complex task. The ventral MGB (vMGB) is the primary, tonotopic, division and the dorsal MGB (dMGB) is one of the higher order, nontonotopic divisions. The vMGB neurons are arranged tonotopically, have sharp tuning properties, and a short response delay to acoustic stimuli. The dMGB neurons are not tonotopically arranged, have broad tuning properties, and a long response delay to acoustical stimuli. These two populations of neurons, with inherently different tasks, may display differences in intrinsic physiological properties, e.g. the capacity to integrate information on a single cell level. Neurons of the ventral and dorsal divisions of the MGB offer an ideal system to explore and compare the intrinsic neuronal properties related to auditory processing. Coronal slices of 200 μm thicknesses were prepared from the thalamus of 4 - 5 week old gerbils. The current-clamp configuration of the patch-clamp technique was used to do experiments on the dorsal and ventral divisions of the medial geniculate body. Slices were subsequently Nissl stained to verify the location of recording. Recordings from the dorsal and ventral divisions exhibited differences in response to depolarizing current injections. The ventral division responded with significantly shorter first spike latency (vMGB = 41.50 ± 7.7, dMGB = 128.43 ± 16.28; (p < 0.01)) and rise time constant (vMGB = 6.95 ± 0.90, dMGB = 116.67 ± 0.13; (p < 0.01)) than the dMGB. Neurons in the dorsal division possessed a larger proportion of slowly accommodating neurons (rapidly accommodating: vMGB: 89%, dMGB: 64%), including a subpopulation of neurons that fired at resting membrane potential. Neurons in the vMGB are primarily responsible for relaying primary auditory input. Dorsal MGB neurons relay converging multimodal input. A comparative analysis with the primary auditory neurons, the Type I and Type II spiral ganglion neurons, reveals a similar pattern. Type I neurons relay primary auditory input and exhibit short first spike latencies and rise time constants. The Type II neurons relay converging input from many sources, while possessing significantly slower response properties and a greater subpopulation of slowly accommodating neurons. Hence, accommodation, first spike latency, and rise time constant are suggested to be a reflection of the amount of input that must be integrated before an action potential can be fired. More converging input correlates to slower accommodation, a longer first spike latency and rise time. Conversely, a greater capacity to derive discrete input is associated with rapid accommodation, along with a short first spike latency and rise time.
Im Zentrum dieser Arbeit steht die Operation der Gruppe Gamma:=SL_n(Z[1/m]) auf dem symmetrischen Raum M:=SL_n(R)/SO(n). Allgemeiner betrachten wir die Operation rho:Gamma->Isom(M) einer S-arithmetischen algebraischen Gruppe durch Isometrien auf dem zugehörigen symmetrischen Raum M. Die symmetrischen Räume sind Riemannsche Mannigfaltigkeiten mit nichtpositiver Krümmung und daher insbesondere CAT(0)-Räume. R. Bieri und R. Geoghegan haben für die Operation rho:G->Isom(M) einer abstrakten Gruppe G auf einem CAT(0)-Raum M die geometrischen Invarianten Sigma^k(rho) als Teilmenge des Randes von M eingeführt (vgl. [Robert Bieri and Ross Geoghegan, Connectivity properties of group actions on non-positively curved spaces, vol. 161, Memoirs of the AMS, no. 765, American Mathematical Society, 2003]). Die Fokusierung, die durch die geometrischen Invarianten erreicht wird, hat sich in vielen Fällen bewährt, in denen eine Operation durch Translationen auf dem euklidischen Raum zur Verfügung steht. Über die Invarianten von anderen CAT(0)-Operationen ist noch wenig bekannt. In der vorliegenden Arbeit berechnen wir nun die geometrischen Invarianten Sigma^k(rho) für die oben erwähnte Operation rho der S-arithmetischen Gruppe Gamma auf dem zugehörigen symmetrischen Raum M. Wir erhalten für die Gruppe SL_n(Z[1/m]) die folgende Invariante: Sigma^k(rho) ist der ganze Rand von M, falls k kleiner als s(n-1) ist; Sigma^k(rho) ist die Menge aller Randpunkte e von M, die nicht im Rand eines rational definierten flachen Unterraum von M liegen, falls k größer oder gleich s(n-1) ist. Hierbei ist s die Anzahl der verschiedenen Primteiler von m. Die obigen Resultate sind eine Verallgemeinerung derer in [Robert Bieri and Ross Geoghegan, Controlled Connectivity of SL_2(Z[1/m]), Geometriae Dedicata 99 (2003), 137--166]. Der Beweis, den wir geben, besteht aus einer Vereinfachung des Beweises von Bieri und Geoghegan, die dann auf die allgemeinere Situation angepasst werden konnte. Ein interessanter Aspekt ergibt sich, wenn wir für eine Operation rho auf M die Zahlen k betrachten, für die gilt: (*) Sigma^k(rho) ist der ganze Rand von M. Operiert die Gruppe Gamma mit diskreten Bahnen, dann ist (*) äquivalent zur Eigenschaft, daß die Punktstabilisatoren Gamma_a, für a aus M, vom Typ F_k sind. Die Eigenschaft (*) ist auch von Interesse für S-arithmetische Untergruppen einer linearen algebraischen Gruppe über einem Funktionenkörper. Wir zeigen, daß es hier eine naheliegende Operation rho' auf einem Bruhat-Tits Gebäude M' gibt, so daß Gamma' ein Punktstabilisator und damit die Eigenschaft (*) mit der Eigenschaft "Gamma' ist vom Typ F_k" zusammenfällt. Im Zahlkörperfall sind die Verhältnisse ganz anders. Unsere S-arithmetischen Gruppen operieren auf dem symmetrischen Raum M nicht mit diskreten Bahnen und sind durchwegs vom Typ F_k für alle k. Dagegen erlaubt unser Hauptresultat die Bestimmung der Zahlen k mit der Eigenschaft (*) und zeigt eine interessante Abhängigkeit von s=|S| und dem Rang r der algebraischen Gruppen (rho erfüllt (*) <=> k<rs). Das Hauptresultat wird außerdem nicht nur für SL_n(Q), sondern allgemeiner für Chevalley-Guppen über Q oder Q(i) gezeigt, so daß wir damit für eine Reihe von klassischen CAT(0)-Operationen die Invarianten Sigma^k(rho) bestimmt haben.
Hintergrund und Fragestellung: Die Verwendung von Opioiden zur therapeutischen und peri-interventionellen Analgesie bei Patienten mit pancreato-biliären Krankheitsbildern ist durch ihre Nebenwirkung auf die Aktivität der glatten Muskulatur begrenzt. Wir untersuchten die Auswirkungen der intravenösen Gabe der synthetischen Opioide Tilidin und Pentazocin auf die Motilität des Sphinkter Oddi. Methoden: Zwanzig Patienten mit Verdacht auf Sphinkter Oddi-Dysfunktion wurden in eine prospektive Doppelblindstudie aufgenommen. Die Sphinkter Oddi-Motilität wurde mittels endoskopischer Manometrie sowohl nach i.v.-Injektion von 0,9% NaCl-Lösung als auch nach randomisierter Verabreichung von entweder 30 mg Pentazocin (n=10) oder 50 mg Tilidin (n=10) beurteilt. Ergebnisse: Pentazocin erhöhte den Basaldruck des Sphinkter Oddi signifikant von 32 ± 21 mmHg bei Kochsalzgabe auf 41 ± 19 mmHg (p = 0.002), während Tilidin den Basaldruck nicht veränderte: 34 ± 15 mmHg bei Kochsalzgabe gegenüber 36 ± 16 mmHg unter Tilidin (p = 0,16). Außerdem erhöhte Pentazocin die phasische Kontraktionsamplitude des Sphinkter Oddi auf 121 ± 18 mmHg gegenüber 108 ± 16 mmHg bei Kochsalzgabe (p = 0.004). Tilidin hatte hier keine Auswirkungen: 125 ± 24 mmHg bei Kochsalzgabe gegenüber 125 ± 21 mmHg unter Tilidine (p = 0.93). Die Frequenz und Dauer der phasischen Sphinkterkontraktionen wurden weder von Pentazocin noch von Tilidin beeinflußt. Schlußfolgerung: Im Gegensatz zu Pentazocin hat Tilidin keine Wirkung auf die Sphinkter Oddi-Motilität. Daher kann Tilidin sowohl zur endoskopischen Manometrie als auch zur Analgesie bei pankreatikobiliären Erkrankungen benutzt werden.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Hypothese, dass der „Life Orientation Test (-Revised)“ (LOT-R), der als Selbstberichtsfragebogen zur Erfassung von dispositionellem Optimismus konstruiert wurde, nicht nur „Optimismus“ erfasse, sondern auch „Pessimismus“; Pessimismus wird im Rahmen dieser „OP-Hypothese“ nicht als der Gegenpol von Optimismus aufgefasst, sondern als ein partiell unabhängiges Konstrukt. Die OP-Hypothese wird typischerweise mit sog. „konfirmatorischen“ Faktorenanalysen untersucht. Die OP-Hypothese wird zunächst aus theoretischer Perspektive analysiert, insbesondere auch deshalb, weil die Begriffe „Optimismus“ und „Pessimismus“ im Rahmen der OP-Hypothese nicht auf dieselbe Art verwendet werden wie sonst in der Psychologie oder in anderen Wissenschaften üblich. Dabei zeigt sich, dass keine angemessene theoretische Herleitung der OP-Hypothese möglich ist: Was „Pessimismus“ ist, wenn es nicht der Gegenpol von Optimismus ist, bleibt unklar. Ausgehend von dem Befund, dass die theoretische Herleitung der OP-Hypothese unangemessen ist, wird diese Hypothese aus methodologisch-testtheoretischer Perspektive und mittels zweier empirischer Arbeiten kritisch überprüft. Aus methodologischer und mathematisch-statistischer Perspektive wird dargestellt, dass die empirischen Befunde, die für die OP-Hypothese sprechen, nicht eindeutig sind; die OP-Hypothese ist also unterdeterminiert. Die Gültigkeit eines reflexiven Messmodells, das für die Untersuchung der OP-Hypothese mittels konfirmatorischer Faktorenanalysen erforderlich wäre, kann nicht ohne Weiteres angenommen werden. Die mathematisch-statistischen Annahmen der „experimentellen Unabhängigkeit“ und der „lokalen Homogenität“, die ein reflexives Messmodell konstituieren, sind für Selbstberichtsfragebogen in vielen Fällen verletzt. Noch gravierender ist das Ergebnis, dass sich aus „konfirmatorischen“ Faktorenmodellen, die für die OP-Hypothese sprechen, keine ausreichenden Informationen über den empirischen Gehalt der Hypothese ergeben. In grundsätzlicher Form und anhand einfacher Beispiele wird gezeigt, dass für eine gegebene Kovarianzmatrix, die die Datenbasis einer „konfirmatorischen“ Faktorenanalyse darstellt, grundsätzlich unendlich viele Alter-nativmodelle konstruiert werden können, von denen zumindest eine Teilmenge auch mit sinnvollen Interpretationen verbunden ist. Angesichts der Existenz solcher Alternativmodelle müssen andere Kriterien zur Überprüfung der OP-Hypothese herangezogen werden als „konfirmatorische“ Faktorenmodelle. Anhand einer empirischen Untersuchung mit dem LOT-R wird gezeigt, dass ein „Methodeneffektmodell“ eine bessere Anpassung an die Daten ermöglicht als das mit der OP-Hypothese verbundene Modell. Das Methodeneffektmodell beinhaltet die Annahme, dass die Antworten auf LOT-R-Items nicht ausschließlich durch die individuelle Ausprägung in „Optimismus“ bedingt werden, sondern zum Teil auch unerwünschte Effekte der Itemformulierungen abbilden. Entsprechend lässt sich eine Korrelation des „Methodenfaktors“ mit sozial erwünschtem Antwortverhalten beobachten. Schließlich wird in einer weiteren empirischen Untersuchung gezeigt, dass mit der Skala „Personaler Optimismus“ ein Instrument zur Erfassung von dispositionellem Optimismus vorliegt, welches nicht unter der faktorenanalytischen Mehrdimensionalität leidet, die den LOT-R kennzeichnet. In der Zusammenschau der methodologischen und empirischen Ergebnisse muss die OP-Hypothese als zu gering begründet zurückgewiesen werden. Über den Rahmen des speziellen Inhaltsgebietes „Optimismus“ hinaus weist die vorliegende Arbeit aber auch auf die Notwendigkeit multipler Betrachtungsebenen bei der Untersuchung persönlichkeitspsychologischer Fragestellungen hin. Nachteilig für die persönlichkeitspsychologische Forschung könnten sich insbesondere die unreflektierte Verwendung von Selbstberichtsfragebogen auf der Seite der Datenerhebung und die unreflektierte Verwendung von „konfirmatorischen“ Faktorenanalysen auf der Seite der Datenauswertung auswirken.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte mit der Aktivierung des Peroxisomen Proliferator-aktivierten Rezeptors eine Rationale und ein möglicher Wirkmechanismus für die traditionelle Anwendung von Gewürz- und Arzneipflanzen bei der Therapie des Typ 2 Diabetes aufgezeigt werden. Vor diesem Hintergrund wurden über fünfzig traditionell bei Diabetes angewandte Pflanzen ausgewählt und mit Ethanol extrahiert. Die erhaltenen Trockenextrakte wurden daraufhin in einem von mir etablierten Reporter-Gen Assay auf eine mögliche Aktivierung der drei Subtypen des PPAR hin untersucht. Von den getesteten Extrakten wurde für fünfundzwanzig, also annähernd die Hälfte, eine signifikante Aktivierung des PPARgamma nachgewiesen. Von diesen zeigten wiederum vierzehn außerdem eine signifikante Aktivierung des PPARalpha, lediglich drei dieser Extrakte zeigten auch eine signifikante Aktivierung des PPARdelta. Somit konnte ich eine mögliche Rationale und einen potentiellen Wirkmechanismus für die volksmedizinische Anwendung dieser Pflanzen bei Diabetes aufzeigen. Von den wirksamen Extrakten wiesen am PPARgamma sieben eine ausreichend hohe Aktivität auf, dass wir auch bei niedrigeren Testkonzentrationen noch einen signifikanten Effekt und somit eine Konzentrationsabhängigkeit des aufzeigen konnten. Für PPARa konnten wir lediglich für drei der Extrakte eine Konzentrationsabhängigkeit aufzeigen, bei PPARdelta für keinen der Extrakte. Die beiden am stärksten aktiven Extrakte aus Rosmarinus offic. und Salvia offic. zeigten bereits ab etwa 10 mg/L signifikante Aktivität am PPARgamma, so dass wir für diese beiden Extrakte mit 20 bzw. 40 mg/L EC50-Konstanten bestimmen konnten. Diese halbmaximale Aktivierungskonstante liegt damit für den potenteren Rosmarin-Extrakt lediglich um den Faktor 200 höher als die des bei Diabetes eingesetzten Arzneistoffs Pioglitazon (Actos®). Die weitere Untersuchung dieser beiden Extrakte ergab, dass in beiden Carnosolsäure bzw. Carnosol enthalten waren, welche bei der Untersuchung im Reporter-Gen Assay EC50-Konzentrationen von 20 bzw. 40 mikroM für die Aktivierung des PPARgamma aufwiesen. Damit sind diese Reinsubstanzen bereits nur noch um den Faktor siebzig schwächer wirksam als Pioglitazon. Vergleicht man hingegen mit Bezafibrat (Cedur®), einem als Lipidsenker eingesetzten Arzneistoff, welcher aufgrund seiner pan-PPAR-agonistischen Wirkung mit EC50-Konzentrationen von je etwa 50 mikroM von besonderem Interesse ist, so sind die beiden Diterpene Carnosolsäure und Carnosol im Hinblick auf PPARgamma äquipotent oder eher stärker aktiv. Der Gehalt an diesen beiden Diterpenen in den von mir hergestellten Extrakten war nun zwar mit in Summe drei bzw. neun Prozent um den Faktor zehn bzw. drei zu niedrig, als dass sich der PPARgamma Agonismus der beiden Extrakte hierdurch hinreichend erklären ließe. Allerdings konnten wir für einen kommerziell erhältlichen und auf 40% Carnosolsäure angereicherten Rosmarin-Extrakt einen EC50-Wert von 10 mg/L bestimmen für die Aktivierung von PPARgamma bestimmen. Eine Aktivität, welche sich zu 70% allein auf den Gehalt an Carnosolsäure zurückführen lässt. Neben dem Nachweis der PPARgamma Aktivität von Carnosolsäure und Carnosol einerseits und der von ethanolischen Rosmarin- und Salbei-Extrakten andererseits, konnte ich somit einen hinreichenden Beweis führen, dass Carnosolsäure zumindest für Rosmarin, vermutlich auch für Salbei, als eines der aktiven Prinzipien anzusehen ist. Meine Befunde liefern damit eine mögliche Erklärung und Wirkmechanismus für die in Tiermodellen gefundene hypoglykämische Wirksamkeit von Rosmarin, Salbei und Carnosolsäure. Darüber hinaus legen meine Untersuchungen nahe, dass in beiden Pflanzen weitere PPARgamma Aktivatoren enthalten sind. Da Carnosol selbst bereits ein Oxidationsprodukt der Carnosolsäure darstellt, kämen hier weitere auch bereits beschriebene Oxidationsprodukte sicherlich in Frage. Diese Oxidationsprodukte stellen allerdings zumeist nur labile Übergangsprodukte dar und sind aus diesem Grunde auch als nicht Reinstoffe erhältlich. Der Nachweis einer PPAR Aktivität könnte somit angesichts der benötigten Inkubationsdauer im Reporter-Gen Assay so nicht geführt werden. Neben den bereits angeführten Ergebnissen ist die hohe Rate von positiven Treffern in meinem Screening selbst einer der interessantesten Befunde. Die signifikante Aktivierung von PPARgamma durch nahezu die Hälfte der getesteten Extrakte lässt die Vermutung zu, dass PPAR agonistische Substanzen im Pflanzenreich sehr weit verbreitet sein könnten. Zwar bestehen zu Recht Vorbehalte gegenüber der Testung von Vielstoff-Gemischen bzw. den hierbei erhaltenen Ergebnissen. Viele pflanzliche Inhaltsstoffe z.B. Gerbstoffe können zu einer unspezifischen Hemmung der Aktivität von Enzyme führen. Das verwendete Testsystem setzt allerdings neben Membrangängigkeit der aktiven Prinzipien die spezifische Aktivierung der Expression eines Gens, dessen Aktivität anschließend bestimmt wird, voraus. Die Art des verwendeten Assay macht damit die Erfassung unspezifischer Effekte eher unwahrscheinlich. Darüberhinaus mag für die Güte der Ergebnisse meines Screenings sprechen, dass unabhängig von uns für einige der gescreenten Pflanzen z.B. Kurkuma und Chili mit den Kurkuminoiden und Capsaicin kürzlich PPAR aktive Prinzipien beschrieben wurden. Vielmehr lässt sich die Hypothese formulieren, dass eine ganze Reihe sekundärer pflanzlicher Inhaltsstoffe zumindest mäßig aktive PPAR Agonisten darstellen. An prominenter Stelle wäre hier die Substanzklasse der Terpene zu nennen, von denen eine ganze Reihe sowohl linearer etwa Farnesol und Phytansäure, als auch cyclischer z.B. Tumeron, Abietansäure, Oleanolsäure und Ursolsäure bereits als PPAR-Aktivatoren beschrieben wurden. Angesichts der hohen Lipophilie dieser Substanz-Klasse und einer relativ großen und wenig selektierenden Bindungstasche des PPAR lässt sich auch für andere Terpene ein PPAR Agonismus erwarten. Der positive Effekt, den eine überwiegend pflanzliche Ernährung nach epidemiologischen Erkenntnissen auf die Gesundheit bewirkt, mag deshalb in Teilen auf PPAR-agonistische Prinzipien zurückzuführen sein. Neben dem höheren Anteil an mehrfach ungesättigen Fettsäuren im Vergleich zu tierischer Nahrung könnten enthaltene Terpene hier durchaus einen relevanten Beitrag leisten. In einem weiteren in Kooperation durchgeführten Projekt konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass die schwache Aktivität des phenolischen Stilben-Derivats Resveratrol am PPARgamma einen Beitrag leistet zur Beeinflussung des Polyamin-Stoffwechsels und der hierdurch bedingten Regulation der Zell-Proliferation. Weiterhin konnte mit Hilfe der in unserem Reporter-Gen Assay erhaltenen Ergebnisse gezeigt werden, dass ein virtuelles Computer-basiertes Screening einer Substanzbibliothek effektiv ist, bei der Findung von PPAR Leitstrukturen.
Es sollte untersucht werden, wie sich das Fehlen der beiden bisher in Säugetieren charakterisierten Melatoninrezeptoren (Mel1A und Mel1B) auf die Lokalisation und die zirkadiane Verteilung der Peptide GRP und NPY im SCN von Mäusen auswirkt. Hierzu wurde der Anteil der für diese beiden Peptide immunreaktiven Perikaryen und Nervenfasern in Tieren untersucht, denen entweder der Mel1A Rezeptor (Genotyp aaBB), der Mel1B Rezeptor (Genotyp AAbb) oder beide Rezeptoren fehlten (Genotyp aabb) fehlten. Die Ergebnisse wurden mit Tieren des Wildtyps (Genotyp AABB) verglichen. Im Hinblick auf die Lokalisation konnte ein Einfluss ausgemacht werden. In den Tieren des Wildtyps waren die Immunreaktionen für beide Peptide diffus über den SCN verteilt, während in den Tieren des Genotyps AAbb eine stärkere GRP-Immunantwort im dorsomedialen Bereich festgestellt wurde. Hingegen war die NPY-Immunantwort im ventrolateralen Bereich des SCN bei den Tieren des Genotyps aaBB verstärkt. Das Fehlen beider Rezeptoren in den aabb Tieren führt für beide Peptide zu einem stark verkürzten Maximum in der Immunantwort. Die Melatoninrezeptoren dürften also eine wichtige Funktion für die Steuerung des Gehalts der Peptide über einen längeren Zeitraum hinweg besitzen. Das Fehlen eines einzelnen Rezeptors ergibt allerdings keinen so einheitlichen Befund. Bei der Untersuchung der Immunantwort in den Genotypen AAbb und aaBB konnte ein GRP-Profil mit mehreren Maxima und Minima ausgemacht werden. Bei den aaBB-Tieren kam es zu einer Verschiebung der NPY-Immunantwort, so dass diese in der späten Licht- und in der Dunkelphase erhöht war, während sie bei den anderen Genotypen in der gesamten Lichtphase maximale Werte erreichte. Die Befunde aus der vorliegenden Arbeit geben deutliche Hinweise darauf, dass das Fehlen der Melatoninrezeptoren einen Einfluss auf den Gehalt und die Lokalisation der untersuchten Peptide hat. Die hier durchgeführten Untersuchungen ergeben allerdings noch kein klares Bild über die konkreten Wirkungsmechanismen dieser Effekte. Es wäre nun interessant herauszufinden wodurch diese Veränderungen zustande kommen. Hierbei sind mehrere Möglichkeiten denkbar, da der Gehalt eines Peptids in der Zelle durch verschiedene Mechanismen verändert werden kann. Die Regulation kann z.B.schon bei der Bildung der Peptide stattfinden, also auf der Ebene der Translation oder Transkription. Durch in situ-Hybridisierung kann Gehalt an mRNA sichtbar gemacht werden, und so Veränderungen der Transkription des Gens nachgewiesen werden. Andererseits kann für eine verminderte Immunreaktion in der Zelle auch eine verstärkte Freisetzung des Peptids in die Cerebrospinalflüssigkeit verantwortlich sein, in der es z. B. durch Microdialyse nachgewiesen werden kann (Kalsbeek et al. 1995). Wenn weder die Produktion, noch die Ausschüttung des Peptids für eine veränderte Immunreaktion verantwortlich sind, ist vermutlich der Abbau betroffen. In eukaryotischen Zellen stellt der Abbau von Proteinen mit Hilfe von Proteasomen einen wichtigen Abbauweg dar. Proteine, die zum proteasomalen Abbau in der Zelle bestimmt sind, werden zuvor durch Bindung mehrerer Einheiten des Polypeptids Ubiquitin, das als eine Art "Adresse" funktioniert, gekennzeichnet. Um den proteasomalen Abbau eines beliebigen Proteins zu zeigen, muß daher zunächst nachgewiesen werden, daß Ubiquitin an dieses Protein bindet (Ciechanover et al. 1984). Dies könnte z.B. mit Hilfe der Immunpräzipitation durchgeführt werden. So ergibt sich aus der vorliegenden Arbeit eine Vielzahl neuer Möglichkeiten die Wirkmechanismen der Melatoninrezeptoren im SCN weiter aufzuklären.
Die Unternehmensbesteuerung ist eines der Instrumentarien das im Wettbewerb um den mobilen Faktor Kapital von den Industriestaaten eingesetzt wird. Hinsichtlich der wissenschaftlichen Forschung, die den Zusammenhang zwischen der Unternehmensbesteuerung und dem unternehmerischen Kapitalstock untersucht, ist mittlerweile eine beträchtliche Zahl von Literatur entstanden. Aus der vorhandenen Literatur sind jedoch zwei Schwächen zu erkennen. Erstens basieren viele der empirischen Analysen auf makroökonomischen Zeitreihendaten und zweitens finden vor allem Reduzierte-Form-Modelle Anwendung. Die vorliegende Dissertation gliedert sich in die Reihe empirischer Arbeiten unter Verwendung von Mikrodaten ein, die Aspekte der Unternehmensbesteuerung untersuchen. Die Arbeiten liefern einen Beitrag zum tieferen Verständnis aus den Teilbereichen der Finanzierunkstruktur, der gemeinsamen Bemessungsgrundlage sowie der Messung der marginalen Steuerbelastung. Dabei konzentrieren sich die Analysen auf die Aktivitäten deutscher Unternehmen im In- und Ausland sowie ausländischer Unternehmen in Deutschland. Grundlage der empirischen Untersuchungen sind vor allem vertrauliche Mikrodaten der Deutschen Bundesbank. Im Rahmen der deskriptiven und multivariaten Analyse werden Hinweise für den Zusammenhang zwischen der Besteuerung und dem unternehmerischen verhalten nachgewiesen. Damit dienen die Resultate auch als Diskussionsgrundlage für die Ausgestaltung künftiger Steuerpolitik in Deutschland und der EU.
Quantifizierung des pulmonal-arteriellen Drucks im Truncus pulmonalis des Schweins. Methode: Künstliche Induktion einer pulmonalen Hypertonie mittels Thromboxan A2 in verschiedenen Schweregraden. Quantifizierung des Blutflusses anhand magnetresonanztomographischer Flussmessung im T.p., hieraus Bestimmung des zeitlichen Flussprofils und Akzelerationszeit (AT). Korrelation der AT mit den simultan erhobenen Daten einer invasiven Druckmessung (Pulmonalis-Katheter).
Im Zeitraum von 1997 bis 2000 wurden 229 Patientinnen im Alter von 16 bis 44 Jahren wegen eines Schwangerschaftsabbruchs in einer südhessischen Allgemeinarztpraxis beraten. Die gesetzlich vorgeschriebene Beratung wurde anhand eines Fragebogens durchgeführt und dokumentiert. 50 % der Patientinnen sind verheiratet und zwischen 21 und 35 Jahre alt. Es ist jedoch im Gegensatz zu vorherigen Jahren ein klarer, wenn auch kleiner Anstieg jüngerer Frauen erkennbar, die eine Abtreibung wünschen. Der Anteil der ausländischen Patientinnen beträgt ca. 55 %, wobei die meisten Frauen aus Osteuropa kommen. 57 % der Patientinnen sind berufstätig. Kontrazeptiva haben nur etwa 45 % der Frauen verwendet. Die meisten der Patientinnen gaben Gründe für den Schwangerschaftsabbruch an, die der Eigenproblematik zuzuordnen sind. Der Anteil der Frauen, die sich zu den sozialen Notständen zählen, ist von 21 % (Zeitraum von 1994 – 1996) auf 5 % (von 1997 – 2000) gesunken. Bei 94 % der Frauen erfolgte der Abbruch wegen einer sozialen Notlage (Indikation). In dieser Notsituation sehen die ungewollt Schwangeren keine andere Alternative als den Schwangerschaftsabbruch. Den Schwangeren sollte insoweit geholfen werden, als dass sie ihren Konflikt selbst erkennen und eine Entscheidung treffen, mit der sie leben können, unabhängig davon, wie sie ausfällt. Die Beratungsprotokolle der verschiedenen Schwangerschaftskonfliktberatungsstellen unterscheiden sich nicht signifikant voneinander. Die staatlichen Hilfen sind zwar ausgedehnt und erweitert worden, jedoch sind sie bei weitem nicht ausreichend. Ist die Schwangere verheiratet und berufstätig, so fällt ihr Verdienst weg, der überbrückt werden muss. Ist die Frau alleinstehend und auf Ihren Verdienst angewiesen, müssen mehr Betreuungsmöglichkeiten für Babys / Kleinkinder angeboten werden, damit sie Ihrer Tätigkeit weiterhin nachgehen kann und nicht auf soziale Hilfen angewiesen ist. Ein deutlicher Trend ist der, dass Frauen Kind und Karriere verbinden möchten. Hier ist die Familienpolitik gefragt, für entsprechende Betreuungsmöglichkeiten der Kinder zu sorgen, bzw. soziale Hilfen und Angebote auszuweiten.
Ziel der vorliegenden Retrospektivbefragung ist die disziplinspezifische Analyse von Verletzungsarten und -häufigkeiten bei Leistungs- und Breitensportlern im Mountainbikesport. Methodik: In einer retrospektiven Erhebung wurden in zwei aufeinander folgenden Jahren aktive Mountainbikesportler mittels standardisierter Fragebogeninstrumente interviewt. Die Verwendung des Begriffs Verletzung bzw. Sportverletzung war definiert als eine während der Sportausübung im Wettkampf oder Training aufgetretene Körperschädigung durch kurzfristige äußere Gewalteinwirkung oder akute Überlastung des Bewegungsapparates mit daraus resultierendem Fahrausfall. Die Auswertung der Verletzungsraten erfolgte unter Berücksichtigung der Faktoren Professionalisierungsgrad (Breitensport vs. Welt-Cup) und Wettkampfdisziplin (Abfahrtsdisziplinen vs. Cross-Country) in Bezug auf die Expositionszeit. Ergebnisse: Bei einer Gesamtrücklaufquote von 75 % ergibt sich eine Datenbasis von 107 Welt-Cup- (39♀; 67♂, 23.1J.) und 134 Breitensportlern (17♀; 117♂, 27.4J.). Vom Erleiden mindestens einer „schweren“ Verletzung berichten 78.5% der Weltcup-Fahrer und die Hälfte aller Breitensportler. Welt-Cup-Abfahrer (1.08/1000h) charakterisiert im Vergleich zu Cross- Country Athleten (0.39/1000h) eine relativ betrachtet mehr als doppelte Verletzungsrate. Welt-Cup-Abfahrer berichten 5.5 Verletzungen/verletztem Fahrer, Cross-Country-Fahrer 4.1. Verletzungen der unteren (47 vs. 35%) und oberen Extremität (40 vs. 41%) zeigen für Leistungs- und Breitensportler vergleichbare Prävalenzraten. Bei Breitensportlern dominieren offene Wunden gefolgt von Prellungen und Frakturen, bei Leistungssportlern eine signifikant (p<0.01) höhere Frakturrate. Zudem exponieren unter den Welt-Cup Athleten die Angaben von Schädel-Hirn-Traumata (n=40). Schlussfolgerung: Mountainbikesportler weisen im Vergleich mit Sportlern anderer Sportarten eine durchschnittliche Verletzungsgefährdung auf. Wenngleich eine Welt-Cup-Teilnahme per se keine wesentliche Erhöhung des Verletzungsrisikos darstellt, zeigt sich eine höhere Gefährdung für die Abfahrtsdisziplin. Das disziplinbezogenen Gefahrenpotenzial einer schnellen Bergabfahrt mit Kurven und Sprüngen führt trotz fahrerischer Qualität und obligatorischem Tragen von vollständiger Schutzausrüstung bei den Abfahrtsdisziplinen zu einer hohen Zahl erlittener knöcherner Verletzungen und Schädel-Hirn-Traumata.
Colorectal cancer is one of the most cause of cancer and death in Western societies. Recently, histone deacetylase inhibitors (HDIs), which regulate transcription through modification of chromatin structure, received considerable interest on the ground of they ability to stop the growth and induce cell death in colon cancer tumours, representing a promising transcriptional cancer therapy. This kind of cancer initiates with an activating mutation in the Wnt cascade, allowing the nuclear import of ß-catenin binding to LEF/TCF. This induces the overexpression of growthpromoting oncogenes affecting the cell cycle arrest, lineage-specific cell differentiation and apoptosis processes. In addition, ß-catenin also participates in cell-cell adhesion via interactions with E-cadherin, which can be repressed by families of transcription factors Snail and ZEB. This, and gain of vimentin has been closely correlated with local invasion and metastasis since they avoid the induction of apoptosis through the loss of cell anchorage, a phenomenon called anoikis. In this process the inactivation of the kinases Src an FAK provoking disruption of focal adhesion complexes through is involved. LAQ824 is a HDAC inhibitor derivative of hydroxamic acid, which present antitumor effect in colon and other cancer cells. The aim of this study is to analyse the effect of LAQ824 in cell proliferation, apoptosis, motility and tumour invasion in a colon carcinoma model based on the adenoma-carcinoma sequence descrying trough which pathways LAQ824 is able to cause these effects. Here I demonstrate for the first time that a HDAC inhibitor, LAQ824, induces detachmentinduced cell death of colon cancer cell lines HCT116 and HT-29, a phenomenon called anoikis, in a caspase-dependent and p53-independent manner. In this process the component of the Wnt signalling pathway ß-catenin is involved. Furthermore LAQ824 upregulates the adhesion molecule E-cadherin expression in these cell lines independently of its repressor Snail, but probably mediated by the repressor ZEB. In addition LAQ824-induced anoikis is caused by disruption of focal adhesion complexes through inhibition of the activity of the kinases FAK and Src inhibiting cell motility indicating a strong antimetastatic potential for LAQ824.
Im Vergleich zur Implantation von Pedikelschrauben im Bereich der lumbalen Wirbelsäule stellt die Besetzung der thorakalen Pedikel hohe Anforderungen auch an erfahrene Wirbelsäulenchirurgen. Aufgrund der komplexen Anatomie der Brustwirbelsäule mit zum einen sehr kleinen Pedikeldurchmessern bei zugleich engem Spinalkanal und zum anderen der Nachbarschaft zu den großen Gefäßen besteht das Risiiko einer neurologischen Komplikation, sowie das einer Affektion der Gefäße. Ziel dieser klinischen Arbeit war die Überprüfung der Präzision der computertomographisch- assistierten Implantation von Pedikelschrauben bei traumatischen und pathologischen Wirbelsäulenveränderungen im Bereich der Brustwirbelsäule. Im Rahmen einer prospektiven Studie erfolgte von Dezember 2003 bis Oktober 2006 bei 39 Patienten mit einem Durchschnittsalter von 48,0 +/- 19,9 Jahren die Anlage eines Fixateur interne nach computertomographisch gesteuerter Drahtmarkierung der zu besetzenden Pedikel. Es wurden zu 60,1% massive Pedikelschrauben USSPedikelschrauben, Fa. Synthes/Umkirch/Deutschland) und zu 39,9% kanülierte Schrauben (NEON-System, Fa. Ulrich/Neu-Ulm/Deutschland) implantiert. Hierbei wurden zu 29,4% Pedikel der oberen Brustwirbelsäule, zu 48,2% Pedikel der mittleren Brustwirbelsäule und zu 17,8% Pedikel der unteren Brustwirbelsäule instrumentiert. Die restlichen Pedikelschrauben entfallen auf den zervikothorakalen und thorakolumbalen Übergang. Postoperativ erfolgte nach Anfertigung einer Computertomographie und multiplanarer Rekonstruktion die Auswertung der Schraubenlage von 254 implantierten Pedikelschrauben in drei Ebenen (sagittal, transversal und koronar). Bei der Auswertung wurde eine vollständige intrapedikuläre Lage der Schrauben, von Pedikelschrauben, die die Kortikalis affektieren ohne diese zu perforieren, und einer Schraubenlage mit Perforation der Kortikalis in mindestens einer Ebene unterschieden. Zusätzlich wurde das Größenverhältnis der Pedikelschrauben zum instrumentierten Pedikel analysiert, d.h. war der Durchmesser der Pedikelschraube größer als der des Pedikels und lag gleichzeitig eine zentrale Lage der Schraube vor, wurde dies als anatomisch bedingte Perforation definiert. Zu 79,6% wurde eine zentrale Lage der Pedikelschrauben dokumentiert, 16,9% der Schrauben wiesen in der multiplanaren Rekonstruktion lediglich eine Affektion der Kortikalis ohne Perforation auf. Eine „echte“ Perforation des Pedikels fand sich bei 7,5% der implantierten Pedikelschrauben. Hierbei lag lediglich in 1,2% eine mediale Kortikalisperforation vor. Bei keinem der Patienten kam es zu einer durch die Schraubenlage bedingten neurologischen Verschlechterung. Des Weiteren war bei keinem der Patienten eine Korrektur der Schraubenlage notwendig. Durch die vorliegende Studie konnte gezeigt werden, dass die computertomographischassistierte Implantation von Pedikelschrauben im Vergleich zu in der Literatur vorliegenden Daten, vor allem im Bereich der „echten“ Fehllage mit Perforation des Pedikels, hervorragende Ergebnisse aufweist. Insbesondere bei schwierigen anatomischen Verhältnissen ist diese Vorgehensweise ein sicheres und reproduzierbares Verfahren für die dorsale Instrumentierung bei traumatischen und pathologischen Veränderungen der thorakalen Wirbelsäule.
In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, wie das Fehlen eines oder beider bisher in Säugern charakterisierter Melatoninrezeptoren die Immunreaktion der Neuropeptide Vasopressin (VP) und Vasoaktives intestinales Peptid (VIP) im SCN von Mäusen beeinflusst. Untersucht wurden Veränderungen in der Lokalisation und des sich tageszeitlich verändernden Profils. Hierzu wurde der Anteil der VP- bzw. VIP- immunreaktiven Perikaryen und Fasern in Tieren bestimmt, denen entweder der Mel1ARezeptor (Genotyp aaBB), der Mel1B-Rezeptor (Genotyp AAbb) oder beide Rezeptoren (Genotyp aabb) fehlten. Die Ergebnisse wurden mit Befunden verglichen, die an Tieren des Wildtyps (Genotyp AABB) erhoben wurden. In den Tieren des Wildtyps konnten bekannte Muster in der Lokalisation und der zirkadianen Verteilung der Peptide VP und VIP bestätigt werden. Das Fehlen der Melatoninrezeptoren hatte einen Einfluss auf die Lokalisation von VIP und die zirkadiane Verteilung beider Peptide. Hierbei wurden sowohl die Dauer, die Anzahl als auch der Zeitpunkt der maximalen Immunreaktion verändert. Wenn man den Verlauf der Immunreaktionen von VP und VIP betrachtet, kann man feststellen, dass sich die Kurven in allen Genotypen stark ähneln, d.h. dass der VIP und VP-Gehalt im Laufe des Tages gemeinsamen Schwankungen unterliegt. Dies lässt vermuten, dass ihre Regulation ähnlichen Mechanismen unterliegt. Eine Auffälligkeit besteht darin, dass sowohl in der Lokalisation von VIP als auch in der zirkadianen Verteilung von VIP und VP das Fehlen beider Rezeptoren zu einem ähnlichen Phänotyp wie bei den Wildtyp-Tieren führt, obwohl bei Fehlen einer der beiden Rezeptoren der Phänotyp deutlich gegenüber dem Wildtyp verändert war. zu erkennen war. Hier lässt sich vermuten, dass sich der Mel1A und der Mel1B Rezeptor den Gehalt an den Peptiden gegensätzlich beeinflusst, dass z. B. einer der Rezeptoren eine vermehrte Bildung und der andere eine vermehrte Ausschüttung oder einen gesteigerten Abbau des Peptids bewirkt. Wenn nun beide Rezeptoren fehlen wird zwar weniger Peptid produziert, aber auch weniger abgebaut, so dass sich die Effekte ausgleichen. Über die konkreten Wirkungsmechanismen kann aber zu diesem Zeitpunkt nur spekuliert werden, da die hier durchgeführten Untersuchungen darüber noch kein klares Bild ergeben. Da es deutliche Hinweise darauf gibt, dass das Fehlen der Rezeptoren einen Einfluss auf den Gehalt und die Lokalisation der Peptide hat, wäre es nun interessant, herauszufinden, wodurch dieser zustande kommt. Der Gehalt an einem Peptid in der Zelle kann über verschiedene Mechanismen verändert werden, z.B. durch Regulation auf der Ebene der Translation oder Transkription, so dass die Menge des gebildeten Peptids verändert wird. Um dies festzustellen, kann man den Gehalt an mRNA durch in situ-Hybridisierung im Gewebe sichtbar machen. Andererseits kann eine verstärkte Ausschüttung des Peptids zu einer verminderten Immunreaktion in den Zellen führen. Wenn das Peptid in den Liquor cerebrospinalis ausgeschüttet wird, kann es in vivo durch Microdialyse nachgewiesen werden (Kalsbeek et al, 1995). Aus der vorliegenden Arbeit lassen sich viele neue Ansatzpunkte formulieren, die die Funktion der Melatoninrezeptoren im SCN weiter aufklären können.
Two distinct mechanisms contribute to the development of blood vessels: vasculogenesis, which is the de novo formation of vascular structures from progenitor cells, and angiogenesis, the formation of new blood vessels from pre-existing ones.
Angiogenesis is a highly ordered and carefully regulated multi-step process, during which the precise spatio-temporal interaction between endothelial and mural cells, i.e. smooth muscle cells and pericytes, is prerequisite for the formation of a functional blood vessel. The crosstalk between these two latter cell ty pes is mediated indirectly by various
secreted growth factors, and directly through cell-cell and cell-matrix interactions. The secretory epidermal growth factor-like protein 7 (EGFL7) has been implicated to
play an important role in the regulation of smooth muscle and endothelial cell recruitment and vascular tube formation. However, in-depth investigation of the underlying molecular mechanism has so far been hampered by the lack of functional recombinant EGFL7. In this study for the first time full length EGFL7 was successfully expressed as a His 6- tagged fusion protein from insect cells using the Baculovirus expression vector system. Recombinant EGFL7 was purified in a two-step protocol involving ion metal affinity chromatography and gel filtration. Furthermore, recombinant EGFL7 was
purified from human embryonic kidney EBN A 293 cells using a similar approach, allowing the production of high amounts of recombinant EGFL7 protein in its native state, with proper post-translational processing and full biological activity. Detailed analysis of the post-translational processing of recombinant EGFL7 and EGFL7-mutants revealed extensive proteolytic processing by protein convertases both at the N- and the C-terminus, the latter being prerequisite for EGFL7 secretion. Furthermore, secreted EGFL7 protein was shown to bind to the extracellular matrix and the responsible heparin-binding domain of EGFL7 was mapped to its N-terminal
portion. Purified recombinant EGFL7 protein was tested for its functionality using cell migration assays, cell proliferation studies and in vivo matrigel studies in mice. In the
modified Boyden chamber migration assay, recombinant EGFL7 proteins inhibited PDGF-BB-induced smooth muscle cell migration. Moreover, recombinant EGLF7 proteins strongly inhibited PDGF-BB-induced proliferation of smooth muscle cells, while it did not affect VEGF induced proliferation of endothelial cells. When applied in the in vivo matrigel plug assay, EGFL7 proteins induced a strong pro-angiogenic response, comparable with that of VEGF on an equimolar basis. Moreover, EGFL7 expression was strongly induced in endothelial cells in response to VEGF stimulation. These novel findings demonstrate the important function of EGFL7 in angiogenesis and are well in line with previous results. They demonstrate a cell specific action of EGFL7 on the different cell types involved in vessel formation, which is a prerequisite for a regulatory function in cell-to-cell crosstalk. Based on the results described here, the following model can be proposed: VEGF, a known strong initiator of angiogenesis, induces endothelial cell proliferation and migration, allowing the
escape from the comparatively rigid structure of a functional vessel to form an angiogenic sprout. At the same time VEGF induces the expression of EGFL7 in endothelial cells. EGFL7 is expressed, proc essed and secreted from these cells. While EGFL7 has no known effect on endothelial cells, it inhibits smooth muscle cell proliferation and migration, providing a mechanism to prevent pre-mature stabilization of the forming vessel. The availability of purified recombinant EGFL7 will be helpful in the detailed characterization of the underlying molecular mechanism of EGFL7 action, including the identification of the putative EGFL7 receptor, and will allow - together with knock-out experiments in mice - the exploration of the additional biological functions of EGFL7. Moreover, considering the strong pro-angiogenic effect of EGFL7 in vivo, it would be also of a great therapeutic interest to investigate its role in the development of tumor vasculature. The insights into these molecular mechanisms might provide a novel approach for the development of anti tumor therapies.
Photosystem II (PSII) is a polypeptide-cofactor complex organised as a homodimeric multisubunit protein embedded in the thylakoid membrane. PSII monomers are heterooligomers related to each other by a pseudo-twofold axis perpendicular to the membrane plane (Loll et al. 2005). PSII acts as a photochemical enzyme that through the chlorophylls and the other cofactors catalyses photon capture and electron transfer from water to the plastoquinone pool with concomitant evolution of oxygen. Photon capture and charge separation take place in the PSII core which consists of the D1 and D2 proteins, the cytochrome b559 alpha- and beta-chains (PsbE and F subunits) and the chlorophyll a-binding antenna proteins CP43 and CP47 (Loll et al. 2005). The remaining polypeptides are low molecular mass proteins with not clearly understood fuctions; they include chloroplast-encoded (PsbH, I, J, K, L, M, N, T and Z) and nucleus-encoded (PsbR, S, W and X) proteins consisting of one to four transmembrane helices (Barber et al. 1997). The oxygen-evolving part of PSII consists of a Mn-Ca transition complex called Mn cluster or oxygen evolving complex that is situated on the luminal side of PSII. In higher plants it is stabilised by the PsbO (33 kDa), PsbP (23 kDa) and PsbQ (17 kDa) extrinsic subunits (Soursa et al. 2006; Ifuku et al. 2005). The structure and mechanisms related to the oxygen evolving complex of PSII are not completely clarified. Currently two high resolution structures from the cyanobacteria S. elongatus are available (Loll et al. 2005; Ferreira et al. 2004) Nevertheless structural information is not as well defined in green algae and higher plants as in cyanobacteria. In fact the 8Å structure available from spinach has too low resolution for addressing questions such as the structural and functional differences in respect to PSII from cyanobateria (Rhee et al. 1997).. Therefore it is obvious that for PSII from higher plants the main general questions are still open: is the structure of PSII from higher plants equivalent to the structures observed in cyanobacteria? Is the typical higher plants subunit PsbS stably or transiently bound to PSII? Finding an answer to these questions was the main focus of this work. In this work a simple and rapid protocol to isolate the oxygen-evolving photosystem II (PSII) core complex from Nicotiana tabacum was developed. A PSII having a His-tag extension made of six or ten consecutive histidine residues at the N-terminus of the PsbE subunit was purified by a single-step Ni2+ NTA-affinity column chromatography after solubilisation of the thylakoid membranes using different mild detergents. Characterization of the oxygen evolution and the subunit composition by immunoblotting and mass spectroscopy revealed that the His-tagging did not affect the functional integrity of the PSII reaction center. The final PSII core complex was purified in a single step from solubilised thylakoids in less than 14 hours getting a very pure sample in high amount. The isolated core complex was in a dimeric form as demonstrated by Blue Native PAGE, analytical gel filtration and single particles analysis; with a molecular mass of about 500 kDa, consisting of D1, D2, CP43, CP47, 33 kDa and low molecular weight proteins. The preparation retains a high rate of oxygen-evolving activity but showed different stabilities of the binding of the three extrinsic proteins. The subunit of 33 kDa was always present in the preparations with a constant amount, whereas the 23 and 17 kDa subunits were always in less and unconstant amounts. Nevertheless the oxygen evolution was not depending on the amount of the 23 and 17 kDa subunits. Furthermore the preparation showed a high oxygen-evolving activity of 1390 micromol/mg Chl·h-1 in presence of betaine, while its activity was 440-680 micromol/mg Chl·h-1 in its absence. The presence of 1.0 mol/L betaine during the isolation of PSII increased the preservation of the photochemical activity hence the oxygen evolution. It was inferred from these results that His-tagging does not affect the functional and structural integrity of the PSII core complex and that the “Histag strategy” is highly useful for biochemical, physicochemical and structural studies of higher plant PSII. PSII is directly involved in two essential processes, the efficient capture and funnelling of light energy to the reaction centre and the controlled dissipation of excess excitation energy. Those functions require structural and functional flexibility in order to be performed with high efficiency. Moreover light-harvesting proteins respond to an external signal, the thylakoid pH, to induce feedback control regulating those activities in every moment. This process called non-photochemical quenching (NPQ) is mainly depending on the xanthophyll cycle and the PsbS protein (Szabo et al. 2005). In this work several new evidences related with those two processes were found. The subunit PsbS is a polypeptide whose involvement in the NPQ processes is debated. Nevertheless, its position in the PSII complex and the mechanisms by which this subunit contributes to carry out the NPQ functions are not definitely known. In addition it is not sure if it is a pigment binding protein or not. Currently several lines of evidence indicate that this subunit is able to bind two molecules of zeaxanthin, one of the pigments involved in the xanthophyll cycle. In this work immunolabelling indicated that PsbS is tightly bound to the PSII core dimer, monomer and incomplete PSII particles as Reaction Centre-CP47 (RC-CP47). Furthermore qualitative HPLC indicates a complete absence of zeaxanthin in the sample and the presence of violaxanthin, another pigment involved in the xanthophyll cycle. The absence of zeaxanthin was expected considering that the plants were harvested after the dark period and that the particles were purified in complete dark (or in green light), whereas the presence of violaxanthin was unexpected considering that so far no evidence of violaxanthin bound to PSII cores devoid of LHC proteins was reported. Furthermore the amount of chlorophyll b was not relevant for suspecting this pigment bound to PsbS. Therefore we conclude that if PsbS is able to bind chlorophyll it has to be a chlorophyll a. The results indicate that PsbS could be able to bind not only zeaxanthin but also violaxanthin. The extrinsic subunit Psb27 was also found in this preparation. The presence and the amount of this subunit, reported to be involved in the repair of damaged PSII, was not constant and therefore behaving as the other two extrinsic proteins 23kDa (PsbP) and 17kDa (PsbQ). Electron crystallography studies on spinach PSII particles purified by differential solubilisation resulted in crystalline tubes with new unit cell constants. From data analysis a density map at 15Å resolution was obtained with a P22121 symmetry. However, at this resolution it cannot be said if the internal symmetry axis is related with the two-fold axis of the dimer or the pseudo two-fold axis of the monomer. In conclusion a method to isolate functional, pure PSII core complexes was developped. These samples, together with the improved 2d crystallisation protocol could lead to crystals with higher quality hence better resolution density maps in the future.
Die Eigenschaften, die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Co-Polymeren auf Basis von a-Hydroxycarbonsäuren und Polyolen, unterscheiden sich deutlich von denn entsprechenden reinen Polymeren ohne Polyolkomponente. Die Polymere dieser Klasse, die sich durch Variation der Parameter Alkoholkomponente, Alkohol/Lactid-Verhältnis, Lactid/Glycolid-Verhätnis, L/DL-Verhältnis ergibt sind äußerst vielfältig. Schwerpunktmäßig wurden Polymere untersucht, die als Carbonsäurekomponente Milch- und/oder Glycolsäure enthalten und bei denen Glycerin oder Ethylenglycol als Polyol verwendet wurde. Diese Arbeit verfolgte zum einen das Ziel, grundlegende Erkenntnisse über die neuartige Polymerklasse zu gewinnen und zum anderen die Eignung dieser Polymere als implantierbares Arzneistoffdepot zu untersuchen. Dabei konnte – wie im ersten Teil dieser Arbeit beschrieben – nur ein Ausschnitt aus dem großen Spektrum der Polymere beispielhaft synthetisiert und untersucht werden. Von vornherein ausgeschlossen waren bei diesen Untersuchungen Polymere, deren Glasübergangstemperatur unter Raum- und über Körpertemperatur lagen. Es sollten so lagerstabile, aber nach Applikation ins Gewebe anpassungsfähige Formkörper erhalten werden. Die Untersuchungen mit den entwickelten Polymerstäbchen haben gezeigt, dass sich die Klasse der Polyol-oligolactide/co-glycoliden von herkömmlichen, reinen Polylactiden bzw. Polylactiden/co-glycoliden in einigen Punkten unterscheidet. So wurde bei keinem der Versuche ein inhomogenes Abbauverhalten festgestellt, wie dies in der Literatur bei reinen Polylactiden/co-glycoliden beschrieben ist. Es kam also nicht zu einem beschleunigten Polymerabbau im Inneren der Stäbchen durch Autokatalyse der sich dort akkumulierenden Milchsäure. Die Glycerol-Polymere scheinen eine ausreichende Diffusion der Degradationsprodukte nach außen zu gewährleisten. Dies ist eine wichtige Voraussetzung für die gleichmäßige Freisetzung von Wirkstoffen. Die Eigenschaften der Polymerstäbchen ließen sich auf unterschiedliche Weise beeinflussen. So konnte ihre Wasseraufnahmefähigkeit durch das Verhältnis der Mischung von L-Polymeren zu DL-Polymeren sehr weit variiert werden. Das amorphe DL-Polymer ermöglicht eine erleichterte Wasseraufnahme gegenüber der reinen teilkristallinen L-Variante. Die Co-Polymerisation mit Glycolid bot eine weitere Möglichkeit, die Eigenschaften der Polymere zu beeinflussen. So stieg bei den Polymeren mit gleichem Glycerin/Monomer-Verhältnis die Hydrophilie in der Reihe GOL-DL-1:18 < GOL-DL-1:13,5:4,5 < GOL-DL-1:9:9 < GOL-L-1:4,5:13,5 an. Die Versuche, die im zweiten Teil der Arbeit beschrieben werden, wurden im Rahmen der Entwicklung eines Applikationssystems für niedermolekulare Cyclooligo-peptide durchgeführt, die in der Krebstherapie eingesetzt werden sollten. Es wurde deutlich, dass die bisher verwendeten Polymerstäbchen für eine solche Anwendung nicht geeignet waren. Sie boten der zur Applikation notwendigen Menge an Peptid eine zu geringe Menge an Polymermatrix, was zu einer hohen Beladungsrate führte. Die Folge war ein mechanisch instabiles System, das nach Implantation zerbrechen könnte und so den Wirkstoff unkontrolliert freisetzen würde. Aus diesem Grund wurde ein Verpressungsverfahren gewählt, um Tabletten beziehungsweise stäbchenförmige Presslinge als Applikationssystem zu erhalten. Für beide Varianten wurde das Polymer gemahlen, die zu untersuchenden Hilfs- oder Wirkstoffe eingemischt und dann verpresst. Bei den Untersuchungen zeigte es sich, dass eine gleichmäßige Freisetzung über mehrere Tage mit diesen resorbierbaren Trägersystemen nicht möglich war. Der Grund hierfür war ein zweiphasiger Verlauf der Freisetzung. Im ersten Teil des zweiphasigen Verlaufs wurde eine große Menge des Wirkstoffes zusammen mit der niedermolekularen Komponente ausgespült. In der zweiten Phase wurde der Wirkstoff im Zuge der Degradation der höhermolekularen Komponente langsam freigesetzt. Der Einfluss des Pressdruckes bei Erstellen der Prüfkörper war für die Freisetzung eher von untergeordneter Bedeutung, während eine vermehrte Zumischung von leicht wasserlöslichen Substanzen oder die Verwendung von hydrophileren Polymeren (DL-Lactide anstelle von reinen L-Lactiden) die Freisetzung des Peptides deutlich erhöhte. Im dritten Teil der Arbeit wurde beispielhaft an den Substanzen Gentamicinsulfat, Methotrexat und einem Cyclo-Oligo-Peptid die Freisetzung aus 13 verschiedenen halbfesten Polymersystemen untersucht. Diese Systeme wurden durch Mischung von nieder- mit höhermolekularen Polymeren hergestellt. Die Menge an freigesetztem Arzneistoff korrelierte erwartungsgemäß mit der Oberfläche der Probenkörper. Die Freisetzung des gut wasserlöslichen Gentamicinsulfats erfolgte aus den Systemen mit einem hohen Anteil an niedermolekularem Polymer sehr schnell und vollständig. Systeme mit überwiegend höhermolekularem Polymer gaben den Wirkstoff weniger schnell frei und es konnte gezeigt werden, dass der Wirkstoff sich in beiden Polymeren der Mischung verteilt. Das Freisetzungsverhalten bei dem in Wasser schwerlöslichen Methotrexat war nicht grundsätzlich anders. Die Verteilung zwischen der höher- und niedermolekularen Phase ähnelt der des Gentamicinsulfates. Eine relativ hohe Beladungsrate mit einem hydrophilen Wirkstoff (EMD 121974) führte zu einer deutlich höheren Freisetzung aus dem höhermolekularen Teil des Polymergemisches, so dass insgesamt eine beinahe vollständige Freisetzung erreicht wurde. Das im vierten Teil der Arbeit untersuchte Beschichten von Hydroxylapatit- Zylindern aus einer Kombination von bFGF mit einem Glycerin-L-1:13 Lactid Polymer führte zu einer gleichmäßigeren Freisetzung als bei Zylindern, die ohne Einsatz von Polymer beschichtet wurden. Außerdem war auch noch nach dem 5. Tag eine Freisetzung von bFGF zu beobachten. Eine signifikante Verzögerung des Einwachsens von Knochen in das Implantat nach 42 und 84 Tagen konnte bei der Gruppe mit bFGF/Polymer-Beschichtung histomorphologisch gezeigt werden. Die Poren des Implantates waren mit dem Polymer gefüllt, was das Einwachsen in den ersten Wochen deutlich erschwerte. Erst nach Beginn der Degradation des Polymers war das Eindringen des umgebenden Knochen möglich. Das Polymer GOL-L-1:12 war also aufgrund seiner langsamen Degradation für eine solche Anwendung ungeeignet. Für eine Verwendung als Beschichtungsmaterial sollte ein Polymer deutlich schneller degradieren und die Beschichtungsdicke müsste optimiert werden. Die Charakterisierung der Polyol-oligolactide/co-glycoliden in dieser Arbeit hat gezeigt, dass es sich bei dieser Polymerklasse um eine sehr interessante Variante der resorbierbaren Polymere handelt. Die einfache Synthese, die gute Bioverträglichkeit und die in sehr weiten Bereichen variierbaren Eigenschaften machen diese Polymere zu vielversprechenden Kandidaten bei der Entwicklung von Arzneimittelträgern oder Medizinprodukten.
Extrazelluläre Ablagerungen aus aggregierten Abeta-Peptiden stellen das pathologische Hauptmerkmal der Alzheimer Demenz dar. Schrittweise Veränderungen der Gleichgewichtsspiegel an Abeta im Gehirn begründen den Beginn der Amyloid Kaskaden Hypothese, in deren Folge es zu einer vermehrten Bildung und Aggregation von Abeta kommt. Im Zuge dieser Arbeit wurde im Zellmodell untersucht, welche Faktoren die Aggregation und die Bildung von Abeta initiieren bzw. verstärken. Etliche Arbeiten deuten darauf hin, dass der Amyloid-Metabolismus eng mit dem zellulären Cholesteringehalt verknüpft ist. In den hier verwendeten Modellsystemen bestätigte sich dieser Befund, da die Reduktion von Cholesterin durch Lovastatin und selektive Inhibitoren der Cholesterinbiosynthese mit einer signifikanten Abnahme der Abeta-Produktion einherging. Der Statin-Effekt konnte dabei nachweislich auf die Cholesterinreduktion bezogen und gegenüber pleitropen Isoprenoid-Effekten abgegrenzt werden, da die Inhibition der Isoprenoid- Transferasen FTase und GGTase zu keiner verminderten Abeta-Sekretion führte. Für eine mechanistische Analyse wurde die Rolle des freien Cholesterins als determinierender Faktor der Membranfluidität untersucht. Die APP-Prozessierung ist in der Membran lokalisiert und unterliegt daher dem Einfluss von Cholesterin als Modulator der physikalisch-chemischen Membraneigenschaften. Die Reduktion von Cholesterin bewirkt eine Zunahme der Membranfluidität, während hohe Cholesterinspiegel zu einer starren Membran führen. Beide Zustände wurden unabhängig vom Cholesteringehalt durch den Membranfluidizer Benzyl-Alkohol und den Membranrigidizer Pluronic F68 simuliert. Die Zunahme der Membranfluidität nach der Behandlung mit Benzyl Alkohol resultierte in einer signifikant verminderten Abeta-Sekretion. Pluronic F68 hingegen führte cholesterinunabhängig zu einer Abnahme an Membranfluidität, die mit einer verstärkten amyloidogenen APP-Prozessierung einherging. Die Befunde weisen die Membranfluidität explizit als regulatorisches Element der Abeta-Produktion aus. Benzyl Alkohol und Pluronic F68 zeigten außerdem eine starke Beeinflussung der Membranorganisation in Bezug auf die Formation von Lipid Rafts als potentielle Domänen der amyloidogenen APP-Prozessierung. Benzyl Alkohol führte zu einer diffusen Lokalisation von GM-1 und Cholesterin, während Pluronic F68 eine Kondensation der Raftlipide bewirkte. Abeta selbst interagiert mit der Plasmamembran und stört deren Integrität. Eine Reihe von Daten deutet darauf hin, dass Abeta spezifisch an Komponenten der Lipid Rafts bindet. Die vorliegende Arbeit bestätigt die Kolokalisation von GM-1 und Abeta und belegt, dass die Interaktion zu einer Abnahme der Membranfluidität führt. Weiterführend konnte gezeigt werden, dass die Bindung von Abeta zu einer verstärkten amyloidogenen APP-Prozessierung führt und so einen selbstverstärkenden Mechanismus der Abeta-Produktion initiiert. Der Effekt konnte in proliferierenden Zellen durch langfristige Inhibition der Abeta-Sekretion rückgängig gemacht werden. Anhand der Ergebnisse wurde ein Modell entworfen, in dem die Aggregation von gebundenem Abeta zu einer Vernetzung von Lipid Rafts führt und so die amyloidogene APP-Prozessierung stimuliert. Die Hypothese wurde mit Hilfe von Antikörperinduzierter Quervernetzung von GM-1 überprüft und bestätigt. Zusammengenommen zeigt die vorliegende Arbeit, dass 1.) die Lovastatin-induzierte Abnahme der Abeta-Sekretion in den verwendeten Zellmodellen auf die Reduktion von Cholesterin, bzw. die daraus resultierende Zunahme der Membranfluidität zurückzuführen ist, 2.) die Membranfluidität unabhängig vom Cholesteringehalt Einfluss auf die APP-Prozessierung nimmt, wobei eine fluide Membran die nicht-amyloidogene und eine starre Membran die amyloidogene APP-Prozessierung begünstigt, 3.) die Vernetzung bzw. Kondensation von Lipid Rafts zu einer verstärkten amyloidogenen Prozessierung führt und 4.) Abeta selbst durch Bindung an die Membran diesen Zustand bedingt und damit einen Teufelskreislauf initiiert, in dem es die eigene Produktion stimuliert. Damit fügt die Arbeit dem Puzzle um die Genesis der sporadischen Form der Alzheimer Demenz einige Stücke hinzu und bietet neue Aspekte für die therapeutische Intervention der Erkrankung an.
Eine in der Forschung häufig gestellte Frage ist, welche schädlichen Auswirkungen Ärger und vor allem Ärgerausdruck haben kann. Bei Ärgerausdruck wird dabei typischerweise in nach innen gerichteten (anger-in) und nach außen gerichteten Ärger (anger-out) unterschieden. Hinsichtlich der gesundheitlichen Auswirkungen gibt es Hinweise dafür, dass beide typischen Ärgerausdrucksformen - sowohl nach innen als auch nach außen gerichteter Ärger - mit Risiken für das kardiovaskuläre System einhergehen. Allerdings ist die Vorhersagekraft einzelner Variablen nur sehr gering, so dass die Kombination von Variablen vielversprechender wirkt. Ein aktuell diskutiertes Risikocluster für koronare Herzkrankheiten ist das Typ D-Konstrukt. In Studie 1 wurden die Zusammenhänge von Typ D und Ärger und Ärgerausdruck in einer klinischen sowie einer nichtklinischen Stichprobe mit Hilfe von Fragebögen überprüft. In beiden Teilstichproben wies Typ D Beziehungen mit Ärger und Ärgerunterdrückung sowie offenem Ärgerausdruck auf. Ärger und Ärgerausdruck scheinen also auch im Typ D-Konzept eine wichtige Rolle zu spielen. Außer Belegen für gesundheitliche Auswirkungen von Ärgerausdruck wurden in jüngerer Zeit auch Hinweise auf Einflüsse auf Leistungsaspekte gefunden. Forschung aus dem Bereich der Emotionsregulation wies darauf hin, dass respondente Emotionsregulation, d.h. die Regulierung des emotionalen Ausdrucks ohne Änderung der erlebten Emotion, eine negative Wirkung auf die Bewältigung von kognitiven Aufgaben haben kann. In Studie 2 und Studie 3 wurde untersucht, ob sich auch für die respondente Regulierung des Ärgerausdrucks ein Effekt auf Leistungsvariablen feststellen lässt. Es wurde davon ausgegangen, dass sich ein inkongruenter Ärgerausdruck, also ein Ausdruck, der mit dem erlebten Ärger nicht übereinstimmt, leistungsreduzierend auswirkt. Ärger wurde mittels Provokation eines Konföderierten induziert. Der Ärgerausdruck wurde durch die Instruktion manipuliert, während einer der kognitiven Aufgabe zusätzlich eine bestimmte Emotion (ärgerlich oder neutral) darzustellen. Im Sinne der Annahme ließen sich nach inkongruentem Ärgerausdruck Defizite in der freien Erinnerung und im Zahlenverbindungstest finden. Die durchgeführten Studien sprechen dafür, dass Ärgerausdruck sowohl nach außen als auch nach innen gerichtet schädliche für Gesundheit und Leistung sein kann, wenn er übertrieben oder mit dem eigenen Erleben inkongruent ist.
An application of EPR spectroscopy that is becoming increasingly important is the measurement of distances between electron spins. Several EPR methods have been developed for this purpose, all based on measuring the dipolar coupling between two spins. Due to the specific nature of the sample, we applied dipolar relaxation enhancement measurements to study the geometry of a protein-protein complex. The paramagnetic centers in question had EPR spectra that were too broad and had such short relaxation time that they could not be studied using the more straightforward PELDOR technique. EPR spectral resolution can be increased appreciably by measuring at a frequency higher than conventional X-band (9 GHz) frequency. The spectra of many paramagnetic species can only be resolved at frequencies higher than 90 GHz. For accurate measurement of the orientation of the vector between two dipolar coupled spins with respect to the g-tensors of the spins, high spectral resolution is required. We therefore performed our EPR measurements at G-band (180 GHz) frequency. Dipolar relaxation measurements were applied to study the complex that is formed by the two electron-transfer proteins cytochrome c and cytochrome c oxidase (CcO) from the soil bacterium Paracoccus denitrificans. We were able to detect dipolar relaxation enhancement due to complex formation of soluble subunit II of P.d. CcO (CcOII) with two substrate cytochromes, which was practically absent in a mixture of CcOII with the negative control protein cytochrome c1. This complex formation was characterized by a pronounced temperature dependence that could be simulated using a home-written computer program. The G-band EPR measurements could not be simulated with a single complex geometry. This provided evidence for the hypothesis that electron-transfer protein complexes are short-lived and highly dynamic; they do not seem to form one specific electron-transfer conformation, but rather move around on each other’s binding surfaces and transfer an electron as soon as the distance between donor and acceptor is short enough. As a test of our simulation program, we also applied dipolar relaxation measurements to specially synthesized organic molecules that contained a nitroxide radical and a metal center. The transverse relaxation of Cu2+-OEP-TPA was compared to the relaxation of Ni2+-OEP-TPA at temperatures between 20 and 120 K. In this temperature range, the nitroxide relaxation was enhanced due to the presence of Cu2+, but not by Ni2+. Similarly, relaxation enhancement was found in the nitroxide-Mn2+ pair in Mn2+-terpyridine-TPA with respect to the terpyridine-TPA ligand. Due to the fast T2 relaxation of the nitroxide radical at high temperatures, the measurements were all performed in the low-temperature regime where the T1 relaxation rate of the metal ion was smaller than the dipolar coupling frequency. In this region, no structural information about the molecule can be deduced, since the dipolar relaxation enhancement is only determined by the T1 of the metal ion. The dipolar relaxation measurements we performed at high field indicated a difference in relaxation times between X-band and G-band frequencies. Extensive T1 - measurements of different paramagnetic centers (CuA, Cu2+) confirmed a strong dependence of T1 on magnetic field in the temperature range where the direct process is the dominating T1 relaxation process. This dependence is very strong (factor of 103 with respect to X-band), but does not follow the B04 dependence predicted in literature. The T1 relaxation of low-spin iron in cytochrome c at high magnetic field, estimated from dipolar relaxation data, is also in agreement with a larger contribution by the direct process (factor of 104). Dipolar relaxation enhancement was found to be a technique that is useful for measuring distances between paramagnetic centers, but only for systems where several important conditions are met, such as: the system exists in one certain static geometry, and the relaxation rate of the fast-relaxing spin is faster than the dipolar coupling frequency within the accessible temperature range. Additionally, it is a great advantage for the analysis of dipolar relaxation data if the procedure of dividing the relaxation trace of the dipolar-coupled slow-relaxing spin by the relaxation trace of the slow-relaxing spin in absence of dipolar coupling can be applied. Another useful application of dipolar relaxation enhancement measurements is the measurement of T1 relaxation of extremely fast-relaxing spins, or spins that are otherwise difficult to detect.
Untersuchungen zur ZNS-Bioverfügbarkeit wirksamkeitsbestimmender Inhaltsstoffe von Johanniskraut
(2007)
In der vorliegenden Arbeit wurde die ZNS-Bioverfügbarkeit der Quercetin-Flavone und der Naphthodianthrone aus Hypericum perforatum untersucht. Hierzu wurde jew. eine HPLC-gestütze Methode zur Quantifizierung der genannten Stoffe in ZNS und Plasma erstellt und in enger Anlehnung an internationale Richtlinien (ICH- u. FDAGuidelines) validiert. Mit Hilfe dieser Methoden wurden im Anschluss Rattenfütterungsstudien durchgeführt und ausgewertet. Im Falle der Quercetin-Flavone konnte eindeutig gezeigt werden, dass diese Stoffgruppe ZNS-bioverfügbar ist und bei wiederholter Gabe (1 x tgl.) über den beobachteten Zeitraum von 8 Tagen im ZNS kumuliert. Ferner ist es gelungen, erste ZNS-Spiegelkurven der Quercetin-Flavone nach Einmal- und Mehrfach-Gabe aufzuzeichnen. Im Gegensatz hierzu weisen die Naphthodianthrone, unter Berücksichtigung der analytischen Grenzen, keine ZNS-Bioverfügbarkeit auf. Betrachtet man diese Ergebnisse im Kontext der bisher erschienenen Publikationen zu Johanniskraut, lässt sich sagen, dass durch die vorliegende Arbeit die Rolle der Flavonoide eindeutig an Bedeutung gewinnt und die der Naphthodianthrone eindeutig an Bedeutung verliert. Schaut man auf die bisher untersuchten Inhaltsstoffe von Johanniskraut, wird deutlich, dass den Phloroglucinolen die wohl herausragendste Bedeutung zukommt, was nicht zuletzt durch Keller et al.[137] und Müller et al. [27,59,67] gezeigt werden konnte. Für die klinische Wirksamkeit des Hypericum-Extraktes sind jedoch auch die Flavonoide essentiell, was durch Tierstudien gezeigt und durch diese Arbeit unterstüzt werden konnte[114]. Der Mechanismus, durch den die Flavonoide zur antidepressiven Wirksamkeit beitragen, liegt, im Gegensatz zu dem der Phloroglucinole, jedoch noch im Dunklen. Durch die Präsenz von Quercetin bzw. dessen Metaboliten im ZNS auf der einen und den Ergebnissen von Tierstudien zur antidepressiven Wirksamkeit isolierter Flavonoide mit Hilfe des Porsolt-Tests auf der anderen Seite[33] lässt sich jedoch spekulieren, dass die Flavonoide einen direkten antidepressiven Effekt ausüben und nicht nur indirekt durch Verbesserung, beispielsweise der ZNS-Bioverfügbarkeit der Phloroglucinole o. ä., zu den antidepressiven Eigenschaften des Extraktes beitragen. Durch ihr Unvermögen, die Blut-Hirn-Schranke in nennenswerten Konzentrationen zu überschreiten, treten die Naphthodianthrone, die in der Vergangenheit als für die Wirksamkeit wichtigsten Inhaltsstoffe angesehen wurden, eindeutig in den Hintergrund. Als Beitrag dieser Stoffgruppe zur antidepressiven Wirksamkeit ist demnach erstens ein wie auch immer gearteter indirekter Effekt durch Verbesserung der ZNS-Bioverfügbarkeit der ZNS-gängigen Substanzen, zweitens ein wegen der bestenfalls möglichen, niedrigen Konzentrationen schwacher antidepressiver Effekt im ZNS, drittens ein antidepressiver Effekt durch aktive Metaboliten oder viertens ein antidepressiver Effekt, der sich in der Peripherie beispielsweise durch Beeinflussung der HPA-Achse abspielt, denkbar. Für ersteres existieren bis dato keinerlei Anhaltspunkte, für den zweiten Punkt existieren weder Beweis noch Gegenbeweis noch Spekulationen in der Literatur, dasselbe gilt für den dritten Punkt, der vierte Punkt wird hingegen kontrovers diskutiert[44,97,143]. In Publikationen wurde hierzu festgestellt, dass unter dem Einfluss von Hypericin sich die Blutspiegel an Cortisol und ACTH, die bei Depressiven erhöht bzw. gestört sind, wieder normalisieren. Der Einwand der Kritiker dieses Wirkmodells scheint hierbei aber plausibel, da es sich bei dem mit Hilfe von Hypericin beeinflussbaren, beobachteten Phänomen der Erhöhten Cortisol- und ACTH-Plasmaspiegel auch nur um ein Symptom einer Depression und nicht um einen für die Depression ursächlichen Vorgang handeln kann. Nicht jeder, bei dem erhöhte Cortisol- und veränderte ACTH-Spiegel vorliegen ist zwangsläufig depressiv. Das exakte Zusammenspiel der einzelnen Extrakt-Komponenten, von denen die bisher in den Focus der Untersuchungen geratenen Stoffe nur etwa 10 bis 15% ausmachen, bleibt jedoch auch weiterhin zum größten Teil im Unklaren, wenngleich gerade dieses Zusammenspiel die besonderen Eigenschaften des Extraktes und dessen Wirkung ausmachen. Unverzichtbare Bestandteile sind hierbei Phloroglucinole und Flavonoide, die in angemessenen Konzentrationen im Extrakt repräsentiert sein müssen, um ein klinisch hochwertiges Produkt zu gewährleisten. Inwieweit ein repräsentativer Gehalt an Hypericinen im Extrakt vorhanden sein sollte, ist nicht zuletzt auf Grund der Ergebnisse dieser Arbeit mit einem Fragezeichen zu versehen, wenngleich die Datenlage zur Zeit keinesfalls ausreicht, die Hypericine gänzlich aus dem Extrakt zu verbannen. In wie weit die An- oder Abreicherung einzelner Komponenten zu einer Verbesserung der klinischen Wirksamkeit führt, muss jedoch stets in zusätzlichen Studien eruiert werden. Insgesamt steht aber mit dem Johanniskraut-Extrakt für die erfolgreiche Therapie von milden bis mittelschweren Depressionen ein wichtiges, fast unverzichtbares Werkzeug zur Verfügung, das sich insbesondere durch sein verglichen mit synthetischen Antidepressiva, überaus günstiges Profil an unerwünschten Arzneimittel-Wirkungen auszeichnet. Trotz in jüngster Zeit propagierter Bedenken hinsichtlich der Unbedenklichkeit der Anwendung von Johanniskraut Extraktpräparaten besonders in Kombination mit anderen Arzneistoffen, was jedoch einer genaueren Betrachtung nur schwer standhält[144], stellt der Johanniskraut-Extrakt zur Behandlung milder bis mittelschwerer Depressionen ein unverzichtbares Werkzeug dar.
Ziele der vorliegenden Arbeit waren einerseits die Inventarisierung der Neo- und Archäophyten, die im Stadtgebiet von Frankfurt am Main im Zeitraum 1700-2006 nachweisbar sind, und die Analyse der Veränderungen während dieses Zeitraumes, andererseits die Untersuchung möglicher Auswirkungen von Neo- und Archäophyten auf die Biodiversität am Beispiel von Brachestandorten. Zur Inventarisierung wurde eine Kombination aus Literatur- und Herbarrecherche im Herbarium Senckenbergianum (FR) mit Feldarbeit in Form einer Rasterkartierung zwischen September 2002 und September 2005 mit Nachträgen aus dem Jahr 2006 durchgeführt. 609 Arten (unter Berücksichtigung von Unterarten/Varietäten 634 Sippen) aus 84 Familien wurden über den Gesamtzeitraum nachgewiesen, wobei mehr als 75 % der Sippen zu 20 Familien gehören. Die erfassten Sippen wurden nach ihrer Einwanderungsgeschichte, Einwanderungsweise und ihrem Einbürgerungsgrad bewertet. 54 % aller Sippen erwiesen sich als Ergasiophygophyten. Aktuell wurden 462 anthropochore Sippen nachgewiesen. Die Familie mit den meisten anthropochoren Vertretern sind sowohl aktuell als auch im Gesamtzeitraum die Asteraceae, die auch auf Brachen eine heruasragende Stellung einnehmen. Der gesamte Untersuchungszeitraum wurde in neun Abschnitte untergliedert. Die Häufigkeit jeder Sippe wurde für die einzelnen Abschnitte in einer sechsstufigen Skala, die sich an die Ergebnisse der Rasterkartierung anlehnt, eingeschätzt. Dadurch wurde es erstmals möglich die starke Zunahme der Neophyten in der Stadtflora sowie den Rückgang von Archäophyten für einen Zeitraum von 300 Jahren quantitativ darzustellen. Untersuchungen zur Diversität erfolgten auf Brachestandorten im Stadtgebiet. Dazu wurden 2003 und 2004 insgesamt 220 Vegetationsaufnahmen nach Braun-Blanquet durchgeführt. Die Probeflächen wurden nach geschätztem Alter in vier Kategorien unterteilt und mit Hilfe von Diversitätsindizes (Evenness, Simpsonund Shannon-Index) verglichen. Es zeigte sich, dass die Diversität auf jungen, d.h. 1-2 Jahre alten Brachen, am höchsten ist und mit zunehmendem Alter abnimmt. Brachen, die erst im Untersuchungsjahr angelegt worden waren, zeigten die größte Variabilität. Auf nährstoffreichen Böden war die Diversität besonders hoch, auf nährstoffarmen Böden extrem niedrig. Brachen, die älter als 5 Jahre waren, zeigten die geringste Diversität und die niedrigsten Zahlen von Archäo- und Neophytenarten. Die höchste Gesamtartenzahl auf 25 m² betrug 58, wobei maximal 16 Archäophyten- und 19 Neophytenarten, im Mittel jedoch nur drei Archäophyten- und vier Neophytenarten, nachgewiesen wurden. Zwischen der Gesamtartenzahl auf Brachen und der Artenzahl von Neo- und Archäophyten ließ sich kein signifikanter Zusammenhang feststellen. Allerdings sind Neophyten auf Brachen aller Altersklassen gleich erfolgreich, während Archäophyten ihren Schwerpunkt auf jungen Brachen haben und mit zunehmendem Brachealter zurückgehen. Die beiden am häufigsten auf Brachen gefundenen Sippen sind die indigenen Hypericum perforatum und Artemisia vulagris. Der Neophyt Fallopia x bohemica und das einheimische Calamagrostis epigejos sind als einzige im Untersuchungsgebiet in der Lage Einart-Bestände zu bilden. Andere, auf den ersten Blick von einer Art (z.B. Solidago canadensis) dominierte Flächen, wiesen bei näherer Untersuchung eine für Brachen durchschnittliche Diversität auf. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass jungen Brachen bis zum 3. Jahr eine besondere Bedeutung in der Stadtökologie zukommt. Sie bieten z.B. Segetalarten Lebens- und Rückzugsraum. Die Diversität alter Brachen beruht auf ihrem Mosaik verschiedener Lebensräume, die mit dieser Untersuchung nicht erfasst werden konnten.
Das Prostatakarzinom ist die häufigste maligne Erkrankung des männlichen Patienten. Sie weist von allen Krebskrankheiten den extremsten Anstieg mit dem Lebensalter auf. In den letzten Jahren gab es einen kontinuierlichen Anstieg der Neuerkrankungen in Deutschland. Das Prostatakarzinom kann unter Umständen zu einer beträchtlichen Einschränkung der Lebensqualität führen und ist in fortgeschrittenen Stadien nicht mehr heilbar. Daher ist es das Ziel, durch Ausschöpfung aller frühdiagnostischen Maßnahmen, möglichst viele Patienten in einem früheren Stadium mit einem kleinen, auf die Prostata begrenzten Tumor zu entdecken und entsprechend auch zu therapieren. Die Behandlung als auch die Prognose des Patienten sind wesentlich durch das Stadium der Erkrankung bei Diagnosestellung bestimmt. Im organbegrenzten Tumorstadium ist das Prostatakarzinom heilbar [11-13]. Ein auf die Prostata beschränktes Karzinom wird üblicherweise durch eine radikale Entfernung von Prostata, Samenblasen und Lymphknoten mit kurativer Zielsetzung behandelt [14]. Bei organbegrenztem Tumor beträgt das progressionsfreie 10-Jahres Überleben ungefähr 75 Prozent [15]. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin durch Untersuchung der klinischen Ergebnisse und der prä- und postoperativen Daten einen Zusammenhang zwischen Komplikationen, Rezidivrate und Kontinenz zu erkennen. In der vorliegenden Studie sind 204 Patienten, bei denen in der Zeit vom 01.03.2001 bis 31.12.2003 eine radikale Prostatektomie durchgeführt wurde, retrospektiv untersucht worden. Im August 2006 wurden die niedergelassenen weiterbehandelnden Urologen angeschrieben und der aktuelle PSA-Wert sowie die Kontinenz erfragt. Die Analyse der erfassten Daten zeigt, dass verschiedene präoperative und pathologische Parameter einen deutlichen Zusammenhang zu den postoperativen Ergebnissen aufweisen. Es konnte gezeigt werden, dass Patienten, die präoperativ einen hohen PSA-Wert (> 10 ng/ml) hatten, auch postoperativ einen PSA-Wert > 0,2 ng/ml hatten. 25 Patienten haben ein PSA-Rezidiv in der Zeit bis August 2006 bekommen. 12 der 25 Patienten, die ein PSA-Rezidiv bekommen haben, hatten präoperativ ein PSAWert > 10 ng/ml. Auch konnte gezeigt werden, dass eine Dauer < 40 Tage zwischen Diagnose und Operation sich positiv auf ein rezidivfreies Überleben auswirkt. 3 Patienten, die ein Gleason-Grading < 7 bei der Operation hatten, haben aktuell einen PSA-Wert > 0,1 ng/ml. 12 Patienten, die ein Gleason-Grading > 7 bei der Operation hatten, haben aktuell einen PSA-Wert > 0,1 ng/ml. Auch kam es bei einer Dauer > 40 Tage zwischen Diagnose und Operation seltener zu einem zutreffenden Grading oder Overgrading aber häufiger zu einem Undergrading. Sowohl der PSA-Verlauf als auch der Gleason-Score sind entscheidende Faktoren für die Prognose des Patienten. Die Zeit zwischen positivem Stanzbefund und Operation sollte nicht unnötig lange sein.
FTY720, ein synthetisches Sphingosin Analogon von Myriocin, ist ein neuartigerImmunomodulator, der in vivo Homing und Migration von Lymphozyten moduliertund hierbei die Immunantwort in verschiedenen Transplantations- undAutoimmunmodellen hemmt. Zudem konnte in aktuellen Untersuchungen einausgeprägter Anti-Tumor-Effekt von FTY720 in mehreren Krebszelllinien,einschließlich Leukämie-, Lymphoma- und Glioma-Zellen dargelegt werden. In vitroVersuche zeigten, dass FTY720 die Proliferation von malignen Zellen hemmtund/oder Apoptose in Krebszellen induziert. Im Rahmen dieser Dissertationuntersuchten wir zum ersten Mal die biologischen Wirkungen von FTY720 inhumanen Kolonkarzinomzellen.
Zunächst wurde die Auswirkung von FTY720 auf das Wachstumsverhalten von dreiverschiedenen Kolonkarzinomzelllinien (Caco-2, HT-29 und HCT-116) durch dieMessung der Zell-Proliferation mittels BrdU-Einbau und Kristallviolett-Assay sowiederStoffwechselaktivität im MTT-Test ermittelt. Die Behandlung dieser Zelllinienmit steigenden Konzentrationen von FTY720 (6-15 μM) führte zu einer dosis- undzeitabhängigen Verminderung der Zell-Überlebensrate. Zur Charakterisierung dieserHemmung der Proliferation untersuchten wir mit Hilfe von Western blot Analysen dieExpression wichtiger Faktoren der Zellzykluskontrolle in Caco-2-Zellen unterWirkung von FTY720. Dabei konnten wir zeigen, dass die Expression des Cdk-Inhibitor p27Kip1 hochreguliert wird, während die von Cyclin D1 und Cdk4 starkreduziert werden, was auf einen Zellzyklusarrest in der G1-Phase hindeutet. Dienachfolgende Untersuchung hinsichtlich einer Induktion von Apoptose zeigte eineSteigerung der DNA-Fragmentierung nach Behandlung mit FTY720, begleitet voneiner Zunahme der Bax/Bcl-2-Ratio als Zeichen einer Aktivierung desmitochondrialen (intrinsischen) Weges, und letztendlich einer Aktivierung vonCaspase-3. Ferner stellten wir fest, dass FTY720 zu einer signifikanten Steigerung derTRAIL-Protein-Expression führt und so möglicherweise Apoptose ebenfalls über denextrinsischen Signalweg vermittelt. Schließlich konnte gezeigt werden, dass der Anti-Tumor-Effekt von FTY720 mit einer Hemmung der Phosphorylierung vonp44/42MAPK, terminalem Stellglied des Ras/MAPK-Signalweges, und einer Induktion der Expression von PTEN, einem negativem Regulator des PI3K/Akt-Signalweges,einhergeht.
Zusammenfassend ist festzustellen, dass FTY720 in vitro im kolorektalen Karzinomeinen ausgeprägten Anti-Tumor-Effekt besitzt, welcher durch eine Inhibition desZellwachstums über einen G1-Zellzyklusarrest und eine Induktion der Apoptose überden extrinsischen und den intrinsischen Weg vermittelt wird.
The rate of species extinctions due to anthropogenic activities has dramatically increased within the past few centuries (Dirzo & Raven, 2003; Novacek & Cleland, 2001). Although the mechanisms and ultimate causes leading to the extinction of species remain largely unclear (Frankham et al., 2002), five threats to global biodiversity have frequently been referred to as the most important: habitat destruction and fragmentation, global climate change, hunting and overuse of food resources, biological invasions and environmental pollution (Dudgeon et al., 2006; Lewis, 2006; Novacek & Cleland, 2001). Different research fields, as conservation biology, ecology and ecotoxicology, investigate the effects of these factors on organisms and found strong evidence for their negative impact on regional and global biodiversity.
In most cases, natural populations will be impacted not only by one threat, but rather a combination of them (Buckley & Roughgarden, 2004; Kappelle et al., 1999). Multiple environmental stress factors can have cumulative negative effects on the survival of populations (Sih et al., 2004). To understand, how natural populations respond to combinations of different stress factors is thus of crucial importance in order to understand our present and future impact on all scales of biodiversity (Warren et al., 2001).
The effects of anthropogenically introduced chemicals on organisms and ecosystems are investigated in the field of ecotoxicology. Research in this area has led to a large body of information concerning the impact of chemical stress on the fitness of model species in the laboratory. In contrast to this, there is an obvious lack of knowledge on the effects of contaminants on natural populations and communities (Bickham et al., 2000; Bourdeau et al., 1990). For instance, ecotoxicologists have just started to investigate the impact of environmental pollution on the genetic variability of natural populations (Bickham et al., 2000; Whitehead et al., 2003). Genetic variation provides the raw material for populations in order to adapt to changing environmental conditions and is thus the substrate for evolution and long-term survival of populations and species (Frankham, 2005). The amount of genetic variation in populations is positively correlated with the effective population size (Frankham, 1996). Habitat destruction and fragmentation has divided the ranges of many species into small and isolated refuges. Without migration from adjacent habitats, isolated populations will decrease in their level of genetic diversity through random loss of alleles (Hedrick, 2000). Frankham (1995) for instance, showed that 32 of the 37 endangered species (which occur in small populations per definition) of different animals and plant taxa display reduced levels of heterozygosity compared to closely related and more frequent species.
In strongly human impacted landscapes, both factors, environmental pollution and habitat destruction, can be expected to occur frequently together. It is thus of crucial importance to investigate the impact of reduced genetic diversity and inbreeding on the response to chemical stress. In addition, chemical exposure has frequently been discussed to have an impact on the extent of genetic variability in exposed populations (Guttman, 1994; Staton et al., 2001; van Straalen & Timmermans, 2002). However, evidence for this 'genetic erosion hypothesis' remained scarce to date, most likely because of the difficulty to single out the impact of pollution stress from a background of multiple factors which influence patterns of genetic variability in natural populations (Belfiore, 2001; Staton et al., 2001; van Straalen & Timmermans, 2002).
In this thesis we investigate the role played by gauge fields in providing new observable signatures that can attest to the presence of color superconductivity in neutron stars. We show that thermal gluon fluctuations in color-flavor locked superconductors can substantially increase their critical temperature and also change the order of the transition, which becomes a strong first-order phase transition. Moreover, we explore the effects of strong magnetic fields on the properties of color-flavor locked superconducting matter. We find that both the energy gaps as well as the magnetization are oscillating functions of the magnetic field. Also, it is shown that the magnetization can be so strong that homogeneous quark matter becomes metastable for a range of parameters. This points towards the existence of magnetic domains or other types of magnetic inhomogeneities in the hypothesized quark cores of magnetars. Obviously, our results only apply if the strong magnetic fields observed on the surface of magnetars can be transmitted to their inner core. This can occur if the superconducting protons expected to exist in the outer core form a type-I I superconductor. However, it has been argued that the observed long periodic oscillations in isolated pulsars can only be explained if the outer core is a type-I superconductor rather than type-I I. We show that this is not the only solution for the precession puzzle by demonstrating that the long-term variation in the spin of PSR 1828-11 can be explained in terms of Tkachenko oscillations within superfluid shells.
The goal of this thesis was to gain further insight into the binding behavior of ligands in the heptahelical domain (HD) of group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs). This was realized by the establishment of strategies for the detection and optimization of molecules acting as non-competitive antagonists of group I mGluRs (mGluR1/5). These strategies should guarantee high diversity in the retrieved chemotypes of the detected compounds not resembling original reference molecules (“scaffold-hopping”). The detection of new scaffolds, in turn, was divided into two approaches: First the development of pharmacological assays to screen compounds at a certain target for bioactivity (here: affinity towards the allosteric recognition site of mGluR1 and mGluR5), and second the evaluation of computer assisted methods for the identification of virtual hits to be screened afterwards on the pharmacological assays established before. Promising molecules should be optimized with respect to activity/affinity and selectivity, their binding mode investigated and, finally, compared to existing lead compounds. Initially, membrane based binding assays for the HD of mGlu1 and mGlu5 receptors with enhanced throughput (shifting from 24-well plates to 96-well plates) were set up. For the mGluR1 assay the potent antagonist EMQMCM exhibited high affinity towards the binding site (Ki ~3nM), which is in accordance with published data from Mabire et al. (functional IC50 3nM). For mGluR5 the reference antagonist MPEP binds with high affinity to the receptor (binding IC50 13.8nM), which confirmed earlier findings from Anderson et al. (binding IC50 15nM). In another series of experiments the properties of rat cerebellar (mGluR1) and corticalmembranes (mGluR5) as well as of radiotracers were investigated by means of binding saturation studies and kinetic experiments. Furthermore, the influence of the solvent DMSO, necessary for compound screening of lipophilic substances, on positive and negative controls was evaluated. As the precise architecture of the HD of mGluR1 is still not known our efforts in identifying new ligands for this receptor focused on the ligand-based approach. All computer assisted methods that were applied to virtually screen large compound collections and to retrieve potential hits (“activity-enriched subsets”) acting at the heptahelical domain of mGluR1 relied on the existence of a valid dataset of reference molecules. This was realized by an initial compilation of a mGluR reference data collection comprising in total 357 entries predominantly negative but also some positive allosteric modulators for mGluR1 and mGluR5. In the next step a pharmacophore model for non-competitive mGluR1 antagonists was constructed. It was based upon six selective, potent and structurally diverse ligands. Prospective virtual screening was performed using the CATS atom-pair descriptor. The Asinex Gold-Collection was screened for each seed compound and some of the most similar compounds (according to the CATS descriptor) were ordered and tested forbinding affinity and functional activity at mGluR1. A high hit rate of approximately 26% (IC50 < 15 micro M) was yielded confirming the applicability of this method. One compound exerted functional activity below one micro molar (IC50-value of C-07:362nM ± 0.03). Moreover, non-linear principal component analysis was employed. Again the Asinex vendor database served as test database and was filtered by the pharmacophore model for mGluR1 established before. Test molecules that were adjacently located with mGluR1 antagonist references were selected. 15 compounds were tested on mGluR1 in binding and functional assays and three of them exhibited functional activity (IC50) below 15 micro M. The most potent molecule P-06 revealed an IC50-value of 1.11 micro M (± 0.41). The COBRA database comprising 5,376 structurally diverse bioactive molecules affecting various targets was encoded with the CATS descriptor and used for training two selforganizing maps (SOM). The encoded mGluR reference data collection was projected onto this map according to the SOM algorithm. This projection allowed to clearly distinguish between antagonists of mGluR1 and mGluR5 subtype. 28 compounds were ordered and tested on activity and affinity for mGluR1. They exhibited functional activity down to the sub-micro molar range (IC50-value of S-08: 744nM ± 0.29) yielding a final hit rate of 46% (<15 micro M). Then, the Asinex collection was screened using the SOM approach. For a predicted target panel including the muscarinic mACh (M1) receptor, the histamine H1-receptor and the dopamine D2/D3 receptors, the tested mGluR ligands exhibited the calculated binding pattern. This virtual screening concept might provide a basis for early recognition of potential sideeffects in lead discovery. We superimposed a set of 39 quinoline derivatives as non-competitive mGluR1 antagonists that were recently published by Mabire and co-workers. A CoMFA model (QSAR) was established and the influence of several side chains on functional activity was investigated. The coumarine derivative C-07 was obtained as a result of similarity searching. Starting from this compound a series of chemical derivatives was synthesized. This led to the discovery of potent (B-28, IC50: 58nM ± 0.008; Ki: 293nM ± 0.022) and selective (rmGluR5 IC50: 28.6 micro M) mGluR1 antagonists. From a homology model of mGluR1 we derived a potential binding mode for coumarines within the allosteric transmembrane region. Potential interacting patterns with amino acids were proposed considering the difference of the binding pockets between rat and human receptors. The proposed binding modes for quinolines (here:EMQMCM) and coumarines (here:B-04) were compared and discussed considering in particular the influence on activity of several side chains of quinolines obtained from the QSAR studies. The present studies demonstrated the applicability of ligand-based virtual screening for non-competitive antagonists of a G-protein coupled receptor, resulting in novel, potent and selective agents.
Riboswitche sind hoch strukturierte RNA‐Elemente, die durch direkte Bindung von kleinen Metaboliten die Expression vieler bakterieller Gene kontrollieren. Sie bestehen aus einer Ligand‐bindenden Aptamerdomäne und einer so genannten Expressionsplattform. Im Zuge der Metabolitbindung an die Aptamerdomäne ändert sich die Konformation der Expressionsplattform. Diese Konformationsänderung führt zu einem vorzeitigen Abbruch der mRNA‐Transkription oder zu einer Inhibierung der Translationsinitiation. In Bacillus subtilis wurden zwei Klassen von Riboswitchen gefunden, die trotz einer sehr hohen Homologie in ihrer Primär‐ und Sekundärstruktur spezifisch zwischen den Purinen Guanin und Adenin unterscheiden.
Durch den direkten NMR‐spektroskopischen Nachweis von Wasserstoffbrückenbindungen konnte der Bindungsmodus von Adenin, Guanin und von weiteren Purinliganden an diese beiden Klassen von Riboswitch‐RNAs beschrieben werden. Für beide Purin‐Riboswitche wurde ein gemeinsamer Bindungsmechanismus des Purinliganden an die RNA beobachtet. Hierbei bildet der Purinligand ein intermolekulares Basentripel mit der Riboswitch‐RNA aus. Die Spezifität der Metabolitbindung ist das Resultat eines intermolekularen Watson‐Crick Basenpaars zwischen dem gebundenen Liganden Guanin und einem Cytidin bzw. zwischen dem Liganden Adenin und einem Uridin der jeweiligen Riboswitch‐RNA. Zusätzlich wurde eine zweite Basenpaarung zwischen der Riboswitch‐RNA und dem gebundenen Liganden entdeckt, die in beiden Riboswitch‐Klassen identisch ist und ein weiteres Uridin der RNA und die N3/N9 Seite des Purinliganden einschließt. Diese Basenpaarung entsteht durch ein bislang unbeschriebenes Wasserstoffbrückenbindungsmuster, das zur Affinität der RNA‐Ligand‐ Wechselwirkung beiträgt. Die beobachteten intermolekularen Wasserstoffbrückenbindungen zwischen der RNA und dem gebundenen Purinliganden erklären die beobachtete Spezifitätsumkehrung einer C zu U Mutation in der Ligandbindungstasche der Riboswitch‐ RNA und die Unterschiede der Bindungsaffinitäten von verschiedenen Purinanaloga.
Weiterhin wurden die Ligand‐ und Kation‐induzierten konformationellen Änderungen der isolierten Aptamerdomänen beider Purin‐bindenden Riboswitche und des gesamten Guanin‐ Riboswitches mittels NMR‐Spektroskopie untersucht. Demnach ist die Ligandbindungstasche in der Ligand‐ungebundenen Form unstrukturiert und Ligandbindung verläuft nach einem induced fit‐Mechanismus. Die Untersuchung der freien und Mg2+‐gebundenen Form der Ligand‐ungebundenen Aptamerdomäne zeigte Unterschiede zwischen den beiden eng verwandten Purin‐bindenden Riboswitchen. Während die Wechselwirkung zwischen den hoch konservierten Sequenzen der apikalen Schlaufen der Helix II und III in der Mg2+‐freien Form des Guanin‐Riboswitches vorgeformt ist, ist sie in der Mg2+‐freien Form des Adenin‐ Riboswitches nicht ausgebildet, wird jedoch in Gegenwart von Mg2+ ausgebildet. Es konnte gezeigt werden, dass dieser konformationelle Unterschied zwischen den Ligand‐ ungebundenen Purin‐Riboswitchen durch die Stabilität der apikalen Basenpaare in Helix II festgelegt wird. Die im Guanin‐Riboswitch gefundene stabile Schlaufen‐Schlaufen‐ Wechselwirkung kann auch außerhalb der Riboswitchsequenz existieren. Durch Mg2+, Mn2+ und Co(NH3)63+ Titrationen der Ligand‐gebundenen Purin‐Riboswitch Aptamerdomänen konnten spezifische Kationbindungsstellen lokalisiert werden, die in beiden Komplexen übereinstimmen und eine Rolle in der Stabilisierung der RNA‐Struktur spielen.
Um die Sekundärstruktur des gesamten Guanin‐Riboswitches in seiner freien und Ligand‐ gebundenen Form zu untersuchen, wurden die NMR‐Spektren dieser RNA mit denen der freien und Ligand‐gebundenen isolierten Aptamerdomäne und der isolierten Terminator‐ und Antiterminatorelemente verglichen. Überaschenderweise bildet bereits die freie Form des gesamten Guanin‐Riboswitches das Terminatorelement und die Aptamerdomäne aus. Somit finden konformationelle Änderungen im Zuge der Ligandbindung einzig in der Aptamerdomäne statt. Weiterhin wurde die Struktur der freien und Ligand‐gebundenen Form einer verkürzten Guanin‐Riboswitch‐RNA untersucht. Diese RNA ist ein Modell für ein Transkriptionsintermediat, das durch eine der drei RNA‐Polymerase‐Ruhestellen induziert wird, die in der Riboswitch‐Sequenz aufzufinden sind. Interessanterweis schließen sich die Ligandbindung an die Aptamerdomäne und die Ausbildung des Antiterminators nicht gegenseitig aus, wie bisher angenommen. Die verkürzte RNA kann in Abhaengigkeit von verschiedenen experimentellen Bedingungen unterschiedliche Sekundärstrukturen annehmen. Das hat interessante Auswirkungen auf die Rolle der im Terminatorelement lokalisierten Transkriptionsruhestelle für den genregulatorischen Prozess und führt zu einem neuen Modell der Funktionsweise des Guanin‐Riboswitches.
Der neoproterozoische Faltengürtel Kameruns (NFBC) ist durch Zahlreiche Pan- Afrikanische Plutone charakterisiert, die von krustalen Scherzonen durchsetzt werden. Der NFBC resultiert aus der Konvergenz des Westafrikanischen und des Kongo/Saõ-Francisco Kratons. Die Borborema Provinz (BOP) in NE-Brasilien wird als Äquivalent des NFBC angesehen. Bisher vorliegende Daten legen nahe dass die Borborema Scherzonen in kontinentaler Kruste durch dextrale Extrusion der BOP enstanden sind. Letztere wurde durch differentielle Bewegungen (Rotation induziert durch Subduktion und Kollision) des Kongo/Saõ- Francisco und des Westafrika-Kratons ausgelöst. Die Aktivität der Scherzonen fällt mit einer Hochtemperatur-Mittel- bis Niederdruckmetamorphose zusammen, welche mit partieller Aufschmelzung und Intrusion krustaler sowie Mantelschmelzen einhergeht. Die Bewegungen entlang dieser Scherzonen begannen zwischen 590 und 570 Ma und hielten bei abnehmender Temperatur bis etwa 500 Ma an. Ob die Scherzonen der BOP tatsächlich in den NFBC hineinreichen, war bisher nicht eindeutig geklärt. Die tektonometamorphe und magmatische Entwicklung des NFBC ist aufgrund fehlender struktureller, petrologischer und geochronologischer Daten kaum verstanden. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Platznahme und Deformation der Plutone im Bereich des westlichen NFBC in der Region von Bafoussam-Batcha. Es wurden strukturelle Untersuchungen sowie U-(Th)-Pb Datierungen von Zirkon und Monazit durchgeführt. Die gewonnenen Daten werden mit bisher vorliegenden Daten aus den benachbarten Arealen des NFBC und aus äquivalenten Arealen Brasiliens verglichen. Innerhalb des NFBC lassen sich drei wesentliche proterozoische Gesteinseinheiten unterscheiden: (1) hoch-gradige metamorphe Komplexe mit palaeoproterozoischem Alter (Eburnium), bestehend aus Metasedimenten und Metaplutoniten, welche im Pan-Afrikanischen Granit-Batholith von Zentral-Kamerun vorkommen (in der Region von Bafia und Adamaoua); (2) einen Schiefer-Gürtel neoproterozoischen Alters, der die Becken von Poli, Lom und Yaoundé beinhaltet, und (3) Pan-Afrikanische (Meta-)Granitoide. Untersuchungen im nördlichen (Region von Poli), südlichen (Region von Yaoundé) und östlichen (Region von Lom-Ngaoundere) zeigen, dass die geodynamische Entwicklung durch Überschiebungs und Blatterverschiebungstektonik charakterisiert ist. Im nördlichen NFBC existieren E-W streichende, flach einfallende Foliationen, welche während der Überschiebung des NFBC auf den Kongo-Kraton entstanden. Im westlichen NFBC existieren vor allem geochemische und petrologische Daten. Die regionale Geologie wird hier durch Pan-Afrikanisches grundgebirge bestimmt, welches aus Graniten und Metamorphiten besteht, die wiederum von känozoischen Magmatiten (Granite, Vulkanite) durchsetzt bzw. überlagert werden. Vorhandene Daten zu Pan-Afrikanischen Plutonen des Untersuchungsgebiets und angrenzenden Regionen zeigen, dass in vielen Regionen ein große Variabilität hinsichtlich des Gesteinschemismus vorliegt, welche von basischen bis hin zu granitischen Gesteinen reicht, wobei der geochemische Charakter i.d.R. kalkalkalin bis alkalin ist. Das initiale Strontium-Verhältnis und Sm-Nd Daten einiger Granite indizieren eine Aufschmelzung im Mantel bei anschließender Kontamination durch kontinentale Kruste. Aufgrund der Anfälligkeit der Rb-Sr Methode existieren kaum verlässliche Alter von Granitoiden des NFBC. Durch die großen Fehler der Rb-Sr Alter sind neben den Platznahmealtern auch die Zeitpunkte der vorhandenen Wiederaufschmelzung weit gehend unbekannt. Durch detaillierte Geländearbeit gelang eine Gliederung des Areals in verschiedene Teilkomplexe. Diese sind der Migmatit-Komplex von Foumbot (MCF), der Bangwa-Komplex (BC), der Komplex von Chepang (CC) und der jüngeren Batié-Pluton (BP), welcher die übrigen Komplexe diskordant durchschlägt. Der BP selbst wird vom känozoischen Batcha Pluton durchsetzt. Innerhalb des MCF existiert eine bedeutende ENE-WSW streichende Scherzone. Im zentralen und südlichen Arbeitsgebiet reichen NE-SW streichende Scherzonen in den BP sowie in den CC und den BC hinein. Der MCF besteht aus Diatexit, Metatexit und Amphibolit. Merkmale wie Scherfaltung älterer Gefüge entlang ENE-WSW streichender Scherflächen und progressive Leukosombildung im Bereich der Faltenscharniere machen deutlich, dass partielle Aufschmelzung mit zunehmender Deformation einhergeht. Bereiche mit hoher Strain-magnitude zeigen koaxiale Plättung an. Die ENE-WSW verlaufende Scherzone weist dextrale Kinematik auf, wobei ältere sinistrale Bewegungen nicht ausgeschlossen werden können. Einzelzirkone von Diatexiten der MCF wurden mittels LA-ICPMS datiert. Mindestens drei Altersdomänen wurden dabei identifiziert: (a) elongierte bis gerundete Zirkon-Kerne mit Altern um 671 ±6 Ma; (b) oszillierend zonierte Zirkon-Mäntel, wahrscheinlich magmatischen Ursprungs, mit einem Alter von 639 ±5 Ma, interpretiert als das Intrusionsalter des Diatexits; (c) rekristallisierte Zirkon-Ränder mit einem Alter von 597 ±6 Ma, welches vermutlich die Metamorphose und Anatexis datiert. Der BC setzt sich aus unterschiedlich stark deformiertem Quarz-Diorit, Granodiorit, Syenogranit, Leucogranit und Monzonit zusammen. Quarz-Diorit und Granodiorit erscheinen in Form von cm- bis m-mächtigen foliierten Körpern. Die Foliation ist im Osten subhorizontal, gen Westen aber fällt sie zunehmend steil nach NE ein. Syenogranit und Leukogranit bilden größere Körper und weisen eine steile, nach NE einfallende, submagmatische Foliation auf. Innerhalb der (Syeno)granite weisen kristallplastische Verformung und Rekristallisation von Feldspat sowie vorhandene S-C Gefüge auf eine Deformation im Subsolidusbereich, d.h. während der Abkühlung, hin. Die aus den Mikrogefügen abgeleiteten Deformationsmechanismen charakteristischer Minerale der Quarz-Diorite und Granodiorite deuten hingegen auf Verformung unter Bedingungen einer hoch- und niedriggradigen Metamorphose hin. Innerhalb NE-SW verlaufender Mylonite am Kontakt BC/BP wird ein dextraler Schersinn durch S-C Gefüge angezeigt. In den zentralen Bereichen des BC sind Überprägungen sinistraler durch dextrale Scherzonen hingegen nur lokal sichtbar. Die Phengit-Zusammensetzung deformierter Gesteine deutet auf Scherung bei einem Maximaldruck von ca. 4.5 kbar bei T = ca. 500 °C hin. Die östlichen Nebengesteine des BC in der Region von Maham sind Migmatite, deren subhorizontale Foliation in zunehmendem Maße in wenige cm bis einige m mächtige ENE-WSW streichende Scherzonen übergeht. Die Gefüge der Migmatite der Region von Maham und (grano)dioritischer Gesteine des BC deuten auf eine regionale Überschiebungstektonik mit SSE gerichtetem Deckentransport hin. Die Zirkon- und Monazitalter deuten auf zwei Altersgruppen innerhalb des BC hin mit jeweils unterschiedlichen Platznahmealtern. Die ältere Gruppe besteht aus Quarzdiorit (643 ±5 Ma und 641 ±4 Ma, LA-ICPMS Daten, U-Pb Zirkonalter) und Granodiorit (638 ±2 Ma, IDTIMS Daten; 641 ±8 Ma und 641 ±2 Ma, LA-ICPMS Daten; U-Pb Zirkonalter), die jüngere Gruppe umfasst Syenogranit (598 ±21 Ma, 605 ±11 Ma, EMP Daten, U-Th-Pb Monazitalter) und Leukogranit (607 ±3 Ma und 603 ±4 Ma, LA-ICPMS Daten; U-Pb Zirkonalter). 206Pb/238U Alter zwischen 656 ±9 Ma und 718 ±13 Ma wurden an Zirkonkernen des Granodiorits bestimmt. Eine Regressionsgerade durch alle analysierten Kerne ergibt ein oberes Schnittpunktalter von 672 ±8 Ma. Der CC wird von im m-Maßstab wechselnden Lagen dioritischer und granitischer Zusammensetzung aufgebaut. Eine mylonitische Foliation streicht NE-SW. S-L-gefüge und Quarz-[c]-Achsen Verteilungen weisen auf Plättung unter hochgradigen Bedingungen (T = 650 °C) hin. Phengit-Barometrie mylonitisierter Granite ergibt einen Maximaldruck von 6 kbar bei T = ca. 500°C. Radiometrische Untersuchungen des mylonitischen Granits des CC wurden mittels LAICPMS an Zirkon und Monazit sowie mit Elektronenstrahlmikrosonde (EMP) an Monazit durchgeführt. Das EMP Monazit Alter (621 ±33 Ma) und LA-ICPMS Alter (622 ±13, oberes Schnittpunktalter; 611 ±4 und 608 ±6 Ma, gewichtete Mittelwerte der 208Pb/232Th und 207Pb/238U Alter) stehen im Einklang mit dem konkordanten LA-ICPMS Zirkonalter (611 ±5 Ma). Letzteres wird als Intrusionsalter des Granits interpretiert. Der BP wird im Wesentlichen von mittel- bis grobkörnigem Syenogranit aufgebaut. Speziell im Randbereich werden magmatische Gefüge (Fließgefüge, Aggregate von xenomorphem Quarz) durch submagmatische Gefüge überprägt und schließlich ersetzt (kristallplastische Deformation und Rekristallisation von Quarz und Feldspat, Bildung von Myrmekiten und S-C Gefügen). Sowohl die vom magmatischen bis in das Subsolidus-Stadium anhaltende Deformation, als auch die Parallelität der steil einfallenden postmagmatischen Foliation im Randbereich des BP und den angrenzenden BC, CC und MCF weisen auf eine synkinematische Platznahme des BP entlang krustaler Blattverschiebungen hin. Ein Konkordiaalter von 602 ±1.4 Ma wurde mit der ID-TIMS Methode erhalten. Mittels LAICPMS wurde ein Alter von 599 ±13 Ma (oberes Schnittpunktalter) bestimmt, welches im Fehler dem ID-TIMS Konkordia-Alter gleicht. Letzteres wird als Platznahmealter interpretiert. Die Kombination geochronologischer und struktureller Daten erlaubt die Unterscheidung von insgesamt drei tektono-magmatischen Abschnitten: Phase I ist durch die Platznahme dioritischer und granodioritischer Gesteine des BC sowie der Protolithe der Migmatite des MCF bei etwa 640 Ma charakterisiert. Während Phase II bei ca. 607 Ma intrudierten Syenogranit und Leukogranite in den BC und der Granits des CC. Gleichzeitig unterlagen die 640 Ma alten Granite einer hochgradigen Metamorphose. Die Intrusion der 607 Ma alten Plutonite geht einher mit einem Wechsel von Überschiebungstektonik hin zu sinistraler Blatterverschiebungstektonik. Die Platznahme des porphyritischen Syenogranits von Batié vor ca. 600 Ma, welche dextrale Bewegungen im Randbereich des BP und unmittelbar angrenzender Nebengesteine auslöste, stellt die dritte tektono-magmatische Phase dar. Alter von 700 bis 660 Ma, bestimmt an Zirkonkernen der Migmatite des MCF und der Granodiorite des BC, indizieren eine Platznahme der ältesten Granite in Pan-Afrikanischem Basement. Einige ererbte Zirkonkerne paläoproterozoischen Alters innerhalb des Leukogranits des BC deuten auf die Beteiligung Eburnischer Kruste in der Entwicklung der Pan-Afrikanischen Granite hin. Die neuen Daten bestätigen bisherige Vermutungen, dass der westliche NFBC ein afrikanisches Äquivalent zur Borborema Provinz Brasiliens darstellt. Auffällig sind geochronologische Übereinstimmungen bei den (Meta)granitoiden und den prä- bis synkinematischen Brasiliano Granitoiden der Borborema Provinz. Auf der anderen Seite ist speziell in der späten Entwicklung ab ca. 600 Ma die Kinematik blattverschiebender Bewegungen teilweise unterschiedlich. Eine mögliche Ursache sind lokale Variationen im Stressfeld, bedingt durch die Platznahme der syn- bis spät-tektonischen Magmatite.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es die Bedeutung von Veränderungen im Neurotransmitterstoffwechsels für die Entstehung der Methotrexat assoziierten Neurotoxizität zu untersuchen. Des Weiteren sollte die Messung der Methyl-Tetrahydrofolsäure als Methode in das Spektrum der Liquordiagnostik des Stoffwechsellabors integriert werden. Es wurden bei 19 Patienten im Rahmen der ALL-BFM 2000 Studie die Konzentrationen der Neurotransmittermetaboliten HVA und 5-HIAA im Liquor gemessen. Begleitend wurde ein klinisches Monitoring durchgeführt um zu untersuchen ob zwischen Veränderungen auf Ebene der biogenen Amine und neurologischer Symptomatik ein Zusammenhang besteht. Bei der Betrachtung des Gesamtkollektives von 19 Patienten zeigte sich unter HDMTX in Protokoll M über den Zeitraum von 6 Wochen zunächst ein diskreter Anstieg der Liquorspiegel von 5-HIAA und HVA, gefolgt von einer deutlichen Konzentrationsminderung der beiden Metaboliten. Die 5-HIAA zeigte dabei einen ausgeprägteren Abfall der Konzentration. Während des zweiten Zyklus MTX in Protokoll M gab es einen transienten Anstieg der Liquorkonzentrationen der biogenen Amine. Der Grund dafür ist wahrscheinlich eine gehemmte Elimination der Metaboliten aus dem Liquor, weil MTX in niedriger Konzentration um dasselbe Auswärtstransportsystem konkurriert, nicht aber ein erhöhter Neurotransmitterumsatz. Die Abnahme der Liquorspiegel in der zweiten Hälfte von Protokoll M kann durch Hemmung der Neurotransmitterbiosynthese durch höhere MTX-Spiegel bei zuvor alterierter Bluthirnschranke bedingt sein. Bei alleiniger intrathekaler Applikation von MTX in Protokoll I und II war keine signifikante Veränderung der biogenen Amine nachweisbar. Die Synthese der biogenen Amine scheint daher nur unter Behandlung mit HDMTX betroffen zu sein. Dass auch das Auftreten von klinisch-neurologischen Ereignissen in Protokoll M gegenüber den übrigen Behandlungsabschnitten erhöht war legt sowohl eine Beteiligung des Neurotransmitterstoffwechsels an der Neurotoxizität, als auch eine Abhängigkeit von der MTX-Dosis in diesen Zusammenhang nahe. Trotzdem bei den Einzelverläufen der 19 Patienten im Verlauf der Therapie kein einheitliches Muster feststellbar ist, spricht die Tatsache, dass die Konzentrationen von HVA und 5-HIAA an Tagen mit neurologischem Ereignis signifikant niedriger waren als an den ereignisfreien Tagen, für die Beteiligung erniedrigter Spiegel der biogenen Amine an der Genese der Methotrexat assoziierten Neurotoxizität. Da Patienten, die im Verlauf neurologische Komplikationen aufwiesen, gegenüber nichtbetroffenen Patienten keine generellen Unterschiede der Neurotransmitterkonzentrationen aufweisen, kann aufgrund des bei Therapiebeginn gemessenen Ausgangswertes eines Patienten keine prädiktive Aussage für die weitere Intensivphase gemacht werden. Demgegenüber könnten Patienten, die unter Behandlung mit MTX bereits zu Beginn einen deutlichen Abfall der biogenen Amine zeigen, ohne dass es bis dahin zu neurologischen Komplikationen gekommen ist, möglicherweise von einer erweiterten supportiven Therapie profitieren. Dabei könnten die Neurotransmittervorstufen L-Dopa und 5-Hydroxytryptophan, sowie Tetrahydrobiopterin eingesetzt werden. Außerdem können Adenosinantagonisten, und Präparate zur Behandlung der Hyperhomocysteinämie verabreicht werden. Durch diese Behandlung kann das Risiko für neurologische Ereignisse eventuell vermindert werden. Veränderungen im Neurotransmitterstoffwechsel unter MTX und deren Bedeutung für das Auftreten von neurologischen Komplikationen wurden in zahlreichen Arbeiten und Fallberichten beschrieben. Dabei konnte allerdings bisher keine eindeutige Beziehung abgeleitet werden. Die gegenseitige Beeinflussung mit den Veränderungen im Stoffwechsel von Adenosin, Homocystein und den schwefelhaltigen exzitatorischen Aminosäuren macht eine multifaktorielle Genese der neurologischen Ereignisse wahrscheinlich. Dabei könnte durch eine Verminderung der biogenen Amine eine Prädisposition geschaffen werden, die durch Wechselwirkung mit den anderen beschriebenen Mechanismen zum Auftreten eines unerwünschten Ereignisses führt. Es ist dabei durchaus möglich, dass es bestimmte Stoffwechselveränderungen gibt, deren Kombination regelhaft zum Auftreten von neurologischen Komplikationen führt. Aufgrund des absolut gesehen seltenen Auftretens der Methotrexat assoziierten Neurotoxizität konnten solche möglichen Risikofaktoren-Profile allerdings bisher nicht charakterisiert werden. Es ist wahrscheinlich dass Methotrexat auch in Zukunft eine bedeutende Rolle bei der Behandlung der kindlichen Leukämie spielen wird. Daher ist eine weitere Aufklärung der Pathomechanismen der Neurotoxizität anzustreben um durch erweiterte supportive Maßnahmen die Therapie für die Patienten weiter verbessern zu können. Ein wesentlicher Fortschritt in der Aufklärung der MTX-Neurotoxizität könnte durch eine prospektive Studie erreicht werden, die standardisierte zusätzliche Liquorpunktionen beinhaltet. Durch die Auswertung dieser Messungen könnte der Verlauf der Konzentrationen der biogenen Amine und weiterer MTX induzierter Stoffwechselveränderungen sehr viel besser beurteilt werden. Eine wichtige Rolle spielt auch die Bestimmung der Methyl-Tetrahydrofolsäure, deren Messung im Liquor als Bestandteil dieser Arbeit in das Leistungsspektrum des Labors integriert wurde. Nach Durchführung des beschriebenen Qualitätskontrollprogramms, welches die Bestimmung einer Messkurve, Reproduzierbarkeit, Stabilitätstestung und Wiederfindungsrate beinhaltet, kann die MTHF-Messung als sichere und reproduzierbare Analyse angewendet werden. Bei den in dieser Studie untersuchten 19 Patienten war kein Zusammenhang zwischen der MTHF-Konzentration im Liquor und den Spiegeln von HVA oder 5-HIAA feststellbar. Auch zum Auftreten von klinisch-neurologischen Komplikationen besteht keine Korrelation. Neben der Bestimmung der Methyl-Tetrahydrofolsäure in weiteren Arbeiten zur Methotrexat assoziierten Neurotoxizität ist diese Messung in der Diagnostik anderer neurologischer Krankheitsbilder einsetzbar.
To determine the effects of inhaled IL-10 at different doses and different time points on the pulmonary and systemic inflammatory response during endotoxemia, 48 ventilated, anaesthetized rats (mean body weight ± standard deviation, 500 ± 33g) were randomly assigned to six groups (n = 8, each). Interleukin-10 was nebulised either prior to or following the intravenous injection of LPS (5mg/kg) at two doses (5.0 mycro-g or 0.5 mycro-g) in our groups. Eight rats received the same insult with no further treatment (LPS-only group). Another eight rats served as controls without endotoxemia but with aerosolized phosphate-buffered saline, the solvent of IL-10 (Sham group). Concentrations of TNF-alpha, IL-1beta, IL-6, and IFN-gamma were analyzed in plasma and bronchoalveolar lavage fluid (BALF). In addition, the nitrite release from ex-vivo cultured alveolar macrophages was determined. As compared to the LPS-only group, the concentrations of the proinflammatory cytokines TNF-alpha, IL-1beta, IL-6, and IFN-gamma in plasma were significantly reduced in the group, which inhaled 5 mycro-g IL-10 before LPS injection (p< 0.0125). Spontaneous nitrite release from exvivo cultured alveolar macrophages was suppressed in this group (p< 0.0125). Inhalation of 0.5 mycro-g IL-10 before LPS injection and both dosages of IL-10 inhalation (5 mycro-g or 0.5 mycro-g) after LPS injection did not significantly influence either inflammatory cytokine concentrations in BALF, in plasma or the nitrite release from ex-vivo cultured alveolar macrophages. In this study, inhaled IL-10 only demonstrated anti-inflammatory effects when it was administered at 5 mycro-g prior to the induction of experimental endotoxemia. Interleukin-10 aerosol had no effect when it was given either following induction of endotoxemia or given at a lower dosage (which here was 0.5 mycro-g) either before or following injection of lipopolysaccharide.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war in einer klinisch prospektiven Studie das diagnostische Potential der 2-Phasen-Positronenemissionstomographie mit 18-Fluor-2-Deoxy-D-Glukose bei Patienten mit suspekter, zufälliger, intestinaler FDG-Aufnahme abzuschätzen. Bei 56 Patienten aus einem Patientenkollektiv von 1098, die im Rahmen des Stagings oder Restagings einer malignen Grunderkrankung eine solitäre fokal suspekte abdominelle Läsion aufwiesen, wurde im Zeitraum vom August 2001 bis Oktober 2002 am Universitätsklinikum Frankfurt am Main eine Zwei-Phasen-PET mit quantitativer Analyse des maximalen Standard-Uptake-Value-Wertes (SUVmax) vorgenommen. Die Erstaufnahme begann 65 ± 19,5 min und die Spätaufnahme 211 ± 52,5 min nach der Injektion des FDG. Die letztendliche Diagnose der initialen suspekten abdominellen Läsionen erfolgte durch Endoskopie (6), Histopathologie (6), CT (18) oder MRT (1); alle Patienten wurden während eines Zeitraums von 13 ± 2,8 Monaten beobachtet. Von den suspekten abdominalen Läsionen zeigten 42 einen initialen SUVmax ≥ 2,5 (75 %) im Gegensatz zu 14 Fällen mit initialem SUVmax < 2,5 (25 %). Von allen untersuchten Patienten zeigten 32 einen Uptake-Anstieg (57 %); 10 maligne (31 %) und 22 benigne Läsionen (69 %). Bei benignen Läsionen mit einer initialen SUVmax ≥ 2,5 (n=31) wurde ein Uptake-Anstieg bei 17 Patienten (55 %) und ein Uptake-Abfall bei 14 Patienten (45 %) beobachtet. Die Hälfte der benignen Läsionen mit einen initialen SUVmax < 2,5 (n=10) zeigten einen Uptake-Anstieg, die restlichen 50% einen Uptake-Abfall. In 5 benignen Fällen veränderte sich die Konfiguration in der Spätaufnahme. Maligne Läsionen mit einem initialen SUVmax ≥ 2,5 zeigten eine FDG- Uptake-Abfall in 4 Fällen (36 %) und einen Uptake-Anstieg in 6 Fällen (54 %). Bei einem Patient mit einer malignen Läsion blieb der SUVmax stabil bei 3,0. Alle malignen Läsionen mit einer initialen SUVmax < 2,5 zeigten eine Steigerung. Läsionen, die eine FDG-Uptake-Steigerung von ≥ 15 % zeigten, wurden mit einer Sensitivität von 60 % und einer Spezifität von 68 % korrekt diagnostiziert. Die Auswertungen zeigen, dass lediglich Läsionen, die in der Spätaufnahme ihre Konfiguration verändern oder nicht mehr festzustellen sind, und Läsionen mit einem SUVmax < 2,5, die einen Uptake-Abfall in der Spätaufnahme zeigen, zuverlässig als benigne eingestuft werden können. Ein maligner Prozess muss bei Läsionen mit einem initialen SUVmax < 2,5, die einen Uptake-Anstieg von mehr als 30 % zeigen, weiter abgeklärt werden. Diese Daten müssten in größeren Patientenkollektiven einschließlich histopathologischer Korrelation weiter untersucht werden. In allen anderen Läsionen mit Uptake-Anstieg und -Abfall konnte ein maligner Prozess durch die 2-Phasen-PET nicht ausgeschlossen werden. Diese Foci sollten durch weitere Untersuchungen unbedingt abgeklärt werden. Zusammenfassend ist die 2-Phasen-PET eine bildgebende Methode mit einem limitierten diagnostischen Potential bei der Interpretation von abdominellen Läsionen. Es lässt sich kein zuverlässiger Cut-Off-Wert des SUVmax zur sicheren Unterscheidung benigner von malignen Läsionen definieren, da die abdominellen Foci unabhängig von ihrer Dignität ein sehr heterogenes Uptake-Muster zeigen.
Die Talsedimente in den ausgedehnten Überflutungsebenen tropischer Flusssysteme stellen ein wertvolles Archiv für die Paläoumweltforschung dar. Die Untersuchung von Sedimentlagen aus zahlreichen Bohr- und Aufschlussprofilen ergibt für das im NW der Zentralafrikanischen Republik liegende Sandsteinplateau von Gadzi-Carnot Hinweise auf mittel- bis jungholozäne Klimawandel an der landschaftsökologisch sensitiven Vegetationsgrenze zwischen Regenwald und Savanne. Die mit konventionellen landschaftskundlichen sowie geomorphologischen und pedologischen Arbeitstechniken durchgeführten Analysen an den mächtigen Alluvionen des tief in das Plateau eingeschnittenen Mbaéré-Flusses und den Schwemmfächer-Sedimenten des Mbaéré-Tributärs Sadika zeigen, dass die rezenten naturräumlichen Zusammenhänge relevante Hinweise für das Verständnis der landschaftshistorischen Prozesse liefern. Der Vergleich von Sedimenten aus beiden fluvialen Systemen verdeutlicht dabei vor allem die Bedeutung der kleinräumigen Variabilität von petrographischen, reliefbedingten, hydrologischen und anthropogenen Rahmenbedingungen auf die morphodynamischen Prozesse und den potentiellen Erhalt auswertbarer Sedimentkörper. Vor dem Hintergrund des geringen Oberflächenabflusses auf den Sandsteinen des Plateaus und der relativen hydrologischen Gunst des Mbaéré-Tals wird durch Auswertung der Befunde für die Plateauregion deutlich, dass nacheiszeitliche Klimawandel hin zu trockeneren Verhältnissen vor allem zu einer Ausdehnung von Savannen auf den Plateauhöhen und einem Rückzug der Regenwald-Vegetation in die tieferen Lagen der weiten Talebene geführt haben. Deren überwiegend sandige Verfüllungen stellen rezent ein enormes Wasserreservoir dar, das unter den derzeitigen tropisch-wechselfeuchten Verhältnissen einer ausgedehnten Überflutungswald-Vegetation ideale Wuchsbedingungen liefert. Vor dem Hintergrund der Diskussion um hochglazialzeitliche Rückzugsgebiete des Tieflands-Regenwaldes impliziert die für das Untersuchungsgebiet postulierte Landschaftsdynamik, dass es sich bei dem Mbaéré-Tal um das wahrscheinlich nördlichste „fluviale Refugium“ im Kongo-Einzugsgebiet im Sinne der „core area“-Konzeptionen von COLYN et al. (1991) und MALEY (1995) handelt.
Die aus dem LZ-EKG bestimmbare HRT ist eine relativ neue, viel versprechende Methode zur Detektierung von Patienten mit einem erhöhten Risiko für arrhythmische Ereignisse. Die HRT konnte in den letzten Jahren als Risikomarker bei Überlebenden eines Myokardinfarktes etabliert werden und beschreibt Fluktuationen des Sinusrhythmus nach spontan einfallenden VES. Die Einführung dieses Risikomarkers erfolgte an zwei großen Populationen (MPIP und EMIAT), die Patienten in der frühen Postinfarktsituation einschlossen [67]. Dabei zeigte sich in der univariaten Analyse, dass die HRT allen anderen Risikomarkern aus dem LZ-EKG überlegen war. Dies konnte Ghuran et al in einer Untersuchung an den Patienten aus dem ATRAMI-Pool bestätigen [21]. Aber nicht nur an Patienten mit einer KHK mit stattgehabten Myokardinfarkt, sondern auch an Patienten mit einer Herzinsuffizienz und idiopathischen DCM konnte der gute prädiktive Wert der HRT nachgewiesen werden, was für eine mögliche breitere klinische Anwendung dieses Risikoparameters spricht [22, 38]. Die vorliegende Arbeit untersuchte den TO und den TS der HRT sowie die Zeitbereichsparameter SDNN und rMSSD der HRV an 27 Patienten, die sich wegen symptomatischer VES vorstellten, sowohl unter als auch ohne Therapie mit Sotalol. Unsere Untersuchungen haben gezeigt, dass der TS mit anderen Risikomarkern des autonomen Nervensystems, hier die Zeitbereichsparameter der HRV, korreliert, nicht jedoch der TO der HRT. Diese Korrelation der HRT mit der HRV konnte auch in anderen Studien nachgewiesen werden. Für das pathophysiologische Verständnis der HRT bedeutet diese Korrelation, dass sie nicht nur die BRS, also die vagale Reflexaktivierbarkeit des Herzens, reflektiert, wie es weithin angenommen wird, sondern wie die HRV auch, mutmaßlich den basalen autonomen Tonus illustriert [26]. Weiter konnten wir feststellen, dass die HRT auch dann valide aus dem 24h- LZ-EKG bestimmbar ist, wenn die Patienten gehäufte ventrikuläre Arrhythmien bieten, d.h., dass es keine Beziehung zwischen der Validität der HRT-Bestimmung und der Anzahl der VES gibt. Dieser Sachverhalt stellt einen möglichen Vorteil gegenüber der HRV dar, die bei gehäuft auftretenden VES nicht präzise bestimmbar ist. Für antiarrhythmisch behandelte Patienten konnten wir eine Unabhängigkeit der Bestimmung der HRT von der medikamentösen Therapie mit Sotalol zeigen. Durch die Anwendung von Sotalol konnte erwartungsgemäß eine Reduktion der Anzahl der VES nachgewiesen werden. Die HRT kann also auch unter einer Therapie mit diesem Klasse II- und III-Antiarrhythmikum valide aus dem LZ-EKG bestimmt werden. Eine signifikante Verbesserung der HRT unter der Sotalol-Therapie, wie Hohnloser et al sie für die HRV finden und Lin et al für die HRT an Atenolol therapierten Patienten mit einer Herzinsuffizienz zeigen konnten, war in unserer Untersuchung nicht nachzuweisen [28, 40]. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die HRT sowohl methodologisch als auch hinsichtlich ihres prädiktiven Wertes prospektiv bei ausreichend großen Patientenkollektiven weitergehend untersucht werden sollte, um diese Methode gegebenenfalls in der klinischen Routinediagnostik etablieren zu können. Und das gerade deshalb, weil sie eine kostengünstige, nicht invasive Möglichkeit darstellt, die diagnostische Erfassung von Patienten mit einem niedrigen Risikoprofil, die keine prophylaktische Therapie benötigen, und Hochrisikopatienten, die durch das übliche diagnostische Netz fallen, z. B. solche mit einer erhaltenen LVEF, zu erleichtern.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein tierexperimentelles Wundheilungsmodell etabliert, welches nach Kultivierung und Transplantation autologer Keratinozyten auf einer biologische Trägermembran aus Hyaluronsäure ein Vergleich mit verschiedenen Wundauflagen im Rahmen einer standardisierten Wundbehandlung erlaubte. Acht narkotisierten Schweinen wurden paravertebral 6 Polytetraflouroethylen-Kammern implantiert und die entstandenen Vollhautwunden mit verschiedenen Wundauflagen konditioniert. Parallel dazu erfolgte die Gewinnung und Kultivierung autologer Keratinozyten auf dem Zellkulturträger Laserskin – einer Hyaluronsäureestermembran. Die Transplantation der Zellen erfolgte 1 Woche nach Wundsetzung und anschließend wurden die Wunden mit den verwendeten Wundauflagen Jelonet, Schaumstoff und Hyalofill-F, einem Hyaluronsäureesterfleece, zweitägig über einen Zeitraum von 3 Wochen behandelt. Zu fest definierten Zeitpunkten erfolgten die vergleichenden photooptischen Dokumentationen und histologischen Untersuchungen (Hämatoxilin-Eosin-Färbung, Bindegewebsfärbung nach Goldner, Elastika-Anfärbung nach Weigert) der Wunden. Zur Bestimmung der biomechanischen Narbenqualität wurde das exzidierte Narbengewebe am Versuchsende 21 Tage nach Transplantation mechanischen Zugversuchen im Laserextensiometer zugeführt und die Zugfestigkeit und Dehnung bei Maximalspannung des Gewebes bestimmt. Sowohl die mikro- und makroskopischen als auch die biomechanischen Eigenschaften der untersuchten Wunden zeigten unabhängig von dem untersuchten Tier, der untersuchten Wunde bzw. der Wundbehandlung und unabhängig vom Zeitpunkt das einheitliche Bild eines neu entstandenen Narbengewebes ohne Anzeichen einer Epithelneubildung und ohne signifikante Unterschiede hinsichtlich der Zugfestigkeit und des Dehnungsverhaltens. Verschiedene Ursachen mögen für die ausbleibende Reepithelialisierung verantwortlich sein. Es konnte jedoch mit Hilfe der hier vorgestellten Wundheilungsstudie mit verschiedenen Wundauflagen an einem Hausschweinemodell eine systematische, reproduzierbare und standardisierte Methode entwickelt werden, um Narbengewebe hinreichend zu beschreiben. Weitere Anstrengungen werden noch notwendig sein, um die Lücke zwischen tierexperimentellen Studien und bereits klinisch erfolgreich angewandten Transplantation autologer Keratinozyten beim Menschen zu schließen.
In dieser Studie wurden drei Patientenkollektive der pädiatrischen Gerinnungsambulanz der Uniklinik Frankfurt auf das Vorhandensein von Antiphospholipid-Antikörpern (APA) untersucht: 1.) Kinder mit verlängerter PTT (n=121) 2.) Kinder mit Z.n. cerebralen Infarkten (n=20) 3.) Kinder mit Z.n. venösen Thrombosen (n=29) Diese drei Kollektive wurden mit drei dem jeweiligen Patientenkollektiv alters- und geschlechtsentsprechenden Kontrollkollektiven verglichen: 1.) Kontrollgruppe A: das dem Kollektiv mit Kindern mit verlängerter PTT entsprechende Kontrollkollektiv (n=25) 2.) Kontrollgruppe B: das dem Kollektiv mit Kindern mit cerebralen Infarkten entsprechende Kontrollkollektiv (n=20) 3.) Kontrollgruppe C: das dem Kollektiv mit Kindern mit Thrombosen entsprechende Kontrollkollektiv (n=29) Der statistische Vergleich zwischen den Patientenkollektiven und dem jeweils entsprechenden Kontrollkollektiv erfolgte mit dem Fisher´s exact Test oder dem Wilcoxon-Mann-Whitney-UTest. Es wurden folgende Parameter bestimmt, um die Patienten und die Kontrollen als „Antiphospholipid-Antikörper-positiv“ bzw. „Antiphospholipid-Antikörper-negativ“ zu klassifizieren: Die Anticardiolipine (ACL) IgG und IgM, die Anti-ß2-Glykoproteine I (Anti-ß2GP I) IgG, IgM und IgA, Lupus Screen, Lupus Ratio und die PTT. Bei einzelnen Patienten konnten als weitere Bestätigungstests ebenfalls KCT und ICA herangezogen werden. Als „APA-positiv“ wurden diejenigen Kinder eingestuft, die erhöhte mittels ELISA bestimmte ACL oder Anti-ß2GP I hatten und/oder die positive, über die PTT als Screeningtest und den Lupus Screen und die Lupus Ratio als Bestätigungstests ermittelte Lupusantikoagulantien (LA) hatten. Als Grenzwerte wurden für die ACL und die Anti-ß2GP I die 95. Percentilen der drei Kontrollkollektive berechnet, wobei diese Werte, mit Ausnahme der Anti-ß2GP I, deutlich unter den Grenzwerten des Testherstellers lagen. Für die PTT, den Lupus Screen, die Lupus Ratio, die KCT und den ICA wurden als Grenzwerte die Testherstellerangaben übernommen. APA wurden bei 53/121 Kindern mit verlängerter PTT, bei 13/20 Kindern mit cerebralen Infarkten und bei 16/29 Kindern mit Thrombosen diagnostiziert und traten in allen drei Patientenkollektiven signifikant häufiger (p<0,05) als in dem jeweils entsprechenden Kontrollkollektiv auf. Es wurde eine Odds Ratio von 7,43 errechnet, bei positiven APA einen cerebralen Infarkt zu erleiden und eine Odds Ratio von 7,38, bei positiven APA eine venöse Thrombose zu bekommen. Die Titer der ACL IgG lagen bei den Kindern mit verlängerter PTT und bei den Kindern mit Thrombosen signifikant höher als in der Kontrollgruppe A bzw. C (p=0,002; p<0,001). Erhöht waren die ACL IgG signifikant häufiger bei den Kindern mit cerebralen Infarkten und bei den Kindern mit Thrombosen als in der Kontrollgruppe B bzw. C (p=0,044; p=0,002). Die Titer der ACL IgM lagen in allen drei Patientenkollektiven signifikant höher als in den drei Kontrollgruppen (p<0,05), und bei den Kindern mit cerebralen Infarkten waren die ACL IgM signifikant häufiger erhöht als in der Kontrollgruppe B (p=0,008). Die Titerhöhe der Anti-ß2GP I IgG, IgM und IgA war in keinem der Patientenkollektive signifikant höher als in den Kontrollgruppen. Auch waren Anti-ß2GP I IgG, IgM und IgA in keinem der Patientenkollektive signifikant häufiger erhöht als in der entsprechenden Kontrollgruppe. Die Werte des Lupus Screens lagen in keinem der Patientenkollektive signifikant über denen des entsprechenden Kontrollkollektivs, jedoch wurde bei den Kontrollen im Gegensatz zu den Patienten kein einziger positiver Lupus Screen durch eine erhöhte Lupus Ratio bestätigt, sodass, auch unter Berücksichtigung der PTT, der KCT und des ICA, bei den Kindern mit verlängerter PTT signifikant häufiger LA nachgewiesen wurden als in der Kontrollgruppe A (p=0,003). Bei den Kindern mit Thrombosen waren LA häufiger positiv als in dem Kontrollkollektiv C, aber ohne Signifikanz (p=0,068). APA scheinen eine wichtige Rolle in der Thrombophilie-Diagnostik zu spielen, wobei wir einen statistischen Zusammenhang zwischen ACL und Thrombosen sowie zwischen ACL und cerebralen Infarkten fanden. Auch können vermutlich APA in vielen Fällen für eine verlängerte PTT bei ansonsten klinisch unauffälligen Kindern verantwortlich gemacht werden. Ob es von Bedeutung ist, bei einem Thrombophilie-Screening bzw. zur Abklärung einer TTVerlängerung die Anti-ß2GP I zu bestimmen, wird durch unsere Studie in Frage gestellt.
Die Verbreitung westlicher Verhaltens- und Lebensmuster im Rahmen der Globalisierung führt zu einer dramatischen Zunahme des Typ 2 Diabetes. Eine schwerwiegende Komplikation der diabetischen Erkrankung ist die Wundheilungsstörung, deren molekulare Pathophysiologie noch weitgehend unverstanden ist. Voraussetzung für einen koordinierten Wundheilungsprozess ist die ausgewogene Interaktion wundheilungsrelevanter Faktoren, die eine Vielfalt an Signaltransduktionskaskaden induzieren und somit zu einem streng kontrollierten Heilungsprozess beitragen. Darüber hinaus scheint auch die Insulinsensitivität der Haut für den Heilungsverlauf eine essentielle Rolle zu spielen. Da die Proteinkinase B/Akt nicht nur ein zentrales Molekül der Insulin-Signaltransduktion ist, sondern als Knotenpunkt vieler Signalkaskaden im Mittelpunkt zellulärer Ereignisse steht, sollte in der vorliegenden Arbeit die Rolle und Funktion der Proteinkinase Akt in der kutanen Wundheilung untersucht werden. Sowohl in der Haut als auch im Wundgewebe konnte Akt1 als dominante Isoform identifiziert werden. Die Verletzung des Hautgewebes induzierte einen Anstieg der Akt1-Expression und -Phosphorylierung in der Epidermis akut heilender Wunden. Insbesondere die am Wundrand gelegenen Keratinozyten waren durch eine starke Expression der Akt1-Kinase gekennzeichnet. Die Phosphorylierung und somit Aktivierung der Akt1-Kinase stieg im Verlauf der Wundheilung stetig an und erreichte ihr Maximum in der Endphase des Heilungsprozesses. Begleitet wurde die Aktivierung dieser Kinase von einer Phosphorylierung des eIF4E-BP1 und einer starken VEGF-Sekretion. Dagegen konnte in diabetisch chronischem Wundgewebe weder eine Aktivierung der Akt1-Kinase noch eine Phosphorylierung des eIF4E-BP1 nachgewiesen werden, was mit einer deutlich verminderten VEGF-Sekretion einherging. Um nun zu untersuchen, ob im Prozess der Wundheilung die VEGF-Sekretion in einem funktionellen Zusammenhang zur Akt1-Aktivierung steht, wurde in vitro der Einfluss wundheilungsrelevanter Faktoren, wie EGF, einer Kombination proentzündlicher Zytokine oder Insulin auf die Aktivierung der Akt1-Kinase und VEGF-Biosynthese untersucht. Obwohl alle Faktoren sowohl eine Aktivierung der Akt1-Kinase als auch VEGF-Sekretion induzierten, wurde ausschließlich die Insulininduzierte VEGF-Biosynthese über den PI3-Kinase/Akt-Signalweg vermittelt. Die Regulation der Insulin-induzierten VEGF-Biosynthese erfolgte posttranskriptionell aus einem gleichbleibenden Pool an VEGF-mRNA über die Phosphorylierung des eIF4E-BP1. Durch die Überexpression einer konstitutiv aktiven Akt1-Mutante und die Verwendung des mTOR-Inhibitors Rapamycin konnte mTOR als Mediator der Akt1-vermittelten Phosphorylierung des eIF4E-BP1 und somit der VEGF-Biosynthese identifiziert werden. In vitro-Lokalisationsexperimente zeigten, dass eine vollständig phosphorylierte und somit aktive Akt1-Kinase nach Insulinstimulation im Zytoplasma lokalisiert ist - exakt dort, wo die Regulation der Translation stattfindet. Zusammenfassend weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass Insulin im kutanen Heilungsverlauf die VEGF-Biosynthese posttranskriptionell über eine Akt1-vermittelte Phosphorylierung des eIF4E-BP1 induzieren kann. Eine ausbleibende Akt-Aktivierung in insulinresistenten Keratinozyten könnte somit zu einer verminderten VEGF Sekretion und folglich zu einer verzögerten Angiogenese in chronisch diabetischen Wunden beitragen.
Das “Protein Associated with Myc” spielt in den verschiedenen physiologischen Vorgängen eine Rolle. Dazu zählen Prozesse der Synaptogenese und Schmerzverarbeitung ebenso wie eine Regulation des Pteridin- und cAMP-Stoffwechsels. Auf welche Weise PAM die unterschiedlichen Effekte vermittelt, ist bislang nur in Ansätzen verstanden. Um die Wirkmechanismen von PAM aufzuklären, wurden in dieser Arbeit seine biochemischen Funktionen untersucht. Die These, dass PAM als E3 Ubiquitinligase aktiv ist, konnte in vitro mittels biochemischer Versuche zweifelsfrei bestätigt werden. Sowohl das nativ aufgereinigte, humane PAM, als auch der heterolog expremierte C-Terminale Bereich (C-PAM), der die katalytisch aktive RING Finger Domäne enthält, wiesen die Fähigkeit zur Ubiquitinkettenbildung und Autoubiquitinierung auf. Bei der Identifikation eines möglichen Zielproteins rückte das Protein TSC2 und der damit verbundene TSC2 / mTOR Signalweg in den Fokus. Für das gewählte Modell-System HeLa Zellen ließ sich eine Interaktion von PAM und TSC2 durch Ko-Immunopräzipitationen und Immunzytochemie nachweisen. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass das vollständige, native PAM, nicht aber die isolierte RING Finger Domäne, TSC2 polyubiquitinieren und zum proteasomalen Abbau markieren kann. TSC2 ist ein negativer Regulator der mTOR Kinaseaktivität, in dem es den stimulatorischen Einfluss von Rheb auf mTOR inhibiert. PAM wird in HeLa Zellen durch das Phospholipid Sphingosin-1-Phosphat (S1P) aktiviert. Nach S1P Behandlung der Zellen war eine Phosphorylierung der Proteinkinase mTOR nachweisbar. Diese ging mit einer Aktivierung der Kinaseaktivität einher, wie die rapamycinsensitive Phosphorylierung der mTOR Zielproteine p70S6K und 4E-BP1 zeigte. Durch Gabe von Rezeptor-Agonisten/-Antagonisten konnte eine Beteiligung des S1P1 und S1P2 Rezeptors ausgeschlossen werden. Der zunächst vermutete Mechanismus eines S1P induzierten, PAM-abhängigen Abbaus von TSC2 konnte trotz vielfältiger Herangehensweisen nicht nachgewiesen werden. Eine Phosphorylierung als Indikation einer Inaktivierung war ebenfalls nicht detektierbar. Auch die GAP Aktivität von TSC2 auf Rheb, wird in in vitro Versuchen durch die Interaktion mit PAM nicht vermindert. Durch eine Verminderung der TSC2 Expression mittels spezifischer siRNA zeigte sich, dass TSC2 nicht in die S1P-abhängige mTOR Aktivierung involviert ist. Auch regulatorische Proteinkinasen wie AKT, ERK oder PI3K, die durch S1P aktiviert werden können, sind an dem Signalweg nicht beteiligt, wie die Hemmung dieser Enzyme mit spezifischen Inhibitoren zeigte. Dagegen konnte eine Beteiligung von PAM und Rheb zum einen mittels Proteintransfektion bestätigt werden, zum anderen ließen sich die S1P Effekte durch Hemmstoffe verhindern, die für eine Aktivierung von PAM, respektive Rheb, nötig sind. Durch Nukleotidbindungsstudien war ein Einfluss von PAM auf den GTP-Beladungszustand von Rheb nachweisbar. Sowohl in einem GTPS Bindungsversuch als auch in einem GDP Dissoziationsexperiment erhöhte PAM konzentrationsabhängig die GTP Bindung bzw. den GDP/GTP Austausch an Rheb. In dieser Arbeit wird damit erstmalig eine duale Funktion eines Proteins als Ubiquitinligase und GEF beschrieben. So konnte die postulierte Aktivität von PAM als Ubiquitinligase bestätigt und TSC2 als Zielprotein identifiziert werden. Gleichzeitig wurde ein TSC2 unabhängiger Weg der mTOR Aktivierung aufgeklärt, an dem PAM und Rheb beteiligt sind. Als möglicher Mechanismus kommt eine Aktivität von PAM als Guanin-Nukleotid Austausch Faktor (GEF) auf Rheb in Frage. Durch Beschreibung von PAM als negativem Regulator von TSC2 und Aktivator von Rheb trägt diese Arbeit einen wichtigen Beitrag zur TSC2 / mTOR Forschung bei. Umgekehrt ermöglicht sie eine neue Sichtweise auf partiell PAM-abhängige Vorgänge wie Synaptogenese und Nozizeption, indem sie TSC2 / mTOR in diese Prozesse integriert.
End-stage renal disease has been denominated a vasculopathic state, owing to the accelerated arterial stiffening, which occurs in addition to and independent of atherosclerosis and bears an increased cardiovascular risk. The altered metabolic milieu in uraemia leads to an increased oxidative stress, heightened inflammatory burden, and an abnormal calcium-phosphate metabolism, which are thought to be responsible for the vascular changes. The pulse wave velocity (PWV) is a widely employed surrogate parameter of arteriosclerosis. The purpose of this study was to gain more insight into the pathogenesis of arterial stiffness, by investigating the influence of markers of oxidative stress, procoagulation, and inflammation, and of the calcium-phosphate product on the PWV. We conducted a cross-sectional study in 53 stable patients aged 59 ± 16 years, who had been on haemodialysis for at least 4 months (68 ± 48). Carotid-radial PWV was measured using a semi-automated device, Complior SP (Artech Medical, France). Advanced glycosylation end-products (AGE) and advanced oxidation protein products (AOPP), were quantified according to previously described methods. High sensitive CRP was measured using ELISA, whereas the other biochemical parameters, i.e. fibrinogen, albumin, calcium, phosphate, cholesterol, and triglycerides, were determined using routine methods. For statistical calculations we employed SPSS (Statistical Package of Social Science, 12.0, 2003). The correlations between PWV, as the dependent variable, and many dependent variables were assessed by means of multiple regression analysis, in which we controlled for the influence of the traditional cardiovascular risk factors and some of the patients’ medication (calcium-channel blockers and statins). PWV was found to be significantly correlated to serum CRP (p=0.003), LDLcholesterol (p<0.001), triglycerides (p<0.001), AGE (p=0.002), calcium (p<0.001), phosphate (p=0.001), and fibrinogen (p=0.020). Between PWV and dialysis duration (months) an interesting quadratic relationship (p=0.058) was noted. Against expectation, regression analysis showed a negative correlation between AOPP and PWV (p=0.001). We failed to confirm the correlation between PWV and age, systolic blood pressure, or heart rate. Among traditional cardiovascular risk factors only LDL-cholesterol was positively correlated to PWV. In this cross-sectional analysis we could put forward that PWV correlates positively and significantly with fibrinogen, CRP, AGEs, calcium, phosphate, and LDL-cholesterol in haemodialysis patients. It seems procoagulatory and proinflammatory pathways, oxidative stress, and the calcium-phosphate product exert a synergistic effect on disturbances of vascular architecture in ESRD patients.
Das Tau-Protein bildet im Verlauf von zahlreichen Demenzen, mit Morbus Alzheimer als die bekannteste unter ihnen, Aggregate, die sogenannten „neurofibrillären Geflechte“, die aus Fibrillen, den „paired helical filaments“ (PHFs) bestehen. Außerdem ist das Tau-Protein ein essentielles „microtubule-associated protein“, welches für die Aufrechterhaltung des neuronalen Zellmetabolismus notwendig ist. Dies veranlasste uns dazu, das Tau-Protein als Monomer, in der Mikrotubuli-gebundenen Form und als Fibrille zu charakterisieren. Die Technik, die wir hierzu verwendeten war die NMR-Spektroskopie, die als einzige strukturaufklärende Technik mit atomarer Auflösung dazu in der Lage ist, intrinsisch ungeordnete Proteine, wie das Tau-Protein, zu charakterisieren. Zwar war die Signalzuordnung der NMR-Spektren eine große Herausforderung, dennoch war es möglich praktisch alle Rückgratresonanzen sogar für die längste Tau-Isoform htau40 mit 441 Resten erfolgreich eindeutig zu identifizieren. Mit Hilfe der Zuordnung war es möglich das Tau-Protein bezüglich residualer Strukturelemente, Rückgratdynamik und Bindungsverhalten zu untersuchen. Wir konnten zeigen, dass in der C-terminalen Hälfte des Tau-Proteins, in welcher eine charakteristische Domäne vorliegt, die durch vier imperfekte „repeat“-Regionen (Länge ist jeweils ca. 31 Reste) gekennzeichnet ist, partieller beta-Strukturcharakter vorliegt. Ebenfalls weist diese Region eine verhältnismäßig hohe Rigidität auf. Aus diesem Grund betrachten wird diesen sequentiellen Bereich als den Aggregationskeim, was auch durch die Beobachtung verstärkt wird, das genau diese Zone den rigiden Teil der Fibrillen bildet. Diese aggregationsanfällige Region bindet gleichzeit stark an Mikrotubuli, wodurch ihre Pathogenität im gesunden biologischen System blockiert sein sollte. Mutationen oder Instabilität in den Mikrotubuli können jedoch dazu führen, dass immer höhere Mengen an Tau in freier gelöster Form vorliegen, sich Dimere ausbilden, welche dann weiter aggregieren und schließlich PHFs bilden, die eine starke cross-beta-Struktur aufweisen. Die übrigen Bereiche, wie die N-terminale Hälfe oder die äußersten 50 C-terminalen Reste weisen hingegen einen partiellen alpha-helikalen Charakter auf und eine höhere Peptidrückgratflexibilität. Deshalb kann man diese Elemente als aggregationsinhibierend betrachten. Das genauere Zusammenspiel dieser Elemente muss noch aufbauend auf der vorliegenden Dissertation verstärkt im Detail untersucht werden.
NE Mount Kenya is characterised by dense population and small scale farming is the main form of land use. In the region, continual pressure on the forest resources as result of land use is a continuing problem. The NE Mount Kenya Forest Reserves (Imenti Forest Reserve, Mount Kenya Forest Reserve) play an important role in the livelihood of the neighbouring communities. However population pressure, reserve management policies, economic changes, an ineffective land tenure system and poverty are socio-economic factors contributing to land use changes and an intensification of agriculture. Illegal factors like clearing forest vegetation for firewood and grazing areas, at the expense of the protected forest areas, are present. This study focuses on an interdisplinary approach to analyse socio-economic and ecological factors in NE Mount Kenya relevant to land degradation. This includes remote sensing data (interpretation of satellite images Landsat TM 1987 and ETM 2000) combined with interviews from the land user’s perspective. Ethnographic research of this type on this topic has not been done in the region before. This entailed applying both a qualitative (giving farmers the opportunity to identify factors they perceived as important in regard to land use) and a quantitative method of data analysis. The Mount Kenya Forest region is distinguished by high elevation and a humid to sub-humid climate, while the Imenti Forest region lies lower and is characterised by semi-humid and transitional zones. Land use in the Mount Kenya Forest region is mainly perennial thus eliminating seasonal land use changes. In the Imenti Forest region, 30% of the farmers said they had gone through major land use changes within the last 20 years. The major land use change consisted of a shift from residential farming in the protected areas which offered more farming and grazing areas, to being restricted to individual farm plots which consequently led to the intensification of cultivation thus contributing to land degradation. The satellite images in the same region show a clear decrease in coverage of forest vegetation and an increase in open areas in the Imenti Forest region which the farmers explain influences the tentative land use changes in the region. On the other hand, in the Mount Kenya forest region, there has been an increase in forest vegetation cover which is also evident in the satellite images. Areas that were plantation and cultivated regions in 1987 have forest cover in 2000, which the farmers stated was as a result of their afforestation initiatives. Nevertheless, indicators of degradation e.g. rill and gully erosion are evident and correlated to the intensified land use in both forest regions. The population impact in the region apparently intensifies land use therefore the identified socio-economic factors in the region should be given priority in integrating development projects that are directly beneficial to park-adjacent communities according to the needs of the particular agro-ecological zone (AEZ). Location specific research can better enhance the understanding of the socio-economic factors influencing land use change. Furthermore, promoting alternative income generating activities, besides the present livestock and crop farming, can help reduce the risks of land degradation.